EP4638695A1 - Vorrichtung und verfahren zur kultivierung von zellen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur kultivierung von zellen

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Publication number
EP4638695A1
EP4638695A1 EP23797715.2A EP23797715A EP4638695A1 EP 4638695 A1 EP4638695 A1 EP 4638695A1 EP 23797715 A EP23797715 A EP 23797715A EP 4638695 A1 EP4638695 A1 EP 4638695A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cavity
channel
microfluidic
microparticles
fluidic connection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23797715.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd SCHEUFELE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4638695A1 publication Critical patent/EP4638695A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device for culturing cells, a method for operating the same and a cartridge comprising the microfluidic device according to the preamble of the independent claims.
  • WO 2019/010587 A1 provides a microfluidic line with cavities in which a hydrogel precursor is stored. Cells enter the cavities and thus the hydrogel precursor, which is finally hardened. The cells are then cultivated in the resulting hydrogel spheres.
  • Cancer patients with solid tumors respond to drug-based cancer therapy to varying degrees.
  • There is a great need for increasing personalization of cancer treatment which takes into account the cellular characteristics of the individual patient in order to be able to derive an individually optimized therapy.
  • three-dimensional cell agglomerates such as organoids or spheroids
  • organoids or spheroids for the research, diagnosis and treatment of diseases, such as tumors
  • three-dimensional Cell agglomerates for example, can well represent organ-specific properties.
  • microfluidics offers advantages such as smaller sample volumes and reagents required, shorter analysis times and parallel processes.
  • So-called lab-on-a-chip systems, or LoC systems for short, are microfluidic systems that accommodate the functionalities of a macroscopic laboratory on a plastic substrate for automated processing. Such systems make it possible to process biochemical processes largely or completely automatically.
  • Lab-on-a-chip systems typically comprise two main components.
  • the first is a test carrier, for example in the form of a cartridge, which comprises structures and mechanisms for manipulating a sample, in particular passive components such as channels, reaction chambers or upstream reagents or active components such as valves, pumps or mixers.
  • the second main component is a control unit for controlling the microfluidic processes in the cartridge.
  • tumor organoids are used to research tumor diseases.
  • One way to produce tumor organoids is to remove individual cells or tissue fragments from the primary tumor of a cancer patient and then cultivate them. This involves differentiation and proliferation of these cells or tissue fragments, which ultimately self-organize into three-dimensional structures.
  • the resulting tumor organoids are thus 3D cell agglomerates that have a similar composition and architecture as the patient's primary tumor tissue.
  • Tumor organoids can be used to represent the conditions in vivo. Established methods of 3D cell cultivation are currently used to produce organoids or tumor organoids.
  • the main process steps here are the cultivation of the cells or tissue fragments removed from the primary material and the subsequent expansion of the resulting tumor organoids.
  • ECM extracellular matrix
  • the ECM is, for example, a hydrogel with suitable ingredients. Drops of this suspension are pipetted into a cell culture vessel, for example a multiwell plate, and incubation at 37°C causes the gel to polymerize. This forms gel structures (gel domes).
  • a suitable culture medium is pipetted into the vessel so that the gel structures are completely covered by it. This is followed by a cultivation phase in an incubator.
  • the cells within the gel structures multiply and organoids of different sizes and shapes are formed.
  • the growth of the organoids is monitored microscopically, for example, and passaging of the organoids is started at an appropriate time.
  • the gel structures are transferred to another vessel, washed, broken open and the organoids are resuspended.
  • the organoids are then expanded and dissociated into multicellular fragments or individual cells.
  • the present invention addresses processes for culturing cells, for example into three-dimensional cell agglomerates, in particular organoids or spheroids, which are considered to be very critical for a microfluidic implementation, and describes a technical solution for the microfluidic implementation of the work steps relevant for cultivation.
  • a microfluidic device for culturing cells comprising a channel with at least one cavity for receiving at least one microparticle which protrudes from an outer surface of the channel, and a method for operating the same with the characterizing features of the independent patent claims.
  • the at least one cavity of the microfluidic device has a fluidic connection connected to a pump unit, which leads away from the channel.
  • the microfluidic device preferably has a plurality of cavities, each with a fluidic connection, which is connected to a pump unit.
  • a cavity protruding from an outer surface of the channel can be understood in particular as a lateral bulge or bay in the channel, which is arranged in particular as a recess in an inner wall of the channel for receiving the at least one microparticle.
  • the cavities have a diameter of 200 - 1500pm, for example, and in particular 400-750pm.
  • the shape and dimensions of the cavities are preferably selected so that one microparticle can be accommodated in each one and subsequently flown-in microparticles are transported to the next free cavity.
  • the cavities can also be dimensioned so that several microparticles can be accommodated in them.
  • Each of the cavities has a fluidic connection that is connected to a pump unit directly or via suitably switched valves. This makes it possible to pump liquids out of a cavity or into a cavity.
  • Suitable pump units for this purpose include syringe, diaphragm or peristaltic pumps.
  • fluidic connections enable the implementation of flow-induced processes within the cavities or the microfluidic device. These are carried out by pumping liquids into or out of the cavities via the individual fluidic connections.
  • microparticles or, after their dissolution, components of the microparticles, in particular cells or three-dimensional cell agglomerates can be moved by supplying A liquid can be flushed out of the cavity into the channel via the fluidic connection.
  • the cultivation conditions and thus the cultivation process can be influenced by a microparticle located in the cavity or by a cell and/or three-dimensional cell agglomerate located in the microparticle. This is done by a precisely dosed supply of suitably selected liquids.
  • different cultivation conditions can be implemented for each cavity, allowing influences on the behavior or properties of the cells or three-dimensional cell agglomerates to be investigated.
  • By supplying suitable liquids via the fluidic connection of at least one cavity it is also ensured that the cavities containing the microparticles always contain fresh nutrients and gases required for cultivation. They are therefore introduced directly where they are needed and do not have to first diffuse into the cavities via a channel or other structures.
  • the fluidic connections thus improve the supply of the cells to be cultivated.
  • a defined volume of liquid can be removed from each cavity for subsequent analysis via the fluidic connection, so that the cultivation process can be monitored and adjusted if necessary.
  • the device according to the invention also offers the advantage that the cultivation of cells and/or three-dimensional cell agglomerates is carried out automatically within a microfluidic system, making the cultivation reproducible, automatable, standardizable and user-friendly. This means that no experienced experts or suitably equipped laboratories are required, which relieves the burden on specialist staff and saves time and money. As manual process steps are eliminated, there are no influences or errors from the operator, for example, and the introduction of possible contamination is prevented. Standardization is particularly necessary for the use of three-dimensional cell agglomerates, such as organoids, for reliable drug testing.
  • the fluidic connection of the at least one cavity has an integrated retaining element.
  • the fluidic connection of the at least one cavity has dimensions of 5 - 75 pm.
  • microparticle(s) have larger dimensions than the fluidic connection or cannot pass through it due to the retaining element, and thus cannot leave the cavity via the fluidic connection. In this way, it is possible to introduce and remove liquids from the cavity without any loss of microparticles.
  • the channel of the microfluidic device has dimensions of 100 - 1000 pm.
  • the term dimension is understood to mean the height and/or width of the microfluidic channel.
  • the channel has at least one bend, wherein the at least one cavity is arranged in the bend of the channel on the outer curved surface.
  • the advantage here is that components such as microparticles that are conveyed through the channel are subjected to a centrifugal force due to the bend, which transports the components in the direction of at least one cavity and into it.
  • the device has a device for tempering the channel and/or the at least one cavity.
  • the channel and/or the at least one cavity are at least partially optically transparent and comprises a control unit, in particular a camera and/or a microscope unit.
  • a control unit in particular a camera and/or a microscope unit.
  • the microfluidic device comprises at least one reservoir for a fluid, which is in fluidic connection with the fluidic connection of the at least one cavity.
  • a culture medium, growth factors, nutrients and/or pharmacological active ingredients are stored in the reservoir.
  • the invention further relates to a method for culturing cells using the microfluidic device according to the invention with the following steps: a) conveying a medium with microparticles via the channel, whereby a microparticle encloses at least one cell, and introducing at least one microparticle into at least one cavity.
  • the microparticles are transported in a culture medium, for example.
  • a dosed supply of a culture medium, growth factors, nutrients and/or pharmacological active ingredients takes place via the fluidic connection of the cavity into the cavity.
  • the surrounding culture medium diffuses into the cavities and into the microparticles, so that the cells are supplied with dissolved nutrients and gases.
  • the culture medium is transported via the microfluidic channel continuously or at specific times.
  • fresh culture medium with the same or a different composition is supplied to the microparticles and thus to the cells or three-dimensional cell agglomerates via the fluidic connections of the cavities, so that used culture medium is replaced by fresh culture medium at certain times, for example.
  • growth factors, nutrients and/or pharmacological active ingredients are supplied in precisely dosed amounts.
  • different growth factors can be added in defined concentrations.
  • the advantage here is that the cultivation of the cells or three-dimensional cell agglomerates can be influenced in a targeted manner in this way.
  • the culture medium, growth factors, nutrients and/or pharmacological active ingredients reach the cavity directly via the fluidic connection and thus their destination in order to have a targeted effect on the cells or three-dimensional cell agglomerates during cultivation.
  • This ensures that the cells or three-dimensional cell agglomerates come into contact with the respective culture medium, growth factors, nutrients and/or pharmacological active ingredients in sufficient concentrations.
  • drug solutions with defined concentrations to a cavity via the fluidic connection, the influence on the cultivation process and the properties of the cells or three-dimensional cell agglomerates in particular can be investigated. For example, individual or multiple chemotherapeutic agents with selectable concentrations can be introduced into the cavities via the fluidic connections.
  • the cavities are heated to a suitable temperature, for example to 37 °C.
  • the channel and the fluidic connections of the cavity can also be heated.
  • the cultivation process of the cells or three-dimensional cell agglomerates is terminated at a selectable time, for example when the three-dimensional cell agglomerates reach a desired size or morphology. Termination can occur for a single or multiple cavities.
  • microparticles located in the microfluidic channel can be further transported and processed.
  • such a process offers the further advantage that the cells or three-dimensional cell agglomerates are available for subsequent cultivation or analysis steps, in particular for expansion or for drug testing.
  • the method according to the invention also offers the advantage that the cultivation of cells and/or three-dimensional cell agglomerates is automated, which makes the cultivation reproducible, automatable, standardizable and user-friendly. This results in the advantages already described for the microfluidic device.
  • step a) the introduction of the at least one microparticle into the at least one cavity takes place due to a centrifugal force acting on the microparticles, which occurs due to a bend in the channel as the fluid flows through it.
  • the cavity is arranged on the outer curved surface of the channel.
  • the advantage here is that the centrifugal force acting on the microparticles transports the microparticles directly towards and into at least one cavity.
  • step a) the introduction of the at least one microparticle into the at least one cavity is flow-induced by conveying out medium via the fluidic connection of the cavity.
  • the movement and positioning of the microparticles into the cavities can also be carried out or supported by other technologies, for example by means of dielectrophoresis and an applied inhomogeneous electric field to move and capture the microparticles and/or by means of applying magnetic fields and magnetic labeling of the microparticles and/or by means of standing ultrasonic waves to generate pressure nodes that attract and hold the microparticles.
  • step b) the oxygen and/or carbon dioxide content in the culture medium supplied via the fluidic connection of the cavity is varied.
  • a volume of liquid is pumped out of the at least one cavity via the fluidic connection and is examined for certain parameters.
  • these parameters are, for example, the pH value, the concentration of glucose and/or lactate in the culture medium, the oxygen and/or carbon dioxide content in the culture medium and/or the presence or concentration of proteins in the culture medium, in particular cytokines.
  • the advantage here is that the analysis and monitoring can be carried out during the cultivation process without stopping or disrupting it.
  • an examination of characteristic properties can provide early information about the quality of the cultivation, so that the cultivation conditions can be adjusted directly during the cultivation.
  • step c) the termination of the cultivation is achieved by generating a liquid flow via the fluidic connection of the cavity in the direction of the channel. This washes away the culture medium around the microparticles, so that the cultivation process is stopped.
  • the microparticles themselves or the cells or three-dimensional cell agglomerates of dissolved microparticles can also be transported out of the cavity into the channel by means of the liquid flow.
  • the liquid supplied can be a culture medium or a buffer, for example. It is advantageous that these steps can be flow-induced via the fluidic connections of the cavities and the removal of the microparticles or cells or three-dimensional cell agglomerates from the cavities is almost completely guaranteed compared to flows caused only via the channel.
  • the microparticles are hydrogel structures comprising at least one cell and/or a three-dimensional cell agglomerate, in particular spherical ones.
  • the three-dimensional cell agglomerates are, for example, organoids or spheroids.
  • MatrigelTM (Corning) is preferably used as the hydrogel of the hydrogel structure.
  • other hydrogels such as agarose, gelatin or polyethylene glycol can also be used.
  • the hydrogel structures are chosen to be large enough to accommodate one or more three-dimensional cell agglomerates, particularly organoids.
  • the diameters of tumor organoids, which are particularly suitable for drug testing, are between 100 and 750 pm.
  • the hydrogel structures are depolymerized in step c) and the cells and/or three-dimensional cell agglomerates, in particular organoids or spheroids, are released in the cavity.
  • a reagent is supplied via the fluidic connection of the cavity.
  • the reagent has, for example, a temperature that causes or supports the depolymerization.
  • this depolymerizing reagent is, for example, the CorningTM Dispase solution (Corning) or CorningTM cell recovery solution (Corning).
  • Alternative reagents are enzyme solutions that contain, for example, trypsin or TrypLETM Express Enzyme (Thermofisher).
  • the depolymerization of the MatrigelTM (Corning) can be carried out by lowering the temperature to approx. 4°C.
  • culture medium with a temperature of approx. 4°C is supplied via the fluidic connections of the cavities and/or the channel of the microfluidic device.
  • the microfluidic device, in particular the cavity is tempered to a temperature of approx. 4°C.
  • the invention further relates to a cartridge, in particular a microfluidic cartridge, as described for example in DE102016222072A1 or DE102016222075A1, comprising the microfluidic device according to the invention.
  • Fig. 1 the schematic representation of a cross section through a microfluidic device according to the invention with a channel and cavities, each having a fluidic connection,
  • Fig. 2 the schematic representation of an inventive
  • Cartridge comprising the microfluidic device according to Figure 1 , and
  • Fig. 3 the schematic representation of a flow chart of an embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 1 shows a microfluidic device 10 for cultivating cells 9.
  • the microfluidic device 10 comprises a channel 1 with three cavities 5a, 5b, 5c, wherein the cavities 5a, 5b, 5c protrude from an outer surface of the channel 1.
  • the number of cavities 5a, 5b, 5c is shown only as an example, preferably the channel 1 has a plurality of cavities 5a, 5b, 5c.
  • Each cavity 5a, 5b, 5c has a fluidic connection 55a, 55b, 55c connected to a pump unit, which is connected to the Channel 1 leads away.
  • the fluidic connections 55a, 55b, 55c have, for example, an integrated retaining element (not shown) and/or dimensions of 5 - 75 pm, so that the hydrogel structures 3 have larger dimensions than the fluidic connections 55a, 55b, 55c and cannot pass through or leave them.
  • the pump unit is not shown in Figure 1.
  • the channel 1 has a bend 11, whereby the channel 1 in the region of the bend 11 has an inner curved surface 12, a neutral axis 13 and an outer curved surface 14.
  • the cavities 5a, 5b, 5c are arranged in the bend of the channel 1 on the outer curved surface 14.
  • the device comprises a device for tempering the channel 1 and/or the at least one cavity 5a, 5b, 5c.
  • the channel 1 and/or the cavities 5a, 5b, 5c can be designed to be at least partially optically transparent and have a control unit (not shown), in particular a camera and/or a microscope unit.
  • Spherical hydrogel structures 3 are described as examples for the microparticles 3 surrounding the at least one cell 9 and organoids 7 are described as examples for the three-dimensional cell agglomerates 7.
  • MatrigelTM (Corning) is preferably used as the hydrogel.
  • the hydrogel structures 3 are chosen to be large enough so that one or more organoids 7 can be cultivated in them.
  • the diameters of the organoids 7 are, for example, 100 - 750 pm.
  • the cavities 5a, 5b, 5c depict different steps of the method.
  • the first cavity 5a depicts the first step a) of the method
  • the second cavity 5b shows the second method step b)
  • the third cavity 5c depicts the third step c) of the method.
  • a medium in particular a culture medium, with spherical hydrogel structures 3 is conveyed through the channel 1.
  • the direction of flow is indicated by the arrows 15.
  • the hydrogel structures 3 each enclose a cell 9 and are transported with the liquid flow in the channel 1.
  • the channel 1 has a bend 11.
  • a centrifugal force acts on the Hydrogel structures 3, which transport them in the direction of the outer curved surface 14 of the channel 1, on which the cavities 5a, 5b, 5c are located, and into them.
  • medium is conveyed out via the fluidic connections 55a, 55b, 55c of the cavities 5a, 5b, 5c, shown as outflow 17, so that a suction is created in the direction of the cavities 5a, 5b, 5c, which draws the hydrogel structures 3 into them.
  • the cavities 5a, 5b, 5c are dimensioned such that exactly one hydrogel structure 3 can be accommodated therein and subsequent hydrogel structures 3 are transported to the next free cavity 5a, 5b, 5c.
  • the cavities 5a, 5b, 5c can also be dimensioned such that several hydrogel structures 3 are accommodated in one cavity 5a, 5b, 5c.
  • a second step b) the cell 9 is cultivated in the hydrogel structure 3 located in the cavity 5a, 5b, 5c and grows into an organoid 7.
  • culture medium is provided for the cultivation process via the channel 1.
  • the culture medium diffuses into the cavities 5a, 5b, 5c and into the hydrogel structures 3.
  • the temperature suitable for cultivating the organoids 7, preferably approx. 37°C, is set by tempering the channel 1 and/or the cavities 5a, 5b, 5c.
  • liquids are supplied to the hydrogel structures 3 or cells 9 in precisely dosed amounts via the fluidic connections 55a, 55b, 55c of the cavities 5a, 5b, 5c, shown as inflow 19, and thus the cultivation of the cells 9 into organoids 7 is specifically influenced.
  • This liquid is a culture medium, for example with a changed composition and/or containing growth factors, nutrients and/or pharmacological agents.
  • the supply or inflow 19 of the liquid can take place continuously or at specific times.
  • culture medium is added, "used” culture medium is replaced by "fresh” so that the cells 9 are supplied with dissolved nutrients and gases. In this way, a media change is implemented microfluidically.
  • a culture medium with a varied oxygen and/or carbon dioxide content can be supplied.
  • a volume of liquid is pumped out of the cavity 5a, 5b, 5c via the fluidic connection 55a, 55b, 55c and monitored for parameters, in particular the pH value, the concentration of glucose and/or lactate, the oxygen and/or carbon dioxide content and/or the presence and concentration of proteins, particularly cytokines.
  • a third step c) the cultivation process is terminated at a specific point in time, for example when the organoids 7 have reached a desired size or morphology.
  • individual or all hydrogel structures 3 within the cavities 5a, 5b, 5c are depolymerized and dissolved in order to release the resulting organoids 7.
  • suitable liquid reagents shown as inflow 19, are supplied via the fluidic connections 55a, 55b, 55c of the cavities 5a, 5b, 5c.
  • the depolymerization of the hydrogel can take place by lowering the temperature to approx. 4°C.
  • the microfluidic device 10 can also be heated to 4°C.
  • the organoids 7 released from the hydrogel structures 3 after depolymerization are then transported from the cavities 5a, 5b, 5c into the microfluidic channel 1.
  • a culture medium is introduced via the fluidic connections 55a, 55b, 55c of the cavities 5a, 5b, 5c and a liquid flow is generated in the direction of the channel 1 via this inflow 19.
  • the organoids 7 located in the microfluidic channel 1 are transported further and are available for subsequent cultivation or analysis steps, in particular for expansion or drug tests.
  • the hydrogel structures 3 in the cavities 5a, 5b, 5c are initially not depolymerized, but flowed into the channel 1 as whole hydrogel structures 3.
  • FIG 2 shows a cartridge 100 according to the invention, which comprises the microfluidic device 10 according to the invention according to Figure 1.
  • the microfluidic device 10 is accommodated, for example, on a plastic substrate or chip.
  • Figure 3 shows a flow chart of the method 500 according to the invention for cultivating cells 9 using the microfluidic device shown in Fig. 1 and the embodiments and method steps described there.

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Abstract

Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung (10) zur Kultivierung von Zellen (9) beschrieben, umfassend einen Kanal (1) mit zumindest einer Kavität (5a, 5b, 5c) zur Aufnahme zumindest eines Mikropartikels (3), welche sich ausgehend von einer Außenfläche des Kanals (1) ausstülpt, wobei die zumindest eine Kavität (5a, 5b, 5c) einen mit einer Pumpeinheit verbundenen fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) aufweist, welcher von dem Kanal (1) wegführt.

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung und Verfahren zur Kultivierung von Zellen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, ein Verfahren zum Betrieb derselben sowie auf eine die mikrofluidische Vorrichtung umfassende Kartusche nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
Stand der Technik
In der WO 2019/010587 A1 ist eine mikrofluidische Leitung mit Kavitäten vorgesehen, in denen ein Hydrogel-Precursor vorgelagert ist. Zellen gelangen in die Kavitäten und somit den Hydrogel-Precursor, welcher schließlich ausgehärtet wird. Anschließend werden die Zellen in den entstandenen Hydrogel-Kugeln kultiviert.
Krebspatienten mit soliden Tumoren sprechen unterschiedlich gut auf eine medikamentöse Krebstherapie an. Es besteht hoher Bedarf an einer zunehmenden Personalisierung der Krebsbehandlung, welche u.a. zelluläre Besonderheiten des einzelnen Patienten berücksichtigt, um eine individuell optimierte Therapie ableiten zu können.
Das Interesse an der Verwendung von dreidimensionalen Zellagglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen, hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen, da solche dreidimensionalen Zellagglomerate zum Beispiel organspezifische Eigenschaften gut abbilden können.
Typischerweise erfolgt deren Handhabung manuell mit Hilfsmitteln wie Pipetten, Reaktionsgefäßen und Laborgeräten. Hier bietet die Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Labortests Vorteile wie beispielsweise geringere benötigte Probenvolumina und Reagenzien, verkürzte Analysezeiten sowie parallel ablaufende Vorgänge.
Bei der Implementierung erforderlicher Prozessschritte in ein mikrofluidisches System gibt es jedoch aufgrund deren Komplexität zahlreiche Herausforderungen, die es zu meistern gilt. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Kultivierung und Vermehrung solcher dreidimensionaler Zellagglomerate in einem mikrofluidischen System.
Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, kurz LoC-Systeme, sind mikrofluidische Systeme, welche Funktionalitäten eines makroskopischen Labors auf einem Kunststoffsubstrat für eine automatisierte Prozessierung unterbringen. Solche Systeme ermöglichen es, biochemische Prozesse weitestgehend oder vollständig automatisiert zu prozessieren.
Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen typischerweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle, Reaktionskammern oder vorgelagerte Reagenzien oder auch aktiven Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Steuereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche.
Offenbarung der Erfindung
Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel sogenannte Tumor-Organoide zum Einsatz. Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor- Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung. Hierbei erfolgt eine Differenzierung und Vermehrung dieser Zellen oder Gewebefragmente, die sich schließlich zu dreidimensionalen Strukturen selbstorganisieren. Die daraus entstehenden Tumor-Organoide sind somit 3D- Zellagglomerate, welche eine ähnliche Zusammensetzung und Architektur aufweisen wie das primäre Tumorgewebe des Patienten. Mittels Tumor- Organoiden können die Gegebenheiten in vivo gut repräsentiert werden. Für die Herstellung von Organoiden bzw. Tumor-Organoiden werden aktuell etablierte Methoden der 3D-Zellkultivierung verwendet.
Hauptprozessschritte hierbei sind die Kultivierung der entnommenen Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärmaterial sowie die anschließende Expansion der entstandenen Tumor-Organoide.
Bei der Kultivierung werden Zellen bzw. Zellagglomeraten in einer sogenannten extrazellulären Matrix (ECM, engl. extracellular matrix) suspendiert. Die ECM ist beispielsweise ein Hydrogel mit geeigneten Inhaltsstoffen. Tropfen dieser Suspension werden in ein Zellkulturgefäß, beispielsweise eine Multiwellplatte, pipettiert und durch Inkubation bei 37°C kommt es zu einer Polymerisation des Gels. Hierbei bilden sich Gelstrukturen (engl. gel domes) aus.
Nach der Verfestigung des Gels wird ein geeignetes Kulturmedium in das Gefäß pipettiert, so dass die Gelstrukturen von diesem vollständig überdeckt sind. Es folgt eine Kultivierungsphase in einem Inkubator. Dabei vermehren sich die Zellen innerhalb der Gelstrukturen und Organoide mit unterschiedlicher Größe und Form bilden sich aus. Das Wachstum der Organoide wird beispielsweise mikroskopisch überwacht und zu einem geeigneten Zeitpunkt mit einem Passagieren der Organoide begonnen. Hierfür werden die Gelstrukturen in ein anderes Gefäß transferiert, gewaschen, aufgebrochen und die Organoide resuspendiert.
Anschließend erfolgt die Expansion der Organoide, wobei diese in multizelluläre Fragmente oder einzelne Zellen dissoziiert werden.
Diese Prozessschritte zur Kultivierung und Expansion sind sehr arbeits- und zeitintensiv und können nur von ausgebildetem und erfahrenem Fachpersonal in geeignet ausgestatteten Laboren durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung adressiert Prozesse zur Kultivierung von Zellen, beispielsweise zu dreidimensionalen Zellagglomeraten, insbesondere Organoiden oder Sphäroiden, die für eine mikrofluidische Implementierung als sehr kritisch anzusehen sind, und beschreibt eine technische Lösung für die mikrofluidische Umsetzung der für die Kultivierung relevanten Arbeitsschritte.
Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, umfassend einen Kanal mit zumindest einer Kavität zur Aufnahme zumindest eines Mikropartikels, welche sich ausgehend von einer Außenfläche des Kanals ausstülpt, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben mit den kennzeichnenden Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.
Dies beruht insbesondere darauf, dass die zumindest eine Kavität der mikrofluidischen Vorrichtung einen mit einer Pumpeinheit verbundenen fluidischen Anschluss aufweist, welcher von dem Kanal wegführt. Bevorzugt weist die mikrofluidische Vorrichtung eine Mehrzahl an Kavitäten mit je einem fluidischen Anschluss, welcher mit einer Pumpeinheit verbunden ist, auf.
Unter einer sich von einer Außenfläche des Kanals ausstülpenden Kavität kann insbesondere eine seitliche Ausbuchtung oder Bucht im Kanal verstanden werden, welche insbesondere als Ausnehmung in einer Innenwand des Kanals für die Aufnahme des zumindest einen Mikropartikels angeordnet ist.
Die Kavitäten weisen beispielsweise einen Durchmesser von 200 - 1500pm, und insbesondere von 400-750pm auf. Die Form und Abmessungen der Kavitäten sind bevorzugt so gewählt, das darin jeweils ein Mikropartikel Platz findet und nachfolgend angeströmte Mikropartikel zur nächsten freien Kavität weitertransportiert werden. Alternativ können die Kavitäten auch so dimensioniert sein, dass mehrere Mikropartikel darin aufgenommen werden können.
Jede der Kavitäten besitzt einen fluidischen Anschluss, der mit einer Pumpeinheit direkt oder über geeignet geschaltete Ventile verbunden ist. Dadurch ist es möglich, Flüssigkeiten aus einer Kavität herauszufördern bzw. in eine Kavität hineinzufördern. Hierfür geeignete Pumpeinheiten sind beispielsweise Spritzen-, Membran- oder Peristaltikpumpen.
Vorteilhaft ist, dass die fluidischen Anschlüsse die Realisierung von strömungsinduzierten Prozessen innerhalb der Kavitäten bzw. der mikrofluidischen Vorrichtung ermöglichen. Diese erfolgen durch Hinein- bzw. Herausfördern von Flüssigkeiten in die Kavitäten oder aus diesen heraus über die einzelnen fluidischen Anschlüsse.
Dies ermöglicht beispielsweise eine strömungsinduzierte Bewegung und Positionierung von einem oder mehreren Mikropartikeln in einer Kavität durch Herausfördern einer Flüssigkeit über den fluidischen Anschluss. Ebenso können die Mikropartikel oder nach deren Auflösung Bestandteile der Mikropartikel, insbesondere Zellen oder dreidimensionale Zellagglomerate, durch Zuführen von einer Flüssigkeit über den fluidischen Anschluss wieder aus der Kavität in den Kanal gespült werden.
Desweiteren können die Kultivierungsbedingungen, und somit der Kultivierungsprozess von einem sich in der Kavität befindlichen Mikropartikel bzw. von einer sich in dem Mikropartikel befindlichen Zelle und/oder dreidimensionalen Zellagglomerat, beeinflusst werden. Dies erfolgt durch eine genau dosierte Zuführung von geeignet ausgewählten Flüssigkeiten.
Es lassen sich damit insbesondere unterschiedliche Kultivierungsbedingungen für jede Kavität realisieren und somit Einflüsse auf das Verhalten bzw. die Eigenschaften der Zellen oder dreidimensionalen Zellagglomerate untersuchen. Durch die Zuführung geeigneter Flüssigkeiten über den fluidischen Anschluss der zumindest einen Kavität ist außerdem sichergestellt, dass sich in den Kavitäten mit den Mikropartikeln immer frische für die Kultivierung benötigte Nährstoffe und Gase befinden. Sie werden also direkt dort eingebracht, wo sie benötigt werden, und müssen nicht erst über einen Kanal oder andere Strukturen in die Kavitäten eindiffundieren. Die fluidischen Anschlüsse verbessern so die Versorgung der zu kultivierenden Zellen.
Desweiteren vorteilhaft kann über den fluidischen Anschluss jeder Kavität ein definiertes Volumen an Flüssigkeit aus der Kavität für eine anschließende Analyse entnommen werden, sodass der Kultivierungsprozess überwacht und gegebenenfalls angepasst werden kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet außerdem den Vorteil, dass die Kultivierung von Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert innerhalb eines mikrofluidischen Systems erfolgt, wodurch die Kultivierung reproduzierbar, automatisierbar, standardisierbar und bedienerfreundlich ist. Somit sind keine erfahrenen Fachexperten und geeignet ausgestattete Labore erforderlich, wodurch das Fachpersonal entlastet wird und Zeit und Kosten eingespart werden. Dadurch, dass manuell durchzuführende Prozessschritte entfallen, treten beispielsweise keine Beeinflussungen bzw. Fehler durch den Bedienung auf und der Eintrag von möglichen Kontaminationen wird verhindert. Insbesondere die Standardisierbarkeit ist für die Verwendung von dreidimensionalen Zellagglomeraten, wie beispielsweise Organoiden, für verlässliche Medikamententests erforderlich.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen. In einer vorteilhaften Ausführungsform weist der fluidische Anschluss der zumindest einen Kavität ein integriertes Rückhalteelement auf. Alternativ oder zusätzlich weist der fluidische Anschluss der zumindest einen Kavität Abmessungen von 5 - 75 pm auf.
Vorteilhaft hierbei ist, dass der oder die Mikropartikel größere Abmessungen aufweisen als der fluidische Anschluss bzw. diesen aufgrund des Rückhalteelements nicht passieren können, und somit die Kavität nicht über den fluidischen Anschluss verlassen können. Auf diese Weise ist es möglich Flüssigkeiten in die Kavität ein- und auszubringen ohne, dass es zu Verlusten der Mikropartikel kommt.
Zudem vorteilhaft ist es, wenn der Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung Abmessungen von 100 - 1000pm, aufweist. Unter dem Begriff Abmessung wird im Sinne der vorliegenden Erfindung die Höhe und/oder Breite des mikrofluidischen Kanals verstanden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist der Kanal zumindest eine Biegung auf, wobei die zumindest eine Kavität in der Biegung des Kanals an der äußeren Bogenfläche angeordnet ist.
Vorteilhaft hierbei ist, dass auf Bestandteile, wie beispielsweise Mikropartikel, die durch den Kanal gefördert werden aufgrund der Biegung eine Zentrifugalkraft wirkt, welche die Bestandteile in Richtung der zumindest einen Kavität und in diese hinein transportiert.
Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass die Vorrichtung eine Einrichtung zur Temperierung des Kanals und/oder der zumindest einen Kavität aufweist.
Hierdurch kann eine geeignete Temperatur zur Kultivierung der Zellen und oder/ dreidimensionalen Zellagglomerate eingestellt werden. Dies wird beispielsweise durch eine Temperierung, insbesondere unterhalb der mikrofluidischen Vorrichtung, realisiert, beispielsweise durch die Verwendung eines oder mehrerer, insbesondere unterhalb der mikrofluidischen Vorrichtung, angebrachter Peltier-Elemente.
Desweiteren ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, wenn der Kanal und/oder die zumindest eine Kavität zumindest teilweise optisch transparent ausgestaltet ist und eine Kontrolleinheit, insbesondere eine Kamera und/oder einer Mikroskopeinheit umfasst. Vorteilhaft hierbei ist, dass eine optische Beobachtung des Kultivierungsprozesses der Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomerate möglich ist Es können beispielsweise die Abmessungen der kultivierten dreidimensionalen Zellagglomerate ermittelt werden und der Kultivierungsprozess gestoppt werden, wenn diese eine definierte Größe erreicht haben.
Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst, welches mit dem fluidischen Anschluss der zumindest einen Kavität in fluidischer Verbindung steht. In dem Reservoir ist ein Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe vorgelagert.
So ist eine schnelle und einfache Zuführung des Kulturmediums, der Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologischen Wirkstoffen sichergestellt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung mit nachfolgenden Schritten: a) Fördern eines Mediums mit Mikropartikeln über den Kanal, wobei ein Mikropartikel zumindest eine Zelle umschließt, und Einbringen zumindest eines Mikropartikels in zumindest eine Kavität. Die Mikropartikel werden hierbei beispielsweise in einem Kulturmedium transportiert. b) Kultivierung der zumindest einen Zelle in dem sich in der Kavität befindlichen Mikropartikel, insbesondere zu einem dreidimensionalen Zellagglomerat. Hierbei erfolgt eine dosierte Zuführung von einem Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen über den fluidischen Anschluss der Kavität in diese.
Bei der Kultivierung diffundiert das umgebende Kulturmedium in die Kavitäten und in die Mikropartikel hinein, sodass die Zellen mit gelösten Nährstoffen und Gasen versorgt sind. Das Kulturmedium wird beispielsweise über den mikrofluidischen Kanal kontinuierlich oder zu bestimmten Zeiten weiter gefördert.
Über die fluidischen Anschlüsse der Kavitäten wird den Mikropartikeln und somit den Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomeraten während des Kultivierungsprozesses frisches Kulturmedium mit der gleichen oder einer anderen Zusammensetzung zugeführt, sodass verbrauchtes Kulturmedium beispielsweise zu bestimmten Zeiten durch frisches Kulturmedium ersetzt wird. Alternativ oder zusätzlich werden Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe genau dosiert zugeführt. Es können beispielsweise unterschiedliche Wachstumsfaktoren in definierten Konzentrationen zugegeben werden.
Vorteilhaft hierbei ist, dass auf diese Weise die Kultivierung der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate gezielt beeinflusst werden kann. Das Kulturmedium, die Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffe gelangen über den fluidischen Anschluss direkt in die Kavität und somit an deren Bestimmungsort um bei der Kultivierung gezielt auf die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate einzuwirken. So ist sichergestellt, dass die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate in ausreichender Konzentration mit dem jeweiligen Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen in Kontakt kommen. Durch Zugabe von Medikamentenlösungen mit definierten Konzentrationen in eine Kavität über den fluidischen Anschluss kann insbesondere der Einfluss auf den Kultivierungsprozess und die Eigenschaften der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate untersucht werden. Es können beispielsweise einzelne oder mehrere Chemotherapeutika mit wählbaren Konzentrationen über die fluidischen Anschlüsse in die Kavitäten eingebracht werden.
Desweiteren vorteilhaft lassen sich damit insbesondere unterschiedliche Kultivierungsbedingungen für jede Kavität realisieren und somit Einflüsse auf das Verhalten bzw. die Eigenschaften der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate untersuchen.
Zur Kultivierung werden die Kavitäten beispielsweise auf eine geeignete Temperatur temperiert, beispielsweise auf 37 °C. Zusätzlich können auch der Kanal und die fluidischen Anschlüsse der Kavität beheizt werden. c) Beenden der Kultivierung und Ausführen des zumindest einen Mikropartikels oder der zumindest einen kultivierten Zelle, insbesondere des dreidimensionalen Zellagglomerats, aus der Kavität heraus in den Kanal. Das Beenden des Kultivierungsprozesses der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate erfolgt zu einem wählbaren Zeitpunkt, beispielsweise bei Erreichen einer gewünschten Größe oder Morphologie der dreidimensionalen Zellagglomerate. Das Beenden kann hierbei für eine einzelne oder mehrere Kavitäten erfolgen.
Abschließend können die sich im mikrofluidischen Kanal befindlichen Mikropartikel weitertransportiert und -prozessiert werden.
Ein derartiges Verfahren bietet neben den zu den einzelnen Verfahrensschritten erläuterten Vorteilen den weiteren Vorteil, dass die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte, insbesondere für eine Expansion oder für Medikamententests zur Verfügung stehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet außerdem den Vorteil, dass die Kultivierung von Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert erfolgt, wodurch die Kultivierung reproduzierbar, automatisierbar, standardisierbar und bedienerfreundlich ist. Dadurch ergeben sich die bereits zu der mikrofluidischen Vorrichtung beschriebenen Vorteile.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt in Schritt a) das Einbringen des zumindest einen Mikropartikels in die zumindest eine Kavität aufgrund einer auf die Mikropartikel wirkenden Zentrifugalkraft, welche aufgrund einer Biegung des Kanals bei dessen Durchströmung auftritt. Hierbei ist die Kavität an der äußeren Bogenfläche des Kanals angeordnet.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die auf die Mikropartikel wirkende Zentrifugalkraft die Mikropartikel direkt in Richtung der zumindest einen Kavität und in diese hinein transportiert.
In einer alternativen oder zusätzlichen vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass in Schritt a) das Einbringen des zumindest einen Mikropartikels in die zumindest eine Kavität strömungsinduziert durch ein Herausfördern von Medium über den fluidischen Anschluss der Kavität erfolgt. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Mikropartikel dadurch strömungsinduziert in Richtung der Kavitäten bewegt werden und sich in diesen positionieren.
Alternativ oder zusätzlich kann die Bewegung und Positionierung der Mikropartikel in die Kavitäten auch mittels anderer Technologien erfolgen oder unterstützt werden, beispielsweise mittels Dielektrophorese und einem angelegten inhomogenen elektrischen Feld zum Bewegen und Einfangen der Mikropartikel und/oder mittels Anlegen magnetischer Felder und magnetischem Labeling der Mikropartikel und/oder mittels stehender Ultraschallwellen zur Erzeugung von Druckknoten, welche die Mikropartikel anziehen und festhalten.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform werden in Schritt b) der Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt im über den fluidischen Anschluss der Kavität zugeführten Kulturmedium variiert.
Hierdurch können vorteilhaft hypoxische Kultivierungsbedingungen innerhalb der Kavität realisiert werden, die charakteristisch für die in vivo Situation bei soliden Tumoren sind.
Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass in Schritt b) während der Kultivierung über den fluidischen Anschluss der zumindest einen Kavität ein Flüssigkeitsvolumen aus dieser herausgefördert wird und auf bestimmte Parameter untersucht wird. Diese Parameter sind beispielsweise der pH-Wert, die Konzentration von Glukose und/oder Laktat im Kulturmedium, der Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt im Kulturmedium und/oder das Vorhandensein bzw. die Konzentration von Proteinen im Kulturmedium, insbesondere von Zytokinen.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Analyse und Überwachung während des Kultivierungsprozesses erfolgen kann, ohne diesen zu stoppen bzw. zu stören. Zudem kann eine Untersuchung charakteristischer Eigenschaften frühzeitig Aufschluss über die Qualität der Kultivierung geben, sodass eine Anpassung der Kultivierungsbedingungen bereits direkt während der Kultivierung erfolgen kann.
Desweiteren ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, wenn in Schritt c) das Beenden der Kultivierung durch die Generierung einer Flüssigkeitsströmung über den fluidischen Anschluss der Kavität in Richtung des Kanals erfolgt. Hierdurch wird das Kulturmedium um die Mikropartikel herum weggespült, sodass der Kultivierungsprozess gestoppt ist. Auch die Mikropartikel selbst oder die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate aufgelöster Mikropartikel können hierbei mittels der Flüssigkeitsströmung aus der Kavität heraus in den Kanal transportiert werden. Bei der zugeführten Flüssigkeit kann es sich beispielsweise um ein Kulturmedium oder einen Puffer handeln. Vorteilhaft ist, dass diese Schritte strömungsinduziert über die fluidischen Anschlüsse der Kavitäten ablaufen können und das Ausbringen der Mikropartikel oder Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate aus den Kavitäten nahezu vollständig gewährleistet ist im Vergleich zu lediglich über den Kanal hervorgerufene Strömungen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform sind die Mikropartikel zumindest eine Zelle und/oder ein dreidimensionales Zellagglomerat umfassende, insbesondere kugelförmige, Hydrogel-Strukturen. Desweiteren sind die dreidimensionalen Zellagglomerate beispielsweise Organoide oder Sphäroide. Als Hydrogel der Hydrogel-Struktur wird bevorzugt Matrigel™ (Corning) verwendet. Alternativ können auch andere Hydrogele wie beispielsweise Agarose, Gelatine oder Polyethylenglykol verwendet werden.
Die Hydrogel-Strukturen werden so groß gewählt, dass ein bzw. mehrere dreidimensionale Zellagglomerate, insbesondere Organoide, darin kultivierbar sind. Die Durchmesser der für Medikamententests besonders geeigneten Tumor- Organoide liegen beispielsweise zwischen 100 - 750 pm.
Zudem ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn in Schritt c) die Hydrogel-Strukturen depolymerisiert werden und die Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomerate, insbesondere Organoide oder Sphäroide, in der Kavität freigesetzt werden. Zur Depolymerisation wird ein Reagenz über den fluidischen Anschluss der Kavität zugeführt. Das Reagenz weist beispielsweise eine die Depolymerisierung hervorrufende oder unterstützende Temperatur auf.
Im Fall des Hydrogels Matrigel ist dieses depolymerisierende Reagenz beispielsweise die Lösung Corning™ Dispase (Corning) bzw. Corning™ cell recovery solution (Corning). Alternative Reagenzien sind Enzymlösungen, die beispielsweise Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher) enthalten. Ergänzend oder alternativ kann die Depolymerisierung des Matrigels™ (Corning) durch eine Senkung der Temperatur auf ca. 4°C erfolgen. Hierfür wird beispielsweise Kulturmedium mit einer Temperatur von ca. 4°C über die fluidischen Anschlüsse der Kavitäten und/oder den Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung zugeführt. Alternativ wird die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere die Kavität, auf eine Temperatur von ca. 4°C temperiert.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 : die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung mit einem Kanal und Kavitäten, die je einen fluidischen Anschluss aufweisen,
Fig. 2: die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen
Kartusche umfassend die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Figur 1 , und
Fig. 3: die schematische Darstellung eines Flussdiagramms eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung
In Figur 1 ist eine mikrofluidische Vorrichtung 10 zur Kultivierung von Zellen 9 dargestellt. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst einen Kanal 1 mit drei Kavitäten 5a, 5b, 5c, wobei die Kavitäten 5a, 5b, 5c sich ausgehend von einer Außenfläche des Kanals 1 ausstülpen. In Figur 1 ist die Anzahl der Kavitäten 5a, 5b, 5c lediglich beispielhaft dargestellt, vorzugsweise weist der Kanal 1 eine Vielzahl an Kavitäten 5a, 5b, 5c auf. Jede Kavität 5a, 5b, 5c weist einen mit einer Pumpeinheit verbundenen fluidischen Anschluss 55a, 55b, 55c auf, welcher vom Kanal 1 wegführt. Die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c weisen beispielsweise ein nicht dargestelltes integriertes Rückhalteelement und/oder Abmessungen von 5 - 75 pm auf, sodass die Hydrogel-Strukturen 3 größere Abmessungen aufweisen als die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c und diese nicht passieren und verlassen können. Die Pumpeinheit ist in Figur 1 nicht dargestellt. Der Kanal 1 weist eine Biegung 11 auf, wodurch der Kanal 1 im Bereich der Biegung 11 in eine innere Bogenfläche 12, eine neutrale Achse 13 und eine äußere Bogenfläche 14 aufweist. Die Kavitäten 5a, 5b, 5c sind in der Biegung des Kanals 1 an der äußeren Bogenfläche 14 angeordnet.
Vorzugsweise und nicht in Figur 1 dargestellt umfasst die Vorrichtung eine Einrichtung zur Temperierung des Kanals 1 und/oder der zumindest einen Kavität 5a, 5b, 5c.
Desweiteren kann der Kanal 1 und/oder die Kavitäten 5a, 5b, 5c zumindest teilweise optisch transparent ausgestaltet sein und eine nicht dargestellte Kontrolleinheit, insbesondere eine Kamera und/oder einer Mikroskopeinheit aufweisen.
Im Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kultivierung von Zellen 9 mittels der mikrofluidischen Vorrichtung 10 beschrieben. Hierbei werden beispielhaft für die die zumindest eine Zelle 9 umschließenden Mikropartikel 3 kugelförmige Hydrogel-Strukturen 3 und für die dreidimensionalen Zellagglomerate 7 Organoide 7 beschrieben. Als Hydrogel wird bevorzugt Matrigel™ (Corning) verwendet.
Die Hydrogel-Strukturen 3 werden so groß gewählt, dass ein bzw. mehrere Organoide 7, darin kultivierbar sind. Die Durchmesser der Organoide 7 liegen beispielsweise bei 100 - 750 pm.
In Figur 1 bilden die Kavitäten 5a, 5b, 5c unterschiedliche Schritte des Verfahrens ab. In der ersten Kavität 5a ist der erste Schritt a) des Verfahrens dargestellt, die zweite Kavität 5b zeigt den zweiten Verfahrensschritt b) und die dritte Kavität 5c bilden den dritten Schritt c) des Verfahrens ab.
Im ersten Schritt a) wird ein Medium, insbesondere ein Kulturmedium, mit kugelförmigen Hydrogel-Strukturen 3 über den Kanal 1 gefördert. Die Strömungsrichtung ist durch die Pfeile 15 angedeutet. Die Hydrogel-Strukturen 3 umschließen je eine Zelle 9 und werden mit der Flüssigkeitsströmung im Kanal 1 transportiert. Der Kanal 1 weist eine Biegung 11 auf. Beim Transport der Hydrogel-Strukturen 3 durch die Biegung 11 wirkt eine Zentrifugalkraft auf die Hydrogel-Strukturen 3 ein, welche diese in Richtung der äußeren Bogenfläche 14 des Kanals 1 , an welcher die Kavitäten 5a, 5b, 5c lokalisiert sind, transportiert und in diese hinein. Zusätzlich wird Medium über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c herausgefördert, dargestellt als Ausstrom 17, sodass ein Sog in Richtung der Kavitäten 5a, 5b, 5c entsteht, welcher die Hydrogel-Strukturen 3 in diese hineinzieht.
Vorzugsweise sind die Kavitäten 5a, 5b, 5c so dimensioniert, dass genau eine Hydrogel-Struktur 3 darin Platz findet und nachfolgende Hydrogel-Strukturen 3 zur nächsten freien Kavität 5a, 5b, 5c weitertransportiert werden. Alternativ und nicht in Figur 1 dargestellt können die Kavitäten 5a, 5b, 5c auch so dimensioniert sein, dass mehrere Hydrogel-Strukturen 3 von einer Kavität 5a, 5b, 5c aufgenommen werden.
In einem zweiten Schritt b) wird die Zelle 9 in der sich in der Kavität 5a, 5b, 5c befindlichen Hydrogel-Struktur 3 kultviert und wächst zu einem Organoid 7 heran. Hierbei wird beispielsweise Kulturmedium über den Kanal 1 für den Kultivierungsprozess bereitgestellt. Das Kulturmedium diffundiert in die Kavitäten 5a, 5b, 5c und in die Hydrogel-Strukturen 3 hinein. Die zur Kultivierung der Organoide 7 geeignete Temperatur, vorzugsweise ca. 37°C, wird durch eine Temperierung des Kanals 1 und/oder der Kavitäten 5a, 5b, 5c eingestellt. Über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c werden den Hydrogel-Strukturen 3 bzw. Zellen 9 während des Kultivierungsprozesses Flüssigkeiten genau dosiert zugeführt, dargestellt als Einstrom 19, und damit gezielt die Kultivierung der Zellen 9 zu Organoiden 7 beeinflusst. Diese Flüssigkeit ist ein Kulturmedium, beispielsweise mit einer veränderten Zusammensetzung und/oder umfassen Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe. Die Zuführung bzw. der Einstrom 19 der Flüssigkeit, kann hierbei kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten erfolgen. Bei einer Zugabe von Kulturmedium wird „verbrauchtes“ Kulturmedium durch „frisches“ ersetzt, so dass die Zellen 9 mit gelösten Nährstoffen und Gasen versorgt sind. Auf diese Weise wird ein Medienwechsel mikrofluidisch umgesetzt. Desweiteren kann beispielsweise ein Kulturmedium mit variiertem Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt zugeführt werden. Auf diese Weise ist es möglich hypoxische Kultivierungsbedingungen einzustellen. Während der Kultivierung wird beispielsweise über den fluidischen Anschluss 55a, 55b, 55c der Kavität 5a, 5b, 5c ein Flüssigkeitsvolumen aus dieser herausgefördert und auf Parameter, insbesondere den pH-Wert, die Konzentration von Glukose und/oder Laktat, den Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt und/oder das Vorhandensein und die Konzentration von Proteinen, insbesondere von Zytokinen untersucht.
In einem dritten Schritt c) wird zu einem bestimmten Zeitpunkt, beispielsweise bei Erreichen einer gewünschten Größe oder Morphologie der Organoide 7 der Kultivierungsprozess beendet. Hierfür werden einzelne oder alle Hydrogel- Strukturen 3 innerhalb der Kavitäten 5a, 5b, 5c depolymerisiert und aufgelöst, um die entstandenen Organoide 7 freizusetzen. Für die Depolymerisierung der Hydrogel-Strukturen 3 werden über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c geeignete flüssige Reagenzien, dargestellt als Einstrom 19, zugeführt. Ergänzend oder alternativ kann die Depolymerisierung des Hydrogels durch eine Senkung der Temperatur auf ca. 4°C erfolgen. Hierfür wird beispielsweise Kulturmedium mit einer Temperatur von ca. 4°C über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c und/oder den Kanal 1 zugeführt. Weiterhin alternativ oder zusätzlich kann hierzu auch die mikrofluidische Vorrichtung 10 auf 4°C temperiert werden. Die nach der Depolymerisierung aus den Hydrogel-Strukturen 3 freigesetzten Organoide 7 werden dann aus den Kavitäten 5a, 5b, 5c in den mikrofluidischen Kanal 1 transportiert. Hierfür wird beispielsweise ein Kulturmedium über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c eingebracht und über diesen Einstrom 19 eine Flüssigkeitsströmung in Richtung des Kanals 1 generiert. Abschließend werden die sich im mikrofluidischen Kanal 1 befindlichen Organoide 7 weitertransportiert und stehen für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte, insbesondere für eine Expansion oder Medikamententests, zur Verfügung. Alternativ und nicht in Figur 1 dargestellt, werden die Hydrogel- Strukturen 3 in den Kavitäten 5a, 5b, 5c zunächst nicht depolymerisiert, sondern als ganze Hydrogel-Strukturen 3 in den Kanal 1 geströmt.
In Figur 2 ist eine erfindungsgemäße Kartusche 100 dargestellt, welche die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß Figur 1 umfasst. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 ist beispielsweise auf einem Kunststoffsubstrat bzw. Chip untergebracht.
Figur 3 zeigt ein Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zur Kultivierung von Zellen 9 mittels der in Fig. 1 dargestellten mikrofluidischen Vorrichtung und den dort beschriebenen Ausführungsbeispielen und Verfahrensschritten.

Claims

Ansprüche
1. Mikrofluidische Vorrichtung (10) zur Kultivierung von Zellen (9), umfassend einen Kanal (1) mit zumindest einer Kavität (5a, 5b, 5c) zur Aufnahme zumindest eines Mikropartikels (3), welche sich ausgehend von einer Außenfläche des Kanals (1) ausstülpt, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Kavität (5a, 5b, 5c) einen mit einer Pumpeinheit verbundenen fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) aufweist, welcher von dem Kanal (1) wegführt.
2. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der fluidische Anschluss (55a, 55b, 55c) der zumindest einen Kavität (5a, 5b, 5c) ein integriertes Rückhalteelement und/oder Abmessungen von 5 - 75 pm aufweist.
3. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal (1) zumindest eine Biegung (11) aufweist, wobei die zumindest eine Kavität (5a, 5b, 5c) in der Biegung (11) des Kanals (1) an der äußeren Bogenfläche (14) angeordnet ist.
4. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (10) eine Einrichtung zur Temperierung des Kanals (1) und/oder der zumindest einen Kavität (5a, 5b, 5c) aufweist.
5. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal (1) und/oder die zumindest eine Kavität (5a, 5b, 5c) zumindest teilweise optisch transparent ausgestaltet ist und eine Kontrolleinheit, insbesondere eine Kamera und/oder einer Mikroskopeinheit umfasst.
6. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese weiterhin ein Reservoir umfasst, welches mit dem fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) der zumindest einen Kavität (5a, 5b, 5c) in fluidischer Verbindung steht, und in welchem ein Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe vorgelagert sind.
7. Mikrofluidisches Verfahren (500) zur Kultivierung von Zellen (9) mittels einer Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 -6 mit nachfolgenden Schritten: a) Fördern eines Mediums mit Mikropartikeln (3) über den Kanal (1), wobei ein Mikropartikel (3) zumindest eine Zelle (9) umschließt, und Einbringen zumindest eines Mikropartikels (3) in zumindest eine Kavität (5a, 5b, 5c) b) Kultivierung der zumindest einen Zelle (9) in dem sich in der Kavität (5a, 5b, 5c) befindlichen Mikropartikel (3), insbesondere zu einem dreidimensionalen Zellagglomerat (7), wobei eine dosierte Zuführung von einem Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen über den fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) der Kavität (5a, 5b, 5c) in diese erfolgt. c) Beenden der Kultivierung und Ausführen des zumindest einen Mikropartikels (3) oder der zumindest einen kultivierten Zelle (9), insbesondere des dreidimensionalen Zellagglomerats (7), aus der Kavität (5a, 5b, 5c).
8. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) das Einbringen des zumindest einen Mikropartikels (3) in die zumindest eine
Kavität (5a, 5b, 5c) aufgrund einer auf die Mikropartikel (3) einwirkenden Zentrifugalkraft erfolgt, welche aufgrund einer Biegung (11) des Kanals (1) bei dessen Durchströmung auftritt.
9. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) das Einbringen des zumindest einen Mikropartikels (3) in die zumindest eine Kavität (5a, 5b, 5c) strömungsinduziert durch ein Herausfördern des Mediums über den fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) der Kavität (5a, 5b, 5c) erfolgt.
10. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 7 - 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) ein Kulturmedium mit variiertem Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt zugeführt wird, insbesondere wobei hypoxische Kultivierungsbedingungen eingestellt werden.
11 . Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 7 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) während der Kultivierung über den fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) der Kavität (5a, 5b, 5c) ein Flüssigkeitsvolumen aus dieser herausgefördert und auf Parameter, insbesondere den pH-Wert, die Konzentration von Glukose und/oder Laktat, den Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt und/oder das Vorhandensein und die Konzentration von Proteinen, insbesondere von Zytokinen, untersucht wird.
12. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 7-11 , dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) das Beenden und/oder das Ausführen des zumindest einen Mikropartikels (3) oder der zumindest einen kultivierten Zelle (9), insbesondere des dreidimensionalen Zellagglomerats (7), aus der Kavität (5a, 5b, 5c) durch eine Flüssigkeitsströmung über den fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) der Kavität (5a, 5b, 5c) in Richtung des Kanals (1) erfolgt.
13. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 7-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikropartikel (3) zumindest eine Zelle (9) und/oder ein dreidimensionales Zellagglomerat (7) umfassende, insbesondere kugelförmige, Hydrogel-Strukturen (3) sind und/oder die dreidimensionalen Zellagglomerate (7) Organoide (7) oder Sphäroide sind.
14. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) die Hydrogel-Strukturen (3) depolymerisiert werden und die Zellen (9) und/oder dreidimensionalen Zellagglomerate (7), insbesondere Organoide (7) oder Sphäroide, in der Kavität (5a, 5b, 5c) freigesetzt werden, wobei zur Depolymerisierung ein Reagenz über den fluidischen Anschluss (55a, 55b, 55c) der Kavität (5a, 5b, 5c) zugeführt wird, insbesondere temperiert auf eine die Depolymerisierung hervorrufende oder unterstützende Temperatur.
15. Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 7-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegung der Mikropartikel (3) in der mikrofluidischen Vorrichtung (10) und die Positionierung der Mikropartikel (3) in den Kavitäten (5a, 5b, 5c) mittels Dielektrophorese und einem angelegten inhomogenen elektrischen Feld und/oder mittels Anlegen magnetischer Felder und magnetischem Labeling der Mikropartikel (3) und/oder mittels stehender Ultraschallwellen zur Erzeugung von Druckknoten, welche die Mikropartikel (3) anziehen und festhalten, erfolgt.
16. Kartusche (100), insbesondere mikrofluidische Kartusche, umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 -6.
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