EP4359022A1 - Procede de consolidation d'un hydrogel alginate / gelatine - Google Patents

Procede de consolidation d'un hydrogel alginate / gelatine

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Publication number
EP4359022A1
EP4359022A1 EP22744282.9A EP22744282A EP4359022A1 EP 4359022 A1 EP4359022 A1 EP 4359022A1 EP 22744282 A EP22744282 A EP 22744282A EP 4359022 A1 EP4359022 A1 EP 4359022A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrogel
alginate
gelatin
solution
consolidation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22744282.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe Marquette
Emma PETIOT
Laura CHASTAGNIER
Audrey CHERBLANC
Morgan DOS SANTOS
Amélie THEPOT
Baptiste GODET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon
Lab Skin Creations
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon
Lab Skin Creations
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon, Lab Skin Creations, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon
Publication of EP4359022A1 publication Critical patent/EP4359022A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
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    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/04—Materials or treatment for tissue regeneration for mammary reconstruction

Definitions

  • the present invention relates to the field of the manufacture of materials in general, and in particular of bio-materials or bio-compatible materials.
  • the present invention relates to a process for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin, which includes a step of consolidating the hydrogel by crosslinking using a suitable solution, in order to give it properties particularly advantageous mechanics.
  • This crosslinking solution to consolidate the structure of a hydrogel comprising alginate and gelatin also constitutes another aspect of the present invention.
  • the hydrogel obtained by this method is also another aspect of the present invention.
  • the present invention also relates to a process for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin, said process comprising the preparation of the hydrogel, its shaping, then its bringing into contact with at least one divalent cation, preferentially calcium, and transglutaminase.
  • the hydrogel obtained by this method is also another aspect of the present invention.
  • the hydrogel may further comprise fibrinogen and/or live cells.
  • Hydrogel-based structures comprising alginate and gelatin are known in the state of the art, but they lack satisfactory mechanical strength, because these constituents most often have limited elasticity (low Young's modulus, in particular), which makes the resulting structures difficult to handle.
  • the international application published under the number WO2017115056 describes the manufacture of hydrogel-based body substitutes comprising alginate, gelatin and fibrinogen, which are then treated with a cross-linking solution containing calcium and thrombin.
  • the mechanical properties of the structures obtained in the prior art nevertheless remain insufficient to make them suitable for manipulation.
  • the process for preparing such structures must be compatible with the presence of living cells and their keeping alive.
  • One of the aims of the invention is to overcome these drawbacks of the prior art, and to make it possible in particular to produce hydrogels, cellularized or not, which have particularly advantageous and innovative characteristics, in particular in terms of (i) the mechanical strength of the constituents, (ii) stability over time, (iii) flexibility, (iv) resistance to tearing and impact, and (v) colonization by cells.
  • a method for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin comprising the preparation of the hydrogel, then its bringing into contact with a consolidation solution comprising at least one divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations.
  • the consolidation solution can also contain thrombin if, in addition to alginate and gelatin, the hydrogel contains fibrinogen.
  • the consolidation step is compatible with the fact that G hydrogel can contain living cells.
  • a solution as described above for consolidating the structure of a hydrogel comprising alginate and gelatin which has a very particular advantage when it is a question of preparing a hydrogel intended to be implanted in the human or animal body, that is to say as a body implant.
  • This use can also be implemented to consolidate a hydrogel further comprising fibrinogen.
  • the consolidation can also be carried out on a hydrogel further comprising living cells.
  • the present invention relates to a process for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin, said process comprising the preparation of the hydrogel, then bringing it into contact with a consolidation solution comprising at least one cation divalent, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations.
  • the contacting of the hydrogel with the consolidation solution is carried out by immersion, preferably total, of the hydrogel in the consolidation solution, or else by spraying the hydrogel with the consolidation solution.
  • the divalent cation(s) is/are chosen from the group comprising calcium, strontium and barium.
  • the hydrogel comprises 0.5 to 3% alginate and 1 to 17.5% gelatin.
  • the hydrogel further comprises fibrinogen and the consolidation solution further comprises thrombin.
  • the hydrogel comprises up to 2% fibrinogen.
  • the consolidation solution includes:
  • the hydrogel further comprises living cells integrated during the preparation of the hydrogel before its consolidation.
  • the contacting with the consolidation solution is carried out:
  • the hydrogel is shaped, prior to its consolidation, preferably said shaping is done by material extrusion, even more preferably said shaping is done by a molding or additive manufacturing technique.
  • the present invention also relates to the use of a solution comprising a divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations, to consolidate a hydrogel comprising alginate and gelatin.
  • a divalent cation preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations
  • the present invention also relates to a hydrogel comprising consolidated alginate and gelatin, intended to be implanted in a human subject, the hydrogel being capable of being obtained by a consolidation process as described above. .
  • a method for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin comprising, in order, the following steps: - the preparation of G hydrogel, the shaping of the prepared G hydrogel, bringing the hydrogel into contact with at least one divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations.
  • said preparation of the hydrogel does not require the shaping of one or more components prior to the preparation of the hydrogel
  • said preparation of the hydrogel does not require the addition of fibers.
  • the divalent cation(s) is/are chosen from the group comprising calcium, strontium and barium.
  • the present invention relates to a hydrogel comprising consolidated alginate and gelatin, intended to be implanted in a human subject, the hydrogel being capable of being obtained by a consolidation process as described previously.
  • Crosslinking agent in the context of the present invention, means an agent capable of crosslinking the components of G hydrogel, in particular alginate, gelatin and fibrinogen.
  • Concomitant in the context of the present invention, designates events taking place at the same time.
  • the concomitant contacting of the hydrogel with calcium and transglutaminase means that the hydrogel comprising alginate and gelatin is brought into contact, at the same time, with calcium and transglutaminase, thus allowing concomitant cross-linking of alginate and gelatin.
  • Fibers in the context of the present invention, denotes any element of filamentary appearance, generally in the form of bundles. Examples of fibers are given below.
  • Shape in the context of the present invention, consists in giving the shaped element a particular shape, structure and/or architecture.
  • this consists, for example, in giving it a particular shape, structure and/or architecture particularly suited to the destination of the hydrogel once consolidated.
  • shaping one or more components of the hydrogel during its preparation this consists, for example, in giving them a particular structure, such as a structure in the form of fibers, when of the preparation of the hydrogel.
  • Crosslinking or “consolidating”, in the context of the present invention, are equivalent terms and designate the fact of consolidating the hydrogel by crosslinking alginate, gelatin and/or fibrinogen.
  • Sequential in the context of the present invention, means events that do not take place at the same time.
  • sequential contacting of the hydrogel with calcium and transglutaminase means that the hydrogel is brought into contact with calcium, then transglutaminase or with transglutaminase then calcium.
  • Consolidation solution and “crosslinking solution”, in the context of the present invention, are equivalent terms and designate the solution used in the method according to the invention to consolidate the hydrogel by crosslinking.
  • the present invention provides a process for preparing hydrogels comprising alginate and gelatin, cellularized or not.
  • the structure of the hydrogel will be consolidated, so as to give it particularly advantageous mechanical characteristics, in particular in terms of the mechanical strength of the constituents, the stability over time and the remarkable resistance to tearing and shocks.
  • the present invention relates to a process for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin, said process comprising the preparation of the hydrogel, then bringing it into contact with a consolidation solution comprising at least one divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations.
  • said consolidation solution can be obtained by alternative but nevertheless equivalent methods.
  • the consolidation solution can be obtained by adding the various elements, i.e. at least one divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations, in the same solution, or else by mixing at least two solutions: a solution comprising at least one divalent cation, preferably calcium, and optionally one or more other divalent cations, and a solution comprising at least transglutaminase.
  • Alginate is a linear polysaccharide extracted from seaweed, mainly from the brown seaweed species Phaeophyceae.
  • This biocompatible polymer is composed of homopolymeric blocks of 1,4 b -D mannuronic acid (M) and its epimer C-5 a-L guluronic acid (G).
  • M 1,4 b -D mannuronic acid
  • G a-L guluronic acid
  • This biopolymer consists of sequences of M-blocks, of G-blocks, intercalated with sequences of MG-blocks. Only G units seem to be involved in intermolecular cross-linking during polymerization.
  • Sodium alginate is widely used as a hydrogel.
  • Gelatin is a collagen-derived macromolecule that contains bioactive sequences like the RGD (arginine-glycine-aspartic acid) motif for cell adhesion. It is obtained by denaturing the native triple helix structure of collagen via an acid (type A gelatin) or alkaline (type B gelatin) treatment.
  • the amino acid composition of gelatin is similar to but different from that of collagen following denaturation (deamination of glutamine to glutamic acid in the manufacturing process of type B gelatin). The structure of gelatin changes during gelation.
  • hydrogels The preparation of hydrogels is well known in the art (E.M. Ahmed; Journal of Advanced Research, 2015, 6, 105-121), as well as the polymerization and crosslinking of alginate and gelatin (Chen Q, Tian X , Fan J, Tong H, Ao Q, Wang X. An Interpenetrating Alginate/Gelatin Network for Three-Dimensional (3D) Cell Cultures and Organ Bioprinting. Molecules. 2020;25(3):756.)).
  • an alginate enriched in M unit will be more flexible because the chain will have a more linear configuration, while a gel containing more G units will be more rigid because more polymerized.
  • the alginate used has, for example, an M/G ratio of between 1 and 2, in particular between 1 and 1.9 or between 1 and 1.5.
  • the alginate used has, for example, an M/G ratio of 1.9.
  • the gelatin contained in the hydrogel is of type A.
  • the hydrogel is preferably prepared from an alginate solution to which a gelatin solution is added, or vice versa from a gelatin solution to which an alginate solution is added, so as to obtain a hydrogel comprising from 0.5 to 3% alginate and from 1 to 17.5% gelatin, and further more preferably 1-2.5% alginate and 2-10% gelatin.
  • the hydrogel comprises 2% alginate and 5% gelatin.
  • the hydrogel to be consolidated contains alginate and gelatin, these constituents are present in a mass ratio ranging from 1:0.3 to 1:35, and most particularly in a mass ratio of 1: 2.5, respectively.
  • this preferably includes:
  • the consolidation solution comprises from 1 to 6% of divalent cation(s), and advantageously 3% of divalent cation(s).
  • the consolidation solution comprises from 1 to 10% of transglutaminase, and advantageously 4% of transglutaminase.
  • T AG transglutaminase
  • the consolidation solution preferably contains type 2 transglutaminase.
  • This TAG is in particular produced commercially as a recombinant microbial protein by the fermentation of the microorganism Streptoverticillium moboarense.
  • the consolidation solution used in the context of the invention can also contain several TAGs.
  • Any other divalent cation preferably non-toxic, can be used in the context of the process according to the invention.
  • the divalent cation(s) is/are selected from the group comprising or consisting of calcium, strontium, barium, zinc, copper, iron and nickel.
  • the divalent cation(s) is/are chosen from the group comprising or consisting of calcium, strontium and barium.
  • the divalent cation is calcium, but it can also be strontium or barium.
  • divalent cations in a mixture.
  • the divalent cation(s) are present in the form of salts in the consolidation solution. Any salt can be used, preferably anhydrous salts.
  • the consolidation solution only comprises a divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase.
  • a divalent cation preferably calcium
  • transglutaminase preferably transglutaminase
  • the consolidation solution contains calcium chloride as the only divalent cation.
  • the simultaneous crosslinking of the components of the hydrogel takes place thanks to the bringing into contact with a consolidation solution in which (i) the divalent cation, preferably calcium, or the other divalent cation(s) allows(s) the crosslinking of the alginate and (ii) the transglutaminase induces the enzymatic crosslinking of gelatin.
  • the contacting of G hydrogel with the consolidation solution is carried out by immersion, during which the hydrogel is immersed in its entirety in the consolidation solution.
  • the contacting of the hydrogel with the consolidation solution can also be carried out by imbibition, by spraying, using a drip system, runoff, or the like.
  • the contacting preferably relates to the entire hydrogel.
  • the hydrogel is fully immersed in the consolidation solution.
  • the hydrogel to be consolidated according to the present invention may further comprise fibrinogen, in addition to alginate and gelatin.
  • the fibrinogen monomer is composed of two repetitions of three chains a, b and g linked by a central E domain and of two fibrinopeptides A and B (FpA, FpB) linking the a chains to the E domain. It has a large number of motifs. of cell adhesion and thus allows an increased development of cells within the hydrogel.
  • the hydrogel which is prepared to be consolidated according to the method of the invention is composed of alginate and gelatin, or else of alginate, gelatin and fibrinogen, without any other constituent capable of forming a gel.
  • the hydrogel comprises fibrinogen
  • it is prepared so as to contain up to 6% fibrinogen, and in particular from 0.0001% to 6% fibrinogen, and in particular 2% fibrinogen.
  • hydrogel contains alginate, gelatin and fibrinogen, these constituents are present in a mass ratio ranging from 1:0.3:0.00003 to 1:35:12, and especially in a mass ratio of 1:1:2.5, respectively.
  • the consolidation solution used in the method according to the invention further comprises thrombin, that is to say thrombin in addition to the calcium and TAG, and optionally one or more other divalent cations.
  • said consolidation solution further comprising thrombin can be obtained by alternative but nevertheless equivalent methods.
  • the consolidation solution can be obtained by adding the various elements, i.e. at least one divalent cation, preferably calcium, transglutaminase, thrombin, and optionally one or more other divalent cations, in the same solution, or else by mixing at least three solutions: a solution comprising at least one divalent cation, preferably calcium, and optionally one or more other divalent cations, a solution comprising at least transglutaminase, and a solution comprising thrombin.
  • the thrombin can be integrated into the solution comprising at least one divalent cation or into the solution comprising transglutaminase.
  • said consolidation solution can be obtained by mixing at least two solutions: i) a solution comprising at least one divalent cation, preferably calcium, and optionally one or more other divalent cations, and thrombin, and a solution comprising transglutaminase, or ii) a solution comprising at least one divalent cation, preferably calcium, and optionally one or more other divalent cations, and a solution comprising transglutaminase and thrombin.
  • Fibrin is a natural biological polymer resulting from a polymerization mimicking the last step of the coagulation cascade by the action of thrombin on fibrinogen. Thrombin will initially cleave fibrinopeptide A, leading to the formation of a protofibril. Cleavage of fibrinopeptide B results in release of ⁇ chains and subsequent lateral polymerization of fibrinogen forming fibrin.
  • the consolidation solution used comprises thrombin, in addition to calcium and TAG, and optionally one or more other divalent cations.
  • the consolidation solution comprises: - from 2 to 25 U/ml of thrombin,
  • the consolidation solution comprises from 1 to 6% of divalent cation(s), and advantageously 3% of divalent cation(s).
  • the consolidation solution comprises from 1% to 10% of transglutaminase, and advantageously 4% of transglutaminase.
  • the consolidation solution also comprises thrombin
  • the latter is present preferably from 2 to 10 U/ml.
  • the consolidation solution comprises 4 U/ml of thrombin, 3% calcium, and 4% transglutaminase.
  • alginate, gelatin and, where appropriate, fibrinogen, which are used are chosen from those which have the characteristics most similar to the following: alginate: viscosity of 130-300 mPa. s for a 2% solution;
  • - gelatin type A, porcine, degree of bloom 280 (strength or resistance to sinking);
  • - fibrinogen human, coagulable protein level > 91 mg/mL;
  • - thrombin human, activity > 500 U/mL.
  • the hydrogels advantageously contain alginate, gelatin and optionally fibrinogen as natural constituents of the hydrogel.
  • hydrogels other natural components may also be present or not in the hydrogels, among which the following may be mentioned in particular: chitin, chitosan, cellulose, agarose, chondroitin sulphate, hyaluronic acid, glycogen, 'starch, pullulan, carrageenan, heparin, collagen, albumin, fibrin, fibroin, dextran, xanthan, gellan, any component extracted from the extracellular matrix such as collagens, laminin, Matrigel-type proteoglycans, gelatin GelMa type methacrylate.
  • the hydrogels of the present invention may or may not also contain synthetic components, such as polyolefins (PE, PP, PTFE, PVC), silicone (PDMS), polyacrylates (PMMA, pHEMA), polyester (PET, dacron, PGA, PLLA, PLA, PDLA, PDO, PCL), polyethers (PEEK, PES), polyamides, polyurethanes, PEG, pluronic F127.
  • synthetic components such as polyolefins (PE, PP, PTFE, PVC), silicone (PDMS), polyacrylates (PMMA, pHEMA), polyester (PET, dacron, PGA, PLLA, PLA, PDLA, PDO, PCL), polyethers (PEEK, PES), polyamides, polyurethanes, PEG, pluronic F127.
  • Textile fibers of natural or synthetic origin may also be present or not in the composition of the hydrogels.
  • Naturally occurring fibers include, but are not limited to, cellulose fibers.
  • fibers of synthetic origin include, without limitation, polyester fibers, nylon fibers, polyethylene fibers, polypropylene fibers, and acrylic fibers.
  • the hydrogel may further comprise living cells.
  • said hydrogel may comprise alginate, gelatin, optionally fibrinogen, and optionally living cells.
  • said hydrogel may consist of alginate, gelatin, optionally fibrinogen, and optionally living cells.
  • living cells can be of any type, with the exception of human embryonic stem cells obtained by destruction of an embryo, and preferably several types of living cells can coexist.
  • the living cells are preferably chosen from cells of epithelial tissue, connective tissue, adipose tissue, endothelial tissue, and in particular from fibroblasts, keratinocytes, stem cells of adipose tissue, adipocytes, melanocytes, endothelial cells, macrophages, leukocytes, etc.
  • the cells are therefore manipulated under conditions that the person skilled in the art is able to determine in the art, to allow the maintenance of their viability and their proliferation, and ideally their differentiation.
  • the hydrogel to be consolidated according to the invention comprises living cells which are integrated during the preparation of the hydrogel before its consolidation.
  • the living cells can be suspended in the fibrinogen solution, to which the alginate and gelatin are added, in one or more stages, so as to obtain a hydrogel comprising the quantities of alginate/gelatin/fibrinogen mentioned above. -above.
  • sequence (iii) is used to prepare a cellularized hydrogel according to the invention.
  • the hydrogel does not include living cells, so in this case it is acellular.
  • the range preferences for each of the constituents mentioned above also apply. It is also possible to prepare the hydrogel to be consolidated in a single step, that is to say by mixing all the constituents at the same time, whether alginate and gelatin, and optionally fibrinogen and/or living cells, if any.
  • the consolidation step which consists in bringing the hydrogel into contact with the solution of consolidation, is carried out at a temperature ranging from 15 to 40°C, and preferably from 20 to 40°C and even more preferably from 21 to 37°C.
  • this consolidation step is carried out for a period ranging from 10 minutes to 6 hours, preferably ranging from 30 minutes to 6 hours, and ideally for 1 hour to 3 hours.
  • the consolidation step is carried out at 37°C for 1 hour 30 minutes.
  • the hydrogel consists of alginate and gelatin, or alternatively of alginate, gelatin and fibrinogen, and the consolidation step is carried out at 37°C for 1 hour 30 minutes.
  • the hydrogel consists of alginate and gelatin, or alternatively alginate, gelatin and fibrinogen, and the consolidation step is carried out by total immersion of the hydrogel in the consolidation solution at 37° C for lh30.
  • the latter may comprise a step of shaping the hydrogel once prepared, and prior to its consolidation.
  • the hydrogels as described in detail above can therefore be "shaped", before consolidation, by various methods well known to those skilled in the art allowing volume structuring (in particular 3D), and particular by adding or agglomeration of material by stacking successive layers or deposition.
  • the hydrogels as described above can be obtained by an additive manufacturing process.
  • these processes mention may in particular be made of methods by injection, by extrusion, and in particular molding, or additive manufacturing, in particular 3D printing.
  • the hydrogels as described above can be obtained by material extrusion, preferably by a molding technique or by additive manufacturing, in particular 3D printing.
  • the hydrogel which is consolidated according to the consolidation process is preferably shaped before consolidation, preferably by a 3D printing technique.
  • the implementation of the method according to the invention makes it possible to confer on the hydrogel, once consolidated, advantageous mechanical properties, which are very particularly suitable for the supply of a hydrogel intended to be implanted in the body. human or animal, i.e. as a bodily implant.
  • the shaping of the hydrogel, prior to its consolidation, by the use of 3D printing has the advantage of being able to prepare a "tailor-made" structured hydrogel whose dimensions and/or filling/porosity are defined with regard to the needs of the body of the organism intended to receive the bodily implant and the role/function that it will have to play in this recipient organism.
  • the porosity of the implant is a key parameter to be adjusted according to the tissues or organs concerned which are in particular to be replaced and/or increased.
  • the porosity translates the empty space present in the implant which it is possible to adapt in order to provide more or less material and thus to confer a certain mechanical resistance approaching as close as possible to that of the native tissue of the area. of implantation.
  • it can be expressed in two different but correlated and therefore equivalent or alternative ways: the pore size expressed in micrometers and/or the hydrogel filling rate expressed as a percentage (volume of hydrogel / total volume of the implant).
  • the living cells are autologous cells, it is that is, cells from the recipient organism.
  • the hydrogel described previously made it possible to obtain a three-dimensional body implant which comprises one or more zones porous each having an overall porosity of between 100 ⁇ m and 10000 ⁇ m, while having a mechanical strength of 1 kPa to 1000 kPa.
  • the overall porosity of a porous zone corresponds to an average of pore sizes of the pores measured in the porous zone.
  • the pores of the porous zone may have homogeneous pore sizes, that is to say not differing by more than 15% from each other.
  • the pores of the porous zone can be distributed homogeneously, that is to say regular.
  • the pores of the porous zone can extend along central axes respectively presenting homogeneous orientations, that is to say not differing by more than 20° from each other.
  • the central axes of the pores of the porous zone can be arranged with homogeneous spacings, that is to say not differing by more than 15% from each other.
  • the pores of the porous zone can respectively present homogeneous geometries, that is to say whose contours are superimposable with more than 50% of merged or parallel portions.
  • the pores of the porous zone can be separated from each other by cords of material having respectively homogeneous thicknesses, that is to say not differing by more than 15% from each other.
  • the implant may in particular comprise at least two porous zones in which the pores have different pore sizes and/or shapes.
  • the porous zones can then be arranged to form a gradient of pore sizes distributed over the implant, the porous zones succeeding one another along a gradient direction following an order chosen from an increasing order and a decreasing order of the pore sizes.
  • the implant may include:
  • a first porous zone forming a base representing 5% to 40%, preferably 20% to 40%, of a total volume of the implant, and having a pore size comprised between 500 micrometers and 5000 micrometers, in particular 250 micrometers to 800 micrometers,
  • a second porous zone forming a heart representing 20% to 70%, preferably 30% to 50%, of the total volume of the implant and having a pore size of between 500 micrometers to 2500 micrometers, in particular 100 micrometers to 250 micrometers ,
  • the implant may also include at least one non-porous zone, the non-porous zone having a filling rate greater than 99%.
  • Said at least one non-porous zone can comprise a perimeter surrounding the porous zone.
  • the porous zone or zones can cover an essential part of the implant, that is to say at least 50%, preferably at least 75%, in particular at least 90%, for example at least 95%.
  • the implant may be made up of a plurality of layers each having a mesh made up of a plurality of meshes, the layers being stacked on top of each other in such a way that the meshes form the pores.
  • the meshes of each layer may have homogeneous mesh sizes, i.e. not differing by more than 15% from each other.
  • the meshes of each layer can be distributed in a homogeneous way, that is to say evenly.
  • the meshes of each layer can extend around central mesh axes respectively having homogeneous orientations, that is to say not differing by more than 20° with respect to each other.
  • the central mesh axes of the meshes of each layer can be arranged with uniform spacings, that is to say not differing by more than 15% relative to each other.
  • the meshes of each layer can respectively present homogeneous geometries, that is to say whose contours are superimposable with more than 50% of merged or parallel portions.
  • the meshes of each layer can be separated from each other by cords of material having respectively homogeneous thicknesses, that is to say not differing by more than 15% from each other.
  • the implant may have a volume in a range from 0.05 mL to 3 L, preferably from 100 mL to 600 mL.
  • the implant may be a breast implant.
  • the present invention relates to the use of a solution comprising a divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations, to consolidate a hydrogel comprising alginate and gelatin.
  • a divalent cation preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations
  • This consolidation solution can also be used to consolidate a hydrogel comprising, in addition to alginate and gelatin, fibrinogen and therefore said solution will comprise thrombin in addition to the divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optional other divalent cation(s).
  • the present invention relates to a hydrogel comprising consolidated alginate and gelatin, preferably intended to be implanted in a human subject, the hydrogel being capable of being obtained by a consolidation process such than previously described.
  • the present invention relates to a method for consolidating a hydrogel comprising alginate and gelatin, said method comprising, in order, the following steps:
  • the hydrogel comprising alginate and gelatin can be prepared as previously described.
  • the preparation of the hydrogel does not require the shaping of one or more components prior to the preparation of the hydrogel.
  • the preparation of the hydrogel does not require the shaping of one or more components, for example alginate and/or gelatin, in the form of fibers prior to the preparation.
  • Methods for shaping components in the form of fibers are well known to those skilled in the art and include, for example, methods of electrospinning, extrusion, by fragmentation, freeze-drying then fragmentation.
  • the preparation of the hydrogel does not require the addition of fibers.
  • G hydrogel does not include fibers. Examples of fibers are mentioned above.
  • the hydrogel can be shaped as described previously.
  • the shaping of the prepared hydrogel is done by material extrusion, preferably by molding or by additive manufacturing, in particular 3D printing.
  • Bringing the hydrogel into contact with at least one divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations can be done concomitantly, using a consolidation solution comprising at least calcium and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations.
  • a consolidation solution comprising at least calcium and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations.
  • the consolidation solution and the contacting of the hydrogel with said solution are as described above.
  • Bringing the hydrogel into contact with at least one divalent cation, preferably calcium, and transglutaminase, and optionally one or more other divalent cations, can also be done sequentially, that is to say that the cross-linking agents are not added at the same time during consolidation.
  • the hydrogel can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • the hydrogel can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • consolidation further includes the cross-linking of fibrinogen with thrombin.
  • This crosslinking can be done sequentially with the crosslinking of the alginate and the gelatin (e.g. before or after the crosslinking of the alginate and/or the gelatin) or concomitantly.
  • the hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin
  • the hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • G hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin, G hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • the hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin
  • the hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • the hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin
  • the hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • a solution comprising a divalent cation, preferably calcium, and optionally one or more other divalent cations.
  • the hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin
  • the hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • G hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin, G hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • the hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin
  • the hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • the hydrogel contains fibrinogen in addition to alginate and gelatin
  • the hydrogel once prepared can be brought into contact with the solutions as described below, in the following order:
  • transglutaminase a solution comprising transglutaminase, and a divalent cation, preferably calcium.
  • the bringing into contact of the hydrogel with the solution(s) mentioned above can be carried out by immersion, during which the hydrogel is immersed in the entirety of the solution(s). of the solution(s) mentioned above. It can also be carried out by imbibition, by spraying, using a drip system, trickling, or the like.
  • the present invention relates to a hydrogel comprising consolidated alginate and gelatin, preferably intended to be implanted in a human subject, the hydrogel being capable of being obtained by a consolidation process such than previously described.
  • FIG. 1 represents the comparison of the Young's modulus (A) and the viscosity (B) of AG and FAG hydrogels which constitute the implants according to the invention.
  • Figure 2 represents the comparison of the Young's moduli E0 (Pa) of an AG hydrogel in which the gelatin is cross-linked with and without transglutaminase and stored for up to 7 days at 37°C.
  • Figure 3 represents the comparison of the Young's moduli E0 (Pa) of an AG hydrogel and commercial hydrogels crosslinked or not with transglutaminase. *: Liquid compound at 37°C; +: visible polymerization but insufficient gel stiffness at 37°C for DMA measurement.
  • Figure 4 represents the cell viability and growth measured kinetically on FAG and AG hydrogels which constitute the implants according to the invention, and which have been colonized in vitro by fibroblasts, after their manufacture.
  • Figure 5 represents the cell viability and growth measured kinetically on FAG and AG hydrogels which constitute the implants according to the invention, and which have been colonized in vitro by adipose tissue stem cells, after their manufacture.
  • Figure 6 represents the metabolic activity of AG implants according to the invention at different culture points following their colonization in vitro by a fraction of purified adipose tissue, after their manufacture.
  • Figure 7 represents the histological analyzes by Hematoxyline, Phloxine, Safran (HPS) staining of AG implants according to the invention after 2 days (4 images on the left) or 7 days (2 images on the right) of in vitro incubation with a fraction of purified adipose tissue, after their manufacture (Top: external edges of the matrices; Bottom: internal pores of the matrices; images taken in white light; magnification 100X; scale 100 ⁇ m).
  • Figure 8 represents the immunolabeling of perilipin-1 and the staining of cell nuclei with Dapi, on AG implants according to the invention after 2 days (top image) or 7 days (bottom image) of incubation in vitro with a fraction of purified adipose tissue, after their manufacture (fluorescence imaging; magnification 200X; scale 50 ⁇ m).
  • FIG. 9 represents the comparison of the Young's moduli of AG implants for crosslinking of variable durations at 21° C. (B) and 37° C. (A).
  • Figure 10 represents the comparison of Young's moduli E0 (A-C) and viscosities (D-F) of AG and FAG implants after crosslinking with different concentrations of CaC12, T AG and thrombin.
  • Figure 11 represents the comparison of Young's moduli E0 (A-B) and viscosities (C-D) of AG and FAG implants after sequential or concomitant cross-linking with CaC12, T AG and thrombin.
  • Figure 12 shows the comparison of Young's moduli E0 (A) and viscosities (B) of AG and FAG implants after crosslinking with a solution containing calcium chloride or barium chloride.
  • Figure 13A illustrates the study of the variation in dimensions (A1-A2) and pores (A3-A4) of AG and FAG implants according to the invention before and after crosslinking.
  • Figure 13B illustrates the impact of sterilization on the dimensions (B1-B2) and Young's modulus (B3-B4) of these implants.
  • Figure 14 illustrates the repeatability of the production of AG implants according to the invention in terms of dimensions (A), volume (B) and porosity (C).
  • Figure 15 illustrates the repeatability of retraction of AG implants according to the invention after consolidation.
  • Figure 16 illustrates the repeatability of the retraction of AG implants according to the invention as a function of the method of sterilization.
  • Figure 17A illustrates the repeatability of the extrusion diameter.
  • Figure 17B illustrates the pore length (B1-B2) of AG implants according to the invention.
  • Figure 18 represents images of pores of variable size in an AG implant according to the invention.
  • Figure 19 represents the surgical plan (left) of the in vivo subcutaneous implantation (right) of AG and FAG implants according to the invention.
  • Figure 20 represents the histological analyzes after staining with Masson's trichrome on sections of AG implants according to the invention, after subcutaneous implantation in vivo in rat back sites for 3 weeks (low, medium and high magnification images ).
  • Figure 21A depicts the 28-day analysis of cell survival as measured by lactate accumulation.
  • Figure 21B depicts the 28-day analysis of cell growth followed by calcein labeling in a cellularized FAG hydrogel.
  • Figure 22 represents the measurement of Young's moduli (E0) as a function of the initial cell concentration present in a cellularized FAG hydrogel.
  • Figure 23 represents the evolution over 21 days of the lactate concentration measured in the culture supernatants of cellularized and consolidated AG or FAG hydrogels.
  • Figure 24 shows the histological analyzes after HPS staining of bioprinted constructs, solid (left panel) or porous (right panel), of FAG fibroblast/endothelial cell hydrogel after 21 days of culture.
  • Figure 25 shows the histological analyzes after HPS staining of bioprinted constructs, solid (left panel) or porous (right panel), of fibroblast/endothelial cell AG hydrogel after 21 days of culture.
  • FIG. 26 represents the CD31-DAB immunostaining (black) on solid bioprinted constructs, of fibroblast/endothelial cell FAG hydrogel after 21 days of culture.
  • FIG. 27 represents the CD31-DAB immunostaining (black) on porous bioprinted constructs, of FAG fibroblast/endothelial cell hydrogel after 21 days of culture.
  • Figure 28 represents the histological analysis by HPS staining of the skins reconstructed from FAG hydrogel bioprinted in 3D and consolidated with TAG.
  • Protocol #1 Preparation of an AG hydrogel: In order to prepare the AG hydrogel, 2 g of alginate (very low viscosity, Alpha Aesar, France), 5 g of gelatin (Sigma-Aldrich, France) are dissolved at 37° C for 12 hours in 100 mL of a 0.1M NaCl solution (Labelians, France). Protocol #2 Preparation of a FAG hydrogel: In order to prepare the FAG hydrogel, 2 g of alginate (very low viscosity, Alpha Aesar, France), 5 g of gelatin (Sigma-Aldrich, France) and 2 g of fibrinogen (Sigma-Aldrich, France) are dissolved at 37° C. for 12 hours in 100 ml of a 0.1 M NaCl solution (Labelians, France).
  • Protocol #3 Molding of an AG or FAG hydrogel 1.8mL of the hydrogel prepared according to protocol #1 or #2 are placed in the wells of a 6-well culture plate and incubated at 21°C for 30 minutes .
  • Protocol #4 Crosslinking of an AG hydrogel A crosslinking solution is prepared by dissolving 4 g of Transglutaminase (Ajinomoto, Japan), 3 g of CaC12 (Sigma Aldrich, France) in lOOmL of a 0.1M NaCl solution (Labelians, France). The crosslinking solution is then brought into contact with the hydrogel for 1 hour 30 minutes at 37° C. (unless otherwise indicated).
  • a cross-linking solution is prepared by dissolving 4 g of Transglutaminase (Ajinomoto, Japan), 3 g of CaC12 (Sigma Aldrich, France) and 400 Units of thrombin (Sigma Aldrich, France) in lOOmL of a 0 NaCl solution. IM. The crosslinking solution is then brought into contact with the hydrogel for 1 hour 30 minutes at 37° C. (unless otherwise indicated).
  • Protocol #6 Dynamic mechanical analysis (DMA) in compression The mechanical properties of FAG and AG hydrogels are measured in triplicate with a rotational rheometer (DHR2, TA Instrument, France), a Peltier plane (TA Instrument, France) and an 8mm geometry toothed (TA Instrument, France). Three 8mm diameter discs are cut from the molded hydrogels according to protocol #3. The disc is placed on the lower geometry at 37°C for 60 seconds and then a compression procedure of 1 oscillatory OLHTI is carried out from 0.1 to 10Hz at 1 OOirm/s and at 37°C.
  • DMA Dynamic mechanical analysis
  • the values of the Young's modulus E0 (Pa) and the viscosity hq (Pa.s) of the hydrogel are obtained from a modeling of the visco-hyperelastic solid using the values E' and E” acquired during the 'essay.
  • Protocol #7 Preparation of a cellularized hydrogel: In order to prepare the cellularized FAG hydrogel, 0.12 g of alginate (very low viscosity, Alpha Aesar, France), 0.3 g of gelatin (Sigma-Aldrich, France) are dissolved in 6mL of DMEM culture medium (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France). Freshly trypsinized cells are taken up in suspension in 2 mF of an 8% fibrinogen solution (Sigma-Aldrich, France). This cell suspension is then added to the previous solution in order to form the cellularized FAG.
  • alginate very low viscosity, Alpha Aesar, France
  • gelatin Sigma-Aldrich, France
  • Protocol #8 3D printing of the hydrogels The hydrogels prepared according to protocol #1, #2 are transferred into a 30 mL cartridge (Nordson EFD) equipped with an extrusion nozzle 410 ⁇ m in diameter (Nordson EFD). The nozzle cartridge assembly is then placed in a 3D printer (BioassemblyBot, Advanced Solution Lifescience, USA) allowing constant pressure to be applied to the cartridge while moving in the three directions of space. The printing parameters are a speed of 10mm/sec, a pressure of 25-35PSI and a temperature of 21°C. Obtaining different filling rates is performed by the internal slicer of the printer driver software (Tsim, Advanced Solution Lifescience, USA).
  • Protocol #9 In vivo implantation in rats The in vivo implantation studies in rats were carried out on the BIOVIVO preclinical research technical platform - Institut Claude Bourgelat (Lyon, France). The experiments were conducted in accordance with European Directives 2010/63/EU.
  • the 16 animals (Sprague Dawley rat, 250-300g) were anesthetized by inhalation (oxygen and 5% isoflurane). Dorsal implant sites were shaved and disinfected with povidone and sterile gauzes, and sterile drapes were placed to delineate the surgical area. General anesthesia was maintained with isoflurane (2%) and oxygen inhalation.
  • Pre-surgical analgesia was performed subcutaneously with meloxicam and morphine at 1 mg/kg respectively.
  • the rats' body temperature and pulse were monitored during the operation.
  • Two skin incisions of 2 to 3 cm were made in the back region.
  • a bioprosthesis was implanted in the subcutaneous dorsal region of each animal.
  • the control group was performed by performing only the incision and dissection.
  • 4 surgical sites were made, three bioprostheses and a control sample.
  • the surgical site was closed in layers using subcutaneous and cutaneous sutures with absorbable braided sutures (PDS® polidioxanone, 4/0 and Nylon 3/0, Ethicon J&J). After the operation, the animals were monitored for signs of distress, and the surgical wounds were inspected daily for skin healing and the absence of infections. Explantation took place 21 days after implantation.
  • FIG. 1 The results are grouped together in FIG. 1 (A-B).
  • the Young's modulus and viscosity values measured are similar between the AG hydrogel and the FAG hydrogel following their crosslinking by the method of the invention. Young's moduli under the precise conditions of this study are around 68 OOOPa.
  • Example 2 Impact of crosslinking with transglutaminase on the mechanical properties of alginate/gelatin (AG) hydrogel
  • AG alginate/gelatin
  • the crosslinking solution is composed of a solution of calcium chloride at 30mg/mF only or of a solution of calcium chloride at 30mg/ml and transglutaminase at 40mg/mF. 4 gels of each condition were molded and then tested in DMA the same day and respectively after 1, 4 and 7 days of storage at 37° C. with the aim of mimicking physiological conditions.
  • Molded samples of AG were prepared from protocols #1 and #3 and cross-linked from protocol #4.
  • the commercial hydrogel samples listed in Table 1 below were prepared according to the protocols provided by the suppliers and molded according to protocol #3.
  • the hydrogels were cross-linked with a variant of protocol #4, using either a solution comprising only calcium at 30mg/mL (no TAG), or a solution of calcium at 30mg/mL and transglutaminase at 40mg/mL, in order to observe the impact of GAD.
  • Non-crosslinked and crosslinked samples with TAG were then studied by DMA using protocol #6. The results are grouped on the LIG. 3. 6 of the 7 commercial hydrogels studied were cross-linked by transglutaminase.
  • Collagen-based hydrogels (CoWCell, Rat Collagen) are not stiff enough to be analyzed by DMA but gelatin-based hydrogels (GeWcell, Gel4cell-VEGL and GelMa) have a Young's modulus significantly higher after crosslinking with transglutaminase (respectively 7.3, 9.9 and 50 kPa). This study shows the effect of cross-linking with transglutaminase on the stiffness of commercial hydrogels.
  • Example 4 Influence of the amount of alginate and gelatin in a fibrinogen/alginate/gelatin (F AG) hydrogel on the mechanical properties
  • FAG hydrogels were prepared from a variant of protocol #2, molded according to protocol #3, then cross-linked using protocol #5, then their mechanical properties were studied by DMA using protocol #6.
  • we studied these mechanical properties by preparing the FAG hydrogel, with 1 or 3 or 2 g of alginate, and 10 or 7.5 or 5 g of gelatin, respectively, and 2 g of fibrinogen.
  • the implants were immersed with culture medium.
  • the implants were cultured in culture medium composed of DMEM containing 10% calf serum supplemented with vitamin C and EGF (Epidermal Growth Factor) at 37°C, 5% C02.
  • the implants were cultured with this same medium for 21 days, renewed every 3 days.
  • the metabolic activity of the fibroblasts within the implants was studied by colorimetric analysis with Alamar Blue on culture days 3, 5, 8, 10, 14 and 21 after inoculation.
  • the solution was produced by diluting to 10th a solution of Bleu Alamar (DAL 1100, Invitrogen) in DMEM. After 19 hours of incubation at 37°C, 100 m ⁇ of the supernatants were sampled and their absorbance at 570 nm and 600 nm was measured with a spectrophotometer (NanoQuant® infinity M200PRO, TECAN).
  • Example 6 Evaluation of the colonization of fibrinogen/alginate/gelatin (F AG) and alginate/gelatin (AG) hydrogels by adipose tissue stem cells (ASC).
  • F AG fibrinogen/alginate/gelatin
  • AG alginate/gelatin
  • ASC adipose tissue stem cells
  • Normal human adipocyte stem cells in passage 2 to 5 are thawed and amplified in 175cm2 culture flasks in culture medium containing DMEM supplemented with 10% serum and 1% antibiotics.
  • Each implant was seeded on its surface with a cell suspension of ASC at a concentration of 6, 12 or 24 million ACS/ml. 250 m ⁇ of these suspensions were deposited drop by drop on each implant, i.e. 1.5, 3 or 6 million ASC/implant. After 1 hour of adhesion, the implants were immersed with culture medium.
  • the implants were cultured in culture medium containing DMEM supplemented with 10% serum and 1% antibiotics for 7 days then in medium containing DMEM supplemented with 10% serum, insulin, rosiglitasone and 1% antibiotics for 14 days.
  • the culture media are renewed every 3 days.
  • the metabolic activity of the fibroblasts within the implants was studied by colorimetric analysis with Alamar Blue on culture days 3, 5, 7, 14 and 21 after inoculation.
  • the solution was produced by diluting to 10th a solution of Bleu Alamar (DAL 1100, Invitrogen) in DMEM. After 5 hours of incubation at 37°C, 100 m ⁇ of the supernatants were taken and their absorbance at 570 nm and 600 nm was measured with a spectrophotometer (NanoQuant® infinity M200PRO, TECAN). Cellular viability and growth was thus monitored over 21 days of culture using 6-point kinetics on days 3, 5, 7, 14 and 21. The results are grouped together in FIG. 5.
  • Example 7 Evaluation of the colonization of alginate/gelatin (AG) hydrogels in contact with a fraction of purified adipose tissue.
  • hydrogels were prepared from protocol #1. Cubic implants 1.5 cm square and 0.8 cm thick were then printed according to protocol #8 and cross-linked using protocol #4. The printed implants are produced with a filling rate of 50% and an extrusion nozzle of 410 mhi internal diameter.
  • the lipoaspirate is centrifuged at 1500 RPM for 2 minutes then rinsed with PBS IX. The lipoaspirate was again centrifuged at 1500 RPM for 30 seconds then the PBS IX was eliminated. Lipoaspirate is considered purified. Each implant is then immersed in 6mL of purified lipoaspirate, then the whole was placed in a culture insert in a 6-well plate with incubation in medium containing DMEM supplemented with 10% serum and 1% antibiotics at 37°C 5% C02 for 2 days or 7 days.
  • the implants were cultured in 6-well plates in culture medium containing DMEM supplemented with 10% serum, insulin, rosiglitasone and 1% antibiotics, with 3 renewals of the medium per week for up to 21 days.
  • the images reveal the presence of agglomerated, polygonal, uniform, unilocular and voluminous adipocytes. These morphological characteristics are those of healthy adipocytes, which can be found in adipose tissue.
  • Perilipin-1 immunostaining was also performed. Samples were included in OCT (CellPath, KMA-0100-00A), then stored at -80°C. Sections 16 ⁇ m thick were made for each sample with a cryostat (Microm, HM 520). The sections were then fixed in an Acetone/methanol (v/v) solution for 20 minutes and rinsed 3 times in PBS IX. A one-hour incubation at room temperature in a 4% PBS-BSA solution was carried out to saturate the aspecific sites. The sections were then incubated overnight at room temperature with a solution of primary antibody specific for perilipin-1.
  • the images show adipocytes having large spherical or polygonal vacuoles depending on cell grouping.
  • the adipocytes appear as unilocular and their size is also physiological since it is between 50 and 200 ⁇ m.
  • Molded samples of AG were prepared from Protocol #1 and Protocol #3 and cross-linked from a variation of Protocol #4. During this variant, the crosslinking times and temperatures were modified, from 10 minutes to 2 p.m. and from 37°C to 21°C.
  • Example 9 Impact of the concentration of the components of the crosslinking solution on the mechanical properties of hydrogels alginate/gelatin (AG) and fibrinogen/alginate/gelatin fFAG) once crosslinked
  • Example 12 Maintenance of the three-dimensional structure and the mechanical properties of implants based on alginate/gelatin (AG) and fibrinogen/alginate/gelatin hydrogel
  • the AG and F AG hydrogels were prepared using protocols #1, #2 and #3, cross-linked using protocols #4 and #5, observed optically and then studied by DMA using protocol #6.
  • the printed forms are half-spheres of 2 cm in diameter produced with variable filling rates (30, 50 and 75%).
  • the sterilization was carried out by the company IONISOS (France) by irradiating the implants with a variable dose (30 kGy and 40 kGy) of Gamma rays.
  • the dimensions of the pores obtained as a function of the filling rate were also studied. These dimensions were measured from images taken using a microscope (Olympus, magnification x4). The results are grouped together in FIG. 13 (A-B). The implants retract on average by 10% following the crosslinking step. The pore size, however, does not vary significantly (FIG. 13A (A1-A4)).
  • Example 13 Quality of production of a large implant based on an alginate/gelatin (AG) hydrogel: repeatability of the printing dimensions, of the dimensions after consolidation and sterilization of the implant according to several methods.
  • AG alginate/gelatin
  • hydrogels were prepared from protocol #1. Implants in the shape of a half-sphere 6cm in diameter and 2cm thick were then printed according to protocol #8 and cross-linked using protocol #4, then optically observed and measured. The printed forms are produced with variable fill rates (25 to 65%) and extrusion nozzles of 410 or 840 pm internal diameter. Sterilization was carried out by the company IONISOS (Lrance) by irradiating the implants with 2 doses (30 kGy and 40 kGy) of Beta rays or a dose of range rays of 30 kGy.
  • IONISOS France
  • the dimensions of the pores obtained as a function of the filling rate were also studied. These dimensions were measured from images taken using a microscope (Olympus, magnification x4).
  • results after printing are grouped LIG.14.
  • A-C results show a high repeatability of the dimensions of large size 3D printed implants, reflecting a high production quality.
  • results after consolidation of the implants are grouped LIG 15. This graph shows a high repeatability of the retraction of the large size implants after the consolidation step.
  • FIG. 17A shows the high repeatability of the extruded bead size.
  • FIG. 17B (Bl-B2) shows the variation in pore length as a function of the filling rate of the hydrogel.
  • Example 14 Studies of the resistance of implants in vivo AG and FAG hydrogels were prepared from protocols #1, #2 and #8, cross-linked using protocols #4 and #5. The printed shapes are half-spheres 1 cm in diameter, produced with variable fill rates (30, 50 and 75%).
  • porous half-spheres were sterilized with a dose of 30 kGy then implanted subcutaneously in rats according to protocol #9.
  • the detail of the implantation groups is described in the following table 3, which refers to the surgical implantation plan described in FIG. 19.
  • Histological analyzes were performed using protocol #10, and the results are grouped in FIG. 20. The explantation made it possible to validate the resistance of the implants to skin tension. Histological analyzes made it possible to evaluate cellular colonization, vascularization, synthesis of extracellular matrix as well as the presence of areas of inflammation.
  • Example 15 Cell viability and growth and mechanical properties of fibrinogen/alginate/gelatin (F AG) hydrogel
  • Cellularized FAG hydrogels were prepared from protocol #7 in the presence of different concentrations of human dermal fibroblasts (0.5/0.25/0.125 million cells/mF of hydrogel). Slabs of 1cm 2 , 0.2cm thick and 100% filling were prepared using protocol #8 then cross-linked using protocol #5.
  • the different slabs were then cultured for 28 days at 37°C and 5% CO2 in a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Glutamax medium (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France), supplemented with 10% (v/v) of bovine calf serum (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France), 0.5% (v/v) amphotericin B (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France) and 1% Penicillin/Streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Glutamax medium Gibco Cell Culture, Invitrogen, France
  • Lactate synthesis is an indicator of cellular activity.
  • a marked increase in the amount of lactate is observed from D15 at all cell concentrations, indicating cell growth in the consolidated bioprinted hydrogels according to the invention.
  • the calcein-AM staining images grouped together in FIG. 21B show a viable and increasing cell presence from Dll and a spreading of the cells from D17 at 0.25M cells/mF and from D22 for the other cell concentrations.
  • Cellularized FAG hydrogels prepared and cultured as described above were studied according to protocol #6.
  • Cellularized AG and FAG hydrogels were prepared from protocol #7 in the presence of a mixture of human dermal fibroblasts (0.25 million cells/mF of hydrogel) and human dermal microvascular endothelial cells (1 million of cells/mF of hydrogel). Slabs of 2.25cm 2 , 0.2cm thick and with 50 and 100% filling were prepared using protocol #8 then consolidated using protocols #4 and #5.
  • Fes different constructs were then cultured for 21 days at 37 ° C and 5% C02 in a culture medium suitable for the culture of human dermis composed of DMEM supplemented with 10% calf serum, 1% antibiotics, vitamin C and EGF.
  • FIG. 23 An increase in the production of lactate by the cells is observed from D11 under all conditions. Lactate production is higher in AG-based hydrogels and porous constructs. These results indicate cell proliferation in the hydrogels consolidated for 21 days. Histological analyzes were performed using protocol #10. HPS stains were performed for all conditions. In order to assess the presence of endothelial cells in the hydrogels, CD31 immunohistochemical labeling specific to endothelial cells with DAB visualization was performed on paraffin sections 5 ⁇ m thick. The results are grouped together in FIGs 24 to FIG 27:
  • FIG 24 the images of the full FAG constructs show that a quantity of cells are present in the gel and seem to proliferate in the form of an agglomerate with adhesion sites on the gel.
  • For porous constructs we also observe clusters of proliferation in the gel but also a proliferative layer on the surface of the pores. A start of degradation of the hydrogel around the cells in the gel is also observed.
  • FIG 25 the images of the full AG constructs show that a quantity of cells are present in the gel.
  • the porous constructs we also observe proliferation clusters in the gel but also a proliferative layer on the surface and areas of high cell density in the corners of the pores. There is also degradation of the hydrogel around the cells in the gel.
  • FIG 26 the images of the full FAG constructs reveal the presence of substantial cell clusters of fibroblasts in the gel with small clusters of endothelial cells located around and in the clusters of fibroblasts.
  • FIG 27 the images of the porous FAG constructs reveal the presence of cell clusters of fibroblasts in the gel with clusters of endothelial cells located around and in the clusters of fibroblasts. A proliferative layer of fibroblasts is also observed on the surface.
  • Example 17 - Obtaining equivalent skins by epidermization of bioprinted constructs in consolidated fibrinogen/alginate/gelatin (FAG) hydrogels.
  • Cellularized FAG hydrogels were prepared from protocol #7 in the presence of a mixture of human dermal fibroblasts. Two distinct conditions were tested: bilayer bioprinting at 1,000,000 fibroblasts/ml and hybrid bilayer bioprinting of an acellular lower layer and a cellularized upper layer at 2,000,000 fibroblasts/ml. For the cellularized two-layer constructs, slabs with dimensions of 2.2 cm x 2.2 cm x 0.2 cm (two layers) and 100% filling were printed using protocol #8 then consolidated using protocol #5.
  • a first acellular layer and dimensions 2.2 cm x 2.2 cm x 0.1 cm then a second cellularized layer (2,000,000 fibroblasts/ml) and dimensions 2.2 cm x 2.2 cm x 0.1 cm and 100% filling were printed using protocol #8 and then consolidated using protocol #5.
  • the different constructs were then cultured for 21 days at 37°C and 5% C02 in a culture medium adapted to the culture of human dermis composed of DMEM supplemented with 10% calf serum, 1% antibiotics, vitamin C and EGF. After three weeks of culture, a suspension of normal human keratinocytes at 4,000,000 c/ml was prepared in suitable culture medium composed of
  • DMEM/HAMF12 supplemented with 10% calf serum, 1% antibiotics, insulin, hydrocortisone, vitamin C and EGF. 250 m ⁇ of this suspension were deposited on each construct for a seeding of 250,000 keratinocytes/cm 2 . After seeding, the various constructs were cultured for 21 days at 37° C. and 5% C02 in culture media adapted to the culture of equivalent human skin composed of DMEM/HAMF12 supplemented with insulin, hydrocortisone , vitamin C and 1% antibiotics.
  • the collagen content of the bioprinted constructs was evaluated under the different conditions.
  • the quantitative analysis of the collagen present in the supports was carried out using a Sircol test (Kit S1000, Biocolor).
  • the control for this study was a cell-free FAG construct made using the same methodology as the bioprinted and surfaced samples.
  • the pellets resulting from collagen degradation were dissolved in 250 ml of basic reagent solution (kit).
  • the absorbance was then measured at 555nm ((NanoQuant® infinity M200PRO, TECAN) and the results compared with those of a standard range to allow the evaluation of the collagen concentration of the digestion supernatants. This concentration was then reported to the mass of each sample to assess their collagen concentration.
  • histological analyzes were carried out. The constructs were cut in half. A first half was fixed in 4% formalin for 24 hours, then dehydrated by successive baths of absolute ethanol and methylcyclohexane with an STP 120 dehydrator (Microm) then embedded in paraffin. Sections 5 ⁇ m thick were made using an HM 340e microtome (Microm). Hematoxyline Phloxine Safran (HPS) staining was then performed on these sections.
  • results are grouped in FIG. 28, in which the images reveal that the two conditions tested made it possible to support the establishment of a thick and healthy dermis with synthesis of the extracellular matrix and of a pluristratified and differentiated epidermis.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de consolidation d'un hydrogel comprenant de l'alginate et de la gélatine, qui inclut une étape de consolidation par réticulation de l'hydrogel à l'aide d'une solution adaptée, afin de lui conférer des propriétés mécaniques particulièrement avantageuses. L'utilisation de cette solution de réticulation pour consolider la structure d'un hydrogel comprenant de l'alginate et de la gélatine et un hydrogel obtenu par ce procédé constituent également d'autres aspects de la présente invention. L'invention concerne également un procédé de consolidation d'un hydrogel comprenant de l'alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l'hydrogel, sa mise en forme, puis sa mise en contact avec des agents de consolidation adaptés. L'hydrogel obtenu par ce procédé est également un autre aspect de la présente invention. Dans tous ces aspects de cette invention, l'hydrogel peut en outre comprendre du fibrinogène et/ou des cellules vivantes.

Description

PROCEDE DE CONSOLIDATION D’UN HYDROGEL ALGINATE /
GELATINE
DOMAINE DE L’INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la fabrication des matériaux en général, et en particulier des bio-matériaux ou matériaux bio-compatibles.
La présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, qui inclut une étape de consolidation par réticulation de l’hydrogel à l’aide d’une solution adaptée, afin de lui conférer des propriétés mécaniques particulièrement avantageuses. L’utilisation de cette solution de réticulation pour consolider la structure d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine constitue également un autre aspect de la présente invention. L’hydrogel obtenu par ce procédé est également un autre aspect de la présente invention.
La présente invention concerne également un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, sa mise en forme, puis sa mise en contact avec au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase. L’hydrogel obtenu par ce procédé est également un autre aspect de la présente invention.
Dans tous les aspects de cette invention, l’hydrogel peut en outre comprendre du fibrinogène et/ou des cellules vivantes.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
On connaît de l’état de la technique des structures à base d’hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine mais elles manquent de tenue mécanique satisfaisante, car ces constituants présentent le plus souvent une élasticité limitée (faible module d’Young, notamment), ce qui rend les structures résultantes difficilement manipulables. La demande internationale publiée sous le numéro W02017115056 décrit la fabrication de substituts corporels à base d’hydrogel comprenant de l’alginate, de la gélatine et du fibrinogène, qui sont ensuite traités avec une solution de réticulation contenant du calcium et de la thrombine. Les propriétés mécaniques des structures obtenues dans l’art antérieur restent néanmoins insuffisantes pour les rendre aptes à être manipulées. De plus, dans le cas de structures destinées à être implantées dans le corps humain ou animal, et le cas échéant suturées, les procédés de l’art antérieur ne permettent pas d’obtenir des structures qui possèdent les propriétés mécaniques adéquates, et dont la dégradabilité au contact de cellules ou tissus vivants ne soit pas trop rapide.
Par ailleurs, lorsque les structures sont susceptibles d’être cellularisées lors de leur fabrication, il existe un besoin de pouvoir maintenir la survie des cellules. Ainsi, le procédé de préparation de telles structures doit être compatible avec la présence de cellules vivantes et leur maintien en vie.
RÉSUMÉ
Un des buts de l’invention est de surmonter ces inconvénients de l'art antérieur, et de permettre en particulier de produire des hydrogels, cellularisés ou non, qui possèdent des caractéristiques particulièrement avantageuses et innovantes, notamment sur le plan de (i) la résistance mécanique des constituants, (ii) la stabilité dans le temps, (iii) la souplesse, (iv) la résistance à la déchirure et aux chocs, et (v) la colonisation par les cellules.
Il est à cet effet proposé de fournir, selon un premier mode de réalisation de la présente invention, un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’ hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents. Optionnellement, la solution de consolidation peut aussi contenir de la thrombine si, outre l’alginate et la gélatine, l’hydrogel contient du fibrinogène. Par ailleurs, l’étape de consolidation est compatible avec le fait que G hydrogel puisse contenir des cellules vivantes. Selon un autre aspect de la présente invention, il est décrit rutilisation d’une solution telle que décrite ci-dessus pour consolider la structure d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ce qui présente un avantage tout particulier lorsqu’il s’agit de préparer un hydrogel destiné à être implanté dans le corps humain ou animal, c’est-à-dire en tant qu’implant corporel. Cette utilisation peut également être mise en œuvre pour consolider un hydrogel comprenant en outre du fibrinogène. Par ailleurs, la consolidation peut également être réalisée sur un hydrogel comprenant en outre des cellules vivantes.
En résumé, la présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
De préférence, la mise en contact de l’hydrogel avec la solution de consolidation est réalisée par immersion, de préférence totale, de l’hydrogel dans la solution de consolidation, ou bien par pulvérisation de l’hydrogel avec la solution de consolidation.
De préférence, le ou les cation(s) divalent(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe comprenant le calcium, le strontium et le baryum.
De préférence, l’hydrogel comprend de 0,5 à 3 % d’alginate et de 1 à 17,5 % de gélatine.
De préférence, l’hydrogel comprend en outre du fibrinogène et en ce que la solution de consolidation comprend en outre de la thrombine.
De préférence, l’hydrogel comprend jusqu’à 2 % de fibrinogène. De préférence, la solution de consolidation comprend :
- de 0,003 à 30 % de cation divalent,
- de 0,004 à 16 % de transglutaminase, et éventuellement
- de 2 à 25 U/ml de thrombine. De préférence, l’hydrogel comprend en outre des cellules vivantes intégrées lors de la préparation de G hydrogel avant sa consolidation.
De préférence, la mise en contact avec la solution de consolidation est réalisée :
- à une température allant de 15 à 40°C, et/ou
- pendant une durée allant de 30 minutes à 6h. De préférence, l’hydrogel est mis en forme, préalablement à sa consolidation, préférentiellement ladite mise en forme se fait par extrusion de matière, encore plus préférentiellement ladite mise en forme se fait par une technique de moulage ou de fabrication additive.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également l’utilisation d’une solution comprenant un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, pour consolider un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine consolidés, destiné à être implanté chez un sujet humain, l’hydrogel étant susceptible d’être obtenu par un procédé de consolidation tel que décrit précédemment.
Il est également proposé de fournir, selon un deuxième mode de réalisation de la présente invention, un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant, dans l’ordre, les étapes suivantes : - la préparation de G hydrogel, la mise en forme de G hydrogel préparé, la mise en contact de l’hydrogel avec au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
De préférence, ladite préparation de l’hydrogel ne nécessite pas la mise en forme d’un ou des composants préalablement à la préparation de l’hydrogeL
De préférence, ladite préparation de l’hydrogel ne nécessite pas l’ajout de fibres.
De préférence, le ou les cation(s) divalent(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe comprenant le calcium, le strontium et le baryum.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine consolidés, destiné à être implanté chez un sujet humain, l’hydrogel étant susceptible d’être obtenu par un procédé de consolidation tel que décrit précédemment.
DÉFINITIONS Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
« Agent réticulant », dans le cadre de la présente invention, désigne un agent capable de réticuler les composants de G hydrogel, en particulier l’alginate, la gélatine et le fibrinogène.
« Concomitante » : dans le cadre de la présente invention, désigne des événements ayant lieu en même temps. Ainsi, la mise en contact concomitante de l’hydrogel avec du calcium et de la transglutaminase signifie que l’hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine est mis en contact, en même temps, avec le calcium et la transglutaminase, permettant ainsi une réticulation concomitante de l’alginate et de la gélatine. « Fibres », dans le cadre de la présente invention, désigne tout élément d’aspect filamenteux, se présentant généralement sous forme de faisceaux. Des exemples de fibres sont donnés ci-dessous.
« Mise en forme », dans le cadre de la présente invention, consiste à donner à l’élément mis en forme, une forme, une structure et/ou une architecture particulière. Lorsqu’il s’agit de la mise en forme d’un hydrogel, cela consiste, par exemple, à lui donner une forme, une structure et/ou une architecture particulière notamment adaptée(s) à la destination de l’hydrogel une fois consolidé. Lorsqu’il s’agit de la mise en forme d’un ou des composants de l’hydrogel lors de sa préparation, cela consiste, par exemple, à leur donner une structure particulière, telle qu’une structure sous forme de fibres, lors de la préparation de l’hydrogel.
« Réticuler » ou « consolider », dans le cadre de la présente invention, sont des termes équivalents et désignent le fait de consolider l’hydrogel par réticulation de l’alginate, la gélatine et/ou le fibrinogène.
« Séquentielle », dans le cadre de la présente invention, désigne des événements n’ayant pas lieu en même temps. Ainsi, la mise en contact séquentielle de l’hydrogel avec du calcium et de la transglutaminase signifie que l’hydrogel est mis en contact avec le calcium, puis la transglutaminase ou avec la trasnglutaminase puis le calcium.
« Solution de consolidation » et « solution de réticulation », dans le cadre de la présente invention, sont des termes équivalents et désignent la solution utilisée dans le procédé selon l’invention pour consolider l’hydrogel par réticulation.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La présente invention fournit un procédé de préparation d’hydrogels comprenant de l’alginate et de la gélatine, cellularisés ou non. En agissant sur la réticulation des constituants de l’hydrogel à l’aide d’au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, la structure de l’hydrogel va être consolidée, de manière à lui conférer des caractéristiques mécaniques particulièrement avantageuses, notamment sur le plan de la résistance mécanique des constituants, de la stabilité dans le temps et de la résistance remarquable à la déchirure et aux chocs.
Selon un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
Dans le cadre de la présente invention, ladite solution de consolidation peut être obtenue par des procédés alternatifs mais néanmoins équivalents. La solution de consolidation peut être obtenue par ajout des différents éléments, i.e. au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, dans une même solution, ou bien par mélange d’au moins deux solutions : une solution comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, et une solution comprenant au moins de la transglutaminase.
L’alginate est un polysaccharide linéaire extrait d’algues marines, principalement de l’espèce d’algue brune Phaeophyceae. Ce polymère biocompatible est composé de blocs homopolymériques d’acide 1,4 b -D mannuronique (M) et de son épimère l’acide C-5 a- L guluronique (G). Ce biopolymère est constitué de séquences de M-blocs, de G-blocs, intercalées avec des séquences de MG-blocs. Seules les unités G semblent intervenir dans le « cross-linking » (la réticulation) intermoléculaire lors de la polymérisation. L’alginate de sodium est largement utilisé en tant qu’hydrogel.
La gélatine est une macromolécule dérivée du collagène qui contient des séquences bioactives comme le motif RGD (arginine-glycine-acide aspartique) pour l’adhésion cellulaire. Elle est obtenue par dénaturation de la structure en triple hélice native du collagène via un traitement acide (gélatine type A), ou alcalin (gélatine type B). La composition en acides aminés de la gélatine est similaire mais différente de celle du collagène suite à la dénaturation (déamination de la glutamine en acide glutamique dans le processus de fabrication de la gélatine de type B). La structure de la gélatine change pendant la gélification.
La préparation d’hydrogels est bien connue dans l’art (E.M. Ahmed ; Journal of Advanced Research, 2015, 6, 105-121), ainsi que la polymérisation et réticulation de l’alginate et de la gélatine (Chen Q, Tian X, Fan J, Tong H, Ao Q, Wang X. An Interpenetrating Alginate/Gelatin Network for Three-Dimensional (3D) Cell Cultures and Organ Bioprinting. Molécules. 2020;25(3):756.)).
Concernant l’alginate, et d’après ce qui est mentionné ci-dessus, un alginate enrichi en unité M sera plus flexible car la chaîne aura une configuration plus linéaire, tandis qu’un gel contenant plus d’unités G sera plus rigide car plus polymérisé. Dans le cadre de la présente invention, l’alginate utilisé a, par exemple, un ratio M/G compris entre 1 et 2, notamment entre 1 et 1,9 ou entre 1 et 1,5. Dans le cadre de la présente invention, l’alginate utilisé a, par exemple, un ratio M/G de 1,9.
De préférence, la gélatine contenue dans l’hydrogel est de type A. Dans le cadre de la présente invention, l’hydrogel est de préférence préparé à partir d’une solution d’alginate à laquelle est ajoutée une solution de gélatine, ou réciproquement à partir d’une solution de gélatine à laquelle est ajoutée une solution d’alginate, de manière à obtenir un hydrogel comprenant de 0,5 à 3 % d’alginate et de 1 à 17,5 % de gélatine, et de manière encore plus préférée de 1 à 2,5 % d’alginate et de 2 à 10 % de gélatine. Avantageusement, l’hydrogel comprend 2 % d’alginate et 5 % de gélatine.
Sauf indication contraire, les pourcentages mentionnés dans la présente description sont exprimés en masse / volume de la composition totale.
De manière préférée, lorsque l’hydrogel à consolider contient de l’alginate et de la gélatine, ces constituants sont présents dans un ratio massique allant de 1:0,3 à 1:35, et tout particulièrement dans un ratio massique de 1 :2,5, respectivement.
S’agissant de la solution de consolidation, celle-ci comprend de préférence :
- de 0,003 à 30 % de cation(s) divalent(s),
- de 0,004 à 16 % de transglutaminase. De manière encore préférée, la solution de consolidation comprend de 1 à 6 % de cation(s) divalent(s), et avantageusement 3 % de cation(s) divalent(s).
De manière encore préférée, la solution de consolidation comprend de 1 à 10 % de transglutaminase, et avantageusement 4 % de transglutaminase.
L'enzyme transglutaminase (T AG), est une aminoacyltransférase extracellulaire. C’est une protéine monomérique qui comporte un seul résidu catalytique cystéine (site actif).
Dans le cadre de l’invention, la solution de consolidation contient de préférence de la transglutaminase de type 2. Cette TAG est notamment produite commercialement en tant que protéine microbienne recombinante par la fermentation du microorganisme Streptoverticillium moboarense. La solution de consolidation utilisée dans le cadre de l’invention peut également contenir plusieurs TAG.
Tout autre cation divalent, de préférence non-toxique, peut être utilisé dans le cadre du procédé selon l’invention.
Par exemple, le ou les cation(s) divalent(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe comprenant ou constitué du calcium, strontium, baryum, zinc, cuivre, fer et nickel. De préférence, le ou les cation(s) divalent(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe comprenant ou constitué du calcium, strontium et baryum. De préférence, le cation divalent est le calcium, mais il peut également s’agir du strontium ou du baryum.
Il peut également être envisagé d’utiliser plusieurs cations divalents en mélange. Par ailleurs, le ou les cations divalents sont présents sous forme de sels dans la solution de consolidation. N’importe quel sel peut être utilisé, et de préférence les sels anhydres.
De préférence, la solution de consolidation comprend uniquement un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase. Avantageusement, si un ou plusieurs autre(s) cation(s) divalent(s) que le calcium étai(en)t présent(s), il s’agirait de préférence d’un seul autre cation divalent, et en particulier du baryum.
De préférence, la solution de consolidation contient du chlorure de calcium en tant que seul cation divalent. Selon la présente invention, la réticulation simultanée des composants de l’hydrogel, c’est-à-dire la transformation en un polymère tridimensionnel à partir d'un polymère linéaire, s’opère grâce à la mise en contact avec une solution de consolidation dans laquelle (i) le cation divalent, préférentiellement le calcium, ou le/les autre(s) cation(s) divalent(s) permet(tent) la réticulation de l’alginate et (ii) la transglutaminase induit la réticulation enzymatique de la gélatine.
De préférence, lors du procédé de consolidation selon l’invention, la mise en contact de G hydrogel avec la solution de consolidation est réalisée par immersion, au cours de laquelle l’hydrogel est immergé dans son intégralité dans la solution de consolidation. On parle encore ici de bain de consolidation. La mise en contact de l’hydrogel avec la solution de consolidation peut également être réalisée par imbibition, par pulvérisation, à l’aide d’un système de goutte à goutte, de ruissellement, ou similaire. La mise en contact se rapporte de préférence à la totalité de l’hydrogel. De préférence, l’hydrogel est plongé intégralement dans la solution de consolidation. L’hydrogel à consolider selon la présente invention peut en outre comprendre du fibrinogène, en plus de l’alginate et de la gélatine.
Le monomère de fibrinogène est composé de deux répétitions de trois chaînes a, b et g reliées par un domaine central E et de deux fïbrinopeptides A et B (FpA, FpB) reliant les chaînes a au domaine E. Il possède un nombre important de motifs d’adhésion cellulaire et permet ainsi un développement accru de cellules au sein de l’hydrogel.
De préférence, l’hydrogel qui est préparé pour être consolidé selon le procédé de l’invention est composé d’alginate et de gélatine, ou encore d’alginate, de gélatine et de fibrinogène, sans autre constituant capable de former un gel.
De préférence, lorsque l’hydrogel comprend du fibrinogène, en plus de l’alginate et de la gélatine, il est préparé de manière à contenir jusqu’à 6 % de fibrinogène, et notamment de 0,0001 % à 6 % de fibrinogène, et en particulier 2 % de fibrinogène.
De manière également préférée, lorsque l’hydrogel contient de l’alginate, de la gélatine et du fibrinogène, ces constituants sont présents dans un ratio massique allant de 1:0,3:0,00003 à 1:35:12, et tout particulièrement dans un ratio massique de 1:1:2, 5, respectivement.
Lorsque l’hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, la solution de consolidation utilisée dans le procédé selon l’invention comprend en outre de la thrombine, c’est-à-dire de la thrombine en plus du calcium et de la TAG, et éventuellement d’un ou plusieurs autres cations divalents.
Dans le cadre de la présente invention, ladite solution de consolidation comprenant en outre de la thrombine peut être obtenue par des procédés alternatifs mais néanmoins équivalents. La solution de consolidation peut être obtenue par ajout des différents éléments, i.e. au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, de la transglutaminase, de la thrombine, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, dans une même solution, ou bien par mélange d’au moins trois solutions : une solution comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, une solution comprenant au moins de la transglutaminase, et une solution comprenant de la thrombine. Il est également possible que la thrombine soit intégrée dans la solution comprenant au moins un cation divalent ou dans la solution comprenant de la transglutaminase. Dans ce cas, ladite solution de consolidation peut être obtenue par mélange d’au moins deux solutions : i) une solution comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, et de la thrombine, et une solution comprenant de la transglutaminase, ou ii) une solution comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, et une solution comprenant de la transglutaminase et de la thrombine.
En effet, et en complément de ce qui est mentionné ci-dessus sur la réticulation de l’alginate et de la gélatine, la thrombine vient dans ce cas réticuler le fibrinogène en fibrine. La fibrine est un polymère biologique naturel résultant d’une polymérisation mimant la dernière étape de la cascade de coagulation par l’action de la thrombine sur le fibrinogène. La thrombine va dans un premier temps cliver le fïbrinopeptide A, entraînant la formation d’une proto fibrille. Le clivage du fïbrinopeptide B entraîne une libération des chaînes a et par la suite la polymérisation latérale des fibrinogènes formant la fibrine. Dès lors que l’hydrogel à consolider par le procédé de l’invention comprend du fibrinogène, la solution de consolidation utilisée comprend de la thrombine, en plus du calcium et de la TAG, et éventuellement d’un ou plusieurs autres cations divalents. Dans ce cas et de manière préférée, la solution de consolidation comprend : - de 2 à 25 U/ml de thrombine,
- de 0,003 à 30 % de cation(s) divalent(s), et
- de 0,004 à 16 % de transglutaminase.
De même que ci-dessus, de manière encore préférée, la solution de consolidation comprend de 1 à 6 % de cation(s) divalent(s), et avantageusement 3 % de cation(s) divalent(s).
De manière encore préférée, la solution de consolidation comprend de 1 à 10 % % de transglutaminase, et avantageusement 4 % de transglutaminase.
De manière encore préférée, lorsque la solution de consolidation comprend en outre de la thrombine, celle-ci est présente de préférence de 2 à 10 U/ml. De manière encore plus préférée, la solution de consolidation comprend 4 U/ml de thrombine, 3 % de calcium, et 4 % de transglutaminase.
Dans le cadre de l’invention, l’alginate, la gélatine et le cas échéant le fibrinogène, qui sont utilisés sont choisis parmi ceux qui présentent les caractéristiques les plus similaires à ce qui suit : - alginate : viscosité de 130-300 mPa.s pour une solution à 2% ;
- gélatine : de type A, porcine, degré de bloom 280 (force ou résistance à l’enfoncement);
- fibrinogène : humain, taux de protéines coagulables > 91 mg/mL ;
- thrombine : humaine, activité > 500 U/mL.
Les hydrogels contiennent avantageusement de l’alginate, de la gélatine et optionnellement du fibrinogène en tant que constituants naturels de l’hydrogel.
Néanmoins, d’autres composants naturels peuvent également être présents ou non dans les hydrogels, parmi lesquels on peut notamment citer : la chitine, le chitosane, la cellulose, l’agarose, la chondroïtine sulfate, l’acide hyaluronique, le glycogène, l’amidon, le pullulane, la carraghénane, l’héparine, le collagène, l’albumine, la fibrine, la fibroïne, le dextrane, le xanthane, la gellane, tout composant extrait de matrice extracellulaire tel que collagènes, laminine, protéoglycanes type Matrigel, la gélatine méthacrylate type GelMa. Outre les constituants d’origine naturelle, et en particulier ceux listés ci-dessus, les hydrogels de la présente invention peuvent également contenir ou non des composants synthétiques, tels que polyoléfïnes (PE, PP, PTFE, PVC), silicone (PDMS), polyacrylates (PMMA, pHEMA), polyester (PET, dacron, PGA, PLLA, PLA, PDLA, PDO, PCL), polyéthers (PEEK, PES), polyamides, polyuréthanes, PEG, pluronic F127. Des fibres textiles d’origine naturelle ou synthétique peuvent également être présentes ou non dans la composition des hydrogels.
Des exemples de fibres d’origine naturelle incluent, de façon non limitative, les fibres de cellulose.
Des exemples de fibres d’origine synthétique incluent, de façon non limitative, les fibres de polyester, les fibres de nylon, les fibres de polyéthylène, les fibres de polypropylène, et les fibres acryliques.
L’hydrogel peut comprendre en outre des cellules vivantes.
Dans le cadre de la présente invention, ledit hydrogel peut comprendre de l’alginate, de la gélatine, éventuellement du fibrinogène, et éventuellement des cellules vivantes. Dans le cadre de la présente invention, ledit hydrogel peut être constitué d’alginate, de gélatine, éventuellement de fibrinogène, et éventuellement de cellules vivantes.
Ces cellules vivantes peuvent être de tout type, à l’exception des cellules souches embryonnaires humaines obtenues par destruction d’un embryon, et de préférence plusieurs types de cellules vivantes peuvent coexister. Les cellules vivantes sont de préférence choisies parmi les cellules du tissu épithélial, du tissu conjonctif, du tissu adipeux, de tissu endothélial, et en particulier parmi les fibroblastes, les kératinocytes, les cellules souches du tissu adipeux, les adipocytes, les mélanocytes, les cellules endothéliales, les macrophages, les leucocytes, etc. Dans cete mise en œuvre du procédé de l’invention, les cellules sont donc manipulées dans des conditions que la personne du métier est à-même de déterminer dans l’art, pour permettre le maintien de leur viabilité et de leur prolifération, et idéalement de leur différenciation.
Ces cellules peuvent être intégrées lors de la préparation-même de l’hydrogel lorsque les solutions d’alginate, de gélatine, et éventuellement de fibrinogène, sont mélangées pour préparer l’hydrogel, avant sa consolidation. On parle alors d’hydrogel cellularisé. Elles peuvent également être ajoutées à la solution de consolidation, ou bien encore être ajoutées suite à la consolidation de l’hydrogel. De préférence, l’hydrogel à consolider selon l’invention comprend des cellules vivantes qui sont intégrées lors de la préparation de l’hydrogel avant sa consolidation. Par exemple, les cellules vivantes peuvent être suspendues dans la solution de fibrinogène, à laquelle est ajoutée l’alginate et la gélatine, en une ou plusieurs étapes, de manière à obtenir un hydrogel comprenant les quantités d’alginate/gélatine/fïbrinogène mentionnées ci-dessus.
Pour illustrer différentes mises en œuvre de la présente invention, les séquences suivantes sont de préférence utilisées pour préparer l’hydrogel à consolider selon le procédé de l’invention :
(i) l’alginate est ajouté à la suspension de cellules vivantes, puis la gélatine est ajoutée ;
(ii) l’alginate est ajouté au fibrinogène, puis la gélatine est ajoutée ;
(iii) les cellules vivantes sont suspendues dans le fibrinogène, puis l’alginate est ajouté, et ensuite la gélatine. De manière avantageuse, la séquence (iii) est utilisée pour préparer un hydrogel cellularisé selon l’invention.
Il est également possible que l’hydrogel ne comprenne pas de cellules vivantes, il est donc dans ce cas acellulaire.
Dans ces séquences particulières, les préférences de gammes pour chacun des constituants mentionnés ci-dessus s’appliquent également. Il est également possible de préparer l’hydrogel à consolider en une seule étape, c’est-à-dire par mélange de tous les constituants en même temps, que ce soit l’alginate et la gélatine, et éventuellement le fibrinogène et/ou les cellules vivantes, le cas échéant. De préférence, l’étape de consolidation qui consiste à mettre en contact l’hydrogel avec la solution de consolidation, est réalisée à une température allant de 15 à 40°C, et de préférence de 20 à 40°C et de manière encore plus préférée de 21 à 37°C.
De préférence, cette étape de consolidation est réalisée pendant une durée allant de 10 minutes à 6h, préférentiellement allant de 30 minutes à 6h, et idéalement pendant lh à 3h. Ainsi, de manière préférée, l’étape de consolidation est réalisée à 37°C pendant lh30.
De préférence, l’hydrogel est constitué d’alginate et de gélatine, ou bien d’alginate, de gélatine et de fibrinogène, et l’étape de consolidation est réalisée à 37°C pendant lh30.
De préférence, l’hydrogel est constitué d’alginate et de gélatine, ou bien d’alginate, de gélatine et de fibrinogène, et l’étape de consolidation est réalisée par immersion totale de l’hydrogel dans la solution de consolidation à 37°C pendant lh30.
Dans le cadre du procédé de consolidation de l’invention, celui-ci peut comprendre une étape de mise en forme de l’hydrogel une fois préparé, et préalablement à sa consolidation.
Les hydrogels tels que décrits en détails ci-dessus, une fois préparés, peuvent donc être « mis en forme », avant consolidation, par différents procédés bien connus de l’homme du métier permettant une structuration en volume (3D notamment), et en particulier par ajout ou agglomération de matière par empilement de couches ou dépôt successifs. Ainsi, les hydrogels tels que décrits ci-dessus peuvent être obtenus par un procédé de fabrication additive. Parmi ces procédés, on peut notamment citer les méthodes par injection, par extrusion, et notamment le moulage, ou la fabrication additive, notamment l’impression 3D. Ainsi, les hydrogels tels que décrits ci-dessus peuvent être obtenus par extrusion de matière, préférentiellement par une technique de moulage ou par fabrication additive, notamment l’impression 3D. En particulier, la personne du métier veillera à choisir un procédé qui permette la mise en forme de matériaux à haute viscosité, puisqu’un hydrogel constitué uniquement d’alginate et de gélatine peut présenter une viscosité allant de 50 à 6000 Pa.s., pour une mesure à une température de 5 à 45°C.
Dans le cadre de l’invention, l’hydrogel qui est consolidé selon le procédé de consolidation est de préférence mis en forme avant consolidation, de préférence par une technique d’impression 3D.
Comme indiqué précédemment, la mise en œuvre du procédé selon l’invention permet de conférer à l’hydrogel, une fois consolidé, des propriétés mécaniques avantageuses, qui sont tout particulièrement adaptées à la fourniture d’un hydrogel destiné à être implanté dans le corps humain ou animal, c’est-à-dire en tant qu’implant corporel. Pour cela, la mise en forme de l’hydrogel, préalablement à sa consolidation, par l’utilisation de l’impression 3D présente l’avantage de pouvoir préparer un hydrogel structuré « sur mesure » dont les dimensions et/ou le remplissage/porosité sont définies au regard des besoins du corps de l’organisme destiné à recevoir l’implant corporel et du rôle/de la fonction qu’il devra jouer dans cet organisme receveur. En effet, la porosité de l’implant est un paramètre clé à ajuster en fonction des tissus ou organes concernés qui sont notamment à remplacer et/ou augmenter. La porosité traduit l’espace vide présent dans l’implant qu’il est possible d’adapter afin d’apporter plus ou moins de matière et ainsi de conférer une certaine résistance mécanique se rapprochant au plus près de celle du tissu natif de la zone d’implantation. Elle peut notamment être exprimée de deux manières différentes mais corrélées et donc équivalentes ou alternatives : la taille des pores exprimée en micromètres et/ou le taux de remplissage en hydrogel exprimé en pourcentage (volume d’hydrogel / volume total de l’implant).
Pour consolider un hydrogel contenant des cellules vivantes (hydrogel cellularisé ou cellularisation postérieure à la fabrication de l’hydrogel) ayant une telle destination, il est par ailleurs particulièrement avantageux en termes d’innocuité que les cellules vivantes soient des cellules autologues, c’est-à-dire des cellules provenant de l’organisme receveur.
Ainsi, dans un exemple de réalisation, l’hydrogel décrit précédemment a permis l’obtention d’un implant corporel tridimensionnel qui comporte une ou plusieurs zones poreuses présentant chacune une porosité globale comprise entre 100 pm et 10000 pm, tout en possédant une résistance mécanique de 1 kPa à 1000 kPa. La porosité globale d’une zone poreuse correspond à une moyenne de tailles de pore des pores mesurées dans la zone poreuse. Les pores de la zone poreuse peuvent présenter des tailles de pore homogènes, c’est-à- dire ne différant pas de plus de 15 % les unes des autres.
Les pores de la zone poreuse peuvent distribués de manière homogène, c’est-à-dire régulière.
Les pores de la zone poreuse peuvent s’étendre selon des axes centraux présentant respectivement des orientations homogènes, c’est-à-dire ne différant pas de plus de 20° les unes par rapport aux autres. Les axes centraux des pores de la zone poreuse peuvent être agencés avec des écartements homogènes, c’est-à-dire ne différant pas de plus de 15 % les uns par rapport aux autres.
Les pores de la zone poreuse peuvent présenter respectivement des géométries homogènes, c’est-à-dire dont les contours sont superposables avec plus de 50% de portions confondues ou parallèles.
Les pores de la zone poreuse peuvent être séparés les uns des autres par des cordons de matière présentant respectivement des épaisseurs homogènes, c’est-à-dire ne différant pas de plus de 15 % les unes par rapport aux autres. L’implant peut notamment comprendre au moins deux zones poreuses dans lesquelles les pores ont des tailles de pore et/ou des formes différentes.
Les zones poreuses peuvent alors être agencées pour former un gradient de tailles de pore réparti sur l’implant, les zones poreuses se succédant selon une direction de gradient en suivant un ordre choisi parmi un ordre croissant et un ordre décroissant des tailles de pore. En particulier, l’implant peut comprendre :
- une première zone poreuse formant une base représentant 5 % à 40 %, de préférence 20 % à 40 %, d’un volume total de l’implant, et possédant une taille de pore comprise entre 500 micromètres et 5000 micromètres, notamment 250 micromètres à 800 micromètres,
- une deuxième zone poreuse formant un cœur représentant 20 % à 70 %, de préférence 30 % à 50 %, du volume total de l’implant et possédant une taille de pore comprise entre 500 micromètres à 2500 micromètres, notamment 100 micromètres à 250 micromètres,
- une troisième zone poreuse formant une coque représentant 5 % à 40 %, de préférence 10 % à 40 %, du volume total de l’implant, et possédant une taille de pore comprise entre 1000 micromètres à 10000 micromètres, notamment 1000 micromètres à 2500 micromètres. L’implant peut également comporter au moins une zone non poreuse, la zone non-poreuse présentant un taux de remplissage supérieur à 99 %.
Ladite au moins une zone non-poreuse peut comprendre un périmètre entourant la zone poreuse.
La ou les zones poreuses peuvent couvrir une partie essentielle de l’implant, c’est-à-dire au moins 50 %, de préférence au moins 75 %, notamment au moins 90 %, par exemple au moins 95 %.
L’implant peut être constitué d’une pluralité de couches présentant chacune un maillage constitué d’une pluralité de mailles, les couches étant empilées les unes sur les autres de telle manière que les mailles forment les pores. Les mailles de chaque couche peuvent présenter des tailles de maille homogènes, c’est- à-dire ne différant pas de plus de 15 % les unes des autres.
Les mailles de chaque couche peuvent être distribuées de manière homogène, c’est-à-dire régulière.
Les mailles de chaque couche peuvent s’étendre autour d’axes de maille centraux présentant respectivement des orientations homogènes, c’est-à-dire ne différant pas de plus de 20° les unes par rapport aux autres. Les axes de maille centraux des mailles de chaque couche peuvent être agencés avec des écartements homogènes, c’est-à-dire ne différant pas de plus de 15 % les uns par rapport aux autres.
Les mailles de chaque couche peuvent présenter respectivement des géométries homogènes, c’est-à-dire dont les contours sont superposables avec plus de 50 % de portions confondues ou parallèles.
Les mailles de chaque couche peuvent être séparées les unes des autres par des cordons de matière présentant respectivement des épaisseurs homogènes, c’est-à dire ne différant pas de plus de 15 % les unes des autres. L’implant peut posséder un volume compris dans une gamme allant de 0,05 mL à 3 L, de préférence de 100 mL à 600 mL.
L’implant peut être un implant mammaire.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l’utilisation d’une solution comprenant un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, pour consolider un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine.
Cette solution de consolidation peut également être utilisée pour consolider un hydrogel comprenant, en plus de l’alginate et de la gélatine, du fibrinogène et dès lors, ladite solution comprendra de la thrombine en plus du cation divalent, préférentiellement le calcium, et de la transglutaminase, et du ou des éventuel(s) autre(s) cation(s) divalent(s).
Toutes les préférences mentionnées ci-dessus concernant le procédé de consolidation s’appliquent mutatis mutandis à l’utilisation de la solution de consolidation selon l’invention.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine consolidés, de préférence destiné à être implanté chez un sujet humain, l’hydrogel étant susceptible d’être obtenu par un procédé de consolidation tel que décrit précédemment. Selon un deuxième mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant, dans l’ordre, les étapes suivantes:
- la préparation de l’hydrogel, - la mise en forme de l’hydrogel préparé,
- la mise en contact de G hydrogel avec au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
L’hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine peut être préparé tel que décrit précédemment.
De préférence, la préparation de l’hydrogel ne nécessite pas la mise en forme d’un ou des composants préalablement à la préparation de l’hydrogel. De préférence, la préparation de l’hydrogel ne nécessite pas la mise en forme d’un ou des composants, par exemple l’alginate et/ou la gélatine, sous forme de fibres préalablement à la préparation. Des méthodes pour mettre en forme des composants sous forme de fibres sont bien connus par l’homme de métier et incluent, par exemple, des méthodes d’électrospinning, extrusion, par fragmentation, lyophilisation puis fragmentation.
De préférence, la préparation de l’hydrogel ne nécessite pas l’ajout de fibres. De préférence, G hydrogel ne comprend pas de fibres. Des exemples de fibres sont mentionnés ci-dessus.
L’hydrogel peut être mis en forme tel que décrit précédemment. De préférence, la mise en forme de l’hydrogel préparé se fait par extrusion de matière, préférentiellement par moulage ou par fabrication additive, notamment l’impression 3D.
La mise en contact de l’hydrogel avec au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, peut se faire de façon concomitante, à l’aide d’une solution de consolidation comprenant au moins du calcium et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents. De préférence, la solution de consolidation et la mise en contact de l’hydrogel avec ladite solution sont telles que décrites précédemment.
La mise en contact de l’hydrogel avec au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, peut également se faire de façon séquentielle, c’est-à-dire que les agents réticulants ne sont pas ajoutés en même temps lors de la consolidation.
L’hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant un cation divalent, de préférence le calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents,
- une solution comprenant de la transglutaminase.
L’hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la transglutaminase,
- une solution comprenant un cation divalent, de préférence le calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents,
Lorsque l’hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, la consolidation comprend, en outre, la réticulation du fibrinogène avec de la thrombine. Cette réticulation peut se faire de manière séquentielle avec la réticulation de l’alginate et de la gélatine ( e.g . avant ou après la réticulation de l’alginate et/ou de la gélatine) ou de façon concomitante.
Lorsque l’hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, l’hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant un cation divalent, de préférence le calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents,
- une solution comprenant de la transglutaminase,
- une solution comprenant de la thrombine. Lorsque G hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, G hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant un cation divalent, de préférence le calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents,
- une solution comprenant de la thrombine,
- une solution comprenant de la transglutaminase.
Lorsque l’ hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, l’ hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la transglutaminase,
- une solution comprenant un cation divalent, de préférence le calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents,
- une solution comprenant de la thrombine.
Lorsque l’ hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, l’ hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la transglutaminase,
- une solution comprenant de la thrombine,
- une solution comprenant.un cation divalent, de préférence le calcium, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
Lorsque l’ hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, l’ hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la transglutaminase,
- une solution comprenant de la thrombine, et un cation divalent, préférentiellement du calcium,
- une solution comprenant.un cation divalent, de préférence le calcium. Lorsque G hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, G hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la thrombine,
- une solution comprenant de la transglutaminase,
- une solution comprenant.un cation divalent, de préférence le calcium.
Lorsque l’ hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, l’ hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la thrombine,
- une solution comprenant.un cation divalent, de préférence le calcium,
- une solution comprenant de la transglutaminase.
Lorsque l’ hydrogel contient du fibrinogène en plus de l’alginate et de la gélatine, l’ hydrogel une fois préparé peut être mis en contact avec les solutions telles que décrites ci-dessous, dans l’ordre suivant:
- une solution comprenant de la thrombine,
- une solution comprenant de la transglutaminase, et un cation divalent, préférentiellement du calcium.
- une solution comprenant.un cation divalent, de préférence le calcium,
Lors de la consolidation, la mise en contact de l’ hydrogel avec la ou les solution(s) mentionnée(s) ci-dessus peut être réalisée par immersion, au cours de laquelle l’ hydrogel est immergé dans l’intégralité de la ou des solution(s) mentionnée(s) ci-dessus. Elle peut également être réalisée par imbibition, par pulvérisation, à l’aide d’un système de goutte à goutte, de ruissellement, ou similaire.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine consolidés, de préférence destiné à être implanté chez un sujet humain, l’hydrogel étant susceptible d’être obtenu par un procédé de consolidation tel que décrit précédemment. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
D’autres caractéristiques, buts et avantages de l’invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels : Figure 1 représente la comparaison du module d'Young (A) et de la viscosité (B) d’hydrogels AG et FAG qui constituent les implants selon l’invention.
Figure 2 représente la comparaison des modules d’Young E0 (Pa) d’un hydrogel AG dans lequel la gélatine est réticulée avec et sans transglutaminase et conservé jusqu’à 7 jours à 37°C. Figure 3 représente la comparaison des modules d’Young E0 (Pa) d’un hydrogel AG et d’hydrogels commerciaux réticulés ou non avec la transglutaminase. * : Composé liquide à 37°C ; + : polymérisation visible mais rigidité du gel insuffisante à 37°C pour mesure DMA.
Figure 4 représente la viabilité et la croissance cellulaire mesurées de manière cinétique sur des hydrogels FAG et AG qui constituent les implants selon l’invention, et qui ont été colonisés in vitro par des fibroblastes, après leur fabrication.
Figure 5 représente la viabilité et la croissance cellulaire mesurées de manière cinétique sur des hydrogels FAG et AG qui constituent les implants selon l’invention, et qui ont été colonisés in vitro par des cellules souches du tissu adipeux, après leur fabrication. Figure 6 représente l’activité métabolique d’implants AG selon l’invention à différents points de culture suite à leur colonisation in vitro par une fraction de tissu adipeux purifié, après leur fabrication.
Figure 7 représente les analyses histologiques par coloration Hématoxyline, Phloxine, Safran (HPS) d’implants AG selon l’invention après 2 jours (4 images de gauche) ou 7 jours (2 images de droite) d’incubation in vitro avec une fraction de tissu adipeux purifié, après leur fabrication (Haut : bords externes des matrices ; Bas : pores internes des matrices ; images prises en lumière blanche ; grossissement 100X ; échelle 100 pm). Figure 8 représente l’immunomarquage de la périlipine-1 et la coloration des noyaux cellulaires au Dapi, sur des implants AG selon l’invention après 2 jours (image du haut) ou 7 jours (image du bas) d’incubation in vitro avec une fraction de tissu adipeux purifié, après leur fabrication (imagerie à fluorescence ; grossissement 200X ; échelle 50 pm). Figure 9 représente la comparaison des modules d'Young d’implants AG pour des réticulations à durées variables à 21°C (B) et 37°C (A).
Figure 10 représente la comparaison des modules d’Young E0 (A-C) et des viscosités (D-F) d’implants AG et FAG après réticulation avec différentes concentrations en CaC12, T AG et thrombine. Figure 11 représente la comparaison des modules d’Young E0 (A-B) et des viscosités (C-D) d’implants AG et FAG après réticulation séquentielle ou concomitante avec CaC12, T AG et thrombine.
Figure 12 représente la comparaison des modules d’Young E0 (A) et des viscosités (B) d’implants AG et FAG après réticulation avec une solution contenant du chlorure de calcium ou du chlorure de baryum.
Figure 13A illustre l’étude de la variation des dimensions (A1-A2) et des pores (A3-A4) d’implants AG et FAG selon l’invention avant et après réticulation. Figure 13B illustre l’impact de la stérilisation sur les dimensions (B1-B2) et le module d’Young (B3-B4) de ces implants. Figure 14 illustre la répétabilité de la production d’implants AG selon l’invention au niveau des dimensions (A), du volume (B) et de la porosité (C).
Figure 15 illustre la répétabilité de la rétractation d’implants AG selon l’invention après consolidation.
Figure 16 illustre la répétabilité de la rétractation d’implants AG selon l’invention en fonction de la méthode de stérilisation. Figure 17A illustre la répétabilité du diamètre d’extrusion. Figure 17B illustre la longueur des pores (B1-B2) d’implants AG selon l’invention.
Figure 18 représente des images de pores de taille variable dans un implant AG selon l’invention. Figure 19 représente le plan chirurgical (à gauche) de l’implantation in vivo en sous cutanée (à droite) d’implants AG et FAG selon l’invention.
Figure 20 représente les analyses histologiques après coloration au trichrome de Masson sur des coupes d’implants AG selon l’invention, après implantation sous-cutanée in vivo dans des sites de dos de rat pendant 3 semaines (images à faible, moyen et fort grossissement).
Figure 21A représente l’analyse sur 28 jours de la survie cellulaire mesurée par l’accumulation de lactate. Figure 21B représente l’analyse sur 28 jours de la croissance cellulaire suivie par marquage à la calcéine dans un hydrogel FAG cellularisé.
Figure 22 représente la mesure des modules d’ Young (E0) en fonction de la concentration cellulaire initiale présente dans un hydrogel FAG cellularisé.
Figure 23 représente l’évolution pendant 21 jours de la concentration en lactate mesurée dans les surnageants de culture d’hydrogels AG ou FAG cellularisés et consolidés.
Figure 24 représente les analyses histologiques après coloration HPS des construits bioimprimés, pleins (planche de gauche) ou poreux (planche de droite), d’hydrogel FAG fîbroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
Figure 25 représente les analyses histologiques après coloration HPS des construits bioimprimés, pleins (planche de gauche) ou poreux (planche de droite), d’hydrogel AG fîbroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
Figure 26 représente l’immunomarquage CD31-DAB (noir) sur des construits bioimprimés pleins, d’hydrogel FAG fîbroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture. Figure 27 représente l’immunomarquage CD31-DAB (noir) sur des construits bioimprimés poreux, d’hydrogel FAG fîbroblastes/cellules endothéliales après 21 jours de culture.
Figure 28 représente l’analyse histologique par coloration HPS des peaux reconstruites à partir d’hydrogel FAG bioimprimé en 3D et consolidé avec de la TAG.
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention. Matériels et Méthodes:
Protocole #1 Préparation d’un hydrogel AG : Afin de préparer l’hydrogel AG, 2 g d’alginate (très basse viscosité, Alpha Aesar, France), 5 g de gélatine (Sigma- Aldrich, France) sont dissous à 37°C pendant 12H dans 100 mL d’une solution de NaCl 0.1M (Labelians, France). Protocole #2 Préparation d’un hydrogel FAG : Afin de préparer l’hydrogel FAG, 2 g d’alginate (très basse viscosité, Alpha Aesar, France), 5 g de gélatine (Sigma- Aldrich, France) et 2 g de fibrinogène (Sigma-Aldrich, France) sont dissous à 37°C pendant 12H dans lOOmL d’une solution de NaCl 0.1M (Labelians, France).
Protocole #3 Moulage d’un hydrogel AG ou FAG : 1.8mL de l’hydrogel préparé selon le protocole #1 ou #2 sont déposés dans les puits d’une plaque de culture 6-puits et incubés à 21°C pendant 30 minutes.
Protocole #4 Réticulation d’un hydrogel AG : Une solution de réticulation est préparée par dissolution de 4 g de Transglutaminase (Ajinomoto, Japon), de 3 g de CaC12 (Sigma Aldrich, France) dans lOOmL d’une solution de NaCl 0.1M (Labelians, France). La solution de réticulation est ensuite mise en contact avec l’hydrogel pendant 1H30 à 37°C (sauf indication contraire). Protocole #5 Réticulation d’un hydrogel FAG : Une solution de réticulation est préparée par dissolution de 4 g de Transglutaminase (Ajinomoto, Japon), de 3 g de CaC12 (Sigma Aldrich, France) et de 400 Unités de thrombine (Sigma Aldrich, France) dans lOOmL d’une solution de NaCl 0. IM. La solution de réticulation est ensuite mise en contact avec l’hydrogel pendant 1H30 à 37°C (sauf indication contraire).
Protocole #6 Analyse mécanique dynamique (DMA) en compression : Les propriétés mécaniques des hydrogels FAG et AG sont mesurées en triplicata avec un rhéomètre rotationnel (DHR2, TA Instrument, France), un plan Peltier (TA Instrument, France) et une géométrie 8mm crantée (TA Instrument, France). Trois disques de 8mm de diamètre sont découpés dans les hydrogels moulés selon le protocole #3. Le disque est placé sur la géométrie inférieure à 37°C pendant 60 secondes puis une procédure de compression de 1 OLHTI oscillatoire est réalisée de 0.1 à 10Hz à 1 OOirm/s et à 37°C. Les valeurs du module d’Young E0 (Pa) et de la viscosité hq (Pa.s) de l’hydrogel sont obtenues à partir d’une modélisation du solide visco-hyperélastique utilisant les valeurs E’ et E” acquises lors de l’essai.
Protocole #7 Préparation d’un hydrogel cellularisé : Afin de préparer l’hydrogel FAG cellularisé, 0.12 g d’alginate (très basse viscosité, Alpha Aesar, France), 0.3 g de gélatine (Sigma- Aldrich, France) sont dissous dans 6mL de milieu de culture DMEM (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France). Fes cellules fraîchement trypsinées sont reprises en suspension dans 2mF d’une solution de fibrinogène 8% (Sigma-Aldrich, France). Cette suspension cellulaire est ensuite ajoutée à la solution précédente afin de former la FAG cellularisée. Afin de préparer l’hydrogel AG cellularisé, 0.12 g d’alginate (très basse viscosité, Alpha Aesar, France), 0.3 g de gélatine (Sigma-Aldrich, France) sont dissous dans 6mF de milieu de culture DMEM (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France). Fes cellules fraîchement trypsinées sont reprises en suspension dans 2mF d’une solution de NaCl 0.1M (Fabelians, France). Cette suspension cellulaire est ensuite ajoutée à la solution précédente afin de former l’AG cellularisé.
Protocole #8 Impression 3D des hydrogels : Fes hydrogels préparés selon le protocole #1, #2 sont transférés dans une cartouche de 30 mL (Nordson EFD) équipée d’une buse d’extrusion de 410 pm de diamètre (Nordson EFD). F’ensemble cartouche buse est ensuite placé dans une imprimante 3D (BioassemblyBot, Advanced Solution Lifescience, USA) permettant d’appliquer une pression constante à la cartouche tout en se déplaçant dans les trois directions de l’espace. Les paramètres d’impression sont une vitesse de lOmm/sec, une pression de 25-35PSI et une température de 21°C. L’obtention de taux de remplissage différent est effectuée par le trancheur interne du logiciel de pilotage de l’imprimante (Tsim, Advanced Solution Lifescience, USA).
Protocole #9 Implantation in vivo chez le rat : Les études d’implantation in vivo chez le rat ont été menées sur le plateau technique de recherches précliniques BIOVIVO - Institut Claude Bourgelat (Lyon, France). Les expériences ont été conduites en accord avec les Directives Européennes 2010/63/EU. Les 16 animaux (Sprague Dawley rat, 250-300g) ont été anesthésiés par inhalation (oxygène et 5% isoflurane). Les sites d’implantation dorsaux ont été rasés et désinfectés avec de la povidone et des gazes stériles, et des champs stériles ont été mis en place pour délimiter la zone chirurgicale. L'anesthésie générale a été maintenue par isoflurane (2%) et inhalation d'oxygène. L'analgésie pré- chirurgicale a été réalisée en sous-cutané avec du méloxicam et de la morphine à respectivement lmg/kg. La température corporelle et le pouls des rats ont été surveillés pendant l'opération. Deux incisions cutanées de 2 à 3 cm ont été pratiquées dans la région du dos. Une bioprothèse a été implantée dans la région dorsale sous-cutanée de chaque animal. Le groupe de contrôle a été réalisé en effectuant uniquement l'incision et la dissection. Chez un animal par groupe, 4 sites chirurgicaux ont été réalisés, trois bioprothèses et un échantillon témoin. Le site chirurgical a été fermé en couches à l'aide de sutures sous-cutanées et cutanées avec des sutures tressées résorbables (PDS® polidioxanone, 4/0 et Nylon 3/0, Ethicon J&J). Après l'opération, les animaux ont été surveillés pour détecter les signes de souffrance, et les plaies chirurgicales ont été inspectées quotidiennement pour vérifier la cicatrisation de la peau et l'absence d'infections. L’explantation a eu lieu 21 jours après l’implantation.
Protocole #10 Analyse histologique : Les implants sont fixés 24h dans une solution de formol 4% (Alphapat, Lrance) puis déshydratés par des bains successifs d’éthanol absolu (vwr Chemicals, Lrance) et de méthylcyclohexane (vwr Chemicals, Lrance) avec un déshydratateur STP 120 (Myr, Espagne) puis inclus en paraffine (Sakura, Japon). Des coupes de 5mhi d’épaisseur sont réalisées au microtome HM 340e (Microm, France). Des colorations Hématoxyline Phloxine Safran (HPS), Trichrome de Masson et un marquage au DAPI ont été réalisés.
Exemple 1 - Propriétés mécaniques d’hydrogels alginate/gélatine (AG) et fïbrinogène/alginate/gélatine (F AG)
Des hydrogels AG et FAG ont été préparés à partir des protocoles #1 et #2, moulés selon le protocole # 3, puis réticulés grâce aux protocoles #4 et #5 afin d’étudier leur propriétés mécaniques DMA grâce au protocole #6.
Fes résultats sont regroupés dans la FIG. 1 (A-B). Fes valeurs de module d’Young et de viscosité mesurées sont similaires entre l’ hydrogel AG et l’ hydrogel FAG suite à leur réticulation par le procédé de l’invention. Fes modules d’Young dans les conditions précises de cette étude sont autour de 68 OOOPa.
Exemple 2 - Impact de la réticulation avec la transglutaminase sur les propriétés mécaniques d’hydrogel alginate/gélatine (AG) Fes échantillons moulés de AG ont été préparés à partir des protocoles # 1 et #3 et réticulés à partir d’une variante du protocoles #4. Fors de cette variante, la solution de réticulation est composée d’une solution de chlorure de calcium à 30mg/mF uniquement ou d’une solution de chlorure de calcium à 30 mg/ml et de transglutaminase à 40mg/mF. 4 gels de chaque condition ont été moulés puis testés en DMA le jour même et respectivement après 1, 4 et 7 jours de stockage à 37°C dans le but de mimer des conditions physiologiques.
Fes échantillons ont ensuite été étudiés par DMA grâce au protocole #6.
Fes résultats sont regroupés sur la FIG. 2. Cette étude montre l’effet avantageux de l’utilisation de la transglutaminase lors de la réticulation sur les propriétés mécaniques des hydrogels. Cet effet est d’autant supérieur lorsque les gels sont conversés à 37°C, justifiant l’intérêt tout particulier de la réticulation selon l’invention pour des hydrogels destinés à être implantés. Exemple 3 - Impact de la réticulation avec la transglutaminase sur les propriétés mécaniques d’hydrogels commerciaux à base de gélatine et/ou de collagène
Les échantillons moulés de AG ont été préparés à partir des protocoles #1 et #3 et réticulés à partir du protocoles #4. Les échantillons d’hydrogels commerciaux listés dans le tableau 1 ci-dessous ont été préparés selon les protocoles transmis par les fournisseurs et moulés selon le protocole #3.
Tableau 1
Les hydrogels ont été réticulés avec une variante du protocole #4, en utilisant soit une solution comprenant uniquement du calcium à 30mg/mL (pas de TAG), soit une solution de calcium à 30mg/mL et de la transglutaminase à 40mg/mL, dans le but d’observer l’impact de la TAG.
Les échantillons non réticulés et réticulés avec la TAG ont ensuite été étudiés par DMA grâce au protocole #6. Les résultats sont regroupés sur la LIG. 3. 6 des 7 hydrogels commerciaux étudiés ont été réticulés par la transglutaminase. Les hydrogels à base de collagène (CoWCell, Collagène de rat) ne sont pas suffisamment rigides pour être analysés par DMA mais les hydrogels à base de gélatine (GeWcell, Gel4cell-VEGL et GelMa) possèdent un module d’Young nettement supérieur après la réticulation par la transglutaminase (respectivement 7.3, 9.9 et 50 kPa). Cette étude montre l’effet de la réticulation avec la transglutaminase sur la rigidité des hydrogels commerciaux.
Exemple 4 - Influence de la quantité d’alginate et de gélatine dans un hydrogel fïbrinogène/alginate/gélatine (F AG) sur les propriétés mécaniques
Des hydrogels FAG ont été préparés à partir d’une variante du protocole #2, moulés selon le protocole # 3, puis réticulés grâce au protocole #5, puis leurs propriétés mécaniques ont été étudiées par DMA grâce au protocole #6. Fors de cette variante, nous avons étudié ces propriétés mécaniques en préparant l’hydrogel FAG, avec 1 ou 3 ou 2 g d’alginate, et 10 ou 7.5 ou 5 g de gélatine, respectivement, et 2 g de fibrinogène.
Fes résultats sont regroupés dans le Tableau 2 ci-dessous. Fes modules d’Young dans les conditions précises de cette étude vont de 200 à 800 kPa.
Tableau 2 Exemple 5 - Evaluation de la colonisation d’hydrogels fibrinogène/alginate/gélatine (FAG) et alginate/gélatine (AG) par des fibroblastes
Fes hydrogels de AG et de FAG ont été préparés à partir des protocoles #1 et #2. Des implants carrés de 1,5 cm de côté et 0,2 cm d’épaisseur ont ensuite été imprimés selon le protocole #8 et réticulés grâce aux protocoles #4 ou #5. Fes implants imprimés sont produits avec un taux de remplissage de 50 % et une buse d’extrusion de 410 mhi de diamètre interne. Un témoin négatif (puit vide) est également utilisé. Des fibroblastes humains normaux en passage 6 sont décongelés et amplifiés dans des flasques de culture de 175cm2 en milieu de culture contenant du DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau et 1% d’antibiotiques. Chaque implant a été ensemencé à sa surface avec une suspension cellulaire de fibroblastes humains normaux à une concentration de 4,000,000 fibroblastes/ml. 250 mΐ de cette suspension ont été déposés au goutte à goutte sur chaque implant, soit 1,000,000 fibroblastes/implant. Après 1 heure d’adhésion, les implants ont été immergés avec du milieu de culture. Les implants ont été cultivés dans du milieu de culture composé de DMEM contenant 10 % de sérum de veau supplémenté en vitamine C et EGF (Epidermal Growth Factor) à 37 °C, 5 % C02. Les implants ont été cultivés avec ce même milieu pendant 21 jours renouvelé tous les 3 jours.
L’activité métabolique des fibroblastes au sein des implants a été étudiée par analyse colorimétrique au Bleu Alamar aux jours de culture 3, 5, 8, 10, 14 et 21 après ensemencement. La solution a été réalisée en diluant au lOeme une solution de Bleu Alamar (DAL 1100, Invitrogen) dans du DMEM. Après 19 heures d’incubation à 37 °C, 100 mΐ des surnageants ont été prélevés et leur absorbance à 570 nm et 600 nm a été mesurée au spectrophotomètre (NanoQuant® infinité M200PRO, TECAN).
La viabilité et croissance cellulaire a ainsi été suivie sur 21 jours de culture grâce à une cinétique en 6 points aux jours 3, 5, 8, 10, 14 et 21. Les résultats sont regroupés sur la FIG. 4. Les résultats ont confirmé que tous les implants ont permis l’adhésion et la survie des fibroblastes dès le 3eme jour de culture. Une croissance cellulaire est observable pour chaque implant poreux sur les 21 jours de culture, sur les deux types d’hydrogels (F AG et AG) ainsi que pour chaque porosité employée.
Exemple 6 : Evaluation de la colonisation d’hydrogels fibrinogène/alginate/gélatine (F AG) et alginate/gélatine (AG) par des cellules souches du tissu adipeux (ASC).
Les hydrogels de AG et de F AG ont été préparés à partir des protocoles #1 et #2. Des implants carrés de 1,5 cm de côté et 0,2 cm d’épaisseur ont ensuite été imprimés selon le protocole #8 et réticulés grâce aux protocoles #4 ou #5. Les implants imprimés sont produits avec un taux de remplissage de 50 % et 75% et une buse d’extrusion de 41 Omhi de diamètre interne. La stérilisation a été effectuée par la société IONISOS (France) par irradiation des implants avec une dose de 30 kGy de rayon Gamma.
Des cellules souches adipocytaires humains normales en passage 2 à 5 sont décongelées et amplifiées dans des flasques de culture de 175cm2 en milieu de culture contenant du DMEM supplémenté par 10% de sérum et 1% d’antibiotiques. Chaque implant a été ensemencé à sa surface avec une suspension cellulaire d’ASC à une concentration de 6, 12 ou 24 millions d’ACS/ml. 250 mΐ de ces suspensions ont été déposés au goutte à goutte sur chaque implant, soit 1.5, 3 ou 6 millions d’ASC/implant. Après 1 heure d’adhésion, les implants ont été immergés avec du milieu de culture. Les implants ont été cultivés dans du milieu de culture contenant du DMEM supplémenté par 10% de sérum et 1% d’antibiotiques pendant 7 jours puis dans du milieu contenant du DMEM supplémenté par 10% de sérum, de l’insuline, de la rosiglitasone et 1% d’antibiotiques pendant 14 jours. Les milieux de culture sont renouvelés tous les 3 jours.
L’activité métabolique des fîbroblastes au sein des implants a été étudiée par analyse colorimétrique au Bleu Alamar aux jours de culture 3, 5, 7, 14 et 21 après ensemencement.
La solution a été réalisée en diluant au lOeme une solution de Bleu Alamar (DAL 1100, Invitrogen) dans du DMEM. Après 5 heures d’incubation à 37 °C, 100 mΐ des surnageants ont été prélevés et leur absorbance à 570 nm et 600 nm a été mesurée au spectrophotomètre (NanoQuant® infinité M200PRO, TECAN). La viabilité et croissance cellulaire a ainsi été suivie sur 21 jours de culture grâce à une cinétique en 6 points aux jours 3, 5, 7, 14 et 21. Les résultats sont regroupés sur la FIG. 5.
Les résultats ont confirmé que tous les implants ont permis l’adhésion et la survie des cellules souches adipocytaires dès le 3eme jour de culture. Une croissance cellulaire est observable pour chaque implant poreux sur les 21 jours de culture, sur les deux types d’hydrogels (F AG et AG) ainsi que pour chaque densité d’encensement. Exemple 7 : Evaluation de la colonisation d’hydrogels alginate/gélatine (AG) au contact d’une fraction de tissu adipeux purifié.
Les hydrogels de AG ont été préparés à partir du protocole #1. Des implants cubiques de 1,5 cm de côté et 0,8 cm d’épaisseur ont ensuite été imprimés selon le protocole #8 et réticulés grâce au protocole #4. Les implants imprimés sont produits avec un taux de remplissage de 50 % et une buse d’extrusion de 410 mhi de diamètre interne.
Le lipoaspirat est centrifugé à 1500 RPM pendant 2 minutes puis rincé avec du PBS IX. Le lipoaspirat a de nouveau été centrifugé à 1500 RPM pendant 30 secondes puis le PBS IX a été éliminé. Le lipoaspirat est considéré comme purifié. Chaque implant est ensuite immergé dans 6mL de lipoaspirat purifié, puis l’ensemble a été placé dans un insert de culture dans une plaque 6 puits avec une incubation dans du milieu contenant du DMEM supplémenté par 10% de sérum et 1% d’antibiotiques à 37°C 5 % C02 pendant 2 jours ou 7 jours.
Suite au contact avec le lipoaspirat, les implants ont été cultivés en plaques 6 puits dans du milieu de culture contenant du DMEM supplémenté par 10% de sérum, de l’insuline, de la rosiglitasone et 1% d’antibiotiques, avec 3 renouvellements du milieu par semaine jusqu’à 21 jours.
L’activité métabolique cellulaire au sein des implants a été étudiée par analyse colorimétrique au Bleu Alamar aux jours de culture 2, 7 et 21 après ensemencement. La solution a été réalisée en diluant au lOeme une solution de Bleu Alamar (DAL 1100, Invitrogen) dans du DMEM. Après 5 heures d’incubation à 37 °C, 100 mΐ des surnageants ont été prélevés et leur absorbance à 570 nm et 600 nm a été mesurée au spectrophotomètre (NanoQuant® infinité M200PRO, TECAN).
La viabilité et croissance cellulaire a ainsi été suivie sur 21 jours. Les résultats sont regroupés sur la LIG. 6.
Une activité métabolique bien supérieure au témoin négatif a été observée dans les implants ayant été au contact d’un lipoaspirat purifié. Des analyses histologiques ont été réalisées afin de compléter cette étude selon le protocole #10. Les résultats sont regroupés sur la FIG. 7.
Les images révèlent la présence d’adipocytes agglomérés, polygonaux, uniformes, uniloculaires et volumineux. Ces caractéristiques morphologiques sont celles d’adipocytes sains, que l’on peut retrouver dans le tissu adipeux.
Un immunomarquage de la périlipine-1 a également été réalisé. Des échantillons ont été inclus en OCT (CellPath, KMA-0100-00A), puis conservés à -80 °C. Des coupes de 16 pm d’épaisseur ont été réalisées pour chaque échantillon avec un cryostat (Microm, HM 520). Les coupes ont ensuite été fixées dans une solution d’Acétone/méthanol (v/v) pendant 20 minutes et rincées 3 fois dans du PBS IX. Une incubation d’une heure à température ambiante dans une solution de PBS-BSA 4 % a été réalisée pour saturer les sites aspécifiques. Les coupes ont ensuite été incubées une nuit à température ambiante avec une solution d’anticorps primaire spécifique de la périlipine-1. Le lendemain, les coupes ont été rincées trois fois au PBS IX puis incubées 45 minutes avec une solution d’anticorps secondaire couplé à l’Alexa fluor 568, à température ambiante. Puis les coupes ont été rincées 3 fois au PBS IX et montées entre lame et lamelle avec un milieu de montage Dapi fluoromount-G® (SouthemBiotech). Les images obtenues sont regroupées FIG. 8.
Les images présentent des adipocytes ayant de grosses vacuoles sphériques ou polygonales en fonction du regroupement des cellules. Les adipocytes apparaissent comme uniloculaires et leur taille est également physiologique car comprise entre 50 et 200 pm.
L’ensemble de ces résultats confirme l’adhésion, la survie et la régénération d’un tissu adipeux humain mis en contact avec les implants. La structure et la composition particulières des implants forment ainsi un environnement favorable à la régénération d’un tissu adipeux sain. Exemple 8 - Influence de la température et du temps de réticulation sur les propriétés mécaniques d’un hydrogel alginate/gé latine (AG)
Les échantillons moulés de AG ont été préparés à partir des protocoles #1 et protocole #3 et réticulés à partir d’une variante du protocole #4. Lors de cette variante, les temps et les températures de réticulation ont été modifiés, de 10 minutes à 14H et de 37°C à 21°C.
Les échantillons ont ensuite été étudiés par DMA grâce au protocole #6.
Les résultats sont regroupés sur la LIG. 9 (A-B). Les temps de réticulation ainsi que la température de réticulation n’influencent que très peu la mécanique finale (module d’Young) des hydrogels. Il semble cependant qu’un optimum puisse être trouvé autour de lh30, quel que soit la température.
Ces modules d’Young sont également très stables sur 7 jours après réticulation à 37°C. La réticulation de la gélatine a été efficace puisqu’il n’y a pas de perte de gélatine dissoute dans le milieu.
Exemple 9 - Impact de la concentration des composants de la solution de réticulation sur les propriétés mécaniques d’hydrogels alginate/gélatine (AG) et fïbrinogène/alginate/gélatine fFAG) une fois réticulés
Les échantillons moulés de AG et LAG ont été préparés à partir des protocoles #1, #2 et #3, réticulés à partir d’une variante des protocoles #4 et #5. Lors de cette variante, les concentrations des composants de la solution de réticulation ont été modifiées (transglutaminase, chlorure de calcium et thrombine).
Les échantillons ont ensuite été étudiés par DMA grâce au protocole #6.
Les résultats sont regroupés sur la LIG. 10 (A-L). Sur cette gamme de concentrations de réactifs, aucunes variations significatives n’ont été observées (E0 tous très similaires). Exemple 10 - Impact d’une réticulation séquentielle ou concomitante d’hydrogel alginate/gélatine (AG) et fibrinogène/alginate/gélatine (F AG)
Les échantillons moulés de AG et F AG ont été préparés à partir des protocoles #1, #2 et #3, réticulés à partir d’une variante des protocoles #4 et #5. Lors de cette variante, nous avons étudié une réticulation séquentielle sur la F AG et F AG, qui consiste à réticuler l’hydrogel en plusieurs temps. Chaque étape a duré lh et trois rinçages par une solution de 0,1M de NaCl ont été effectués entre chaque étape afin d’éliminer les agents réticulant résiduels. Les conditions testées pour la réticulation séquentielle sont décrites dans le tableau ci-dessous (chaque étape consiste en l’immersion de l’hydrogel dans la solution décrite pendant 1 h):
Les échantillons ont ensuite été étudiés par DMA grâce au protocole #6.
Les résultats sont regroupés dans la FIG. 11 (A-D). L’ensemble des réticulations séquentielles (FAG et AG) génèrent des hydrogels de plus faibles modules d’Young que la réticulation en une seule étape.
On peut observer que des gels très souples et fragiles sont obtenus si le calcium n’est pas ajouté en premier, en effet la TAG et la thrombine sont calcium-dépendantes leur activité est donc largement diminuée sans l’ajout de CaCh. Les gels sont donc difficilement manipulables sans la réticulation au calcium. Lorsque la thrombine est ajoutée en premier, les gels ont très peu de tenue mécanique et des trous apparaissent.
Exemple 11 - Impact de la nature du cation divalent pour la réticulation d’hydrogels alginate/gélatine (AG) et fibrinogène/alginate/gélatine (FAG)
Les échantillons moulés de AG et FAG ont été préparés à partir des protocoles #1, #2 et #3, réticulés à partir d’une variante des protocoles #4 et #5. Lors de cette variante, nous avons étudié une réticulation en présence de chlorure de baryum 30mg/mL.
Les échantillons ont ensuite été étudiés par DMA grâce au protocole #6. Les résultats sont regroupés sur la FIG. 12 (A-B). La réticulation en présence de baryum permet d’obtenir des gels de modules d’Young très semblables à ceux obtenus avec le CaC12. Le baryum permettant cependant d’augmenter la viscosité des gels, on peut supposer la formation de chaînes pendantes supplémentaires. Exemple 12 - Maintien de la structure tridimensionnelle et des propriétés mécaniques d’implants à base d’hydrogel alginate/gélatine (AG) et fïbrinogène/alginate/gélatine
(F AG) après stérilisation
Les hydrogels de AG et F AG ont été préparés à partir des protocoles #1 , #2 et #3, réticulés grâce aux protocoles #4 et #5, observés optiquement puis étudiés par DMA grâce au protocole #6. Fes formes imprimées sont des demi-sphères de 2 cm de diamètre produites avec des taux de remplissage variable (30, 50 et 75%).
Fa stérilisation a été effectuée par la société IONISOS (France) par irradiation des implants avec une dose variable (30 kGy et 40 kGy) de rayon Gamma.
F’impact de l’étape de réticulation sur les dimensions d’implants à base d’hydrogel alginate/gélatine et fïbrinogène/alginate/gélatine a été étudié. Ces dimensions ont été mesurées à partir d’images macroscopiques.
Fes dimensions des pores obtenus en fonction du taux de remplissage ont également été étudiées. Ces dimensions ont été mesurées à partir d’images effectuée grâce à un microscope (Olympus, grossissement x4). Fes résultats sont regroupés sur la FIG. 13 (A-B). Fes implants se rétractent en moyenne de 10 % suite à l’étape de réticulation. Fa taille des pores ne varie cependant pas de façon significative (FIG. 13A (Al -A4)).
En ce qui concerne la stérilisation, il apparaît que la dose de 40 kGy entraîne une plus forte rétractation des construits que la dose 30 kGy. Concernant le E0, la stérilisation n’entraîne pas de changement de la mécanique du matériau pour les deux doses (FIG. 13B (B1-B4)). Exemple 13 : Qualité de production d’implant de grande taille à base d’un hydrogel alginate/gélatine (AG) : répétabilité des dimensions d’impression, des dimensions après consolidation et stérilisation de l’implant selon plusieurs méthodes.
Les hydrogels de AG ont été préparés à partir du protocoles #1. Des implants en forme de demi-sphère de 6cm de diamètre et 2cm d’épaisseur ont ensuite été imprimés selon le protocole #8 et réticulés grâce au protocole #4 puis observés optiquement et mesurés. Les formes imprimées sont produites avec des taux de remplissage variables (25 à 65%) et des buses d’extrusion de 410 ou 840 pm de diamètre interne. La stérilisation a été effectuée par la société IONISOS (Lrance) par irradiation des implants avec 2 doses (30 kGy et 40 kGy) de rayons Beta ou une dose de rayons gamme de 30 kGy.
L’impact de l’étape de réticulation et de stérilisation sur les dimensions d’implants grande taille à base d’hydrogel alginate/gélatine a été étudié. Ces dimensions ont été mesurées à partir d’images macroscopiques.
Les dimensions des pores obtenus en fonction du taux de remplissage ont également été étudiées. Ces dimensions ont été mesurées à partir d’images effectuée grâce à un microscope (Olympus, grossissement x4).
Les résultats après impression sont regroupés LIG.14. (A-C) Ces résultats montrent une haute répétabilité des dimensions des implants grande taille imprimés en 3D, traduisant une haute qualité de production. Les résultats après consolidation des implants sont regroupés LIG 15. Ce graphique montre une haute répétabilité de la rétractation des implants grande taille après l’étape de consolidation.
Les résultats après stérilisation des implants selon 3 méthodes (rayons b doses 40 et 30 kGy et rayons g 30 kGy) sont regroupés LIG 16. Ces résultats montrent une plus faible rétractation des implants grande taille avec les rayons b 30 et 40 kGy.
Des implants grande taille ont été imprimés avec 2 buses d’extrusion de diamètre interne 410 et 840 mhi avec des taux de remplissage de 25 à 65%. La répétabilité du diamètre d’extrusion ainsi que la longueur des pores obtenues ont été mesurées. Les résultats sont regroupés FIG 17 (A-B).
La FIG. 17A montre la haute répétabilité de la taille du cordon extrudé. La FIG. 17B (Bl- B2) montre la variation de la longueur des pores en fonction du taux de remplissage de l’hydrogel.
Des images de pores de taille variable ont été prises et sont regroupées sur la FIG. 18.
Ces données montrent la large gamme de pores qu’il est possible d’obtenir pour les implants et leur haute répétabilité et qualité de production.
Example 14 - Etudes de la résistance des implants in vivo Les hydrogels d’AG et de FAG ont été préparés à partir des protocoles #1, #2 et #8, réticulés grâce aux protocoles #4 et #5. Les formes imprimées sont des demi-sphères de 1 cm de diamètre, produites avec des taux de remplissage variable (30, 50 et 75 %).
Les demi-sphères poreuses ont été stérilisées avec la dose de 30kGy puis implantées en sous-cutané chez le rat selon le protocole #9. Le détail des groupes d’implantation est décrit dans le tableau 3 suivant, qui fait référence au plan chirurgical d’implantation décrit sur la FIG. 19.
Tableau 3
Les analyses histologiques ont été effectuées grâce au protocole #10, et les résultats sont regroupés sur la FIG. 20. L’explantation a permis de valider la résistance des implants à la tension cutanée. Les analyses histologiques ont permis d’évaluer la colonisation cellulaire, la vascularisation, la synthèse de matrice extracellulaire ainsi que la présence de zones d’inflammation.
Exemple 15 - Viabilité et croissance cellulaires et propriétés mécaniques d’hydrogel fïbrinogène/alginate/gélatine (F AG)
Des hydrogels de FAG cellularisé ont été préparés à partir du protocole #7 en présence de différentes concentrations de fîbroblastes dermiques humains (0,5/0,25/0,125 millions de cellules/mF d’hydrogel). Des dalles de 1cm2, de 0.2cm d’épaisseur et de remplissage 100% ont été préparées grâce au protocole #8 puis réticulées grâce au protocole #5. Les différentes dalles ont ensuite été cultivées pendant 28 jours à 37°C et 5% CO2 dans un milieu Dulbecco’s Modifïed Eagle Medium (DMEM)/Glutamax (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France), supplémenté par 10% (v/v) de sérum de veau bovin (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France), 0.5% (v/v) d’amphotéricine B (Gibco Cell Culture, Invitrogen, France) et 1% de Pénicilline/Streptomycine.
Afin de suivre la croissance cellulaire, des dosages de l’acide F-lactique produit ont été effectué tous les deux jours grâce à un kit commercial (F-Factic Acid Assay Kit, Megazyme) selon le protocole recommandé par le fournisseur. Fes mesures de densité optique ont été effectuées grâce à un lecteur de plaque INFINITE (TEC AN, France). Afin d’observer la présence de cellules vivantes au sein des dalles d’hydrogel au long de la culture, un marquage de viabilité a été effectué tous les 5 jours en présence de ImM de Calcein-AM (Thermofïsher, France).
Fes résultats sont regroupés sur la FIG. 21 A. Fa synthèse de lactate est un indicateur de l’activité cellulaire. On observe une nette augmentation de la quantité de lactate dès J15 à toutes les concentrations cellulaires, indiquant une croissance cellulaire dans les hydrogels bioimprimés consolidés selon l’invention.
Fes images des marquages par la calcein-AM regroupées sur la FIG. 21B montrent une présence cellulaire viable et croissante dès Jll et un étalement des cellules dès J17 à 0,25M cellules/mF et dès J22 pour les autres concentrations cellulaires. Des hydrogels de FAG cellularisés préparés et cultivés comme décrit ci-dessus ont été étudiés selon le protocole #6.
Fes résultats sont regroupés sur la FIG. 22. Fe module d’ Young des hydrogels cellularisés après 28 jours de culture n’est pas dépendant de la concentration cellulaire utilisée lors de la production. Ces modules d’ Young sont cependant inférieurs à ceux obtenu à partir d’hydrogels non cellularisés, ce qui dénote un remodelage de l’hydrogel par les cellules. Exemple 16 - Bioimpression de dermes équivalents dans des hydrogels alginate/gélatine
(AG) et fïbrinogène/alginate/gélatine (F AG) consolidés
Des hydrogels de AG et de FAG cellularisés ont été préparés à partir du protocole #7 en présence d’un mélange de fibroblastes dermiques humains (0,25 millions de cellules/mF d’hydrogel) et de cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines (1 million de cellules/mF d’hydrogel). Des dalles de 2.25cm2, de 0.2cm d’épaisseur et de remplissage 50 et 100% ont été préparées grâce au protocole #8 puis consolidées grâce aux protocoles #4 et #5.
Fes différents construits ont ensuite été cultivés pendant 21 jours à 37°C et 5% C02 dans un milieu de culture adapté à la culture de dermes humains composé de DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau, 1% d’antibiotiques, de la vitamine C et de l’EGF.
Afin de suivre la croissance cellulaire, des dosages de l’acide F-lactique produit ont été effectué tous les deux jours grâce à un kit commercial (F-Factic Acid Assay Kit, Megazyme) selon le protocole recommandé par le fournisseur. Fes mesures de densité optique ont été effectuées grâce à un lecteur de plaque INFINITE (TEC AN, France).
Fes résultats sont regroupés sur la FIG. 23. On observe une augmentation de la production de lactate par les cellules dès J11 dans toutes les conditions. Fa production de lactate est supérieure dans les hydrogels à base de AG et dans les construits poreux. Ces résultats indiquent une prolifération cellulaire dans les hydrogels consolidés pendant 21 jours. Des analyses histologiques ont été réalisées à partir du protocole #10. Des colorations HPS ont été réalisées pour toutes les conditions. Afin d’évaluer la présence de cellules endothéliales dans les hydrogels, un marquage immunohistochimique CD31 spécifique des cellules endothéliales avec révélation au DAB a été réalisé sur des coupes paraffine de 5pm d’épaisseur. Fes résultats sont regroupés sur les FIG 24 à FIG 27 :
FIG 24 : les images des construits pleins FAG montrent que des cellules en quantité sont présentes dans le gel et semblent proliférer sous forme d’agglomérat avec des sites d’adhésion sur le gel. Pour les construit poreux, on observe également des clusters de prolifération dans le gel mais aussi une couche proliférative à la surface des pores. On observe également un début de dégradation de l’hydrogel autour des cellules dans le gel.
FIG 25 : les images des construits pleins AG montrent que des cellules en quantité sont présentes dans le gel. Pour les construit poreux, on observe également des clusters de prolifération dans le gel mais aussi une couche proliférative en surface et des zones de haute densité cellulaire dans les coins des pores. On observe également une dégradation de l’hydrogel autour des cellules dans le gel.
FIG 26 : les images des construits pleins FAG révèlent la présence d’amas cellulaires conséquents de fîbroblastes dans le gel avec de petits amas de cellules endothéliales localisées autour et dans les amas de fibroblastes.
FIG 27 : les images des construits poreux FAG révèlent la présence d’amas cellulaires de fîbroblastes dans le gel avec des amas de cellules endothéliales localisées autour et dans les amas de fibroblastes. On observe également une couche proliférative de fibroblastes en surface. Exemple 17 - Obtention de peaux équivalentes par épidermisation de construits bioimprimés dans des hydrogels de fibrinogène/alginate/gélatine (FAG) consolidés.
Des hydrogels FAG cellularisés ont été préparés à partir du protocole #7 en présence d’un mélange de fîbroblastes dermiques humains. Deux conditions distinctes ont été testées : bioimpression bicouche à 1,000,000 fibroblastes/ml et bioimpression bicouche hydribe d’une couche inférieure acellulaire et d’une couche supérieure cellularisée à 2,000,000 fîbroblastes/ml. Pour les construits bicouches cellularisés, des dalles de dimensions 2,2 cm x 2,2 cm x 0,2 cm (deux couches) et de remplissage 100% ont été imprimées grâce au protocole #8 puis consolidées grâce aux protocoles #5. Pour les construits bicouches cellularisés hybride, une première couche acellulaire et de dimensions 2,2 cm x 2,2 cm x 0,1 cm puis une deuxième couche cellularisée (2,000,000 fibroblastes/ml) et de dimensions 2,2 cm x 2,2 cm x 0,1 cm et de remplissage 100% ont été imprimées grâce au protocole #8 puis consolidées grâce aux protocoles #5. Les différents construits ont ensuite été cultivés pendant 21 jours à 37°C et 5% C02 dans un milieu de culture adapté à la culture de dermes humains composé de DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau, 1% d’antibiotiques, de la vitamine C et de l’EGF. Après trois semaines de culture, une suspension de kératinocytes humains normaux à 4,000,000 c/ml a été préparée dans du milieu de culture adapté composé de
DMEM/HAMF12 supplémenté par 10% de sérum de veau, 1% d’antibiotiques, de l’insuline, de l’ hydrocortisone, de la vitamine C et de l’EGF. 250 mΐ de cette suspension ont été déposés sur chaque construit pour un ensemencement de 250,000 kératinocytes/cm2. Après l’ensemencement, les différents construits ont été cultivés pendant 21 jours à 37°C et 5% C02 dans des milieux de culture adaptés à la culture de peaux humaines équivalentes composé de DMEM/HAMF12 supplémenté de l’insuline, de l’ hydrocortisone, de la vitamine C et 1% d’antibiotiques.
Le contenu en collagène des construits bioimprimés a été évalué dans les différentes conditions. L’analyse quantitative du collagène présent dans les supports a été réalisée à l’aide d’un test au Sircol (Kit S1000, Biocolor). Le contrôle pour cette étude était un construit acellulaire de FAG réalisé selon la même méthodologie que les échantillons bioimprimés et surfacés. Les culots résultants de la dégradation du collagène ont été dissous dans 250m1 de solution de réactif basique (kit). L’absorbance a ensuite été mesurée à 555nm ((NanoQuant® infinité M200PRO, TECAN) et les résultats comparés à ceux d’une gamme étalon pour permettre l’évaluation de la concentration en collagène des surnageants de digestion. Cette concentration a ensuite été rapportée à la masse de chaque échantillon pour évaluer la concentration en collagène de ces derniers.
Les résultats sont regroupés dans le Tableau 4 ci-dessous, dans lequel la concentration en collagène néosynthétisé est indiquée par type de construit. Ces résultats ont été obtenus par la soustraction de la concentration en collagène par mg d’échantillon du témoin aux concentrations des différents construits étudiés (masse en pg de collagène par mg d’échantillon pesé humide en fin de culture cellulaire) : Tableau 4
La valeur correspondant à T échantillon contrôle étant non nulle, il peut être déduit que le test au sircol fait ressortir la gélatine de Thydrogel FAG comme du collagène. Les construits ont montré une concentration en collagène supérieure à celle du témoin, confirmant donc la présence de collagène néosynthétisé.
En fin de culture des analyses histologiques ont été réalisées. Les construits ont été coupés en deux. Une première moitié a été fixée dans du formol 4 % pendant 24 heures, puis déshydratée par des bains successifs d’éthanol absolu et de méthylcyclohexane avec un déshydrateur STP 120 (Microm) puis inclus en paraffine. Des coupes de 5 pm d’épaisseur ont été réalisées à l’aide d’un microtome HM 340e (Microm). Une coloration Hématoxyline Phloxine Safran (HPS) a ensuite été réalisée sur ces coupes.
Les résultats sont regroupés sur la FIG. 28, dans laquelle les images révèlent que les deux conditions testées ont permis de soutenir la mise en place d’un derme épais et sain avec synthèse de matrice extracellulaire et d’un épiderme pluristratifïé et différencié.
Cette étude a permis de démontrer la faisabilité de réalisation de tissus reconstruits à partir de supports d’hydrogel FAG consolidé avec de la TAG. Fes différentes conditions ont mené à l’obtention de peaux reconstruites (dermes équivalents épais et épidermes convenablement différenciés). Fes deux méthodes étudiées ici ont permis de produire des ensembles dermo-épidermiques matures démontrant une néosynthèse de collagène.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant la préparation de l’hydrogel, puis sa mise en contact avec une solution de consolidation comprenant au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en contact de l’hydrogel avec la solution de consolidation est réalisée par immersion, de préférence totale, de l’hydrogel dans la solution de consolidation, ou bien par pulvérisation de G hydrogel avec la solution de consolidation.
3. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que le ou les cation(s) divalent(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe comprenant le calcium, le strontium et le baryum.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend de 0,5 à 3 % d’alginate et de 1 à 17,5 % de gélatine.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend en outre du fibrinogène et en ce que la solution de consolidation comprend en outre de la thrombine.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend jusqu’à
2 % de fibrinogène.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution de consolidation comprend :
- de 0,003 à 30 % de cation divalent, - de 0,004 à 16 % de transglutaminase, et éventuellement
- de 2 à 25 U/ml de thrombine.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’hydrogel comprend en outre des cellules vivantes intégrées lors de la préparation de G hydrogel avant sa consolidation.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la mise en contact avec la solution de consolidation est réalisée :
- à une température allant de 15 à 40°C, et/ou
- pendant une durée allant de 30 minutes à 6h.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’hydrogel est mis en forme, préalablement à sa consolidation, préférentiellement ladite mise en forme se fait par extrusion de matière, encore plus préférentiellement ladite mise en forme se fait par une technique de moulage ou de fabrication additive.
11. Utilisation d’une solution comprenant un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents, pour consolider un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine.
12. Hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine consolidés, destiné à être implanté chez un sujet humain, l’hydrogel étant susceptible d’être obtenu par un procédé de consolidation selon l’une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Procédé de consolidation d’un hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine, ledit procédé comprenant, dans l’ordre, les étapes suivantes : - la préparation de G hydrogel, la mise en forme de G hydrogel préparé, la mise en contact de l’hydrogel avec au moins un cation divalent, préférentiellement du calcium, et de la transglutaminase, et éventuellement un ou plusieurs autres cations divalents.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la préparation de l’hydrogel ne nécessite pas la mise en forme d’un ou des composants préalablement à la préparation de l’hydrogel.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la préparation de l’hydrogel ne nécessite pas l’ajout de fibres.
16. Procédé selon l’une quelconques des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le ou les cation(s) divalent(s) est/sont choisi(s) parmi le groupe comprenant le calcium, le strontium et le baryum.
17. Hydrogel comprenant de l’alginate et de la gélatine consolidés, destiné à être implanté chez un sujet humain, l’hydrogel étant susceptible d’être obtenu par un procédé de consolidation selon l’une quelconque des revendications 13 à 16.
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