EP4626909A1 - Nouvelles souches de bacillus subtilis produisant de nouvelles isoformes de mycosubtiline - Google Patents

Nouvelles souches de bacillus subtilis produisant de nouvelles isoformes de mycosubtiline

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Publication number
EP4626909A1
EP4626909A1 EP23813415.9A EP23813415A EP4626909A1 EP 4626909 A1 EP4626909 A1 EP 4626909A1 EP 23813415 A EP23813415 A EP 23813415A EP 4626909 A1 EP4626909 A1 EP 4626909A1
Authority
EP
European Patent Office
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gln1
isoforms
strain
mycosubtilin
new
Prior art date
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Pending
Application number
EP23813415.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
François COUTTE
Arnaud DELECROIX
Debarun DHALI
Philippe Jacques
Tambi KAR
Yazen YASEEN
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Lipofabrik SAS
Universite de Lille
Original Assignee
Lipofabrik SAS
Universite de Lille
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Filing date
Publication date
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    • A01N63/22—Bacillus
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    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01004—L-Arabinose isomerase (5.3.1.4)
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    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Definitions

  • Lipopeptides are bioactive molecules produced by different bacterial strains, notably Bacillus and Pseudomonas bacteria (Jacques, 2011). Bacillus strains are capable of producing three different families of molecules, namely surfactins (surfactin, pumillacidin); fengycins (fengycin, plipastatin, agrastatin); and iturins (iturin, mycosubtilin, bacilomycin, mojavensin). Among the iturin family, mycosubtilin is the compound with the highest antifungal activity (Besson et al., 1979).
  • Mycosubtiline is a lipopeptide whose heptapeptide ring is linked to a fatty acid chain by a ⁇ -amino bond.
  • the length of the fatty acid chain can vary from C15 to C18, and the isomerism can be linear, iso or anteiso. (Stein, 2005) .
  • the classic peptide chain formula is Asn/D-Tyr/D-Asn/Gln/Pro/ /D-Ser/Asn, as described in .
  • composition of the peptide cycle but also the length and isomerism of the fatty acid chain are factors which influence the activity of the molecule and in particular its antifungal activity.
  • a study showed that the anteiso-C17 isoform of mycosubtilin was most active against the yeast C. albicans. (Fickers et al., 2009).
  • another work studied the effect of different alkyl chains of mycosubtilin against B. cinerea The authors showed that the anteiso-C17 isoform was the most active against B.
  • the inventors have developed new strains of Bacillus subtilis capable of producing new isoforms of mycosubtilin which are both more effective as an antifungal agent and less cytotoxic than the mycosubtilins described to date.
  • the invention concerns two new strains of Bacillus subtilis genetically modified by 7 mutations so that they produce new isoforms of mycosubtilin. These two strains are deposited after the CNCM under the numbers CNCM I-5565 and CNCM I-5679.
  • the invention relates to 2 new mycosubtilin isoforms, namely Gln1-C16 and Gln1-C17, as well as compositions containing them.
  • the invention also relates to the use of new isoforms as an antifungal agent, in particular against the strains B. cinerea , Aspergillus sp and Z. tritici.
  • the invention relates to a process for producing at least one of these new isoforms by culturing a strain of Bacillus subtilis genetically modified in accordance with the invention.
  • the present invention provides access to surfactants suitable for use in agriculture, namely compounds which are non-toxic and which are available in large quantities.
  • the new isoforms of mycosubtilin presented here exhibit antifungal activities superior to those of the mycosutilins described to date.
  • the Gln1C16 isoform exhibits greater antifungal activity than the C16 isoform.
  • these new isoforms present less cytotoxicity compared to these same known mycosubtilins.
  • these new isoforms can be used in the production of biopesticides or biosurfactants intended for the phytosanitary industry for the biocontrol of plant diseases or post-harvest treatment, as well as for the stimulation of plant growth.
  • Such surfactants are of interest for use in other fields due to their properties, in particular in the fields of the food, cosmetic, chemical, medical, pharmaceutical, detergent, petroleum and environmental industries.
  • a first subject of the invention concerns the Bacillus subtilis strain deposited on July 30, 2020 under the number CNCM I-5565 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute (Paris, France).
  • the I-5565 strain presents 7 mutations responsible for a modification of metabolism; this modification led to an increase in the production of mycosubtilin and the appearance of new isoforms, in particular the Gln1-C16 and Gln1-C17 isoforms.
  • the invention also relates to a strain as defined above (strain I-5565) modified by replacement of the endogenous promoter with the constitutive promoter PrepU characterized in that it is the Bacillus subtilis strain deposited on May 5, 2021 under number CNCM I-5679 in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute (Paris, France).
  • strain I-5565 modified by replacement of the endogenous promoter with the constitutive promoter PrepU characterized in that it is the Bacillus subtilis strain deposited on May 5, 2021 under number CNCM I-5679 in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute (Paris, France).
  • the inventors have shown that the combination of these 7 mutations allows the overall increase in the production of mycosubtilin and in particular the production of new isoforms of mycosubtilin, such as the Gln1-C16 and Gln1-C17 isoforms.
  • the seven genes modified in the strains of Bacillus sp . according to the invention are the following:
  • ResE is a gene that encodes a protein similar to that of two-component signal transduction systems and plays a regulatory role in respiration. ResE, is involved in the overall regulation of aerobic and anaerobic respiration in B. subtilis . ResE (as well as ResD) are two-component regulatory proteins that are required for transcriptional activation of Fnr under oxygen limitation in B. subtilis. (Sun et al., 1996). Mycosubtilin production is strongly impacted by oxygenation conditions (Guez et al., 2008).
  • rpoC is a gene responsible for the beta subunit of DNA-directed RNA polymerase. Mutation of rpoC leads to elevated expression of stress-responsive regulators, including those of the extracytoplasmic function (ECF) ⁇ -factors ( ⁇ M, ⁇ W, and ⁇ X) and the general stress ⁇ -factor ( ⁇ B).
  • ECF extracytoplasmic function
  • ⁇ M extracytoplasmic function
  • ⁇ W ⁇ W
  • ⁇ X general stress ⁇ -factor
  • ⁇ B general stress ⁇ -factor
  • the 03457 gene codes for a protein whose function is unknown but which could be linked to the transport of secondary metabolites.
  • strains I-5565 and I-5679 produce 13 other new minor mycosubtilins (in terms of production level) namely: Gln7-C16; Gln1, Gln3-C16; Gln3,Gln7-C16; Gln1-C16; Gln1,Gln3,Gln7-C16; Gln7-C17; Gln1,Gln3-C17; Gln3,Gln7-C17; Gln1-C17; Gln3-C18; Gln7-C18; Gln1-C18 and A-C19.
  • a second object of the invention relates to a composition comprising at least one mycosubtiline chosen from the Gln1-C16 and Gln1-C17 isoforms.
  • the Gln3-C16 isoform is represented in .
  • compositions according to the invention may contain at least one of the new mycosubtilines chosen from Gln7-C16; Gln1, Gln3-C16; Gln3,Gln7-C16; Gln1-C16; Gln1,Gln3,Gln7-C16; Gln7-C17; Gln1,Gln3-C17; Gln3,Gln7-C17; Gln1-C17; Gln3-C18; Gln7-C18; Gln1-C18 and A-C19, as well as any other known mycosubtilin.
  • Surfactant molecules include amphiphilic molecules, surfactants, lipopeptides, such as surfactin, fengycin, chemical surfactants and biological surfactants, such as rhamnolipids, polysaccharides, etc.
  • surfactants mention may be made of heparin, hyaluronic acid, dextran, amylose, chitosan, anionic surfactants derived from amino acids, non-ionic surfactants derived from poly-glycosides, surfactants hydrotropic active ingredients, lipopeptides such as surfactin isomers and/or fengycin (or plipastatin) isomers, rhamnolipids and vegetable oils.
  • the surfactants of the family of nonionic surfactants are chosen for example from: fatty alcohol axalkylate, pentylene glycol and its derivatives, hydrotropic molecules of the alkylpolyglycoside type (alkypolyglycoside and alkylethoxypolyglycoside), molecules of the polyglycoside texture agent type (gum xanthan, gum arabic, gum tragacanth, guar gum, locust bean gum, tamarind gum, pectin, gellan gum, carrageenans, agar-agar, alginates.)
  • Surfactants from the anionic surfactant family are chosen for example from surfactins, fengycins, sodium laureth sulfate and its derivatives or amino acid derivatives.
  • the surfactants of the oil family are chosen for example from modified oils and oil extracts (acidified, methylated, esterified) in particular from: almond, peanut, argan, avocado, rapeseed, ricin, lorenzo, neem, hazelnut, walnut cashew, macadamia nut, olive, pistachio, rice, oleic sunflower, camelina, flax, borage, safflower, hemp, cotton, wheat germ, corn, walnuts, popsicle, evening primrose, barley, pumpkin seeds, grape seeds, peas, sesame, soy, sunflower.
  • modified oils and oil extracts in particular from: almond, peanut, argan, avocado, rapeseed, ricin, lorenzo, neem, hazelnut, walnut cashew, macadamia nut, olive, pistachio, rice, oleic sunflower, camelina, flax, borage, safflower, hemp, cotton, wheat germ,
  • the adjuvants some can facilitate the penetration of the composition into the plant (such as oils), others increase the contact surface between the plant leaf and the composition (wetting agents), others can absorb humidity. of the air and thus fight against desiccation (salts), still others can fix the composition on the leaves so as to limit leaching and volatilization.
  • the adjuvants must therefore be adapted to the modes of action of the compositions (root, contact, systemic or penetrating), to the types of product formulations and to the types of plants targeted (glabrous or hairy leaves, thickness of the cuticles, stages of the plants, positions stomata).
  • a third object of the invention relates to the use of at least one mycosubtiline chosen from the Gln1-C16 and Gln1-C17 isoforms or a composition comprising such a mycosubtiline (as described above) as an antifungal agent.
  • this use consists of using at least one mycosubtiline corresponding to the Gln1-C16 isoform as an antifungal agent against the B. Cinera strain.
  • this use consists of using at least one mycosubtiline corresponding to the Gln1-C17 isoform as an antifungal agent against the Aspergillus sp strain.
  • this use consists of using at least one mycosubtiline corresponding to one of the Gln1-C16 or Gln3-C16 isoforms as an antifungal agent against the Z. tritici strain.
  • a particular embodiment consists of using Gln1-C16 or Gln1-C17 in combination with Gln3-C16 as an antifungal agent against the Z. tritici strain.
  • a fourth object of the invention relates to a process for producing an antifungal composition consisting of cultivating a genetically modified Bacillus strain as defined above.
  • the production process makes it possible to produce at least one new isoform of mycosubtilin chosen from the Gln1-C16 and Gln1-C17 isoforms by cultivating a genetically modified Bacillus strain as defined above.
  • E EXAMPLE 1 Construction of s strain s Bacillus subtilis I-5565 and I-5679
  • Strain Bacillus subtilis I-5679 derives from strain I-5565; the constructions of these strains are described below
  • a first deposit of the strain was made on July 30, 2020 under the number CNCM I-5565 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute (Paris, France).
  • a second strain deposit was made on May 5, 2021 under the number CNCM I-5679 in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Pasteur Institute (Paris, France).
  • Strain I-5565 was constructed from a B. subtilis strain deposited on February 6, 2020 under the number CNCM I-5487 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) of the Institut Pasteur (Paris, France) .
  • the method used for screening mutant strains involves diluting one unit volume of mutant library stock in one unit volume of physiological water.
  • the cell suspension is spread on nutrient agar plates (provided by Condalab) to obtain single colonies.
  • Several single colonies are then picked using the Qpix 460 (from Molecular Devices) and inoculated into a nutrient culture medium. After incubation at 30°C for 24 hours, the cells are harvested, and the supernatant is used for the analysis of mycosubtilin by reversed-phase high-performance liquid chromatography as described in Example 2.
  • d Other culture media can be used such as LB medium, Landy medium or Cooper medium.
  • Genome sequencing of B. subtilis strain I-5565 was carried out using Illumina Paired end 2*150 bp (Library prepared by fowling Nextera XT). Genome sequencing results confirm changes in the nucleotide sequence of seven genes, namely: resE , rpoC , addB , araA, cotY, 03427 and 03457.
  • Bacillus subtilis I-5565 strain produces more mycosubtilin as presented in example 2 and different new isoforms.
  • a hybrid plasmid containing ⁇ pbp-P repU -neo- ⁇ fenF and rep(R6K) was first constructed as follows.
  • the bLIP1 plasmid is digested with the restriction enzymes GeneJET gel extraction (Thermo scientific; reference K0692).
  • the pbp gene fragment (950 base pairs) is amplified from B. subtilis I-5565 using primers containing similar restriction sites. The amplified fragment is extracted and purified.
  • the ligation of the 4.5 kb fragment and the 950 bp PCR fragment is carried out following the rapid DNA ligation kit protocol (Thermo scientific; reference K1422).
  • the ligation product is transformed into ready-to-use competent E. coli JM 109 cells (Promega, reference L2005).
  • the selection of clones is carried out on Luria-Bertani medium containing agar and 50 ⁇ g/ml of neomycin/kanamycin.
  • the final plasmid of the positive clones is extracted following the protocol of the GeneJET plasmid minipreparation kit (Thermo scientific; reference K0503).
  • the final plasmid obtained is called pLIP1 (5.5 kb).
  • the B. subtilis I-5565 strain is then transformed with the pLIP1 plasmid using the natural transformation protocol.
  • the selection of clones is carried out on Luria-Bertani medium containing agar and 20 ⁇ g/ml of neomycin/kanamycin.
  • the positive clone is verified by colony PCR.
  • the final construct is known as B. subtilis I-5679 .
  • the Bacillus subtilis I-5679 strain produces a better concentration of mycosubtilin and a greater number of the different new isoforms presented in Example 2 .
  • composition of the modified Landy medium is as follows: glucose, 60 g/l; ammonium sulfate, 8 g/l; yeast extract, 4 g/1; MgSO 4 , 0.25 g/l; K 2 HPO 4 , 1 g/l; KCl, 0.5 g/l; CuSO 4 .5H 2 O, 1.6 mg/l; FeSO 4.7H2O , 1.2 mg/l; MnSO 4 .H 2 O, 0.4 mg/l.
  • a 10x glucose solution 400 g/l is sterilized by autoclaving at 121°C. for 10 minutes.
  • a 10x ammonium sulfate solution 80 g/l
  • a 10x yeast extract solution 40 g/l
  • a 10x mineral salt solution No.
  • a 150 ml glucose solution is taken under sterile conditions and poured into a 1 L reagent bottle. Each solution is successively added under sterile conditions, 100 ml of yeast extract solution, 100 ml of sulfate solution. ammonium, 100 ml of mineral solution no. 1, and finally 1 ml of mineral solution no. 2.
  • a 20xMOPS buffer (2M) is produced by dissolving 3-N-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma, part number M3183) in water, the pH is adjusted to 7.0 by NaOH. Then the solution is sterilized on a filter with a porosity of 0.2 ⁇ m. To produce 1 liter of modified Landy's medium buffered at 100 mM with MOPS, 50 ml of 20xMOPS was added to the mixture.
  • MOPS 3-N-Morpholinopropanesulfonic acid
  • the final pH was adjusted to 7.0 using sterile 6M NaOH solution.
  • the volume is made up to 1 liter with sterile water.
  • the inoculum was prepared from a stock of strains stored at -80°C in 25% glycerol.
  • the glycerol stock was inoculated into Luria-Bertani (LB) broth for 7–8 hours.
  • the culture was then spread on Luria-Bertani (LB) agar plates containing 20 ⁇ g/ml kanamycin (kanamycin sulfate, Sigma, reference 60615) to obtain a single colony. The plate is incubated at 37°C overnight.
  • a P1 preculture is then produced with a single colony from the plate grown overnight inoculated into a final volume of 10 ml of Luria-Bertani (LB) broth containing 20 ⁇ g/ml of kanamycin contained in a 100 ml Erlenmeyer flask.
  • the culture is incubated at 30°C with shaking at 200 rpm for 10 to 14 hours.
  • the culture is centrifuged at 2000 g for 10 minutes at 25°C.
  • the cells are washed with physiological water and finally suspended in sterile physiological water. The suspension is then ready for inoculation.
  • a P2 preculture is produced with an inoculation OD 600 0.2 in a final volume of 100 ml of modified Landy medium contained in a 1 L Erlenmeyer flask.
  • the culture is incubated at 30°C with shaking at 200 rpm for 7 to 8 hours.
  • the cells of the P2 preculture are harvested and washed with physiological water and finally suspended in sterile physiological water. This suspension is used for inoculation.
  • the inoculation OD 600 is between 0.1 and 0.2.
  • the volume of Erlenmeyer flasks is 1L containing 100 ml of modified Landy medium.
  • ten 1L Erlenmeyer flasks containing 100 ml of modified Landy's medium are prepared to have a high concentration of mycosubtiline.
  • the culture is incubated at 30°C with shaking at 200 rpm for a maximum of 72 hours. After the incubation period, the culture supernatant is used for lipopeptide analysis.
  • the cultures are mixed with acetonitrile (VWR chemical, reference 83639.320) with a final concentration of acetonitrile 50%.
  • the mixture is centrifuged at 8500 g for 10 minutes at 25°C.
  • the cells are separated and the supernatant is used to concentrate the mycosubtilin using a laboratory rotary evaporator (Buchi, Rotavapor R300).
  • the sample was concentrated to a final concentration of 3 g/L.
  • mycosubtilin production was increased 6-fold in strain I-5565 compared to its parent strain LBS0, while mycosubtilin production of strain I-5679 (where the native mycosubtilin promoter was replaced by the constitutive prepU in I-5565) is 28.5 and 2.5 times higher than that of LBS0 and I-5565 respectively. If we compare these results to those obtained with the B. subtilis strain BBG125 previously obtained by suppressing the production of surfactin and inserting the PrepU promoter in front of the mycosubtilin gene (WO2013/050700), strain I-5565 produces 5 times more than the BBG125 strain and the I-5679 strain produces 12 times more than the BBG125 strain.
  • the PuriFlash - interchim preparative HPLC column is used to separate isoforms.
  • the purification was carried out on the interchim US5C18HQ-250/300 column (UPTISPHERE STRATEGY C18-HQ 5um 250X30mm HPLC COLUMN).
  • Table 1 Size of acetonitrile used for the separation of mycosubtiline isoforms by preparative HPLC.
  • the different peaks representing the different isoforms of mycosubtilin are presented in the .
  • Each peak was collected in several 14 ml tubes. The quantity of tubes depends on the volume of the peak.
  • a total of 5 passages were performed (10 ml of sample for each passage).
  • Each isoform sample was then analyzed by mass spectrometry (Q-tof analysis) as described in Example 3.
  • the antifungal analysis was carried out on the different isoforms as described in Example 4.
  • the analysis of Cytotoxicity was also carried out on the different isoforms as described in Example 5 .
  • the UPLC experiments were performed on Agilent 1290 Infinity II 2D-LC technologies.
  • An Acquity UPLC BEH C18 column (2.1 ⁇ 50 mm ⁇ 1.7 ⁇ m; Waters) was used at a flow rate of 0.3 mL/min and a temperature of 40 °C.
  • the injection volume was 20 ⁇ L, and the diode array detector (DAD) scanned a wavelength spectrum between 190 and 600 nm.
  • Agilent OpenLab CDS ChemStation software and Agilent 1290 Infinity 2D-LC acquisition software were used for LC analysis.
  • Gln7-C16 Gln1,Gln3-C16; Gln3,Gln7-C16; Gln1-C16; Gln1,Gln3,Gln7-C16; Gln7-C17; Gln1,Gln3-C17; Gln3,Gln7-C17; Gln1-C17; Gln3-C18; Gln7-C18; Gln1-C18 and A-C19.
  • the antifungal activity is carried out on three different fungal strains, namely B. cinerea , Aspergillus sp. And Z. tritici .
  • three new isoforms are tested for their antifungal property.
  • a range of concentrations ⁇ g a.i./ml or ppm 0; 0.0037; 0.0146; 0.0586; 0.2344; 0.9375; 3.75 and 15 is used to determine the activity coefficient. Based on this concentration range, the EC 50 (Concentration which reduces the growth of the fungal strain by 50%) and THIS 95 (Concentration that reduces the growth of the pathogen by 95%) were calculated and presented as described in Table 5.
  • the EC 50 value of A-C16 is 0.933 ppm while Gln1-C16 is 1.048 ppm, indicating a 10% lower concentration of the former required to have the same activity as the latter.
  • the EC 95 value of A-C16 is 1.457 ppm while that of Gln1-C16 is 1.282 ppm, which indicates a 17% higher concentration of the first necessary to have the same activity as the second .
  • This new isoform (Gln1-C16) proves effective against this fungal strain.
  • the EC 50 value of A-C17 is 1.191 ppm while that of Gln1-C17 is 1.019 ppm, which indicates a 14% higher concentration of the first necessary to have the same activity as the second.
  • the EC 95 value of A-C17 is 1.905 ppm while that of Gln1-C17 is 1.290 ppm, indicating a 32% higher concentration of the former necessary to have the same activity as the latter. This new isoform proves effective against this fungal strain.
  • the EC 50 value of A-C16 is 4.258 ppm while Gln1-C16 is 1.906 ppm, indicating a 55% higher concentration of the former necessary to have the same activity as the latter.
  • the EC 95 value of A-C16 is 26.106 ppm while that of Gln3-C16 is 17.874 ppm, which indicates a 32% higher concentration of the first to have the same activity as the second.
  • the other new isoform Gln1-C17 appears effective against this fungal strain but at a higher concentration.
  • the cytotoxicity test is carried out using Vero cells and the CyQUANTTM XTT Cell Viability assay kit (provided by InvitrogenTM).
  • Samples are dissolved in 100% DMSO at a concentration of 20-50 g/L.
  • the final concentration in DMEM medium is 40 ⁇ g/L.
  • Cells were prepared in flasks containing DMEM cell culture medium with 10% FBS as follows:
  • the medium was centrifuged for 5 minutes at 300 g. Centrifuge the medium for 5 min at 300g. The medium was discarded, and the cells were resuspended. 100 ⁇ L of cells were added to 100 ⁇ L of dye then 12 ⁇ L was used for counting. The viability percentage was compared to a control of cells without any treatment.
  • the test is carried out in a 96-well plate. A range of concentrations (mg/l) 0.14; 0.28; 0.56; 1.16; 2.25; 4.5 is used to determine the toxicity limit of each isoform.
  • the EC50 can be determined, the EC50 of Gln3-C16- is greater than 4.5 mg/L, the EC50 of Gln1-C16 is 4.5 mg/L, the EC50 of A-C16 is 1.7 mg/L, which is at least 2.64 times less than the new C16 isoforms of mycosubtiline.
  • the cytotoxicity profile of the C16 isoforms is as follows Gln3-C16 ⁇ Gln1-C16 ⁇ A-C16.
  • C16 isoforms namely Gln3-C16 and Gln1-C16, appear to be significantly less toxic than the conventional isoform, A-C16.
  • the same profile is observed for the mycosubtilin-based C17 isoforms.
  • the EC50 of Gln3-C17 is greater than 4.5 mg/L, the EC50 of Gln1-C17 is approximately 3.4 mg/L, the EC50 of A-C17 is approximately 1.7 mg /L, which is at least 2 times less than the new C17 isoforms of mycosubtilin.
  • the toxicity profile is as follows Gln3-C17 ⁇ Gln1-C17 ⁇ A-C17.

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Abstract

L'invention se rapporte au domaine des molécules de biosurfactants antifongiques d'origine bactérienne. Plus particulièrement, l'invention concerne des nouvelles souches de Bacillus subtilis productrices de nouvelles isoformes de mycosubtilines, leur procédé de préparation ainsi que des compositions les contenant. Ces nouvelles isoformes de mycosubtiline présentent de meilleures activités antifongiques et des propriétés cytotoxiques diminuées par rapport aux mycosubtilines de l'art antérieur.

Description

    NOUVELLES SOUCHES DE BACILLUS SUBTILIS PRODUISANT DE NOUVELLES ISOFORMES DE MYCOSUBTILINE
  • L’invention se rapporte au domaine des molécules de biosurfactants antifongiques d’origine bactérienne. Plus particulièrement, l’invention concerne des nouvelles souches de Bacillus subtilis productrices de nouvelles isoformes de mycosubtilines, leur procédé de préparation ainsi que des compositions les contenant. Ces nouvelles isoformes de mycosubtiline présentent de meilleures activités antifongiques et des propriétés cytotoxiques diminuées par rapport aux mycosubtilines de l’art antérieur.
    • Domaine de l’invention
  • La population mondiale est en croissance et devrait atteindre 8,3 milliards en 2025 et près de 10 milliards en 2050. Selon les différentes hypothèses utilisées, la demande alimentaire mondiale pourrait progresser de 40% à 68% d'ici 2050 (Hérault, 2011). Cette augmentation de la demande pourrait être satisfaite par une agriculture encore plus intensive, entraînant une augmentation de la consommation d'eau, de combustibles fossiles, d'engrais et de produits phytosanitaires pour assurer des rendements élevés. Pour relever ces défis, la communauté scientifique et l'industrie doivent développer des approches de recherche innovantes. Dans le domaine de l'agriculture, ceci renvoie à la problématique de sécurisation des rendements et de rentabilité des exploitations tout en limitant le recours aux intrants issus de la synthèse chimique. Ces derniers font l'objet de nombreux débats et leur impact sur la santé des agriculteurs, des consommateurs, de l'environnement et sur la biodiversité a été démontré dans de nombreux cas. Partout dans le monde, les autorités ont mis en place des réglementations visant à limiter l'utilisation de composés toxiques dans les secteurs agricole, alimentaire et autres.
  • La demande de molécules d'origine biologique en agriculture est donc très importante. Un rapport récent indique que le marché des biopesticides devrait atteindre 8,5 milliards d'USD d'ici 2025. Les autres secteurs d'activité sont aussi très impactés par une pression réglementaire accrue sur les molécules de synthèse en Europe depuis la mise en œuvre en 2007 de la directive REACH. Les industriels recherchent notamment des conservateurs, des biosurfactants et de nouvelles molécules antimicrobiennes. Les métabolites secondaires microbiens produits par de nombreux micro-organismes tels que B. subtilis possèdent toutes ces propriétés.
  • Dans le secteur agricole, il existe de nombreux agents pathogènes des plantes (environ 7000 espèces) et parmi eux, Botrytis cinerea (responsable de la pourriture grise) et Zymoseptoria tritici (responsable de la septoriose du blé) se classent dans le top 10 des agents pathogènes des plantes qui ont le plus d'impact sur les cultures (Dean et al. 2012).
  • Les lipopeptides sont des molécules bioactives produites par différentes souches bactériennes et notamment les bactéries Bacillus et Pseudomonas (Jacques, 2011). Les souches de Bacillus sont capables de produire trois familles différentes de molécules, à savoir les surfactines (surfactine, pumillacidine) ; les fengycines (fengycin, plipastatine, agrastatine) ; et les iturines (iturine, mycosubtiline, bacilomycine, mojavensine). Parmi la famille des iturines, la mycosubtiline est le composé présentant l’activité antifongique la plus élevée (Besson et al., 1979). La mycosubtiline est un lipopeptide dont le cycle heptapeptidique est lié à une chaîne d'acide gras par une liaison β-amino. La longueur de la chaîne d'acide gras peut varier de C15 à C18, et l'isomérie peut être linéaire, iso ou antéiso. (Stein, 2005) . La formule classique de la chaîne peptidique est Asn/D-Tyr/D-Asn/Gln/Pro/ /D-Ser/Asn, comme décrit dans la .
  • La composition du cycle peptidique mais aussi la longueur et l'isomérie de la chaîne d'acides gras sont des facteurs qui influencent l'activité de la molécule et notamment son activité antifongique. En 2009, une étude a montré que l'isoforme antéiso-C17 de la mycosubtiline était la plus active contre la levure C. albicans. (Fickers et al., 2009). En 2013, un autre travail a étudié l'effet des différentes chaînes alkyles de la mycosubtiline contre B. cinerea. Les auteurs ont montré que l'isoforme antéiso-C17 était la plus active contre B. cinerea avec une CMI de 8 μM, suivie des isoformes n-C16 et iso-C17 (CMI = 16 μM) et iso-C16 (CMI = 32 μM). De plus, il a été montré que la présence (même à faible concentration) de la chaîne C18 améliorait significativement l'activité du mélange, ce qui suggère une activité très puissante pour cette isoforme (Béchet et al., 2013). Plus récemment, les activités antifongiques des isoformes de mycosubtiline ont été mesurées contre A. niger, les résultats ont montré que l'isoforme antéiso-C17 était la plus active contre A. niger avec une CMI de 8 μM, suivie par les isoformes n-C16 et iso-C17 (CMI = 16 μM) et iso-C16 (CMI = 32 μM). (J.-S. Guez et al., 2022).
  • De nombreuses études scientifiques ont montré le large spectre d'activité antifongique de la mycosubtiline. C'est notamment le cas contre Candida albicans, Bremia lactucae, Zymoseptoria tritici, Botrytis cinera, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum et Fusarium verticillioides Candida krusei, Paecilomyces variotii, Byssocchlamys fulva, Venturia inaequalis, Verticillium dahlia ou Aspergilus niger (Béchet et al., 2013; Chen et al., 2021; Deravel et al., 2014; Desmyttere et al., 2019; Farace et al., 2015; Fickers et al., 2009; Guez et al., 2022; Kourmentza et al., 2021; Mejri et al., 2017; Mihalache et al., 2018; Yu et al., 2021)
  • En 2011, une nouvelle isoforme de mycosubtiline a été découverte dans une souche modifiée de B. subtilis et brevetée. Cette molécule avec une chaîne d'acides gras en C17 contient une Glutamine en position 3 [Gln3] au lieu d'une Asparagine (W02013/050700). Dans ce brevet les inventeurs ont montré qu'un mélange d'isoformes de mycosubtiline contenant cette nouvelle isoforme [Gln3-C17] (même en petite quantité, de l'ordre de 1%) était aussi actif qu'un mélange ne la contenant pas, démontrant le meilleur pouvoir antifongique de cette isoforme par rapport aux autres.
  • Il existe très peu d'études sur la toxicité et l'écotoxicité des molécules lipopeptidiques produites par B. subtilis et en particulier de chaque isoforme lipopeptidique. L'écotoxicité a été étudiée sur des mélanges d'isoformes de surfactine et de mycosubtiline seules ou en mélange binaire. Les résultats de cette étude ont montré que la CE50 des mycosubtilines dans le test microtox (sur Aliivibrio fischeri) était au moins 4,5 fois inférieure à celle des surfactines. Mais aussi que la CE50 sur Daphnia magna pour les mycosubtilines (8 mg/L) est 3 fois inférieure à celle des surfactines (26 mg/L) (Deravel et al. 2014). Dans une autre étude portant sur l’iturine A, sa toxicité aiguë a été investiguée chez les rats pendant 28 jours. L'iturine A n'a montré aucun effet toxique sur les poumons, le cœur et les reins après les 28 jours de traitement, ainsi qu'après une période de récupération (14 jours) (Dey et al., 2016). Plus récemment, une étude de cytotoxicité a été réalisée avec le mélange de trois familles de lipopeptides (surfactines, fengycines et mycosubtilines) sur deux lignées cellulaires différentes : les cellules Caco-2 et Vero. Les résultats ont montré que le mélange d'isoformes de mycosubtilines présente une CI50 entre 10 et 20 mg/L sur ces deux lignées cellulaires (Kourmentza et al., 2021).
  • A ce jour, il existe un besoin de disposer de molécules antifongiques en grande quantité et aux propriétés améliorées afin de rendre ces alternatives biologiques économiquement viables à l'échelle industrielle.
    •
  • Les inventeurs ont développé de nouvelles souches de Bacillus subtilis capables de produire de nouvelles isoformes de mycosubtiline qui sont à la fois plus efficaces en tant qu’agent antifongique et moins cytotoxiques que les mycosubtilines décrites à ce jour.
  • Ainsi l’invention concerne deux nouvelles souches de Bacillus subtilis modifiées génétiquement par 7 mutations de sorte qu’elles produisent de nouvelles isoformes de mycosubtiline. Ces deux souches sont déposées après de la CNCM sous les numéros CNCM I-5565 et CNCM I-5679.
  • L’invention concerne 2 nouvelles isoformes de mycosubtiline à savoir Gln1-C16 et Gln1-C17 ainsi que des compositions les contenant.
  • L’invention concerne aussi l’utilisation de nouvelles isoformes en tant qu’agent antifongique, en particulier contre les souches B. cinerea, Aspergillus sp et Z. tritici.
  • Enfin, l’invention concerne un procédé de production d’au moins une de ces nouvelles isoformes par mise en culture d’une souche de Bacillus subtilis génétiquement modifiée conformément à l’invention.
    • Avantages de l’invention
  • La présente invention donne accès à des surfactants adaptés à une utilisation en agriculture à savoir des composés qui ne soient pas toxiques et qui soient disponibles en grande quantité.
  • En effet, les nouvelles isoformes de mycosubtiline présentées ici présentent des activités antifongiques supérieures à celles des mycosutilines décrites à ce jour. En particulier, l’isoforme Gln1C16 présente une activité antifongique supérieure à celle de l’isoforme C16. De plus, ces nouvelles isoformes présentent une cytotoxicité moindre comparée à ces mêmes mycosubtilines connues.
  • En agriculture, ces nouvelles isoformes peuvent être utilisées dans la production de biopesticides ou de biosurfactants destinés à l'industrie phytosanitaire pour le biocontrôle des maladies des plantes ou le traitement post-récolte, ainsi que pour la stimulation de la croissance des plantes.
  • De tels surfactants présentent un intérêt d’usage dans d’autres domaines du fait de leurs propriétés, notamment dans les domaines de l'industrie alimentaire, cosmétique, chimique, médicale, pharmaceutique, détergente, pétrolière et de l'environnement.
    •  DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
  • Un premier objet de l’invention concerne la souche Bacillus subtilis déposée le 30 juillet 2020 sous le numéro CNCM I-5565 à la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  • Une seconde souche particulière selon l’invention est la souche Bacillus subtilis déposée le 05 mai 2021 sous le numéro CNCM I-5679 dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  • La souche I-5565 présente 7 mutations responsables d’une modification du métabolisme ; cette modification a conduit à une augmentation de la production de mycosubtiline et à l’apparition de nouvelles isoformes, en particulier les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17.
  • La souche I-5679 diffère de la souche I-5565 par la nature du promoteur permettant l’expression de la mycosubtiline : la souche I-5565 comprend le promoteur natif alors que la souche I-5679 a été modifiée par remplacement du promoteur endogène par le promoteur constitutif PrepU. Le changement de promoteur a conduit à une augmentation de la production globale de la mycosubtiline : de la forme classique de mycosubtiline et de celle de nouvelles isoformes produites par la souche I-5565.
  • Ainsi, l’invention concerne aussi une souche telle que définie précédemment (souche I-5565) modifiée par remplacement du promoteur endogène par le promoteur constitutif PrepU caractérisée en ce qu’il s’agit de la souche Bacillus subtilis déposée le 05 mai 2021 sous le numéro CNCM I-5679 dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  • Les souches selon l’invention sont des souches de Bacillus sp. modifiée génétiquement et caractérisées en qu’elles comprennent au moins les mutations suivantes :
    • remplacement d’une sérine par une asparagine du fait d’une mutation en position 1118 du gène resE_1
    • remplacement de l'acide aspartique par une asparagine du fait d’une mutation en position 3466 du gène rpoC
    • remplacement d’une alanine par une valine du fait d’une mutation en position 886 du gène addB
    • remplacement d’un acide glutamique par une lysine du fait d’une mutation en position 121 du gène araA
    • remplacement d’une proline par une sérine du fait d’une mutation en position 154 du gène cotY
    • remplacement d’une sérine par une phénylalanine du fait d’une mutation en position 32 du gène 03427
    • remplacement d’une sérine par une phénylalanine du fait d’une mutation en position 92 du gène 03457
  • Les mutations opérées dans ces gènes sont en particulier des mutations nucléotidiques.
  • Un exemple de chacun des gènes mutés est présenté dans le listage de séquences à savoir :
    • le gène resE_1 muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 1
    • le gène rpoC muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 2
    • le gène addB muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 3
    • le gène araA muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 4
    • le gène cotY muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 5
    • le gène 03427 muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 6
    • le gène 03457 muté est représenté par la séquence SEQ ID NO. 7
  • D’autres mutations sont possibles du fait que le code génétique est dégénéré. L’homme du métier saura déterminer les mutations alternatives à celles décrites dans ces séquences.
  • Les inventeurs ont montré que la combinaison de ces 7 mutations permet l’augmentation globale de la production de mycosubtiline et en particulier la production de nouvelles isoformes de mycosubtiline, telles que les isoformes Gln1- C16 et Gln1- C17.
  • Les sept gènes modifiés dans les souches de Bacillus sp. selon l’invention sont les suivants :
  • - resE est un gène qui code pour une protéine similaire à celle des systèmes de transduction de signaux à deux composants et joue un rôle régulateur dans la respiration. ResE, est impliqué dans la régulation globale de la respiration aérobie et anaérobie chez B. subtilis. ResE (ainsi que ResD) sont des protéines régulatrices à deux composants qui sont nécessaires à l'activation transcriptionnelle de Fnr en cas de limitation en oxygène chez B. subtilis. (Sun et al., 1996). La production de mycosubtiline est fortement impactée par les conditions d'oxygénation (Guez et al., 2008).
  • - rpoC est un gène responsable de la sous-unité bêta de l'ARN polymérase dirigée par l'ADN. Une mutation de rpoC conduit à une expression élevée des régulateurs sensibles au stress, notamment ceux des facteurs σ de la fonction extracytoplasmique (ECF) (σM, σW et σX) et du facteur σ de stress général (σB). SigB (σB) joue un rôle important dans la réponse adaptative, y compris la réponse de la présence pathogène conduisant à un impact positif sur les molécules antifongiques produites par les espèces de Bacillus. (Lee et al., 2013; Rodriguez Ayala et al., 2020).
  • - araA est un gène codant la L-arabinose isomérase. Ce gène est réprimé par une concentration élevée de glucose (Sá-Nogueira et al., 1997).
  • - addB est un gène qui contribue à la réparation de l'ADN et à la recombinaison. L'enzyme est fonctionnelle en tant qu'hétérodimère des sous-unités AddA et AddB, qu'elle est une hélicase d'ADN rapide et processive, et qu'elle catalyse le déroulement de l'ADN (Yeeles et al., 2009). Une mutation dans ce gène peut avoir un impact sur l'activité de l'enzyme (Haijema et al., 1996).
  • - cotY est le gène qui code pour la la protéine Y de l'enveloppe de la spore. Ce gène fait partie du régulateur sigE et il y a un site de liaison SigE dans la région du promoteur de l'opéron mycosubtiline. (Wu et al., 2015).
  • - Le gène 03427 code pour une protéine dont la fonction n'est pas précisément décrite dans la littérature mais qui pourrait être apparentée à la protéine Rap. Les protéines Rap chez B. subtilis régulent le niveau de phosphorylation ou l'activité de liaison à l'ADN des régulateurs de réponse tels que Spo0F, impliqué dans l'initiation de la sporulation, ou ComA, régulant le développement de la compétence (Diaz et al., 2012). Les protéines Rap sont également impliquées dans l'expression des gènes codant pour la biosynthèse des lipopeptides.
  • - Le gène 03457 code pour une protéine dont la fonction est inconnue mais qui pourrait être liée au transport des métabolites secondaires.
  • Un deuxième objet de l’invention concerne une nouvelle isoforme de mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17.
  • Ces molécules sont représentées aux Figures 4 et 5 respectivement.
  • Il est à noter que les souches I-5565 et I-5679 produisent 13 autres nouvelles mycosubtilines mineures (en termes de niveau de production) à savoir : Gln7-C16 ; Gln1, Gln3-C16 ; Gln3,Gln7-C16 ; Gln1-C16 ; Gln1,Gln3,Gln7-C16 ; Gln7-C17 ; Gln1,Gln3-C17 ; Gln3,Gln7-C17 ; Gln1-C17 ; Gln3-C18 ; Gln7-C18 ; Gln1-C18 et A-C19.
  • Un deuxième objet de l’invention concerne une composition comprenant au moins une mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17.
  • Une composition selon l’invention comprend une, deux ou trois isoformes de mycosubtiline, à savoir :
    • l’isoforme Gln1-C16
    • l’isoforme Gln1-C17
    • les isoformes Gln1-C16 et Gln3-C16
    • les isoformes Gln1-C17 et Gln3-C16
    • les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17
    • les isoformes Gln1-C16, Gln1-C17 et Gln3-C16.
  • L’isoforme Gln3-C16 est représenté à la .
  • Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition comprend au moins l’isoforme Gln1-C16.
  • De plus, une composition selon l’invention peut contenir au moins l’une des mycosubtilines nouvelles choisie parmi Gln7-C16 ; Gln1, Gln3-C16 ; Gln3,Gln7-C16 ; Gln1-C16 ; Gln1,Gln3,Gln7-C16 ; Gln7-C17 ; Gln1,Gln3-C17 ; Gln3,Gln7-C17 ; Gln1-C17 ; Gln3-C18 ; Gln7-C18 ; Gln1-C18 et A-C19, ainsi que toute autre mycosubtiline connue.
  • Une telle composition peut aussi comprendre d’autres lipopeptides que la mycosubtiline (qui est une iturine), notamment :
    • des molécules de la famille des iturines, telles que l’iturine A, la mojavensine, et les bacillomycines A, B, C, D, F et L ;
    • des molécules de la famille des surfactines , telles que les surfactines A, B ou C, la lichenysine et la pumilacidine ;
    • des molécules de la famille des fengycines, telles les fengycines A et B, les plipastatines A et B  et les agrastatines A et B. 
  • Une telle composition peut également comprendre d’autres composants telles que d’autres molécules tensioactives, des conservateurs, de adjuvants.
  • Les molécules tensioactives regroupent les molécules amphiphiles, les surfactants, les lipopeptides, comme par exemple, la surfactine, la fengycine, les tensioactifs chimiques et les tensioactifs biologiques, comme par exemple les rhamnolipides, les polysaccharides, etc….
  • Parmi les agents tensioactifs, on peut citer l’héparine, l’acide hyaluronique, le dextrane, l’amylose, le chitosane, des tensioactifs anioniques dérivés d’acides aminés, des tensioactifs non-ioniques dérivés des poly-glycosides, des tensio-actifs hydrotropes, des lipopeptides tels que les isomères de surfactine et/ou les isomères de fengycine (ou plipastatine), les rhamnolipides et les huiles végétales. 
  • Les tensioactifs de la famille des tensio-actifs non ioniques sont choisis par exemple parmi : les fatty alcohol axalkylate, le pentylène glycol et ses dérivés, les molécules hydrotropes de type alkylpolyglycoside (alkypolyglycoside et alkylethoxypolyglycoside, les molécules de type agent de texture polyglycoside (gomme de xanthane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme de caroube, gomme de tamarin, pectine, gomme gellane, carraghénates, agar-agar, alginates.)  
  • Les tensioactifs de la famille des tensio-actifs anioniques sont choisis par exemple parmi les surfactines, les fengycines, le laureth sulfate de sodium et ses dérivés ou des dérivés d’acide aminés. 
  • Les tensioactifs de la famille des huiles sont choisis par exemple parmi les huiles et extraits d’huiles modifiés (acifidiés, méthylés, esterifiés) notamment issus de : amande, arachide, argan, avocat, colza, ricine, lorenzo, neem, noisette, noix de cajou, noix de macadamia, olive, pistache, riz, tournesol oléique, cameline, lin, bourrache, carthame, chanvre, coton, germe de blé, mais, noix, oeillette, onagre, orge, pépins de courge, pépins de raisin, pois, sésame, soja, tournesol.  
  • Parmi les adjuvants, certains peuvent faciliter la pénétration de la composition dans la plante (comme les huiles), d’autres augmenter la surface de contact entre la feuille des plantes et la composition (les mouillants), d’autres peuvent absorber l’humidité de l’air et lutter ainsi contre la dessiccation (les sels), d’autres encore peuvent fixer la composition sur les feuilles de sorte à limiter le lessivage et la volatilisation. Les adjuvants sont donc à adapter aux modes d’action des compositions (racinaires, contact, systémique ou pénétrant), aux types de formulations des produits et aux types de plantes ciblées (feuilles glabres ou velues, épaisseur des cuticules, stades des plantes, positions des stomates …). 
  • Un troisième objet de l’invention concerne l’utilisation d’au moins une mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17 ou d’une composition comprenant une telle mycosubtiline (telle que décrite précédemment) en tant qu’agent antifongique.
  • Ces deux isoformes sont efficaces contre un champignon ascomycète, en particulier contre les souches B. Cinera, Aspergillus sp. et Z. tritici.
  • Dans un mode de réalisation particulier, cette utilisation consiste à utiliser au moins une mycosubtiline correspondant à l’isoforme Gln1-C16 comme agent antifongique contre la souche B. Cinera.
  • Dans un autre mode de réalisation particulier, cette utilisation consiste à utiliser au moins une mycosubtiline correspondant à l’isoforme Gln1-C17 comme agent antifongique contre la souche Aspergillus sp.
  • Dans encore un autre mode de réalisation particulier, cette utilisation consiste à utiliser au moins une mycosubtiline correspondant à l’un des isoformes Gln1-C16 ou Gln3-C16 comme agent antifongique contre la souche Z. tritici. Un mode de réalisation particulier consiste à utiliser Gln1-C16 ou Gln1-C17 en association avec Gln3-C16 comme agent antifongique contre la souche Z. tritici.
  • Un quatrième objet de l’invention concerne un procédé de production d’une composition antifongique consistant à cultiver une souche Bacillus modifiée génétiquement telle que définie précédemment.,
  • Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de production permet de produire au moins une nouvelle isoforme de mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17 en cultivant une souche Bacillus modifiée génétiquement telle que définie précédemment.
  • De manière séquentielle, ce procédé consiste à :
  • -mettre une souche de Bacillus sp. selon l’invention en culture
  • - incuber cette souche dans un milieu de culture approprié
  • - récolter la souche et/ou le surnageant de culture.
  • Ce procédé peut se poursuivre par une ou plusieurs des étapes suivantes:
    • purification des mycosubtilines (globale ou différenciée par isoforme)
    • concentration de la solution comprenant la mycosubtiline ou les isoformes d’intérêt de la mycosubtiline
    • déshydratation de solution comprenant la mycosubtiline ou les isoformes d’intérêt de la mycosubtiline
  • Les nouvelles isoformes de mycosubtiline décrites précédemment ainsi que les compositions les contenant peuvent être utilisées dans de nombreuses applications du fait de leurs propriétés tensioactives et/antifongiques et de leur absence ou faible niveau de toxicité :
    • En agriculture : production de biopesticides ou de biosurfactants destinés à l'industrie phytosanitaire pour le biocontrôle des maladies des plantes ou le traitement post-récolte ou comme agent de stimulation de la croissance des plantes
    • Dans l'industrie alimentaire : agent de conservation
    • En cosmétique : agent de conservation et en tant qu’agent de formulation
    • En chimie
    • Dans le domaine médical et pharmaceutique : action ou prévention antifongique, agent de conservation
    • En tant que détergent
    • Dans l’industrie pétrolière
    • Dans le domaine de la protection de l'environnement : lutte biologique contre les nuisibles, agent de formulation non toxique.
  • Elles peuvent donc être utilisées dans des applications non thérapeutiques telles que les domaines de l’agriculture et de l'industrie alimentaire, chimique, des détergents, pétrolière et de l'environnement, ou dans des applications médicales telles que les domaines cosmétique, médical et pharmaceutique.
  • La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
    • DESCRIPTION DES FIGURES
  •  : Formule classique de la mycosubtiline A-C17 (n=13)
  •  : Représentation schématique du chromatogramme de la HPLC préparative. Les pics P3, P5, P6, P7 et P8 sont des isoformes classiques de la mycosubtiline, tandis que les pics P1, P2 et P4 sont de nouvelles isoformes de la mycosubtiline. L'acide aminé modifié dans l'anneau peptidique a été marqué.
  •  : Formule de l’isoforme de la mycosubtiline Gln3-C16
  •  : Formule de la nouvelle isoforme de la mycosubtiline Gln1-C16
  •  : Formule de la nouvelle isoforme de la mycosubtiline Gln1-C17
  • : Analyse quantitative de la mycosubtiline produite par les nouvelles souches modifiées de Bacillus subtilis.
  • : Pourcentage du test de viabilité cellulaire des cellules vero traitées avec différentes isoformes de mycosubtiline à différentes concentrations de chaque isoforme.
    • EXEMPLES
  • E XEMPLE 1 : Construction de s souche s Bacillus subtilis I-5565 et I-5679
  • La souche Bacillus subtilis I-5679 dérive de la souche I-5565 ; les constructions de ces souches sont décrites ci-après
  • Un premier dépôt de souche a été effectué le 30 juillet 2020 sous le numéro CNCM I-5565 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France). Un deuxième dépôt de souche a été effectué le 05 mai 2021 sous le numéro CNCM I-5679 dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  • 1.1 Procédure pour obtenir la souche B. subtilis I-5565
  • La souche I-5565 a été construite à partir d’une souche B. subtilis déposée le 06 février 2020 sous le numéro CNCM I-5487 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  • Dans cette souche I-5487, sept gènes ont été modifiés (resE, rpoC, addB, araA, cotY, 03427 et 03457) en effectuant une modification ponctuelle, c'est-à-dire qu'un seul nucléotide est changé. La suppression ou la modification d'un seul nucléotide (mutation ponctuelle) peut changer la séquence d'acides aminés, ce qui entraîne un nouveau phénotype sur la souche mutante. Pour réaliser ce type de mutation génétique, différentes techniques liées au génie génétique peuvent être utilisées :
    • La méthode d'ingénierie des génomes médiée par CRISPR-Cas9 dépassé les méthodes précédentes en termes de précision et a permis de créer des mutants fiables sans ADN étranger dans de nombreux types sauvages de souches bactériennes, y compris chez B. subtilis, avec une efficacité de mutation ponctuelle allant jusqu'à ∼68%. Cette méthode peut créer un nouveau phénotype sans introduire aucun ADN étranger dans le génome (So et al., 2017).
    • La mutagenèse dirigée est l'une des bases de la biologie moléculaire moderne, permettant un contrôle parfait de la séquence des protéines. Plusieurs stratégies ont été développées, le système de mutagenèse dirigée QuikChange™ développé par Stratagene (La Jolla, CA) étant probablement le plus utilisé. QuikChange™ fonctionne en utilisant une paire d'amorces complémentaires avec une mutation. Dans une série de cycles de PCR, ces amorces s'hybrident à l'ADN matrice, répliquant l'ADN plasmidique avec la mutation. Le produit d'ADN mutant présente une rupture de brin (nick). Le pool d'ADN résultant (mutant et parental) est ensuite traité avec de la DpnI pour détruire l'ADN parental méthylé de l'ADN mutant non méthylé nouvellement synthétisé et transformé en cellules E. coli où la cassure est ligaturée par les enzymes de réparation de l'hôte. (Liu & Naismith, 2008).
    • La mutagenèse par agent mutagène ciblé. Cette méthode repose sur l'utilisation d'agent mutagène chimique (méthane sulfonate d'éthyle (EMS) et méthane sulfonate de méthyle (MMS) ou des agents physiques comme une forte exposition aux rayons ultraviolets (UV)).  une modification génétique se produit et crée un changement de phénotype. L'EMS sera choisi pour cibler les région riches en G-C, les UV seront choisis pour cibler une région riche en A-T. 
  • Après la modification génétique, en utilisant la procédure de mutation décrite ci-dessus, des mutants intéressants ont été obtenus. La méthode utilisée pour le criblage des souches mutantes comprend la dilution d'une unité de volume de stock de la bibliothèque mutante dans une unité de volume d'eau physiologique. La suspension cellulaire est étalée sur des plaques de gélose nutritive (fournie par Condalab) pour obtenir des colonies uniques. Plusieurs colonies uniques sont ensuite prélevées à l'aide du Qpix 460 (de Molecular Devices) et inoculées dans un milieu de culture nutritif. Après incubation à 30°C pendant 24h, les cellules sont récoltées, et le surnageant est utilisé pour l'analyse de la mycosubtiline par chromatographie liquide haute performance en phase inverse comme décrit dans l'exemple 2. Dans une mise en œuvre différente, d'autres milieux de culture peuvent être utilisés tels que le milieu LB, le milieu Landy ou le milieu Cooper.
  • En utilisant cette méthodologie après plusieurs séries de procédure de mutation ponctuelle, la souche B. subtilis I-5565 a été sélectionnée. Le séquençage du génome à l'aide de Illumina Paired end 2*150 bp (Library prepared fowling Nextera XT) de cette souche a montré des changements dans la séquence de ces sept gènes comme décrit ci-après.
  • 1.2 Caractérisation génétique de la souche B. subtilis I- 556 5
  • Le séquençage du génome de la souche B. subtilis I-5565 a été réalisé à l'aide d'Illumina Paired end 2*150 bp (Bibliothèque préparée par fowling Nextera XT). Les résultats du séquençage du génome confirment des changements dans la séquence nucléotidique de sept gènes, à savoir : resE, rpoC, addB, araA, cotY, 03427 et 03457.
  • L'impact de ces changements nucléotidiques a ensuite été analysé et confirmé sur la structure primaire des protéines correspondantes, et est décrit ci-après :
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement d’une sérine par une asparagine du fait d’une mutation dans le gène RseE_1 en position 1118.
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement de l'acide aspartique par une asparagine dans le gène RpoC en position 3466.
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement d’une alanine par une valine du fait d’une mutation dans le gène AddB en position 886.
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement d’un acide glutamique par une lysine du fait d’une mutation dans le gène AraA en position 121.
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement d’une proline par une sérine du fait d’une mutation dans le gène CotY en position 154.
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement d’une sérine par une phénylalanine du fait d’une mutation dans le gène 03427 en position 32.
  • - changement dans la séquence d'acides aminé par remplacement d’une sérine par une phénylalanine du fait d’une mutation dans le gène 03457 en position 92.
  • En comparaison avec B. subtilis LBS0, la souche Bacillus subtilis I-5565 produit plus de mycosubtiline comme présenté dans l'exemple 2 et différentes nouvelles isoformes.
    • 1.3 Protocole de construction du plasmide pLIP1
  • Afin de remplacer le promoteur natif de l'opéron mycosubtiline dans la souche I-5565 de B. subtilis, un plasmide hybride contenant εpbp-P repU -neo-εfenF et rep(R6K) a d'abord été construit comme suit. Le plasmide bLIP1 est digéré par les enzymes de restriction XmiI (Thermo scientific ; référence FD1484) et PaeI (Thermo scientific ; référence FD0604) pour extraire et purifier un fragment de 4,5 kilo-base paires (Kb) en suivant le protocole du kit d'extraction sur gel GeneJET (Thermo scientific ; référence K0692). Le fragment du gène pbp (950 paires de bases) est amplifié à partir de B. subtilis I-5565 en utilisant des amorces contenant des sites de restriction similaires. Le fragment amplifié est extrait et purifié. La ligature du fragment de 4,5 kb et du fragment PCR de 950 pb est effectuée en suivant le protocole du kit de ligature rapide d'ADN (Thermo scientific ; référence K1422). Le produit de ligature est transformé dans des cellules E. coli JM 109 compétentes prêtes à l'emploi (Promega, référence L2005). La sélection des clones est réalisée sur un milieu Luria-Bertani contenant de l'agar et 50μg/ml de néomycine/kanamycine. Le plasmide final des clones positifs est extrait en suivant le protocole du kit de minipréparation de plasmide GeneJET (Thermo scientific ; référence K0503). Le plasmide final obtenu est appelé pLIP1 (5,5 kb).
    • 1.4 Protocole d'obtention de B. subtilis I-5679
  • La souche B. subtilis I-5565 est ensuite transformée avec le plasmide pLIP1 en utilisant le protocole de transformation naturelle. La sélection des clones est réalisée sur un milieu Luria-Bertani contenant de l'agar et 20μg/ml de néomycine/kanamycine. Le clone positif est vérifié par PCR en colonie. La construction finale est connue sous le nom de B. subtilis I-5679. Par rapport à la souche B. subtilis I-5565, la souche Bacillus subtilis I-5679 produit une meilleure concentration de mycosubtiline et un plus grand nombre des différentes nouvelles isoformes présentées dans l'E xemple 2.
  • EXEMPLE 2 : Production et purification de la mycosubtiline à partir des nouvelles souches modifiées de B. subtilis
    • 2.1 Composition du milieu Landy modifié
  • La composition du milieu Landy modifié est la suivante : glucose, 60 g/l ; sulfate d'ammonium, 8 g/l ; extrait de levure, 4 g/1 ; MgSO4 , 0,25 g/l ; K2 HPO4 , 1 g/l ; KCl, 0,5 g/l ; CuSO4 .5H2 O, 1,6 mg/l ; FeSO4 .7H2O, 1,2 mg/l ; MnSO4 .H2 O, 0,4 mg/l.
    • 2.2 Solutions de stock
  • Pour assurer la reproductibilité de la composition du milieu, des solutions concentrées stériles sont produites. Une solution de glucose 10x (400 g/l) est stérilisée par autoclavage à 121°C. pendant 10 minutes. Une solution de sulfate d'ammonium 10x (80 g/l) ; une solution d'extrait de levure 10x (40 g/l) ; une solution de sels minéraux 10x n°1 (KHPO 10 g/l ; MgSO 2,5 g/l ; KCl, 5 g/l) ; une solution de sels minéraux 1000x n°2 (CuSO4 .5H2 O, 1.6 g/l ; FeSO4 .7H2O, 1.2 g/l ; MnSO4 .H2 O, 0.4 g/l a été acidifiée avec de l'acide sulfurique concentré pour la dissolution totale des sels, toutes ces solutions mères sont stérilisées par autoclavage à 121°C, pendant 20 minutes.
  • 2.3 Production d'un litre de milieu de Landy modifié avec MOPS
  • Une solution de glucose de 150 ml est prélevée en condition stérile et versée dans une bouteille de réactif de 1 L. On ajoute successivement chaque solution dans des conditions stériles, 100 ml de solution d'extrait de levure, 100 ml de solution de sulfate d'ammonium, 100 ml de solution de minéraux n°1, et enfin 1 ml de solution de minéraux n°2. Un tampon 20xMOPS (2M) est produit en dissolvant de l'acide 3-N-Morpholinopropanesulfonique (MOPS) (Sigma, référence M3183) dans de l'eau, le pH est ajusté à 7.0 par NaOH. Puis la solution est stérilisée sur un filtre d'une porosité de 0,2 μm. Pour produire 1 litre de milieu de Landy modifié tamponné à 100 mM avec du MOPS, 50 ml de 20xMOPS ont été ajoutés au mélange.
  • Le pH final a été ajusté à 7,0 en utilisant une solution stérile de NaOH 6M. Le volume est complété à 1 litre avec de l'eau stérile.
    • 2.4 Préparation d'un inoculum
  • L'inoculum a été préparé à partir d'un stock de souches conservé à -80°C dans du glycérol à 25%. Le stock de glycérol a été inoculé dans un bouillon Luria-Bertani (LB) pendant 7 à 8 heures. La culture a ensuite été étalée sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) contenant 20μg/ml de kanamycine (sulfate de kanamycine, Sigma, référence 60615) pour obtenir une seule colonie. La plaque est incubée à 37°C pendant une nuit. Une préculture P1 est ensuite produite avec une seule colonie de la plaque cultivée pendant la nuit inoculée dans un volume final de 10 ml de bouillon Luria-Bertani (LB) contenant 20μg/ml de kanamycine contenu dans un flacon Erlenmeyer de 100 ml. La culture est incubée à 30°C avec une agitation de 200 rpm pendant 10 à 14 heures. Après la période d'incubation P1 de la préculture, la culture est centrifugée à 2000 g pendant 10 minutes à 25°C. Les cellules sont lavées avec de l'eau physiologique et finalement mises en suspension dans de l'eau physiologique stérile. La suspension est alors prête pour l'inoculation. Une préculture P2 est produite avec une DO d'inoculation600 0.2 dans un volume final de 100ml de milieu Landy modifié contenu dans une fiole Erlenmeyer de 1 L. La culture est incubée à 30°C avec une agitation de 200 rpm pendant 7 à 8 heures.
    • 2.5 Cultures en flacons d'Erlenmeyer
  • Avant l'inoculation, les cellules de la préculture P2 sont récoltées et lavées avec de l'eau physiologique et finalement mises en suspension dans de l'eau physiologique stérile. Cette suspension est utilisée pour l'inoculation. La DO d'inoculation600est comprise entre 0,1 et 0,2. Le volume des flacons Erlenmeyer est de 1L contenant 100 ml de milieu de Landy modifié. De même, dix flacons d'Erlenmeyer de 1L contenant 100 ml de milieu de Landy modifié sont préparés pour avoir une concentration élevée de mycosubtiline. La culture est incubée à 30°C avec une agitation de 200 rpm pendant un maximum de 72 heures. Après la période d'incubation, le surnageant de la culture est utilisé pour l'analyse des lipopeptides.
  • 2.6 Concentration et purification de la mycosubtiline
  • Les cultures sont mélangées avec de l'acétonitrile (VWR chemical, référence 83639.320) avec une concentration finale d'acétonitrile 50%. Le mélange est centrifugé à 8500 g pendant 10 minutes à 25°C. Les cellules sont séparées et le surnageant est utilisé pour concentrer la mycosubtiline à l'aide d'un évaporateur rotatif de laboratoire (Buchi, Rotavapor R300). L'échantillon a été concentré jusqu'à une concentration finale de 3 g/L.
  • 2.7 Analyse quantitative de la mycosubtiline par UPLC
  • Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un système UPLC complet de marque Waters (Aqcuity H class plus) (Waters SAS, Guyancourt, France) utilisant une colonne C18 (2.1 X150mm, CORTECS. UPLC. C18.1.6µm).
    Pour analyser la mycosubtiline : 3 µL d'échantillon purifié ont été injectés et confrontés à un
    standard d'iturine A à 500 mg/L (11774, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, U.S.A.) avec un débit de 0.4 mL/min. L'élution a été réalisée en mode isocratique en utilisant un solvant eau/acétonitrile/acide formique 60/40/0,1 (v/v/v). Le temps de rétention et la dérivée seconde du spectre entre 200 et 400 nm de chaque pic ont été analysés automatiquement à l'aide du logiciel Empower 3 pour l'identification des molécules éluées.
  • Comme le montre la , des cultures de chaque souche ont été analysées en triplicate et la production de mycosubtiline des trois souches (LBS0, I-5565 et I-5679) a été comparée.
  • Comme le montre la , la production de mycosubtiline a été multipliée par 6 dans la souche I-5565 par rapport à sa souche mère LBS0, tandis que la production de mycosubtiline de la souche I-5679 (où le promoteur natif de la mycosubtiline a été remplacé par le promoteur constitutif prepU dans I-5565) est respectivement 28,5 et 2,5 fois supérieure à celle de LBS0 et I-5565 respectivement. Si l'on compare ces résultats à ceux obtenus avec la souche B. subtilis BBG125 obtenus précédemment en supprimant la production de surfactine et en insérant le promoteur PrepU devant le gène de la mycosubtiline (WO2013/050700), la souche I-5565 produit 5 fois plus que la souche BBG125 et la souche I-5679 produit 12 fois plus que la souche BBG125. En conclusion, l'interruption des gènes resE, rpoC, addB, araA, cotY, 03427 et 03457 dans la souche I-5565 a conduit de manière inattendue à une augmentation de la production bien supérieure aux résultats obtenus précédemment. Plus important encore, la combinaison de ces sept interruptions de gènes et de l'insertion du promoteur PrepU dans la souche I-5679 a encore augmenté la production de mycosubtiline d'un facteur 2,5 par rapport à la souche I-5565.
  • 2.8 Analyse préparative de la mycosubtiline par HPLC
  • La colonne HPLC préparative PuriFlash - interchim est utilisée pour séparer les isoformes. La purification a été réalisée sur la colonne interchim US5C18HQ-250/300 (COLONNE HPLC UPTISPHERE STRATEGY C18-HQ 5um 250X30mm).
  • Les paramètres utilisés pour la HPLC préparative sont les suivants :
    • Volume d'injection : 10ml
    • Phase mobile : eau/acétonitrile avec 0,1 TFA
    • Débit : 35 ml/min
    • Volume de la fraction : 14 ml et le seuil était de 3 mAU.
    • Détecteur : 214 nm
  • Le programme utilisé pour la séparation des isoformes est présenté dans le tableau 1 ci-après :
  • Temps (minutes) Acénitrile (%) Eau (%)
    0 20 80
    2 20 80
    3 43 57
    43 43 57
    44 90 10
    46 90 10
    47 20 80
    49 20 80
  • Tableau 1 : Grandeur de l'acétonitrile utilisé pour la séparation des isoformes de mycosubtiline par HPLC préparative.
  • Les différents pics représentant les différentes isoformes de la mycosubtiline sont présentés dans la . Chaque pic a été collecté dans plusieurs tubes de 14 ml. La quantité de tubes dépend du volume du pic. Un total de 5 passages a été effectué (10 ml d'échantillon pour chaque passage). Chaque échantillon d'isoforme a ensuite été analysé par spectrométrie de masse (analyse Q-tof) comme décrit dans l'exemple 3. L'analyse antifongique a été réalisée sur les différentes isoformes comme décrit dans l'exemple 4. L'analyse de cytotoxicité a également été réalisée sur les différentes isoformes comme décrit dans l'exemple 5.
  • EXEMPLE 3 : Analyse qualitative de la mycosubtiline produite par les nouvelles souches modifiées de B. subtilis
  • Les paramètres utilisés pour l'analyse LC/MS-Qtof sont les suivants :
  • Les expériences UPLC ont été réalisées sur des technologies Agilent 1290 Infinity II 2D-LC. Une colonne C18 Acquity UPLC BEH (2,1 × 50 mm × 1,7 μm ; Waters) a été utilisée à un débit de 0,3 mL/min et à une température de 40 °C. Le volume d'injection était de 20 μL et le détecteur à réseau de diodes (DAD) a balayé un spectre de longueur d'onde compris entre 190 et 600 nm. Le logiciel Agilent OpenLab CDS ChemStation et le logiciel d'acquisition Agilent 1290 Infinity 2D-LC ont été utilisés pour l'analyse LC.
  • Les paramètres utilisés pour l'UPLC sont les suivants :
    • Volume d'injection : 10µl
    • Température colonne : 40°C
    • Phase mobile : Eau / Acétonitrile avec 0,1% d'acide formique.
  • Le programme utilisé pour la séparation des isoformes est présenté dans le tableau 2 ci-après :
  • Temps (minutes) Acénitrile (%) Eau (%)
    0 37 63
    5 37 63
    7.5 45 55
    8 100 0
    10 100 0
    10.5 37 63
  • Tableau 2 : Teneur en acétonitrile utilisée pour l'analyse des isoformes de mycosubtiline par LC/MS-Qtof
  • Les analyses LC/MS-Qtof ont été réalisées à l'aide du 1290 Infinity II couplé au Jet Stream ESI-Q-TOF 6530 (Agilent Technologies) en mode négatif en utilisant les paramètres suivants : tension capillaire : 3,5 kV ; pression du nébuliseur : 35 psig ; gaz de séchage : 8 L/min ; température du gaz de séchage : 300°C ; débit du gaz de gaine : 11 L/min ; température du gaz de gaine : 350°C ; tension du fragmentateur : 175 V ; tension de l'écumoire : 65 V ; RF du ctopôle : 750 V. Des spectres de masse précis ont été enregistrés dans la gamme de m/z = 100-1200. En bref, 10 µL d'échantillon ont été injectés et séparés à l'aide d'un C18 Acquity UPLC BEH (2,1 × 50 mm × 1,7 μm ; Waters) en utilisant de l'acide formique (FA) à 0,1 % comme solvant A et de l'ACN + 0,1 % de FA comme solvant B. Le gradient a commencé avec 0 % de solvant B et a augmenté à 30 % en 5 min. Les données ont été traitées à l'aide du logiciel MassHunter Qualitative Analysis (Agilent Technologies). Le tableau 3 montre les nouvelles isoformes de mycosubtiline C16 et C17 en comparaison avec les C16 et C17 classiques obtenues à partir de l'analyse LC/MS-Qtof comme décrit ci-dessus.
  • N uméro d u pic Variantes Acide gras A A 1 A A 2 A A 3 A A 4 A A 5 A A 6 A A 7 m/z
    1 Gln3-C16 C16 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1085
    2 Gln1-C16 C16 Gln Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    3 A-C16 C16 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1071
    4 Gln1-C17 C17 Gln Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1099
    5 A-C17 C17 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1085
    6 A-C17 C17 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    7 A-C17 C17 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    8 A-C18 C18 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1099
  • Tableau 3 : Analyse des isoformes de mycosubiline réalisée par LC/MS-Qtof des différentes fractions purifiées par HPLC préparative (les nouvelles isoformes sont en caractères gras)
  • En plus de l'isoforme C16 classique de la mycosubtiline (C16-myco), de l'isoforme C17 de la mycosubtiline (C17-myco) et de l'isoforme C18 de la mycosubtiline (pic 3, pic 5, pic 6, pic 7 et pic 8), trois nouvelles isoformes ont été détectées. Les pics 1, 2 et 4, qui correspondent à C16-Gln1 et C17-Gln1, sont de nouvelles isoformes de la mycosubtiline. Il y a un remplacement de l'Asparagine par la Glutamine en troisième position pour le pic 1 alors qu'il y a un remplacement de l'Asparagine par la Glutamine en troisième position pour les pics 2 et 4.
  • Variantes Acide gras AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA m/z
    Gln3-C16 C16 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1085
    Gln7-C16 C16 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Gln 1085
    Gln1,Gln3-C16 C16 Gln Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1099
    Gln3,Gln7-C16 C16 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Gln 1099
    Gln1-C16 C16 Gln Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    A-C16 C16 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1071
    Gln1,Gln3, Gln7-C16 C16 Gln Tyr Gln Gln Pro Ser Gln 1113
    Gln3-C17 C17 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1099
    Gln7-C17 C17 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Gln 1099
    Gln1,Gln3-C17 C17 Gln Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1113
    Gln3,Gln7-C17 C17 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Gln 1113
    Gln1-C17 C17 Gln Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1099
    A-C17 C17 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    A-C17 C17 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    A-C17 C17 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1085
    A-C18 C18 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1099
    Gln3-C18 C18 Asn Tyr Gln Gln Pro Ser Asn 1113
    Gln7-C18 C18 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Gln 1113
    Gln1-C18 C18 Gln Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1113
    A-C19 C19 Asn Tyr Asn Gln Pro Ser Asn 1113
  • Tableau 4 : Analyse des isoformes de la mycosubiline réalisée par LC/MS-Qtof sur le surnageant complet des souches B. subtilis I-5565 et I-5679 (les nouvelles isoformes sont en caractères gras) (AA = acide aminé).
  • En plus des huit isoformes principales purifiées par HPLC préparative (présentées dans le tableau 3), plusieurs autres isoformes mineures ont été séparées par UPLC à partir du surnageant des souches I-5565 et I-5679. Ces iso-formes mineures ont ensuite été identifiées et caractérisées en utilisant la méthode très sensible MS-Qtof décrite ci-dessus. Comme présenté dans le tableau 4, un total de 20 isoformes ont été identifiées dans les surnageants des nouvelles souches de B. subtilis. Parmi celles-ci, 13 nouvelles isoformes mineures ont été découvertes, énumérées ici : Gln7-C16 ; Gln1,Gln3-C16 ; Gln3,Gln7-C16 ; Gln1-C16 ; Gln1,Gln3,Gln7-C16 ; Gln7-C17 ; Gln1,Gln3-C17 ; Gln3,Gln7-C17 ; Gln1-C17 ; Gln3-C18 ; Gln7-C18 ; Gln1-C18 et A-C19. En plus de toutes les nouvelles isoformes découvertes par ce travail, il s'avère également que dans nos mutants surproducteurs, les domaines d'adénylation de la mycosubtiline synthétase peuvent activer à la fois un Gln et un Asn en positions 1, 3 et 7 du cycle peptidique. Les nouvelles isoformes sont utilisées pour des expériences d'activité et de cytotoxicité afin de déterminer leur efficacité. Les isoformes sont dissoutes dans du DMSO et utilisées pour l'étude de l'activité. Les résultats sont décrits dans les exemples 4 et 5.
  • EXEMPLE 4 : Activités antifongiques des différentes isoformes de la mycosubtiline
  • L'activité antifongique est réalisée sur trois souches fongiques différentes, à savoir B. cinerea, Aspergillus sp. et Z. tritici. En plus des deux isoformes classiques, trois nouvelles isoformes sont testées pour leur propriété antifongique. Une gamme de concentrations (µg m.a./ml ou ppm) 0 ; 0,0037 ; 0,0146 ; 0,0586 ; 0,2344 ; 0,9375 ; 3,75 et 15 est utilisée pour déterminer le coefficient d'activité. Sur la base de cette gamme de concentrations, les CE50 (Concentration qui réduit de 50% la croissance de la souche fongique) et CE95 (Concentration qui réduit de 95% la croissance de l'agent pathogène) ont été calculés et présentés comme décrit dans le tableau 5.
    • 4.1 Activité antifongique sur B. cinerea
  • La valeur de la CE50 de A-C16 est de 0,933 ppm alors que Gln1-C16 est de 1,048 ppm, ce qui indique une concentration de 10% inférieure de la première requise pour avoir la même activité que la seconde. La valeur de la CE95 de l'A-C16 est de 1,457 ppm alors que celle de la Gln1-C16 est de 1,282 ppm, ce qui indique une concentration 17 % plus élevée de la première nécessaire pour avoir la même activité que la seconde. Cette nouvelle isoforme (Gln1-C16) s'avère efficace contre cette souche fongique.
  • Les deux autres isoformes testées, Gln3-C16 et Gln1-C17, se sont révélées efficaces contre cette souche fongique mais à une concentration plus élevée.
  • 4.2 Activité antifongique sur Aspergillus sp .
  • La valeur de la CE50 de A-C17 est de 1,191 ppm alors que celle de Gln1-C17 est de 1,019 ppm, ce qui indique une concentration 14% plus élevée du premier nécessaire pour avoir la même activité que le second. La valeur de la CE95 de A-C17 est de 1,905 ppm alors que celle de Gln1-C17 est de 1,290 ppm, ce qui indique une concentration 32 % plus élevée de la première nécessaire pour avoir la même activité que la seconde. Cette nouvelle isoforme s'avère efficace contre cette souche fongique.
  • Les deux autres isoformes testées, Gln1-C16 et Gln3-C16, se sont révélées efficaces contre cette souche fongique mais à une concentration plus élevée.
    • 4.3 Activité antifongique sur Z. tritici
  • La valeur de la CE50 de A-C16 est de 4,258 ppm alors que Gln1-C16 est de 1,906 ppm, ce qui indique une concentration 55% plus élevée du premier nécessaire pour avoir la même activité que le second. La valeur de la CE95 de A-C16 est de 26,106 ppm alors que celle de Gln3-C16 est de 17,874 ppm, ce qui indique une concentration 32 % plus élevée de la première pour avoir la même activité que la seconde. Ces isoformes se sont avérées efficaces contre cette souche fongique.
  • L'autre nouvelle isoforme Gln1-C17 s'avère efficace contre cette souche fongique mais à une concentration plus élevée.
  • CE 50 (µg/ml) Gln3-C16 Gln1-C16 A-C16 Gln3-C17 Gln1-C17 A-C17
    B. cinerea 9,918 1,048 0,933 1,646 0,920 0,467
    Aspergillus sp. 13,148 1,691 1,062 6,335 1,019 1,191
    Z. tritici 10,077 1,906 4,258 4,314 2,156 0,943
    CE 95 (µg/ml) Gln3-C16 Gln1-C16 A-C16 Gln3-C17 Gln1-C17 A-C17
    B. cinerea 14,232 1,282 1,457 3,437 1,117 0,677
    Aspergillus sp. 14,772 3,040 1,374 13,659 1,290 1,905
    Z. tritici 17,874 24,286 26,106 16,078 17,040 18,010
  • Tableau 5 : Activité antifongique de 6 isoformes différentes de mycosubtiline sur trois champignons phytopathogènes.
    • EXEMPLE 5 : Tests de cytotoxicité
  • Le test de cytotoxicité est réalisé à l'aide de cellules Vero et du kit CyQUANT™ XTT Cell Viability assay (fourni par Invitrogen™).
  • Les échantillons sont dissous dans du DMSO à 100% à une concentration de 20-50 g/L. La concentration finale dans le milieu DMEM est de 40 µg/L. Les cellules ont été préparées dans des flacons contenant un milieu de culture cellulaire DMEM avec 10% de FBS comme suit :
  • Un flacon de 175ml contenant 20-30 millions de cellules avec 25ml de milieu et 2ml de trypsine a été ajouté. Puis le milieu a été jeté car les cellules sont attachées à la paroi du flacon. Rincer deux fois avec du PBS, puis la trypsine a été ajoutée pour détacher les cellules de la paroi du flacon. Le mélange a été incubé 5 minutes à 37°C. Pour inactiver la trypsine, 6 ml de trypsine ont été ajoutés au milieu (deux fois le volume de la trypsine originale dans le milieu).
  • Dans un flacon de 50 ml, le milieu a été centrifugé 5 minutes à 300 g. Centrifuger le milieu, 5min à 300g. Le milieu a été jeté, et les cellules ont été remises en suspension. 100 µL de cellules ont été ajoutés à 100µL de colorant puis 12 µL ont été utilisés pour le comptage. Le pourcentage de viabilité a été comparé à un contrôle de cellules sans aucun traitement.
  • L'essai est réalisé dans une plaque de 96 puits. Une gamme de concentrations (mg/l) 0,14 ; 0,28 ; 0,56 ; 1,16 ; 2,25 ; 4,5 est utilisée pour déterminer la limite de toxicité de chaque isoforme.
  • Les résultats présentés dans la montrent que le pourcentage de cellules Vero viables est significativement plus élevé en présence des nouvelles isoformes C16 et C17 par rapport aux isoformes habituelles A-C16 et A-C17. A partir de ces données, la CE50 peut être déterminée, la CE50 de la Gln3-C16- est supérieure à 4,5 mg/L, la CE50 de la Gln1-C16 est à 4,5 mg/L, la CE50 de la A-C16 est de 1,7 mg/L, ce qui est au moins 2,64 fois moins que les nouvelles isoformes C16 de la mycosubtiline. Le profil de cytotoxicité des isoformes C16 est le suivant Gln3-C16 < Gln1-C16 < A-C16. Les isoformes C16, à savoir Gln3-C16 et Gln1-C16, se révèlent nettement moins toxiques que l'isoforme conventionnelle, l'A-C16. Le même profil est observé pour les isoformes C17 à base de mycosubtiline. La CE50 de la Gln3-C17 est supérieure à 4,5 mg/L, la CE50 de la Gln1-C17 est d'environ 3,4 mg/L, la CE50 de la A-C17 est d'environ 1,7 mg/L, ce qui est au moins 2 fois moins que les nouvelles isoformes C17 de la mycosubtiline. Pour les isoformes C17, le profil de toxicité est le suivant Gln3-C17< Gln1-C17 < A-C17.
    •

Claims (11)

  1. Souche de Bacillus sp modifiée génétiquement caractérisée en ce qu’il s’agit de la souche Bacillus subtilis déposée le 30 juillet 2020 sous le numéro CNCM I-5565 à la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  2. Souche telle que définie à la revendication 1 modifiée par remplacement du promoteur endogène par le promoteur constitutif PrepU et caractérisée en ce qu’il s’agit de la souche Bacillus subtilis déposée le 05 mai 2021 sous le numéro CNCM I-5679 dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris, France).
  3. Nouvelle Isoforme de mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1- C16 et Gln1- C17.
  4. Composition comprenant au moins une mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17.
  5. Utilisation d’au moins une mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17 en tant qu’agent antifongique dans les domaines de l’agriculture et de l'industrie alimentaire, chimique, des détergents, pétrolière et de l'environnement
  6. Mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17 pour son utilisation en tant qu’agent antifongique dans les domaines cosmétique, médical et pharmaceutique.
  7. Utilisation selon la revendication 5 dans laquelle on utilise au moins une mycosubtiline correspondant à l’isoforme Gln1-C16 comme agent antifongique contre la souche B. cinera.
  8. Utilisation selon la revendication 5 dans laquelle on utilise au moins une mycosubtiline correspondant à l’isoforme Gln1-C17 comme agent antifongique contre la souche Aspergillus sp.
  9. Utilisation selon la revendication 5 dans laquelle on utilise au moins une mycosubtiline correspondant à l’isoforme Gln1-C16 comme agent antifongique contre la souche Z. tritici.
  10. Utilisation d’au moins une mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17 et de l’isoformeGln3-C16 comme agent antifongique contre la souche Z. tritici dans les domaines de l’agriculture et de l'industrie alimentaire, chimique, des détergents, pétrolière et de l'environnement.
  11. Procédé de production d’au moins une nouvelle isoforme de mycosubtiline choisie parmi les isoformes Gln1-C16 et Gln1-C17 consistant à cultiver une souche telle que définie à l’une des revendications 1 ou 2.
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