EP4340996A1 - Puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique spécifique - Google Patents

Puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique spécifique

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Publication number
EP4340996A1
EP4340996A1 EP22731739.3A EP22731739A EP4340996A1 EP 4340996 A1 EP4340996 A1 EP 4340996A1 EP 22731739 A EP22731739 A EP 22731739A EP 4340996 A1 EP4340996 A1 EP 4340996A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reservoir
chip
microfluidic chip
biological element
microchannels
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22731739.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Marie RAMIREZ
Benoît CHARLOT
Sébastien MEANCE
Xavier Garric
Coline PINESE
Isabelle GUIRAUD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM, Universite de Montpellier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4340996A1 publication Critical patent/EP4340996A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2205/00—General characteristics of the apparatus
    • A61M2205/02—General characteristics of the apparatus characterised by a particular materials
    • A61M2205/0244—Micromachined materials, e.g. made from silicon wafers, microelectromechanical systems [MEMS] or comprising nanotechnology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2205/00—General characteristics of the apparatus
    • A61M2205/04—General characteristics of the apparatus implanted
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions

Definitions

  • the present application relates to the field of microfluidic devices capable of attracting and trapping a specific biological element. More specifically, the present application relates to a microfluidic chip capable of attracting and trapping in vivo a specific biological element, such as a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • cancers There are different types of cancers depending on the tissue in which they develop. A distinction can thus be made between solid tumours, which are characterized by a localized cluster of cancer cells, and blood cell tumours, which are diffuse and whose cancer cells circulate in the bone marrow or blood. Blood cell tumors also called hematopoietic cancers are cancers affecting the blood or lymphoid organs, such as leukemias and lymphomas.
  • carcinomas As regards solid tumours, a distinction is made between carcinomas and adenocarcinomas, cancers arising from epithelial tissue. There are also sarcomas which correspond to cancerous cells appearing in a so-called support tissue. We then speak of osteosarcoma for the bones, liposarcoma for the fat or even myosarcoma for the muscles.
  • surgery is one of the main treatments for a solid tumor and corresponds to the resection of the entire tumor when possible and possibly of the tissues located around the tumor called the resection margin.
  • Surgery can be used as a single treatment when the tumor is very localized, especially when the tumor is at an early stage, but it is often associated with other treatments such as radiotherapy which is also a local treatment. and/or medical treatments such as chemotherapy which is a systemic treatment potentially acting on all cancerous cells in the body.
  • the advantage of local surgery for the treatment of a solid tumor is the possibility of removing the entire tumor when possible and of preserving the organs and anatomical structures not affected by the cancerous cells. It also makes it possible to limit the side effects attributed to radiotherapy treatment such as burns, or the generation of radiation-induced cancers, and to chemotherapy such as skin reactions, nausea, vomiting, diarrhea, muscle pain, fatigue, falls. hair and chemotherapy-induced cancers.
  • the resection area includes an area of healthy tissue present around the tumor, which corresponds to the resection margin.
  • the tumor cells of the primary tumor are included in the resection area and there will be no recurrence.
  • some tumor cells are localized beyond the resection area either locally or remotely and then a recurrence is possible either locally or remotely to form metastases, i.e. secondary colonies of cancerous cells which spread far from the organ affected by the initial tumor and which are at the origin of a so-called “metastatic” cancer in an organ other than that in which the solid tumor was located.
  • Chemotherapy can be used after local surgery aimed at resection of the tumour, it is called “adjuvant chemotherapy” in order to prevent recurrence and/or the formation of metastatic cancer.
  • adjuvant chemotherapy many side effects are caused by this drug treatment.
  • Microfluidic devices have been described in the prior art for their use in the field of cancer treatment. Reference may in particular be made to document WO2018/089989 Al which describes an ex vivo device for the treatment of cancer by subjecting a biological fluid such as blood with electromagnetic radiation specific to the type of targeted cancer cell and capable of destroying it.
  • No document of the prior art describes or suggests a microfluidic chip for attracting and destroying, preferably in vivo, a biological element and in particular a cancerous cell after the resection of a solid tumor and thus preventing and/or reducing the risks of local recurrence and/or development of metastatic cancer, the manufacture of which is simple and inexpensive, which is effective and which is easy to implement in vivo for a clinical application.
  • the present invention proposes a microfluidic chip capable of attracting, trapping and ultimately destroying a specific biological element
  • a reservoir consisting of a matrix comprising a chemoattractant compound capable of attracting the biological element, at least one network of microchannels arranged between the reservoir and the external medium of the chip and allowing the chemoattractant compound to pass towards the said medium and to allow the biological element present in the said medium to pass in the direction of the reservoir
  • each microchannel is in the form of a harpoon comprising at least two arrows spaced longitudinally from each other and directed towards the tank, in which each arrow comprises two branches each having a free end forming an acute angle of between 10° and 80°, and wherein each arrow comprises two openings communicating with a longitudinal part of the microchannel and having a e width between 5 ⁇ m and 30 ⁇ m.
  • the present invention relates to a microfluidic chip capable of attracting and trapping a specific biological element, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising a chemoattractant compound capable of attracting the biological element
  • each microchannel is in the form of a harpoon comprising at least two arrows spaced longitudinally from each other and directed towards the tank, in which each arrow comprises two branches each having a free end forming an acute angle comprised between 10° and 80°, and in which each arrow comprises two openings communicating with a longitudinal part of the microchannel and having a width comprised between 5 ⁇ m and 30 ⁇ m.
  • Figure 1 shows a network of microchannels (2) forming part of the chip according to the invention.
  • FIG. 2 shows an electron microscope view (X414 magnification) of a network of microchannels (2) forming part of the chip according to the invention. A distinction is made between the cells (15) trapped within the chip and the cells (16) present within the external medium.
  • Figure 3 is a sectional view of the chip according to the invention.
  • Figure 4 shows the upper part (9) of the chip seen from above.
  • Figure 5 shows the lower part (8) of the chip seen from above.
  • Figure 6 shows an exploded view of the underside of the chip according to the invention.
  • FIG. 7 represents an exploded top view of the chip according to the invention.
  • FIG. 8 represents a cross-sectional view of the chip according to the invention on a scale of 5:0.5 cm.
  • Figure 9 shows a cross-sectional view of the chip at 5:1 cm scale.
  • the Applicants have developed a microfluidic chip to attract and trap a biological element, such as a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • This microfluidic chip is particularly interesting for attracting and trapping a cancerous cell in vivo after the resection of a solid tumor in order to prevent and/or reduce the risks of local recurrence and/or the development of metastatic cancer.
  • the microfluidic chip developed by the Applicants is particularly advantageous because it makes it possible to attract, trap and ultimately destroy a biological element without requiring the use of one or more electrodes.
  • the absence of an electrode makes it possible in particular to manufacture the microfluidic chip more easily, to limit the production costs but also to facilitate the implementation of the microfluidic chip in vivo.
  • the particular structure of the microchannels implemented in the chip according to the invention allows the passage of a biological element within said chip, from the external medium in the direction of the reservoir consisting of a matrix comprising a chemoattractant compound capable of attracting the biological element, while preventing said biological element from coming out of the chip towards the external environment.
  • the chip according to the present invention not only makes it possible to attract a biological element present in the medium outside of the chip but also to trap it within said chip and ultimately to destroy it since the biological element deprived of the resources necessary for its survival ends up being destroyed.
  • a "microfluidic chip” is a device comprising a network of microchannels, i.e. channels of micrometric size, etched or molded in a material, connected to each other and connecting the inside of the chip to the outside of the chip by drilled inputs and outputs through the chip, to achieve a desired function.
  • the microfluidic chip can be obtained by specific processes such as by deposition and electrodeposition, etching, bonding, injection molding, embossing, soft lithography, anodic welding, or any other technology. These manufacturing methods are known to those skilled in the art.
  • the desired function of the microfluidic chip is to be able to attract in vivo a specific biological element, preferably a eukaryotic cell in particular a cancerous cell, and to destroy it in vivo.
  • microchannel network corresponds to a multitude of channels, connected on the outside of the chip by inputs and outputs drilled through the chip.
  • the microchannels can for example be made from a mold, or directly in the material of the microfluidic chip.
  • the number of microchannels varies according to the diameter of the chip, the width of the microchannels or even the spacing between said microchannels.
  • Each microchannel making up the network of microchannels corresponds to a passage whose height can be from a few micrometers to a few hundred micrometers with a length from a few hundred micrometers up to a few millimeters.
  • the width of a microchannel corresponds to the horizontal distance of the two points which are on the opposite edges of the cross section and which are furthest from each other.
  • the height of a microchannel corresponds to the vertical distance of the points located on opposite edges of the cross section and furthest apart from each other.
  • the length of a microchannel is the distance between the two ends of said channel, the length of a microchannel corresponds to the largest dimension.
  • the two shorter dimensions generally define the aforementioned cross-section.
  • the microfluidic chip is preferably “intended to be implanted in vivo”, ie the microfluidic chip is intended and able to be implanted within a living being, preferably a mammal and in particular a human being. More particularly, this means that the chip can be implanted in a living being without interfering with or degrading the tissues with which it is in contact and that said chip is capable of functioning in vivo, that is to say attracting, trapping and destroying a specific biological element in vivo, preferably a eukaryotic cell such as a cancer cell, and to destroy it in vivo.
  • biological element within the meaning of the present invention, reference is made to any element comprising genetic information in the form of RNA or DNA and likely to be found within a living organism, i.e. say in vivo, such as prokaryotic cells, eukaryotic cells and microorganisms.
  • prokaryotic cells such as a bacterium
  • eukaryotic cell such as an animal cell.
  • specific biological element or "target biological element” refers to the biological element of interest in the context of the use of the chip, that is to say the biological element that one wishes to attract and destroy in vivo.
  • the chemoattractant compound present in the reservoir being chosen to attract the biological element of interest in the context of the use of the microfluidic chip.
  • the biological element of interest is a prokaryotic or eukaryotic cell, more preferably the biological element of interest is a eukaryotic cell. Even more preferably, the eukaryotic cell is a cancer cell, preferably a metastatic cancer cell.
  • a “cancer cell” is a cell in which one or more major DNA lesions have occurred, thus transforming the normal cell into a cancerous cell capable of proliferating to form a group of identical transformed cells, i.e. a tumor.
  • cancer cell refers to a cell derived from a so-called initial or original or primary solid tumor, present at or near the area of resection of the tumor. solid.
  • cancer cell to a “metastatic cancer cell”, that is to say a cancer cell, capable of or having migrated through the body via the blood vessels. or lymphatics from the original tumor and capable of or having colonized one or more other tissues close to or at a distance from said tumor, thus forming metastases, at the origin of “metastatic cancers” or even “metastatic tumors”.
  • the cancerous cell is a cell resulting from a so-called secondary or tertiary solid tumour, which correspond to metastatic tumors in a second or third tissue or organ other than that of the initial tumour.
  • the microfluidic chip according to the present invention is capable of attracting and destroying several of said elements and cells in vivo. It is also worth noting that the chip microfluidics according to the present invention is capable of attracting and destroying in vivo several specific biological elements which may be of different nature, said elements being attracted within the chip by the specific choice of the chemoattractant compound(s) present in the reservoir.
  • the term “prevent” designates a reduction in the risk of acquiring a specified disease or disorder, the reduction or slowing of the appearance of the symptoms of this disease.
  • the term “prevent” may correspond to the reduction in the risk of spreading an infection when the biological element is a prokaryotic cell or to the reduction in the risk of local recurrence of the cancer and/ or the risk of appearance of metastases, more precisely of metastatic cancers when the biological element is a eukaryotic cell of the cancerous type.
  • the term “treat” means an amelioration or reversal of a specified disease or disorder or at least one discernible symptom.
  • the term “treating” may also refer to reducing or slowing the progression of the disease or disorder, or the onset of symptoms of that disease or disorder.
  • the term “treating” may correspond to the reduction or slowing down of the progression of an infection when the biological element is a prokaryotic cell or to the reduction or slowing down of the appearance of metastases, more precisely of metastatic cancers when the biological element is a eukaryotic cell of the cancerous type.
  • the microfluidic chip is preferably intended to be implanted in vivo in a subject.
  • the subject in the context of the present invention is a living being, preferably a mammal and more particularly human beings, children, men or women.
  • solid cancer or “solid tumor” we refer to an individualized mass of cancerous cells in any tissue such as the skin, mucous membranes, bones, or any other tissue present in the organs, that is i.e. carcinomas or endocarcinomas arising from epithelial cells such as skin, mucous membranes, glands and sarcomas arising from connective and supporting tissue cells such as bone, cartilage.
  • solid cancer or “solid tumor” refers to a carcinoma such as cancer of the breast, lungs, prostate, bladder, salivary glands, skin, intestine, colon-rectum, thyroid, cervix, endometrium and ovaries, lip-mouth-larynx cancer, kidney, liver, brain, testicles , pancreas, preferentially breast cancer.
  • solid tumors not being limiting.
  • chemoattractant compound refers to any compound capable of attracting a biological element by chemotaxis, preferably a cell expressing specific membrane receptors for this compound on its surface, said biological element moving according to the gradient of concentration of chemoattractant compound.
  • the chemoattractant compound is able to induce the displacement of one or more specific biological elements according to the concentration gradient of said compound by positive chemotaxis, the biological element moving towards the region where the concentration in chemoattractant compound is the highest.
  • the chemoattractant compound is said to be "capable of attracting" a specific biological element when it allows said element to move inside the microfluidic chip and in particular towards the reservoir of chemoattractant compound in which is the highest concentration of chemoattractant compound.
  • a person skilled in the art will know how to characterize the specific biological element of interest in order to choose the chemoattractant compound capable of attracting said element within the chip.
  • the chemoattractant compound is chosen according to the specific biological element of interest.
  • the chemoattractant compound is chosen according to the type of membrane receptors that this cell expresses.
  • the chemoattractant compound can be a cytokine, that is to say a polypeptide or a soluble protein synthesized by a cell and acting remotely on other cells to regulate the activity and function via membrane receptors, selected from chemokines, granulocyte and macrophage colony stimulating factors such as M-CSF, G-CSF, CSF-1, growth factors and transforming growth factors such as TGF alpha, TGF beta, EGF, betacellulin, amphiregulin, heregulin, HBEGF, FGF, VEGF, tumor necrosis factors such as NGF, TNF alpha, TNF beta, interferons such as IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN lambda and interleukins such as IL-1 to IL-38.
  • chemokines granulocyte and macrophage colony stimulating factors such as M-CSF, G-CSF, CSF-1
  • growth factors and transforming growth factors such as TGF alpha, TGF beta, E
  • the chemoattractant compound is chosen from chemokines, growth factors and transformation growth factors.
  • a chemokine is a small protein of 8 to 14 kilo daltons characterized by the presence of four cysteine residues in conserved positions allowing the formation of their three-dimensional structure. Chemokines can be classified into four subfamilies according to the spacing between two of their cysteines in the N-terminal position, one can in particular refer to the CXC or alpha family, that is to say whose first two cysteines are separated by any amino acid, the CC or beta family, the CX3C or delta family, the C or gamma family.
  • the chemokine in the context of the present invention can for example be chosen from the following chemokines: CXCL12, also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25 , CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1.
  • a growth factor is a low molecular weight protein (less than 30 kilo daltons) which stimulates cell multiplication and is recognized by specific membrane receptors which are most often tyrosine kinases.
  • the growth factor in the context of the present invention may for example be chosen from TGF alpha or beta (transforming growth factor alpha or beta), FGF (fibroblast growth factor alpha), EGF (epidermal growth factor), betacellulin amphiregulin, heregulin, HBEGF, VEGF (vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor).
  • TGF alpha or beta transforming growth factor alpha or beta
  • FGF fibroblast growth factor alpha
  • EGF epidermal growth factor
  • betacellulin amphiregulin heregulin
  • HBEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the chemoattractant compound can be a peptide carrying a formyl N group such as N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) or carbohydrate molecules such as glucose .
  • FMLP N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine
  • the chemoattractant compound is included in a matrix which is composed of a biocompatible material as defined in the present invention.
  • the biocompatible material of the matrix being chosen specifically according to the chemoattractant compound, the desired release profile as well as the context of use of the microfluidic chip.
  • external environment in the context of the present invention, reference is made to the tissues located around the microfluidic chip when the latter is implanted in vivo, more precisely to the tissues located directly in contact with the chip, up to 300 mm, preferably up to 150 mm, more preferably up to 100 mm around the chip.
  • resection of a solid tumour is meant the removal, ablation or even excision of a solid tumour, for example by surgery.
  • the present invention relates to a microfluidic chip capable of attracting and trapping a specific biological element in vivo.
  • the chip according to the invention allows passive destruction of the biological element trapped within the chip which, without the conditions necessary for its survival, ends up being destroyed.
  • a first object of the invention relates to a microfluidic chip capable of attracting and trapping a specific biological element, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising a chemoattractant compound capable of attracting the biological element
  • each microchannel is in the form of a harpoon comprising at least two arrows (4) spaced longitudinally from each other and directed towards the tank, in which each arrow comprises two branches (5) each having a free end (6) forming an acute angle comprised between 10° and 80°, and in which each arrow comprises two openings (7) communicating with a longitudinal part of the microchannel and having a width comprised between 5 p.m. and 30 p.m.
  • the present invention relates to a microfluidic chip intended to be implanted in vivo to attract and trap in order to ultimately destroy a specific biological element, preferably a eukaryotic cell, and more preferably a cancerous cell
  • the matrix of the reservoir comprising the chemoattractant compound is formed from a biocompatible material.
  • the chemoattractant compound included in the matrix of the reservoir makes it possible to attract in vivo the specific biological element within the chip by positive chemotaxis, the biological element migrating in the direction of the reservoir where the concentration of chemoattractant compound is the highest.
  • the network of microchannels it allows the passage by diffusion of the chemoattractant compound from the reservoir to the external environment of the chip as well as the passage of the specific biological element from the external environment of the chip to the interior of the chip. , towards the tank.
  • each microchannel making up the network of microchannels that is to say in the form of a harpoon comprising at least two arrows spaced longitudinally from each other and directed towards the reservoir, with each arrow comprising two branches each having a free end forming an acute angle of between 10° and 80°, and with each arrow comprising two openings communicating with a longitudinal part of the microchannel and having a width of between 5 ⁇ m and 30 ⁇ m, allows the passage of the biological element from the external environment within the microfluidic chip towards the reservoir while preventing the passage of the biological element present in said chip towards the external environment.
  • the network of microchannels implemented in the chip according to the invention advantageously makes it possible to trap the biological element present in the chip but also to destroy it passively since said element trapped within the chip does not have the necessary conditions to his survival.
  • the biological element attracted and trapped in the microfluidic chip is a prokaryotic or eukaryotic cell
  • the cell in the absence of the conditions necessary for its survival, the cell will be destroyed, in particular by apoptosis after a few hours to a few days. .
  • the cellular debris or apoptotic bodies emerge from the chip via the network of microchannels and are rejected into the external environment.
  • the microfluidic chip allows passive destruction of the biological element not requiring the implementation of one or more electrodes and requiring no energy consumption.
  • the operating capacity of the chip is continuously renewed thanks to the passive destruction of the biological element trapped within the chip and also thanks to its passive rejection towards the external environment.
  • the dimensions and the geometry of the microchannels implemented in the chip according to the invention are particularly suitable for allowing the movement of eukaryotic cells which need a support to migrate in particular by projecting their membranes towards forward and forming an actin-rich structure called lamellipodia.
  • the dimensions and the geometry of the microchannels implemented in the chip according to the invention advantageously participate in the release profile of the chemoattractant compound towards the external environment, in particular by creating a hydrodynamic resistance which limits the diffusion of the chemoattractant compound towards the outside. and contributes to the creation and maintenance of a chemoattractant compound gradient.
  • the dimensions and the geometry of the microchannels implemented in the chip according to the invention make it possible to ensure the unidirectional passage of a specific biological element within the chip from the external environment towards the reservoir of chemoattractant compound, allowing thereby trapping the element within the chip.
  • each microchannel comprises between 2 and 6 arrows, preferably between 3 and 5 arrows and even more preferably 3 arrows.
  • each free end of an arrow forms an angle of between 10° and 60°, preferably between 10° and 45°, more preferably between 10° and 30°, more preferably an angle of 20°.
  • the two openings present on each arrow and communicating with the longitudinal part of the microchannel have a width of between 10 ⁇ m and 20 ⁇ m, preferably between 10 ⁇ m and 15 ⁇ m, even more preferably 10 ⁇ m.
  • the two openings present on each arrow and communicating with the longitudinal part of the microchannel have a width of less than 10 ⁇ m.
  • This embodiment advantageously makes it possible to improve the ability of the chip to specifically target and attract cancerous cells which are the only eukaryotic cells able to invaginate so as to be able to pass said openings.
  • the two openings present on each arrow are located on the longitudinal axis of the microchannel and communicate with the longitudinal part of said microchannel.
  • each arrow comprises a first so-called “entrance” opening arranged at the entrance of the arrow and through which the biological element enters and a second so-called “exit” opening through which the biological element leaves in the direction of the reservoir comprising the chemoattractant compound.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which each arrow (4) comprises a first opening through which the biological element enters and a second opening through which the biological element exits in the direction of the reservoir comprising the chemoattractant compound.
  • each of the branches of the same arrow is symmetrical to the other branch along the longitudinal axis of the microchannel.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object, in which the free end (6) of each branch (5) is separated from the other by a distance of between 30 and 200 ⁇ m.
  • the free end (6) of each branch (5) is separated from the other by a distance of between 50 and 100 ⁇ m, more preferably by a distance of between 50 and 70 ⁇ m.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which each arrow (4) is spaced longitudinally from the next by a distance of between 10 and 100 ⁇ m, preferably between 10 and 30 ⁇ m.
  • each arrow (4) comprises a first opening through which the biological element enters and a second opening through which the biological element exits in the direction of the reservoir (1) and in which the second opening of an arrow is spaced longitudinally from the first opening of the next arrow by a distance of between 10 and 100 ⁇ m, preferably between 10 and 30 ⁇ m.
  • the length formed by all of the arrows included on the same microchannel and the longitudinal space between each of them is between 100 ⁇ m and 500 ⁇ m, preferably between 200 ⁇ m and 250 ⁇ m.
  • each arrow (4) has a length of between 50 and 200 ⁇ m, preferably 50 ⁇ m, a height of between 10 and 50 ⁇ m, preferably 10 ⁇ m and a distance between each free end (6) of each branch (5) of between 30 and 200 ⁇ m, preferably 50 ⁇ m.
  • each arrow (4) has a length of 50 ⁇ m, a height of 10 ⁇ m and a distance between each free end (6) of each branch (5) of 50 ⁇ m.
  • all the arrows present on the same microchannel have the same dimensions.
  • each microchannel has a length of between 100 and 500 ⁇ m, preferably between 200 and 300 ⁇ m, a width of between 30 and 200 ⁇ m, preferably between 50 and 100 ⁇ m , a height of between 5 and 50 ⁇ m, preferably between 20 and 30 ⁇ m
  • each microchannel included in a network of microchannels is separated from the directly adjacent microchannel by a distance of between 50 and 400 ⁇ m, preferably between 100 and 200 ⁇ m.
  • microchannels making up the network of microchannels of the microfluidic chip according to the present invention can be of parallelepiped, cylindrical, cobblestone, frustoconical shape or a mixture of these shapes.
  • all the microchannels included in a network of microchannels have the same shape and the same dimensions.
  • each microchannel comprises 3 arrows, of which each free end (6) of an arrow (4) forms an angle of 20° and of which the two openings (7) present on each arrow present a width of between 10 ⁇ m and 20 ⁇ m.
  • the free end (6) of each branch (5) is separated from the other by a distance of between 50 and 100 ⁇ m.
  • each arrow (4) has a length of 50 ⁇ m, a height of 10 ⁇ m and a distance between each free end (6) of each branch (5) of 50 ⁇ m.
  • each arrow is separated longitudinally from the next by a distance of between 10 and 30 ⁇ m.
  • each microchannel has a length of between 100 and 500 ⁇ m, a width of between 30 and 200 ⁇ m, a height of 10 ⁇ m.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which said chip has no electrode between the reservoir (1) and the network of microchannels (2).
  • the absence of an electrode allows easier manufacture and implementation of the chip and also makes it possible to have a chip making it possible to attract, trap and ultimately destroy a biological element passively. specific.
  • the biological element is preferably a cancerous cell and in particular a cancerous cell originating from a cancer or from a solid tumour.
  • the migration of this cell inside the chip takes place by adhesion to the support on which the microchannel network is located.
  • the network of microchannels of the microfluidic chip according to the present invention is located on the outer edge of said chip, that is to say in contact with the external environment, thus ensuring communication between said environment and the interior space of the chip.
  • the chip according to the present invention can comprise several networks of microchannels, for example two networks of microchannels.
  • the microfluidic chip according to the first object of the invention comprises a lower part (8) and an upper part (9), the reservoir (1) comprising the matrix of chemoattractant compound and the network of microchannels (2) which can be understood independently from each other in the upper part (9) and/or the lower part (8) of said chip.
  • the microfluidic chip according to the first object of the invention comprises a lower part (8) comprising part of the reservoir (1), the network of microchannels (2) and an upper part (9) comprising a part of the tank (1) and able to be arranged on the lower part (8), the said parts being fixed together.
  • the microfluidic chip according to the present invention comprises a lower part (8) comprising part of the reservoir (1), and an upper part (9) comprising part of the reservoir (1) and the network of microchannels (2), said upper part being able to be arranged on the lower part (8), said parts being fixed to each other.
  • the upper part of the microfluidic chip is able to be placed on the lower part to form a cover, said parts being fixed together.
  • the reservoir comprised in the lower part and in the upper part corresponds to one and the same reservoir, part of which is located in the upper part of the chip and the other part is located in the lower part of the chip.
  • the term "upper part suitable for being placed on the lower part to form a lid” means the fact that the shape of the upper part is such that it adapts to that of the lower part. on which it rests without hindering the functionality of each element making up the lower part and makes it possible to form a cover closing the chip.
  • the upper and lower part of the microfluidic chip are rounded so that the chip can be implanted in vivo without damaging the tissues.
  • the chip is of rounded shape, with for example the upper and lower part having a half-oval or half-sphere shape so that when the upper part is placed on the lower part, the microfluidic chip is respectively of oval or spherical.
  • the size of the microfluidic chip according to the first object is suitable for implantation in vivo and is of the order of a few centimeters, preferably between 0.5 and 5 cm, more preferably between 1 and 3 cm, even more preferably of 1 cm. More particularly, the present invention relates to a microfluidic chip in which the reservoir (1) and the network of microchannels (2) are annular in shape and in which the reservoir is located at the center of the chip.
  • the ring shape corresponds to a ring shape.
  • This particular configuration makes it possible in particular to ensure a radial diffusion of the chemoattractant compound included in the reservoir towards the external environment and a homogeneous attraction of the biological element from said environment towards the reservoir, thanks to the central location of the reservoir as well as 'to the annular shape of the network of microchannels.
  • the lower part and the upper part of the microfluidic chip can be attached to each other by any physical or chemical means, suitable for in vivo use.
  • physical or chemical fixing means reference may be made respectively to a screw or to an adhesive suitable for in vivo use on the chip or even to a protruding element coming opposite a hollow element present in the lower and upper part to put them together.
  • the upper part comprises one or more openings through which one or more screws can be inserted and the lower part comprises one or more nuts adapted to receive said screw or screws.
  • the upper part of the microfluidic chip according to the invention comprises a central opening through which a screw (17) can be inserted and the lower part comprises a central nut able to receive said screw.
  • the annular reservoir is arranged around the central opening present on the upper part and the central nut present on the lower part of the chip.
  • the microfluidic chip comprises one or more seals (10) capable of sealing the chip, said seals being arranged between the lower part and the upper part above the network of microchannels.
  • seal capable of sealing the chip is understood here to mean the property of the seal not to allow any fluids that may be present in the external environment, such as blood, to enter within said chip and not to let it escape into the environment. outside the liquids and materials present inside said chip by a place other than by the network of microchannels.
  • the position of said joint(s) above the network of microchannels making it possible not to hinder the diffusion of the chemoattractant compound towards the external medium nor the passage of the specific cell present in said medium within the chip, in the direction of the reservoir.
  • the seals make it possible to create a support zone between the upper and lower part of the chip.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (9) and/or the lower part (8) comprise an annular cavity i) (8) capable of receiving the matrix comprising the chemoattractant compound, and an annular cavity ii) (10) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2), able to receive a liquid in which the chemoattractant compound is able to diffuse.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (6) and/or the lower part (5) comprise an annular cavity i) (11) capable of receiving the matrix comprising the chemoattractant compound via one or more openings (12) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity, and an annular cavity ii) (13) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2), capable of receiving a liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing, via one or more openings (14) communicating with the external medium (3) and opening into said cavity.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (9) and the lower part (8) comprise an annular cavity i) (11) able to receive the matrix comprising the chemoattractant compound via one or more openings (12) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity, and an annular cavity ii) (13) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2), capable of receiving a liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing, via one or more openings (14) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity.
  • the chemoattractant compound is added to the reservoir matrix before it is added to the annular cavity i).
  • the chemoattractant compound can be added to the annular cavity i) before or after the addition to this same cavity of the matrix forming the reservoir.
  • the matrix comprising the chemoattractant compound and the liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing are added respectively to the annular cavity i) and to the annular cavity ii) via said openings (12, 14) preferably after the upper part was arranged on the lower part.
  • the liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing is preferably an aqueous solution such as physiological serum or a physiological buffer solution such as an aqueous solution comprising a phosphate buffered saline (PBS).
  • a aqueous solution such as physiological serum
  • a physiological buffer solution such as an aqueous solution comprising a phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the annular cavity i) is included in the upper part and the lower part of the chip, the opening or openings opening into this cavity being in the lower part of the chip, and the annular cavity ii) as well as the the openings opening into this cavity are included in the upper part of the chip.
  • the chip according to the present invention is made of biocompatible material.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part, the lower part and the matrix comprising the chemoattractant compound are composed of a biocompatible material.
  • the upper part and the lower part as such as well as the elements which they comprise are made of a biocompatible material. More precisely still, the upper part, the lower part, the reservoir, in particular the matrix comprising the chemoattractant compound, the network of microchannels, and the gaskets are made of a biocompatible material.
  • biocompatible material or “biomaterial” we refer to a material having the ability not to interfere, not to degrade the biological environment in which it is used, even in direct or indirect, brief or prolonged contact with the internal tissues and fluids of the body of a human or animal.
  • biocompatible material that can be used in the context of the present invention, reference may be made in a non-exhaustive manner to glass, to ceramics such as alumina, zirconia, hydroxyapatite, to metals and metal alloys such as titanium, platinum, polymers of natural origin such as collagen, agarose, chitosan, carrageenan, xanthan and alginate or degradable synthetics such as polyesters and polyanhydrides or non-degradable such as polyurethanes , cellulose and its derivatives, vinyl polymers.
  • the polymers of synthetic origin are PEEK (polyetheretherketone) or PDMS (polydimethylsiloxane).
  • the upper part, the lower part and the network of microchannels are independently of one another, made of polymers of synthetic origin such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyetheretherketone (PEEK). More preferably, the upper part and the lower part are made of polyetheretherketone (PEEK).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PEEK polyetheretherketone
  • the network of microchannels is made of polyetheretherketone (PEEK).
  • PEEK polyetheretherketone
  • the reservoir and in particular the matrix comprising the chemoattractant compound is made of collagen and/or alginate, more preferably said reservoir, in particular said matrix, is made of alginate.
  • the upper part, the lower part and the network of microchannels of the chip according to the invention are made of polyetheretherketone (PEEK), the reservoir of chemoattractant compound is made of alginate.
  • PEEK polyetheretherketone
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the matrix comprising the chemoattractant compound is composed of a biocompatible material, preferably a crosslinked polymer.
  • the crosslinked polymer making up the matrix is a polymer of natural origin and in particular collagen and/or alginate, preferably alginate.
  • the crosslinking of a polymer corresponds to the formation of one or more three-dimensional networks from linear or branched polymers, by chemical and/or physical means.
  • a person skilled in the art knows how to induce crosslinking of the polymers according to the polymers considered, for example the crosslinking can be carried out by heating and/or by the use of a crosslinking agent.
  • a so-called “cross-linked” polymer is a polymer in which some of its chains are interconnected by strong or weak bonds.
  • collagen can be cross-linked by the use of cross-linking agents such as ammonia gas, oxidized sugars or aldehydes at room temperature and alginate can be cross-linked in a calcium chloride bath at ambient temperature.
  • cross-linking agents such as ammonia gas, oxidized sugars or aldehydes at room temperature
  • alginate can be cross-linked in a calcium chloride bath at ambient temperature.
  • the biocompatible material making up the matrix comprising the chemoattractant compound is crosslinked alginate in a bath of calcium chloride, preferably at room temperature.
  • the crosslinking of the biocompatible material making up the matrix comprising the chemoattractant compound advantageously allows prolonged release of this compound.
  • sustained release refers to controlled and continuous release kinetics of the chemoattractant compound over a period of time.
  • the release of the chemoattractant compound takes place between 3 days and 6 months, preferably between 15 days and 3 months.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the mass percentage of chemoattractant compound/reservoir matrix (1) is between 0.1 and 20%, preferably between 0.5 and 10% and more preferably between 0.5 and 5%.
  • a person skilled in the art will know how to determine the content of the chemoattractant compound in the reservoir depending on the context of use of the chip, the specific biological element of interest, the duration of release of the desired chemoattractant compound and the biomaterial making up the chip. reservoir matrix.
  • the chemoattractant compound included in the reservoir of the microfluidic chip and in particular in the matrix of the reservoir is preferably chosen from chemokines such as CXCL12, also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, growth factors and transformation growth factors such as TGF alpha or beta (transforming growth factor alpha or beta), FGF (fibroblast growth factor alpha), EGF (epidermal growth factor alpha), betacellulin, amphiregulin, heregulin, HBEGF, PDGF (factor growth factor-derivative), VEGF (vascular endothelial growth factor).
  • CXCL12 also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1)
  • CCL5 stromal cell-derived factor 1
  • CCL5 stromal cell-derived factor 1
  • CCL5 stromal cell
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the chemoattractant compound included in the reservoir of the chip is chosen from at least one of following compounds: CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
  • the chemoattractant compound included in the reservoir of the chip is chosen from at least one of following compounds: CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
  • the chemoattractant included in the reservoir of the microfluidic chip and in particular in the matrix of the reservoir is preferably chosen from carbohydrate molecules.
  • the chemoattractant compound can be used alone or in combination with one or more other chemoattractant compounds mentioned above and / or with other compounds capable of directly or indirectly improving the ability of said chemoattractant compound to attract a specific biological element, such as a cell eukaryote and in particular a cancer cell such as carbohydrate molecules (glucose) and / or lipid molecules (fatty acids) which provide the necessary energy (energy provided in the form of ATP after degradation of glucose or fatty acids) to the survival of the biological element, in particular of a eukaryotic cell and in particular of a cancerous cell.
  • Other molecules such as oxygen can be used in combination with chemoattractants.
  • Oxygen can be transported by hemoglobin or by synthetic hemoglobins. Oxygen is an essential molecule for the survival and proliferation of cells, especially cancer cells.
  • the chemoattractant compound is used in combination with one or more carbohydrate (glucose) and/or lipid (fatty acid) molecules.
  • chemoattractant compound(s) A person skilled in the art will take care to choose the chemoattractant compound(s) according to the specific biological element targeted.
  • the biological element is a eukaryotic cell
  • an analysis of the membrane receptors expressed by the targeted cell must be carried out upstream in order to ensure the specificity of the chemoattractant compound(s) chosen.
  • the specific biological element is a cancer cell expressing the transmembrane receptor CXCR4 such as for example a breast cancer cell, in particular a human breast cancer cell
  • the chemoattractant compound chosen is stromal cell-derived factor 1 (SDF-1).
  • the chosen chemoattractant compound is epidermal growth factor (EGF) or transforming growth factor alpha (TGF alpha).
  • a second object of the invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention to attract and trap a specific biological element.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or a method for attracting and trapping a specific biological element in vivo, said chip being implanted in vivo. More specifically, the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or a method for treating or preventing the proliferation and dissemination of a specific biological element in a subject, such as a prokaryotic cell or eukaryote in which the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or a method for treating or preventing an infection caused by a prokaryotic cell such as a bacterium in which the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or a method for treating or preventing the proliferation and dissemination of a eukaryotic cell and in particular of a cancerous cell. , preferably after resection of a solid tumor in a subject, wherein the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or a method for preventing the risks of local recurrence of cancer and/or development of metastatic cancer in a subject, wherein the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the microfluidic chip is implanted at a distance of 0.1 to 20 cm, preferably from 1 to 10 cm, more preferably at a distance of 5 cm from the resection zone of a solid tumor or focus of bacterial infection in a subject.
  • the microfluidic chip is preferably implanted at the level of the resection zone as soon as the solid tumor is removed, preferably immediately after the resection of said tumor.
  • the microfluidic chip can be used alone or combined with the simultaneous or sequential administration of other medicinal compounds such as anticancer compounds, in particular chemotherapeutic and/or hormone therapy compounds and/or immunotherapy and/or targeted therapy and/or radiotherapy when the specific biological element is a cancerous cell.
  • other medicinal compounds such as anticancer compounds, in particular chemotherapeutic and/or hormone therapy compounds and/or immunotherapy and/or targeted therapy and/or radiotherapy when the specific biological element is a cancerous cell.
  • the present invention also relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for attracting and destroying a specific biological element in vivo, said chip being implanted in vivo, in accordance with the aforementioned implementation conditions.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for treating or preventing the proliferation and dissemination of a biological element specific in a subject, such as a prokaryotic or eukaryotic cell, in which the chip is implanted in vivo in a subject in accordance with the aforementioned implementation conditions.
  • a biological element specific in a subject such as a prokaryotic or eukaryotic cell
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for treating or preventing an infection caused by a prokaryotic cell such as a bacterium, in which the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for treating or preventing the proliferation and dissemination of a eukaryotic cell and in particular of a cancerous cell, preferably after the resection of a a solid tumor in a subject, wherein the chip is implanted in vivo in a subject in accordance with the aforementioned implementation conditions.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use to prevent the risks of local recurrence of cancer and/or development of metastatic cancer in a subject, in which the chip is implanted in vivo in a subject in accordance with the aforementioned conditions of implementation.
  • the duration of use of the microfluidic chip in vivo can be between 2 and 12 months. Following this period of use, a new chip can be implanted.
  • the specific biological element is a eukaryotic cell and in particular a cancerous cell
  • said cell preferably comes from breast, lung, prostate, bladder, salivary glands, skin, intestine, colon-rectum, thyroid, cervix, endometrium and ovaries, lip-mouth-larynx cancer, kidney, liver, brain, testicles, pancreas, preferentially breast cancer.
  • solid tumors not being limiting.
  • Example 1 Manufacture of the microfluidic chip for the in vitro concept study
  • a microfluidic chip containing in its center a reservoir in which is placed a chemoattractant with a network of microchannels in the form of harpoons, in accordance with the present invention was manufactured.
  • a) Fabrication of the MicroChemicals SU-8 Photosensitive Epoxy Resin Mold A silicon plate (diameter 76.2 mm) is prepared in a “piranha” solution followed by dehumidification for 15 to 150°C. The SU-8 resin is deposited on the silicon plate by centrifugal coating (3000 rpm, 30s) in order to obtain the desired thickness (10pm or lOOpm depending on the type used SU-8 2010 or SU-8 2100) .
  • the evaporation of the solvents is obtained with very light heating and cooling ramps in order to minimize the mechanical stress in the resin (5°C/min).
  • the sample is subjected to 365 nm UV exposure of 125 mJ/cm2 for a thickness of 10 ⁇ m, and 250 mJ/cm2 for a thickness of 100 ⁇ m.
  • the plate is then subjected to a post exposure bake (PEB) (4 min at 95° C. for a thickness of 10 ⁇ m and 30 min at 95° C. for a thickness of 100 ⁇ m).
  • PEB post exposure bake
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) silicone polymer is prepared by mixing it with its curing agent (SylgardTM184 silicone elastomer kit from Dow, ratio 1:10). The bubbles formed during mixing are eliminated using a desiccator and a vacuum pump. Once the PDMS has been degassed, it is poured onto the SU-8 mold placed in a Petri dish, then placed in an oven at 80°C for at least 2 hours in order to complete the crosslinking process.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the PDMS is peeled off then cut using a circular blade in order to obtain the cylindrical shapes of the devices. These are then pierced using a punch to form the central well which will contain the chemoattractants.
  • the final step is to bond the PDMS to a glass substrate to encapsulate the channels. This is obtained by activating the surface to transform the Si-CH 3 function of the PDMS into Si-OH using a plasma 0 2 or air generator. In contact with the glass (Si0 2 ), a permanent Si-O-Si covalent bond will be created.
  • a 3% (w/v) aqueous alginate solution was deposited in a porous mold having the shape of the reservoir of the chip.
  • the mold is immersed in a calcium chloride crosslinking bath for 24 hours. After 3 washes with miliQ water, the matrix is frozen at -20° C. and then freeze-dried.
  • the matrix is gently deposited in the chip.
  • the microfluidic chip was implemented in vitro to test its ability to attract MDA-MB-231 breast cancer cells, which are epithelial cells from breast tumors.
  • the compound SDF-1 "stromal cell-derived factor" corresponds to the chemoattractant compound capable of attracting MDA-MB-231 cells.
  • the MDA-MB-231 cells stably transfected with the “green fluorescent protein” (GFP) are trypsinized on D0. Then 20,000 cells are seeded in a 35 mm petri dish containing the in vitro microfluidic chip in its center. The cells are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) 1% fetal calf serum (FCS)+1% antibiotic (streptomycin, penicillin) medium.
  • DMEM F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12
  • FCS fetal calf serum
  • antibiotic streptomycin, penicillin
  • the central reservoir of the in vitro microfluidic chip is loaded either with 50 pL of DMEM F12 + 1% FCS (fetal calf serum) + 1% of antibiotic (streptomycin, penicillin) (negative control) or with 50 pL of SDF- 1 alpha at 100 ng/ml in 0.1% BSA in DMEM F12 + + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin).
  • DMEM F12 + 1% FCS fetal calf serum
  • antibiotic streptomycin, penicillin
  • SDF- 1 alpha 100 ng/ml in 0.1% BSA in DMEM F12 + + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin).
  • the cells move from the outside towards the inside of the chip and in particular towards the central reservoir in the presence of the chemoattractant SDF-1 alpha.
  • the chemoattractant SDF-1 alpha On the 7th day in the chip containing the chemoattractant, there are 850 cells in the chip, distributed throughout the chip and in particular in the central reservoir.
  • the 7th day in the chip not containing the chemoattractant that is to say the negative control chip, there are 154 cells in the chip, exclusively located at the outlet of the microchannels inside the chip.
  • an in vitro microfluidic chip equipped with harpoon microchannels containing in its reservoir the chemoattractant SDF-1 alpha at 100 ng/ml, is placed in an incubator under an inverted microscope equipped with a 10X objective and a camera allowing cell monitoring after 5 to 6 days of culture.
  • the number of cells having crossed the chip after 5 to 6 days of culture on a portion of the chip corresponding to 7 microchannels was quantified as well as the number of cells leaving the chip after 5 to 6 days of culture. This number was later extrapolated to 200 microchannels, corresponding to the average number of microchannels present in the network of microchannels of a chip according to the invention.

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Abstract

Puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique spécifique La présente invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et piéger un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant : - un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique - au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1), caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches (4) espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches (5) ayant chacune une extrémité libre (6) formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures (7) communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 µm et 30 µm.

Description

Description
Titre de l'invention : Puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique spécifique
Domaine Technique
La présente demande concerne le domaine des dispositifs microfluidiques aptes à attirer et à piéger un élément biologique spécifique. Plus précisément, la présente demande concerne une puce microfluidique apte à attirer et à piéger in vivo un élément biologique spécifique, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote.
Technique antérieure
Chaque année en France environ 400 000 nouveaux cas de cancers sont identifiés avec environ 150 000 décès.
Il existe différents types de cancers en fonction du tissu dans lequel ils se développent. On peut ainsi distinguer les tumeurs solides qui se caractérisent par un amas localisé de cellules cancéreuses et les tumeurs des cellules sanguines, qui sont diffuses et dont les cellules cancéreuses circulent dans la moelle osseuse ou le sang. Les tumeurs des cellules sanguines aussi appelées cancers hématopoïétiques sont des cancers affectant le sang ou les organes lymphoïdes, tels que les leucémies et les lymphomes.
Pour ce qui est des tumeurs solides on distingue les carcinomes et les adénocarcinomes, cancers issus d'un tissu épithélial. On distingue également les sarcomes qui correspondent à des cellules cancéreuses apparaissant dans un tissu dit de support on parle alors d'ostéosarcome pour les os, de liposarcome pour la graisse ou encore de myosarcome pour les muscles.
Chez les hommes comme chez les femmes, les cancers solides représentent 90 % des cancers, avec les cancers de la prostate, du poumon et du colon-rectum représentant les trois cancers les plus fréquents chez les hommes et les cancers du sein, du colon-rectum et du poumon représentant les trois cancers les plus fréquents chez les femmes. Bien que la mortalité par cancer ait diminué de 1,5 % par an chez les hommes et de 1 % par an chez les femmes entre 1980 et 2012 (taux standardisés), il reste nécessaire de disposer de solutions efficaces pour traiter et prévenir ces tumeurs solides ainsi que leurs complications.
A ce jour, la chirurgie est l'un des traitements principaux d'une tumeur solide et correspond à la résection de la totalité de la tumeur lorsque cela est possible et éventuellement des tissus situés autour de la tumeur dite marge de résection. La chirurgie peut être utilisée en traitement unique lorsque la tumeur est très localisée, notamment lorsque la tumeur est à un stade précoce mais elle est souvent associée à d'autres traitements tels que la radiothérapie qui est aussi un traitement local et / ou à des traitements médicaux comme la chimiothérapie qui est un traitement systémique agissant potentiellement sur toutes les cellules cancéreuses du corps.
L'avantage de la chirurgie locale pour le traitement d'une tumeur solide est la possibilité de retirer la totalité de la tumeur lorsque cela est possible et de préserver les organes et les structures anatomiques non atteints par les cellules cancéreuses. Elle permet également de limiter les effets secondaires attribués au traitement par radiothérapie tels que les brûlures, ou la génération de cancers radio-induits, et à la chimiothérapie tels que les réactions cutanées, les nausées, vomissements, diarrhées, douleurs musculaires, fatigue, chute des cheveux ainsi que les cancers chimio-induits.
Afin de diminuer le taux de rechute la zone de résection inclut une zone de tissus sains présents autour de la tumeur, qui correspond à la marge de résection. A ce stade, plusieurs cas de figures doivent être considérés. Dans un premier cas de figure, les cellules tumorales de la tumeur primaire sont inclues dans la zone de résection et il n'y aura pas de récidive. Dans un second cas de figure, certaines cellules tumorales sont localisées au-delà de la zone de résection soit au niveau local soit à distance et alors une récidive est envisageable soit localement ou à distance pour former des métastases, c'est-à-dire des colonies secondaires de cellules cancéreuses qui se propagent à distance de l'organe atteint par la tumeur initiale et qui sont à l'origine d'un cancer dit « métastatique» dans un organe autre que celui dans lequel se trouvait la tumeur solide.
Il est donc nécessaire de prévenir au mieux les risques de récidive locale et de cancer métastatique après la résection d'une tumeur solide.
La chimiothérapie peut être utilisée après la chirurgie locale visant la résection de la tumeur, on parle de « chimiothérapie adjuvante » afin de prévenir la récidive et / ou la formation d'un cancer métastatique. Cependant, tel qu'indiqué précédemment, de très nombreux effets secondaires sont engendrés par ce traitement médicamenteux. Parmi les effets secondaires les plus considérables liés à l'utilisation de la chimiothérapie on peut en particulier faire référence aux cancers chimio-induits qui par définition correspondent aux nouvelles tumeurs survenant chez des patients traités par des drogues cytotoxiques pour une première tumeur maligne et causées par celles-ci, on peut également faire référence au risque de générer une résistance des cellules cancéreuses au traitement chimiothérapeutique limitant ainsi fortement les possibilités d'éliminer lesdites cellules.
Il existe un besoin de disposer d'une solution permettant d'éliminer efficacement les cellules cancéreuses restantes après la résection d'une tumeur solide afin de prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique, qui soit efficace et ne présente pas d'effets secondaires médicamenteux à court et moyen terme.
Des dispositifs microfluidiques ont été décrits dans l'art antérieur pour leur utilisation dans le domaine du traitement du cancer. On peut notamment faire référence au document WO2018/089989 Al qui décrit un dispositif ex vivo pour le traitement du cancer en soumettant un fluide biologique tel que le sang à rayonnement électromagnétique spécifique du type de cellule cancéreuse ciblée et apte à la détruire.
On peut également faire référence au document US2018111124 Al qui décrit un dispositif microfluidique comprenant un ou plusieurs canaux microfluidiques et un ou plusieurs réseaux d'électrodes bipolaires sans fil permettant une capture à haut débit des cellules tumorales circulantes dans une solution ionique conductrice, en appliquant un champ électrique alternatif de 40 kHz à un échantillon biologique. Les cellules ainsi capturées peuvent être utilisées pour diagnostiquer un cancer ou évaluer l'effet d'un traitement anticancéreux. Aucun document de l'art antérieur ne décrit ou ne suggère une puce microfluidique pour attirer et détruire, de préférence in vivo, un élément biologique et en particulier une cellule cancéreuse après la résection d'une tumeur solide et ainsi prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique, dont la fabrication est simple et peu coûteuse, qui est efficace et qui est facile à mettre en oeuvre in vivo pour une application clinique.
Pour répondre à ce besoin, la présente invention propose une puce microfluidique apte à attirer, piéger et in fine détruire un élément biologique spécifique comprenant un réservoir constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique, au moins un réseau de microcanaux disposé entre le réservoir et le milieu extérieur de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir, caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches ayant chacune une extrémité libre formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.
Exposé de l'invention
La présente invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et piéger un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :
- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique
- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1), caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches ayant chacune une extrémité libre formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.
Brève description des dessins
[Fig. 1] La figure 1 représente un réseau de microcanaux (2) faisant partie de la puce selon l'invention.
[Fig. 2] La figure 2 représente une vue au microscope électronique (grossissement X414) d'un réseau de microcanaux (2) faisant partie de la puce selon l'invention. On distingue les cellules (15) piégées au sein de la puce et les cellules (16) présentes au sein du milieu extérieur.
[Fig. 3] La figure 3 est une vue en coupe de la puce selon l'invention.
[Fig. 4] La figure 4 représente la partie supérieure (9) de la puce vue du dessus.
[Fig. 5] La figure 5 représente la partie inférieure (8) de la puce vue du dessus.
[Fig. 6] La figure 6 représente une vue éclatée du dessous de la puce selon l'invention.
[Fig. 7] La figure 7 représente une vue éclatée du dessus de la puce selon l'invention.
[Fig. 8] La figure 8 représente une vue en coupe de la puce selon l'invention à l'échelle 5 :0,5 cm.
[Fig. 9] La figure 9 représente une vue en coupe de la puce à l'échelle 5 :1 cm.
Description détaillée
Les Demandeurs ont mis au point une puce microfluidique pour attirer et piéger un élément biologique, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote. Cette puce microfluidique est particulièrement intéressante pour attirer et piéger une cellule cancéreuse in vivo après la résection d'une tumeur solide afin de prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique. La puce microfluidique mise au point par les Demandeurs est particulièrement avantageuse car elle permet d'attirer, de piéger et in fine de détruire un élément biologique sans nécessiter la mise en oeuvre d'une ou plusieurs électrodes. L'absence d'électrode permet notamment de fabriquer plus facilement la puce microfluidique, de limiter les coûts de production mais aussi de faciliter la mise en oeuvre de la puce microfluidique in vivo. En effet, la structure particulière des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention, permet le passage d'un élément biologique au sein de ladite puce, depuis le milieu extérieur en direction du réservoir constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique, tout en empêchant ledit élément biologique de ressortir de la puce en direction du milieu extérieur. Ainsi, la puce selon la présente invention permet non seulement d'attirer un élément biologique présent dans le milieu extérieur de la puce mais aussi de le piéger au sein de ladite puce et in fine de le détruire puisque l'élément biologique privé des ressources nécessaires à sa survie finit par être détruit.
Définitions
Une « puce microfluidique » est un dispositif comprenant un réseau de microcanaux, c'est-à dire des canaux de taille micrométrique, gravés ou moulés dans un matériau, connectés entre eux et reliant l'intérieur de la puce à l'extérieur de la puce par des entrées et des sorties percées à travers la puce, pour réaliser une fonction voulue. La puce microfluidique peut être obtenue par des procédés spécifiques tels que par déposition et électrodéposition, gravure, collage, moulage par injection, embossage, lithographie douce, soudure anodique, ou toutes autres technologies. Ces procédés de fabrication sont connus de l'Homme du métier. Dans le cadre de la présente invention, la fonction voulue de la puce microfluidique est de pouvoir attirer in vivo un élément biologique spécifique, de préférence une cellule eucaryote en particulier une cellule cancéreuse, et de le détruire in vivo.
Le « réseau de microcanaux» correspond à une multitude de canaux, reliés à l'extérieur de la puce par des entrées et des sorties percées à travers la puce. Les microcanaux peuvent par exemple être fabriqués à partir d'un moule, ou directement dans le matériau de la puce microfluidique. Le nombre de microcanaux varie en fonction du diamètre de la puce, de la largeur des microcanaux ou encore de l'espacement entre lesdits microcanaux.
Chaque microcanal composant le réseau de microcanaux correspond à un passage dont la hauteur peut être de quelques micromètres à quelques centaines de micromètres avec une longueur de quelques centaines de micromètres jusqu'à quelques millimètres. La largeur d'un microcanal correspond à la distance horizontale des deux points qui sont sur les bords opposés de la section transversale et qui sont les plus éloignés l'un de l'autre. La hauteur d'un microcanal correspond à la distance verticale des points situés sur les bords opposés de la section transversale et les plus éloignés les uns des autres. La longueur d'un microcanal est la distance entre les deux extrémités dudit canal, la longueur d'un microcanal correspond à la plus grande dimension. Les deux dimensions les plus courtes définissent généralement la section transversale susmentionnée. Par « microcanal sous la forme de harpon » au sens de la présente invention, on fait référence au fait que chaque microcanal faisant partie du réseau de microcanaux présente une forme longitudinale de type lance.
La puce microfluidique est de préférence « destinée à être implantée in vivo » c'est à dire que la puce microfluidique est destinée et apte à être implantée au sein d'un être vivant, de préférence un mammifère et en particulier un être humain. Plus particulièrement, cela signifie que la puce peut être implantée dans un être vivant sans interférer, ni dégrader les tissus avec lesquels elle est en contact et que ladite puce est apte à fonctionner in vivo c'est-à-dire attirer, piéger et détruire un élément biologique spécifique in vivo, de préférence une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, et de le détruire in vivo. Par « élément biologique » au sens de la présente invention on fait référence à tout élément comprenant de l'information génétique sous forme d'ARN ou d'ADN et susceptible de se trouver au sein d'un organisme vivant c'est-à-dire in vivo, tels que les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes et les microorganismes. Parmi les éléments biologiques envisageables on peut notamment faire référence à une cellule procaryote telle qu'une bactérie, à une cellule eucaryote telle qu'une cellule animale.
Par « élément biologique spécifique » ou « élément biologique cible » on fait référence à l'élément biologique d'intérêt dans le cadre de l'utilisation de la puce c'est-à-dire l'élément biologique que l'on souhaite attirer et détruire in vivo. Le composé chimioattractant présent dans le réservoir étant choisi pour attirer l'élément biologique d'intérêt dans le cadre de l'utilisation de la puce microfluidique.
De préférence dans le cadre de l'invention, l'élément biologique d'intérêt est une cellule procaryote ou eucaryote, de préférence encore l'élément biologique d'intérêt est une cellule eucaryote. De façon encore plus préférée, la cellule eucaryote est une cellule cancéreuse, de préférence une cellule cancéreuse métastatique.
Une « cellule cancéreuse » est une cellule dans laquelle une ou plusieurs lésions majeures de l'ADN se sont produites, transformant ainsi la cellule normale en cellule cancéreuse apte à proliférer pour former un groupe de cellules transformées identiques c'est-à-dire une tumeur. On fait notamment référence à une cellule cancéreuse lorsque la cellule considérée présente un certain nombre de caractéristiques telles qu'une indépendance vis-à-vis des signaux de régulation de la croissance cellulaire, une capacité à échapper au processus de mort cellulaire programmée ainsi qu'une capacité à se diviser indéfiniment.
Plus particulièrement dans le cadre de la présente invention, on fait référence par « cellule cancéreuse » à une cellule issue d'une tumeur solide dite initiale ou d'origine ou primaire, présente au niveau ou à proximité de la zone de résection de la tumeur solide.
De préférence dans le cadre de la présente invention, on fait également référence par « cellule cancéreuse » à une « cellule cancéreuse métastatique » c'est à dire une cellule cancéreuse, capable de ou ayant migré à travers le corps par la voie des vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de la tumeur d'origine et capable de ou ayant colonisé un ou plusieurs autres tissus à proximité ou à distance de ladite tumeur formant ainsi des métastases, à l'origine de « cancers métastatiques » ou encore « tumeurs métastatiques ». Dans ce cadre, la cellule cancéreuse est une cellule issue d'une tumeur solide dite secondaire ou tertiaire qui correspondent à des tumeurs métastatiques dans un second ou troisième tissu ou organe autre que celui de la tumeur initiale.
Il est fait référence à « élément biologique spécifique », « une cellule procaryote », « une cellule eucaryote », « une cellule cancéreuse », « une cellule métastatique» au singulier pour des raisons de clarté, étant entendu que la puce microfluidique selon la présente invention est apte à attirer et détruire in vivo plusieurs desdits éléments et cellules. Il est également bon de noter que la puce microfluidique selon la présente invention est apte à attirer et détruire in vivo plusieurs éléments biologiques spécifiques qui peuvent être de nature différente, lesdits éléments étant attirés au sein de la puce par le choix spécifique du ou des composés chimioattractants présents dans le réservoir.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « prévenir » désigne une réduction du risque d'acquisition d'une maladie ou d'un trouble spécifié, la réduction ou le ralentissement de l'apparition des symptômes de cette maladie. Par exemple dans le cadre de la présente invention, le terme « prévenir » peut correspondre à la réduction du risque de propagation d'une infection lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou à la réduction du risque de récidive locale du cancer et / ou du risque d'apparition de métastases, plus précisément de cancers métastatiques lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote de type cancéreuse.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter » désigne une amélioration ou l'inversion d'une maladie ou d'un trouble spécifié ou d'au moins un symptôme discernable. Le terme « traiter » peut aussi désigner la réduction ou le ralentissement de la progression de la maladie ou du trouble, ou de l'apparition des symptômes de cette maladie ou trouble. Par exemple dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter» peut correspondre à la réduction ou au ralentissement de la progression d'une infection lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou à la réduction ou le ralentissement d'apparition de métastases, plus précisément de cancers métastatiques lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote de type cancéreuse.
Au sens de la présente invention, la puce microfluidique est de préférence destinée à être implantée in vivo chez un sujet.
Le sujet dans le cadre de la présente invention est un être vivant, de préférence un mammifère et plus particulièrement les êtres humains, enfants, hommes ou femmes.
Par « cancer solide », ou « tumeur solide » on fait référence à une masse individualisée de cellules cancéreuses dans n'importe quel tissu tel que la peau, les muqueuses, les os, ou tout autre tissu présent dans les organes, c'est-à-dire aux carcinomes ou aux endocarcinomes issus de cellules épithéliales comme la peau, les muqueuses, les glandes et aux sarcomes issus de cellules des tissus conjonctifs et de soutien tels que l'os, le cartilage.
De préférence dans le cadre de la présente invention on fait référence par « cancer solide » ou « tumeur solide », à un carcinome tel que le cancer du sein, des poumons, de la prostate, de la vessie, des glandes salivaires, de la peau, de l'intestin, du côlon-rectum, de la thyroïde, du col de l'utérus, de l'endomètre et des ovaires, du cancer lèvre-bouche-larynx, du rein, du foie, du cerveau, des testicules, du pancréas, préférentiellement le cancer du sein. Ces exemples de tumeurs solides n'étant pas limitatifs.
Par « composé chimioattractant » on fait référence à tout composé apte à attirer par chimiotactisme un élément biologique, de préférence une cellule exprimant des récepteurs membranaires spécifiques de ce composé à sa surface, ledit élément biologique se déplaçant en fonction du gradient de concentration en composé chimioattractant. Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est apte à induire le déplacement d'un ou plusieurs éléments biologiques spécifiques en fonction du gradient de concentration dudit composé par chimiotactisme positif, l'élément biologique se déplaçant vers la région où la concentration en composé chimioattractant est la plus élevée.
En particulier dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est dit « apte à attirer » un élément biologique spécifique lorsqu'il permet le déplacement dudit élément à l'intérieur de la puce microfluidique et en particulier vers le réservoir de composé chimioattractant dans lequel se trouve la concentration la plus élevée en composé chimioattractant. L'Homme du métier saura caractériser l'élément biologique spécifique d'intérêt afin de choisir le composé chimioattractant apte à attirer ledit élément au sein de la puce.
Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est choisi en fonction de l'élément biologique spécifique d'intérêt.
Lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote, le composé chimioattractant est choisi en fonction du type de récepteurs membranaires que cette cellule exprime.
Plus précisément, lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote le composé chimioattractant peut être une cytokine c'est-à-dire un polypeptide ou une protéine soluble synthétisée par une cellule et agissant à distance sur d'autres cellules pour en réguler l'activité et la fonction par l'intermédiaire de récepteurs membranaires, choisie parmi les chimiokines, les facteurs stimulant les colonies de granulocytes et de macrophages tels que M-CSF, G-CSF, CSF-1, les facteurs de croissance et facteurs de croissance transformant tels que TGF alpha, TGF beta, EGF, bétacelluline, amphiréguline, héréguline, HBEGF, FGF, VEGF, les facteurs de nécrose tumorale tels que NGF, TNF alpha, TNF beta, les interférons tels que IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN lambda et les interleukines telles que IL-1 à IL-38.
De préférence lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, le composé chimioattractant est choisi parmi les chimiokines, les facteurs de croissance et les facteurs de croissance de transformation.
Une chimiokine est une petite protéine de 8 à 14 kilo daltons caractérisée par la présence de quatre résidus cystéine en des positions conservées permettant la formation de leur structure tridimensionnelle. Les chimiokines peuvent être classées en quatre sous-familles en fonction de l'espacement entre deux de leurs cystéines en position N-terminale, on peut notamment faire référence à la famille CXC ou alpha c'est à dire dont les deux premières cystéines sont séparées par un acide aminé quelconque, la famille CC ou beta, la famille CX3C ou delta, la famille C ou gamma. La chimiokine dans le cadre de la présente invention peut par exemple être choisie parmi les chimiokines suivantes : CXCL12, appelée également stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1. Un facteur de croissance est une protéine de faible poids moléculaire (inférieur à 30 kilo daltons) qui stimule la multiplication cellulaire et est reconnu par des récepteurs membranaires spécifiques qui sont le plus souvent des tyrosines kinases. Le facteur de croissance dans le cadre de la présente invention peut par exemple être choisi parmi TGF alpha ou beta (facteur de croissance transformant alpha ou beta), FGF (facteur de croissance du fibroblaste alpha), EGF (facteur de croissance épidermique), la bétacelluline l'amphiréguline, l'héréguline, HBEGF, VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire), PDGF (facteur de croissance plaquette-dérivé).
Lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote, telle qu'une bactérie, le composé chimioattractant peut être un peptide portant un groupe N formylé tel que le N-formylméthionyl- leucyl-phénylalanine (FMLP) ou encore des molécules glucidiques telles que le glucose.
Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est compris dans une matrice qui est composée d'un matériau biocompatible tel que défini dans la présente invention. Le matériau biocompatible de la matrice étant choisi spécifiquement en fonction du composé chimioattractant, du profil de libération souhaité ainsi que du contexte d'utilisation de la puce microfluidique.
Par « milieu extérieur» dans le cadre de la présente invention on fait référence aux tissus situés autour de la puce microfluidique lorsque celle-ci est implantée in vivo, plus précisément aux tissus situés directement au contact de la puce, jusqu'à 300 mm, de préférence jusqu'à 150 mm, de préférence encore jusqu'à 100 mm autour de la puce.
Par « résection d'une tumeur solide » on entend le retrait, l'ablation ou encore l'exérèse d'une tumeur solide par exemple par chirurgie.
Ainsi, la présente invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et à piéger in vivo un élément biologique spécifique. De façon avantageuse, la puce selon l'invention permet une destruction passive de l'élément biologique piégé au sein de la puce qui dépourvu des conditions nécessaires à sa survie fini par être détruit.
Les références numériques utilisées dans le cadre de la présente description détaillée de l'invention font référence aux figures de la présente demande ayant pour objectif d'illustrer l'invention sans pour autant s'y limiter.
Un premier objet de l'invention concerne une puce microfluidique apte à attirer et piéger un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :
- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique
- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1), caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches (4) espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches (5) ayant chacune une extrémité libre (6) formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures (7) communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.
De préférence, la présente invention concerne une puce microfluidique destinée à être implantée in vivo pour attirer et piéger pour in fine détruire un élément biologique spécifique, de préférence une cellule eucaryote, et de préférence encore une cellule cancéreuse
La matrice du réservoir comprenant le composé chimioattractant est formée d'un matériau biocompatible.
Le composé chimioattractant compris dans la matrice du réservoir permet d'attirer in vivo l'élément biologique spécifique au sein de la puce par chimiotactisme positif, l'élément biologique migrant en direction du réservoir où la concentration en composé chimioattractant est la plus élevée. Le réseau de microcanaux quant à lui, permet le passage par diffusion du composé chimioattractant depuis le réservoir vers le milieu extérieur de la puce ainsi que le passage de l'élément biologique spécifique depuis le milieu extérieur de la puce vers l'intérieur de la puce, en direction du réservoir. De façon avantageuse, la forme particulière de chaque microcanal composant le réseau de microcanaux, c'est- à-dire sous forme d'un harpon comprenant au moins deux flèches espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, avec chaque flèche comprenant deux branches ayant chacune une extrémité libre formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et avec chaque flèche comprenant deux ouvertures communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm, permet le passage de l'élément biologique depuis le milieu extérieur au sein de la puce microfluidique en direction du réservoir tout en empêchant le passage de l'élément biologique présent dans ladite puce en direction du milieu extérieur. Ainsi, le réseau de microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention permet avantageusement de piéger l'élément biologique présent dans la puce mais aussi de le détruire de façon passive puisque ledit élément piégé au sein de la puce est dépourvu des conditions nécessaires à sa survie.
En particulier, lorsque l'élément biologique attiré et piégé dans la puce microfluidique est une cellule procaryote ou eucaryote, en l'absence des conditions nécessaire à sa survie, la cellule va être détruite, notamment par apoptose au bout de quelques heures à quelques jours. Les débris cellulaires ou corps apoptotiques ressortent de la puce via le réseau de microcanaux et sont rejetés dans le milieu extérieur. Ainsi la puce microfluidique permet une destruction passive de l'élément biologique ne nécessitant pas la mise en oeuvre d'une ou plusieurs électrodes et ne nécessitant aucune consommation d'énergie. La capacité de fonctionnement de la puce est renouvelée en continu grâce à la destruction passive de l'élément biologique piégé au sein de la puce et grâce également à son rejet passif vers le milieu extérieur. Les dimensions et la géométrie des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention sont particulièrement adaptés pour permettre le déplacement de cellules eucaryotes qui ont besoin d'un support pour migrer notamment en projetant leurs membranes vers l'avant et en formant une structure riche en actine nommée lamellipode. De plus, les dimensions et la géométrie des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention participent avantageusement au profil de libération du composé chimioattractant vers le milieu extérieur notamment en créant une résistance hydrodynamique qui limite la diffusion du composé chimioattractant vers l'extérieur et contribue à la création et au maintien d'un gradient de composé chimioattractant. Enfin, les dimensions et la géométrie des microcanaux mis en oeuvre dans la puce selon l'invention permettent d'assurer le passage unidirectionnel d'un élément biologique spécifique au sein de la puce depuis le milieu extérieur en direction du réservoir de composé chimioattractant, permettant ainsi de piéger l'élément au sein de la puce.
Selon un aspect préféré chaque microcanal comprend entre 2 et 6 flèches, de préférence entre 3 et 5 flèches et de façon encore préférée 3 flèches.
Selon un autre aspect préféré, chaque extrémité libre d'une flèche forme un angle compris entre 10° et 60°, de préférence entre 10° et 45°, de préférence encore entre 10° et 30°, de façon encore préférée un angle de 20°.
Selon un autre aspect préféré, les deux ouvertures présentes sur chaque flèche et communiquant avec la partie longitudinale du microcanal, présentent une largeur comprise entre 10 pm et 20 pm, de préférence entre 10 pm et 15 pm, de façon encore préférée 10 pm.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les deux ouvertures présentes sur chaque flèche et communiquant avec la partie longitudinale du microcanal, présentent une largeur inférieure à 10 pm. Ce mode de réalisation permet avantageusement d'améliorer la capacité de la puce à cibler et à attirer spécifiquement les cellules cancéreuses qui sont les seules cellules eucaryotes à pouvoir s'invaginer de sorte à pouvoir passer lesdites ouvertures.
En particulier, dans la puce selon l'invention, les deux ouvertures présentes sur chaque flèche se trouvent sur l'axe longitudinal du microcanal et communiquent avec la partie longitudinale dudit microcanal.
Dans la puce microfluidique selon l'invention, chaque flèche comprend une première ouverture dite « d'entrée » disposée à l'entrée de la flèche et par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture dite de « sortie » par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir comprenant le composé chimioattractant. En d'autres termes la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) comprend une première ouverture par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir comprenant le composé chimioattractant. Dans la puce microfluidique selon l'invention, chacune des branches d'une même flèche est symétrique à l'autre branche selon l'axe longitudinal du microcanal.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet, dans laquelle l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 30 et 200 pm. De préférence, l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 50 et 100 pm, de préférence encore d'une distance comprise entre 50 et 70 pm.
Selon un autre aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) est espacée longitudinalement de la suivante par une distance comprise entre 10 et 100 pm, de préférence entre 10 et 30 pm.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) comprend une première ouverture par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir (1) et dans laquelle la deuxième ouverture d'une flèche est espacée longitudinalement de la première ouverture de la flèche suivante par une distance comprise entre 10 et 100 pm, de préférence entre 10 et 30 pm.
De préférence, la longueur formée par l'ensemble des flèches comprises sur un même microcanal et l'espace longitudinal entre chacune d'elles, est comprise entre 100 pm et 500 pm, de préférence entre 200 pm et 250 pm.
Selon un aspect encore particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque flèche (4) présente une longueur comprise entre 50 et 200 pm, de préférence 50 pm, une hauteur comprise entre 10 et 50 pm, de préférence 10 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) comprise entre 30 et 200 pm, de préférence 50 pm.
Selon un aspect préféré de l'invention, chaque flèche (4) présente une longueur de 50 pm, une hauteur de 10 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) de 50 pm. De préférence, toutes les flèches présentent sur un même microcanal, présentent les mêmes dimensions.
Selon un aspect encore particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle chaque microcanal présente une longueur comprise entre 100 et 500 pm, de préférence entre 200 et 300pm, une largeur comprise entre 30 et 200 pm, de préférence entre 50 et 100 pm, une hauteur comprise entre 5 et 50 pm, de préférence entre 20 et 30 pm De préférence, chaque microcanal compris dans un réseau de microcanaux est séparé du microcanal directement adjacent par une distance comprise entre 50 et 400pm, de préférence entre 100 et 200 pm.
Les microcanaux composant le réseau de microcanaux de la puce microfluidique selon la présente invention peuvent être de forme parallélépipédique, cylindrique, pavimenteuse, tronconique ou un mélange de ses formes.
De préférence, dans le cadre de la présente invention l'ensemble des microcanaux compris dans un réseau de microcanaux a la même forme et les mêmes dimensions.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, chaque microcanal comprend 3 flèches, dont chaque extrémité libre (6) d'une flèche (4) forme un angle de 20° et dont les deux ouvertures (7) présentes sur chaque flèche présentent une largeur comprise entre 10 pm et 20 pm. De préférence selon ce mode de réalisation, l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 50 et 100 pm. De préférence encore selon ce mode de réalisation, chaque flèche (4) présente une longueur de 50 pm, une hauteur de 10 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) de 50 pm.
De façon encore préférée selon ce mode de réalisation chaque flèche est séparée longitudinalement de la suivante par une distance comprise 10 et 30 pm.
De façon encore plus préférée selon ce mode de réalisation, chaque microcanal présente une longueur comprise entre 100 et 500 pm, une largeur comprise entre 30 et 200 pm, une hauteur de 10 pm.
En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle ladite puce est dépourvue d'électrode entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2).
De façon avantageuse, l'absence d'électrode permet une fabrication et une mise en oeuvre plus facile de la puce et permet également de disposer d'une puce permettant d'attirer, de piéger et in fine de détruire de façon passive un élément biologique spécifique.
Dans le cadre de la présente invention, l'élément biologique est de préférence une cellule cancéreuse et en particulier une cellule cancéreuse provenant d'un cancer ou d'une tumeur solide. La migration de cette cellule à l'intérieur de la puce s'effectue par adhérence au support sur lequel se trouvent le réseau de microcanaux.
De préférence, le réseau de microcanaux de la puce microfluidique selon la présente invention se situe sur la bordure externe de ladite puce c'est-à-dire au contact du milieu extérieur, assurant ainsi la communication entre ledit milieu et l'espace intérieur de la puce. La puce selon la présente invention peut comprendre plusieurs réseaux de microcanaux, par exemple deux réseaux de microcanaux.
La puce microfluidique selon le premier objet de l'invention comprend une partie inférieure (8) et une partie supérieure (9), le réservoir (1) comprenant la matrice de composé chimioattractant et le réseau de microcanaux (2) pouvant être compris indépendamment l'un de l'autre dans la partie supérieure (9) et / ou la partie inférieure (8) de ladite puce.
Selon un mode de réalisation particulier, la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention comprend une partie inférieure (8) comprenant une partie du réservoir (1), le réseau de microcanaux (2) et une partie supérieure (9) comprenant une partie du réservoir (1) et apte à être disposée sur la partie inférieure (8), lesdites parties étant fixées entre elles.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la puce microfluidique selon la présente invention comprend une partie inférieure (8) comprenant une partie du réservoir (1), et une partie supérieure (9) comprenant une partie du réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), ladite partie supérieure étant apte à être disposée sur la partie inférieure (8), lesdites parties étant fixées entre elles.
La partie supérieure de la puce microfluidique est apte à être disposée sur la partie inférieure pour former un couvercle, lesdites parties étant fixées entre elles. Le réservoir compris dans la partie inférieure et dans la partie supérieure correspond à un seul et même réservoir dont une partie se trouve dans la partie supérieure de la puce et l'autre partie se trouve dans la partie inférieure de la puce.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par partie supérieure « apte à être disposée sur la partie inférieure pour former un couvercle » le fait que la forme de la partie supérieure est telle qu'elle s'adapte à celle de la partie inférieure sur laquelle elle repose sans entraver la fonctionnalité de chaque élément composant la partie inférieure et permet de former un couvercle fermant la puce.
De façon avantageuse et préférée, la partie supérieure et inférieure de la puce microfluidique sont arrondies de manière à ce que la puce soit implantée in vivo sans endommager les tissus.
De préférence la puce est de forme arrondie, avec par exemple la partie supérieure et inférieure ayant une forme de demi-ovale ou de demi-sphère de sorte que lorsque la partie supérieure est disposée sur la partie inférieure, la puce microfluidique est respectivement de forme ovale ou sphérique.
La taille de la puce microfluidique selon le premier objet est adaptée à une implantation in vivo et est de l'ordre de quelques centimètres, de préférence entre 0,5 et 5 cm, de préférence encore entre 1 et 3 cm, de façon encore préférée de 1 cm. Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) sont de forme annulaire et dans laquelle le réservoir est situé au centre de la puce.
Comme son nom l'indique, la forme annulaire correspond à une forme d'anneau. Cette configuration particulière permet notamment d'assurer une diffusion radiale du composé chimioattractant compris dans le réservoir en direction du milieu extérieur et une attraction homogène de l'élément biologique à partir dudit milieu en direction du réservoir, grâce à la situation centrale du réservoir ainsi qu'à la forme annulaire du réseau de microcanaux. La partie inférieure et la partie supérieure de la puce microfluidique peuvent être fixées l'une à l'autre par n'importe quel moyen physique ou chimique, adapté à une utilisation in vivo. A titre d'exemple de moyen de fixation physique ou chimique on peut faire référence respectivement à une vis ou à une colle adaptées à une utilisation in vivo àe la puce ou encore à un élément proéminent venant au regard d'un élément creux présents dans la partie inférieure et supérieure pour les assembler.
De préférence dans le cadre de la présente invention, la partie supérieure comprend une ou plusieurs ouvertures par lesquelles une ou plusieurs vis peuvent être insérées et la partie inférieure comprend un ou plusieurs écrous aptes à recevoir ladite ou lesdites vis.
De façon encore préférée, la partie supérieure de la puce microfluidique selon l'invention comprend une ouverture centrale par laquelle une vis (17) est apte à être insérée et la partie inférieure comprend un écrou central apte à recevoir ladite vis. Dans ce mode de réalisation préféré, le réservoir annulaire est disposé autour de l'ouverture centrale présente sur la partie supérieure et de l'écrou central présent sur la partie inférieure de la puce.
En particulier, la puce microfluidique comprend un ou plusieurs joints (10) aptes à rendre la puce étanche, lesdits joints étant disposés entre la partie inférieure et la partie supérieure au-dessus du réseau de microcanaux.
On entend ici par « joint apte à rendre la puce étanche », la propriété du joint à ne pas laisser entrer au sein de ladite puce les fluides pouvant être présents dans le milieu extérieur tel que le sang et à ne pas laisser sortir dans le milieu extérieur les liquides et matériaux présents à l'intérieur de ladite puce par un autre endroit que par le réseau de microcanaux. La position du ou desdits joints au- dessus du réseau de microcanaux permettant de ne pas entraver la diffusion du composé chimioattractant vers le milieu extérieur ni le passage de la cellule spécifique présente dans ledit milieu au sein de la puce, en direction du réservoir. De façon avantageuse, les joints permettent de créer une zone d'appui entre la partie supérieure et inférieure de la puce.
En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (9) et / ou la partie inférieure (8) comprennent une cavité annulaire i) (8) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant, et une cavité annulaire ii) (10) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (6) et / ou la partie inférieure (5) comprennent une cavité annulaire i) (11) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (12) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (13) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (14) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité.
Plus particulièrement encore, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (9) et la partie inférieure (8) comprennent une cavité annulaire i) (11) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (12) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (13) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (14) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité.
De préférence le composé chimioattractant est ajouté à la matrice du réservoir avant son ajout dans la cavité annulaire i). Alternativement, le composé chimioattractant peut être ajouté dans la cavité annulaire i) avant ou après l'ajout dans cette même cavité de la matrice formant le réservoir.
La matrice comprenant le composé chimioattractant et le liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, sont ajoutés respectivement dans la cavité annulaire i) et dans la cavité annulaire ii) par l'intermédiaire desdites ouvertures (12, 14) de préférence après que la partie supérieure a été disposée sur la partie inférieure.
Le liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser est de préférence une solution aqueuse telle que du sérum physiologique ou une solution tampon physiologique telle qu'une solution aqueuse comprenant un tampon phosphate salin (PBS).
L'étanchéité de chacune des cavités après lesdits ajouts est assurée par l'obturation des ouvertures par l'intermédiaire de joints, par exemple en PDMS ou tout autre matériau adapté, lesdits joints étant situés à la sortie de ces ouvertures (12, 14) et communiquant avec le milieu extérieur.
De préférence, la cavité annulaire i) est comprise dans la partie supérieure et la partie inférieure de la puce, la ou les ouvertures débouchant dans cette cavité se trouvant dans la partie inférieure de la puce, et la cavité annulaire ii) ainsi que la ou les ouvertures débouchant dans cette cavité sont comprises dans la partie supérieure de la puce. La puce selon la présente invention est en matériau biocompatible. En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure, la partie inférieure et la matrice comprenant le composé chimioattractant sont composées d'un matériau biocompatible.
Plus précisément, la partie supérieure et la partie inférieure en tant que telles ainsi que les éléments qu'elles comprennent sont constitués d'un matériau biocompatible. Plus précisément encore, la partie supérieure, la partie inférieure, le réservoir notamment la matrice comprenant le composé de chimioattractant, le réseau de microcanaux, et les joints sont constitués d'un matériau biocompatible.
Par « matériau biocompatible » ou « biomatériau » on fait référence à un matériau ayant la capacité de ne pas interférer, de ne pas dégrader le milieu biologique dans lequel il est utilisé et ce, même en contact direct ou indirect, bref ou prolongé avec les tissus et fluides internes du corps d'un être humain ou d'un animal. A titre d'exemple de matériau biocompatible utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut faire référence de façon non exhaustive au verre, aux céramiques telles que l'alumine, la zircone, l'hydroxyapatite, aux métaux et alliages métalliques tels que le titane, la platine, aux polymères d'origine naturelle tels que le collagène, l'agarose, le chitosan, le carraghénane, le xanthane et l'alginate ou synthétique dégradables tels que les polyesters et polyanhyd rides ou non dégradables tels que les polyuréthanes, la cellulose et ses dérivés, les polymères vinyliques. De préférence dans le cadre de la présente invention les polymères d'origine synthétiques sont le PEEK (polyétheréthercétone) ou le PDMS (polydiméthylsiloxane).
De préférence, la partie supérieure, la partie inférieure et le réseau de microcanaux sont indépendamment l'un de l'autre, en polymères d'origine synthétique tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) ou le polyétheréthercétone (PEEK). De préférence encore, la partie supérieure et la partie inférieure sont en polyétheréthercétone (PEEK).
De préférence, le réseau de microcanaux est en polyétheréthercétone (PEEK).
De préférence, le réservoir et en particulier la matrice comprenant le composé chimioattractant est en collagène et / ou en alginate, de préférence encore ledit réservoir, en particulier ladite matrice est en alginate.
De façon particulière et préférée, la partie supérieure, la partie inférieure et le réseau de microcanaux de la puce selon l'invention sont en polyétheréthercétone (PEEK), le réservoir de composé chimioattractant est en alginate.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la matrice comprenant le composé chimioattractant est composée d'un matériau biocompatible, de préférence un polymère réticulé. De préférence, le polymère réticulé composant la matrice est un polymère d'origine naturelle et en particulier le collagène et / ou en alginate, de préférence en alginate. La réticulation d'un polymère correspond à la formation d'un ou de plusieurs réseaux tridimensionnels à partir de polymères linéaires ou ramifiés, par voie chimique et / ou physique. L'Homme du métier sait comment induire une réticulation des polymères selon les polymères considérés, à titre d'exemple la réticulation peut être effectuée par chauffage et/ou par l'utilisation d'agent de réticulation. Un polymère dit « réticulé » est un polymère dont certaines de ses chaînes sont reliées entre elles par des liaisons fortes ou faibles.
A titre d'exemple, le collagène peut être réticulé par l'utilisation d'agents réticulants tels que l'ammoniac gazeux, des sucres oxydés ou des aldéhydes à température ambiante et l'alginate peut être réticulé dans un bain de chlorure de calcium à température ambiante.
De préférence encore, le matériau biocompatible composant la matrice comprenant le composé chimioattractant est en alginate réticulé dans un bain de chlorure de calcium de préférence à température ambiante.
La réticulation du matériau biocompatible composant la matrice comprenant le composé chimioattractant permet avantageusement une libération prolongée de ce composé. Par « libération prolongée » on fait référence à une cinétique de libération du composé chimioattractant contrôlée et continue sur une période de temps. De préférence dans le cadre de la présente invention, la libération du composé chimioattractant s'effectue entre 3 jours et 6 mois, de préférence entre 15 jours et 3 mois.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le pourcentage massique composé chimioattractant / matrice du réservoir (1) est compris entre 0,1 et 20 %, de préférence entre 0,5 et 10 % et de préférence encore entre 0,5 et 5%.
L'Homme du métier saura déterminer la teneur du réservoir en composé chimioattractant en fonction du contexte de l'utilisation de la puce, de l'élément biologique spécifique d'intérêt, de la durée de libération du composé chimioattractant souhaitée et du biomatériau composant la matrice du réservoir.
Lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote, de préférence une cellule cancéreuse, le composé chimioattractant compris dans le réservoir de la puce microfluidique et en particulier dans la matrice du réservoir, est de préférence choisi parmi les chimiokines telles que CXCL12, appelée également stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, les facteurs de croissance et les facteurs de croissance de transformation tels que TGF alpha ou beta (facteur de croissance transformant alpha ou beta), FGF (facteur de croissance du fibroblaste alpha), EGF (facteur de croissance épidermique alpha), la bétacelluline, l'amphiréguline, l'héréguline, HBEGF, PDGF (facteur de croissance plaquette-dérivé), VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire).
Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le composé chimioattractant compris dans le réservoir de la puce, est choisi parmi au moins un des composés suivants : CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
Selon un autre aspect, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule procaryote, de préférence une bactérie, le chimioattractant compris dans le réservoir de la puce microfluidique et en particulier dans la matrice du réservoir, est de préférence choisi parmi les molécules glucidiques.
Le composé chimioattractant peut être utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres composés chimioattractants susmentionnés et / ou avec d'autres composés aptes à améliorer directement ou indirectement l'aptitude dudit composé chimioattractant à attirer un élément biologique spécifique, tel qu'une cellule eucaryote et en particulier une cellule cancéreuse comme par exemple des molécules glucidiques (glucose) et / ou lipidiques (acides gras) qui permettent d'apporter l'énergie nécessaire (énergie apportées sous forme d'ATP après dégradation du glucose ou des acides gras) à la survie de l'élément biologique, notamment d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse. D'autres molécules comme l'oxygène peuvent être utilisées en association avec les chimioattractants. L'oxygène peut être transporté par l'hémoglobine ou par des hémoglobines synthétiques. L'oxygène est une molécule indispensable à la survie et prolifération des cellules et notamment des cellules cancéreuses. De préférence le composé chimioattractant est utilisé en combinaison avec une ou plusieurs molécules glucidiques (glucose) et / ou lipidiques (acides gras).
L'Homme du métier veillera à choisir le ou les composés chimioattractants en fonction de l'élément biologique spécifique ciblé.
A cet effet, lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote une analyse des récepteurs membranaires exprimés par la cellule ciblée devra être réalisée en amont afin de s'assurer de la spécificité du ou des composés chimioattractants choisis.
A titre d'exemple, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse exprimant le récepteur transmembranaire CXCR4 comme par exemple une cellule cancéreuse mammaire notamment humaine, le composé chimioattractant choisi est le stromal cell-derived factor 1 (SDF-1).
De même, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse provenant du cancer du poumon, le composé chimioattractant choisi est le facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance transformant alpha (TGF alpha).
Un second objet de l'invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention pour attirer et piéger un élément biologique spécifique.
Plus particulièrement la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour attirer et piéger in vivo un élément biologique spécifique, ladite puce étant implantée in vivo. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'un élément biologique spécifique chez un sujet, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Selon un aspect, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou prévenir une infection causée par une cellule procaryote telle qu'une bactérie dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou pour prévenir la prolifération et la dissémination d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse, de préférence après la résection d'une tumeur solide chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour prévenir les risques de récidive locale d'un cancer et / ou de développement d'un cancer métastatique chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, la puce microfluidique est implantée à une distance de 0,1 à 20 cm, de préférence de 1 à 10 cm, de préférence encore à une distance de 5 cm de la zone de résection d'une tumeur solide ou du foyer d'infection bactérienne chez un sujet. La puce microfluidique est de préférence implantée au niveau de la zone de résection dès le retrait de la tumeur solide, de préférence de suite après la résection de ladite tumeur.
On fait référence ici par « contexte d'utilisation de la puce », au type d'élément biologique spécifique ciblé, c'est-à-dire au type d'infection bactérienne lorsque ledit élément est une bactérie, ou au type de cellule cancéreuse ciblée et en particulier au type de tumeur solide retirée et le stade auquel se trouve ladite tumeur lorsque ledit élément est une cellule cancéreuse.
Dans le contexte des utilisations susmentionnées, la puce microfluidique peut être utilisée seule ou combinée à l'administration simultanée ou séquentielle d'autres composés médicamenteux tels que composés anti-cancéreux, notamment des composés chimiothérapeutiques et/ou d'hormonothérapie et/ou d'immunothérapie et/ou de thérapie ciblées et/ou radiothérapie lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse.
Enfin, la présente invention concerne également une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour attirer et détruire in vivo un élément biologique spécifique, ladite puce étant implantée in vivo, conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.
Plus précisément, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'un élément biologique spécifique chez un sujet, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.
Selon un aspect, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir une infection causée par une cellule procaryote telle qu'une bactérie, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse, de préférence après la résection d'une tumeur solide chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.
De façon encore préférée, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour prévenir les risques de récidive locale d'un cancer et / ou de développement d'un cancer métastatique chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en oeuvre susmentionnées.
La durée d'utilisation de la puce microfluidique in vivo peut être comprise entre 2 et 12 mois. A la suite de cette durée d'utilisation, une nouvelle puce pourra être implantée.
Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote et en particulier une cellule cancéreuse, ladite cellule provient de préférence d'un cancer du sein, des poumons, de la prostate, de la vessie, des glandes salivaires, de la peau, de l'intestin, du côlon-rectum, de la thyroïde, du col de l'utérus, de l'endomètre et des ovaires, du cancer lèvre- bouche-larynx, du rein, du foie, du cerveau, des testicules, du pancréas, préférentiellement le cancer du sein. Ces exemples de tumeurs solides n'étant pas limitatifs.
L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Fabrication de la puce microfluidiaue pour l'étude de concept in vitro
Pour réaliser la preuve de concept in vitro, une puce microfluidique contenant en son centre un réservoir dans lequel est placé un chimioattractant avec un réseau de microcanaux sous forme de harpons, conforme à la présente invention a été fabriquée. a) Fabrication du moule en résine de type époxy photosensible SU-8 de MicroChemicals Une plaque de silicium (diamètre 76,2 mm) est préparée dans une solution « piranha » suivie d'une déshumidification pendant 15 à 150°C. La résine SU-8 est déposée sur la plaque de silicium par enduction centrifuge (3000 tr/min, 30s) afin d'obtenir l'épaisseur voulue (10pm ou lOOpm en fonction du type utilisé SU-8 2010 ou SU-8 2100). L'évaporation des solvants est obtenue avec des rampes de chauffage et de refroidissement très légères afin de minimiser le stress mécanique dans la résine (5°C/min). L'échantillon est soumis à une exposition UV 365 nm de 125mJ/cm2 pour une épaisseur de 10pm, et de 250mJ/cm2 pour une épaisseur de 100 pm. La plaque est ensuite soumise à un recuit post insolation (« post exposure bake (PEB) ») (4 min à 95°C pour une épaisseur de 10pm et 30 min à 95°C pour une épaisseur de lOOpm). Enfin, le développement permet de diluer les parties non réticulées de la résine SU-8 dans un solvant (« SU-8 developer » composé principalement de PGMEA (propylene glycol monomethyl ether acetate)). A la fin de cette étape, les motifs permettant la structuration des microcanaux sous forme de harpon restent sur la plaque de silicium. b) Structuration des microcanaux et assemblage final de la puce
Suite à la fabrication du moule, un polymère silicone polydiméthylsiloxane (PDMS) est préparé en le mélangeant avec son agent de durcissement (Sylgard ™184 silicone elastomer kit de chez Dow, ratio 1:10). Les bulles formées pendant le mélange sont éliminées grâce à un dessiccateur et une pompe à vide. Une fois le PDMS dégazé, il est versé sur le moule SU-8 posé dans une boîte de Pétri, puis placé dans une étuve à 80°C pendant au moins 2 heures afin de terminer le processus de réticulation.
Après refroidissement, le PDMS est décollé puis découpé à l'aide d'une lame circulaire afin d'obtenir les formes cylindriques des dispositifs. Ceux-ci sont alors percés à l'aide d'un emporte-pièce pour former le puit central qui contiendra les chimioattractants. La dernière étape consiste à coller le PDMS sur un substrat de verre pour encapsuler les canaux. Cela est obtenu en activant la surface pour transformer la fonction Si-CH3 du PDMS en Si-OH grâce à un générateur de plasma 02 ou air. Au contact du verre (Si02), une liaison covalente Si-O-Si permanente sera créée. c) Fabrication de la matrice de libération
Une solution aqueuse d'alginate à 3% (w/v) a été déposée dans un moule poreux ayant la forme du réservoir de la puce. Le moule est immergé dans un bain de réticulation de chlorure de calcium durant 24h. Après 3 lavages à l'eau miliQ, la matrice est congelée à -20°C puis lyophilisée.
Par la suite, la matrice est déposée délicatement dans la puce.
Exemple 2 : Mise en oeuyre de la puce microfluidiaue in vitro
A) Capacité d'attraction des cellules à l'intérieur de la puce
La puce microfluidique a été mise en oeuvre in vitro pour tester sa capacité à attirer les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 qui sont des cellules épithéliales de tumeurs mammaires. Le composé SDF-1 « stromal cell-derived factor » correspond au composé chimioattractant apte à attirer les cellules MDA-MB-231.
1) Les cellules MDA-MB-231 stablement transfectées avec la « green fluorescent protein » (GFP) sont trypsinisées à JO. Puis 20 000 cellules sont ensemencées dans une boîte de pétri de 35 mm contenant en son centre la puce microfluidique in vitro. Les cellules sont cultivées dans le milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) 1% sérum de veaux foetal (SVF) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline).
Le réservoir central de la puce microfluidique in vitro est chargé soit avec 50 pL de DMEM F12 + 1% SVF (sérum de veau foetal) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline) (contrôle négatif) soit avec 50 pL de SDF-1 alpha à 100 ng/ml dans 0,1 % BSA dans DMEM F12 + + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline). Après 2, 4 et 7 jours de culture dans un incubateur C02 5% et une humidité de 95 % on réalise des photographies à partir d'un microscope inversé à fluorescence et les cellules présentes au sein de la puce sont comptées au bout de 4 jours puis de 7 jours. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :
[Table 1] Comptage cellulaire à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence
On constate que les cellules se déplacent de l'extérieur vers l'intérieur de la puce et en particulier vers le réservoir central en présence du chimioattractant SDF-1 alpha. Au 7eme jour dans la puce contenant le chimioattractant, on compte 850 cellules dans la puce, réparties dans l'ensemble de la puce et en particulier dans le réservoir central. En revanche, au 7eme jour dans la puce ne contenant pas le chimioattractant c'est-à-dire la puce contrôle négatif, on compte 154 cellules dans la puce, exclusivement localisées à la sortie des microcanaux à l'intérieur de la puce.
Dans une autre expérience, dans les conditions expérimentales identiques à celles citées précédemment une puce microfluidique in vitro équipée de microcanaux harpons, contenant dans son réservoir le chimoattractant SDF-1 alpha à 100 ng/ml est placée dans un incubateur sous un microscope inversé équipé d'un objectif X10 et d'une caméra permettant le suivi des cellules après 5 à 6 jours de culture.
Le nombre de cellules ayant traversé la puce après 5 à 6 jours de culture sur une portion de la puce correspondant à 7 microcanaux a été quantifiées ainsi que le nombre de cellules sorties de la puce après 5 à 6 jours de culture. Ce nombre a par la suite été extrapolé à 200 microcanaux, correspondant au nombre moyen de microcanaux présents dans le réseau de microcanaux d'une puce selon l'invention.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
[Table 2] Comptage cellulaire à l'aide d'un microscope inversé couplé à une caméra doté d'un objectif X10
On observe que les cellules pénètrent dans les microcanaux en forme de harpons et une fois à l'intérieur elles ne peuvent pas faire demi-tour. Les cellules sont donc piégées au sein de la puce et finissent par mourir à l'intérieur soit des microcanaux soit du réservoir central (Voir Figure 2).

Claims

Revendications
[Revendication 1] Puce microfluidique apte à attirer et piéger un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :
- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique
- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1), caractérisée en ce que chaque microcanal se présente sous une forme de harpon comprenant au moins deux flèches (4) espacées longitudinalement l'une de l'autre et dirigées vers le réservoir, dans laquelle chaque flèche comprend deux branches (5) ayant chacune une extrémité libre (6) formant un angle aigu compris entre 10° et 80°, et dans laquelle chaque flèche comprend deux ouvertures (7) communiquant avec une partie longitudinale du microcanal et présentant une largeur comprise entre 5 pm et 30 pm.
[Revendication 2] Puce microfluidique selon la revendication 1, dans laquelle l'extrémité libre (6) de chaque branche (5) est séparée de l'autre par une distance comprise entre 30 et 200 pm.
[Revendication 3] Puce microfluidique selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle chaque flèche (4) comprend une première ouverture par laquelle l'élément biologique entre et une deuxième ouverture par laquelle l'élément biologique sort en direction du réservoir (1) et dans laquelle la deuxième ouverture d'une flèche est espacée longitudinalement de la première ouverture de la flèche suivante par une distance comprise entre 10 et 100 pm.
[Revendication 4] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes dans laquelle chaque flèche (4) présente une longueur comprise entre 50 et 200 pm, une hauteur comprise entre 10 et 50 pm et une distance entre chaque extrémité libre (6) de chaque branche (5) comprise entre 30 et 200 pm.
[Revendication 5] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes dans laquelle chaque microcanal présente une longueur comprise entre 100 et 500 pm, une largeur comprise entre 30 et 200 pm, une hauteur comprise entre 5 et 50 pm.
[Revendication 6] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est dépourvue d'électrode entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2).
[Revendication 7] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes, comprenant une partie inférieure (8) comprenant une partie du réservoir (1), et une partie supérieure (9) comprenant une partie du réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), ladite partie supérieure étant apte à être disposée sur la partie inférieure (8), lesdites parties étant fixées entre elles.
[Revendication 8] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) sont de forme annulaire et dans laquelle le réservoir est situé au centre de la puce.
[Revendication 9] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, dans laquelle la partie supérieure (9), la partie inférieure (8) et la matrice comprenant le composé chimioattractant sont composées d'un matériau biocompatible.
[Revendication 10] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le pourcentage massique composé chimioattractant / matrice du réservoir (1) est compris entre 0,1 et 20 %, de préférence entre 0,5 et 10 % et de préférence encore entre 0,5 et 5%.
[Revendication 11] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote.
[Revendication 12] Puce microfluidique selon la revendication 11 dans laquelle la cellule eucaryote est une cellule cancéreuse.
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