EP4312989A1 - Formulation pour la délivrance d'arn messager - Google Patents

Formulation pour la délivrance d'arn messager

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Publication number
EP4312989A1
EP4312989A1 EP22719866.0A EP22719866A EP4312989A1 EP 4312989 A1 EP4312989 A1 EP 4312989A1 EP 22719866 A EP22719866 A EP 22719866A EP 4312989 A1 EP4312989 A1 EP 4312989A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
mrna
lipid
formulation
surfactant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22719866.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabrice Navarro Y Garcia
Patrice Marche
Adrien NOUGAREDE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante Et De Larecherche Medicale Inserm
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Grenoble Alpes
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Grenoble Alpes
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Grenoble Alpes, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4312989A1 publication Critical patent/EP4312989A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
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    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
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    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • TITLE Formulation for messenger RNA delivery
  • the present invention relates to a nanoemulsion type formulation useful for the delivery of messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • Messenger ribonucleic acid is a transient copy of a portion of DNA corresponding to one or more genes and coding for proteins.
  • mRNA is used as an intermediate by cells for protein synthesis.
  • mRNA is a linear single-stranded copy of DNA and is composed of RNA, which includes the protein coding region flanked by non-coding regions. There are three main functional regions in an mRNA: the 5' untranslated region (5'-UTR), the coding cistron(s) (ORF region) and finally the 3' untranslated region (3'-UTR).
  • the two untranslated regions or UTR regions (from the English “untranslated regions”) often contain signals for expression or RNA processing.
  • mRNA further contains a 5' cap and a 3' poly(A) tail, which allow efficient translation of mRNA into protein.
  • the information carried by the ORF region of the mRNA consists of a series of codons, consecutive triplets of nucleotides which each code for an amino acid of the corresponding protein.
  • mRNAs The development of drugs or vaccines based on mRNAs is sought, in order to express a protein of interest in a host cell. Once in the cytoplasm of the host cell, the mRNA is read by the ribosome and translated into a protein that has the desired therapeutic activity.
  • the prerequisite is therefore that the mRNA reaches the cytoplasm.
  • the delivery systems used include lipid nanoparticles (LNP) or liposomes, making it possible to protect the mRNA by encapsulating it within a nanoparticle or a lipid vesicle.
  • LNP lipid nanoparticles
  • the encapsulation of the mRNA at the heart of an LNP advantageously makes it possible to protect it from degradation by nucleases.
  • WO 2014/032953 describes a formulation in the form of a nanoemulsion, comprising a continuous aqueous phase and at least one dispersed phase, and comprising an amphiphilic lipid, a cationic surfactant, a co-surfactant, a solubilizing lipid, and a sequence nucleotide capable of modulating the interference mechanisms.
  • This nucleotide sequence is short, since it comprises less than 200 bases for a single-stranded nucleotide sequence or less than 200 base pairs for a double-stranded nucleotide sequence.
  • microRNA it is preferably microRNA or SiRNA.
  • siRNA GFP-22 siRNA rhodamine, siGFP or miRIDIAN Mimic Fluman has-miR612 microRNA were used.
  • this application only shows the feasibility of this approach with very short RNAs, and does not suggest that the vehicle can be adapted for the delivery of sequences having more than 200 bases.
  • mRNA is a fragile molecule and sensitive to RNA degrading enzymes (RNase) which are present in most biological media.
  • RNase RNA degrading enzymes
  • Complexing the mRNA on the surface of the lipid nanoparticles therefore makes it accessible to RNases, all the more so since it is a large molecule which, once complexed on the lipid nanoparticle, exceeds well beyond the lipid nanoparticle. For this reason, the person skilled in the art is discouraged from complexing large nucleotide sequences on the surface of lipid nanoparticles.
  • Another prejudice against the complexation method is the strong affinity of the electrostatic interaction between a large (negatively charged) nucleic acid, such as mRNA, and a cationic (positively charged) lipid nanoparticle, which can interfere with the release of mRNA from the mRNA-LNP complex once it is in the cytoplasm of the host cell. Because it is not only necessary for the mRNA to reach the cytoplasm, but also for it to be released so that it can perform its role.
  • the invention relates to a formulation in the form of a nanoemulsion, comprising a continuous aqueous phase and at least one dispersed phase in the form of lipid nanoparticles, and comprising:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 11 to 23 carbon atoms, an ester or an amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and phosphatidylethanolamine , and
  • hydrophilic group comprising at least one cationic group chosen from:
  • hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group
  • co-surfactant comprising at least one poly(ethylene oxide) chain comprising at least 25 ethylene oxide units
  • a fusogenic lipid where the molar percentages of amphiphilic lipid, of cationic surfactant and of co-surfactant are compared to the cumulated molar proportions of the amphiphilic lipid, of the cationic surfactant, of the co-surfactant and of the possible fusogenic lipid, in which at least one messenger RNA, the single-stranded nucleotide sequence of which comprises at least 300 bases, is complexed to the surface of the lipid nanoparticles, the N/P ratio of the quantity of positive charges of the cationic surfactant relative to the quantity of negative charges of the messenger RNA being greater than or equal to 2/1.
  • such a formulation is stable and has the ability to protect from the external biological environment and to efficiently deliver mRNA so that it can be translated into protein by a eukaryotic cell.
  • the formulation advantageously has good bioavailability and makes it possible to limit the degradation of the mRNA generally observed with other delivery systems, in particular to limit the degradation by RNases.
  • the mRNA is complexed on the surface of a lipid nanoparticle, which is advantageously very stable on storage.
  • the complex mRNA-lipid nanoparticle can be stored for at least two weeks at 4°C without any degradation being observed.
  • the emulsion is an oil-in-water type emulsion. It can be single or multiple, in particular by comprising in the dispersed phase a second aqueous phase. Preferably, it is simple. When it is simple, the lipid nanoparticles do not include an internal aqueous phase, and are therefore not liposomes.
  • the formulation according to the invention comprises a cationic surfactant comprising:
  • group R representing a linear hydrocarbon chain comprising from 11 to 23 carbon atoms, an ester or an amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine, such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • hydrophilic group comprising at least one cationic group chosen from:
  • hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group, said polymeric group being chosen in particular from:
  • poly(ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and comprising at least one cationic group.
  • polysaccharide such as dextran, cellulose or chitosan, having in particular molecular masses between 0.5 and 20 kDa, for example between 1 and 12 kDa,
  • a polyamine such as a chitosan or a polylysine, having in particular molecular masses of between 0.5 and 20 kDa, for example between 1 and 12 kDa.
  • each cationic surfactant is preferably as defined above.
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine is meant a group of formula: in which - R3 and R4 independently represent a linear hydrocarbon chain comprising from 11 to 23 carbon atoms,
  • - M represents Fl or a cation.
  • the cationic groups of the cationic surfactant are typically:
  • - oniums chosen from ammonium, imidazolium, pyridinium, pyrrolidinium, piperidinium, phosphonium or sulfonium groups, or
  • - metal complexes between a radical of a mono- or multi-dentate chelating organic group, for example phenanthroline, pyridine, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), porphyrins, phthalocyanines, clorines, bacteriochlorines complexed with an inorganic cation, such as Ca 2+ , Al 3+ , Ni + , Zn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ or Cu 2+ ,
  • a radical of a mono- or multi-dentate chelating organic group for example phenanthroline, pyridine, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), porphyrins, phthalocyanines, clorines, bacteriochlorines complexed with an inorganic cation, such as Ca 2+ , Al 3+ , Ni + , Zn 2+
  • the cationic group (or each cationic group if there are several cationic groups) of the cationic surfactant (of each cationic surfactant if there are several) is not ionizable (i.e. the (each) cationic group is neither proton donor nor acceptor).
  • the nitrogen of this function (each nitrogen if there are several of them) does not carry (or cannot carry) a hydrogen.
  • An example of a non-ionizable ammonium group is - + NMe3.
  • anions are associated with the cationic group(s) so that the formulation is electrically neutral.
  • the nature of the anions is not limited. By way of illustration, mention may be made of halides, in particular chloride or bromide, or trifluoroacetate.
  • the nature of the linking group linking the lipophilic group(s) to the hydrophilic group(s) comprising at least one cationic group is not limited. Examples of linking groups are provided below (group L).
  • the cationic surfactant preferably each cationic surfactant in the formulation, has the following formula (A):
  • - n is an integer greater than or equal to 1, generally between 1 and 50,
  • Lipo represents a lipophilic group as defined above
  • Hydro represents a hydrophilic group as defined above comprising at least one cationic group
  • - vn is an integer representing the charge of the cation [(Lipo)iL-(Hydro) h ].
  • L is such that:
  • L is a divalent linking group chosen from:
  • Alk group being an alkylene comprising from 1 to 6 carbon atoms
  • a Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk or Z-Alk-Z group where Alk and Z are as defined above and where the two Z groups of the Z-Alk-Z group are the same or different, when one of the groups I or h represents 1, and the other represents 2,
  • L is a trivalent group chosen from a phosphate group OP-(0 -) 3 , a group derived from glycerol of formula -0-CH 2 -CH-(0-)CH 2 -0- and a cyclic trivalent radical of 5 to 6 atoms,
  • L is a cyclic multivalent radical of 5 to 6 atoms.
  • L is such that:
  • L is a divalent linking group chosen from:
  • L is a trivalent group chosen from a phosphate group OP-(0-) 3 and a group derived from glycerol of formula -0-CH 2 - CH-(0-)CH 2 -0-.
  • I and h preferably independently represent 1 or 2.
  • the Z groups defined above are not cleavable, in particular under the conditions of use of the formulation (at the pH of the continuous aqueous phase in particular).
  • the hydrophilic group of the cationic surfactant (preferably of each cationic surfactant) is a linear or branched alkyl group comprising from 1 to 12 carbon atoms and interrupted and/or substituted by at least one cationic group.
  • cationic surfactants mention may be made of:
  • Lipo is a lipophilic group as defined above
  • m1 represents 1 or 2 and R30, R31 and R32 independently represent H, Me or -CH 2 - CH 2 -OH, each Lipo is independently a lipophilic group as defined above, and R33 represents H, Me or -CH 2 -CH 2 -OH, Lipo is a lipophilic group as defined above, and R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41, R42 and R43 independently represent H,
  • the cationic surfactant (preferably each cationic surfactant of the formulation) is chosen from: L/[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-/V,/V,/V-trimethylammonium (DOTMA), 1,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), - A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium (DOTIM), and
  • DOGS dioctadecylamidoglycylspermine
  • DOTAP 1,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane
  • the hydrophilic group of the cationic surfactant (preferably of each cationic surfactant) is a hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group.
  • the cationic group(s) can be terminal or pendent group(s).
  • the hydrophilic polymeric group is a poly(ethylene oxide)
  • the cationic group(s) is (are) generally located on a terminal group at the end of the chain poly(ethylene oxide).
  • the cationic group(s) is (are) generally located on a terminal group at the end of the polysaccharide chain.
  • the cationic group(s) is (are) generally a pendant group(s), in particular -NH 3 + groups present in an acid medium on chitosan.
  • the cationic group(s) is (are) a terminal group(s).
  • the pendant groups of anionic surfactants adjacent to the surface of the lipid nanoparticles of the dispersed phase repel each other by electrostatic interactions and, consequently, the formulations comprising cationic surfactants whose Hydro group comprises pendant groups are generally less stable.
  • the cationic group(s) is (are) pendant group(s). It is advantageously possible to use a cationic surfactant whose hydrophilic group comprises several pendent cationic groups, and therefore to obtain a more positively charged formulation, and which will all the better allow the complexation of negative species such as mRNAs.
  • the preferred hydrophilic polymeric group is a radical of a poly(ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and comprising at least one cationic group.
  • the cationic surfactant (preferably each cationic surfactant in the formulation) has one of the following formulas: in which :
  • R 2 , R 3 and R 4 independently represent a linear hydrocarbon chain comprising from 11 to 23 carbon atoms
  • Ai A 2 , A 3 and A represent O or NH
  • - m, n, 0 and p independently represent whole numbers from 3 to 500, preferably 20 to 200, and
  • - a represents an integer from 20 to 120
  • - M represents H or a cation
  • An, A I2 and A 13 independently represent a group - + NR 20 R 2I R 22 , in which R 20 , R 21 and R 22 independently represent H, Me or -CH 2 -CH 2 -OH.
  • An represents - + NH 3 and the cationic surfactant (preferably of each cationic surfactant) has the following formula: in which A 2 , R 2 and n are as defined above.
  • R 2 represents C17H35.
  • hydrophilic polymeric group would allow:
  • the formulation according to the invention comprises at least two cationic surfactants, preferably exactly two, of which: one is chosen from: L/[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-/V ,/V,/V-trimethylammonium (DOTMA), 1,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3- bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM), and
  • DOGS dioctadecylamidoglycylspermine
  • DOTAP 1,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane
  • a cationic surfactant comprising:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 11 to 23 carbon atoms, an ester or an amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and phosphatidylethanolamine , such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group
  • said polymeric group being chosen from: a poly(ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units , and comprising at least one cationic group,
  • a polysaccharide such as dextran, cellulose or chitosan
  • a polyamine such as a chitosan or a polylysine
  • the formulation according to the invention comprises, as cationic surfactants:
  • a cationic surfactant comprising:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 11 to 23 carbon atoms, an ester or an amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and phosphatidylethanolamine , such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • poly(ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and comprising at least one cationic group.
  • the formulation according to the invention comprises, as cationic surfactants:
  • the formulation is preferably free of cationic lipid comprising an -S-S- group, or more generally comprising a cleavable group, and/or comprising an ionizable group.
  • the formulation does not comprise any other cationic lipid than those mentioned above.
  • the cationic lipid(s) described above is/are then the only cationic lipid(s) of the formulation.
  • the cationic surfactant is located in the crown of the lipid nanoparticles of the formulation. Thanks to the positive charge(s) of its cationic group(s), it binds by electrostatic interactions to the mRNAs and makes it possible to maintain the mRNAs on the surface of the lipid nanoparticles.
  • the formulation comprises from 15 to 70 molar% of cationic surfactant relative to the cumulative molar proportions of the amphiphilic lipid, of the cationic surfactant, of the co-surfactant and of the optional fusogenic lipid. Below 15%, the formulation does not include enough positive charges and the subsequent complexation of the “premix” formulation with the mRNA (negatively charged) is insufficient. Beyond 70%, the formulations are not stable, and generally cannot even be formulated (the formation of the nanoemulsion is not possible because the lipid nanoparticles coalesce to form two phases), and the lipid nanoparticles generally become toxic to the cells.
  • the formulation comprises several cationic surfactants, it is their cumulated molar quantity which must respect the range of 15 to 70% molar. In general, within the meaning of the application, when there are several components of the same type, the proportion, mass or quantity of all of them must be taken into account.
  • the formulation according to the invention comprises a fusogenic lipid, which is capable of facilitating cytosolic release by destabilization of the endosomal membrane, called “helper” lipid.
  • this lipid is dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE).
  • This lipid makes it possible to promote the endosomal escape of the lipid nanoparticles of the formulation according to the invention, and therefore of the mRNA that they contain.
  • the fusogenic lipid is located in the crown of the lipid nanoparticles of the formulation.
  • the formulation comprises at least one amphiphilic lipid, which is located in the crown of the lipid nanoparticles of the formulation.
  • the composition In order to form a stable nanoemulsion, it is necessary to include in the composition at least one amphiphilic lipid as a surfactant.
  • the amphiphilic nature of the surfactant ensures the stabilization of the lipid nanoparticles within the aqueous continuous phase. Below 5 molar % of amphiphilic lipid relative to the cumulative molar proportions of amphiphilic lipid, cationic surfactant, co-surfactant and any fusogenic lipid, the formulations are not stable, and generally cannot even be formulated (the formation of the nanoemulsion is not possible because the lipid nanoparticles coalesce to form two phases).
  • the formulation comprises from 5 to 85% molar, preferably from 5 to 75% molar, in particular from 5 to 50% molar and very particularly from 8 to 30% molar of amphiphilic lipid relative to the cumulative molar proportions of the amphiphilic lipid , cationic surfactant, co-surfactant and optional fusogenic lipid.
  • the amount of amphiphilic lipid advantageously contributes to controlling the size of the dispersed phase of the nanoemulsion.
  • Amphiphilic lipids have a hydrophilic part and a lipophilic part. They are generally chosen from compounds whose lipophilic part comprises a saturated or unsaturated, linear or branched chain, having from 8 to 30 carbon atoms. They can be chosen from phospholipids, cholesterols, lysolipids, sphingomyelins, tocopherols, glucolipids, stearylamines, cardiolipins of natural or synthetic origin; molecules composed of a fatty acid coupled to a hydrophilic group via an ether or ester function, such as sorbitan esters such as, for example, sorbitan monooleate and monolaurate sold under the names Span® by the company Sigma; polymerized lipids; lipids conjugated with short chains of polyethylene oxide (PEG) such as the nonionic surfactants sold under the trade names Tween® by the company ICI Americas, Inc.
  • PEG polyethylene oxide
  • Phospholipids are the preferred amphiphilic lipids.
  • Lecithin is the particularly preferred amphiphilic lipid.
  • the formulation also comprises a solubilizing lipid comprising at least one fatty acid glyceride, which is located in the dispersed phase of the nanoemulsion, more precisely in the core of the lipid nanoparticles.
  • a solubilizing lipid comprising at least one fatty acid glyceride, which is located in the dispersed phase of the nanoemulsion, more precisely in the core of the lipid nanoparticles.
  • the main purpose of this compound is to solubilize the poorly soluble amphiphilic lipid in the dispersed phase of the nanoemulsion.
  • the solubilizing lipid is a lipid exhibiting an affinity with the amphiphilic lipid sufficient to allow its solubilization.
  • the solubilizing lipid is solid at room temperature (20°C).
  • amphiphilic lipid is a phospholipid
  • it may be in particular: fatty acid and fatty alcohol esters, such as cetylpalmitate, or - glycerol derivatives, and in particular glycerides obtained by esterification of glycerol with fatty acids.
  • the solubilizing lipid used is advantageously chosen according to the amphiphilic lipid used. It will generally have a similar chemical structure, in order to ensure the desired solubilization. It can be an oil or a wax. Preferably, the solubilizing lipid is solid at room temperature (20°C), but liquid at body temperature (37°C).
  • Preferred solubilizing lipids are esters of fatty acids and of fatty alcohol, such as cetylpalmitate, or glycerides of fatty acids, in particular of saturated fatty acids, and in particular of fatty acids saturated containing 8 to 18 carbon atoms, more preferably 12 to 18 carbon atoms.
  • it is a mixture of different glycerides.
  • they are saturated fatty acid glycerides comprising at least 10% by weight of C12 fatty acids, at least 5% by weight of C14 fatty acids, at least 5% by weight of C16 fatty acids and at least 5% by weight of C18 fatty acids.
  • they are saturated fatty acid glycerides comprising 0% to 20% by weight of C8 fatty acids, 0% to 20% by weight of C10 fatty acids, 10% to 70% by weight of C12 fatty acids, 5% to 30% by weight of C14 fatty acids, 5% to 30% by weight of C16 fatty acids and 5% to 30% by weight of C18 fatty acids.
  • Table 1 Fatty acid composition of Suppocire ® NC from Gattefossé
  • the aforementioned solubilizing lipids make it possible to obtain a formulation in the form of an advantageously stable nanoemulsion.
  • the aforementioned solubilizing lipids make it possible to obtain lipid nanoparticles having an amorphous core.
  • the core thus obtained has a high internal viscosity without however having any crystallinity.
  • crystallization is detrimental to the stability of the nanoemulsion because it generally leads to an aggregation of the lipid nanoparticles and/or to an expulsion of the encapsulated molecules outside the lipid nanoparticles. These physical properties promote the physical stability of the nanoemulsion.
  • the amount of solubilizing lipid can vary widely depending on the nature and amount of amphiphilic lipid present in the dispersed phase.
  • the core of the lipid nanoparticles (including the solubilizing lipid, the possible oil, the possible imaging agent, the possible therapeutic agent if it is lipophilic) comprises from 1 to 100% by weight, preferably from 5 to 80% by weight and very particularly from 40 to 75% by weight of solubilizing lipid.
  • the dispersed phase may also comprise one or more other oils, which are located in the core of the lipid nanoparticles.
  • the oils used preferably have a hydrophilic-lipophilic balance (HLB) of less than 8 and even more preferably between 3 and 6.
  • HLB hydrophilic-lipophilic balance
  • the oils are used without chemical or physical modification prior to the formation of the emulsion.
  • oils are generally chosen from biocompatible oils, and in particular from oils of natural (vegetable or animal) or synthetic origin.
  • oils of natural vegetable origin among which are in particular soybean, linseed, palm, peanut, olive, grapeseed and sunflower oils; synthetic oils among which include in particular triglycerides, diglycerides and monoglycerides. These oils can be first expressions, refined or interesterified.
  • Preferred oils are soybean oil and flaxseed oil.
  • the oil will be contained in the core of the lipid nanoparticles (including the solubilizing lipid, the possible oil, the possible imaging agent, the possible therapeutic agent if it is lipophilic) in a proportion ranging from from 1 to 80% by weight, preferably between 5 and 50% by weight and very particularly 10 to 30% by weight.
  • the formulation is free of squalene.
  • the dispersed phase may additionally contain other additives such as colorants, stabilizers, preservatives or other active principles, in an appropriate amount.
  • additives such as colorants, stabilizers, preservatives or other active principles, in an appropriate amount.
  • the formulation includes a co-surfactant, which stabilizes the nanoemulsion.
  • the co-surfactants that can be used in the formulations used in the invention are generally water-soluble surfactants. They comprise at least one poly(ethylene oxide) chain comprising at least 25, in particular at least 30, preferably at least 35, ethylene oxide units. The number of ethylene oxide units is usually less than 500.
  • Formulations comprising a co-surfactant comprising a poly(ethylene oxide) chain comprising less than 25 ethylene oxide units are in fact not stable. Generally, it is not even possible to prepare the nanoemulsion.
  • the presence of the chain composed of ethylene oxide units of the co-surfactant would make it possible to protect the mRNAs, located on the surface of the lipid nanoparticles, from the nucleases of the medium in which the formulation is administered/used, and therefore the degradation of said mRNAs by these nucleases.
  • co-surfactants By way of example of co-surfactants, mention may in particular be made of the conjugated polyethylene glycol/phosphatidyl-ethanolamine (PEG-PE) compounds, fatty acid and polyethylene glycol ethers such as the products sold under the trade names Brij ® (for example Brij ® 35, 58, 78 or 98) by the company ICI Americas Inc., fatty acid and polyethylene glycol esters such as the products sold under the trade names Myrj ® by the company ICI Americas Inc.
  • PEG-PE conjugated polyethylene glycol/phosphatidyl-ethanolamine
  • the co-surfactant is located both in the continuous aqueous phase and in the dispersed phase.
  • the hydrophobic part of the co-surfactant is inserted into the lipid nanoparticles of the dispersed phase, while the polyalkoxylated chains are in the continuous aqueous phase.
  • the described molar or mass percentages of dispersed phase are calculated considering that the co-surfactant belongs to the dispersed phase.
  • the formulation comprises from 10% to 55% molar of co-surfactant relative to the cumulative molar proportions of the amphiphilic lipid, of the cationic surfactant, of the co-surfactant and of any fusogenic lipid.
  • the formulations are not stable, and generally cannot even be formulated (the formation of the nanoemulsion is not possible because the lipid nanoparticles coalesce to form two phases).
  • the subsequent complexation of the "premix" formation with the mRNA does not take place, probably because the positive charges of the cationic surfactant are masked by the poly(ethylene oxide) chains of the co-surfactant. , and therefore more accessible to bind by electrostatic binding to mRNA.
  • the co-surfactant may also have other effects in the envisaged application of the nanoemulsion.
  • the dispersed phase of the nanoemulsion is surface-grafted with molecules of interest such as biological ligands, in order to increase the specific targeting of an organ.
  • molecules of interest such as biological ligands
  • the surface grafting is carried out by coupling the molecules of interest or their precursors with an amphiphilic compound, in particular with the co-surfactant.
  • the nanoemulsion then comprises a grafted co-surfactant.
  • the co-surfactant plays the role of a spacer making it possible to accommodate the molecules of interest at the surface.
  • the molecules of interest can be for example:
  • - biological targeting ligands such as antibodies, peptides, saccharides, aptamers, oligonucleotides or compounds such as folic acid;
  • a stealth agent an entity added in order to give the nanoemulsion stealth vis-à-vis the immune system, to increase its circulation time in the body, and to slow down its elimination.
  • the biological ligand is a peptide comprising one or more cysteine (for example to use the formulation for the treatment of a disease)
  • the grafting to the alkylene oxide chain of the surfactant can be ensured by thiol maleimide coupling.
  • the formulation comprises an imaging agent, which advantageously makes it possible to visualize the distribution of the lipid nanoparticles in the cells or the body of the patient, and therefore the distribution of the mRNAs.
  • the imaging agent can in particular be used in imaging of the type:
  • PET positron emission tomography
  • the imaging agent possibly being a compound comprising a radionuclide, such as 18 F, 11 C, a chelate of metal cations 68 Ga, 64 Cu ),
  • the imaging agent may be a compound comprising a radionuclide for example 123 l, or a chelate of 99m Tc or 1 1 1 In),
  • the imaging agent may be a gadolinium chelate or a magnetic nanocrystal such as an iron oxide, manganese oxide or iron-platinum FePt nanocrystal), - optical imaging or X-ray imaging (the imaging agent possibly being a lipophilic fluorophore or a contrast agent, for example an iodine molecule such as iopamidol, amidotrizoate, or gold nanoparticles).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the imaging agent possibly being a lipophilic fluorophore or a contrast agent, for example an iodine molecule such as iopamidol, amidotrizoate, or gold nanoparticles.
  • the imaging agent is a lipophilic fluorophore making it possible to carry out optical imaging.
  • the nature of the lipophilic fluorophore(s) that can be used is not critical as long as they are compatible with in vivo imaging (i.e. they are biocompatible and non-toxic).
  • the fluorophores used as imaging agent absorb and emit in the visible or near infrared.
  • the preferred fluorophores absorb and emit in the near infrared. Indeed, so that the excitation light and the light emitted by the fluorophore can better cross the tissues, it is advisable to use fluorophores absorbing and emitting in the near infrared, that is to say at a length of wave between 640 and 900 nm.
  • lipophilic fluorophore By way of lipophilic fluorophore, mention may for example be made of the compounds described in chapter 13 (“Probes for Lipids and Membranes”) of the InVitrogen catalog. More specifically, mention may in particular be made, by way of fluorophore, of indocyanine green (ICG), fatty acid analogues and phospholipids functionalized with a fluorescent group, such as the fluorescent products sold under the trade names Bodipy ( R) such as Bodipy (R) 665/676 (Ex/Em.); lipophilic carbocyanine derivatives such as 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine (DiD) perchlorate, for example sold under the reference D-307, 3,3'-perchlorate dihexadecyloxacarbocyanine (DiO), for example sold under the reference D1125, 1,1'-dihexade
  • the fluorophore is indocyanine green, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate, 3,3'- dihexadecyloxacarbocyanine, or 1,T-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate.
  • Therapeutic agent is indocyanine green, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate, 3,3'- dihexadecyloxacarbocyanine, or 1,T-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate.
  • the formulation according to the invention may comprise a therapeutic agent.
  • the therapeutic agents capable of being encapsulated in the nanoemulsion according to the invention comprise in particular the active principles acting by chemical, biological or physical means.
  • they may be pharmaceutical active ingredients or biological agents such as DNA, proteins, peptides or antibodies or even agents useful for physical therapies such as compounds useful for thermotherapy, compounds releasing singlet oxygen when excited by light useful for phototherapy and radioactive agents.
  • they are active principles administered parenterally.
  • the therapeutic agent will be encapsulated by the dispersed phase or will be located at the interface of the two phases.
  • the nature of the therapeutic agents encapsulated in the nanoemulsion is not particularly limited.
  • the nanoemulsion is particularly interesting for poorly soluble compounds, which are difficult to formulate in conventional administration systems and for active principles useful for phototherapy, whose quantum yield can be preserved.
  • the formulation described is particularly interesting for the encapsulation of therapeutic agents which degrade at high temperature.
  • agents used in the treatment of AIDS the agents used in the treatment of heart diseases, analgesics, anesthetics, anorectics, anthelmintics, antiallergics, antianginals, antiarrhythmics, anticholinergics, anticoagulants, antidepressants, antidiabetics, antidiuretics, antiemetics, anticonvulsants, antifungals, antihistamines, antihypertensives, anti-inflammatory drugs, antimigraine drugs, antimuscarinics, antimycobacterials, anticancer drugs including antiparkinsonians, antithyroid drugs, antivirals, astringents, blocking agents, blood products, blood substitutes, cardiac inotropic agents, cardiovascular agents, central nervous system agents, chelating agents, chemotherapy, colleges hematopoietic growth promoters, corticosteroids, antitussives, dermatological agents, diuretics, dopaminergics,
  • anti-cancer drugs such as taxol (paclitaxel), doxorubicin and cisplatin in particular for therapeutic applications, or immunostimulating agents, adjuvants, TLR agonists, in particular for prophylactic applications (vaccines)
  • radioactive isotopes and photosensitizers.
  • the photosensitizers there may be mentioned in particular those belonging to the class of tetrapyrroles such as porphyrins, bacteriochlorins, phthalocyanines, chlorins, purpurines, porphycenes, pheophorbides, or those belonging to the class of texaphyrins or hypericins.
  • the first-generation photosensitizers mention may be made of hemato-porphyrin and a mixture of hemato-porphyrin (HpD) derivatives (sold under the trade name Photofrin® by Axcan Pharma).
  • second-generation photosensitizers mention may be made of meta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC; trade name Foscan ® , Biolitec AG) and the monoacid derivative of cycle A of benzoporphyrin (BPD-MA sold under the trade name Visudyne ® by QLT and Novartis Opthalmics).
  • mTHPC meta-tetra-hydroxyphenyl chlorine
  • BPD-MA the monoacid derivative of cycle A of benzoporphyrin sold under the trade name Visudyne ® by QLT and Novartis Opthalmics.
  • the formulations of second-generation photosensitizers which combine with these photosensitizers a molecule (lipid, peptide, sugar, etc.) qualified as a carrier which allows their selective delivery to the level of the tumor tissue are called third-generation photosensitizers.
  • the formulation is free of SiRNA and/or microRNA, and more generally free of nucleotide sequence capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms, or even free of RNA other than mRNA, or even free of nucleotide sequence other than mRNA.
  • the therapeutic agent can be formulated directly in its active form or in the form of a prodrug. Further, it is contemplated that several therapeutic agents may be formulated in combination in the nanoemulsion.
  • the amount of therapeutic agent depends on the intended application as well as the nature of the agent. However, it will generally be sought to formulate the nanoemulsion with a maximum concentration of therapeutic agent, in particular when it comes to poorly soluble therapeutic agents, in order to limit the volume and/or the duration of administration to the patient.
  • the molar proportion of the core components of the lipid nanoparticles relative to the components of the lipid nanoparticles, without taking into account the molar amount of the mRNA(s), is 10 to 80%, especially 25 to 75%, of preferably from 33.35 to 73.99%.
  • the molar proportion (mol/mol) of the cumulated molar quantities of solubilizing lipid, of the possible oil, of the possible imaging agent, of the possible lipophilic therapeutic agent) compared to the molar quantity of the dispersed phase i.e. the cumulated molar quantity of all the components of the dispersed phase, except that of the mRNA(s), i.e.
  • the cumulated molar quantity of solubilizing lipid, any oil , possible imaging agent, possible lipophilic therapeutic agent, amphiphilic lipid, cationic surfactant, co-surfactant, possible fusogenic lipid, possible amphiphilic therapeutic agent is generally from 10 to 80%, in particular from 25 to 75%, preferably from 33 .35 to 73.99%.
  • the mass proportion (wt/wt) of the core components of the lipid nanoparticles relative to the components of the lipid nanoparticles, without taking into account the weight of the mRNA(s), is 10 to 60%, in particular 20 to 60 %, preferably from 23.53 to 59.51%.
  • the mass proportion of the cumulated masses of the solubilizing lipid, of the possible oil, of the possible imaging agent, of the possible lipophilic therapeutic agent with respect to the dispersed phase i.e. to the mass of all components of the dispersed phase except mRNA, i.e.
  • the cumulative masses of solubilizing lipid / possible oil / possible imaging agent / possible lipophilic therapeutic agent / amphiphilic lipid / cationic surfactant / co surfactant/possible fusogenic lipid, possible amphiphilic therapeutic agent is generally from 10 to 60%, in particular from 20 to 60%, preferably from 23.53 to 59.51%.
  • These molar and/or mass proportions are particularly suitable for the "premix" formulation (that used to prepare the formulation according to the invention, before complexation of the mRNA) to be stable on storage, in particular for it to be stable while being stored more than 2 years at 4°C.
  • the stability can in particular be measured by following the size of the lipid nanoparticles, their polydispersity index and/or their zeta potential (for example by quasi-elastic light scattering, in particular by a device of the ZetaSizer type, Malvern).
  • This stability of the “premix” formulation is important for the applications envisaged. It is particularly interesting to be able to store the “premix” formulation and to carry out the complexation with the mRNA just before using the formulation according to the invention.
  • the aqueous phase of the nanoemulsion used in the invention preferably consists of water and/or a buffer such as a phosphate buffer such as for example PBS ("Phosphate Buffer Saline”) or a saline solution, especially sodium chloride.
  • a buffer such as a phosphate buffer such as for example PBS ("Phosphate Buffer Saline") or a saline solution, especially sodium chloride.
  • the continuous aqueous phase also comprises a thickening agent such as glycerol, a saccharide, oligosaccharide or polysaccharide, a gum or even a protein, preferably glycerol.
  • a thickening agent such as glycerol, a saccharide, oligosaccharide or polysaccharide, a gum or even a protein, preferably glycerol.
  • the aqueous phase advantageously comprises from 0 to 50% by weight, preferably from 1 to 30% by weight and very particularly from 5 to 20% by weight of thickening agent.
  • the aqueous phase may also contain other additives such as colorants, stabilizers and preservatives in appropriate quantities.
  • the proportion of dispersed phase and aqueous phase is highly variable. However, most often, the nanoemulsions will be prepared with 1 to 50%, preferably 5 to 40% and very particularly 10 to 30% by weight of dispersed phase (without taking into account the mRNA) and 50 to 99%, of preferably 60 to 95% and very particularly 70 to 90% by weight of aqueous phase.
  • mRNA Messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • the single-stranded nucleotide sequence of which comprises at least 300 bases is complexed to the surface of the lipid nanoparticles.
  • This mRNA can be translated into protein by a eukaryotic cell.
  • nucleotide sequence is single-stranded, and it comprises at least 300 bases, typically at least 400 bases, in particular at least 500 bases, preferably at least 1000 bases, particularly preferably at least 2000 bases, or even more than 10,000 bases. Generally, it comprises less than 50,000 bases.
  • mRNA typically includes (and usually consists of) a 5' cap, a 5'-UTR region, an ORF region, a 3'-UTR region, and a 3' poly(A) tail.
  • mRNA can be natural or synthetic.
  • the mRNA may in particular be a synthetic mRNA transcribed in vitro (IVT mRNA), for example as described in the article Sahin et al. Nature Reviews 13, 2014, 759.
  • IVT mRNA synthetic mRNA transcribed in vitro
  • the synthetic mRNA may comprise one or more non-natural bases, chosen in particular from uridine, pseudoridine, N1-methyl-pseudouridine, 5-methoxy-uridine and 5-methyl-cytidine, provided that the mRNA remains capable of being translated into protein by a eukaryotic cell.
  • 3'-UTR region can be stabilized, in particular by a stabilization sequence rich in pyrimidines.
  • the 3'UTR region is that of a- or b-globin.
  • Synthetic mRNA usually includes a 3' poly(A) tail.
  • the mRNA is not covalently linked to the other components of the lipid nanoparticles.
  • the mRNA is not covalently linked either to the co-surfactant, or to the amphiphilic lipid, or to the possible imaging agent. This is very advantageous because the mRNAs, once released in their site of action, are not denatured and can play the expected role.
  • An mRNA includes phosphodiester bonds, which include negatively charged phosphate groups. mRNA therefore naturally carries negative charges.
  • the mRNAs are maintained on the surface of the lipid nanoparticles of the dispersed phase of the formulation thanks to the electrostatic interactions with the positive charges of the cationic surfactants.
  • lipid nanoparticles are therefore located on the surface of the lipid nanoparticles, at the level of the crown of the lipid nanoparticles, on the hydrophilic side of the crown.
  • the N/P ratio of the quantity of positive charges of the cationic surfactant relative to the quantity of negative charges of the messenger RNA is greater than or equal to 2/1, in particular greater than or equal to 4 /1, in particular greater than or equal to 5/1, preferably greater than or equal to 6/1, particularly preferably greater than or equal to 8/1.
  • Lower N/P ratios lead to insufficient mRNA delivery.
  • the higher the N/P ratio the more the lipid nanoparticles are loaded with mRNA.
  • the N/P ratio is generally less than 2000. Generally, mRNA is unlikely to modulate endogenous RNA interference mechanisms.
  • the formulation may include protamine, preferably protamine sulfate. This advantageously makes it possible to contract the mRNA and therefore to limit its steric hindrance, which improves the complexation between the mRNA and the lipid nanoparticles. This embodiment is therefore particularly advantageous for long chain mRNAs, typically comprising at least 2000 bases.
  • the lipid nanoparticles of the formulation generally have a diameter of between 20 and 250 nm, typically between 40 and 200 nm. This diameter can in particular be measured by quasi-elastic light scattering on a ZetaSizer device, Malvern.
  • the lipid nanoparticles of the formulation according to the invention are organized in the form of a heart-crown, where:
  • the heart includes:
  • solubilizing lipid any oil, any imaging agent, any therapeutic agent if it is lipophilic
  • the crown includes:
  • the cationic surfactant the co-surfactant (possibly grafted with a molecule of interest)
  • the core of the lipid nanoparticles of the formulation is free of mRNA, or even of RNA, or even of nucleotide sequence.
  • mRNA transmission electron microscopy
  • cryo-TEM cryo-microscopy
  • the invention relates to the process for preparing the formulation defined above.
  • the various oily constituents are first mixed to prepare an oily premix for the dispersed phase of the nanoemulsion, then it is dispersed in an aqueous phase under the effect of shearing, and finally the mRNA is complexed .
  • the preparation process typically includes the following steps:
  • step (iv) adding the messenger RNA whose single-stranded nucleotide sequence comprises at least 300 bases to the formulation obtained in step (iii), then
  • the preparation of the oily phase comprises mixing the oily components of the formulation (solubilizing lipid/amphiphilic lipid/cationic surfactant).
  • the formulation comprises a lipid capable of facilitating cytosolic release by destabilization of the endosomal membrane and/or an oil, and/or an imaging agent and/or a therapeutic agent, these are generally introduced into the oily phase during of step (i).
  • Mixing may optionally be facilitated by dissolving one of the constituents or the complete mixture in an appropriate organic solvent.
  • the organic solvent is then evaporated, to obtain a homogeneous oily premix for the dispersed phase.
  • step (i) it is preferred to carry out the premix (step (i)) at a temperature at which all the ingredients are liquid.
  • the oily phase is dispersed in the aqueous phase in the liquid state. If one of the phases solidifies at room temperature, it is preferable to carry out the mixture with one or preferably both phases heated to a temperature greater than or equal to the melting temperature.
  • the emulsification under the shear effect is preferably carried out using a sonicator or a microfluidizer.
  • a sonicator or a microfluidizer Preferably, the aqueous phase and then the oily phase are introduced in the desired proportions into a suitable cylindrical container, then the sonicator is immersed in the medium and turned on for a sufficient time to obtain a nanoemulsion, most often a few minutes.
  • a homogeneous nanoemulsion is generally obtained in which:
  • the average diameter of the lipid nanoparticles measured by quasi-elastic light scattering, for example on a ZetaSizer device, Malvern, is generally greater than 10 nm and less than 200 nm, in particular from 20 to 200 nm, preferably from 30 at 190 nm, and
  • the zeta potential is greater than 20 mV, generally between 25 mV and 60 mV, preferably between 40 and 55 mV, measured by electrophoretic light scattering (ELS), for example on a ZetaSizer device, Malvern, preferably when the aqueous phase of the formulation is an aqueous solution of 0.15 mM NaCl.
  • ELS electrophoretic light scattering
  • the nanoemulsion obtained at the end of step (iii) corresponds to the so-called “premix” formulation.
  • lipid nanoparticles of size between 20 and 40 nm it is preferable to use a formulation comprising at least 5% molar of amphiphilic lipid and:
  • lipid nanoparticles of size between 40 and 100 nm it is preferable to use a formulation comprising at least 5% molar of amphiphilic lipid and:
  • the formulation may present stability problems. Beyond 50%, the release of mRNA from the LNP-mRNA complex is less effective, and or
  • molar cationic surfactant below 30% molar, the release of mRNA from the LNP-mRNA complex is less effective. Above 40%, the formulation may present stability problems).
  • lipid nanoparticles of size between 130 and 175 nm it is preferable to use a formulation comprising
  • the molar percentages of amphiphilic lipid, of cationic surfactant and of co-surfactant are relative to the cumulative molar proportions of the amphiphilic lipid, of the cationic surfactant, of the co-surfactant and of any fusogenic lipid.
  • Step (iv) then makes it possible to prepare the formulation by complexation of said mRNAs on the “premix” formulation obtained at the end of step (iii).
  • the mRNAs are added to the nanoemulsion formed and the mixture obtained is mixed at ambient temperature (from 20 to 25° C.), for example from 5 to 30 minutes.
  • the mRNAs carrying negatively charged phosphate groups, bind by electrostatic bonds to the lipid nanoparticles whose surface is positively charged thanks to the cationic groups of the cationic surfactants. Complexes are thus formed between the mRNAs and the lipid nanoparticles of the nanoemulsion.
  • mRNAs are usually added in aqueous solution, e.g. nuclease-free water, cell culture media, culture media.
  • Step (iv) is typically carried out at room temperature (25° C.), after simple homogenization or with stirring (for example between 100 and 1000 revolutions per minute), for a period of between 5 minutes and 2 hours, for example the order of 30 minutes.
  • the amount of mRNA introduced is such that the ratio between the amount of positive charges due to the cationic surfactant in the “premix” formulation to the amount of negative charges provided by the nucleotide sequences introduced into the middle is greater than or equal to 2/1.
  • a person skilled in the art is able to calculate the quantity of negative charges provided by the nucleotide sequences introduced into the medium, and the quantity of positive charges due to the cationic surfactant in the “premix” formulation.
  • Step (iv) can be followed by various methods, for example by: electrophoresis on agarose gel, which makes it possible to observe the migration of mRNAs. If there is good complexation, then the mRNAs complexed with the lipid nanoparticles are heavier and are visualized in the wells. If the complexation is less important, free mRNAs will migrate to another position.
  • dynamic light scattering DLS, by observing the impact of complexation on the hydrodynamic diameter. The more efficient the complexation, the more the profile is oriented towards a monomodal distribution.
  • a homogeneous nanoemulsion is generally obtained in which the average diameter of the lipid nanoparticles is generally greater than 10 nm and less than 200 nm, preferably between 60 and 200 nm.
  • the process for preparing the formulation does not require chemically modifying the mRNAs, and in particular does not require them to be grafted in such a way covalent to another component of the formulation. It is therefore very easy to prepare in parallel numerous formulations according to the invention comprising mRNAs.
  • the formulation can be purified, for example by column purification or by dialysis.
  • the emulsion Before conditioning, the emulsion can be diluted and/or sterilized, for example by filtration or dialysis. This step makes it possible to eliminate any aggregates which may have formed during the preparation of the emulsion.
  • the emulsion thus obtained is ready for use, if necessary after dilution.
  • the invention relates to the formulation capable of being obtained by the method defined above.
  • the invention relates to a kit comprising the “premix” formulation as defined above, and separately, at least one mRNA.
  • the “premix” formulation is physically separated from the mRNA. It is for example possible to use a kit comprising at least two containers, one for the “premix” formulation, and at least one for an mRNA, preferably several each containing mRNAs of a different nature.
  • the amount of mRNA in the kit is such that the N/P ratio of the amount of positive charges of the cationic surfactant of the "premix” formulation relative to the amount of negative charges of the messenger RNA is greater than or equal at 2/1.
  • the mixing of the “premix” formulation and the mRNA leads to the preparation of the formulation according to the invention.
  • the co-surfactant comprises a poly(ethylene oxide) chain comprising at least 25 ethylene oxide units
  • the formulation is advantageously stable and low in toxicity. It can be used as an in vitro or in vivo mRNA delivery system.
  • the invention relates to the formulation defined above for its use for the prevention and/or treatment of a disease.
  • a preferred use of the formulation according to the invention is the delivery of an mRNA sequence coding for an antigenic protein with the aim of inducing a prophylactic immune response against pathogens.
  • pathologies can be, for example, inflammatory pathologies, cancers (cancer, solid tumors, metastases but also chronic myeloid leukemia), or even infectious diseases in the case of prophylactic therapy.
  • infectious disease can be that induced by the hepatitis C virus (HCV), by the human immunodeficiency virus (HIV), by the respiratory syncytial virus (RSV), by a coronavirus, in particular by the strain of coronavirus SARS -CoV-2, for example COVID19, or the flu.
  • the formulation comprises an imaging agent
  • the formulation according to the invention protects the mRNAs of the body of the patient (and of these nucleases) to which the formulation is administered.
  • the formulation may comprise a therapeutic agent making it possible to treat the disease, which makes it possible to benefit from a double therapeutic or prophylactic effect: that induced by the mRNAs and that induced by the therapeutic agent.
  • a method of preventing and/or treating a disease comprising the administration to a mammal, preferably a human, in need thereof of an effective amount of the formulation as defined above is also one of the objects of the present invention.
  • nanoemulsion is understood to mean a composition having at least two phases, generally an oily phase and an aqueous phase, in which the average size of the dispersed phase is less than 1 micron, preferably from 10 to 500 nm and in particular from 20 to 200 nm, and most preferably from 50 to 200 nm (see article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid In , 2005, 10, 102-110).
  • the expression "dispersed phase” means the lipid nanoparticles comprising the possible oil / the cationic surfactant / the solubilizing lipid / the amphiphilic lipid / the co-surfactant / the possible surfactant of formula (I) / the possible fusogenic lipid / the possible imaging agent / the possible therapeutic agent / the mRNA.
  • the dispersed phase is generally free of aqueous phase.
  • lipid nanoparticles encompasses both liquid oil droplets themselves as well as solid particles from oil-in-water type emulsions in which the dispersed phase is solid. In the latter case, it is often also referred to as a solid emulsion.
  • lipid refers in the context of this presentation to all fatty substances or substances containing fatty acids present in fats of animal origin and in vegetable oils. They are hydrophobic or amphiphilic molecules mainly made up of carbon, hydrogen and oxygen and having a lower density than water. Lipids can be in the solid state at room temperature (25°C), as in waxes, or liquid, as in oils.
  • phospholipid refers to lipids having a phosphate group, in particular phosphoglycerides. Most often, phospholipids have a hydrophilic end formed by the optionally substituted phosphate group and two hydrophobic ends formed by chains of fatty acids. Among the phospholipids, mention will be made in particular of phosphatidylcholine, phosphatidyl ethanolamine, phophatidyl inositol, phosphatidyl serine and sphingomyelin.
  • lecithin designates phosphatidylcholine, that is to say a lipid formed from a choline, a phosphate, a glycerol and two fatty acids. It more broadly covers phospholipids extracted from living organisms, of plant or animal origin, insofar as they are mainly made up of phosphatidylcholine. These lecithins generally constitute mixtures of lecithins bearing different fatty acids.
  • fatty acid is understood to denote aliphatic carboxylic acids having a carbon chain of at least 4 carbon atoms. Natural fatty acids have a carbon chain of 4 to 28 carbon atoms (usually an even number). We speak of long chain fatty acid for a length of 14 to 22 carbons and very long chain if there are more than 22 carbons.
  • surfactant is understood to mean compounds with an amphiphilic structure which gives them a particular affinity for interfaces of the oil/water and water/oil type, which gives them the ability to lower the free energy of these interfaces and to stabilize scattered systems.
  • co-surfactant a surfactant acting in addition to a surfactant to further lower the interface energy.
  • hydrocarbon chain means a chain composed of carbon and hydrogen atoms, saturated or unsaturated (double or triple bond). Preferred hydrocarbon chains are alkyl or alkenyl.
  • alkylene is understood to denote a divalent hydrocarbon-based, saturated, linear or branched, preferably linear, aliphatic group.
  • cyclic radical is meant a radical resulting from a cycle.
  • a phenylene radical is a divalent radical derived from a benzene group.
  • cycle is meant a carbocycle or a heterocycle, saturated, unsaturated or aromatic (aryl or heteroaryl), a carbocycle: a cycle composed of carbon atoms, saturated (the preferred saturated carbocycles being in particular a cycloalkyl, such as a cyclopentyl or a cyclohexyl), unsaturated (for example a cyclohexene) or aromatic (that is to say a phenyl),
  • heterocycle a cyclic group comprising, unless otherwise stated, from 5 to 6 atoms, and comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and/or S.
  • Said heterocycle may be saturated or partially unsaturated and comprise one or more double bonds . This is called a heterocycloalkyl group. It can also be aromatic, comprising, unless otherwise stated, from 5 to 6 atoms and then represent a heteroaryl group.
  • pyrazolidinyl imidazolidinyl, tetrahydrothiophenyl, dithiolanyl, thiazolidinyl, tetrahydropyranyl, dioxanyl, morpholinyl, piperidyl, piperazinyl, tetrahydrothiopyranyl, thiomorpholinyl , the dihydrofuranyl, 2-imidazolinyl, 2,-3-pyrrolinyl, pyrazolinyl, dihydrothiophenyl, dihydropyranyl, pyranyl, tetrahydropyridyl, dihydropyridyl, tetrahydropyrinidinyl, dihydrothiopyranyl, isoxazolidinyl, as heteroaryl, is may in particular cite the following representative groups: furyl, imidazolyl, isoxazoly
  • activated ester is meant a group of formula -CO-LG
  • activated carbonate is meant a group of formula -O-CO-LG where LG is a good leaving group chosen in particular from a chlorine, a imidazolyl, a pentafluorophenolate, a pentachlorophenolate, a 2,4,5-trichlorophenolate, 2,4,6-trichlorophenolate, an -O-succinimidyl group, -O-benzotriazolyl, -0-(7-aza-benzotriazolyl) and -0 -(4-nitrophenyl).
  • FIG. 1 shows a schematic of the complexation of mRNA with a lipid nanoparticle (“LNP”) having a core/crown structure in order to form an mRNA-LNP complex.
  • LNP lipid nanoparticle
  • the phospholipids lecithin as an amphiphilic lipid and DOTAP as a cationic surfactant
  • the co-surfactant whose folding poly(ethylene oxide) chain is represented in the aqueous phase.
  • the mRNA localizes in the crown of the lipid nanoparticles.
  • Figure 2 represents the percentage of GFP-positive cells determined from confocal microscopy images for each experiment, the experiments differing from each other by the N/P ratio of the mRNA-LNP complexes used and/or by the dose of mRNA-LNP complexes per well (Example 2).
  • FIG. 4 shows the percentage of GFP-positive cells determined from confocal microscopy images for each experiment (Example 3). ns, non-significant, * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • Lipofectamine (positive control),
  • LNP2018 mRNA-LNP complex prepared from LNP having been stored for 2 years at +4°C before complexation with mRNA
  • LNP 2020 mRNA-LNP complex prepared from LNPs that were prepared just before complexation with mRNA
  • Figure 5 represents the percentage of GFP-positive cells determined from confocal microscopy images for each experiment (example
  • Figure 6 represents the percentage of GFP-positive cells determined from confocal microscopy images for each experiment (example
  • Figure 7 represents the percentage of CD4 T cells expressing CD69 in response to dendritic cells treated with Ova mRNA - LNP complexes stored for 7 days, 1 month or 3 months at 4°C or -20°C, determined from confocal microscopy images for each experiment (Example 6).
  • Fresh CL40-mRNA cherry freshly complexed LNP-mRNA cherry complex (positive control)
  • Fresh CL40-mRNA OVA freshly complexed LNP-mRNA OVA complex (positive control)
  • CL40-mRNA OVA -20°C LNP-mRNA OVA complex after storage at -20°C.
  • CL40-mRNA OVA 4°C LNP-mRNA OVA complex after storage at 4°C.
  • FIG. 8A represents the concentration of IFN ⁇ in the supernatants of splenocytes cultured for 4 days in the presence of OVA+lipopolysaccharide (LPS) (example 7). Each dot represents a mouse.
  • LPS lipopolysaccharide
  • CL40-mRNA control LNP-mRNA control complex
  • CL40-mRNA OVA LNP-mRNA OVA complex
  • FIG. 8B Figure 8B shows the serum concentration of anti-OVA antibodies (Example 7). Each dot represents a mouse.
  • FIG. 9A represents the CI'IFNY concentration in the supernatants of splenocytes cultured for 2 days in the presence of Spike+lipopolysaccharide (LPS) (Example 8). Each dot represents a mouse.
  • LPS Spike+lipopolysaccharide
  • CL40-mRNA OVA I.P. LNP-mRNA OVA complex (control), intraperitoneal injection
  • FIG. 9B shows the serum concentration of anti-Spike antibodies (Example 8). Each dot represents a mouse.
  • CL40-mRNA OVA LNP-mRNA OVA complex (control)
  • FIG. 10 represents the expression index of the Spike protein determined by flow cytometry measurements of the proportion of PC3 cells expressing the Spike protein and of the average fluorescence intensity of these cells (Example 9).
  • SPIKE Compacted Alone Spike mRNA and Protamine Sulfate (LNP Free)
  • SPIKE-LNP N/P 6: Spike LNP-mRNA complex with an N/P ratio of 6 (protamine sulfate free)
  • cationic nanoparticles LNP are those of emulsion A3 of table 1 of patent application WO 2014/032953 following the preparation process described on p. 65, 1. 30 from p. 66, 1. 16.
  • mRNA complexation was achieved by mixing the prepared formulation with a solution of mRNA in OptiMEM medium.
  • the mixture was stirred for 10 minutes at 600 rpm at room temperature (about 25°C).
  • Figure 1 schematizes the complexation step between the lipid nanoparticles and the mRNA in order to form the LNP-mRNA complex.
  • Example 2 Determination of mRNA-LNP complexation conditions for optimal mRNA release
  • mRNA coding for a fluorescent protein was used to demonstrate the ability of mRNA-LNP complexes to deliver mRNA.
  • mRNA-LNP complexes were prepared extemporaneously with N/P ratios of 2/1, 4/1, 8/1, 16/1, 24/1 or 36/1.
  • the N/P ratio is the ratio of the amount of positive charges due to the cationic surfactant in the formulation before complexation (due to the charged nitrogen, hence the N of N/P) compared to the amount of negative charges provided by the mRNA (due to the phosphate of the mRNA, hence the P of N/P).
  • a dose of mRNA-LNP complexes per well was added to the PC3 cells in RPMI medium supplemented with HEPES pH7.3 at 20 mM so that the dose of mRNA per well was 7.8 ng, 15.8ng, 31.25ng, 62.5ng, 125ng or 250ng.
  • Lipofectamine (Lipo) reagent Sigma was used as a positive control (reference) method for mRNA delivery.
  • mRNA alone (mRNA) was used as a negative control.
  • the medium was aspirated and replaced with RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin/streptomycin.
  • the cell nuclei were then labeled 24 h after incubation with the complexes with Hoechst 33342 (2 mM) for 20 min then the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 20 min. Finally, the cells were observed under a confocal microscope (Zeiss LSM880) by automated imaging (25 images per well, illumination time of 4 psec per pixel).
  • LNP NPX corresponds to the results for the mRNA-LNP complex prepared with an N/P ratio of X/1, where X is the number indicated.
  • LNP NP2 means mRNA-LNP complex prepared with an N/P ratio of 2:1.
  • the fluorescence intensity is variable depending on the N/P ratio of the mRNA-LNP complexes, corresponding to the ratio between the positive charges carried the amine groups of the LNPs and the phosphate groups of each phosphodiester bond of the mRNA.
  • the transfection efficiency as a function of the number of LNPs per cell, which is the product of the N/P ratio and the amount of mRNA, we can identify an optimal amount of nanoparticles per cell to use for mRNA delivery. . This optimal number can be determined from Figure 3 and amounts to 8.32 million LNPs per cell in the case of PC3 epithelial cells.
  • This optimal number is of course variable depending on the type of cells. This method for determining the parameters of the complexes formed for optimal delivery of mRNA thus allows rapid development and is applicable to different cell types of interest.
  • LNP-mRNA complexes were prepared from:
  • PC3 cells were seeded on a 96-well plate at a density of 8400 cells per well 24 h before incubation with the different LNP-mRNA complexes.
  • the mRNA-LNP complexes were produced extemporaneously at the N/P ratios of 8/1, 16/1, 32/1, 64/1, 128/1, 256/1, 512/1 or 1024/1 and these were added to the PC3 cells in RPMI medium supplemented with HEPES pH7.3 at 20 mM at a dose of mRNA-LNP complexes per well such that the dose of mRNA is respectively 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12, 5 ng, 6.25 ng, 3.13 ng, 1.56 ng and 0.78 ng per well, which allowed a constant number of 8 million LNPs per cell.
  • Lipofectamine (Lipo) reagent was used as the gold standard positive control method for mRNA delivery, while mRNA alone (mRNA) was used as the negative control.
  • the medium was aspirated and replaced with RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin/streptomycin.
  • the cell nuclei were labeled with Hoechst 33342 (2 mM) for 20 min then the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 20 min. The fixed cells were observed under a confocal microscope (Zeiss LSM880) by automated imaging (25 images per well, illumination time of 4 psec per pixel).
  • LNPs manufactured in March 2018 or September 2020 were used, without noting statistically significant differences (n.s., P-Values displayed) between these two groups.
  • LNP-mRNA complexes are efficient for mRNA delivery, with an efficiency similar to the commercial positive control (Lipofectamine, Lipo).
  • This example demonstrates the very high stability over time of the LNPs, and the possibility of storing the non-complexed LNPs at +4° C. for at least 2 years.
  • Example 4 Study of stability on storage at +4° C. of the mRNA-LNP complexes
  • example 4 it is the LNP-mRNA complexes (therefore once the complexation has been carried out) which were stored for 2 weeks at +4° C. in order to determine their capacity to deliver a GFP mRNA into target cells after 2 weeks of storage.
  • PC3 cells were seeded on a 96-well plate at a density of 8400 cells per well 24 h before incubation with the different complexes.
  • the complexes were produced extemporaneously at an N/P ratio of 8/1 (CL40-NP8 CTRL) or 2 weeks before the experiment at an N/P ratio of 32/1 (CL40-NP32 2 wk-4C), 8 /1 (CL40-NP82week-4C) or 4/1 (CL40-NP42week-4C).
  • N/P ratio 32/1
  • CL40-NP32 2 wk-4C 8/1
  • CL40-NP82week-4C 4/1
  • mRNA per well 6.25, 12.5, 25, 50 or 100 ng was added to the PC3 cells in RPMI medium supplemented with HEPES pH7.3 at 20 mM.
  • Uncomplexed (mRNA-free) nanoparticles were used as a negative control.
  • the medium was aspirated and replaced with RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin/streptomycin.
  • the cell nuclei were then labeled with Hoechst 33342 (2 mM) for 20 min and then the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 20 min.
  • the LNP-mRNA complexes are therefore stable for at least two weeks and allow good mRNA delivery efficiency.
  • the N/P ratio also seems to play a role in the conservation of mRNA and LNP complexes with a lipid core at +4°C.
  • PC3 cells were seeded on a 96-well plate at a density of 8400 cells per well 24 h before incubation with the different complexes.
  • the complexes were made at a dose of 100 ng ng of mRNA per well, extemporaneously at an N/P ratio of 8/1 or 32/1.
  • RNase A is added to the GFP mRNA alone at a final concentration of 1 ng/mL then incubated for 10 min at 25°C, prior to the addition of the LNPs (comparative) .
  • the mRNA was therefore brought into contact with RNase before the complexation with the LNPs.
  • RNase A is added to the mRNA-LNP complexes at a final concentration of 1 ng/mL then the complexes were incubated for 10 min at 25°C. The mRNA brought into contact with RNase is therefore complexed with the LNPs.
  • LNPs alone free of mRNA N/P of 8/1 and N/P of 32/1 alone, free of mRNA, the quantities of LNP (not complexed) introduced corresponding to those introduced respectively for the NP8-mRNA and NP32-mRNA) as well as mRNA alone were used as a negative control.
  • the medium was aspirated and replaced with RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin/streptomycin.
  • the cell nuclei were then labeled 24 h after incubation with the complexes with Hoechst 33342 (2 mM) for 20 min then the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 20 min.
  • Pretreatment of GFP mRNA with RNase A at a concentration of 1 ng/mL for 10 min at 25°C (Pre-RNAse group), leads to its degradation. Indeed, we do not observe PC3 positive cells for GFP by adding LNP at N/P of 8/1 or N/P of 32/1 after this RNase A pretreatment.
  • LNPs protect the mRNA complexed on their surfaces from degradation by enzymes present in the external environment, such as RNAses (RNA-degrading enzymes), thanks to the protective crown of co-surfactant present on the surface of the LNPs.
  • RNAses RNA-degrading enzymes
  • Example 6 Study of stability on storage at +4°C or -20°C of the complexes
  • example 4 it is the LNP-mRNA complexes (therefore once the complexation has been carried out) which were stored for 2 weeks at +4° C. in order to determine their capacity to deliver an mRNA into target cells after 2 weeks of storage.
  • the mRNA was Ova mRNA.
  • Example 7 Induction of an immune response by vaccination based on LNP-mRNA Ova
  • mice were immunized on D0 and D21 by intraperitoneal injection with 10 pg of Ova or control mRNA complexed with LNPs at an N/P ratio of 6.
  • 10 pg of Ova or control mRNA complexed with LNPs at an N/P ratio of 6.
  • Example 8 Induction of an immune response by vaccination based on LNP-mRNA Spike
  • the Spike mRNA has 4074 bases and is therefore longer than the mRNAs tested in the examples above.
  • mice 10 pg of Spike or control (Ova) mRNA vectorized by LNPs at an N/P ratio of 6 were injected on D0 and D27 by the intraperitoneal (I.P.) or intramuscular (I.M.) route.
  • I.P. intraperitoneal
  • I.M. intramuscular
  • the mice were sacrificed and the splenocytes were restimulated ex vivo for 48 hours with a pool of Spike peptides in the presence of LPS in order to evaluate the secretion of IFN ⁇ by ELISA.
  • Each group consisted of three C57BI6 mice.
  • the immunization route by intramuscular injection makes it possible to mount a specific cellular response against the spike protein involving the production of IFN ⁇ , whereas the route of immunization by intraperitoneal injection does not induce any response.
  • Example 9 Effect of protamine sulfate compaction to improve the delivery of a Long mRNA
  • the cells were transfected at 1.5 pg/ml with the Spike-SARS-CoV-2 mRNA (4074 bases) complexed or not with LNPs according to an N/P ratio of 6, with or without compaction by sulphate of protamine.
  • the negative controls used were LNP alone and packed Spike mRNA alone.
  • PC3 cells epidermal cell line from prostate cancer
  • RPMI GibcoTM 61870044
  • FCS 1% AT B GabcoTM 15140122
  • the cells were seeded at 4.10 4 cells/cm 2 in a 24-well plate.
  • the cells were transfected in medium without FCS and without antibiotics.
  • the cells were transfected with the mRNA coding for the SPIKE protein of the SARS-CoV-2 virus (mRNA size 4074NT) at 1.5 pg/ml in a final volume of 500mI per well.
  • mRNA at 0.250 mg/ml in H20 was previously mixed in a 1:1 ratio with protamine sulfate also at 0.250 mg/ml in H20.
  • the complexation volume was adjusted to 50mI in Optimem (GibcoTM A4124801) before being completed to a final 500mI in transfection medium.
  • the cells were incubated with the complexes at 37° C. for 6 h. The medium was then replaced with RPMI 10% FCS 1% ATB culture medium.
  • the cells were detached for 10 minutes in tryple (GibcoTM 12605010) after rinsing in PBS without calcium and without magnesium (GibcoTM 14190250). They were then fixed in 4% PFA for 20 minutes.
  • the Spike protein was labeled with an anti-Spike primary antibody (Cell signaling 42172) and a FITC secondary antibody (Jackson Lab 115.095.146) in PBS 1%BSA 0.1% Saponin.
  • the results are from two experiments each with at least one duplicate per condition.
  • the spike protein expression index was calculated by multiplying the percentage of cells expressing the spike protein by the average fluorescence intensity of these cells.
  • the results presented in Figure 10 show the ability of LNPs to efficiently deliver the Spike-SARS-CoV-2 mRNA of 4074 nucleotides into cells when it is previously compacted with protamine sulfate. The presence of protamine enhances the delivery of mRNA into cells by LNPs. Protamine alone does not deliver Spike mRNA into cells.

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Abstract

L'invention concerne une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques dans laquelle au moins un ARN messager est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques, son procédé de préparation et ses utilisations pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie.

Description

TITRE : Formulation pour la délivrance d’ARN messager
La présente invention concerne une formulation de type nanoémulsion utile pour la délivrance d’ARN messager (ARNm).
L'acide ribonucléique messager, ARN messager ou ARNm, est une copie transitoire d'une portion de l'ADN correspondant à un ou plusieurs gènes et codant des protéines.
L'ARNm est utilisé comme intermédiaire par les cellules pour la synthèse des protéines.
L'ARNm est une copie simple brin linéaire de l'ADN et est composé d'ARN, qui comprend la région codant une protéine encadrée de régions non codantes. On distingue trois principales régions fonctionnelles dans un ARNm : la région 5' non traduite (5'-UTR), le ou les cistrons codants (région ORF) et enfin la région 3' non traduite (3'-UTR). Les deux régions non traduites ou régions UTR (de l'anglais « untranslated régions ») contiennent souvent des signaux d'expression ou de maturation de l'ARN. L’ARNm contient en outre une coiffe en 5' et une queue poly(A) en 3’, qui permettent une traduction de l’ARNm en protéine efficace. L'information portée par la région ORF de l'ARNm est constituée d'une série de codons, des triplets de nucléotides consécutifs qui codent chacun un acide aminé de la protéine correspondante.
Le développement de médicaments ou vaccins basés sur des ARNm est recherché, afin d’exprimer une protéine d’intérêt dans une cellule hôte. Une fois dans le cytoplasme de la cellule hôte, l’ARNm est lu par le ribosome et traduit en une protéine qui possède l’activité thérapeutique recherchée.
Le pré-requis est donc que l’ARNm parvienne au cytoplasme.
Il y a deux obstacles majeurs au développement de vaccins ou thérapies à base de ARNm: leur instabilité in vivo, en particulier à cause de leur dégradation pour les RNase, et leur instabilité lors de leur stockage, ce qui freine le développement de vaccin à ARNm. Augmenter la concentration en ARNm pour compenser l’ARNm dégradé n’est pas une solution envisageable, puisque le vaccin deviendrait alors beaucoup trop cher.
Les systèmes de délivrance utilisés incluent les nanoparticules lipidiques (LNP) ou les liposomes, permettant de protéger l’ARNm en l’encapsulant au sein d’une nanoparticule ou d’un vésicule lipidique. L’encapsulation de l’ARNm au cœur d’une LNP permet avantageusement de le protéger de la dégradation par des nucléases. La revue Guevara et al. Frontiers in Chemistry 2020, 8, 589959 rapporte l’utilisation de LNP dans lesquelles l’ARNm est encapsulé comme véhicule pour la délivrance d’ARNm et son utilisation pour le traitement du cancer.
La littérature décrit quelques systèmes de délivrance basés sur l’utilisation de LNP à la surface desquelles sont complexées des séquences nucléotidiques. Ainsi, la demande WO 2014/032953 décrit une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée, et comprenant un lipide amphiphile, un tensioactif cationique, un co-tensioactif, un lipide solubilisant, et une séquence nucléotidique susceptible de moduler les mécanismes d’interférence. Cette séquence nucléotidique est courte, puisqu’elle comprend moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin. Il s’agit de préférence de microARN ou SiARN. Dans les exemples, du siARN GFP-22 siRNA rhodamine, du siGFP ou du microARN miRIDIAN Mimic Fluman has-miR612 ont été utilisés. Ainsi, cette demande ne montre la faisabilité de cette approche qu’avec des ARN très courts, et ne suggère pas que le véhicule puisse être adapté pour la délivrance de séquences ayant plus de 200 bases.
Il existe en effet des préjugés pour l’homme du métier à utiliser un système de délivrance dans lequel une grosse séquence nucléotidique est localisée sur la couronne de nanoparticules lipidiques.
En effet, contrairement à l’encapsulation de l’ARNm dans le cœur des nanoparticules lipidiques, la complexation de l’ARNm à la surface de celles-ci conduit à l’exposer à la surface de la nanoparticule. Or, l’ARNm est une molécule fragile et sensible aux enzymes dégradant l’ARN (RNase) qui sont présentes dans la plupart des milieux biologiques. Complexer l’ARNm à la surface des nanoparticules lipidiques le rend donc accessible aux RNase, et ce d’autant plus qu’il s’agit d’une grosse molécule qui, une fois complexée sur la nanoparticule lipidique, dépasse bien au-delà de la nanoparticule lipidique. Pour cette raison, l’homme du métier est découragé de complexer de grosses séquences nucléotidiques à la surface de nanoparticules lipidiques.
Un autre préjugé à l’encontre de la méthode de complexation est la forte affinité de l’interaction électrostatique entre un acide nucléique (chargé négativement) de grande taille, tel que l’ARNm, et une nanoparticule lipidique cationique (chargée positivement), pouvant nuire au relargage de l’ARNm à partir du complexe ARNm-LNP une fois celui-ci dans le cytoplasme de la cellule hôte. Car il faut non seulement que l’ARNm atteigne le cytoplasme, mais en plus que celui-ci soit relargué pour qu’il puisse assurer son rôle.
Il existe un besoin de système de délivrance de grandes séquences nucléotidiques, en particulier d’ARNm, qui soit suffisamment stable au stockage et in vivo pour permettre une délivrance efficace. A cet effet, selon un premier objet, l’invention concerne une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile, de 15 à 70% molaire de tensioactif cationique porteur d’au moins une charge positive comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et
- de 10% à 55% molaire de co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène, où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, dans laquelle au moins un ARN messager, dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques, le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager étant supérieur ou égal à 2/1 .
De façon surprenante, une telle formulation est stable et a la capacité de protéger du milieu biologique extérieur et de délivrer efficacement un ARNm pour qu’il soit traduit en protéine par une cellule eucaryote. La formulation présente avantageusement une bonne biodisponibilité et permet de limiter la dégradation de l’ARNm généralement observée avec d’autres systèmes de délivrance, notamment de limiter la dégradation par des RNase.
Dans la formulation de l’invention, l’ARNm est complexé à la surface d’une nanoparticule lipidique, qui est avantageusement très stable au stockage. Le complexe ARNm-nanoparticule lipidique peut être stockée au moins deux semaines à 4°C sans qu’aucune dégradation ne soit observée.
L’émulsion est une émulsion de type huile dans l’eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. De préférence, elle est simple. Lorsqu’elle est simple, les nanoparticules lipidiques ne comprennent pas de phase aqueuse interne, et ne sont donc pas des liposomes.
La formulation selon l’invention comprend un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R représentant une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant notamment choisi parmi :
- un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
- un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa,
- un polyamine, tel qu’un chitosan ou une polylysine, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa.
Lorsque la formulation comprend plusieurs tensioactifs cationiques, de préférence, chaque tensioactif cationique est tel que défini ci-dessus. Par «ester ou amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine», on entend un groupe de formule : dans laquelle - R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone,
- A3 et A représentent O ou NFI, et
- M représente Fl ou un cation.
Les groupes cationiques du tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique lorsqu’il y en a plusieurs) sont typiquement :
- des oniums choisis parmi les groupes ammonium, imidazolium, pyridinium, pyrrolidinium, pipéridinium, phosphonium ou sulfonium, ou
- des complexes métalliques entre un radical d’un groupe organique chélatant mono- ou multi-dentate, par exemple la phénantroline, la pyridine, l’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA), les porphyrines, les phtalocyanines, les clorines, les bactériochlorines complexé avec un cation inorganique, tel que Ca2+, Al3+, Ni+, Zn2+ , Fe2+, Fe3+ ou Cu2+,
- les groupes ammonium, notamment -+NMe3, -+NFIMe2, -+NFl2Me et -+NFl3, en particulier - +NFl3, étant particulièrement préféré. De préférence, le groupe cationique (ou chaque groupe cationique s’il y a plusieurs groupes cationiques) du tensioactif cationique (de chaque tensioactif cationique s’il y en a plusieur) n’est pas ionisable (c’est-à-dire que le (chaque) groupe cationique n’est ni donneur ni accepteur de proton). Typiquement, lorsque le groupe cationique comprend une fonction onium ou ammonium, l’azote de cette fonction (chaque azote s’il y en a plusieurs) n’est pas porteur (ou ne peut pas être porteur) d’un hydrogène. Un exemple de groupe ammonium non ionisable est -+NMe3.
Bien sûr, des anions sont associés au(x) groupe(s) cationique(s) pour que la formulation soit électriquement neutre. La nature des anions n’est pas limitée. A titre illustratif, on peut citer les halogénures, notamment le chlorure ou le bromure, ou le trifluoroacétate. Dans le tensioactif cationique, la nature du groupe de liaison liant le(s) groupe(s) lipophile(s) au(x) groupe(s) hydrophile(s) comprenant au moins un groupe cationique n’est pas limitée. Des exemples de groupes de liaison sont fournis ci-dessous (groupe L).
Dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique, de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation, a la formule (A) suivante :
[(Lipo)i-L-(Hydro)h]n+, (n/m) [Af- (A) dans laquelle:
- 1 et h représentent des nombres entiers indépendamment compris entre 1 et 4,
- n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 , généralement compris entre 1 et 50,
- Lipo représente un groupe lipophile tel que défini ci-dessus,
- Hydro représente un groupe hydrophile tel que défini ci-dessus comprenant au moins un groupe cationique,
- L représente un groupe de liaison,
- A représente un anion,
- m est un nombre entier représentant la charge de l’anion,
- vn est un nombre entier représentant la charge du cation [(Lipo)i-L-(Hydro)h].
Dans la formule (A) susmentionnée, de préférence L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH, -0-P0(0H)-0- ou un radical divalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci- dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, lorsque l’un des groupes I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3, un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0- et un radical trivalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- pour les autres valeurs de I et h, L est un radical multivalent cyclique de 5 à 6 atomes.
De manière particulièrement préférée, L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH ou -0-P0(0H)-0-, lorsque l’un des groupes I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3 et un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0-.
Dans la formule (A) susmentionnée, I et h représentent de préférence indépendamment 1 ou 2.
De préférence, les groupes Z définis ci-dessus ne sont pas clivables, en particulier dans les conditions d’utilisation de la formulation (au pH de la phase aqueuse continue notamment).
Selon une première alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique) est un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique. Comme exemple de tels tensioactifs cationiques, on peut citer:
1) (Lipo)-(CH2)mi-NR3oR3iR32, où Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, m1 représente 1 ou 2 et R30, R31 et R32 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2- OH, chaque Lipo est indépendamment un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, et R33 représente H, Me ou -CH2-CH2-OH, Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci- dessus, et R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41 , R42 et R43 représentent indépendamment H,
Me ou -CH2-CH2-OH. Dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique (de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation) est choisi parmi : le L/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium (DOTMA), le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), - le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium (DOTIM), et
- le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS) (sous forme protonée), et est de préférence le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP).
Selon une deuxième alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique) est un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique.
Lorsque le groupe hydrophile du tensioactif cationique est polymérique, le(s) groupe(s) cationique(s) peu(ven)t être un(des) groupe(s) terminal(aux) ou pendant(s). Par exemple : - lorsque groupe polymérique hydrophile est un poly(oxyde d’éthylène), le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l’extrémité de la chaîne poly(oxyde d’éthylène).
- lorsque le groupe polymérique hydrophile est du dextrane ou de la cellulose, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l’extrémité de la chaîne polysaccharidique.
- lorsque le groupe polymérique hydrophile est du chitosan, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement un(des) groupe(s) pendant(s), en particulier des groupes -NH3 + présents en milieu acide sur le chitosan.
Dans un mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) terminal(aux). En effet, les groupes pendants de tensioactifs anioniques adjacents en surface des nanoparticules lipidiques de la phase dispersée se repoussent par interactions électrostatiques et, par conséquent, les formulations comprenant des tensioactifs cationiques dont le groupe Hydro comprend des groupes pendants sont généralement moins stables. Dans un autre mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) pendant(s). Il est avantageusement possible d’utiliser un tensioactif cationique dont le groupe hydrophile comprend plusieurs groupes cationiques pendants, et donc d’obtenir une formulation plus chargée positivement, et qui permettra d’autant mieux la complexation d’espèces négatives comme les ARNm. Le groupe polymérique hydrophile préféré est un radical d’un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
Ainsi, dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique (de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation) a l’une des formules suivantes : ) dans lesquelles :
- FL, R2, R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone,
- Ai, A2, A3 et A représentent O ou NH,
- m, n, 0 et p représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence 20 à 200, et
- a représente un nombre entier de 20 à 120, - M représente H ou un cation,
- A10, An, AI2 et A13 représentent indépendamment un groupe -+NR20R2IR22, dans lequel R20, R21 et R22 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2-OH.
Dans un mode de réalisation, dans la formule (Ail), An représente -+NH3 et le tensioactif cationique (de préférence de chaque tensioactif cationique) a la formule suivante : dans laquelle A2, R2 et n sont tels que définis ci-dessus. De préférence, dans la formule (AN), R2 représente C17H35.
Sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence du groupe polymérique hydrophile permettrait :
- de stabiliser la formulation, et
- de protéger les ARNm, localisés à la surface des nanoparticules lipidiques, des protéines du milieu dans lequel la formulation est administrée/utilisée, et donc la dégradation des ARNm par ces protéines.
Selon une troisième alternative, la formulation selon l’invention comprend au moins deux tensioactifs cationiques, de préférence exactement deux, dont : l’un est choisi parmi : le L/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium (DOTMA), le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1-propananium) (DMRIE), le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM), et
- le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS), et est de préférence le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), et
- l’autre est un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant choisi parmi : un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique,
- un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan, un polyamine, tel qu’un chitosan ou une polylysine, et est de préférence un poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins un groupe cationique.
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l’invention comprend, à titre de tensioactifs cationiques :
- du 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane, et
- un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde d’éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d’éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d’éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l’invention comprend, à titre de tensioactifs cationiques :
- du 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane, et
- un composé de formule (Ail) telle que définie ci-dessus, notamment de formule (AV).
La formulation est de préférence exempte de lipide cationique comprenant un groupe -S-S-, ou plus généralement comprenant un groupe clivable, et/ou comprenant un groupe ionisable.
De préférence, la formulation ne comprend pas d’autre lipide cationique que ceux mentionnés ci-dessus. Le(s) lipide(s) cationique(s) décrit(s) ci-dessus est(sont) alors le(s) seul(s) lipide(s) cationique(s) de la formulation. Le tensioactif cationique se situe dans la couronne des nanoparticules lipidiques de la formulation. Grâce à la ou es charge(s) positive(s) de son(es) groupe(s) cationique(s), il se lie par interactions électrostatiques aux ARNm et permet de maintenir les ARNm à la surface des nanoparticules lipidiques.
La formulation comprend de 15 à 70% molaire de tensioactif cationique par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co- tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène. En dessous de 15%, la formulation ne comprend pas assez de charges positives et la complexation ultérieure de la formulation « prémix » avec l’ARNm (chargé négativement) est insuffisante. Au-delà de 70%, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n’est pas possible car les nanoparticules lipidiques coalescent pour former deux phases), et les nanoparticules lipidiques deviennent généralement toxiques pour les cellules. Lorsque la formulation comprend plusieurs tensioactifs cationiques, c’est leur quantité molaire cumulée qui doit respecter la plage de 15 à 70% molaire. De manière générale, au sens de la demande, lorsqu’il y a plusieurs composants du même type, il faut tenir compte de la proportion, de la masse ou de la quantité de l’ensemble d’entre eux.
Ces proportions sont particulièrement adaptées pour obtenir une complexation efficace des ARNm, et donc une bonne délivrance.
Lipide fusooène (« helper lipid » en anolais)
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l’invention comprend un lipide fusogène, qui est susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale, dit lipide « helper ». De préférence, ce lipide est le dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE).
Ce lipide permet de favoriser l’échappement endosomal des nanoparticules lipidiques de la formulation selon l’invention, et donc ARNm qu’elles contiennent.
Le lipide fusogène se situe dans la couronne des nanoparticules lipidiques de la formulation.
La formulation comprend au moins un lipide amphiphile, qui se situe dans la couronne des nanoparticules lipidiques de la formulation.
Afin de former une nanoémulsion stable, il est nécessaire d’inclure dans la composition au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des nanoparticules lipidiques au sein de la phase continue aqueuse. En dessous de 5% molaire de lipide amphiphile par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n’est pas possible car les nanoparticules lipidiques coalescent pour former deux phases).
Généralement, la formulation comprend de 5 à 85% molaire, de préférence de 5 à 75% molaire, en particulier de 5 à 50% molaire et tout particulièrement de 8 à 30% molaire de lipide amphiphile par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène.
La quantité de lipide amphiphile contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion.
Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d’origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d’un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span® par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween® par la société ICI Americas, Inc. et Triton® par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges.
Les phospholipides sont les lipides amphiphiles préférés.
La lécithine est le lipide amphiphile particulièrement préféré.
La formulation comprend par ailleurs un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d’acides gras, qui se situe dans la phase dispersée de la nanoémulsion, plus précisément dans le cœur des nanoparticules lipidiques. Ce composé a pour mission principale de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase dispersée de la nanoémulsion.
Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C).
Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s’agir notamment : d’esters d’acides gras et d’alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou - de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras.
Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du lipide amphiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin d’assurer la solubilisation recherchée. Il peut s’agir d’une huile ou d’une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20°C), mais liquide à la température du corps (37°C).
Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les esters d’acides gras et d’alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou les glycérides d’acides gras, notamment d’acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, il s’agit d’un mélange de différents glycérides. De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant au moins 10% en poids d'acides gras en C12, au moins 5% en poids d'acides gras en C14, au moins 5% en poids d'acides gras en C16 et au moins 5% en poids d'acides gras en C18.
De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18.
Particulièrement préférés sont les mélanges de glycérides semi-synthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire®NC par la société Gattefossé et approuvé pour l’injection chez l’homme. Les Suppocire® de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, dont la composition quali- quantitative est indiquée dans le tableau 1.
[Table 1] Tableau 1 : Composition en acides gras du Suppocire® NC de Gattefossé
Les lipides solubilisants précités permettent d’obtenir une formulation sous forme de nanoémulsion avantageusement stable. Sans vouloir être lié à une théorie particulière, il est supposé que les lipides solubilisants précités permettent d’obtenir des nanoparticules lipidiques présentant un cœur amorphe. Le cœur ainsi obtenu présente une viscosité interne élevée sans pour autant présenter de cristallinité. Or, la cristallisation est néfaste pour la stabilité de la nanoémulsion car elle conduit généralement à une agrégation des nanoparticules lipidiques et/ou à une expulsion des molécules encapsulées à l’extérieur des nanoparticules lipidiques. Ces propriétés physiques favorisent la stabilité physique de la nanoémulsion. La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la phase dispersée. Généralement, le cœur des nanoparticules lipidiques (comprenant le lipide solubilisant, l’éventuelle huile, l’éventuel agent d’imagerie, l’éventuel agent thérapeutique s’il est lipophile) comprend de 1 à 100% en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 40 à 75% en poids de lipide solubilisant.
Huile
La phase dispersée peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles, qui se situe(nt) dans le cœur des nanoparticules lipidiques.
Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile-lipophile (HLB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l’émulsion.
Les huiles sont généralement choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d’origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d’origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d’arachide, d’olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées.
Les huiles préférées sont l’huile de soja et l’huile de lin.
Généralement, si présente, l’huile sera contenue dans le cœur des nanoparticules lipidiques (comprenant le lipide solubilisant, l’éventuelle huile, l’éventuel agent d’imagerie, l’éventuel agent thérapeutique s’il est lipophile) dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids.
De préférence, la formulation est exempte de squalène.
La phase dispersée peut contenir en outre d’autres additifs tels que des colorants, stabilisants, conservateurs ou d’autres principes actifs, en quantité appropriée. Co-tensioactif
La formulation comprend un co-tensioactif, qui permet de stabiliser la nanoémulsion.
Les co-tensioactifs utilisables dans les formulations utilisées dans l’invention sont généralement des tensioactifs hydrosolubles. Ils comprennent au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25, notamment au moins 30, de préférence au moins 35, unités d’oxyde d’éthylène. Le nombre d’unités d’oxyde d’éthylène est généralement inférieur à 500.
Des formulations comprenant un co-tensioactif comprenant une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant moins de 25 unités d’oxyde d’éthylène ne sont en effet pas stables. Généralement, il n’est même pas possible de préparer la nanoémulsion.
Ces nombres d’unités sont en effet particulièrement adaptés pour éviter la fuite des ARNm hors des nanoparticules lipidiques. En effet, les inventeurs ont observé qu’une formulation ne comprenant pas un co- tensioactif n’est pas suffisamment stable.
De plus, sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence de la chaîne composée de motifs d'oxyde d’éthylène du co-tensioactif permettrait de protéger les ARNm, localisés à la surface des nanoparticules lipidiques, des nucléases du milieu dans lequel la formulation est administrée/utilisée, et donc la dégradation desdits ARNm par ces nucléases.
A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij® (par exemple Brij® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj® par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj® 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® par la société BASF AG (par exemple Pluronic® F68, F127, L64, L61 , 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64).
Ainsi, le co-tensioactif se situe à la fois dans la phase aqueuse continue et dans la phase dispersée. En effet, la partie hydrophobe du co-tensioactif s’insère dans les nanoparticules lipidiques de la phase dispersée, alors que les chaînes polyalcoxylées sont dans la phase aqueuse continue. Dans la présente demande, les pourcentages molaires ou massiques de phase dispersée décrits sont calculés en considérant que le co-tensioactif appartient à la phase dispersée.
La formulation comprend de 10% à 55% molaire de co-tensioactif par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co- tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène. En dessous de 10%, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n’est pas possible car les nanoparticules lipidiques coalescent pour former deux phases). Au-delà de 55%, la complexation ultérieure de la formation « prémix » avec l’ARNm n’a pas lieu, probablement car les charges positives du tensioactif cationique sont masquées par les chaînes poly(oxyde d’éthylène) du co-tensioactif, et donc plus accessibles pour se lier par liaison électrostatique à l’ARNm.
Le co-tensioactif peut par ailleurs présenter d’autres effets dans l’application envisagée de la nanoémulsion. Selon un mode de réalisation, la phase dispersée de la nanoémulsion est greffée en surface avec des molécules d’intérêts tels que des ligands biologiques, afin d’augmenter le ciblage spécifique d’un organe. Un tel greffage permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules ou de certains organes en favorisant l’internalisation des nanoparticules lipidiques de la formulation selon l’invention par les cellules cibles qui expriment le récepteur en surface. De préférence, le greffage en surface est réalisé par couplage des molécules d’intérêts ou de leurs précurseurs avec un composé amphiphile, notamment avec le co- tensioactif. La nanoémulsion comprend alors un co-tensioactif greffé. Dans ce cas, le co- tensioactif joue le rôle d’un espaceur permettant d’accommoder les molécules d’intérêt en surface.
Les molécules d'intérêt peuvent être par exemple :
- des ligands biologiques de ciblage tels que des anticorps, peptides, saccharides, aptamères, oligonucléotides ou des composés comme l’acide folique ;
- un agent de furtivité : une entité ajoutée afin de conférer à la nanoémulsion une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination.
Par exemple, lorsque le ligand biologique est un peptide comprenant une ou plusieurs cystéine (par exemple pour utiliser la formulation pour le traitement d’une maladie), le greffage à la chaîne oxyde d’alkylène du tensioactif peut être assuré par couplage thiol maléimide.
Agent d’imagerie
Dans un mode de réalisation, la formulation comprend un agent d’imagerie, qui permet avantageusement de visualiser la distribution des nanoparticules lipidiques dans les cellules ou le corps du patient, et donc la distribution des ARNm.
L’agent d’imagerie peut notamment être utilisé dans les imageries de type :
- tomographie à émission de positons (Positron Emission Tomography (PET) en anglais) (l’agent d’imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide, tel que 18F, 1 1C, un chélate de cations métalliques 68Ga, 64Cu),
- tomographie d'émission monophotonique (TEMP) (Single photon émission computed tomography (SPECT) en anglais) (l’agent d’imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide par exemple 123l, ou un chélate de 99mTc ou 1 1 1 In),
- imagerie par résonance magnétique (IRM) (l’agent d’imagerie pouvant être un chélate de gadolinium ou un nanocristal magnétique tel qu’un nanocristal d’oxyde de fer, d’oxyde de manganèse ou de fer-platine FePt), - imagerie optique ou imagerie aux rayons X (l’agent d’imagerie pouvant être un fluorophore lipophile ou un agent de contraste, par exemple une molécule iodée telle que l’iopamidol, l’amidotrizoate, ou des nanoparticules d’or).
De préférence, l’agent d’imagerie est un fluorophore lipophile permettant de réaliser de l’imagerie optique.
La nature du ou des fluorophores lipophiles utilisables n'est pas critique à partir du moment où ils sont compatibles avec l'imagerie in vivo (c’est à dire qu’ils sont biocompatibles et non toxiques). De préférence, les fluorophores utilisés comme agent d’imagerie absorbent et émettent dans le visible ou le proche infrarouge. Pour l’imagerie non invasive dans un tissu ou un organisme vivant (animal, homme) les fluorophores préférés absorbent et émettent dans le proche infrarouge. En effet, pour que la lumière d'excitation et la lumière émise par le fluorophore puissent mieux traverser les tissus, il convient d'utiliser des fluorophores absorbant et émettant dans le proche infrarouge, c'est- à-dire à une longueur d'onde comprise entre 640 et 900 nm.
A titre de fluorophore lipophile on peut par exemple citer les composés décrits dans le chapitre 13 ("Probes for Lipids and Membranes") du catalogue InVitrogen. De façon plus précise, on peut notamment citer, à titre de fluorophore, le vert d’indocyanine (ICG), les analogues d'acides gras et les phospholipides fonctionnalisés par un groupement fluorescent tels que les produits fluorescents vendus sous les dénominations commerciales Bodipy (R) tels que le Bodipy (R) 665/676 (Ex/Em.) ; les dérivés lipophiles de carbocyanines telles que le perchlorate de 1 ,1 '-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD), par exemple vendu sous la référence D-307, le perchlorate de 3,3'- dihexadecyloxacarbocyanine (DiO), par exemple vendu sous la référence D1125, le perchlorate de 1 ,1'-dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (Dil), par exemple vendu sous la référence D384; les sondes fluorescentes dérivées de sphingolipides, de stéroïdes ou de lipopolysaccharides tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales BODIPY ® TR céramides, BODIPY ® FL C5-lactosylcéramide, BODIPY ® FL C5-ganglioside, BODIPY ® FL cérébrosides ; les dérivés amphiphiles de cyanines, de rhodamines, de fluorescéines ou de coumarines tels que l'octadécyl rhodamine B, l'octadécyl ester de fluorescéine et la 4-heptadécyl-7- hydroxycoumarine ; et le diphénylhexatriène (DPH) et ses dérivés ; l'ensemble de ces produits étant vendus par la société Invitrogen.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le fluorophore est le vert d’indocyanine, le perchlorate de 1 ,1 '-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine, le perchlorate de 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine, ou le perchlorate de 1,T-dihexadecyl- 3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine. Agent thérapeutique
La formulation selon l’invention peut comporter un agent thérapeutique.
Les agents thérapeutiques susceptibles d’être encapsulés dans la nanoémulsion selon l’invention comprennent en particulier les principes actifs agissant par voie chimique, biologique ou physique. Ainsi, il peut s’agir de principes actifs pharmaceutiques ou d’agents biologiques tels que de l’ADN, des protéines, peptides ou anticorps ou encore des agents utiles pour des thérapies physiques tels que des composés utiles pour la thermothérapie, les composés relarguant de l’oxygène singulet lorsqu’ils sont excités par une lumière utiles pour la photothérapie et des agents radioactifs. De préférence, il s’agit de principes actifs administrés de façon parentérale.
Selon son affinité lipophile ou amphiphile, l’agent thérapeutique sera encapsulé par la phase dispersée ou se situera à l’interface des deux phases.
La nature des agents thérapeutiques encapsulés dans la nanoémulsion n’est pas particulièrement limitée. Cependant, la nanoémulsion est particulièrement intéressante pour des composés peu solubles, qui sont difficiles à formuler dans les systèmes d’administration classiques et pour les principes actifs utiles pour la photothérapie, dont le rendement quantique peut être préservé.
Du fait des conditions douces du procédé de préparation, la formulation décrite est particulièrement intéressante pour l’encapsulation d’agents thérapeutiques qui se dégradent à température élevée.
Parmi les principes actifs pharmaceutiques intéressants comme agents thérapeutiques, on peut citer en particulier les agents utilisés dans le traitement du SIDA, les agents utilisés dans le traitement des maladies cardiaques, les analgésiques, les anesthésiques, les anorexigènes, les anthelmintiques, les antiallergiques, les antiangineux, les antiarythmisants, les anticholinergiques, les anticoagulants, les antidépresseurs, les antidiabétiques, les antidiurétiques, les antiémétiques, les anticonvulsivants, les antifongiques, les antihistaminiques, les antihypertenseurs, les anti-inflammatoires, les anti migraineux, les antimuscariniques, les antimycobactériens, les anticancéreux y compris les antiparkinsoniens, les antithyroïdiens, les antiviraux, les astringents, les agents bloquants, les produits sanguins, les substituts sanguins, les agents inotropes cardiaques, les agents cardiovasculaires, les agents du système nerveux central, les chélateurs, les agents de chimiothérapie, les facteurs de croissance hématopoïétiques, les corticostéroïdes, les antitussifs, les agents dermatologiques, les diurétiques, les dopaminergiques, les inhibiteurs de l'élastase, les agents endocrines, les alkaloïdes de l'ergot, les expectorants, les agents gastro-intestinaux, les agents génito-urinaires, le facteur de déclenchement de l'hormone de croissance, les hormones de croissance, les agents hématologiques, les agents hématopoïétiques, les hémostatiques, les hormones, les immunosuppresseurs, les interleukines, les analogues d'interleukines, les agents de régulation des lipides, la gonadolibérine, les myorelaxants, les antagonistes narcotiques, les nutriments, les agents nutritifs, les thérapies oncologiques, les nitrates organiques, les vagomimétiques, les prostaglandines, les antibiotiques, les agents rénaux, les agents respiratoires, les sédatifs, les hormones sexuelles, les stimulants, notamment les immunostimulants, les adjuvants, les agonistes Toll-like récepteur (TLRs), les sympathomimétiques, les anti-infectieux systémiques, le tacrolimus, les agents thrombolytiques, les agents thyroïdiens, les traitements pour les troubles de l'attention, les vasodilatateurs, les xanthines, les agents diminuant le cholestérol. Particulièrement visés sont les anticancéreux tels que le taxol (paclitaxel), la doxorubicine et le cisplatine en particulier pour les applications thérapeutiques, ou bien les agents immunostimulants, les adjuvants, les agonistes TLRs, en particulier pour les applications prophylactiques (vaccins)
Parmi les agents physiques ou chimiques, on peut citer notamment les isotopes radioactifs et les photo-sensibilisateurs.
Parmi les photo-sensibilisateurs, on peut citer notamment ceux appartenant à la classe des tétrapyrroles comme les porphyrines, les bactériochlorines, les phtalocyanines, les chlorines, les purpurines, les porphycènes, les phéophorbides, ou encore ceux appartenant à la classe des texaphyrines ou des hypericines. Parmi les photo sensibilisateurs de première génération, on peut mentionner l’hémato-porphyrine et un mélange de dérivés d’hémato-porphyrine (HpD) (vendu sous la marque commerciale Photofrin® par Axcan Pharma). Parmi les photo-sensibilisateurs de seconde génération, on peut mentionner le méta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC ; nom commercial Foscan®, Biolitec AG) et le dérivé monoacide du cycle A de la benzoporphyrine (BPD-MA vendu sous la marque commerciale Visudyne® par QLT et Novartis Opthalmics). Les formulations des photo-sensibilisateurs de seconde génération qui associent à ces photo-sensibilisateurs une molécule (lipide, peptide, sucre etc..) qualifiée de transporteur qui permet leur acheminement sélectif au niveau du tissu tumoral sont appelées photo-sensibilisateurs de troisième génération.
Parmi les agents biologiques, on peut mentionner les oligonucléotides, de l’ADN, de l’ARN, des siARN, les peptides et les protéines et les saccharides, de préférence les peptides et les protéines et les saccharides. De préférence, la formulation est exempte de SiARN et/ou de microARN, et plus généralement exempte de séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d’ARN interférence, voire même exempte d’ARN autre que le mARN, voire même exempte de séquence nucléotidique autre que le mARN. Bien entendu, l’agent thérapeutique peut être formulé directement sous sa forme active ou sous forme d’un prodrug. Par ailleurs, il est envisagé que plusieurs agents thérapeutiques puissent être formulés en association dans la nanoémulsion.
La quantité d’agent thérapeutique dépend de l’application visée ainsi que de la nature de l’agent. Toutefois, on cherchera généralement à formuler la nanoémulsion avec une concentration maximale en agent thérapeutique, notamment lorsqu’il s’agit d’agents thérapeutiques peu solubles, afin de limiter le volume et/ou la durée d’administration au patient.
Or il a été constaté que la présence du lipide solubilisant dans la phase dispersée permet d’incorporer une quantité importante de composés mêmes hydrophobes ou amphiphiles.
Généralement, la proportion molaire des composants du cœur des nanoparticules lipidiques par rapport aux composants des nanoparticules lipidiques, sans tenir compte de la quantité molaire de(des) l’ARNm, est de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%. Autrement dit, la proportion molaire (mol/mol) des quantités molaires cumulées de lipide solubilisant, de l’éventuelle huile, de l’éventuel agent d’imagerie, de l’éventuel agent thérapeutique lipophile) par rapport à la quantité molaire de la phase dispersée (c'est-à-dire à la quantité molaire cumulée de tous les composants de la phase dispersée, sauf de celle du(des) ARNm, c’est-à-dire la quantité molaire cumulée de lipide solubilisant, éventuelle huile, éventuel agent d’imagerie, éventuel agent thérapeutique lipophile, lipide amphiphile, tensioactif cationique, co-tensioactif, éventuel lipide fusogène, éventuel agent thérapeutique amphiphile, est généralement de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%.
Généralement, la proportion massique (wt/wt) des composants du cœur des nanoparticules lipidiques par rapport aux composants des nanoparticules lipidiques, sans tenir compte du poids de(des) l’ARNm, est de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51%. Autrement dit, la proportion massique des masses cumulées du lipide solubilisant, de l’éventuelle huile , de l’éventuel agent d’imagerie, de l’éventuel agent thérapeutique lipophile par rapport à la phase dispersée (c'est-à-dire à la masse de tous les composants de la phase dispersée sauf l’ARNm, c’est-à-dire les masses cumulées de lipide solubilisant / éventuelle huile / éventuel agent d’imagerie / éventuel agent thérapeutique lipophile/ lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène, éventuel agent thérapeutique amphiphile, est généralement de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51%. Ces proportions molaires et/ou massiques sont particulièrement adaptées pour que la formulation « prémix » (celle utilisée pour préparer la formulation selon l’invention, avant complexation de l’ARNm) soit stable au stockage, notamment qu’elle soit stable en étant stockée plus de 2 ans à 4°C. La stabilité peut notamment être mesurée en suivant la taille des nanoparticules lipidiques, leur index de polydispersité et/ou leur potentiel zêta (par exemple par diffusion quasi-élastique de la lumière, notamment par un appareil de type ZetaSizer, Malvern). Cette stabilité de la formulation « prémix » est importante pour les applications envisagées. Il est particulièrement intéressant de pouvoir stocker la formulation « prémix » et d’effectuer la complexation avec l’ARNm juste avant utilisation de la formulation selon l’invention.
La phase aqueuse de la nanoémulsion utilisée dans l’invention est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium.
Selon un mode de réalisation, la phase aqueuse continue comporte également un agent épaississant tel que du glycérol, un saccharide, oligosaccharide ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol. En effet, l’utilisation d’une phase continue de viscosité plus élevée facilite l’émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication.
La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d’agent épaississant.
Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d’autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée.
La proportion de phase dispersée et de phase aqueuse est très variable. Cependant, le plus souvent, les nanoémulsions seront préparées avec 1 à 50%, de préférence 5 à 40% et tout particulièrement 10 à 30% en poids de phase dispersée (sans tenir compte de l’ARNm) et 50 à 99%, de préférence 60 à 95% et tout particulièrement 70 à 90 % en poids de phase aqueuse.
ARN messager (ARNm)
Dans la formulation, au moins un ARN messager (ARNm), dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques.
Cet ARNm est susceptible d’être traduit en protéine par une cellule eucaryote.
Sa séquence nucléotidique est monobrin, et il comprend au moins 300 bases, typiquement au moins 400 bases, notamment au moins 500 bases, de préférence au moins 1000 bases, de manière particulièrement préféré au moins 2000 bases, voire même plus de 10000 bases. Généralement, il comprend moins de 50 000 bases.
L’ARNm comprend typiquement (et est généralement constitué de) une coiffe en 5’, une région 5’-UTR, une région ORF, une région 3’-UTR et une queue poly(A) en 3’.
L’ARNm peut être naturel ou synthétique.
L’ARNm peut notamment être un ARNm synthétique transcrit in vitro (IVT mARN), par exemple tel que décrit dans l’article Sahin et al. Nature Reviews 13, 2014, 759.
L’ARNm synthétique peut comprendre une ou plusieurs bases non naturelles, notamment choisies parmi l’uridine, la pseudoridine, la N1-méthyl-pseudouridine, la 5- méthoxy-uridine et la 5-méthyl-cytidine, sous réserve que l’ARNm reste susceptible d’être traduit en protéine par une cellule eucaryote.
Sa région 3’-UTR peut être stabilisée, notamment par une séquence de stabilisation riche en pyrimidines. Typiquement la région 3’UTR est celle de la a- ou b-globine. Des modifications usuelles de l’ARNm synthétique sont décrites au paragraphe « Improving the translation and stability of mRNA » de l’article Sahin et al. Nature Reviews 13, 2014, 759.
L’ARNm synthétique comprend généralement une queue poly(A) en 3’.
Dans la formulation, l’ARNm n’est pas lié de façon covalente aux autres composants des nanoparticules lipidiques. Notamment, l’ARNm n’est pas lié de façon covalente ni au co-tensioactif, ni au lipide amphiphile, ni à l’éventuel agent d’imagerie. Ceci est très avantageux car les ARNm, une fois libérés dans leur site d’action, ne sont pas dénaturées et peuvent jouer le rôle attendu.
Un ARNm comprend des liaison phosphodiester, qui comprennent des groupements phosphates chargés négativement. L’ARNm est donc naturellement porteur de charges négatives.
Grâce à leurs charges négatives, les ARNm sont maintenus à la surface des nanoparticules lipidiques de la phase dispersée de la formulation grâce aux interactions électrostatiques avec les charges positives des tensioactifs cationiques.
Ils sont donc localisés à la surface des nanoparticules lipidiques, au niveau de la couronne des nanoparticules lipidiques, du côté hydrophile de la couronne.
Dans la formulation selon l’invention, le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager est supérieur ou égal à 2/1 , notamment supérieur ou égal à 4/1 , notamment supérieur ou égal à 5/1 , de préférence supérieur ou égal à 6/1 , de manière particulièrement préférée supérieur ou égal à 8/1 . Des rapports N/P inférieurs conduisent à une délivrance insuffisante de l’ARNm. Plus le rapport N/P est important, plus les nanoparticules lipidiques sont chargées en ARNm. Le rapport N/P est généralement inférieur à 2000. Généralement, l’ARNm n’est pas susceptible de moduler des mécanismes endogènes d’ARN interférence.
La formulation peut comprendre de la protamine, de préférence du sulfate de protamine. Celle-ci permet avantageusement de contracter l’ARNm et donc de limiter son encombrement stérique, ce qui améliore la complexation entre l’ARNm et les nanoparticules lipidiques. Ce mode de réalisation est donc particulièrement avantageux pour les ARNm à chaîne longue, comprenant typiquement au moins 2000 bases.
Taille
Les nanoparticules lipidiques de la formulation ont généralement un diamètre compris entre 20 et 250 nm, typiquement entre 40 et 200 nm. Ce diamètre peut notamment être mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière sur un appareil ZetaSizer, Malvern.
Comme illustré sur la figure 1 , les nanoparticules lipidiques de la formulation selon l’invention s’organisent sous forme de cœur - couronne, où :
- le cœur comprend :
- le lipide solubilisant, l’éventuelle huile, l’éventuel agent d’imagerie, l’éventuel agent thérapeutique s’il est lipophile,
- la couronne comprend :
- le lipide amphiphile,
- le tensioactif cationique, le co-tensioactif (éventuellement greffé avec une molécule d’intérêt),
- l’ARNm, l’éventuel lipide fusogène, l’éventuel agent thérapeutique s’il est amphiphile, l’éventuel tensioactif de formule (I).
De préférence, le cœur des nanoparticules lipidiques de la formulation est exempt d’ARNm, voire d’ARN, voire même de séquence nucléotidique. Autrement dit, il n’y a généralement pas d’ARNm, voire d’ARN, voire même de séquence nucléotidique, encapsulé à l’intérieur des nanoparticules lipidiques. La localisation des ARNm peut par exemple être vérifiée par microscopie électronique en transmission (TEM) ou par cryo- microscopie (cryo-TEM).
[Procédé de préparation]
Selon un deuxième objet, l’invention concerne le procédé de préparation de la formulation définie ci-dessus. Typiquement, on mélange d’abord les différents constituants huileux pour préparer un pré-mélange huileux pour la phase dispersée de la nanoémulsion, puis on le disperse dans une phase aqueuse sous l’effet d’un cisaillement, et enfin on complexe l’ARNm.
Le procédé de préparation comprend typiquement les étapes suivantes :
(i) préparer une phase huileuse comprenant le lipide solubilisant, le lipide amphiphile, le tensioactif cationique, l’éventuel lipide fusogène;
(ii) préparer une phase aqueuse comprenant le co-tensioactif;
(iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l’action d’un cisaillement suffisant pour former une formulation sous forme de nanoémulsion; puis
(iv) ajouter l’ARN messager dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases à la formulation obtenue à l’étape (iii), puis
(v) récupérer la formulation ainsi formée.
Généralement, la préparation de la phase huileuse comprend le mélange des composants huileux de la formulation (lipide solubilisant / lipide amphiphile / tensioactif cationique). Lorsque la formulation comprend un lipide susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale et/ou une huile, et/ou un agent d’imagerie et/ou un agent thérapeutique, ceux-ci sont généralement introduits dans la phase huileuse lors de l’étape (i).
Le mélange peut éventuellement être facilité par mise en solution d’un des constituants ou du mélange complet dans un solvant organique approprié. Le solvant organique est ensuite évaporé, pour obtenir un pré-mélange huileux homogène pour la phase dispersée.
Par ailleurs, il est préféré de réaliser le pré-mélange (étape (i)) à une température à laquelle l’ensemble des ingrédients est liquide.
Avantageusement, la phase huileuse est dispersée dans la phase aqueuse à l’état liquide. Si l’une des phases se solidifie à température ambiante, il est préférable de réaliser le mélange avec l’une ou de préférence les deux phases chauffées à une température supérieure ou égale à la température de fusion.
L’émulsification sous l’effet de cisaillement est de préférence réalisée à l'aide d'un sonificateur ou d'un microfluidiseur. De préférence, la phase aqueuse puis la phase huileuse sont introduites dans les proportions souhaitées dans un récipient cylindrique approprié puis le sonificateur est plongé dans le milieu et mis en marche pendant une durée suffisante pour obtenir une nanoémulsion, le plus souvent quelques minutes. A la fin de l’étape (iii), on obtient généralement une nanoémulsion homogène dans laquelle :
- le diamètre moyen des nanoparticules lipidiques, mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière, par exemple sur un appareil ZetaSizer, Malvern, est généralement supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, notamment de 20 à 200 nm, de préférence de 30 à 190 nm, et
- le potentiel zêta est supérieur à 20 mV, généralement compris entre 25 mV et 60 mV, de préférence entre 40 et 55 mV, mesuré par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS), par exemple sur un appareil ZetaSizer, Malvern, de préférence lorsque la phase aqueuse de la formulation est une solution aqueuse de NaCI 0,15 mM.
La nanoémulsion obtenue à la fin de l’étape (iii) (donc avant la complexation avec l’ARNm) correspond à la formulation dite « prémix ».
Pour une formulation prémix comprenant des nanoparticules lipidiques de taille comprise entre 20 et 40 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et :
- de 25 à 45% molaire de co-tensioactif (en dessous de 25% molaire, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité), et/ou
- de 15 à 50% molaire de tensioactif cationique.
Pour une formulation prémix comprenant des nanoparticules lipidiques de taille comprise entre 40 et 100 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et :
- de 45 à 50% molaire de co-tensioactif (en dessous de 45% molaire, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité. Au-delà de 50%, le relargage de l’ARNm du complexe LNP-ARNm est moins efficace, et/ou
- de 30 à 40% molaire de tensioactif cationique (en dessous de 30% molaire, le relargage de l’ARNm du complexe LNP-ARNm est moins efficace. Au-delà de 40%, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité).
Pour une formulation prémix comprenant des nanoparticules lipidiques de taille comprise entre 130 et 175 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile et de 15 à 70% molaire d’au moins un tensioactif cationique et :
- de 10 à 25% molaire, notamment de 10 à 15% de co-tensioactif.
Les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène. En complexant la formulation « prémix » définie ci-dessus avec de l’ARNm, on obtient la formulation selon l’invention.
L’étape (iv) permet alors de préparer la formulation par complexation desdits ARNm sur la formulation « prémix » obtenue à la fin de l’étape (iii).
Généralement, les ARNm sont ajoutés à la nanoémulsion formée et le mélange obtenu est mélangé à température ambiante (de 20 à 25°C), par exemple de 5 à 30 minutes.
Lors de l’étape (iv), les ARNm, porteurs de groupes phosphates chargés négativement, se lient par liaisons électrostatiques aux nanoparticules lipidiques dont la surface est chargée positivement grâce aux groupes cationiques des tensioactifs cationiques. Des complexes sont ainsi formés entre les ARNm et les nanoparticules lipidiques de la nanoémulsion. Les ARNm sont généralement ajoutés en solution aqueuse, par exemple de l’eau exempte de nucléases, des milieux de culture cellulaire, des milieux de culture. L’étape (iv) est typiquement réalisée à température ambiante (25°C), après simple homogénéisation ou sous agitation (par exemple entre 100 et 1000 tours par minute), pendant une durée comprise entre 5 minutes et 2 heures, par exemple de l’ordre de 30 minutes.
Lors de l'étape (iv), la quantité d’ARNm introduite est telle que le rapport entre la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charges négatives apportées par les séquences nucléotidiques introduites dans le milieu est supérieur ou égal à 2/1. L’homme du métier est à même de calculer la quantité de charges négatives apportées par les séquences nucléotidiques introduites dans le milieu, et la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix ».
L’étape (iv) peut être suivie par diverses méthodes, par exemple par : électrophorèse sur gel d’agarose, qui permet d’observer la migration des ARNm. S’il y a une bonne complexation, alors les ARNm complexés aux nanoparticules lipidiques sont plus lourds et sont visualisés dans les puits. Si la complexation est moins importante, des ARNm libres migreront à une autre position. diffusion dynamique de la lumière (DLS), en observant l’impact de la complexation sur le diamètre hydrodynamique. Plus la complexation est efficace, plus le profil s’oriente vers une distribution monomodale.
A la fin de l’étape (iv), on obtient généralement une nanoémulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des nanoparticules lipidiques est généralement supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, de préférence entre 60 et 200 nm.
Avantageusement, le procédé de préparation de la formulation ne nécessite pas de modifier chimiquement les ARNm, et ne nécessite en particulier pas de les greffer de façon covalente à un autre composant de la formulation. Il est donc très aisé de préparer en parallèle de nombreuses formulations selon l’invention comprenant des ARNm.
L’ajout de l’ARNm après la fabrication des nanoparticule lipidiques permet de rationaliser la fabrication à grande échelle d’une formulation prémix, qui sera complexé ultérieurement avec des ARNm distincts. Ceci apporte une forte amélioration par rapport à l’encapsulation d’ARNm au cœur de LNP, qui nécessite de préparer à nouveau les LNP dès que l’on souhaite changer la nature de l’ARNm.
La formulation peut être purifiée, par exemple par purification sur colonne ou par dialyse.
Avant conditionnement, l'émulsion peut être diluée et/ou stérilisée, par exemple par filtration ou dialyse. Cette étape permet d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion.
L’émulsion ainsi obtenue est prête à l’emploi, le cas échéant après dilution.
Selon un troisième objet, l’invention concerne la formulation susceptible d’être obtenue par le procédé défini ci-dessus.
[Kit]
Selon un quatrième objet, l’invention concerne un kit comprenant la formulation « prémix » telle que définie ci-dessus, et séparément, au moins un ARNm.
Dans le kit, la formulation « prémix » est séparée physiquement de l’ARNm. On peut par exemple utiliser un kit comprenant au moins deux récipients, un pour la formulation « prémix », et au moins un pour un ARNm, de préférence plusieurs contenant chacun des ARNm de nature différente.
De préférence, la quantité d’ARNm du kit est telle que le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique de la formulation « prémix » par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager est supérieur ou égal à 2/1. Autrement dit, le mélange de la formulation « prémix » et l’ARNm conduit à la préparation de la formulation selon l’invention.
Comme explicité ci-dessus, la formulation « prémix », notamment grâce à :
- la proportion molaire de tensioactif cationique dans la couronne des nanoparticules lipidiques,
- la proportion molaire de lipide amphiphile dans la couronne des nanoparticules lipidiques,
- la proportion molaire de co-tensioactif dans la couronne des nanoparticules lipidiques,
- le fait que le co-tensioactif comprenne une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- la présence de lipide solubilisant dans le cœur des nanoparticules lipidiques, et/ou - la proportion molaire et/ou massique de cœur dans les nanoparticules lipidiques, est avantageusement stable. Cette stabilité de la formulation « prémix » permet de stocker à long terme la formulation « prémix », notamment plus de deux ans à 4°C, ce qui est un énorme avantage pour pouvoir stocker et commercialiser le kit défini ci-dessus.
Il est ainsi avantageusement possible de préparer la formulation selon l’invention à partir de la formulation « prémix » et de l’ARNm juste avant utilisation de la formulation selon l’invention. La formulation « prémix » peut être stockée. Ainsi, il n’est pas nécessaire de préparer l’émulsion « prémix » à chaque fois que l’on souhaite utiliser la formulation selon l’invention, ce qui est un avantage en termes de gain de temps et de coût. [Utilisation]
La formulation est avantageusement stable et peu toxique. Elle peut être utilisée comme système de délivrance in vitro ou in vivo de ARNm.
Ainsi, selon un cinquième objet, l’invention concerne la formulation définie ci-dessus pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie.
Une utilisation préférentielle de la formulation selon l’invention est la délivrance d’une séquence d’ARNm codant pour une protéine antigénique dans le but d’induire une réponse immunitaire prophylactique contre des pathogènes. Ces pathologies peuvent être par exemple des pathologies inflammatoires, les cancers (cancer, les tumeurs solides, les métastases mais également les leucémies myéloïdes chroniques), ou bien les maladies infectieuses dans le cas d’une thérapie prophylactique. La maladie infectieuse peut être celle induite le virus de l’hépatite C (VHC), par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), par le virus respiratoire syncytial (VRS), par un coronavirus, notamment par la souche de coronavirus SARS-CoV-2, par exemple la COVID19, ou la grippe.
Lorsque la formulation comprend un agent d’imagerie, il est avantageusement possible de suivre la délivrance des ARNm, par exemple par suivi de la fluorescence lorsque l’agent d’imagerie est un fluorophore lipophile.
Avantageusement, comme explicité ci-dessus, la formulation selon l’invention protège les ARNm du corps du patient (et de ces nucléases) auquel la formulation est administrée.
La formulation peut comprendre un agent thérapeutique permettant de traiter la maladie, ce qui permet de bénéficier d’un double effet thérapeutique ou prophylactique : celui induit par les ARNm et celui induit par l’agent thérapeutique.
Du fait qu’elle peut être préparée exclusivement à partir de constituants approuvés pour l’homme, elle est intéressante pour une administration par voie parentérale. Cependant, il est également possible d’envisager une administration par d’autres voies, notamment par voie orale, par voie topique, ou par voie ophtalmologique. Une méthode de prévention et/ou de traitement d’une maladie comprenant l'administration chez un mammifère, de préférence un humain, qui en a besoin d'une quantité efficace de la formulation telle que définie ci-dessus est également un des objets de la présente invention.
[Définitions]
Dans le cadre de la présente demande, on entend par le terme « nanoémulsion » une composition présentant au moins deux phases, généralement une phase huileuse et une phase aqueuse, dans laquelle la taille moyenne de la phase dispersée est inférieure à 1 micron, de préférence de 10 à 500 nm et en particulier de 20 à 200 nm, et tout préférentiellement de 50 à 200 nm (voir article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid In, 2005, 10, 102-110).
Au sens de la présente demande, l’expression « phase dispersée » signifie les nanoparticules lipidiques comprenant l’éventuelle huile / le tensioactif cationique / le lipide solubilisant/ le lipide amphiphile/ le co-tensioactif/ l’éventuel tensiactif de formule (I)/ l’éventuel lipide fusogène / l’éventuel agent d’imagerie / l’éventuel agent thérapeutique / l’ARNm. La phase dispersée est généralement exempte de phase aqueuse.
Le terme « nanoparticules lipidiques » englobe à la fois les gouttelettes d’huile liquide proprement dites ainsi que les particules solides issues d’émulsions de type huile- dans-eau dans lesquelles la phase dispersée est solide. Dans ce dernier cas, on parle souvent aussi d’émulsion solide.
Le terme « lipide » désigne dans le cadre de cet exposé l’ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d’origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont des molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d’hydrogène et d’oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25°C), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles.
Le terme « phospholipide » vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d’acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline.
Le terme « lécithine » désigne la phosphatidylcholine, c’est-à-dire un lipide formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d’origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras.
On entend par le terme « acide gras » désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d’au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones.
On entend par le terme « tensioactif » des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés.
On entend par le terme « co-tensioactif » un tensioactif agissant en plus d’un tensioactif pour abaisser davantage l’énergie de l’interface.
On entend par le terme « chaîne hydrocarbonée » désigner une chaîne composée d’atomes de carbone et d’hydrogène, saturée ou insaturée (double ou triple liaison). Les chaînes hydrocarbonées préférées sont les alkyle ou alcényle.
On entend par le terme « alkylène » désigner un groupe divalent aliphatique hydrocarboné, saturé, linéaire ou ramifié, de préférence linéaire.
On entend par « radical cyclique » un radical issu d’un cycle. Par exemple, un radical phénylène est un radical divalent issu d’un groupe benzène. Par « cycle », on entend un carbocycle ou un hétérocycle, saturé, insaturé ou aromatique (aryle ou hétéroaryle), un carbocycle : un cycle composé d’atomes de carbone, saturé (les carbocycles saturés préférés étant notamment un cycloalkyle, tel que un cyclopentyle ou un cyclohexyle), insaturé (par exemple un cyclohexène) ou aromatique (c'est-à-dire un phényle),
- un hétérocycle : un groupe cyclique comprenant, sauf mention contraire, de 5 à 6 atomes, et comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et/ou S. Ledit hétérocycle peut être saturé ou partiellement insaturé et comprendre une ou plusieurs doubles liaisons. On parle alors de groupe hétérocycloalkyle. Il peut également être aromatique, comprenant, sauf mention contraire, de 5 à 6 atomes et représenter alors un groupe hétéroaryle. à titre d’hétérocycle non aromatique ou hétérocycloalkyle, on peut citer, le pyrazolidinyle, l’imidazolidinyle, le tétrahydrothiophényle, le dithiolanyle, le thiazolidinyle, le tétrahydropyranyle, le dioxanyle, le morpholinyle, le pipéridyle, le pipérazinyle, le tétrahydrothiopyranyle, le thiomorpholinyle, le dihydrofuranyle, le 2-imidazolinyle, le 2,-3-pyrrolinyle, le pyrazolinyle, le dihydrothiophényle, le dihydropyranyle, le pyranyle, le tétrahydropyridyle, le dihydropyridyle, le tétrahydropyrinidinyle, le dihydrothiopyranyle, l’isoxazolidinyle, à titre d’hétéroaryle, on peut notamment citer les groupes représentatifs suivants : furyle, imidazolyle, isoxazolyle, isothiazolyle, oxadiazolyle, 1 ,2,4- oxadiazolyle, 1 ,3,4-oxadiazolyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrazolyle, pyridyle, pyrimidinyle, pyrrolyle, 1 ,3,4-thiadiazolyle, 1 ,2,3-thiadiazolyle, thiazolyle, thiényle, triazolyle, 1 ,2,3-triazolyle et 1 ,2,4-triazolyle.
Par « ester activé », on entend un groupe de formule -CO-LG, et par « carbonate activé », on entend un groupe de formule -O-CO-LG où LG est un bon groupe partant notamment choisi parmi un chlore, un imidazolyle, un pentafluorophénolate, un pentachlorophénolate, un 2,4,5-trichlorophénolate, 2,4,6-trichlorophénolate, un groupe -O- succinimidyle, -O-benzotriazolyle, -0-(7-aza-benzotriazolyle) et -0-(4-nitrophényle).
L’invention sera décrite plus en détail au moyen des figures en annexe et des exemples qui suivent.
FIGURES
[Fig. 1] La figure 1 représente un schéma de la complexation de l’ARNm avec une nanoparticule lipidique (« LNP ») ayant une structure cœur/couronne afin de former un complexe ARNm-LNP. Dans la couronne de la nanoparticule lipidique sont illustrés les phospholipides (lécithine en tant que lipide amphiphile et DOTAP en tant que tensioactif cationique) et le co-tensioactif dont la chaîne poly(oxyde d’éthylène) se repliant est représentée dans la phase aqueuse. Dans le complexe ARNm-LNP, l’ARNm se localise dans la couronne des nanoparticules lipidiques.
[Fig. 2] La figure 2 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience, les expériences différant les unes des autres par le rapport N/P des complexes ARNm-LNP utilisés et/ou par la dose de complexes ARNm-LNP par puits (exemple 2).
* P < 0.05, ** P < 0.01 , *** P < 0.001 . NT, Non traité.
[Fig. 3] La figure 3 représente le pourcentage de cellules positive pour la GFP en fonction du nombre de nanoparticules lipidiques (« LNP ») par cellules (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes) (exemple 2).
[Fig. 4] La figure 4 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple 3). n.s., non-significatif, * P < 0.05, ** P < 0.01 , *** P < 0.001 .
NT, Non traité.
Lipo : Lipofectamine (contrôle positif),
LNP2018 : complexe ARNm-LNP préparé à partir de LNP ayant été stockées pendant 2 ans à +4°C avant la complexation avec l’ARNm,
LNP 2020 : complexe ARNm-LNP préparé à partir de LNP ayant été préparés juste avant la complexation avec l’ARNm
[Fig. 5] La figure 5 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple
4).
* P < 0.05, NT, Non traité.
[Fig. 6] La figure 6 représente le pourcentage de cellules positives à la GFP déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple
5).
*** P < 0.001. NT, Non traité.
[Fig. 7] La figure 7 représente le pourcentage de lymphocytes T CD4 exprimant CD69 en réponse aux cellules dendritiques traitées avec des complexes ARNm Ova - LNP conservés pendant 7 jours, 1 mois ou 3 mois à 4°C ou -20°C, déterminé à partir d’images de microscopie confocale pour chaque expérience (exemple 6).
No ttt : sans ajout de LNP ou de complexe (témoin)
CL40 : LNP non complexé
CL40-mRNA cherry frais : complexe LNP- mRNA cherry fraîchement complexé (contrôle positif)
CL40-mRNA OVA frais: complexe LNP- mRNA OVA fraîchement complexé (contrôle positif)
CL40-mRNA OVA -20°C: complexe LNP- mRNA OVA après conservation à -20°C. CL40-mRNA OVA 4°C: complexe LNP- mRNA OVA après conservation à 4°C.
[Fig. 8A] La figure 8A représente la concentration d’IFNy dans les surnageants des splénocytes cultivés 4 jours en présence de OVA + lipopolysaccharide (LPS) (exemple 7). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA control : complexe LNP- mRNA contrôle CL40-mRNA OVA : complexe LNP- mRNA OVA
[Fig. 8B] La figure 8B représente la concentration sérique d’anticorps anti-OVA (exemple 7). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA control : complexe LNP- mRNA contrôle CL40-mRNA OVA : complexe LNP- mRNA OVA [Fig. 9A] La figure 9A représente la concentration CI’IFNY dans les surnageants des splénocytes cultivés 2 jours en présence de Spike + lipopolysaccharide (LPS) (exemple 8). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA OVA I.P. : complexe LNP- mRNA OVA (contrôle), injection par voie intrapéritonéale
CL40-mRNA Spike I.P. : complexe LNP- mRNA Spike, injection par voie intrapéritonéale CL40-mRNA Spike I.M. : complexe LNP- mRNA Spike, injection par voie intramulsculaire [Fig. 9B] La figure 9B représente la concentration sérique d’anticorps anti-Spike (exemple 8). Chaque point représente une souris.
CL40-mRNA OVA : complexe LNP- mRNA OVA (contrôle)
CL40-mRNA Spike: complexe LNP- mRNA Spike
[Fig. 10] La figure 10 représente l’indice d’expression de la protéine Spike déterminé par des mesures en cytométrie de flux de la proportion de cellules PC3 exprimant la protéine Spike et de l’intensité moyenne de fluorescence de ces cellules (exemple 9). SPIKE Compacté seul : ARNm Spike et sulfate de protamine (exempt de LNP)
LNP seules : LNP non complexées
SPIKE-LNP N/P=6 : Complexe LNP-ARNm Spike avec un ratio N/P de 6 (exempt de sulfate de protamine)
SPIKE compacté-LNP N/P=6 : Complexe LNP-ARNm Spike compacté avec du sulfate de protamine.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de complexes ARNm-LNP
Dans les exemples qui suivent, des nanoparticules cationiques LNP sont celles de l’émulsion A3 du tableau 1 de la demande de brevet WO 2014/032953 en suivant le procédé de préparation décrit p. 65, 1. 30 à p. 66, 1. 16.
Un ARNm codant pour une protéine fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein, Tebu-Bio) a été utilisé.
La complexation de l’ARNm a été réalisée par mélange de la formulation préparée avec une solution d’ARNm dans du milieu OptiMEM.
Le mélange a été agité durant 10 minutes à 600 rpm à température ambiante (environ 25°C).
La figure 1 schématise l’étape de complexation entre les nanoparticules lipidiques et l’ARNm afin de forme le complexe LNP-ARNm. Exemple 2 : Détermination des conditions de complexation ARNm-LNP pour une déliyrance optimale de l’ARNm
Un ARNm codant pour une protéine fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein) a été utilisé pour démontrer la capacité des complexes ARNm-LNP à délivrer l’ARNm.
Des cellules des cellules épithéliales (PC3, adénocarcinome de la prostate, ATCC) ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes.
Des complexes ARNm-LNP ont été préparés extemporanément avec des rapports N/P de 2/1 , 4/1 , 8/1 , 16/1 , 24/1 ou 36/1 . Le rapport N/P est le rapport de la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation avant complexation (dues à l’azote chargé, d’où le N de N/P) par rapport à la quantité de charges négatives apportée par l’ARNm (dues au phosphate de l’ARNm, d’où le P de N/P).
Dans chaque cas, une dose de complexes ARNm-LNP par puits a été ajoutée sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7,3 à 20 mM de manière que la dose d’ARNm par puits soit de 7,8 ng, 15,8 ng, 31 ,25 ng, 62,5 ng, 125 ng ou 250 ng.
Le réactif Lipofectamine (Lipo) (Sigma) a été utilisé comme méthode de contrôle positif (référence) pour la délivrance d’ARNm. L’ARNm seul (ARNm) a été utilisé comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. Les noyaux cellules ont ensuite été marqués 24h après l’incubation avec les complexes avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Enfin, les cellules ont été observées au microscope confocal (Zeiss LSM880) par une prise d’image automatisée (25 images par puits, temps d’illumination de 4 psec par pixel). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>2000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA. * P < 0.05, ** P < 0.01 , *** P < 0.001 .
Les résultats sont fournis à la figure 2, où LNP NPX correspond aux résultats pour le complexe ARNm-LNP préparé avec un rapport N/P de X/1 , X étant le nombre indiqué. Par exemple, LNP NP2 signifie complexe ARNm-LNP préparé avec un rapport N/P de 2/1 .
On a observé que l’intensité de fluorescence est variable en fonction du rapport N/P des complexes ARNm-LNP, correspondant au rapport entre les charges positives portées les groupement amines des LNP et les groupements phosphates de chaque liaison phosphodiester de l’ARNm.
Une quantification systématique du nombre de cellules positives pour la GFP a été réalisée pour déterminer une plage optimale de rapport N/P permettant avoir une bonne efficacité de délivrance de l’ARNm GFP. Cette plage optimale du rapport N/P est dépendante de la quantité d’ARNm par puits.
En exprimant l’efficacité de transfection en fonction du nombre de LNP par cellules, qui est le produit du rapport N/P par la quantité d’ARNm, nous pouvons identifier une quantité optimale de nanoparticules par cellules à utiliser pour la délivrance d’ARNm. Ce nombre optimal peut être déterminé à partir de la figure 3 et s’élève à 8,32 millions de LNP par cellules dans le cas des cellules épithéliales PC3.
Ce nombre optimal est bien sûr variable en fonction du type de cellules. Cette méthode de détermination des paramètres des complexes formés pour une délivrance optimale d’ARNm permet ainsi une mise au point rapide et applicable à différents types cellulaires d’intérêt.
Exemple 3 : Etude de stabilité au stockage des LNP (avant complexation)
Pour démontrer la stabilité au stockage des LNP à +4°C, des complexes LNP-ARNm ont été préparés à partir :
- soit de LNP préparées en 2018 , soit deux ans avant la complexation, les LNP ayant été conservés à +4°C
- soit de LNP préparées en 2020, soit juste avant la complexation.
Des expériences ont été réalisées dans les conditions optimales déterminées sur les cellules épithéliales PC3 dans l’Exemple 2, c’est-à-dire avec un nombre de LNP par cellules constant à 8 millions.
Les cellules PC3 ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes LNP-ARNm. Les complexes ARNm-LNP ont été réalisés extemporanément aux rapports N/P de 8/1 , 16/1 , 32/1 , 64/1 , 128/1 , 256/1 , 512/1 ou 1024/1 et ceux-ci ont été ajoutés sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7.3 à 20mM à une dose de complexes ARNm-LNP par puits telle que la dose d’ARNm soit respectivement de 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng, 3,13 ng, 1 ,56 ng et 0,78 ng par puits, ce qui a permis un nombre constant de 8 millions de LNP par cellules.
Le réactif Lipofectamine (Lipo) a été utilisé comme méthode contrôle positif de référence pour la délivrance d’ARNm, tandis que l’ARNm seul (ARNm) a été utilisé comme contrôle négatif. Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. 24h après l’incubation avec les complexes, les noyaux cellules ont été marqués avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Les cellules fixées ont été observées au microscope confocal (Zeiss LSM880) par une prise d’image automatisée (25 images par puits, temps d’illumination de 4 psec par pixel). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>2000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA.
Les résultats sont fournis à la figure 4.
Les résultats montrent un pourcentage de cellules positives pour la GFP élevé et statistiquement significatif par rapport au contrôle non traité jusqu’à 3 ng d’ARNm par puits, lorsque l’ARNm est délivré par des LNP. Cela confirme bien l’efficacité des paramètres déterminés par la méthode décrite dans l’Exemple 2.
De plus, des LNP fabriquées en mars 2018 ou bien en septembre 2020 ont été utilisés, sans noter de différences statistiquement significatives (n.s., P-Values affichées) entre ces deux groupes. Ainsi, les complexes LNP-ARNm sont efficaces pour la délivrance d’ARNm, avec une efficacité similaire au contrôle positif commercial (Lipofectamine, Lipo). Cet exemple démontre la très forte stabilité dans le temps des LNP, et la possibilité de stocker les LNP non complexées à +4°C pendant au moins 2 ans.
Exemple 4: Etude de stabilité au stockage à +4°C des complexes ARNm-LNP
Dans l’exemple 3, ce sont les LNP avant complexation qui avaient été stockés à 4°C pendant deux ans.
A l’exemple 4, ce sont les complexes LNP-ARNm (donc une fois la complexation effectuée) qui ont été stockés 2 semaines à +4°C afin de déterminer leur capacité à délivrer un ARNm GFP dans des cellules cibles après 2 semaines de stockage.
Les cellules PC3 ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes.
Les complexes ont été réalisé extemporanément à un rapport de N/P de 8/1 (CL40- NP8 CTRL) ou bien 2 semaines avant l’expérience au rapport N/P de 32/1 (CL40-NP32 2sem-4C), 8/1 (CL40-NP82sem-4C) ou 4/1 (CL40-NP42sem-4C). Pour chacun des quatre types de complexes, et une dose d’ARNm par puits de 6,25, 12,5, 25, 50 ou 100 ng a été ajoutée sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7,3 à 20mM.
Les nanoparticules non complexées (exemptes d’ARNm) (LNP CTRL) ont été utilisées comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. 24h après l’incubation avec les complexes, les noyaux cellules ont ensuite été marqués avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Les cellules fixées ont été observées au microscope à épifluorescence (TECAN SparkCyto) par une prise d’image automatisée (5 images par puits, objectif X10). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>4000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA. * P < 0.05. NT, Non traité.
Les résultats sont fournis à la figure 5.
Une bonne efficacité de délivrance de l’ARNm GFP pour la dose de 100 ng est observée, que ce soit avec des complexes formés extemporanément à N/P de 8/1 ou bien 2 semaines au préalable à N/P 8/1 et N/P de 32/1 . En revanche, les complexes réalisés à N/P de 4/1 ne possèdent pas une efficacité de délivrance suffisante. Il faudrait augmenter la quantité de complexes LNP-ARNm introduits.
Les complexes LNP-ARNm sont donc stables pendant au moins deux semaines et permettent une bonne efficacité de délivrance d’ARNm. Le rapport N/P semble également jouer un rôle dans la conservation des complexes d’ARNm et de LNP à cœur lipidique à +4°C.
Exemple 5 : Démonstration de la résistance aux RNase de l’ARNm complexé à la surface des complexes LNP-ARNm
Dans cet exemple d’utilisation de l’invention, la résistance à la RNase de complexes formés par l’ARNm complexé à la surface des LNP a été testée.
Les cellules PC3 ont été ensemencées sur une plaque 96 puits à une densité de 8400 cellules par puits 24 h avant l’incubation avec les différents complexes.
Les complexes ont été réalisés à une dose de 100 ng ng d’ARNm par puits, extemporanément à un rapport de N/P de 8/1 ou 32/1. Dans le cas du groupe « Pre-RNAse », la RNase A est ajoutée à l’ARNm GFP seul à une concentration de 1 ng/mL finale puis incubée 10 min à 25°C, préalablement à l’ajout des LNP (comparatif). L’ARNm a dont été mis en contact de RNase avant la complexation avec les LNP.
Dans le cas du groupe « Post-RNase », la RNase A est ajoutée aux complexes ARNm-LNP à une concentration de 1 ng/mL finale puis les complexes ont été incubés 10 min à 25°C. L’ARNm mis en contact de RNase est donc complexé avec les LNP.
Les différents complexes ou contrôles ont ensuite été ajoutés sur les cellules PC3 dans du milieu RPMI supplémenté en HEPES pH7,3 à 20 mM.
Les LNP seules exemptes de ARNm (N/P de 8/1 et N/P de 32/1 seul, exempt d’ARNm, les quantités de LNP (non compléxés) introduites correspondants à celles introduites respectivement pour les tests NP8-ARNm et NP32-ARNm) ainsi que l’ARNm seul ont été utilisé comme contrôle négatif.
Après 6 h d’incubation, le milieu a été aspiré et remplacé par du milieu RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. Les noyaux cellules ont ensuite été marquées 24h après l’incubation avec les complexes avec du Hoechst 33342 (2 mM) pendant 20 min puis les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. Les cellules fixées ont été observées au microscope à épifluorescence (TECAN SparkCyto) par une prise d’image automatisée (5 images par puits, objectif X10). Les images ont été segmentées à l’aide du logiciel Cell Profiler et la positivité de chaque cellule pour la GFP a été évaluée par rapport à l’intensité de fluorescence normalisée pour corriger le bruit de fond à l’aide d’un script Python (>4000 cellules par conditions). Enfin, le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été quantifié (moyenne, ± S.E.M., N = 3 expériences indépendantes). Les P-values ont été déterminées par un test ANOVA. *** P < 0.001 . NT, Non traité.
Les résultats sont fournis à la figure 6.
Le prétraitement de l’ARNm GFP par la RNase A, à une concentration de 1 ng/mL pendant 10 min à 25°C (groupe Pre-RNAse), entraine une dégradation de celui-ci. En effet, nous n’observons pas de cellules PC3 positives pour la GFP en ajoutant les LNP à N/P de 8/1 ou N/P de 32/1 après ce prétraitement à la RNase A.
En revanche, si l’on complexe en premier une quantité d’ARNm GFP équivalente à la surface d’une LNP (groupe Post-RNAse), l’effet de la RNase A à 1 ng/mL pendant 10 min à 25°C est alors fortement réduit et nous observons toujours un nombre important de cellules positives pour la GFP aux rapports N/P de 8 ou N/P de 32. On note également que la conditions N/P de 8/1 est également plus favorable avec un taux de cellules positives pour la GFP plus important. Cette expérience démontre que l’ARNm est bien protégé d’une dégradation enzymatique bien qu’il ne soit pas encapsulé dans le cœur des LNP et qu’il soit exposé à la surface des LNP.
Les LNP protègent l’ARNm complexé à leurs surfaces de la dégradation par des enzymes présentes dans le milieu extérieur, telles que les RNAses (enzymes dégradant l’ARN), et ce grâce à la couronne protectrice de co-tensioactif présente à la surface des LNP.
Exemple 6 : Etude de stabilité au stockage à +4°C ou -20°C des complexes
ARNm Ova -LNP
Comme à l’exemple 4, ce sont les complexes LNP-ARNm (donc une fois la complexation effectuée) qui ont été stockés 2 semaines à +4°C afin de déterminer leur capacité à délivrer un ARNm dans des cellules cibles après 2 semaines de stockage. Dans cet exemple, l’ARNm était l’ARNm Ova.
A partir d’un même pool d’ARNm Ova complexés aux LNP, des aliquots ont été réalisés le même jour et ont été conservés à 4°C ou -20°C. A chacun des temps indiqués, des cellules dendritiques primaires ont été transfectées avec 1 aliquot conservés à 4°C ou 1 aliquot conservés à -20°C ou des LNP seuls ou de l’ARNm Ova ou Cherry fraîchement complexé aux LNP. 6h00 post transfection, des lymphocytes T CD4 d’OT-ll ont été co cultivés pendant 48h00 avec les cellules dendritiques préalablement traitées et la fréquence de lymphocytes T CD4 activés (CD69+) a été évaluée par cytométrie en flux.
Comme contrôle positif, des complexations LNP-ARNm Ova réalisées extemporanément (« frais ») ont été utilisés.
Les résultats sont fournis à la figure 7.
Alors que la conservation à 4°C des complexes LNP-ARNm Ova pendant 7 jours n’affecte pas l’activation des lymphocytes T CD4 induite par les cellules dendritiques traitées en comparaison aux complexes réalisées fraîchement, la conservation à -20°C altère la capacité des cellules dendritiques traitées à induire l’expression de CD69 dès J7. D’autre part, il faut atteindre 3 mois de conservation à 4°C pour que les complexes deviennent complètement inefficaces à induire une réponse cellulaire.
Exemple 7 : Induction d’une réponse immunitaire par une vaccination à base de LNP-ARNm Ova
Les souris C57BI6 ont été immunisées à JO et J21 par injection intrapéritonéale avec 10 pg d’ARNm Ova ou contrôle complexés aux LNP à un ratio N/P de 6. Une semaine après le rappel, à J28, les animaux ont été sacrifiés. Le sang a été récolté pour doser les anticorps anti-OVA par ELISA dans les sérums et les splénocytes ont été restimulés ex vivo avec la protéine OVA en présence de LPS pendant 4 jours afin d’évaluer la sécrétion d’IFNy par ELISA.
Les résultats sont fournis aux figures 8A et 8B. Cette expérience a été réalisé trois fois indépendamment et les résultats des figures 8A et 8B représentent l’ensemble de ces expériences regroupées.
Après 4 de jours de stimulation avec la protéine OVA en présence de LPS, les niveaux d’IFNy sécrétés dans le surnageant cellulaire sont supérieurs pour les cultures de splénocytes issues de souris immunisées avec l’ARNm Ova vectorisé. Bien qu’hétérogène, la production d’anticorps est aussi plus élevée dans ce groupe d’animaux.
Exemple 8 : Induction d’une réponse immunitaire par une vaccination à base de LNP-ARNm Spike
L’ARNm Spike a 4074 bases et est donc plus long que les ARNm testés dans les exemples qui précèdent.
10 pg d’ARNm Spike ou contrôle (Ova) vectorisés par des LNP à un ratio N/P de 6 ont été injectés à J0 et J27 par voie intrapéritonéale (I.P.) ou par voie intramusculaire (I.M.). A J34, les souris ont été sacrifiées et les splénocytes ont été restimulés ex vivo pendant 48h avec un pool de peptides Spike en présence de LPS afin d’évaluer la sécrétion d’IFNy par ELISA. Chaque groupe était composé de trois souris C57BI6.
Dosage d’anticorps anti-Spike : 3 pg d’ARNm Spike ou contrôle (Ova) vectorisés par des LNP à ratio N/P de 6 ont été injectés à J0 et J21 par voie intramusculaire. A J28, les souris ont été sacrifiées et le sérum a été utilisé pour doser les anticorps anti-Spike circulants par ELISA. Chaque groupe était composé de cinq souris Balb/c.
Les résultats sont fournis aux figures 9A et 9B.
La voie d’immunisation par injection intramusculaire permet de monter une réponse cellulaire spécifique contre la protéine spike impliquant la production d’IFNy, alors que la voie d’immunisation par injection intrapéritonéale n’induit aucune réponse.
Bien que la production d’anticorps anti-spike circulants soit relativement faible en comparaison à une immunisation avec la stratégie vaccinale de Pfizer (résultats non montrés), nous observons une augmentation dans le groupe de souris immunisé avec 3 pg d’ARNm Spike vectorisés par les LNP en comparaison au groupe contrôle (ARNm Ova vectorisé).
Exemple 9 : Effet de la compactation au sulfate de protamine pour améliorer la délivrance d’un ARNm Long Les cellules ont été transfectées à 1 ,5 pg/ml avec l’ARNm Spike-SARS-CoV-2 (4074 bases) complexés ou non avec des LNP selon un ratio N/P de 6, avec ou sans compactation par du sulfate de protamine.
Les contrôles négatifs utilisés étaient les LNP seules et l’ARNm Spike compacté seul.
Plus précisément, le protocole ci-dessous a été suivi.
Les cellules PC3 (lignée cellulaire épithéliale issue de cancer de la prostate) ont été cultivées en RPMI (Gibco™ 61870044) 10%SVF 1% AT B (Gibco™ 15140122) dans un incubateur à 37°C à 0% de C02 (PHCbi_MCO-20AIC).
Les cellules ont été ensemencées à 4.104cellules/cm2 en plaque 24 puits.
Au bout de 24h, les cellules ont été transfectées en milieu sans SVF et sans antibiotiques.
Les cellules ont été transfectées avec l’ARNm codant pour la protéine SPIKE du virus SARS-CoV-2 (taille ARNm 4074NT) à 1 ,5 pg/ml dans un volume final de 500mI par puits.
Pour la condition compactée, l’ARNm à 0,250 mg/ml en H20 a été préalablement mélangé selon un ratio 1 :1 avec le sulfate de protamine également à 0,250mg/ml en H20.
L’ARNm a été complexé avec les LNP selon un ratio N/P=6. Le volume de complexation a été ajusté à 50mI en Optimem (Gibco™ A4124801) avant d’être complété à 500mI final en milieu de transfection. Les cellules ont été incubées avec les complexes à 37°c pendant 6h. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu de culture RPMI 10%SVF 1% ATB.
Au bout de 24h de transfection les cellules ont été détachées 10 minutes en tryple (Gibco™ 12605010) après rinçage en PBS sans calcium et sans magnésium (Gibco™ 14190250). Elles ont ensuite été fixées en PFA 4% pendant 20 minutes. La protéine Spike était marquée avec un anticorps primaire anti-Spike (Cell signaling 42172) et un anticorps secondaire FITC (Jackson Lab 115.095.146) en PBS 1%BSA 0,1% Saponine.
La quantité de protéine Spike traduite suite à la transfection de l’ARNm spike est mesurée en cytométrie de flux (Becton Dickinson FACS_BD LSR II) en mesurant la proportion de cellules fluorescentes et l’intensité moyenne de fluorescence = 24h après la transfection des ARNm
Les résultats sont issus de deux expériences avec chacune au moins un duplicat par condition. L’indice d’expression de la protéine spike a été calculé en multipliant le pourcentage de cellules exprimant la protéine spike par l’intensité moyenne de fluorescence de ces cellules. Les résultats présentés sur la figure 10 montrent la capacité des LNP à acheminer efficacement l’ARNm Spike-SARS-CoV-2 de 4074 nucléotides dans les cellules lorsque celui-ci est préalablement compacté avec du sulfate de protamine. La présence de protamine améliore la délivrance de l’ARNm dans les cellules par les LNP. La protamine seule ne permet pas d’acheminer l’ARNm Spike dans les cellules.

Claims

REVENDICATIONS
1. Formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile, de 15 à 70% molaire de tensioactif cationique porteur d’au moins une charge positive comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et
- de 10% à 55% molaire de co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène, où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, dans laquelle au moins un ARN messager, dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, est complexé à la surface des nanoparticules lipidiques, le rapport N/P de la quantité de charges positives du tensioactif cationique par rapport à la quantité de charges négatives de l’ARN messager étant supérieur ou égal à 2/1.
2. Formulation selon la revendication 1 , dans laquelle le tensioactif cationique, de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation, a la formule (A) suivante :
[(Lipo)i-L-(Hydro)h]n+, (n/m) [Af (A) dans laquelle:
I et h représentent des nombres entiers indépendamment compris entre 1 et 4, n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 , généralement compris entre 1 et 50, Lipo représente un groupe lipophile tel que défini à la revendication 1 ,
Hydro représente un groupe hydrophile tel que défini à la revendication 1 comprenant au moins un groupe cationique,
L représente un groupe de liaison tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)- , -0-(C0)-0-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH, -0-P0(0H)-0- ou un radical divalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, lorsque l’un des I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3, un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0- et un radical trivalent cyclique de 5 à 6 atomes, pour les autres valeurs de I et h, L est un radical multivalent cyclique de 5 à 6 atomes,
A représente un anion, m est un nombre entier représentant la charge de l’anion, n est un nombre entier représentant la charge du cation [(Lipo)i-L-(Hydro)h].
3. Formulation selon la revendication 2, dans laquelle, dans la formule (A) du tensioactif cationique, L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(C0)-0-, -0-(C0)-NH- et -NH-(CO)-NH ou -0-P0(0H)-0-, lorsque l’un des groupes I ou h représente 1, et l’autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate 0P-(0-)3 et un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0-.
4. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le tensioactif cationique, de préférence chaque tensioactif cationique de la formulation, est choisi parmi : le L/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium,
- le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane,
- le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1 -propananium), le 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium, et
- le dioctadecylamidoglycylspermine.
5. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant un lipide fusogène, tel que la 1 ,2-Dioléoyl-sn-Glycéro-3-Phosphoéthanolamine.
6. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le lipide amphiphile est un phospholipide.
7. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant de la protamine, de préférence du sulfate de protamine.
8. Formulation selon la revendication 7, dans laquelle l’ARN messager comprend au moins 2000 bases.
9. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant un agent d’imagerie et/ou un agent thérapeutique.
10. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant un co-tensioactif greffé avec une molécule d’intérêt, de préférence un ligand biologique de ciblage.
11. Procédé de préparation d’une formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer une phase huileuse comprenant le lipide solubilisant, le lipide amphiphile, le tensioactif cationique, l’éventuel lipide fusogène;
(ii) préparer une phase aqueuse comprenant le co-tensioactif;
(iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l’action d’un cisaillement suffisant pour former une formulation sous forme de nanoémulsion; puis
(iv) ajouter l’ARN messager dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases à la formulation obtenue à l’étape (iii), puis (v) récupérer la formulation ainsi formée.
12. Méthode d’introduction in vitro d’un ARN messager, dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases, dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en contact de la cellule eucaryote avec une formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
13. Formulation selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d’une maladie.
14. Formulation pour son utilisation selon la revendication 13, pour le traitement d’un cancer.
15. Kit comprenant :
- une formulation sous forme de nanoémulsion comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée sous forme de nanoparticules lipidiques, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile, de 15 à 70% molaire d’au moins un tensioactif cationique porteur d’au moins une charge positive comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 11 à 23 atomes de carbone, un ester ou un amide d’acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et de 10% à 55% molaire d’un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d’éthylène) comprenant au moins 25 unités d’oxyde d’éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène, où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport aux proportions molaires cumulées du lipide amphiphile, du tensioactif cationique, du co-tensioactif et de l’éventuel lipide fusogène, et - séparément, au moins un ARN messager dont la séquence nucléotidique monobrin comprend au moins 300 bases.
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