EP4630059A1 - Nouveaux peptides et leur utilisation en tant que transporteurs pour l'internalisation de molécules d'intérêt dans des cellules cibles - Google Patents

Nouveaux peptides et leur utilisation en tant que transporteurs pour l'internalisation de molécules d'intérêt dans des cellules cibles

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Publication number
EP4630059A1
EP4630059A1 EP23836896.3A EP23836896A EP4630059A1 EP 4630059 A1 EP4630059 A1 EP 4630059A1 EP 23836896 A EP23836896 A EP 23836896A EP 4630059 A1 EP4630059 A1 EP 4630059A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
sequence
protein
polypeptide
interest
Prior art date
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Pending
Application number
EP23836896.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Luc Lenormand
Déborah REYNAUD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Polytechnique de Grenoble
Universite Grenoble Alpes
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Polytechnique de Grenoble
Universite Grenoble Alpes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Polytechnique de Grenoble, Universite Grenoble Alpes filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4630059A1 publication Critical patent/EP4630059A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to the field of peptide transporters for the internalization of molecules of interest into target cells. It relates more particularly to new peptides or nucleic acids encoding such peptides, and their uses as transporters for the internalization of molecules of interest into target cells. It also aims at the combination of such peptides with molecules of interest, in particular polypeptides of interest and the use of such a combination in the treatment, diagnosis or prevention of pathologies, in particular cancer.
  • the invention further relates to a fusion protein comprising a new peptide having the cell-penetrating property (called “cell-penetrating peptide” or “Cell-penetrating peptide, CPP”) which is the subject of the present invention and a polypeptide of interest, as well as a nucleic acid encoding such a fusion protein, an expression vector comprising nucleic acids encoding such a fusion protein, but also a host cell comprising such an expression vector.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a new peptide which is the subject of the present invention and a polypeptide of interest.
  • PTD Protein Transduction Domain
  • CPP Cell-Penetrating Peptides
  • the ZEBRA protein is a transcriptional activator from the Epstein-Barr virus. It is a 245 amino acid protein comprising an N-terminal transactivation region (TAD), a DNA binding domain (DBD) and a leucine zipper dimerization region (DIM). The C-terminal domain of said protein interacts with the leucine zipper domain leading to the formation of a hydrophobic pocket which stabilizes the ZEBRA protein/DNA complex.
  • TAD N-terminal transactivation region
  • DBD DNA binding domain
  • DIM leucine zipper dimerization region
  • Patent application WO2011135222 discloses the use of a peptide fragment from the ZEBRA protein (from the amino acid in position 170 to the amino acid in position 220) as a transporter peptide making it possible to carry out a internalization of polypeptides of interest at low concentrations and to avoid the degradation of these polypeptides of interest by a direct penetration mechanism independent of endosomes.
  • the cell penetrating peptide used is a sequence fragment of the ZEBRA protein (from amino acid at position 178 to amino acid at position 220) called MD11.
  • the present invention aims to provide new peptides as transporters intended for the internalization of molecules of interest into target cells.
  • These new peptides are mutants of a peptide fragment of the ZEBRA protein.
  • This fragment whose sequence is the sequence SEQ ID NO: 1 corresponding to the peptide sequence of the ZEBRA protein going from the amino acid in position 178 to the amino acid in position 220 is known and will be called MD11 in the remainder of the this description.
  • It is a cell-penetrating peptide (CPP for “cell-penetrating peptide” in Anglo-Saxon terminology) also called “transport peptide” or “transporter peptide” or more simply “transporter” or “transport vector » (“Delivery system” in Anglo-Saxon terminology).
  • the present invention aims at a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • Such peptides can be qualified as transporter peptides and are intended for the internalization of molecules of interest into target cells. They have the advantage of benefiting from a cell penetration capacity at least equivalent to or greater than that of the transport peptide MD11. They are also present in cells even when they are treated with low concentrations of the order of nanomolars, which corroborates direct and unmediated penetration into cells for the molecules that they can transport. Finally, no toxicity of the peptides alone for the target cells could be demonstrated.
  • Cell penetration capacity means the efficiency of internalization of molecules of interest, that is to say the percentage of treated cells containing the molecules of interest in their cytoplasm. This internalization efficiency is based on the detection of molecules of interest in the transduced cells by means, for example, of microscopy or flow cytometry or any other imaging techniques making it possible to visualize internalization at the molecular level, for example the transfer of energy by resonance of bioluminescence (BRET for “Bioluminescence Resonance Energy Transfer” in Anglo-Saxon terminology), energy transfer by Forster type resonance (FRET for “Forster Resonance Energy Transfer” in Anglo-Saxon terminology, electron microscopy, force microscopy atomic (AFM for “Atomic Force Microscopy” in Anglo-Saxon terminology), optogenetics, etc.
  • BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer
  • FRET Force Microscopy atomic
  • transporter designates a molecule capable of transporting and transferring another different molecule across the plasma membrane to allow it to enter the cell.
  • the expression “the internalization of a molecule of interest into the target cells” designates the passage of a molecule of interest from the outside of a target cell to the interior thereof.
  • the present invention aims at a nucleic acid molecule encoding a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • nucleic acid sequences encoding the peptides represented by the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 as described above can be deduced from these amino acid sequences according to the principle of degeneration of the genetic code known to those skilled in the art.
  • the present invention aims at an expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • an expression vector can be of any type known in itself for a implementation in genetic engineering, in particular a plasmid, a cosmid, a virus, a bacteriophage, containing the elements necessary for the transcription and translation of the sequence coding the peptide according to the invention.
  • the vector further comprises the elements of genetic engineering, in particular the origins replication and promoters, making it possible to control the autonomous replication of the vector in the host organism and the specific expression of the peptides as described above.
  • the present invention targets a host cell comprising a nucleic acid molecule encoding a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, or an expression vector comprising such a nucleic acid molecule.
  • the host cells can be for example prokaryotic cells such as E.
  • co t or Bacillus or eukaryotic cells such as yeasts in particular Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, filamentous fungi, in particular Trichoderma reesei and Aspergillus niger, cells of insect using Baculoviruses, or cell lines such as CHO, HEK 293, Cos or Per.C6.
  • yeasts in particular Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris
  • filamentous fungi in particular Trichoderma reesei and Aspergillus niger
  • cells of insect using Baculoviruses or cell lines such as CHO, HEK 293, Cos or Per.C6.
  • the cells capable of being the target cells of an internalization process implemented by a transporter which is the subject of the present invention are preferably chosen from eukaryotic cells, in particular human cells.
  • human cells may be tumor cells, such as melanoma cells, breast cancer cells, glioblastoma cells, colon cancer cells, lymphoma cells.
  • human cells can also be normal cells including fibroblasts, epithelial cells, lymphocytes, dendritic cells, muscle cells such as myocytes, myoblasts and myotubes for example....
  • These cells humans can also be differentiated somatic cells which will be brought to dedifferentiation to form induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • peptide sequences such as guide peptides or targeting peptides (respectively “homing peptides” and “target peptides” in English terminology), nuclear localization signals or NLS (for “nuclear localization signal”). » in Anglo-Saxon terminology), can be grafted onto the carrier according to the invention.
  • the present invention aims at a combination comprising a transporter and a molecule of interest, said transporter being a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the molecule of interest is preferably a molecule of biotechnological, diagnostic or therapeutic interest.
  • a molecule of interest is preferably chosen from polypeptide, DNA, RNA, oligonucleotides, siRNA, shRNA miRNA, antisense RNA, or peptide nucleic acids (PNA).
  • the present invention aims at a fusion protein comprising a transporter which is a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and a molecule of interest which is a polypeptide of interest.
  • a transporter which is a peptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and a molecule of interest which is a polypeptide of interest.
  • fusion protein is meant a recombinant or synthetic polypeptide containing at least two peptides, derived from two different proteins, one linked to the other directly by peptide bond, or by a peptide linker, for example GSGG.
  • the polypeptide of interest may be linked to the N-terminal or C-terminal part of the transporter.
  • the fusion protein comprises or consists of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 61.
  • the present invention targets a nucleic acid molecule encoding the fusion protein which is the subject of the present invention.
  • the present invention aims at an expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding the fusion protein which is the subject of the present invention.
  • an expression vector can be of any type known in itself for implementation in genetic engineering, in particular a plasmid, a cosmid, a virus, a bacteriophage, containing the elements necessary for the transcription and translation of the sequence encoding the fusion protein according to the invention.
  • the vector further comprises genetic engineering elements, in particular the origins of replication and the promoters, making it possible to control the autonomous replication of the vector in the host organism and the specific expression of fusion proteins as described above.
  • the present invention targets a host cell comprising a nucleic acid molecule coding for the fusion protein which is the subject of the present invention or an expression vector comprising such a nucleic acid molecule.
  • the host cells can be for example prokaryotic cells such as E. co t or Bacillus, or eukaryotic cells such as yeasts in particular Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, filamentous fungi, in particular Trichoderma reesei and Aspergillus niger, cells of insect using Baculoviruses, or cell lines such as CHO, HEK 293, Cos, Per.C6.
  • the molecule of interest is linked to the transporter by a covalent or non-covalent bond, such as an ionic bond, a bond hydrogen, or a hydrophobic bond.
  • a covalent or non-covalent bond such as an ionic bond, a bond hydrogen, or a hydrophobic bond.
  • the polypeptide of interest is linked to the transporter according to the invention by a direct peptide bond.
  • the present invention aims at a pharmaceutical composition comprising a combination or a fusion protein which is the subject of the present invention.
  • the composition comprises an excipient and/or a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the choice of a excipient and/or a pharmaceutically acceptable vehicle is known to those skilled in the art.
  • the present invention targets the combination or the fusion protein or the pharmaceutical composition which is the subject of the present invention for its use in the treatment, diagnosis or prevention of cancers such as melanomas, breast cancer, tumors brain, glioblastomas, colon cancer, lymphomas.
  • cancers such as melanomas, breast cancer, tumors brain, glioblastomas, colon cancer, lymphomas.
  • the molecule of interest comprises or consists of a polypeptide of interest chosen from a polypeptide encoding the eGFP protein represented by the sequence SEQ ID NO: 17, a polypeptide encoding the elF3f protein represented by the sequence SEQ ID NO: 18, a polypeptide encoding the FERM protein represented by the sequence SEQ ID NO: 19, a polypeptide encoding all or part of the MDA-7 protein represented respectively by the sequences SEQ ID NO: 20 (entire MDA-7 protein) and SEQ ID NO: 21 (truncated MDA-7 protein) and a polypeptide represented by a sequence having 80%, in particular 90% , particularly 95% sequence identity with one of the sequences SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.
  • the percentage identity of peptide sequences is determined by direct comparison of two sequences of polypeptide molecules, by determining the number of identical amino acid residues in the two sequences, then dividing it by the number of residues d amino acids of the longer sequence of the two, and multiplying the result by 100.
  • nucleic acid sequences encoding the polypeptides represented by the sequences SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 as described below above can be deduced from these amino acid sequences of the peptides according to the principle of degeneration of the genetic code known to those skilled in the art.
  • Figure 1 illustrates a histogram presenting the percentages of fluorescent HEK, B16-Ova and beta-TC-6 cells after treatment with fluorescent fusion proteins which are the subject of the present invention
  • FIG. 2 Figure 2 illustrates images of HEK and B16-Ova cells observed under a fluorescence microscope after treatment with fluorescent fusion proteins which are the subject of the present invention
  • FIG. 3 Figure 3 illustrates viability curves of B16-Ova and HEK cells as a function of the treatment dose after 24h and 48h making it possible to calculate I IC50 of the potentially therapeutic fusion proteins which are the subject of the present invention.
  • nucleic acid sequences encoding the peptides and polypeptides represented by the amino acid sequences as described below can be deduced from these amino acid sequences according to the principle of degeneration of the genetic code known to those skilled in the art.
  • MDmut2 which corresponds to the sequence RREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
  • MDmut3 which corresponds to the sequence KRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL,
  • MDmut3DelCys which corresponds to the sequence KRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL,
  • MDmut4 which corresponds to the sequence RREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL
  • MDmut4DelCys which corresponds to the sequence RREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL.
  • each MDmut mutant CPP is obtained by PCR and inserted into the expression vector pET15b which makes it possible to express in bacteria, the peptides whose N-terminal end is linked to a tag of 6-histidine, all plasmids being constructed according to the same organization of genetic engineering elements surrounding the CPP sequence.
  • the MD11 sequence numbered #1 and corresponding to the sequence KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ (SEQ ID NO: 1) is also inserted into an expression plasmid pET_15b comprising the same organization of genetic engineering elements as the plasmids comprising the MDmut mutants .
  • His Tag polyhistidine tag
  • TEV seq Tev protease cleavage sequence
  • MMP2 cleavage site metalloprotease 2 cleavage sequence (tumor targeting)
  • MD Seq the MD11 or MDmut sequence
  • the plasmids were all verified by double-direction sequencing at the level of the insertion sequence of the genetic elements coding for the fusion proteins of interest.
  • polypeptides of the proteins eGFP for “enhanced green fluorescent protein” in Anglo-Saxon terminology
  • elF3f for “eukaryotic Translation Initiation Factor 3 subunit F” in Anglo-Saxon terminology
  • FERM corresponding to the FERM domain
  • MDA-7 for “Melanoma Differentiation Associated 7” in Anglo-Saxon terminology
  • the inventors have these sequences (SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 21) flanked by the XhoI and BamHI restriction sites in a pET 15b plasmid. They were previously sequenced using the commercial primer pET_RP and their restriction profile was also analyzed by single and double digestions in order to ensure the possibility of extracting them without impacting the sequence which must be translated.
  • the 8 Mdmut plasmids and the 5 donor plasmids of the polypeptides of interest were transformed into E. coli XL10 Gold bacteria.
  • 25 ⁇ l of bacteria were transformed with 50 ng of plasmids by heat shock for 30 min in ice then 40 sec at 42°C before passing through ice.
  • This step was followed by liquid culture in 100pL of SOC culture medium at 37°C for 1 hour then spreading on a Petri dish containing LB (Lysogeny Broth) medium - Agar
  • the plasmids thus obtained were prepared for subcloning after double digestion with the restriction enzymes XhoI and BamHI. 2 pg of plasmid were therefore digested with 5 units of each restriction enzyme for 3 hours at 37°C. The migration of the digestion products in a 0.6% agarose gel - TAE 0.5X - Gel Red 1 Nagel according to the manufacturer's protocol.
  • the MDmut and MD11 plasmids which can be described as recipients, gave their backbone containing the CPP-mutant or MD11 sequences and the plasmids comprising the polypeptides of interest, qualified as donors, gave their insert containing the sequence polypeptides of interest.
  • the inserts corresponding to the polypeptides of interest could be subcloned into each of the 8 MDmut plasmids, thus creating a new bank of 40 recombinant plasmids allowing the synthesis of fusion proteins.
  • ligation was carried out with 3 molar folds of each polypeptide insert of interest and 50 ng of mutant plasmid using a T4 DNA ligase in 10 min at 22°C. This step was followed by the transformation of 25pL of XL10 Gold bacteria with half of the ligation product according to the same protocol as previously cited.
  • the colonies transformed by the recombinant plasmids were preselected using colony PCRs.
  • a ready-to-use 2X commercial enzyme was used by diluting 10 LIM of sense and antisense primers in half in sterile water.
  • New E. coli XL10 Gold bacteria were then retransformed from the plasmid samples validated by sequencing. This new transformation allowed the constitution of a glycerol stock (freezing at - 80°C of 750 pJ of overnight culture of XL10 bacteria with 25% sterile glycerol) and a stock of concentrated recombinant plasmids, and purified by Use of the Macherey Nagel “midiprep” kit according to the manufacturer's protocol.
  • the organization of the genetic engineering elements is as follows in the 5' to 3' direction:
  • His Tag polyhistidine tag
  • TEV seq Tev protease cleavage sequence
  • MMP2 cleavage site metalloprotease 2 cleavage sequence (tumor targeting)
  • MD Seq the MD11 sequence (SEQ ID NO: 1) or an MDmut sequence (SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 8)
  • PolyPep the sequence of the polypeptide of interest (SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 21)
  • the lysis of the bacteria was optimal in 2 stages in a MOPS - NaCI - imidazole buffer.
  • chemical lysis with lysozyme at 1 mg/ml for 30 min on a wheel for gentle shaking was carried out at 4°C to preserve protein integrity.
  • mechanical lysis by 5 cycles of 30 sec of sonication at 70% power followed, the bacterial lysates having been put back on ice for a minimum of 30 sec between each sonication.
  • the proteins were purified on a Nickel column by competition with imidazole (MOPS 20mM - NaCl 250mM - Cysteine 15mM - Urea 8M - Imidazole 500mM), the proteins were renatured by the dropwise dilution method (Na Citrate 50mM - MgCl22mM - DTT 2mM - NaCI 50mM - L-Argine 500mM - Tween 200.5%) then dialyzed in 2 stages (Na Citrate 50mM - MgCl22mM - DTT 2mM - NaCI 50mM - L-Argine 50mM - N-Lauryl Sarcosine 0.01 %; Na Citrate 50mM - NaCI 50mM - Glycerol 10%) to be in solution in a buffer compatible with in cellulo and in vivo experiments.
  • the purity and quality of the proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting with the same protocol as that used for the fusion proteins comprising the eGFP protein and described in the previous section.
  • the treatment samples were assayed by the microBCA method according to the manufacturer's protocol.
  • fusion proteins comprising a mutant CPP (MDmut) or MD11 and the MDA-7 polypeptide (SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 53) or the truncated MDA-7 polypeptide (SEQ ID NO: 54 to SEQ ID NO: 61) are defined below.
  • the lysis of the bacteria was optimal in 2 stages in a 50mM Tris - 250mM NaCl - 5mM imidazole buffer.
  • chemical lysis with lysozyme at 1 mg/ml for 30 min on a wheel for gentle shaking was carried out at 4°C to preserve protein integrity.
  • mechanical lysis by 5 cycles of 30 sec of sonication at 70% power followed, the bacterial lysates having been put back on ice for a minimum of 30 sec between each sonication.
  • the treatments with fusion proteins comprising a mutant CPP and the eGFP polypeptide were compared to the treatment with eGFP alone, not linked to a transporter, and to the treatments by the fusion proteins comprising either the CPP MD11 (SEQ ID NO: 1) without the new genetic engineering elements and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 17), or comprising the CPP MD11 with the new genetic engineering elements and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 22).
  • HEK293, B16-Ova and beta-TC-6 cells were seeded then treated at approximately 60% confluence with 200 nM of respective fusion proteins in the absence of bovine serum for 4 hours. They were then supplemented with 5% bovine serum and incubated overnight. The next day the cells were trypsinized then washed with 1X PBS and passed through FACS for analysis.
  • An untreated cell sample supplemented with Propridium lodide at 1.g/ml made it possible to calibrate the blank and the range of living cells.
  • a minimum of 25,000 live cells were analyzed for green fluorescence.
  • MD11 -eGFP corresponds to the control fusion protein comprising the MD11 CPP sequence but without the genetic engineering elements (SEQ ID NO: 1) and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 17);
  • A-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the CPP MD11 sequence with the genetic engineering elements and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 22);
  • - #2B-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the CPP MDmutl DelCys sequence and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 23);
  • - #3C-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the MDmut2 CPP sequence and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 24);
  • - #4D-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the CPP sequence MDmut2DelCys and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 25);
  • - #5E-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the MDmut3 CPP sequence and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 26);
  • - #6F-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the CPP sequence MDmut3DelCys and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 27);
  • - #7G-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the MDmut4 CPP sequence and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 28);
  • - #8H-eGFP corresponds to the fusion protein comprising the CPP sequence MDmut4DelCys and the eGFP polypeptide (SEQ ID NO: 29).
  • the fusion proteins comprising a mutant CPP and the eGFP polypeptide have a preserved cell penetration capacity, including a non-significant upward trend for #3C-eGFP, #5E-eGFP, #6F- eGFP and #7G-eGFP compared to the control (MD11 -eGFP) with a rate of GFP-positive cells between 73% and 82% compared to 57%.
  • B16-Ova (B16) cells the penetration capacity of the #3C-eGFP, #5E-eGFP, #6F-eGFP and #7G-eGFP mutants is equivalent to that of MD11 - eGFP.
  • the cell penetration capacity of the #2B-eGFP, #4D-eGFP and #8H-eGFP mutants is significantly lower between 15% and 20% compared to more than 41%.
  • the penetration capacity of the mutants #1A-eGFP, #5E-eGFP and #7G-eGFP is significantly higher between 21% and 30% compared to 15% for MD11-eGFP.
  • the penetration capacity of the #2B-eGFP, #3C-eGFP, #4D-eGFP, #6F-eGFP and #8H-eGFP mutants is significantly lower between 1% and 8% compared to 15%.
  • the same cells (HEK293 and B16-Ova) were also seeded on glass slides equipped with culture chambers then treated with the fusion proteins MD11 -eGFP, #1 A-eGFP, #3C- eGFP, #5E-eGFP, #7G-eGFP or 4h pdt buffer in the absence of serum.
  • the cells were then washed with 1X PBS then with heparin and fixed with Paraformaldehyde and observed under a fluorescence microscope. 5 successive focal planes spaced 2 pm apart were captured in order to highlight the intracellular localization of the proteins.
  • Viability was tested with Prestoblue®. For this, the cells were seeded in 96-well plates with black edges and transparent bottoms then, the next day, treated to 60% confluence with 0.25X fetal calf serum (FBS). In order to calculate the median inhibitory concentration (IC50) of each fusion protein, they were diluted over a wide concentration range between 15 and 100 nM and incubated for 24 or 48 hours.
  • FBS fetal calf serum
  • - 3E corresponds to the fusion protein comprising the sequence of CPP MDmut2 and the elF3f polypeptide (SEQ ID NO: 32);
  • - 5E corresponds to the fusion protein comprising the CPP MDmut3 sequence and the elF3f polypeptide (SEQ ID NO: 34);
  • - 7E corresponds to the fusion protein comprising the sequence of the CPP MDmut4 and the elF3f polypeptide (SEQ ID NO: 36).

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux peptides de pénétration cellulaire comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. L'invention concerne en outre des protéines de fusion comprenant lesdits peptides et une molécule d'intérêt pharmaceutique, diagnostic ou biotechnologique.

Description

Description
Titre de l'invention : Nouveaux peptides et leur utilisation en tant que transporteurs pour l'internalisation de molécules d'intérêt dans des cellules cibles
Domaine technique de l'invention
[0001] L’invention relève du domaine des transporteurs peptidiques pour l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Elle concerne plus particulièrement des nouveaux peptides ou acides nucléiques codant pour de tels peptides, et leurs utilisations en tant que transporteurs pour l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Elle vise également la combinaison de tels peptides avec des molécules d’intérêt, notamment des polypeptides d’intérêt et l’utilisation d’une telle combinaison dans le traitement, le diagnostic ou la prévention de pathologies, notamment le cancer. L’invention concerne en outre une protéine de fusion comprenant un nouveau peptide ayant la propriété de pénétration cellulaire (dit « peptide de pénétration cellulaire » ou « Cell-penetrating peptide, CPP ») objet de la présente invention et un polypeptide d’intérêt, ainsi qu’un acide nucléique codant pour une telle protéine de fusion, un vecteur d’expression comprenant des acides nucléiques codant une telle protéine de fusion, mais aussi une cellule hôte comprenant un tel vecteur d’expression. Enfin, l’invention vise également une composition pharmaceutique comprenant un nouveau peptide objet de la présente invention et un polypeptide d’intérêt.
Technique antérieure
[0002] Les médicaments issus de biotechnologies, aussi appelés biomédicaments ou médicaments biologiques, ont une place importante dans le traitement des pathologies humaines. Ils comprennent notamment les protéines thérapeutiques (enzymes, hormones de croissance, anticorps monoclonaux, facteurs de croissance, vaccins recombinants, ...), les acides nucléiques (ADN, siARN, ARNm, oligonucléotides, ...), les peptides et les dérivés tels que les acides nucléiques peptidiques (ANP). [0003] Dans certains cas, il est nécessaire d’utiliser des transporteurs pour que ces biomédicaments soient internalisés dans des cellules cibles. L’internalisation de molécules thérapeutiques dans des cellules fait l’objet de nombreuses recherches dans le but de trouver de nouveaux transporteurs, d’améliorer l’efficacité des transporteurs connus mais aussi des molécules thérapeutiques transportées, d’améliorer leur ciblage au niveau des cellules et de diminuer la dose efficace de certains traitements afin de diminuer le risque de toxicité.
[0004] Plusieurs familles de peptides transporteurs ont déjà été mis en évidence. Ces peptides naturels ou synthétiques appelés PTD (pour « Protein Transduction Domain » en terminologie anglo-saxonne) ou CPP (pour « Cell-Penetrating Peptides » en terminologie anglo-saxonne) possèdent la capacité de transporter et transférer dans les cellules des molécules telles que des peptides ou des acides nucléiques selon différents mécanismes d’internalisation cellulaires possible comme l’endocytose, la macropinocytose ou la formation de pores membranaires par exemple.
[0005] Dans leur publication de 2008 “Expression and purification of Zebra Fusion Proteins and Applications for the Delivery of Macromolecules into Mammalian Cells” dans la revue Current Protocols in Protein Science, 54 : 18.11.1 - 18.11.29, Lenormand et Rothe décrivent une méthode de production de protéines de fusion comprenant un segment de la protéine ZEBRA et la protéine eGFP ou la p-galactosidase. Lesdites protéines de fusion sont capables d’être internalisées dans les cellules HeLa à une concentration de 0,01 pM à 0,3 pM.
[0006] La protéine ZEBRA est un activateur transcriptionnel issu du virus Epstein- Barr. C’est une protéine de 245 acides aminés comprenant une région de transactivation en N-terminal (TAD), un domaine de liaison à l'ADN (DBD) et une région de dimérisation (DIM) de type leucine zipper. Le domaine C- terminal de ladite protéine interagit avec le domaine leucine zipper conduisant à la formation d'une poche hydrophobe qui stabilise le complexe protéine ZEBRA/ADN.
[0007] Jusqu'à présent, les voies d'internalisation empruntées par les peptides de transport, connus de l'homme du métier, telles que l'endocytose et la macropinocytose, nécessitaient une dépense d'énergie importante afin de réaliser ce mécanisme de pénétration intracellulaire. De plus, le mécanisme d’endocytose conduit à l’internalisation des molécules par l’intermédiaire des endosomes dont le contenu subit une dégradation partielle. Seule, une petite fraction des peptides transportés est relarguée dans le cytosol, après rupture de la membrane des endosomes, leur permettant d'exercer leur action au niveau intracellulaire. Par conséquent, à l'échelle de production industrielle, afin d'assurer l'efficacité de la transduction de polypeptides d'intérêt, il est nécessaire de produire une grande quantité de transporteur et de polypeptides d'intérêt. Cela exige parfois une procédure de production ou de purification lourde qui n’est pas réalisable pour tous les types de polypeptides d'intérêt. Par ailleurs, pour certains polypeptides d’intérêt, il est nécessaire de limiter la quantité administrée en raison des risques de toxicité. Il apparait donc nécessaire d’utiliser des polypeptides de transport plus efficaces dans leur capacité de pénétration cellulaire afin de limiter ces risques.
[0008] La demande de brevet WO2011135222 divulgue l’utilisation d’un fragment peptidique issue de la protéine ZEBRA (de l’acide aminé en position 170 à l’acide aminé en position 220) en tant que peptide transporteur permettant d’effectuer une internalisation de polypeptides d’intérêt à des concentrations faibles et d’éviter la dégradation de ces polypeptides d’intérêt par un mécanisme de pénétration direct indépendant des endosomes.
[0009] La publication “MD11 mediated delivery of recombinant elF3f induces melanoma and colorectal carcinoma cell death” de R. MARCHIONE et al. en 2015 divulgue l’utilisation d’un complexe formé de la protéine elF3f fusionnée avec un peptide de pénétration cellulaire pour augmenter la quantité intracellulaire disponible de protéine elF3f dans les cellules cancéreuses et activer leur apoptose. Le peptide de pénétration cellulaire utilisé est un fragment de séquence de la protéine ZEBRA (de l’acide aminé en position 178 à l’acide aminé en position 220) appelé MD11 .
[0010] Il persiste encore aujourd’hui un besoin de trouver de nouveaux peptides transporteurs dont le potentiel de pénétration cellulaire est amélioré et dont la production est facilitée, ceux-ci devant permettre de transporter, à une concentration faible, avec une haute efficacité et une meilleure affinité, des molécules d'intérêt dans les cellules cibles tout en garantissant leur bonne stabilité et faible toxicité dans lesdites cellules. Présentation de l'invention
[0011] La présente invention a pour objectif de fournir de nouveaux peptides comme transporteurs destinés à l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Ces nouveaux peptides sont des mutants d’un fragment peptidique de la protéine ZEBRA. Ce fragment dont la séquence est la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence peptidique de la protéine ZEBRA allant de l’acide aminé en position 178 à l’acide aminé en position 220 est connu et sera appelé MD11 dans la suite de la présente description. Il s’agit d’un peptide de pénétration cellulaire (CPP pour « cell- penetrating peptide » en terminologie anglo-saxonne) aussi appelé « peptide de transport » ou encore « peptide transporteur » ou plus simplement « transporteur » ou « vecteur de transport » (« Delivery system » en terminologie anglo-saxonne).
[0012] A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
[0013] De tels peptides peuvent être qualifiés de peptides transporteurs et sont destinés à l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Ils ont pour avantage de bénéficier d’une capacité de pénétration cellulaire au moins équivalente ou supérieure à celle du peptide transport MD11. Ils sont par ailleurs présents dans les cellules même lorsqu’elles sont traitées avec de faibles concentrations de l’ordre du nanomolaire ce qui corrobore une pénétration directe et sans intermédiaire dans les cellules pour les molécules qu’ils peuvent transporter. Enfin, aucune toxicité des peptides seuls pour les cellules cibles n’a pu être mise en évidence.
[0014] On entend par capacité de pénétration cellulaire l'efficacité d'internalisation de molécules d'intérêt, c’est à dire le pourcentage de cellules traitées contenant les molécules d'intérêt dans leur cytoplasme. Cette efficacité d'internalisation repose sur la détection des molécules d'intérêt dans les cellules transduites au moyen, par exemple, de la microscopie ou de la cytométrie en flux ou toutes autres techniques d’imagerie permettant de visualiser l’internalisation au niveau moléculaire, par exemple le transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET pour « Bioluminescence Resonance Energy Transfer » en terminologie anglo-saxonne), le transfert d’énergie par résonnance de type Fôrster (FRET pour « Forster Resonance Energy Transfer » en terminologie anglo-saxonne, la microscopie électronique, la microscopie à force atomique (AFM pour « Atomic Force Microscopy » en terminologie anglo-saxonne), l’optogénétique,....
[0015] L'expression « transporteur » désigne une molécule capable de transporter et de transférer une autre molécule différente à travers la membrane plasmique pour lui permettre de pénétrer dans la cellule.
[0016] L’expression « l’internalisation d’une molécule d’intérêt dans les cellules cibles » désigne le passage d’une molécule d’intérêt de l’extérieur d’une cellule cible à l’intérieur de celle-ci.
[0017] Selon un deuxième aspect la présente invention vise une molécule d’acide nucléique codant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
[0018] Les séquences d’acides nucléiques codant les peptides représentés par les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 tels que décrit ci-dessus peuvent être déduites à partir de ces séquences d’acides aminés selon le principe de la dégénérescence du code génétique connu de l’homme du métier.
[0019] Selon un troisième aspect la présente invention vise un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. Un tel vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en œuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant le peptide selon l’invention.
[0020] Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le vecteur comporte en outre les éléments de génie génétique, en particulier les origines de réplication et les promoteurs, permettant de contrôler la réplication autonome du vecteur dans l’organisme hôte et l’expression spécifique des peptides tels que décrits ci-dessus.
[0021] Selon un quatrième aspect la présente invention vise une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique codant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8, ou un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique. Les cellules hôtes peuvent être par exemple des cellules procaryotes telles que E. co t ou les Bacillus, ou des cellules eucaryotes telles que les levures notamment Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris, les champignons filamenteux, notamment Trichoderma reesei et Aspergillus niger, les cellules d’insecte en utilisant les Baculovirus, ou des lignées cellulaires telles que CHO, HEK 293, Cos ou Per.C6.
[0022] Selon un cinquième aspect la présente invention vise l’utilisation d’un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 ou d’une molécule d’acide nucléique codant pour un tel peptide ou d’un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou d’une cellule hôte comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou un tel vecteur d’expression, pour l’obtention d’un transporteur destiné à l'internalisation d'une molécule d'intérêt dans des cellules cibles.
[0023] Les cellules susceptibles d'être les cellules cibles d'un processus d'internalisation mis en œuvre par un transporteur objet de la présente invention sont de préférence choisies parmi des cellules eucaryotes, notamment des cellules humaines. Ces cellules humaines peuvent être des cellules tumorales, telles que des cellules de mélanomes, des cellules de cancer du sein, des cellules de glioblastomes, des cellules de cancer du côlon, des cellules de lymphomes. Ces cellules humaines peuvent être également des cellules normales incluant des fibroblastes, cellules épithéliales, lymphocytes, cellules dendritiques, cellules musculaires comme les myocytes, les myoblastes et les myotubes par exemple.... Ces cellules humaines peuvent être également des cellules somatiques différenciées qui seront amenées à la dédifférenciation pour former des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Pour cibler certaines lignées de cellules, des séquences peptidiques comme des peptides de guidage ou peptide de ciblage (respectivement « homing peptides » et « target peptides » en terminologie anglo-saxonne), des signaux de localisation nucléaire ou NLS (pour « nuclear localization signal » en terminologie anglo-saxonne), peuvent être greffées sur le transporteur selon l'invention.
[0024] Selon un sixième aspect la présente invention vise une combinaison comprenant un transporteur et une molécule d’intérêt, ledit transporteur étant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
[0025] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention la molécule d’intérêt est de préférence une molécule d’intérêt biotechnologique, diagnostique ou thérapeutique. Une telle molécule d'intérêt est de préférence choisie parmi polypeptide, ADN, ARN, oligonucléotides, siARN, shARN miARN, ARN antisens, ou des acides nucléiques peptidiques (ANP).
[0026] Selon un septième aspect la présente invention vise une protéine de fusion comprenant un transporteur qui est un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8, et une molécule d’intérêt qui est un polypeptide d’intérêt.
[0027] Par « protéine de fusion », on entend un polypeptide recombinant ou synthétique contenant au moins deux peptides, issus de deux protéines différentes, l’un lié à l’autre directement par liaison peptidique, ou par un linker peptidique, par exemple GSGG. Le polypeptide d’intérêt peut être lié à la partie N-terminale ou C-terminale du transporteur.
[0028] Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la protéine de fusion comprend ou consiste en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47 à SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 55 à SEQ ID NO : 61 . [0029] Selon un huitième aspect la présente invention vise une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion objet de la présente invention.
[0030] Selon un neuvième aspect la présente invention vise un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion objet de la présente invention. Un tel vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en œuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant la protéine de fusion selon l’invention.
[0031] Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le vecteur comporte en outre les éléments de génie génétique, en particulier les origines de réplication et les promoteurs, permettant de contrôler la réplication autonome du vecteur dans l’organisme hôte et l’expression spécifique des protéines de fusion telles que décrites ci-dessus.
[0032] Selon un dixième aspect la présente invention vise une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion objet de la présente invention ou un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique. Les cellules hôtes peuvent être par exemple des cellules procaryotes telles que E. co t ou les Bacillus, ou des cellules eucaryotes telles que les levures notamment Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris, les champignons filamenteux, notamment Trichoderma reesei et Aspergillus niger, les cellules d’insecte en utilisant les Baculovirus, ou des lignées cellulaires telles que CHO, HEK 293, Cos, Per.C6.
[0033] Dans des modes de réalisation particulier de la combinaison ou de la protéine de fusion objet de la présente invention, la molécule d’intérêt est liée au transporteur par une liaison covalente ou non covalente, telle qu’une liaison ionique, une liaison hydrogène, ou une liaison hydrophobique. Lorsque la molécule d’intérêt est un polypeptide d’intérêt, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le polypeptide d'intérêt est lié au transporteur selon l'invention par une liaison peptidique directe.
[0034] Selon un onzième aspect la présente invention vise une composition pharmaceutique comprenant une combinaison ou une protéine de fusion objet de la présente invention. De préférence, la composition comprend un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le choix d'un excipient et/ou d’un véhicule pharmaceutiquement acceptable est connu de l'homme du métier.
[0035] Selon un douzième aspect la présente invention vise la combinaison ou la protéine de fusion ou la composition pharmaceutique objet de la présente invention pour son utilisation dans le traitement, le diagnostic ou la prévention des cancers tels que mélanomes, cancer du sein, tumeurs du cerveau, glioblastomes, cancer du côlon, lymphomes.
[0036] Pour n’importe lequel des aspects de l’invention cités ci-avant, selon des modes de réalisations particuliers de l’invention, la molécule d’intérêt comprend ou consiste en un polypeptide d’intérêt choisi parmi un polypeptide codant la protéine eGFP représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, un polypeptide codant la protéine elF3f représenté par la séquence SEQ ID NO : 18, un polypeptide codant la protéine FERM représenté par la séquence SEQ ID NO : 19, un polypeptide codant tout ou partie de la protéine MDA-7 représenté respectivement par les séquences SEQ ID NO : 20 (protéine MDA- 7 entière) et SEQ ID NO : 21 (protéine MDA-7 tronquée) et un polypeptide représenté par une séquence ayant 80%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 21 .
[0037] Le pourcentage d'identité de séquences de peptides est déterminé par comparaison directe de deux séquences de molécules polypeptidiques, en déterminant le nombre de résidus d'acides aminés identiques dans les deux séquences, puis en le divisant par le nombre de résidus d'acides aminées de la séquence la plus longue des deux, et en multipliant le résultat par 100.
[0038] Les séquences d'acides nucléiques codant les polypeptides représentés par les séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 tels que décrit ci-dessus peuvent être déduites à partir de ces séquences d'acides aminés des peptides selon le principe de la dégénérescence du code génétique connu de l'homme du métier.
Brève description des figures
[0039] L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent : [0040] [Fig. 1] la figure 1 illustre un histogramme présentant les pourcentages de cellules HEK, B16-Ova et beta-TC-6 fluorescentes après traitement avec des protéines de fusion fluorescentes objet de la présente invention ;
[0041] [Fig. 2] la figure 2 illustre des images de cellules HEK et B16-Ova observées au microscope à fluorescence après traitement avec des protéines de fusion fluorescentes objet de la présente invention ;
[0042] [Fig. 3] la figure 3 illustre des courbes de viabilité des cellules B16-Ova et HEK en fonction de la dose de traitement après 24h et 48h permettant de calculer I IC50 des protéines de fusion potentiellement thérapeutiques objet de la présente invention.
Description des modes de réalisation
[0043] Dans la suite de la description, les séquences d'acides nucléiques codant les peptides et polypeptides représentés par les séquences d’acides aminés telles que décrites ci-après, peuvent être déduites à partir de ces séquences d'acides aminés selon le principe de la dégénérescence du code génétique connu de l'homme du métier.
[0044] Réalisation des plasmides MDmut et MD11
[0045] A partir de la séquence originale du peptide de pénétration cellulaire (CPP) MD11 , les inventeurs ont créé 7 modifications de séquence numérotées de #2 à #8 selon l’éloignement par rapport à la séquence d’origine :
- SEQ ID NO : 2 appelée MDmutl DelCys qui correspond à la séquence KRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK,
- SEQ ID NO : 3 appelée MDmut2 qui correspond à la séquence RREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK,
- SEQ ID NO : 4 appelée MDmut2DelCys qui correspond à la séquence RREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK,
- SEQ ID NO : 5 appelée MDmut3 qui correspond à la séquence KRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL,
- SEQ ID NO : 6 appelée MDmut3DelCys qui correspond à la séquence KRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL,
- SEQ ID NO : 7 appelée MDmut4 qui correspond à la séquence RREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL, - SEQ ID NO : 8 appelée MDmut4DelCys qui correspond à la séquence RREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL.
[0046] Les fragments d’ADN codant chaque CPP mutant MDmut sont obtenus par PCR et insérés dans le vecteur d’expression pET15b qui permet d’exprimer dans des bactéries, les peptides dont l'extrémité N-terminale est liée à une étiquette de 6-histidine, tous les plasmides étant construits selon la même organisation d’éléments de génie génétiques entourant la séquence du CPP.
[0047] La séquence de MD11 numérotée #1 et correspondant à la séquence KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ (SEQ ID NO : 1 ) est également insérée dans un plasmide d’expression pET_15b comprenant la même organisation d’éléments de génie génétique que les plasmides comprenant les mutants MDmut.
[0048] L’organisation des éléments de génie génétique est la suivante dans chaque plasmide d’expression dans le sens 5’ vers 3’ :
Ndel Res Site - His Tag - TEV seq - site de clivage MMP2 - MD Seq - Xhol Res Site dans laquelle :
Ndel Res Site = site de restriction Ndel
His Tag = étiquette polyhistidine
TEV seq = séquence de clivage de la protéase Tev
Site de clivage MMP2 = séquence de clivage par la métalloprotéase 2 (ciblage des tumeurs)
MD Seq = la séquence MD11 ou MDmut
Xhol Res Site = site de restriction Xhol
[0049] Les plasmides ont tous été vérifiés par séquençage en double sens au niveau de la séquence d’insertion des éléments génétiques codant pour les protéines de fusion d’intérêt.
[0050] Avec cette organisation des éléments de génie génétique on obtient ainsi les séquences suivantes de peptides de pénétration cellulaire (CPP) :
- SEQ ID NO : 9 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKQ pour le CPP comprenant la séquence MD11 ,
- SEQ ID NO : 10 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLK pour le CPP comprenant la séquence MDmutl DelCys,
- SEQ ID NO : 11 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLK pour le CPP comprenant la séquence Mdmut2,
- SEQ ID NO : 12 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLK pour le CPP comprenant la séquence Mdmut2DelCys,
- SEQ ID NO : 13 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut3,
- SEQ ID NO : 14 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut3DelCys,
- SEQ ID NO : 15 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut4,
- SEQ ID NO : 16 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut4DelCys.
[0051 ] Réalisation des plasmides des polypeptides d’intérêt
[0052] Pour l’obtention des séquences des molécules d’intérêt rapportrices, ici des polypeptides des protéines eGFP (pour « enhanced green fluorescent protein » en terminologie anglo-saxonne) à usage biotechnologique et elF3f (pour « eukaryotic Translation Initiation Factor 3 subunit F » en terminologie anglo-saxonne), FERM (correspondant au domaine FERM) et MDA-7 (pour « Melanoma Differentiation Associated 7 » en terminologie anglo-saxonne) entière ou tronquée, aussi connue sous le nom IL-24, à usage thérapeutique, à mettre en fusion de nos CPP-mutants Mdmut, 5 plasmides, dits donneurs, contenant les inserts d’intérêt dont les séquences des polypeptides d’intérêt sont les suivantes ont été utilisés :
- SEQ ID NO : 17 correspondant au polypeptide
MVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFIC TTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQE RTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNY NSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVL LPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK de la protéine eGFP,
- SEQ ID NO : 18 correspondant au polypeptide ATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPA AAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRWRLHPVI LASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVA VDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPN PIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTE RIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLS GKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLT QSQIALNEKLVNL de la protéine elF3f,
- SEQ ID NO : 19 correspondant au polypeptide MPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQWKTIGLREVWYFGLHY VDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDIT QKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYL SSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIA QDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEI RNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRR KPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER de la protéine FERM,
- SEQ ID NO : 20 correspondant au polypeptide
NFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSG AQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQ EGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANN FVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGE VDILLTWMQKFYKL de la protéine MDA-7,
- SEQ ID NO : 21 correspondant au polypeptide
GQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVL QNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLI VSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDIL LTWMQKFYKL de la protéine MDA-7 tronquée.
[0053] Les inventeurs disposent de ces séquences (SEQ ID NO : 17 à SEQ ID NO : 21 ) flanquées des sites de restriction Xhol et BamHI dans un plasmide pET 15b. Elles ont été préalablement séquencées grâce au primer commercial pET_RP et leur profil de restriction a également été analysé par digestions simples et doubles afin de s’assurer de la possibilité de les extraire sans impacter la séquence qui devra être traduite.
[0054] Création de la banque de plasmides
[0055] Tout d’abord, les 8 plasmides Mdmut et les 5 plasmides donneurs des polypeptides d’intérêt ont été transformés dans des bactéries E. coli XL10 Gold. Pour cela, 25pl de bactéries ont été transformées avec 50 ng de plasmides par choc thermique 30 min dans la glace puis 40 sec à 42°C avant un passage dans la glace. Cette étape a été suivie d’une mise en culture liquide dans 100pL de milieu de culture SOC à 37°C pendant 1 h puis d’un étalement sur boite de Pétri contenant du milieu LB (Lysogeny Broth) - Agar
- Ampicilline et d’une incubation à 37°C sur la nuit. Le lendemain, une colonie isolée a été ensemencée dans 5 ml de milieu LB-Ampicilline et incubée à 37°C
- 150 rpm sur la nuit. 2 ml de culture ont ensuite été centrifugés à 11000g et les plasmides ont été purifiés et élués dans 25pL d’eau grâce au kit Miniprep de Macherey Nagel selon le protocole du fabricant.
[0056] Les plasmides ainsi obtenus ont été préparés en vue du sous-clonage après double digestion par les enzymes de restriction Xhol et BamHI 2 pg de plasmide ont donc été digéré par 5 unités de chaque enzyme de restriction pendant 3h à 37°C. La migration des produits de digestion dans un gel d’agarose 0.6% - TAE 0.5X - Gel Red 1 X pendant 1 h30 à 75V a été suivi d’une purification des bandes d’intérêt grâce au kit PCR and Gel clean Up de Macherey Nagel selon le protocole du fabricant.
[0057] Les plasmides MDmut et MD11 , qu’on peut qualifier de receveurs, ont donné leur squelette contenant les séquences CPP-mutants ou MD11 et les plasmides comprenant les polypeptides d’intérêt, qualifiés de donneurs, ont donné leur insert contenant la séquence des polypeptides d’intérêt. [0058] Les inserts correspondant aux polypeptides d’intérêt ont pu être sous-clonés dans chacun des 8 plasmides MDmut, créant ainsi une nouvelle banque de 40 plasmides recombinants permettant la synthèse des protéines de fusion. Pour cela, une ligation a été effectué avec 3 fold molaire de chaque insert de polypeptides d’intérêt et 50 ng de plasmide mutant grâce à une T4 ADN ligase en 10 min à 22°C. Cette étape a été suivie de la transformation de 25pL de bactéries XL10 Gold avec la moitié du produit de ligation selon le même protocole que précédemment cité.
[0059] Les colonies transformées par les plasmides recombinants ont été présélectionnées grâce à des PCR sur colonie. Pour réaliser cela, une enzyme commerciale au 2X prête à l’emploi a été utilisée en y diluant de moitié 10 LIM d’amorces sens et antisens dans de l’eau stérile. Un piquage au cône de toutes les colonies de la boite a été effectué afin de contaminer 20 l de mix PCR avant lancement du thermocycleur selon un programme adapté aux amorces (Lid = 110°C ; 1 : 3min - 94° ; 2 : 30 sec - 94° ; 3 : 30 sec - 60°C ; 4 : 1 min - 72°C ; 5 : GOTO 2 x 25 repeats ; 6 : 5min - 72°C ; 7 : Hold - 16°C). Par la suite la migration des produits PCR dans un gel d’agarose 1 .5% - TAE 0.5X - Gel Red 1X pendant 40 min à 100V a été effectuée.
[0060] Après migration des produits PCR sur gel d’agarose, les échantillons issus des piquages de colonie ont été comparés aux échantillons contrôle positif (plasmide donneur) ou contrôle négatif (Eau). Une ou deux colonies ayant donné un amplicon de taille et d’aspect comparable au contrôle positif, ont ensuite été mises en culture afin d’amplifier et de purifier par l’utilisation d’un kit commercial « miniprep » les plasmides pour les envoyer au séquençage en double sens (amorces T7 et pET_RP) pour vérification de l’alignement de leur séquence par rapport à la séquence théorique.
[0061] De nouvelles bactéries E. coli XL10 Gold ont ensuite été retransformées à partir des échantillons plasmidiques validés en séquençage. Cette nouvelle transformation a permis la constitution d’un stock glycérol (congélation à - 80°C de 750pJ de culture sur la nuit de bactéries XL10 avec 25% de glycérol stérile) et d’un stock de plasmides recombinants concentrés, et purifiés par l’utilisation du kit « midiprep » Macherey Nagel selon le protocole du fabricant. [0062] Dans chaque plasmide recombinant l’organisation des éléments de génie génétique est la suivante dans le sens 5’ vers 3’ :
Ndel Res Site - His Tag - TEV seq - site de clivage MMP2 - MD Seq - Xhol
- PolyPep - BamHI dans laquelle :
Ndel Res Site = site de restriction Ndel
His Tag = étiquette polyhistidine
TEV seq = séquence de clivage de la protéase Tev
Site de clivage MMP2 = séquence de clivage par la métalloprotéase 2 (ciblage des tumeurs)
MD Seq = la séquence MD11 (SEQ ID NO : 1 ) ou une séquence MDmut (SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 8)
Xhol = site de restriction Xhol
PolyPep = la séquence du polypeptide d’intérêt (SEQ ID NO : 17 à SEQ ID NO : 21 )
BamHI = site de restriction BamHI
[0063] On obtient ainsi les séquences suivantes de protéines de fusion codées par les plasmides recombinants ainsi créés :
- SEQ ID NO : 22 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKQLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFS VSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDH MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIEL
KGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGS VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 , en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 23 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVS GEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHM KQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSV QLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFV TAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmutl DelCys en fusion avec la protéine eGFP ( SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 24 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKLEMVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSV SGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDH MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIEL KGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGS VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 11 ) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 25 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVS GEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHM KQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELK GIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSV QLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFV TAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 26 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKF SVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPD HMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIE LKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDG SVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLE FVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17). - SEQ ID NO : 27 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFS VSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDH MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIEL KGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGS VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 28 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKF SVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPD HMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIE LKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDG SVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLE FVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 29 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFS VSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDH MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIEL KGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGS VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 30 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYRE
VAAAKSSENDRLRLLLKQLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPT
PAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALP GPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKH SVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYAT GHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPG RTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGG ASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDF ETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 31 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPA PAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGP ALPGPFPGGRWRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSV EVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGH DITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRT MGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGAS ARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFET MLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmutl DelCys en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 32 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTP APAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPG PALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHS VEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATG HDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGR TMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGA SARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFE TMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 11 ) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 33 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPA PAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGP ALPGPFPGGRWRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSV EVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGH DITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRT MGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGAS ARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFET MLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 34 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAP TPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPAL PGPALPGPFPGGRWRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDK HSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYA TGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVP GRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVG GASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDD FETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 35 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPT PAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALP GPALPGPFPGGRWRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKH SVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYAT GHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPG RTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGG ASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDF ETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18). - SEQ ID NO : 36 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAP TPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPAL PGPALPGPFPGGRWRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDK HSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYA TGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVP GRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVG GASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDD FETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 37 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPT PAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALP GPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKH SVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYAT GHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPG RTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGG ASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDF ETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine elF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 38 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKQLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFD QVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFK FRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAV QAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHA EHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLN IYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINK RILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 39 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQV VKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFR AKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQA KFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEH RGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIY EKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRI LQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmutl DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 40 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQ WKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKF RAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQ AKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAE HRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNI YEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINK RILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 11 ) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 41 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQV VKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFR AKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQA KFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEH RGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIY EKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRI LQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 42 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLF DQWKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQF KFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYA VQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWH AEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGL NIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRIN KRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 43 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFD QVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFK FRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAV QAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHA EHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLN IYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINK RILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 44 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLF DQWKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQF KFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYA VQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWH AEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGL NIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRIN KRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO :15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 45 qui correspond à la séquence
MMHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLI SEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQL FDQWKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQ FKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSY AVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVW HAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDAL GLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRL RINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 46 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKQLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQ MVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWA VKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKN YHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLL FRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 47 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMV VLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKD TMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmutl DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20). - SEQ ID NO : 48 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQM WLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVK DTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYH NRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFR RAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 11 ) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 49 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMV VLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKD TMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 50 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQM QMWLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFW AVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFK NYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFL LFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 51 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQ MVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWA VKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKN YHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLL FRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 52 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQM QMWLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFW AVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFK NYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFL LFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 53 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQ MVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWA VKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKN YHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLL FRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 54 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKQLEGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVK DTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO :
9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 55 qui correspond à la séquence
MMHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKLEGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVKD TMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNR TVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAF KQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmutl DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 56 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYRE VAAAKSSENDRLRLLLKLEGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVKD TMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNR TVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAF KQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 11 ) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 57 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDT MQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRT VEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFK QLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 58 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVK DTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 59 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVK DTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 60 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLIS EIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVK DTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO :
15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
- SEQ ID NO : 61 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISE IDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVK DTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHN RTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRR AFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO :
16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21 ).
[0064] Protocoles de production et purification des protéines de fusion
[0065] Les protocoles ci-après ont été mis au point par la technique « d’essais- erreur » sur chacun des paramètres suivants :
- Production : souche bactérienne de E. coli, temps, température, volume de culture, condition de stress (addition éthanol à 1 , 3 ou 5%), densité optique d’induction de la production, concentration en inducteur de la production (IPTG, isopropyl 0-D-1 -thiogalactopyranoside) ;
- Lyse : méthode chimique et/ou mécanique, temps, puissance, répétition ;
- Purification : solubilisation ou non, tampon, affinité, pureté, type de colonne, conditions de renaturation, dialyse.
[0066] Production des protéines de fusion comprenant un CPP et le polypeptide eGFP [0067] Les conditions optimales de production et purification des protéines de fusion comprenant un CPP mutant (MDmut) ou MD11 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 22 à SEQ ID NO : 29) ont été définies telles que décrites ci-après.
[0068] Le meilleur rendement de production a été observé après culture de bactéries E. coli BL21 (DE3) transformées par les plasmides recombinants codant les séquences SEQ ID NO : 22 à SEQ ID NO : 29 sur la nuit à 16°C après induction de la production avec 0,5 mM d’IPGT ajouté à D026o=1 .
[0069] La lyse des bactéries a été optimale en 2 temps dans un tampon Tris - NaCI - imidazole. Tout d’abord, une lyse chimique au lysozyme à 1 mg/ml pendant 30 min sur une roue pour une agitation douce a été réalisée à 4°C afin de préserver l’intégrité des protéines. Puis une lyse mécanique par 6 cycles de 30 sec de sonication d’abord 3 cycles à 30% de puissance puis 3 cycles à 70% de puissance ont suivi, les lysats bactériens ayant été remis dans la glace au minimum 30 sec entre chaque sonication.
[0070] Après centrifugation, la fraction soluble a été passée sur colonne de Nickel et les protéines ont pu être éluées par compétition avec 500mM d’imidazole.
[0071] La pureté, la qualité et la quantité des protéines ont été analysées par SDS- PAGE et Western blot. Pour cela, 15 pl d’échantillon sont mélangés à 5 pL de tampon réducteur 4X et migrés dans un gel d’acrylamide à 12% pendant 1 h à 30mA-150V. Les gels sont soit colorés au bleu de Coomassie pendant 2h à température ambiante (TA) sous agitation puis décolorés à l’eau, soit transférés sur une membrane de nitrocellulose 0.2 pm par le système Bio-Rad Mini-protean selon le protocole du fabricant sur le programme poids moléculaire mixte ou « Mixed Molecular Weight » en terminologie anglo- saxonne. Les membranes ont ensuite été bloquées au lait écrémé 5% - TBS 1X tween 0.1 % pendant 2h à TA sous agitation puis incubées avec un Anticorps anti-His HRP (pour « HorseRadish Peroxidase » en terminologie anglo-saxonne) dilué au 1/50000 dans la solution de blocage. L’anticorps anti- His se fixe sur l’étiquette poly-histidine des protéines de fusion et HRP permet sa détection au ChemiDoc Imaging System (BioRad) par chimioluminescence.
[0072] La coloration au bleu de Coomassie des gels d’acrylamide nous a permis de constater que plus le rendement de production est important, moins la solubilisation des protéines est efficace. Cependant, les quantités de protéines solubilisées restent très importantes et suffisantes pour la purification de plusieurs milligrammes de protéines selon le protocole.
[0073] Le western-blot, quant à lui, nous a indiqué la présence d’agrégats protéiques dans les échantillons qui ont pu être éliminés par l’addition d’une étape de centrifugation à très haute vitesse.
[0074] Production des protéines de fusion comprenant un CCP et le polypeptide elF3f
[0075] Les conditions optimales de production et purification des protéines de fusion comprenant un CPP mutant (MDmut) ou MD11 et le polypeptide elF3f (SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 37) sont définies ci-après.
[0076] Le meilleur rendement de production a été observé après culture de bactéries E. coli BL21 (DE3) transformées par les plasmides recombinants codant les séquences SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 37 sur la nuit à 16°C après induction de la production à 0,5 mM d’IPGT ajouté à DO=1 .
[0077] La lyse des bactéries a été optimale en 2 temps dans un tampon MOPS - NaCI - imidazole. Tout d’abord, une lyse chimique au lysozyme à 1 mg/ml pendant 30 min sur une roue pour une agitation douce a été réalisée à 4°C afin de préserver l’intégrité des protéines. Puis une lyse mécanique par 5 cycles de 30 sec de sonication à 70% de puissance a suivi, les lysats bactériens ayant été remis dans la glace au minimum 30 sec entre chaque sonication.
[0078] Aucun des protocoles testés n’a permis d’obtenir une quantité suffisante de protéines sous forme soluble. Après centrifugation, la fraction soluble a donc été éliminée et les corps d’inclusions ont été lavés dans 3 différents tampons de lavage (MOPS 20mM - NaCI 2M - Cystéine 15mM ; MOPS 20mM - NaCI 250mM - Cystéine 15mM - Tritton X100 2% ; MOPS 20mM - NaCI 250mM - Cystéine 15mM) puis solubilisés en condition dénaturante (MOPS 20mM - NaCI 250mM - Cystéine 15mM - Urée 8M). Les protéines ont été purifiées sur colonne de Nickel par compétition à l’imidazole (MOPS 20mM - NaCI 250mM - Cystéine 15mM - Urée 8M - Imidazole 500mM), les protéines ont été renaturées par la méthode de dilution au goutte à goutte (Na Citrate 50mM - MgCl22mM - DTT 2mM - NaCI 50mM - L-Argine 500mM - Tween 200,5%) puis dialysées en 2 temps (Na Citrate 50mM - MgCl22mM - DTT 2mM - NaCI 50mM - L-Argine 50mM - N-Lauryl Sarcosine 0,01 % ; Na Citrate 50mM - NaCI 50mM - Glycérol 10%) pour être en solution dans un tampon compatible avec les expériences in cellulo et in vivo.
[0079] La pureté et la qualité des protéines ont été analysées par SDS-PAGE et Western blot avec le même protocole que celui utilisé pour les protéines de fusions comprenant la protéine eGFP et décrit dans la section précédente. Les échantillons de traitement ont quant à eux été dosés par la méthode microBCA selon le protocole du fabricant.
[0080] Dans les échantillons d’élution, de refolding et les dialysats une seule bande, marquée par l’anticorps anti-histidine en western blot, de 50kDa a été mise en évidence par la coloration du gel d’acrylamide au bleu de Coomassie. Les échantillons de traitement utilisés pour les expériences in vitro sont donc pures et de bonne qualité. En effet, l’absence de bande surnuméraire en Western blot a démontré l’absence de protéine dégradées et/ou agrégées dans les échantillons.
[0081] Production des protéines de fusion comprenant un CCP et le polypeptide MDA-7 ou MDA-7 tronquée
[0082] Les conditions optimales de production et purification des protéines de fusion comprenant un CPP mutant (MDmut) ou MD11 et le polypeptide MDA-7 (SEQ ID NO : 46 à SEQ ID NO : 53) ou le polypeptide de MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 54 à SEQ ID NO : 61 ) sont définies ci-après.
[0083] Le meilleur rendement de production a été observé après culture de bactéries E. coli BL21 (DE3) transformées par les plasmides recombinants codant les séquences SEQ ID NO : 46 à SEQ ID NO : 61 sur la nuit à 16°C après induction de la production avec 1 M d’IPGT ajouté à D026o>1.
[0084] La lyse des bactéries a été optimale en 2 temps dans un tampon Tris 50mM - NaCI 250 mM - imidazole 5 mM. Tout d’abord, une lyse chimique au lysozyme à 1 mg/ml pendant 30 min sur une roue pour une agitation douce a été réalisée à 4°C afin de préserver l’intégrité des protéines. Puis une lyse mécanique par 5 cycles de 30 sec de sonication à 70% de puissance a suivi, les lysats bactériens ayant été remis dans la glace au minimum 30 sec entre chaque sonication.
[0085] Aucun des protocoles testés n’a permis d’obtenir une concentration suffisante de protéines sous forme soluble. Après centrifugation, la fraction soluble a donc été éliminée et les corps d’inclusions ont été lavés dans 3 différents tampons de lavage (Tris 50 mM - p-mercaptoéthanol 20 mM - Tritton X100 2% ; Tris 20 mM - [3-mercaptoéthanol 20 mM ; Tris 50 mM - DTT 20mM - Guanidine HydroChloride 6M) puis solubilisés en condition dénaturante de Guanidine. Les protéines ont été purifiées sur colonne de Nickel par compétition à l’imidazole (Tris 50 mM - Guanidine HydroChloride 6M - Imidazole 500mM) et renaturées par la méthode de dilution au goutte à goutte (Tris 50 mM - Guanidine HydroChloride 1 ,4M - NaCI 50mM - L-Argine 500mM - Titton X100 0,5%) puis dialysées en 2 temps pour être en solution (Tris 50 mM - Guanidine HydroChloride 0,75M - NaCI 50mM - L-Argine 50mM - Tween20 0,5% ; Tris 50mM - NaCI 50 mM - Glycérol 10%) dans un tampon compatible avec les expériences in cellulo et in vivo.
[0086] La pureté et la qualité des protéines ont été analysées par SDS-PAGE et Western blot puis ces dernières ont été dosées par la méthode microBCA. Une seule bande, marquée par l’anticorps anti-histidine en western blot, a été mise en évidence par la coloration du gel d’acrylamide au bleu de Coomassie. Les échantillons de protéines de fusion CPP couplé au polypeptides MDA7 entier ou tronqué sont donc pures et de bonne qualité. En effet, l’absence de bande surnuméraire en Western blot a démontré l’absence de protéine dégradées et/ou agrégées dans les échantillons.
[0087] Analyse du potentiel de pénétration cellulaire des CPP
[0088] Afin de démontrer le haut potentiel de pénétration intracellulaire des CPP mutants MDmut, des analyses de cytométrie en flux et en microscopie à fluorescence ont été réalisées.
[0089] Les traitements par les protéines de fusion comprenant un CPP mutants et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 29) ont été comparé au traitement par la eGFP seule, non lié à un transporteur, et aux traitements par les protéines de fusion comprenant soit le CPP MD11 (SEQ ID NO : 1 ) sans les éléments nouveaux de génie génétique et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 17), soit comprenant le CPP MD11 avec les nouveaux éléments de génie génétiques et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 22).
[0090] Pour dénombrer le nombre de cellules fluorescentes après traitement, des cellules HEK293, B16-Ova et beta-TC-6 ont été ensemencées puis traitées à 60% de confluence environ par 200 nM de protéines de fusion respectives en l’absence de sérum bovin pendant 4h. Elles ont ensuite été supplémentées avec 5% de sérum bovin et incubées sur la nuit. Le lendemain les cellules ont été trypsinées puis lavées au PBS 1X et passées au FACS pour analyses.
[0091] Un échantillon cellulaire non traité et supplémenté en lodure de Propridium à 1 .g/ml, a permis de calibrer le blanc et la plage de cellules vivantes. Pour les échantillons traités, un minimum de 25000 cellules vivantes a été analysé pour leur fluorescence verte.
[0092] Les résultats d’analyse indiquent le pourcentage de cellules GFP positives après traitement et sont présentés en figure 1 dans laquelle :
- MD11 -eGFP correspond à la protéine de fusion contrôle comprenant la séquence du CPP MD11 mais sans les éléments de génie génétique (SEQ ID NO : 1 ) et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 17) ;
- #1 A-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MD11 avec les éléments de génie génétique et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 22) ;
- #2B-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmutl DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 23) ;
- #3C-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut2 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 24) ;
- #4D-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut2DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 25) ;
- #5E-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut3 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 26) ;
- #6F-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut3DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 27) ;
- #7G-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut4 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 28) ;
- #8H-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut4DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 29).
[0093] La cytométrie en flux nous a montré que globalement, dans les conditions de traitements actuelles avec un nombre de réplicas compris entre 3 et 5 par condition, le pouvoir de pénétration des protéines est plus important dans les cellules non tumorales humaines HEK293 que dans les cellules tumorales B16-Ova (B16) et les cellules tumorales humaines beta-TC-6 (bTC6). Pour les protéines de fusion MD11 -eGFP et #5E-eGFP, nous sommes à la limite de la significativité p=0,057. Le même défaut de pénétration, par rapport à MD11 -eGFP, est observé pour le mutant #4D-eGFP dans les trois lignées cellulaires.
[0094] Dans les cellules HEK293, les protéines de fusion comprenant un CPP mutant et le polypeptide eGFP ont une capacité de pénétration cellulaire préservée, dont une tendance non significative à la hausse pour #3C-eGFP, #5E-eGFP, #6F-eGFP et #7G-eGFP par rapport au contrôle (MD11 -eGFP) avec un taux de cellules GFP-positives compris entre 73% et 82% contre 57%.
[0095] Dans les cellules B16-Ova (B16), la capacité de pénétration des mutants #3C- eGFP, #5E-eGFP, #6F-eGFP et #7G-eGFP est équivalente à celle de MD11 - eGFP. En revanche la capacité de pénétration cellulaire des mutants #2B- eGFP, #4D-eGFP et #8H-eGFP est significativement plus faible entre 15% et 20% contre plus de 41 %.
[0096] Dans les cellules bTC6, la capacité de pénétration des mutants #1A-eGFP, #5E-eGFP et #7G-eGFP est significativement supérieure entre 21 % et 30% contre 15% pour MD11 -eGFP. En revanche, la capacité de pénétration des mutants #2B-eGFP, #3C-eGFP, #4D-eGFP, #6F-eGFP et #8H-eGFP est significativement plus faible entre 1 % et 8% contre 15%.
[0097] En parallèle, les mêmes cellules (HEK293 et B16-Ova) ont également été ensemencées sur des lames de verre équipées de chambres de culture puis traitées par les protéines de fusion MD11 -eGFP, #1 A-eGFP, #3C-eGFP, #5E- eGFP, #7G-eGFP ou le tampon pdt 4h en l’absence de sérum. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS 1X puis à l’héparine et fixées au Paraformaldéhyde et observées au microscope à fluorescence. 5 plans focaux successifs espacés de 2pm ont été capturés afin de mettre en évidence la localisation intracellulaire des protéines.
[0098] Les images représentatives de la fluorescence des cellules après traitement sont données en figure 2.
[0099] L’efficacité de pénétration cellulaire des différents mutants étant inégale, certains signaux fluorescents ont dû être « forcés » pour être visibles mais tous ont été repérés comme intracellulaire. Cependant, les agrégats protéiques visualisés sur certaines images semblent quant à eux fixés aux membranes. [00100] Analyse du potentiel thérapeutique antitumoral de la protéine de fusion comprenant CPP et polypeptide de elF3f
[00101] Afin de démontrer le potentiel thérapeutique des CPP mutants MDmut fusionnés au facteur de régulation de la traduction elF3f (SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 37) sur le mélanome, l’étude s’est poursuivie avec toujours les cellules HEK293 et B16-Ova.
[00102] La viabilité a été testée au Prestoblue®. Pour cela, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à bords noirs et fonds transparents puis, le lendemain, traitées à 60% de confluence à 0,25X de sérum de veau fœtal (SVF). Afin de calculer la concentration inhibitrice médiane (IC50) de chaque protéine de fusion, celles-ci ont été diluées selon une large gamme de concentration comprise entre 15 et 100 nM et incubées 24h ou 48h.
[00103] Les courbes de viabilité des cellules B16-Ova (B16) et HEK293 après 24h et 48h de traitement par les protéines de fusion sont illustrées en figure 3 dans laquelle :
- 1 E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MD11 et le polypeptide elF3f (SEQ ID NO : 30) ;
- 3E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut2 et le polypeptide elF3f (SEQ ID NO : 32) ;
- 5E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut3 et le polypeptide elF3f (SEQ ID NO : 34) ;
- 7E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut4 et le polypeptide elF3f (SEQ ID NO : 36).
[00104] Ces tests ont montré que le CPP mutant 3E s’avère le moins efficace tant sur les cellules B16 que HEK293 après 24 ou 48h. L’IC50 à 24h des autres CPP mutants est identique à environ 50 nM pour les cellules B16 et 30 nM pour les HEK293. L’IC50 à 48h n’est pas significativement différente non plus et située entre 25 et 35 nM, concentration extrêmement faible qui corrobore une action directe et sans intermédiaire des protéines de fusion dans les cellules.
[00105] Ces tests ont également montré que les protéines de fusion #1A-eGFP, #5E- eGFP et #7G-eGFP (et par extension les peptides mutants qui les forment) présentent une meilleure capacité de pénétration cellulaire que celle de la protéine de fusion formée avec MD11 . Cette capacité accrue a été confirmée dans au moins deux lignées cellulaires différentes, en l’occurrence la lignée humaine non tumorale HEK et la lignée humaine tumorale bTC6.
[00106] De manière plus générale, il est à noter que les modes de mise en œuvre et de réalisation de l’invention considérés ci-dessus ont été décrits à titre d’exemples non limitatifs et que d’autres variantes sont par conséquent envisageables.

Claims

Revendications
Revendication 1 . Peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
Revendication 2. Molécule d’acide nucléique codant un peptide selon la revendication 1 .
Revendication 3. Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant un peptide selon la revendication 1 .
Revendication 4. Cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 2 ou un vecteur d’expression selon la revendication 3.
Revendication 5. Utilisation d’un peptide selon la revendication 1 ou d’une molécule d’acide nucléique selon la revendication 2 ou d’un vecteur d’expression selon la revendication 3 ou d’une cellule hôte selon la revendication 4, pour l’obtention d’un transporteur destiné à l'internalisation d'une molécule d'intérêt dans des cellules cibles.
Revendication 6. Combinaison comprenant un transporteur et une molécule d’intérêt, ledit transporteur étant un peptide selon la revendication 1 .
Revendication 7. Protéine de fusion comprenant un transporteur qui est un peptide selon la revendication 1 , et une molécule d’intérêt qui est un polypeptide d’intérêt.
Revendication 8. Molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon la revendication 7.
Revendication 9. Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon la revendication 7.
Revendication 10. Cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 8 ou un vecteur d’expression selon la revendication 9.
Revendication 11 . Composition pharmaceutique comprenant une combinaison selon la revendication 6 ou une protéine de fusion selon la revendication 7 ainsi qu’un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Revendication 12. Combinaison selon la revendication 6 ou protéine de fusion selon la revendication 7 ou composition pharmaceutique selon la revendication 11 , pour son utilisation dans le traitement, le diagnostic ou la prévention de pathologies, notamment de cancers tels que mélanomes, cancer du sein, tumeurs du cerveau, glioblastomes, cancer du côlon, lymphomes. Revendication 13. Combinaison selon la revendication 6, protéine de fusion selon la revendication 7, molécule d’acide nucléique selon la revendication 8, vecteur d’expression selon la revendication 9, cellule hôte selon la revendication 10 ou composition pharmaceutique selon la revendication 11 , dans laquelle la molécule d’intérêt comprend ou consiste en un polypeptide d’intérêt choisi parmi un polypeptide codant la protéine eGFP représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, un polypeptide codant la protéine elF3f représenté par la séquence SEQ ID NO : 18, un polypeptide codant la protéine FERM représenté par la séquence SEQ ID NO : 19, un polypeptide codant la protéine MDA-7 représenté par la séquence SEQ ID NO : 20, un polypeptide codant la protéine MDA-7 tronquée représenté par la séquence SEQ ID NO : 21 et un polypeptide représenté par une séquence ayant 80%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 21.
Revendication 14. Combinaison ou protéine de fusion ou composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 12, dans laquelle la molécule d’intérêt comprend ou consiste en un polypeptide d’intérêt choisi parmi un polypeptide codant la protéine eGFP représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, un polypeptide codant la protéine elF3f représenté par la séquence SEQ ID NO : 18, un polypeptide codant la protéine FERM représenté par la séquence SEQ ID NO : 19, un polypeptide codant la protéine MDA-7 représenté par la séquence SEQ ID NO : 20, un polypeptide codant la protéine MDA-7 tronquée représenté par la séquence SEQ ID NO : 21 et un polypeptide représenté par une séquence ayant 80%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 21 .
Revendication 15. Protéine de fusion selon la revendication 7 comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47 à SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 55 à SEQ ID NO : 61.
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