EP4508230A1 - Procédé de préparation d'un composé de formule (i) par fermentation - Google Patents

Procédé de préparation d'un composé de formule (i) par fermentation

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Publication number
EP4508230A1
EP4508230A1 EP23719748.8A EP23719748A EP4508230A1 EP 4508230 A1 EP4508230 A1 EP 4508230A1 EP 23719748 A EP23719748 A EP 23719748A EP 4508230 A1 EP4508230 A1 EP 4508230A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
formula
compound
preparing
carried out
present
Prior art date
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Pending
Application number
EP23719748.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laurent Garel
Guillaume PIREAU
Chenglu DAVID
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Specialty Operations France SAS
Original Assignee
Specialty Operations France SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Specialty Operations France SAS filed Critical Specialty Operations France SAS
Publication of EP4508230A1 publication Critical patent/EP4508230A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group

Definitions

  • the present invention relates to a process for preparing a compound of formula (I) comprising a step (a) in which a substrate is transformed into a compound of formula (I) by bioconversion in the presence of a microorganism characterized in that step (a) is carried out under non-sanitized conditions, preferably under non-sterile conditions.
  • Vanillin can be obtained by different methods known to those skilled in the art, and in particular by the following two routes:
  • a biotechnological process including in particular the cultivation of a microorganism capable of allowing the biotransformation of a fermentation substrate into vanillin.
  • Such a process is known in particular from application EP0885968 in which the fermentation substrate is ferulic acid.
  • US patent 5017388 describes a process in which the fermentation substrate is eugenol and/or isoeugenol. These processes result in the preparation of a vanillin called natural vanillin.
  • vanillin can also be prepared according to a route described as “bio-based” in which the vanillin comes from lignin, we can cite in particular documents US 2745796, DE1132113 and the article entitled “Preparation of lignin from wood dust as vanillin source and comparison of different extraction method” by Azadbakht et al in International Journal of Biology and Biotechnology, 2004, vol 1, No 4, pp 535-537, or prepared from materials of natural origin, we can cite in particular document WO 2019/020773. Frambinone can also be obtained by different methods and in particular by a bioconversion process as described in document CN 112391418.
  • the present invention aims to provide a process for preparing a compound of formula (I) that is simple to implement and whose ecological and/or energy footprint is improved.
  • a first subject of the present invention relates to a process for preparing a compound of formula (I) comprising a step (a) in which a substrate is transformed into a compound of formula (I) by bioconversion in the presence of a characterized microorganism in that step (a) is carried out under non-sterile conditions.
  • the growth of a microorganism refers to a process in which said microorganism multiplies. Growth results in the production of biomass.
  • bioconversion refers to a biotechnological process in which a microorganism allows the transformation of a substrate into a bioconversion product.
  • the microorganism may be a wild strain, genetically modified obtained by molecular biology or mutated, in particular by random or directed mutagenesis.
  • process carried out under aseptic conditions refers to a process carried out under conditions free of any germs and/or microorganisms.
  • process carried out in sterile conditions refers to a process carried out in conditions free of any germ and/or microorganism likely to be deleterious to the microorganism capable of transforming a substrate made of compound of formula (I) used in the context of the process of the present invention.
  • a deleterious effect on the microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I) can be measured by the rate of conversion of said substrate into a compound of formula (I).
  • asepsis or sterilization can be obtained by any method, in particular thermal, chemical, mechanical or by radiation, allowing the elimination of germs and/or microorganisms. Asepsis or sterilization can be carried out on the fluids, raw materials, and/or devices used as part of the process according to the present invention.
  • Sterilization by dry or moist heat carried out by raising the temperature to a sufficient temperature, followed by maintaining this temperature for a sufficient period of time for the elimination of germs and/or microorganisms, for illustration purposes the temperature can be 121°C, then maintaining this temperature of 121°C for a sufficient time to eliminate germs,
  • reactor refers to a container capable of carrying out chemical reactions.
  • the reactor can be used after having been sanitized or sterilized or without sanitized or sterilized.
  • the term “fermentation” refers to any biological reaction involving a microorganism such as bacterial growth, bioconversion, biosynthesis or biocatalysis.
  • the term “fermenter” refers to a reactor capable of carrying out fermentations, for example a bioreactor. In the context of the present invention, the fermenter can be used after having been sanitized or sterilized or without sanitized or sterilized.
  • a compound of formula (I) obtained by a bioconversion process can be qualified as a natural compound of formula (I).
  • a frambinone obtained by a bioconversion process can be qualified as a natural frambinone.
  • a vanillin obtained by a bioconversion process can be qualified as natural vanillin.
  • a first aspect of the present invention relates to a process for preparing a compound of formula (I) comprising a step (a) in which a substrate is transformed into a compound of formula (I) by bioconversion in the presence of a microorganism characterized in that step (a) is carried out under non-sterile conditions.
  • n is between 0 and 5, preferably between 1 and 2
  • R identical or different, is chosen from the group consisting of OH, ORi, formyl, CO2H, linear or branched alkyl chains, optionally substituted, comprising between 1 and 6 carbon atoms, alkenyls, linear or branched, optionally substituted, comprising between 1 and 6 carbon atoms.
  • RI is chosen from the group consisting of methyl, ethyl, propyl and butyl.
  • the compound of formula (I) is chosen from vanillin and frambinone.
  • the microorganism can be any microorganism capable of forming the compound of formula (I) by bioconversion of an appropriate substrate.
  • the microorganism in particular bacteria or fimgus, may be a wild microorganism, genetically modified by molecular biology, mutated, by random or directed mutagenesis.
  • the microorganism is chosen from bacteria belonging to the order Actinomycetales, Caulobacterales or Pseudomonadales, preferably belonging to the family Streptomycetacae, Pseudonocardiacae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, or Pseudomonadaceae, preferably Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus, Amycolatopsis thermoflava, Micrococcus sp, Caulobacter segnis, Pseudomonasfluorescens. or their mutants, even more preferably Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp.
  • the bioconversion reaction is carried out in the presence of a strain available under the number ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, CCTCC 2011265, IMI 390106 or Zyl 926 or their mutants, preferably ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992 , CCTCC 2015329, IMI 390106 or Zyl 926 or their mutants and very preferably ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 or Zyl 926.
  • the microorganism can be chosen from genetically modified microorganisms belonging to the family Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, E.coli, Corynebacterium glutamicul.
  • microorganism used in the context of the present invention can also be a strain as described in WO 2014/102368, WO 2016/001203 or EP 2721148.
  • the microorganism is chosen from the fungus belonging to the genus Aspergillus, Pycnoporus, Pénicillium, preferably belonging to the family Aspergillus luchuensis, Aspergillus niger, Picnoporus cinnabarinus, Pénicillium camamberti
  • the substrate can be transformed by bioconversion into a compound of formula (I).
  • the substrate can be transformed by bioconversion into frambinone.
  • the substrate is generally chosen from the group consisting of p-coumaric acid, p-hydroxybenzalacetone.
  • the substrate can be transformed by bioconversion into vanillin.
  • the substrate is generally chosen from the group consisting of glucose, ferulic acid, eugenol, isoeugenol, coumaric acid, caffeic acid, L-tyrosine, vanillic acid, 4-vinyl guaiacol, preferably chosen from glucose, ferulic acid and eugenol .
  • step (a) of the process is carried out under non-aseptic conditions, preferably non-sterile.
  • the expression "step (a) is carried out under non-aseptic, preferably non-sterile conditions" indicates that the reactor or fermenter in which step (a) is carried out, and optionally the various supply or outlet pipes from the reactor or the fermenter have not been sanitized, preferably have not been sterilized prior to their use in step (a).
  • step (a) is carried out under non-aseptic, preferably non-sterile conditions” indicates that the fermentation substrate and/or the solvent used during step ( a) have not been sanitized, preferably have not been sterilized prior to their use in step (a).
  • step (a) is carried out under non-aseptic conditions, preferably non-sterile” indicates that the transfer of the biomass used for fermentation is not carried out in a manner aseptic, preferably not carried out in a sterile manner.
  • step (a) is carried out under non-aseptic, preferably non-sterile conditions
  • the gas(es), in particular air or oxygen, used in the during step (a) are not sanitized, preferably have not been sterilized prior to their use in step (a).
  • step (a) of bioconversion is particularly advantageous, in particular in that it allows the use of simpler equipment.
  • the energy cost of the bioconversion process is also improved, in fact the absence of sanitization, sterilization preference, reduces steam consumption and reduces the carbon footprint of the process.
  • step (a) can be carried out in batch or fed-batch. According to another embodiment, step (a) can be carried out continuously. Step (a) can also be carried out in a cascade of perfectly stirred reactors in series.
  • the fermentation substrate is introduced into the reactor or fermenter.
  • a biomass is then introduced into the reactor.
  • the fermentation substrate is introduced into the reactor containing the biomass.
  • the total concentration of fermentation substrate and compound of formula (I) is between 0.1 g/L and 50 g/L.
  • the total concentration of fermentation substrate and compound of formula (I) is between 0.1 g/L and 25 g/L, preferably between 0.2 g/L and 20 g/L. L.
  • the total concentration of fermentation substrate and compound of formula (I) is between 10 g/L and 50 g/L, preferably between 12 g/L and 40 g/L, very preferably between 15 g/L and 35 g/L.
  • the pH during step (a) is controlled and between 7 and 9.
  • the pH can optionally be regulated by adding a base or acid.
  • Step (a) is generally carried out at a temperature between 25 and 50°C, preferably between 28°C and 45°C.
  • Step (a) is generally carried out with stirring.
  • Step (a) is generally carried out under air or oxygen.
  • the pO2 during step (a) is monitored and optionally regulated. Those skilled in the art will be able to adapt the pO2 during step (a) to the needs of the microorganism capable of transforming a substrate into a compound of formula (I), preferably into vanillin or frambinone, very preferably into vanillin used in the context of the present invention.
  • the pO2 can be between 1% and 99%, preferably of the order of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%.
  • the pO2 corresponds to the concentration of dissolved oxygen in the bioconversion medium relative to the concentration of dissolved oxygen at saturation, without biomass.
  • pO2 can be measured with an 02 Sensor Hamilton OXYFERM FDA VP 225.
  • the process of the invention is not only more sustainable, due to the reduction in its energy consumption, while making it possible to obtain a yield in compound of formula (I) at least equivalent to those of processes requiring asepsis or sterilization.
  • the bioconversion step (a) is preceded by a step (aO) during which a microorganism is cultured so as to obtain a sufficient quantity of biomass.
  • This biomass can then be used in a bioconversion process according to the present invention.
  • Culturing the bacteria is generally carried out in an aqueous medium, in the presence of nutrients.
  • the culture medium includes a carbon source, an organic or inorganic nitrogen source, inorganic salts and growth factors.
  • the carbon source concentration is generally between 5 and 50 gL 4 , preferably between 20 and 34 gL 4 .
  • the nitrogen source such as a yeast extract
  • the growth factors are generally added at a concentration of between 2 and 20 gL, preferably between 5 and 10 gL 4 .
  • magnesium ions such as magnesium sulfate, can be added at a concentration between 0.1 and 5 gL 4 , preferably between 0.5 and 1 gL 4 .
  • the pH of the culture is between 3 and 9, in particular between 4 and 8, and very preferably between 6 and 8.
  • the temperature of the culture is between 10 and 55 °C, particularly preferably in the range of 30 to 50°C, and very preferably between 35°C and 45°C.
  • the culture period generally lasts between 15 minutes and 80 hours, preferably between 1 hour and 50 hours and very preferably between 5 hours and 40 hours.
  • the duration of the culture period is variable and can be adapted depending on the microorganism capable of transforming a substrate into the compound of formula (I) used in the context of the present invention.
  • the culture period can last until the carbon source, generally glucose, is almost completely consumed, preferably such that the concentration of carbon source is less than or equal to 15 gL 4 , of preferably less than or equal to 5 gL 4 , very preferably less than or equal to 3 gL 4 .
  • the cultivation period may last until 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of the source of carbon introduced at the start of the stage (aO) has been consumed.
  • Step (aO) is generally carried out in a fermenter, under aseptic, preferably sterile, conditions.
  • step (a) can be followed by a step (b) of purification of the compound of formula (I) obtained.
  • purification includes a first step in which the fermentation wort is separated from the biomass.
  • step (a) The purification of the compound of formula (I) obtained at the end of step (a) can in particular be carried out by liquid/liquid extraction, by distillation, by crystallization, by evaporation in a scraped film evaporator, with a falling film, in a bulkhead evaporator, and/or by stripping. Nanofiltration and ultrafiltration steps can also be carried out as part of purification step (b).
  • the purification of the vanillin obtained at the end of step (a) can in particular be carried out by liquid/liquid extraction, by distillation, by crystallization, by evaporation in a scraped film evaporator, with falling film, in an evaporator with partition, and/or by stripping. Nanofiltration and ultrafiltration steps can also be carried out as part of purification step (b).
  • the purification process can be carried out according to the methods described in WO2013/087795, WO 2014/114590, WO2018/146210, WO2021/019005.
  • the vanillin can be continuously extracted from the fermenter using a vanillin separation device.
  • the purification process can be carried out according to the process described in WO2017/025339.
  • the vanillin separation device is a membrane filtration device. This type of device makes it possible to recover fermentation must, a retentate containing the microorganism and a filtrate free of microorganism.
  • the vanillin separation device can also enable the selective extraction of vanillin from the extracted fermentation wort.
  • the present invention also relates to a compound of formula (I), preferably a vanillin or a frambinone, capable of being obtained according to the process of the present invention.
  • the present invention refers to the use of the compound of formula (I), preferably vanillin or frambinone obtained according to the present invention as a flavoring in the field of human and animal food, pharmacy, or as a fragrance in the cosmetics, perfumery and detergent industry. Examples
  • Streptomyces setonii ATCC 39116 strain is cultivated under the conditions described in document WO 2017/025339.
  • Growth medium containing biomass prepared according to Example 1, is used.
  • the pH of the growth medium is adjusted to 8.4 by adding 30 mol% sodium hydroxide and kept constant, with stirring and aeration.
  • a solution containing ferulic acid, 30 mol% sodium hydroxide, and water is prepared. This solution is then added to the fermenter or reactor containing the biomass.
  • Growth medium containing biomass prepared according to Example 1, is used.
  • the pH of the medium is adjusted to 8.4, a solution of coumaric acid is introduced so as to obtain a final concentration of between 5 and 50 g/L.
  • the reaction medium is maintained at 37°C and 170 rpm for 24 h. After 24 h of bioconversion, the biomass is removed by centrifugation, the supernatant is filtered and analyzed by HPLC. 4-hydroxybenzaldehyde is obtained in the same proportions according to Examples 4 and 5.
  • 4-hydroxybenzalacetone is mixed into the medium obtained after the growth period as described in Example 1.
  • the mixture is incubated at 30° C. with stirring (200 rpm) for 72 hours.
  • the biomass is removed by centrifugation, the supernatant is filtered and analyzed by HPLC. Frambinone is obtained in the same proportions according to Example 6 and 7.
  • the process according to the present invention makes it possible to obtain results at least as good as the process according to comparative Example 2 in terms of vanillin concentration or comparative Examples 4 and 6 for the preparation of 4-hydroxybenzaldehyde and frambinone.
  • the results in Table 2 demonstrate that the process according to the present invention is particularly advantageous in that it makes it possible in particular to reduce the steam consumption of the process and simplifies handling by not requiring any sterilization of incoming materials involved in the process. These results are obtained while maintaining the yields of step (a) of bioconversion.

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Abstract

Domaine de l'invention La présente invention se réfère à un procédé de préparation d'un composé de formule (I) dans lequel n est compris entre 0 et 5, de préférence compris entre 1 et 2, R, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de OH, OR1, formyle, CO2H, les chaînes alkyles linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, alcényles, linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, R1 est choisi dans le groupe constitué de méthyle, éthyle, propyle et butyle, comprenant une étape (a) dans laquelle un substrat est transformé en composé de formule (I) par bioconversion en présence d'un microorganisme caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptiques, de préférence non stériles.

Description

DESCRIPTION
Procédé de préparation d’un composé de formule (I) par fermentation
Domaine de l’invention
La présente invention se réfère à un procédé de préparation d’un composé de formule (I) comprenant une étape (a) dans laquelle un substrat est transformé en composé de formule (I) par bioconversion en présence d’un microorganisme caractérisé en ce que l’étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptisées, de préférence dans des conditions non stériles.
Art antérieur
La vanilline peut être obtenue par différentes méthodes connues de l’homme de l’art, et notamment par les deux voies suivantes :
- Une voie dite naturelle basée sur un procédé biotechnologique comprenant notamment la culture d’un microorganisme apte à permettre la biotransformation d’un substrat de fermentation en vanilline. Il est notamment connu de la demande EP0885968 un tel procédé dans lequel le substrat de fermentation est l’acide férulique. Le brevet US 5017388 décrit un procédé dans lequel le substrat de fermentation est l’eugénol et/ou l’isoeugénol. Ces procédés aboutissent à la préparation d’une vanilline dite vanilline naturelle.
- Une voie dite synthétique comprenant des réactions chimiques classiques à partir du gaïacol ne faisant pas intervenir de microorganisme. Ce procédé aboutit à la préparation d’une vanilline dite vanilline synthétique.
Enfin la vanilline peut également être préparée selon une voie qualifiée de « bio-based » dans laquelle la vanilline est issue de lignine, on peut citer en particulier les documents US 2745796, DE1132113 et l’article intitulé « Preparation of lignin from wood dust as vanillin source and comparison of different extraction method » by Azadbakht et al in International Journal of Biology and Biotechnology, 2004, vol 1, No 4, pp 535-537, ou préparée à partir de matériaux d’origine naturelle, on peut citer en particulier le document WO 2019/020773. La frambinone également être obtenue par différentes méthodes et notamment par un procédé de bioconversion tel que décrit dans le document CN 112391418.
Les procédés permettant la production d’une vanilline ou d’une frambinone dite naturelle sont réalisés dans des fermenteurs, dans des conditions stériles. La stérilisation est en générale obtenue par l’injection dans les dispositifs utilisés de vapeur d’eau pendant une durée en générale supérieure à 20 min. Les réactifs sont en général également stériles notamment par passage sur membrane filtrante. Ces procédés sont donc fastidieux et coûteux à mettre en œuvre et requiert un équipement spécifique pouvant être stérilisé, l’impact énergétique de ces procédés est également très important.
La présente invention vise à mettre à disposition un procédé de préparation d’un composé de formule (I) simple à mettre en œuvre et dont l’empreinte écologique et/ou énergétique est améliorée.
Brève description
Un premier objet de la présente invention porte sur un procédé de préparation d’un composé de formule (I) comprenant une étape (a) dans laquelle un substrat est transformé en composé de formule (I) par bioconversion en présence d’un microorganisme caractérisé en ce que l’étape (a) est réalisée dans des conditions non stériles.
Description détaillée
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, l’expression « compris entre ... et... » inclut les bornes.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, la croissance d’un microorganisme se réfère à un processus dans lequel ledit microorganisme se multiplie. La croissance aboutit à la production d’une biomasse.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « bioconversion » se réfère à un procédé biotechnologique dans lequel un microorganisme permet la transformation d’un substrat en un produit de bioconversion. Le microorganisme peut être une souche sauvage, génétiquement modifiée obtenue par biologie moléculaire ou mutée, notamment par mutagénèse aléatoire ou dirigée. Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « procédé réalisé en conditions aseptiques » se réfère à un procédé réalisé dans des conditions exemptes de tout germe et/ou microorganisme.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « procédé réalisé en conditions stériles » se réfère à un procédé réalisé dans des conditions exemptes de tout germe et/ou microorganisme susceptible d’être délétère au microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I) utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention. Un effet délétère au microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I) peut être mesuré par le taux de conversion du dudit substrat en composé de formule (I).
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, l’asepsie ou la stérilisation peut être obtenue par toute méthode, en particulier thermique, chimique, mécanique ou par rayonnement, permettant l’élimination des germes et/ou microorganismes. L’asepsie ou la stérilisation peuvent être réalisées sur les fluides, matières premières, et/ou dispositifs utilisés dans le cadre du procédé selon la présente invention. A titre illustratif on peut citer notamment, les méthodes suivantes :
Stérilisation par chaleur sèche ou humide, réalisée par montée en température jusqu’à un température suffisante, suivie d’un maintien de cette température sur une durée suffisante pour l’élimination des germes et/ou microorganismes, à titre illustratif la température peut être de 121°C, puis maintien de cette température de 121°C pendant une durée suffisante permettant l’élimination des germes,
Filtration sur membrane ou plusieurs filtrations successives sur membrane, dont le plus petit diamètre de coupure permet l’élimination de tout germe et/ou microorganisme
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « réacteur » fait référence à un récipient apte à la réalisation de réactions chimiques. Dans le cadre de la présente invention, le réacteur peut être utilisé après avoir été aseptisé ou stérilisé ou sans aseptisation ou stérilisation.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « fermentation » fait référence à toute réaction biologique faisant intervenir un microorganisme telle que croissance bactérienne, bioconversion, biosynthèse ou biocatalyse. Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « fermenteur » fait référence à un réacteur apte à la réalisation de fermentations, par exemple un bioréacteur. Dans le cadre de la présente invention, le fermenteur peut être utilisé après avoir été aseptisé ou stérilisé ou sans aseptisation ou stérilisation.
Dans le cadre de la présente invention et sauf indication contraire, un composé de formule (I) obtenu par un procédé de bioconversion peut être qualifié de composé de formule (I) naturel. Dans le cadre de la présente invention et sauf indication contraire, une frambinone obtenue par un procédé de bioconversion peut être qualifiée de frambinone naturelle.
Dans le cadre de la présente invention et sauf indication contraire, une vanilline obtenue par un procédé de bioconversion peut être qualifiée de vanilline naturelle.
Un premier aspect de la présente invention se réfère à un procédé de préparation d’un composé de formule (I) comprenant une étape (a) dans laquelle un substrat est transformé en composé de formule (I) par bioconversion en présence d’un microorganisme caractérisé en ce que l’étape (a) est réalisée dans des conditions non stériles.
Dans le cadre de la présente invention, un composé de formule (I) présente la formule suivante :
Formule (I) dans lequel n est compris entre 0 et 5, de préférence compris entre 1 et 2,
R, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de OH, ORi, formyle, CO2H, les chaines alkyles linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, alcényles, linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation particulier, RI est choisi dans le groupe constitué de méthyle, éthyle, propyl et butyle. Selon un mode de réalisation particulier, R est choisi dans le groupe constitué de formyle -CHO, OH, OMe, OEt, OPr, OBu, méthyle, éthyle, -(CH2)2-C(O)-CH3, -CH=CH-C(O)-CH3, -CH=CH- CO2H, -CO2H, -CH2-OH.
Selon un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) est choisi parmi vanilline et frambinone.
Dans le cadre de la présente invention, le microorganisme peut être n'importe quel microorganisme capable de former le composé de formule (I) par bioconversion d'un substrat approprié. Le microorganisme, en particulier bactérie ou fimgus, peut être un microorganisme sauvage, modifié génétiquement par biologie moléculaire, muté, par mutagénèse aléatoire ou dirigée.
De préférence le microorganisme est choisi parmi les bactéries appartenant à l’ordre des Actinomycetales, Caulobacterales ou Pseudomonadales, de préférence appartenant à la famille des Streptomycetacae , Pseudonocardiacae, Micrococcaceae, Caulobacteraceae, ou Pseudomonadaceae, xès préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus, Amycolatopsis thermoflava, Micrococcus sp, Caulobacter segnis, Pseudomonasfluorescens. ou leurs mutants, encore plus préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus. De manière préférée la réaction de bioconversion est conduite en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, CCTCC 2011265, IMI 390106 ou Zyl 926 ou leurs mutants, préférentiellement ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 ou Zyl 926 ou leurs mutants et très préférentiellement ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329, IMI 390106 ou Zyl 926. Selon un autre mode de réalisation le microorganisme peut être choisi parmi les microorganismes génétiquement modifiés appartenant à la famille Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, E.coli, Corynebacterium glutamicul.
Le microorganisme utilisé dans le cadre de la présente invention peut également être une souche telle que décrite dans WO 2014/102368, WO 2016/001203 ou EP 2721148.
Selon un autre mode de réalisation, le microorganisme est choisi parmi les fungus appartenant au genre des Aspergillus, Pycnoporus, Pénicillium, de préférence appartenant à la famille Aspergillus luchuensis, Aspergillus niger, Picnoporus cinnabarinus , Pénicillium camamberti Dans le cadre de la présente invention, le substrat peut être transformé par bioconversion en composé de formule (I).
Dans le cadre de la présente invention, le substrat peut être transformé par bioconversion en frambinone. Le substrat est en général choisi dans le groupe constitué de l’acide p-coumarique, p-hydroxybenzalacétone.
Dans le cadre de la présente invention, le substrat peut être transformé par bioconversion en vanilline. Le substrat est en général choisi dans le groupe constitué de glucose, acide férulique, eugénol, isoeugénol, acide coumarique, acide caféique, L-tyrosine, l’acide vanillique, 4-vinyl guaiacol, de préférence choisi parmi glucose, acide férulique et eugénol.
Dans la cadre de la présente invention, l’étape (a) du procédé est réalisée dans des conditions non aseptiques, de préférence non stériles. Dans le cadre de la présente invention, l’expression « l’étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptiques, de préférence non stériles » indique que le réacteur ou le fermenteur dans lequel est réalisé l’étape (a), et optionnellement les différents tuyaux d’alimentation ou de sortie du réacteur ou du fermenteur n’ont pas été aseptisés, de préférence n’ont pas été stérilisés préalablement à leur utilisation dans l’étape (a). Dans le cadre de la présente invention, l’expression «l’étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptiques, de préférence non stériles » indique que le substrat de fermentation et/ou le solvant utilisé au cours de l’étape (a) n’ont pas été aseptisés, de préférence n’ont pas été stérilisés préalablement à leur utilisation dans l’étape (a). Dans le cadre de la présente invention, l’expression «l’étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptiques, de préférence non stériles » indique que le transfert de la biomasse utilisée pour la fermentation n’est pas été réalisé de manière aseptique, de préférence n’est pas réalisé de manière stérile. Dans le cadre de la présente invention, l’expression «l’étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptiques, de préférence non stériles » indique que le ou les gaz, en particulier l’air ou l’oxygène, utilisés au cours de l’étape (a) ne sont pas aseptisés, de préférence n’ont pas été stérilisés préalablement à leur utilisation dans l’étape (a).
L’absence d’aseptisation, de préférence de stérilisation, des équipements, des réactifs et de l’air ou l’oxygène utilisés lors de l’étape (a) de bioconversion est particulièrement avantageuse, notamment en ce qu’elle permet l’utilisation d’équipements plus simples. Le coût énergétique du procédé de bioconversion est également amélioré, en effet l’absence d’aseptisation, de préférence de stérilisation, réduit la consommation de vapeur et réduit l’empreinte carbone du procédé.
Dans le cadre de la présente invention, l’étape (a) peut être réalisée en batch ou en fed-batch. Selon un autre mode de réalisation l’étape (a) peut être réalisée en continu. L’étape (a) peut également être conduite dans une cascade de réacteur parfaitement agités en série.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat de fermentation est introduit dans le réacteur ou fermenteur. Une biomasse est introduite ensuite dans le réacteur.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le substrat de fermentation est introduit dans le réacteur contenant la biomasse.
Avantageusement, la concentration totale en substrat de fermentation et en composé de formule (I) est comprise entre 0,1 g/L et 50 g/L. Selon un mode de réalisation particulier, la concentration totale en substrat de fermentation et en composé de formule (I) est comprise entre 0,1 g/L et 25 g/L, de préférence entre 0,2 g/L et 20 g/L. Selon un autre mode de réalisation particulier, la concentration totale en substrat de fermentation et en composé de formule (I) est comprise entre 10 g/L et 50 g/L, de préférence entre 12 g/L et 40 g/L, très préférentiellement entre 15 g/L et 35 g/L..
Le pH au cours de l’étape (a) est contrôlé et compris entre 7 et 9. Le pH peut optionnellement être régulé par ajout de base ou d’acide.
L’étape (a) est en général réalisée à une température comprise entre 25 et 50°C, de préférence comprise entre 28°C et 45°C. L’étape (a) est en général réalisée sous agitation. L’étape (a) est en général réalisée sous air ou oxygène. Dans le cadre de la présente invention, la pO2 au cours de l’étape (a) est contrôlée et optionnellement régulée. L’homme du métier pourra adapter la pO2 au cours de l’étape (a) aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I), de préférence en vanilline ou frambinone, très préférentiellement en vanilline utilisé dans le cadre de la présente invention. A titre illustratif, la pO2 peut être comprise entre 1% et 99%, de préférence de l’ordre de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. La pO2 correspond à la concentration en oxygène dissous dans le milieu de bioconversion par rapport à la concentration en oxygène dissous à saturation, sans biomasse. La pO2 peut notamment être mesurée avec un 02 Sensor Hamilton OXYFERM FDA VP 225.
Avantageusement, le procédé de l’invention est non seulement plus durable, par le fait de la réduction de sa consommation énergétique, tout en permettant d’obtenir un rendement en composé de formule (I) au moins équivalent à ceux des procédés requérant une asepsie ou stérilisation.
En général l’étape (a) de bioconversion est précédée par une étape (aO) pendant laquelle un microorganisme est mis en culture de manière à obtenir une quantité de biomasse suffisante. Cette biomasse peut ensuite être utilisée dans un procédé de bioconversion selon la présente invention.
La mise en culture de la bactérie est généralement réalisée en milieu aqueux, en présence d’éléments nutritifs. En général, le milieu de culture comprend une source de carbone, une source organique ou inorganique d’azote, des sels inorganiques et des facteurs de croissance. L’homme du métier pourra adapter la composition du milieu de culture aux besoins du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I) utilisé dans le cadre du procédé de la présente invention.
La concentration en source de carbone est généralement comprise entre 5 et 50 g.L4, de préférence entre 20 et 34 g.L4. La source d’azote, telle qu’un extrait de levure, et les facteurs de croissance sont en général ajoutés à une concentration comprise entre 2 et 20 g.L , de préférence entre 5 et 10 g.L4. En outre, des ions magnésium, tels que du sulfate de magnésium, peuvent être ajoutés à une concentration comprise entre 0,1 et 5 g.L4, de préférence comprise entre 0,5 et 1 g.L4. En général, le pH de la mise en culture est compris entre 3 et 9, en particulier compris entre 4 et 8, et très préférentiellement compris entre 6 et 8. En général, la température de la mise en culture est comprise entre 10 à 55°C, de manière particulièrement préférée dans la plage de 30 à 50°C, et très préférentiellement entre 35°C et 45°C.
La période de culture dure en général entre 15 minutes et 80 heures, de préférence entre 1 heure et 50 heures et très préférentiellement entre 5 heures et 40 heures. La durée de la période de culture est variable et peut être adaptée en fonction du microorganisme apte à transformer un substrat en composé de formule (I) utilisé dans le cadre de la présente invention. A titre illustratif, la période de culture peut durer jusqu’à ce que la source de carbone, en général du glucose, soit presque intégralement consommée, de préférence telle que la concentration en source de carbone soit inférieure ou égale à 15 g.L4, de préférence inférieure ou égale à 5 g.L4, très préférentiellement inférieure ou égale à 3 g.L4. Selon un autre mode de réalisation, la période de culture peut durer jusqu’à ce que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de la source de carbone introduite en début d’étape (aO) ait été consommée. L’étape (aO) est en général réalisée dans un fermenteur, en conditions aseptiques, de préférence stériles.
Dans le cadre de la présente invention, l’étape (a) peut être suivie d’une étape (b) de purification du composé de formule (I), obtenu. En général, la purification comprend une première étape dans laquelle le moût de fermentation est séparé de la biomasse.
La purification du composé de formule (I) obtenu à l’issue de l’étape (a) peut notamment être réalisée par extraction liquide/liquide, par distillation, par cristallisation, par évaporation dans un évaporateur à film raclé, à film tombant, dans un évaporateur à cloison, et/ou par stripping. Des étapes de nanofiltration, ultrafiltrations peuvent également être opérées dans le cadre de l’étape (b) de purification.
La purification de la vanilline obtenue à l’issue de l’étape (a) peut notamment être réalisée par extraction liquide/liquide, par distillation, par cristallisation, par évaporation dans un évaporateur à film raclé, à film tombant, dans un évaporateur à cloison, et/ou par stripping. Des étapes de nanofiltration, ultrafiltrations peuvent également être opérées dans le cadre de l’étape (b) de purification. A titre illustratif, le procédé de purification peut être réalisé selon les procédés décrits dans WO2013/087795, WO 2014/114590, W02018/146210, WO2021/019005.
Selon un autre mode de réalisation, la vanilline peut être extraite en continu du fermenteur grâce à un dispositif de séparation de la vanilline. A titre illustratif, le procédé de purification peut être réalisé selon le procédé décrit dans WO2017/025339. Il n’y a pas de limitation particulière quant au choix du dispositif de séparation de la vanilline. De préférence, le dispositif de séparation de la vanilline est un dispositif de filtration sur membrane. Ce type de dispositif permet de récupérer du moût de fermentation, un rétentat contenant le microorganisme et un filtrat exempt de microorganisme. Le dispositif de séparation de la vanilline peut également permettre l’extraction sélective de la vanilline du moût de fermentation extrait.
La présente invention vise également un composé de formule (I), de préférence une vanilline ou une frambinone, susceptible d’être obtenu selon le procédé de la présente invention. Enfin la présente invention se réfère à l’utilisation du composé de formule (I), de préférence la vanilline ou la frambinone obtenus selon la présente invention en tant qu’ arôme dans le domaine de l’alimentation humaine et animale, de la pharmacie, ou en tant que parfum dans l'industrie des cosmétiques, de la parfumerie et de la détergence. Exemples
Exemple 1 : mise en culture
La souche Streptomyces setonii ATCC 39116 est cultivée dans les conditions décrites dans le document WO 2017/025339.
Exemples 2 et 3 : Procédé de bioconversion selon l’invention et comparatif
Du milieu de croissance contenant de la biomasse, préparé selon l’exemple 1 est utilisé. Le pH du milieu de croissance est ajusté à 8,4 par ajout de soude à 30% molaire et maintenu constant, sous agitation et aération.
Une solution contenant de l’acide férulique, de la soude à 30% molaire, et de l’eau est préparée. Cette solution est ensuite ajoutée dans le fermenteur ou réacteur contenant la biomasse. Conditions
Tableau 1
Les résultats de bioconversion suivants ont été obtenus :
Tableau 2
Exemples 4 et 5 : Procédé de bioconversion selon l’invention et comparatif
Du milieu de croissance contenant de la biomasse, préparé selon l’exemple 1 est utilisé. Le pH du milieu est ajusté à 8.4 on introduit une solution d’acide coumarique de façon à obtenir une concentration finale comprise entre 5 et 50 g/L. Le milieu réactionnel est maintenu à 37 °C et 170 tours/min pendant 24 h. Après 24 h de bioconversion, la biomasse est éliminée par centrifugation, le surnageant est fdtré et analysé en HPLC. Le 4-hydroxybenzaldéhyde est obtenu dans les mêmes proportions selon l’exemple 4 et 5.
Conditions
Tableau 3
Exemples 6 et 7: Procédé de bioconversion selon l’invention et comparatif
Du milieu de croissance contenant de la biomasse, préparé selon l’exemple 1 est utilisé.
On mélange 4-hydroxybenzalacétone dans le milieu obtenu après la période de croissance telle que décrite à l’exemple 1. Le mélange est incubé à 30°C sous agitation (200 tours/min) 72 heures. Après 72h de bioconversion, la biomasse est éliminée par centrifugation, le surnageant est fdtré et analysé en HPLC. La frambinone est obtenue dans les mêmes proportions selon l’exemple 6 et 7. Conditions
Tableau 4
Ainsi le procédé selon la présente invention permet d’obtenir des résultats au moins aussi bons que le procédé selon l’exemple 2 comparatif en termes de concentration en vanilline ou les exemples 4 et 6 comparatifs pour la préparation de 4-hydroxybenzaldéhyde et de frambinone. Les résultats du tableau 2 démontrent que le procédé selon la présente invention est particulièrement avantageux en ce qu’il permet notamment de réduire la consommation de vapeur du procédé et simplifie les manipulations en ne requérant aucune stérilisation de matières entrants enjeu dans le procédé. Ces résultats sont obtenus tout en maintenant les rendements de l’étape (a) de bioconversion.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d’un composé de formule (I)
Formule (I) dans lequel n est compris entre 0 et 5, de préférence compris entre 1 et 2,
R, identique ou différent, est choisi dans le groupe constitué de OH, ORi, formyle, CO2H, les chaines alkyles linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, alcényles, linéaires ou branchées, optionnellement substituées, comprenant entre 1 et 6 atomes de carbone, RI est choisi dans le groupe constitué de méthyle, éthyle, propyle et butyle, comprenant une étape (a) dans laquelle un substrat est transformé en composé de formule (I) par bioconversion en présence d’un microorganisme caractérisé en ce que l’étape (a) est réalisée dans des conditions non aseptiques.
2. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) dans lequel l’étape (a) est réalisée dans des conditions non stériles.
3. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que le réacteur ou le fermenteur dans lequel est réalisé l’étape (a), optionnellement les différents tuyaux d’alimentation ou de sortie du réacteur ou du fermenteur n’ont pas été aseptisés, de préférence n’ont pas été stérilisés préalablement à leur utilisation dans l’étape (a).
4. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le substrat de fermentation et/ou le solvant utilisés au cours de l’étape (a) n’ont pas été aseptisés, de préférence n’ont pas été stérilisés préalablement à leur utilisation dans l’étape (a).
5. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le transfert de la biomasse utilisée pour la fermentation n’est pas réalisé en conditions aseptiques, de préférence n’est pas réalisé en conditions stériles.
6. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la concentration totale en substrat de fermentation et en composé de formule (I) est comprise entre 0,1 g/L et 50 g/L.
7. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le ou les gaz, de préférence l’air ou l’oxygène, utilisés au cours de l’étape (a) ne sont pas aseptisés, de préférence ne sont pas stérilisés préalablement à leur utilisation dans l’étape (a).
8. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le substrat de fermentation est introduit dans le réacteur ou fermenteur, la biomasse est introduite ensuite dans le réacteur.
9. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le substrat de fermentation est introduit dans le réacteur contenant la biomasse.
10. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une étape (aO) de mise en culture d’un microorganisme de manière à obtenir une quantité de biomasse suffisante préalable à l’étape (a).
11. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une étape (b) de purification du composé de formule (I) obtenu à l’issue de l’étape (a).
12. Procédé de préparation d’un composé de formule (I) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel le composé de formule (I) est choisi dans le groupe constitué de vanilline, frambinone.
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