EP4423485A1 - Verfahren und anordnung zur in-ovo geschlechtsbestimmung von vogeleiern - Google Patents

Verfahren und anordnung zur in-ovo geschlechtsbestimmung von vogeleiern

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EP4423485A1
EP4423485A1 EP22809059.3A EP22809059A EP4423485A1 EP 4423485 A1 EP4423485 A1 EP 4423485A1 EP 22809059 A EP22809059 A EP 22809059A EP 4423485 A1 EP4423485 A1 EP 4423485A1
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EP
European Patent Office
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spectra
fluorescence
raman scattering
excitation wavelengths
laser beam
Prior art date
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Pending
Application number
EP22809059.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Gerald Steiner
Edmund Koch
Christian Schnabel
Grit PREUSSE
Roberta Galli
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
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Filing date
Publication date
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Publication of EP4423485A1 publication Critical patent/EP4423485A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G01N2201/129—Using chemometrical methods
    • G01N2201/1296—Using chemometrical methods using neural networks

Definitions

  • the invention relates to the technical fields of bioanalytics and agriculture and relates to a method and an arrangement for in-ovo sex determination of bird eggs.
  • the proposed method and the arrangement can be used, for example, to determine the sex of productive poultry, in animal husbandry and in commercial egg production.
  • DE 10 2014 010 150 A1 discloses a method and a device for Raman spectroscopic in-ovo sex determination of fertilized and incubated bird eggs, in which a hole is made in the calcareous shell by a laser or mechanical perforation and the Raman scattered radiation of the irradiated blood is recorded and evaluated by means of an evaluation unit.
  • a non-contact spectroscopic method and a device for optical in-ovo sex determination of fertilized and incubated bird eggs is described in DE 10 2016 004 051 A1.
  • a hole is also made in the calcareous shell and the sex is determined by evaluating the Raman scattered radiation on incubation day 4, which corresponds to an early embryonic stage before the onset of pain sensation.
  • DE 10 2018 105 512 A1 discloses a method for in-ovo fertilization and sex determination on a closed egg, in which a closed egg is positioned, transilluminated and/or illuminated, an image of the closed egg is then recorded, and then the the recorded data is evaluated and the position of the cardiovascular system in the egg is calculated, a detection unit is set over the calculated position of the cardiovascular system by means of a positioning unit and the blood is then stimulated, after which the blood-specific and non-blood absorption spectra are detected and selected, fertilization is determined and then the spectra are compensated with non-blood information by a compensation method and the spectra are classified for gender determination.
  • a disadvantage of the known solutions is that the in-ovo sex determination is carried out with an insufficiently stable prognosis accuracy. It is also disadvantageous that known methods and arrangements are complex and expensive.
  • the object of the present invention consists in specifying a new method and an arrangement provided for carrying out the method, with which the in-ovo sex determination of avian eggs is carried out with a high and stable prediction accuracy of the sex and which are simple and inexpensive to carry out.
  • a method for in-ovo sex determination of bird eggs in which the following method steps are carried out:
  • the temperature of the fertilized and incubated bird's egg is adjusted to between 35°C and 38°C while the method is being carried out.
  • the at least two different excitation wavelengths differ by at least 0.3 eV of the emitted light.
  • At least one first laser beam with an excitation wavelength of 400 nm to 570 nm and at least one second laser beam with an excitation wavelength of 640 nm to 790 nm are used.
  • complementary spectra in a backscatter wavelength range of 620 nm to 700 nm and 820 nm to 900 nm are used to determine the classification value.
  • Complementary spectra in the form of sex-specific spectra of molecular concentrations in the blood are advantageously processed to determine the sex.
  • the classification value is also advantageously determined by algebraically linking the respective intensity maxima Ismax of the complementary spectra and/or spectral range of fluorescence and Raman scattering assigned to the different excitation wavelengths, with the classification value being particularly advantageously determined by quotient, difference and/or sum formation .
  • the intrinsically determined threshold value is determined by comparison operations of the classification value, taking into account a given training sets, formation of intensity ratios and/or neural networks is realized.
  • an arrangement for in-ovo sex determination of fertilized and incubated bird eggs using the method described above comprising
  • At least one egg storage unit on which at least one fertilized bird egg that has been incubated for 3 to 9 days is arranged in a secured position
  • At least two light-emitting laser beam sources the laser beams of which have different excitation wavelengths and stimulate fluorescence and Raman scattering in the blood of at least one component of the developed extraembryonic cardiovascular system, wherein
  • At least one detector device for detecting the excited fluorescence and Raman scattering
  • Classification unit for determining a classification value and determining gender.
  • the laser beam sources have excitation wavelengths Ai, A2 . . . Ai in the range from 400 nm to 1064 nm. It is also advantageous if the different excitation wavelengths differ by at least 0.3 eV.
  • a first laser beam source has an excitation wavelength Ai of 500 nm to 550 nm and a second laser beam source has an excitation wavelength A2 of 750 nm to 790 nm.
  • the laser focus of the at least two laser beams in the xyz direction and/or the beam waist is set essentially the same.
  • the present invention provides a new method and an arrangement for carrying out the method, with which the in ovo sex determination of avian eggs is carried out with a high and stable predictive accuracy of the sex on the basis of the biochemical molecular profile of the avian egg and which has a simple and enable a cost-effective procedure for sex determination. Furthermore, the present invention describes a solution with which the surprisingly found natural variations in the biochemical molecular profile of bird eggs can be compensated for in the measurement.
  • the main advantages of the solution according to the invention are achieved by a method for in-ovo sex determination of bird eggs, in which in a first step at least one fertilized bird egg incubated between 3 and 9 days is provided, in which the lime shell has an opening in the area of the pointed or blunt pole is generated.
  • the blood of at least one component of the developed extra-embryonic cardiovascular system of the embryo is emit- ted through the opening in the calcareous shell with at least two light sources Laser beam sources irradiated.
  • the blood is irradiated by means of at least two laser beams with different frequencies and thus different excitation wavelengths.
  • the excitation of the blood is carried out with at least two different excitation wavelengths in the range from >400 nm to 1064 nm is realized.
  • At least two laser beam sources with laser beams of different excitation wavelengths are used. This ensures that the blood of the embryo is excited in the same volume fraction, which causes fluorescence and Raman scattering as a function of the excitation wavelengths, and as a result at least two different, complementary spectra are obtained.
  • complementary spectra should be understood to mean such intensity spectra of fluorescence and Raman scattering that lead to a reversal of the imaged spectra of male and female spectral regions due to different excitation wavelengths.
  • the complementary spectra are information about sex-specific molecule concentrations, which are obtained from the components of the blood, namely hemoglobin and protoporphyrin become.
  • the spectra of two different biochemical molecules or molecular structural units are selected whose relative concentrations with regard to sex are inversely complementary. Referring to Figure 6, one biochemical compound is present at a higher concentration in female embryos relative to male embryos and, complementarily, another biochemical compound is present at a lower concentration in female embryos relative to male embryos.
  • the inversely complementary present concentrations of the biochemical molecules with regard to gender advantageously lead to an amplification of the gender-specific signals and can at the same time be used for intrinsic referencing.
  • laser beam sources are used to irradiate the blood of the embryo, in which the excitation wavelengths of the at least two laser beams differ from one another by at least 0.3 eV.
  • the fluorescence scattering of the blood of female embryos showed a higher intensity compared to the fluorescence scattering of the blood of male embryos.
  • the intensity of the fluorescence scattering is lower than the intensity of the fluorescence scattering of the blood of male embryos and the complementary spectra and their intensity maxima are thus reversed in a gender-specific manner behave.
  • the profile of the fluorescence intensities as well as the Raman spectra show gender-specific molecular signals that can be used for evaluation and gender recognition.
  • the detection of the fluorescence and Raman scattering excited in the blood takes place using at least one detector device, with the subsequent processing of the complementary spectra taking place using an evaluation unit taking into account at least one intrinsic referencing and one or more computationally determined intrinsic referencing variables or referencing functions.
  • intrinsic referencing is to be understood as a procedure for processing and evaluating the fluorescence and Raman scattering obtained, in which process parameters that deviate and possibly influence the results or varying gender-unspecific signals are compensated for or normalized, and the result of the intensity spectra is thus normalized by absolute fluctuations the intensities or other internal or external influences is adjusted.
  • a freely definable internal standard value or an isobestic point to be designated in analogy to absorption spectroscopy can be determined. In this way, in particular, a better comparability of the registered intensity spectra and a higher prediction accuracy in gender determination is achieved.
  • the recorded and processed intensity spectra of the fluorescence and Raman scattering are output from the complementary spectra assigned to the different excitation wavelengths.
  • the sex of the embryo is subsequently determined from the complementary spectra obtained by determining a classification value using algebraic, univariate, multivariate and/or logical linking.
  • the classification value can be determined by algebraic arithmetic operations of the respective intensity maxima of the different excitation wavelengths associated complementary spectra of fluorescence and Raman scattering is determined. This procedure offers the advantage of a quick, simple and cost-effective determination of the classification value in the gender-specific determination using one or more cost-effective detector devices, such as one or more diodes.
  • a data evaluation and classification of the intensity spectra of the fluorescence and Raman scattering can be done, for example, by classifying the fluorescence and Raman spectra of the excitation wavelength Xi and fluorescence and Raman spectra of the excitation wavelength X2 using classifiers in a first step, with the classification values being determined for both classes .
  • classifiers in a first step, with the classification values being determined for both classes .
  • two classification values for the classes "male” and "female” are determined from the determined classification values.
  • a further algorithm converts these classification values into a definition and output of the gender, with the gender assignment being able to be output either singularly or in binary with an indication of the probability.
  • the binary output has the advantage that less clear sex statements can be evaluated from a hatchery economic point of view.
  • the classification value is determined taking into account predetermined spectral ranges which are assigned to the complementary spectra of the respective different excitation wavelengths.
  • the classification value determined can be classified via comparison operations of the classification value using a predetermined training set, formation of intensity ratios and/or neural networks be realized, which result in a threshold value for gender determination.
  • the temperature of the blood in the extra-embryonic cardiovascular system of the embryo has a significant influence on the metabolic function and on the intensity of the excited fluorescence and Raman scattering after irradiation with laser beams.
  • the temperature of the fertilized and incubated bird egg is set to between 35°C and 38°C during the implementation of the method.
  • a significantly improved and compact arrangement is proposed according to the invention, which has at least one egg storage unit on which at least one fertilized bird egg incubated for 3 to 9 days is arranged in a secured position.
  • it is proposed to use at least two light-emitting laser beam sources whose laser beams are superposed in different ways to one another
  • the blood can be irradiated by the at least two lasers with different excitation wavelengths.
  • the irradiation can take place at different positions in the cardiovascular system, provided that it is ensured that volume components of the blood are irradiated.
  • a complex positioning device and detection of the extra-embryonic cardiovascular system can be omitted, which leads to a cost-effective arrangement.
  • the arrangement according to the invention also has at least one device for positioning the laser focus, with advantageously the position of the focus of the at least two laser beams in the xyz direction and/or the beam waist in the essentially set the same.
  • the arrangement according to the invention has at least two beam splitter devices with which the excited fluorescence and Raman scattering can be separated depending on the excitation wavelength.
  • the proposed beam splitter devices consist of excitation wavelength-dependent reflection and transmission devices and enable a quick and easy separation and thus targeted forwarding of the excited fluorescence and Raman scattering for a time-saving and quick sex determination with the information obtained.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the invention
  • FIG. 3 the classified by simple ratio formation of the maxima of the complementary spectra obtained
  • FIG. 4 schematic representation of the evaluation method using a calculated spectrum with intrinsic referencing
  • FIG. 5 schematic representation of the evaluation method using a calculated classification value
  • an arrangement for in-ovo sex determination is shown schematically, in which a fertilized, incubated bird egg 1, which has been opened at the blunt pole, is arranged in a secured position on an egg storage unit (not shown).
  • an egg storage unit not shown.
  • An illumination device 20 with an illumination fiber 21 for illuminating the interior of the egg and an additional camera 19 are arranged in the immediate vicinity of the opening of the bird's egg.
  • the excited fluorescence and Raman scattering, which is dependent on the different excitation wavelengths, and the illumination beams of the illumination device 20 are separated via the beam splitter devices 9 (single edge 514 nm), 10 and 11 (T 813.5 - 1100 nm), and are detected by the detector devices 14 and 17 depending on the wavelength forwarded to an evaluation unit (not shown).
  • FIG. 2 shows the mean values of the evaluated intensity spectra on incubation day 3.5, 5.5 and 6.5 for female and male embryos.
  • the spectra clearly show the differences in intensity of the complementary spectra at the excitation wavelengths Ai and A2 both with regard to sex and regarding the incubation day. A decrease in the relative intensity differences between female and male embryos with increasing incubation duration can also be seen.
  • the spectra in Figure 2 also illustrate the complementary character of the spectra, ie the different, inversely behaving intensities at the excitation wavelengths Ai and A2.
  • the intensity spectra Isi and Is2 of the fluorescence and Raman scattering which are dependent on the excitation wavelengths Ai and A2, are obtained for evaluation and sex determination.
  • the spectra Isi and Is2 are subjected to an algebraic, univariate, multivariate and/or logical combination in the logic unit 201 .
  • the calculated intensity spectrum with intrinsic referencing (IIR) is subsequently subjected to the classification algorithm 202, the classification algorithm outputting probabilities for belonging to the “female” and “male” classes.
  • the probabilities of class membership are passed as classification values for the class "female” (S$) and for the class "male” (Sj) to an evaluation unit with an algorithm for determining and outputting sex 203 .
  • exemplary embodiment 3 presents a further possibility for evaluating and classifying the spectra.
  • An arrangement for in-ovo gender determination is provided and the method steps according to exemplary embodiment 1 are carried out.
  • the fluorescence and Raman spectra Isi of the excitation wavelength Xi and the fluorescence and Raman spectra Is2 of the excitation wavelength A2 are classified independently of one another using the classifiers 202a and 202b, with the classification values S?i S ⁇ ji and S?2 S ⁇ j2 can be determined for both classes.
  • two classification values S 1 and 8 2 for the classes “male” and “female” are determined from the 4 classification values S 1 S ⁇ ji S 2 S ⁇ j2. These classification values are compared by a further algorithm 204 and converted into a gender definition and output.
  • the comparison algorithm advantageously outputs probabilities for belonging to the “female” and “male” classes.
  • the probabilities of class membership are passed as classification values for the class "female” (S$) and for the class "male” (Sj) to an evaluation unit with an algorithm for determining and outputting sex 203 .
  • This also advantageously allows the sensitivity and/or specificity of the gender determination to be adjusted for each class. This allows, for example, a very precise determination of female or male eggs, which can be adjusted according to business criteria. However, it is also possible to carry out the gender assignment singularly
  • Figure 6 shows schematically the energetic states in sex specific molecules or molecular groups.
  • the energetic excitation takes place with the excitation wavelength Xi 301 and the excitation wavelength X2 401.
  • the energy bands of the excited energy level 302 and 402 are separated by at least 0.3 eV. This ensures that the energetic overlap of the fluorescence transitions 303 and 403 is only insignificant.
  • Optical fiber for excitation light a Mirror collimator b Laser radiation with excitation wavelengths Ai and A2

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die technischen Gebiete der Bioanalytik und Landwirtschaft und betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Angabe eines Verfahrens und einer Anordnung, mit der die in-ovo Geschlechtsbestimmung bei Vogeleiern mit einer stabilen Vorhersagegenauigkeit des Geschlechts erfolgt und die einfach und kostengünstig in der Durchführung sind.Die Aufgabe wird durch ein Verfahren und eine Anordnung gelöst, bei dem ein befruchtetes und zwischen 3 und 9 Tagen bebrütetes Vogelei nach der Öffnung der Kalkschale mit mindestens zwei Licht emittierenden Laserstrahlquellen mit unterschiedlichen Anregungswellen bestrahlt wird, wobei die erfassten und verarbeiteten Spektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung als den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordnete komplementäre Spektren zur Ermittlung eines Klassifizierungswertes herangezogen und das Geschlecht durch Vergleich des ermittelten Klassifizierungswertes mit einem intrinsisch ermittelten Schwellwert bestimmt wird. Das Verfahren und die Anordnung können zur Geschlechtsbestimmung von Nutzgeflügel eingesetzt werden.

Description

Verfahren und Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf die technischen Gebiete der Bioanalytik und der Landwirtschaft und betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern. Das vorgeschlagene Verfahren und die Anordnung können beispielsweise zur Geschlechtsbestimmung von Nutzgeflügel, in der Tierzucht und kommerziellen Eiproduktion eingesetzt werden.
Eine hohe negative Korrelation zwischen Legeleistung und Mastleistung verhindert die gleichzeitige Nutzung des Haushuhnes als Eierproduzent und Fleischlieferant. So entstanden in den letzten Jahrzehnten durch Züchtung spezialisierte Linien von Wirtschaftshühnern, die entweder eine ökonomische Produktion von qualitativ hochwertigen Eiern ermöglichen (Hennen) oder aber sich für eine effiziente Fleischproduktion eignen (Hähne und Hennen). Während die Hennen der Mastlinien ebenfalls gemästet werden, können Hähne aus Legelinien gegenwärtig nur in sehr geringem Umfang wirtschaftlich aufgezogen und vermarktet werden. Von dieser Problematik ist nicht nur die konventionelle Eierproduktion betroffen, sondern auch die nach ökologischen Richtlinien wirtschaftende Legehennenhaltung. Das bisher gängige Verfahren, die männlichen Nachkommen von Legehennenlinien bereits unmittelbar nach dem Schlupf zu töten, steht im Widerspruch zu den gesetzlichen Bestimmungen und Zielen des Tierschutzes und stößt damit sowohl im In- als auch im Ausland auf ethische und rechtliche Bedenken. Deshalb gibt es zunehmend Forschungsaktivitäten hinsichtlich Alternativen zur Tötung männlicher Eintagsküken bei der Produktion von Eiern. Bisher wurden invasive und nichtinvasive Methoden zur Geschlechtsbestimmung von befruchteten Hühnereiern in verschiedenen Bebrütungszeiträumen beschrieben.
Im Stand der Technik werden bereits verschiedene Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern vorgeschlagen. So sind Verfahren zur Geschlechtsbestimmung bekannt, die sich mit der Detektion biologischer Komponenten, der spektroskopischen Charakterisierung von Keimscheibenzellen, der Analyse von DNA relevantem Zellmaterial, der endokrinologischen Bestimmung von entnommenen Probenmaterial des Vogelembryos beschäftigen. Bekannt ist weiterhin, dass mittels Magnet-Resonanz-Tomografie (MRT) das Geschlecht nicht invasiv bestimmt werden kann.
Zudem sind aus dem Stand der Technik Verfahren bekannt, die eine kontaktlose in- ovo Geschlechtsbestimmung unter Nutzung von Blutbestandteilen des Vogelembryos verfolgen.
Aus der DE 10 2014 010 150 A1 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Raman- spektroskopischen in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern bekannt, bei dem ein Loch in die Kalkschale durch einen Laser oder mechanische Perforation eingebracht wird und die Ramanstreustrahlung des bestrahlten Blutes erfasst und mittels Auswerteeinheit ausgewertet wird.
Ein kontaktloses spektroskopisches Verfahren und eine Vorrichtung zur optischen in- ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern wird in der DE 10 2016 004 051 A1 beschrieben. Ebenfalls wird ein Loch in die Kalkschale eingebracht und die Geschlechtsbestimmung erfolgt hierbei durch Auswertung der Ramanstreustrahlung am Bruttag 4, was einem frühen Embryonalstadium vor Einsetzen des Schmerzempfindens entspricht.
Aus der DE 10 2018 105 512 A1 ist ein Verfahren zur in-ovo Fertilisations- und Geschlechtsbestimmung am geschlossenen Ei bekannt, bei dem ein geschlossenes Ei positioniert, durchleuchtet und/oder beleuchtet wird, anschließend eine Aufnahme eines Bildes vom geschlossenen Ei erfolgt, danach die erfassten Daten ausgewertet und die Position des im Ei befindlichen kardiovaskulären Systems berechnet werden, eine Detektionseinheit über der berechneten Position des kardiovaskulären Systems mittels einer Positioniereinheit eingestellt und nachfolgend das Blut angeregt wird, danach die blutspezifischen und die blutfremden Absorptionsspektren detektiert und selektiert werden, die Fertilisation festgestellt wird und danach die Spektren mit blutfremden Informationen durch ein Kompensationsverfahren kompensiert werden und die Spektren zur Geschlechtsbestimmung klassifiziert werden. Nachteilig bei den bekannten Lösungen ist, dass die in-ovo Geschlechtsbestimmung mit einer ungenügend stabilen Prognosegenauigkeit erfolgt. Auch ist nachteilig, dass bekannte Verfahren und Anordnungen aufwendig und kostenintensiv sind.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Angabe eines neuen Verfahrens und einer zur Durchführung des Verfahrens vorgesehenen Anordnung, mit der die in-ovo Geschlechtsbestimmung bei Vogeleiern mit einer hohen und stabilen Vorhersagegenauigkeit des Geschlechts erfolgt und die einfach und kostengünstig in der Durchführung sind.
Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern bereitgestellt, bei dem die nachfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt werden:
- Bereitstellen eines befruchteten und zwischen 3 und 9 Tagen bebrüteten Vogeleies,
- Erzeugen einer Öffnung in der Kalkschale des Vogeleies im Bereich des spitzen oder stumpfen Pols,
- Bestrahlen und Anregen von Blut mindestens eines Bestandteiles des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems des Embryos mit mindestens zwei Licht emittierenden Laserstrahlquellen, die unterschiedliche Anregungswellenlängen A im Bereich von 400nm bis 1064m aufweisen und gleichzeitig Fluoreszenz- und Ramanstreuung anregen,
- Erfassen der im Blut angeregten und mit mindestens zwei Strahlteilereinrichtungen und nach Wellenlängenbereichen separierten Spektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung mittels mindestens zwei Detektoreinrichtungen und Verarbeiten der Spektren mittels Auswerteeinheit,
- Ausgabe der erfassten und verarbeiteten Spektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung als den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordnete komplementäre Spektren, - Ermitteln eines Klassifizierungswertes unter Verwendung der ausgegebenen komplementären Spektren eines ausgewählten spektralen Bereichs und/oder spektraler Intensitätsmaxima Ismax der den jeweiligen Anregungswellenlängen zugeordneten Fluoreszenz- und Ramanstreuung,
- Bestimmen des Geschlechts durch Vergleich des ermittelten Klassifizierungswertes mit einem intrinsisch ermittelten Schwellwert.
Vorteilhafterweise wird eine Temperatur des befruchteten und bebrüteten Vogeleies während der Verfahrensdurchführung zwischen 35°C bis 38°C eingestellt.
Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn sich die mindestens zwei verschiedenen Anregungswellenlängen um mindestens 0,3 eV des emittierten Lichts unterscheiden.
Auch ist es von Vorteil, wenn mindestens ein erster Laserstrahl mit einer Anregungswellenlänge von 400 nm bis 570nm und mindestens ein zweiter Laserstrahl mit einer Anregungswellenlänge von 640 nm bis 790 nm eingesetzt wird.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens werden zur Ermittlung des Klassifizierungswertes komplementäre Spektren in einem Wellenlängenbereich der Rückstreuung von 620 nm bis 700 nm und 820 nm bis 900 nm verwendet.
Vorteilhafterweise werden zur Ermittlung des Geschlechts komplementäre Spektren in Form geschlechtsspezifischer Spektren von Molekülkonzentrationen des Blutes verarbeitet.
Ebenfalls vorteilhafterweise erfolgt die Ermittlung des Klassifizierungswertes durch algebraische Verknüpfung der jeweiligen Intensitätsmaxima Ismax der den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordneten komplementären Spektren und/oder spektraler Bereich von Fluoreszenz- und Ramanstreuung, wobei besonders vorteilhaft die Ermittlung des Klassifizierungswertes durch Quotient-, Differenz- und/oder Summenbildung erfolgt.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn der intrinsisch ermittelte Schwellwert durch Vergleichsoperationen des Klassifikationswertes unter Berücksichtigung eines vorgegebenen Trainingssets, Bildung von Intensitätsverhältnissen und/oder neuronaler Netzwerke realisiert wird.
Erfindungsgemäß wird eine Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern unter Einsatz des vorbeschriebenen Verfahrens bereitgestellt, aufweisend
- mindestens eine Ei-Lagerungseinheit, auf der mindestens ein befruchtetes und 3 bis 9 Tage bebrütetes Vogelei lagegesichert angeordnet ist,
- mindestens zwei Licht emittierende Laserstrahlquellen, deren Laserstrahlen unterschiedliche Anregungswellenlängen aufweisen und Fluoreszenz- und Ramanstreuung im Blut mindestens eines Bestandteiles des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems anregen, wobei
- mindestens eine Einrichtung zur Positionierung des Laserfokus der mindestens zwei Laserstrahlquellen,
- mindestens zwei Anregungswellenlängen abhängige Strahlteilereinrichtungen, mit denen die angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung nach Wellenlängen separierbar sind,
- mindestens eine Detektoreinrichtung zum Erfassen der angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung,
- mindestens eine Auswerteeinheit zum Verarbeiten und
Ausgeben der Fluoreszenz- und Ramanstreuung als den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordnete komplementäre Spektren,
- mindestens eine der Auswerteinheit nachgeschaltete
Klassifizierungseinheit zum Ermitteln eines Klassifizierungswertes und zum Bestimmen des Geschlechts.
Bei der erfindungsgemäßen Anordnung ist es von Vorteil, wenn die Laserstrahlquellen Anregungswellenlängen Ai, A2 ... Ai im Bereich von 400nm bis 1064nm aufweisen. Auch ist es von Vorteil, wenn sich die unterschiedlichen Anregungswellenlängen um mindestens 0,3 eV unterscheiden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Anordnung weist eine erste Laserstrahlquelle eine Anregungswellenlänge Ai von 500nm bis 550nm und eine zweite Laserstrahlquelle eine Anregungswellenlänge A2 von 750 nm bis 790nm auf.
Zudem ist es von Vorteil, wenn zum Einkoppeln der Laserstrahlen mit unterschiedlicher Anregungswellenlänge mindestens ein Wellenlängenmultiplexer mit nachgeschalteter Koppelvorrichtung vorhanden ist.
Und auch ist es vorteilhaft, wenn der Laserfokus der mindestens zwei Laserstrahlen in xyz-Richtung und/oder die Strahltaille im Wesentlichen gleich eingestellt ist.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren und eine zur Durchführung des Verfahrens vorgesehene Anordnung bereitgestellt, mit denen die in-ovo Geschlechtsbestimmung bei Vogeleiern mit einer hohen und stabilen Vorhersagegenauigkeit des Geschlechts auf der Grundlage des biochemischen molekularen Profils des Vogeleies erfolgt und die ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Geschlechtsbestimmung ermöglichen. Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung eine Lösung, mit der die überraschenderweise herausgefundenen natürlichen Variationen des biochemischen molekularen Profils von Vogeleiern in der Messung ausgeglichen werden können.
Die wesentlichen Vorteile der erfindungsgemäßen Lösung werden durch ein Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern erreicht, bei dem in einem ersten Verfahrensschritt mindestens ein befruchtetes und zwischen 3 und 9 Tagen bebrütetes Vogelei bereitgestellt wird, bei dem in der Kalkschale eine Öffnung im Bereich des spitzen oder stumpfen Pols erzeugt wird.
Nach dem Öffnen des Vogeleies wird durch die Öffnung in der Kalkschale hindurch das Blut mindestens eines Bestandteiles des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems des Embryos mit mindestens zwei Licht emittierenden Laserstrahlquellen bestrahlt. Die Bestrahlung des Blutes erfolgt mittels mindestens zwei in der Frequenz und damit Anregungswellenlänge unterschiedlichen Laserstrahlen.
Um zu verhindern, dass durch die Einwirkung der Laserstrahlenergie eine unerwünschte Modifizierung des Blutes und seiner Bestandteile erfolgt und damit die für die Geschlechtsbestimmung wesentlichen biochemischen molekularen Informationen verfälscht werden, hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Anregung des Blutes mit mindestens zwei unterschiedlichen Anregungswellenlängen im Bereich von >400 nm bis 1064 nm realisiert wird.
Erfindungswesentlich ist, dass mindestens zwei Laserstrahlquellen mit Laserstrahlen unterschiedlicher Anregungswellenlängen eingesetzt werden. Dadurch wird erreicht, dass eine Anregung des Blutes des Embryos im selben Volumenanteil erfolgt, durch die in Abhängigkeit von den Anregungswellenlängen Fluoreszenz- und Ramanstreuung hervorgerufen und dadurch mindestens zwei unterschiedliche komplementäre Spektren erhalten werden.
Erfindungsgemäß sollen unter komplementären Spektren derartige Intensitätsspektren von Fluoreszenz- und Ramanstreuung verstanden werden, die aufgrund unterschiedlicher Anregungswellenlängen zu einer Umkehr der abgebildeten Spektren von männlichen und weiblichen spektralen Bereichen führen.
Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass mit Lasern unterschiedlicher Anregungswellenlängen Fluoreszenz- und Ramanspektren registriert werden können, bei denen sich mindestens die Fluoreszenzintensitäten der beiden komplementären Spektren bezüglich des Geschlechts gegenläufig verhalten. Das gegenläufige Verhalten der mit unterschiedlicher Frequenz angeregten Fluoreszenzintensitäten führt zu einer Verstärkung geschlechtsspezifischer Unterschiede und damit zu einer Erhöhung der Spezifität als auch Sensitivität der Geschlechtserkennung.
Erfindungswesentlich ist, dass es sich bei den komplementären Spektren um Informationen geschlechtsspezifischer Molekülkonzentrationen handelt, die aus den Bestandteilen des Blutes, nämlich Hämoglobin und Protoporphyrin gewonnen werden. Insofern ist erfindungswesentlich, dass die Auswahl der Spektren von zwei unterschiedlichen biochemischen Molekülen oder molekularen Struktureinheiten erfolgt, deren relativen Konzentrationen bezüglich des Geschlechts sich invers komplementär verhalten. Mit Verweis auf Figur 6 liegt eine biochemische Verbindung bei weiblichen Embryonen relativ zu männlichen Embryonen in einer höheren Konzentration vor und komplementär liegt eine andere biochemische Verbindung bei weiblichen Embryonen relativ zu männlichen Embryonen in einer niedrigeren Konzentration vor. Die invers komplementär vorliegenden Konzentrationen der biochemischen Moleküle bezüglich des Geschlechts führen in vorteilhafter Weise zu einer Verstärkung der geschlechtsspezifischen Signale und können zugleich zu einer intrinsischen Referenzierung genutzt werden.
Zur Abbildung eindeutig zuordenbarer komplementärer Spektren sowie für eine zuverlässige Bestimmung des Geschlechts des Vogeleies ist es von Vorteil, wenn zur Bestrahlung des Blutes des Embryos Laserstrahlquellen eingesetzt werden, bei denen sich die Anregungswellenlängen der mindestens zwei Laserstrahlen um mindestens 0,3 eV voneinander unterscheiden.
Es wurde festgestellt, dass beim Bestrahlen des embryonalen Blutes mit Laserstrahlen und Anregungswellenlängen von 400 nm bis 570 nm die Fluoreszenzstreuung des Blutes weiblicher Embryonen eine höhere Intensität gegenüber der Fluoreszenzstreuung des Blutes männlicher Embryonen aufweist. Dem gegenüber wurde herausgefunden, dass bei einer Bestrahlung des embryonalen Blutes weiblicher Embryonen mit Laserstrahlen und Anregungswellenlängen von 640 nm bis 790 nm die Intensität der Fluoreszenzstreuung gegenüber der Intensität der Fluoreszenzstreuung des Blutes männlichen Embryonen geringer ist und sich damit die komplementären Spektren sowie deren Intensitätsmaxima geschlechtsspezifisch umgekehrt verhalten. Weiterhin wurde festgestellt, dass das Profil der Fluoreszenzintensitäten als auch der Ramanspektren geschlechtsspezifische molekulare Signale aufweisen, die zur Bewertung und Geschlechtserkennung herangezogen werden können.
Diese Erkenntnisse ermöglichen es erstmals, die erhaltenen komplementären Spektren basierend auf den unterschiedlichen Anregungswellenlängen für eine einfache Auswertung der Ergebnisse sowie für eine stabile und genaue Geschlechtsbestimmung mit hoher Vorhersagezuverlässigkeit zu verwenden. Mit den geschlechtsspezifischen molekularen Raman-spektroskopischen Signalen lässt sich die Sicherheit der Geschlechtserkennung erhöhen beziehungsweise absichern.
Das Erfassen der im Blut angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung erfolgt mittels mindestens einer Detektoreinrichtung, wobei das nachfolgende Verarbeiten der komplementären Spektren mittels einer Auswerteeinheit unter Berücksichtigung mindestens einer intrinsischen Referenzierung und einer oder mehreren rechnerisch ermittelten intrinsischen Referenzierungsgrößen oder Referenzierungsfunktionen erfolgt.
Im Rahmen der Erfindung soll unter intrinsischer Referenzierung eine Vorgehensweise bei der Verarbeitung und Auswertung der erhaltenen Fluoreszenz- und Ramanstreuung verstanden werden, bei der abweichende und das Ergebnisse möglicherweise beeinflussende Verfahrensparameter oder variierende geschlechtsunspezifische Signale kompensiert oder normiert werden und damit das Ergebnis der Intensitätsspektren um absolute Schwankungen der Intensitäten oder andere interne oder externe Einflüsse bereinigt wird. Mit der intrinsischen Referenzierung kann ein frei definierbarer innerer Standardwert oder ein in Analogie zur Absorptionsspektroskopie zu bezeichnender isobestischer Punkt bestimmt werden. Dadurch wird insbesondere eine bessere Vergleichbarkeit der registrierten Intensitätsspektren und eine höhere Vorhersagegenauigkeit bei der Geschlechtsbestimmung erreicht.
Erfindungsgemäß erfolgt die Ausgabe der erfassten und verarbeiteten Intensitätsspektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung aus den, den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordneten komplementären Spektren. Das Bestimmen des Geschlechts des Embryos erfolgt nachfolgend aus den erhaltenen komplementären Spektren durch Ermittlung eines Klassifizierungswertes mittels algebraischen, univariaten, multivariaten und/oder logischen Verknüpfung.
Vorstellbar ist, dass der Klassifizierungswert durch algebraische Rechenoperationen der jeweiligen Intensitätsmaxima der den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordneten komplementären Spektren von Fluoreszenz- und Ramanstreuung ermittelt wird. Diese Vorgehensweise bietet den Vorteil einer schnellen, einfachen und kostengünstigen Ermittlung des Klassifizierungswertes bei der geschlechtsspezifischen Bestimmung unter Einsatz einer oder mehrerer kostengünstiger Detektoreinrichtungen, wie beispielsweise einer oder mehrerer Dioden.
Eine Datenauswertung und Klassifikation der Intensitätsspektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass in einem ersten Schritt die Fluoreszenz- und Ramanspektren der Anregungswellenlänge Xi und Fluoreszenz- und Ramanspektren der Anregungswellenlänge X2 mittels Klassifikatoren klassifiziert werden, wobei die Klassifizierungswerte für beide Klassen bestimmt werden. Mit einem Vergleichs- oder Referenzierungsalgorithmus werden aus den bestimmten Klassifizierungswerten zwei Klassifizierungswerte für die Klassen „männlich“ und „weiblich“ ermittelt. Diese Klassifizierungswerte werden durch einen weiteren Algorithmus in eine Festlegung und Ausgabe des Geschlechts überführt, wobei die Geschlechtszuordnung entweder singulär oder binär mit Angabe der Wahrscheinlichkeit ausgegeben werden kann. Die binäre Ausgabe besitzt den Vorteil, dass wenig eindeutige Geschlechtsaussagen unter brütereiwirtschaftlichen Gesichtspunkten bewertet werden können. Damit kann erreicht werden, dass entweder bevorzugt männliche Küken oder weibliche Küken mit hoher Genauigkeit erkannt und dem Brutprozess entzogen oder zugeführt werden. Das hat im Fall der Legehennenaufzucht den Vorteil, dass unerwünschte männliche Tiere nicht mit aufgezogen werden müssen. Generell ermöglicht die Berechnung von Klassifizierungswerten eine Einstellung der gewünschten Spezifität und/oder Sensitivität der Geschlechtsbestimmung.
Möglich ist aber auch, dass die Bestimmung des Klassifizierungswertes unter Berücksichtigung vorgegebener spektraler Bereiche erfolgt, die den komplementären Spektren der jeweiligen unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordnet sind.
Die Einordnung des ermittelten Klassifikationswertes kann über Vergleichsoperationen des Klassifikationswertes unter Einsatz eines vorgegebenen Trainingssets, Bildung von Intensitätsverhältnissen und/oder neuronale Netzwerke realisiert werden, die im Ergebnis einen Schwellwert zur Geschlechtsbestimmung liefern.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens konnte herausgefunden werden, dass die Temperatur des Blutes im extraembryonalen kardiovaskulären System des Embryos einen signifikanten Einfluss auf die Stoffwechselfunktion und auf die Intensität der angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung nach dem Bestrahlen mit Laserstrahlen hat. Zur Sicherstellung einer hohen Mess- und - Vorhersagegenauigkeit des Geschlechts ist es deshalb von Vorteil, wenn die Temperatur des befruchteten und bebrüteten Vogeleies während der Verfahrensdurchführung zwischen 35°C bis 38°C eingestellt wird.
Zur Durchführung des Verfahrens zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern wird erfindungsgemäß eine wesentlich verbesserte und kompakte Anordnung vorgeschlagen, die mindestens eine Ei- Lagerungseinheit aufweist, auf der mindestens ein befruchtetes und 3 bis 9 Tage bebrütetes Vogelei lagegesichert angeordnet ist. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, mindestens zwei Licht emittierende Laserstrahlquellen einzusetzen, deren Laserstrahlen unterschiedliche zueinander superpositionierte
Anregungswellenlängen aufweisen und Fluoreszenz- und Ramanstreuung im Blut mindestens eines Bestandteiles des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems anregen. Nachdem mindestens ein blutführender Bestandteil des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems im Vogelei detektiert wurde, kann die Bestrahlung des Blutes durch die mindestens zwei Laser mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen durchgeführt werden. Die Bestrahlung kann dabei an unterschiedlichen Positionen des kardiovaskulären Systems erfolgen, sofern sichergestellt ist, dass eine Bestrahlung von Volumenbestanteilen des Blutes erfolgt. Dadurch kann eine aufwendige Positionierungseinrichtung und Detektion des extraembryonalen kardiovaskulären Systems entfallen, was zu einer kostengünstigen Anordnung führt.
Die erfindungsgemäße Anordnung weist zudem mindestens eine Einrichtung zur Positionierung des Laserfokus auf, wobei vorteilhafterweise die Position des Fokus der mindestens zwei Laserstrahlen in xyz-Richtung und/oder die Strahltaille im Wesentlichen gleich eingestellt ist. Durch die im Wesentlichen gleiche Einstellung des Laserfokus der beiden unterschiedlichen Laserstrahlen wird vorteilhafterweise erreicht, dass Informationen über geschlechtsspezifische Molekülkonzentrationen aus dem gleichen Volumenanteil des Blutes des extraembryonalen kardiovaskulären Systems gewonnen und gleiche Bedingungen wie beispielsweise eine vergleichbare Gefäßstärke der blutführenden Bestandteile des kardiovaskulären Systems vorliegen. Dadurch wird eine wesentliche reduzierte Fehlerquote und eine bessere Vergleichbarkeit der erhaltenen Spektren bezogen auf den gleichen Volumenbestandteil des Blutes ermöglicht.
Außerdem weist die erfindungsgemäße Anordnung mindestens zwei Strahlteilereinrichtungen auf, mit denen die angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung anregungswellenlängenabhängig separierbar ist. Die vorgeschlagenen Strahlteilereinrichtungen bestehen aus Anregungswellenlängen abhängigen Reflexions- und Durchlasseinrichtungen und ermöglichen eine schnelle und einfache Trennung und damit gezielte Weiterleitung der angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung für eine zeitsparende und schnelle Geschlechtsbestimmung mit den erhaltenen Informationen.
Zusammenfassend bestehen die technischen Vorteile und Wirkungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der dazugehörigen Anordnung darin, dass
- über eine verlängerte Brutzeit vom 3. Tag bis zum 9. Tag mit stabilen Messbedingungen eine deutlich genauere Geschlechtsbestimmung des Embryos durch den Einsatz von mindestens zwei Lasern mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen im Bereich von 400 nm bis 1064 nm ermöglicht wird,
- eine verbesserte Robustheit des Verfahrens zur in-ovo Geschlechtsbestimmung gegenüber natürlich auftretenden Variationen der Eigenschaften von Vogeleiern erreicht wird,
- eine schnellere, einfachere und preiswertere Verfahrensdurchführung erreicht wird,
- ein sicheres und einfaches Erkennen von nicht lebenden Embryonen oder unerwünschten Einflussgrößen durch den Einsatz von mindestens zwei Laserstrahlquellen mit im Wesentlichen gleicher Fokusposition in xyz-Richtung sowie im Wesentlichen gleicher Einstellung der Brennpunktgröße ermöglicht wird,
- eine einfache Auswertung der komplementären Spektren und Klassifizierung des Geschlechts durch algebraische Verknüpfungen mit der Möglichkeit der zusätzlichen Kombination mit einer supervidierten Klassifikation beruhend auf Verfahren der optimalen spektralen Selektion oder auch neuronaler Netzwerke möglich ist.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die dazugehörigen Figuren zeigen
Figur 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen
Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung am stumpfen Pol eines geöffneten Vogeleies,
Figur 2 schematische Darstellungen der registrierten und von den
Anregungswellenlängen abhängigen Intensitätsspektren an unterschiedlichen Bruttagen,
Figur 3 die durch einfache Verhältnisbildung der Maxima der erhaltenen komplementären Spektren eingeordneten
Klassifizierungserfolge,
Figur 4 schematische Darstellung des Auswerteverfahrens unter Einsatz eines berechneten Spektrums mit intrinsischer Referenzierung, Figur 5 schematische Darstellung des Auswerteverfahrens unter Einsatz eines berechneten Klassifizierungswert, und
Figur 6 schematische Darstellung der energetischen
Intensitätsverhältnisse von Fluoreszenz- und Ramanstreuung in Form eines Jablonski-Diagramms.
Ausführungsbeispiel 1
Gemäß Figur 1 wird eine Anordnung zur in-ovo-Geschlechtsbestimmung schematisch dargestellt, bei der auf einer Ei-Lagerungseinheit (nicht dargestellt) ein befruchtetes, bebrütetes und am stumpfen Pol geöffnetes Vogelei 1 lagegesichert angeordnet ist. Es sind zwei Licht emittierende Laserstrahlquellen 3 und 4 vorhanden, wobei der erzeugte Laserstrahl der Laserstrahlquelle 3 mit einer Anregungswellenlänge Ai = 532 nm und der erzeugte Laserstrahl der Laserstrahlquelle 4 mit einer Anregungswellenlänge A2 = 785 nm über einen Wellenlängenmultiplexer 5 in eine Koppelvorrichtung 6 eingekoppelt und gebündelt ist.
Die Laserstrahlen werden über eine optische Faser 7 als Anregungsstrahl 7b mittels Spiegelkollimator 7a und durch nachfolgend angeordnete Spiegeleinrichtungen durch das Objektiv 8 geleitet und auf das extraembryonale kardiovaskuläre System des Embryos mit den unterschiedlichen Anregungswellenlängen von Ai = 532 nm und A2 = 785 nm mit in xyz-Richtung gleich eingestellter Fokusposition und gleicher Strahltaille gestrahlt, wodurch räumlich identische Volumenanteile des in einem Blutgefäß vorhandenen Blutes angeregt wird.
Eine Beleuchtungseinrichtung 20 mit Beleuchtungsfaser 21 zur Ausleuchtung des Eiinneren sowie eine zusätzliche Kamera 19 sind in unmittelbarer Umgebung der Öffnung des Vogeleies angeordnet.
Die angeregten und von den unterschiedlichen Anregungswellenlängen abhängige Fluoreszenz- und Ramanstreuung sowie Beleuchtungsstrahlen der Beleuchtungseinrichtung 20 werden über die Strahlteilereinrichtungen 9 (single edge 514nm), 10 und 11 (T 813,5 - 1100nm) separiert, wellenabhängig von den Detektoreinrichtungen 14 und 17 erfasst und an eine Auswerteeinheit (nicht dargestellt) weitergeleitet.
Um das Geschlecht des Embryos im Vogelei zu ermitteln, werden die erfassten und verstärkten Intensitätsspektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung, die aus den Blutbestanteilen Hämoglobin und Protoporphyrin gewonnen worden, in der Auswerteeinheit verarbeitet und als den Anregungswellenlängen Ai und A2 zugeordnete komplementäre Spektren gemäß Figur 2 abgebildet. Figur 2 zeigt dabei die Mittelwerte der ausgewerteten Intensitätsspektren am Bruttag 3,5, 5,5 und 6,5 für weibliche und männliche Embryonen. Die Spektren zeigen deutlich die Intensitätsunterschiede der komplementären Spektren bei den Anregungswellenlängen Ai und A2 sowohl hinsichtlich des Geschlechts als auch hinsichtlich des Bruttages. Erkennbar ist zudem eine Abnahme der relativen Intensitätsunterschiede zwischen weiblichen und männlichen Embryonen mit zunehmender Brutdauer. Die Spektren der Abbildung 2 verdeutlichen auch den komplementären Charakter der Spektren, d.h. die unterschiedliche, sich invers verhaltenden Intensitäten bei den Anregungswellenlängen Ai und A2.
Mit den vorliegenden komplementären Spektren erfolgt im Anschluss die mathematische Auswertung und Ermittlung eines Klassifizierungswertes durch Quotientbildung des Intensitätsmaxima aus der Anregungswellenlänge Ai = 532 nm durch das Intensitätsmaxima aus der Anregungswellenlänge Ai = 785 nm.
Die Einordnung des ermittelten Klassifizierungswertes und Bestimmung des Geschlechts des Embryos erfolgt anschließend mit Hilfe eines intrinsisch ermittelten Schwellwertes und Vergleichsoperationen des Klassifikationswertes gemäß Figur 3.
Ausführungsbeispiel 2
Es wird eine Anordnung zur in-ovo-Geschlechtsbestimmung bereitgestellt und die Verfahrensschritte gemäß Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt. Zur Auswertung und Geschlechtsbestimmung werden gemäß Figur 4 die von den Anregungswellenlänge Ai und A2 abhängigen Intensitätsspektren Isi und Is2 der Fluoreszenz- und Ramanstreuung erhalten. Die Spektren Isi und Is2 werden in der Logikeinheit 201 einer algebraischen, univariaten, multivariaten und/oder logischen Verknüpfung unterzogen. Das berechnete Intensitätsspektrum mit intrinsischer Referenzierung (IIR) wird nachfolgend dem Algorithmus zur Klassifizierung 202 unterzogen, wobei der Klassifizierungsalgorithmus Wahrscheinlichkeiten für die Zugehörigkeit zu den Klassen „weiblich“ und „männlich“ ausgibt. Die Wahrscheinlichkeiten der Klassenzugehörigkeit werden als Klassifizierungswerte für die Klasse „weiblich“ (S$) und für die Klasse „männlich“ (Sj) an eine Bewertungseinheit mit einem Algorithmus zur Festlegung und Ausgabe des Geschlechts 203 übergeben. Damit lassen sich vorteilhafter Weise die Sensitivität und/oder Spezifität der Geschlechtsbestimmung für jede Klasse einstellen. Das erlaubt beispielsweise eine nach betriebswirtschaftlichen Kriterien einstellbare und sehr genaue Bestimmung von weiblichen oder männlichen Vogeleiern. Ausführungsbeispiel 3
Mit Ausführungsbeispiel 3 wird gemäß Figur 5 eine weitere Möglichkeit zur Auswertung und Klassifizierung der Spektren vorgestellt. Es wird eine Anordnung zur in-ovo-Geschlechtsbestimmung bereitgestellt und die Verfahrensschritte gemäß Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt.
Zur Auswertung und Geschlechtsbestimmung werden gemäß Figur 5 die Fluoreszenz- und Ramanspektren Isi der Anregungswellenlänge Xi und Fluoreszenz- und Ramanspektren Is2 der Anregungswellenlänge A2 mit den Klassifikatoren 202a und 202b unabhängig voneinander klassifiziert, wobei die Klassifizierungswerte S?i S<ji und S?2 S<j2 für beide Klassen bestimmt werden. Mit dem Vergleichs- oder Referenzierungsalgorithmus 204 werden aus den 4 Klassifizierungswerten S?i S<ji S?2 S<j2 zwei Klassifizierungswerte S?1 und 8 2 für die Klassen „männlich“ und „weiblich“ ermittelt. Diese Klassifizierungswerte werden durch einen weiteren Algorithmus 204 verglichen und in eine Festlegung und Ausgabe des Geschlechts überführt. Der Vergleichsalgorithmus gibt vorteilhaft Wahrscheinlichkeiten für die Zugehörigkeit zu den Klassen „weiblich“ und „männlich“ aus. Die Wahrscheinlichkeiten der Klassenzugehörigkeit werden als Klassifizierungswerte für die Klasse „weiblich“ (S$) und für die Klasse „männlich“ (Sj) an eine Bewertungseinheit mit einem Algorithmus zur Festlegung und Ausgabe des Geschlechts 203 übergeben. Damit lassen sich ebenso in vorteilhafter Weise die Sensitivität und/oder Spezifität der Geschlechtsbestimmung für jede Klasse einstellen. Das erlaubt beispielsweise eine nach betriebswirtschaftlichen Kriterien einstellbare sehr genaue Bestimmung von weiblichen oder männlichen Eiern. Es ist aber auch möglich, die Geschlechtszuordnung singulär vorzunehmen
Die Figur 6 zeigt schematisch die energetischen Zustände in geschlechtsspezifischen Molekülen oder molekularen Gruppen. Ausgehend von dem energetischen Grundzuständen 300 und 400 erfolgt die energetische Anregung mit der Anregungswellenlänge Xi 301 und der Anregungswellenlänge X2 401. Erfindungsgemäß haben die energetischen Bänder des angeregten Energieniveaus 302 und 402 einen Abstand von mindestens 0,3 eV. Damit ist sichergestellt, dass der energetische Überlapp der Fluoreszenzübergänge 303 und 403 nur unwesentlich ist.
Bezugszeichenhste geöffnetes Vogelei
Fokus, Spot
Laser 1 mit Anregungswellenlänge Ai
Laser 2 mit Anregungswellenlänge A2
Wellenlängenmultiplexer
Koppelvorrichtung
Optische Faser für Anregungslicht a Spiegelkollimator b Laserstrahlung mit Anregungswellenlängen Ai und A2
Objektiv 20-fach
Strahlteiler 514nm 0 Strahlteiler 1 Strahlteiler 813,5 bis 110Onm 2 Objektiv Acromat 3, 16 Optischer Faser 4 Detektoreinrichtung 5 Kollimator 7 Detektoreinrichtung 8 Objektiv 50-fach 9 Kamera für 400 - 500nm 0 Beleuchtungseinheit 1 Beleuchtungsfaser 1a Licht Kamerabild 00 Fluoreszenz- und Ramanstreuung 00a Fluoreszenz- und Ramanstreuung 500 - 750nm 00b Fluoreszenz- und Ramanstreuung 785 - 1013nm 01 algebraische, univariate, multivariate, und/oder logische Verknüpfung02 Algorithmus zur Klassifizierung, Ausgabe von Klassifizierungswerten03 Algorithmus zur Festlegung, Ausgabe des Geschlechts 04 Referenzierungsalgorithmus 00 Grundzustand des Moleküls MO1 01 Anregungswellenlänge Ai 302 Energieniveau des ersten Singuletzustandes des Molekül MO1
303 Fluoreszenzübergang des Moleküls MO1
400 Grundzustand des Moleküls MO2
401 Anregungswellenlänge A2
402 Energieniveau des ersten Singuletzustandes des Molekül MO2
403 Fluoreszenzübergang des Moleküls MO2
Isi Intensitätsspektrum bei Anregungswellenlänge Xi
IS2 Intensitätsspektrum bei Anregungswellenlänge X2 liR Intensitätsspektrum mit intrinsischer Referenzierung
S(?1, 2 Klassifizierungswert für Klasse „männlich“
S$1, 2 Klassifizierungswert für Klasse „weiblich“

Claims

Patentansprüche Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von Vogeleiern, bei dem die nachfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt werden:
- Bereitstellen eines befruchteten und zwischen 3 und 9 Tagen bebrüteten Vogeleies,
- Erzeugen einer Öffnung in der Kalkschale des Vogeleies im Bereich des spitzen oder stumpfen Pols,
- Bestrahlen und Anregen von Blut mindestens eines Bestandteiles des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems des Embryos mit mindestens zwei Licht emittierenden Laserstrahlquellen, die unterschiedliche Anregungswellenlängen A im Bereich von 400nm bis 1064m aufweisen und gleichzeitig Fluoreszenz- und Ramanstreuung anregen,
- Erfassen der im Blut angeregten und mit mindestens zwei Strahlteilereinrichtungen und nach Wellenlängenbereichen separierten Spektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung mittels mindestens zwei Detektoreinrichtungen und Verarbeiten der Spektren mittels Auswerteeinheit,
- Ausgabe der erfassten und verarbeiteten Spektren der Fluoreszenz- und Ramanstreuung als den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordnete komplementäre Spektren,
- Ermitteln eines Klassifizierungswertes unter Verwendung der ausgegebenen komplementären Spektren eines ausgewählten spektralen Bereichs und/oder spektraler Intensitätsmaxima Ismax der den jeweiligen Anregungswellenlängen zugeordneten Fluoreszenz- und Ramanstreuung,
- Bestimmen des Geschlechts durch Vergleich des ermittelten Klassifizierungswertes mit einem intrinsisch ermittelten Schwellwert. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem eine Temperatur des befruchteten und bebrüteten Vogeleies während der Verfahrensdurchführung zwischen 35°C bis 38°C eingestellt wird. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem Laserstrahlquellen eingesetzt werden, bei denen sich die mindestens zwei verschiedenen Anregungswellenlängen um mindestens 0,3 eV des emittierten Lichts unterscheiden. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem mindestens ein erster Laserstrahl mit einer Anregungswellenlänge von 400 nm bis 570nm und mindestens ein zweiter Laserstrahl mit einer Anregungswellenlänge von 640 nm bis 790 nm eingesetzt wird. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem zur Ermittlung des Klassifizierungswertes komplementäre Spektren in einem Wellenlängenbereich der Rückstreuung von 620 nm bis 700 nm und 820 nm bis 900 nm verwendet werden. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem zur Ermittlung des Geschlechts komplementäre Spektren in Form geschlechtsspezifischer Spektren von Molekülkonzentrationen des Blutes verarbeitet werden. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem die Ermittlung des Klassifizierungswertes durch algebraische Verknüpfung der jeweiligen Intensitätsmaxima Ismax der den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordneten komplementären Spektren und/oder spektraler Bereich von Fluoreszenz- und Ramanstreuung erfolgt. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Ermittlung des Klassifizierungswertes durch Quotient-, Differenz- und/oder Summenbildung erfolgt. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem der intrinsisch ermittelte Schwellwert durch Vergleichsoperationen des Klassifikationswertes unter Berücksichtigung eines vorgegebenen Trainingssets, Bildung von Intensitätsverhältnissen und/oder neuronaler Netzwerke realisiert wird. Anordnung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung von befruchteten und bebrüteten Vogeleiern unter Einsatz des Verfahrens gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, aufweisend - mindestens eine Ei-Lagerungseinheit, auf der mindestens ein befruchtetes und 3 bis 9 Tage bebrütetes Vogelei lagegesichert angeordnet ist,
- mindestens zwei Licht emittierende Laserstrahlquellen, deren Laserstrahlen unterschiedliche Anregungswellenlängen aufweisen und Fluoreszenz- und Ramanstreuung im Blut mindestens eines Bestandteiles des ausgebildeten extraembryonalen kardiovaskulären Systems anregen, wobei
- mindestens eine Einrichtung zur Positionierung des Laserfokus der mindestens zwei Laserstrahlquellen,
- mindestens zwei Anregungswellenlängen abhängige Strahlteilereinrichtungen, mit denen die angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung nach Wellenlängen separierbar sind,
- mindestens eine Detektoreinrichtung zum Erfassen der angeregten Fluoreszenz- und Ramanstreuung,
- mindestens eine Auswerteeinheit zum Verarbeiten und
Ausgeben der Fluoreszenz- und Ramanstreuung als den unterschiedlichen Anregungswellenlängen zugeordnete komplementäre Spektren,
- mindestens eine der Auswerteinheit nachgeschaltete
Klassifizierungseinheit zum Ermitteln eines Klassifizierungswertes und zum Bestimmen des Geschlechts. Anordnung nach Anspruch 10, bei der die Laserstrahlquellen Anregungswellenlängen Ai, A2 ... Ai im Bereich von 400nm bis 1064nm aufweisen. Anordnung nach Anspruch 10, bei der sich die unterschiedlichen Anregungswellenlängen um mindestens 0,3 eV unterscheiden. Anordnung nach Anspruch 10, bei der eine erste Laserstrahlquelle eine Anregungswellenlänge Ai von 500nm bis 550nm und eine zweite Laserstrahlquelle eine Anregungswellenlänge A2 von 750 nm bis 790nm aufweist. Anordnung nach Anspruch 10, bei der zum Einkoppeln der Laserstrahlen mit unterschiedlicher Anregungswellenlänge mindestens ein Wellenlängenmultiplexer mit nachgeschalteter Koppelvorrichtung vorhanden ist. Anordnung nach Anspruch 10, bei der der Laserfokus der mindestens zwei Laserstrahlen in xyz-Richtung und/oder die Strahltaille im Wesentlichen gleich eingestellt ist.
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