EP4399558A1 - Microscope optique et procédé de microscopie optique haute résolution à champ de vue augmenté - Google Patents

Microscope optique et procédé de microscopie optique haute résolution à champ de vue augmenté

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EP4399558A1
EP4399558A1 EP22777969.1A EP22777969A EP4399558A1 EP 4399558 A1 EP4399558 A1 EP 4399558A1 EP 22777969 A EP22777969 A EP 22777969A EP 4399558 A1 EP4399558 A1 EP 4399558A1
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EP
European Patent Office
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image
microscope
plane
optical
camera
Prior art date
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Pending
Application number
EP22777969.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Amaury Badon
Gaëlle RECHER
Pierre Nassoy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut D'optique Theorique Et Appliquee Iota
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Original Assignee
Institut D'optique Theorique Et Appliquee Iota
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • G02B21/0088—Inverse microscopes

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of optical microscopy and the acquisition of high resolution images in optical microscopy.
  • the increase in spatial resolution is generally accompanied by a reduction in the field of the image on the camera.
  • a displacement stage of the sample holder is generally used, to bring the region of interest back to the center of the high-resolution image.
  • the present invention proposes an optical microscope comprising a microscope body and a box surrounding the body of the microscope, the optical microscope comprising a sample holder capable of receiving a sample in an object plane, a microscope objective able to collect an image beam coming from an object field in the object plane and to form an intermediate image of the object field in an image plane, the optical microscope having a Fourier plane located between the object plane and the image plane inside the microscope housing.
  • an optical microscope in which the housing comprises an output port and, the optical microscope comprising an imaging module arranged outside the housing of the microscope and a controller, the module imaging system comprising a first camera, a second camera, a beam splitter able to receive the image beam from the image plane and to form a first image beam and a second image beam, a first optical system arranged between the beam splitter and the first camera, a second optical system disposed between the beam splitter and the second camera, the second optical system and the second camera being configured to acquire a wide-view image capable of extending over the entire object field of the microscope objective , the first optical system having a higher magnification than the second optical system and the first optical system comprising an offset optical system arranged to offset the Fourier plane via the output port on the exterior of the housing and to form the image of the Fourier plane in an image Fourier plane, the first optical system comprising a reflective scanning device disposed in or near the plane of Fourier image optically conjugated with the Fourier plane of the optical microscope
  • This imaging module makes it possible to greatly enlarge the observed zone of the sample quickly and without having to physically move the sample.
  • the microscope comprises an eyepiece arranged to form a visual image of the object field.
  • the visual image extends over a field of view inscribed in the mosaic image.
  • the reflective angular scanning device comprises a flat mirror mounted on a galvanometric or motorized actuator, the flat mirror being movable around one or two axes.
  • the reflective angular scanning device comprises a microelectromechanical system based on micromirrors.
  • the microscope is of the straight or inverted type.
  • the microscope comprises a display device adapted to simultaneously display the wide view image of the object field and said at least one first image of a portion of the object field of the microscope objective .
  • the invention also proposes an optical microscopy method comprising the following steps: collection of an image beam from an object field in an object plane of a microscope objective and formation of an intermediate image in a plane image optically conjugated with the object plane; collection of the image bundle from the image plane and optical separation into a first image beam and a second image beam; transmission of the first image beam via a first optical system to a first camera, the first optical system comprising a reflective angular scanning device arranged in or close to a plane optically conjugate with the Fourier plane of the optical microscope; and simultaneously, transmission of the second image beam via a second optical system to a second camera, the first optical system having a higher magnification than the second optical system; acquisition via the second camera of a wide-view image able to extend over the entire object field of the microscope objective; angular orientation of the reflective scanning device for the acquisition via the first camera of at least a first image of a portion of the object field of the microscope objective, simultaneously with the acquisition of the large image seen via the second camera.
  • Figure 1 is a schematic view of a microscope comprising an imaging module and a controller according to the invention
  • Figure 2 is a top view of an imaging module according to an exemplary embodiment
  • Figure 3 is a schematic view of a reflective angular scanning device according to one embodiment
  • FIG. 4 is an example of a wide view image of the object field at low resolution and of a first image of a portion of the object field captured simultaneously;
  • Figure 5 is a schematic view illustrating an example of reconstruction of a high resolution mosaic image of the object field. It should be noted that in these figures the structural and/or functional elements common to the different variants may have the same references.
  • Figure 1 shows an optical microscope 100 to which is attached an imaging module 200 according to the invention.
  • the imaging module is associated with a controller 300 comprising in particular an image processing system.
  • the optical microscope 100 is here of the inverted type.
  • the microscope used is a Zeiss Axiovert 200 microscope.
  • the present disclosure easily adapts to an upright microscope.
  • the optical microscope 100 comprises a body or frame 10, a sample holder 11, at least one microscope objective 21, at least one light source 13 and/or 14, an eyepiece 12 and a port output 2.
  • the microscope comprises several microscope objectives 21, 22, 23 generally having different magnifications, for example x10, x20, x50, x100.
  • the microscope objectives 21, 22, 23 are mounted on a rotating plate 20 objective support.
  • a sample 1 is placed on the sample holder 11.
  • the sample is located in an object plane 3 of the microscope objective 21.
  • the sample can be any type of physical, chemical or biological sample.
  • the sample can be a biological sample in solution, for example a colloidal suspension, or comprises an organoid in solution.
  • the sample holder here is non-motorized.
  • the sample is manually positioned relative to the microscope objective.
  • the sample holder is mounted on a displacement stage along one or more X, Y and/or Z axes.
  • the light source 13 illuminates the sample 1 from above, over a wide field.
  • the other light source 14 illuminates the sample from below, through the microscope objective 21.
  • the light sources 13 and 14 are suitable for different imaging modalities.
  • the source 13 illuminating in transmission is mainly used for bright field microscopy or phase imaging.
  • the source 14 illuminating in reflection is used mainly for fluorescence imaging.
  • the microscope of Figure 1 is an inverted microscope.
  • the microscope collects the light transmitted by the sample and forms an image of the sample in an image plane 33.
  • the microscope collects the light reflected by the sample or emitted by fluorescence via an optical beam splitter 17.
  • the image beam 30 is collected and propagates below the sample holder.
  • the user can observe the sample with the naked eye through the eyepiece 12.
  • the user thus quickly views a large circular image of the sample formed in particular by the microscope objective and viewed via the eyepiece .
  • the microscope comprises an internal imaging optical system comprising for example the beam splitter 17, a mirror 18 and a lens optical system 19.
  • This imaging optical system forms an image of the sample in the image plane 33.
  • the image plane 33 is optically conjugated with the object plane 3 of the microscope objective 31.
  • the Fourier plane is located downstream of the microscope objective 21 and upstream of the lens 19.
  • the Fourier plane 71 is located inside the microscope frame and is generally not accessible.
  • the image plane 33 is generally located outside the microscope frame, the image beam 30 being transmitted through the output port 2.
  • a camera is generally placed in the image plane 33 on the output port 2 to detect the image of the sample.
  • the conventional image acquired by a camera in the image plane 33 is of much smaller extent than the image observed through the eyepiece. Depending on the shape of the camera sensor, this acquired image is square or rectangular. This difference between the image seen through the eyepiece and the image acquired in the image plane 33 is due to the size of the sensor and the number of pixels of current cameras, generally limited to between 1 and 5 million pixels.
  • the acquired image has a high spatial resolution associated with a reduced field extent in order to satisfy the Nyquist sampling conditions.
  • the imaging module 200 comprises an optical beam splitter 40 , a first camera 51 and a second camera 52.
  • the optical beam splitter 40 receives the image beam 30 coming from the output port 2.
  • the optical beam splitter 40 angularly splits the image beam 30 into a first image beam 31 propagating in one direction and a second image beam 32 propagating in another direction.
  • the optical beam splitter 40 can have an energy distribution of 50-50, that is to say 50% on each arm.
  • the energy distribution of the optical beam splitter 40 can be different, for example from 80-20.
  • a first optical system is arranged between the optical beam splitter 40 and the first camera 51.
  • the first optical system comprises for example a lens 41, a plane mirror 42 and another lens 43.
  • the first optical system directs the first image beam 31 to the first camera 51.
  • the lenses 41 and 43 have for example identical focal length. By way of example, lenses 41, 43 having a focal length of 100 mm are used here.
  • a second optical system is arranged between the optical beam splitter 40 and the second camera 52.
  • the second optical system comprises for example a lens 44, a reflective optical system with two mirrors 45 and 46 and another lens 47.
  • the second optical system is fixed.
  • the second optical system directs the second image beam 32 towards the second camera 52.
  • the two mirrors 45 and 46 are planar and serve to fold the optical path to make the imaging module 200 more compact.
  • the lenses 44 and 47 are chosen to form an optical system of magnification less than 1.
  • a lens 44 having a focal length Fi of 250 mm and a lens 47 having a focal length of 75 mm are chosen here.
  • the ratio between the focal lengths of the lenses 44 and 47 is here 0.3.
  • the lens 44 of focal length Fi is placed at the distance Fi from the image plane 33 at the exit from the microscope. Between the lenses 44 and 47, the second image beam 32 is collimated. Thus, the incident beam on the mirrors 45 and 46 is collimated.
  • the second camera 52 is placed in the focal plane of the lens 47.
  • the second optical system and the second camera 52 are thus arranged and configured to make it possible to acquire a wide-view image 60 extending for example over the entire object field of the microscope objective 21.
  • This wide view image 60 is generally square or rectangular in shape and has at least the same field as the image seen through the eyepiece.
  • the first optical system has a higher magnification than the second optical system.
  • the first optical system has a magnification of 1 and the second optical system has a magnification of 0.3.
  • the first optical system comprises a reflective scanning device.
  • the reflective scanning device comprises a plane mirror 42 mounted on an actuator 48 movable around at least one axis of rotation and preferably two axes of rotation.
  • the actuator comprises servomotors for pivoting the mirror 42 around two transverse axes of rotation.
  • a two-axis galvanometric actuator is used which allows for faster scanning than servo motors.
  • the reflective angular scanning device comprises a micro-electromechanical system (or MEMS for “Micro Electro-Mechanical System”) based on micromirrors. MEMS also allow faster scanning than servomotors.
  • the lens 41 of focal length F? is placed at the distance F? of the image plane 33 at the output of the microscope.
  • a plane 72 optically conjugated with the Fourier plane 71 of the optical microscope 100 is obtained downstream of the lens 41, at the distance F? of this lens 41.
  • the lens 41 forms the image of the Fourier plane 71 in an image Fourier plane, denoted 72.
  • the plane mirror 42 is arranged in the vicinity or in the image Fourier plane 72.
  • the first beam incident image 31 on plane mirror 42 is collimated.
  • An electronic controller 300 makes it possible to control the orientation of the actuator 48 and therefore the angular position of the plane mirror 42.
  • the first camera 51 is placed in the focal plane of the lens 43.
  • the plane mirror 42 being oriented in a first position, the first camera 51 acquires a first image 61 of a portion of the object field of the objective of microscope 21.
  • the acquisition of the first image 61 on the first camera 51 and of the wide view image 60 on the second camera 52 can be simultaneous.
  • a wide-view image 60 is thus available, in particular of the entire object field of the sample, and a first image 61 of higher resolution of a smaller portion of the object field. than the wide view image 60.
  • the wide view image 60 and the first image 61 can be displayed on one or more display screens.
  • the displayed wide view image is refreshed in real time. This real-time display has a significant advantage in the case of biological samples or samples presenting physicochemical reactions liable to change over time.
  • the simultaneous display of the wide view image 60 and the first image 61 allow the user to locate the position of the first high resolution image 61 in the object field of the wide view image, knowing the position of the actuator 48 of the mirror 42.
  • FIG. 4 there is shown on the wide view image 60, the contours corresponding to the first image 61 displayed alongside.
  • the first image 61 and possibly the wide image are stored in memory, for example in the memory of a computer or of the controller 300.
  • the coordinates of the first position of the plane mirror 42 corresponding to the first image 61 are also stored in memory. .
  • the plane mirror 42 being oriented in a second position, the first camera 51 acquires a second image 62 of another portion of the object field of the microscope objective 21.
  • the coordinates of the second position of the plane mirror 42 corresponding to the second image 62 are stored in memory.
  • the second image 62 is displayed on screen and also stored in memory. It is thus possible to obtain high resolution images of different portions of the sample by simply orienting the mirror 42 and without moving the sample.
  • the first image 61 and the second image 62 have the same spatial resolution.
  • the simultaneous display of the wide view image, the first image 61 and the second image 62 allows the user to easily navigate in the object plane via the orientation of the mirror 42 in the Fourier plane. image 62. It is recalled that the wide view image is updated in real time.
  • the user By a calibration establishing the correspondence between the position of the mirror and the position in the object field, the user knows the position of each image of high resolution with respect to the object plane.
  • the order of magnitude of the inclination of the mirror 42 to move the imaged zone of the image is a few degrees, for example 5 degrees.
  • the controller includes an image processing system which makes it possible to reconstruct a mosaic image 600 of the sample at high resolution from the series of N second images 61, 62, ... 6N as illustrated in figure 5.
  • the image reconstruction method is for example based on the known method of assembling or merging images (stitching in English).
  • Image stitching or merging uses only high-resolution images and stitches them together by finding the identical elements between two neighboring images. In case of overlap on the edge of the images, there are several possibilities, for example to average the two images which overlap.
  • the mosaic image 600 can be constructed and updated as the second images 61, 62, ... 6N are acquired. A mosaic image is thus obtained which has both a wide field and a high resolution over the entire field. Additionally, the first wide view image can be displayed in real time simultaneously and alongside the 600 mosaic image. of evolution evolved for example, while retaining the other high resolution images all around.
  • the use of the image scanning device allows the acquisition and reconstruction of a wide-field, high-resolution mosaic image without moving the sample on the sample holder.
  • the complete reconstruction of a mosaic image is limited by the movement time of the servo motors.
  • the use of galvanometric actuators or MEMS makes it possible to increase the speed of movement of the scanning device.
  • the rate of acquisition and reconstruction of a mosaic image is then limited by the rate of acquisition of the first camera 51. For example, if the number N of images necessary to reconstruct a mosaic image on the field of view d together at high-resolution is equal to 10, the total acquisition time is only equal to 10 times the acquisition time of a single image, or only a few milliseconds.
  • the imaging module 200 thus makes it possible to obtain a high-resolution mosaic image over a large field of view without moving the sample and without changing the microscope objective. There is thus no offset between the different acquired images 61, 62, ... 6N.
  • the imaging module 200 makes it possible to increase the performance of an already existing microscope for a moderate cost.
  • the imaging module makes it possible to obtain a mosaic image having a field of view increased by a factor of 10 compared to a single first image 61 while being fast.
  • the system is easy to use.
  • the imaging module 200 is compact (dimensions approximately 30cmx30cmx15cm).
  • the speed of the system is crucial in the field of biology, in particular for observing rapid phenomena and/or for fluorescence imaging where photobleaching is directly linked to the duration of exposure and/or the duration of the measure.
  • Another advantage of the invention relates to the gain on the size of the stored data. Only certain areas of the sample of interest can be imaged at high resolution, which means that unused information is not stored unnecessarily.
  • the module differs here from the use of a camera having a large number of pixels which is expensive and which records a large high-resolution image, without possible adjustment, and therefore produces a large quantity of useless information.
  • the imaging module 200 is compatible with any conventional commercial inverted microscope. It makes it possible to greatly enlarge the observed area of the sample quickly and without having to physically move the sample. For a moderate cost, it thus makes it possible to greatly increase the performance of an already existing microscope. It also facilitates, by saving time, correlative microscopy experiments aimed at combining electron microscopy and optical microscopy images. [0051]
  • the imaging module has a relatively limited manufacturing cost, it only contains inexpensive components, in comparison with fast scanning systems such as resonant scanners.
  • the imaging module makes it possible to implement an optical microscopy method.
  • the microscopy method comprises the following steps.
  • An image beam 30 from the object field of a sample located in the object plane 3 of a microscope objective 21 is collected.
  • An intermediate image is formed in an image plane 33 optically conjugate with the object plane 3.
  • the image beam 30 from the image plane 33 is collected and it is angularly separated into a first image beam 31 and a second image beam 32.
  • the first image beam 31 is transmitted via the first optical system to the first camera 51, the first optical system comprising a reflective angular scanning device arranged in or close to a plane 72 optically conjugate with the Fourier plane 71 of the optical microscope 100.
  • the second image beam 32 is transmitted via the second optical system to the second camera 52.
  • the first optical system has a higher magnification than the second optical system.
  • the reflective scanning device is angularly oriented to acquire via the first camera 51 at least a first image 61 of a portion of the object field of the microscope objective 21, 22, 23.
  • a wide-view image 60 and at least a first image 61 of a portion of the object field are thus simultaneously available without changing the microscope objective.
  • a series of N second images 61, 62, . . . 6N are successively acquired.
  • the various images 61, 62, ... 6N thus obtained are assembled so as to reconstruct a mosaic image 600 wide view and of high resolution over at least part of the mosaic image.
  • the mosaic image which presents both a high resolution and a wide field, is obtained without moving the sample and without changing the microscope objective.
  • the present disclosure finds applications in the field of observation of samples sensitive to displacement, in particular in biology (cells, organoids, embryos, etc.) but also in physics (nano-films for example) or in chemistry (colloidal suspensions for example).

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Abstract

L'invention concerne un microscope optique (100) et un procédé de microscopie. Selon l'invention, le microscope comporte un module d'imagerie (200) comprenant un séparateur optique de faisceau (40), un premier système optique (41, 42, 43), une première caméra (51), un second système optique (44, 45, 46, 47) et une seconde caméra (52), le second système optique (44, 45, 46, 47) et la seconde caméra (52) étant configurés pour acquérir une image large vue, et le premier système optique (41, 42, 43) comportant un dispositif réflectif de balayage (42, 48) disposé dans un plan (72) conjugué optiquement avec le plan de Fourier (71) du microscope optique (100), un contrôleur (300) étant adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage (42, 48) de façon à ce que la première caméra (51) acquière au moins une première image (61, 62,..., 6N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23).

Description

Microscope optique et procédé de microscopie optique haute résolution à champ de vue augmenté
Domaine technique
[0001] La présente invention concerne le domaine technique de la microscopie optique et de l'acquisition d'images de haute résolution en microscopie optique.
Technique antérieure
[0002] Dans le domaine ci-dessus, il est connu d'intégrer une caméra sur un port de sortie d'un microscope optique pour acquérir des images via le microscope. Il est aussi connu de changer une partie du système optique du microscope, en commutant l'objectif de microscope et/ou des éléments optiques internes au microscope, pour augmenter le grossissement du système optique entre l'échantillon et la caméra. Un tel changement de grossissement permet d'augmenter la résolution spatiale de l'image de microscopie formée sur la caméra.
[0003] Toutefois, l'augmentation de la résolution spatiale s'accompagne généralement d'une réduction du champ de l'image sur la caméra. Pour obtenir une image de différentes régions d'intérêt d'un échantillon, on utilise généralement une platine de déplacement du porte-échantillon, pour ramener la région d'intérêt au centre de l'image de haute résolution.
[0004] Cependant, les mouvements mécaniques liés au déplacement du porte-échantillon ou à une commutation d'une partie du système optique peuvent induire des vibrations néfastes pour certains échantillons fragiles et mobiles comme des échantillons biologiques en solution, par exemple des suspensions colloïdales, des organoïdes. De plus, ces mouvements mécaniques entraînement généralement un désalignement entre les différentes images. Enfin, ces systèmes sont relativement lents.
[0005] Il existe un besoin pour un appareil et un procédé d'acquisition d'image de microscopie optique ayant à la fois une haute résolution et un champ image étendu, qui soit rapide et sans vibrations.
Exposé de l'invention [0006] Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un microscope optique comprenant un corps de microscope et un boîtier entourant le corps du microscope, le microscope optique comprenant un porte- échantillon apte à recevoir un échantillon dans un plan objet, un objectif de microscope apte à collecter un faisceau image issu d'un champ objet dans le plan objet et à former une image intermédiaire du champ objet dans un plan image, le microscope optique ayant un plan de Fourier situé entre le plan objet et le plan image à l'intérieur du boîtier du microscope.
[0007] Plus particulièrement, on propose selon l'invention un microscope optique dans lequel le boîtier comporte un port de sortie et, le microscope optique comportant un module d'imagerie arrangé à l'extérieur du boîtier du microscope et un contrôleur, le module d'imagerie comprenant une première caméra, une seconde caméra, un séparateur de faisceau apte à recevoir le faisceau image du plan image et à former un premier faisceau image et un second faisceau image, un premier système optique disposé entre le séparateur de faisceau et la première caméra, un second système optique disposé entre le séparateur de faisceau et la seconde caméra, le second système optique et la seconde caméra étant configurés pour acquérir une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope, le premier système optique ayant un grossissement supérieur au second système optique et le premier système optique comprenant un système optique de déport disposé de manière à déporter le plan de Fourier via le port de sortie à l'extérieur du boîtier et à former l'image du plan de Fourier dans un plan de Fourier image, le premier système optique comportant un dispositif réflectif de balayage disposé dans ou à proximité du plan de Fourier image conjugué optiquement avec le plan de Fourier du microscope optique et le premier système optique comportant une lentille, la première caméra étant placée dans le plan focal de la lentille, le contrôleur étant adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage de façon à ce que la première caméra acquière au moins une première image d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope, simultanément avec l'image large vue du champ objet acquise par la seconde caméra, et dans lequel le contrôleur est adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage angulaire dans une série d'au moins deux positions, la première caméra étant adaptée pour acquérir une série de premières images d'au moins deux portions du champ objet sans déplacement de l'échantillon, sans changement d'objectif de microscope et sans changement de grossissement optique entre le champ objet et la première caméra, le microscope comprenant un système de traitement d'image adapté pour recevoir la série de premières images et pour reconstruire une image mosaïque haute résolution du champ objet.
[0008] Ce module d'imagerie permet d'agrandirfortement la zone observée de l'échantillon de façon rapide et sans avoir à déplacer physiquement l'échantillon.
[0009] D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du microscope conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes.
[0010] De façon avantageuse, le microscope comprend un oculaire disposé pour former une image visuelle du champ objet.
[0011] Avantageusement, l'image visuelle s'étend sur un champ de vue inscrit dans l'image mosaïque.
[0012] Selon un mode de réalisation, le dispositif réflectif de balayage angulaire comprend un miroir plan monté sur un actionneur galvanométrique ou motorisé, le miroir plan étant mobile autour d'un ou deux axes.
[0013] Selon un autre mode de réalisation, le dispositif réflectif de balayage angulaire comprend un microsystème électromécanique à base de micromiroirs.
[0014] Le microscope est de type droit ou inversé.
[0015] Selon un aspect particulier et avantageux, le microscope comprend un dispositif d'affichage adapté pour afficher simultanément l'image large vue du champ objet et ladite au moins une première image d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope.
[0016] L'invention propose également un procédé de microscopie optique comprenant les étapes suivantes : collection d'un faisceau image issu d'un champ objet dans un plan objet d'un objectif de microscope et formation d'une image intermédiaire dans un plan image conjugué optiquement avec le plan objet ; collection du faisceau image issu du plan image et séparation optique en un premier faisceau image et un second faisceau image ; transmission du premierfaisceau image via un premier système optique vers une première caméra, le premier système optique comportant un dispositif réflectif de balayage angulaire disposé dans ou à proximité d'un plan conjugué optiquement avec le plan de Fourier du microscope optique ; et simultanément, transmission du second faisceau image via un second système optique vers une seconde caméra, le premier système optique ayant un grossissement supérieur au second système optique ; acquisition via la seconde caméra d'une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope ; orientation angulaire du dispositif réflectif de balayage pour l'acquisition via la première caméra d'au moins une première image d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope, simultanément avec l'acquisition de l'image large vue via la seconde caméra.
[0017] Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
Brève description des dessins
[0018] De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où :
[0019] La figure 1 est une vue schématique d'un microscope comprenant un module d'imagerie et un contrôleur selon l'invention ;
[0020] La figure 2 est une vue de dessus d'un module d'imagerie selon un exemple de réalisation ;
[0021] La figure 3 est une vue schématique d'un dispositif réflectif de balayage angulaire selon un mode de réalisation ;
[0022] La figure 4 est un exemple d'image large vue du champ objet à basse résolution et d'une première image d'une portion du champ objet capturées simultanément ;
[0023] La figure 5 est une vue schématique illustrant un exemple de reconstruction d'une image mosaïque haute résolution du champ objet. [0024] Il est à noter que sur ces figures les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références.
Description détaillée
[0025] La figure 1 représente un microscope optique 100 auquel est fixé un module d'imagerie 200 selon l'invention. Le module d'imagerie est associé à un contrôleur 300 comportant en particulier un système de traitement d'image. Le microscope optique 100 est ici de type inversé. Par exemple, le microscope utilisé est un microscope Zeiss Axiovert 200. En variante, la présente divulgation s'adapte aisément à un microscope droit.
[0026] De manière classique, le microscope optique 100 comprend un corps ou bâti 10, un porte-échantillon 11, au moins un objectif de microscope 21, au moins une source de lumière 13 et/ou 14, un oculaire 12 et un port de sortie 2.
[0027] De façon avantageuse, le microscope comporte plusieurs objectifs de microscope 21, 22, 23 ayant en général des grossissements différents, par exemple xlO, x20, x50, xlOO. Les objectifs de microscope 21, 22, 23 sont montés sur une platine rotative 20 support d'objectif.
[0028] Un échantillon 1 est disposé sur le porte-échantillon 11. L'échantillon est situé dans un plan objet 3 de l'objectif de microscope 21. L'échantillon peut être tout type d'échantillon physique, chimique ou biologique. En particulier, l'échantillon peut être un échantillon biologique en solution, par exemple une suspension colloïdale, ou comporte un organoïde en solution. Le porte-échantillon est ici non-motorisé. On positionne manuellement l'échantillon par rapport à l'objectif de microscope. En option, le porte- échantillon est monté sur une platine de déplacement suivant un ou plusieurs axes X, Y et/ou Z.
[0029] La source de lumière 13 permet d'éclairer l'échantillon 1 par le dessus, sur un large champ. L'autre source de lumière 14 éclaire l'échantillon par en-dessous, à travers l'objectif de microscope 21. Les sources de lumière 13 et 14 sont adaptées à des modalités d'imagerie différentes. La source 13 éclairant en transmission est principalement utilisée pour de la microscopie de champ clair ou de l'imagerie de phase. La source 14 éclairant en réflexion est utilisée principalement pour de l'imagerie de fluorescence.
[0030] Comme indiqué plus haut, le microscope de la figure 1 est un microscope inversé. Autrement dit, dans le cas où on utilise la source de lumière 13, le microscope collecte la lumière transmise par l'échantillon et forme une image de l'échantillon dans un plan image 33. Dans le cas où on utilise l'autre source de lumière 14, le microscope collecte la lumière réfléchie par l'échantillon ou émise par fluorescence via un séparateur optique de faisceau 17. Dans les deux cas, le faisceau image 30 est collecté et se propage en dessous du porte-échantillon.
[0031] L'utilisateur peut observer l'échantillon à l'œil nu par l'oculaire 12. L'utilisateur visualise ainsi rapidement une grande image circulaire de l'échantillon formée notamment par l'objectif de microscope et visualisée via l'oculaire.
[0032] D'autre part, le microscope comporte un système optique d'imagerie interne comprenant par exemple le séparateur de faisceau 17, un miroir 18 et un système optique à lentille 19. Ce système optique d'imagerie forme une image de l'échantillon dans le plan image 33. Le plan image 33 est conjugué optiquement avec le plan objet 3 de l'objectif de microscope 31. On note 71 le plan de Fourier du microscope. Pour un objectif de microscope 21 corrigé à l'infini, le plan de Fourier est situé en aval de l'objectif de microscope 21 et en amont de la lentille 19. Le plan de Fourier 71 est situé à l'intérieur du bâti du microscope et n'est en général pas accessible. Par contre, le plan image 33 est généralement situé à l'extérieur du bâti microscope, le faisceau image 30 étant transmis à travers le port de sortie 2.
[0033] Dans un microscope conventionnel, une caméra est généralement placée dans le plan image 33 sur le port de sortie 2 pour détecter l'image de l'échantillon. Toutefois, l'image conventionnelle acquise par une caméra dans le plan image 33 est d'étendue beaucoup plus petite que l'image observée à travers l'oculaire. Selon la forme du capteur de la caméra, cette image acquise est de forme carrée ou rectangulaire. Cette différence entre l'image vue à travers l'oculaire et l'image acquise dans le plan image 33 est due à la taille du capteur et au nombre de pixels des caméras actuelles, limité généralement entre 1 et 5 millions de pixels. L'image acquise présente une haute-résolution spatiale associée à une étendue de champ réduite afin de satisfaire les conditions d'échantillonnage de Nyquist.
[0034] Comme illustré sur les figures 1 et 2, à la place du détecteur d'image classique placé sur le port de sortie, on dispose le module d'imagerie 200. Le module d'imagerie 200 comporte un séparateur optique de faisceau 40, une première caméra 51 et une seconde caméra 52. Le séparateur optique de faisceau 40 reçoit le faisceau image 30 provenant du port de sortie 2. Le séparateur optique de faisceau 40 sépare angulairement le faisceau image 30 en un premier faisceau image 31 se propageant dans une direction et un second faisceau image 32 se propageant dans une autre direction. Le séparateur optique de faisceau 40 peut avoir une répartition en énergie de 50-50, c'est-à-dire 50% sur chaque bras. En variante, la répartition d'énergie du séparateur optique de faisceau 40 peut être différente, par exemple de 80-20.
[0035] Un premier système optique est disposé entre le séparateur optique de faisceau 40 et la première caméra 51. Le premier système optique comprend par exemple une lentille 41, un miroir plan 42 et une autre lentille 43. Le premier système optique dirige le premier faisceau image 31 vers la première caméra 51. Les lentilles 41 et 43 sont par exemple de focale identique. A titre d'exemple, on utilise ici des lentilles 41, 43 ayant une longueur focale de 100 mm.
[0036] Un second système optique est disposé entre le séparateur optique de faisceau 40 et la seconde caméra 52. Le second système optique comprend par exemple une lentille 44, un système optique réflectif à deux miroirs 45 et 46 et une autre lentille 47. De préférence, le second système optique est fixe. Le second système optique dirige le second faisceau image 32 vers la seconde caméra 52. Les deux miroirs 45 et 46 sont plans et servent à replier le chemin optique pour rendre le module d'imagerie 200 plus compact. Les lentilles 44 et 47 sont choisies pour former un système optique de grossissement inférieur à 1. A titre d'exemple, on choisit ici une lentille 44 ayant une longueur focale Fi de 250 mm et une lentille 47 ayant une longueur focale de 75 mm. Le rapport entre les longueurs focales des lentilles 44 et 47 est ici de 0,3. La lentille 44 de longueur focale Fi est placée à la distance Fi du plan image 33 en sortie du microscope. Entre les lentilles 44 et 47, le second faisceau image 32 est collimaté. Ainsi, le faisceau incident sur les miroirs 45 et 46 est collimaté. La seconde caméra 52 est placée dans le plan focal de la lentille 47. Le second système optique et la seconde caméra 52 sont ainsi disposés et configurés pour permettre d'acquérir une image large vue 60 s'étendant par exemple sur tout le champ objet de l'objectif de microscope 21. Cette image large vue 60 est en général de forme carrée ou rectangulaire et présente au moins le même champ que l'image vue à travers l'oculaire.
[0037] Le premier système optique a un grossissement supérieur à celui du second système optique. Dans l'exemple détaillé ci-dessus, le premier système optique a un grossissement de 1 et le second système optique a un grossissement de 0,3.
[0038] De plus, le premier système optique comporte un dispositif réflectif de balayage. Dans le mode de réalisation illustré sur les figures 1 à 3, le dispositif réflectif de balayage comprend un miroir plan 42 monté sur un actionneur 48 mobile autour d'au moins un axe de rotation et de préférence deux axes de rotation. Sur la figure 2, l'actionneur comporte des servomoteurs pour pivoter le miroir 42 autour de deux axes de rotation transverses. En variante, on utilise un actionneur galvanométrique à deux axes qui permet un balayage plus rapide que des servomoteurs. Dans un autre mode de réalisation, le dispositif réflectif de balayage angulaire comprend un microsystème électromécanique (ou MEMS pour « Micro Electro-Mechanical System » en anglais) à base de micromiroirs. Les MEMS autorisent aussi un balayage plus rapide que des servomoteurs.
[0039] La lentille 41 de longueur focale F? est placée à la distance F? du plan image 33 en sortie du microscope. Un plan 72 conjugué optiquement avec le plan de Fourier 71 du microscope optique 100 est obtenu en aval de la lentille 41, à la distance F? de cette lentille 41. Autrement dit, la lentille 41 forme l'image du plan de Fourier 71 dans un plan de Fourier image, noté 72. Le miroir plan 42 est disposé au voisinage ou dans le plan de Fourier image 72. Le premier faisceau image 31 incident sur le miroir plan 42 est collimaté. Un contrôleur 300 électronique permet de commander l'orientation de l'actionneur 48 et donc la position angulaire du miroir plan 42. La première caméra 51 est placée dans le plan focal de la lentille 43.
[0040] Le miroir plan 42 étant orienté dans une première position, la première caméra 51 acquiert une première image 61 d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope 21. L'acquisition de la première image 61 sur la première caméra 51 et de l'image large vue 60 sur la seconde caméra 52 peuvent être simultanées. Comme illustré sur la figure 4, on dispose ainsi d'une image large vue 60, en particulier de tout le champ objet de l'échantillon, et d'une première image 61 de plus haute résolution d'une portion du champ objet plus petite que l'image large vue 60. L'image large vue 60 et la première image 61 peuvent être affichées sur un ou plusieurs écrans de visualisation. L'image large vue affichée est rafraîchie en temps réel. Cet affichage temps réel présente un avantage important dans le cas d'échantillons biologiques ou présentant des réactions physicochimiques susceptibles d'évoluer dans le temps. De plus, l'affichage simultané de l'image large vue 60 et de la première image 61 permettent à l'utilisateur de situer la position de la première image 61 de haute résolution dans le champ objet de l'image large vue, connaissant la position de l'actionneur 48 du miroir 42. Sur la figure 4, on a représenté sur l'image large vue 60, les contours correspondant à la première image 61 affichée à côté. La première image 61 et éventuellement l'image large sont stockées en mémoire, par exemple dans la mémoire d'un ordinateur ou du contrôleur 300. On enregistre aussi en mémoire les coordonnées de la première position du miroir plan 42 correspondant à la première image 61.
[0041] Le miroir plan 42 étant orienté dans une deuxième position, la première caméra 51 acquiert une deuxième image 62 d'une autre portion du champ objet de l'objectif de microscope 21. Les coordonnées de la deuxième position du miroir plan 42 correspondant à la deuxième image 62 sont enregistrées en mémoire. La deuxième image 62 est affichée sur écran et aussi enregistrée en mémoire. On peut ainsi obtenir des images haute résolution de différentes portions de l'échantillon en orientant simplement le miroir 42 et sans déplacer l'échantillon. La première image 61 et la deuxième image 62 ont la même résolution spatiale. De plus, l'affichage simultané de l'image large vue, de la première image 61 et de la deuxième image 62, permet à l'utilisateur de naviguer aisément dans le plan objet via l'orientation du miroir 42 dans le plan de Fourier image 62. On rappelle que l'image large vue est remise à jour en temps réel. Par une calibration établissant la correspondance entre la position du miroir et la position dans le champ objet, l'utilisateur connaît la position de chaque image de haute résolution par rapport au plan objet. L'ordre de grandeur de l'inclinaison du miroir 42 pourdéplacer la zone imagée de l'image est de quelques degrés, parexemple de 5 degrés.
[0042] De la même manière, le miroir étant orienté successivement suivant N orientations différentes, on acquiert une série de N deuxièmes images 61, 62, ... 6N, qui sont stockées en mémoire ainsi que les positions correspondantes du miroir 42 pour chaque image acquise. Le contrôleur comprend un système de traitement d'images qui permet de reconstruire une image mosaïque 600 de l'échantillon à haute résolution à partir de la série de N deuxièmes images 61, 62, ... 6N comme illustré sur la figure 5.
[0043] Le procédé de reconstruction d'image est par exemple basé sur la méthode connue d'assemblage ou de fusion d'images (stitching en anglais). L'assemblage ou la fusion d'images utilise seulement des images haute-résolution et les assemble en trouvant les éléments identiques entre deux images voisines. En cas de superposition sur le bord des images, il existe plusieurs possibilités, par exemple de moyenner les deux images qui se superposent.
[0044] L'image mosaïque 600 peut être construite et remise à jour au fur et à mesure de l'acquisition des deuxièmes images 61, 62, ... 6N. On obtient ainsi une image mosaïque qui présente à la fois un large champ et une haute résolution sur tout le champ. De plus, la première image large vue peut être affichée en temps réel simultanément et à côté de l'image mosaïque 600. Cette configuration permet d'orienter l'acquisition d'image haute résolution dans une partie de l'image large vue en cours d'évolution évolué par exemple, tout en conservant les autres images de haute résolution tout autour.
[0045] L'utilisation du dispositif de balayage d'image permet l'acquisition et la reconstruction d'une image mosaïque large champ et de haute résolution sans déplacer l'échantillon sur le porte-échantillon. Lorsqu'on utilise des servo-moteurs relativement lents, la reconstruction complète d'une image mosaïque est limitée par le temps de déplacement des servo-moteurs. L'utilisation d'actionneurs galvanométriques ou de MEMS permet d'augmenter la vitesse de déplacement du dispositif de balayage. La cadence d'acquisition et de reconstruction d'une image mosaïque est alors limitée par la cadence d'acquisition de la première caméra 51. Par exemple, si le nombre N d'images nécessaires pour reconstruire une image mosaïque sur le champ de vue d'ensemble à haute-résolution est égal à 10, le temps d'acquisition total est seulement égal à 10 fois la durée d'acquisition d'une seule image, soit seulement quelques millisecondes.
[0046] Le module d'imagerie 200 permet ainsi d'obtenir une image mosaïque de haute résolution sur un grand champ de vue sans déplacer l'échantillon et sans changer d'objectif de microscope. Il n'y a ainsi pas de décalage entre les différentes images acquises 61, 62, ... 6N. Le module imagerie 200 permet d'augmenter les performances d'un microscope déjà existant pour un coût modéré.
[0047] Dans l'exemple détaillé ci-dessus, le module d'imagerie permet d'obtenir une image mosaïque ayant un champ de vue augmenté d'un facteur 10 par rapport à une seule première image 61 tout en étant rapide. Le système est simple d'utilisation. Le module d'imagerie 200 est compact (dimensions environ 30cmx30cmxl5cm).
[0048] Le même procédé peut être appliqué quel que soit l'objectif de microscope utilisé 21, 22 ou 23.
[0049] La rapidité du système est cruciale dans le domaine de la biologie, notamment pour observer des phénomènes rapides et/ou pour de l'imagerie de fluorescence où le photoblanchiment est directement lié à la durée d'exposition et/ou à la durée de la mesure. Un autre avantage de l'invention est relatif au gain sur la taille des données stockées. Seules certaines zones de l'échantillon présentant un intérêt peuvent être imagées à haute-résolution ce qui permet de ne pas stocker inutilement de l'information non- exploitée. Le module se différencie ici de l'emploi d'une caméra présentant un grand nombre de pixels qui est onéreuse et qui enregistre une grande image à haute-résolution, sans ajustement possible, et produit donc une grande quantité d'information inutile.
[0050] Le module d'imagerie 200 est compatible avec tout microscope inversé conventionnel du commerce. Il permet d'agrandir fortement la zone observée de l'échantillon de façon rapide et sans avoir à déplacer physiquement l'échantillon. Pour un coût modéré, il permet ainsi d'augmenter grandement les performances d'un microscope déjà existant. Il permet aussi de faciliter, par un gain de temps, les expériences en microscopie corrélative visant à combiner les images de microscopie électronique et de microscopie optique. [0051] Le module d'imagerie est d'un coût de fabrication relativement limité, il contient seulement des composants peu onéreux, en comparaison avec des systèmes de balayage rapides tels que les scanners résonants.
[0052] Le module d'imagerie permet d'implémenter un procédé de microscopie optique. Le procédé de microscopie comporte les étapes suivantes.
[0053] On collecte un faisceau image 30 issu du champ objet d'un échantillon situé dans le plan objet 3 d'un objectif 21 de microscope. On forme une image intermédiaire dans un plan image 33 conjugué optiquement avec le plan objet 3.
[0054] On collecte le faisceau image 30 issu du plan image 33et on le sépare angulairement en un premier faisceau image 31 et un second faisceau image 32.
[0055] On transmet le premier faisceau image 31 via le premier système optique vers la première caméra 51, le premier système optique comportant un dispositif réflectif de balayage angulaire disposé dans ou à proximité d'un plan 72 conjugué optiquement avec le plan de Fourier 71 du microscope optique 100.
[0056] Simultanément, on transmet le second faisceau image 32 via le second système optique vers la seconde caméra 52. Le premier système optique a un grossissement supérieur au second système optique.
[0057] On acquiert via la seconde caméra 52 une image large vue s'étendant par exemple sur tout le champ objet de l'objectif de microscope 21.
[0058] On oriente angulairement le dispositif réflectif de balayage pour acquérir via la première caméra 51 au moins une première image 61 d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope 21, 22, 23.
[0059] On dispose ainsi simultanément d'une image large vue 60 et d'au moins une première image 61 d'une portion du champ objet sans changer d'objectif de microscope. En changent l'orientation du dispositif réflectif de balayage suivant N orientations différentes, on acquiert successivement une série de N deuxièmes images 61, 62, ... 6N. A l'étape 320, on assemble les différentes images 61, 62, ... 6N ainsi obtenues de façon à reconstruire une image mosaïque 600 large vue et de haute résolution sur au moins sur une partie de l'image mosaïque. L'image mosaïque, qui présente à la fois une haute résolution et un large champ, est obtenue sans déplacer l'échantillon et sans changer d'objectif de microscope.
[0060] La présente divulgation trouve des applications dans le domaine de l'observation d'échantillons sensibles au déplacement, en particulier en biologie (cellules, organoïdes, embryons, etc.) mais également en physique (nano-films par exemple) ou en chimie (suspensions colloïdales par exemple).
[0061] Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l'invention dans le cadre des revendications annexées.

Claims

Revendications Microscope optique (100) comprenant un corps de microscope et un boîtier (10) entourant le corps du microscope, le microscope optique comprenant un porte-échantillon (11) apte à recevoir un échantillon (1) dans un plan objet (3), un objectif de microscope (21, 22, 23) apte à collecter un faisceau image (30) issu d'un champ objet dans le plan objet (3) et à former une image intermédiaire du champ objet dans un plan image (33), le microscope optique ayant un plan de Fourier (71) situé entre le plan objet (3) et le plan image (33) à l'intérieur du boîtier du microscope, caractérisé en ce que le boîtier comporte un port de sortie et, le microscope optique comporte un module d'imagerie (200) arrangé à l'extérieur du boîtier du microscope et un contrôleur (300), le module d'imagerie (200) comprenant une première caméra (51), une seconde caméra (52), un séparateur optique de faisceau (40) apte à recevoir le faisceau image (30) du plan image (33) et à former un premier faisceau image (31) et un second faisceau image (32), un premier système optique (41, 42, 43) disposé entre le séparateur de faisceau (40) et la première caméra (51), un second système optique (44, 45, 46, 47) disposé entre le séparateur de faisceau (40) et la seconde caméra (52), le second système optique (44, 45, 46, 47) et la seconde caméra (52) étant configurés pour acquérir une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23), le premier système optique (41, 42, 43) ayant un grossissement supérieur au second système optique (44, 45, 46, 47) et le premier système optique (41, 42, 43) comprenant un système optique de déport (41) disposé de manière à déporter le plan de Fourier (71) via le port de sortie à l'extérieur du boîtier et former l'image du plan de Fourier (71) dans un plan de Fourier image (72), le premier système optique (41, 42, 43) comportant un dispositif réflectif de balayage (42, 48) disposé dans ou à proximité du plan de Fourier image (72) conjugué optiquement avec le plan de Fourier (71) du microscope optique (100) et le premier système optique (41, 42, 43) comportant une lentille (43), la première caméra (51) étant placée dans le plan focal de la lentille (43), le contrôleur (300) étant adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage (42, 48) de façon à ce que la première caméra (51) acquière au moins une première image (61, 62,..., 6 N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23), simultanément avec l'image large vue du champ objet acquise par la seconde caméra (52), et dans lequel le contrôleur (300) est adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) dans une série d'au moins deux positions, la première caméra (51) étant adaptée pour acquérir une série de premières images (61,
62,..., 6N) d'au moins deux portions du champ objet sans déplacement de l'échantillon, sans changement d'objectif de microscope et sans changement de grossissement optique entre le champ objet et la première caméra (51), le microscope (100) comprenant un système de traitement d'image adapté pour recevoir la série de premières images (61,
62,..., 6N) et pour reconstruire une image mosaïque (600) haute résolution du champ objet. Microscope optique selon la revendication 1 comprenant un oculaire disposé pour former une image visuelle du champ objet. Microscope optique selon la revendication 2 dans lequel l'image visuelle s'étend sur un champ de vue inscrit dans l'image mosaïque. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) comprend un miroir plan monté sur un actionneur galvanométrique ou motorisé, le miroir plan étant mobile autour d'un ou deux axes. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) comprend un microsystème électromécanique à base de micromiroirs. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel le microscope est de type droit ou inversé. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 6 comprenant un dispositif d'affichage adapté pour afficher simultanément l'image large vue du champ objet et ladite au moins une première image (61, 62,..., 6 N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23). Procédé de microscopie optique comprenant les étapes suivantes : collection d'un faisceau image (30) issu d'un champ objet dans un plan objet (3) d'un objectif de microscope et formation d'une image intermédiaire dans un plan image (33) conjugué optiquement avec le plan objet (3) ;
Collection du faisceau image issu du plan image (33) et séparation optique en un premier faisceau image (31) et un second faisceau image (32) ; 16
Transmission du premier faisceau image (31) via un premier système optique (41, 42, 43) vers une première caméra (51), le premier système optique (41, 42, 43) comportant un dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) disposé dans ou à proximité d'un plan (72) conjugué optiquement avec le plan de Fourier (71) du microscope optique ; et simultanément, transmission du second faisceau image (32) via un second système optique (44, 45, 46, 47) vers une seconde caméra (52), le premier système optique (41, 42, 43) ayant un grossissement supérieur au second système optique (44, 45, 46, 47); acquisition via la seconde caméra (52) d'une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23) ; orientation angulaire du dispositif réflectif de balayage (42, 48) pour l'acquisition via la première caméra (51) d'au moins une première image (61, 62,..., 6N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23), simultanément avec l'acquisition de l'image large vue via la seconde caméra (52).
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