EP4376831A1 - Composition pour la captation de plomb et/ou de cadmium dans un fluide de dialyse - Google Patents

Composition pour la captation de plomb et/ou de cadmium dans un fluide de dialyse

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Publication number
EP4376831A1
EP4376831A1 EP22762123.2A EP22762123A EP4376831A1 EP 4376831 A1 EP4376831 A1 EP 4376831A1 EP 22762123 A EP22762123 A EP 22762123A EP 4376831 A1 EP4376831 A1 EP 4376831A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
dialysis
dialysis fluid
lead
cadmium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22762123.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier Tillement
François LUX
Thomas BRICHART
Coralie GRANGE
Marco NATUZZI
Jordyn HOWARD
Juan SALAZAR ARIZA
Aymeric COUTURIER
Fabien ROSSETTI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Mexbrain SAS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Mexbrain SAS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Mexbrain SAS, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4376831A1 publication Critical patent/EP4376831A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/14—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis
    • A61M1/16—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis with membranes
    • A61M1/1654—Dialysates therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/04—Chelating agents

Definitions

  • the present disclosure relates to the field of dialysis techniques. It relates more specifically to methods for treating water and dialysis liquids, in particular to capture certain toxic metals such as lead, aluminium, chromium, nickel or cadmium, thus reducing the concentration of metallic cations liable to diffuse through a membrane, and prevent their passage into the blood during dialysis of a patient, for example hemodialysis, hemofiltration or hemodiafiltration.
  • certain toxic metals such as lead, aluminium, chromium, nickel or cadmium
  • metals are subject to many balances and are associated with complex functions. Some metals such as copper or iron are essential for the functioning of the human body while others have no recognized function and are associated with high toxicity. This is particularly the case of heavy metals such as lead, mercury or cadmium. These metals can in particular induce oxidative stress or interact and modify the functions of essential biomolecules.
  • Cadmium and lead are thus cited by the “World Health Organization” (WHO) as two of the ten pollutants of major importance for human health (S. Satarug et al., Toxics, 2020). They are mainly concentrated in the bones and kidneys, but their toxic effect is not limited to these organs, in particular by inducing oxidative stress, DNA damage, taking the place of other metals or diverting their use certain proteins, especially those containing sulfur compounds. The safety agencies have thus greatly reduced the acceptable levels of these compounds, although it has been shown that even a low level below these values is recognized as toxic and that any greater reduction in this level would be beneficial.
  • WHO World Health Organization
  • the WHO thus recommends a blood level of less than 100 pg.L 1 for adults and the American agency recommends a level of 50 pg.L 1 for children (LA Alli, Interdiscip. Toxicol., 2015 ).
  • the rate is much lower and between 0.3 and 1.2 pg.L 1 for the WHO.
  • the increase in the level of cadmium or lead in the blood is thus linked in particular to an increase in the risk of kidney disease, cardiovascular disease or cancer.
  • Hemodialysis and hemodiafiltration are currently the most conventionally used treatments for patients suffering from end-stage renal disease and are unfortunately associated with excess mortality from infection or cardiovascular disease (M. Tonelli et al., BMC Medicine, 2009).
  • These techniques consist of allowing, through a membrane permeable to molecules of small and medium molecular weight, free exchanges of ions and toxins between a fluid called dialysate and the patient's blood. This technique makes it possible to extract toxic molecules or atoms such as heavy metals from the blood.
  • a dialysis fluid is essentially made up of water. The objective of dialysis being to purify the blood, it goes without saying that the water used for the preparation of a dialysis fluid must be sterile and as pure as possible.
  • Heavy metals are known to promote oxidative stress, and a reduction in their content in dialysis fluids would provide benefits in terms of reducing the risk of cardiovascular disease, artherosclerosis, reduced kidney function, joints and bones and also neurodegenerative diseases. By capturing heavy metals, the patient's endothelium is preserved.
  • new devices such as ultrafiltration filters, make it possible to reduce the level of endotoxins directly on the dialysis fluid circulation line, before passing through the dialyzer, or even before their direct reinsertion into the patient in case of haemodiafiltration.
  • dialysis fluid circulation line Several tens of liters of dialysis fluids can thus be directly injected into the patient during a session, and the quality of the fluid is very important. If these devices, such as the DIASAFE hemodialysis filter Plus, allow effective retention of microbial contamination and/or bacterial endotoxins, they are ineffective on the retention of free metals.
  • the invention presented lies, which relates in particular to the use of a chelating polymeric adjuvant, present in a very small quantity in the dialysate and capable of chelating undesirable heavy metals, while having a sufficient size to prevent its release into the body during dialysis.
  • An object of the invention is therefore to propose a method for preparing a composition for dialysis, independent of the place of implementation of the dialysis.
  • Another object of the invention is to provide a dialysis composition having extremely low levels of diffusible heavy metals (lead and cadmium in the form of free cations or associated with small molecules/complexing ions), below ppb and preferably below 0.1 ppb.
  • An additional objective is to propose a method making it possible to prevent pollution by exogenous metals such as lead or cadmium from the dialysis patient.
  • the invention relates to a composition for dialysis, comprising a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, said polymer being present in an amount sufficient to be in a concentration of between 0.01 mg/L and 10 mg/L in the dialysate during dialysis of a patient.
  • the invention also relates to a method for capturing at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, present in a dialysis fluid, comprising a step of addition to said dialysis fluid of a sufficient quantity of a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, thus allowing the capture of said toxic metal by chelation with the chelating agent of said polymer.
  • a method for capturing at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium
  • the invention also relates to the use of a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa bearing at least one chelating agent for at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium to prepare a composition for dialysis, for example for hemodialysis, hemodiafiltration or hemofiltration, in particular a composition according to the invention.
  • a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa bearing at least one chelating agent for at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium to prepare a composition for dialysis, for example for hemodialysis, hemodiafiltration or hemofiltration, in particular a composition according to the invention.
  • Figure 1 is a diagram describing the principle of Vivaspin ultrafiltration.
  • Figure 2 is a graph representing the efficiency of the capture of Pb 2+ and Cd 2+ according to example 1.
  • Figure 2a is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Pb 2+ in interaction with the polymer Mex-CD1 according to example 1.
  • Figure 2b is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Cd 2+ in interaction with the polymer Mex-CD1 according to example 1.
  • Figure 3 is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Pb 2+ in acetic acid according to example 2.
  • Figure 4 is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Pb 2+ in citric acid according to example 2.
  • Figure 5 is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Pb 2+ in acetic acid according to Example 3.
  • Fig. 6 is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Pb 2+ in acetic acid according to Example 3.
  • Figure 6 is an HPLC-MS chromatogram of the detection of Pb 2+ in citric acid according to example 3.
  • Figure 7 is a graph representing the efficiency of the capture of Pb 2+ according to Example 4.
  • FIG. 8 represents 2 graphs representing the efficiency of the capture of Pb 2+ and of Cd 2+ , at high and low concentration, according to Example 5.
  • FIG. 9 represents 2 graphs representing the efficiency of the capture of Pb 2+ and of Cd 2+ , at high and low concentration, according to Example 5.
  • Figure 9 is a graph representing the efficiency of the capture of Cu 2+ and Mn 2+ , according to Example 5.
  • Figure 10 is a graph representing the efficiency of the capture of Pb 2+ , according to Example 6.
  • FIG. 11 is a graph representing the efficiency of the capture of Cd 2+ , Cu 2+ and of Pb 2+ , according to example 7.
  • Figure 12 is a graph representing the efficiency of the capture of the
  • FIG. 13 is a graph representing the efficiency of the capture of Cd 2+ , Cu 2+ and of Pb 2+ , according to example 9.
  • FIG. 14 is a graph representing the efficiency of the capture of Cd 2+ , Cu 2+ and of Pb 2+ , according to example 9.
  • FIG. 14 is a graph representing the efficiency of the capture of Cd 2+ , Cu 2+ and Pb 2+ , according to example 10.
  • Figure 15 shows a chromatogram representing the stability of MEX-CD1 in citric acid according to example 11.
  • Figure 16 shows a chromatogram representing the stability of PEG@DOTAGA in citric acid according to example 11.
  • FIG. 17 [0040] [Fig. 17] Figure 17 a chromatogram representing the chelation of Pb 2+ and
  • FIG. 18 is a chromatogram representing the chelation of Pb 2+ and of Cd 2+ in an acid medium according to Example 12.
  • FIG. 19 is a chromatogram representing the chelation of Pb 2+ and of Cd 2+ in an acid medium according to Example 12.
  • Figure 19 is a chromatogram representing the chelation of aluminum according to example 13.
  • Figure 20 is a chromatogram representing the chelation of aluminum in the presence of citrate according to example 13.
  • Figure 21 is a graph representing the aluminum concentration measured by ICP-MS according to example 14.
  • Figure 22 is a graph representing the percentage of aluminum extracted according to Example 14.
  • the invention relates to a composition for dialysis, said composition comprising a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa and carrying at least one chelating agent of at least one metal such as lead, aluminium, chromium, nickel or cadmium, said polymer being in an amount sufficient to be in a concentration of between 0.01 mg/L and 10 mg/L in the dialysate (or dialysis fluid) during dialysis of a patient.
  • the term “dialysis” encompasses methods for purifying the blood in patients who need it, for example patients suffering from acute or chronic renal insufficiency, in particular renal insufficiency terminal chronicle, and including the use of a dialyzer.
  • the dialyzer comprises a porous or semi-permeable membrane, allowing the passage by diffusion or convection of small molecules, while blocking the passage of larger molecules, for example proteins.
  • the membrane thus has a cut-off threshold, i.e. the molecular mass beyond which the membrane is considered strictly impermeable, i.e. capable of blocking 90 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, or even up to at least 99.9% of the molecules of molecular mass above the cut-off threshold.
  • dialysis or "extra renal purification” encompasses in particular hemodialysis, hemofiltration and hemodiafiltration.
  • Dialysis designates all the methods of extrarenal purification allowing the purification of uremic toxins and the correction of hydroelectrolyte disorders resulting from renal dysfunction (potassium, calcium, phosphorus, acid, base).
  • the cut-off threshold of a semi-permeable membrane for hemodialysis is less than 20 to 50 kDa for high permeability membranes.
  • the exchanges through the porous or semi-permeable membrane mainly take place by gradient of concentrations on either side of the membrane, a mechanism called diffusion.
  • Hemodiafiltration In the context of hemofiltration, the exchanges take place by pressure gradient, from the dialysate to the blood, called convection. Hemodiafiltration is the most commonly prescribed technique, it combines diffusion and convection (B. Canaud, Principles and procedures for applying hemodialysis to the treatment of chronic renal failure. Nephrology and therapy 2009).
  • the extra renal purification devices used with the present invention therefore allow exchanges between dialysate and blood through a semi-permeable membrane, they comprise (1) a reservoir containing ultrapure water, (2) a generator that provides extracorporeal blood circulation, dialysate circulation and generates dialysate (or dialysis fluid), (3) a semi-permeable membrane, also called a dialyzer, (4) an extracorporeal blood circulation device and (5) vascular access.
  • extracorporeal blood circulation device means a device making it possible to achieve a diversion of venous blood flow in a circuit located outside the body with a circulation rate of 300 to 400 ml/min in adults. (variable in children, in neonatology >10 ml/min).
  • dialysate or “dialysis fluid” (used interchangeably) corresponds to the fluid prepared by the generator, and used during the dialysis session for correction of hydroelectrolyte disorders.
  • the dialysate results from a mixture from the acid bath (acetic acid, citric acid or hydrochloric acid), ions (potassium, sodium, chlorine, calcium, magnesium), glucose, sterile ultrapure water and bicarbonate buffer.
  • an ultrafiltration purification device eg DIASAFE (R) plus or DIACLEAR (R) Ultrafiltrate
  • the composition of the dialysate can be measured upstream or at the outlet of an ultrapurification filter. It is preferably heard upstream of these filters, at the level of the input connection.
  • dialysate generator produces continuously and extemporaneously 120 to 170 liters of dialysate per session.
  • Certain short hemodialysis protocols (2 hours per session, and 6 sessions per week), called daily hemodialysis, use generators (NxStage, Physidia S3) which require dialysate in sterile 5-litre bags, of the same composition as described previously.
  • composition for dialysis thus means any composition suitable for its use in the preparation of a dialysate or dialysis fluid.
  • composition for dialysis encompasses the dialysate, or a concentrated solution (additive) allowing the preparation of the dialysis fluid after dilution in sterile water, and, where appropriate with d other additives.
  • the composition for dialysis according to the invention is a concentrated solution for dialysis or an additive for concentrated solution.
  • Said concentrated solutions include in particular concentrated acid solutions, comprising at least a sufficient quantity of acid, for example chosen from acetic acid, hydrochloric acid or citric acid, associated with a mixture of ions, such as potassium, sodium, chlorine, calcium or magnesium, with glucose, to this solution is added the bicarbonate buffer and sterile ultrapure water.
  • concentrated acid solutions comprising at least a sufficient quantity of acid, for example chosen from acetic acid, hydrochloric acid or citric acid, associated with a mixture of ions, such as potassium, sodium, chlorine, calcium or magnesium, with glucose, to this solution is added the bicarbonate buffer and sterile ultrapure water.
  • composition for dialysis according to the invention is a concentrated solution further comprising one or more electrolytes, in particular chosen from sodium, potassium, chlorine, magnesium or calcium, and bicarbonates.
  • the composition for dialysis is a concentrated solution comprising, in addition to said polymer, an acid and several electrolytes, in particular chosen from sodium, potassium, chlorine, magnesium and calcium, and bicarbonates.
  • the composition for dialysis according to the invention is a concentrated solution packaged in a pocket suitable for a dialysis device, preferably a pocket containing a volume of solution comprised between 500 and 5000 mL and an amount of said polymer of between 5 and 5000 mg and preferably between 10 and 100 mg.
  • the polymer has a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa.
  • the polymer has an average molecular mass greater than the cut-off threshold of the semi-permeable membrane used in the dialysis device.
  • the polymer has a weight-average molecular mass of between 100 kDa and 900 kDa, more preferably between 250 kDa and 750 kDa and even more preferably between 400 kDa and 600 kDa.
  • the polymer is a random polysaccharide carrying at least one chelating agent.
  • the average molecular mass of the polymer can be determined by steric exclusion chromatography.
  • the polymer according to the invention preferably the polysaccharide of formula I or II below, has a complexation constant of at least 10 15 for a transition element d or f.
  • the polymer is a random polysaccharide of formula I [0061] [Chem. 1]:
  • each Rc independently represents a group comprising a chelating agent
  • each Z independently represents a binder which may be a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family,.
  • x is between 0.005 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.7, preferably between 0.2 and 0.6, and more preferably between 0.25 and 0.4
  • y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2, the ratio y/x being greater than or equal to 0.05, preferably greater than or equal to 0.15, and the sum x + y being greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0.35.
  • Rc groups may be present in the polysaccharide. These Rc groups can be identical to or different from each other. They are all independently chosen from the groups bearing a chelating agent.
  • Z binders several Z binders may be present, and they may be identical or different from each other.
  • x is between 0.05 and
  • y is between 0.1 and 0.9, the ratio y/x being greater than 0.16, and the sum x+y being greater than 0.4.
  • the polysaccharide of formula I is a polysaccharide of formula II
  • Rci and RC 2 are different, and are groups comprising a chelating agent
  • Zi and 2.2 which are identical or different, are binders which may be a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more heteroatoms , preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family,
  • x is between 0.005 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.7, preferably between 0.2 and 0.6, and more preferably between 0.25 and 0.4
  • y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2, the y/x ratio being greater than or equal to 0.05, preferably greater than or equal to 0.15, the sum x + y being greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0.35
  • z is between 0.5 and 1.
  • z is between 0.8 and 0.99, the Rci group is therefore largely in the majority.
  • x is between 0.05 and 0.6
  • y is between 0.1 and 0.9
  • the y/x ratio being greater than 0.16
  • the sum x + y being greater than 0.4.
  • Rc-type group means the Rc groups in the polysaccharide of formula I, and the Rci and Rc2 groups, when the Rc2 group is present, in the polysaccharide of formula II.
  • the Rc group is a chelating agent.
  • the Rc group makes it possible to chelate one or more metals by forming a complex.
  • the groups Rc, Rci and Rc2 are chelating agents.
  • the groups Rc, Rci and Rc2 make it possible to chelate one or more metals by forming a complex.
  • Each of the groups Rc, Rci and Rc2 can contain one or more coordination sites.
  • the coordination site is a nitrogen or oxygen atom.
  • each of the groups Rc, Rci and Rc2 comprises between 4 and 8 coordination sites, more advantageously between 6 and 8 coordination sites and even more advantageously each of the groups Rc, Rci and Rc2 comprises 8 coordination sites. coordination.
  • coordination site is meant a single function capable of chelate a metal.
  • an amine function represents a coordination site by the formation of a dative bond between the nitrogen atom and the metal and a hydroxamic acid function also represents a coordination site by the formation of a dative bond between the oxygen of the carbonyl unit and by a covalent bond with the oxygen of the N-oxide unit the coordination site thus forming a five-membered ring.
  • each Rc group is independently chosen from the group consisting of DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N ”,N”'-teracetic acid), NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane-1-glutaric-4,7-diacetic acid ), DOTAGA (2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentanedioic acid), DOTAM (1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl) - 1,4,7,10 tetraazacyclododecane), D03AM (2-'4,7,10-tris(2-amino-2oxoethyl)-1,4,7,10-te
  • Rci and RC 2 are independently chosen from the group consisting of DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, DTPA and DFO, preferably from the group consisting of DOTAGA, DFO, DOTAM and DTPA.
  • the group consisting of DOTAGA, DFO, DOTAM and DTPA preferably from the group consisting of DOTAGA, DFO, DOTAM and DTPA.
  • the Rci group is DOTAGA and the Rc2 group is DFO.
  • type Z binder is meant the binders Z in the polysaccharide of formula I, and the binders Zi and Z2, when the binder Z2 is present, in the polysaccharide of formula II.
  • each Z is independently a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more several heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family.
  • each Z is independently selected from the group consisting of: a bond, a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, and a linear or branched alkenyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl and alkenyl chains possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S -, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR'-, -NR'-C(O)-, -NR'-C(0)-NR'-, -NR'- C(0)-0-, -0-C(0)NR', -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'-C(S)-NR' said chains alkyl and alkenyl which may be substituted by one or more groups selected from the group consisting of halogen,
  • each Z is independently selected from the group consisting of: a bond and a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl chain possibly being interrupted by one or more groups C6-C10 aryl, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S-, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR'- , -NR'-C(O)-, -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'-C(S)-NR', each R' is independently H or a C1-C6 alkyl .
  • each Z is an alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms.
  • each Z is a polyethylene glycol (PEG).
  • Z1 and Z2 are independently a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising a or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family.
  • Z1 and Z2 are independently selected from the group consisting of: a bond, a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, and a linear alkenyl chain or branched chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl and alkenyl chains possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, - S-, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR'-, -NR'-C(O)-, -NR'-C(0)-NR'-, -NR' -C(0)-0-, -0-C(0)NR', -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'-C(S)-NR' said alkyl and alkenyl chains possibly being substituted by one or more groups selected from the group consisting of
  • Z1 and Z2 are independently selected from the group consisting of: a bond and a linear or branched alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said alkyl chain possibly being interrupted by one or more C6-C10 aryl groups, and/or by one or more heteroatoms or groups selected from the group consisting of -O-, -S-, -C(O)-, -NR'-, -C(0)NR' -, -NR'-C(O)-, -C(S)NR'-, -NR'-C(S)-, -NR'-C(S)-NR', each R' is independently H or a C1-C6 alkyl .
  • Z1 and/or Z2 is an alkyl chain comprising between 1 and 12 carbon atoms.
  • Z1 and/or Z2 is a polyethylene glycol (PEG).
  • the polymer of formula I is composed of 3 monomeric units, namely an A unit of N-acetylglucosamine type, a B unit of glucosamine type and a C unit of the glucosamine type functionalized by a chelating agent (Rc) linked by a linker Z to the nitrogen of the glucosamine.
  • Rc chelating agent
  • the polysaccharide according to the invention is composed of 3 monomeric units, namely an N-acetylglucosamine type A unit, a glucosamine type B unit and a glucosamine type C type unit functionalized with a chelating agent (of type Rc) bound by a (Z-type) linker to the glucosamine nitrogen.
  • the polymer of formula I or II is a random polymer. In other words, the sequence of the different A, B and C-type monomeric units is random.
  • x represents the proportion of A units and x is between 0.05 and 0.7, preferably x is between 0.2 and 0.6, more preferred x is between 0.25 and 0.4.
  • y represents the proportion of C units and y is between 0.1 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2.
  • the y/x ratio is preferably between 0.15 and 1.5.
  • the sum x+y is preferably between 0.35 and 0.8.
  • the polymer is a biocompatible polymer, for example of the polyethylene glycol (PEG), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polyacrylamides, polyamines or polycarboxylic type.
  • PEG polyethylene glycol
  • PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
  • polyacrylamides polyamines or polycarboxylic type.
  • the biocompatible polymer preferably a PEG
  • the polymer is a PEG comprising a chelating agent which can be chosen from a PEG functionalized with DOTAGA, a PEG functionalized with EDTA, a PEG functionalized with DTPA, a PEG functionalized with DFO, and a PEG functionalized with DOTA.
  • a chelating agent which can be chosen from a PEG functionalized with DOTAGA, a PEG functionalized with EDTA, a PEG functionalized with DTPA, a PEG functionalized with DFO, and a PEG functionalized with DOTA.
  • the polymer is chosen from polysaccharides of formula I, polysaccharides of formula II and PEGs comprising a chelating agent.
  • the chelating agent of the polymer is capable of chelating the heavy metals likely to be present in the waters and liquids used for the preparation of the dialysate.
  • the concentration of the polymer in the composition for dialysis is sufficient to allow a free residual heavy metal concentration in the dialysate which is less than 0.1 ppb.
  • free residual concentration we mean the concentration of toxic heavy metals, typically lead and cadmium, not complexed with the chelating agent of the polymer in the dialysate and therefore likely to cross the semi-permeable membrane of the dialysis device.
  • the chelating agent is therefore preferably present in the dialysate during the step of dialysis of a patient at a concentration of between 10 4 mmol.L 1 and 10 6 mmol .L 1 .
  • the composition for dialysis comprises a sufficient quantity of polymer to be in a concentration in the dialysate of between 0.1 mg/L and 10 mg/L, if necessary after dilution.
  • concentration of the polymer in the concentrated solution is preferably between 4.5 and 450 mg/L.
  • the polymer used is stable in acid, in particular acetic acid or citric acid.
  • the present invention relates to an additive, in particular a ready-to-use concentrated solution for dialysis, for example hemodialysis, and comprising
  • a) one or more electrolytes such as potassium, sodium, chlorine, calcium, magnesium, bicarbonate, acetate or citrate, and (b) at least one sugar, such as glucose or dextrose.
  • Said concentrated solution can be packaged in the form of a pouch, cartridge or canister, for example with a view to a 1/45 or 1/35 dilution with a dialysate generator.
  • the present invention relates to an acidic concentrated solution, in particular a ready-to-use acidic concentrated solution for dialysis, for example hemodialysis, and comprising
  • Said concentrated acid solution can be packaged in the form of a bag or canister, for example with a view to a 1/45 or 1/35 dilution with a dialysate generator.
  • the invention also relates to a PEG with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa bearing at least one chelating agent for at least one metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, the chelating agent preferably being selected from the group consisting of EDTA, DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, DT PA and DFO, and more preferably in the group made up of DOTAGA, EDTA, DFO, DOTAM and DTPA.
  • the PEG comprises between 1 pmol and 1 mmol of chelating agent per gram of polymer.
  • the invention also relates to a composition for dialysis comprising such a PEG, said PEG being present in an amount sufficient to be in a concentration of between 0.01 mg/L and 10 mg/L in the dialysate during dialysis of a patient.
  • compositions described above are advantageously used to capture the toxic metals likely to be present in the waters and liquids used to prepare the dialysate.
  • the invention relates to a method for capturing at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, likely to be present in a dialysis fluid comprising a step of adding to said dialysis fluid a sufficient quantity of a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic exogenous metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, and in particular one of the polymers described in the preceding paragraph, more preferably the polymer of formula (I) or (II), or a PEG comprising a chelating agent.
  • a toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium
  • the polymer is present in a concentrated solution suitable for its use in a dialysis device, as described above, for example an acidic concentrated solution.
  • the dialysis fluid comprising the polymer is introduced into the reservoir of the dialysis device capable of being connected to an extracorporeal blood circulation device comprising a porous dialysis membrane, typically having a cut-off threshold lower than the average molecular mass of said polymer, for example lower than 20 kDa.
  • the polymer captures any toxic metals that may be present in the water or the liquids or powders used during the preparation of the dialysis fluid by complexation with the chelating agent.
  • the polymer does not pass into the blood because of its molecular weight greater than the cut-off threshold of the semi-porous membrane of the dialysis device.
  • the dialysis fluid comprising the polymer is introduced upstream of an ultrafiltration filter, and in particular upstream of a filter which makes it possible to obtain an ultrapure dialysis fluid, with in particular a level of microbial contamination ⁇ 0.1 CFU/ml and/or a level of bacterial endotoxins ⁇ 0.03 lU/ml.
  • the dialysis fluid comprising the polymer makes it possible to sequester toxic metals upstream and thus purify dialysis water with less than 1 ppb in heavy metals and even less than 0.1 ppb in lead and/or Cadmium in particular.
  • the dialysis fluid comprising the polymer can be injected upstream of a Diasafe (R) plus or DIACLEAR (R) Ultrafiltrate type filter or equivalent, it can also be injected downstream, directly before the dialyzer in contact with the patient's blood.
  • a Diasafe (R) plus or DIACLEAR (R) Ultrafiltrate type filter or equivalent it can also be injected downstream, directly before the dialyzer in contact with the patient's blood.
  • the capture method according to the present invention is implemented to capture aluminum, for example, in order to obtain a concentration of non-complexed aluminum of less than 1 ppb in the dialysate.
  • the capture method according to the present invention is implemented to capture lead, for example, in order to obtain a concentration of non-complexed lead of less than 0.1 ppb in the dialysate, preferably in the dialysate at the inlet of the dialyzer and/or for direct injection into the blood, that is to say upstream or downstream of the filter.
  • the capture method according to the present invention is implemented to capture cadmium, for example, in order to obtain a concentration of non-complexed cadmium of less than 0.01 ppb in the dialysate, preferably in the dialysate at the inlet of the dialyzer and/or for direct injection into the blood, that is to say upstream or downstream of the filter.
  • the present method is implemented in a dialysis session of a patient, for example a patient suffering from acute or chronic renal failure. In this embodiment, at least 120 L of dialysis fluid can be used.
  • the invention also relates to a method for treating liquids used in the preparation of a dialysis fluid, said method comprising a step of adding to said dialysis fluid a sufficient quantity of a polymer of average molecular weight by weight between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic exogenous metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, and in particular one of the polymers described in preceding paragraph, more preferably the polymer of formula (I).
  • the invention relates to the use of a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent for at least one toxic exogenous metal such as lead , aluminum, chromium, nickel or cadmium, in particular a polymer as defined above, and in particular the polymer of formula (I), to prepare a dialysis fluid, a concentrated acid solution, or powdered bicarbonate concentrate or any other solution containing electrolytes.
  • a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent for at least one toxic exogenous metal such as lead , aluminum, chromium, nickel or cadmium, in particular a polymer as defined above, and in particular the polymer of formula (I), to prepare a dialysis fluid, a concentrated acid solution, or powdered bicarbonate concentrate or any other solution containing electrolytes.
  • the invention also relates to the method for preparing a dialysis fluid, said method comprising the use of a composition for dialysis fluid as described above, and comprising a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, in a dialysate generator in order to produce a dialysate comprising said polymer in a concentration sufficient to complex said toxic metals.
  • a composition for dialysis fluid as described above, and comprising a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, in a dialysate generator in order to produce a dialysate comprising said polymer in a concentration sufficient to complex said toxic metals.
  • the invention also relates to liquid concentrates, for example packaged in the form of a bag, cartridge or container suitable for their use in a dialysis device, and comprising a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent for at least one toxic exogenous metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, in particular a polymer as defined above, and in particular the polymer of formula (I) ; for their use in a dialysis process in a patient who needs them, for example a patient suffering from acute or chronic renal failure.
  • Such liquid concentrates may further comprise an acid, for example, citric, acetic or hydrochloric acid.
  • the polymer is in sufficient quantity to allow the capture of toxic metals likely to be present in the liquids used in the preparation of the dialysate. Use of the composition for dialysis
  • composition for dialysis according to the invention can be used on patients with plasma lead levels greater than 1 ppb or plasma cadmium levels greater than 0.1 ppb.
  • composition for dialysis according to the invention can be used on patients who also have cardiovascular diseases and/or a neurodegenerative disease and/or joint problems or bone fragility.
  • composition for dialysis according to the invention can be used on patients who are going to undergo a kidney transplant within one year and preferably within 3 months.
  • the invention relates to a composition for dialysis, comprising a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa bearing at least one chelating agent of at least one metal such as lead , aluminum, chromium, nickel or cadmium, said polymer being present in an amount sufficient to be in a concentration of between 0.01 mg/L and 10 mg/L in the dialysate during dialysis of a patient.
  • Variant 2 Composition for dialysis according to variant 1, characterized in that the metal is chosen from heavy metals such as lead or cadmium.
  • Variant 3 Composition for dialysis according to variant 1 or 2, characterized in that the chelating agent is chosen from the group consisting of DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA , TETAM, DTPA, EDTA and DFO, preferably from the group consisting of DOTAGA, DFO, DOTAM and DTPA and more preferably DOTAGA.
  • Variant 4 Composition for dialysis according to one of variants 1 to 3, characterized in that the polymer is a random polysaccharide bearing at least one chelating agent.
  • Variant 5 Composition for dialysis according to one of variants 1 to 4, characterized in that the polymer is a random polysaccharide of formula I: Formula I in which: each Rc independently represents a group comprising a chelating agent, each Z independently represents a binder which may be a single bond or a hydrocarbon chain comprising between 1 and 12 carbon atoms, said chain possibly being linear or branched and possibly comprising one or more unsaturations and possibly comprising one or more heteroatoms, preferably chosen from nitrogen, oxygen, sulfur and atoms of the halogen family, x is between 0.005 and 0.7, preferably between 0, 05 and 0.7, preferably between 0.2 and 0.6, and more preferably between 0.25 and 0.4, y is between 0.01 and 0.7, preferably between 0.05 and 0.2 , the ratio y/x being greater than or equal to 0.05, preferably greater than or equal to 0.15, and the sum x+y being greater than or equal to 0.30, preferably greater than or equal to 0.35.
  • Variant 6 Composition for dialysis according to one of variants 1 to 4, characterized in that the polymer is a biocompatible polymer, for example of the polyethylene glycol (PEG) type.
  • PEG polyethylene glycol
  • Variant 7 Composition for dialysis, according to one of variants 1 to 6, characterized in that it is a concentrated solution or an additive for a concentrated solution for dialysis, preferably a concentrated solution acid comprising, in addition to the polymer, a sufficient quantity of acetic acid, hydrochloric acid, or citric acid.
  • Variant 8 Composition for dialysis, according to one of variants 1 to 7, characterized in that it is a concentrated solution comprising one or more electrolytes, in particular chosen from sodium, potassium, chlorine, magnesium or calcium, and bicarbonates.
  • Variant 9 Composition for dialysis, according to one of variants 1 to 7, characterized in that it is a concentrated solution packaged in a bag suitable for a dialysis device, preferably a bag containing a volume of solution comprised between 500 and 5000 ml_ and an amount of said polymer comprised between 5 and 5000 mg and preferably between 10 and 100 mg.
  • Variant 10 The invention relates to a method for capturing at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, present in a dialysis fluid, comprising a step adding to said dialysis fluid a sufficient quantity of a polymer with an average molecular weight by weight of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium, thus allowing the capture of said toxic metal by chelation with the chelating agent of said polymer.
  • a toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium
  • Variant 11 Collection method according to variant 10, characterized in that the toxic metal is aluminium.
  • Variant 12 Collection method according to variant 10, characterized in that the toxic metal is lead and that the concentration in the dialysis fluid is less than 0.1 ppb.
  • Variant 13 Collection method according to variant 10, characterized in that the toxic metal is cadmium and that the concentration in the dialysis fluid is less than 0.01 ppb.
  • Variant 14 Collection method according to variant 10 or 11, characterized in that at least 120 L of dialysis fluid is used in dialysis of a patient.
  • Variant 15 Collection method according to one of variants 10 to 12, characterized in that the dialysis fluid is introduced into a reservoir of a dialysis device, capable of being connected to a blood circulation device extracorporeal comprising a porous dialysis membrane.
  • Variant 16 Method according to variant 13, characterized in that the cut-off threshold of the porous membrane is less than the size of the polymer.
  • a polymer with a weight-average molecular mass of between 20 kDa and 1000 kDa carrying at least one chelating agent of at least one toxic metal such as lead, aluminum, chromium, nickel or cadmium for preparing a composition for dialysis, for example for hemodialysis, hemodiafiltration or hemofiltration, in particular a composition according to one of variants 1 to 9.
  • step 1 60 g of chitosan, 4 L of ultra-pure water and 45 ml of glacial acetic acid are introduced into a 10 L reactor and placed under stirring for a period of 16 hours at a pH of 4.5 ⁇ 0.5. A pale yellow solution is obtained.
  • step 2 1.2 L of propane-1,2-diol are added to the pale yellow solution obtained in step 1 and stirring is maintained for 1 hour.
  • a solution composed of 14 ml_ of acetic anhydride dissolved in 600 ml_ of propane-1,2-diol is then added slowly over 10 min in order to obtain homogeneous acetylation along the polymer chain, the reaction medium is kept under stirring for 4 hrs.
  • the acetylation rate can be determined by elemental analysis.
  • the non-acetylated unit of the polysaccharide (unit B) has a molar mass of 161.2 g. mol 1 (C 6 NO 4 H 11 ) while the acetylated unit (unit A) has a molar mass of 203.2 g. mol 1 (C 8 NO 5 H 13 ).
  • stage 3 2 L of the solution obtained in stage 2 of acetylation, are placed in a stirred reactor. 120 g of DOTAGA anhydride are then added and stirring is maintained for 16 h. At the end of this reaction, the solution is diluted by 10 in ultra-pure water and purified by tangential filtration using a membrane of 100 kDa. After a first step of re-concentration up to 16 L, the solution is filtered through 480 L of 0.1 M acetic acid solution at constant volume (16 L), followed by 320 L of ultra-pure water and by another step of re-concentration up to 8 L. The HPLC-UV makes it possible to verify that the DOTAGA has indeed been eliminated.
  • the peak around 7 min corresponds to the polymer while the peak around 11 min corresponds to the non-grafted DOTAGA.
  • the solution with a polysaccharide concentration of 10 g/L is then filtered through a nylon filter (0.4 ⁇ m) before freeze-drying.
  • the proton NMR makes it possible to determine the level y of functionalization by the DOTAGA on the polysaccharide by knowing the level x of acetylation.
  • the non-grafted and non-acetylated unit (unit B) consists of 7 protons, covalently bonded to carbon atoms, with a chemical shift between 2.9 and 4.3 ppm.
  • the acetylated unit (unit A) has these same 7 protons as well as 3 protons, covalently bonded to a carbon atom, present on the acetyl characterized by a chemical shift between 2 and 2.2 ppm.
  • the unit grafted with DOTAGA (unit C) includes 34 protons, covalently bonded to carbon atoms, of which 32 integrate between 2.9 and 4.3 ppm and 2 integrate between 2 and 2.2 ppm.
  • the NMR spectrum allows thanks to the integrations of the different solid masses to determine the values of y thanks to the following equation:
  • the rate of grafted unit (unit C) is approximately 0.1.
  • the level of grafted units can also be determined by fluorescence with europium.
  • Europium indeed presents a luminescence mainly centered around 590 ( 5 Do -> 7 Fi) and 615 nm ( 5 Do -> 7 F2). This luminescence is extinguished when the europium ion is coordinated only with water molecules.
  • the principle of the method for determining the rate of grafted units is to add increasing amounts of europium, so that it is chelated, the luminescence then increases, when all the chelation sites are filled, the luminescence reaches a plateau.
  • the polysaccharide obtained at the end of step 3 was placed in an acetate buffer at pH 5, a europium chloride salt dissolved in the acetate buffer was then added.
  • the PEG used is an 8-Arm PEG Amine with a molecular weight of 40 kDa, purchased from Creative PEGWork.
  • DOTAGA-anhydride (2,2',2”-(10-(2,6-dioxotetrahydro-2H-pyran-3-yl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triyl) triacetic acid) was supplied by Chematech and used as is. The synthesis was carried out in DMSO (Fischer Chemicals). VIVAFLOW 30kDa cassettes for purification were purchased from Sartorius. A mass of 10 g of PEG was weighed and inserted into a 500 mL flask.
  • a volume of 250 mL of DMSO was added and the solution was stirred and heated to 40°C by a hot water bath. Once the polymer was completely solubilized, a mass of 2.8 g of DOTAGA-anhydride was weighed and inserted into the PEG solution. The solution was stirred and heated at 40°C for 1 hour 30 minutes. The solution was then purified with ultrapure water using a Vivaflow cassette with a cut-off threshold of 30 kDa up to a purification rate of 1500. The purified product is then freeze-dried. The average mass of product recovered is 496 mg and 23.2 mg per 20 mL of solution.
  • the amount of grafted chelator is determined by UV-Visible spectrophotometric assay at 295 nm for DOTAGA.
  • Increasing concentrations of copper (II) are added to a solution of Peg@DOTAGA at 1.0 g/L in an acetate buffer at pH 4.5 (0.1 M ammonium acetate and 0.1 M acetic acid).
  • the absorption measured at 295 nm is then plotted against the copper concentration (in mmol/g). The break in slope observed indicates that the Peg@DOTAGA contains 0.14 mmol of DOTAGA per gram of polymer.
  • the PEG used is an 8-Arm PEG Amine with a molecular weight of 40 kDa, purchased from Creative PEGWork.
  • EDTA di-anhydride (4-[2-(2,6-dioxomorpholin-4-yl)ethyl]morpholine-2,6-dione) and DTPA di-anhydride (2-[bis[2-(2, 6-dioxomorpholin-4-yl)ethyl]amino]acetic acid) were supplied by Chematech and used as is.
  • the synthesis was carried out in DMSO (Fischer Chemicals).
  • VIVAFLOW 30 kDa cassettes for purification were purchased from Sartorius.
  • a solution of EDTA di-anhydride at 24 g/L and a solution of DTPA di-anhydride at 35 g/L were prepared in DMSO.
  • a volume of 10 mL of the chelating agent solution (EDTA diananhydride at 24 g/L or DTPA diananhydride at 35 g/L) is inserted into a 100 mL flask then the solution was placed under stirring and heated to 40° C. by a hot water bath.
  • a volume of 40 mL of a 6.25 g/L solution of PEG in DMSO is inserted into a dropping funnel. This solution is added drop by drop. Once the addition was complete, the solution was stirred and heated at 40° C.
  • the amount of grafted chelator is determined by UV-Visible spectrophotometric assay at 295 nm for EDTA and 275 nm for DTPA.
  • Increasing concentrations of copper (II) are added to a solution of PEG-EDTA or PEG-DTPA at 1.0 g/L in an acetate buffer at pH 4.5 (0.1 M ammonium acetate and 0.1 M acetic acid) .
  • the absorption measured at 295 nm (or 275 nm) is then plotted against the copper concentration (in mmol/g). The breaks in slope observed indicate that PEG-EDTA and PEG-DTPA contain respectively 0.16 mmol of EDTA and 0.12 mmol of DTPA per gram of polymer.
  • the PEG used is an 8-Arm PEG Amine with a molecular weight of 40 kDa, purchased from Creative PEGWork.
  • p-NCS-Bz-DFO N1-hydroxy-N1-(5-(4-(hydroxy(5-(3-(4-isothiocyanatophenyl)thioureido)pentyl)amino)-4-oxobutanamido)pentyl)-N4- (5-(N-hydroxyacetamido)pentyl)succinamide) was supplied by Chematech and used as is. The synthesis was carried out in DMSO (Fischer Chemicals). VIVAFLOW 30kDa cassettes for purification were purchased from Sartorius.
  • a mass of 1 g of PEG was weighed and inserted into a 250 mL flask. A volume of 100 mL of DMSO was added and the solution was stirred and heated to 40°C by a hot water bath. Once the polymer has completely dissolved, a mass of 69.4 mg of p-NCS-Bz-DFO was weighed and inserted into the PEG solution. The solution was stirred and heated at 40°C for 1h30min. The solution was then purified with ultrapure water using a Vivaflow cassette with a cut-off threshold of 30 kDa up to a purification rate of 25000. The purified product is then freeze-dried, the average mass of recovered product is 25 mg per 5 mL of solution.
  • the quantity of p-NCS-Bz-DFO grafted can be determined by UV-Visible spectrophotometric assay at 430 nm.
  • Increasing concentrations of iron (III) are added to a solution of PEG-DFO at 1.0 g/L in an acetate buffer at pH 4.5 (0.1 M ammonium acetate and 0.1 M acetic acid).
  • the absorption measured at 430 nm is then plotted against the iron concentration and a break in slope is observed for 7.9 mM of iron.
  • a molecule of DFO can complex a single atom of iron, so 1 gram of polymer contains 7.9 pmol of DFO.
  • the PEG used is an 8-Arm PEG Amine with a molecular weight of 40 kDa, purchased from Creative PEGWork.
  • DOTA-NHS (2-[4,10-bis(carboxymethyl)-7-[2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec- 1-yl]acetic acid) was supplied by Chematech and used as is. The synthesis was carried out in DMSO (Fischer Chemicals). The 30 kDa PES membrane used for purification was purchased from Sartorius and used with the SARTOFLOW SMART purification machine.
  • a 16.67 g/L solution of PEG was prepared in DMSO. A volume of 30 mL of this solution is inserted into a 100 mL flask, the solution was stirred and heated to 40°C by a hot water bath. A solution of DOTA-NHS at 7.5 g/L was prepared in DMSO. A volume of 20 mL of the DOTA-NHS solution is inserted into a funnel. This solution is added drop by drop. Once the addition was complete, the solution was stirred and heated at 40°C for 1 h 30 min.
  • the solution was then purified in the SARTOFLOW SMART machine with a membrane having a cut-off threshold of 30 kDa, with 8 L of ultra-pure water then 3 L of acetic acid and finally 2 L of water to return to pH neutral.
  • the amount of grafted chelator is determined by UV-Visible spectrophotometric assay at 275 nm.
  • Increasing concentrations of copper (II) are added to a solution of PEG-DOTA at 1.0 g/L in an acetate buffer at pH 4.5 (0.1 M ammonium acetate and 0.1 M acetic acid).
  • the absorption measured at 275 nm is then plotted against the copper concentration (in mmol/g). The break in slope observed indicates that the PEG-DOTA contains 0.16 mmol of DOTA per gram of polymer.
  • the lyophilized MexCDI was dissolved in ultra-pure water at a concentration of 10 g/L.
  • Solution 2 10 g/L Peg@DOTAGA
  • the lyophilized PEG@DOTAGA was dissolved in ultra-pure water at a concentration of 10 g/L.
  • Solution 3 10 g/L Peg@EDTA
  • the lyophilized PEG@DTPA was dissolved in ultra-pure water at a concentration of 10 g/L.
  • Solution 5 Concentrated acetic acid standard for hemodialysis
  • composition of the standard solution of concentrated acetic acid is as follows: 263 g/L NaCl, 3.35 g/L KCl, 6.24 g/L CaCl 2 , 2.14 g/L MgCl 2 , 10.8 g/L acetic acid and
  • This solution has a pH of 1.95.
  • Solution 6 Concentrated citric acid standard for hemodialysis
  • composition of the standard solution of concentrated citric acid is as follows: 263 g/L NaCI, 3.35 g/L KCI, 6.24 g/L CaCI 2 , 2.14 g/L MgCI 2 , 1.11 g/L acetate, 6.92 g/L citric acid and 45.0 g/L Dextrose.
  • This solution has a pH of 1.08.
  • Solution 7 0.1 M acetate buffer, pH 4.6
  • the acetate buffer solution contains 11.4 mL of acetic acid (MS-grade), 15.4 g of ammonium acetate and 2 L of ultra-pure water.
  • Solution 8 0.010 M HEPES buffer, pH 7.4
  • the buffer solution contains 2.383 g HEPES (Sigma Aldrich) in 1000 mL of ultra-pure water, the pH was adjusted with sodium hydroxide .
  • Protocol 1 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
  • the eluent used is the acetate buffer (solution 7), 10 pl of sample are injected and eluted at a flow rate of 0.8 mL/min.
  • the column used is a Polysep GFC-P 4000 SEC column and detection is performed with a UV detector at 250 nm and 295 nm wavelengths.
  • Protocol 2 High Pressure Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy (HPLC-MS)
  • the eluent used is acetate buffer (solution 7 prepared with MS-Grade certified products), the injection volume is 10 pL and the flow rate is set at 0.4 mL/min.
  • the column used is an SEC Polysep GFC-P 4000 column, the HPLC is coupled to a mass spectrometer (ICP-MS) for the detection of the desired isotopes.
  • Protocol 3 Ultrafiltration experiment using Vivaspin tubes
  • the membrane Ideally, at least 1 mL of supernatant remains above the membrane and is analyzed by ICP-MS to determine the exact concentration factor of the experiment.
  • the samples were diluted at least 10 times with a 1% nitric acid solution.
  • An internal standard (Indium) was added to each sample to reach a final indium concentration of 2 ppb.
  • the analyzes were carried out in KED (Kinetic Energy Discrimination) mode with a flow of helium in the chamber.
  • the isotopes detected are: 208 Pb, 206 Pb, 111 Cd, 112 Cd, 114 Cd, 63 Cu, 65 Cu, 27 Al.
  • Figure 2 shows that lead and cadmium are captured by the functionalized polymer product, MEXCD1, in the ppb concentration range.
  • Figure 2 the ordinate is the air of the polymer peak and the abscissa the original concentration of metals.
  • the linear regression shows that the uptake of lead and cadmium increases linearly with the amount of polymer introduced (R2 greater than 0.99).
  • Figures 2a and 2b below are the HPLC/SEC chromatograms coupled with ICP-MS for the detection of lead or cadmium.
  • the peaks correspond to the polymer peaks which have a retention time of around 15 minutes.
  • the increase in the area of the peak corresponding to the polymer with the increase in the initial concentration of lead or cadmium illustrates the increasingly strong capture of lead and cadmium according to the concentrations introduced.
  • Figures 3 and 4 show that the polymer dispersed at 0, a solution representative of an acid concentrate (with acetic acid or citric acid) is effective in capturing lead as soon as the dialysis fluid begins to form.
  • a solution representative of an acid concentrate with acetic acid or citric acid
  • Figures 5 and 6 show that the polymer dispersed at 0, a solution representative of an acid concentrate (with acetic acid or citric acid) is effective in capturing lead as soon as the dialysis fluid begins to form.
  • a solution representative of an acid concentrate with acetic acid or citric acid
  • the samples were prepared from ultra-pure water, solution 1 and a stock solution of Pb 2+ at 50,000 ppm in nitric acid HNO3 5% to obtain a sample with a volume 100mL total. Following protocol 3, 90 mL of each solution was centrifuged through 20 mL Vivaspins with a cutoff of 30 kDa. The volume of the final supernatant was approximately 10 mL, hence a concentration by one factor 9 of the original sample.
  • Table 6 The composition of the samples and the results are given in Table 6.
  • HPLC/SEC-ICP-MS chromatogram c (Pb detection) of Figure 7 corresponds to an initial concentration of about 5 ppb in lead and to purification by tangential filtration through a 30 kDa membrane. . If 10 mg/L of MEX-CD1 are put in solution, 8 times less lead passes through the membrane in comparison with the same experiment carried out without MEX-CD1. The product shows efficacy at very low concentrations (0.1 ppb). [0223] Example 5: Chelation of trace metals by MEX-CD1 via
  • the samples were prepared from solution 2, ultra-pure water and a Pb 2+ solution at 50,000 ppm in I ⁇ NO35% purchased from SCP Science, the final volume of the sample is 100mL. According to protocol 3, 99 mL of each sample was centrifuged through 6 mL Vivaspins with a pore size of 10 kDa. The final supernatant has a volume of 1 mL, ie a reconcentration by a factor of 99 of the initial sample.
  • Table 8 The composition of the samples and the results are given in Table 8.
  • FIG. 10 shows the effectiveness of the PEG@DOTAGA product for capturing lead in the ppb range.
  • a concentration in solution of the supernatant of 10 to 20 times higher in lead is measured by ICP/MS. We therefore overconcentrated the solution with lead and sequestered part of the lead to prevent it from passing through the porous membrane.
  • Example 7 Chelation of trace metals by MEX-CD1 in a situation of dialysis by Ultrafiltration
  • Solution 7 was diluted to 10 mM and 100 mg/L of Ca 2+ (from CaCh, Sigma Aldrich) was added to this solution to reproduce an environment similar to that of dialysis.
  • the samples were then prepared from this solution, solution 1 and a mixture of metals (Al 2+ , Mn 2+ , Pb 2+ , Cd 2+ , Cu 2+ , and Zn 2+ ) at 10 ppm in 5% HNO3 purchased from SCP Science, to obtain a final sample volume of 31 mL.
  • 30 mL of each solution was centrifuged through the 30 kDa cut-off membranes of the Vivaspin 6 mL.
  • the final supernatant has a volume of 1 mL, i.e. a reconcentration of the initial sample by a factor of 30.
  • Figure 11 shows the lead uptake as a function of the original lead concentration.
  • Example 8 Chelation of trace metals by Peq@DOTAGA in a situation of dialysis by Ultrafiltration
  • Solution 7 was diluted to 10 mM and 100 mg/L of Ca 2+ (from CaCh, Sigma Aldrich) was added to this solution to reproduce an environment similar to that of dialysis.
  • the samples were then prepared from this solution, solution 1 and a mixture of metals (Al 2+ , Mn 2+ , Pb 2+ , Cd 2+ , Cu 2+ , and Zn 2+ ) at 10 ppm in 5% HNO3 purchased from SCP Science, in order to obtain a sample with a final volume of 31 mL.
  • 30 mL of each solution was centrifuged through the 30 kDa membranes of the 6 mL Vivaspin.
  • the final supernatant has a volume of 1 mL, i.e. a reconcentration of the initial sample by a factor of 30.
  • Figure 12 shows that in the presence of 100 ppm of calcium, the Peg@DOTAGA product added at 100 mg/L is capable of sequestering lead and cadmium, even at low initial levels between 0.1 and 1 ppb.
  • the reference without the product
  • Example 9 Chelation of trace metals by Peq@EDTA in a situation of dialysis by Ultrafiltration
  • Solution 7 was diluted to 10 mM and 100 mg/L of Ca 2+ (from CaCh, Sigma Aldrich) was added to this solution to reproduce an environment similar to that of dialysis.
  • the samples were then prepared from this solution, solution 1 and a mixture of metals (Al 2+ , Mn 2+ , Pb 2+ , Cd 2+ , Cu 2+ , and Zn 2+ ) at 10 ppm in 5% HNO 3 purchased from SCP Science, in order to obtain a sample with a final volume of 31 mL.
  • 30 mL of each solution was centrifuged through the 30 kDa membranes of the 6 mL Vivaspins.
  • the final supernatant has a volume of 1 mL, i.e. a reconcentration of the initial sample by a factor of 30.
  • Figure 13 shows that in the presence of calcium, the PEG@EDTA product also captures part of the lead and cadmium and prevents it from passing the diafiltration membrane and overconcentrates the supernatant solution, between 0.1 and 1 ppb.
  • the supernatant was concentrated by 4.4 in cadmium and by 9.5 in lead.
  • Example 11 Stability of polymers in an acid medium
  • Figures 15 and 16 show that the product can be dispersed directly into an acid concentrate for use.
  • 1 g/L of MEX-CD1 and 1 g/L of PEG@DOTAGA were placed in a solution similar to an acid concentrate of the citric acid and salts type. After several weeks of storage, no modification of the product is observed, the product does not seem to have degraded and retains its capture capacity (tested here with copper) after 3 weeks.
  • Example 12 Complexation of Cd 2+ and Pb 2+ by PEG-DOTA in an acid medium
  • the PEG-DOTA was dissolved in ultra-pure water at a concentration of 1 g/L.
  • the standard solutions of lead and cadmium at 1000 ppm in 5% nitric acid purchased from SCP Science) were diluted by 2000 in 0.01 M hydrochloric acid.
  • the PEG-DOTA was diluted to 10 mg/L in dilute acetate buffer (0.01 M ammonium acetate and 0.01 M acetic acid) and 1 ppb of each of the metals (Pb and Cd) was added to the sample.
  • the pH was adjusted with 0.1 M or 1 M hydrochloric acid to reach pH 4, 3, 2 or 1.
  • Example 13 Complexation of aluminum by PEG-DFO in the presence of citrate
  • the freeze-dried PEG-DFO was dissolved in ultra-pure water at a concentration of 10 g/L.
  • the standard solution of Aluminum at 1000 ppm in 5% nitric acid (purchased from
  • the PEG-DFO was diluted to 0.1 g/L in the acetate buffer and 100 ppb of aluminum were added to the sample. When the samples contained citrate, this was added first, then the aluminum and finally the polymer in order to study the ability of PEG-DFO to extract the aluminum already complexed by the citrate.
  • the samples were analyzed by HPLC-MS to observe the distribution of aluminum on the different species present (PEG-DFO, citrate or free aluminium). HPLC-MS analysis showed a peak of aluminum bound to the polymer at a retention time of 17 min and a very weak peak of free aluminum at 24 min, which confirms the complexation of aluminum by the polymer (Figure 19).
  • the freeze-dried PEG-DFO was dissolved in ultra-pure water at a concentration of 10 g/L.
  • the standard solution of Aluminum at 1000 ppm in 5% nitric acid (purchased from SCP Science) was diluted by 200 in 0.01 M hydrochloric acid.
  • a solution of EDTA at 8 mM was prepared in the ultra-pure water.
  • the samples were prepared in a buffered solution of Hemosol B0 diluted by 100.
  • Reference samples of polymer without aluminum and aluminum complexed with 1.1 molar equivalent of EDTA, i.e. 1.189 ppm of EDTA, without polymer were prepared.
  • the composition of the different samples is detailed in Table 17.

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Abstract

L'invention porte sur une méthode de traitement des eaux et liquides de dialyse, en particulier pour capter certains métaux toxiques tels que le plomb, l'aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, et prévenir leur passage dans le sang lors d'une dialyse d'un patient, par exemple hémodialyse, hémofiltration ou hémodiafiltration. En particulier, elle concerne une composition pour dialyse, comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d'au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l'aluminium, le chrome, le nickel et le cadmium, ledit polymère étant présent dans une quantité suffisante pour être à une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10 mg/L lors de l'utilisation au cours d'une dialyse chez un patient.

Description

Description
Titre : Composition pour la captation de plomb et/ou de cadmium dans un fluide de dialyse
Domaine technique [0001] La présente divulgation relève du domaine des techniques de dialyse. Elle porte plus précisément sur des méthodes de traitement des eaux et liquides de dialyse, en particulier pour capter certains métaux toxiques tels que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, diminuer ainsi la concentration en cations métalliques susceptibles de diffuser au travers d’une membrane, et prévenir leur passage dans le sang lors d’une dialyse d’un patient, par exemple une hémodialyse, une hémofiltration ou une hémodiafiltration.
Technique antérieure
[0002] Le maintien de l’homéostasie du milieu intérieur de l’organisme, c’est-à-dire de l’ensemble des liquides ou fluides biologiques de l’organisme, est nécessaire au bon fonctionnement de ce dernier. Dans de nombreuses pathologies, des dérégulations systémiques ou locales de l’homéostasie des métaux ont été mises en évidence.
[0003] Dans l’organisme, les métaux sont soumis à de nombreux équilibres et sont associés à des fonctions complexes. Certains métaux comme le cuivre ou le fer sont indispensables pour le fonctionnement du corps humain tandis que d’autres n’ont aucune fonction reconnue et sont associés à de fortes toxicités. C’est notamment le cas des métaux lourds comme par exemple le plomb, le mercure ou le cadmium. Ces métaux peuvent notamment induire un stress oxydant ou interagir et modifier les fonctions de biomolécules essentielles.
[0004] Le cadmium et le plomb sont ainsi cités par la « World Health Organization » (WHO) comme deux des dix polluants d’importance majeure pour la santé humaine (S. Satarug et al., Toxics, 2020). Ils se concentrent majoritairement dans les os et les reins, mais leur effet toxique ne se limite pas à ces organes, notamment en induisant un stress oxydant, des lésions de l’ADN, en prenant la place d’autres métaux ou en détournant de leur usage certaines protéines, notamment celles contenant des composés soufrés. Les agences de sûreté ont ainsi baissé fortement les taux acceptables de ces composés, bien qu’il ait été montré que même un taux faible en dessous de ces valeurs est reconnu comme toxique et que toute diminution plus forte de ce taux serait bénéfique. Pour le plomb, le WHO recommande ainsi un taux dans le sang inférieur à 100 pg.L1 pour les adultes et l’agence américaine préconise un taux à 50 pg.L1 pour les enfants (L. A. Alli, Interdiscip. Toxicol., 2015). Pour le cadmium, le taux est beaucoup plus bas et compris entre 0,3 et 1,2 pg.L 1 pour la WHO. L’augmentation du taux de cadmium ou de plomb dans le sang est ainsi notamment liée à une augmentation du risque de maladie des reins, de maladies cardiovasculaires ou de cancers.
[0005] L’hémodialyse et l’hémodiafiltration sont actuellement les traitements les plus classiquement utilisés pour les patients souffrant d’une maladie rénale en phase terminale et sont malheureusement associés à une surmortalité par infection ou maladie cardiovasculaire (M. Tonelli et al., BMC Medicine, 2009). Ces techniques consistent à permettre, à travers une membrane perméable aux molécules de poids moléculaires petits et moyens, des échanges libres d’ions et de toxines entre un fluide appelé dialysat et le sang du patient. Cette technique permet d’extraire du sang des molécules ou atomes toxiques tels que les métaux lourds. Un fluide de dialyse est essentiellement constitué d’eau. L’objectif de la dialyse étant de purifier le sang, il va de soi que l’eau utilisée pour la préparation d’un fluide de dialyse doit être stérile et la plus pure possible. Il a été montré dans de nombreuses études que les patients traités à long terme par dialyse peuvent présenter une déficience en éléments essentiels comme le zinc et le sélénium mais également une surconcentration en métaux lourds tels que le plomb ou le cadmium (A. Almeida et al., J. Trace Elem. Med. Biol., 2020). Les patients subissant une hémodialyse sont en effet soumis à une grande quantité de dialysat (> 300 L/semaine), ainsi même une pollution à l’état de trace dans le dialysat peut conduire à une surconcentration métallique en métaux lourds et à une toxicité clinique avérée (G. Filler étal., Pediatr. Nephrol., 2014) le cadmium est par exemple associé à une dysfonction rénale (C. G. Sotomayor Kidney int, 2020), à l’ostéoporose (K. A. James, Int. J. of Public Health 2013) et à l’artériosclérose (B. Messner, Arteriosclerosis, thrombosis ans Vascular Bio 2009) avec une augmentation de la mortalité cardiovasculaire chez les patients exposés à des concentrations élevées (S. Larsson, Int. J. of Epdemiology 2016). Ces risques sont d’autant plus grands pour les enfants pour lesquels la toxicité des métaux lourds est reconnue comme encore plus critique notamment pour le développement neurocognitif et la croissance. Ces risques sont également élevés chez la femme enceinte pour le développement du foetus.
[0006] La pureté recommandée des eaux de dialyse est déjà bien stricte, et est souvent de l’ordre du ppb en concentration maximale en plomb ou cadmium, c’est-à-dire souvent des concentrations beaucoup plus faibles que la concentration totale dans le sang. Néanmoins, ces concentrations ne semblent pas encore assez faibles, pour éviter des problèmes de santés liés aux surcharges en métaux lourds. En effet, si les concentrations en métaux lourds dans le sang sont très souvent supérieures aux fluides de dialyses utilisés, il est à noter que dans le sang, la grande majorité de ces métaux est associée à des cellules (en particulier érythrocytes) et seuls quelques pourcents se retrouvent dans le plasma. La concentration plasmatique en plomb et cadmium est alors assez proche des teneurs initiales en métaux lourd dans les fluides de dialyses. Plus précisément encore, sur la teneur plasmatique en métaux, une grande majorité est associé à des protéines de grandes tailles (comme l’albumine) et ne peuvent ainsi pas diffuser à travers les membranes conventionnelles de dialyses. La concentration plasmatique en cations de métaux lourds, Pb2+ et Cd2+, libres ou associés à des petites espèces qui peuvent diffuser à travers une membrane de dialyse est donc beaucoup plus faible et apparaît souvent en dessous des teneurs du fluide de dialyse. Il existe alors un risque de contamination du patient en métaux lourds lors des dialyses, même si les teneurs du fluide de dialyse sont inférieures à 1 ppb. [0007] Un fluide de dialyse purifié en partie en métaux libre, et en particulier en métaux lourds de type plomb ou cadmium, apporte un bénéfice au traitement de dialyse et surtout en hémodiafiltration, lorsque le fluide est réinjecté directement dans le patient, en amont ou aval de la dialyse. Les métaux lourds sont connus pour favoriser le stress oxydant, et une diminution de leur teneur au sein des fluides de dialyse apporterait un bénéfice au niveau de la diminution des risques de maladies cardiovasculaires, d’arthérosclérose, de diminution de la fonction rénale, de problème d’articulation et osseux et également de maladies neurodégénératives. En captant les métaux lourds on préserve l’endothélium des patients.
[0008] Il est extrêmement difficile de garantir une absence d’impuretés métalliques dans des réactifs chimiques ou même une source d’eau nécessaire à la formulation d’un fluide de dialyse. Ce fait est même encore plus problématique dans les pays émergents rendant nécessaire la mise en place de solutions technologiques pour garantir une dialyse qui ne contribuera pas à une surconcentration en espèces métalliques toxiques. En particulier, la purification de l’eau utilisée pour préparer un fluide de dialyse fait appel à un processus long et coûteux nécessitant des appareils de haute technicité. Par ailleurs, les teneurs en éléments potentiellement polluants pour le patient dialysé varient d’un endroit à un autre.
[0009] Ainsi, de manière générale, dans les dispositifs d’hémodialyse, les utilisations d’eaux ultra-pures, mais aussi de fluides de dialyse ultra-purs sont largement conseillés.
[0010] En particulier de nouveaux dispositifs, comme des filtres d’ultrafiltration, permettent de diminuer le taux d’endotoxines directement sur la ligne de circulation des fluides de dialyse, avant le passage dans le dialyseur, ou même avant leur réinsertion directe dans le patient en cas d’hémodiafiltration. Plusieurs dizaines de litres de fluides de dialyse peuvent ainsi être directement injectées dans le patient au cours d’une séance, et la qualité du fluide est très importante. Si ces dispositifs, comme par exemple le filtre d’hémodialyse DIASAFE Plus, permettent une rétention efficace des contaminations microbiennes et/ou endotoxines bactériennes, ils n’ont pas d’efficacité sur la rétention de métaux libres.
[0011] Ainsi, il serait bénéfique de proposer une solution qui s’affranchisse, au moins en partie, de ces appareils et du lieu de préparation du fluide de dialyse pour prévenir la pollution du patient dialysé.
[0012] C’est dans ce cadre que se situe l’invention présentée qui concerne notamment l’utilisation d’un adjuvant polymérique chélatant, présent en très faible quantité dans le dialysat et susceptible de chélater les métaux lourds indésirables, tout en présentant une taille suffisante pour prévenir son relargage dans l’organisme lors de la dialyse.
[0013] Un objectif de l’invention est donc de proposer une méthode de préparation d’une composition pour dialyse, indépendante du lieu de mise en oeuvre de la dialyse.
[0014] Un autre objectif de l’invention est de proposer une composition de dialyse présentant des teneurs en métaux lourds diffusables (plomb et cadmium sous forme de cations libres ou associés à des petites molécules/ions complexants) extrêmement faibles, en dessous du ppb et de préférence en dessous de 0,1 ppb.
[0015] Un objectif supplémentaire est de proposer une méthode permettant de prévenir la pollution par des métaux exogènes tels que le plomb ou le cadmium du patient dialysé.
[0016] Ces objectifs et d’autres sont atteints grâce à la composition selon l’invention et ses utilisations détaillées ci-après.
Résumé
[0017] L’invention porte sur une composition pour dialyse, comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant présent dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L dans le dialysat lors d’une dialyse d’un patient.
[0018] L’invention porte également sur un méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, présent dans un fluide de dialyse, comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, permettant ainsi la captation dudit métal toxique par chélation avec l’agent chélatant dudit polymère. [0019] L’invention porte également sur l’utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium pour préparer une composition pour dialyse, par exemple pour hémodialyse, hémodiafiltration ou hémofiltration, en particulier une composition selon l’invention.
[0020] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en oeuvre, indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres.
Brève description des dessins
[0021] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1
[0022] [Fig. 1] La figure 1 est un schéma décrivant le principe d’une ultrafiltration Vivaspin.
Fig. 2
[0023] [Fig. 2] La figure 2 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Pb2+ et du Cd2+ selon l’exemple 1.
Fig.2a
[0024] [Fig. 2a] La figure 2a est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb2+ en interaction avec le polymère Mex-CD1 selon l’exemple 1.
Fig.2b
[0025] [Fig. 2b] La figure 2b est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Cd2+ en interaction avec le polymère Mex-CD1 selon l’exemple 1.
Fig. 3
[0026] [Fig. 3] La figure 3 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb2+dans l’acide acétique selon l’exemple 2.
Fig. 4
[0027] [Fig. 4] La figure 4 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb2+dans l’acide citrique selon l’exemple 2.
Fig. 5
[0028] [Fig. 5] La figure 5 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb2+dans l’acide acétique selon l’exemple 3. Fig. 6
[0029] [Fig. 6] La figure 6 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb2+dans l’acide citrique selon l’exemple 3
Fig. 7 [0030] [Fig. 7] La figure 7 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Pb2+ selon l’exemple 4.
Fig. 8
[0031] [Fig. 8] La figure 8 représente 2 graphiques représentant l’efficacité de la captation du Pb2+ et du Cd2+, à haute et basse concentration, selon l’exemple 5. Fig. 9
[0032] [Fig. 9] La figure 9 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cu2+ et du Mn2+, selon l’exemple 5.
Fig. 10
[0033] [Fig. 10] La figure 10 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Pb2+, selon l’exemple 6.
Fig. 11
[0034] [Fig. 11] La figure 11 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cd2+, Cu2+ et du Pb2+, selon l’exemple 7.
Fig. 12 [0035] [Fig. 12] La figure 12 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du
Cd2+, Cu2+ et du Pb2+, selon l’exemple 8.
Fig. 13
[0036] [Fig. 13] La figure 13 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cd2+, Cu2+ et du Pb2+, selon l’exemple 9. Fig. 14
[0037] [Fig. 14] La figure 14 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cd2+, Cu2+ et du Pb2+, selon l’exemple 10.
Fig. 15
[0038] [Fig. 15] La figure 15 représente un chromatogramme représentant la stabilité du MEX-CD1 dans de l’acide citrique selon l’exemple 11. Fig. 16
[0039] [Fig. 16] La figure 16 représente un chromatogramme représentant la stabilité du PEG@DOTAGA dans de l’acide citrique selon l’exemple 11.
Fig. 17 [0040] [Fig. 17] La figure 17 un chromatogramme représentant la chélation du Pb2+ et du
Cd2+ selon l’exemple 12.
Fig. 18
[0041] [Fig. 18] La figure 18 est un chromatogramme représentant la chélation du Pb2+ et du Cd2+ en milieu acide selon l’exemple 12. Fig. 19
[0042] [Fig. 19] La figure 19 est un chromatogramme représentant la chélation de l’aluminium selon l’exemple 13.
Fig. 20
[0043] [Fig. 20] La figure 20 est un chromatogramme représentant la chélation de l’aluminium en présence de citrate selon l’exemple 13.
Fig. 21
[0044] [Fig. 21] La figure 21 est un graphique représentant la concentration en aluminium mesurée par ICP-MS selon I’exemple14.
Fig. 22 [0045] [Fig. 22] La figure 22 est un graphique représentant le pourcentage d’aluminium extrait selon l’exemple 14.
Description détaillée
[0046] L’invention concerne une composition pour dialyse, ladite composition comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa et portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10 mg/L dans le dialysat (ou fluide de dialyse) lors d’une dialyse d’un patient.
[0047] Au sens de l’invention, le terme « dialyse » englobe les procédés d’épuration du sang chez des patients qui en ont besoin, par exemple des patients souffrant d’insuffisance rénale, aiguë ou chronique, notamment d’insuffisance rénale chronique terminale, et comprenant l’utilisation d’un dialyseur. Le dialyseur comprend une membrane poreuse ou semi-perméable, permettant le passage par diffusion ou convection des petites molécules, tout en bloquant le passage des molécules de taille plus importante, par exemple des protéines. La membrane présente ainsi un seuil de coupure ou « cut-off », c’est-à-dire la masse moléculaire au-delà de laquelle la membrane est considérée comme strictement imperméable, c’est-à-dire comme susceptible de bloquer 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, voire jusqu’à au moins 99,9% des molécules de masse moléculaire supérieure au seuil de coupure.
[0048] Le terme « dialyse » ou « épuration extra rénale » englobe en particulier l’hémodialyse, l’hémofiltration et l’hémodiafiltration. La dialyse désigne l’ensemble des méthodes d’épuration extrarénale permettant d’épurer les toxines urémiques et de corriger les troubles hydroélectrolytiques résultant de la dysfonction rénale (potassium, calcium, phosphore, acide, base). En pratique, le seuil de coupure d’une membrane semi-perméable pour une hémodialyse est de moins de 20 à 50 kDa pour les membranes à haute perméabilité. Dans le cadre de l’hémodialyse, les échanges à travers la membrane poreuse ou semi-perméable se font principalement par gradient de concentrations de part et d’autre de la membrane, mécanisme appelé diffusion. Dans le cadre d’hémofiltration, les échanges se font par gradient de pressions, du dialysat vers le sang, appelé convection. L’hémodiafiltration est la technique la plus communément prescrite, elle combine diffusion et convection (B. Canaud, Principes et modalités d’application de l’hémodialyse au traitement de l’insuffisance rénale chronique. Néphrologie et thérapeutique 2009).
[0049] Les dispositifs d’épuration extra rénale utilisés avec la présente invention, permettent donc des échanges entre dialysat et sang à travers une membrane semi perméable, ils comprennent (1 ) un réservoir contenant de l’eau ultra pure, (2) un générateur qui assure la circulation sanguine extra corporelle, la circulation du dialysat et qui génère le dialysat (ou fluide de dialyse), (3) une membrane semi perméable, aussi appelée dialyseur, (4) un dispositif de circulation sanguine extracorporelle et (5) un accès vasculaire.
[0050] Typiquement, on entend par « dispositif de circulation sanguine extracorporel », un dispositif permettant de réaliser une diversion du flux sanguin veineux dans un circuit situé hors du corps avec un débit de circulation de 300 à 400 ml/min chez l’adulte (variable chez l’enfant, en néonatologie >10 ml/min).
[0051] Le terme « dialysat » ou « fluide de dialyse » (utilisé de manière interchangeable) correspond au fluide préparé par le générateur, et utilisé lors de la séance de dialyse pour correction des troubles hydroélectrolytiques. Le dialysat résulte d’un mélange à partir du bain d’acide (acide acétique, acide citrique ou acide chlorhydrique), d’ions (potassium, sodium, chlore, calcium, magnésium), de glucose, d’eau ultrapure stérile et d’un tampon bicarbonate. En cas d’utilisation d’un dispositif de purification par ultrafiltration (par exemple DIASAFE(R)plus ou DIACLEAR(R)Ultrafiltrate), la composition du dialysat peut être mesurée en amont ou en sortie d’un filtre d’ultrapurification. Elle s’entend préférentiellement en amont de ces filtres, au niveau de la connexion d’entrée. Le débit du dialysat étant généralement de 500 à 700ml/min, et les séances de dialyse de 4 heures, un générateur de dialysat produit de façon continue et extemporanée 120 à 170 litres de dialysat par séance. Certains protocoles d’hémodialyse courts (2 heures par séance, et 6 séances par semaine), appelés hémodialyse quotidienne, utilisent des générateurs (NxStage, Physidia S3) qui nécessitent du dialysat en poches stériles de 5 litres, de même composition que décrit précédemment.
[0052] Par « composition pour dialyse », on entend ainsi toute composition adaptée pour son utilisation dans la préparation d’un dialysat ou fluide de dialyse. Ainsi, au sens de l’invention, le terme « composition pour dialyse » englobe le dialysat, ou une solution concentrée (additif) permettant la préparation du fluide de dialyse après dilution dans de l’eau stérile, et, le cas échéant avec d’autres additifs. Typiquement, dans un mode de réalisation, la composition pour dialyse selon l’invention est une solution concentrée pour dialyse ou un additif pour solution concentrée. Lesdites solutions concentrées comprennent notamment des solutions concentrées acides, comprenant au moins une quantité suffisante d’acide, par exemple choisi parmi l’acide acétique, l’acide chlorhydrique ou l’acide citrique, associé à un mélange d’ions, tel que le potassium, le sodium, le chlore, le calcium ou le magnésium, avec du glucose, à cette solution s’ajoute le tampon bicarbonate et l’eau ultrapure stérile.
[0053] Dans un autre mode de réalisation, la composition pour dialyse selon l’invention est une solution concentrée comprenant en outre un ou plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium ou le calcium, et des bicarbonates.
[0054] Dans un mode de réalisation particulier, la composition pour dialyse est une solution concentrée comprenant en plus dudit polymère, un acide et plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium et le calcium, et des bicarbonates.
[0055] Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition pour dialyse selon l’invention est une solution concentrée conditionnée dans une poche adaptée pour un dispositif de dialyse, de préférence une poche contenant un volume de solution compris entre 500 et 5000 mL et une quantité dudit polymère comprise entre 5 et 5000 mg et de préférence entre 10 et 100 mg.
Le polymère
[0056] Conformément à l’invention, le polymère est de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa. Ainsi, lorsque la composition pour dialyse est mise en oeuvre dans un dispositif de dialyse, le polymère est d’une masse moléculaire moyenne supérieure au seuil de coupure de la membrane semi-perméable utilisée dans le dispositif de dialyse. De manière préférée, le polymère est de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 900 kDa, de manière plus préférée entre 250 kDa et 750 kDa et de manière encore plus préférée, entre 400 kDa et 600 kDa.
[0057] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polymère est un polysaccharide statistique portant au moins un agent chélatant.
[0058] La masse moléculaire moyenne du polymère peut être déterminée par chromatographie d’exclusion stérique. [0059] De manière préférée, le polymère selon l’invention, de préférence le polysaccharide de formule I ou II ci-dessous, présente une constante de complexation d’au moins 1015 pour un élément de transition d ou f.
[0060] En particulier, dans un mode avantageux, le polymère est un polysaccharide statistique de formule I [0061] [Chem. 1]:
Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisi parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes,. x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[0062] Il est entendu que, dans la formule I ci-dessus, plusieurs groupements Rc peuvent être présents dans le polysaccharide. Ces groupements Rc peuvent être identiques ou différents les uns des autres. Ils sont tous indépendamment choisis parmi les groupements portant un agent chélatant. Il en va de même des liants Z : plusieurs liants Z peuvent être présents, et ils peuvent être identiques ou différents les uns des autres.
[0063] Selon un autre mode de réalisation, dans la formule I, x est compris entre 0,05 et
0,6, y est compris entre 0,1 et 0,9, le rapport y/x étant supérieur à 0,16, et la somme x + y étant supérieure à 0,4.
[0064] Selon un mode de réalisation, le polysaccharide de formule I est un polysaccharide de formule II
[0065] [Chem. 2]: Formule II dans laquelle :
Rci et RC2 sont différents, et sont des groupements comportant un agent chélatant,
Zi et 2.2, identiques ou différents, sont des liants pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35, et z est compris entre 0,5 et 1.
[0066] Dans ce mode de réalisation spécifique, le polysaccharide de formule II peut comprendre : - un seul type de groupement comportant un agent chélatant, Rci, lorsque z = 1 , ou
- 2 types de groupements comportant un agent chélatant, Rci et RC2, lorsque 0,5 < z < 1.
[0067] Selon un mode de réalisation, z est compris entre 0,8 et 0,99, le groupement Rci est donc largement majoritaire.
[0068] Selon un autre mode de réalisation, dans la formule II, x est compris entre 0,05 et 0,6, y est compris entre 0,1 et 0,9, le rapport y/x étant supérieur à 0,16, et la somme x + y étant supérieure à 0,4.
[0069] On entend par groupement de type Rc, les groupements Rc dans le polysaccharide de formule I, et les groupements Rci et Rc2, lorsque le groupement Rc2 est présent, dans le polysaccharide de formule II.
[0070] Le groupement Rc est un agent chélatant. En d’autres termes le groupement Rc permet de chélater un ou plusieurs métaux en formant un complexe.
[0071] Conformément à l’invention, les groupements Rc, Rci et Rc2 sont des agents chélatants. En d’autres termes les groupements Rc, Rci et Rc2 permettent de chélater un ou plusieurs métaux en formant un complexe.
[0072] Chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 peut contenir un ou plusieurs sites de coordination. De préférence, le site de coordination est un atome d’azote ou d’oxygène. De manière avantageuse, chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 comporte entre 4 et 8 sites de coordination, de manière plus avantageuse entre 6 et 8 sites de coordination et de manière encore plus avantageuse chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 comporte 8 sites de coordination.
[0073] On entend par site de coordination une unique fonction capable de chélater un métal. Par exemple, une fonction amine représente un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’atome d’azote et le métal et une fonction acide hydroxamique représente également un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’oxygène du motif carbonyle et par une liaison covalente avec l’oxygène du motif N-oxyde le site de coordination formant ainsi un cycle à cinq chaînons. [0074] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule I, chaque groupement Rc est indépendamment choisi dans le groupe constitué du DOTA (acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N”,N”’-téracétique), NOTA (acide 1,4,7- triazacyclononane-1 ,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1- glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxyméthyl)-1,4,7,10- tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), DOTAM (1 , 4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)- 1,4,7,10 tétraazacyclododécane), D03AM (acide 2-‘4,7,10-tris(2-amino-2oxoéthyl)- 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécan — 1-yl) acétique), NOTAM (1 ,4,7-tetrakis(carbamoylméthyl)- 1 ,4,7-triazacyclononane), DOTP (1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane 1,4,7,10- tétrakis(méthylène phosphonate), NOTP (1,4,7-tétrakis(méthylène phosphonate )-1 ,4,7- triazacyclononane), TETA (acide 1,4,8,11-tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N’”- téraacétique), TETAM (1 ,4,8,11-tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N”’-tétrakis(carbamoyl méthyl), du DTPA (acide diéthylène triaminopentaacétique) et DFO (deferoxamine), de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, du DFO, du DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le groupement Rc est le DOTAGA.
[0075] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule II, Rci et RC2 sont indépendamment choisis dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DTPA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA. [0076] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement
Rci est le DOTAGA, et de préférence, z=1.
[0077] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement Rci est le DOTAGA et le groupement Rc2est le DFO.
[0078] On entend par liant de type Z, les liants Z dans le polysaccharide de formule I, et les liants Zi et Z2, lorsque le liant Z2 est présent, dans le polysaccharide de formule II.
[0079] Le choix des liants Z, Z1 et Z2 dans les formules I et II dépend essentiellement des groupements Rc, Rci et RC2 et du métal à chélater. En effet, pour des raisons stériques notamment, les groupements Rc, Rci et RC2 peuvent être plus ou moins proches du cycle à 6 chaînons de l’azote de l’unité glucosamine. [0080] De préférence, dans la formule I, chaque Z est indépendamment une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes. [0081] Selon un mode de réalisation, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison, une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaîne alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -NR’-C(0)-NR’-, -NR’- C(0)-0-, -0-C(0)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, -SR’, -NR’2, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0082] Avantageusement, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0083] Dans un mode de réalisation particulier chaque Z est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.
[0084] Dans un autre mode de réalisation particulier, chaque Z est un polyéthylène glycol (PEG).
[0085] De préférence, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes.
[0086] Selon un mode de réalisation, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison, une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaîne alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -NR’-C(0)-NR’-, -NR’- C(0)-0-, -0-C(0)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, -SR’, -NR’2, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0087] Avantageusement, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment sélectionnés dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.
[0088] Dans un mode de réalisation particulier Z1 et/ou Z2 est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.
[0089] Dans un autre mode de réalisation particulier, Z1 et/ou Z2 est un polyéthylène glycol (PEG)Le polymère de formule I est composé de 3 unités monomériques, à savoir une unité A de type N-acétylglucosamine, une unité B de type glucosamine et une unité C de type glucosamine fonctionnalisée par un agent chélatant (Rc) lié par un liant Z à l’azote de la glucosamine.
[0090] Le polysaccharide selon l’invention est composé de 3 unités monomériques, à savoir une unité A de type N-acétylglucosamine, une unité B de type glucosamine et une unité de type C de type glucosamine fonctionnalisée par un agent chélatant (de type Rc) lié par un liant (de type Z) à l’azote de la glucosamine.
[0091] Le polymère de formule I ou II est un polymère statistique. En d’autres termes, l’enchainement des différentes unités monomériques A, B et de type C est aléatoire.
[0092] Dans les formules I et II, x représente la proportion d’unités A et x est compris entre 0,05 et 0,7, de manière préférée, x est compris entre 0,2 et 0,6, de manière plus préférée x est compris entre 0,25 et 0,4.
[0093] Dans les formules I et II, y représente la proportion d’unités C et y est compris entre 0,1 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2.
[0094] Le rapport y/x est de préférence compris entre 0,15 et 1 ,5.
[0095] La somme x + y est de préférence comprise entre 0,35 et 0,8.
[0096] Le reste des unités monomériques des formules I et II sont des unités B. Ainsi, dans la formule I, la proportion d’unités B est égale à 1-x-y. [0097] Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le polymère est un polymère biocompatible, par exemple de type polyéthylèneglycol (PEG), poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), polyacrylamides, polyamines ou polycarboxyliques. Dans ce cas, le polymère biocompatible, de préférence un PEG, comprend un agent chélatant de préférence sélectionné dans le groupe constitué par EDTA, DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DT PA et DFO, et plus préférentiellement dans le groupe constitué du DOTAGA, EDTA, DFO, DOTAM et du DTPA.
[0098] En particulier, le polymère est un PEG comprenant un agent chélatant qui peut être choisi parmi un PEG fonctionnalisé avec du DOTAGA, un PEG fonctionnalisé avec de l’EDTA, un PEG fonctionnalisé avec du DTPA, un PEG fonctionnalisé avec du DFO, et un PEG fonctionnalisé avec du DOTA.
[0099] Selon un mode de réalisation, le polymère est choisi parmi les polysaccharides de formule I, les polysaccharides de formule II et les PEG comprenant un agent chélatant. [0100] L’agent chélatant du polymère est capable de chélater les métaux lourds susceptibles d’être présent dans les eaux et liquides utilisés pour la préparation du dialysat. En particulier, dans un mode de réalisation préféré, la concentration du polymère dans la composition pour dialyse est suffisante pour permettre une concentration résiduelle libre en métal lourd dans le dialysat, qui soit inférieure à 0,1 ppb. Par concentration résiduelle libre, on entend la concentration de métaux lourds toxiques, typiquement le plomb et le cadmium, non complexés à l’agent chélatant du polymère dans le dialysat et donc susceptibles de traverser la membrane semi-perméable du dispositif de dialyse.
[0101] De manière générale selon l’invention, l’agent chélatant est donc présent de préférence, dans le dialysat lors de l’étape de dialyse d’un patient à une concentration comprise entre 104mmol.L 1 et 106mmol.L1.
[0102] Dans un mode de réalisation préféré, en particulier en combinaison avec le mode avantageux dans lequel le polymère est de formule I ci-dessus, la composition pour dialyse comprend une quantité suffisante de polymère pour être dans une concentration dans le dialysat comprise entre 0,1 mg/L et 10 mg/L, le cas échéant après dilution. Ainsi par exemple, s’il s’agit d’une solution concentrée à diluer 45 fois, la concentration du polymère dans la solution concentrée est de préférence comprise entre 4,5 et 450 mg/L.
[0103] De manière avantageuse, le polymère utilisé est stable dans l’acide, en particulier l’acide acétique ou l’acide citrique. [0104] Dans un mode de réalisation, la présente invention vise un additif, en particulier une solution concentrée prête à l’emploi pour une dialyse, par exemple une hémodialyse, et comprenant
(i) un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa, et portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère de formule I ou II, ou un PEG comprenant un agent chélatant, de préférence dans une concentration comprise entre 4,5 et 450 mg/L ; (ii) le cas échéant, (a) un ou plusieurs éléctrolytes tels que le potassium, le sodium, le chlore, le calcium, le magnésium, le bicarbonate, l’acétate ou le citrate, et (b) au moins un sucre, tel que le glucose ou le dextrose.
[0105] Ladite solution concentrée peut être conditionnée sous forme de poche, cartouche ou bidon, par exemple en vue d’une dilution 1/45 ou 1/35 avec un générateur de dialysat.
[0106] Dans un mode de réalisation, la présente invention vise une solution concentrée acide, en particulier une solution concentrée acide prête à l’emploi pour une dialyse, par exemple l’hémodialyse, et comprenant
(i) un acide choisi parmi l’acide citrique, l’acide acétique ou l’acide chlorhydrique
(ii) un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa, et portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère de formule I ou II, ou un PEG comprenant un agent chélatant, de préférence dans une concentration comprise entre 4,5 et 450 mg/L.
(iii) le cas échéant, (a) un ou plusieurs éléctrolytes tels que le potassium, le sodium, le chlore, le calcium, le magnésium, le bicarbonate, l’acétate ou le citrate, et (b) au moins un sucre, tel que le glucose ou le dextrose.
[0107] Ladite solution concentrée acide peut être conditionnée sous forme de poche ou bidon, par exemple en vue d’une dilution 1/45 ou 1/35 avec un générateur de dialysat.
[0108] L’invention concerne également un PEG de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, l’agent chélatant étant de préférence sélectionné dans le groupe constitué par EDTA, DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DT PA et DFO, et plus préférentiellement dans le groupe constitué du DOTAGA, EDTA, DFO, DOTAM et du DTPA. Avantageusement, le PEG comprend entre 1pmol et 1 mmol d’agent chélatant par gramme de polymère.
[0109] L’invention concerne également une composition pour dialyse comprenant un tel PEG, ledit PEG étant présent dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L dans le dialysat lors d’une dialyse d’un patient.
La méthode de captation
[0110] Les compositions décrites ci-dessus sont avantageusement utilisées pour capter les métaux toxiques susceptibles d’être présents dans les eaux et liquides utilisées pour préparer le dialysat.
[0111] Par conséquent, selon un autre aspect, l’invention concerne une méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, susceptible d’être présent dans un fluide de dialyse comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, et notamment l’un des polymères décrit au paragraphe précédent, plus préférentiellement le polymère de formule (I) ou (II), ou un PEG comprenant un agent chélatant.
[0112] Dans un mode de réalisation, le polymère est présent dans une solution concentrée adaptée pour son utilisation dans un dispositif de dialyse, comme décrit plus haut, par exemple une solution concentrée acide.
[0113] Dans un mode de réalisation, le fluide de dialyse comprenant le polymère est introduit dans le réservoir du dispositif de dialyse susceptible d’être connecté à un dispositif de circulation sanguine extracorporel comprenant une membrane de dialyse poreuse, typiquement présentant un seuil de coupure inférieure à la masse moléculaire moyenne dudit polymère, par exemple inférieur à 20kDa. Le polymère capte les éventuels métaux toxiques susceptibles d’être présents dans l’eau ou les liquides ou poudres utilisés lors de la préparation du fluide de dialyse par complexation à l’agent chélatant. Le polymère ne passe pas dans le sang du fait de sa masse moléculaire supérieure au seuil de coupure de la membrane semi-poreuse du dispositif de dialyse.
[0114] Dans un autre mode de réalisation, le fluide de dialyse comprenant le polymère est introduit en amont d’un filtre d’ultrafiltration, et en particulier en amont d’un filtre qui permet d’obtenir un fluide de dialyse ultra pure, avec en particulier un taux de contamination microbienne <0.1 CFU/ml et/ou un taux d’endotoxines bactériennes <0.03 lU/ml. Ainsi, outre une captation des endotoxines classiquement, le fluide de dialyse comprenant le polymère permet de séquestrer les métaux toxiques en amont et purifier ainsi les eaux de dialyses avec moins de 1 ppb en métaux lourds et même moins de 0.1 ppb en plomb et/ou Cadmium en particulier.
[0115] Ainsi, par exemple, le fluide de dialyse comprenant le polymère peut être injecté en amont d’un filtre de type Diasafe(R)plus ou DIACLEAR(R)Ultrafiltrate ou équivalent, il peut également être injecté en aval, directement avant le dialyseur au contact du sang du patient.
[0116] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de captation selon la présente invention est mise en oeuvre pour capter l’aluminium, par exemple, afin d’obtenir une concentration d’aluminium non complexé inférieure à 1 ppb dans le dialysat. [0117] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de captation selon la présente invention est mise en oeuvre pour capter le plomb, par exemple, afin d’obtenir une concentration de plomb non complexé inférieure à 0,1 ppb dans le dialysat, de préférence dans le dialysat à l’entrée du dialyseur et/ou pour une injection directe dans le sang, c’est- à-dire en amont ou en aval du filtre. [0118] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de captation selon la présente invention est mise en oeuvre pour capter le cadmium, par exemple, afin d’obtenir une concentration de cadmium non complexé inférieure à 0,01 ppb dans le dialysat, de préférence dans le dialysat à l’entrée du dialyseur et/ou pour une injection directe dans le sang, c’est-à-dire en amont ou en aval du filtre. [0119] Dans un mode de réalisation, on met en oeuvre la présente méthode dans une séance de dialyse d’un patient, par exemple un patient souffrant d’insuffisance rénale aiguë ou chronique. Dans ce mode de réalisation, on peut utiliser au moins 120 L de fluide de dialyse.
[0120] L’invention concerne également une méthode de traitement des liquides utilisés dans la préparation d’un fluide de dialyse, ladite méthode comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, et notamment l’un des polymères décrit au paragraphe précédent, plus préférentiellement le polymère de formule (I).
L’utilisation du polymère
[0121] Selon un troisième aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère tel que défini plus haut, et notamment le polymère de formule (I), pour préparer un fluide de dialyse, une solution concentrée acide, ou concentré bicarbonate en poudre ou toute autre solution contenant des électrolytes. [0122] L’invention concerne aussi le procédé de préparation d’un fluide de dialyse, ledit procédé comprenant l'utilisation d’une composition pour fluide de dialyse comme décrit plus haut, et comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, dans un générateur de dialysat afin de produire un dialysat comprenant ledit polymère dans une concentration suffisante pour complexer lesdits métaux toxiques.
[0123] L’invention vise également les concentrés liquides, par exemple conditionnés sous forme de poche, cartouche ou bidon adapté pour leur utilisation dans dispositif de dialyse, et comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère tel que défini plus haut, et notamment le polymère de formule (I) ; pour leur utilisation dans un procédé de dialyse chez un patient qui en a besoin, par exemple un patient souffrant d’insuffisance rénale aiguë ou chronique. De tels concentrés liquides peuvent comprendre en outre un acide, par exemple, l’acide citrique, acétique ou chlorhydrique.
[0124] Le polymère est en quantité suffisante pour permettre la captation de métaux toxiques susceptibles d’être présents dans les liquides utilisés dans la préparation du dialysat. Utilisation de la composition pour dialyse
[0125] De manière avantageuse, la composition pour dialyse selon l’invention peut être utilisée sur des patients présentant des teneurs en plomb plasmatique supérieure à 1 ppb ou en cadmium plasmatique supérieure à 0,1 ppb.
[0126] De manière avantageuse, la composition pour dialyse selon l’invention peut être utilisée sur des patients présentant en plus des maladies cardiovasculaires et/ou une maladie neurodégénérative et/ou des problèmes articulaires ou fragilité des os.
[0127] De manière avantageuse, la composition pour dialyse selon l’invention peut être utilisée sur des patients qui vont subir une greffe de reins dans l’année et de préférence dans les 3 mois. Variantes de réalisation
[0128] Selon une variante 1, l’invention porte sur une composition pour dialyse, comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant présent dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L dans le dialysat lors d’une dialyse d’un patient.
[0129] Variante 2 : Composition pour dialyse selon la variante 1, caractérisée en ce que le métal est choisi parmi les métaux lourds tels que le plomb ou le cadmium. [0130] Variante 3 : Composition pour dialyse selon la variante 1 ou 2, caractérisé en ce que l’agent chélatant est choisi dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, DTPA, EDTA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le DOTAGA. [0131] Variante 4: Composition pour dialyse selon l’une des variantes 1 à 3, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide statistique portant au moins un agent chélatant.
[0132] Variante 5 : Composition pour dialyse selon l’une des variantes 1 à 4, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide statistique de formule I : Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisi parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[0133] Variante 6 : Composition pour dialyse selon l’une des variantes 1 à 4, caractérisée en ce que le polymère est un polymère biocompatible, par exemple de type polyéthylène glycol (PEG).
[0134] Variante 7 : Composition pour dialyse, selon l’une des variantes 1 à 6, caractérisé en ce qu’il s’agit d’une solution concentrée ou d’un additif pour solution concentrée pour dialyse, de préférence une solution concentrée acide comprenant, en plus du polymère, une quantité suffisante d’acide acétique, d’acide chlorhydrique, ou d’acide citrique.
[0135] Variante 8 : Composition pour dialyse, selon l’une des variantes 1 à 7, caractérisé en ce qu’il s’agit d’une solution concentrée comprenant un ou plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium ou le calcium, et des bicarbonates.
[0136] Variante 9 : Composition pour dialyse, selon l’une des variantes 1 à 7, caractérisé en qu’il s’agit d’une solution concentrée conditionnée dans une poche adaptée pour un dispositif de dialyse, de préférence une poche contenant un volume de solution compris entre 500 et 5000 ml_ et une quantité dudit polymère comprise entre 5 et 5000 mg et de préférence entre 10 et 100 mg.
[0137] Variante 10 : L’invention porte sur une méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, présent dans un fluide de dialyse, comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, permettant ainsi la captation dudit métal toxique par chélation avec l’agent chélatant dudit polymère.
[0138] Variante 11 : Méthode de captation selon la variante 10, caractérisée en ce que le métal toxique est l’aluminium.
[0139] Variante 12 : Méthode de captation selon la variante 10, caractérisée en ce que le métal toxique est le plomb et que la concentration dans le fluide de dialyse est inférieure à 0,1 ppb.
[0140] Variante 13 : Méthode de captation selon la variante 10 caractérisée en ce que le métal toxique est le cadmium et que la concentration dans le fluide de dialyse est inférieure à 0,01 ppb. [0141] Variante 14 : Méthode de captation selon la variante 10 ou 11, caractérisée en ce qu’au moins 120L de fluide de dialyse est utilisé dans une dialyse d’un patient.
[0142] Variante 15 : Méthode de captation selon l’une des variantes 10 à 12, caractérisée en ce que le fluide de dialyse est introduit dans un réservoir d’un dispositif de dialyse, susceptible d’être connecté à un dispositif de circulation sanguine extracorporel comprenant une membrane de dialyse poreuse.
[0143] Variante 16 : Méthode selon la variante 13, caractérisée en ce que le seuil de coupure de la membrane poreuse est inférieur à la taille du polymère.
[0144] Utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 10OOkDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium pour préparer une composition pour dialyse, par exemple pour hémodialyse, hémodiafiltration ou hémofiltration, en particulier une composition selon l’une des variantes 1 à 9.
Exemples G0145Ί Synthèse des polymères
[0146] Préparation du MexCDI (Chitosane@DOTAGA)
[0147] Dans l’étape 1, 60 g de chitosane, 4 L d’eau ultra-pure et 45 ml_ d’acide acétique glacial sont introduits dans un réacteur de 10 L et placés sous agitation pendant une durée de 16 heures à un pH de 4,5 ± 0,5. Une solution jaune pâle est obtenue. [0148] Dans l’étape 2, 1,2 L de propane-1,2-diol sont ajoutés à la solution jaune pâle obtenue à l’étape 1 et l’agitation est maintenue pendant 1 h. Une solution composée de 14 ml_ d’anhydride acétique dissous dans 600 ml_ de propane-1,2-diol est ensuite ajoutée lentement en 10 min afin d’obtenir une acétylation homogène le long de la chaîne polymérique, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 4 h. [0149] Le taux d’acétylation peut être déterminé par analyse élémentaire. L’unité non acétylée du polysaccharide (unité B) présente une masse molaire de 161,2 g. mol 1 (C6NO4H11) tandis-que l’unité acétylée (unité A) présente une masse molaire de 203,2 g. mol 1 (C8NO5H13). L’analyse élémentaire du polysaccharide obtenu à l’issue de l’étape 2 d’acétylation est la suivante : C 39,22% ; H 7,55% et N 6,77%, ce qui correspond à un taux d’unités acétylées (unités A) de 40% (x=0,4)
[0150] Dans l’étape 3, 2 L de la solution obtenue à l’étape 2 d’acétylation, sont placés dans un réacteur sous agitation. 120 g de DOTAGA anhydride sont ensuite ajoutés et l’agitation est maintenue pendant 16 h. A l’issue de cette réaction, la solution est diluée par 10 dans de l’eau ultra-pure et purifiée par filtration tangentielle en utilisant une membrane de 100 kDa. Après une première étape de re-concentration jusqu’à 16 L, la solution est filtrée par 480 L de solution à 0,1 M en acide acétique à volume constant (16 L), suivi par 320 L d’eau ultra-pure et par une autre étape de re-concentration jusqu’à 8 L. L’HPLC-UV permet de vérifier que le DOTAGA a bien été éliminé. Le pic aux alentours de 7 min correspond au polymère tandis que le pic aux alentours de 11 min correspond aux DOTAGA non greffés. La solution à une concentration de polysaccharide de 10 g/L est ensuite filtrée sur un filtre nylon (0,4 pm) avant lyophilisation.
[0151] La RMN du proton permet de déterminer le taux y de fonctionnalisation par le DOTAGA sur le polysaccharide en connaissant le taux x d’acétylation. L’unité non greffée et non acétylée (unité B) est constituée de 7 protons, liés de manière covalente à des atomes de carbone, présentant un déplacement chimique compris entre 2,9 et 4,3 ppm. L’unité acétylée (unité A) présente ces 7 mêmes protons ainsi que 3 protons, liés de manière covalente à un atome de carbone, présents sur l’acétyle caractérisés par un déplacement chimique compris entre 2 et 2,2 ppm. Enfin, l’unité greffée avec le DOTAGA (unité C) inclut 34 protons, liés de manière covalente à des atomes de carbone, dont 32 intègrent entre 2,9 et 4,3 ppm et 2 intègrent entre 2 et 2,2 ppm. Le spectre RMN permet grâce aux intégrations des différents massifs de déterminer les valeurs de y grâce à l’équation suivante :
[Math. 1]
[0152] Le taux d’unité greffée (unité C) est d’environ 0,1.
[0153] Ainsi, le polysaccharide obtenu à un taux d’unité A d’environ 0,4 (x=0,4), un taux d’unité B d’environ 0,5 (1-x-y=0,5) et un taux d’unité C d’environ 0,1 (y=0,1).
[0154] Le taux d’unités greffées (unité C) peut également être déterminé par fluorescence avec de l’europium. L’europium présente en effet une luminescence principalement centrée autour de 590 (5Do -> 7Fi) et 615 nm (5Do -> 7F2). Cette luminescence est éteinte lorsque l’ion europium est coordonné seulement avec des molécules d’eau. Le principe de la méthode de détermination du taux d’unités greffées est d’ajouter des quantités croissantes d’europium, afin que celui-ci soit chélaté, la luminescence augmente alors, lorsque tous les sites de chélation sont remplis, la luminescence atteint un plateau. En pratique, le polysaccharide obtenu à l’issue de l’étape 3 a été placé dans un tampon acétate à pH 5, un sel de chlorure d’europium dissous dans le tampon acétate a ensuite été ajouté. Une courbe de dosage est ensuite tracée en excitant à 396 nm et en relevant l’émission à 590 nm. Ce dosage permet de remonter à une quantité de chélate de 0,4 pmol par mg de polymère, soit un taux d’environ 10% (y=0,1).
[0155] Synthèse du PEG@DOTAGA
[0156] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. Le DOTAGA-anhydride (2,2',2”-(10-(2,6-dioxotetrahydro-2H- pyran-3-yl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane-1 ,4,7-triyl)triacetic acid) a été fourni par Chematech et utilisé tel quel. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). Les cassettes VIVAFLOW 30kDa pour la purification ont été achetées chez Sartorius. [0157] Une masse de 10 g de PEG a été pesée et insérée dans un ballon de 500 mL. Un volume de 250 mL de DMSO a été ajouté et la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Une fois le polymère entièrement solubilisé, une masse de 2,8 g de DOTAGA-anhydride a été pesée et insérée dans la solution de PEG. La solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1h30 min. La solution a ensuite été purifiée à l’eau ultra pure à l’aide d’une cassette Vivaflow avec un seuil de coupure de 30 kDa jusqu’à un taux de purification de 1500. Le produit purifié est ensuite lyophilisé. La masse moyenne de produit récupéré est de 496 mg et 23,2 mg pour 20 mL de solution.
[0158] L’analyse HPLC-UV du Peg@DOTAGA à 295 nm permet de déterminer la pureté du produit en faisant le ratio du pic de polymère sur l’aire totale des pics. Cette méthode permet de conclure que les taux de pureté du Peg@DOTAGA est 97%.
[0159] La quantité de chélateur greffé est déterminée par dosage spectrophotométrique UV-Visible à 295 nm pour le DOTAGA. Des concentrations croissantes de cuivre (II) sont ajoutées à une solution de Peg@DOTAGA à 1,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4.5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 295 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en cuivre (en mmol/g). La rupture de pente observée indique que le Peg@DOTAGA contient 0,14 mmol de DOTAGA par gramme de polymère.
[0160] Synthèse du PEG-EDTA et PEG-DTPA
[0161] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. L’EDTA di-anhydride (4-[2-(2,6-dioxomorpholin-4- yl)ethyl]morpholine-2,6-dione) et le DTPA di-anhydride (2-[bis[2-(2,6-dioxomorpholin-4- yl)ethyl]amino]acetic acid) ont été fournis par Chematech et utilisé tels quels. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). Les cassettes VIVAFLOW 30 kDa pour la purification ont été achetées chez Sartorius. [0162] Une solution d’EDTA di-anhydride à 24 g/L et une solution de DTPA di-anhydride à 35 g/L ont été préparées dans du DMSO. Pour chacune des synthèses, un volume de 10 mL de la solution de chélateur (EDTA di-anhydride à 24 g/L ou DTPA di-anhydride à 35 g/L) est inséré dans un ballon de 100 mL puis la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Un volume de 40 mL d’une solution de PEG à 6,25 g/L dans le DMSO est inséré dans une ampoule de coulé. Cette solution est ajoutée goutte à goutte. Une fois l’ajout fini, la solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1 h30min. La solution a ensuite été purifiée à l’eau ultra pure à l’aide d’une cassette Vivaflow avec un seuil de coupure de 30 kDa jusqu’à un taux de purification de 20000. Le produit purifié est ensuite lyophilisé. Pour le PEG-EDTA et le PEG-DTPA, la masse moyenne de produit récupéré est respectivement de 16,2 mg et 23,2 mg pour 5 mL de solution.
[0163] L’analyse HPLC-UV du PEG-EDTA et PEG-DTPA à 295 nm permet de déterminer la pureté du produit en faisant le ratio du pic de polymère min sur l’aire totale des pics. Cette méthode permet de conclure que les taux de pureté du PEG-EDTA et du PEG-DTPA sont respectivement de 96% et 92%.
[0164] La comparaison des spectres RMN 1H du PEG et PEG-DTPA ou PEG-EDTA après purification et lyophilisation confirme le greffage des chélateurs.
[0165] La quantité de chélateur greffé est déterminée par dosage spectrophotométrie UV- Visible à 295 nm pour l’EDTA et 275 nm pour le DTPA. Des concentrations croissantes de cuivre (II) sont ajoutées à une solution de PEG-EDTA ou PEG-DTPA à 1,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0.1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 295 nm (ou 275 nm) est ensuite tracée en fonction de la concentration en cuivre (en mmol/g). Les ruptures de pente observées indiquent que le PEG-EDTA et le PEG-DTPA contiennent respectivement 0,16 mmol d’EDTA et 0,12 mmol de DTPA par gramme de polymère.
[0166] Synthèse du PEG-DFO
[0167] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. Le p-NCS-Bz-DFO (N1-hydroxy-N1-(5-(4-(hydroxy(5-(3-(4- isothiocyanatophenyl)thioureido)pentyl)amino)-4-oxobutanamido)pentyl)-N4-(5-(N- hydroxyacetamido)pentyl)succinamide) a été fourni par Chematech et utilisé tel quel. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). Les cassettes VIVAFLOW 30kDa pour la purification ont été achetées chez Sartorius.
[0168] Une masse de 1 g de PEG a été pesée et insérée dans un ballon de 250 mL. Un volume de 100 mL de DMSO a été ajouté et la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Une fois le polymère entièrement solubilisé, une masse de 69,4 mg de p-NCS-Bz-DFO a été pesée et insérée dans la solution de PEG. La solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1h30min. La solution a ensuite été purifiée à l’eau ultra pure à l’aide d’une cassette Vivaflow avec un seuil de coupure de 30 kDa jusqu’à un taux de purification de 25000. Le produit purifié est ensuite lyophilisé, la masse moyenne de produit récupéré est de 25 mg pour 5 mL de solution.
[0169] L’analyse RMN 1H du PEG-DFO après purification et lyophilisation confirme la présence de p-NCS-Bz-DFO greffé. Les pics caractéristiques des protons portés par le benzène se retrouvent dans le spectre RMN de la déferoxamine mésylate.
[0170] Comme dans l’exemple 1 , la quantité de p-NCS-Bz-DFO greffé peut être déterminée par dosage spectrophotométrie UV-Visible à 430 nm. Des concentrations croissantes de fer (III) sont ajoutées à une solution de PEG-DFO à 1 ,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 430 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en fer et une rupture de pente est observée pour 7.9 mM de fer. Une molécule de DFO pouvant complexer un seul atome de fer, 1 gramme de polymère contient donc 7,9 pmol de DFO.
[0171] Synthèse du PEG-DOTA
[0172] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. Le DOTA-NHS (2-[4,10-bis(carboxymethyl)-7-[2-(2,5- dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid) a été fourni par Chematech et utilisé tel quel. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). La membrane en PES de 30 kDa utilisée pour la purification a été achetée chez Sartorius et utilisée avec la machine de purification SARTOFLOW SMART.
[0173] Une solution de PEG à 16,67 g/L a été préparée dans le DMSO. Un volume de 30 mL de cette solution est inséré dans un ballon de 100 mL, la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Une solution de DOTA-NHS à 7,5 g/L a été préparée dans du DMSO. Un volume de 20 mL de la solution de DOTA-NHS est inséré dans une ampoule de coulé. Cette solution est ajoutée goutte à goutte. Une fois l’ajout fini, la solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1 h30min. La solution a ensuite été purifiée dans la machine SARTOFLOW SMART avec une membrane possédant un seuil de coupure de 30 kDa, avec 8 L d’eau ultra-pure puis 3 L d’acide acétique et enfin 2 L d’eau pour revenir à pH neutre.
[0174] La quantité de chélateur greffé est déterminée par dosage spectrophotométrie UV- Visible à 275 nm. Des concentrations croissantes de cuivre (II) sont ajoutées à une solution de PEG-DOTA à 1,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 275 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en cuivre (en mmol/g). La rupture de pente observée indique que le PEG- DOTA contient 0,16 mmol de DOTA par gramme de polymère.
[0175] Le PEG-DOTA après lyophilisation a aussi été caractérisé par RMN 1H qui confirme le greffage du DOTA. G0176Ί Préparation des solutions
[0177] Solution 1 : 10 g/L MexCDI
[0178] Le MexCDI lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L.
[0179] Solution 2 : 10 g/L Peg@DOTAGA [0180] Le PEG@DOTAGA lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L.
[0181] Solution 3 : 10 g/L Peg@EDTA
[0182] Le PEG@EDTA lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L. [0183] Solution 4 : 10 g/L Peg@DTPA
[0184] Le PEG@DTPA lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L.
[0185] Solution 5: Standard concentré d’acide acétique pour hémodialyse
[0186] La composition de la solution standard d’acide acétique concentré est la suivante : 263 g/L NaCI, 3,35 g/L KCI, 6,24 g/L CaCI2, 2,14 g/L MgCI2, 10,8 g/L acide acétique et
45,0 g/L Dextrose. Cette solution a un pH de 1,95.
[0187] Solution 6: Standard concentré d’acide citrique pour hémodialyse
[0188] La composition de la solution standard d’acide citrique concentré est la suivante : 263 g/L NaCI, 3,35 g/L KCI, 6,24 g/L CaCI2, 2,14 g/L MgCI2, 1 ,11 g/L acétate, 6,92 g/L acide citrique et 45,0 g/L Dextrose. Cette solution a un pH de 1 ,08.
[0189] Solution 7: Tampon acetate à 0.1 M, pH 4,6
[0190] La solution de tampon acétate contient 11 ,4 mL d’acide acétique (MS-grade), 15,4 g d’ammonium acétate et 2 L d’eau ultra-pure.
[0191] Solution 8: Tampon HEPES à 0.010 M, pH 7,4 [0192] La solution de tampon contient 2.383 g HEPES (Sigma Aldrich) dans 1000 mL d’eau ultra-pure, le pH a été ajusté avec de la soude. [0193] Protocoles expérimentaux:
[0194] Protocole 1: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
[0195] L’éluant utilisé est le tampon acétate (solution 7), 10 pl_ d’échantillon sont injectés et élués à un débit de 0,8 mL/min. La colonne utilisée est une colonne SEC Polysep GFC- P 4000 et la détection est réalisée avec un détecteur UV aux longueurs d’onde 250 nm and 295 nm.
[0196] Protocole 2: High Pressure Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy (HPLC-MS)
[0197] L’éluant utilisé est le tampon acétate (solution 7 préparée avec des produits certifiés MS-Grade), le volume d’injection est de 10 pL et le débit est fixé à 0,4 mL/min. La colonne utilisée est une colonne SEC Polysep GFC-P 4000, l’HPLC est couplée à un spectromètre de masse (ICP-MS) pour la détection des isotopes recherchés.
[0198] Protocole 3: Expérience d’ultrafiltration à l’aide de tubes Vivaspin
[0199] Différents tubes de centrifugation Vivaspin ont été utilisés : Vivaspin 20 mL avec une membrane de seuil de coupure de 30 kDa ou Vivaspin 6 mL avec une membrane de seuil de coupure de 30 kDa ou de 10 kDa. Tout le matériel a été préalablement nettoyé avec une solution d’EDTA à 21 mM puis deux fois à l’eau ultra-pure (18,2 MW) pour éliminer toute trace de contamination métallique. La centrifugation a été réalisée à une vitesse de 4000 rpm pendant 10 min. Après chaque cycle de centrifugation, le liquide qui avait passé à travers la membrane a été collecté pour chaque échantillon, cette partie est appelé le sous- nageant, et les tubes de centrifugation ont été à nouveau remplis avec la solution initiale. Cela a été reproduit jusqu’à l’utilisation de la totalité de la solution initiale. Idéalement, au moins 1 mL de surnageant reste au-dessus de la membrane et est analysé par ICP-MS pour déterminer le facteur de concentration exact de l’expérience. [0200] Les échantillons de la solution initiale avant centrifugation, du sous-nageant et surnageant à la fin de l’expérience ont été analysés par ICP-MS. Les échantillons ont été dilués au moins par 10 avec une solution d’acide nitrique à 1%. Un standard interne (Indium) a été ajouté à chaque échantillon pour atteindre une concentration finale en indium de 2 ppb. Les analyses ont été effectuées en mode KED (Kinetic Energy Discrimination) avec un flux d’hélium dans la chambre. Les isotopes détectés sont les suivants : 208Pb, 206Pb, 111Cd, 112Cd, 114Cd, 63Cu, 65Cu, 27AI.
[0201] Une courbe de calibration entre 0,02 et 10 ppb de cadmium et 0,1 et 50 ppb de plomb a été réalisée. Cette calibration permet une conversion fiable du nombre de coups par secondes en concentration (ppb) pour chaque échantillon à l’aide du logiciel. [0202] Le principe d’une ultrafiltration Vivaspin est présentée en figure 1.
[0203] Exemple 1 : Chélation de Pb2+ et Cd2+ avec MexCDI et Peq@DOTAGA
[0204] Les échantillons ont été créés en utilisant la solution 8. A partir d’un mélange de métaux à 10 ppm de Pb2+ et Cd2+ dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science ainsi que les solutions 1 et 2 de polymères, six échantillons par polymère ont été créés et analysés par HPLC-MS suivant le protocole 2. La composition des échantillons est donnée dans le tableau 1.
[0205] [Tableau 1]
[0206] La figure 2 montre que le plomb et le cadmium sont captés par e produit polymère fonctionnalisé, MEXCD1, dans le domaine de concentration du ppb.
[0207] En effet, sur la figure 2, en ordonnée se trouve l’air du pic du polymère et en abscisse la concentration originale en métaux. La régression linéaire montre que la captation du plomb et du cadmium augmente de manière linéaire avec la quantité de polymère introduite (R2 supérieurs à 0,99). [0208] Les figures 2a et 2b ci-dessous sont les chromatogrammes HPLC/SEC couplée à l’ICP-MS pour la détection du plomb ou du cadmium. Les pics correspondent aux pics du polymère qui ont un temps de rétention aux alentours de 15 minutes. L’augmentation de l’aire du pic correspondant au polymère avec l’augmentation de la concentration initiale en plomb ou en cadmium illustre la captation de plus en plus forte du plomb et du cadmium en fonction des concentrations introduites.,
[0209] Exemple 2: Chélation du plomb Pb2+ par le MEX-CD1 dans les concentrés d’acide acétique et citrique
[0210] 77 ppb de Pb2+ ont été ajoutés à la solution 5 et 26 ppb de Pb2+ ont été ajoutés à la solution 6. Ces solutions, en plus des solutions 1 (MEX-CD1 à 10 g/L) et 7 (tampon acétate MS Grade) et d’eau ultra-pure, ont été utilisées pour créer différents environnements acides avec 0,1 g/L de MEX-CD1. La complexation a été testée dans trois conditions : dans l’acide concentrée (pH 2 pour l’acide acétique et pH 1 ,2 pour l’acide citrique), à pH 5 et à pH 7,4. Le pH a été ajusté avec de la soude et les échantillons ont été analysés par HPLC-MS suivant le protocole 2. La composition des échantillons est donnée dans les tableaux 2 et 3.
[0211] [Tableau 2]
[0212] [Tableau 3]
[0213] Les figures 3 et 4 montrent que le po ymère dispersé à 0, une solution représentative d’un concentré acide (à l’acide acétique ou à l’acide citrique) est efficace pour capter du plomb dès que le fluide de dialyse commence à se formuler. A pH
5 et 7,4, une grosse partie du plomb est ainsi déjà captée et associée au polymère comme le montre le chromatogramme d’HPLC/SEC-ICP-MS (détection Pb) avec l’augmentation du pic au temps de rétention de 15 min correspondant au polymère. G0214Ί Exemple 3: Chélation du plomb Pb2+ par le Peq@DOTAGA dans les concentrés d’acide acétique et citrique
[0215] 77 ppb de Pb2+ ont été ajoutés à la solution 5 et 26 ppb de Pb2+ ont été ajoutés à la solution 6. Ces solutions, en plus des solutions 2 (Peg@DOTAGA à 10 g/L) et 7 (tampon acétate MS Grade) et d’eau ultra-pure, ont été utilisées pour créer différents environnements acides avec 0,1 g/L de Peg@DOTAGA. La complexation a été testée dans trois conditions : dans l’acide concentrée (pH 2 pour l’acide acétique et pH 1 ,2 pour l’acide citrique), à pH 5 et à pH 7,4. Le pH a été ajusté avec de la soude et les échantillons ont été analysés par HPLC-MS suivant le protocole 2. La composition des échantillons est donnée dans les tableaux 4 et 5.
[0216] [Tableau 4] [0217] [Tableau 5]
[0218] Les figures 5 et 6 montrent que le po ymère dispersé à 0, une solution représentative d’un concentré acide (à l’acide acétique ou à l’acide citrique) est efficace pour capter du plomb dès que le fluide de dialyse commence à se formuler. A pH
5 et 7,4, une grosse partie du plomb est ainsi déjà captée et associée au polymère comme le montre le chromatogramme d’HPLC/SEC-ICP-MS (détection Pb) avec l’augmentation du pic au temps de rétention de 17 min correspondant au polymère.
[0219] Exemple 4: Chélation du plomb Pb2+ par le MEX-CD1 via Ultrafiltration
[0220] Les échantillons ont été préparés à partir d’eau ultra-pure, de la solution 1 et d’une solution mère de Pb2+ à 50000 ppm dans l’acide nitrique HNO3 5% pour obtenir un échantillon d’un volume total de 100 mL. En suivant le protocole 3, 90 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les Vivaspin 20 mL avec un seuil de coupure de 30 kDa. Le volume du surnageant final était d’environ 10 mL d’où une concentration par un facteur 9 de l’échantillon initial. La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans le tableau 6.
[0221] [Tableau 6]
[0222] Le chromatogramme c ’HPLC/SEC-ICP-MS (détection Pb) de la figure 7 corresponc à une concentration initiale de l’ordre de 5 ppb en plomb et à une purification par filtration tangentielle à travers une membrane de 30 kDa. Si 10 mg/L de MEX-CD1 sont mis en solution, 8 fois moins de plomb passe à travers la membrane en comparaison avec la même expérience réalisée sans MEX-CD1. Le produit montre une efficacité à des concentrations très basses (0,1 ppb). [0223] Exemple 5: Chélation de métaux à l’état de traces par le MEX-CD1 via
Ultrafiltration
[0224] Deux solutions métalliques achetées chez SCP Science, une de fer à 1000 ppm dans 5% HNChet un mélange de différentes métaux (Al2+, Mn2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+) à 10 ppm dans 5% HNO3, ont été utilisées en plus de la solution 1 et d’eau ultra-pure pour créer les échantillons ayant un volume final de 800 mL. Selon le protocole 3, environ 350 mL de chaque échantillon ont été centrifugés à travers les Vivaspin 20 mL possédant une membrane de seuil de coupure de 30 kDa. Le volume du surnageant final est d’environ 10 mL soit une reconcentration par un facteur 35 de l’échantillon initial. La composition des échantillons est donnée dans le tableau 7. [0225] [Tableau 7] [0226] Les figures 8 et 9 mettent en évidence une efficacité de captation dès 0,05 ppb (50 ppt) pour le plomb et le cadmium par mesure ICP/MS. Le manganèse et le cuivre sont également captés. Avec le plomb, même dans le domaine de 0,01 ppb, une efficacité de captation est observée. [0227] Exemple 6: Chélation du Pb2+ par le Peq@DOTAGA via Ultrafiltration
[0228] Les échantillons ont été préparés à partir de la solution 2, d’eau ultra-pure et d’une solution de Pb2+ à 50000 ppm dans IΉNO35% achetée chez SCP Science, le volume final de l’échantillon est de 100 mL. Selon le protocole 3, 99 mL de chaque échantillon ont été centrifugés à travers les Vivaspin 6 mL possédant une taille de pores de 10 kDa. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration par un facteur 99 de l’échantillon initial. La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans le tableau 8.
[0229] [Tableau 8] [0230] La figure 10 montre l’efficacité du produit PEG@DOTAGA pour capter du plomb dans le domaine du ppb. Pour une concentration initiale en plomb comprise entre 0,5 et 10 ppb, après les expériences d’ultrafiltration, on mesure une concentration en solution du surnageant de 10 à 20 fois supérieure en plomb par ICP/MS. On a donc surconcentré en plomb la solution et séquestré une partie du plomb pour l’empêcher de passer la membrane poreuse.
[0231] Exemple 7: Chélation de métaux à l’état de traces par le MEX-CD1 en situation de dialyse par Ultrafiltration
[0232] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca2+ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui de la dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al2+, Mn2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, and Zn2+) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final de 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de seuil de coupure de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.
[0233] Cette situation présente des conditions proches des conditions de dialyse en termes de concentrations ioniques, ce qui est particulièrement important car le calcium Ca2+ a de fortes interactions avec le chélateur DOTAGA. Les concentrations en Ca2+ dans le sang et dans le dialysat sont proches de 100 mg/L.
[0234] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 9 et 10. [0235] [Tableau 9]
[0236] [Tableau 10]
[0237] La figure 11 montre la captation plomb en fonction de la concentration originale en plomb. Lorsque le polymères MEX-CD1 est placé à une concentration de 100 mg/mL, une rétention des métaux lourds est possible même en présence de 100 ppm de calcium et lorsqu’ils sont placés à l’état de traces à une concentration inférieure au ppb.
[0238] Exemple 8: : Chélation de métaux à l’état de traces par le Peq@DOTAGA en situation de dialvse par Ultrafiltration
[0239] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca2+ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui de dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al2+, Mn2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, and Zn2+) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.
[0240] Cette situation présente des conditions proches des conditions de dialyse en termes de concentrations ioniques, ce qui est particulièrement important car le calcium Ca2+ a de fortes interactions avec le chélateur DOTAGA. Les concentrations en Ca2+ dans le sang et dans le dialysat sont proches de 100 mg/L.
[0241] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 11 et 12. [0242] [Tableau 11]
[0243] [Tableau 12]
[0244] La figure 12 montre qu’en présence de 100 ppm de calcium, le produit Peg@DOTAGA ajouté à 100 mg/L est capable de séquestrer du plomb et du cadmium, même à des faibles teneurs initiales entre 0,1 et 1 ppb. Ainsi par rapport à la référence (sans le produit) à une concentration initiale autour de 1 ppb en plomb ou en cadmium, il est possible de faire passer à travers la membrane près de 10 fois moins de plomb (9,15 fois moins de plomb dans le sous-nageant) et près de deux fois moins de cadmium (1,69 fois moins de cadmium dans le sous-nageant). [0245] Exemple 9: Chélation de métaux à l’état de traces par le Peq@EDTA en situation de dialvse par Ultrafiltration
[0246] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca2+ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui 5 de dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al2+, Mn2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, and Zn2+) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une 10 reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.
[0247] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 13 et 14.
[0248] [Tableau 13]
[0249] [Tableau 14]
15 [0250] La figure 13 montre qu’en présence de calcium, le produit PEG@EDTA capte également une partie du plomb et du cadmium et l’empêche de passer la membrane de diafiltration et surconcentre la solution surnageante, entre 0,1 et 1 ppb. Ainsi à 0,1 ppb en cadmium ou 0,2 ppb en plomb et en présence de 100 ppm de calcium, après un cycle de diafiltration, le surnageant a été concentré par 4,4 en cadmium et par 9,5 en plomb.
20 G025P Exemple 10: Chélation de métaux à l’état de traces par le Peq@DTPA en situation de dialyse par Ultrafiltration [0252] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca2+ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui de dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al2+, Mn2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, and Zn2+) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.
[0253] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 15 et 16
[0254] [Tableau 15]
[0255] [Tableau 16] intéressante pour séquestrer le plomb et le cadmium, même en présence de 100 ppm de calcium.
[0257] Exemple 11: Stabilité des polymères en milieu acide
[0258] Les figures 15 et 16 montrent que le produit peut être dispersé directement dans un concentré acide pour être utilisé. Ainsi 1 g/L de MEX-CD1 et 1 g/L de PEG@DOTAGA ont été mis dans une solution similaire à un concentré acide de type acide citrique et sels. Après plusieurs semaines de stockage, aucune modification du produit n’est observée, le produit ne semble pas s’être dégradé et conserve sa capacité de captation (testée ici au cuivre) après 3 semaines. [0259] Exemple 12 : Complexation du Cd2+ et Pb2+ par le PEG-DOTA en milieu acide
[0260] Le PEG-DOTA a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 1 g/L. Les solutions standards de plomb et cadmium à 1000 ppm dans l’acide nitrique 5% (achetées chez SCP Science) ont été diluées par 2000 dans l’acide chlorhydrique 0,01 M. [0261] Le PEG-DOTA a été dilué à 10 mg/L dans le tampon acétate dilué (0,01 M acétate d’ammonium et 0,01 M d’acide acétique) et 1 ppb de chacun des métaux (Pb et Cd) a été ajouté à l’échantillon. Le pH a été ajusté avec de l’acide chlorhydrique à 0,1 M ou 1M pour atteindre pH 4, 3, 2 ou 1.
[0262] L’analyse HPLC-MS des échantillons montre que le PEG-DOTA à 10 mg/L est capable de complexer le cadmium aux 4 pH testés. En considérant que l’aire totale des pics de cadmium libre et lié au polymère correspond à la quantité totale de métal ajouté, le PEG- DOTA est capable de complexer plus de 26% du cadmium aux pH 1 et 2. Ce pourcentage atteint 50% et 100% à pH 3 et 4 respectivement (Figure 17). Concernant le plomb, aucun pic n’est visible à pH 1 (non représenté ici) alors qu’on observe un pic de plomb lié au polymère à 17 min aux pH 2, 3 et 4 ce qui confirme la captation du plomb par le PEG-DOTA (Figure 18).
[0263] Exemple 13 : Complexation de l’aluminium par le PEG-DFO en présence de citrate
[0264] Le PEG-DFO lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L. La solution standard d’Aluminium à 1000 ppm dans l’acide nitrique 5% (acheté chez
SCP Science) a été diluée par 200 dans l’acide chlorhydrique 0,01 M. Une solution d’acide citrique à 2.0 mM a été préparée dans l’eau ultra-pure. Les échantillons ont été préparés dans un tampon acétate (0,1 M acétate d’ammonium et 0,1 M d’acide acétique, pH 4,6).
[0265] Le PEG-DFO a été dilué à 0,1 g/L dans le tampon acétate et 100 ppb d’aluminium ont été ajoutés à l’échantillon. Lorsque les échantillons contenaient du citrate, celui-ci a été ajouté en premier puis l’aluminium et enfin le polymère afin d’étudier la capacité du PEG- DFO à extraire l’aluminium déjà complexé par le citrate. Les échantillons ont été analysés par HPLC-MS pour observer la répartition de l’aluminium sur les différentes espèces présentes (PEG-DFO, citrate ou aluminium libre). L’analyse par HPLC-MS a montré un pic d’aluminium lié au polymère à un temps de rétention de 17 min et un très faible pic d’aluminium libre à 24 min, ce qui confirme la complexation de l’aluminium par le polymère (Figure 19). En considérant que l’aire totale des pics d’aluminium libre et lié au polymère (auquel l’aire du polymère sans ajout d’aluminium a été soustraite) correspond au 100 ppb de métal ajouté, le PEG-DFO est capable de complexer plus de 85% de l’aluminium. En présence de citrate à 20 mM et de PEG-DFO 0,1 g/L, on observe un transfert de l’aluminium du citrate (pic à 22 min) vers le polymère (pic à 17 min) (Figure 20). Comme précédemment, si on considère l’aire totale réelle des pics (polymère, citrate et métal libre) comme étant 100 ppb d’aluminium, le PEG-DFO est capable de capter 45% de l’aluminium total et de capturer plus de 90% de l’aluminium complexé par le citrate. [0266] Exemple 14 : Extraction de l’Aluminium complexé par l’EDTA par le PEG-DFO
[0267] Le PEG-DFO lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L. La solution standard d’Aluminium à 1000 ppm dans l’acide nitrique 5% (acheté chez SCP Science) a été diluée par 200 dans l’acide chlorhydrique 0,01 M. Une solution d’EDTA à 8 mM a été préparée dans l’eau ultra-pure. Les échantillons ont été préparés dans une solution tamponnée d’Hémosol B0 dilué par 100. Des échantillons références de polymère sans aluminium et d’aluminium complexé par 1.1 équivalent molaire d’EDTA, i.e. 1.189 ppm d’EDTA, sans polymère ont été préparés. La composition des différents échantillons est détaillée en tableau 17.
[0268] [Tableau 17] [0269] Lors de l’expérience, le polymère a été ajouté dans une solution contenant déjà l’aluminium et l’EDTA. Après un temps d’incubation de 30 min, les échantillons sont centrifugés dans des tubes Vivaspin 20 (4000 rpm, cycle de 10 min). Ces tubes possèdent une membrane de 30 kDa ce qui permet de retenir le polymère au-dessus de la membrane grâce à sa taille supérieure à 30 kDa et de laisser passer les petites espèces telles que l’EDTA et l’aluminium libre. Selon le protocole 3, après chaque cycle de centrifugation, le sous-nageant est récupéré et le tube est complété à nouveau jusqu’à 20 mL avec la solution initiale, et cela jusqu’à que les 100 mL de solution initiale soient centrifugés et que 20 mL d’échantillon soit récupéré dans le surnageant. Tous les échantillons (solution initiale, surnageant et sous-nageant) ont ensuite été analysés par ICP-MS pour déterminer la concentration en aluminium dans chaque fraction (Tableau 18). Pour les deux échantillons contenant le polymère, la surconcentration de l’aluminium dans le surnageant par rapport à la solution initiale met en évidence la capture de l’aluminium par le polymère (Tableau 18 et Figure 21). De plus, la concentration en aluminium dans le sous-nageant est réduite en présence de polymère ce qui confirme la capacité du PEG-DFO à capter l’aluminium à faible concentration en présence d’EDTA (1 à 2 ppm) (Figure 21). En effet, dans une solution à pH 6 contenant 100 ppb d’aluminium et environ 1 ppm d’EDTA, 0.1 g/L de PEG- DFO peut extraire plus de 50 % de l’aluminium (Figure 22). [0270] [Tableau 18]

Claims

Revendications
[Revendication 1] Fluide de dialyse, comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l'aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant présent dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L.
[Revendication 2] Fluide de dialyse selon la revendication 1, caractérisée en ce que le métal est choisi parmi les métaux lourds tels que le plomb ou le cadmium.
[Revendication 3] Fluide de dialyse selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’agent chélatant est choisi dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, DTPA, EDTA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA, et de manière plus préférée le DOTAGA.
[Revendication 4] Fluide de dialyse selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide statistique portant au moins un agent chélatant.
[Revendication 5] Fluide de dialyse selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide statistique de formule I :
[Chem. 1]
Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisi parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.
[Revendication 6] Fluide de dialyse selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le polymère est un polymère biocompatible, par exemple de type polyéthylène glycol (PEG).
[Revendication 7] Procédé de préparation d’un fluide de dialyse, selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’elle comprend une étape de dilution avec de l’eau d’une solution concentrée ou d’un additif pour solution concentrée pour dialyse, de préférence une solution concentrée acide comprenant, en plus du polymère, une quantité suffisante d’acide acétique, d’acide chlorhydrique, ou d’acide citrique.
[Revendication 8] Procédé de préparation d’un fluide de dialyse selon la revendication 7, caractérisé en ce que la solution concentrée comprend un ou plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium ou le calcium, et des bicarbonates.
[Revendication 9] Procédé de préparation d’un fluide de dialyse selon l’une des revendications 7 à 8, caractérisé en que la solution est concentrée conditionnée dans une poche adaptée pour un dispositif de dialyse, de préférence une poche contenant un volume de solution compris entre 500 et 5000 ml_, et une quantité dudit polymère comprise entre 5 et 5000 mg et de préférence entre 10 et 100 mg.
[Revendication 10] Méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, présent dans un fluide de dialyse, comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, permettant ainsi la captation dudit métal toxique par chélation avec l’agent chélatant dudit polymère.
[Revendication 11] Méthode de captation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le métal toxique est l’aluminium.
[Revendication 12] Méthode de captation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le métal toxique est le plomb et que la concentration dans le fluide de dialyse est inférieure à 0,1 ppb.
[Revendication 13] Méthode de captation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le métal toxique est le cadmium et que la concentration dans le fluide de dialyse est inférieure à 0,01 ppb.
[Revendication 14] Méthode de captation selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce qu’au moins 120L de fluide de dialyse est utilisé dans une dialyse d’un patient.
[Revendication 15] Méthode de captation selon l’une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que le fluide de dialyse est introduit dans un réservoir d’un dispositif de dialyse, susceptible d’être connecté à un dispositif de circulation sanguine extracorporel comprenant une membrane de dialyse poreuse.
[Revendication 16] Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que le seuil de coupure de la membrane poreuse est inférieur à la taille du polymère.
[Revendication 17] Utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 10OOkDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium pour préparer une composition pour dialyse, par exemple pour hémodialyse, hémodiafiltration ou hémofiltration, en particulier une composition selon l’une des revendications 1 à 6.
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