EP4367267A2 - Procede et kit de detection d'un virus respiratoire replicatif - Google Patents

Procede et kit de detection d'un virus respiratoire replicatif

Info

Publication number
EP4367267A2
EP4367267A2 EP22751137.5A EP22751137A EP4367267A2 EP 4367267 A2 EP4367267 A2 EP 4367267A2 EP 22751137 A EP22751137 A EP 22751137A EP 4367267 A2 EP4367267 A2 EP 4367267A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
level
transcripts
marker gene
subject
replicative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22751137.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sophie ASSANT
Karen Brengel-Pesce
Marine MOMMERT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Biomerieux SA
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Hospices Civils de Lyon HCL, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP4367267A2 publication Critical patent/EP4367267A2/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/0045—Devices for taking samples of body liquids
    • A61B10/0051—Devices for taking samples of body liquids for taking saliva or sputum samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of diagnostic methods and kits.
  • the subject of the invention is methods and kits making it possible to determine whether or not a subject is suffering from an infection by a replicative respiratory virus.
  • a PCR test only detects fragments of the DNA or RNA genome of the virus, and therefore the presence of a virus which is not active, that is to say which has not the ability to replicate in the subject's organism.
  • the presence of symptoms in particular that can be described as mild (or weak), which could be associated with many infections, viral or bacterial, is also not a sign of the presence of a replicative respiratory virus.
  • symptoms in particular that can be described as mild (or weak), which could be associated with many infections, viral or bacterial, is also not a sign of the presence of a replicative respiratory virus.
  • it is sometimes difficult to associate symptoms such as fever, suspecting an infection, with the presence of a directly responsible replicating respiratory virus.
  • Application WO 2019/236768 also proposes a method for detecting a respiratory infection in a subject, based on the level of expression of one or more genes of the subject (host gene).
  • a very long list of host genes is given, among which certain ISGs appear, including IFIT1, IFIT2, IFIT3 and RSAD2, without these being presented as particularly advantageous to select.
  • IFIT1, IFIT2, IFIT3 and RSAD2 include these being presented as particularly advantageous to select.
  • the fact of knowing whether or not the subject is infected by a replicative respiratory virus is in no way studied in this patent application.
  • the present invention relates to a method for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, comprising a step i) of determination, in a test sample from of the mouth or nose of said subject, of the level of transcripts of at least one marker gene selected from the genes stimulated by interferons, known as ISG (hereinafter called ISG marker gene, or more simply marker gene or ISG, for the sake of simplicity).
  • ISG marker gene hereinafter called ISG marker gene, or more simply marker gene or ISG, for the sake of simplicity.
  • the level of transcripts of one or more marker genes chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15, and SIGLEC1 is determined.
  • the level of transcripts of all these marker genes can be determined.
  • the level of transcripts of one or more marker genes chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 is determined.
  • the level of transcripts of all the marker genes IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 is determined.
  • the level of transcripts can be determined for each marker gene independently, or a simultaneous determination of the different transcripts of all the marker genes used, the level of which is globally determined.
  • data in particular a score as used in the examples
  • the test sample is an oropharyngeal or nasopharyngeal sample or a saliva sample.
  • step i) consists of determining the mRNA level of the said marker gene(s).
  • the methods according to the invention can be implemented on a sample from a subject who exhibits symptoms of an infection, or on a sample from a subject who is asymptomatic.
  • the method according to the invention is particularly advantageous, in the case of asymptomatic subjects or of subjects presenting symptoms which can be qualified as benign, such as fatigue, body aches, muscle pain, fever, respiratory symptoms, including cough without pneumonitis, headache, sore throat, malaise, nausea, vomiting, diarrhea, anosmia, or ageusia.
  • the test sample can be obtained or taken at any time.
  • the test sample may be obtained or collected before or after the onset of symptoms.
  • the test sample can come from any type of subject, from a subject who has or has not been diagnosed with a respiratory virus, from a subject who is awaiting a result of detection or diagnosis of a respiratory virus, in particular by detection of DNA or RNA of said virus...
  • the methods according to the invention can be carried out on a sample from a subject who does not have neutralizing autoantibodies directed against the interferon a and/or neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • the method according to the invention may comprise the following steps: i) determining the level of transcripts of at least one marker gene chosen from among the ISGs, for said test sample of the subject, ii) comparing the level of transcripts of said at least obtained marker gene, at a reference level.
  • the methods according to the invention comprise a step iii) which is to conclude on the presence or not of an infection by a replicative respiratory virus in said subject. Such a conclusion is made using at least one threshold value.
  • threshold value is meant a predetermined value which is relevant for draw a conclusion as to the presence or absence of an infection by a replicative respiratory virus in a subject.
  • a comparison is carried out between a threshold value and the level of transcripts of at least one ISG marker gene determined for the test sample of said subject, or with data (in particular a score) obtained from the level of transcripts of at least an ISG marker gene determined for the test sample of said subject.
  • Said data (or score) can, in particular, be obtained from the levels of transcripts of several ISG marker genes determined for the test sample of said subject.
  • the level of transcripts of at least one ISG marker gene determined for the test sample of said subject or the data or the score obtained from the level of transcripts of at least one gene ISG marker determined for the test sample of said subject, is different, in particular greater than the threshold value, it is concluded that there is an infection by a replicative respiratory virus in said subject.
  • step iii) it can be concluded that there is or is not an infection by a replicative respiratory virus in said subject, from the result of step ii), that is to say the comparison between the level of transcripts of said at least one marker gene obtained, and the reference level of said marker gene which then plays the role of threshold value.
  • the level of transcripts of a single ISG marker gene is determined.
  • the transcript level of several ISG marker genes is determined globally and this global level is compared to a global reference level.
  • the reference level used as a threshold value, with which the level of transcripts of a marker gene is compared corresponds to the level of transcripts of said marker gene, in a reference subject, and in particular in a subject not infected with a replicative respiratory virus, or in a population of such subjects.
  • Subjects not infected with a replicative respiratory virus include subjects who test positive for the presence of a respiratory virus, but for whom the virus is not replicative, and subjects not infected with a respiratory virus ( negative to a test for the presence of a virus respiratory).
  • the reference level corresponds to the level of transcripts of said marker gene, in a subject showing no infection by a replicative respiratory virus, whether or not he is positive for a test for detecting a respiratory virus, and who, preferably does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or neutralizing autoantibodies directed against interferon w, or else the reference level corresponds to the level of transcripts of said marker gene in a population of such subjects showing no infection by a replicative respiratory virus, whether or not they are positive for a detection test for a respiratory virus, and who preferably do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • the level of transcripts of a single marker gene chosen from among the ISGs can be determined in step i) and it is concluded that the presence of an infection by a virus replicative respiratory in said subject in the event of a difference with the reference level of said marker gene.
  • the invention relates to a method for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus comprising the following steps: i) determining the level of transcripts of a single selected marker gene among the ISGs, in a test sample from the mouth or nose of said subject, ii) comparing the level of transcripts of said marker gene obtained, with a reference level, used as a threshold value, said reference level being the level of transcripts of said marker gene, in a reference subject, and in particular in a subject not infected with a replicative respiratory virus, who preferably does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or d neutralizing autoantibodies directed against interferon w, or in a population of such subjects, and iii) concluding the presence of an infection by a replicative respiratory virus in said subject in the event of a difference with said reference level of said marker gene.
  • said difference corresponds to a level of transcripts of said marker gene for the test sample which is higher than that of the reference level.
  • said marker gene selected from among the ISGs is preferably NFIT1 or NFI44L.
  • step i) the transcript levels of several marker genes selected from among the ISGs can be determined in step i), for the test sample, and
  • the level of transcripts of each marker gene determined for the test sample can be compared with the reference level of the said corresponding marker gene.
  • the invention relates to a method for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus comprising the following steps: i) determining the levels of transcripts of several marker genes selected from among the ISGs for the test sample, in a test sample originating from the mouth or nose of said subject, ii) comparing the level of transcripts of each marker gene determined in the test sample with a reference level corresponding to said marker gene , used as a threshold value, for each marker gene considered, said reference level being the level of transcripts of said marker gene, in a reference subject, and in particular in a subject not infected with a replicative respiratory virus, which, preferably does not have neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or neutralizing autoantibodies directed against interferon w, or in a population of te ls subjects, and iii) concluding the presence of an infection by a replicative respiratory virus in said subject, in the event of a difference with the
  • the level of transcripts of one or more marker genes chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 , and SIGLEC1 is determined.
  • the level of transcripts of all these marker genes can be determined.
  • the level of transcripts of one or more marker genes chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 is determined.
  • the level of transcripts of all the marker genes IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 is determined.
  • step iii) it can be concluded that there is or is not an infection by a replicative respiratory virus in said subject, by implementing a intermediate step iibis) leading to data obtained from the level of transcripts of at least one marker gene selected from the ISGs, for the test sample.
  • a comparison step ii) may be carried out during which the level of transcripts of each ISG marker gene is compared with a reference level of said marker gene, this comparison taking in particular the form of calculating a ratio, in particular the ratio between said level of transcripts of each marker gene on a reference level of said marker gene.
  • An intermediate step iii) can then be carried out: this step can consist of calculating a score representative of the results of the comparisons carried out for each marker gene.
  • a score is, for example, the median of all the ratios obtained (in particular, level of transcripts of each ISG marker gene for the test sample/reference level corresponding to said marker gene).
  • the conclusion can then be made by comparing this score with a threshold value, in particular of 1.5, to conclude that there is or is not the presence of an infection by a replicative respiratory virus in the subject of interest. If the score obtained for the test sample is higher than this threshold value, in particular by 1.5, it will be concluded that there is presence of an infection by a replicative respiratory virus.
  • the level of transcripts of one or more marker genes chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15, and SIGLEC1 is determined.
  • the level of transcripts of all these marker genes can be determined.
  • the level of transcripts of one or more marker genes chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 is determined.
  • the level of transcripts of all the marker genes IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 is determined.
  • a method for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a respiratory virus replicative comprising the following steps: i) determining the levels of transcripts of several marker genes selected from among the ISGs, in a test sample from the mouth or nose of said subject, ii) comparing the level of transcripts of each marker gene determined in the test sample with a reference level corresponding to said marker gene, with calculation of the ratio between said level of transcripts on said reference level of said marker gene, iibis) calculating the median of all the ratios obtained in step ii), and iii ) conclude on the presence of an infection by a replicative respiratory virus in said subject, when said median calculated in step iibis) is greater than a threshold value, which is preferably equal at 1.5.
  • the value of 1.5 can thus be considered as the threshold value used to issue the conclusion that there is or is not the presence of an infection by a replicative respiratory virus.
  • the reference level used for the calculation of the ratio is the level of transcripts of said marker gene, in a subject not infected with a respiratory virus, or in a population of such subjects, said marker gene.
  • a subject not infected with a respiratory virus is, in particular, a subject negative for a test for detecting the presence of a respiratory virus.
  • the reference level used for calculating the ratio is the level of transcripts of said marker gene, in a subject not infected with a respiratory virus, not possessing neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/ or neutralizing autoantibodies directed against interferon w or in a population of such subjects.
  • the methods according to the invention can also comprise a step carried out before or concomitantly with step i), during which the test sample is subjected to a diagnostic test, for detection of DNA or RNA, in particular by PCR or RT-PCR, of a respiratory virus, and in particular of a SARS-CoV-2 virus.
  • a diagnostic test for detection of DNA or RNA, in particular by PCR or RT-PCR, of a respiratory virus, and in particular of a SARS-CoV-2 virus.
  • said diagnostic test is carried out prior to step i) and gives a positive result.
  • the test sample is subjected to a diagnostic test, by detection of DNA or RNA, in particular by PCR or RT-PCR, of a respiratory virus chosen from the SARS-CoV-2 virus and its variants and the influenza viruses, in particular influenza A, B and C, said diagnostic test having given a positive result.
  • a diagnostic test can also be implemented, prior to or concomitantly with step i), and the positive or negative result can be obtained before or after the determination of the presence or absence in said subject, of infection with a replicative respiratory virus.
  • the determination of the level of transcripts of the marker gene(s) is carried out, in particular at the mRNA level.
  • the determination of the level of transcripts is, in particular, carried out by hybridization, amplification or sequencing, and in particular by RT-qPCR.
  • the level of transcripts of the marker gene(s) obtained can be a normalized value with respect to the level of transcripts of one or more housekeeping genes, in particular chosen from DECR1, HPRT1 and PPIB.
  • the present invention also relates to a kit for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, comprising:
  • At least one threshold value stored on a medium readable by a computer and/or used in the form of a code executable by a computer configured to compare the level of transcripts of said marker gene, determined using the determination means or data obtained from said level of marker gene transcripts to said threshold value.
  • the kit will generally include at least one means of determining the level of transcripts for each of them.
  • the kit can comprise a threshold value and/or a reference level for each of them, stored(s) on a medium readable by a computer and/or used(s) in the form of code executable by a computer.
  • the kit can also comprise an executable code making it possible to generate a global reference datum, from the comparison of each marker gene with its reference datum and allowing a comparison of this global datum with a threshold value.
  • the comparison of the level of each marker gene to its reference level can take the form of calculating a ratio, as previously explained.
  • said threshold value corresponds to the level of transcripts of said marker gene in a subject not exhibiting any infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w, or in a population of subjects exhibiting no infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or do not have neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • such a kit according to the invention further comprises at least one reference level for said marker gene, stored on a computer-readable medium and/or used in the form of a code executable by a computer configured to compare the level of transcripts of the marker gene determined by means of determining said reference level, with said reference level which is, preferably, the level of transcripts of said marker gene, in an uninfected subject by a respiratory virus, or in a population of such subjects.
  • at least one reference level for said marker gene stored on a computer-readable medium and/or used in the form of a code executable by a computer configured to compare the level of transcripts of the marker gene determined by means of determining said reference level, with said reference level which is, preferably, the level of transcripts of said marker gene, in an uninfected subject by a respiratory virus, or in a population of such subjects.
  • kits according to the invention further comprise at least one means for detecting a respiratory virus, and in particular at least one means for detecting a SARS-CoV-2 virus and/ or at least one means of detecting the influenza virus (influenza A, B or C).
  • the present invention also relates to a kit for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, comprising:
  • At least one means for detecting a respiratory virus and in particular at least one means for detecting a SARS-CoV-2 virus.
  • such a kit further comprises at least one threshold value stored on a computer-readable medium and/or used in the form of code executable by a computer configured to compare the level of transcripts said marker gene determined by the determining means, or data obtained from said transcript level of the marker gene, at said threshold value.
  • said threshold value corresponds to the level of transcripts of said marker gene in a subject not exhibiting any infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon has and/or does not possess self- neutralizing antibodies directed against interferon w, or in a population of subjects showing no infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or do not possess no neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • such a kit according to the invention further comprises at least one reference level for said marker gene, stored on a computer-readable medium and/or used in the form of a code executable by a computer configured to compare the level of transcripts of the marker gene determined by means of determining said reference level, with said reference level which is, preferably, the level of transcripts of said marker gene, in a subject not infected with a respiratory virus, or in a population of such subjects.
  • the detection kits according to the invention may also comprise a negative control sample, such as a sample making it possible to ensure the absence of contamination, and/or a positive control sample which corresponds to the level of transcripts of said marker gene at a concentration representative of the level of transcripts of a subject having an infection by a replicative respiratory virus or in a population of subjects having an infection by a replicating respiratory virus.
  • a negative control sample such as a sample making it possible to ensure the absence of contamination
  • a positive control sample which corresponds to the level of transcripts of said marker gene at a concentration representative of the level of transcripts of a subject having an infection by a replicative respiratory virus or in a population of subjects having an infection by a replicating respiratory virus.
  • FIG. 3 Figure 3 shows the kinetic measurements of ISG NP (gray square) and blood (black square) scores after diagnosis of COVID-19.
  • n 75 longitudinal samples from 23 patients.
  • the Loess fit curves represent local polynomial regressions as determined by the Loess method.
  • the 95% Cl is indicated (grey area).
  • the black circles represent negative viral culture samples and the open circles the positive viral culture sample, the triangles correspond to positive samples in cell culture without cytopathic effect.
  • Figure 5 is an ROC (Receiver Operating Curve) curve distinguishing the results of positive and negative SARS-CoV-2 viral cultures. Area under the curve and Youden's index are shown and represent the ability of the NP ISG type l/lll score to separate positive and negative virus cultures.
  • ROC Receiveiver Operating Curve
  • FIG. 6 represents the type I/III nasal ISG score measured after serial dilutions at 1/10 (10° to 10 -2 ) of NP samples (solid line, FilmArray®) as well as the detection of SARS-CoV-2 (Ct detection, dashed line, SARS-CoV-2 R-gene® kit).
  • the lower gray zone indicates the threshold value of the nasal ISG type l/lll score known as normal (1.99) and the upper gray zone marks the value of 6.75 of the nasal ISG type l/lll score associated to a viral culture of a replicative virus.
  • FIG. 7 compares the normalized nasal viral load and the NP ISG type l/lll score in patients with severe COVID-19, without anti-IFN autoantibodies (nAb) (open circles) or with autoantibodies (nAb). - neutralizing antibodies directed against IFN-a (black triangles).
  • the gray area represents the viral load obtained for 90% of mild COVID-19 patients with a score nasal ISG type I/III > 6.75 (separation value associated with a viral culture of a replicative virus).
  • FIG. 8 is an ROC curve discriminating between the positive and negative result of the viral PCR for the IFN type l/III score.
  • the area under the curve, Youden's index and cut-off point are shown and represent the ability of the nasal IFN type I/III score to discriminate PCR positive from negative samples.
  • FIG. 10 highlights graphs representing (A) IFI27 mRNA expression level versus viral PCR, (B) IFI44L mRNA expression level versus viral PCR, ( C) RSAD2 mRNA expression level as a function of viral PCR and (D) IFIT1 mRNA expression level as a function of viral PCR.
  • the level of expression of the mRNAs is expressed in log2 of the ratio between the OR of the ISG and the median OR of this same ISG of a population of VS.
  • Figure 12 is an ROC curve discriminating between the positive and negative result of the viral culture of the influenza virus for the nasal IFN l/III score. The area under the curve, the Youden index and the cutoff point are shown and represent the ability of nasal IFN l/III score and viral load to differentiate between positive and negative cultures.
  • the term “subject” designates a mammal and, preferably, a human being.
  • Said subject, who is a human being can be a patient who has come into contact with a health professional, such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital or a clinic, and more particularly an emergency department, an intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • a health professional such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital or a clinic, and more particularly an emergency department, an intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • sample from a subject's mouth or nose it can be a sample taken from the subject's nose or mouth or an exhaust air sample. by the subject.
  • the sample may be a nasal sample or a saliva sample, but is preferably an oropharyngeal or nasopharyngeal sample.
  • Oropharyngeal or nasopharyngeal samples are obtained in particular by taking a sample using a swab, respectively at the back of the mouth or nose of a subject.
  • replicative virus is meant a virus which is capable of multiplying in said subject.
  • a subject infected with a replicative virus is a transmission vector for such a virus, to another subject.
  • the concept of replicative virus excludes virus fragments, which have lost their ability to reproduce. Such virus fragments will give a positive result, during a test for detecting the DNA or RNA of the virus, but do not have the capacity to replicate in the subject, who therefore cannot be a transmission vector of the corresponding virus.
  • the risk of transmission of the virus is high, which is not the case in the absence of the possibility of replication.
  • the capacity of a virus to multiply (replicate) and therefore its replicative character can be defined by the fact that the latter multiplies (increase in viral load), which can result in the observation of a cytopathic effect when it is cultured, or a part of the test sample taken which is likely to contain such a replicative virus is cultured, on epithelial cells, such as Vero cells.
  • Vero cells that are particularly suitable for testing the replication capacity of a virus are in particular those deposited under the ATCC number CCL-81®, or else the Vero E6 cells deposited under the ATCC number CRL-1586®.
  • a cytopathic effect can, in particular, be materialized by the presence of lysis plaques, which is characteristic of the presence of replicative viral particles.
  • a subject infected with a replicative virus is a transmission vector for such a virus to another subject
  • respiratory virus means a virus which infects the respiratory tract and/or the lungs. Such viruses are typically found in samples taken from the nose, throat and/or mouth of a subject, in particular in nasal or nasopharyngeal samples (which require a sample taken deeper in the nose), oral samples -pharyngeal (which requires a swab at the back of the throat) or saliva.
  • respiratory viruses include seasonal coronaviruses, the SARS-CoV-2 virus, whatever its variants, the influenza virus (influenza A, B and C), the respiratory syncytial virus (RSV ), rhinoviruses, metapneumoviruses, parainfluenza viruses and adenoviruses...
  • the Brazilian variant P.1 is a descendant of the B.1.1.28 lineage (which circulated extensively in the state of Rio de Janeiro and probably emerged in Brazil in February 2020).
  • This Brazilian P.1 variant contains numerous mutations, in particular the E484K, K417T and N501Y mutations.
  • the Japanese variant which derives from a lineage present in Brazil (B.1.1.28) contains a very high number of genetic changes. It has twelve amino acid mutations in the spike protein, including N501Y, E484K, K417T mutations.
  • the South African variant called 501Y.V2 (lineage B.1.351) also contains different mutations including three, K417N, E484K and N501Y, located in the RBD domain of the spike protein, the receptor binding domain.
  • the respiratory virus is chosen from the SARS-CoV-2 viruses, the influenza virus (influenza A, B and C), the respiratory syncytial virus (RSV), the rhinoviruses, the metapneumoviruses, parainfluenza viruses and adenoviruses, and preferably from among the SARS-CoV-2 viruses and its variants, and the influenza virus (influenza A, B and C).
  • the respiratory virus is chosen from the SARS-CoV-2 virus and its variants.
  • the respiratory virus is chosen from the influenza A, B and C viruses, preferably it is the influenza B virus.
  • Interferons are among the first molecules produced in the body, after recognition of a pathogen by the receptors of innate immunity. Interferons are widely described in the literature. Reference may be made, for example, to Manry J. et al., 2012 and Hertzorg PJ et al., 2016. Human IFNs have been classified into three types, depending on the receptors they use, their homology and their chromosomal location . There are 17 type 1 IFNs: 13 subtypes of IFN-a, and IFN-b, e, k and w. The genes encoding these IFNs are located on chromosome 9 and bind to the same receptor composed of the IFNAR1 and IFNAR2 subunits.
  • IFN-g the only type II IFN, is the product of a gene located on chromosome 12, and uses a receptor composed of IFN-yR1 and IFN-yR2 subunits.
  • Type III IFNs have been described more recently and correspond to the cytokines: IL-28A, IL-28B and IL-29 (also called IFN-A2, IFN-A3 and IFN-A1).
  • the genes encoding these IFNs are located on chromosome 19. Interferons regulate the expression of several hundred genes, the so-called interferon-stimulated genes (or ISGs).
  • IFNs interferon receptors
  • JFNARs interferon receptors
  • JNK1 Janus kinase 1
  • Tyk2 tyrosine kinase 2
  • IRF9 interferon-stimulated response elements
  • IFNARs interferon receptors
  • JNK1 Janus kinase 1
  • Tyk2 tyrosine kinase 2
  • IRF9 interferon-stimulated response elements
  • Secreted type III IFNs bind to another receptor, consisting of IFNLR and IL10RB, and yet activate the same ISGF-3, inducing widely overlapping ISGs (Lazear, H. M etal., 2019).
  • IFN-I and III are involved as the first line of defense against infection, since they promote virus clearance, induce tissue repair, and stimulate the adaptive immune response.
  • ISG genes By way of example of ISG genes, mention may be made of ADAR, BST2, CHUK, DDX58, EIF2AK2, FOS, GBP2, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, IFI35, IFI6, IFIH1 , IFIT2, IFIT3, IFITM1 , IFITM2, IFITM3, IFNA14/16, IFNA2, IFNA4/7/10/17/21 , IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNAR1 , IFNAR2, IFNB1 , IKBKB, IKBKE, IKBKG, IRF1, IRF3, IRF4 , IRF7, IRF9, JAK1 , JUN, MAP3K7, MAPK14, MAPK8, MAVS, MX1 ,
  • the ISGs chosen from IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 and SIGLEC1 are preferred in the context of the invention. Their sequences are given in the ENSEMBL and NCBI databases. These ISGs are, in particular, stimulated by type I and III interferons.
  • IFI27, IFI44L, RSAD2 and IFIT 1 which are four ISGs regulated through ISRE elements dependent on IFN-stimulated gene factor 3 (ISGF3), are even more preferred within the scope of the invention.
  • the level of transcripts of one or more marker genes of the ISG type chosen from: IFI27, IFI44L, IFIT 1, RSAD2, ISG15, and SIGLEC1 (Picard C, etal., 2018).
  • neutralizing antibody an antibody which neutralizes the effect of the target against which it is directed.
  • auto-antibodies antibodies generated by the subject himself directed against self-proteins. Such autoantibodies can be generated in the absence of infection.
  • symptom means any type of symptom, for example symptoms which may be qualified as mild, such as fatigue, body aches, fever, respiratory symptoms, such as cough without pneumopathy, headache, anosmia or ageusia, or even severe symptoms, which require hospitalization in intensive care or respiratory assistance.
  • SARS-CoV-2 a classification of SARS-CoV-2 infections (for people who test positive for SARS-CoV-2, by PCR test or antigen test), asymptomatic to critical was established based on symptoms (Trouillet-Aimpuls, S. etal., 2020 and https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/overview/clinical-spectrum/):
  • the methods according to the invention can be implemented on samples from subjects having an infection with SARS-CoV-2, which is asymptomatic, presymptomatic, benign or moderate.
  • a “comparison” or a verification of a “difference” between two values or levels can be carried out by any known technique, and in particular by any automated technique, carried out by a computer or assisted by a computer. Comparing or verifying a “difference” may involve calculating a ratio or a difference.
  • the issue of a conclusion as to the presence or not of an infection by a replicative respiratory virus in the subject from which the test sample originates, can also be carried out by any automated, computer-implemented or computer-assisted technique.
  • the “median” of a set of values is the value located in the middle of the lowest value and the highest value of the set of values.
  • test for detecting a respiratory virus diagnostic test for a respiratory virus or test for detecting the presence of an infection by a respiratory virus, is meant any test known to those skilled in the art making it possible to bring such a conclusion, in particular tests for detecting the DNA or RNA of said respiratory virus, in particular PCR tests or even antigenic tests.
  • the invention proposes to use the level of transcripts of at least one marker gene selected from the genes stimulated by interferons, called ISG, determined in a test sample from the mouth or nose of a subject, to determine whether or not said subject has a replicative respiratory virus infection.
  • the invention proposes methods for determining in vitro or ex vivo the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, comprising a step i) of determination, in a test sample originating from the mouth or nose of said subject, the level of transcripts of at least one marker gene selected from the genes stimulated by interferons, called ISG.
  • the level of transcripts of at least one marker gene selected from among the genes stimulated by interferons, called ISGs is used to determine whether or not said subject is suffering from an infection by a replicative respiratory virus. .
  • a conclusion as to the possible presence of an infection by a replicative respiratory virus in said subject is delivered by taking into account the level of transcripts of a gene ISG marker, or even several levels of transcripts of different ISG marker genes.
  • the conclusion can be made on this sole basis (i.e. from the level of transcripts of a single ISG marker gene or from several levels of transcripts of different ISG marker genes) or by taking into account other genes than ISGs, although this is not preferred within the scope of the invention.
  • the determination of the level of transcripts is done by quantitative detection of one or more transcript(s) of the gene, and in particular of the messenger RNA (mRNA) type, in the sample of interest ( whether it is the test sample or a reference sample).
  • the determination of the level of transcripts of an ISG therefore involves a quantitative measurement representative of the quantity of transcripts of said ISG, in particular the quantity of mRNA of said ISG, in the test sample.
  • transcript means the RNAs, and in particular the messenger RNAs (mRNAs), resulting from the transcription of the gene. More precisely, the transcripts are the RNAs produced by the transcription of a gene followed by the post-transcriptional modifications of the pre-RNA forms.
  • the measurement of the level of transcripts of the same gene can comprise the level of identical or different transcripts.
  • the determination of the level of transcripts relates to the determination of the level of mRNA of said gene.
  • the detection can be carried out by a direct method, by any method known to those skilled in the art making it possible to determine the presence of said transcript in the sample, or by indirect detection of the transcript after transformation of the latter into DNA, or after amplification of said transcript or after amplification of the DNA obtained after transformation of said transcript into DNA.
  • Numerous methods exist for the detection of nucleic acids see for example Kricka et al., 1999, and Relier GH et al., 1993).
  • Gene expression can in particular be measured by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction or RT-PCR, preferably by quantitative RT-PCR or RT-qPCR (for example using FilmArray® technology), by sequencing (including high-level sequencing throughput) or by hybridization techniques (for example with hybridization microchips or by techniques of the NanoString® nCounter® type).
  • RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
  • sequencing including high-level sequencing throughput
  • hybridization techniques for example with hybridization microchips or by techniques of the NanoString® nCounter® type.
  • a technique without RNA or DNA extraction can be implemented, which is the case with the FilmArray® technique (Poritz et al. 2011).
  • Determining the level of transcripts of a gene makes it possible to determine the quantity of one or more transcripts of said gene present in the sample of interest or to give a derived value therefrom which is representative of the quantity of transcripts present in the sample of interest.
  • a derived value representative of the quantity can, for example, be the absolute concentration, calculated using a calibration curve obtained from successive dilutions of a solution of amplicons of known concentration. It can also correspond to the normalized and/or calibrated value of the quantity of transcript, such as the CNRQ (Calibrated Normalized Relative Quantity), (Hellemans et al., 2007), which integrates the values of a reference sample (or a calibrator) and one or more housekeeping genes (also called reference genes).
  • housekeeping genes include DECR1, HPRT1, PPIB, RPLP0, PPIA, GLYR1, RANBP3, 18S, GAPDH, ACTB, ABCF1, ALAS1, GUSB, HPRT1, MRPS7, NMT1, NRDE2, OAZ1 genes. , PGK1, SDHA, STK1 11P and TBP.
  • the level of transcripts of a selected marker gene determined for the subject's test sample is compared to a level reference for said marker gene, which in certain embodiments is also used as a threshold value to bring a conclusion as to the presence or not of an infection by a replicative respiratory virus, in the subject of interest.
  • Such a comparison can be carried out in different ways, and this in a manner known to those skilled in the art.
  • it is also possible, for the comparison to calculate a ratio between the level of transcripts of a selected marker gene and the reference level for said marker gene, in particular before carrying out a comparison with the threshold value used.
  • the level of transcripts of the selected marker gene(s) is normalized with respect to the level of transcript one or more housekeeping genes (or reference genes), as known to those skilled in the art; more preferably using one or more of the following housekeeping genes: DECR1 (chromosomal location of the gene according to GRCh38/hg38: chr8:90,001,352-90,053,633), HPRT1 (chromosomal location of the gene according to GRCh38/hg38: chrX :134,452,842-134,520,513) and PPIB (chromosomal location of the gene according to GRCh38/hg38: chr15:64, 155,812-64, 163,205).
  • housekeeping genes or reference genes
  • the reference level used is also normalized beforehand, in the same way.
  • the normalization whether for the reference level or for the level of transcripts of the test sample, is carried out before the comparison, in particular before the calculation of a ratio between the level of transcripts of the test sample and the level reference.
  • this normalization may be taken into account for the choice of the threshold value.
  • the method according to the invention includes the determination of the level of transcripts of the or housekeeping genes used for standardization.
  • the level of transcripts of a single marker gene selected from the ISGs can be determined in step i) and it can be concluded that there is an infection by a replicative respiratory virus. in said subject, if the comparison of the level of transcripts of said ISG marker gene with a predetermined threshold value, shows that there is a difference with said given or predetermined threshold value corresponding to said marker gene. In particular, said difference corresponds to a level of transcripts for the test sample which is greater than that corresponding to the threshold value.
  • said threshold value corresponds to a reference level of said marker gene which is the level of transcripts of said marker gene in a subject not showing any infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, does not have any neutralizing auto-antibodies directed against interferon a and/or does not possess neutralizing auto-antibodies directed against interferon w, or in a population of subjects showing no infection by a replicative respiratory virus and who, preferably , do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • said difference between the level of transcripts of the selected ISG marker gene determined in the test sample and the reference level of said ISG marker gene corresponds to the fact that the level of transcripts of said marker gene ISG determined in the test sample is increased, or even significantly increased, in particular by at least 10%, by at least 20%, by at least 30%, by at least 40%, by at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or at least 90% compared to the reference level of said ISG.
  • the increase considered relevant to bring a conclusion will be a function of the threshold value considered, and in particular of the reference level used as threshold value, and will be adapted accordingly by those skilled in the art.
  • the threshold value corresponds to the reference level of said ISG marker gene which is the level of transcripts of said ISG marker gene in a subject not exhibiting any infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, does not possess auto - neutralizing antibodies directed against interferon a and/or does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w, or in a population of subjects not exhibiting no infection with a replicative respiratory virus and who preferably do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w, he may suffice that the level of transcripts of the selected ISG determined in the test sample is simply greater than the threshold value.
  • a different reference level in particular the level in subjects not suffering from a respiratory infection or more generally healthy subjects (without infection of any kind, as are in particular blood donors )
  • the difference with respect to the threshold value must be more significant, in particular according to one of the aforementioned % increases.
  • An increase may be deemed significant, after applying a statistical method well known to those skilled in the art, such as the Student or Wilcoxon test. Such a method is notably used in the examples.
  • said marker gene selected from among the ISGs can be any ISG gene given in the present description, but is preferably IFIT 1 or NFI44L.
  • the comparison can be carried out by comparing the level of transcripts of each marker gene selected with a given or predetermined threshold value for each marker gene considered. It is also possible to make a more global comparison. In particular, it is possible to obtain the level of transcripts of several marker genes and to compare the level of overall transcripts of these marker genes with a single overall threshold value. It is also possible to carry out a comparison of the level of transcripts of each marker gene selected with a threshold value given for each marker gene.
  • said threshold value corresponds to a reference level of said marker gene which is the level of transcripts of said marker gene in a subject not exhibiting any infection by a replicative respiratory virus and who, preferably, does not possess no neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or does not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w, or in a population of subjects having no infection with a replicative respiratory virus and who preferably do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • step i) the transcript levels of several marker genes selected from among the ISGs can be determined in step i), for the test sample, and
  • the level of transcripts of each marker gene determined in the test sample is compared with the threshold value of the said corresponding ISG marker gene.
  • said difference corresponds to a level higher than that of the threshold value.
  • the level of transcripts of said ISG marker gene determined in the the test sample is increased, or even increased significantly, in particular by at least 10%, by at least 20%, by at least 30%, by at least 40%, by at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or at least 90% with respect to the threshold value considered for said ISG.
  • the methods according to the invention may comprise the determination of the level of transcripts of 1 to 71 marker genes chosen from those given in the present description, and, preferably of the level of transcripts of 1 to 6, marker genes chosen by the ISGs, and in particular chosen from IFI27, IFI44L, IFIT 1, RSAD2, ISG15 and SIGLEC1.
  • a comparison may be performed by calculating a ratio of the transcript level of said selected marker gene determined for the test sample to a corresponding baseline level for said marker gene. It is also possible that such a comparison is made by calculating the ratio of the reference level of said selected marker gene to the level of transcripts of said selected marker gene determined for the test sample.
  • an overall ratio corresponding to the median of said ratios can be calculated and used to make a conclusion as to the presence or absence of an infection by a replicative respiratory virus in said subject.
  • the median of all the ratios obtained is then calculated and it is concluded that the presence of infection by a replicative respiratory virus is present in said subject, when said median is greater than a threshold value, which may for example be equal to 1.5, preferably greater than 2, 3, 4, 5, or 6.
  • a threshold value which may for example be equal to 1.5, preferably greater than 2, 3, 4, 5, or 6.
  • the reference level of said marker gene for calculating the ratios may be the level of transcripts of said marker gene, in a subject not infected with a respiratory virus, or in a population of such subjects of said marker gene.
  • a subject not infected with a respiratory virus is, in particular, a subject negative for a test to detect the presence of a respiratory virus.
  • the reference level used for calculating the ratio is the level of transcripts of said marker gene, in a subject not infected with a respiratory virus, not possessing neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or neutralizing autoantibodies directed against interferon w or in a population of such subjects.
  • the methods according to the invention may comprise the determination of the level of transcripts for 1 to 71, and preferably for 1 to 6, marker genes chosen by the ISGs, and in particular chosen ) among IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 and SIGLEC1.
  • the method according to the invention comprises: i) determining the levels of transcripts of several marker genes selected from IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 and SIGLEC1, for the test sample, ii) for each marker gene for which the level of transcripts in the test sample is determined in step i), the ratio between said level of transcripts on the reference level of said marker gene, is calculated, iii) the median of all the ratios obtained is then calculated and it is concluded that there is an infection by a replicative respiratory virus in said subject, when said median is greater than the threshold value which may for example be equal to 1.5, preferably greater than 2 , 3, 4, 5, or 6.
  • step i) it is possible to determine in step i) and to use in steps ii) and iii), the levels of transcripts of all the marker genes IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 , or even of all the marker genes IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 and SIGLEC1.
  • the levels of transcripts of the IFI27, IFI44L, IFIT1 and RSAD2 genes are determined and used as marker genes. That is, the conclusion regarding the presence or absence in the subject of an infection with a replicative respiratory virus does not take into account the level of transcripts of another marker gene.
  • the threshold value or the reference level are, in general, values determined upstream which are available during the implementation of the method according to the invention.
  • the threshold value is a value which has previously been judged to be relevant for obtaining a conclusion as to the presence or absence of an infection by a replicative respiratory virus.
  • the reference level corresponds to the level of transcripts for the marker gene considered, in a reference subject or a reference population.
  • a reference sample is of the same type as the test sample, namely a sample from the mouth or nose of a subject and, preferably, an oropharyngeal or nasopharyngeal sample, or saliva.
  • a reference subject can be a subject not infected with a replicative respiratory virus, that is to say, in particular a subject detected positive for the presence of a respiratory virus but for which the virus is not replicative. , or a subject not infected with a respiratory virus (in particular not positive for a test for detecting a respiratory virus); a subject not infected with a respiratory virus (in particular not positive for a test to detect a respiratory virus); a healthy subject, that is to say without infection of any kind, as blood donors are in particular...
  • the reference sample (coming from a so-called reference subject) for determining a reference level used as a threshold value for the level of transcripts of a marker gene is, advantageously, a sample coming from a subject (called reference subject) not infected with a replicative respiratory virus, that is to say, in particular a subject detected positive for the presence of a respiratory virus but for which the virus is not replicative, or a subject not infected with a respiratory virus (in particular not positive for a test for detecting a respiratory virus), or a mixture of such samples.
  • the reference sample (coming from a so-called reference subject) to determine the reference level used for calculating a ratio or a derived value or score as previously described is, advantageously, a sample from a subject (called reference subject) not infected with a respiratory virus (in particular not positive for a test for detecting a respiratory virus), or a mixture of such samples.
  • the reference subjects from which the reference samples come do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon a and/or do not possess neutralizing autoantibodies directed against interferon w.
  • Such verification can be done from a blood sample, in particular serum of the subject concerned, by any known antibody detection technique, in particular an ELISA technique.
  • the reference sample can also be a sample from such a subject, treated ex vivo with an agent stimulating the immune system (such as LPS or lipopolysaccharide).
  • the reference sample can also be a mixture of untreated sample(s) and samples treated ex vivo with an immune system stimulating agent.
  • level of reference transcripts when the latter is the level of transcripts of a reference population, this may be the mean or the median of the various levels of transcripts measured for said population, i.e. i.e. the mean or median of the transcript levels measured in the reference samples.
  • the method according to the invention may also comprise the detection of DNA or RNA, of one or more respiratory viruses, and in particular of SARS-CoV-2 or one of its variants (Mommert, M. et al., 2020).
  • detection techniques are known to those skilled in the art. It is possible to use a non-quantitative, quantitative or semi-quantitative detection technique. In particular, the use of an amplification, hybridization or sequencing technique adapted to the DNA or RNA of the virus sought may be used.
  • the invention also relates to a kit comprising means for determining the level of transcripts of one or more ISG marker genes such as defined in the context of the invention.
  • Such means make it possible to quantitatively determine the level of transcripts of said selected gene in the test sample.
  • the level of transcripts determined may not be equal to the quantity of transcripts present in the test sample, but may be a derived value, representative of the quantity of transcripts present in the test sample. Indeed, conventionally, the determination may include a step of amplification and/or normalization and/or calculation of a ratio...
  • kit is meant a set of products and/or tools to be used together to obtain, in particular, the determination of the level of transcripts of one or more ISG marker genes as defined in the context of the invention.
  • the necessary products or tools may or may not be grouped together in the same kit or device.
  • kits according to the invention may comprise means of amplification and/or detection for one or more ISG marker genes, such as those mentioned above, in particular chosen from IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15, and SIGLEC1.
  • the kits according to the invention may comprise amplification and/or detection means for each selected ISG marker gene, and in particular which are specific to said marker gene.
  • the kits according to the invention may also comprise at least one means of determination, making it possible to determine the level of transcripts of a housekeeping gene.
  • the kits according to the invention may comprise means of amplification and/or detection for one or more housekeeping genes (preferably selected from the list consisting of: DECR1, HPRT1 and PPIB).
  • the kits according to the invention may comprise amplification and/or detection means for each housekeeping gene selected, and in particular which are specific to said housekeeping gene.
  • the means for determining the level of transcripts comprise, in particular, one or more amplification product(s) or tool(s) and/or one or more detection product(s) or tool(s).
  • the kit comprises one or more oligonucleotides, allowing the amplification and/or the detection of a transcript of said gene, in particular an amplification primer or pair of primers and/or at least one probe for detecting a transcript of said gene.
  • primer or “amplification primer” is understood to mean an oligonucleotide or nucleotide fragment which may consist of 5 to 100 nucleotides, preferably of 15 to 30 nucleotides, and possessing a hybridization specificity with a nucleotide sequence target, under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction of the target nucleotide sequence.
  • primers consisting of two primers.
  • probe or “hybridization probe” means an oligonucleotide or nucleotide fragment typically consisting of 5 to 100 nucleotides, preferably 15 to 90 nucleotides, even more preferably 15 to 35 nucleotides, possessing a hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide sequence.
  • the probe also includes a reporter (such as a fluorophore, an enzyme or any other detection system), which will allow the detection of the target nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA (mRNA) or a nucleotide sequence included in a complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription of said mRNA.
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA complementary DNA
  • Primer and probe sequences suitable for determining the level of transcripts of each IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 and SIGLEC1 gene are, in particular, described in M. Bergallo et al., 2020.
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two oligonucleotides or nucleotide fragments, such as, for example, a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences, are capable of forming a double strand with stable and specific hydrogen bonds.
  • a nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment capable of hybridizing with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in a known manner.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. The hybridization is all the more specific as it is carried out at higher stringency.
  • Stringency is defined in particular according to the base composition of a probe/target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the stringency can also be a function of the reaction parameters, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and/or the hybridization temperature.
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will mainly depend on the hybridization probes used. All of these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art.
  • the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 70°C, in particular between 35 and 65°C in a saline solution at a concentration of about 0 .5 to 1 M.
  • a step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment, by the action of at least one enzyme.
  • amplification reactions are well known to those skilled in the art and the following techniques may be mentioned in particular: PCR
  • RT-PCR reverse transcription
  • mRNA RNA messenger
  • cDNA complementary DNA
  • kits according to the invention may comprise means for detecting a respiratory virus, preferably SARS-CoV-2.
  • a respiratory virus preferably SARS-CoV-2.
  • such means correspond to a product or tool for detecting and/or amplifying the DNA or RNA of said virus.
  • kits according to the invention can also comprise positive control means, in particular a positive control sample, making it possible to qualify the quality of the extraction of the RNA, the quality of any amplification process and/or 'hybridization.
  • kits according to the invention are characterized in that they comprise a set of amplification and/or detection means which allow the detection and /or the amplification of at most 100 genes, preferably at most 90, preferably at most 80, preferably at most 70, preferably at most 60, preferably at most 50, preferably at most 40, preferably at most 30, preferably at most 20, preferably at most 10 genes, in particular at most 6, at most 5, at most 4, at most 3, or at most 2 genes, in total.
  • amplification and/or detection means which allow the detection and /or the amplification of at most 100 genes, preferably at most 90, preferably at most 80, preferably at most 70, preferably at most 60, preferably at most 50, preferably at most 40, preferably at most 30, preferably at most 20, preferably at most 10 genes, in particular at most 6, at most 5, at most 4, at most 3, or at most 2 genes, in total.
  • biomarker genes that is to say of an objectively measurable biological characteristic which represents an indicator of normal or pathological biological processes or pharmacological response to a therapeutic intervention.
  • the biomarker genes therefore include the marker genes selected from the ISGs and the housekeeping genes described in the context of the invention.
  • the biomarker gene may, in particular, be detectable at the mRNA level.
  • biomarker which may also be present in a kit according to the invention, mention may be made of an endogenous or loci biomarker (such as a gene or a HERV/Human Endogenous RetroVirus) which is found in the chromosomal material of an individual, or an exogenous biomarker (such as a virus).
  • endogenous or loci biomarker such as a gene or a HERV/Human Endogenous RetroVirus
  • kits according to the invention comprise, as means for amplifying and/or detecting genes, exclusively means for amplifying and/or detecting genes of biomarker(s) consisting exclusively in ways for amplifying and/or detecting one or more ISG marker genes, means for amplifying and/or detecting one or more housekeeping genes and, optionally, means for amplifying and/or detecting one or more respiratory viruses.
  • kits can therefore comprise a solid support comprising one or more oligonucleotide(s) suitable for determining the level of transcripts of the or each IGS marker gene, or even one or more oligonucleotide(s) suitable for determining the level of transcripts of the gene or of each housekeeping gene selected, or even one or more oligonucleotide(s) suitable for the detection of a respiratory virus such as SARS-CoV-2, as previously described.
  • solid supports are well known to those skilled in the art, and in particular described in applications WO2008/140568 and WO2017/093672 to which reference may be made for more details.
  • kits are intended to be implemented in an automated manner as regards the comparison with a threshold value and/or reference value.
  • the kits are intended to be implemented in an automated manner with respect to the comparison of the level(s) of transcript(s) of the selected ISG marker gene(s), and the value(s) threshold used, or if necessary by using a reference level to calculate a datum (or a score) from the level(s) of transcript(s) of the selected ISG marker(s) gene(s) and compare it with a threshold value.
  • they comprise, in addition to one or more threshold values, at least one reference level for said (or each) selected ISG marker gene, which is either stored on a medium readable by a computer, or intended to be used in the form of a code executable by a computer, in particular configured to compare the level of transcripts of the ISG marker gene determined for the test sample, with said reference level.
  • the invention also relates to the use of a kit as described in the context of the invention to determine the possible presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus.
  • the use will aim to determine the presence or absence in a subject of a replicative respiratory virus, chosen from replicative seasonal coronaviruses, replicative SARS-CoV-2 viruses (regardless of the variant concerned), influenza viruses (influenza A, B and C), respiratory syncytial virus (RSV), rhinoviruses, metapneumoviruses, parainfluenza viruses and adenoviruses.
  • a replicative respiratory virus chosen from replicative seasonal coronaviruses, replicative SARS-CoV-2 viruses (regardless of the variant concerned), influenza viruses (influenza A, B and C), respiratory syncytial virus (RSV), rhinoviruses, metapneumoviruses, parainfluenza viruses and adenoviruses.
  • kits according to the invention are particularly suitable for determining the presence or absence in a subject of a replicative respiratory virus chosen from replicative SARS-CoV-2 viruses, whatever the variant concerned, and the influenza virus.
  • the in vitro or ex vivo determination of the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus is solely based on the determination, in a test sample from of the mouth or nose of said subject, of the level of transcripts of one or more marker gene(s) selected from among the genes stimulated by interferons, known as ISG.
  • ISG the level of transcripts of one or more marker gene(s) selected from among the genes stimulated by interferons
  • marker gene(s) selected from among the genes stimulated by interferons called ISGs, one or more other ( s) marker gene(s), for example, selected from type I interferon genes.
  • additional marker gene(s) mention may be made of genes coding for the various proteins of type I, II and/or III interferons.
  • the invention also relates to the methods for determining in vitro the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, as defined in the present description, which further comprise the treatment of a respiratory virus infection.
  • the treatment is initiated as soon as when it is concluded that said subject has an infection with a replicative respiratory virus.
  • the treatment can also be initiated, once it is concluded that the said subject has an infection with a replicative respiratory virus and that a respiratory virus present has been identified. In this case, the treatment will be directed against the identified respiratory virus. Even if there is no certainty that the respiratory virus whose presence has been identified and the respiratory virus present which is replicative are identical, the presumption is strong because the probability that the subject is infected with two different respiratory viruses is particularly reduced.
  • the treatment can be initiated, as soon as the subject exhibits symptoms of a respiratory infection and it is concluded that the subject is present with an infection by a replicative respiratory virus.
  • the treatment consists of the administration of a suitable antiviral drug.
  • antiviral treatment mention may be made of Iopinavir®, Ritonavir®, recombinant interferons, in particular interferon beta, alpha and lambda.
  • Iopinavir® Iopinavir®
  • Ritonavir® recombinant interferons, in particular interferon beta, alpha and lambda.
  • Many therapeutic treatments for COVID-19 are currently being tested (Canedo-Marroquin, G. etal., 2020).
  • the invention also relates to methods for determining in vitro the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, as defined in the present description, which further comprise the establishment of measures of isolation, confinement and/or obligation to wear a mask for said subject.
  • measures can be put in place, pending the result as to the determination of an infection by a replicative respiratory virus, and, possibly be lifted, in the event of the conclusion that there is no presence in said subject, infection with a replicative respiratory virus. It is also possible that such measures will be put in place, in the event of the conclusion that there is presence in the said subject, of an infection by a replicative respiratory virus.
  • the invention also relates to a method for determining in vitro the presence in a subject of an infection by a replicative respiratory virus, as defined in the present description, which comprises, in addition to the steps described above, the setting in place or not, or the discontinuation of isolation, confinement and/or mask-wearing measures for said subject, depending on the conclusion made by said method, as to the presence or absence of an infection by a replicative respiratory virus, in said subject.
  • the methods according to the invention may also include a subject management step, depending on the result given by the method.
  • a subject identified as having a respiratory infection by a replicative virus, and in particular by SARS-coV-2, may be subject to a treatment protocol or to measures of isolation, confinement and/or the obligation to wear a mask.
  • the present invention is illustrated in a non-limiting manner by the following examples.
  • Table 1 summarizes the demographic data and the main clinical characteristics of the cohort of subjects who were the subject of the study: healthcare professionals (HCW) with mild symptoms of COVID-19 (COVID -19) and patients with critical COVID-19 admitted to an intensive care unit (ICU) (critical COVID-19). HCWs with mild COVID-19 were not hospitalized and were pneumonia-free.
  • BMI body mass index
  • IQR interquartile
  • N/A not applicable
  • a prospective longitudinal cohort study was performed at the University Hospital of Lyon, France (Hospices Civils de Lyon, HCL), encompassing HCWs with symptoms suggestive of SARS-CoV-2 infection (at least one of the following symptoms: fever, respiratory symptoms, headache, anosmia, ageusia - Trouillet-Aimpuls, S. etal. 2020a).
  • the diagnosis of COVID-19 was confirmed in all patients by qRT-PCR (cobas® SARS-CoV-2 test, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland).
  • the nasopharyngeal (NP) swab used was either in Copan universal transport medium (UTM-RT®) or in a tube of Cobas® PCR medium.
  • the FilmArray® prototype (in the form of a pocket) which was used makes it possible to determine the level of transcripts of four ISGs (protein 27 inducible by interferon alpha (IFI27), protein analogous to interferon-induced protein 44 (IFI44L), interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats (IFIT1), and protein 2 containing radical S-adenosyl methionine domain (RSAD2)) and three housekeeping genes (hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1), peptidylpropyl isomerase B (PPIB), 2,4-dienoyl-CoA reductase 1 (DECR1)), for signal normalization.
  • IFI27 protein 27 inducible by interferon alpha
  • IFI44L protein analogous to interferon-induced protein 44
  • IFIT1 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats
  • RRSAD2 protein 2 containing radical S-aden
  • NP sample or PAXgeneTM blood were tested with the prototype IFN (Tawfik, DM etal., 2020) according to the instructions of the maker. Briefly, the pouches were hydrated with the hydration solution provided with the kit. PAXgeneTM NP or blood samples were mixed with 800 ⁇ l of the sample buffer supplied with the kit and injected directly into the bag and passed through FilmArray® 2.0 and FilmArray® Torch instruments (BioFire Diagnostics, LLC., Known Lake City, UT). The results were delivered in less than an hour. Using a research version of the instrument, real-time quantification cycle (Cq) values and post-amplification melting curves were measured for each assay.
  • Cq real-time quantification cycle
  • the serum concentrations of IFN-a2 (fg/ml) from the plasma were determined by an ultrasensitive test (SIMOA®) using a commercial kit for the quantification of IFN-a2 (QuanterixTM, Lexington, MY).
  • the assay was based on a three-step protocol using an HD-1 analyzer (Quanterix) and required a turnaround time of 3 hours from sampling to results.
  • Interferon lambda was determined by an assay using a commercial kit for the quantification of IFN-1 (mesoscale discovery).
  • the SARS-CoV-2 load was determined from an NP sample using the SARS-CoV-2 R-gene® kit (bioMérieux, Lyon, France). Briefly, nucleic acid extraction was performed from 0.2 ml of an NP sample on NUCLISENS® easyMAG® and by means of amplification using a Biorad CFX96 thermocycler. Viral load was quantified using four internally developed quantification controls (QS) targeting the SARS-CoV-2 N gene: QS1 to QS4 respectively at 2.5.10 6 ,
  • NPs positive by RT-PCR were inoculated on confluent Vero cells (ATCC CCL-81®) with Eagle's minimal essential medium (EMEM) supplemented with 2% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamine, and 2% inactivated fetal bovine serum.
  • EMEM Eagle's minimal essential medium
  • the plates were incubated at 33°C with 5% CO2 for 96 hours. Cytopathic effects (CPE) were monitored daily; samples were harvested when positive, while negative samples at 96 hours were subcultured onto new plates.
  • RNA from supernatants was extracted by an automated MGISP-960 workstation using the MGI Easy magnetic bead viral DNA/RNA extraction kit (MGI Tech ⁇ , Marupe, Lithuania), and detection of SARS- CoV-2 was performed using the TaqPath(tm) COVID-19 CE-IVD RT-PCR kit on a QuantStudio(tm) 5 system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).
  • the presence of anti-SARS-CoV-2 antibodies was assessed using the Wantai Ab assay which detects total antibodies against the receptor binding domain (RBD) of protein S.
  • the presence of anti-IFN- ⁇ antibodies was studied using a commercially available kit (Thermo-Fisher) (David, G et al., 2021).
  • the neutralizing capacity of a patient's serum towards IFN- ⁇ was then evaluated as previously described (Bastard, P. et al., 2021).
  • Nonparametric Wilcoxon-Mann-Whitney tests and Spearman correlation were performed for all comparisons, unless otherwise stated.
  • the minimum p-value of the non-parametric significance test (Wilcoxon rank sum) was used applied iteratively to the ISG score, separated on standardized nasal viral load thresholds ranging from minimum (0.60) to maximum (9.00) detected values with a step of 0.01.
  • the advantage of this technique is that it is semi-automated and also designed for clinical routine, giving a score derived from the quantification of four ISGs regulated through ISRE elements dependent on gene factor 3 stimulated by a IFN (ISGF3), namely IFI27, IFI44L, RSAD2 and IFIT1 (Fêtandez, N. et al., 2018).
  • This score was analyzed during diagnosis in 23 FICWs infected with SARS-CoV-2, and compared to the same score obtained from blood samples and the serum level of IFN-a2 from the same patients.
  • FIG. 7 demonstrates that there is a significant correlation between the score associated with the levels of transcripts of the various type I/III ISGs (called ISG score) obtained for the nano-pharyngeal samples and the viral load.
  • ISG score the score associated with the levels of transcripts of the various type I/III ISGs
  • the nasal ISG type l/l II score is lower in patients with neutralizing type I anti-IFN autoantibodies.
  • nasal viral load the viral load in the nasopharyngeal samples
  • ISG score the score ISG in nasopharyngeal specimens
  • Anti-IFN-a and/or anti-IFN-w autoantibodies were detected in the serum of 6 of 19 severely affected patients and in none of the mildly symptomatic patients (Figure 7).
  • patients with anti-IFN-1 autoantibodies had very low nasal ISG scores, regardless of viral load, except for one patient who had autoantibodies against IFN-a2 only, and for which it was assumed that IFN-w compensated for the blockade of IFN a2.
  • NP samples 2017-2018
  • HCL Livings Civils de Lyon
  • NP swabs from healthy volunteers were recruited according to the same protocol as example 1.
  • the RESPIFERON study was approved by the ethics committee for biomedical research and by the personal protection committee. CPC.
  • Authorization to use the samples was granted on the basis of non-objection by the subjects directly concerned or their legal guardians, if applicable, after having informed them by mail. Anonymization of the subjects' personal data was carried out prior to their transfer to the laboratory.
  • the viral load was quantified for each NP sample.
  • the nucleic acids were extracted using the NucliSens® easyMAGTM automated extractor (bioMérieux, Marcy l'Etoile). The extraction was carried out from 200 pL of NP samples which were deposited in a lysis buffer. At the end incubation for 10 minutes at room temperature, 50 ⁇ l of magnetic silica were added before starting the extraction.
  • RNA was reverse transcribed and amplified using the Influenza A/B R-gene® ready-to-use real-time RT-PCR kit.
  • the reaction required 10 pL of eluate, 15 pL of amplification premix containing the reagents necessary for the PCR and 0.15 pL of reverse transcriptase (diluted in 10th).
  • the amplification was launched on the Bio-Rad CFX96 following a specific protocol, namely 5 min at 50° C. for the reverse transcription followed by 15 min at 95° C. to activate the Taq polymerase, and finally 45 cycles which alternate: 10sec at 95°C for denaturation, 40sec at 60°C for hybridization, and 25sec at 72°C for elongation.
  • the viral load was quantified using a range of r-gene standards (QS1 to QS4 containing respectively 10 5 , 10 4 , 10 3 and 10 2 copies/pL of plasmid).
  • the CELL Control r-gene® kit was used firstly to check the presence of cells in the sample and quantify them by detecting the HPRT 1 housekeeping gene, and secondly to normalize the charge.
  • This kit contains 2 quantification standards, QS1 and QS2 respectively at 10 4 and 10 3 copies/pL of DNA. Data were retrieved, processed and analyzed using CFX Maestro software.
  • the viral load was normalized by dividing the number of copies of viral RNA/PCR by the number of cells/PCR and is expressed in Iog10 of the number of copies per 10 6 cells.
  • the viral culture, the collection of the samples, the sampling of the culture supernatants and the extraction of the RNAs from said supernatants are as described in example 1.
  • the detection of the influenza virus was carried out using the Influenza A/B R-gene® kit (bioMérieux, Marcy l'Etoile).
  • Influenza virus infection is associated with increased nasal IFN response
  • an IFN l/III score based on the expression of 4 ISGs in the nasal mucosa measured by RT-qPCR using the IFN FilmArray® BioFire® pocket prototype was calculated.
  • This nasal IFN l/III score informative as to the local IFN response, turned out to be significantly higher (p ⁇ 0.0001) for the positive PCR samples, therefore from individuals infected with the virus of the Influenza, in comparison to PCR negative samples corresponding to uninfected individuals.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • the level of expression of the ISG mRNAs, expressed in log2 of the QR ratios, was estimated for each NP sample from the results obtained with the IFN FilmArray® BioFire® pocket prototype as explained previously (see material and method).
  • Nasal INF response reflects active influenza virus infection
  • Figure 12 thus highlights the good performance of the IFN l/III score in predicting the replicative capacity of the GRB virus with an area under the curve of 0.89 with a cut-off point at 16.08, for a sensitivity of 0, 93 and a specificity of 0.86.
  • this example confirms that the measurement of the level of transcripts of genes stimulated by interferons, known as ISG, made it possible to effectively and reliably detect the presence of an infection by a replicative respiratory virus, such as for example SARS-CoV-2 or the influenza virus, thus providing a new tool for the clinician to quickly identify patients at risk of viral transmission, and alternatively to avoid quarantine measures for patients who are not, or no longer, a possible source of contamination.
  • a replicative respiratory virus such as for example SARS-CoV-2 or the influenza virus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d'une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant une étape i) de détermination, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, du niveau de transcrits d'au moins un gène marqueur sélectionné parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG, ainsi que les kits associés.

Description

Description
Titre de l'invention : Procédé et kit de détection d’un virus respiratoire réplicatif
Domaine Technique
[0001] La présente invention concerne le domaine technique des procédés et kits de diagnostic. En particulier, l’invention a pour objet des procédés et kits permettant de déterminer si un sujet est atteint ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
Technique antérieure
[0002] Aujourd’hui, il existe de nombreuses techniques qui détectent l’ADN ou l’ARN d’un virus, chez un sujet. C’est notamment le cas pour le virus pathogène SARS- CoV-2 où plusieurs tests PCR, réalisés majoritairement sur des échantillons naso-pharyngés ou salivaires des sujets concernés, sont disponibles. On peut citer les tests qRT-PCR, notamment le test SARS-COV-2 RESPI R-GENE®, de bioMérieux, le test BioFire® COVID-19, de bioMérieux, le test SARS-CoV-2 ddPCR, de Bio-Rad, le test RealTime SARS-CoV-2, d’Abbott, le test RealStar®. RSV RT-PCR, d’Altona-diagnostics, le test ALINITY m RESP-4-PLEX ASSAY, d’Abbott et le test cobas® SARS-CoV-2, de Roche Diagnostics, notamment.
[0003] Cependant, les résultats de PCR sont souvent difficiles à interpréter dans la routine clinique et en l'absence de manifestations cliniques (Han, M. S étal.,
2021 ). En particulier, il est possible qu’un test PCR détecte uniquement des fragments du génome ADN ou ARN du virus, et donc la présence d’un virus qui n’est pas actif, c’est-à-dire qui n’a pas la capacité de se répliquer dans l’organisme du sujet. La présence de symptômes, notamment pouvant être qualifiés de bénins (ou faibles), qui pourrait être associée à de nombreuses infections, virales ou bactériennes, n’est pas non plus le signe de la présence d’un virus respiratoire réplicatif. De plus, en période automnale et hivernale pendant lesquelles de nombreux virus respiratoires circulent, il est parfois difficile d’associer des symptômes comme la fièvre, suspectant une infection, à la présence d’un virus respiratoire réplicatif directement responsable. Il existe donc un intérêt important à identifier un moyen permettant de déterminer la présence, chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif tel que le SARS- CoV-2. Ceci permettrait, notamment, d'aider à identifier rapidement les patients présentant un risque de transmission virale, et alternativement d’éviter des mesures de quarantaine pour les patients qui ne sont pas, ou qui ne sont plus, une source possible de contamination, notamment dans le cas du SARS-CoV-2.
[0004] Bien qu'une infection virale respiratoire, notamment par le SARS-CoV-2, se produise initialement par les voies respiratoires supérieures, l'immunité médiée par les interférons des types I et III (IFN-I et III) dans la muqueuse nasale reste mal caractérisée au cours d'une infection virale respiratoire.
[0005] Récemment, Monel B. étal., 2021 se sont intéressés à la production de différents interférons et interleukines dans des échantillons naso-pharyngés et ont étudié la corrélation de leur production avec la présence d’infection par un virus SARS-CoV-2 réplicatif. D’autres auteurs ont également étudié le niveau d’expression de gènes stimulés par les interférons, dits ISG, chez des patients ayant des tests PCR positifs à SARS-CoV-2 confirmant le rôle des interférons dans la réponse immunitaire mucosale anti SARS-CoV-2 (Mick, E. étal., 2020, et Ng, D. L. et al., 2021). Cependant, dans les études liées au niveau d’expression des ISG, le caractère réplicatif ou non du virus correspondant aux tests PCR positifs n’a nullement été étudié ; il n’a pas non plus été évoqué la probabilité d’investiguer le niveau d’expression de gènes stimulés par les interférons, dits ISG, pour évaluer la contagiosité.
[0006] La publication de Gupta R K. étal., 2021, concerne l’évaluation de la précision diagnostique de signatures transcriptomiques de l’infection virale afin de prédire la positivité d’un test PCR nasopharyngé du SARS-CoV-2. D’après les résultats, plusieurs signatures reflétant la voie de signalisation de l’interféron 1 permettent d’effectuer une discrimination entre un test négatif contrôle et un test PCR positif au SARS-CoV-2. Cependant, là encore, le caractère réplicatif du virus n’a pas été évalué dans les tests PCR positifs rendant ainsi impossible l’identification du caractère contagieux du virus.
[0007] La demande WO 2019/236768 propose également une méthode de détection d’une infection respiratoire chez un sujet, à partir du niveau d’expression d’un ou plusieurs gènes du sujet (gène de l’hôte). Une très longue liste de gènes de l’hôte est donnée, parmi laquelle figurent certains ISG, dont IFIT1 , IFIT2, IFIT3 et RSAD2, sans que ceux-ci ne soient présentés comme particulièrement avantageux à sélectionner. De plus, le fait de savoir si le sujet est ou non infecté par un virus respiratoire réplicatif n’est nullement étudié dans cette demande de brevet.
Exposé de l’invention
[0008] Dans ce contexte, la présente invention concerne un procédé de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant une étape i) de détermination, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, du niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur sélectionné parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG (nommé dans la suite gène marqueur ISG, ou plus simplement gène marqueur ou ISG, par souci de simplicité).
[0009] De manière avantageuse, lors de l’étape i), le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT1 , RSAD2, ISG15, et SIGLEC1 , est déterminé. Le niveau de transcrits de tous ces gènes marqueurs peut être déterminé. En particulier, le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 est déterminé. De manière avantageuse, le niveau de transcrits de tous les gènes marqueurs IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 est déterminé. Dans les cas où le niveau de transcrits de plusieurs gènes marqueurs est déterminé, on peut procéder à la détermination du niveau de transcrits pour chaque gène marqueur indépendamment, ou à une détermination simultanée des différents transcrits de tous les gènes marqueurs utilisés, dont le niveau est déterminé de manière globale. Lorsque le niveau de transcrits de plusieurs gènes marqueurs est déterminé de manière indépendante, une donnée (notamment un score tel qu’utilisé dans les exemples) représentative du niveau de transcrits de tous ces gènes marqueurs pourra être calculée.
[0010] De manière avantageuse, l’échantillon test est un échantillon oro-pharyngé ou naso-pharyngé ou un échantillon de salive.
[0011] Dans le cadre de l’invention, de manière avantageuse, également, l’étape i) consiste en la détermination du niveau d’ARNm du ou desdits gènes marqueurs. [0012] Les procédés selon l’invention, quel que soit leur mode de réalisation, peuvent être mis en œuvre sur un échantillon provenant d’un sujet qui présente des symptômes d’une infection, ou encore sur un échantillon provenant d’un sujet qui est asymptomatique. Le procédé selon l’invention est particulièrement avantageux, dans le cas de sujets asymptomatiques ou de sujets présentant des symptômes qui peuvent être qualifiés de bénins, tels que de la fatigue, des courbatures, des douleurs musculaires, de la fièvre, des symptômes respiratoires, notamment une toux sans pneumopathie, une céphalée, un mal de gorge, un malaise, des nausées, des vomissements, de la diarrhée, une anosmie ou une agueusie.
[0013] Dans le cadre de l’invention, l’échantillon test peut être obtenu ou prélevé à n’importe quel moment. Dans le cas de sujets présentant des symptômes, l’échantillon test peut être obtenu ou prélevé avant ou après l’apparition de symptômes. L’échantillon test peut provenir de n’importe quel type de sujet, d’un sujet qui a ou n’a pas été diagnostiqué comme infecté par un virus respiratoire, d’un sujet qui est dans l’attente d’un résultat de dépistage ou de diagnostic d’un virus respiratoire, notamment par détection d’ADN ou d’ARN dudit virus...
[0014] Selon certains modes de réalisation, les procédés selon l’invention, quelle que soit leur variante de mise en œuvre, peuvent être menés sur un échantillon provenant d’un sujet qui ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[0015] En particulier, le procédé selon l’invention peut comprendre les étapes suivantes : i) déterminer le niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur choisi parmi les ISG, pour ledit échantillon test du sujet, ii) comparer le niveau de transcrits dudit au moins gène marqueur obtenu, à un niveau de référence.
[0016] Les procédés selon l’invention comprennent une étape iii) qui est de conclure à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet. Une telle conclusion est apportée en utilisant au moins une valeur seuil.
Par valeur seuil, on entend une valeur prédéterminée qui est pertinente pour apporter une conclusion quant à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez un sujet. Une comparaison est menée entre une valeur seuil et le niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur ISG déterminé pour l’échantillon test dudit sujet, ou avec une donnée (notamment un score) obtenue à partir du niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur ISG déterminé pour l’échantillon test dudit sujet. La dite donnée (ou score) peut, notamment, être obtenue à partir des niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs ISG déterminés pour l’échantillon test dudit sujet. En fonction du résultat de la comparaison, notamment si le niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur ISG déterminé pour l’échantillon test dudit sujet, ou la donnée ou le score obtenu à partir du niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur ISG déterminé pour l’échantillon test dudit sujet, est différent, notamment supérieur à la valeur seuil, il est conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet.
[0017] Selon un premier mode de réalisation des procédés selon l’invention, à l’étape iii), il peut être conclu à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, à partir du résultat de l’étape ii), c’est-à-dire de la comparaison entre le niveau de transcrits dudit au moins gène marqueur obtenu, et le niveau de référence dudit gène marqueur qui joue alors le rôle de valeur seuil. C’est, en particulier, le cas lorsque dans le procédé selon l’invention le niveau de transcrits d’un seul gène marqueur ISG est déterminé. C’est également le cas lorsque le niveau de transcrits de plusieurs gènes marqueurs ISG est déterminé de manière globale et que ce niveau global est comparé à un niveau de référence global.
[0018] Dans ce premier mode de réalisation, d’une manière générale, le niveau de référence utilisé en tant que valeur seuil, avec lequel le niveau de transcrits d’un gène marqueur est comparé, correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet de référence, et en particulier chez un sujet non infecté par un virus respiratoire réplicatif, ou chez une population de tels sujets. Les sujets non infectés par un virus respiratoire réplicatif comprennent les sujets qui sont positifs à un test de détection de la présence d’un virus respiratoire, mais pour lesquels le virus n’est pas réplicatif, et les sujets non infectés par un virus respiratoire (négatifs à un test de détection de la présence d’un virus respiratoire). En particulier, le niveau de référence correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif, qu’il soit positif ou non à un test de détection d’un virus respiratoire, et qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou bien le niveau de référence correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur chez une population de tels sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif, qu’ils soient positifs ou non à un test de détection d’un virus respiratoire, et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[0019] Selon une première variante du premier mode de réalisation, le niveau de transcrits d’un seul gène marqueur choisi parmi les ISG peut être déterminé à l’étape i) et il est conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet en cas de différence avec le niveau de référence dudit gène marqueur. Ainsi, l’invention concerne un procédé de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif comprenant les étapes suivantes : i) déterminer le niveau de transcrits d’un seul gène marqueur sélectionné parmi les ISG, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, ii) comparer le niveau de transcrits dudit gène marqueur obtenu, à un niveau de référence, utilisé en tant que valeur seuil, ledit niveau de référence étant le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet de référence, et en particulier chez un sujet non infecté par un virus respiratoire réplicatif, qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de tels sujets, et iii) conclure à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet en cas de différence avec ledit niveau de référence dudit gène marqueur.
[0020] En particulier, ladite différence correspond à un niveau de transcrits dudit gène marqueur pour l’échantillon test qui est supérieur à celui du niveau de référence. [0021] Dans de tels cas, ledit gène marqueur sélectionné parmi les ISG est, de préférence, NFIT1 ou NFI44L.
[0022] Selon une deuxième variante de réalisation du premier mode de réalisation :
- les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG peuvent être déterminés à l’étape i), pour l’échantillon test, et
- le niveau de transcrits de chaque gène marqueur déterminé pour l’échantillon test peut être comparé avec le niveau de référence dudit gène marqueur correspondant.
[0023] Dans cette deuxième variante de réalisation, il peut être conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en cas de différence avec le niveau de référence correspondant, utilisé en tant que valeur seuil, pour au moins un des gènes marqueurs, pour lequel le niveau de transcrits a été déterminé dans l’échantillon test.
[0024] Ainsi, l’invention concerne un procédé de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif comprenant les étapes suivantes : i) déterminer les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG pour l’échantillon test, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, ii) comparer le niveau de transcrits de chaque gène marqueur déterminé dans l’échantillon test avec un niveau de référence correspondant audit gène marqueur, utilisé en tant que valeur seuil, pour chaque gène marqueur considéré, ledit niveau de référence étant le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet de référence, et en particulier chez un sujet non infecté par un virus respiratoire réplicatif, qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de tels sujets, et iii) conclure à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en cas de différence avec le niveau de référence correspondant, pour au moins un des gènes marqueurs, pour lequel le niveau de transcrits a été déterminé dans l’échantillon test. [0025] En particulier, ladite différence correspond à un niveau de transcrits dudit gène marqueur pour l’échantillon test qui est supérieur à celui correspondant au niveau de référence dudit gène marqueur.
[0026] De manière avantageuse, dans la deuxième variante de réalisation du premier mode de réalisation, lors de l’étape i), le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15, et SIGLEC1 , est déterminé. Le niveau de transcrits de tous ces gènes marqueurs peut être déterminé. En particulier, le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 est déterminé.
De manière avantageuse, le niveau de transcrits de tous les gènes marqueurs IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 est déterminé.
[0027] Selon un deuxième mode de réalisation des procédés selon l’invention, à l’étape iii), il peut être conclu à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en mettant en œuvre une étape intermédiaire iibis) conduisant à une donnée obtenue à partir du niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur sélectionné parmi les ISG, pour l’échantillon test. C’est en particulier le cas, lorsque les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs ISG sont déterminés à l’étape i), pour l’échantillon test. Il peut être conduit une étape de comparaison ii) lors de laquelle le niveau de transcrits de chaque gène marqueur ISG est comparé à un niveau de référence dudit gène marqueur, cette comparaison prenant notamment la forme du calcul d’un rapport, notamment du rapport entre ledit niveau de transcrits de chaque gène marqueur sur un niveau de référence dudit gène marqueur. Une étape intermédiaire iibis) peut alors être menée : cette étape peut consister au calcul d’un score représentatif des résultats des comparaisons effectuées pour chaque gène marqueur. Un tel score est, par exemple, la médiane de tous les rapports obtenus (en particulier, niveau de transcrits de chaque gène marqueur ISG pour l’échantillon test/ niveau de référence correspondant audit gène marqueur). La conclusion peut alors être apportée en comparant ce score à une valeur seuil, notamment de 1 ,5, pour conclure qu’il y a présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez le sujet d’intérêt. Si le score obtenu pour l’échantillon test est supérieur à cette valeur seuil, notamment de 1 ,5, il sera conclu qu’il y a présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0028] De manière avantageuse, dans le deuxième mode de réalisation des procédés selon l’invention, lors de l’étape i), le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15, et SIGLEC1 , est déterminé. Le niveau de transcrits de tous ces gènes marqueurs peut être déterminé. En particulier, le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 est déterminé.
De manière avantageuse, le niveau de transcrits de tous les gènes marqueurs IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 est déterminé.
[0029] Ainsi, en tant qu’exemple du deuxième mode de réalisation des procédés selon l’invention, on peut donc citer un procédé de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif comprenant les étapes suivantes : i) déterminer les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, ii) comparer le niveau de transcrits de chaque gène marqueur déterminé dans l’échantillon test avec un niveau de référence correspondant audit gène marqueur, avec calcul du rapport entre ledit niveau de transcrits sur ledit niveau de référence dudit gène marqueur, iibis) calculer la médiane de tous les rapports obtenus à l’étape ii), et iii) conclure à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, lorsque ladite médiane calculée à l’étape iibis) est supérieure à une valeur seuil, qui est, de préférence, égale à 1 ,5.
[0030] Dans un tel procédé, la valeur de 1 ,5 peut ainsi être considérée comme la valeur seuil utilisée pour émettre la conclusion qu’il y a présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0031] De manière avantageuse, dans le deuxième mode de réalisation des procédés selon l’invention, pour chaque gène marqueur pour lequel le niveau de transcrits dans l’échantillon test est déterminé à l’étape i), le niveau de référence utilisé pour le calcul du rapport est le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets dudit gène marqueur. Un sujet non infecté par un virus respiratoire est, en particulier, un sujet négatif à un test de détection de la présence d’un virus respiratoire. De manière préférée, le niveau de référence utilisé pour le calcul du rapport est le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ne possédant pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w ou chez une population de tels sujets.
[0032] Les procédés selon l’invention, quel que soit leur mode de réalisation, peuvent également comprendre une étape réalisée préalablement ou concomitamment à l’étape i), lors de laquelle l’échantillon test est soumis à un test de diagnostic, par détection d’ADN ou d’ARN, notamment par PCR ou RT- PCR, d’un virus respiratoire, et notamment d’un virus SARS-CoV-2. En particulier, ledit test de diagnostic est réalisé préalablement à l’étape i) et donne un résultat positif.
[0033] Selon des modes de réalisation particuliers, dans les procédés selon l’invention, l’échantillon test est soumis à un test de diagnostic, par détection d’ADN ou d’ARN, notamment par PCR ou RT-PCR, d’un virus respiratoire choisi parmi le virus SARS-CoV-2 et ses variants et les virus de la grippe, notamment influenza A, B et C, ledit test de diagnostic ayant donné un résultat positif. Un tel test de diagnostic peut également être mis en œuvre, préalablement ou concomitamment à l’étape i), et le résultat positif ou négatif peut être obtenu avant ou après la détermination de la présence ou de l’absence chez ledit sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0034] Dans le cadre de l’invention, et ce quelle que soit la variante de mise en œuvre, la détermination du niveau de transcrits du ou des gènes marqueurs est réalisée, en particulier au niveau ARNm. La détermination du niveau de transcrits est, notamment, réalisée par hybridation, amplification ou séquençage, et en particulier par RT-qPCR.
[0035] Selon l’invention, le niveau de transcrits du ou des gènes marqueurs obtenu peut être une valeur normalisée par rapport au niveau de transcrits d’un ou plusieurs gènes de ménage, notamment choisi(s) parmi DECR1, HPRT1 et PPIB. [0036] La présente invention concerne également un kit de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant :
- au moins un moyen de détermination du niveau de transcrits d’un gène marqueur sélectionné parmi les ISG, notamment choisi parmi les oligonucléotides,
- au moins une valeur seuil stockée sur un support lisible par un ordinateur et/ou utilisée sous la forme d’un code exécutable par un ordinateur configuré pour comparer le niveau de transcrits dudit gène marqueur, déterminé grâce au moyen de détermination ou une donnée obtenue à partir dudit niveau de transcrits du gène marqueur, à ladite valeur seuil.
[0037] Si plusieurs gènes marqueurs ISG sont utilisés, le kit comprendra, généralement, au moins un moyen de détermination du niveau de transcrits pour chacun d’entre eux.
[0038] Si plusieurs gènes marqueurs ISG sont utilisés, le kit peut comprendre une valeur seuil et/ou un niveau de référence pour chacun d’entre eux, stocké(s) sur un support lisible par un ordinateur et/ou utilisé(s) sous la forme d’un code exécutable par un ordinateur.
[0039] Si plusieurs gènes marqueurs sont utilisés, le kit peut également comprendre un code exécutable permettant de générer une donnée de référence globale, à partir de la comparaison de chaque gène marqueur à sa donnée de référence et permettant une comparaison de cette donnée globale à une valeur seuil. Dans ce cas, la comparaison du niveau de chaque gène marqueur à son niveau de référence peut prendre la forme du calcul d’un rapport, comme précédemment expliqué.
[0040] Selon certains modes de réalisation, ladite valeur seuil correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[0041] Selon certains modes de réalisation, un tel kit selon l’invention comprend, en outre, au moins un niveau de référence pour ledit gène marqueur, stocké sur un support lisible par un ordinateur et/ou utilisé sous la forme d’un code exécutable par un ordinateur configuré pour comparer le niveau de transcrits du gène marqueur déterminé grâce au moyen de détermination audit niveau de référence, avec ledit niveau de référence qui est, de préférence, le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets.
[0042] De manière avantageuse, de tels kits selon l’invention comprennent, en outre, au moins un moyen de détection d’un virus respiratoire, et notamment au moins un moyen de détection d’un virus SARS-CoV-2 et/ou au moins un moyen de détection du virus de la grippe (influenza A, B ou C).
[0043] La présente invention concerne également un kit de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant :
- au moins un moyen de détermination du niveau de transcrits d’un gène marqueur sélectionné parmi les ISG, notamment choisi parmi les oligonucléotides,
- au moins un moyen de détection d’un virus respiratoire, et notamment au moins un moyen de détection d’un virus SARS-CoV-2.
[0044] De manière avantageuse, un tel kit comprend, en outre, au moins une valeur seuil stockée sur un support lisible par un ordinateur et/ou utilisée sous la forme d’un code exécutable par un ordinateur configuré pour comparer le niveau de transcrits dudit gène marqueur déterminé grâce au moyen de détermination, ou une donnée obtenue à partir dudit niveau de transcrits du gène marqueur, à ladite valeur seuil.
[0045] Selon certains modes de réalisation, ladite valeur seuil correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto- anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[0046] Selon d’autres modes de réalisation, un tel kit selon l’invention comprend, en outre, au moins un niveau de référence pour ledit gène marqueur, stocké sur un support lisible par un ordinateur et/ou utilisé sous la forme d’un code exécutable par un ordinateur configuré pour comparer le niveau de transcrits du gène marqueur déterminé grâce au moyen de détermination audit niveau de référence, avec ledit niveau de référence qui est, de préférence, le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets.
[0047] Quel que soit leur mode de réalisation, les kits de détection selon l’invention peuvent comprendre, en outre, un échantillon contrôle négatif, tel qu’un échantillon permettant de s’assurer de l’absence de contamination, et/ou un échantillon contrôle positif qui correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur à une concentration représentative du niveau de transcrits d’un sujet ayant une infection par un virus respiratoire réplicatif ou chez une population de sujets ayant une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0048] L’invention sera mieux comprise au vu de la description détaillée ci-après, en référence aux dessins.
Brève description des dessins
[0049] [Fig. 1] La figure 1 met en évidence la corrélation entre le score nasal ISG de type l/lll obtenu à partir d’un prélèvement naso-pharyngé (NP) et le score sanguin ISG de type l/lll obtenu à partir d'un échantillon de sang entier PAXgene™ (PX, n = 75 échantillons longitudinaux provenant de 23 patients). Les différents scores sont mesurés au moyen de la technologie FilmArray®. Le coefficient de corrélation de Spearman est indiqué.
[0050] [Fig. 2] La figure 2 met en évidence que le score nasal (NP pour naso- pharyngé) ISG, déterminé par la technologie FilmArray® est corrélé aux niveaux d'IFN-a2 (fg/ml) dans le plasma (n = 39 échantillons ayant une valeur détectable provenant de 23 patients), mesurés par une matrice à molécule unique (SIMOA®) utilisant une trousse du commerce. Le coefficient de corrélation de Spearman est indiqué.
[0051] [Fig. 3] La figure 3 présente les mesures cinétiques des scores NP (carré gris) et sanguin (carré noir) ISG après diagnostic de COVID-19. n = 75 échantillons longitudinaux provenant de 23 patients. Les courbes d'ajustement de Loess représentent des régressions polynomiales locales telles que déterminées par la méthode de Loess. Le Cl à 95 % est indiqué (zone grise).
[0052] [Fig. 4] La figure 4 représente le diagramme de dispersion du score NP ISG chez des patients ayant une culture virale de SARS-CoV-2 nasal négative ou positive (n = 30 échantillons longitudinaux provenant de 12 patients). Les cercles noirs représentent les échantillons de culture virale négative et les cercles vides l'échantillon de culture virale positive, les triangles correspondent aux échantillons positifs en culture cellulaire sans effet cytopathique.
[0053] [Fig.5] La figure 5 est une courbe ROC (de l’anglais « Receiver Operating Curve ») distinguant les résultats de cultures virales de SARS-CoV-2 positives et négatives. La zone sous la courbe et l'indice de Youden sont indiqués et représentent l'aptitude du score NP ISG de type l/lll à séparer les cultures virales positives et négatives.
[0054] [Fig. 6] La figure 6 représente le score nasal ISG de type l/lll mesuré après dilutions en série au 1/10 (10° à 10-2) d'échantillons de NP (ligne en trait plein, FilmArray®) ainsi que la détection de SARS-CoV-2 (détection Ct, ligne en tirets, trousse SARS-CoV-2 R-gene®). La zone grise inférieure indique la valeur seuil du score nasal d’ISG de type l/lll dit normal (1,99) et la zone grise supérieure marque la valeur de 6,75 du score nasal d’ISG de type l/lll associé à une culture virale d’un virus réplicatif.
[0055] [Fig. 7] La figure 7 compare la charge virale nasale normalisée et le score NP ISG de type l/lll chez des patients gravement atteints par la COVID-19, sans auto-anticorps (nAb) anti-IFN (cercles vides) ou avec des auto- anticorps neutralisants dirigés contre l'IFN-a (triangles noirs). La zone grise représente la charge virale obtenue pour 90 % des patients à COVID-19 légère avec un score nasal d’ISG de type l/lll > 6,75 (valeur de séparation associée à une culture virale d’un virus réplicatif).
[0056] [Fig. 8] La figure 8 est une courbe ROC discriminant entre le résultat positif et négatif de la PCR virale pour le score IFN de type l/lll. L’aire sous la courbe, l’index de Youden et le point de coupure sont montrés et représentent la capacité du score IFN de type l/lll nasal à discriminer les échantillons PCR positifs des négatifs.
[0057] [Fig. 9] La figure 9 est un graphique représentant le score IFN l/lll en fonction de la PCR virale, de prélèvements NP d’individus PCR virale négative (n=23) ou PCR positive au virus de la grippe (influenza B) (n=42). Les comparaisons ont été réalisées en utilisant un test Kruskal-Wallis suivi d’un test Dunn de comparaison multiple (p<0,0001 ****).
[0058] [Fig. 10] La figure 10 met en évidence les graphiques représentant (A) le taux d’expression d’ARNm IFI27 en fonction de la PCR virale, (B) le taux d’expression d’ARNm IFI44L en fonction de la PCR virale, (C) le taux d’expression d’ARNm RSAD2 en fonction de la PCR virale et (D) le taux d’expression d’ARNm IFIT1 en fonction de la PCR virale. Le taux d’expression des ARNm est exprimé en log2 du ratio entre le OR de l’ISG et le OR médian de ce même ISG d’une population de VS. Les OR ont été calculés pour les échantillons NP NEG (n=23) et GRB (n=42) en convertissant le Ct obtenu avec le panel de poche IFN FilmArray® BioFire® en OB(2 CT) divisé ensuite par la moyenne géométrique des OB des gènes de ménage. NP (nasopharyngé), GRB (Virus de la grippe - influenza B), VS (volontaires sains), OR (quantité relative) OB (quantité brute).
[0059] [Fig. 11] La figure 11 est un graphique représentant le score IFN l/lll FilmArray en fonction de la culture virale, de prélèvements NP de patients infectés par le virus de la grippe (influenza B) (n=7 ; n=28) et VRS (n=25 ; n=7). Les comparaisons ont été réalisées en utilisant le test non paramétrique Wilcoxon Mann et Withney (p<0,0001***).
[0060] [Fig. 12] La figure 12 est une courbe ROC discriminant entre le résultat positif et négatif de la culture virale du virus de la grippe pour le score IFN l/lll nasal. L’aire sous la courbe, l’index de Youden et le point de coupure sont montrés et représentent la capacité du score IFN l/lll nasal et de la charge virale à différencier les cultures positives et négatives.
Description détaillée de l’invention
[0061] Certains termes et expressions utilisés dans le cadre de l’invention sont détaillés ci-après.
[0062] Le terme « sujet » désigne un mammifère et, de préférence, un être humain. Ledit sujet, qui est un être humain, peut être un patient qui est entré en contact avec un professionnel de santé, tel qu’un médecin (par exemple, un médecin généraliste) ou une structure médicale ou un établissement de santé (par exemple, un hôpital ou une clinique, et plus particulièrement un service des urgences, un service de réanimation, une unité de soins intensifs ou une unité de soins continus, ou une structure médicalisée pour personnes âgées, de type EHPAD).
[0063] En tant qu’ « échantillon provenant de la bouche ou du nez d’un sujet », il peut s’agir d’un échantillon prélevé dans le nez ou la bouche du sujet ou encore d’un échantillon d’air rejeté par le sujet. L’échantillon peut être un échantillon nasal ou un échantillon de salive, mais est, de préférence, un échantillon oro pharyngé ou naso-pharyngé. Les échantillons oro-pharyngés ou naso-pharyngés sont notamment obtenus en réalisant un prélèvement à l’aide d’un écouvillon, respectivement au fond de la bouche ou du nez d’un sujet.
[0064] Par « virus réplicatif », on entend un virus qui est capable de se multiplier chez ledit sujet. Ainsi, un sujet infecté par un virus réplicatif est un vecteur de transmission pour un tel virus, à un autre sujet. En particulier, la notion de virus réplicatif exclut les fragments de virus, qui ont perdu leur capacité de reproduction. De tels fragments de virus vont donner un résultat positif, lors d’un test de détection de l’ADN ou de l’ARN du virus, mais n’ont pas la capacité de se répliquer chez le sujet, qui ne peut donc pas être un vecteur de transmission du virus correspondant. En présence d’un virus réplicatif, le risque de transmission du virus est important, ce qui n’est pas le cas en l’absence de possibilité de réplication. La capacité d’un virus à se multiplier (se répliquer) et donc son caractère réplicatif peuvent être définis par le fait que ce dernier se multiplie (augmentation de la charge virale), ce qui peut se traduire par l’observation d’un effet cytopathique lorsqu’il est mis en culture, ou qu’une partie de l’échantillon test prélevé susceptible de contenir un tel virus réplicatif est mise en culture, sur des cellules épithéliales, telles que les cellules Vero. Des cellules Vero particulièrement adaptées pour tester la capacité de réplication d’un virus sont notamment celles déposées sous le numéro ATCC CCL-81®, ou encore les cellules Vero E6 déposées sous le numéro ATCC CRL-1586®. Un effet cytopathique peut, notamment, être matérialisé par la présence de plages de lyse, ce qui est caractéristique de la présence de particules virales réplicatives. Les protocoles de mise en culture de virus ou d’échantillon sur cellules épithéliales, qui peuvent être utilisés pour mettre en évidence une multiplication virale, sont largement connus de l’homme du métier et sont décrits, par exemple, dans Leland D.S. étal., 2007, et plus spécifiquement dans Stelzer-Braid S., et al., 2020. Cependant, de telles méthodes demandent un certain temps, notamment au moins 96 heures, alors qu’avec les procédés selon l’invention, il est possible d’obtenir une conclusion quant à la présence ou l’absence d’un virus respiratoire réplicatif en un temps typiquement de 45 minutes à 6 heures. Etant donné qu’un sujet infecté par un virus réplicatif est un vecteur de transmission pour un tel virus à un autre sujet, il est particulièrement avantageux dans le cadre de l’invention de proposer des procédés, utilisations et kits permettant de déterminer si un sujet est ou non atteint d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, notamment dans le cadre de la pandémie au virus SARS-CoV-2.
[0065] Par « virus respiratoire », on entend un virus qui infecte les voies respiratoires et/ou les poumons. De tels virus se retrouvent classiquement dans les échantillons prélevés dans le nez, la gorge et/ou la bouche d’un sujet, notamment dans les échantillons nasaux ou naso-pharyngés (qui nécessitent un prélèvement plus profond dans le nez), les échantillons oro-pharyngés (qui nécessitent un prélèvement au fond de la gorge) ou la salive. A titre d’exemple de virus respiratoire, on peut citer les coronavirus saisonniers, le virus SARS- CoV-2, quels que soient ses variants, le virus de la grippe (influenza A, B et C), le virus respiratoire syncytial (VRS), les rhinovirus, les métapneumovirus, les virus parainfluenza et les adénovirus... A ce jour, les variants connus du virus SARS- CoV-2, sont, notamment ses variants dits anglais, brésilien, sud-africain, américain, indien. La connaissance de ces variants et leurs dénomination évoluent (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation- reports/20210225_weekly_epi_update_voc-special- edition.pdf?sfvrsn=1eacfa47_7&download=true) et l’invention est applicable à chacun d’entre eux. La découverte du « variant anglais » de SARS-CoV-2 remonte au 20 septembre 2020, dans le Kent (Sud-Est de l’Angleterre) (https://www.lemonde.fr/blog/realitesbiomedicales/tag/vui-202101-01/). Le 14 décembre, le Royaume-Uni a signalé à l’Organisation mondiale de la santé (OMS) la circulation de ce variant. Baptisé dans un premier temps VUI 202012/01 (pour Variant Under Investigation, année 2020, mois 12, variant 01), il a été rapidement renommé, le 18 décembre 2020, VOC 202012/01 (pour Variant Of Concern, littéralement « variant préoccupant »). Il fait partie du lignage B.1.1.7 dans l’arbre phylogénétique et comporte la délétion 69-70, encore désignée DH69L/70. Le variant brésilien P.1 est un descendant du lignage B.1.1.28 (qui a circulé abondamment dans l’État de Rio de Janeiro et qui a probablement émergé au Brésil en février 2020). Ce variant brésilien P.1 renferme de nombreuses mutations, en particulier les mutations E484K, K417T et N501Y. Le variant japonais qui dérive d’un lignage présent au Brésil (B.1.1.28) renferme un nombre très élevé de changements génétiques. Il comporte douze mutations d’acides aminés dans la protéine spike, notamment les mutations N501Y, E484K, K417T. Le variant sud-africain baptisé 501Y.V2 (lignage B.1.351) lui aussi renferme différentes mutations dont trois, K417N, E484K et N501Y, localisées dans le domaine RBD de la protéine spike, le domaine de fixation au récepteur.
[0066] Selon un mode de réalisation particulier, le virus respiratoire est choisi parmi les virus SARS-CoV-2, le virus de la grippe (influenza A, B et C), le virus respiratoire syncytial (VRS), les rhinovirus, les métapneumovirus, les virus parainfluenza et les adénovirus, et de préférence parmi les virus SARS-CoV-2 et ses variants, et le virus de la grippe (influenza A, B et C).
[0067] Ainsi, selon une variante de ce mode de réalisation, le virus respiratoire est choisi parmi le virus SARS-CoV-2 et ses variants. Selon une autre variante de ce mode de réalisation, le virus respiratoire est choisi parmi les virus influenza A, B et C, de préférence il s’agit du virus influenza B.
[0068] Les interférons (IFN) sont parmi les premières molécules produites dans l’organisme, après reconnaissance d’un pathogène par les récepteurs de l’immunité innée. Les interférons sont largement décrits dans la littérature. On pourra se référer, par exemple, Manry J. étal., 2012 et Hertzorg P.J. étal., 2016. Les IFN humains ont été classés en trois types, en fonction des récepteurs qu’ils utilisent, de leur homologie et de leur localisation chromosomique. Il existe 17 IFN de type 1 : 13 sous-types d’IFN-a, et les IFN-b, e, k et w. Les gènes codant ces IFN sont localisés sur le chromosome 9 et se lient à un même récepteur composé des sous-unités IFNAR1 et IFNAR2. L’IFN-g, le seul IFN de type II, est le produit d’un gène localisé sur le chromosome 12, et utilise un récepteur composé des sous-unités IFN-yR1 et IFN-yR2. Les IFN de type III ont été décrits plus récemment et correspondent aux cytokines : IL-28A, IL-28B et IL-29 (également nommées d’IFN-A2, IFN-A3 et IFN-A1). Les gènes codant ces IFN sont localisés sur le chromosome 19. Les interférons régulent l'expression de plusieurs centaines de gènes, les gènes dits stimulés par les interférons (ou ISG). Les IFN de type I sécrétés se lient à des récepteurs d'interféron (IFNAR) qui réalisent une signalisation par l'intermédiaire de la Janus kinase 1 (JAK1) et de la tyrosine kinase 2 (Tyk2) et activent la production de STAT1 , STAT2 et IRF9. Ces derniers forment le complexe ISGF-3 qui se translocalise sur le noyau pour se lier à des éléments de réponse stimulés par un interféron (ISRE) dans le génome, en induisant ainsi l'expression de centaines d'ISG, dont la plupart ont une activité antivirale. Les IFN de type III sécrétés se lient à un autre récepteur, consistant en IFNLR et IL10RB, et cependant activent le même ISGF-3, induisant des ISG (Lazear, H. M étal., 2019) se chevauchant largement. Les IFN-I et III sont impliqués en tant que première ligne de défense contre une infection, puisqu'ils favorisent la clairance des virus, induisent une réparation des tissus, et stimulent la réponse immunitaire adaptative.
[0069] A titre d’exemple de gènes ISG, on peut citer ADAR, BST2, CHUK, DDX58, EIF2AK2, FOS, GBP2, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, IFI35, IFI6, IFIH1, IFIT2, IFIT3, IFITM1 , IFITM2, IFITM3, IFNA14/16, IFNA2, IFNA4/7/10/17/21 , IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNAR1 , IFNAR2, IFNB1 , IKBKB, IKBKE, IKBKG, IRF1, IRF3, IRF4, IRF7, IRF9, JAK1 , JUN, MAP3K7, MAPK14, MAPK8, MAVS, MX1 ,
MYD88, NFKB1 , OAS1 , OAS2, OAS3, OASL, PSMB8, PTPN6, RIPK1 , RNASEL, SAMHD1 , SOCS1 , SOCS3, STAT1 , STAT2, TBK1 , TLR7, TRAF3, TRAF6,
TYK2, XAF1 , IFNL1 , IFNL2/3, IFNL4, IFNLR1 , IL10RB, IFI27, IFI44L IFIT1, RSAD2, ISG15, et SIGLEC1. Les ISG choisis parmi IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 et SIGLEC1 (Picard C, étal., 2018) sont préférés dans le cadre de l’invention. Leurs séquences sont données dans les bases ENSEMBL et NCBI. Ces ISG sont, notamment, stimulés par des interférons de type I et III. IFI27, IFI44L, RSAD2 et IFIT 1 , qui sont quatre ISG régulés par l'intermédiaire d'éléments ISRE dépendants du facteur génique 3 stimulé par un IFN (ISGF3), sont encore plus préférés dans le cadre de l’invention.
[0070] En particulier, dans le cadre de l’invention, on détermine le niveau de transcrits de un ou plusieurs gènes marqueurs du type ISG, choisis parmi : IFI27, IFI44L, IFIT 1 , RSAD2, ISG15, et SIGLEC1 (Picard C, étal., 2018).
[0071] Par « anticorps neutralisant », on entend un anticorps qui neutralise l’effet de la cible contre laquelle il est dirigé.
[0072] Par « auto-anticorps », on entend des anticorps générés par le sujet lui-même dirigés contre des protéines du soi. De tels auto-anticorps peuvent être générés en l’absence d’infection.
[0073] Par « symptôme », on entend, tout type de symptôme, par exemple, des symptômes qui peuvent être qualifiés de bénins, tels que de la fatigue, des courbatures, de la fièvre, des symptômes respiratoires, telle que de la toux sans pneumopathie, une céphalée, une anosmie ou une agueusie, ou encore des symptômes graves, qui nécessitent, une hospitalisation en soin intensif ou une aide respiratoire. Dans le cas du SARS-CoV-2, une classification d’infections par SARS-CoV-2 (pour les personnes dont le test de dépistage du SARS-CoV-2, par un test PCR ou un test antigénique, est positif), asymptomatique à critique a été établie en fonction des symptômes (Trouillet-Assant, S. étal., 2020 et https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/overview/clinical-spectrum/) :
- infection asymptomatique ou présymptomatique : personnes dont le test de dépistage du SARS-CoV-2 est positif à l'aide d'un test virologique, mais qui ne présentent aucun symptôme compatible avec la COVID-19 ;
- infection bénigne : personnes qui présentent l'un des divers signes et symptômes de la COVID-19 (par exemple, fièvre, toux, mal de gorge, malaise, maux de tête, douleurs musculaires, nausées, vomissements, diarrhée, perte du goût et de l'odorat), mais qui ne présentent pas un essoufflement, une dyspnée ou une imagerie thoracique anormale ;
- infection modérée : personnes qui présentent des signes de maladie des voies respiratoires inférieures lors d'une évaluation clinique ou d'une imagerie et qui ont une saturation en oxygène (Sp02) > 94 % à l'air ambiant et au niveau de la mer ;
- infection grave : personnes qui ont une Sp02 < 94 % à l'air ambiant et au niveau de la mer, un rapport de la pression artérielle partielle d'oxygène à la fraction d'oxygène inspiré (Pa02/Fi02) < 300 mm Hg, une fréquence respiratoire > 30 respirations/min, ou des poumons infiltrés > 50 % ;
- infection critique (sepsis) : personnes souffrant d'insuffisance respiratoire, de choc septique et/ou de dysfonctionnement de plusieurs organes.
[0074] En particulier, les procédés selon l’invention pourront être mis en œuvre sur des échantillons de sujets ayant une infection au SARS-CoV-2, qui est asymptomatique, présymptomatique, bénigne ou modérée.
[0075] Une « comparaison » ou une vérification d’une « différence » entre deux valeurs ou niveaux peut être effectuée par toute technique connue, et notamment par toute technique automatisée, réalisée par un ordinateur ou assistée par ordinateur. La comparaison ou la vérification d’une « différence » peut impliquer le calcul d’un rapport ou d’une différence.
[0076] Dans le cadre de l’invention, l’émission d’une conclusion, quant à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez le sujet dont est issu l’échantillon test, peut également être effectuée par toute technique automatisée, réalisée par un ordinateur ou assistée par ordinateur.
[0077] La « médiane » d’un ensemble de valeurs est la valeur située au milieu de la valeur la plus faible et de la valeur la plus élevée de l’ensemble de valeurs.
[0078] Par test de détection d’un virus respiratoire, test de diagnostic d’un virus respiratoire ou test de détection de la présence d’une infection par un virus respiratoire, on entend tout test connu de l’homme du métier permettant d’apporter une telle conclusion, notamment les tests de détection de l’ADN ou de l’ARN dudit virus respiratoire, notamment les tests PCR ou encore les tests antigéniques. [0079] L’invention propose d’utiliser le niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur sélectionné parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG, déterminé dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez d’un sujet, pour déterminer si ledit sujet est atteint ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0080] Pour cela, l’invention propose des procédés de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant une étape i) de détermination, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, du niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur sélectionné parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG. Dans les procédés selon l’invention, le niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur sélectionné parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG est utilisé pour déterminer si ledit sujet est ou non atteint d’une infection par un virus respiratoire réplicatif. C’est-à-dire que dans les procédés selon l’invention, une conclusion quant à la présence éventuelle d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, est délivrée en prenant en compte le niveau de transcrits d’un gène marqueur ISG, voire de plusieurs niveaux de transcrits de différents gènes marqueurs ISG. La conclusion peut être apportée sur cette seule base (c’est-à-dire à partir du niveau de transcrits d’un seul gène marqueur ISG ou de plusieurs niveaux de transcrits de différents gènes marqueurs ISG) ou en prenant en compte d’autres gènes que les ISG, bien que ceci soit non préféré dans le cadre de l’invention.
[0081] Selon l’invention, la détermination du niveau de transcrits se fait par détection quantitative d’un ou plusieurs transcrit(s) du gène, et en particulier du type ARN messager (ARNm), dans l’échantillon d’intérêt (qu’il s’agisse de l’échantillon test ou d’un échantillon de référence). La détermination du niveau de transcrits d’un ISG, implique donc une mesure quantitative représentative de la quantité de transcrits dudit ISG, notamment de la quantité d’ARNm dudit ISG, dans l’échantillon test.
[0082] Par « transcrit », on entend les ARN, et en particulier les ARN messagers (ARNm), issus de la transcription du gène. Plus précisément, les transcrits sont les ARN produits par la transcription d’un gène suivi des modifications post- transcriptionnelles des formes pré-ARN. Dans le cadre de la présente invention, la mesure du niveau de transcrits d’un même gène peut comprendre le niveau de transcrits identiques ou différents. De préférence, dans le cadre de l’invention, la détermination du niveau de transcrits concerne la détermination du niveau d’ARNm dudit gène. Dans le cas d’un transcrit ARNm, la détection peut être réalisée par une méthode directe, par tout procédé connu de l’homme du métier permettant de déterminer la présence dudit transcrit dans l’échantillon, ou par détection indirecte du transcrit après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit en ADN. De nombreuses méthodes existent pour la détection des acides nucléiques (voir par exemple Kricka étal., 1999, et Relier G. H. et al., 1993). L’expression des gènes peut notamment être mesurée par Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ou RT-PCR, de préférence par RT-PCR quantitative ou RT-qPCR (par exemple en utilisant la technologie FilmArray®), par séquençage (incluant le séquençage haut débit) ou par des techniques d’hybridation (par exemple avec des micropuces d’hybridation ou par des techniques du type NanoString® nCounter®). Une technique, sans extraction d’ARN ou d’ADN, pourra être mise en œuvre, ce qui est le cas de la technique FilmArray® (Poritz et al. 2011 ).
[0083] La détermination du niveau de transcrits d’un gène permet de déterminer la quantité d’un ou plusieurs transcrits dudit gène présent dans l’échantillon d’intérêt ou d’en donner une valeur dérivée qui est représentative de la quantité de transcrits présente dans l’échantillon d’intérêt. Une telle valeur dérivée représentative de la quantité peut, par exemple, être la concentration absolue, calculée grâce à une courbe de calibration obtenue à partir de dilutions successives d’une solution d’amplicons de concentration connue. Elle peut également correspondre à la valeur normalisée et/ou calibrée de la quantité de transcrit, comme le CNRQ (Calibrated Normalized Relative Quantity), (Hellemans étal., 2007), qui intègre les valeurs d’un échantillon de référence (ou d’un calibrateur) et d’un ou plusieurs gènes de ménage (appelés également gènes de référence). A titre d’exemples de gènes de ménage, on peut citer les gènes DECR1 , HPRT1 , PPIB, RPLP0, PPIA, GLYR1 , RANBP3, 18S, GAPDH, ACTB, ABCF1 , ALAS1 , GUSB, HPRT1 , MRPS7, NMT1 , NRDE2, OAZ1 , PGK1 , SDHA, STK1 11P et TBP. [0084] D’une manière générale, dans les procédés et utilisations selon l’invention, quels que soient leurs modes de réalisation, le niveau de transcrits d’un gène marqueur sélectionné déterminé pour l’échantillon test du sujet est comparé à un niveau de référence pour ledit gène marqueur, qui dans certains modes de réalisation est également utilisé en tant que valeur seuil pour apporter une conclusion quant à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, chez le sujet d’intérêt. Une telle comparaison peut être effectuée de différentes manières, et ce de manière connue de l’homme du métier. Dans le cadre de l’invention, il est également possible, pour la comparaison, de calculer un rapport entre le niveau de transcrits d’un gène marqueur sélectionné et le niveau de référence pour ledit gène marqueur, notamment avant d’effectuer une comparaison avec la valeur seuil utilisée.
[0085] De préférence, dans le procédé selon l’invention, quel que soit le mode de réalisation, le niveau de transcrits du(des) gène(s) marqueur(s) sélectionné(s) est normalisé par rapport au niveau de transcrit d’un ou plusieurs gènes de ménage (ou gènes de référence), comme cela est connu de l’homme du métier ; de préférence encore en utilisant un ou plusieurs des gènes de ménage suivants : DECR1 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr8:90, 001 ,352-90,053,633), HPRT1 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chrX:134,452,842-134,520,513) et PPIB (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr15:64, 155,812-64, 163,205). Dans un tel cas, le niveau de référence utilisé est également normalisé au préalable, de la même manière. La normalisation, que ce soit pour le niveau de référence ou pour le niveau de transcrits de l’échantillon test, est réalisée avant la comparaison, notamment avant le calcul d’un rapport entre le niveau de transcrits de l’échantillon test et le niveau de référence. Lorsqu’une valeur seuil différente d’un niveau de référence est utilisée pour émettre une conclusion, il pourra être tenu compte de cette normalisation, pour le choix de la valeur seuil.
[0086] Si le niveau de transcrits d’un gène marqueur est normalisé par rapport au niveau de transcrits d’un ou plusieurs gènes de ménage, bien entendu, cela implique que le procédé selon l’invention inclut la détermination du niveau de transcrits du ou des gènes de ménage utilisé(s) pour la normalisation. [0087] Selon une première variante de réalisation, le niveau de transcrits d’un seul gène marqueur sélectionné parmi les ISG peut être déterminé à l’étape i) et il peut être conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, si la comparaison du niveau de transcrits dudit gène marqueur ISG avec une valeur seuil prédéterminée, montre qu’il y a une différence avec ladite valeur seuil donnée ou prédéterminée correspondant audit gène marqueur. En particulier, ladite différence correspond à un niveau de transcrits pour l’échantillon test qui est supérieur à celui correspondant à la valeur seuil.
[0088] De manière avantageuse, ladite valeur seuil correspond à un niveau de référence dudit gène marqueur qui est le niveau de transcrits dudit gène marqueur chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[0089] De manière préférée, ladite différence entre le niveau de transcrits du gène marqueur ISG sélectionné déterminé dans l’échantillon test et le niveau de référence dudit gène marqueur ISG (valeur seuil), correspond au fait que le niveau de transcrits dudit gène marqueur ISG déterminé dans l’échantillon test est augmenté, voire augmenté de manière significative, en particulier d'au moins 10%, d'au moins 20%, d'au moins 30 %, d'au moins 40%, d'au moins 50%, d’au moins 60%, d’au moins 70%, d’au moins 80% ou d’au moins 90% par rapport au niveau de référence dudit ISG. L’augmentation considérée comme pertinente pour apporter une conclusion sera fonction de la valeur seuil considérée, et notamment du niveau de référence utilisé comme valeur seuil, et sera adaptée en fonction par l’homme du métier. En particulier, si la valeur seuil correspond au niveau de référence dudit gène marqueur ISG qui est le niveau de transcrits dudit gène marqueur ISG chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, il pourra suffire que le niveau de transcrits de l’ISG sélectionné déterminé dans l’échantillon test soit simplement supérieur à la valeur seuil.
Mais, si est pris comme valeur seuil, un niveau de référence différent notamment le niveau chez des sujets non atteints d’une infection respiratoire ou plus généralement des sujets sains (sans infection quelle qu’elle soit, comme le sont notamment des donneurs de sang), la différence par rapport à la valeur seuil devra être plus significative, notamment selon un des % d’augmentation susmentionné. Une augmentation pourra être jugée significative, après application d’une méthode statistique bien connue de l’homme du métier, tel que le test de Student ou Wilcoxon. Une telle méthode est notamment utilisée dans les exemples.
[0090] Dans de tels cas de procédé utilisant un seul gène marqueur pour apporter une conclusion, ledit gène marqueur sélectionné parmi les ISG peut être tout gène ISG donné dans la présente description, mais est, de préférence, l’IFIT 1 ou NFI44L.
[0091] Lorsque plusieurs gènes marqueurs sont utilisés dans le cadre de l’invention, la comparaison peut être effectuée en comparant le niveau de transcrits de chaque gène marqueur sélectionné avec une valeur seuil donnée ou prédéterminée pour chaque gène marqueur considéré. Il est également possible d’effectuer une comparaison plus globale. Notamment, il est possible d’obtenir le niveau de transcrits de plusieurs gènes marqueurs et de comparer le niveau de transcrits global de ces gènes marqueurs à une valeur seuil globale unique. Il est aussi possible de réaliser une comparaison du niveau de transcrits de chaque gène marqueur sélectionné avec une valeur seuil donnée pour chaque gène marqueur. Dans un tel cas, de manière avantageuse, ladite valeur seuil correspond à un niveau de référence dudit gène marqueur qui est le niveau de transcrits dudit gène marqueur chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[0092] Dans ce contexte, selon une deuxième variante de réalisation des procédés selon l’invention :
- les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG peuvent être déterminés à l’étape i), pour l’échantillon test, et
- le niveau de transcrits de chaque gène marqueur déterminé dans l’échantillon test est comparé avec la valeur seuil dudit gène marqueur ISG correspondant.
[0093] Dans la deuxième variante de réalisation, il peut être conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en cas de différence avec la valeur seuil, pour au moins un des gènes marqueurs, pour lequel le niveau de transcrits a été déterminé dans l’échantillon test.
[0094] En particulier, ladite différence correspond à un niveau supérieur à celui de la valeur seuil. Notamment, il pourra être conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, si pour au moins un des gènes marqueurs ISG dont le niveau de transcrits est sélectionné, le niveau de transcrits dudit gène marqueur ISG déterminé dans l’échantillon test est augmenté, voire augmenté de manière significative, en particulier d'au moins 10%, d'au moins 20%, d'au moins 30 %, d'au moins 40%, d'au moins 50%, d’au moins 60%, d’au moins 70%, d’au moins 80% ou d’au moins 90% par rapport à la valeur seuil considérée pour ledit ISG. Là encore, l’augmentation considérée comme pertinente pour apporter une conclusion sera fonction de la valeur seuil considérée, et notamment du niveau de référence utilisé comme valeur seuil, et sera adaptée en fonction par l’homme du métier. Dans de tels cas, les procédés selon l’invention pourront comprendre la détermination du niveau de transcrits de 1 à 71 gènes marqueurs choisis parmi ceux donnés dans la présente description, et, de préférence du niveau de transcrits de 1 à 6, gènes marqueurs choisis par les ISG, et notamment choisis parmi IFI27, IFI44L, IFIT 1 , RSAD2, ISG15 et SIGLEC1 . En particulier, il pourra être conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, si pour au moins un, voire au moins deux, ou trois à quatre, des ISG dont le niveau de transcrits est sélectionné, le niveau de transcrits dudit ou desdits ISG déterminé(s) dans l’échantillon test est augmenté par rapport à la valeur seuil correspondante, et, notamment selon un pourcentage d’augmentation défini précédemment. [0095] Dans certains modes de réalisation, une comparaison peut être effectuée en calculant un rapport du niveau de transcrits dudit gène marqueur sélectionné déterminé pour l’échantillon test sur un niveau de référence correspondant pour ledit gène marqueur. Il est également possible qu’une telle comparaison soit effectuée en calculant le rapport du niveau de référence dudit gène marqueur sélectionné sur le niveau de transcrits dudit gène marqueur sélectionné déterminé pour l’échantillon test. Ensuite, un rapport global correspondant à la médiane desdits rapports, peut être calculé et utilisé pour apporter une conclusion quant à la présence ou l’absence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet. [0096] Dans une troisième variante de réalisation, il peut également être conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en mettant en œuvre les étapes suivantes :
- pour chaque gène marqueur pour lequel le niveau de transcrits dans l’échantillon test est déterminé à l’étape i), le rapport entre ledit niveau de transcrits sur le niveau de référence correspondant dudit gène marqueur, est calculé,
- la médiane de tous les rapports obtenus est, ensuite, calculée et il est conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, lorsque ladite médiane est supérieure à une valeur seuil, qui peut par exemple être égale à 1 ,5, de préférence supérieure à 2, 3, 4, 5, ou 6. De telles valeurs sont déterminées et adaptées par l’homme du métier, de manière tout à fait classique, en fonction du sujet et du niveau de référence utilisé pour le calcul du rapport, notamment, par application d’une méthode statistique telle que précédemment décrite. En particulier, le niveau de référence dudit gène marqueur pour le calcul des rapports peut être le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets dudit gène marqueur. Un sujet non infecté par un virus respiratoire est, en particulier, un sujet négatif à un test de détection de la présence d’un virus respiratoire. De manière préférée, le niveau de référence utilisé pour le calcul du rapport est le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ne possédant pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w ou chez une population de tels sujets.
[0097] Dans de tels cas, les procédés selon l’invention pourront comprendre la détermination du niveau de transcrits pour 1 à 71 , et de préférence pour 1 à 6, gènes marqueurs choisi(s) par les ISG, et notamment choisi(s) parmi IFI27, IFI44L, IFIT1 , RSAD2, ISG15 et SIGLEC1.
[0098] En particulier, le procédé selon l’invention comprend : i) la détermination des niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 et SIGLEC1 , pour l’échantillon test, ii) pour chaque gène marqueur pour lequel le niveau de transcrits dans l’échantillon test est déterminé à l’étape i), le rapport entre ledit niveau de transcrits sur le niveau de référence dudit gène marqueur, est calculé, iii) la médiane de tous les rapports obtenus est, ensuite, calculée et il est conclu à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, lorsque ladite médiane est supérieure à la valeur seuil qui peut par exemple être égale à 1 ,5, de préférence supérieure à 2, 3, 4, 5, ou 6.
[0099] Dans le cadre de ce procédé, il est possible de déterminer à l’étape i) et d’utiliser dans les étapes ii) et iii), les niveaux de transcrits de tous les gènes marqueurs IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2, voire de tous les gènes marqueurs IFI27, IFI44L, IFIT1 , RSAD2, ISG15 et SIGLEC1. Selon un mode de réalisation particulier illustré dans les exemples, seuls les niveaux de transcrits des gènes IFI27, IFI44L, IFIT1 et RSAD2 sont déterminés et utilisés en tant que gènes marqueurs. C’est-à-dire que la conclusion concernant la présence ou l’absence chez le sujet d’une infection par un virus respiratoire réplicatif ne prend pas en compte le niveau de transcrits d’un autre gène marqueur. Selon un autre mode de réalisation particulier, seuls les niveaux de transcrits des gènes IFI27, IFI44L, IFIT 1 , RSAD2, ISG15 et SIGLEC1 sont déterminés et utilisés en tant que gènes marqueurs. [0100] La valeur seuil ou le niveau de référence sont, en général, des valeurs déterminées en amont qui sont disponibles lors de la mise en œuvre du procédé selon l’invention. La valeur seuil est une valeur qui a été préalablement jugée comme pertinente pour obtenir une conclusion quant à la présence ou l’absence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif. Le niveau de référence correspond au niveau de transcrits pour le gène marqueur considéré, chez un sujet de référence ou une population de référence. Comme le niveau de transcrits dudit gène marqueur pour l’échantillon test, il correspond donc à la quantité d’un ou plusieurs transcrits dudit gène marqueur ou à une valeur dérivée qui est représentative de la quantité de transcrits dudit gène marqueur, mais dans un échantillon de référence d’un sujet de référence ou dans un ensemble d’échantillons de référence (pour une population de sujets de référence). Les méthodes de détermination du niveau de transcrits pour l’échantillon test et de détermination préalable d’un niveau de référence sont équivalentes ou identiques. Ainsi, un échantillon de référence est du même type que l’échantillon test, à savoir un échantillon provenant de la bouche ou du nez d’un sujet et, de préférence, un échantillon oro-pharyngé ou naso-pharyngé, ou la salive.
[0101] Un sujet de référence peut être un sujet non infecté par un virus respiratoire réplicatif, c’est-à-dire, notamment un sujet détecté positif à la présence d’un virus respiratoire mais pour lequel le virus n’est pas réplicatif, ou un sujet non infecté par un virus respiratoire (notamment non positif à un test de détection d’un virus respiratoire) ; un sujet non infecté par un virus respiratoire (en particulier non positif à un test de détection d’un virus respiratoire) ; un sujet sain, c’est-à-dire sans infection quelle qu’elle soit, comme le sont notamment des donneurs de sang ...
[0102] L’échantillon de référence (provenant d’un sujet dit de référence) pour déterminer un niveau de référence utilisé en tant que valeur seuil pour le niveau de transcrits d’un gène marqueur est, de manière avantageuse, un échantillon provenant d’un sujet (nommé sujet de référence) non infecté par un virus respiratoire réplicatif, c’est-à-dire, notamment un sujet détecté positif à la présence d’un virus respiratoire mais pour lequel le virus n’est pas réplicatif, ou un sujet non infecté par un virus respiratoire (notamment non positif à un test de détection d’un virus respiratoire), ou un mélange de tels échantillons. [0103] L’échantillon de référence (provenant d’un sujet dit de référence) pour déterminer le niveau de référence utilisé pour le calcul d’un rapport ou d’une valeur dérivée ou score comme précédemment décrit est, de manière avantageuse, un échantillon provenant d’un sujet (nommé sujet de référence) non infecté par un virus respiratoire (en particulier non positif à un test de détection d’un virus respiratoire), ou un mélange de tels échantillons.
[0104] Il pourra également être vérifié que les sujets de référence d’où proviennent les échantillons de référence ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w. Une telle vérification peut se faire à partir d’un échantillon de sang, notamment de sérum du sujet concerné, par toute technique connue de détection d’anticorps, notamment une technique ELISA. L’échantillon de référence peut, aussi, être un échantillon d’un tel sujet, traité ex vivo par un agent stimulant le système immunitaire (tel que le LPS ou lipopolysaccharide). L’échantillon de référence peut également être un mélange d’échantillon(s) non traité(s) et d’échantillons traité(s) ex vivo par un agent stimulant du système immunitaire.
[0105] Concernant le niveau de transcrits de référence, lorsque ce dernier est le niveau de transcrits d’une population de référence, celui-ci pourra être la moyenne ou la médiane des différents niveaux de transcrits mesurés pour ladite population, c’est-à-dire la moyenne ou la médiane des niveaux de transcrits mesurés dans les échantillons de référence.
[0106] Le procédé selon l’invention peut également comprendre la détection de l’ADN ou de l’ARN, de un ou plusieurs virus respiratoires, et en particulier de SARS-CoV-2 ou un de ses variants (Mommert, M. et al., 2020). De telles techniques de détection sont connues de l’homme du métier. Il est possible d’utiliser une technique de détection non quantitative, quantitative ou semi- quantitative. Notamment, l’utilisation d’une technique d’amplification, d’hybridation, ou de séquençage adaptée, à l’ADN ou l’ARN du virus recherché pourra être utilisée.
[0107] L’invention a également pour objet un kit comprenant des moyens pour déterminer le niveau de transcrits d’un ou plusieurs gènes marqueurs ISG tels que définis dans le cadre de l’invention. De tels moyens permettent de déterminer quantitativement le niveau de transcrits dudit gène sélectionné dans l’échantillon test. Comme expliqué précédemment, le niveau de transcrits déterminé peut ne pas être égal à la quantité de transcrits présents dans l’échantillon test, mais être une valeur dérivée, représentative de la quantité de transcrits présents dans l’échantillon test. En effet, de manière classique, la détermination peut inclure une étape d’amplification et/ou de normalisation et/ou de calcul d’un rapport...
[0108] Par kit, on entend un ensemble de produits et/ou outils à utiliser ensemble pour obtenir, en particulier, la détermination du niveau de transcrits d’un ou plusieurs gènes marqueurs ISG tels que définis dans le cadre de l’invention. Les produits ou outils nécessaires peuvent ou non être rassemblés au sein d’une même trousse ou d’un même dispositif.
[0109] Ainsi les kits selon l’invention peuvent comprendre des moyens d’amplification et/ou de détection pour un ou plusieurs gènes marqueurs ISG, tels que ceux précédemment cités, en particulier choisis parmi IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15, et SIGLEC1. Les kits selon l’invention peuvent comprendre des moyens d’amplification et/ou de détection pour chaque gène marqueur ISG sélectionné, et en particulier qui sont spécifiques audit gène marqueur. Par ailleurs, les kits selon l’invention peuvent, également, comprendre au moins un moyen de détermination, permettant de déterminer le niveau de transcrits d’un gène de ménage. Ainsi, les kits selon l’invention peuvent comprendre des moyens d’amplification et/ou de détection pour un ou plusieurs gènes de ménage (de préférence sélectionnés dans la liste constituée par : DECR1, HPRT1 et PPIB). Là encore, les kits selon l’invention peuvent comprendre des moyens d’amplification et/ou de détection pour chaque gène de ménage sélectionné, et en particulier qui sont spécifiques audit gène de ménage.
[0110] Les moyens pour déterminer le niveau de transcrits comprennent, notamment un ou plusieurs produit(s) ou outil(s) d’amplification et/ou un ou plusieurs produit(s) ou outil(s) de détection. En particulier, pour chaque gène marqueur ou gène de ménage dont le niveau de transcrits doit être déterminé, le kit comprend un ou plusieurs oligonucléotides, permettant l’amplification et/ou la détection d’un transcrit dudit gène, notamment une amorce ou couple d’amorces d’amplification et/ou au moins une sonde de détection d’un transcrit dudit gène.
[0111] On entend par « amorce » ou « amorce d'amplification », un oligonucléotide ou fragment nucléotidique pouvant être constitué de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d’amorces », constitués de deux amorces. Lorsque l’on souhaite réaliser l’amplification de plusieurs gènes différents, plusieurs couples d’amorces différentes sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s’hybrider spécifiquement avec un gène différent.
[0112] On entend par « sonde » ou « sonde d’hybridation », un oligonucléotide ou fragment nucléotidique constitué typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu’un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l’on souhaite cibler plusieurs gènes différents, plusieurs sondes différentes sont, de préférence, utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s’hybrider spécifiquement avec un gène différent.
[0113] Des séquences d’amorce et sonde adaptées pour déterminer le niveau de transcrits de chaque gène IFI27, IFI44L, IFIT1, RSAD2, ISG15 et SIGLEC1 sont, notamment, décrites dans M. Bergallo étal., 2020.
[0114] Par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux oligonucléotides ou fragments nucléotidiques, tels que, par exemple, une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.
[0115] Par « réaction d'amplification enzymatique », on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR
(Polymerase Chain Reaction ), LCR ( Ligase Chain Reaction ), RCR ( Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Séquence Réplication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491 , et LAMP (Loop mediated isothermal amplification) avec le brevet US6410278.
Lorsque la réaction d’amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l’étape d’amplification est précédée d’une étape de réverse-transcription d’ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.
[0116] Les kits selon l’invention peuvent comprendre des moyens de détection d’un virus respiratoire, préférentiellement de SARS-CoV-2. En particulier, de tels moyens correspondent à un produit ou outil de détection et/ou d’amplification de l’ADN ou de l’ARN dudit virus.
[0117] Les kits selon l’invention peuvent également comprendre des moyens de contrôle positif, notamment un échantillon contrôle positif, permettant de qualifier la qualité de l’extraction de l’ARN, la qualité de tout procédé d’amplification et/ou d’hybridation.
[0118] Selon certains modes de réalisation, les kits selon l’invention, quel que soit leur mode de réalisation, sont caractérisés par le fait qu’ils comprennent un ensemble de moyens d’amplification et/ou de détection qui permettent la détection et/ou l’amplification d’au plus 100 gènes, de préférence au plus 90, de préférence au plus 80, de préférence au plus 70, de préférence au plus 60, de préférence au plus 50, de préférence au plus 40, de préférence au plus 30, de préférence au plus 20, de préférence au plus 10 gènes, notamment au plus 6, au plus 5, au plus 4, au plus 3, ou au plus 2 gènes, au total. Parmi les gènes, on trouvera les gènes de virus, notamment de virus respiratoires, ainsi que des gènes de « biomarqueur », c’est-à-dire d’une caractéristique biologique mesurable objectivement qui représente un indicateur des processus biologiques normaux ou pathologiques ou de réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique. Les gènes de biomarqueurs incluent donc les gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG et les gènes de ménage décrits dans le cadre de l’invention. Le gène biomarqueur peut, en particulier, être détectable au niveau ARNm. A titre d’autres exemples de biomarqueur qui peut être également présent dans un kit selon l’invention, on peut citer un biomarqueur endogène ou loci (tel qu’un gène ou un HERV / Human Endogenous RetroVirus) qui se retrouve dans le matériel chromosomique d’un individu, ou un biomarqueur exogène (tel qu’un virus). Selon des modes de réalisation particuliers, les kits selon l’invention comprennent, en tant que moyens d’amplification et/ou de détection de gènes, exclusivement des moyens d’amplification et/ou de détection de gènes de biomarqueur(s) consistant exclusivement en des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes marqueurs ISG, des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs gènes de ménage et, éventuellement, des moyens d’amplification et/ou de détection d’un ou plusieurs virus respiratoires.
[0119] Lesdits produits ou moyens de détermination, plus précisément, lesdits produits d’amplification et/ou produits de détection peuvent être liés à un même support solide. Le kit peut donc comprendre un support solide comprenant un ou plusieurs oligonucléotide(s) adapté(s) à la détermination du niveau de transcrits du ou de chaque gène marqueur IGS, voire un ou plusieurs oligonucléotide(s) adapté(s) à la détermination du niveau de transcrits du gène ou de chaque gène de ménage sélectionné, voire un ou plusieurs oligonucléotide(s) adapté(s) à la détection d’un virus respiratoire tel que SARS-CoV-2, comme précédemment décrit. De tels supports solides sont bien connus de l’homme du métier, et notamment décrits dans les demandes W02008/140568 et WO2017/093672 auxquelles on pourra se référer pour plus de détails.
[0120] Les kits sont destinés à être mis en œuvre de manière automatisée quant à la comparaison avec une valeur seuil et/ou valeur de référence. En particulier, les kits sont destinés à être mis en œuvre de manière automatisée quant à la comparaison du ou des niveaux de transcrit(s) du ou des gène(s) marqueur(s) ISG sélectionné(s), et la ou les valeurs seuil utilisées, ou le cas échéant en utilisant un niveau de référence pour calculer une donnée (ou un score) à partir du ou des niveaux de transcrit(s) du ou des gène(s) marqueur(s) ISG sélectionné(s) et la comparer avec une valeur seuil. Aussi, de manière avantageuse, ils comprennent, en plus de une ou plusieurs valeurs seuils, au moins un niveau de référence pour ledit (ou chaque) gène marqueur ISG sélectionné, qui est soit stocké sur un support lisible par un ordinateur, soit destiné à être utilisé sous la forme d’un code exécutable par un ordinateur, notamment configuré pour comparer le niveau de transcrits du gène marqueur ISG déterminé pour l’échantillon test, audit niveau de référence.
[0121] L’invention a également pour objet l’utilisation d’un kit tel que décrit dans le cadre de l’invention pour déterminer la présence éventuelle chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif. [0122] En particulier, l’utilisation visera à déterminer la présence ou l’absence chez un sujet, d’un virus respiratoire réplicatif, choisi parmi les coronavirus saisonniers réplicatifs, les virus SARS-CoV-2 réplicatifs (quel que soit le variant concerné), les virus de la grippe (influenza A, B et C), le virus respiratoire syncytial (VRS), les rhinovirus, les métapneumovirus, les virus parainfluenza et les adénovirus.
Les exemples montrent, notamment, que les kits selon l’invention sont, particulièrement, adaptés à déterminer la présence ou l’absence chez un sujet, d’un virus respiratoire réplicatif choisi parmi les virus SARS-CoV-2 réplicatifs, quel que soit le variant concerné, et le virus de la grippe.
[0123] Les modes de réalisation spécifiques ou préférés décrits en lien avec les procédés selon l’invention s’appliquent, bien entendu, aux kits et utilisations faisant l’objet de l’invention.
[0124] Dans le cadre de l’invention, de manière avantageuse, la détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif est uniquement basée sur la détermination, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, du niveau de transcrits de un ou plusieurs gène(s) marqueur(s) sélectionné(s) parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG. Selon un mode de réalisation particulier illustré dans les exemples, seuls les niveaux de de un ou plusieurs gène(s) marqueur(s) sélectionné(s) parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG sont déterminés et utilisés en tant que gènes marqueurs. C’est-à-dire que les gènes ISG sont les seuls marqueurs utilisés pour apporter une conclusion concernant la présence ou l’absence chez le sujet d’une infection par un virus respiratoire réplicatif. Il est, cependant, possible, bien que non préféré, d’utiliser, en plus, du ou des gène(s) marqueur(s) sélectionné(s) parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG, un ou plusieurs autre(s) gène(s) marqueur(s), par exemple, sélectionné(s) parmi les gènes des interférons de type I. A titre d’exemples de gène(s) marqueur(s) additionnel(s), on peut citer les gènes codant pour les différentes protéines des interférons de type I, Il et/ou III.
[0125] L’invention concerne également les procédés de détermination in vitro de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, tels que définis dans la présente description, qui comprennent, en outre, le traitement d’une infection par un virus respiratoire. En particulier, le traitement est initié, dès lors qu’il est conclu à la présence chez ledit sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif. Le traitement peut également être initié, dès lors qu’il est conclu à la présence chez ledit sujet d’une infection par un virus respiratoire réplicatif et qu’un virus respiratoire présent a été identifié. Dans ce cas, le traitement sera dirigé contre le virus respiratoire identifié. Même s’il n’y a pas une certitude que le virus respiratoire dont la présence a été identifiée et le virus respiratoire présent qui est réplicatif sont identiques, la présomption est forte car la probabilité que le sujet soit infecté par deux virus respiratoires différents est particulièrement réduite. Selon une autre variante, le traitement peut être initié, dès lors que le sujet présente des symptômes d’une infection respiratoire et qu’il est conclu à la présence chez ledit sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0126] Le traitement consiste à l’administration d’un médicament antiviral adapté. A titre de traitement antiviral, on peut citer l’Iopinavir®, le Ritonavir®, les interferons recombinants, notamment l’interferon beta, alpha et lambda. De nombreux traitements thérapeutiques de la COVID-19 sont actuellement en cours de test (Canedo-Marroquin, G. étal., 2020).
[0127] L’invention concerne également les procédés de détermination in vitro de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, tels que définis dans la présente description, qui comprennent, en outre, la mise en place de mesures d’isolement, de confinement et/ou d’obligation de porter un masque pour ledit sujet. De telles mesures peuvent être mises en place, dans l’attente du résultat quant à la détermination d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, et, éventuellement être levées, en cas de conclusion qu’il n’y a pas présence chez ledit sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif. Il est également possible que de telles mesures soient mises en place, en cas de conclusion qu’il y a présence chez ledit sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif.
[0128] L’invention concerne également un procédé de détermination in vitro de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, tel que défini dans la présente description, qui comprend, outre les étapes précédemment décrites, la mise en place ou non, ou l’arrêt de mesures d’isolement, de confinement et/ou d’obligation de porter un masque pour ledit sujet, en fonction de la conclusion apportée par ledit procédé, quant à la présence ou l’absence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, chez ledit sujet.
[0129] Selon des mises en œuvre particulières, les procédés selon l’invention, quels que soient leurs modes de réalisation, peuvent comprendre également une étape de gestion du sujet, en fonction du résultat donné par le procédé. Un sujet identifié comme présentant une infection respiratoire par un virus réplicatif, et en particulier par SARS-coV-2, pourra être soumis à un protocole de traitement ou à des mesures d’isolement, de confinement et/ou d’obligation de porter un masque. [0130] La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.
EXEMPLE 1 : Virus respiratoire réplicatif SARS-CoV-2 MATERIEL ET METHODE Participants
[0131] Le Tableau 1 ci-après récapitule les données démographiques et les caractéristiques cliniques principales de la cohorte de sujets ayant fait l’objet de l’étude : professionnels de la santé (HCW) ayant des symptômes bénins de COVID-19 (COVID-19 bénigne) et patients atteints d’une COVID-19 critique admis en unité de soin intensifs (USI) (COVID-19 critique). Les HCW atteints d’une COVID-19 bénigne n’étaient pas hospitalisés et étaient sans pneumonie.
Tableau 1
[0132] Abréviations : IMC, indice de masse corporelle ; IQR, interquartile ; N/A, non applicable [0133] Davantage d'informations sur la cohorte sont décrites ci-dessous.
Participants ayant une COVID-19 bénigne
[0134] Une étude longitudinale prospective de la cohorte a été réalisée à l'hôpital universitaire de Lyon, France ( Hospices Civils de Lyon, HCL), englobant des HCW avec des symptômes suggérant une infection par le SARS-CoV-2 (au moins un des symptômes suivants : fièvre, symptômes respiratoires, céphalées, anosmie, agueusie - Trouillet-Assant, S. étal. 2020a). Le diagnostic de COVID- 19 a été confirmé chez tous les patients par qRT-PCR (test cobas® SARS- CoV-2, Roche Diagnostics, Bâle, Suisse). L'écouvillonnage naso-pharyngé (NP) utilisé était soit dans du milieu de transport universel Copan (UTM-RT®) soit dans un tube de milieu de PCR Cobas®. Les données cliniques et microbiologiques ont été collectées pour tous les HCW inclus dans l'étude. Les patients ayant un résultat de RT-PCR positif à l'inclusion (V1) sont revenus chaque semaine (V2, V3 et V4) pour un échantillonnage sanguin et nasopharyngé jusqu'à une RT-PCR négative. Un consentement informé écrit a été obtenu de tous les participants ; l'approbation de comité d'éthique a été obtenue auprès du comité national d'examen pour la recherche biomédicale en avril 2020 (Comité de Protection des Personnes Sud Méditerranée I, Marseille, France; ID RCB 2020-A00932-37), et l'étude clinique a été enregistrée sur ClinicalTrials.gov (NCT04341142).
Patients à COVID-19 critique
[0135] Les échantillons NP utilisés pour effectuer le test de détection du SARS- CoV-2 par RT-PCR lors de l'hospitalisation ont été collectés et utilisés pour les différentes expériences additionnelles. Durant le séjour en USI, le sang collecté dans des tubes d'EDTA a été utilisé pour une recherche d'anticorps anti-IFN. Tous les patients gravement atteints admis en USI étaient inclus dans l'étude MIR-COVID. Cette étude a été enregistrée à l'Agence Nationale Française de Protection des Données sous le numéro 20-097 et a été approuvée par un comité d'éthique pour la recherche biomédicale (Comité de Protection des Personnes HCL) sous le numéro N°20-41. En accord avec la Règlementation Générale sur la Protection des Données (Règlementation (EU) 2016/679 et Directive 95/46/EC) et de la loi française sur la protection des données (loi N°78- 17 du 06/01/1978 et Décret n°2019-536 du 29/05/2019), le consentement informé de chaque patient ou de son plus proche parent a été obtenu.
FilmArray® pour la détermination des transcrits des ISG
[0136] Le prototype FilmArray® (se présentant sous la forme d’une poche) qui a été utilisé, permet de déterminer le niveau de transcrits de quatre ISG (protéine 27 inductible par l'interféron alpha (IFI27), protéine analogue à la protéine 44 induite par un interféron (IFI44L), protéine induite par un interféron avec des répétitions de tétratricopeptide (IFIT1), et protéine 2 contenant un domaine de S-adénosyle méthionine radicalaire (RSAD2)) et trois gènes de ménage (hypoxanthine phosphoribosyle transférase 1 (HPRT1), peptidylpropyle isomérase B (PPIB), 2,4-diénoyl-CoA réductase 1 (DECR1)), pour la normalisation des signaux. Cent microlitres d’échantillon NP ou de sang PAXgene™ ont été testés avec le prototype d'IFN (Tawfik, D. M. étal., 2020) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les poches ont été hydratées avec la solution d'hydratation fournie avec la trousse. Les échantillons de NP ou de sang PAXgene™ ont été mélangés avec 800 pl du tampon d'échantillonnage fourni avec la trousse et directement injectés dans la poche et passés sur des instruments FilmArray® 2.0 et FilmArray® Torch (BioFire Diagnostics, LLC., Sait Lake City, UT). Les résultats ont été délivrés en moins d'une heure. Par utilisation d'une version recherche de l'instrument, les valeurs de cycle de quantification (Cq) en temps réel et les courbes de fusion post-amplification ont été mesurées pour chaque dosage. Des valeurs de transcrits normalisées de chaque dosage ont ensuite été calculées au moyen des gènes de ménage. Un score ISG dans le cas des échantillons NP a été calculé par le même procédé que celui appliqué aux échantillons PAXgene, comme décrit antérieurement (Pescarmona, R. étal., 2019).
Mesure de protéine d'IFN-a et d'IFN-l
[0137] Les concentrations sériques d'IFN-a2 (fg/ml) à partir du plasma ont été déterminées par un test ultrasensible (SIMOA®) utilisant une trousse du commerce pour la quantification d'IFN-a2 (Quanterix™, Lexington, MA). Le dosage se basait sur un protocole à trois étapes utilisant un analyseur HD— 1 (Quanterix) et a nécessité un temps de traitement de 3 heures entre l'échantillonnage et les résultats. L’interféron lambda a été déterminé par un test utilisant un kit du commerce pour la quantification d'IFN-l (mesoscale discovery).
Mesure de la charge virale
[0138] La charge de SARS-CoV-2 a été déterminée à partir d'un échantillon NP au moyen de la trousse SARS-CoV-2 R-gene® (bioMérieux, Lyon, France). En bref, l'extraction d'acide nucléique a été effectuée à partir de 0,2 ml d'un échantillon NP sur NUCLISENS® easyMAG® et au moyen d'une amplification utilisant un thermocycleur Biorad CFX96. La charge virale a été quantifiée par utilisation de quatre contrôles de quantification (QS) développés en interne, ciblant le gène N de SARS-CoV-2 : QS1 à QS4 respectivement à 2,5.106,
2,5.105, 2,5.104, 2,5.103 copies/ml d'un ADN contrôle de SARS-CoV-2. Ces QS ont été contrôlés et quantifiés au moyen d'un spectrophotomètre Nanodrop (ThermoFisher) et d'une PCR numérique 3D Applied Biosystems QuantStudio. En parallèle, les échantillons NP ont été testés avec la trousse CELL Control R- GENE® (amplification du gène domestique HPRT1) qui contient 2 contrôles de quantification QS1 et QS2, respectivement à 104 copies/pl (50000 cellules/PCR c'est-à-dire 1,25.106 cellules/ml dans les conditions des exemples) et 103 copies/pl (5000 cellules/PCR c'est-à-dire 1,25.105 cellules/ml dans les conditions des exemples) d'ADN contrôle, pour normaliser la charge virale en fonction de la qualité de l'échantillonnage (Log10 [(nombre de copies de SARS- CoV-2 par ml / nombre de cellules par ml)x106 cellules par ml]).
Culture virale
[0139] La culture virale a été réalisée conformément aux directives de prévention des risques biologiques provisoires établies par l'OMS [WHO/WPE/GIH/2020.3] à partir des échantillons NP dans de l'UTM-RT®. Les NP positifs par RT-PCR ont été inoculés sur des cellules Vero à confluence (ATCC CCL-81®) avec du milieu essentiel minimal d'Eagle (EMEM) complémenté de 2 % de pénicilline- streptomycine, 1 % de L-glutamine, et 2 % de sérum de veau fœtal inactivé. Les plaques ont été incubées à 33 °C avec 5 % de C02 pendant 96 heures. Les effets cytopathiques (CPE) ont été surveillés chaque jour ; les échantillons ont été récoltés lorsqu'ils étaient positifs, tandis que les échantillons négatifs à 96 heures ont été soumis à une sous-culture sur de nouvelles plaques. Les surnageants de culture ont été échantillonnés 2 heures après inoculation, au bout de 96 heures, et encore après 96 heures en sous-culture. L'ARN des surnageants a été extrait par un poste de travail automatisé MGISP-960 utilisant la trousse d'extraction d'ADN/ARN viral sur perles magnétiques MGI Easy (MGI Tech©, Marupe, Lettonie), et la détection du SARS-CoV-2 a été effectuée au moyen de la trousse TaqPath(tm) COVID-19 CE-IVD RT-PCR sur un système QuantStudio(tm) 5 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).
Test sérologique
[0140] La présence d'anticorps anti-SARS-CoV-2 a été évaluée au moyen du dosage Wantai Ab qui détecte les anticorps totaux dirigés contre le domaine se liant à un récepteur (RBD) de la protéine S. [0141] La présence d'anticorps anti-IFN-a a été étudiée au moyen d'une trousse disponible dans le commerce (Thermo-Fisher) (David, G. étal., 2021). La capacité de neutralisation du sérum d'un patient vis-à-vis de l'IFN-a a ensuite été évaluée comme décrit antérieurement (Bastard, P. étal., 2021).
Analyse statistique
[0142] Des tests de Wilcoxon-Mann-Whitney non paramétriques et une corrélation de Spearman ont été effectués pour toutes les comparaisons, sauf mention contraire. Pour calculer le seuil de charge virale qui divise au mieux les patients en deux groupes d'ISG, a été utilisée la valeur p minimale du test de signification non paramétrique (somme des rangs de Wilcoxon) appliquée itérativement au score d'ISG, séparée sur des seuils de charge virale nasale normalisés allant des valeurs détectées minimale (0,60) à maximale (9,00) avec un pas de 0,01.
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées par R (fondation R, https://www.r-project.org/foundation/version 3.6.1) et le logiciel GraphPad Prism 8.3.0. Une valeur p < 0,05 a été considérée être statistiquement significative. Les corrélations n’ont été effectuées que sur des échantillons où une double détection avait pu être menée.
RESULTATS
Régulation coordonnée des ISG des voies nasales et du sang en réponse à l'IFN-l durant une infection
[0143] La régulation et le rôle de la signalisation des interférons de type I et III a été étudiée dans la muqueuse nasale en réponse à une infection par SARS-CoV-2. Pour cela, les échantillons naso-pharyngés utilisés pour la détection par RT- qPCR de SARS-CoV-2 ont été utilisés. Toutefois, la quantité de matière cellulaire et de transcrits présents pour ce type d’échantillon étant très limitée, la technologie FilmArray® a été utilisée. C’est une technique PCR permettant une mesure rapide et sensible des niveaux de transcrits de différents ISG déjà décrite dans la littérature (Mommert, M. étal., 2020), qui a été adaptée aux échantillons naso-pharyngés. L'avantage de cette technique est qu'elle est semi-automatisée et aussi conçue pour la routine clinique, en donnant un score issu de la quantification de quatre ISG régulés par l'intermédiaire d'éléments ISRE dépendants du facteur génique 3 stimulé par un IFN (ISGF3), à savoir IFI27, IFI44L, RSAD2 et IFIT1 (Flernandez, N. et al., 2018). Ce score a été analysé lors du diagnostic chez 23 FICW infectés par le SARS-CoV-2, et comparé au même score obtenu à partir d’échantillon sanguin et au niveau sérique d'IFN-a2 des mêmes patients. Une forte corrélation a été observée entre les scores obtenus à partir des échantillons nasaux-pharyngés (NP) et sanguins et entre les scores obtenus à partir des échantillons nasaux-pharyngés et les niveaux sériques d'IFN-a2 (Spearman p > 0,75 pour les deux comparaisons Figures 1 et 2). Les niveaux sériques d'IFN-a1 n'étaient, par contre, pas aussi bien corrélés aux scores obtenus à partir des échantillons nasaux-pharyngés et sanguins (résultats non présentés). Ces résultats mettent en évidence l'association temporelle entre les réponses antivirales basées sur les transcrits des ISG, au niveau nasal et systémique, et suggèrent que l'IFN-a2 stimule la génération des transcrits des ISG mesurés dans les deux cas. L’évolution dans le temps du score dans le sang (nommé score sang ou score sanguin) et du score dans les échantillons nasaux- pharyngés (nommé score nasal ou score NP) a également été étudiée. Comme le montre la Figure 3, les deux paramètres suivaient des cinétiques très similaires, en culminant aux points de temps les plus précoces après l'apparition des symptômes et en diminuant rapidement ensuite, puis en devenant virtuellement négatifs 14 jours après l'apparition des symptômes. Cette corrélation confirme la coordination des défenses antivirales par les IFN— l/lll au niveau nasal et systémique et montre que le score nasal ISG de type l/lll, mesuré par utilisation de FilmArray® directement à partir d'échantillons NP, est un indicateur qui suit le score sanguin ISG de type l/lll chez les patients.
Le score des niveaux de transcrits de différents ISG dans des échantillons naso-pharyngés est corrélé à la charge nasale de SARS-CoV-2 et à la capacité de réplication du virus
[0144] La Figure 7 met en évidence qu’il y a une corrélation significative entre le score associé aux niveaux de transcrits des différents ISG de type l/lll (nommé score ISG) obtenus pour les échantillons nano-pharyngés et la charge virale. Directement à partir des écouvillonnages correspondant aux échantillons naso- pharyngés, des cultures sur cellules Vero ont été réalisées, comme décrit antérieurement (Bal, A. étal., 2021), afin d'évaluer l'association putative entre le score ISG dans les échantillons naso-pharyngés et la capacité de réplication du virus isolé à partir de l'écouvillonnage. Il est apparu que les cultures donnant lieu à un effet cytopathique sur les cellules Vero (dites cultures positives) étaient très majoritairement associées à des scores ISG élevés et, qu’au contraire, des cultures ne donnant pas lieu à un effet cytopathique sur les cellules Vero (dites cultures négatives) étaient presque toujours associées à des scores ISG faibles (Figure 4). L'intérêt de l'utilisation du score ISG en tant que marqueur indicatif d'une infection par un virus SARS-CoV-2 réplicatif a été confirmé, par l'intermédiaire d'une courbe ROC (Figure 5). La zone sous la courbe ROC [intervalle de confiance à 95 %] était de 0,84 [0,7 à 0,99], montrant une bonne performance du score ISG pour prédire la capacité de réplication virale avec un score de séparation à 6,75. Finalement, pour évaluer davantage le score ISG en tant que marqueur d'infection par un virus réplicatif, des mesures comparatives du score ISG et des quantités d’ARN viral dans des conditions de matériau limité, imitées par des dilutions en série au 1/10 d'écouvillonnages positifs, ont été réalisées. Les résultats présentés sur la Figure 6 montrent que les valeurs Ct de la PCR virale augmentaient rapidement suite aux dilutions des écouvillonnages, tandis que les scores ISG restaient relativement stables et systématiquement supérieurs à la valeur de 6,75 qui s'était antérieurement avérée distinguer les échantillons naso-pharyngés contenant ou non le virus en état réplicatif.
[0145] Le score nasal ISG de type l/l II est plus faible chez les patients ayant des auto-anticorps anti-IFN de type I neutralisants.
Une fraction des patients gravement atteints par la Covid-19 ont montré des niveaux sanguins faibles ou indétectables d'IFN de type I (Hadjadj, J. et al, , 2020 et Trouillet-Assant, S. étal. 2020), qui peuvent être dus soit à des anomalies congénitales de l'immunité par l’IFN de type I (Zhang, O. et al., 2020) soit à la présence dans le sang d'auto-anticorps qui neutralisent l'IFN-a ou l'IFN-w ou les deux (Bastard, P. et al., 2020). Une étude a donc été menée sur les relations entre la gravité de la maladie, la présence d'auto-anticorps dirigés contre un interféron de type I, la charge virale dans les échantillons naso- pharyngés (nommée charge virale nasale), et le score ISG dans les échantillons naso-pharyngés (nommé score ISG nasal ou score ISG NP). Pour cela, une cohorte de patients gravement atteints a été constituée et les échantillons de sang et les échantillons naso-pharyngés issus d’écouvillonnages nasaux ont été obtenus lors de l'admission en USI (n = 19). Alors que 90 % des patients atteints de COVID-19, qui étaient faiblement symptomatiques avec un score ISG nasal supérieur à 6,75 (conformément à la valeur de séparation définie par l'indice de Younden sur la Figure 5) ont une charge virale nasale normalisée > 4,90 Log- cp/106 cellules, seuls 57 % des patients atteints de COVID-19 critique (4 sur 7) avec une charge virale nasale similairement élevée ont un score ISG nasal supérieur à 6,75. Pour expliquer cette divergence entre la charge virale nasale et le score ISG nasal, la présence d'auto-anticorps neutralisants dirigés contre l'IFN-a et/ou l'IFN-w a été déterminée, dans le sérum des patients de cette cohorte, en utilisant un nouveau dosage Elisa très sensible (David, G. et al., 2021). Des auto- anticorps anti-IFN-a et/ou anti-IFN-w ont été détectés dans le sérum de 6 sur 19 patients gravement atteints et chez aucun des patients faiblement symptomatiques (Figure 7). De plus, les patients ayant des auto- anticorps anti-IFN-l avaient des scores ISG nasaux très faibles, quelle que soit la charge virale, sauf pour un patient qui présentait des auto-anticorps dirigés contre l'IFN-a2 uniquement, et pour lequel il a été supposé que l'IFN-w compensait le blocage d'IFN a2. Les 5 autres patients avaient des auto anticorps dirigés contre les IFN tant a qu'ox Ces données suggèrent que les auto-anticorps anti-IFN-l neutralisants compromettent les défenses antivirales précoces dans la muqueuse nasale de patients gravement atteints, en particulier quand des auto-anticorps dirigés contre à la fois l'IFN-a2 et l'IFN-w sont présents. Ces données suggèrent également que l'IFN-w est impliqué dans l'immunité par l’IFN de type I dans les voies nasales.
EXEMPLE 2 : Virus respiratoire réplicatif de la Grippe
MATERIEL ET METHODE
Participants
[0146] Des prélèvements nasopharyngés (NP) rétrospectifs (2017-2018) des Hospices civils de Lyon (HCL) ont été sélectionnés selon la présence ou non de symptômes chez les sujets, sur la confirmation d’une infection virale respiratoire par RT-qPCR du virus de la grippe (Influenza B), ainsi que sur la connaissance du statut de la culture virale. Les données cliniques des patients desquels sont issus les échantillons sont reprises dans le Tableau 2 ci-après.
Tableau 2 [0147] Des écouvillons NP de volontaires sains (VS) ont été recrutés selon le même protocole que l’exemple 1. L’étude RESPIFERON a été approuvée par le comité d’éthique pour les recherches biomédicales et par le comité de protection des personnes CPP. L’autorisation d’utiliser les prélèvements a été accordée sur la base d’une non opposition des sujets directement concernés ou de leurs tuteurs légaux, le cas échéant, après les avoir informés par courrier. Une anonymisation des données personnelles des sujets a été réalisée en amont de leur transfert au laboratoire.
FilmArray® pour la détermination des transcrits des ISG
[0148] Le matériel et méthode de cette section est identique à celui de l’exemple 1. Mesure de la charge virale
[0149] La charge virale a été quantifiée pour chaque échantillon NP. Les acides nucléiques ont été extraits à l’aide de l’extracteur automatisé NucliSens® easyMAG™ (bioMérieux, Marcy l’Etoile). L’extraction a été réalisée à partir de 200pL d’échantillons NP qui ont été déposés dans un tampon de lyse. A l’issue d’une incubation de 10 minutes à température ambiante, 50 pl_ de silice magnétique ont été rajoutés avant de lancer l’extraction.
[0150] A l’issue de l’extraction, 50 mI_ d’éluât contenant l’ARN extrait ont été récupérés. L’ARN extrait a été reverse transcrit et amplifié en utilisant le kit de RT-PCR en temps réel prêt à l’emploi Influenza A/B R-gène®. La réaction a nécessité 10 pL d’éluât, 15 pL de prémix d’amplification contenant les réactifs nécessaires à la PCR et 0,15 pL de reverse transcriptase (diluée au 10ème).
[0151] L’amplification a été lancée sur le Bio-Rad CFX96 en suivant un protocole spécifique, à savoir 5 min à 50°C pour la reverse transcription suivie de 15min à 95°C pour activer la Taq polymérase, et enfin 45 cycles qui alternent : 10sec à 95°C pour la dénaturation, 40sec à 60°C pour l’hybridation, et 25sec à 72°C pour l’élongation.
[0152] La charge virale a été quantifiée en utilisant une gamme de standards r-gène (QS1 à QS4 contenant respectivement 105, 104, 103 et 102 copies/pL de plasmide). En parallèle, le kit CELL Control r-gène® a été utilisé d’une part pour vérifier la présence de cellules dans l’échantillon et les quantifier par la détection du gène de ménage HPRT 1 , et d’autre part pour normaliser la charge virale. Ce kit contient 2 standards de quantification, QS1 et QS2 respectivement à 104 et 103 copies/pL d’ADN. Les données ont été récupérées, traitées et analysées sur le logiciel CFX Maestro. La charge virale a été normalisée en divisant le nombre de copies d’ARN viral/PCR par le nombre de cellules/PCR et est exprimée en Iog10 du nombre de copies pour 106 cellules.
Culture Virale
[0153] La culture virale, la récolte des échantillons, l’échantillonnage des surnageants de culture et l’extraction des ARN desdits surnageants sont tels que décrits dans l’exemple 1. La détection du virus de la grippe a été effectuée en utilisant le kit Influenza A/B R-gène® (bioMérieux, Marcy l’Etoile).
Analyse statistique
[0154] Le matériel et méthode de cette section est identique à celui de l’exemple 1. RESULTATS
L’infection par le virus de la grippe est associée à une réponse IFN nasale accrue
[0155] Afin d’évaluer le lien entre la réponse IFN l/lll nasale et l’infection par le virus de la grippe, pour chaque échantillon NP inclus, un score IFN l/lll basé sur l’expression de 4 ISG dans la muqueuse nasale mesurée par RT-qPCR en utilisant le prototype de poche IFN FilmArray® BioFire® a été calculé.
[0156] Ce score IFN l/lll nasal, informatif quant à la réponse IFN locale, s’est avéré être significativement plus élevé (p<0,0001) pour les échantillons PCR positive, donc d’individus infectés par le virus de la Grippe, en comparaison des échantillons PCR négative correspondant aux individus non infectés.
[0157] En complément, une courbe ROC (de l’anglais « Receiver Operating Characteristic ») a été établie afin de déterminer la capacité du score IFN l/lll nasal à discriminer entre les échantillons PCR virale négative des échantillons PCR virale positive. La figure 8 met en évidence qu’une très bonne performance du score IFN l/lll pour prédire la présence d’une infection virale a été obtenue avec une aire sous la courbe de 0,98 avec un point de coupure à 3,29 (caractérisé par une sensibilité à 93% et une spécificité à 100%).
[0158] Comme démontré par la figure 9, cette même observation a pu être faite en analysant le score IFN l/lll de l’infection par le virus de la grippe. L’ensemble des résultats suggèrent que la réponse IFN l/lll nasale, permet de discriminer les sujets infectés de ceux qui ne le sont pas, reflétant donc potentiellement la présence d’une infection virale respiratoire quelle qu’elle soit.
Signature transcriptomique ISG dans l’infection
[0159] Le taux d’expression des ARNm d’ISG, exprimé en log2 des ratios de QR, a été estimé pour chaque échantillon NP à partir des résultats obtenus avec le prototype de poche IFN FilmArray® BioFire® comme expliqué précédemment (voir matériel et méthode).
[0160] Les résultats présentés en figure 10 montrent bien que les taux d’expressions des transcrits IFI27, IFI44L, RSAD2 et IFIT1 étaient significativement plus élevés pour les échantillons de sujets infectés par le virus de la grippe que pour les échantillons de sujets non infectés, confirmant ainsi bien l’implication des gènes stimulés par les interférons dans la réponse de l’hôte à l’infection par le virus.
La réponse INF nasale reflète une infection active par le virus de la grippe
[0161] La réponse IFN nasale d’échantillons NP de sujets infectés par le virus de la grippe dont le statut (positif ou négatif) de la culture virale était connu a été analysée.
[0162] Comme présenté sur figure 11, en comparant le score IFN l/lll nasal calculé grâce à la technologie FilmArray® selon le statut de la culture virale, il a été constaté que ce dernier était significativement plus élevé pour les échantillons culture virale positive que pour les échantillons culture virale négative, lors d’une infection par le virus de la grippe.
[0163] Pour confirmer la pertinence du score IFN l/lll à être utilisé comme un biomarqueur du caractère infectieux du virus de la grippe, une courbe ROC a été établie. La figure 12 met ainsi en évidence la bonne performance du score IFN l/lll à prédire la capacité réplicative du virus GRB avec une aire sous la courbe de 0,89 avec un point de coupure à 16,08, pour une sensibilité à 0,93 et une spécificité à 0,86.
[0164] Conjointement au précédent, cet exemple confirme que la mesure du niveau de transcrits des gènes stimulés par les interférons, dits ISG, permettait de manière efficace et fiable, de détecter la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, tel que par exemple le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe, fournissant ainsi un nouvel outil pour le clinicien afin d’identifier rapidement les patients présentant un risque de transmission virale, et alternativement d’éviter des mesures de quarantaine pour les patients qui ne sont pas ou plus, une source possible de contamination.
Références bibliographiques
[0165] Trouillet-Assant, S., et al., Assessment of serological techniques for screening patients for COVID-19 (COVID-SER): a prospective, multicentric study. BMJ Open 10, e041268 (2020a). [0166] Tawfik, D. M., et al., Immune Profiling Panel: A Proof-of-Concept Study of a New Multiplex Molecular Tool to Assess the Immune Status of Critically III Patients. J. Infect. Dis. 222, S84-S95 (2020).
[0167] Pescarmona, R., étal., Comparison of RT-qPCR and Nanostring in the measurement of blood interferon response for the diagnosis of type I interferonopathies. Cytokine 113, 446-452 (2019).
[0168] David, G., étal., Antibodies against type-l Interferon: détection and association with severe clinical outcome in COVID-19 patients. medRxiv 2021.04.02.21253262 (2021 ) doi:10.1101/2021.04.02.21253262. [0169] Bastard, P., étal., Auto-antibodies to type I IFNs can underlie adverse reactions to yellowfever live attenuated vaccine. J. Exp. Med. 218 (2021).
[0170] Mommert, M., étal., Type-l Interferon assessment in 45 minutes using the FilmArray® PCR platform in SARS-CoV-2 and other viral infections. Eur. J. Immunol. (2020) doi:10.1002/eji.202048978. [0171] Flernandez, N., étal., Life-threatening influenza pneumonitis in a child with inherited IRF9 deficiency. J. Exp. Med. 215, 2567-2585 (2018).
[0172] Bal, A., étal., Six-month antibody response to SARS-CoV-2 in healthcare workers assessed by virus neutralization and commercial assays. Clin. Microbiol. Infect. Off. Publ. Eur. Soc. Clin. Microbiol. Infect. Dis. (2021) doi:10.1016/j. cmi.2021.01.003.
[0173] Hadjadj, J., étal., Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science 369, 718-724 (2020).
[0174] Trouillet-Assant, S., étal. ,Type I IFN immunoprofiling in COVID-19 patients. J. Allergy Clin. Immunol. (2020) doi:10.1016/j.jaci.2020.04.029. [0175] Zhang, Q., étal., Inborn errors of type I IFN immunity in patients with life- threatening COVID-19. Science 370 (2020).
[0176] Bastard, P., étal., Autoantibodies against type I IFNs in patients with life- threatening COVID-19. Science 370 (2020).
[0177] Kricka, et al., Clinical Chemistry, n° 45(4), p.453-458 (1999). [0178] Relier G. H., et al., DNA Probes, 2nd E<±, Stockton Press, sections 5 et 6, p.173-249 (1993).
[0179] Mick, E., et al., Upper airway gene expression reveals suppressed immune responses to SARS-CoV-2 compared with other respiratory viruses. Nat. Commun. 11 (2020).
[0180] Ng, D. L, étal., A diagnostic host response biosignature for COVID-19 from RNA profiling of nasal swabs and blood. Sci. Adv. 7 (2021).
[0181] Gupta, R K, étal., Blood transcriptional biomarkers of acute viral infection for dectection of pre-symptomatic SARS-CoV-2 infection : a nested, case-control diagnostic accuracy study. Lancet Microbe 2021 ; 2:e508-17.
[0182] Han, M. S., étal., RT-PCR for SARS-CoV-2: quantitative versus qualitative. Lancet Infect. Dis. 21, 165 (2021).
[0183] Leland D. S, et al., Rôle of Cell Culture for Virus Détection in the Age of Technology, Clinical Biology Reviews, vol. 20, N°1, p.49-78 (Jan. 2007). [0184] Stelzer -Braid S., et al., Virus isolation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) for diagnostic and research purposes, Pathology, 52(7), p.760-763 (Dec. 2020).
[0185] Monel B., étal., Release of infectious virus and cytokines in nasopharyngeal swabs from individuals infected with non-B.1.1.7 or B.1.1.7 SARS-CoV-2 variants, (2021) https://doi.Org/10.1101/2021.05.20.21257393.
[0186] Manry J .,etal., Génétique des populations et immunité chez l’homme, Le cas des interféronsMed Sci (Paris) 28 : p.1095-1101, 2012.
[0187] Hertzorg P.J., étal., « New Interferons », Encyclopedia of Immunobiology, Volume 2, p.501-508, 2016. [0188] Lazear, H. M., étal., Shared and Distinct Functions of Type I and Type III
Interferons. Immunity 50, 907-923 (2019).
[0189] Hellemans, étal., Genome biology 8(2):R19 (2007).
[0190] Picard C, étal, Type I interferonopathies, Literature review. Rev Med Interne 39:271-278. (2018). [0191] Bergallo M., étal., Interferon signature in immunosuppressed patients with lower respiratory tract infections: dosage on bronchoalveolar lavage, Minerva Medica; 111 (3):245-53, (2020 June).
[0192] Canedo-Marroquin, G., étal., SARS-CoV-2: Immune Response Elicited by Infection and Development of Vaccines and Treatments. Front. Immunol. 11, (2020).
[0193] Poritz M., étal., FilmArray, an automated nested multiplex PCR System for multi-pathogen détection: development and application to Respiratory tract infection, 2011, PLoS One 6(10): e26047. Doi:10.1371/journal. pone.0026047

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant une étape i) de détermination, dans un échantillon test provenant de la bouche ou du nez dudit sujet, du niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur sélectionné parmi les gènes stimulés par les interférons, dits ISG.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’à l’étape i), le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI44L, IFIT1, IFI27, RSAD2, ISG15, et SIGLEC1 , est déterminé.
[Revendication 3] Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’à l’étape i), le niveau de transcrits de un ou de plusieurs gènes marqueurs choisis parmi : IFI44L, IFIT1, IFI27 et RSAD2, est déterminé.
[Revendication 4] Procédé selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que l’échantillon test est un échantillon oro-pharyngé ou naso-pharyngé, ou un échantillon de salive.
[Revendication 5] Procédé selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’étape i) consiste en la détermination du niveau d’ARNm du ou desdits gènes marqueurs.
[Revendication 6] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’échantillon test provient d’un sujet qui présente des symptômes d’une infection.
[Revendication 7] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’échantillon test provient d’un sujet qui ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[Revendication 8] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : i) déterminer le niveau de transcrits d’au moins un gène marqueur choisi parmi les ISG, pour ledit échantillon test du sujet, ii) comparer le niveau de transcrits dudit au moins gène marqueur obtenu, à un niveau de référence.
[Revendication 9] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend, en outre, une étape iii) qui est de conclure à la présence ou non d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en utilisant au moins une valeur seuil.
[Revendication 10] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : i) déterminer le niveau de transcrits d’un seul gène marqueur sélectionné parmi les ISG, pour l’échantillon test, ii) comparer le niveau de transcrits dudit gène marqueur obtenu, à un niveau de référence, utilisé en tant que valeur seuil, ledit niveau de référence étant le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire réplicatif, qui, de préférence, ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de tels sujets et iii) conclure à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet en cas de différence avec ledit niveau de référence dudit gène marqueur.
[Revendication 11] Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit gène marqueur est l’IFITI ou l’IFI44L.
[Revendication 12] Procédé selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : i) déterminer les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG pour l’échantillon test, et ii) comparer le niveau de transcrits de chaque gène marqueur déterminé dans l’échantillon test avec un niveau de référence correspondant audit gène marqueur, utilisé en tant que valeur seuil, ledit niveau de référence étant le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire réplicatif, qui, de préférence, ne possède pas d’auto anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de tels sujets, et iii) conclure à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, en cas de différence avec le niveau de référence correspondant, pour au moins un des gènes marqueurs, pour lequel le niveau de transcrits a été déterminé dans l’échantillon test.
[Revendication 13] Procédé selon l’une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que ladite différence correspond à un niveau de transcrits dudit gène marqueur déterminé pour l’échantillon test supérieur à celui dudit niveau de référence.
[Revendication 14] Procédé selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : i) déterminer les niveaux de transcrits de plusieurs gènes marqueurs sélectionnés parmi les ISG, pour l’échantillon test, ii) comparer le niveau de transcrits de chaque gène marqueur déterminé dans l’échantillon test avec un niveau de référence correspondant audit gène marqueur, avec calcul du rapport entre ledit niveau de transcrits sur ledit niveau de référence dudit gène marqueur, ledit niveau de référence étant, de préférence, le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets, iibis) calculer la médiane de tous les rapports obtenus à l’étape ii), et iii) conclure à la présence d’une infection par un virus respiratoire réplicatif chez ledit sujet, lorsque ladite médiane calculée à l’étape iibis) est supérieure à une valeur seuil, qui est, de préférence, égale à 1 ,5.
[Revendication 15] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détermination du niveau de transcrits du ou des gènes marqueurs est réalisée par hybridation, amplification ou séquençage, et, en particulier, par RT-qPCR.
[Revendication 16] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le niveau de transcrits du ou des gènes marqueurs obtenu est une valeur normalisée par rapport au niveau de transcrits d’un ou plusieurs gènes de ménage, notamment choisi(s) parmi DECR1, HPRT1 et PPIB.
[Revendication 17] Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que préalablement ou concomitamment à l’étape i), l’échantillon test est soumis à un test de diagnostic, par détection d’ADN ou d’ARN, notamment par PCR ou RT-PCR, d’un virus respiratoire, notamment choisi parmi les virus SARS-CoV-2 et le virus de la grippe.
[Revendication 18] Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l’échantillon test est soumis à un test de diagnostic, par détection d’ADN ou d’ARN, notamment par PCR ou RT-PCR, d’un virus respiratoire choisi parmi les virus SARS-CoV-2 et le virus de la grippe, ledit test de diagnostic étant, de préférence, réalisé préalablement à l’étape i) et ayant donné un résultat positif.
[Revendication 19] Kit de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant :
- au moins un moyen de détermination du niveau de transcrits d’un gène marqueur sélectionné parmi les ISG, choisi parmi les oligonucléotides,
- au moins une valeur seuil stockée sur un support lisible par un ordinateur, ladite valeur seuil correspondant au niveau de transcrits dudit gène marqueur chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[Revendication 20] Kit selon la revendication 19, caractérisé en ce qu’il comprend, en outre, au moins un niveau de référence pour ledit gène marqueur, stocké sur un support lisible par un ordinateur, ledit niveau de référence qui étant, de préférence, le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets.
[Revendication 21] Kit de détection selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce qu’il comprend, en outre, au moins un moyen de détection d’un virus respiratoire.
[Revendication 22] Kit de détermination in vitro ou ex vivo de la présence chez un sujet, d’une infection par un virus respiratoire réplicatif, comprenant :
- au moins un moyen de détermination du niveau de transcrits d’un gène marqueur sélectionné parmi les ISG, choisi parmi les oligonucléotides,
- au moins un moyen de détection et/ou d’amplification de l’ADN ou de l’ARN d’un virus respiratoire.
[Revendication 23] Kit de détection selon la revendication 22, caractérisé en ce qu’il comprend, en outre, au moins une valeur seuil stockée sur un support lisible par un ordinateur.
[Revendication 24] Kit de détection selon la revendication 23, caractérisé en ce que la valeur seuil correspond au niveau de transcrits dudit gène marqueur chez un sujet ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possède pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w, ou chez une population de sujets ne présentant aucune infection par un virus respiratoire réplicatif et qui, de préférence, ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron a et/ou ne possèdent pas d’auto-anticorps neutralisants dirigés contre l’interféron w.
[Revendication 25] Kit de détection selon la revendication 23, caractérisé en ce qu’il comprend, en outre, au moins un niveau de référence pour ledit gène marqueur, stocké sur un support lisible par un ordinateur ledit niveau de référence étant, de préférence, le niveau de transcrits dudit gène marqueur, chez un sujet non infecté par un virus respiratoire, ou chez une population de tels sujets.
[Revendication 26] Kit de détection selon l’une des revendications 19 à 25, caractérisé en ce qu’il comprend, en outre, un échantillon contrôle négatif permettant de s’assurer de l’absence de contamination, et/ou un échantillon contrôle positif qui correspond au niveau de dudit gène marqueur à une concentration représentative du niveau de transcrits d’un sujet ayant une infection par un virus respiratoire réplicatif ou chez une population de sujets ayant une infection par un virus respiratoire réplicatif.
EP22751137.5A 2021-07-08 2022-07-07 Procede et kit de detection d'un virus respiratoire replicatif Pending EP4367267A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2107421A FR3125065A1 (fr) 2021-07-08 2021-07-08 Procédé et kit de détection d’un virus respiratoire réplicatif
PCT/FR2022/051366 WO2023281225A2 (fr) 2021-07-08 2022-07-07 Procede et kit de detection d'un virus respiratoire replicatif

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4367267A2 true EP4367267A2 (fr) 2024-05-15

Family

ID=80122619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP22751137.5A Pending EP4367267A2 (fr) 2021-07-08 2022-07-07 Procede et kit de detection d'un virus respiratoire replicatif

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240318268A1 (fr)
EP (1) EP4367267A2 (fr)
JP (1) JP2024524584A (fr)
CN (1) CN117677713A (fr)
FR (1) FR3125065A1 (fr)
WO (1) WO2023281225A2 (fr)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200208203A1 (en) * 2015-06-03 2020-07-02 The Second Xiangya Hospital Of Central South University Kit for diagnosis of systemic lupus erythematosus and probe for the detection and quantification of the methylation level of an ifi44l fragment

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2005589C (fr) 1988-12-16 2001-02-06 Akzo Nobel Nv Systeme de replication de sequences auto-entretenu
CA2020958C (fr) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Methodes d'amplification de sequences d'acide nucleique
EP1020534B2 (fr) 1998-11-09 2011-01-05 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Procede de synthese d'acide nucleique
EP2089543B1 (fr) 2006-11-15 2020-07-01 BioFire Diagnostics, LLC Analyse biologique auto-contenue haute densité
FR3044325B1 (fr) 2015-12-01 2019-05-03 Biomerieux Procede d'evaluation du risque de complications chez les patients qui presentent un syndrome de reponse inflammatoire systemique (sirs)
CN107058521B (zh) * 2017-03-17 2019-12-27 中国科学院北京基因组研究所 一种检测人体免疫状态的检测系统
US12344893B2 (en) 2018-06-05 2025-07-01 Washington University Nasal genes used to identify, characterize, and diagnose viral respiratory infections
CN110387428A (zh) * 2019-08-30 2019-10-29 王刚 Ifi44l基因和pi3基因在制备诊断细菌/病毒感染试剂盒中的用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200208203A1 (en) * 2015-06-03 2020-07-02 The Second Xiangya Hospital Of Central South University Kit for diagnosis of systemic lupus erythematosus and probe for the detection and quantification of the methylation level of an ifi44l fragment

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of WO2023281225A2 *
SHOJAEI MARYAM ET AL: "IFI27 transcription is an early predictor for COVID-19 outcomes; a multi-cohort observational study", MEDRXIV, 1 November 2021 (2021-11-01), XP055921561, Retrieved from the Internet <URL:https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9850159/pdf/fimmu-13-1060438.pdf> [retrieved on 20220516], DOI: 10.1101/2021.10.29.21265555 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR3125065A1 (fr) 2023-01-13
WO2023281225A2 (fr) 2023-01-12
US20240318268A1 (en) 2024-09-26
WO2023281225A3 (fr) 2023-03-23
JP2024524584A (ja) 2024-07-05
CN117677713A (zh) 2024-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ziegler et al. Impaired local intrinsic immunity to SARS-CoV-2 infection in severe COVID-19
Truong et al. Persistent SARS-CoV-2 infection and increasing viral variants in children and young adults with impaired humoral immunity
Castro et al. Rapid diagnosis of Zika virus through saliva and urine by Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
Emadi et al. Highly conserve sequences in envelope, nucleoprotein and RNA-dependent RNA polymerase of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal samples of the COVID-19 patients; a diagnostic target for further studies
Park et al. Replicative virus shedding in the respiratory tract of patients with Middle East respiratory syndrome coronavirus infection
Zerbib et al. Pathway mapping of leukocyte transcriptome in influenza patients reveals distinct pathogenic mechanisms associated with progression to severe infection
EP4551721A1 (fr) Determination du risque de deces d&#39;un sujet infecte par un virus respiratoire par la mesure du niveau d&#39;expression du gene adgre3
da Silva Queiroz et al. Development of a quantitative one-step multiplex RT-qPCR assay for the detection of SARS-CoV-2 in a biological matrix
EP4551725A1 (fr) Determination du risque de deces d&#39;un sujet infecte par un virus respiratoire par mesure du niveau d&#39;expression du gene oas2
Feizollahi et al. Association of IFIH1 and DDX58 genes polymorphism with susceptibility to COVID-19
KR102346881B1 (ko) 코로나 바이러스 및 인플루엔자 바이러스 동시 진단용 키트
Tah et al. The ACE 2 G8790A and IL-22 Gene Polymorphisms and their Association with Susceptibility to COVID-19 in Yaounde, Cameroon
WO2023281225A2 (fr) Procede et kit de detection d&#39;un virus respiratoire replicatif
WO2022125702A1 (fr) Analyse de l&#39;expression d&#39;un gène hôte pour le diagnostic d&#39;une infection par le coronavirus à syndrome respiratoire aigu sévère 2
Sherman et al. Acute SARS-CoV-2 infection
Szentiks et al. Polar bear encephalitis: establishment of a comprehensive next-generation pathogen analysis pipeline for captive and free-living wildlife
Hu et al. Altered baseline immunological state and impaired immune response to SARS-CoV-2 mRNA vaccination in lung transplant recipients
Parai et al. Dynamicity and persistence of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 antibody response after double dose and the third dose with BBV-152 and AZD1222 vaccines: A prospective, longitudinal cohort study
US20240392393A1 (en) Subgenomic RNAs for Evaluating Viral Infection
Zhang et al. Enhanced expression of two ISGs as potential biomarkers of prognosis in HIV-infected immunological non-responders
Zeng et al. The intra-host evolution of SARS-CoV-2 after neutralizing antibody therapy, revealed by nanopore sequencing
EP4303319A1 (fr) Détermination du risque de décès d&#39;un sujet infecté par un virus respiratoire par mesure du niveau d expression du gène cd74
Khan et al. Modern diagnostics processes among new strains of Coronaviruses: A review
EP4303320A1 (fr) Détermination du risque de décès d&#39;un sujet infecté par un virus respiratoire par mesure du niveau d expression du gène tdrd9
Bouzid et al. Polyphasic molecular approach to the characterization of methanogens in the saliva of Tunisian adults

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20240115

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20251203