EP4313071A1 - Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux - Google Patents

Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux

Info

Publication number
EP4313071A1
EP4313071A1 EP22714905.1A EP22714905A EP4313071A1 EP 4313071 A1 EP4313071 A1 EP 4313071A1 EP 22714905 A EP22714905 A EP 22714905A EP 4313071 A1 EP4313071 A1 EP 4313071A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
antisense oligonucleotide
treatment
aso
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22714905.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sandrine Humbert
Fabienne Agasse
Frédéric Saudou
Kassem RAYANE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Universite Grenoble Alpes
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Universite Grenoble Alpes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Universite Grenoble Alpes filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP4313071A1 publication Critical patent/EP4313071A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/17—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine
    • A61K31/175—Amides, e.g. hydroxamic acids having the group >N—C(O)—N< or >N—C(S)—N<, e.g. urea, thiourea, carmustine having the group, >N—C(O)—N=N— or, e.g. carbonohydrazides, carbazones, semicarbazides, semicarbazones; Thioanalogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense

Definitions

  • Antisense oligonucleotides for their use in an anti-cancer treatment
  • the invention relates to antisense oligonucleotides for their use in an anticancer treatment. It falls within the field of therapeutic applications and more particularly concerns the use of antisense oligonucleotides to sensitize glioma cells to anti-cancer treatments.
  • GBM Glioblastoma multiforme
  • type IV astrocytoma is a rare brain tumor (4 cases per 100,000 inhabitants in France each year), with rapid growth and whose vital prognosis is poor since only 2% of patients survive the more than 2 years after diagnosis. Tumors have a glial origin, so they are called gliomas. It has been shown more recently that deregulated subventricular zone stem cells could be the cause of GBM (“Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations” Lee et al. 2018). The environmental and molecular factors at the origin of these deregulations remain to be determined. Tumors are made up of multiple more or less differentiated cell types. Among these cells, rare cancer stem cells are responsible for resistance to cancer treatments and tumor recurrence.
  • the first phase of treatment consists of surgical excision.
  • the GBM cells proliferate rapidly and invade the cerebral parenchyma and it is therefore impossible to remove the whole tumor and in particular the stem cells.
  • Repeated cycles of radiotherapy and chemotherapy with oral temozolomide (TMZ) for 7 days every 28 days can slow tumor regrowth.
  • TMZ is a DNA alkylating agent that adds a methyl group at the N-7 or 0-6 position of guanine and at the N-3 position of adenine.
  • TMZ is a DNA alkylating agent that adds a methyl group at the N-7 or 0-6 position of guanine and at the N-3 position of adenine.
  • MGMT 06-methylguanine DNA methyltransferase
  • the present invention aims to overcome the aforementioned drawbacks by providing an antisense oligonucleotide having the ability to reduce the level of expression of the huntingtin protein in glioma cells, for use in sensitizing said cells to cancer treatment.
  • the present invention further relates to an antisense oligonucleotide having the ability to decrease the level of expression of the protein huntingtin and of the protein 6-O-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) in glioma cells, for its use in sensitizing said cells to an anti-cancer treatment.
  • MGMT protein 6-O-methylguanine DNA methyltransferase
  • the huntingtin protein is a pleiotropic protein of 350 kDa. This protein is mainly studied in its mutant form, i.e. presenting an expansion of more than 36 CAG triplets in exon 1 of its gene sequence because the mutated gene (huntingtin gene with the abnormal expansion of CAG triplets) encoding the HTT protein causes Huntington's disease, a fatal neurodegenerative disease. Wild-type HTT maintains the stem state of cells. Indeed, the decrease in HTT levels in stem/progenitor cells of different origins leads to a depletion of the reservoir of these cells which will tend to differentiate early (Godin et al. 2010, Elias et al. 2014, Lopes et al.
  • HTT has also been shown to participate in the epithelial-mesenchymal transition, and in its absence, breast cancer cells are more metastatic and non-cancerous cells lose their polarity (Elias et al. 2015, Thion et al. 2015).
  • Antisense oligonucleotides also called ASO from the Anglo-Saxon terminology “Antisense Oligonucleotides” are short synthetic DNA sequences (approximately 20 bases) which target the messenger RNA (mRNA) of interest according to the principle of Crick and Watson of nitrogenous base pairing. The mRNA is then degraded by RNAse H and is therefore not translated into protein.
  • ASOs present phosphothiorate bonds and modifications of nitrogenous bases with in particular the addition of 2'-0-methoxyethyl (MOE) groups on the nucleotides of the 3' and 5' ends making them resistant to nucleases and soluble in water.
  • MOE 2'-0-methoxyethyl
  • the antisense oligonucleotide sequences used in the present invention to reduce HTT levels in glioma cells are sequences available in the literature (Kordasiewicz et al. 2012, “In Vivo Evaluation of Candidate Allele-specific Mutant Huntingtin Gene Silencing Antisense Oligonucleotides” Southwell et al. 2014).
  • ASO of sequence SEQ ID NO: 1 also called in the description of the present application antisense oligonucleotides RG6042.
  • HTT levels are decreased in the cerebrospinal fluid of patients with Huntington's disease (Tabrizi et al. 2019).
  • the 6-O-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) protein is a DNA repair enzyme. It is found expressed in different tissues of the body (low tissue specificity). In the brain, it is expressed by endothelial cells and glial cells but not by neurons.
  • MGMT MGMT-induced MGMT
  • brain tumours following repeated cycles of radiotherapy/chemotherapy, certain cells re-expressing MGMT emerge, “take over” the other cells of the tumor mass which are partly eliminated by the treatment. These resistant cells are the cause of tumor recurrence.
  • antisense oligonucleotides having the ability to reduce the level of expression of the huntingtin protein and of the 6-O-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) protein in glioma cells according to the invention is therefore particularly advantageous in order to avoid the phenomenon of tumor recurrence.
  • MGMT 6-O-methylguanine DNA methyltransferase
  • the invention also responds to the following characteristics, implemented separately or in each of their technically effective combinations.
  • the antisense oligonucleotide comprises between 12 and 35 nucleic bases.
  • the antisense oligonucleotide is chosen from antisense oligonucleotides of sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the antisense oligonucleotide is chosen from antisense oligonucleotides having a sequence identical to at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, of preferably at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 92%, more preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, preferably at least 98%, of preferably at least 99%, with a sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the anticancer treatment to which the glioma cells are sensitized is a treatment which causes damage to the DNA of said cells.
  • the anticancer treatment to which the glioma cells are sensitized is treatment with a DNA alkylating agent.
  • the alkylating agent is preferably chosen from temozolomide (TMZ), lomustine (CCNU), carmustine (BCNU), procarbazine and carboplatin.
  • the anticancer treatment to which the glioma cells are sensitized is a treatment with temozolomide (TMZ)
  • the glioma cells are preferably sensitized so that the lethal dose 50 (LD50) at TMZ is reduced by at least 30% but preferably by at least 40%.
  • the lethal dose 50 (LD50) designates the concentration of TMZ for which cell viability is reduced by 50% relative to the control condition (without use of antisense oligonucleotides which are the subject of the present invention).
  • the anticancer treatment to which the glioma cells are sensitized is a treatment using radiation.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one antisense oligonucleotide which is the subject of the present invention, or comprising a salt, an ester, a salt of such an ester or a pharmaceutically acceptable prodrug thereof.
  • ci and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, for use in sensitizing said cells to anti-cancer treatment.
  • a "pharmaceutical composition comprising an antisense oligonucleotide” refers to a composition comprising an antisense oligonucleotide targeting huntingtin in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • Pharmaceutically acceptable diluents are well known to those skilled in the art. The selection of a pharmaceutically acceptable diluent or carrier is based on a number of factors, including but not limited to the solubility of the compound and route of administration. These considerations are well understood by those skilled in the art.
  • a "pharmaceutical carrier” or excipient can be a pharmaceutically acceptable solvent, a suspending agent or any other pharmacologically inert vehicle for delivering one or more nucleic acids to an animal and are known in the technical field.
  • the excipient can be liquid or solid and is chosen, taking into account the intended mode of administration, so as to obtain the volume, consistency, etc. desired when combined with a nucleic acid and the other components of a given pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable salt designates the physiologically and pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the invention: that is to say the salts which retain the desired biological activity of the parent compound and do not confer on it adverse toxicological effects.
  • Sodium salts of antisense oligonucleotides are useful and are well accepted for therapeutic administration to humans.
  • prodrug herein refers to a therapeutic agent which is prepared in an inactive or less active form which is converted to an active form (i.e. a drug) in the body or cells. of it by the action of endogenous enzymes or other chemical substances and/or conditions.
  • the present invention relates to the antisense oligonucleotide or the composition comprising at least one antisense oligonucleotide according to the present invention for its use in the treatment of a brain tumor.
  • the present invention relates to the antisense oligonucleotide or the composition comprising at least one antisense oligonucleotide according to the present invention for its use in the treatment of glioblastoma multiforme or type IV astrocytoma.
  • FIG. 1 illustrates in A the results of the western blot carried out from cells of the U251 cell line having been transfected with the antisense oligonucleotide (ASO) RG6042 (SEQ ID NO: 1), with the ASO Scr (for "scramble” in Anglo-Saxon terminology and “jamming” in French terminology) or treated with lipofectamine alone (Ctrl for control), and, in B, the quantification of HTT protein levels obtained in western blot after 4 repetitions of the experiment presented in (A);
  • ASO antisense oligonucleotide
  • FIG. 2 illustrates in A the result of the western blot carried out from cells of the U87 cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or treated with lipofectamine alone (Ctrl), and, in B, the quantification of the protein levels of FITT obtained in western blot after at least 3 repetitions of the experiment presented in (A);
  • FIG. 3 illustrates in A the result of the western blot carried out from cells of the T98G cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or treated with lipofectamine alone (Ctrl), and, in B, the quantification of the protein levels of HTT obtained in western blot after 5 repetitions of the experiment presented in (A);
  • FIG. 4 illustrates in A the result of the western blot carried out from cells of the T98G cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or treated with lipofectamine alone (Ctrl), and, in B, the quantification of the protein levels of MGMT obtained in western blot after 4 repetitions of the experiment presented in (A);
  • Figure 5 illustrates the result of the western blot carried out from cells of the T98G cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO PH1, with ASO PH2, with ASO PH3, or with the ASO Scr;
  • FIG. 6 Figure 6 illustrates the quantification of the protein levels of HTT in A and of MGMT in B, obtained by western blot after at least four repetitions of the experiment presented in Figure 5;
  • FIG. 7 illustrates a graph of HTT mRNA expression in A quantified by qPCR, and a graph of MGMT mRNA expression in B quantified by qPCR, in T98G cells treated with l 'ASO RG6042;
  • FIG. 8 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the concentration of TMZ measured at the LD50 for cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl);
  • FIG. 9 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U87 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the concentration of TMZ measured at the LD50 for cells of the U87 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl);
  • Figure 10 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the T98G line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the concentration of TMZ measured at the LD50 for cells of the T98G line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl);
  • FIG. 11 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or Scr as a function of the dose of Lomustine received and, at B, the mean of the concentrations of Lomustine measured at the LD50 in 4 different MTT tests for cells of line U251 transfected with ASO RG6042 or Scr;
  • Figure 12 illustrates at A a curve showing the percentage of live cells of the T98G line transfected with ASO RG6042 or Scr as a function of the dose of Lomustine received and, at B, the mean of the concentrations of Lomustine measured at the LD50 in 4 different MTT assays for T98G cell line transfected with ASO RG6042 or Scr.
  • glioma cells transfected with antisense oligonucleotides The U87, T98G and U251 glioma cell lines are cultured in DMEM medium ("Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium" in English terminology and "Eagle's minimum essential medium modified by Dulbecco/Vogt” in English terminology). French) supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin and streptomycin.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • the ASO Scr (for "scramble” in Anglo-Saxon terminology and “jamming” in French terminology) is an ASO serving as a control whose sequence SEQ ID NO: 5 is ⁇ A * CATG * > A * C * C * G * C * A * C * T * C * A * ⁇ CTAT * A> where * is a phosphorothioate bond and the bases between the signs ⁇ and > are 2'-O-methoxyethyl RNA.
  • the cells are then used either in a susceptibility test to temozolomide (TMZ), or in a susceptibility test to the alkylating agent Lomustine, or in huntingtin (HTT) and 6- protein level expression tests.
  • TMZ temozolomide
  • HTT huntingtin
  • 6- protein level expression tests O-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT).
  • the cells are rinsed with phosphate-buffered saline (PBS) and then lysed in RIPA-type lysis buffer supplemented with protease and phosphatase inhibitors.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the proteins solubilized in the buffer are harvested after centrifugation, denatured in Laemmli loading buffer and deposited on polyacrylamide gel. After migration, the proteins are transferred onto a polyvinylidine difluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidine difluoride
  • the HTT protein is revealed by incubation with the D7F7 antibody (#5656, from the Cell signaling technology ® brand). Vinculin is used as a load control.
  • Figure 1 illustrates in A the results of the western blot carried out from cells of the U251 cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or simply treated with lipofectamine alone (Ctrl for control), and, in B, the quantification of HTT protein levels obtained by western blot after 4 repetitions of the experiment presented in A.
  • FIG. 2 illustrates at A the result of the western blot produced from cells of the U87 cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or treated with lipofectamine alone (Ctrl), and, in B, the quantification of HTT protein levels obtained by western blot after at least 3 repetitions of the experiment presented in A.
  • FIG. 3 illustrates at A the result of the western blot produced from cells of the T98G cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or treated with lipofectamine alone (Ctrl), and, in B, the quantification of HTT protein levels obtained by western blot after 5 repetitions of the experiment presented in A.
  • the protocol is the same as for the previously cited test of the level of expression of the HTT protein with the only change being the use of anti-MGMT antibodies (#2739, from the Cell signaling technology ® brand) in incubation for reveal the MGMT protein. Vinculin is also used here as a load control.
  • FIG. 4 illustrates at A the result of the western blot produced from cells of the T98G cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO Scr or treated with lipofectamine alone (Ctrl) and, in B, quantification of MGMT protein levels obtained by western blot after at least 4 repetitions of the experiment presented in A.
  • T98G cells transfected with ASO RG6042, or ASO PH1, or ASO PH2 or ASO PH3, or ASO Scr are harvested for testing the level of expression of HTT proteins and MGMT.
  • the protocol is the same as for the previously cited tests for the level of expression of the HTT protein and the level of expression of the MGMT protein.
  • Vinculin is also used here as a load control.
  • Figure 5 illustrates the result of the western blot produced from cells of the T98G cell line having been transfected with ASO RG6042, with ASO PH1, with ASO PH2, with ASO PH3, or with the ASO Scr.
  • FIG. 6 illustrates the quantification of the protein levels of HTT in A and of MGMT in B, obtained by western blot after at least four repetitions of the experiment presented in FIG. 5.
  • the statistics were carried out using the Kruskal-wallis test followed by Dunn's multiple comparison test, error bars, SEM, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.001.
  • FIG. 7 illustrates the expression of the mRNA of HTT in A and of MGMT in B quantified by qPCR. Statistics were established using Mann Whitney's t-test, error bars, SEM, * p ⁇ 0.05, **** p ⁇ 0.0001.
  • TTZ Temozolomide
  • the cells transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl for control) are harvested for the TMZ sensitivity test.
  • the TMZ was prepared in the form of a stock solution of 50 mM in 33.3 mM of citrate monohydrate. The solution is sonicated, filtered and frozen at -20 ° C until further use (Nygren, H., and Eksborg, S. (2012), “Stability of temozolomide in solutions aimed for oral treatment prepared from a commercially available powder for infusion”, Pharm Methods 3, 1-3). The cells are distributed in 96-well culture dishes at the rate of 200 cells per well for the U251 and T98G lines and 100 cells per well for the U87 line. The cells are left developing for 24 hours.
  • the cells are then treated for 48 hours with increasing doses of TMZ at the rate of 10 mM to 110 mM for the U87 and U251 lines and from 100 mM to 1500 mM for the T98G line. Each dilution is tested in triplicate.
  • the control condition consists of cells treated with complete culture medium. Blank wells contain only complete culture medium.
  • the medium containing the TMZ is removed and replaced with fresh complete culture medium in which the cells are left to incubate for 72 hours.
  • An MTT test (known live cell count test) is then set up in order to evaluate the cell survival in the different wells.
  • the yellow probe of MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, is then added at a working concentration of 0.5 mg. ml 1 to each well.
  • the wells are incubated for 4 hours in a humidified incubator with 95% air and 5% CO2 at 37°C.
  • the insoluble purple formazan resulting from the reduction of the MTT probe in living cells is solubilized by adding a solubilizing solution (10% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 0.01% hydrogen chloride (HCl) in water) overnight at 37 ° C.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • HCl hydrogen chloride
  • the optical density (OD) of the contents of each well is then analyzed with a spectrophotometer at wavelengths between 490 nm and 570 nm.
  • the lethal dose 50 denotes the concentration of TMZ for which cell viability is reduced by 50% relative to the control condition.
  • FIG. 8 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the average TMZ concentrations measured at the LD50 in 4 different MTT tests for cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl).
  • FIG. 8 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the average TMZ concentrations measured at the LD50 in 4 different MTT tests for cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl).
  • FIG 9 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U87 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the averages TMZ concentrations measured at the LD50 in 4 different MTT tests for cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl).
  • FIG. 10 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the T98G line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl) as a function of the dose of TMZ received and, at B, the average TMZ concentrations measured at the LD50 in 6 different MTT tests for cells of the T98G line transfected with ASO RG6042 or treated with lipofectamine alone (Ctrl).
  • the cells transfected with ASO RG6042 or ASO Scr are harvested for the susceptibility test to the alkylating agent Lomustine.
  • Lomustine was prepared in the form of a stock solution of 50 mg/ml (214 mM) in pure ethanol. The solution was filtered to sterilize it (0.2 ⁇ m pore filter) and frozen at -20 ° C until further use.
  • the cells are distributed in 96-well culture dishes at the rate of 200 cells per well for the U251 and T98G lines. The cells are left developing for 24 hours.
  • the cells are then treated for 48 hours with increasing doses of Lomustine at the rate of 5 mM to 500 mM for the U251 line and from 100 mM to 1500 mM for the T98G line. Each dilution is tested in three copies.
  • the control condition consists of cells treated with complete culture medium. Blank wells contain only complete culture medium.
  • the medium containing Lomustine is removed and replaced with fresh complete culture medium in which the cells are left to incubate for 72 h.
  • An MTT test is then set up in the same way as the previous test concerning sensitivity to TMZ in order to evaluate the cell survival in the different wells.
  • the lethal dose 50 denotes the concentration of Lomustine for which cell viability is reduced by 50% relative to the control condition.
  • FIG. 11 illustrates at A a curve showing the percentage of living cells of the U251 line transfected with ASO RG6042 or Scr as a function of the dose of Lomustine received and, at B, the mean of the concentrations of Lomustine measured at the LD50 in 4 different MTT assays for U251 cell line transfected with ASO RG6042 or Scr.
  • FIG. 12 illustrates at A a curve showing the percentage of live cells of the T98G line transfected with ASO RG6042 or Scr as a function of the dose of Lomustine received and, at B, the mean of the concentrations of Lomustine measured at the LD50 in 4 different MTT assays for T98G cell line transfected with ASO RG6042 or Scr.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

L'invention concerne des Oligonucléotides antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d'expression de la protéine huntingtine dans des cellules de gliomes, pour leur utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux.

Description

Description
Titre de l'invention : Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux
Domaine technique de l’invention
[0001] L’invention relève d’oligonucléotides antisens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux. Elle s’inscrit dans le domaine des applications thérapeutiques et concerne plus particulièrement l’utilisation d’oligonucléotides antisens pour sensibiliser les cellules de gliomes à des traitements anticancéreux.
Technique antérieure
[0002] Le glioblastome multiforme (GBM) ou astrocytome de type IV, est une tumeur cérébrale rare (4 cas pour 100000 habitants en France chaque année), à croissance rapide et dont le pronostic vital est mauvais puisque seulement 2 % des patients survivent au-delà de 2 ans après le diagnostic. Les tumeurs ont une origine gliale, elles sont donc appelées gliomes. Il a été montré plus récemment que des cellules souches de la zone sous- ventriculaire dérégulées pourraient être à l’origine des GBM (« Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations » Lee et al. 2018). Les facteurs environnementaux et moléculaires à l’origine de ces dérégulations restent à déterminer. Les tumeurs sont constituées de multiples types cellulaires plus ou moins différenciés. Parmi ces cellules, les rares cellules souches cancéreuses sont responsables de la résistance aux traitements anticancéreux et à la récurrence tumorale.
[0003] La première phase du traitement consiste en une exérèse chirurgicale. Cependant, les cellules de GBM prolifèrent rapidement et envahissent le parenchyme cérébral et il est donc impossible d’enlever toute la tumeur et notamment les cellules souches. Des cycles répétés de radiothérapie et de chimiothérapie par prise orale de témozolomide (TMZ) pendant 7 jours tous les 28 jours permettent de ralentir la repousse tumorale. Le TMZ est un agent alkylant de l’ADN qui ajoute un groupement méthyl en position N-7 ou 0-6 de la guanine et en position N-3 de l’adénine. Bien que la présence de méthyl-06 guanine ne représente que moins de 10% du total de l’alkylation due au TMZ, c’est principalement par cette modification que le TMZ induit l’apoptose. Au cours de la réplication, la guanine modifiée s’apparie de façon erronée à la thymine. Ce mésappariement est reconnu par les enzymes du système de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR pour « mismatch repair » en terminologie anglo-saxonne). Ces enzymes tentent en boucle de réparer ces mésappariements sans succès. Il en résulte des cassures du double brin d’ADN, un arrêt du cycle cellulaire en G2 et l’induction de l’apoptose. Cependant, les tumeurs récurrentes expriment l’enzyme 06-methylguanine DNA méthyltransférase (MGMT), une enzyme qui ôte le groupement alkyl présent sur la guanine après traitement au TMZ. Le TMZ devient donc inefficace et il n’existe pas d’alternative de traitement au TMZ.
[0004] Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients souffrant de gliomes.
Présentation de l'invention
[0005] A cet effet, la présente invention a pour objectif de palier les inconvénients précités en proposant un oligonucléotide antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine dans des cellules de gliomes, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux.
[0006] La présente invention vise en outre un oligonucléotide antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine et de la protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) dans des cellules de gliomes, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux.
[0007] La protéine huntingtine (HTT) est une protéine pléiotropique de 350 kDa. Cette protéine est majoritairement étudiée sous sa forme mutante, c’est à dire présentant une expansion de plus de 36 triplets de CAG dans l’exon 1 de sa séquence génique car le gène muté (gène huntingtine avec l’expansion anormale de triplets CAG) codant la protéine HTT entraîne la maladie de Huntington, une maladie neurodégénérative létale. La HTT sauvage permet le maintien de l’état souche des cellules. En effet, la diminution des niveaux de HTT dans des cellules souches/progénitrices de différentes origines conduit à une déplétion du réservoir de ces cellules qui auront tendance à se différencier de façon précoce (Godin et al. 2010, Elias et al. 2014, Lopes et al. 2016). Il a également été montré que la HTT participait à la transition épithélio-mésenchymateuse, et en son absence, les cellules cancéreuses mammaires sont plus métastatiques et les cellules non cancéreuses perdent leur polarité (Elias et al. 2015, Thion et al. 2015).
[0008] Les oligonucléotides antisens aussi appelés ASO venant de la terminologie anglo-saxonne « Antisense Oligonucleotides », sont des séquences courtes d’ADN de synthèse (environs 20 bases) qui ciblent l’ARN messager (ARNm) d’intérêt selon le principe de Crick et Watson d’appariement des bases azotées. L’ARNm est alors dégradé par la RNAse H et n’est donc pas traduit en protéine. Les ASO présentent des liaisons phosphothiorates et des modifications des bases azotées avec notamment ajout de groupements 2’-0-méthoxyéthyl (MOE) sur les nucléotides des extrémités 3’ et 5’ les rendant résistants aux nucléases et solubles dans l’eau.
[0009] Les inventeurs ont découvert que, de manière tout à fait surprenante, les ASO ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine HTT dans des cellules de gliomes par ciblage de leur ARNm et les ASO ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine HTT et de la protéine MGMT (rendant les cellules qui l’expriment particulièrement résistantes aux traitements anticancéreux) dans des cellules de gliomes, lorsqu’ils sont transfectés auxdites cellules, permettent de sensibiliser ces dernières à un traitement anticancéreux auquel elles développent habituellement une résistance dans le temps.
[0010] Les séquences d’oligonucléotides antisens utilisées dans la présente invention pour diminuer les niveaux de HTT dans les cellules de gliomes sont des séquences disponibles dans la littérature (Kordasiewicz et al. 2012, « In Vivo Evaluation of Candidate Allele-specific Mutant Huntingtin Gene Silencing Antisense Oligonucleotides » Southwell et al. 2014). Dans le cadre de la maladie de Huntington, des essais cliniques ont été réalisés avec l’ASO de séquence SEQ ID NO : 1 également appelé dans la description de la présente demande oligonucléotides antisens RG6042. Après 4 injections intrathécales de l’ASO RG6042, les niveaux de HTT sont diminués dans le liquide cérébrospinal des patients atteints de la maladie de Huntington (Tabrizi et al. 2019).
[0011] La protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) est une enzyme de la réparation de l’ADN. On la retrouve exprimée dans différents tissus de l’organisme (spécificité tissulaire faible). Dans le cerveau, elle est exprimée par les cellules endothéliales et les cellules gliales mais pas par les neurones.
[0012] Les niveaux de MGMT sont bas dans le cerveau et normalement corrélés à la méthylation du promoteur du gène voire du corps du gène (mécanismes de « silencing » en terminologie anglo-saxonne). Dans les tumeurs cérébrales, suite aux cycles répétés de radio/chimiothérapies, certaines cellules ré-exprimant la MGMT émergent, « prennent le dessus » sur les autres cellules de la masse tumorale qui pour partie, sont éliminées par le traitement. Ces cellules résistantes sont à l’origine de la récurrence tumorale. L’utilisation des oligonucléotides antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine et de la protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) dans des cellules de gliomes selon l’invention est donc particulièrement avantageuse afin d’éviter le phénomène de récurrence tumorale.
[0013] Dans des modes particuliers de réalisation, l’invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en œuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.
[0014] Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, l’oligonucléotide antisens comprend entre 12 et 35 bases nucléiques.
[0015] Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, l’oligonucléotide antisens est choisi parmi les oligonucléotides antisens de séquence SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
[0016] Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, l’oligonucléotide antisens est choisi parmi les oligonucléotides antisens ayant une séquence identique à au moins 50%, de préférence au moins 60%, encore de préférence au moins 70%, de manière préférentielle au moins 80%, préférentiellement au moins 90%, de préférence au moins 92%, encore de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
[0017] Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement qui provoque des dommages à l’ADN desdites cellules.
[0018] Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement avec un agent alkylant de l’ADN. L’agent alkylant est de préférence choisi parmi le témozolomide (TMZ), la lomustine (CCNU), la carmustine (BCNU), la procarbazine et la carboplatine.
[0019] Dans les modes particuliers de réalisation de l’invention dans lesquels le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement au témozolomide (TMZ), les cellules de gliomes sont de préférence sensibilisées de sorte que la dose létale 50 (DL50) au TMZ est diminuée d’au moins 30% mais de préférence d’au moins 40%. La dose létale 50 (DL50) désigne la concentration de TMZ pour laquelle la viabilité cellulaire est réduite de 50 % par rapport à la condition de contrôle (sans utilisation d’oligonucléotides antisens objet de la présente invention).
[0020] Dans des modes particuliers de réalisation de l’invention, le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement utilisant des radiations.
[0021] Selon un autre aspect, l’invention vise une composition pharmaceutique comprenant au moins un oligonucléotide antisens objet de la présente invention, ou comprenant un sel, un ester, un sel d’un tel ester ou un promédicament pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux.
[0022] Dans le présent document, une "composition pharmaceutique comprenant un oligonucléotide antisens" désigne une composition comprenant un oligonucléotide antisens ciblant la huntingtine dans un diluant pharmaceutiquement acceptable. Les diluants pharmaceutiquement acceptables sont bien connus des spécialistes de cet art. La sélection d'un diluant ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable est basée sur un certain nombre de facteurs, y compris, mais sans s'y limiter, la solubilité du composé et la voie d'administration. Ces considérations sont bien comprises par l’homme de l’art.
[0023] Un "support pharmaceutique" ou excipient peut être un solvant pharmaceutiquement acceptable, un agent de suspension ou tout autre véhicule pharmacologiquement inerte pour délivrer un ou plusieurs acides nucléiques à un animal et sont connus dans le domaine technique. L'excipient peut être liquide ou solide et est choisi, en tenant compte du mode d'administration prévu, de manière à obtenir le volume, la consistance, etc. souhaités lorsqu'il est combiné avec un acide nucléique et les autres composants d'une composition pharmaceutique donnée.
[0024] Le terme "sel pharmaceutiquement acceptable" désigne les sels physiologiquement et pharmaceutiquement acceptables des composés de l'invention : c'est-à-dire les sels qui conservent l'activité biologique souhaitée du composé parent et ne lui confèrent pas d'effets toxicologiques indésirables. Les sels de sodium des oligonucléotides antisens sont utiles et sont bien acceptés pour l'administration thérapeutique à l'homme.
[0025] Le terme "promédicament" désigne dans la présente demande un agent thérapeutique qui est préparé sous une forme inactive ou moins active qui est convertie en une forme active (c'est-à-dire un médicament) dans le corps ou les cellules de celui-ci par l'action d'enzymes endogènes ou d'autres substances chimiques et/ou conditions.
[0026] Selon un autre aspect, la présente invention vise l’oligonucléotide antisens ou la composition comprenant au moins un oligonucléotide antisens selon la présente invention pour son utilisation dans le traitement d’une tumeur cérébrale.
[0027] Selon un autre aspect, la présente invention vise l’oligonucléotide antisens ou la composition comprenant au moins un oligonucléotide antisens selon la présente invention pour son utilisation dans le traitement d’un glioblastome multiforme ou astrocytome de type IV.
Brève description des figures
[0028] L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent : [0029] [Fig. 1] La figure 1 illustre en A les résultats du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire U251 ayant été transfectées avec l'oligonucléotide antisens (ASO) RG6042 (SEQ ID NO : 1), avec l’ASO Scr (pour « scramble » en terminologie anglo-saxonne et « brouillage » en terminologie française) ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl pour contrôle), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après 4 répétitions de l’expérience présentée en (A) ;
[0030] [Fig. 2] La figure 2 illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire U87 ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de FITT obtenus en western blot après au moins 3 répétitions de l’expérience présentée en (A) ;
[0031] [Fig. 3] La figure 3 illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après 5 répétitions de l’expérience présentée en (A) ;
[0032] [Fig. 4] La figure 4 illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de MGMT obtenus en western blot après 4 répétitions de l’expérience présentée en (A) ;
[0033] [Fig. 5] La figure 5 illustre le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO PH1 , avec l’ASO PH2, avec l’ASO PH3, ou avec l’ASO Scr ;
[0034] [Fig. 6] La figure 6 illustre la quantification des niveaux protéiques de HTT en A et de MGMT en B, obtenus en western blot après au moins quatre répétitions de l’expérience présentée en figure 5 ;
[0035] [Fig. 7] La figure 7 illustre un graphe de l'expression de l'ARNm de HTT en A quantifiée par qPCR, et un graphe de l'expression de l'ARNm de MGMT en B quantifiée par qPCR, dans des cellules T98G traitées avec l’ASO RG6042 ; [0036] [Fig. 8] La figure 8 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B, la concentration de TMZ mesurée à la DL50 pour les cellules de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) ;
[0037] [Fig. 9] La figure 9 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U87 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B, la concentration de TMZ mesurée à la DL50 pour les cellules de lignée U87 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) ;
[0038] [Fig. 10] La figure 10 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B, la concentration de TMZ mesurée à la DL50 pour les cellules de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées avec la lipofectamine seule (Ctrl) ;
[0039] [Fig. 11] La figure 11 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr en fonction de la dose de Lomustine reçue et, en B, la moyenne des concentrations de Lomustine mesurées à la DL50 dans 4 tests MTT différents pour les cellules de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr ;
[0040] [Fig. 12] La figure 12 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr en fonction de la dose de Lomustine reçue et, en B, la moyenne des concentrations de Lomustine mesurées à la DL50 dans 4 tests MTT différents pour les cellules de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr.
Description des modes de réalisation
[0041] Obtention de cellules de gliomes transfectées avec des oligonucléotides antisens [0042] Les lignées cellulaires de gliomes U87, T98G et U251 sont cultivées dans du milieu DMEM (« Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium » en terminologie anglo-saxonne et « milieu minimum essentiel de Eagle modifié par Dulbecco/Vogt » en terminologie française) additionné de 10% de sérum de veau fœtal et de 1 % de pénicilline et streptomycine.
[0043] Lorsque les cultures sont à 60 % de confluence, elles sont transfectées avec 100mM d’oligonucléotide antisens (ASO) RG6042 (de séquence SEQ ID NO : 1), ou PH1 (SEQ ID NO : 2) ou PH2 (SEQ ID NO : 3) ou PH3 (SEQ ID NO : 4) ou Scr dans de la lipofectamine pendant 48h. L’ASO Scr (pour « scramble » en terminologie anglo-saxonne et « brouillage » en terminologie française) est un ASO servant de contrôle dont la séquence SEQ ID NO : 5 est <A*CATG*>A*C*C*G*C*A*C*T*C*A*<CTAT*A> dans laquelle * est une liaison phosphorothioate et les bases entre les signes < et > sont de l’ARN 2’-0-methoxyéthyle.
[0044] Les cellules sont ensuite utilisées soit dans un test de sensibilité au temozolomide (TMZ), soit dans un test de sensibilité à l’agent alkylant Lomustine, soit en tests d’expression du niveau des protéines huntingtine (HTT) et 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT).
[0045] Test du niveau d’expression de la protéine huntingtine (HTT)
[0046] Des cellules transfectées avec l’ASO RG6042, l’ASO Scr, ou traitées avec la lipofectamine seule (pour contrôle), sont récoltées pour le test du niveau d’expression de la protéine HTT.
[0047] Les cellules sont rincées au tampon phosphate salin (PBS) puis lysées dans du tampon de lyse de type RIPA additionné d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases. Les protéines solubilisées dans le tampon sont récoltées après centrifugation, dénaturées dans du tampon de charge Laemmli et déposées sur gel de polyacrylamide. Après migration, les protéines sont transférées sur membrane de polyvinylidine difluoride (PVDF). La protéine HTT est révélée par incubation avec l’anticorps D7F7 (#5656, de la marque Cell signaling technology ®). La vinculine est utilisée comme contrôle de charge.
[0048] La figure 1 illustre en A les résultats du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire U251 ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou simplement traitées à la lipofectamine seule (Ctrl pour contrôle), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après 4 répétitions de l’expérience présentée en A.
[0049] La figure 2 illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire U87 ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après au moins 3 répétitions de l’expérience présentée en A.
[0050] La figure 3 illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl), et, en B, la quantification des niveaux protéiques de HTT obtenus en western blot après 5 répétitions de l’expérience présentée en A.
[0051] Ce test permet de constater que l’ASO RG6042 réduit significativement les niveaux de protéine HTT dans les cellules de gliomes.
[0052] Test du niveau d’expression de la protéine 6-O-methylguanine ADN methyltransferase (MGMT)
[0053] Des cellules transfectées avec l’ASO RG6042, l’ASO Scr, ou traitées avec la lipofectamine seule (pour contrôle), sont récoltées pour le test du niveau d’expression de la protéine MGMT.
[0054] Le protocole est le même que pour le test précédemment cité du niveau d’expression de la protéine HTT avec pour seule changement l’utilisation d’anticorps anti MGMT (#2739, de la marque Cell signaling technology ®) en incubation pour révéler la protéine MGMT. La vinculine et également ici utilisée comme contrôle de charge.
[0055] La figure 4 illustre en A le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO Scr ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl) et, en B, la quantification des niveaux protéiques de MGMT obtenus en western blot après au moins 4 répétitions de l’expérience présentée en A.
[0056] Ce test permet de constater que l’ASO RG6042 réduit significativement les niveaux de MGMT dans les cellules T98G. [0057] Test du niveau d’expression de la protéine huntingtine (HTT) et de la protéine 6-0-methylguanine ADN methyltransferase (MGMT) dans les cellules T98G
[0058] Des cellules T98G transfectées avec l’ASO RG6042, ou l’ASO PH1, ou l’ASO PH2 ou l’ASO PH3, ou l’ASO Scr, sont récoltées pour le test du niveau d’expression des protéines HTT et MGMT.
[0059] Le protocole est le même que pour les tests précédemment cités du niveau d’expression de la protéine HTT et du niveau d’expression de la protéine MGMT. La vinculine et également ici utilisée comme contrôle de charge.
[0060] La figure 5 illustre le résultat du western blot réalisé à partir de cellules de la lignée cellulaire T98G ayant été transfectées avec l’ASO RG6042, avec l’ASO PH1 , avec l’ASO PH2, avec l’ASO PH3, ou avec l’ASO Scr.
[0061] La figure 6 illustre la quantification des niveaux protéiques de HTT en A et de MGMT en B, obtenus en western blot après au moins quatre répétitions de l’expérience présentée en figure 5. Les statistiques ont été réalisées à l'aide du test de Kruskal-wallis suivi du test de comparaisons multiples de Dunn, barres d'erreur, SEM, *p<0,05, **p<0,001.
[0062] La figure 7 illustre l'expression de l'ARNm de HTT en A et de MGMT en B quantifiée par qPCR. Les statistiques ont été établies à l'aide du test T de Mann Whitney, les barres d'erreur, SEM, *p<0,05, ****p<0,0001.
[0063] Ce test permet de constater que les ASO RG6042, PH1, PH2 et PH3 réduisent significativement les niveaux de protéine HTT et MGMT dans les cellules de gliomes T98G.
[0064] Test de sensibilité au temozolomide (TMZ)
[0065] Les cellules transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl pour contrôle) sont récoltées pour le test de sensibilité au TMZ.
[0066] Le TMZ a été préparé sous forme de solution mère de 50 mM dans 33,3 mM de citrate monohydraté. La solution est soumise à sonication, filtrée et congelée à -20 °C jusqu'à son utilisation ultérieure (Nygren, H., et Eksborg, S. (2012), « Stability of temozolomide in solutions aimed for oral treatment prepared from a commercially available powder for infusion », Pharm Methods 3, 1-3). [0067] Les cellules sont réparties dans des boites de culture de 96 puits à raison de 200 cellules par puit pour les lignées U251 et T98G et de 100 cellules par puit pour la lignée U87. Les cellules sont laissées ainsi en développement durant 24h.
[0068] Les cellules sont ensuite traitées pendant 48h avec des doses croissantes de TMZ à raison de 10 mM à 110 mM pour les lignées U87 et U251 et de 100 mM à 1500 mM pour la lignée T98G. Chaque dilution est testée en trois exemplaires. La condition de contrôle consiste en des cellules traitées avec un milieu de culture complet. Les puits vierges ne contiennent que du milieu de culture complet.
[0069] A l’issue des 48h de traitement au TMZ, le milieu contenant le TMZ est retiré et remplacé par du milieu de culture complet frais dans lequel les cellules sont laissées en incubation pendant 72h.
[0070] Un test MTT (test connu de numération de cellules vivantes) est ensuite mis en place afin d’évaluer la survie cellulaire dans les différents puits.
[0071] La sonde jaune du MTT, le bromure de 3-(4,5-Diméthyl-2-thiazolyl)-2,5- diphényl-2H-tétrazolium, est alors ajoutée à une concentration de travail de 0,5 mg.ml 1 à chaque puits. Les puits sont incubés pendant 4 heures dans un incubateur humidifié à 95% d'air et 5% de C02 à 37°C. Le formazan violet insoluble résultant de la réduction de la sonde MTT dans les cellules vivantes est solubilisé par addition d'une solution de solubilisation (10 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 0,01 % de chlorure d'hydrogène (HCl) dans de l'eau) pendant la nuit à 37QC. La densité optique (OD) du contenu de chaque puit est ensuite analysée avec un spectrophotomètre à des longueur d’ondes comprises entre 490 nm et 570 nm.
[0072] La dose létale 50 (DL50) désigne la concentration de TMZ pour laquelle la viabilité cellulaire est réduite de 50 % par rapport à la condition de contrôle.
[0073] La figure 8 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B, la moyenne des concentrations de TMZ mesurées à la DL50 dans 4 tests MTT différents pour les cellules de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl). [0074] La figure 9 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U87 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B, la moyennes des concentrations de TMZ mesurées à la DL50 dans 4 tests MTT différents pour les cellules de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl).
[0075] La figure 10 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl) en fonction de la dose de TMZ reçue et, en B, la moyenne des concentrations de TMZ mesurées à la DL50 dans 6 tests MTT différents pour les cellules de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou traitées à la lipofectamine seule (Ctrl).
[0076] Il apparaît donc que la DL50 au TMZ des trois lignées cellulaires U87, U251 et T98G est diminuée dans les cultures présentant un niveau de HTT réduit.
[0077] La réduction du niveau de HTT entraîne une diminution de la DL50 au TMZ de :
- 32% dans les cultures de U87 (DL50= 81 ,7 ± 6,2 mM contre DL50 = 55,0 ± 3.0 mM après traitement avec RG6042),
- 40% dans les cultures de U251 (DL50= 61 ,6 ± 3,3 mM contre DL50 = 36,7 ± 2,6 mM après traitement avec RG6042),
- 45% dans les cultures de T98G (DL50= 968,1 ± 63,0 mM contre DL50 = 531 ,6 ± 51 ,6 mM après traitement avec RG6042).
[0078] Test de sensibilité à l’agent alkylant Lomustine
[0079] Les cellules transfectées avec l’ASO RG6042 ou l’ASO Scr sont récoltées pour le test de sensibilité à l’agent alkylant Lomustine.
[0080] La Lomustine a été préparée sous forme de solution mère de 50 mg/ml (214 mM) dans l’éthanol pur. La solution a été filtré pour la stériliser (filtre de pores de 0.2pm) et congelé à -20 °C jusqu'à son utilisation ultérieure.
[0081] Les cellules sont réparties dans des boites de culture de 96 puits à raison de 200 cellules par puits pour les lignées U251 et T98G. Les cellules sont laissées ainsi en développement durant 24h.
[0082] Les cellules sont ensuite traitées pendant 48h avec des doses croissantes de Lomustine à raison de 5 mM à 500 mM pour la lignée U251 et de 100 mM à 1500 mM pour la lignée T98G. Chaque dilution est testée en trois exemplaires. La condition de contrôle consiste en des cellules traitées avec un milieu de culture complet. Les puits vierges ne contiennent que du milieu de culture complet.
[0083] A l’issue des 48h de traitement à la Lomustine, le milieu contenant la Lomustine est retiré et remplacé par du milieu de culture complet frais dans lequel les cellules sont laissées en incubation pendant 72h.
[0084] Un test MTT est ensuite mis en place de la même manière qu’au test précédent concernant la sensibilité au TMZ afin d’évaluer la survie cellulaire dans les différents puits.
[0085] La dose létale 50 (DL50) désigne la concentration de Lomustine pour laquelle la viabilité cellulaire est réduite de 50 % par rapport à la condition de contrôle.
[0086] La figure 11 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr en fonction de la dose de Lomustine reçue et, en B, la moyenne des concentrations de Lomustine mesurées à la DL50 dans 4 tests MTT différents pour les cellules de lignée U251 transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr.
[0087] La figure 12 illustre en A une courbe montrant le pourcentage de cellules vivantes de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr en fonction de la dose de Lomustine reçue et, en B, la moyenne des concentrations de Lomustine mesurées à la DL50 dans 4 tests MTT différents pour les cellules de lignée T98G transfectées avec l’ASO RG6042 ou Scr.
[0088] Il apparait donc que la DL50 à la Lomustine des lignées cellulaires U251 et T98G est diminuée dans les cultures présentant un niveau de HTT réduit.
[0089] La réduction du niveau de HTT entraine une diminution de la DL50 à la Lomustine de :
- 41% dans les cultures de U251 (DL50= 66,79 ± 4,9 mM contre DL50 = 39,64 ± 2,08 mM après traitement avec RG6042) ;
- 47% dans les cultures de T98G (DL50= 279,7 ± 7,09 mM contre DL50 = 149,9 ± 2,85 mM après traitement avec RG6042).
[0090] La diminution des taux de HTT par l'ASO RG6042 sensibilise donc les cellules U251 et T98G à l'agent alkylant Lomustine. [0091] De manière plus générale, il est à noter que les modes de mise en œuvre et de réalisation de l’invention considérés ci-dessus ont été décrits à titre d’exemples non limitatifs et que d’autres variantes sont par conséquent envisageables.

Claims

Revendications
Revendication 1. Oligonucléotide antisens ayant la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine huntingtine dans des cellules de gliomes, pour son utilisation dans la sensibilisation desdites cellules à un traitement anticancéreux, ledit oligonucléotide antisens étant choisi parmi les oligonucléotides antisens de séquence SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 et les oligonucléotides antisens ayant une séquence identique à au moins 50%, de préférence au moins 60%, encore de préférence au moins 70%, de manière préférentielle au moins 80%, préférentiellement au moins 90%, de préférence au moins 92%, encore de préférence au moins 95%, de préférence au moins 96%, de préférence au moins 97%, de préférence au moins 98%, de préférence au moins 99%, avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4.
Revendication 2. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon la revendication 1, ledit oligonucléotide antisens ayant en outre la capacité de diminuer le niveau d’expression de la protéine 6-O-méthylguanine ADN méthyltransférase (MGMT) dans des cellules de gliomes.
Revendication 3. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, ledit oligonucléotide antisens comprenant entre 12 et 35 bases nucléiques.
Revendication 4. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement qui provoque des dommages à l’ADN desdites cellules.
Revendication 5. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement avec un agent alkylant de l’ADN.
Revendication 6. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement avec un ou une combinaison de plusieurs des agents alkylants choisis parmi le témozolomide (TMZ), la lomustine (CCNU), la carmustine (BCNU), la procarbazine et la carboplatine.
Revendication 7. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement du témozolomide (TMZ) et les cellules de gliomes sont sensibilisées de sorte que la dose létale 50 (DL50) au TMZ est diminuée d’au moins 30%, de préférence d’au moins 40%.
Revendication 8. Oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le traitement anticancéreux auquel sont sensibilisées les cellules de gliome est un traitement utilisant des radiations.
Revendication 9. Composition pharmaceutique comprenant au moins un oligonucléotide antisens pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, ou comprenant un sel, un ester, un sel d’un tel ester ou un promédicament pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
Revendication 10. Oligonucléotide antisens selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans le traitement d’une tumeur cérébrale.
Revendication 11. Oligonucléotide antisens selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition selon la revendication 9, pour son utilisation dans le traitement d’un glioblastome multiforme ou astrocytome de type IV.
EP22714905.1A 2021-03-25 2022-03-18 Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux Pending EP4313071A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2102992A FR3121039B1 (fr) 2021-03-25 2021-03-25 Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux
PCT/FR2022/050497 WO2022200720A1 (fr) 2021-03-25 2022-03-18 Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4313071A1 true EP4313071A1 (fr) 2024-02-07

Family

ID=76034767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP22714905.1A Pending EP4313071A1 (fr) 2021-03-25 2022-03-18 Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240158797A1 (fr)
EP (1) EP4313071A1 (fr)
JP (1) JP2024511134A (fr)
CN (1) CN117062610A (fr)
CA (1) CA3207034A1 (fr)
FR (1) FR3121039B1 (fr)
WO (1) WO2022200720A1 (fr)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2836831B1 (fr) * 2002-03-07 2004-06-25 Centre Nat Rech Scient Combinaison chimiotherapie et antisens de la dna demethylase
EP1991677A2 (fr) * 2006-01-26 2008-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions et leurs utilisations dirigées contre la huntingtine
NZ714887A (en) * 2009-09-11 2019-07-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation of huntingtin expression

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022200720A1 (fr) 2022-09-29
CA3207034A1 (fr) 2022-09-29
FR3121039B1 (fr) 2023-03-31
CN117062610A (zh) 2023-11-14
JP2024511134A (ja) 2024-03-12
US20240158797A1 (en) 2024-05-16
FR3121039A1 (fr) 2022-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105641700B (zh) 对抗肌肉病症的方式和方法
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
KR102118429B1 (ko) 마이크로rna 화합물 및 mir-21 활성 조절 방법
JPH04505752A (ja) オリゴヌクレオチドを使用する癌治療用の方法及び組成物
AU2014229985B2 (en) Methods of treating colorectal cancer
JP2024525512A (ja) 治療用核酸及びその使用方法
JP2013511964A (ja) ｍｉＲＮＡ−１００を含む医薬組成物ならびに血管増殖および内皮炎症を調節するためのその使用
KR20250029877A (ko) 면역 질환을 치료하기 위한 비암호화 rna 제제(bcyrn1 및 그의 유도체)
EP4313071A1 (fr) Oligonucléotides anti-sens pour leur utilisation dans un traitement anticancéreux
EP3876948B1 (fr) Utilisation du microrna mir-27a-5p pour traiter l&#39;inflammation intestinale induite par clostridium difficile
JP2021195364A (ja) Ｒｎａを含有する抗腫瘍剤、免疫細胞の活性化方法、腫瘍細胞の転移の抑制方法、免疫賦活剤、抗腫瘍剤の抗腫瘍効果の増強剤、及び医薬組成物
JP2012219085A (ja) 頭頸部癌及び食道癌用抗癌剤及び増強剤
JP2022541984A (ja) Ｅｐｈ２ａアプタマーおよびその使用
JP2017082002A (ja) 核酸移送担体
EP3999075A1 (fr) Sequences siarn ciblant l&#39;expression des genes jak1 ou jak3 humains pour une utilisation therapeutique
US20150140020A1 (en) Pharmaceutical composition for treating adverse reactions due to administration of spiegelmers
CA3163139A1 (fr) Compositions et methodes pour le traitement du cancer
JP2010536379A (ja) アポトーシスから膵島細胞を保護するため、そしてその機能を保持するためのＥＩＦ−５Ａ１のｓｉＲＮＡの使用
Hu et al. Suppression of PARP1 Enhances PTEN mRNA Therapy in Castration-Resistant Prostate Cancer by Glycolysis Disruption
CN120693153A (zh) 可离子化脂质和包括其的纳米颗粒
Ren et al. Overcoming Multidrug Resistance in Human Carcinoma Cells by an Antisense Oligodeoxynucleotide− Doxorubicin Conjugate in Vitro and in Vivo
US20250243486A1 (en) Compositions and methods for inhibiting stag1 expression and uses thereof
WO2008055317A1 (fr) Compositions et procédés pour le traitement du cancer de la prostate
FR2733913A1 (fr) Sequence d&#39;adn a titre de medicament, et compositions pharmaceutiques en contenant
CA3257253A1 (fr) Modulation de polarité de cellules satellites et de division de cellules asymétrique

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20231010

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20240930