EP4308688A1 - Milieu et procédé de production d'une reconstitution de moelle osseuse - Google Patents

Milieu et procédé de production d'une reconstitution de moelle osseuse

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EP4308688A1
EP4308688A1 EP22716252.6A EP22716252A EP4308688A1 EP 4308688 A1 EP4308688 A1 EP 4308688A1 EP 22716252 A EP22716252 A EP 22716252A EP 4308688 A1 EP4308688 A1 EP 4308688A1
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EP
European Patent Office
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cells
mesenchymal stem
endothelial
bone marrow
stem cells
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Pending
Application number
EP22716252.6A
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German (de)
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Mélanie Alexandra GADELORGE
Nicolas Lucien ESPAGNOLLE
Frédéric DESCHASEAUX
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Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Établissement Français du Sang
École Nationale Vétérinaire de Toulouse
Université de Toulouse
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Établissement Français du Sang
Universite Toulouse III Paul Sabatier
École Nationale Vétérinaire de Toulouse
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Publication date
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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium and a culture method making it possible to obtain, in a single step and in the same culture container, cells differentiated into osteoblasts and adipocytes as well as a network of endothelial cells organized from the same pool of mesenchymal stem cells and/or of a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells, previously selected and amplified simultaneously in the same culture container from a single sample. It also relates to a composition obtained by said process, a reconstitution of bone marrow and their uses.
  • the present invention also relates to a culture medium and a culture method allowing the culture and/or the differentiation into osteoblasts and adipocytes of mesenchymal stem cells as well as the organization of a network of endothelial cells. It also relates to a composition obtained by said process, a reconstitution of bone marrow and their uses.
  • these cocultures are usually carried out in several stages (osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells in the first stage, then assembly with a second pool of endothelial cells in a second stage). Furthermore, medullary adipose tissue is often ignored in these studies despite its increasing functional importance described in the literature.
  • the inventors have created a new model that comprehensively incorporates all the cellular and non-hematopoietic micro-environmental parameters of a marrow human bone. It includes the medullary adipose tissue, the osteoblastic compartment and the vascular compartment, also called the endothelial compartment.
  • the culture medium developed by the inventors makes it possible to obtain these 3 non-hematopoietic compartments of human bone marrow simultaneously and in particular from a single sample, in a single step, in the same culture container, without the use of cell line.
  • This makes it possible to generate an ex vivo human bone marrow comprising the osteoblastic, adipocyte and endothelial compartments in 2D but also in 3D, in particular via the use of a biomaterial.
  • this ex vivo bone marrow can form a spheroid/organoid type 3D structure.
  • the invention relates to a culture medium making it possible to obtain in a single step, in the same culture container, cells differentiated into osteoblasts and adipocytes, as well as a network of organized endothelial cells, from the same pool of mesenchymal stem cells and/or of a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells, comprising: a) fetal bovine serum (FCS), and/or platelet lysate (LP), b) 10 - 100 mM ascorbic acid, c) 10 - 100 ng/mL Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), d) 1 - 10 pg/mL insulin, e) 1 - 50 pg/mL apotransferrin, f) 1 - 100 ng/mL vascular endothelial growth factor (VEGF), and optionally g) 0.01-0.5% (v/v) intralipids.
  • FCS feta
  • the invention relates to a culture medium for the culture and/or the differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells, and optionally allowing the organization of a network of endothelial cells, comprising: a) fetal calf serum (SVF), and/or platelet lysate (LP), b) 10 - 100 mM ascorbic acid, c) 10 - 100 ng/mL Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), d) 1 -10 pg /mL insulin, e) 1 - 50 pg/mL apotransferrin, and f) 1 - 100 ng/mL vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • a culture medium for the culture and/or the differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells comprising: a) fetal calf serum (SVF), and/or platelet lysate (LP), b) 10 -
  • the invention in a second aspect, relates to a process for the in vitro culture of mesenchymal stem cells comprising the steps consisting in: a) seeding the mesenchymal stem cells in a culture medium as defined above; and b) culturing said mesenchymal stem cells.
  • the invention relates to a method for the in vitro culture of mesenchymal stem cells and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells, comprising the steps of: a) seeding the mesenchymal stem cells and/or the mixture mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells in a culture medium as defined above; and b) culturing said mesenchymal stem cells and/or said mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells.
  • this method makes it possible to obtain in a single step, in the same culture container, cells differentiated into osteoblasts and adipocytes, as well as a network of organized endothelial cells, from the same pool of mesenchymal stem cells. and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells.
  • the invention relates to a method of producing a bone marrow reconstitution comprising the method of in vitro culture of mesenchymal stem cells according to the invention.
  • the invention relates to a method for producing a reconstitution of bone marrow comprising the method of culturing in vitro mesenchymal stem cells and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells according to the invention.
  • the invention also relates to a reconstitution of bone marrow obtained by the method according to the invention.
  • the invention also relates to a reconstitution of bone marrow comprising osteoblasts, adipocytes and vessel-forming endothelial cells.
  • the invention also relates to a reconstitution of bone marrow comprising osteoblasts, adipocytes and a network of endothelial cells.
  • the invention also relates to a composition, preferably injectable, comprising cells obtained by the process of the invention.
  • the invention also relates to a reconstitution of bone marrow according to the invention or a composition according to the invention for its use for the treatment of diseases, in particular diseases affecting the integrity of the bone marrow and/or linked to a disorder of the hematopoiesis.
  • the invention relates to the use of a bone marrow reconstitution according to the invention, as a model for the study of physiology, physiopathology, the test of compounds and/or the test of physical and mechanical conditions.
  • the invention also relates to the use of a bone marrow reconstitution according to the invention, in a prosthesis or a medical device.
  • medium for the culture and/or the differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells is meant a medium suitable for the culture and/or the differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells.
  • this medium is a medium for the culture and/or the differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells and for the formation of a vascular network by endothelial progenitors and/or endothelial cells.
  • the term "medium for the culture and differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells” means a medium suitable for the culture and simultaneous differentiation into osteoblasts and into adipocytes of the same pool of cells mesenchymal strains, in a single step, in the same culture container, without cell assembly.
  • this medium is a medium for the culture and differentiation into osteoblasts and into adipocytes of mesenchymal stem cells allowing the organization of a network of endothelial cells.
  • this medium allows the simultaneous differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts and into adipocytes.
  • this medium allows the simultaneous differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts and adipocytes and the organization of an endothelial network, in a single step, in a single culture container, without assembly of cells a posteriori. It can be in different forms but is preferably liquid and allows the culture of eukaryotic cells, in particular of mammalian cells and more particularly of human cells.
  • culture refers to the multiplication of cultured cells.
  • differentiation relates to the acquisition by cells cultured in a culture medium of cellular characteristics which are not present in the cells initially used to inoculate the cell culture medium.
  • differentiation designates in particular the acquisition of characteristics involving in particular here the cells in the adipocyte or osteoblastic pathway.
  • meenchymal stem cells also called “mesenchymal stromal cells”, or MSCs
  • MSCs meenchymal stromal cells
  • stromal cells of mesodermal origin are characterized phenotypically by the co-expression of a certain number of markers such as for example CD73, CD90, CD105, CD146, and the absence of expression of other markers, in particular CD45 and CD34. They can be derived from bone marrow, adipose tissue, or umbilical cord blood from mammals.
  • Mesenchymal stem cells can be derived from rodents or primates, and in particular are of murine or human origin.
  • the mesenchymal stem cells are derived from primary cultures.
  • primary culture is meant a culture of cells derived directly from the tissue and/or cells of an individual.
  • endothelial progenitors cells engaged in endothelial differentiation but which are not yet recognizable as cells. endothelial cells under the microscope. They are characterized phenotypically by the expression of a certain number of markers such as for example CD133, CD34, CD31, VEGFR2.
  • endothelial cells cells completely differentiated in the endothelial pathway and therefore recognizable as endothelial cells under the microscope. They are characterized phenotypically by the expression of a certain number of markers such as for example CD31, VE-Cadherin, von Willebrand factor, VEGFR2.
  • Endothelial progenitors and endothelial cells have the ability to organize themselves into a network of endothelial cells, or even a vascular network, and therefore to organize themselves into vessels.
  • endothelial progenitors and endothelial cells of the invention can for example be obtained from mononuclear cells of the bone marrow.
  • ⁇ is meant a subject of an animal species, in particular of mammals. According to one mode of the invention, the individual is a primate or a rodent, preferably a mouse or a human being.
  • osteoblasts cells expressing the Runx2, DSX, ESP, BSP, DLX5 and/or Osterix (OSX) markers.
  • the osteoblastic phenotype can be evaluated under a phase-contrast microscope by assessing the level of mineralization, by staining with alizarin red, by immunohistochemistry by demonstrating alkaline phosphatase (ALP) activity thanks to a chemical reaction with naphthol AS - BIphosphate, by immunofluorescence with demonstration of osteocalcin, osteopontin, PAL and OSX.
  • ALP alkaline phosphatase
  • adipocytes cells expressing the LPL, PPARy, AdipoQ markers and/or cells detectable with a Bodipy fluorescent probe marking the lipids present in the lipid vacuoles.
  • the adipocyte nature of the cells can be verified by phase contrast microscopic examination showing the presence of lipid vacuoles, and by immunohistochemical staining with oil red O marking the lipids present in the lipid vacuoles.
  • the culture medium according to the invention is composed of a basic medium supplemented with various compositions and/or compounds.
  • the basal medium makes it possible to cultivate eukaryotic cells such as mammalian cells and in particular human cells.
  • eukaryotic cells such as mammalian cells and in particular human cells.
  • Such culture media are well known to those skilled in the art.
  • the base medium is chosen from DMEM, MEM- ⁇ , Ham's F-12, RPMI 1640, IMDM and combinations thereof.
  • the basal medium is MEM- ⁇ .
  • the basic medium according to the invention is supplemented with fetal calf serum (SVF), preferably from 0.5 to 5% (v/v) of S VF, and more particularly 2% ( v/v) of SVF.
  • This medium may further comprise intralipids, preferably from 0.01% to 1% (v/v) of intralipids, preferably from 0.01 to 0.5% (v/v) of intralipids, and more particularly 0.04% (v/v) intralipids.
  • the basic medium according to the invention is supplemented with platelet lysate (LP), preferably from 0.5 to 5% (v/v) of LP, and more particularly 1% (v/ v) LP.
  • LP platelet lysate
  • the basic medium according to the invention is supplemented with fetal calf serum (FCS) and platelet lysate (LP).
  • FCS fetal calf serum
  • LP platelet lysate
  • This medium may further comprise intralipids, preferably from 0.01% to 1% (v/v) of intralipids, preferably from 0.01 to 0.5% (v/v) of intralipids, and more particularly 0.04% (v/v) intralipids.
  • the fetal bovine serum and the platelet lysate are preferably sterile before being used in the culture medium.
  • the basal medium according to the invention is also supplemented with 10 to 100 mM of ascorbic acid, 10 to 100 ng/mL of “Bone Morphogenetic Protein 7” (BMP7), 1 to 10 pg/mL of insulin, 1 to 50 pg/mL apotransferrin, and 1 to 100 ng/mL vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • BMP7 “Bone Morphogenetic Protein 7”
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the medium according to the invention is supplemented with 30 to 70 pM of ascorbic acid, more preferably with 45 to 55 pM of ascorbic acid.
  • the medium according to the invention is supplemented with 30 to 70 ng/mL of BMP7, more preferably with 45 to 55 ng/mL of BMP7.
  • BMP7 according to the invention is a recombinant human protein.
  • the medium according to the invention is supplemented with 3 to 7 pg/mL of insulin, more preferably with 4.5 to 5.5 pg/mL of insulin.
  • the insulin according to the invention is a recombinant human insulin.
  • the medium according to the invention is supplemented with 8 to 12 pg/mL of apotransferrin, more preferably with 9 to 11 pg/mL of apotransferrin.
  • the apotransferrin according to the invention is a recombinant human apotransferrin.
  • the medium according to the invention is supplemented with 1 to 20 ng/mL of vascular endothelial growth factor (VEGF), more preferably with 5 to 15 ng/mL of VEGF.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the VEGF according to the invention is a recombinant human VEGF.
  • the proteins used in the medium are preferably of recombinant origin and used in purified form.
  • the culture medium according to the invention can be sterilized or filtered before being used.
  • the culture medium according to the invention can be used in various culture methods.
  • the invention relates to a process for the in vitro culture of mesenchymal stem cells comprising the steps consisting in: a) seeding the mesenchymal stem cells in a culture medium as defined above; and b) culturing said mesenchymal stem cells.
  • the invention also relates to a process for the in vitro culture of mesenchymal stem cells and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells, comprising the steps consisting in: a) seeding the mesenchymal stem cells and/or the mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells in a culture medium as defined above; and b) culturing said mesenchymal stem cells and/or said mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells.
  • these methods make it possible to obtain in a single step, in the same culture container, cells differentiated into osteoblasts and into adipocytes, as well as a network of organized endothelial cells, from the same pool of stem cells cells and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells.
  • endothelial progenitors and endothelial cells can also be cultured in the culture medium, at the same time as said mesenchymal stem cells.
  • the culture takes place in an adherent or non-adherent monolayer or in suspension or in the presence of a biomaterial (in solid form or in gel form).
  • the cells are cultured in suspension.
  • the culture can be carried out continuously or discontinuously, in batch, in fed-batch or in a perfused bioreactor or even within a microfluidic chip.
  • part of the mesenchymal stem cells is differentiated into osteoblasts and another part of the mesenchymal stem cells is differentiated into adipocytes, preferably simultaneously, in a single step, in the same medium and the same culture container, without assembly of cells a posteriori, and preferably from a single sample.
  • the endothelial progenitors and the endothelial cells organize themselves into vessels in the culture medium, at the same time as the said mesenchymal stem cells differentiate.
  • all the cells of the method according to the invention come from the same animal species, in particular from a mammal.
  • the cells are rodent or primate cells, preferably human cells.
  • Endothelial progenitors and/or endothelial cells can be cultured in the culture medium, at the same time as said mesenchymal stem cells.
  • Endothelial progenitors and/or endothelial cells present in the same pool of initial cells as the mesenchymal stem cells and originating from the same donor, can be cultured in the culture medium, at the same time as said mesenchymal stem cells.
  • the cells of the culture methods according to the invention are primary cells.
  • the mesenchymal stem cells are derived from primary cultures.
  • the endothelial progenitors and the endothelial cells are derived from primary cultures.
  • the mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells are derived from primary cultures, preferably from the same individual.
  • the mesenchymal stem cells, the endothelial progenitors and the endothelial cells are derived from a single sample taken from an individual.
  • the mesenchymal stem cells, the endothelial progenitors and the endothelial cells come from the same primary culture in the same well, from a single sample.
  • the mesenchymal stem cells, the endothelial progenitors and the endothelial cells are derived from a single sample taken from an individual.
  • the cells all come from the same sample taken from a single subject.
  • the cells come from a healthy individual, that is to say not suffering from a disease, in particular a disease affecting the integrity of the bone marrow and/or related to a disorder of hematopoiesis.
  • the cells used come from an individual suffering from a disease, in particular a disease affecting the integrity of the bone marrow and/or linked to a hematopoiesis disorder, such as aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, primary immune deficiency, or blood disease.
  • a disease in particular a disease affecting the integrity of the bone marrow and/or linked to a hematopoiesis disorder, such as aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, primary immune deficiency, or blood disease.
  • step a) is preceded by a step aO) in which the mesenchymal stem cells (MSCs), the endothelial progenitors and the endothelial cells are selected and amplified together in the same medium and, preferably , in the same culture container.
  • This medium is preferably the EGM2 medium (for Endothelial Growth Medium 2).
  • This stage lasts between 3 and 30 days, preferably between 5 and 25 days and more particularly between 10 and 20 days.
  • the temperature of the culture process is selected to allow the culture of the cells. Typically a temperature for culturing the cells is between 30°C and 38°C.
  • the oxygen concentration is selected to allow cell culture. Typically the oxygen concentration is between 10 and 30%, preferentially from 15 to 25%. Similarly, the carbon dioxide concentration is between 2 and 8%.
  • the cells are cultured in 2 dimensions or in 3 dimensions.
  • the inventors have in particular developed two distinct 3-dimensional (3D) culture approaches.
  • the different cell types form spheroids or organoids by self-organization
  • the cells are deposited on a 3D support.
  • the cells are seeded in step a) on a 3-dimensional support, preferably in the form of spheroids or on a 3-dimensional support.
  • the support can be any support allowing the culture of the cells considered.
  • the support can be a gel such as a hydrogel, or a solid. It can be formed from a silicone polymer (such as polydimethylsiloxane PDMS), a resin (such as DS 3000) and/or a calcium biomaterial.
  • the support is integrated into a microfluidic chip.
  • the support is a calcium biomaterial, preferably based on Tricalcium phosphate and/or hydroxyapatite, and more particularly the calcium biomaterial is formed from b-TCP.
  • the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts and adipocytes, as well as the organization of a vascular network are carried out simultaneously on the biomaterial or within the organoid, preferably in a single step, in a single culture container, from a single sample, without assembly of cells a posteriori.
  • the seeding as well as the culture and the differentiations can be carried out in a perfused bioreactor.
  • This embodiment ensures good cellular homogeneity on the biomaterial and allows maintenance in culture for at least 3 weeks thanks to the supply of oxygen and nutrients provided by the perfusion. This is particularly the case in cultures on a microfluidic chip which are perfused microbioreactors.
  • the invention relates to a method for producing a reconstitution of bone marrow comprising the method of in vitro culture of mesenchymal stem cells described above.
  • the invention relates to a method of producing a bone marrow reconstitution comprising the method of in vitro culture of mesenchymal stem cells and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells described above.
  • these methods are preceded by a cell expansion step, possibly lasting 1 to 2 weeks.
  • the cells are cultured in the culture medium according to the invention for 4 to 20 days, more preferentially from 7 to 15 days.
  • the temperature of the culture processes is selected in order to allow the culture of the cells. Typically a temperature for culturing the cells is between 30°C and 38°C.
  • the oxygen concentration is selected to allow cell culture. Typically the oxygen concentration is between 10 and 30%, preferentially from 15 to 25%. Similarly, the carbon dioxide concentration is between 2 and 8%.
  • the process for producing a bone marrow reconstitution comprises a process for the in vitro culture of mesenchymal stem cells comprising the steps consisting in: a) seeding the mesenchymal stem cells in a culture medium according to the invention with endothelial progenitors and endothelial cells; and b) culturing said cells.
  • the cells are cultured in step b) for 4 to 20 days, more preferably for 7 to 15 days.
  • the process for producing a bone marrow reconstitution comprises a process for the in vitro culture of mesenchymal stem cells and/or a mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells comprising the steps consisting in: a) inoculating the mesenchymal stem cells and/or the mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells in a culture medium according to the invention; and b) culturing said cells.
  • the cells are cultured in step b) for 4 to 20 days, more preferably for 7 to 15 days.
  • the inventors have demonstrated at the protein level the presence of the three marrow compartments in their reconstitution of bone marrow.
  • the invention relates to a reconstitution of bone marrow capable of being obtained by the production methods according to the invention.
  • the invention also relates to a reconstitution of bone marrow comprising osteoblasts, adipocytes and vessel-forming endothelial cells.
  • the invention also relates to a reconstitution of bone marrow comprising osteoblasts, adipocytes and a network of endothelial cells.
  • the cells of the bone marrow reconstitution are in direct contact.
  • the reconstitution of bone marrow according to the invention comprises vessels.
  • the reconstitution of bone marrow can therefore be in two or in three dimensions and possibly include the support or the biomaterial having served for its formation.
  • the reconstitution is included in a pharmaceutically acceptable medium.
  • the bone marrow reconstitution of the invention is typically suitable for implantation into an individual's body.
  • compositions comprising the cells obtained by the culture method according to the invention.
  • the composition according to the invention is preferably liquid, and more preferably injectable.
  • the cells can be in dispersed suspension or in the form of spheroids. In the latter case, the spheroids have an average diameter of less than 500 ⁇ m.
  • spheroids we mean a group of cells linked together in the three dimensions of space.
  • a spheroid comprises from 500 to 750,000 cells, or else from 1,000 to 500,000 cells.
  • the spheroids of the composition according to the invention have an average diameter of between 50 ⁇ m and 750 ⁇ m, preferably between 100 ⁇ m and 500 ⁇ m.
  • the composition is a pharmaceutical composition which comprises at least one cell obtained by the culture method according to the invention in a pharmaceutically acceptable medium.
  • compositions and molecular entities that do not produce side, allergic, or otherwise undesired reactions when administered to a subject.
  • a pharmaceutically acceptable excipient or vehicle is thus an encapsulating material, a diluent, a carrier, or any other non-toxic liquid, semi-solid or solid formulation auxiliary.
  • compositions of the invention are typically prepared to suit the mode of administration.
  • Acceptable pharmaceutical excipients are typically determined in part by the composition being administered, as well as the particular technique used to administer the composition.
  • compositions of the invention are preferably liquid and adapted to the route of administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can also comprise at least one other active compound, for example a calcium biomaterial.
  • a calcium biomaterial is known to be osteoinductive. They are already used in particular for fillings of loss of bone substance.
  • the subject of the invention is the reconstitution of bone marrow according to the invention or the composition according to the invention for its use for the treatment of diseases.
  • the diseases are diseases affecting the integrity of the bone marrow and/or linked to a disorder of hematopoiesis.
  • the reconstitution of bone marrow or the composition according to the invention could be used in order to promote hematopoiesis in various pathological situations, and in particular allow ectopic hematopoiesis, which would allow hematopoietic "normalization" in these patients.
  • treatment or “treating”, we mean here achieving, partially or substantially, one or more of the following results: partially or totally reducing the extent of the disease, improving a clinical symptom or an indicator associated with the disease, delaying, inhibit or prevent the progression of the disease, or partially or totally delay, inhibit or prevent the occurrence of a relapse of the disease.
  • a method for treating a disease affecting the integrity of the bone marrow and/or linked to a haematopoiesis disorder is thus proposed, in which a therapeutically effective quantity of a reconstitution of bone marrow according to the invention or of the composition according to the invention is administered to a subject suffering from a disease affecting the integrity of the bone marrow and/or linked to a haematopoiesis disorder.
  • subject is meant here a mammal, preferably a primate and preferably a human.
  • subject treated within the framework of the invention suffers from a disease affecting the integrity of the bone marrow, and/or from a hematopoiesis disorder.
  • a disease affecting the integrity of the bone marrow and / or a disorder of hematopoiesis we mean diseases where the bone marrow is damaged and / or diseases related to an excess, a deficiency or a disorder of hematopoiesis in an individual. These diseases include, for example, bone marrow aplasia, myelodysplastic syndrome, primary immune deficiency, and hematology, such as leukaemia, lymphoma or myeloma.
  • therapeutically effective amount is meant herein an amount of composition or reconstitution sufficient to destroy, modify, control or eliminate the disease.
  • a “therapeutically effective amount” also refers to an amount capable of delaying or minimizing the extent of the disease.
  • therapeutically effective amount means an amount of the composition or reconstitution, alone, or in combination with other therapies, which provides therapeutic benefit in the treatment or management of disease, including an improvement in the symptoms associated with the disease.
  • the therapeutically effective amount naturally depends on the product administered, the mode of administration, the therapeutic indication, the age of the patient and his condition.
  • the dosage depends on the individual case and, as is well known to those skilled in the art, must be adapted to the individual circumstances to obtain an effective therapeutic amount and an optimum effect.
  • the therapeutically effective dose level is specific for any patient, and will in particular depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disorder, age, body weight, general health, gender and the patient's diet, time of administration, route of administration, duration of treatment, drugs used in combination, and the like factors well known in the medical field.
  • the bone marrow reconstitution or the composition according to the invention are administered subcutaneously or intrafemorally.
  • the subject of the invention is the use of bone marrow reconstitution as defined above, in a biomedical application, in which the biomedical application is preferably selected from prostheses, and devices medical.
  • the invention therefore relates to the use of a bone marrow reconstitution as defined above, in a prosthesis, or a medical device.
  • the invention relates to the use of a reconstitution of bone marrow as defined above, as a model for the study of physiology, physiopathology, the test of compounds, and/or of physical conditions and /or mechanical.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a reconstitution of bone marrow according to the invention to study the cellular and/or molecular mechanisms involved in the differentiation of mesenchymal stem cells.
  • the reconstruction can be formed from a sample from a donor, it can be used to study variations due to age, sex, etc. It can also serve as a bone marrow model for a stage. particular life model, such as aged bone marrow model, young bone marrow model, fetal bone marrow model, etc.
  • the reconstitution then comprises at least one model cell type of the disease under study and/or a cell type originating from an individual suffering from the disease under study.
  • the invention also relates to the use of a bone marrow reconstitution according to the invention as a model of pathological bone marrow.
  • one or more of the cell types of the reconstitution are model cell types of pathologies.
  • model cell types of pathologies we mean cell types from animal models reproducing pathologies appearing spontaneously or induced by genetic engineering methods (such as for example transgenesis) or with pharmacological tools in order to reproduce the characteristics of cells individuals affected by these particular pathologies.
  • one or more of the cell types of the reconstitution come from an individual suffering from the disease under study.
  • the pathologies studied according to the invention are pathologies having or being suspected of having an influence on the bone marrow, such as: bone marrow aplasia, myelodysplastic syndrome, primary immune deficiency, hemopathies such as leukaemia, lymphoma or myeloma.
  • the reconstitution according to the invention can also be used to study pathologies developing at a particular time in the life of the individual.
  • testing molecules we mean studying the impact of these molecules on the bone marrow.
  • at least one molecule to be tested is applied to the reconstitution according to the invention, and after an exposure or incubation time, the reconstitution is analyzed in order to determine the changes which have been caused by said at least one molecule tested. These changes may in particular concern cell morphology, cell growth and death, the formation or disappearance of vessels, the expression of certain proteins, cell differentiation, etc. ...
  • molecules we mean molecules for preventive, therapeutic or diagnostic purposes targeting the cellular and molecular actors of the bone marrow.
  • Another aspect of the invention relates to the use of bone marrow reconstitution according to the invention to study the efficacy and/or toxicity of a drug candidate.
  • the invention relates to the use of a bone marrow reconstitution according to the invention to study the efficacy and/or toxicity of a drug candidate for a particular individual.
  • a reconstitution of bone marrow made from an individual's sample can serve as a model to study the efficacy and/or toxicity of a drug candidate for this particular individual.
  • This type of analysis can be carried out in particular in the context of personalized medicine, to define the most suitable treatment for an individual.
  • testing physical and/or mechanical conditions we mean studying the impact of these conditions on the reconstitution of bone marrow.
  • at least one physical or mechanical condition is applied to the reconstitution according to the invention.
  • the reconstitution is analyzed in order to determine the changes that have been caused by the said at least one physical or mechanical condition tested.
  • These changes may in particular concern cell morphology, cell growth and death, the formation or disappearance of vessels, the expression of certain proteins, cell differentiation, etc.
  • the result of adding of the physical or mechanical condition by comparing it to a reconstruction on which the condition has not been applied.
  • mechanical condition is meant in particular pressure, contraction, stretching, gravity, weightlessness, shear.
  • the invention relates to the use of a reconstitution of bone marrow according to the invention, as a model for the long-term study of hematopoiesis and/or the differentiation of mesenchymal stem cells.
  • long term we mean over more than 3 days, more than 10 days, more than 15 days, more than 20 days and preferably up to 21 days.
  • Figure 1 presents the relative expression of genes involved in osteoblastic, adipocyte and vascular (endothelial cells) lineages present in bone marrow reconstructions after culture in 2D models.
  • the cells After selection and amplification in EGM2 medium, the cells are cultured without passage, in the same culture container, for 14 days in 2D in the medium according to the invention (with FCS and intralipids).
  • RT-qPCR Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction
  • Figure 2 presents the relative expression of genes involved in the osteoblastic, adipocyte and vascular (endothelial cells) lineages present in the bone marrow reconstructions after culture in the 2D models.
  • EGM2 medium After selection and amplification in EGM2 medium, the cells are cultured without passage, in the same culture container, for 14 days in 2D in either a medium with FCS and intralipids, or a medium with LP without intralipid, or in their medium of amplification (EGM2 medium), corresponding to the CTRL condition.
  • RT-qPCR Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction
  • Figure 3 presents the relative expression of genes corresponding to the prohaematopoietic factors present in the bone marrow reconstructions after culture in the 2D models.
  • the cells After selection and amplification in EGM2 medium, the cells are cultured without passage, in the same culture container, for 14 days in 2D in either a medium with FCS and intralipids, or a medium with LP without intralipid, or in their medium of amplification (EGM2 medium), corresponding to the CTRL condition.
  • RT-qPCR Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction
  • Figure 4 shows the number of CD34CD38 cells, the most immature hematopoietic cells, obtained after co-culture for 14 days of hematopoietic stem cells (HSC) with bone marrow reconstitutions obtained according to the method described in the invention.
  • HSC hematopoietic stem cells
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • Promocell Endothelial Growth Medium 2
  • the cells are cultured in a medium allowing the differentiation in the same culture of a part of the MSCs into osteoblasts (bone compartment), of another part into adipocytes (adipose compartment), while allowing the organization of 'a vascular network
  • the medium used here is composed of a base of MEMa medium supplemented with 2% fetal calf serum, 50uM ascorbic acid, 0.04% (v/v) intralipids, 50ng/mL of Bone Morphogenetic Protein 7. 5 pg/mL insulin, 10 pg/mL apotransferrin and 10 ng/mL VEGF.
  • the inventors have also demonstrated the presence of the different compartments by fluorescence analyzes (immunofluorescence and fluorescent probes), targeting markers specific to each compartment (Osterix for the osteoblasts, CD31 for the endothelial cells, Bodipy for the adipocytes). These different markers were highlighted in the 2D model, the spheroid model (3D model) as well as in the model on bTOR biomaterial in a perfused bioreactor (3D model).
  • the bone marrow reconstitutions were carried out as in example 1 but different compositions of the differentiation medium are tested.
  • the cells recovered after a primary culture of bone marrow in EGM2 are seeded at 20,000 cells/cm 2 in EGM2 medium and left in this medium for 4 to 6 days, at 37° C. and 5% C0 2 .
  • the EGM2 medium is then replaced by one of the two differentiation media (SVF or LP) described below.
  • the differentiation medium is renewed at the rate of 2 changes per week. After 14 days in differentiation medium, the culture is stopped to carry out a gene analysis.
  • the so-called SVF medium is composed of a base of MEMa medium supplemented with 2% (v/v) fetal calf serum, 50 mM ascorbic acid, 0.04% (v/v) intralipids, 50 ng/ mL of Bone Morphogenetic Protein 7.5 pg/mL insulin, 10 pg/mL apotransferrin and 10 ng/mL VEGF.
  • the so-called LP medium is composed of a base of MEMa medium supplemented with 1% (v/v) of platelet lysate (LP), 50 pM of ascorbic acid, 50 ng/mL of Bone Morphogenetic Protein 7.5 pg/mL of insulin, 10 ⁇ g/mL apotransferrin and 10 ng/mL VEGF.
  • LP platelet lysate
  • the older the bone marrow the more the adipose tissue increases in proportion and loses functionality with a drop in vascularization, conversely, the younger the bone marrow, the greater the bone density with a more vascularity.
  • the modulation of the composition of the culture medium could allow the study of aging at the level of the hematopoietic niche.
  • results show an increase in the expression of the main pro-haematopoietic factors in the bone marrow reconstructions generated in vitro using the method according to the invention, compared with the CTRL condition (FIG. 3).
  • These factors are secreted or expressed in vivo by the marrow microenvironment at the hematopoietic niches, and are necessary for the establishment of hematopoiesis in the bone marrow, indicating the functionality of the bone marrow reconstitutions according to the invention.
  • the mesenchymal stem cells and/or the mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells are cultured without passage, in the same culture container, for 14 days in 2D in either a medium with FCS and intralipids, or a medium with LP without intralipids, or in their amplification medium (EGM2 medium), corresponding to the “EGM2” condition.
  • EGM2 medium amplification medium
  • the mesenchymal stem cells and/or the mixture of mesenchymal stem cells, endothelial progenitors and endothelial cells are cultured under the same conditions as before (same cell density, culture time, etc) for 14 days in 2D in MEMa medium with FCS.
  • This medium being a reference medium used in most publications for the culture of mesenchymal stem cells, it corresponds to the “MES” condition.
  • HSCs hematopoietic stem cells

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Abstract

La présente invention concerne un milieu de culture et un procédé de culture permettant d'obtenir en une seule étape et dans un même contenant de culture, des cellules différenciées en ostéoblastes et en adipocytes ainsi qu'un réseau de cellules endothéliales organisées à partir d'un même pool de cellules souches mésenchymateuses et/ou d'un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales, préalablement sélectionnés et amplifiés simultanément dans un même contenant de culture à partir d'un prélèvement unique. Elle concerne également une composition obtenue par ledit procédé, une reconstitution de moelle osseuse et leurs utilisations.

Description

TITRE : Milieu et procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse
La présente invention concerne un milieu de culture et un procédé de culture permettant d’obtenir en une seule étape et dans un même contenant de culture, des cellules différenciées en ostéoblastes et en adipocytes ainsi qu’un réseau de cellules endothéliales organisées à partir d’un même pool de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales, préalablement sélectionnés et amplifiés simultanément dans un même contenant de culture à partir d’un prélèvement unique. Elle concerne également une composition obtenue par ledit procédé, une reconstitution de moelle osseuse et leurs utilisations.
La présente invention concerne aussi un milieu de culture et un procédé de culture permettant la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses ainsi que l’organisation d’un réseau de cellules endothéliales. Elle concerne également une composition obtenue par ledit procédé, une reconstitution de moelle osseuse et leurs utilisations.
La reproduction de moelle osseuse humaine adulte ex vivo est de plus en plus décrite dans la littérature afin de pallier aux modèles animaux qui sont coûteux, consommateurs en temps et tributaires de la barrière des espèces. Des études ont commencé à mettre en évidence des modèles 3D de cocultures regroupant les compartiments ostéoblastique et endothélial, généralement à partir de cellules issues de lignées. Par exemple, le compartiment endothélial, jouant un rôle actif dans la prolifération des cellules souches hématopoïétiques (CSH), est souvent incorporé par l’intermédiaire de lignées cellulaires endothéliales de type HUVEC. D’autres modèles nécessitent une étape chez la souris pour permettre la vascularisation ou des approches fonctionnelles. De plus, ces cocultures sont réalisées la plupart du temps en plusieurs étapes (différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses dans un premier temps, puis assemblage avec un second pool de cellules endothéliales dans un second temps). Par ailleurs, le tissu adipeux médullaire est souvent ignoré dans ces études malgré son importance fonctionnelle croissante décrite dans la littérature.
Les inventeurs ont créé un nouveau modèle incorporant de manière exhaustive tous les paramètres micro-environnementaux cellulaires et non hématopoïétiques d’une moelle osseuse humaine. Il comprend le tissu adipeux médullaire, le compartiment ostéoblastique et le compartiment vasculaire, aussi appelé compartiment endothélial. Le milieu de culture développé par les inventeurs permet d’obtenir de manière simultanée ces3 compartiments non hématopoïétiques de la moelle osseuse humaine et en particulier à partir d’un prélèvement unique, en une seule étape, dans le même contenant de culture, sans utilisation de lignée cellulaire. Cela permet de générer une moelle osseuse humaine ex vivo comportant les compartiments ostéoblastique, adipocytaire et endothélial en 2D mais également en 3D notamment via l’utilisation d’un biomatériau. En outre, par auto organisation cette moelle osseuse ex vivo peut former une structure 3D de type sphéroïde/organoïde.
De plus, dans les études précédentes la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en adipocytes et en ostéoblastes nécessitait de réaliser les deux différenciations séparément dans deux milieux différents. Non seulement, le milieu développé par les inventeurs permet de réaliser ces deux voies de différenciation en même temps mais aussi de favoriser l’organisation d’un réseau endothélial dans le même milieu, et dans le même puits de culture, sans assemblage de cellules à posteriori, simplifiant ainsi grandement les manipulations nécessaires notamment à la réalisation d’une reconstitution de moelle osseuse.
Ainsi l’invention concerne un milieu de culture permettant d’obtenir en une seule étape, dans un même contenant de culture, des cellules différenciées en ostéoblastes et en adipocytes, ainsi qu’un réseau de cellules endothéliales organisées, à partir d’un même pool de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales, comprenant : a) du sérum de veau fœtal (SVF), et/ou du lysat plaquettaire (LP), b) 10 - 100 mM d’acide ascorbique, c) 10 - 100 ng/mL de « Bone Morphogenetic Protein 7 » (BMP7), d) 1 -10 pg/mL d’insuline, e) 1 - 50 pg/mL d’apotransferrine, f) 1 - 100 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), et optionnellement g) 0,01-0,5% (v/v) d’intralipides. Ainsi l’invention concerne un milieu de culture pour la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses, et optionnellement permettant l’organisation d’un réseau de cellules endothéliales, comprenant : a) du sérum de veau fœtal (SVF), et/ou du lysat plaquettaire (LP), b) 10 - 100 mM d’acide ascorbique, c) 10 - 100 ng/mL de « Bone Morphogenetic Protein 7 » (BMP7), d) 1 -10 pg/mL d’insuline, e) 1 - 50 pg/mL d’apotransferrine, et f) 1 - 100 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF).
Dans un second aspect, l’invention concerne un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses comprenant les étapes consistant à : a) Ensemencer les cellules souches mésenchymateuses dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus; et b) cultiver les dites cellules souches mésenchymateuses.
L’invention concerne un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales, comprenant les étapes consistant à : a) Ensemencer les cellules souches mésenchymateuses et/ou le mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus; et b) cultiver les dites cellules souches mésenchymateuses et/ou ledit mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales.
De préférence ce procédé permet d’obtenir en une seule étape, dans un même contenant de culture, des cellules différenciées en ostéoblastes et en adipocytes, ainsi qu’un réseau de cellules endothéliales organisées, à partir d’un même pool de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales.
L’invention concerne un procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses selon l’invention. L’invention concerne un procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales selon l’invention.
L’invention a aussi pour objet une reconstitution de moelle osseuse obtenue par le procédé selon l’invention. L’invention concerne également une reconstitution de moelle osseuse comprenant des ostéoblastes, des adipocytes et des cellules endothéliales formant des vaisseaux. L’invention concerne aussi une reconstitution de moelle osseuse comprenant des ostéoblastes, des adipocytes et un réseau de cellules endothéliales.
L’invention a également pour objet une composition, de préférence injectable, comprenant des cellules obtenues par le procédé de l’invention.
L’invention concerne également une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de maladies, notamment de maladies affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l’hématopoïèse.
Enfin, l’invention concerne l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention, comme modèle pour l’étude de la physiologie, physiopathologie, le test de composés et/ou le test de conditions physiques et mécaniques.
L’invention porte également sur l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention, dans une prothèse ou un dispositif médical.
Description détaillée de l’invention
Milieu de culture
Par « milieu pour la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses », on entend un milieu adapté pour la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses. De préférence ce milieu est un milieu pour la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses et pour la formation d’un réseau vasculaire par des progéniteurs endothéliaux et/ou des cellules endothéliales.
Par « milieu pour la culture et la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses », on entend un milieu adapté pour la culture et la différenciation simultanée en ostéoblastes et en adipocytes d’un même pool de cellules souches mésenchymateuses, en une seule étape, dans un même contenant de culture, sans assemblage de cellules. De préférence ce milieu est un milieu pour la culture et la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses permettant l’organisation d’un réseau de cellules endothéliales.
De préférence ce milieu permet la différenciation simultanée de cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes et en adipocytes. De préférence ce milieu permet la différenciation simultanée de cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes et en adipocytes et l’organisation d’un réseau endothélial, en une seule étape, dans un seul contenant de culture, sans assemblage de cellules a posteriori. Il peut se présenter sous différentes formes mais est de préférence liquide et permet la culture de cellules eucaryotes, en particulier de cellules de mammifères et plus particulièrement de cellules humaines.
Tel que prévu ici, le terme « culture » se rapporte à la multiplication des cellules cultivées.
Le terme « différenciation » concerne l'acquisition par des cellules cultivées dans un milieu de culture de caractéristiques cellulaires qui ne sont pas présentes dans les cellules initialement utilisées pour ensemencer le milieu de culture cellulaire. Comme prévu ici, la « différenciation » désigne notamment l'acquisition de caractéristiques engageant en particulier ici les cellules dans la voie adipocytaire ou ostéoblastique.
Par « cellules souches mésenchymateuses » aussi appelées « cellules stromales mésenchymateuses », ou CSM, on entend des cellules stromales d'origine mésodermique. Elles sont caractérisées phénotypiquement par la co-expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD73, CD90, CD105, CD146, et l'absence d'expression d'autres marqueurs, en particulier le CD45 et le CD34. Elles peuvent être issues de la moelle osseuse, du tissu adipeux, ou du sang de cordon ombilical de mammifères. Les cellules souches mésenchymateuses peuvent être issues de rongeurs ou de primates, et en particulier sont d’origine murine ou humaine.
Dans un mode préférentiel, les cellules souches mésenchymateuses sont issus de cultures primaires. Par « culture primaire » on entend une culture de cellules issue directement du tissu et/ou de cellules d’un individu.
Par « progéniteurs endothéliaux » on entend des cellules engagées dans la différenciation endothéliale mais qui ne sont pas encore reconnaissable comme cellules endothéliales au microscope. Elles sont caractérisées phénotypiquement par l’expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD133, CD34, CD31 , VEGFR2.
Par « cellules endothéliales » on entend des cellules complètement différenciées dans la voie endothéliale et donc reconnaissable comme cellules endothéliales au microscope. Elles sont caractérisées phénotypiquement par l’expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD31 , VE-Cadherine, von Willebrand factor, VEGFR2.
Les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales ont la capacité de s’organiser en réseau de cellules endothéliales, ou encore réseau vasculaire, et de donc de s’organiser en vaisseaux.
Les progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales de l'invention peuvent par exemple être obtenues à partir de cellules mononuclées de la moelle osseuse.
Par « individu » on entend un sujet d’une espèce animale, en particulier de mammifères. Selon un mode de l’invention, l’individu est un primate ou un rongeur, de manière préférée une souris ou un être humain.
Par « ostéoblastes » on entend des cellules exprimant les marqueurs Runx2, DSX, ESP, BSP, DLX5 et/ou Osterix (OSX). Le phénotype ostéoblastique peut être évalué au microscope à contraste de phase par appréciation du niveau de minéralisation, par coloration à l’alizarine rouge, par immunohistochimie par mise en évidence de l’activité phosphatase alcaline (PAL) grâce à une réaction chimique au naphtol AS-BIphosphate, par immunofluorescence avec mise en évidence de l’ostéocalcine, de l’ostéopontine, de la PAL et OSX.
Par « adipocytes » on entend des cellules exprimant les marqueurs LPL, PPARy, AdipoQ et/ou des cellules détectables avec une sonde fluorescente Bodipy marquant les lipides présents dans les vacuoles lipidiques. La nature adipocytaire des cellules peut être vérifiée par l’examen microscopique à contraste de phase montrant la présence de vacuoles lipidiques, et par une coloration immunohistochimique à l’oil red O marquant les lipides présents dans les vacuoles lipidiques.
Le milieu de culture selon l’invention est composé d’un milieu de base supplémenté par divers compositions et/ou composés.
De préférence le milieu de base permet de cultiver des cellules eucaryotes tel que des cellules de mammifères et en particulier des cellules humaines. De tels milieu de culture sont bien connus de l’homme du métier. De préférence, le milieu de base est choisi parmi le DMEM, le MEM-a, le Ham’s F-12, le RPMI 1640, le IMDM et les combinaisons de ceux- ci. De préférence le milieu de base est le MEM- a.
Dans un mode de réalisation, le milieu de base selon l’invention est supplémenté par du sérum de veau fœtal (SVF), de préférence de 0,5 à 5% (v/v) de S VF, et plus particulièrement 2 % (v/v) de SVF. Ce milieu peut en outre comprendre des intralipides, de préférence de 0,01% à 1 % (v/v) d’intralipides, de préférence de 0,01 à 0,5% (v/v) d’intralipides, et plus particulièrement 0,04 % (v/v) d’intralipides.
Dans un second mode de réalisation, le milieu de base selon l’invention est supplémenté par du lysat plaquettaire (LP), de préférence de 0,5 à 5% (v/v) de LP, et plus particulièrement 1 % (v/v) de LP.
Dans un troisième mode de réalisation, le milieu de base selon l’invention est supplémenté par du sérum de veau fœtal (SVF) et du lysat plaquettaire (LP). Ce milieu peut en outre comprendre des intralipides, de préférence de 0,01% à 1% (v/v) d’intralipides, de préférence de 0,01 à 0,5% (v/v) d’intralipides, et plus particulièrement 0,04 % (v/v) d’intralipides.
Le sérum de veau fœtal et le lysat plaquettaire sont de préférence stériles avant d’être utilisés dans le milieu de culture.
Le milieu de base selon l’invention est aussi supplémenté par 10 à 100 mM d’acide ascorbique, 10 à 100 ng/mL de « Bone Morphogenetic Protein 7 » (BMP7), 1 à 10 pg/mL d’insuline, 1 à 50 pg/mL d’apotransferrine, et 1 à 100 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF).
De manière préférée, le milieu selon l’invention est supplémenté avec 30 à 70 pM d’acide ascorbique, plus préférentiellement avec 45 à 55 pM d’acide ascorbique.
De manière préférée, le milieu selon l’invention est supplémenté avec 30 à 70 ng/mL de BMP7, plus préférentiellement avec 45 à 55 ng/mL de BMP7. De préférence, BMP7 selon l'invention est une protéine humaine recombinante.
De manière préférée, le milieu selon l’invention est supplémenté avec 3 à 7 pg/mL d’insuline, plus préférentiellement avec 4,5 à 5,5 pg/mL d’insuline. De préférence, l'insuline selon l'invention est une insuline humaine recombinante.
De manière préférée, le milieu selon l’invention est supplémenté avec 8 à 12 pg/mL d’apotransferrine, plus préférentiellement avec 9 à 11 pg/mL d’apotransferrine. De préférence, l'apotransferrine selon l'invention est une apotransferrine humaine recombinante.
De manière préférée, le milieu selon l’invention est supplémenté avec 1 à 20 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), plus préférentiellement avec 5 à 15 ng/mL de VEGF. De préférence, le VEGF selon l'invention est un VEGF humain recombinant.
Les protéines utilisées dans le milieu sont de préférence d’origine recombinante et utilisée sous forme purifiée.
Le milieu de culture selon l’invention peut être stérilisé ou filtré avant d’être utilisé. Le milieu de culture selon l’invention peut être utilisé dans des procédés de culture variées.
Procédé de culture in vitro
L’invention concerne un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer les cellules souches mésenchymateuses dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus; et b) cultiver lesdites cellules souches mésenchymateuses.
L’invention concerne aussi un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales, comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer les cellules souches mésenchymateuses et/ou le mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus; et b) cultiver lesdites cellules souches mésenchymateuses et/ou ledit mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales.
De préférence, ces procédés permettent d’obtenir en une seule étape, dans un même contenant de culture, des cellules différenciées en ostéoblastes et en adipocytes, ainsi qu’un réseau de cellules endothéliales organisées, à partir d’un même pool de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales. Dans ces procédés selon l’invention, des progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales peuvent être également cultivés dans le milieu de culture, en même temps que lesdites cellules souches mésenchymateuses.
Dans un mode de réalisation la culture a lieu en monocouche adhérente, non adhérente ou en suspension ou en présence d’un biomatériau (sous forme solide ou sous forme de gel). Dans un autre mode de réalisation des procédés selon l’invention, les cellules sont cultivées en suspension.
La culture peut être réalisée en continue ou en discontinue, en batch, en fed-batch ou en bioréacteur perfusé ou encore au sein d’une puce microfluidique.
Dans les procédés de culture in vitro selon l’invention, une partie des cellules souches mésenchymateuses est différenciée en ostéoblastes et une autre partie des cellules souches mésenchymateuses est différenciée en adipocytes, de préférence simultanément, en une seule étape, dans le même milieu et le même contenant de culture, sans assemblage de cellules a posteriori, et de préférence à partir d’un prélèvement unique.
De préférence, dans les procédés de culture in vitro selon l’invention, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales s’organisent en vaisseau dans le milieu de culture, en même temps que lesdites cellules souches mésenchymateuses se différencient.
De manière préférée, toutes les cellules du procédé selon l’invention proviennent d’une même espèce animale, en particulier d’un mammifère. Selon un mode de réalisation de l’invention, les cellules sont des cellules de rongeurs ou de primates, de manière préférée des cellules humaines.
Des progéniteurs endothéliaux et/ou des cellules endothéliales peuvent être cultivés dans le milieu de culture, en même temps que lesdites cellules souches mésenchymateuses.
Des progéniteurs endothéliaux et/ou des cellules endothéliales présents dans le même pool de cellules initial que les cellules souches mésenchymateuses et issus du même donneur, peuvent être cultivés dans le milieu de culture, en même temps que lesdites cellules souches mésenchymateuses.
Dans un mode préférentiel, les cellules des procédés de culture selon l’invention sont des cellules primaires. Dans un mode préférentiel, les cellules souches mésenchymateuses sont issus de cultures primaires.
Dans un mode préférentiel, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont issus de cultures primaires.
De préférence, les cellules souches mésenchymateuses, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont issus de cultures primaires, de préférence issues du même individu.
Dans un mode de réalisation selon l’invention, les cellules souches mésenchymateuses, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont issus d’un seul prélèvement sur un individu. De préférence, les cellules souches mésenchymateuses, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont issus de la même culture primaire dans un même puits, à partir d’un prélèvement unique.
Dans un mode de réalisation selon l’invention, les cellules souches mésenchymateuses, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont issus d’un seul prélèvement sur un individu.
Dans un mode de réalisation selon l’invention, les cellules sont toutes issues d’un même prélèvement sur un sujet unique.
Dans un mode de réalisation selon l’invention, les cellules sont issues d’un individu sain, c’est-à-dire ne souffrant pas d’une maladie, en particulier une maladie affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l'hématopoïèse.
Dans un autre mode de réalisation selon l’invention, les cellules utilisées sont issues d’un individu souffrant d’une maladie, en particulier une maladie affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l'hématopoïèse, telle que l’aplasie médullaire, le syndrome myélodysplasique, le déficit immunitaire primitif, ou une hémopathie.
Dans un mode de réalisation du procédé l’étape a) est précédée d’une étape aO) dans laquelle les cellules souches mésenchymateuses (CSM), les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont sélectionnés et amplifiés conjointement dans un même milieu et, de préférence, dans un même contenant de culture. Ce milieu est de préférence le milieu EGM2 (pour Endothélial Growth Medium 2). Cette étape dure entre 3 et 30 jours, de préférence entre 5 et 25 jours et plus particulièrement entre 10 et 20 jours.
La température du procédé de culture est sélectionnée afin de permettre la culture des cellules. Typiquement une température pour la culture des cellules est comprise entre 30°C et 38°C. La concentration en oxygène est sélectionnée afin de permettre la culture des cellules. Typiquement la concentration en oxygène est comprise entre 10 et 30%, préférentiellement de 15 à 25%. De même la concentration en dioxyde de carbone est comprise entre 2 et 8%.
Dans un mode de réalisation selon l’invention, les cellules sont cultivées en 2 dimensions ou en 3 dimensions. Les inventeurs ont notamment développé deux approches de culture en 3 dimensions (3D) distinctes. Dans la première, les différents types cellulaires forment des sphéroïdes ou organoïdes par auto-organisation, dans la seconde les cellules sont déposées sur un support 3D.
Ainsi, dans un mode de réalisation du procédé selon l’invention, les cellules sont ensemencées à l’étape a) sur un support en 3 dimensions, de préférence sous forme de sphéroïdes ou sur un support en 3 dimensions. Ainsi le support peut être n’importe quel support permettant la culture des cellules considérées. En particulier le support peut être un gel tel qu’un hydrogel, ou un solide. Il peut être formé à partir de polymère siliconé (tel que le polydiméthylsiloxane PDMS), d’une résine (tel que le DS 3000) et/ou d’un biomatériau calcique. Dans un mode de réalisation particulier le support est intégré dans une puce microfluidique. De préférence, le support est un biomatériau calcique, de préférence à base de Tricalcium phosphate et/ou d’hydroxyapatite, et plus particulièrement le biomatériau calcique est formé à partir de b-TCP.
Dans un mode de réalisation de l’invention la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes et adipocytes, ainsi que l’organisation d’un réseau vasculaire sont réalisées en simultanée sur le biomatériau ou au sein de l’organoïde, de préférence en une seule étape, dans un seul contenant de culture, à partir d’un seul prélèvement, sans assemblage de cellules à posteriori.
Concernant la culture sur un support en 3 dimensions, l’ensemencement ainsi que la culture et les différenciations peuvent être réalisés dans un bioréacteur perfusé. Ce mode de réalisation assure une bonne homogénéité cellulaire sur le biomatériau et permet un maintien en culture pendant au moins 3 semaines grâce à l’apport en oxygène et nutriments apportés par la perfusion. C’est notamment le cas dans les cultures sur puce microfluidique qui sont des microbioréacteurs perfusés.
Les inventeurs ont observé que dans le milieu selon l’invention les cellules souches mésenchymateuses se différenciaient en ostéoblastes et en adipocytes et les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales formaient des vaisseaux, reconstituant ainsi le microenvironnement d’une moelle osseuse in vitro. Les inventeurs ont observé que dans le milieu selon l’invention les cellules souches mésenchymateuses se différenciaient en ostéoblastes et en adipocytes et qu’un réseau de cellules endothéliales s’organisait, reconstituant ainsi le microenvironnement d’une moelle osseuse in vitro.
Procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse Ainsi l’invention concerne un procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses décrit ci-dessus.
L’invention concerne un procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales décrit ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, ces procédés sont précédés d’une étape d’expansion des cellules, pouvant éventuellement durer de 1 à 2 semaines.
De préférence, les cellules sont cultivées dans le milieu de culture selon l’invention pendant 4 à 20 jours, plus préférentiellement de 7 à 15 jours.
La température des procédés de culture est sélectionnée afin de permettre la culture des cellules. Typiquement une température pour la culture des cellules est comprise entre 30°C et 38°C.
La concentration en oxygène est sélectionnée afin de permettre la culture des cellules. Typiquement la concentration en oxygène est comprise entre 10 et 30%, préférentiellement de 15 à 25%. De même la concentration en dioxyde de carbone est comprise entre 2 et 8%.
Dans un mode préféré de l’invention, le procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprend un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer les cellules souches mésenchymateuses dans un milieu de culture selon l’invention avec des progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales; et b) cultiver lesdites cellules.
Dans ce mode de réalisation, les cellules sont cultivées à l’étape b) pendant 4 à 20 jours, plus préférentiellement pendant 7 à 15 jours. Dans un mode préféré de l’invention, le procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprend un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer les cellules souches mésenchymateuses et/ou le mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales dans un milieu de culture selon l’invention; et b) cultiver lesdites cellules.
Dans ce mode de réalisation, les cellules sont cultivées à l’étape b) pendant 4 à 20 jours, plus préférentiellement pendant 7 à 15 jours.
Les inventeurs ont mis en évidence au niveau protéique la présence des trois compartiments médullaires dans leur reconstitution de moelle osseuse.
Reconstitution de moelle osseuse
L’invention concerne une reconstitution de moelle osseuse susceptible d’être obtenue par les procédés de production selon l’invention.
L’invention concerne également une reconstitution de moelle osseuse comprenant des ostéoblastes, des adipocytes et des cellules endothéliales formant des vaisseaux.
L’invention concerne également une reconstitution de moelle osseuse comprenant des ostéoblastes, des adipocytes et un réseau de cellules endothéliales. De préférence les cellules de la reconstitution de moelle osseuse sont en contact direct. En particulier la reconstitution de moelle osseuse selon l’invention comprend des vaisseaux.
La reconstitution de moelle osseuse peut donc être en deux ou en trois dimensions et éventuellement comprendre le support ou le biomatériau ayant servi à sa formation. De préférence la reconstitution est comprise dans un milieu pharmaceutiquement acceptable.
La reconstitution de moelle osseuse de l’invention est typiquement adaptée à une implantation dans l’organisme d’un individu.
Composition L’invention concerne également une composition comprenant les cellules obtenues par le procédé de culture selon l’invention. La composition selon l’invention est de préférence liquide, et plus préférentiellement injectable. Dans cette composition les cellules peuvent être en suspension dispersées ou sous la forme de sphéroïdes. Dans ce dernier cas les sphéroïdes ont un diamètre moyen inférieur à 500 pm.
Par « sphéroïdes », on entend un regroupement de cellules liées entre elles dans les trois dimensions de l’espace. De préférence un sphéroïde comprend de 500 à 750 000 cellules, ou encore de 1 000 à 500 000 cellules. Les sphéroïdes de la composition selon l’invention ont un diamètre moyen compris entre 50 pm et 750 pm, de préférence compris entre 100 pm et 500 pm.
Dans un mode de réalisation la composition est une composition pharmaceutique qui comprend au moins une cellule obtenue par le procédé de culture selon l’invention dans un milieu pharmaceutiquement acceptable.
Par "pharmaceutiquement acceptable", on entend ici des compositions et entités moléculaires qui ne produisent pas de réactions secondaires, allergiques ou autrement non- désirées quand elles sont administrées à un sujet. Un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable est ainsi une matière encapsulante, un diluant, un support, ou tout autre auxiliaire de formulation liquide, semi-solide ou solide non-toxique.
Les compositions de l’invention sont typiquement préparées afin de s'adapter au mode d'administration. Les excipients pharmaceutiques acceptables sont typiquement déterminés en partie par la composition administrée, ainsi que par la technique particulière utilisée pour administrer la composition.
Les compositions de l’invention sont de préférence liquides et adaptées à la voie d'administration.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut également comprendre au moins un autre composé actif, par exemple un biomatériaux calcique. En effet les biomatériaux calciques sont connus pour être ostéoinducteurs. Ils sont déjà utilisés notamment pour des comblements de perte de substance osseuse.
Utilisation de la reconstitution de moelle osseuse ou de la composition
L’invention a pour objet la reconstitution de moelle osseuse selon l’invention ou la composition selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de maladies. De préférence les maladies sont des maladies affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liées à un désordre de l'hématopoïèse.
En effet la reconstitution de moelle osseuse ou la composition selon l’invention pourrait être utilisée afin de favoriser l'hématopoïèse dans diverses situations pathologiques, et en particulier permettre une hématopoïèse ectopique, ce qui permettrait une « normalisation » hématopoïétique chez ces patients.
Par « traitement » ou « traiter », on entend ici atteindre, partiellement ou substantiellement, un ou plusieurs des résultats suivants : réduire partiellement ou totalement l'étendue de la maladie, améliorer un symptôme clinique ou un indicateur associé à la maladie, retarder, inhiber ou prévenir la progression de la maladie, ou partiellement ou totalement retarder, inhiber ou prévenir la survenue d'une rechute de la maladie.
Une méthode de traitement d’une maladie affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l'hématopoïèse est ainsi proposée, dans laquelle une quantité thérapeutiquement efficace d’une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention ou de la composition selon l’invention, est administrée à un sujet souffrant d’une maladie affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l'hématopoïèse.
Par « sujet », on entend ici un mammifère, de préférence un primate et de manière préférée un humain. De préférence, le sujet traité dans le cadre de l’invention souffre d’une maladie affectant l’intégrité de la moelle osseuse, et/ou d’un désordre de l'hématopoïèse.
Par « une maladie affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou un désordre de l'hématopoïèse », on entend les maladies où la moelle osseuse est lésée et/ou les maladies liées à un excès, une carence ou un dérèglement de l’hématopoïèse chez un individu. Ces maladies comprennent par exemple l’aplasie médullaire, le syndrome myélodysplasique, le déficit immunitaire primitif, et l’hémopathie, telle qu’une leucémie, un lymphome ou un myélome. Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend ici une quantité de composition ou de reconstitution suffisante pour détruire, modifier, contrôler ou éliminer la maladie. Une « quantité thérapeutiquement efficace » désigne aussi une quantité permettant de retarder ou minimiser l'étendue de la maladie. Elle se réfère également à la quantité fournissant un bénéfice thérapeutique dans le traitement ou la prise en charge de la maladie. Enfin, l'expression « quantité thérapeutiquement efficace » signifie une quantité de la composition ou de la reconstitution, seul, ou en combinaison avec d'autres thérapies, qui fournit un bénéfice thérapeutique dans le traitement ou la prise en charge de la maladie, incluant une amélioration des symptômes associés à la maladie. La quantité thérapeutiquement efficace dépend naturellement du produit administré, du mode d'administration, de l'indication thérapeutique, de l'âge du patient et de son état.
La détermination de la voie d’administration et du dosage adapté en fonction du sujet est à la portée de l’homme du métier.
Le dosage dépend du cas individuel et, comme il est bien connu de l’homme du métier, doit être adapté aux circonstances individuelles pour obtenir une quantité thérapeutique efficace et un effet optimum. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace est spécifique pour tout patient, et dépendra en particulier d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la sévérité du trouble, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le temps d'administration, la voie d'administration, la durée du traitement, les médicaments utilisés en combinaison, et des facteurs analogues bien connus du domaine médical.
De préférence, la reconstitution de moelle osseuse ou la composition selon l’invention sont administrés par voie sous cutanée ou intra fémorale.
Dans un autre aspect, l’invention a pour objet l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie ci-dessus, dans une application biomédicale, dans lequel l’application biomédicale est sélectionnée de préférence parmi les prothèses, et les dispositifs médicaux. L’invention a donc pour objet l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie ci-dessus, dans une prothèse, ou un dispositif médical.
Dans un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie précédemment, comme modèle pour l’étude de la physiologie, de la physiopathologie, le test de composés, et/ou de conditions physiques et/ou mécaniques.
Par « étudier la physiologie » on entend l’étude des mécanismes impliqués dans les interactions cellulaires, le fonctionnement et le développement de la moelle osseuse au cours de la vie.
En effet les mécanismes impliqués dans les interactions cellulaires au sein de la moelle osseuse humaine demeurent encore mal connus, que ce soit en physiologie ou en pathologie. La compréhension de ces mécanismes est en effet limitée du fait de l’absence d’outil in vitro permettant d’étudier la moelle osseuse humaine dans un contexte global intégrant en particulier ses aspects microenvironnementaux. En particulier l’utilisation de cultures de cellules primaires dans la reconstitution selon l’invention permet de se rapprocher davantage encore des conditions in vivo. La reconstitution de moelle osseuse de l’invention peut être utilisée pour étudier le rôle des éléments cellulaires et humoraux la constituant.
Aussi, un autre aspect de l’invention porte sur l’utilisation d’une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention pour étudier les mécanismes cellulaires et/ou moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules souches mésenchymateuses.
Comme la reconstitution peut être formée à partir d’un échantillon d’un donneur, elle peut être utilisée pour étudier les variations due à l’âge, au sexe, etc... Elle peut également servir de modèle de moelle osseuse pour un stade de la vie particulier, comme par exemple modèle de moelle osseuse âgée, modèle de moelle osseuse jeune, modèle de moelle osseuse fœtale, etc.
Par « étudier la physiopathologie » on entend étudier l’impact de maladies sur les caractéristiques de la moelle osseuse, telles que la morphologie cellulaire, la croissance cellulaire, la formation ou la disparition de vaisseaux, l’expression de certaines protéines etc .... Dans ce mode de réalisation, la reconstitution comprend alors au moins un type cellulaire modèle de la maladie étudiée et/ou un type cellulaire issus d’un individu souffrant de la maladie étudiée.
Ainsi l’invention a aussi pour objet l’utilisation d'une reconstitution de moelle selon l’invention comme modèle de moelle osseuse pathologique. Selon un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs des types cellulaires de la reconstitution sont des types cellulaires modèles de pathologies. Par « types cellulaires modèles de pathologies », on entend des types cellulaires issues de modèles animaux reproduisant des pathologies apparaissant spontanément ou induites par des méthodes de génie génétique (comme par exemple la transgénèse) ou avec des outils pharmacologiques afin de reproduire les caractéristiques de cellules des individus atteints par ces pathologies particulières.
Selon un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs des types cellulaires de la reconstitution sont issus d’un individu souffrant de la maladie étudiée.
De préférence les pathologies étudiées selon l’invention sont des pathologies ayant ou étant suspectées d’avoir une influence sur la moelle osseuse telles que : l’aplasie médullaire, le syndrome myélodysplasique, le déficit immunitaire primitif, les hémopathies telle qu’une leucémie, un lymphome ou un myélome.
La reconstitution selon l’invention peut également être utilisée pour étudier des pathologies se développant à un moment particulier de la vie de l’individu. Par « tester des molécules » on entend étudier l’impact de ces molécules sur la moelle osseuse. Dans ce mode de réalisation, au moins une molécule à tester est appliquée à la reconstitution selon l’invention, et après un temps d’exposition ou d’incubation, la reconstitution est analysée afin de déterminer les changements qui ont été provoqués par ladite au moins une molécule testée. Ces changements peuvent en particulier concerner la morphologie cellulaire, la croissance et la mortalité cellulaire, la formation ou la disparition de vaisseaux, l’expression de certaines protéines, la différenciation cellulaire, etc. ...
Par « molécules » on entend des molécules à visée préventive, thérapeutique ou diagnostique ciblant les acteurs cellulaires et moléculaires de la moelle osseuse
Aussi, un autre aspect de l’invention porte sur l’utilisation d’une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention pour étudier l’efficacité et/ou la toxicité d’un candidat médicament.
Dans un mode de réalisation, l’invention porte sur l’utilisation d’une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention pour étudier l’efficacité et/ou la toxicité d’un candidat médicament pour un individu particulier. En effet, une reconstitution de moelle osseuse réalisée à partir de l’échantillon d’un individu peut servir de modèle afin d’étudier l’efficacité et/ou la toxicité d’un candidat médicament pour cet individu en particulier. Ce type d’analyse peut notamment être réalisée dans le cadre de la médecine personnalisée, pour définir le traitement le plus adapté à un individu.
Par « tester des conditions physiques et/ou mécanique », on entend étudier l’impact de ces conditions sur la reconstitution de moelle osseuse. Dans ce mode de réalisation, au moins une condition physique ou mécanique est appliquée à la reconstitution selon l’invention. Après un temps d’exposition ou d’incubation, la reconstitution est analysée afin de déterminer les changements qui ont été provoqués par ladite au moins une condition physique ou mécanique testée. Ces changements peuvent en particulier concerner la morphologie cellulaire, la croissance, et la mortalité cellulaire la formation ou la disparition de vaisseaux, l’expression de certaines protéines, la différenciation cellulaire, etc... On peut notamment étudier le résultat de l’ajout de la condition physique ou mécanique en la comparant à une reconstitution sur laquelle la condition n’a pas été appliquée.
Par « condition physique », on entend en particulier l’utilisation d’ondes telles que des ondes magnétiques, électromagnétiques ou encore des ultrasons.
Par « condition mécanique », on entend en particulier la pression, la contraction, l’étirement, la gravité, l’apesanteur, le cisaillement. L’invention concerne l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention, comme modèle pour l’étude à long terme de l’hématopoïèse et/ou de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses.
Par « long terme », on entend sur plus de 3 jours, plus de 10 jours, plus de 15 jours plus de 20 jours et de préférence jusqu’à 21 jours.
Par « étude de l’hématopoïèse », on entend l’étude de la prolifération et de la différenciation des cellules sanguines.
Dans le cadre de la présente demande, le terme « comprenant » doit être interprété comme couvrant toutes les caractéristiques spécifiquement mentionnées, ainsi qu’éventuellement certaines non-spécifiées additionnelles. Par ailleurs, l’utilisation du terme « comprenant » décrit également le mode de réalisation dans lequel aucune caractéristique autre que celles spécifiques mentionnées n’est présente ( i.e . « consistant en »).
La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous.
FIGURES
La Figure 1 présente l’expression relative de gènes impliqués dans les lignages ostéoblastique, adipocytaire et vasculaire (cellules endothéliales) présents dans les reconstitutions de moelle osseuse après culture dans les modèles 2D. Après sélection et amplification en milieu EGM2, les cellules sont cultivées sans passage, dans un même contenant de culture, pendant 14 jours en 2D dans le milieu selon l’invention (avec SVF et des intralipides). L’expression génique est quantifiée par Reverse Transcriptase- quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) et calculée après normalisation par un gène de référence en utilisant la méthode du 2 °t, n=5.
La Figure 2 présente l’expression relative de gènes impliqués dans les lignages ostéoblastique, adipocytaire et vasculaire (cellules endothéliales) présents dans les reconstitutions de moelle osseuse après culture dans les modèles 2D. Après sélection et amplification en milieu EGM2, les cellules sont cultivées sans passage, dans un même contenant de culture, pendant 14 jours en 2D dans soit un milieu avec SVF et intralipides, soit un milieu avec LP sans intralipide, soit dans leur milieu d’amplification (milieu EGM2), correspondant à la condition CTRL. L’expression génique est quantifiée par Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) et calculée après normalisation par un gène de référence en utilisant la méthode du 2 °t, n=3. La Figure 3 présente l’expression relative de gènes correspondant aux facteurs pro hématopoïétiques présents dans les reconstitutions de moelle osseuse après culture dans les modèles 2D. Après sélection et amplification en milieu EGM2, les cellules sont cultivées sans passage, dans un même contenant de culture, pendant 14 jours en 2D dans soit un milieu avec SVF et intralipides, soit un milieu avec LP sans intralipide, soit dans leur milieu d’amplification (milieu EGM2), correspondant à la condition CTRL. L’expression génique est quantifiée par Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction (RT- qPCR) et calculée après normalisation par un gène de référence en utilisant la méthode du 2 °T, n=3.
La Figure 4 présente le nombre de cellules CD34 CD38 , cellules hématopoïétiques les plus immatures, obtenues après mise en coculture pendant 14 jours de cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec les reconstitutions de moelle osseuse obtenues selon le procédé décrit dans l’invention.
Exemple:
Exemple 1 :
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), les progéniteurs endothéliaux ainsi que les cellules endothéliales issus d’un même prélèvement de moelle osseuse sont sélectionnées et amplifiées grâce aux propriétés d’adhérence de ces types cellulaires et à l’utilisation du milieu Endothélial Growth Medium 2 (Promocell) pour la culture.
Après 14 jours de culture, ces cellules sont décollées et utilisées pour générer différents modèles de moelle osseuse, en 2 et en 3 dimensions. Dans ce but, les cellules sont cultivées dans un milieu permettant la différenciation dans la même culture d’une partie des CSM en ostéoblastes (compartiment osseux), d’une autre partie en adipocytes (compartiment adipeux), tout en permettant l’organisation d’un réseau vasculaire Le milieu utilisé ici est composé d’une base de milieu MEMa supplémenté par 2% de sérum de veau fœtal, 50uM d’acide ascorbique, 0,04% (v/v) d’intralipides, 50ng/mL de Bone Morphogenetic Protein 7, 5 pg/mL d'insuline, 10 pg/mL d'apotransferrine et 10 ng/mL de VEGF.
Pour les modèles en 3D, deux technologies sont utilisées : la génération de sphéroïdes basée sur l’auto-organisation cellulaire et l’utilisation d’un complexe cellules/ biomatériaux mis en perfusion dans un bioréacteur dans lequel le biomatériau est le bTΰR. Les inventeurs ont mis en évidence la présence des différents compartiments par des analyses géniques (RT-qPCR). La figure 1 présente ces résultats sur le modèle 2D.
Les inventeurs ont mis également en évidence la présence des différents compartiments par des analyses en fluorescence (immunofluorescence et sondes fluorescentes), en ciblant des marqueurs spécifiques de chaque compartiment (Osterix pour les ostéoblastes, CD31 pour les cellules endothéliales, Bodipy pour les adipocytes). Ces différents marqueurs ont été mis en évidence dans le modèle en 2D, le modèle en sphéroïdes (modèle 3D) ainsi que sur le modèle sur biomatériau bTOR en bioréacteur perfusé (modèle 3D).
Exemple 2 ;
Les reconstitutions de moelle osseuse ont été réalisées comme dans l’exemple 1 mais différentes compositions du milieu de différenciation sont testées.
Les cellules récupérées à l’issue d’une primoculture de moelle osseuse en EGM2 sont ensemencées à 20 000 cellules/cm2 en milieu EGM2 et laissées dans ce milieu pendant 4 à 6 jours, à 37°C et 5%C02. Le milieu EGM2 est alors remplacé par l’un des deux milieux de différenciation (SVF ou LP) décrits ci-après. Le milieu de différenciation est renouvelé à raison de 2 changements par semaine. Au terme de 14 jours en milieu de différenciation, la culture est arrêtée pour effectuer une analyse génique.
Le milieu dit SVF est composé d’une base de milieu MEMa supplémenté par 2% (v/v) de sérum de veau fœtal, 50 mM d’acide ascorbique, 0,04% (v/v) d’intralipides, 50ng/mL de Bone Morphogenetic Protein 7,5 pg/mL d'insuline, 10 pg/mL d'apotransferrine et 10 ng/mL de VEGF.
Le milieu dit LP est composé d’une base de milieu MEMa supplémenté par 1% (v/v) de lysat plaquettaire (LP), 50 pM d’acide ascorbique, 50ng/mL de Bone Morphogenetic Protein 7,5 pg/mL d'insuline, 10 pg/mL d'apotransferrine et 10 ng/mL de VEGF.
La génération simultanée des 3 compartiments médullaires a été évaluée dans une culture en 2D par analyse génique (voir figure 2).
Les résultats montrent qu’il n’y a pas de différence significative entre les deux milieux de différenciations testés. Chacun des deux milieux permet la différenciation in vitro d’une partie des CSM en ostéoblastes, d’une autre partie en adipocytes tout en permettant le maintien des cellules CD31 positives correspondant au compartiment endothélial (figure 2). Par ailleurs, les inventeurs ont observé une tendance. Le milieu à base de SVF permettrait de différencier davantage de CSM en adipocytes et le milieu à base de LP davantage de CSM en ostéoblastes. Ces résultats suggèrent une adaptabilité/flexibilité du procédé. En effet, plusieurs études montrent que la différenciation des CSMs est modifiée par les contraintes physiques et mécaniques, ce qui est à prendre en considération pour les modèles 3D dans lesquels ces contraintes sont différentes des modèles standards en 2D (rigidité variable des biomatériaux, contraction variable des sphéroïdes/organoïdes, etc...). Le procédé de production pourrait donc permettre de s’adapter à ces contraintes en adaptant le milieu de différenciation.
D’autre part, plus une moelle osseuse est âgée, plus le tissu adipeux augmente en proportion et perd en fonctionnalité avec une chute de la vascularisation, à l’inverse, plus une moelle osseuse est jeune, plus la densité osseuse est importante avec une plus forte vascularisation. Ainsi la modulation de la composition du milieu de culture pourrait permettre l’étude du vieillissement au niveau de la niche hématopoïétique.
En outre, les résultats montrent une augmentation de l’expression des principaux facteurs pro-hématopoïétiques dans les reconstitutions de moelle osseuse générées in vitro grâce au procédé selon l’invention, par comparaison avec la condition CTRL (figure 3). Ces facteurs sont sécrétés ou exprimés in vivo par le microenvironnement médullaire au niveau des niches hématopoïétiques, et sont nécessaires à la mise en place de l’hématopoïèse dans la moelle osseuse, indiquant la fonctionnalité des reconstitutions de moelle osseuse selon l’invention
Exemple 3 ;
Afin de renforcer l’étude fonctionnelle des reconstitutions de moelle osseuse in vitro, les inventeurs ont testé l’ajout de cellules souches hématopoïétiques à ces reconstitutions de moelle osseuse, afin d’évaluer l’hématopoïèse in vitro (figure 4).
Formation de reconstitutions de moelle osseuse : Après sélection et amplification en milieu EGM2, les cellules souches mésenchymateuses et/ ou le mélange cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales sont cultivées sans passage, dans un même contenant de culture, pendant 14 jours en 2D dans soit un milieu avec SVF et intralipides, soit un milieu avec LP sans intralipide, soit dans leur milieu d’amplification (milieu EGM2), correspondant à la condition « EGM2 ». En parallèle, après une pré-sélection et pré-amplification en milieu MEMa avec SVF, les cellules souches mésenchymateuses et/ ou le mélange cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales sont cultivés dans les mêmes conditions que précédemment (même densité cellulaire, temps de culture, etc) pendant 14 jours en 2D dans du milieu MEMa avec SVF. Ce milieu étant un milieu de référence utilisé dans la plupart des publications pour la culture des cellules souches mésenchymateuses, il correspond à la condition « MES ».
Coculture avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH) : Les CSH sont triées à partir d’unité de sang placentaire sur la base du marqueur CD34 positif. Elles sont ensuite mises en coculture avec les reconstitutions de moelle osseuse en 2D générées au préalable, pendant 14 jours dans du milieu IMDM + 10%SVF + 1mM d’hydrocortisone. Au terme de la coculture, l’ensemble des cellules sont récupérées, comptées, puis analysées par cytométrie en flux (n=3). Les premiers résultats montrent un maintien et une prolifération des cellules hématopoïétiques les plus immatures (CD34VCD38 ) meilleurs avec les reconstitutions de moelles osseuses selon l’invention que dans les conditions contrôles. En effet, dans beaucoup de modèles, la plupart de ces cellules se différencient vite et sont peu maintenues.

Claims

REVENDICATIONS
1) Milieu de culture permettant d’obtenir en une seule étape, dans un même contenant de culture, des cellules différenciées en ostéoblastes et en adipocytes, ainsi qu’un réseau de cellules endothéliales organisées, à partir d’un même pool de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales, comprenant : a) du sérum de veau fœtal (SVF) et/ou du lysat plaquettaire (LP), b) 10 - 100 mM d’acide ascorbique, c) 10 - 100 ng/mL de « Bone Morphogenetic Protein 7 » (BMP7), d) 1 - 10 pg/mL d’insuline, e) 1 - 50 pg/mL d’apotransferrine, et f) 1 - 100 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), et optionnellement g) 0,01-0,5% (v/v) d’intralipides.
2) Procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales comprenant les étapes consistant à : a) ensemencer les cellules souches mésenchymateuses et/ou le mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales dans un milieu de culture tel que défini dans la revendication 1 ; et b) cultiver lesdites cellules souches mésenchymateuses et/ou le mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales.
3) Procédé de culture selon la revendication 2, dans lequel une partie des cellules souches mésenchymateuses est différenciée en ostéoblastes et une autre partie des cellules souches mésenchymateuses est différenciée en adipocytes simultanément, en une seule étape, dans le même milieu et le même contenant de culture, sans assemblage de cellules a posteriori.
4) Procédé de culture selon l’une des revendications 2 à 3, dans lequel des progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales s’organisent en vaisseau dans le milieu de culture, en même temps que lesdites cellules souches mésenchymateuses se différencient. 5) Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel les cellules sont des cellules primaires.
6) Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel les cellules sont toutes issues d’un même prélèvement sur un sujet unique.
7) Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel à l’étape a) les cellules sont ensemencées en 3 dimensions sous forme de sphéroïdes ou sur un support en 3 dimensions.
8) Procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses et/ou d’un mélange de cellules souches mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales selon l’une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel les cellules sont cultivées à l’étape b) pendant 4 à 20 jours.
9) Reconstitution de moelle osseuse obtenue par le procédé de la revendication 8.
10) Reconstitution de moelle osseuse comprenant des ostéoblastes, des adipocytes et des cellules endothéliales formant des vaisseaux.
11) Composition comprenant des cellules obtenues par le procédé de l’une quelconque des revendications 2 à 6.
12) Reconstitution de moelle osseuse selon l’une quelconque des revendications 9 à 10 ou composition selon la revendication 11 pour son utilisation pour le traitement de maladies, notamment de maladies affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l'hématopoïèse.
13) Utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie dans la revendication 9 ou la revendication 10, comme modèle pour l’étude de la physiologie, physiopathologie, le test de composés, et/ou le test de conditions physiques et mécaniques.
14) Utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie dans la revendication 9 ou la revendication 10, dans une prothèse ou un dispositif médical.
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PL1989295T3 (pl) * 2006-02-16 2021-02-22 Université Libre de Bruxelles Różnicowanie osteogenne komórek macierzystych szpiku kostnego oraz komórki i populacje osteoprogenitorowe lub osteoblastyczne
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