EP4275045A1 - Biosensor für elektrochemische detektion von z.b. malaria-biomarkern - Google Patents

Biosensor für elektrochemische detektion von z.b. malaria-biomarkern

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EP4275045A1
EP4275045A1 EP21835207.8A EP21835207A EP4275045A1 EP 4275045 A1 EP4275045 A1 EP 4275045A1 EP 21835207 A EP21835207 A EP 21835207A EP 4275045 A1 EP4275045 A1 EP 4275045A1
Authority
EP
European Patent Office
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aptamer
electrode
electrodes
biomarker
aptamers
Prior art date
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Pending
Application number
EP21835207.8A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Mayer
Gabriela FIGUEROA MIRANDA
Michael PRÖMPERS
Viviana RINCÓN MONTES
Andreas Offenhäusser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to biosensors, in particular based on flexible multi-electrode arrays, for the electrochemical detection of biomarkers, preferably biomarkers of infectious diseases, particularly preferably malaria biomarkers, in particular the simultaneous electrochemical detection of multiple biomarkers of the same pathogen or different pathogens, for example Malaria Biomarkers.
  • biomarkers preferably biomarkers of infectious diseases, particularly preferably malaria biomarkers
  • simultaneous electrochemical detection of multiple biomarkers of the same pathogen or different pathogens for example Malaria Biomarkers.
  • RDTs colorimetric rapid tests
  • Detection is based on antibody-antigen interactions using antibodies as receptor molecules.
  • the receptor antibodies have a low thermostability at elevated temperatures. Given that most regions where malaria is prevalent have hot and humid climates, these antibody-based diagnostic systems are of poor accuracy.
  • a disadvantage of these receptor antibodies is that they are quite expensive to produce and they are sensitive to many chemicals and chemical modifications, which limits their use.
  • aptamers are short, single-stranded, artificial RNA or DNA oligonucleotides, peptides or such molecules with chemical modification.
  • Such aptamers recognize and bind to a target analyte with high specificity and strong affinity.
  • aptamers are thermostable, cheaper and easier to produce, and can be easily chemically modified.
  • aptamers are an alternative to overcome the difficulties associated with using antibody-based assays.
  • Different detection platforms with different transducers ranging from optical to electrochemical systems have been proposed using aptamers as the receptor molecule. These known systems essentially detect protein biomarkers that indicate, for example, the presence of the malaria parasite.
  • Plasmodium lactate dehydrogenase produced by all malaria parasite species. This enzyme can indicate recent infection because its concentration in body fluids correlates with the level of parasitemia.
  • P. falciparum histidine-rich protein 2 HRP-2
  • HRP-2 P. falciparum histidine-rich protein 2
  • aptamers have been developed for the detection of these protein biomarkers, such as the 2008s aptamer, which detects the P.
  • PfLDH falciparum LDH
  • PvLDH P. vivax LDH
  • LDHpll aptamer which is highly selective only for PfLDH, has also already been described (e.g. in Frith, KA et al.; Towards development of aptamers that specifically bind to lactate dehydrogenase of Plasmodium falciparum through epitopic targeting. Malaria Journal 2018, 17(1), 191).
  • An aptamer that selectively detects HRP-2 protein is the 2106s aptamer (see, for example, US 2013/0210023 A1; SEQ ID NO. 7).
  • a combination of these receptor aptamers allows for the targeted study of these major malaria biomarkers mentioned above, which is a great advantage in distinguishing between the two more common P. falciparum and P. vivax parasites and accordingly for the antimalarial treatment indicated in each case.
  • Electrochemical sensors have been shown to be superior to other detection platforms due to their high sensitivities, ease of use and execution of detection, with the possibility of miniaturization of the electrodes, making such sensors suitable for point-of-care (PoC) applications. are suitable.
  • the approach is based on multi-electrode arrays (MEA chips) which have multiple electrodes and combine the advantages of a large detection area and investigations with low background noise.
  • MEAs enable the immobilization of different aptamers on different electrodes of the same MEA chip for the simultaneous detection of multiple malaria biomarkers via individually addressable aptasensors.
  • the development of MEAs on flexible substrates seems to represent an advantage in terms of cheap and easy manufacturing as well as their point-of-care use as multi-target biosensors.
  • Plasmodium falciparum L-lactate dehydrogenase PfLDH
  • Plasmodium vivax L-lactate dehydrogenase PvLDH
  • histidine-rich protein 2 HRP-2
  • PfLDH, PvLDH and HRP-2 can be detected using immunoassays and rapid immunoassays. Such tests usually work colorimetrically, but there are other detection methods in addition to electrochemical and fluorescence-based detection.
  • aptamer receptors for the detection of PfLDH, PvLDH and HRP-2.
  • the existing detectors are still in need of improvement, in particular with regard to their accuracy for the species to be examined and their manufacture.
  • corona viruses preferably the SARS-CoV-2 virus
  • SARS-CoV-2 virus in particular the joint review and differentiation of other viral diseases with similar symptoms such as the influenza virus, human respiratory syncytial virus [abbr.: HRSV ] as well as variants of SARS and MERS.
  • HRSV human respiratory syncytial virus
  • the object of the present invention was to provide improved sensors for biomarkers, in particular malaria biomarkers, SARS-CoV-2 biomarkers and biomarkers for other respiratory diseases. These sensors should have good thermal and chemical stability, be inexpensive to manufacture, and have high accuracy for the species(s) to be examined.
  • an improved detection technology for quantitative multi-target rapid tests for the detection of various infectious respiratory diseases is to be used Will be provided. Not only the detection of the SARS-CoV-2 virus, but also the joint detection and differentiation of other viral diseases with similar symptoms to COVID-19, e.g. B. influenza virus, human respiratory syncytial virus and variants of SARS and MERS.
  • room temperature means a temperature of 293.15 Kelvin, i.e. 20°C.
  • biomarker sensor multi-target apta sensor
  • flex MEA multi-target apta sensor flex MEA multi-target apta sensor
  • flex MEA chip or MEA chip are used synonymously for the biomarker sensor according to the invention.
  • the present invention relates in particular to a biomarker sensor with a multi-electrode field structure, comprising a carrier substrate on which at least two separate sets of electrodes are arranged and each set of electrodes has one electrode or a plurality of electrodes.
  • Each set of electrodes is subdivided in the following order into i) an incubation zone in which at least one, preferably exactly one, specific aptamer is bound to the one electrode or the several electrodes, ii) a passivation zone in which a passivation layer covers the one electrode or covering the multiple electrodes, iii) a contact zone in which the one electrode is configured or the multiple electrodes are configured to be electrically contacted.
  • the essential feature of these biomarker sensors is that the incubation zones of the individual electrode sets or the incubation zones and a part of up to 95% of the length of the passivation zones of the individual electrode sets are movable, each independently of those of the other electrode sets, and that the contact zones of the individual Electrode sets together form a common contact zone.
  • the individual, moving parts of the respective electrode sets naturally also include the carrier substrate on which they are arranged.
  • the electrodes are not restricted in their precise design, but can have customary designs known in the art.
  • the electrode itself can be a conductor track etched on or out of a substrate or a wire; a conductor track is particularly preferred, in particular one produced by lithography.
  • the area of the electrode to which the aptamers are bound can have different structures; it is only necessary that the resulting surface area of this electrode area is sufficient to bind the desired or necessary amount of aptamer.
  • this part of the electrode which is also called the aptamer contact region or is comb-shaped, double-comb-shaped or square, particularly preferably square.
  • This (contact) area of the electrode can also be referred to as an aptamer-covered electrode contact or electrode contact for aptamer coverage.
  • the incubation zones are the area in which the electrodes or electrode sets are immersed in aptamer solutions in order to bind the aptamers to the electrode.
  • the area includes a little more area in order to leave space between the aptamer solution surface and the chip and not to accidentally wet the chip in places where this is not at all intended.
  • the mobility of the individual electrode sets can be achieved in various ways.
  • One possibility is to attach various other parts to a base substrate and connect them via joints.
  • Another way, which is preferred according to the invention, is to produce the carrier substrate from a flexible material, which then makes the individual Electrode sets are independently movable due to the flexibility of the substrate.
  • the carrier substrate is a material selected from the group consisting of polyethylene terephthalate (PET), polyethylene naphthalate (PEN), polydimethylsiloxane (PDMS), polyimide, polyester and agarose, preferably polyethylene terephthalate, or polyethylene naphthalate, particularly preferably polyethylene terephthalate.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PEN polyethylene naphthalate
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • polyimide polyimide
  • polyester and agarose preferably polyethylene terephthalate, or polyethylene naphthalate, particularly preferably polyethylene terephthalate.
  • these materials are characterized by the fact that they are flexible, i.e. bendable without breaking, and that they are inert to the chemicals used in the production of the biomarker sensors.
  • Flexible materials within the scope of the present invention withstand one, preferably multiple, bending and bending back into the starting position by 90°, preferably with a radius of curvature of 2 mm to 10 mm, in particular 3 mm to 5 mm, without breaking.
  • flexible materials have a lateral elongation (epsilon - £) of 0.01 and a deflection of 47% with a radius of curvature (r) of 4 mm.
  • the carrier substrate has layer thicknesses between 50 ⁇ m and 300 ⁇ m, preferably 75 ⁇ m to 200 ⁇ m and particularly preferably between 80 ⁇ m and 150 ⁇ m, with material thicknesses of 100 ⁇ m being highly preferred in individual embodiments.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention comprises a polyethylene terephthalate film with a thickness of between 80 ⁇ m and 150 ⁇ m, in particular 100 ⁇ m, as the carrier substrate.
  • the biomarker sensor has two, three or four, preferably three or four, separate electrode sets, preferably each with at least two electrodes, particularly preferably each with at least four electrodes, the electrodes preferably being made of noble metal or carbon, particularly preferably gold or a gold alloy, particularly preferably gold.
  • the aptamers are selected from the group consisting of 2008s aptamer, 2106s aptamer, pLl aptamer, LDHpll aptamer and combinations thereof or selected from the group consisting of C5 aptamer, C7 aptamer, C9 aptamer, Cll aptamer, C15 aptamer or Il aptamer, IHl aptamer, SGl aptamer, HCSI aptamer, NGl aptamer and combinations thereof (the C7 aptamer binds to the spike protein of the SARS-CoV-2 virus (all variants), C5 aptamer binds to the spike protein of the delta variant, C9 aptamer binds to the spike protein of the alpha variant, II aptamer binds to the HAI protein of the influenza virus, C15 aptamer binds to the spike protein SARS -CoV-2 omicron (B.1.1.529),
  • the present invention also includes those aptamers that bind to spike proteins of mutated SARS-CoV-2 viruses (whose exact designation is of course not yet known at the moment).
  • aptamers or aptamer mixtures are bound in each electrode set, preferably in a first electrode set 2008s aptamer and in a second electrode set 2106s aptamer and in a third electrode set pLl aptamer and in a fourth electrode set LDHpll aptamer or in a first set of electrodes C7 aptamer and in a second set of electrodes II aptamer, or in at least two sets of electrodes aptamers selected from the group consisting of C5 aptamer, C7 aptamer, C9 aptamer, Cll aptamer, C15 aptamer or II aptamer, IHI aptamer, SGI aptamer, HCSI aptamer, NGI aptamer, and combinations thereof.
  • the configuration of the biomarker sensor can also be varied with regard to further electrodes.
  • the biomarker sensor can additionally i) a total of one reference electrode and one counter-electrode, ii) a total of one reference electrode, one counter-electrode and one resistance thermometer, iii) one reference electrode and one counter-electrode per set of electrodes, or iv) one reference electrode and one counter-electrode per set of electrodes and a total of one resistance thermometer.
  • thermometer is the only option to be used in addition to the reference and counter electrode; it is of course possible to replace this device with others.
  • these can be moisture sensors, bending sensors, deformation sensors, pH sensors.
  • the present invention relates to multi-electrode field chips (flex MEA chips) produced with a flexible carrier substrate.
  • the material of the carrier substrate is preferably selected from the group consisting of polyethylene terephthalate (PET), polyethylene naphthalate (PEN), polydimethylsiloxane (PDMS), polyimide, polyester and agarose, preferably polyethylene terephthalate or polyethylene naphthalate, particularly preferably polyethylene terephthalate.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PEN polyethylene naphthalate
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • polyimide polyimide
  • polyester and agarose preferably polyethylene terephthalate or polyethylene naphthalate, particularly preferably polyethylene terephthalate.
  • the multi-electrode fields are structured by wet-chemical etching.
  • a stencil passivation process employed in preferred embodiments allows the conductive traces on the electrodes to be partially passivated at a lower cost compared to standard lithographic passivation.
  • a cheap method called "stencil passivation” is used to produce the passivation layer, using parylene C to form the passivation layer (protective layer over the electrode lines). This method costs about half compared to standard lithographic passivation .
  • the electrode arrays of the present invention are divided into different sets of electrodes, each separated from one another by a free strip in a preferred embodiment.
  • the flexible substrate polymer
  • the electrode subgroups electrode sets
  • the configuration based on a flexible substrate thus enables the incubation of different sets of electrodes with different aptamer solutions for the simple realization of the immobilization of different aptamers for the production of apta sensors with multiple receptors.
  • the different sets of electrons can simply be bent down individually like fingers and immersed in aptamer solutions.
  • biomarker sensors of the present invention can thus be illustratively compared to a hand, with the individual fingers representing the individual electrode sets; Due to the mobility of the individual fingers, they can be bent individually and thus individually and independently of one another dipped into aptamer solutions and incubated with aptamer.
  • the electrode sets are modified with different molecules, which may be receptors targeting the same or different analytes.
  • Electrodes modified with these molecules are used as control sensors. This is the subject of a preferred embodiment of the present invention.
  • the electrode field can have reference electrodes, counter-electrodes and resistance thermometers.
  • the substrate of the individual electrode sets can be designed to taper to a point on the incubation side in order to facilitate introduction into an incubation vessel.
  • a chip can include two or more sets of electrodes. Each set of electrodes can consist of two or more individually electrically addressable electrodes.
  • the biomarker sensors according to the invention are not limited to the detection of malaria or SARS-Cov-2 viruses. Accordingly, in a preferred embodiment of the present invention, the aptamers are not aptamers targeting malaria biomarkers or SARS-Cov-2 biomarkers.
  • the subject matter of the present invention is also a method for producing biomarker sensors, in particular as described above, comprising the following steps
  • the layer of electrode material is applied to the substrate by means of physical gas phase deposition, preferably by means of electron beam-supported physical gas phase deposition, particularly preferably after prior application of an adhesion layer.
  • a photoresist preferably a positive photoresist
  • the electrode material from which a mask with the desired pattern of the Meta II structures is then produced by exposure and development.
  • the material of the adhesion layer and the electrode layer that is not required, and then the photoresist are then removed again by means of a wet-chemical etching step.
  • the passivation in step IV) takes place by means of stencil passivation, with a stencil, preferably a polymer stencil, particularly preferably produced using a laser cutting machine, being placed on the surface of the electrodes and then the conductive supply lines of the electrodes are partially passivated by means of chemical vapor deposition (CVD), preferably with a parylene C polymer.
  • CVD chemical vapor deposition
  • the subdivision in step V) takes place by cutting into the substrate, preferably in such a way that the total number of electrodes is evenly distributed over the resulting electrode sets.
  • care must be taken to ensure that the previously produced electrode structures are not damaged or destroyed by the dividing/cutting.
  • Such an already pre-divided carrier substrate represents a preferred embodiment for the biomarker sensors according to the invention and the methods according to the invention.
  • This method comprises the following steps or consists of the following steps i) providing a biomarker sensor according to the invention, or a biomarker sensor produced using the method according to the invention, ii) applying a body fluid sample to the biomarker sensor, iii) connecting the biomarker sensor to a measuring device for current
  • measuring device v) analysis of the measured values, preferably by means of computers, transportable
  • Reading device preferably using software and/or calibration data. vi) optionally storing, transmitting and/or displaying the analyzed results.
  • biomarker sensors according to the invention with regard to the materials that can be used etc. can also be used for the methods according to the invention. That is, in the case of the method according to the invention, in preferred configurations, the same materials can also be used in the same Dimensions are used, as in the biomarker sensors of the invention.
  • an electron beam-assisted physical vapor deposition is used to first adhesion layer on the flexible substrate, which is preferably a
  • Polyethylene terephthalate film is to be deposited.
  • This is preferably a titanium adhesion layer, in special cases a 5 nm titanium adhesion layer.
  • a layer of a conductive metal is deposited as an electrode layer; this is preferably a gold layer, in special cases a 50 nm gold layer.
  • a positive photoresist which in preferred embodiments of the present invention can be based on novolak resin and naphthoquinone diazide as the photoactive substance (an example of this is AZ 5214 E from Microchemicals GmbH, Ulm, Germany), is used in preferred embodiments as a mask for the following patterning of the Used metal structures and exposed the areas where the metal layers should remain.
  • the paint can then be developed in a developer.
  • this can be a developer based on tetramethylammonium hydroxide in H2O (an example of this is AZ 326 MIF from Microchemicals GmbH, Ulm, Germany) and can take place in some variants for, for example, 70 seconds.
  • a wet-chemical etching step is then carried out in preferred embodiments in order to remove excess of the deposited electrode layers which do not correspond to the desired pattern; in preferred embodiments of the present invention, an etching solution based on potassium iodide can be used (an example of this is TechniEtch ACI2, Microchemicals GmbH, Ulm, Germany).
  • the subsequent photoresist removal, to remove the etching mask, is carried out in preferred embodiments by immersing the PET substrate comprising the patterned electrodes in a photoresist remover, which is preferably based on organic solvents such as acetone, NMP or DMSO, optionally in combination with at least one amine, in particular Ethanolamine based, most preferably AZ 100 remover (Microchemicals GmbH, Ulm, Germany), most preferably in an ultrasonic bath for 10 minutes, followed by rinsing with isopropanol and deionized water.
  • a procedure called template passivation is used in preferred embodiments of the present invention.
  • the polymer template is preferably made using a laser cutting machine and placed on the surface of the electrodes. Then the uncovered areas of the conductive supply lines of the electrodes are passivated.
  • the passivation takes place by means of chemical vapor deposition (CVD), particularly preferably the passivation takes place with a parylene C polymer, epoxy-based (negative) photoresists (such as SU-8 from Microchem Corp.) or ( positive) polyimide lacquers (such as HD 8820 from HD-Microsystems).
  • CVD chemical vapor deposition
  • passivation therefore means the covering or covering of a part of the electrode lines which should not be accessible in the finished sensors.
  • each flexible polymer chip has a size of 10.5 mm x 15.8 mm, with 16 individually addressable electrodes.
  • Each square-shaped electrode with a size of 550 pm x 550 pm is placed on the so-called incubation side of the sensor (the incubation zone), which serves as the base for the flex-MEA.
  • each flexible polymer chip has a size of 10.5 mm ⁇ 24.13 mm, with 16 individually addressable electrodes, in further variants also a size of 10.5 mm ⁇ 21.5 mm and/or with 20 individually addressable electrodes.
  • Each square-shaped electrode with a size of 550 pm x 550 pm is placed on the so-called incubation side of the sensor (the incubation zone), which serves as the base for the flex-MEA.
  • the conductor tracks of the individual electrodes can be varied in their diameter from the side of their electrical contact to their end to be covered with aptamer. preferably gradually narrowing. In other preferred configurations, however, the dimensions of the chip can also be smaller or larger, depending on the respective application.
  • Further preferred embodiments of the present invention relate to methods for determining a malaria infection and the percentage of parasitemia in blood samples parasitized by Plasmodium falciparum using the biomarker sensors according to the invention.
  • Other preferred embodiments of the present invention relate to methods for determining a COVID-19 infection and, if appropriate, accompanying the viral load in mucus samples, in particular from the mouth and nose, using the biomarker sensors according to the invention, the mucus samples being diluted with defined amounts of buffer solution, if necessary to improve handling be able.
  • the biofunctionalization of the flex-MEA multi-target Apta sensor is carried out by overnight incubations (16 hours) of the various electrode sets created in various previously activated aptamer solutions with concentrations of 0.5 pM for 2008s, pL1, 2106s and 0.03 pM for LDHpII realized.
  • the aptamers for their immobilization on the gold electrode surface; this is particularly preferably achieved by incubating them in 10 mM TCEP solution for 1 hour.
  • this is followed by blocking using 5 mg/ml PEG solution for 7 hours, followed by multiple washes with Tris buffer.
  • the multi-target aptasensor is then incubated with lysed Plasmodium falciparum parasite sample for 45 minutes and then washed with Tris buffer.
  • the electrochemical signal detection is carried out in preferred embodiments with a potentiostat using differential pulse voltammetry (DPV) measurements
  • DPV measurements can be carried out in redox species solution (5 mM [Fe(CN) 6 ] 3/4 in 25 mM Tris buffer).
  • the mean values obtained for the redox current change after the target detection of various electrodes can be evaluated by means of statistical analysis using statistical analysis software.
  • the software that can be used for this purpose is also not restricted to a specific one.
  • Another particularly preferred embodiment of the present invention can be described in exactly the same way as just described, with the difference that C5 aptamers, C7 aptamers, C9 aptamers, Cll aptamers, C15 aptamers and/or II aptamers, preferably C7 Aptamers and C15 aptamers, in particular C7 aptamers, are used.
  • the thicknesses of the gold and titanium metal layers mentioned as preferred embodiments are not to be understood as limiting. On the contrary, within the framework of the present invention, these layers can be of any other thickness; depending on the exact application, the layer thicknesses will be thinner or thicker in preferred embodiments of the present invention.
  • the electrode material is not limited to the gold described as the preferred embodiment; it can be varied widely as long as sufficient conductivity of the electrodes is ensured and sufficient ability to adsorb the aptamers, optionally after prior activation, is given.
  • Examples of other electrode materials preferred according to the invention are carbon, platinum or polymer/metal/carbon composites (polymer here means conductive polymers, e.g. PEDOT:PSS (poly(3,4-ethylenedioxythiophene) polystyrene sulfonate)).
  • the patterning of the Meta II structures is also not limited to the wet-chemical etching described as a preferred embodiment.
  • Another preferred embodiment is an off-hook process known in the art.
  • Photoresist removal can be accomplished with any photoresist removal solution, not just those described as preferred embodiments.
  • the dimensions of the leads and electrodes can be of any size; they only have to be adapted to the exact application situation.
  • the integration of a reference electrode and a counter electrode can also be included in the same chip design.
  • the resistance thermometer (RTD) employed in preferred embodiments is not limited to any specific design, size, or resistance.
  • the template made for the passivation can be of any material and any shape that covers the planned passivation area; its manufacture is not limited to the use of a laser cutting machine described as the preferred embodiment.
  • the stencil passivation described as the preferred embodiment is not the only method of passivating the conductive leads.
  • other polymers or insulating materials can be used as passivation layers. Examples of preferred materials are polyimides, epoxy-based negative photoresists (such as SU-8 from Microchem Corp.).
  • the aptamer receptors are selected such that they bind to different epitopes of the same biomarker and/or to other biomarkers indicative of the same disease and/or to an agent that interferes with binding to the biomarker ( possibly producing false positive results).
  • the outputs of sensors treated with different receptors are analyzed by combining them with logic gates, allowing for unambiguous test results.
  • the outputs from different sensors treated with the same receptor are averaged to increase redundancy.
  • the method described above as preferred, in which different electrode sets produced are incubated with the different aptamer solutions is not the only way to immobilize different aptamers. In other preferred configurations, this can be achieved by many other methods, such as in particular electrochemical molecule stripping, printing, spotting or lithography.
  • the aptamers can be attached to the electrode via monothiol bonds or via multithiol bonds or via other covalent bonds.
  • the specific concentrations and specific aptamers mentioned as particularly preferred for the production of the multi-target aptasensors of the present invention can be extended in other variants of the present invention to any concentration and any different type of aptamer receptors targeting any other biomarker.
  • the incubation time for the aptamer immobilization can be varied.
  • the multi-target aptasensor of the present invention can be applied to the immobilization of at least two different aptameric receptors and is not limited to a maximum number of receptor molecules.
  • aptamer receptors (detection aptamers) (specific for the corresponding analyte) modified with catalytically active units can be added to the analyte sample in order to increase the electrochemical signal.
  • these catalytically active species of the detection aptamers can be enzymes, preferably horseradish peroxidase, or nanoparticles, preferably platinum nanoparticles.
  • conductive polymers such as poly(3,4-ethylenedioxythiophene) polystyrene sulfonate can be used as an aptamer-embedding electrode coating to increase the density of aptamers on the surface of the electrodes.
  • conductive 3-D scaffolds ie micro and nano frameworks that are produced from metals, carbon and conductive polymers, can be used for this purpose.
  • the aptamers can also be anchored to the electrode in another way, particularly preferably by oligonucleotides such as poly A or with a different sequence, by diazonium coupling reaction, by EDC:NHS or similar coupling reaction, (3+2)-cycloaddition between alkyne and azide groups or other coupling reaction based on covalent or electrostatic bonds.
  • helix water, tap water, drinking water or any other solvent capable of removing the excess molecules/biological solutions can be used as the rinsing medium or washing solvent.
  • other substances can also be used instead of the PEG described above in a preferred variant, in order to prevent non-specific binding to the electrode.
  • these can be alkanethiols of different termination and length, BSA (bovine serum albumin), HSA (human serum albumin) or the like, betaines or oligosaccharides of different termination, side chains and lengths.
  • the incubation time of the sensor with the analyte sample can be varied widely and depends on the specific framework conditions of the precise individual case, in particular also dependent on the binding constant of the binding of the aptamers to the corresponding analyte (and thus, for example, also dependent on the temperature).
  • microfluidic channels can be integrated on the surface of the electrodes in order to reduce the detection time of the target molecules.
  • any suitable device for generating and measuring any electrical/electrochemical signal can be used with the inventive Biomarker sensor are coupled.
  • these are accordingly transportable reading devices, Bluetooth and/or wireless transmitters.
  • individual electrodes can each be assigned a counter electrode and a reference electrode.
  • the aptamer-covered electrode contacts/electrode contact for aptamer coverage are comb-shaped in preferred embodiments, particularly preferably double-comb-shaped, and the counter electrode and the reference electrode can enclose the aptamer-covered area (area to be covered with aptamer) of the measuring electrode.
  • the sensor chip of the present invention can also include microfluidic channels, by means of which the respective sample can be guided to the electrodes, as a result of which the required sample quantity can be reduced and the detection time can be reduced.
  • microfluidic channels are preferably made from a polymer, particularly preferably from a polymer which has a water contact angle of less than 90°.
  • Biomarkers of other viruses include the hemagglutinin (HAI) protein of the influenza virus, the glycoprotein G of the HRS virus and the spike protein of the MERS-CoV (middle east respiratory syndrome-related coronavirus).
  • HAI hemagglutinin
  • any disease-specific biomarker can be detected within the scope of the present invention; it is only necessary for the necessary aptamers to be known or found and to be able to adhere to electrodes in the sense of the present invention.
  • biomarker sensor kits comprising or consisting of at least one biomarker sensor according to the present invention without aptamers already being bound, a preparation comprising at least one biomarker-specific aptamer, and optionally further analysis material, preferably pipettes, biosensor chips, portable readers, chemicals, preparation tubes (Eppendorf tubes) and the like.
  • kit does not necessarily have to be suitable for the "trouser pocket”. Rather, this is intended to express the fact that, before the analysis, both the biomarker sensor as described above and the preparation comprising the biomarker-specific aptamer are present separately from one another, although they are coordinated and associated with one another.
  • the kit should also be able to include several detection sensors and several aptamer preparations, which are also designed for different biomarkers.
  • the body fluid is not limited to a specific body fluid in the method for determining disease-specific biomarkers according to the present invention, it is self-evident for the person skilled in the art that he selects the body fluid according to whether the disease-specific biomarkers he is looking for occur in the respective body fluid.
  • the body fluid is a blood sample.
  • the body fluid is a mucus sample, particularly from the nose and/or throat.
  • the body fluids Before being used in the method of the present invention, the body fluids can be processed or prepared in accordance with the methods customary in the art.
  • the method of the present invention is particularly suitable and intended for examining body fluid samples which are already available as such, ie the collection of body fluids is not part of the method of the present invention.
  • the biosensor according to the invention can be implemented as a technology platform for the detection of many different infectious diseases caused by viruses, bacteria, fungi or parasites.
  • neurodegenerative diseases detection of misfolded proteins
  • chronic diseases diabetes melitus, cardiovascular diseases
  • the present invention can thus serve as a technological platform capable of monitoring seasonal infectious diseases and treatment efficacy, and has the potential to enable epidemiological surveillance due to the data transfer capabilities.
  • the present invention can also serve as a basic technology for early application to emerging diseases and prevention of future pandemics.
  • the present invention also relates to uses of the biomarker sensors according to the invention or the biomarker sensors produced using the method according to the invention, or the biomarker sensor kits according to the invention for the qualitative or quantitative determination of disease-specific biomarkers, preferably malaria biomarkers, particularly preferably in body fluid samples, particularly preferably in blood samples or mucus samples , the latter preferably originating from the nose or throat.
  • disease-specific biomarkers preferably malaria biomarkers, particularly preferably in body fluid samples, particularly preferably in blood samples or mucus samples , the latter preferably originating from the nose or throat.
  • biomarker sensors according to the invention are used as a substrate in automated multititer plates.
  • the present invention includes uses of the biosensors according to the invention, the biomarker sensors produced according to the invention, or the biomarker sensor kits according to the invention for the determination of malaria biomarkers or SARS-CoV-2 biomarkers, particularly preferably in body fluid samples, particularly preferably in blood samples or mucus samples , the latter in particular from the throat and/or nose, most preferably as a substrate in automated multititer plates or in PoC devices.
  • the biosensor according to the invention can also be used in particular in the context of point-of-care applications or PoC diagnostic tests, for the selective and sensitive detection of infectious respiratory diseases, the present invention, the quantification of the viral load of the infection, if one is detected, can be determined.
  • the device can be easily operated by anyone, for example at home, at school, in hospitals and so on.
  • the device in this use case comprises a disposable chip that is impregnated with a sample of mucus from a patient's nose or throat and a reusable wearable reader, similar to what is known from PoC glucose sensors.
  • the reader can process the data from various tests and transmit the data, for example, via WiFi or Bluetooth, but also wired, for example to a smartphone, to the doctor treating you, or to a central healthcare facility.
  • additional biomarker-specific aptamers which are modified with catalytically active groups and amplify the electrochemical signal, can be added to the analyte after binding of the biomarker to the sensor surface.
  • the sensors of the present invention are less sensitive to environmental influences such as temperature, chemicals, and shelf life compared to antibody sensors and are also less expensive to manufacture. Nevertheless, with the biosensors of the present invention, the tests can be evaluated digitally, qualitatively and quantitatively. With the sensors of the present invention it is possible to analyze several biomarkers, in particular PfLDH-, PvLDH- and HRP-2 simultaneously and Plasmodium parasite species can be distinguished.
  • An advantage of the present invention is that by combining the signals from multiple sets of electrodes for the detection of different biomarkers, it enables the differentiation of parasite species and increases the redundancy of the infection detection.
  • a further advantage of the present invention is that chips can be manufactured with small dimensions and these small dimensions of the chip and the electrodes enable the analysis of small blood sample volumes.
  • the sample volume can be further reduced by using microfluidic channels.
  • digitization is very easily possible and thus (appropriate) epidemiological monitoring of/by means of the sensor data determined is/is possible with the present invention. Because the electronic connection of the sensors and the electronic recording of the measurement data means that they can be easily processed and edited.
  • FIG. 1a is a plan view of a biomarker sensor/a flex MEA layout 1 according to the present invention.
  • the double-dashed lines 4 represent the cutting strips 3 along which the originally undivided workpiece was subdivided by cutting. These cutting strips 4 divide the electrode field into different electrode sets ES-1 to ES-4, which makes it easier to immobilize different aptamers per electrode set.
  • the incubation side/incubation zone I, passivation area/passivation zone P and the contact field area/contact zone K are also indicated.
  • the incubation zone I is the area with which the different electron sets ES-1 to ES-4 are incubated in the respective aptamer solutions in order to fix the aptamers on the electrode contacts 3.
  • the different electron sets ES-1 to ES-4 can be bent independently of each other in order to incubate them individually.
  • the figure also shows the passivation zone P, in which the conductor tracks of the respective electrodes are covered and protected by a passivation layer, preferably made of parylene C polymer.
  • the respective electrodes or the sensor are electrically contacted and connected to measuring devices, such as preferably potentiostats.
  • FIG. 1b) is a side view of the flex MEA chip 1 shown in FIG. 1a), in which the preferred materials are listed; PET for the substrate, gold for the electrodes and parylene C-polymer for the passivation layer.
  • the electrode extends from the incubation zone I via the passivation zone P to the contact zone K. In the area of the incubation zone I and the contact zone K, the electrode is not provided with a passivation layer so that aptamers or contacting remains possible . Only in the passivation zone is the electrode covered with the passivation layer for protection.
  • FIG. 2a is a plan view of a biomarker sensor 1, as also shown in FIG.
  • individual counter-electrodes 5 and reference electrodes 6 are now shown for each electrode set ES-1 to ES-4;
  • Each set of working electrodes i.e. each electrode set ES-1 to ES-4
  • each set of working electrodes therefore has an associated counter-electrode 5 and an associated reference electrode 6.
  • there is a resistance thermometer 7 in the passivation zone P whose contacts are routed into/over the contact zone K.
  • the double-dashed lines indicate the cut surface 4 for the production of different electrode sets ESI to ES-4; here, in contrast to FIG. 1, it is also indicated that the individual cuts for subdividing the substrate and separating the individual electrode sets ES-1 to ES-4 can be made up to the passivation zone P.
  • FIG. 2b is a plan view of a biomarker sensor 1, as illustrated in FIG. 2a), with the difference that the electrode sets ES-1 to ES-4 have no individual counter-electrodes 5 and reference electrodes 6.
  • all four electrode sets ES-1 to ES-4 share a counter electrode 5 and a reference electrode 6.
  • FIG. 2c is a schematic top view of a biomarker sensor 1, as illustrated in FIG. 2a), with the difference that here only three electrode sets ES-1 to ES- are shown. Also shown in this figure are alignment marks, which can be used for orientation if several lithography steps have to be carried out. These can be applied just as well to the variants of the other figures, but are not illustrated there for the sake of simplicity; the other way around, although they are shown in this figure, they are not absolutely necessary.
  • FIG. 3 shows the graphic plot of the detection data of the specific biomarkers in samples of Plasmodium falciparum parasite blood samples of the respective specific aptasensors.
  • the control represents the signal measured with uninfected blood (uRBC).
  • the percentages represent the percentage of parasitemia.
  • the dashed line indicates the threshold and the ordinate shows the relative peak current change per area. It can be seen from this figure that the measurement signal is higher with increasing parasitemia and consequently not only the presence of the biomarkers corresponding to the aptamers can be qualitatively detected with the biomarker sensors according to the present invention, but also their amount quantitatively.
  • FIG. 4 shows a different configuration of an electrode arrangement.
  • the aptamer occupied electrode contacts/electrode contact for aptamer occupancy 3 were each shown as squares.
  • the electrode contact for aptamer occupancy 3 is designed in a double-comb configuration.
  • a single electrode is shown arranged together with an enclosing counter electrode 5 and an enclosing reference electrode 6 .
  • Such a configuration can be used as an alternative to the electrode arrangements shown in FIGS.
  • some size specifications are given in this figure by way of example.
  • FIG. 5 is a reproduction of the biomarker sensor shown in FIG.
  • FIG. 6a is a reproduction of the biomarker sensor shown in FIG. 2a), with the difference that in FIG. 6a) a specific embodiment with specific size and length information is shown, as was also carried out.
  • FIG. 6b is a reproduction of the biomarker sensor shown in FIG. 2b), with the difference that FIG. 6b) shows a specific embodiment with specific size and length information, as was also carried out.
  • the inset 12 shows the meander structure of a resistance thermometer (Resistance Temperature Detector, RTD) 7 with specific dimensions as used in this specific embodiment.
  • RTD Resistance Temperature Detector
  • FIG. 6c is a representation of the biomarker sensor shown in FIG. 2c, with the difference that in FIG. 6c a specific embodiment with specific size and length indications is shown as it was also carried out.
  • FIG. 7 shows the graphic plot of the sensor signal against the concentration of the biomarker (S protein) of the SARS-CoV-2 virus.
  • the sensor signal was measured with a flex-MEA modified with the C7 aptamers. The specific detection took place in the sample medium in a concentration range from 1 fg/ml to 100 ng/ml.
  • the dashed line indicates the threshold value, the abscissa the concentration of protein in the sample and the ordinate shows the relative peak current change per area. It can be seen from this figure that the measurement signal is higher with increasing concentration and therefore not only qualitatively the presence of the specific biomarker (S protein) of the SARS-CoV-2 virus can be detected with the biomarker sensors according to the present invention, but also quantitatively its amount.
  • Flexible multi-electrode arrays (flex-MEA) were fabricated in an ISO 1-3 clean room on a polyethylene terephthalate film (PET, DuPont Teijin Films Ltd.) with a thickness of 100 ⁇ m and a diameter of 100 mm manufactured as a flexible substrate.
  • PVD electron beam assisted physical vapor deposition
  • first a 5 nm titanium adhesion layer and then a layer of 50 nm gold (Au) were deposited on the flexible substrate to fabricate the electrode.
  • An etch mask for the pattern of the leads and the 16 electrodes was prepared using standard photolithography with a positive photoresist using a mask aligner, applied to the gold surface, and then the electrodes were etched using a wet chemical process using a gold etchant (TechniEtch ACI2, Microchemicals, Ulm, Germany). The exposed titanium layer was then removed by wet chemical etching using a titanium etchant (TechniEtch TC, Ulm, Germany). The etch mask was then removed by immersing the PET substrate comprising the patterned electrodes in AZ-100 remover in an ultrasonic bath for 10 minutes, followed by an isopropanol and deionized water rinse.
  • the flexible polymer chips obtained had a size of 10.5 mm ⁇ 15.8 mm, with 16 individually addressable electrodes (see also FIG. 5).
  • Each square-shaped electrode with a size of 550 ⁇ m ⁇ 550 ⁇ m is arranged on the so-called incubation side (or incubation zone) of the chip, with this incubation side of the chip serving as the base for the flex-MEA.
  • other flex MEA designs were also included, including an on-chip reference electrode 6 (RE), a counter electrode 5 (CE), and a
  • Resistance temperature detector 7 produced (see also Figure 6).
  • the passivation layer was produced by means of template passivation using Parylene C to form the passivation layer (protective layer over the electrode lines).
  • a polymer template was produced for this using a laser cutting machine.
  • the stencil was applied to the PET substrate with the patterned electrode.
  • Parylene C was then deposited by chemical vapor deposition (CVD) with the following parameters: vacuum pressure 20 mTorr, set point 25 mTorr and vaporizor 160°C. Finally, the stencil was carefully peeled off the PET substrate.
  • CVD chemical vapor deposition
  • the new flex-MEA chips were immersed in acetone and isopropanol for 5 minutes each, followed by a high-purity deionized water rinse (from a Milli-Q® system (18.2 megohm resistivity)) and drying in nitrogen flow.
  • the chemically cleaned electrodes were connected to a printed circuit board with a zero force socket connector that allowed connection to a potentiostat.
  • the electrochemical cleaning of the flex-MEA chip was first performed by cyclic voltammetry (CV) in 0.1 M NaOH in a potential range of -1.35 V to -0.35 V during 10 scans at 2 V s 1 and subsequent scanning in 0.05 M H2SO4 in a potential range from 0 V to 1.5 V during 20 scans at 1 V s _1 .
  • the electrochemical surface area (ESA) was determined by CV in 0.05 M H2SO4 in a potential range from 0 V to 1.5 V at 0.1 V s 1 .
  • ssDNA single-stranded deoxyribonucleic acid
  • TCEP Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride
  • the solutions were diluted in 10mM phosphate buffered saline (PBS - NaCl 1M, Na ⁇ PO 10mM, Na2HPC>4 10mM, MgCh 1mM, pH 7.1) after 1 hour to a final volume of 1mL resuspended.
  • 10mM phosphate buffered saline PBS - NaCl 1M, Na ⁇ PO 10mM, Na2HPC>4 10mM, MgCh 1mM, pH 7.1
  • Four parallel strip-like sections were then cut into the flex-MEA using scissors, taking care to leave the electrodes and leads intact, allowing for electrode incubation with the four different aptamer solutions for the final fabrication of the multi-target aptasensor. Due to the flexible substrate, the individual cut electrodes could be bent individually, so that it was possible to immerse them in the selected incubation solution without the other electrode fields running the risk of being incubated as well.
  • the electrodes were then incubated individually with their in
  • Table 1 Sequences of the receptor aptamers used for the multi-target flex MEA aptasensor 3. Wash
  • the aptamer-modified flex-MEA chip was first rinsed with 25 mM Tris-HCl buffer (NaCl 0.1 M, Tris(hydroxymethyl)aminomethane 25 mM, HCl 25 mM, pH 7.5) and then with deionized water (Milli-Q® -water) to remove non-specifically adsorbed molecules.
  • Tris-HCl buffer NaCl 0.1 M, Tris(hydroxymethyl)aminomethane 25 mM, HCl 25 mM, pH 7.5
  • deionized water Milli-Q® -water
  • the flex-MEA chip was incubated with a 5 mg/ml monofunctional methoxy polyethylene glycol thiol (PEG, 2 kDa) solution for 7 hours.
  • PEG monofunctional methoxy polyethylene glycol thiol
  • the PEG served as a blocking molecule to avoid biofouling by other molecules present in the blood samples.
  • the output signals obtained from the various electrodes, each modified with a particular aptamer receptor, are presented in Table 2.
  • the signal was considered 0 or 1 if the measured current was below or above a certain threshold. 3o (3-sigma) was assumed as the threshold value, where o (sigma) represents the standard deviation of the analyte-free measurement.
  • Both the 2008s and the pLl aptamer target PfLDH and PvLDH, resulting in highly redundant signals that result in high reliability of the malaria test.
  • the LDHpII and 2106s aptamers which selectively target PfLDH and HRP-2, respectively, allow discrimination between P. falciparum and P. vivax malaria parasites.
  • the output significance indicates whether the combination of the respective inputs makes sense for the diagnosis or not.
  • T-1, T-2 and T-3 are presented for logical operations as they were performed, but other logical operations of different levels can also be performed.
  • Table 3 Input and output table for sensors modified with LDHpII aptamer and 2106s aptamer for the detection of different combinations of biomarkers. The output is only 1 if both Plasmodium falciparum biomarkers (PfLDH + HRP-2) are detected. Co-infection with Plasmodium vivax cannot be ruled out.
  • Table 4 Truth table of combination of LDHpll and 2106s for P. falciparum infections using AND gate.
  • Logic diagram: Output Inp 1 x Inp 2 (here: infection with Plasmodium falciparum )
  • Table 5 Input and output table for the combinations of detection of 2008s, LDHpII and 2106s aptamers for P. v/Vax detection only. A co-infection with P. falciparum is excluded.
  • Table 7 Input and output table for the combination of detection of 2008s and pLl aptamers for P. falciparum and P. vivax mixed infections using redundant signal to reject a false positive result.
  • Table 8 Truth table for the combination of 2008s and pLl modified sensors for redundant confirmation of P. falciparum and P. vivax co-infection detection using AND gates.
  • Logic diagram: Output Inp 1 x Inp 2
  • Differential pulse voltammetry (DPV) measurements were performed to determine the detection of the PfLDH and HRP-2 aptasensors in the parasitized blood samples.
  • the DPV measurements were performed in 5 mM potassium ferri- and ferrocyanide ([Fe(CN) 6 ] 3 /4 ) in 25 mM Tris buffer solution using a multichannel potentiostat with a three-electrode system.
  • a platinum wire was used as the counter electrode (CE), an Ag/AgCl electrode as the reference electrode (RE) and the flex-MEA multi-target aptasensor as the working electrode (WE).
  • the DPV measurements were performed in a potential range of 0 V to 0.7 V, with a step potential of 0.005 V, an amplitude modulation of 0.025 V, an equilibrium time of 2 seconds, a pulse width of 0.05 seconds, and a measurement width of
  • the flexMEA sensors according to the invention were used to detect the spike protein of the SARS-CoV-2 virus.
  • the C7 aptamer which binds to the spike protein of the SARS-CoV-2 virus, was used as the aptamer.
  • the aptasensor was incubated with the spike protein for 30 minutes and then rinsed with Tris buffer (as described above).
  • the electrochemical signal detection was performed with a potentiostat using differential pulse voltammetry (DPV), the DPV measurements being carried out in particular in redox species solution (5 mM [Fe(CN) 6 ] 3/4 in 25 mM Tris buffer). .
  • DPV differential pulse voltammetry
  • this electrochemical biosensor shows an outstanding performance, even exceeding the detection limits reported for other methods, for example rapid (lateral flow) tests.
  • the sensor data determined showed that the sensors according to the invention are outstandingly suitable for detecting the spike protein of the SARS-CoV-2 virus clearly and in low concentrations (see also FIG. 7).
  • the flex MEA sensor of the present invention can be used as a logic gate.
  • the detected signals of each individual electrode of the biosensor serve as input signals (input signals/inputs) for the logic gate, whose output is the result of the Boolean operation, indicating positive (1) or negative (0) identification of the pathogen, respectively indicating the presence + positive (1) or absence - negative (0) of the pathogen.
  • Such a concept is presented in Tables CA and CB below with an example of a multi-target determination of different spike protein variants.
  • the biosensors function as exclusive-or gates (XOR gates) to distinguish between COVID-19 and its different variants, the spike protein and the SARS-CoV-2 virus are the gate inputs.
  • the output significance indicates whether the combination of the various target inputs represents a meaningful biomarker combination that clearly indicates an infection or no infection. In this case the result is "clear”. Random combinations are considered “unclear”. The presence of two different spike proteins representing co-infection (unlikely) are considered unclear.
  • Table CA Example of a discriminatory detection of a COVID-19 infection between different virus variants
  • Table CB shows an example of a biosensor implementation from Table CA, where the electrodes are used as XOR gates to discriminate between different variants of COVID-19.
  • the different spike proteins of the SARS-CoV-2 variants are used as input signals of the gate.
  • This logic gate facilitates an unambiguous determination of the infections with the ability to discriminate between the different infecting viruses and exclude co-infections by processing the different redundant sensor signals coming from the different electrodes and rejecting the possibility of a false positive output.
  • Various other logic gates can be built from the possible combinations of the aptamer-based biosensor signals coming from the same flexible chip and used for specific disease discrimination.
  • Table CB XOR logic gate inputs and outputs for two sets of sensors modified differently with either C9 or C5 aptamers for detection of different COVID-19 biomarkers. The output is only 1 if one of the biomarkers is detected. Co-infection is ruled out in the same way as wild-type infection. Output 1 is obtained only when the aptasensors are reporting a signal above their respective detection limit thresholds.
  • Table CC Truth table of an XOR logic gate, according to table CB.
  • Input 1 (Inp 1) is spike protein alpha and input 2 (Inp 2) is spike protein delta.
  • Logic diagram: Output inpi ® inp2 with Covid-19 alpha or Covid-19 delta).
  • 0 indicates an equivocal test result due to aptamer receptor cross-selectivity or no infection.
  • Such tables were also created accordingly with other aptamers, in particular with the C15 aptamer (which is relevant for the omicron variant of SARS-CoV2); not shown again here due to "equality".
  • different sets of sensors of the same flexible multi-electrode chip were modified with either C7 aptamer, which detects the spike protein of the SARS-CoV-2 virus, or Il aptamer, which detects the HA1 protein of the influenza virus to specifically identify COVID-19 infections. The output is only 1 if the spike protein is detected. A 1 output was obtained only when the C7 aptasensor gives a signal above its respective threshold, which is determined by the biosensor's detection limit threshold.
  • aptamers namely the II aptamer, the SGI aptamer, the C15 aptamer, which include other biomarkers: hemagglutinin (HAI) protein of the influenza virus, the glycoprotein G des HRS virus and the spike protein of the MERS-CoV and in particular the Omicron variant of the SARS-CoV-2 virus

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Biomarkersensoren mit Multielektrodenfeld-Struktur, Kits enthaltend diese, Verfahren zu deren Herstellung sowie entsprechende Ver- und Anwendungen.

Description

Biosensor für elektrochemische Detektion von z.B. Malaria-Biomarkern
Die vorliegende Erfindung betrifft Biosensoren, insbesondere basierend auf flexiblen Multielektroden-Feldern, für die elektrochemische Detektion von Biomarkern, bevorzugt von Biomarkern von Infektionskrankheiten, besonders bevorzugt von Malaria-Biomarkern, insbesondere die simultane elektrochemische Detektion von multiplen Biomarkern desselben Pathogens oder unterschiedlicher Krankheitserreger, zum Beispiel Malaria-Biomarkern.
Für die Detektion von Malaria aber auch für SARS-CoV-2-Viren existieren verschiedene kommerziell erhältliche kolorimetrische Schnelltests (rapid detection tests; RDTs). Die Detektion basiert auf Antikörper-Antigen Interaktionen, wobei Antikörper als Rezeptormoleküle verwendet werden. Ungünstigerweise fehlt solchen kommerziellen RDTs immer noch eine ausreichende analytische Sensitivität und die allermeisten dieser Schnelltests unterscheiden nicht zwischen den verschiedenen Malaria-Parasiten bzw. SARS-CoV-2-Virusvarianten. Zudem weisen die Rezeptorantikörper eine geringe Thermostabilität bei erhöhten Temperaturen auf. Angesichts der Tatsache, dass die meisten Regionen in denen Malaria weit verbreitet ist heißes und feuchtes Klima aufweisen, sind diese diagnostischen Systeme basierend auf Antikörpern nur von geringer Genauigkeit. Ferner ist ein Nachteil dieser Rezeptorantikörper, dass diese in der Fierstellung recht teuer sind, und dass sie empfindlich gegenüber vielen Chemikalien und chemische Modifikationen sind, was ihre Verwendung einschränkt. In diesem Zusammenhang wurden robustere Rezeptormoleküle wie beispielsweise Aptamere vorgeschlagen. Aptamere sind kurze einsträngige, künstliche RNS oder DNS Oligonukleotide, Peptide oder solche Moleküle mit chemischer Modifizierung. Solche Aptamere erkennen und binden an einen Zielanalyt mit hoher Spezifizität und starker Affinität. Im Vergleich mit Antikörpern sind Aptamere thermostabil, günstiger und einfacher herzustellen und können einfach chemisch modifiziert werden. Aus diesem Grund sind Aptamere eine Alternative, um die Schwierigkeiten in Zusammenhang mit der Verwendung von Antikörper-basierten Tests zu überwinden. Verschiedene Detektionsplattformen mit verschiedenen Wandlern, die von optischen bis zu elektrochemischen Systemen reichen, wurden vorgeschlagen, unter Verwendung von Aptameren als Rezeptormolekül. Diese bekannten Systeme detektieren im Wesentlichen Proteinbiomarker, die zum Beispiel auf die Anwesenheit der Malariaparasiten hindeuten. Das Protein, auf das dabei am meisten abgezielt wird, ist Plasmodium Lactat Dehydrogenase (PLDH), das von allen Malariaparasiten-Spezies produziert wird. Dieses Enzym kann eine kürzliche Infizierung anzeigen, weil dessen Konzentration in Körperflüssigkeiten mit dem Maß der Parasitämie korreliert. Ein weiterer üblicher Biomarker ist P. falciparum Histidin-reiches Protein 2 (HRP-2), das allerdings ausschließlich durch den Plasmodium falciparum Parasiten exprimiert wird. Es ist in roten Blutzellen, Serum, zerebrospinaler Flüssigkeit und Urin von mit dieser Spezies infizierten Patienten vorhanden. Verschiedene Aptamere sind für die Detektion dieser Proteinbiomarker entwickelt worden, wie beispielsweise das 2008s- Aptamer, welches den P. falciparum LDH (PfLDH) Biomarker nachweist (vergleiche beispielsweise US 2013/0210023 Al; SEQ ID NO. 2). Ein weiteres Aptamer, das sowohl PfLDH als auch P. vivax LDH (PvLDH) Proteine detektieren kann ist das pLl- Aptamer (siehe beispielsweise in der US 2012/0316325 Al; SEQ ID NO. 1) beschrieben ist. Das sogenannte LDHpll-Aptamer, das hoch selektiv nur für PfLDH ist, wurde ebenfalls schon beschrieben (beispielsweise in Frith, K.-A. et al.; Towards development of aptamers that specifically bind to lactate dehydrogenase of Plasmodium falciparum through epitopic targeting. Malaria Journal 2018, 17 (1), 191). Ein Aptamer, das selektiv HRP-2 Protein nachweist, ist das 2106s-Aptamer (siehe beispielsweise US 2013/0210023 Al; SEQ ID NO. 7). Eine Kombination von diesen Rezeptor-Aptameren erlaubt zielgerichtet die Untersuchung dieser oben genannten Hauptmalariabiomarker, was ein großer Vorteil bei der Unterscheidung zwischen den zwei häufigeren P. falciparum- und P. vivax- Parasiten darstellt und entsprechend für die jeweils angezeigte Antimalariabehandlung.
Es wurde gezeigt, dass elektrochemische Sensoren aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeiten, der einfachen Verwendung und Ausführung der Detektion, mit der Möglichkeit der Miniaturisierung der Elektroden, anderen Detektionsplattformen überlegen sind, so dass solche Sensoren für Point-of-Care-Anwendungen (PoC- Anwendungen) geeignet sind. Der Ansatz basierend auf Multielektrodenfeld-Chips (multi electrode arrays; MEA Chips) welche mehrere Elektroden aufweist und die Vorteile einer großen Detektionsfläche und Untersuchungen mit geringem Hintergrundrauschen kombinieren. Abgesehen davon ermöglichen die MEAs die Immobilisierung von verschiedenen Aptameren auf verschiedenen Elektroden desselben MEA-Chips für die simultane Detektion von mehreren Malariabiomarkern über individuell adressierbare Aptasensoren. Die Entwicklung von MEAs auf flexiblen Substraten scheint einen Vorteil bei der billigen und einfacheren Herstellung als auch deren Point-of-Care Einsatz als Multitarget-Biosensoren darzustellen. Wichtig als Biomarker bei der Untersuchung von Malaria sind im allgemeinen Plasmodium falciparum L-Laktat-Dehydrogenase (PfLDH), Plasmodium vivax L-Laktat- Dehydrogenase(PvLDH) und Histidin-reiches Protein 2 (HRP-2). PfLDH, PvLDH und HRP- 2 können über Immunoassays und Immunoschnelltests nachgewiesen werden. Solche Tests funktionieren in der Regel kolorimetrisch, es gibt aber neben elektrochemischen und fluoreszenzbasierten Nachweisen auch noch weitere Detektionsmethoden. Zudem ist es bekannt, Aptamerrezeptoren für den Nachweis von PfLDH, PvLDH und HRP-2 zu verwenden.
Gleichwohl sind die existierenden Detektoren immer noch verbesserungswürdig, insbesondere hinsichtlich deren Genauigkeit für die zu untersuchende(n) Spezies, sowie deren Herstellung.
Ein weiteres Beispiel für den Nachweis von Infektionskrankheiten ist die Detektion von Coronaviren, bevorzugt des SARS-CoV-2 Virus, insbesondere die gemeinsame Überprüfung und Unterscheidung anderer viraler Erkrankungen mit ähnlichen Symptomen wie den Influenza Virus, humanes respiratorisches Synzytial-Virus [Abk.: HRSV] als auch Varianten von SARS und MERS.
Weiterhin hat mit hunderten Millionen Infektionen und Millionen Todesfällen weltweit die COVID-19-Pandemie gezeigt, wie unzureichend die Verfahren zur Erkennung, Isolierung und Verfolgung des Ausbruchs neu auftretender Krankheitserreger ist. Die Einführung von Testverfahren unter Verwendung von Antigen-Schnelltests hat den schnellen qualitativen Nachweis des neuen SARS-CoV-2-Virus erleichtert und sich als wirksame Maßnahme zur Verhinderung und Eindämmung der Ausbreitung des Virus erwiesen. Dennoch ist es nach wie vor zeitaufwändig, das Virus quantitativ nachzuweisen und zwischen verschiedenen Virusvarianten und/oder Krankheiten mit ähnlichen Symptomen zu unterscheiden.
Mehr noch, die fehlende Digitalisierung der derzeitigen Diagnosetests macht sie ineffizient und erschwert eine angemessene epidemiologische Überwachung.
Quantitative Nachweise des Virus sind erforderlich, da sich die Viruslast im Verlauf der Infektion verändert. Daher kann der Nachweis der Viruslast die Zuverlässigkeit von Tests erhöhen und falsch-negative Ergebnisse vermeiden. Die Unterscheidung zwischen verschiedenen Virusvarianten ist derzeit über RT-PCR-Tests möglich, und die Bestätigung einer Virusinfektion aufgrund anderer infektiöser Atemwegserkrankungen als COVID-19 durch die Anwendung verschiedener Tests, wobei in den meisten Fällen jeweils eine biologische Probe für den Test erforderlich ist. Daher ist die Identifizierung von Virusvarianten, die möglicherweise infektiöser sind, und die Identifizierung der richtigen Infektionskrankheit bei der getesteten Person kostspielig und zeitaufwändig. Letzteres zeigt, dass ein Bedarf an einer Nachweisplattform besteht, die die verschiedenen SARS-CoV-2-Varianten und mehrere Erreger von Atemwegserkrankungen nachweisen und unterscheiden kann, um eine differenzierte Diagnose von infektiösen Atemwegserkrankungen zu ermöglichen.
Die derzeitigen Testmethoden haben einen Engpass bei der Untersuchung und Rückverfolgung von Infektionsfällen aufgedeckt, da sie nur eine analoge Verfolgung der Ergebnisse ermöglichen. Mit anderen Worten, die Bewertung der diagnostischen Testergebnisse und die Rückverfolgung von Kontakten erfolgen manuell von Ärzten oder anderem hochqualifiziertem Personal, was die Test-, Rückverfolgungs- und Isolierungsmaßnahmen zur Bekämpfung der Pandemie erschwert und begrenzt. Angesichts der laufenden Pandemie und der Vorhersage des Ausbruchs künftiger Pandemien ist die einfache, schnelle, genaue und quantitative Identifizierung neu auftretender Krankheitserreger, sowie die Möglichkeit der Bereitstellung digitaler Ergebnisse für eine einfachere epidemiologische Überwachung nach wie vor eine Herausforderung. Die Unterscheidung zwischen COVID-19 und anderen Erregern von Atemwegserkrankungen kann die schnelle und genaue Diagnose, Behandlung und Isolierung von Patienten erleichtern und wird zunehmend an Bedeutung gewinnen, da SARS-CoV-2 in vielen Gebieten endemisch wird.
Es gibt aktuell keine Methoden bzw. Sensorplattformen, welche die Detektion von Malaria und Sars-CoV-2, ermöglichen bzw. schnell und effektiv auf das jeweils andere angepasst werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, verbesserte Sensoren für Biomarker, insbesondere Malaria-Biomarker, SARS-CoV-2-Biomarker und Biomarker andere Atemwegserkrankungen zur Verfügung zu stellen. Diese Sensoren sollen eine gute thermische und chemische Stabilität aufweisen, kostengünstig herzustellen sein, und hohe Genauigkeit für die zu untersuchende(n) Spezies aufweisen.
Zudem soll eine verbesserte Nachweistechnologie für quantitative Multi-Target - Schnelltests für den Nachweis verschiedener infektiöser Atemwegserkrankungen zur Verfügung gestellt werden. So soll nicht nur der Nachweis des SARS-CoV-2-Virus, sondern auch der gemeinsame Nachweis und die Unterscheidung anderer Viruserkrankungen mit ähnlichen Symptomen wie COVID-19, z. B. Influenzavirus, humanes respiratorisches Synzytialvirus sowie Varianten von SARS und MERS ermöglicht werden.
Weitere Aufgabenstellungen ergeben sich für den Fachmann bei Betrachtung der nachfolgenden Beschreibung und der Ansprüche.
Diese und weitere Aufgaben, die sich dem Fachmann bei Betrachtung der vorliegenden Beschreibung erschließen, werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen dargestellten Gegenstände gelöst.
Besonders vorteilhafte und bevorzugte Gegenstände ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet Raumtemperatur eine Temperatur von 293,15 Kelvin, d.h. 20°C.
Soweit nicht weiter ausgeführt herrscht bei allen Reaktionen und Vorgehensweisen Atmosphärendruck (1013 mbarabsoiut) und Raumtemperatur.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe Biomarkersensor, Multiziel-Aptasensor, flex-MEA-Multiziel-Aptasensor, flex-MEA-Multiziel-Apta-Sensor, flex-MEA-Chip bzw. MEA-Chip synonym für den erfindungsgemäßen Biomarkersensor verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Biomarkersensor mit Multielektrodenfeld-Struktur umfassend ein Trägersubstrat, auf dem mindestens zwei separate Elektrodensets angeordnet sind und jedes Elektrodenset eine Elektrode oder mehrere Elektroden aufweist.
Dabei ist jedes Elektrodenset in der folgenden Reihenfolge unterteilt in i) eine Inkubationszone, in der mindestens ein, bevorzugt genau ein, spezifisches Aptamer an die eine Elektrode oder die mehreren Elektroden gebunden ist, ii) eine Passivierungszone, in der eine Passivierungsschicht die eine Elektrode oder die mehreren Elektroden überdeckt, iii) eine Kontaktzone, in der die eine Elektrode konfiguriert ist oder die mehreren Elektroden konfiguriert sind, elektrisch kontaktiert zu werden. Wesentliches Merkmal dieser Biomarkersensoren ist dabei, dass die Inkubationszonen der einzelnen Elektrodensets oder die Inkubationszonen und ein Teil von bis zu 95% der Länge der Passivierungszonen der einzelnen Elektrodensets beweglich, jeweils unabhängig von denen der anderen Elektrodensets, ausgeführt sind, und dass die Kontaktzonen der einzelnen Elektrodensets zusammen eine gemeinsame Kontaktzone bilden.
Dabei umfassen die einzelnen, beweglichen Teile der jeweiligen Elektrodensets selbstverständlich auch das Trägersubstrat auf dem sie angeordnet sind.
Die Elektroden sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung in ihrer genauen Ausführung nicht beschränkt, sondern können übliche, fachbekannte Ausgestaltungen aufweisen. Die Elektrode an sich, kann in bevorzugten Ausführungsformen eine auf oder aus einem Substrat geätzte Leiterbahn sein oder ein Draht, besonders bevorzugt ist eine Leiterbahn, insbesondere eine durch Lithographie hergestellte. Der Bereich der Elektrode, an den die Aptamere gebunden werden kann dabei verschiedene Strukturen aufweisen, es ist lediglich notwendig, dass die resultierende Oberfläche dieses Elektrodenbereichs ausreichend ist, die gewünschte beziehungsweise notwendige Menge Aptamer zu binden. In bevorzugten Ausführungsformen ist dieser Teil der Elektrode, der auch Aptamerkontaktbereich oder genannt wird, kammförmig, doppelkammförmig oder quadratisch, besonders bevorzugt quadratisch, ausgestaltet. Dieser (Kontakt-)Bereich der Elektrode kann auch als aptamerbelegter Elektrodenkontakt beziehungsweise Elektrodenkontakt für Aptamerbelegung bezeichnet werden.
Die Inkubationszonen sind der Bereich, in mit welchem die Elektroden beziehungsweise Elektrodensets in Aptamerlösungen getaucht werden, um die Aptamere an die Elektrode zu binden. In manchen Ausführungsformen umfasst der Bereich noch etwas mehr Fläche, um zwischen Aptamerlösungsoberfläche und Chip Platz zu lassen und den Chip nicht versehentlich an Stellen zu benetzen, wo dies gar nicht gewollt ist.
Die Beweglichkeit der einzelnen Elektrodensets kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung über verschiedene Wege erreicht werden. Eine Möglichkeit ist es, an einem Grundsubstrat verschiedene weitere Teile anzubringen, und diese über Gelenke zu verbinden. Ein weiterer, erfindungsgemäß bevorzugter, Weg ist es, dass Trägersubstrat aus einem flexiblen Material herzustellen, wodurch dann die einzelnen Elektrodensets aufgrund der Flexibilität des Substrates unabhängig voneinander beweglich sind.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, wenn das Trägersubstrat ein Material ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenterephthalat (PET), Polyethylennaphthalat (PEN), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polyimid, Polyester und Agarose, bevorzugt Polyethylenterephthalat, oder Polyethylennaphthalat, besonders bevorzugt Polyethylenterephthalat. Diese Materialien zeichnen sich unter anderem dadurch aus, dass sie flexibel, also biegbar sind, ohne dabei zu zerbrechen, und dass sie gegenüber den bei der Herstellung der Biomarkersensoren verwendeten Chemikalien inert sind.
Flexible Materialien im Rahmen der vorliegenden Erfindung halten eine, bevorzugt auch mehrfache, Verbiegung und Zurückbiegung in die Ausgangsposition um 90°, bevorzugt bei einem Krümmungsradius von 2 mm bis 10 mm, insbesondere 3 mm bis 5 mm, aus, ohne dabei zu brechen. Dies gilt insbesondere für eine Schichtdicke des flexiblen Materials zwischen 30 pm und 1000 pm, bevorzugt 75 pm bis 200 pm und besonders bevorzugt zwischen 80 pm und 150 pm, wobei Materialstärken von 100 pm in einzelnen Ausführungsformen höchst bevorzugt sind.
Flexible Materialien weisen in weiter bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bei einem Krümmungsradius (r) von 4 mm eine laterale Dehnung (Epsilon - £) von 0.01 und eine Verbiegung von 47% auf.
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung weist das Trägersubstrat Schichtdicken zwischen 50 pm und 300 pm, bevorzugt 75 pm bis 200 pm und besonders bevorzugt zwischen 80 pm und 150 pm, wobei Materialstärken von 100 pm in einzelnen Ausführungsformen höchst bevorzugt sind.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst als Trägersubstrat eine Polyethylenterephthalat-Folie mit einer Dicke zwischen 80 pm und 150 pm, insbesondere 100 pm.
In besonderen bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung weist der Biomarkersensor zwei, drei oder vier, bevorzugt drei oder vier separate Elektrodensets auf, bevorzugt mit jeweils mindestens zwei Elektroden, besonders bevorzugt mit jeweils mindestens vier Elektroden, wobei die Elektroden bevorzugt aus Edelmetall oder Kohlenstoff, besonders bevorzugt Gold oder einer Goldlegierung, ganz besonders bevorzugt Gold, sind.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung werden die Aptamere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2008s-Aptamer, 2106s-Aptamer, pLl-Aptamer, LDHpll-Aptamer und Kombinationen davon oder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5-Aptamer, C7-Aptamer, C9-Aptamer, Cll-Aptamer, C15- Aptamer oder Il-Aptamer, IHl-Aptamer, SGl-Aptamer, HCSl-Aptamer, NGl-Aptamer und Kombinationen davon (das C7-Aptamer bindet an das Spikeprotein des SARS- CoV-2-Virus (alle Varianten), C5-Aptamer bindet an das Spikeprotein der delta- Variante, C9-Aptamer bindet an das Spikeprotein der alpha-Variante, Il-Aptamer bindet an das HAl-Protein des Influenza-Virus, C15 Aptamer bindet an Spike Protein SARS-CoV-2 omicron (B.1.1.529), SGI Aptamer bindet an das Glycoprotein G des humanen respiratorischen Synzytial-Virus, HCS1 Aptamer bindet an das HCoV Spike- Protein, NGl Aptamer bindet an das Glycoprotein G des Nipah-Virus).
Im Hinblick auf die immer neuen Mutationen des SARS-CoV-2-Virus ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung dabei höchst bevorzugt, ein Aptamer zu verwenden, dass auf die jeweils zu untersuchende Virus-Variante passt. Insofern sind auch solche Aptamere von der vorliegenden Erfindung umfasst, die an Spikeproteine von mutierten SARS-CoV-2-Viren binden (deren genaue Bezeichnung aktuelle natürlich noch nicht bekannt ist).
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung sind in jedem Elektrodenset andere Aptamere oder Aptamermischungen gebunden, bevorzugt in einem ersten Elektrodenset 2008s-Aptamer und in einem zweiten Elektrodenset 2106s-Aptamer und in einem dritten Elektrodenset pLl-Aptamer und in einem vierten Elektrodenset LDHpll-Aptamer oder in einem ersten Elektrodenset C7-Aptamer und in einem zweiten Elektrodenset Il-Aptamer, oder in zumindest mindestens zwei Elektrodensets Aptamere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5-Aptamer, C7- Aptamer, C9-Aptamer, Cll-Aptamer, C15-Aptamer oder Il-Aptamer, IHl-Aptamer, SGl-Aptamer, HCSl-Aptamer, NGl-Aptamer und Kombinationen davon.
In besonderen bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung kann der Biomarkersensor zusätzlich in seiner Ausgestaltung im Hinblick auf weitere Elektroden variiert werden. Der Biomarkersensor kann zusätzlich i) insgesamt eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode, ii) insgesamt eine Referenzelektrode, eine Gegenelektrode, und ein Widerstandsthermometer, iii) pro Elektrodenset eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode, oder iv) pro Elektrodenset eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode und insgesamt ein Widerstandsthermometer aufweisen.
Diese Aufzählung bedeutet dabei nicht, dass das Widerstandsthermometer die einzige Möglichkeit ist, neben Referenz- und Gegenelektrode eingesetzt zu werden; es ist selbstverständlich möglich, dieses Gerät durch andere zu ersetzen. In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können dies Feuchtigkeitssensoren, Biegesensoren, Deformationssensoren, pH-Sensoren sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausgestaltung mit einem flexiblen Trägersubstrat hergestellte Multielektrodenfeld-Chips (flex-MEA-Chips).
Das Material des Trägersubstrats wird bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenterephthalat (PET), Polyethylennaphthalat (PEN), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polyimid, Polyester und Agarose, bevorzugt Polyethylenterephthalat oder Polyethylennaphthalat, besonders bevorzugt Polyethylenterephthalat.
Die Multielektrodenfelder werden in einer bevorzugten Ausgestaltung durch nasschemisches Ätzen strukturiert. Ein in bevorzugten Ausgestaltungen eingesetzter Schablonenpassivierungsprozess erlaubt die teilweise Passivierung der leitfähigen Bahnen auf den Elektroden mit geringeren Kosten verglichen mit Standardlithographie-Passivierung. Es wird in bevorzugten Ausgestaltungen zur Herstellung der Passivierungsschicht ein günstiges Verfahren, genannt „Schablonenpassivierung", unter Verwendung von Parylen C zur Bildung der Passivierungsschicht (Schutzschicht über den Elektrodenleitungen) eingesetzt. Dieses Verfahren kostet etwa die Hälfte im Vergleich zu einer Standard-Lithographie- Passivierung.
Die Elektrodenfelder der vorliegenden Erfindung sind in verschiedene Elektrodensets aufgeteilt, in einer bevorzugten Ausgestaltung jeweils durch einen freien Streifen voneinander getrennt. Das flexible Substrat (Polymer) wird in einer erfindungsgemäß bevorzugten Variante durchschnitten, was es erlaubt, die Elektrodenuntergruppen (Elektrodensets) unabhängig voneinander zu biegen, ohne dass diese von dem Chip separiert werden (abbrechen). Die Ausgestaltung auf Basis eines flexiblen Substrats ermöglicht somit die Inkubation von verschiedenen Elektrodensätzen mit verschiedenen Aptamerlösungen zur einfachen Realisierung der Immobilisierung von verschiedenen Aptameren für die Herstellung von Aptasensoren mit multiplen Rezeptoren. Es können in dieser Ausgestaltung einfach die verschiedenen Elektronensets einzeln jeweils wie Finger nach unten gebogen und in Aptamerlösungen getaucht werden.
Es ist ein erheblicher Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass auf diese Art und Weise verschiedene Aptamere auf einem Sensor mit geringem Aufwand aufgebracht werden können.
Die Biomarkersensoren der vorliegenden Erfindung können mithin illustrativ mit einer Hand verglichen werden, wobei die einzelnen Finger die einzelnen Elektrodensets darstellen; aufgrund der Beweglichkeit der einzelnen Finger können diese einzeln gebogen und damit einzeln und unabhängig voneinander in Aptamerlösungen getaucht und mit Aptamer inkubiert werden.
Die Elektrodensets sind in einer bevorzugten Ausgestaltung mit verschiedenen Molekülen modifiziert, wobei dies Rezeptoren sein können, die auf den Gleichen oder verschiedene Analyten abzielen.
Es ist in einer bevorzugten Ausgestaltung ebenfalls möglich, statt der gewünschten Aptamere auf einzelne oder mehrere Elektrodensets andere Moleküle als Passivierungsmoleküle oder Rezeptoren ohne Bindungsaffinität aufzubringen. Elektroden, die mit diesen Molekülen modifiziert sind, werden als Kontrollsensoren verwendet. Dies ist Gegenstand einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin kann das Elektrodenfeld in einer bevorzugten Ausgestaltung Referenzelektroden, Gegenelektroden und Widerstandsthermometer aufweisen.
Das Substrat der individuellen Elektrodensets kann in einer bevorzugten Ausgestaltung an der Inkubationsseite spitz zulaufend ausgestaltet sein, um die Einführung in ein Inkubationsgefäß zu erleichtern. Ein Chip kann zwei oder mehrere Elektrodensets umfassen. Jedes Elektrodenset kann aus zwei oder mehr individuell elektrisch ansprechbaren Elektroden bestehen. Die erfindungsgemäßen Biomarkersensoren sind nicht auf die Detektion von Malaria oder SARS-Cov-2-Viren beschränkt. Entsprechend sind in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Aptamere keine auf Malariabiomarker oder SARS-Cov-2-Biomarker gerichteten Aptamere.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Biomarkersensoren, insbesondere wie oben beschrieben, umfassend die folgenden Schritte
I) Bereitstellung eines Trägersubstrats, bevorzugt eines flexiblen Trägersubstrats,
II) Aufbringung einer Schicht aus Elektrodenmaterial auf das Substrat,
III) Strukturierung des Elektrodenmaterials zu einzelnen Elektroden,
IV) Passivierung eines zwischen den Enden befindlichen Teils des
Elektrodenmaterials,
V) Unterteilung der Elektroden in eine Anzahl an Elektrodensets,
VI) Inkubierung eines Endes der jeweiligen Elektrodensets, des Aptamerkontaktbereichs, in Aptamerlösung.
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung wird die Schicht aus Elektrodenmaterial mittels physikalischer Gasphasenabscheidung, bevorzugt mittels Elektronenstrahl-unterstützter physikalischer Gasphasenabscheidung, auf das Substrat aufgebracht, besonders bevorzugt nach vorheriger Aufbringung einer Adhäsionsschicht.
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung wird in Schritt III) zuerst ein Fotolack, bevorzugt ein positiver Fotolack, auf das Elektrodenmaterial aufgebracht, aus diesem wird dann durch belichten und entwickeln eine Maske mit der gewünschten Musterung der Meta II Strukturen erzeugt. Anschließend wird in diesen Ausgestaltungen mittels eines nasschemischen Ätzschritts das nicht benötigte Material der Adhäsionsschicht und der Elektrodenschicht und danach der Fotolack wieder entfernt.
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Passivierung in Schritt IV) mittels Schablonenpassivierung, wobei zunächst eine Schablone, bevorzugt eine Polymerschablone, besonders bevorzugt hergestellt unter Verwendung einer Laserschneidemaschine, auf die Oberfläche der Elektroden platziert wird, und dann die leitenden Zuleitungen der Elektroden mittels chemischer Gasphasenabscheidung (CVD) partiell passiviert werden, bevorzugt mit einem Parylen-C-Polymer.
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Unterteilung in Schritt V) durch einschneiden des Substrates, bevorzugt dergestalt, dass die Gesamtzahl der Elektroden gleichmäßig auf die resultierenden Elektrodensets verteilt ist. Selbstverständlich ist bei diesem Schritt darauf zu achten, dass die zuvor hergestellten Elektrodenstrukturen durch das unterteilen/einschneiden nicht beschädigt oder zerstört werden. Es ist aber ebenso möglich, ein Substrat zur Verfügung zu stellen, dass bereits entsprechend unterteilt ist. Bei Substraten auf Polymerbasis kann dieses beispielsweise dadurch geschehen, dass das Polymer in einer entsprechenden Form hergestellt wird.
Ein solches bereits vor-unterteiltes Trägersubstrat stellt eine bevorzugte Ausführungsform für die erfindungsgemäßen Biomarkersensoren und die erfindungsgemäßen Verfahren dar.
In Zusammenhang damit steht ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung von Biomarkern in Körperflüssigkeiten, bevorzugt in Blutproben. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte oder besteht aus den folgenden Schritten i) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Biomarkersensors, oder eines Biomarkersensors, der mit dem erfindungsgemäß Verfahren hergestellt wurde, ii) Aufbringen einer Körperflüssigkeitsprobe auf den Biomarkersensor, iii) Verbinden des Biomarkersensors mit einer Messvorrichtung für Strom
Spannung, Widerstand oder Frequenz, iv) Detektion des Messsignals und Ausgabe der Messwerte durch die
Messvorrichtung, v) Analyse der Messwerte, bevorzugt mittels Computern, transportablem
Lesegerät, bevorzugt mittels Software und/oder Kalibrierdaten. vi) optional Speichern, Übertragen und/oder Anzeigen der analysierten Ergebnisse.
Die zu den erfindungsgemäßen Biomarkersensoren gemachten Ausführungen hinsichtlich der einsetzbaren Materialien etc. sind auch die erfindungsgemäßen Verfahren anwendbar. D.h. bei den erfindungsgemäßen Verfahren können in bevorzugten Ausgestaltungen auch die gleichen Materialien in den gleichen Dimensionen verwendet werden, wie bei den erfindungsgemäßen Biomarkersensoren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in bevorzugten Ausgestaltungen
Verfahren zur Herstellung von Biomarkersensoren wie oben dargestellt, bevorzugt flexiblen Gold-Multielektrodenfeldchips, sowie einer Schablonenpassivierungsschicht: a) In bevorzugten Ausgestaltungen wird eine Elektrodenstrahl-unterstützte physikalische Gasphasenabscheidung verwendet, um zunächst Adhäsionsschicht auf dem flexiblen Substrat, das bevorzugt eine
Polyethylenterephthalat-Folie ist, abzuscheiden. Dies ist bevorzugt Titan- Adhäsionsschicht, in besonderen Fällen eine 5 nm Titan-Adhäsionsschicht. Anschließend wird dann über das gleiche Verfahren eine Schicht eines leitenden Metalls als Elektrodenschicht abgeschieden, bevorzugt ist dies eine Goldschicht, in besonderen Fällen eine 50-nm Gold-Schicht. b) Ein positiver Fotolack, der in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf Novolakharz und Naphthochinondiazid als photoaktiver Substanz basieren kann (ein Beispiel hierfür ist AZ 5214 E der Microchemicals GmbH, Ulm, Deutschland), wird in bevorzugten Ausgestaltungen als Maske für die folgende Musterung der Metallstrukturen verwendet und die Bereiche in denen die Metallschichten verbleiben sollen belichtet. Anschließend kann der Lack in einem Entwickler entwickelt werden. Dies kann in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Entwickler auf Basis von Tetramethylammoniumhydroxid in H2O sein (ein Beispiel hierfür ist AZ 326 MIF der Microchemicals GmbH, Ulm, Deutschland) und in manchen Varianten für beispielsweise 70 Sekunden erfolgen. c) Ein nasschemischer Ätzschritt wird dann in bevorzugten Ausgestaltungen durchgeführt, um Überschüsse der abgeschiedenen Elektrodenschichten, die nicht der gewollten Musterung entsprechen, zu entfernen; in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann dabei eine Ätzlösung auf Kaliumiodidbasis eingesetzt werden (ein Beispiel hierfür ist TechniEtch ACI2, Microchemicals GmbH, Ulm, Germany). d) Die anschließende Fotolackentfernung, zur Entfernung der Ätzmaske, wird in bevorzugten Ausgestaltungen durch Eintauchen des die gemusterten Elektroden umfassenden PET-Substrats in einen Fotolackentferner, der bevorzugt auf organischem Lösungsmittel wie Aceton, NMP oder DMSO gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem Amin, insbesondere Ethanolamin, basiert, besonders bevorzugt AZ 100-Entferner (Microchemicals GmbH, Ulm, Germany), erreicht, insbesondere bevorzugt im Ultraschallbad für 10 Minuten, gefolgt von Spülung mit Isopropanol und entionisiertem Wasser. e) Für die partielle Passivierung der leitenden Zuleitungen, wird in bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung eine Prozedur namens Schablonenpassivierung eingesetzt. Die Polymerschablone wird bevorzugt unter Verwendung einer Laserschneidemaschine hergestellt und auf die Oberfläche der Elektroden platziert. Anschließend werden die nicht abgedeckten Bereiche der leitenden Zuleitungen der Elektroden passiviert. In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Passivierung mittels chemischer Gasphasenabscheidung (CVD), besonders bevorzugt erfolgt die Passivierung mit einem Parylen-C-Polymer, Epoxy- basierten (negativ-)Photolacken (wie SU-8 der Firma Microchem Corp.) oder (positiven) Polyimid-Lacken (wie HD 8820 der Firma HD-Microsystems). In einigen bevorzugten Ausgestaltungen kann eine Niedrigdruck-chemischer Gasphasenabscheidung angewandt werden. Passivierung bedeutet mithin im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Überdeckung bzw. Abdeckung eines Teils der Elektrodenleitungen, welcher bei den fertigen Sensoren nicht zugänglich sein soll. Dies sind also die Teile zwischen dem Bereich wo die Aptamere binden sollen und dem Bereich, wo die Verschaltung des Sensors mit Messgeräten erfolgt. f) In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hat jeder flexible Polymerchip eine Größe von 10,5 mm x 15,8 mm, mit 16 individuell ansprechbaren Elektroden. Jede quadratförmige Elektrode mit einer Größe von 550 pm x 550 pm ist auf der sogenannten Inkubationsseite des Sensors (der Inkubationszone) angeordnet, was als Basis für den flex-MEA dient. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hat jeder flexible Polymerchip eine Größe von 10,5 mm x 24,13 mm, mit 16 individuell ansprechbaren Elektroden, in weiteren Varianten auch eine Größe von 10,5 mm x 21,5 mm und/oder mit 20 individuell ansprechbaren Elektroden. Jede quadratförmige Elektrode mit einer Größe von 550 pm x 550 pm ist auf der sogenannten Inkubationsseite des Sensors (der Inkubationszone) angeordnet, was als Basis für den flex-MEA dient.
Die Leiterbahnen der einzelnen Elektroden können dabei in bevorzugten Ausführungsformen von der Seite ihrer elektrischen Kontaktierung bis zu ihrem mit Aptamer zu belegenden Ende in ihrem Durchmesser variiert werden, bevorzugt graduell enger werdend. Die Dimensionen des Chips können in anderen bevorzugten Ausgestaltungen jedoch auch kleiner oder größer sein, abhängig von der jeweiligen Anwendung.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Bestimmung einer Malariainfektion und des Prozentsatzes an Parasitämie in Plasmodium falciparum parasitierten Blutproben unter Verwendung der erfindungsgemäßen Biomarkersensoren. Andere bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Bestimmung einer COVID-19-Infektion und gegebenenfalls begleitend der Viruslast in Schleimproben, insbesondere aus Mund und Nase, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Biomarkersensoren, wobei die Schleimproben gegebenenfalls zur Verbesserung der Handhabbarkeit mit definierten Mengen Pufferlösung verdünnt werden können.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung lässt sich wie folgt beschreiben:
Die Biofunktionalisierung des flex-MEA-Multiziel-Apta-Sensors wird in besonders bevorzugten Ausgestaltungen durch Inkubationen über Nacht (16 Stunden) der verschiedenen erstellten Elektrodensets in verschiedenen zuvor aktivierten Aptamer- Lösungen mit Konzentrationen von 0,5 pM für 2008s, pLl, 2106s sowie 0,03 pM für LDHpll realisiert.
Es ist in bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung möglich, eine Aktivierung der Aptamere, für deren Immobilisierung auf der Goldelektrodenoberfläche, vorzunehmen; dies wird insbesondere bevorzugt durch deren Inkubation in 10 mM TCEP-Lösung für 1 Stunde erreicht.
Dann kann mehrfaches Waschen mit Tris-Puffer und nachfolgend mit entionisiertem Wasser folgen.
In bevorzugten Ausgestaltungen erfolgt anschließend ein Blockieren unter Verwendung von 5 mg/ml PEG-Lösung für 7 Stunden, gefolgt von mehrfachem Waschen mit Tris-Puffer.
In einigen bevorzugten Ausgestaltungen wird dann der Multiziel-Aptasensor mit lysierter Plasmodium falciparum- Parasitenprobe für 45 Minuten inkubiert und anschließend mit Tris-Puffer gewaschen.
Die elektrochemische Signaldetektion erfolgt in bevorzugten Ausgestaltungen mit einem Potentiostaten mittels Differentialpulsvoltametrie-(DPV)-Messungen, wobei die DPV-Messungen insbesondere in Redoxspezies-Lösung (5 mM [Fe(CN)6]3 /4 in 25 mM Tris-Puffer) durchgeführt werden.
In diesem Zusammenhang können in bevorzugten Ausgestaltungen die erhaltenen Mittelwerte der Redoxstromänderung nach der Zieldetektion verschiedener Elektroden mittels statistischer Analyse mit Hilfe von statistischer Analysesoftware ausgewertet werden. Die hierzu einsetzbare Software ist ebenfalls nicht auf eine bestimmte beschränkt.
Eine andere besonders bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung lässt sich genauso wie eben dargestellt beschreiben, mit dem Unterschied, dass C5- Aptamere, C7-Aptamere, C9-Aptamere, Cll-Aptamere, C15-Aptamere und/oder II- Aptamere, bevorzugt C7-Aptamere und C15-Aptamere, insbesondere C7-Aptamere, eingesetzt werden.
Die als bevorzugte Ausführungsform genannte Dicke der Gold- und Titanmetallschichten sind nicht beschränkend zu verstehen. Im Gegenteil, im Rahmen der vorliegenden Erfindung diese Schichten von beliebiger anderer Dicke sein; abhängig von der genauen Anwendung werden die Schichtdicken in bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung dünner oder dicker sein.
Das Elektrodenmaterial ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht auf das als bevorzugte Ausführungsform beschriebene Gold beschränkt, es kann breit variiert werden, solange eine ausreichende Leitfähigkeit der Elektroden gewährleistet ist und eine ausreichende Fähigkeit zur Adsorption der Aptamere, gegebenenfalls nach vorheriger Aktivierung, gegeben ist. Beispiele für andere erfindungsgemäß bevorzugte Elektrodenmaterialien sind Kohlenstoff, Platin oder Polymer/Metall/Kohlenstoff- Komposite (Polymer bedeutet hierbei leitfähige Polymere z.B. PEDOT:PSS (Poly(3,4- EthyleneDiOxyThiophene) PolyStyrene Sulfonate)).
Die Musterung der Meta II Strukturen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls nicht auf das als bevorzugte Ausführungsform beschriebene nasschemische Ätzen beschränkt. Eine andere bevorzugte Ausgestaltung ist ein fachbekannter Abhebevorgang.
Die Entfernung des Photolacks kann mit jeder beliebigen Photolackentfernungslösung erfolgen und nicht nur mit den als bevorzugten Ausführungsformen beschriebenen. Die Dimensionen der Zuleitungen und Elektroden können von jeder beliebigen Größe sein; sie sind lediglich an die genaue Anwendungssituation anzupassen.
Es kann in bevorzugten Ausgestaltungen ebenfalls die Integration einer Referenz- und einer Gegenelektrode in dem gleichen Chipdesign beinhaltet sein.
Das in bevorzugten Ausgestaltungen eingesetzte Widerstandsthermometer (RTD) ist nicht auf ein spezifisches Design, eine spezifische Größe oder einen spezifischen Widerstandswert beschränkt.
Die für die Passivierung hergestellte Schablone kann aus jedem beliebigen Material und von jeder beliebigen Form sein, welche die geplante Passivierungsfläche bedeckt; seine Herstellung ist nicht auf die als bevorzugte Ausführungsform beschriebene Verwendung einer Laserschneidemaschine beschränkt.
Die als bevorzugte Ausführungsform beschriebene Schablonenpassivierung ist zudem nicht das einzige Verfahren zur Passivierung der leitenden Zuleitungen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können andere Polymere oder Isoliermaterialien als Passivierungsschichten verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Materialien sind Polyimide, Epoxid-basierte Negativ-Fotolacke (wie z.B. SU-8 der Firma Microchem Corp.).
In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung werden die Aptamerrezeptoren derart ausgesucht, dass sie an verschiedene Epitope desselben Biomarkers und/oder an andere Biomarker binden, die indikativ für die gleiche Krankheit sind und/oder an ein Agens, das mit der Bindung an die Biomarker interferiert (möglicherweise falsche positive Resultate hervorrufend).
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung werden die Ausgaben der mit verschiedenen Rezeptoren behandelten Sensoren analysiert, indem sie mit Logikgattern kombiniert werden, was unzweideutige Testresultate ermöglicht. In noch weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung werden die Ausgaben von verschiedenen Sensoren, die mit dem gleichen Rezeptor behandelt sind, gemittelt, um die Redundanz zu erhöhen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist das oben als bevorzugte beschriebene Verfahren, in welchem verschiedene hergestellte Elektrodensets mit den verschiedenen Aptamerlösungen inkubiert werden, nicht der einzige Weg, um verschiedene Aptamere zu immobilisieren. Dies kann in anderen bevorzugten Ausgestaltungen durch viele andere Verfahren, wie insbesondere elektrochemisches Molekülstripping, Drucken, Spotten oder Lithographie erreicht werden. Die Aptamere können an der Elektrode über Monothiolbindung oder über Multithiolbindungen oder über andere kovalente Bindungen verankert sein.
Die als besonders bevorzugt genannten spezifischen Konzentrationen und spezifische Aptamere für die Herstellung der Multiziel-Aptasensoren der vorliegenden Erfindung können in andern Variante der vorliegenden Erfindung auf jegliche Konzentration und jegliche unterschiedliche Art von Aptamerrezeptoren, die auf jeden beliebigen anderen Biomarker zielen, ausgedehnt werden. Zudem kann die Inkubationszeit für die Aptamerimmobilisierung variiert werden. Der Multiziel-Aptasensor der vorliegenden Erfindung kann auf die Immobilisierung von wenigstens zwei verschiedenen Aptamerrezeptoren angewendet werden und ist nicht auf eine maximale Anzahl an Rezeptormolekülen limitiert.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können zur Erhöhung des elektrochemischen Signals mit katalytisch aktiven Einheiten modifizierte Aptamerrezeptoren (Detektionsaptamere) (spezifisch für den korrespondierenden Analyten) zu der Analytenprobe zugegeben werden. In noch weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können diese katalytisch aktiven Spezies der Detektionsaptamere Enzyme, bevorzugt Meerrettichperoxidase, oder Nanopartikel, bevorzugt Platinnanopartikel, sein.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können zur Erhöhung der Dichte an Aptameren auf der Oberfläche der Elektroden leitfähige Polymere wie Poly(3,4-Ethylendioxythiophen)-Polystyrolsulfonat als eine Aptamer- einbettende Elektrodenbeschichtung eingesetzt werden. In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können hierfür leitfähige 3-D Scaffolds, d.h. Mikro- und Nanogerüste, die aus Metallen, Kohlenstoff und leitfähigen Polymeren hergestellt werden, eingesetzt werden. In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können anstelle der als bevorzugt beschriebenen Aptameraktivierung durch TCEP, die Aptamere auch auf andere Weise an der Elektrode verankert werden, besonders bevorzugt durch Oligonukleotide wie poly A oder mit anderer Sequenz, durch Diazonium- Kopplungsreaktion, durch EDC:NHS oder ähnliche Kopplungsreaktion, (3+2)- Zykloaddition zwischen Alkyn- und Azid-Gruppen oder eine andere Kopplungsreaktion basierend auf kovalenten oder elektrostatischen Bindungen.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können als Spülmedium bzw. Waschlösungsmittel Helix-Wasser, Leitungswasser, Trinkwasser oder jedes andere beliebige Lösungsmittel, das in der Lage ist, den Überschuss an Molekülen/biologischen Lösungen zu entfernen, eingesetzt werden.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können anstelle des oben in einer bevorzugten Variante dargestellten PEG auch andere Stoffe eingesetzt werden, um nicht spezifische Bindungen an die Elektrode zu verhindern. In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können dies Alkanthiole unterschiedlicher Terminierung und Länge, BSA (Rinderserumalbumin), HSA (humanes Serumalbumin) oder ähnliches, Betaine oder Oligosaccharide unterschiedlicher Terminierung, Seitenketten und Längen sein.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung kann die Inkubationszeit des Sensors mit der Analytenprobe breit variiert werden und richtet sich nach den spezifischen Rahmenbedingungen des genauen Einzelfalls, insbesondere auch abhängig von der Bindungskonstante der Bindung der Aptamere an den entsprechenden Analyten (und mithin beispielsweise auch abhängig von der Temperatur).
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können zur Reduzierung der Detektionszeit der Zielmoleküle mikrofluidische Kanäle auf der Oberfläche der Elektroden integriert werden.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung zum Erhalt von elektrischen Detektionssignale kann, neben Potentiostaten, im Prinzip jedes taugliche Gerät zur Generierung und Messung jedes beliebigen elektrischen/elektrochemischen Signals (Strom, Potential, Frequenz, etc.) mit dem erfindungsgemäßen Biomarkersensor gekoppelt werden. In bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung sind dies demgemäß transportable Lesegeräte, Bluetooth und/oder Wireless Transmitter.
In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung können einzelnen Elektroden jeweils eine Gegen- und eine Referenzelektrode zugeordnet sein. In diesen Ausgestaltungen sind die aptamerbelegten Elektrodenkontakte / Elektrodenkontakt für Aptamerbelegung in bevorzugten Ausführungsformen kammartig ausgeführt, besonders bevorzugt doppelt kammförmig, und die Gegenelektrode und die Referenzelektrode können den aptamerbelegten Bereich (mit Aptamer zu belegenden Bereich) der Messelektrode umschließen.
Weiterhin kann der Sensorchip der vorliegenden Erfindung auch mikrofluidische Kanäle umfassen, mittels derer die jeweilige Probe zu den Elektroden geleitet werden kann, wodurch die erforderliche Probenmenge verringert und die Detektionszeit reduziert werden kann. Solche mikrofluidischen Kanäle sind bevorzugt aus eine Polymer hergestellt, besonders bevorzugt aus einem Polymer welches einen Wasserkontaktwinkel von weniger als 90° aufweist.
Auf ähnliche Art und Weise können andere Aptamere, die Biomarker von verschiedenen SARS-CoV-2-Varianten oder von verschiedenen respiratorischen-Viren, die ähnliche Symptome wie COVID-19 hervorrufen, immobilisiert werden, um einen Multitarget-flexMEA-Biosensor für infektiöse respiratorische Viren herzustellen. Biomarker anderer Viren umfassen das Hämagglutinin-(HAl)-Protein des Influenza- Virus, das Glycoprotein G des HRS-Virus und das Spikeprotein des MERS-CoV (englisch: middle east respiratory syndrome-related Coronavirus).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können aufbauend auf dem erfindungsgemäßen Prinzip quasi beliebige krankheitsspezifische Biomarker detektiert werden, es ist dafür lediglich notwendig, dass dafür nötige Aptamere bekannt sind oder gefunden werden und auf Elektroden im Sinne der vorliegenden Erfindung anhaften können.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Biomarkersensor-Kits umfassend oder bestehend aus mindestens einem Biomarkersensor gemäß der vorliegenden Erfindung ohne dass bereits Aptamere gebunden sind, einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer, sowie optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Pipetten, Biosensorchips, transportable Lesegeräte, Chemikalien, Präparationsröhrchen (Eppendorf-Tubes) und ähnliches.
Im Zusammenhang mit dem Begriff „Kit" sei drauf hingewiesen, dass dieses Kit nicht zwangsweise für die „Hosentasche" geeignet sein muss. Vielmehr soll dadurch ausgedrückt werden, dass vor der Analyse sowohl der Biomarkersensor wie oben beschrieben als auch die Zubereitung umfassend das Biomarker-spezifische Aptamer getrennt voneinander vorliegen, obwohl sie aufeinander abgestimmt und zugehörig sind. Zudem soll das Kit auch mehrere Detektionssensoren und mehrere Aptamerzubereitungen, die auch für verschiedene Biomarker ausgeführt sind, umfassen können.
Obwohl bei dem Verfahren zur Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern gemäß vorliegender Erfindung die Körperflüssigkeit nicht auf eine spezielle Körperflüssigkeit beschränkt ist, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass er die Körperflüssigkeit danach auswählt, ob die von ihm gesuchten krankheitsspezifischen Biomarker in der jeweiligen Körperflüssigkeit Vorkommen.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn auf Malaria geprüft werden soll, handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Blutproben.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn auf respiratorische Infektionen wie COVID-19, Influenza bzw. MERS geprüft werden soll, handelt es sich bei der Körperflüssigkeit um Schleimproben, insbesondere aus Nase und/oder Rachen.
Die Körperflüssigkeiten können vor Einsatz in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung entsprechend den in der Fachwelt üblichen Verfahren aufgearbeitet bzw. vorbereitet werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung insbesondere dafür geeignet und dazu gedacht ist, Körperflüssigkeitsproben zu untersuchen, die bereits als solche vorliegen, d.h. die Entnahme von Körperflüssigkeiten ist nicht Teil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. In derselben Weise kann der erfindungsgemäße Biosensor als Technologieplattform für den Nachweis vieler unterschiedlicher Infektionserkrankungen hervorgerufen durch Viren, Bakterien, Pilze, oder Parasiten implementiert werden. Aber auch neurodegenerative Erkrankungen (Nachweis fehlgefalteter Proteine) und chronische Erkrankungen (Diabetes Melitus, kardiovaskulären Erkrankungen) können nachgewiesen bzw. überwacht werden.
Die vorliegende Erfindung kann insofern als technologische Plattform dienen, mit der saisonale infektiöse Krankheiten und Behandlungswirksamkeit beobachten werden können, und hat das Potential epidemiologische Überwachung aufgrund der Datentransferfähigkeiten zu ermöglichen.
Daher kann die vorliegende Erfindung ebenfalls als Basistechnologie für frühe Anwendung bei auftauchenden Krankheiten (emerging diseases) und der Verhinderung von zukünftigen Pandemien dienen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Verwendungen der erfindungsgemäßen Biomarkersensoren oder der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Biomarkersensoren, oder der erfindungsgemäßen Biomarkersensor-Kits zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern, bevorzugt Malaria-Biomarkern, besonders bevorzugt in Körperflüssigkeitsproben, insbesondere bevorzugt in Blutproben oder Schleimproben, wobei letztere bevorzugt aus Nase oder Rachen stammen.
Weiterhin finden die erfindungsgemäßen Biomarkersensoren Verwendung als Substrat in automatisierten Multititerplatten.
Insbesondere von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Verwendungen der erfindungsgemäßen Biosensoren, der erfindungsgemäß hergestellten Biomarkersensoren, oder der erfindungsgemäßen Biomarkersensor-Kits für die Bestimmung von Malaria-Biomarkern oder SARS-CoV-2-Biomarkern, besonders bevorzugt in Körperflüssigkeitsproben, insbesondere bevorzugt in Blutproben oder Schleimproben, letztere insbesondere aus Rachen- und/oder Nase, höchst bevorzugt als Substrat in automatisierten Multititerplatten oder in PoC-Geräten.
Der erfindungsgemäße Biosensor kann entsprechend auch insbesondere im Rahmen von Point-of-Care-Anwendungen bzw. PoC-Diagnosetests verwendet werden, für die selektive und empfindliche Detektion von infektiösen Atemwegskrankheiten, wobei die vorliegende Erfindung die Quantifizierung der viralen Last der Infektion, sofern eine festgestellt wird, bestimmt werden kann. Die Vorrichtung kann einfach von jedermann bedient werden, zum Beispiel zu Hause, in der Schule, in Krankenhäusern und so weiter. Die Vorrichtung umfasst in diesem Verwendungsfall einen Wegwerf-Chip, der mit einer Schleimprobe aus Nase oder Rachen eines Patienten getränkt wird und ein wiederbenutzbares tragbares Lesegerät, ähnlich wie dies von PoC-Glukosesensoren bekannt ist. Das Lesegerät kann die Daten von verschiedenen Tests verarbeiten und die Daten zum Beispiel via WiFi oder Bluetooth, aber auch kabelgebunden, übertragen, zum Beispiel an ein Smartphone, an den behandelnden Arzt, oder eine zentrale Gesundheitseinrichtung.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können dem Analyten nach Bindung des Biomarkers an die Sensoroberfläche zusätzliche Biomarker spezifische Aptamere, die mit katalytisch aktiven Gruppen modifiziert sind und das elektrochemische Signal verstärken, zugegeben werden.
Die Sensoren der vorliegenden Erfindung sind im Vergleich mit Antiköpersensoren weniger empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen wie Temperatur, Chemikalien, und Lagerungsdauer und zudem weniger teuer in der Herstellung. Gleichwohl können bei den Biosensoren der vorliegenden Erfindung die Auswertungen der Tests digital, qualitativ und quantitativ erfolgen. Mit den Sensoren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, mehrere Biomarker, insbesondere PfLDH-, PvLDH- und HRP-2, simultan zu analysieren und Plasmodium-Parasitenarten können unterschieden werden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass durch die Kombination der Signale von mehreren Elektrodensätzen für den Nachweis unterschiedlicher Biomarker die Unterscheidung der Parasitenspezies ermöglicht und die Redundanz des Infektionsnachweises erhöht wird.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass Chips mit kleinen Dimensionen gefertigt werden können und diese kleinen Dimensionen des Chips und der Elektroden die Analyse kleiner Blutprobenvolumina ermöglichen. Zudem ist es vorteilhaft, dass das Probenvolumen durch Verwendung von mikrofluidischen Kanälen weiter reduziert werden kann. Zudem ist es ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass im Gegensatz zu den bisherigen Diagnosetests eine Digitalisierung ganz einfach möglich ist und somit durch die vorliegende Erfindung eine (angemessene) epidemiologische Überwachung der/durch die ermittelten Sensordaten möglich wird/ist. Denn durch die elektronische Verbindung der Sensoren und die elektronische Erfassung der Messdaten sind diese leicht aufarbeitbar und verarbeitbar.
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Die Figuren sind dabei nicht unbedingt maßstabsgetreu und vereinfacht. So sind übliche, dem Fachmann geläufige Maßnahmen etc. nicht unbedingt dargestellt (Verschaltung, Wände, genaue Molekülstruktur etc.), um die Lesbarkeit der Figuren zu erleichtern.
Figurenbeschreibung:
Figur la) ist eine Aufsicht auf einen Biomarkersensor/ein flex-MEA-Layout 1 gemäß vorliegender Erfindung. Die doppelt gestrichelten Linien 4 repräsentieren die Schnittstreifen 3 entlang derer die Unterteilung des ursprünglich nicht unterteilten Werkstücks mittels Schneidens erfolgte. Diese Schnittstreifen 4 teilen das Elektrodenfeld in verschiedenen Elektrodensets ES-1 bis ES-4 auf, wodurch die Immobilisation von verschiedenen Aptameren je Elektrodenset erleichtert wird. Die Inkubationsseite/Inkubationszone I, Passivierungsfläche/Passivierungszone P und die Kontaktfeldfläche/Kontaktzone K sind ebenfalls angedeutet. Die Inkubationszone I ist der Bereich, mit dem die verschiedenen Elektronensets ES-1 bis ES-4 in die jeweiligen Aptamerlösungen inkubiert werden, um die Aptamere auf den Elektrodenkontakten 3 zu fixieren. Dazu können die verschiedenen Elektronensets ES-1 bis ES-4, aufgrund des flexiblen Substrates, unabhängig voneinander gebogen werden, um diese einzeln zu inkubieren. Ebenfalls in der Figur zu sehen ist die Passivierungszone P, in welcher die Leiterbahnen der jeweiligen Elektroden von einer Passivierungsschicht, bevorzugt aus Parylen-C-Polymer, überdeckt und geschützt sind. In der Kontaktzone K werden die jeweiligen Elektroden bzw. der Sensor elektrisch kontaktiert und mit Messgeräten, wie bevorzugt Potentiostaten verbunden.
Figur lb) ist eine Seitenansicht des in Figur la) dargestellten flex-MEA-Chips 1, bei dem die bevorzugten Materialien angeführt sind; für das Substrat PET, für die Elektroden Gold und für die Passivierungsschicht Parylen C-Polymer. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, erstreckt sich die Elektrode von der Inkubationszone I über die Passivierungszone P bis hin zur Kontaktzone K. Im Bereich der Inkubationszone I und der Kontaktzone K ist die Elektrode nicht mit einer Passivierungsschicht versehen, damit eine Belegung mit Aptameren beziehungsweise eine Kontaktierung möglich bleibt. Lediglich in der Passivierungszone ist die Elektrode zum Schutz mit der Passivierungsschicht überdeckt.
Figur 2a) ist eine Aufsicht auf einen Biomarkersensor 1, wie auch in Figur la) dargestellt. Zusätzlich sind nun aber bei jedem Elektrodenset ES-1 bis ES-4 individuelle Gegenelektroden 5 und Referenzelektroden 6 dargestellt; jedes Set von Arbeitselektroden (also jedes Elektrodenset ES-1 bis ES-4) hat demnach eine zugeordnete Gegenelektrode 5 und eine zugeordnete Referenzelektrode 6. Zusätzlich ist ein Widerstandsthermometer 7 in der Passivierungszone P vorhanden, dessen kontakte in/über die Kontaktzone K geführt werden. Die doppelt gestrichenen Linien zeigen auch hier die Schnittfläche 4 zur Herstellung von verschiedenen Elektrodensets ESI bis ES-4 an; hier ist im Unterschied zu Figur 1 noch angedeutet, dass die einzelnen Schnitte zur Unterteilung des Substrates und Separierung der einzelnen Elektrodensets ES-1 bis ES-4 bis in die Passivierungszone P erfolgen können.
Figur 2b) ist eine Aufsicht auf einen Biomarkersensor 1, wie in Figur 2a) illustriert, mit dem Unterscheid, dass die Elektrodensets ES-1 bis ES-4 keine individuellen Gegenelektroden 5 und Referenzelektroden 6 aufweisen. Hier teilen sich alle vier Elektrodensets ES-1 bis ES-4 eine Gegenelektrode 5 und eine Referenzelektrode 6.
Figur 2c) ist eine schematische Aufsicht einen Biomarkersensor 1, wie in Figur 2a) illustriert, mit dem Unterscheid, dass hier nur drei Elektrodensets ES-1 bis ES-gezeigt sind. Weiterhin gezeigt sind bei dieser Figur exemplarisch Alignment-Marken, die zur Orientierung verwendet werden können, wenn mehrere Lithographieschritte ausgeführt werden müssen. Diese sind genauso gut bei den Varianten der anderen Figuren anwendbar, dort aber der Einfachheit halber nicht illustriert; anders herum sind sie zwar in dieser Figur gezeigt, aber nicht zwingend notwendig.
Figur 3 zeigt die grafische Auftragung der Detektionsdaten der spezifischen Biomarker in Proben von Plasmodium falciparum Parasit-Blutproben der jeweiligen spezifischen Aptasensoren. a) 2008s-Aptamer, b) pLl-Aptamer, c) LDHpll-Aptamer und d) 2106s- Aptamer. Die Kontrolle stellt das Signal gemessen mit uninfiziertem Blut (uRBC) dar. Die prozentualen Angaben repräsentieren den Prozentsatz an Parasitämie. Die gestrichelte Linie indiziert den Schwellenwert und die Ordinate zeigt die relative Peakstromänderung pro Fläche. Es ist aus dieser Figur ersichtlich, dass mit steigender Parasitämie das Messsignal höher liegt und mithin mit den Biomarkersensoren gemäß vorliegender Erfindung nicht nur qualitativ das Vorhandensein der den Aptameren korrespondierenden Biomarker detektiert werden kann, sondern auch quantitativ deren Menge.
Figur 4 zeigt eine unterschiedliche Ausgestaltung einer Elektrodenanordnung. In den vorhergehenden Figuren waren die aptamerbelegten Elektrodenkontakte / Elektrodenkontakt für Aptamerbelegung 3 jeweils als Quadrate dargestellt. Hier ist der Elektrodenkontakt für Aptamerbelegung 3 in einer doppelt kammförmigen Ausgestaltung ausgeführt. In dieser Ausgestaltung ist eine einzelne Elektrode gezeigt, die zusammen mit einer umschließenden Gegenelektrode 5 und einer umschließenden Referenzelektrode 6 angeordnet ist. Eine solche Ausgestaltung ist alternativ zu den in Figuren 1 und 2 dargestellten Elektrodenanordnungen einsetzbar. Ferner sind in dieser Figur beispielhaft einige Größenangaben angeführt. Diese sind aber nicht limitierend, sondern nur beispielhaft und repräsentieren eine hergestellte Ausführungsform basierend auf zöllischen Maßen (der Abstand zwischen den einzelnen Kammstäben in dem gezeigten Beispiel beträgt 0,05 mm und ist der besseren Lesbarkeit halber nicht in der Figur gezeigt); von den angegebenen Maßen kann deutlich abgewichen werden, insbesondere können die Größenverhältnisse in Ausführungsformen um zwischen 80% und 500%, bezogen auf die angegebenen Größen, abweichend ausgestaltet werden.
Figur 5 ist eine Wiedergabe des in Figur la) dargestellten Biomarkersensors, mit dem Unterschied, dass in Figur 5 eine spezifische Ausführungsform mit spezifischen Größen- und Längenangaben dargestellt ist, wie sie auch ausgeführt wurde.
Figur 6a ist eine Wiedergabe des in Figur 2a) dargestellten Biomarkersensors, mit dem Unterschied, dass in Figur 6a) eine spezifische Ausführungsform mit spezifischen Größen- und Längenangaben dargestellt ist, wie sie auch ausgeführt wurde.
Figur 6b ist eine Wiedergabe des in Figur 2b) dargestellten Biomarkersensors, mit dem Unterschied, dass in Figur 6b) eine spezifische Ausführungsform mit spezifischen Größen- und Längenangaben dargestellt ist, wie sie auch ausgeführt wurde. Das Inset zeigt dabei die Mäander-Struktur eines Widerstandsthermometers (Resistance Temperature Detector, RTD) 7 mit spezifischen Abmessungen, wie in dieser spezifischen Ausführungsform eingesetzt.
Figur 6c ist eine Wiedergabe des in Figur 2c dargestellten Biomarkersensors, mit dem Unterschied, dass in Figur 6c eine spezifische Ausführungsform mit spezifischen Größen- und Längenangaben dargestellt ist, wie sie auch ausgeführt wurde.
Figur 7 zeigt die grafische Auftragung des Sensorsignals gegen die Konzentration des Biomarkers (S-Protein) des SARS-CoV-2-Virus. Das Sensorsignal wurde mit einem flex- MEA gemessen, der mit dem C7-Aptamers modifiziert wurde. Die spezifische Detektion erfolgte im Probenmedium in einem Konzentrationsbereich von 1 fg/ml bis 100 ng/ml. Die gestrichelte Linie indiziert den Schwellenwert, die Abszisse die Konzentration an Protein in der Probe und die Ordinate zeigt die relative Peakstromänderung pro Fläche. Es ist aus dieser Figur ersichtlich, dass mit steigender Konzentration das Messsignal höher liegt und mithin mit den Biomarkersensoren gemäß vorliegender Erfindung nicht nur qualitativ das Vorhandensein des spezifischen Biomarkers (S-Protein) des SARS- CoV-2-Virus detektiert werden kann, sondern auch quantitativ dessen Menge.
Bezugszeichenliste:
In den Figuren bedeuten gleiche Bezugszeichen gleiche Materialien, Stoffe etc.
1 Biomarkersensor mit Multielektrodenfeld-Struktur (flex-MEA)
2 Leiterbahn
3 Aptamerbelegter Elektrodenkontakt / Elektrodenkontakt für Aptamerbelegung
4 Elektrodenseparierungsbereich / Schnittstreifen
5 Gegenelektrode
6 Referenzelektrode
7 Widerstandsthermometer
8 Alignment-Marken ES-1 Elektrodenset 1 ES-2 Elektrodenset 1 ES-3 Elektrodenset 1 ES-4 Elektrodenset 1
I Inkubationszone
P Passivierungszone K Kontaktzone
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Heranziehung der folgenden nicht- limitierenden Beispiele näher erläutert. Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele dienen dazu die darin ausgeführten Ausgestaltungen darzulegen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Variationen dieser Beispiele im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich sind.
Beispiele:
Beispiel 1: Malaria
1. Herstellung und Reinigung von flexiblen Multielektrodenfeldern-Chips Flexible Multielektrodenfelder (flex-MEA) wurden in einem ISO 1-3-Reinraum auf einem Polyethylenterephthalat-Film (PET, DuPont Teijin Films Ltd.) einer Dicke von 100 pm und einem Durchmesser von 100 mm als flexiblem Substrat hergestellt. Mittels elektrodenstrahlunterstützter physikalischer Gasphasenabscheidung (PVD) wurden zunächst eine 5 nm Titan-Adhäsionsschicht und dann darauf eine Schicht von 50 nm Gold (Au) auf dem flexiblen Substrat zur Herstellung der Elektrode abgeschieden. Eine Ätzmaske für die Muster der Zuleitungen und der 16 Elektroden (je vier Elektroden für vier Elektrodensets) wurde mittels Standard-Fotolithografie mit einem positive Fotolack unter Verwendung eines Maskenausrichters hergestellt, auf die Goldoberfläche aufgebracht und dann die Elektroden mittels eines nasschemischen Ätzverfahrens unter Zuhilfenahme eines Goldätzmittels (TechniEtch ACI2, Microchemicals, Ulm, Deutschland) gemustert. Anschließend wurde die freiliegende Titanschicht mittels nasschemischem Ätzen unter Verwendung eines Titanätzmittels (TechniEtch TC, Ulm, Deutschland) entfernt. Die Ätzmaske wurde dann durch Immersion des die gemusterten Elektroden umfassenden PET-Substrats in AZ-100- Entferner in einem Ultraschallbad für 10 Minuten entfernt, gefolgt von einer Spülung mit Isopropanol und entionisiertem Wasser. Die erhaltenen flexiblen Polymerchips hatten eine Größe von 10,5 mm x 15,8 mm, mit 16 individuell adressierbaren Elektroden (siehe auch Figur 5). Jede quadratförmige Elektrode mit einer Größe von 550 pm x 550 pm ist auf der sogenannten Inkubationsseite (bzw. Inkubationszone) des Chips angeordnet, wobei diese Inkubationsseite des Chips als Basis für den flex- MEA dient. Zudem wurden entsprechend weitere flex-MEA-Designs umfassend außerdem eine On- Chip-Referenzelektrode 6 (RE), eine Gegenelektrode 5 (CE), und einen
Widerstandstemperaturdetektor 7 (RTD) hergestellt (siehe auch Figur 6).
Die Herstellung der Passivierungsschicht erfolgte mittels Schablonenpassivierung unter Verwendung von Parylen C zur Bildung der Passivierungsschicht (Schutzschicht über den Elektrodenleitungen). Eine Polymerschablone wurde dafür mittels Laserschneidemaschine hergestellt. Dann wurde die Schablone auf das PET-Substrat mit der gemusterten Elektrode aufgebracht. Anschließend erfolgte die Abscheidung von Parylen C mittels chemischer Gasphasenabscheidung (CVD) mit den folgenden Parametern: Vakuumdruck 20 mTorr, Set Point 25 mTorr und Vaporizor 160°C. Schließlich wurde die Schablone vorsichtig von dem PET-Substrat abgezogen.
Zur endgültigen Reinigung vor der Anwendung wurden die neuen flex-MEA-Chips jeweils für 5 Minuten in Aceton und Isopropanol eingetaucht, gefolgt von einer Spülung mit hochreinem entionisiertes Wasser (aus einem Milli-Q®-System (18,2 Megaohm spezifischer Widerstand)) und Trocknung im Stickstofffluss. Die chemisch gereinigten Elektroden wurden mit einer Leiterplatte mit Nullkraftsockel- Anschluss verbunden, der die Verbindung mit einem Potentiostaten erlaubte. Die elektrochemische Reinigung des flex-MEA-Chips erfolgte zunächst durch zyklische Voltametrie (CV) in 0,1 M NaOH in einem Potentialbereich von -1,35 V bis -0,35 V während 10 Scans bei 2 V s 1 und anschließendem Scannen in 0,05 M H2SO4 in einem Potentialbereich von 0 V bis 1,5 V während 20 Scans bei 1 V s_1. Die elektrochemische Oberflächenfläche (ESA) wurde mittels CV in 0,05 M H2SO4 in einem Potentialbereich von 0 V bis 1,5 V bei 0,1 V s 1 bestimmt.
2. flex-MEA Multiziel-Aptasensor-Biofunktionalisierung
Es wurden die folgenden Konzentrationen für die in Tabelle 1 angeführten, einsträngigen Desoxyribonukleinsäure (ssDNS)-Aptamere verwendet: 0,5 pM für 2008s, pLl und 2106s sowie 0,03 pM für LDHpll. Alle Aptamere wurden mit 10 mM Tris-(2-carboxyethyl)-Phosphinhydrochlorid (TCEP)-Lösung während einer Stunde bei Raumtemperatur getrennt voneinander inkubiert, um die Disulfid-Schutzbindung zu lösen und Immobilisierung auf den Elektroden über eine Thiol-Gold selbstorganisierende Monoschicht zu ermöglichen. Die Lösungen wurden in 10 mM phosphatgepufferter Salzlösung (PBS - NaCI 1 M, Na^PO 10 mM, Na2HPC>4 10 mM, MgCh 1 mM, pH 7,1) nach einer Stunde auf ein endgültiges Volumen von 1 mL resuspendiert. In das flex-MEA wurden dann mittels Scheren vier parallele streifenähnliche Sektionen eingeschnitten, wobei darauf geachtet wurde, die Elektroden und Zuleitungen intakt zu lassen, wodurch die Elektrodeninkubation mit den vier verschiedenen Aptamerlösungen für die endgültige Herstellung des Multiziel- Aptasensors ermöglicht wurde. Die einzelnen geschnittenen Elektroden konnten, aufgrund des flexiblen Substrats einzeln gebogen werden, so dass ein jeweiliges Eintauchen in die gewählte Inkubationslösung, ohne dass die anderen Elektrodenfelder Gefahr liefen mit inkubiert zu werden, möglich wurde. Die Elektroden wurden dann mit ihrer Inkubationszone einzeln über Nacht (16 Stunden) mit der jeweiligen Aptamerlösung unter Ausschluss von Licht inkubiert.
Tabelle 1: Sequenzen der für den Multiziel-flex-MEA-Aptasensor verwendeten Rezeptoraptamere 3. Waschen
Der Aptamer-modifizierte flex-MEA-Chip wurde zunächst mit 25 mM Tris-HCl-Puffer (NaCI 0.1 M, Tris(hydroxymethyl)aminomethan 25 mM, HCl 25 mM, pH 7.5) gespült und anschließend mit entionisiertem Wasser (Milli-Q®-Wasser), um nicht spezifisch adsorbierte Moleküle zu entfernen.
4. Blockierung
Der flex-MEA-Chip wurde für 7 Stunden mit einer 5 mg/ml monofunktionellen Methoxy-Polyethylenglykolthiol-Lösung (PEG, 2 kDa) inkubiert. Das PEG diente als Blockierungsmolekül, um Biofouling durch andere vorhandene Moleküle in den Blutproben zu vermeiden.
5. Waschen Der flex-MEA Aptasensor wurde mit Tris-Puffer gewaschen, um überschüssige, nicht spezifisch adsorbierte PEG-Moleküle zu entfernen.
6. Analytdetektion Blutproben enthaltend den Plasmodium Falciparum Parasiten wurden 1: 1 mit Lyse- Puffer (25 mM Tris-HCI Puffer mit 0.5% Triton X-100 (Octylphenolethoxylat)), wird verwendet, um die Zellen des Parasiten aufzubrechen) gemischt. Nach 15 Minuten Inkubierung mit dem Puffer wurde das resultierende lysierte parasitierte Blut in 25 mM Tris-Puffer 1: 100 auf ein endgültiges Volumen von 2 ml verdünnt. Der Aptasensor wurde während 45 Minuten mit dieser verdünnten Probe inkubiert.
Die erhaltenen Ausgabesignale der verschiedenen Elektroden, die jeweils mit einem bestimmten Aptamerrezeptor modifiziert waren, sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Das Signal wurde als 0 oder 1 angesehen, sofern der gemessene Strom unter oder über einem gewissen Schwellenwert lag. Als Schwellwert wurde 3o (3-Sigma) angenommen, wobei o (Sigma) die Standardabweichung der analytfreien Messung darstellt. Sowohl das 2008s- als auch das pLl-Aptamer zielen auf PfLDH und PvLDH, wodurch hoch redundante Signale erzielt werden, die zu einer hohen Verlässlichkeit des Malariatests führen. Die LDHpll- und 2106s-Aptamere, die selektiv auf PfLDH bzw. HRP-2 abzielen, ermöglichen eine Unterscheidung zwischen P. falciparum- und P. vivax- Malariaparasiten.
Die Ausgabesignifikanz zeigt an, ob die Kombination der jeweiligen Eingaben sinnvoll für die Diagnose ist oder ob nicht.
Tabelle 2: Ein- und Ausgabetabelle für die verschiedenen Biomarkerdetektionen durch Sensoren mit jeweiligen Aptameren (Inp in dieser und den folgenden Tabellen = Abkürzung von Input, Englisch für Eingabe)
Die Ausgabe der jeweiligen Sensoren führte zu vielen uneindeutigen Informationen (z.B. durch Querempfindlichkeiten), so dass es in vielen Szenarien unmöglich war, die Infektionen gezielt anzugehen, wenn nur die Ausgabe von jeweils einem Sensor betrachtet wurde. Um die Ausgaben auf „klar" zu stellen und eine selektive und unzweideutige Detektion des Biomarkers und einer korrespondierenden Diagnose zu ermöglichen, wurden logische Operationen durchgeführt, die Eingabe- und Ausgabetabellen (Tabellen 3, 5 und 7, siehe weiter unten) umfassen. Dabei wurden die verschiedenen Ausgaben der Elektroden auf einem Chip kombiniert. Dafür wurden die Ausgaben der jeweiligen Sensoren (Tabelle 2) als Eingabe für Logikgatter verwendet und korrespondierende Wahrheitstabellen für spezifische parasitische Infektionsszenarien erstellt, die mit dem Sensor überprüft wurden (Tabellen 4, 6 und 8, siehe weiter unten). Die Kombinationen der verschiedenen Aptamerausgaben und Verarbeitungen dieser Sensorausgaben durch Logikgatter-Operationen erlaubt die eindeutige Detektion von Malariainfektionen, die Unterscheidung zwischen verschiedenen Malariaparasiten, die Bestätigung des Resultats durch redundante Sensoranalyse sowie die Verwerfung der Wahrscheinlichkeit von falschen positiven Ergebnissen, wie in Tabelle 8. Weiterhin waren alle Elektroden eines Elektrodensets mit dem gleichen Aptamerrezeptor modifiziert, und daher wurden die Signale, die von den verschiedenen Elektroden kamen, gemittelt. Die Mittelung der aufgenommenen Daten in paralleler Art und Weise erhöhte die Verlässlichkeit der Messinformationen.
Im Folgenden werden drei Teil-Beispiele T-l, T-2 und T-3, für logische Operationen dargestellt, wie sie durchgeführt wurden, jedoch können auch andere logische Operationen verschiedener Level durchgeführt werden.
Teil-Beispiel T-l: Plasmodium falciparum
Tabelle 3: Ein- und Ausgabetabelle für Sensoren modifiziert mit LDHpll-Aptamer und 2106s-Aptamer für die Detektion von verschiedenen Kombinationen von Biomarkern. Die Ausgabe ist nur 1, wenn beide Plasmodium falciparum -Biomarker (PfLDH + HRP- 2) detektiert werden. Eine Co-Infektion mit Plasmodium vivax ist nicht ausgeschlossen.
Tabelle 4: Wahrheitstabelle der Kombination von LDHpll und 2106s für P. falciparum- Infektionen mittels AND Gatter. Logikdiagramm: Ausgabe = Inp 1 x Inp 2 (hier: Infektion mit Plasmodium falciparum )
0: Repräsentiert ein zweideutiges Testergebnis aufgrund von Kreuzselektivitäten der Aptamerrezeptoren oder keine Infektion.
Teil-Beispiel T-2: Nur Plasmodium vivax Infektion
Tabelle 5: Ein- und Ausgabetabelle für die Kombinationen der Detektion von 2008s-, LDHpll- und 2106s-Aptameren für ausschließlich P. v/Vax-Detektion. Eine Co- Infektion mit P. falciparum ist ausgeschlossen. Tabelle 6: Wahrheitstabelle der Kombination aus 2008s, LDHpll und 2106s nur für P. vivax-Infektion mit NOT/NOR - NOT/NOR Gatter: Logikdiagramm: Ausgabe = Inp 1 + Inp 2 + Inp 3.
Teil-Beispiel T-3: Bestätigung der Detektion durch redundante Sensorsignale
Tabelle 7: Ein- und Ausgabetabelle für die Kombination der Detektion von 2008s- und pLl-Aptameren für P. falciparum- und P. vivax-Mischinfektionen mittels redundantem Signal zur Verwerfung eines falschen positiven Ergebnisses.
Tabelle 8: Wahrheitstabelle für die Kombination von 2008s- und pLl-modifizierten Sensoren für die redundante Bestätigung einer P. falciparum und P. vivax Co- Infektionsdetektierung mittels AND-Gatter. Logikdiagramm: Ausgabe = Inp 1 x Inp 2
7. Waschen
Anschließend wurde der flex-MEA-Aptasensor mit Tris-Puffer gespült, um ungebundene Proteine zu entfernen. 8. Messung des elektrochemischen Multiziel-Aptasensor-Detektionssignals
Differenzpulsvoltametrie(DPV)-Messungen wurden durchgeführt, um die Detektion der PfLDH- und HRP-2-Aptasensoren in den parasitierten Blutproben zu bestimmen. Die DPV-Messungen wurden in 5 mM Kaliumferri- und -ferrocyanid ([Fe(CN)6]3 /4 ) in 25 mM Tris-Pufferlösung mit einem Multikanalpotentiostaten mit einem Dreielektrodensystem durchgeführt. Dabei wurde ein Platindraht als Gegenelektrode (CE), eine Ag/AgCI-Elektrode als Referenzelektrode (RE) und der flex-MEA-Multiziel- Aptasensor als Arbeitselektrode (WE) eingesetzt. Die DPV-Messungen wurden in einem Potenzialbereich von 0 V bis 0,7 V durchgeführt, mit einem Schrittpotential von 0,005 V, einer Amplitudenmodulation von 0,025 V, einer Gleichgewichtszeit von 2 Sekunden, einer Pulsbreite von 0,05 Sekunden und einer Messbreite von
0,025 Sekunden. Die statistische Analyse der Detektion mit den verschiedenen Elektroden und den verschiedenen Aptameren wurde mittels statistischer Analysesoftware durchgeführt und ausgewertet (siehe auch Figur 3). Mit den erfindungsgemäßen Biomarkersensoren konnten zuverlässig Malaria- Infizierungen mit sehr hoher Genauigkeit in Blutproben festgestellt werden.
Beispiel 2: SARS-CoV-2:
Die erfindungsgemäßen flexMEA- Sensoren wurden in diesem Beispiel für die Detektion des Spikeproteins des SARS-CoV-2-Virus eingesetzt. Dazu wurde als Aptamer das C7-Aptamer, das an das Spikeprotein des SARS-CoV-2-Virus bindet, eingesetzt.
Der Aptasensor wurde mit dem Spikeprotein während 30 Minuten inkubiert und anschließend wurde mit Tris-Puffer (wie oben beschrieben) gespült. Die elektrochemische Signaldetektion wurde mit einem Potentiostaten unter Verwendung von Differentieller Puls-Voltametrie (DPV) durchgeführt, wobei die DPV-Messungen insbesondere in Redoxspezies-Lösung (5 mM [Fe(CN)6]3 /4 in 25 mM Tris-Puffer) erfolgten.
Nach dem Normalisieren der Spitzenströme, die bei der Detektion des Spikeproteins bei verschiedenen Konzentrationen erhalten wurde, wurde eine Kalibrierungskurve, entsprechend dem C7-Aptamer, erhalten. Es war möglich, ein Detektionslimit von 100 ag/ml, eine Empfindlichkeit von 8,8 + 0,9/Dekade und einen dynamischen Detektionsbereich, der Konzentrationen von 100 ag/ml bis 100 ng/ml abdeckt, zu bestimmen.
Entsprechend wurde gezeigt, dass dieser elektrochemische Biosensor eine herausragende Performance zeigt, und sogar die Detektionslimits überschreitet, die für andere Methoden berichtet wurde, zum Beispiel für (Lateralfluss-)Schnelltests.
Die ermittelten Sensordaten zeigten, dass die erfindungsgemäßen Sensoren hervorragend geeignet sind, um das Spikeprotein des SARS-CoV-2-Virus eindeutig und in geringer Konzentration zu detektieren (siehe auch Figur 7).
Die nachfolgenden Erkenntnisse wurden aus/bei den durchgeführten Experimenten gewonnen, d.h. entsprechende Arbeiten wurden durchgeführt, sind aber aufgrund ihrer Gültigkeit für zukünftige Arbeiten im Präsens formuliert.
Bei einer Multitarget-Bestimmung kann der flex-MEA-Sensor der vorliegenden Erfindung als Logikgatter verwendet werden. Entsprechen dienen die detektierten Signale jeder einzelnen Elektrode des Biosensors als Eingangssignale (Inputsignale/Inputs) für das Logikgatter, dessen Output dem Resultat der Bool'schen Operation entspricht, wodurch die positive (1) oder negative (0) Identifizierung des Pathogens angezeigt wird, beziehungsweise wodurch die Gegenwart + positiv (1) oder Abwesenheit - negativ (0) des Pathogens angezeigt wird. Ein solches Konzept wird in den nachfolgenden Tabellen C-A und C-B mit einem Beispiel für eine Multitarget- Bestimmung von unterschiedlichen Spikeprotein-Varianten dargestellt. Dabei funktionieren die Biosensoren als Exklusiv-Oder-Gatter (XOR-Gatter) zur Unterscheidung zwischen COVID-19 und seinen verschiedenen Varianten, das Spikeprotein und das SARS-CoV-2-Virus sind die Eingänge des Gatters. Diese Logikgatter erleichtern eine eindeutige Bestimmung der Infektionen mit der Möglichkeit zwischen den verschiedenen infizierenden Viren zu unterscheiden oder eine mögliche Co-Infektion mit anderen Pathogenen zu validieren, oder die Möglichkeit eines falsch-positiven Ergebnisses verworfen wird indem über mehrerer redundante Sensorsignale von den verschiedenen Elektroden gemittelt wird. Tabelle C-A zeigt die drei verschiedenen Aptamere und die entsprechenden Spike- Targets. Wenn das Target seinem Aptamer-Rezeptor ausgesetzt wird (InpX = 1), erhält der Ausgang den Status 1. Wenn das Target nicht vorhanden ist (InpX = 0), erhält der Ausgang den Status 0. Berücksichtigend alle Inputkombinationen, können ebenfalls mehrere Spikeproteine vorhanden sein, was jedoch nicht unbedingt eine realistische Situation, die in echten Proben gefunden werden kann, wiedergibt. Insofern zeigt die Ausgabesignifikanz, ob die Kombination der verschiedenen Target- Inputs eine sinnvolle Biomarker-kombination wiedergibt, die eindeutig eine Infektion oder keine Infektion anzeigt, an. In diesem Fall ist das Resultat „klar". Zufällige Kombinationen werden als „unklar" angesehen. Die Gegenwart von zwei verschiedenen Spikeproteinen, die eine Co-Infektion repräsentieren (unwahrscheinlich), werden als unklar angesehen.
Tabelle C-A: Beispiel für eine diskriminatorische Detektion einer COVID-19 Infektion zwischen verschiedenen Virusvarianten
In Tabelle C-B wird ein Beispiel einer Biosensor-Implementierung aus Tabelle C-A gezeigt, worin die Elektroden als XOR-Gatter zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Varianten von COVID-19 genutzt werden. Die verschiedenen Spikeproteine der SARS-CoV-2-Varianten werden als Eingangssignale des Gatters genutzt. Diese Logikgatter erleichtert eine eindeutige Bestimmung der Infektionen mit der Möglichkeit zwischen den verschiedenen infizierenden Viren zu unterscheiden und Co-Infizierungen auszuschließen, durch Verarbeitung der verschiedenen redundanten Sensorsignale, die von den verschiedenen Elektroden kommen, und Verwerfen der Möglichkeit eines falsch-positiven Ausgangs. Verschiedene andere Logikgatter können aus den möglichen Kombinationen der Aptamer-basierten Biosensorsignale, die von demselben flexiblen Chip kommen, erstellt werden und für spezifische Krankheitsunterscheidung genutzt werden. Tabelle C-B: XOR Logikgatter-Ein- und Ausgaben für zwei Sätze von Sensoren, die unterschiedlich mit entweder C9- oder C5-Aptameren für die Detektion von verschiedenen COVID-19 Biomarkern, modifiziert wurden. Die Ausgabe ist nur 1, wenn einer der Biomarker detektiert wird. Eine Co-Infektion wird genauso wie eine Infektion mit dem Wildtyp ausgeschlossen. Man erhält die Ausgabe 1 nur, wenn die Aptasensoren ein Signal oberhalb ihres jeweiligen Nachweisgrenzen-Schwellenwerts ausgeben.
Tabelle C-C: Wahrheitstabelle eines XOR Logikgatters, entsprechend Tabelle C-B. Eingabe 1 (Inp 1) ist Spikeprotein alpha und Eingabe 2 (Inp 2) ist Spikeprotein delta. Ausgaben für zwei Sätze von unterschiedlich modifizierten Sensoren, entweder mit C9- oder C5- Aptameren, für die Detektion von verschiedenen COVID-19 Biomarkern. Logikdiagramm: Output= inpi ® inp2 mit Covid-19 alpha oder Covid-19 delta) an.
0 zeigt ein unklares Testergebnis aufgrund der Kreuzselektivität der Aptamerrezeptoren oder keine Infektion an.
Solche Tabellen wurden entsprechend auch mit anderen Aptameren erstellt, insbesondere auch mit dem C15-Aptamer (das für die Omikron-Variante des SARS- CoV2 relevant ist); aufgrund der „Gleichheit" aber hier nicht noch einmal gezeigt. In einer anderen Ausgestaltung wurden verschiedene Sätze von Sensoren desselben flexiblen Multielektrodenchips entweder mit C7-Aptamer modifiziert, das das Spikeprotein des SARS-CoV-2-Virus detektiert, oder mit Il-Aptamer, das das HA1- Protein des Influenza-Virus detektiert, um spezifisch COVID-19-Infektionen zu bestimmen. Die Ausgabe ist nur 1, wenn das Spikeprotein detektiert wird. Es wurde nur dann eine 1 als Ausgabe erhalten, wenn der C7-Aptasensor ein Signal oberhalb seines jeweiligen Schwellenwerts gibt, der durch den Nachweisgrenzen-Schwellenwert des Biosensors bestimmt wird.
Entsprechende Sensoren wurden auch bereits hergestellt, bei denen Aptamere verwendet wurden, namentlich das Il-Aptamer, das SGl-Aptamer, das C15-APtamer, welche weitere Biomarker umfassen: Hämagglutinin-(HAl)-Protein des Influenza- Virus, das Glycoprotein G des HRS-Virus und das Spikeprotein des MERS-CoV und insbesondere auch die Omicron Variante des SARS-CoV-2-Viruses

Claims

Ansprüche
1. Biomarkersensor mit Multielektrodenfeld-Struktur umfassend ein Trägersubstrat, auf dem mindestens zwei separate Elektrodensets angeordnet sind, und jedes Elektrodenset eine Elektrode oder mehrere Elektroden aufweist, wobei jedes Elektrodenset in der folgenden Reihenfolge unterteilt ist in i) eine Inkubationszone, in der mindestens ein, bevorzugt genau ein, spezifisches Aptamer an die eine Elektrode oder die mehreren Elektroden gebunden ist, ii) eine Passivierungszone, in der eine Passivierungsschicht die eine Elektrode oder die mehreren Elektroden überdeckt, iii) eine Kontaktzone, in der die eine Elektrode konfiguriert ist oder die mehreren Elektroden konfiguriert sind, elektrisch kontaktiert zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationszonen der einzelnen Elektrodensets oder die Inkubationszonen und ein Teil von bis zu 95% der Länge der Passivierungszonen der einzelnen Elektrodensets beweglich, jeweils unabhängig von denen der anderen Elektrodensets, ausgeführt sind, und dass die Kontaktzonen der einzelnen Elektrodensets zusammen eine gemeinsame Kontaktzone bilden.
2. Biomarkersensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat ein Material ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenterephthalat, Polyethylennaphthalat, Polydimethylsiloxan, Polyimid, Polyester und Agarose, bevorzugt Polyethylenterephthalat, oder Polyethylennaphthalat, besonders bevorzugt Polyethylenterephthalat.
3. Biomarkersensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat ein flexibles Material ist.
4. Biomarkersensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er zwei, drei oder vier separate Elektrodensets aufweist, bevorzugt mit jeweils mindestens zwei Elektroden, besonders bevorzugt mit jeweils mindestens vier Elektroden, wobei die Elektroden bevorzugt aus Edelmetall oder Kohlenstoff, besonders bevorzugt Gold oder einer Goldlegierung, ganz besonders bevorzugt Gold, sind.
5. Biomarkersensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aptamere ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2008s- Aptamer, 2106s-Aptamer, pLl-Aptamer, LDHpll-Aptamer und Kombinationen davon oder ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C5-Aptamer, C7- Aptamer, C9-Aptamer, Cll-Aptamer, C15-Aptamer oder Il-Aptamer, IH1- Aptamer, SGl-Aptamer, HCSl-Aptamer, NGl-Aptamer und Kombinationen davon.
6. Biomarkersensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in jedem Elektrodenset andere Aptamere oder Aptamermischungen gebunden sind, bevorzugt in einem ersten Elektrodenset 2008s-Aptamer und in einem zweiten Elektrodenset 2106s-Aptamer und in einem dritten Elektrodenset pLl-Aptamer und in einem vierten Elektrodenset LDHpll- Aptamer oder in einem ersten Elektrodenset C7-Aptamer und in einem zweiten Elektrodenset Il-Aptamer, oder in zumindest mindestens zwei Elektrodensets Aptamere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5-Aptamer, C7-Aptamer, C9-Aptamer, Cll-Aptamer, C15-Aptamer oder Il-Aptamer, IHl-Aptamer, SGl- Aptamer, HCSl-Aptamer, NGl-Aptamer und Kombinationen davon.
7. Biomarkersensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Biomarkersensor zusätzlich i) insgesamt eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode, ii) insgesamt eine Referenzelektrode, eine Gegenelektrode, und ein Widerstandsthermometer, iii) pro Elektrodenset eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode, oder iv) pro Elektrodenset eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode und insgesamt ein Widerstandsthermometer aufweist.
8. Verfahren zur Herstellung von Biomarkersensoren, insbesondere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die folgenden Schritte
I) Bereitstellung eines Trägersubstrates, bevorzugt eines flexiblen
Trägersubstrats, II) Aufbringung einer Schicht aus Elektrodenmaterial auf das Substrat,
III) Strukturierung des Elektrodenmaterials zu einzelnen Elektroden,
IV) Passivierung eines zwischen den Enden befindlichen Teils des Elektrodenmaterials,
V) Aufteilung der Elektroden in eine Anzahl einzelner Elektrodensets,
VI) Inkubierung eines Endes der jeweiligen Elektrodensets in Aptamerlösung.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbringung einer Schicht aus Elektrodenmaterial auf das Substrat mittels physikalischer Gasphasenabscheidung, bevorzugt mittels Elektronenstrahl-unterstützter physikalischer Gasphasenabscheidung, erfolgt, besonders bevorzugt nach vorheriger Aufbringung einer Adhäsionsschicht.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt III) zuerst ein Fotolack, bevorzugt ein positiver Fotolack, auf das Elektrodenmaterial aufgebracht wird, aus diesem durch belichten und entwickeln eine Maske mit der gewünschten Musterung der Metallstrukturen erzeugt wird, anschließend mittels eines nasschemischen Ätzschritts das nicht benötigte Material der Adhäsionsschicht und der Elektrodenschicht entfernt wird, und danach der Fotolack wieder entfernt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Passivierung in Schritt IV) mittels Schablonenpassivierung erfolgt, wobei zunächst eine Schablone, bevorzugt eine Polymerschablone, besonders bevorzugt hergestellt unter Verwendung einer Laserschneidemaschine, auf die Oberfläche der Elektroden platziert wird, und dann die leitenden Zuleitungen der Elektroden mittels chemischer Gasphasenabscheidung partiell passiviert werden, bevorzugt mit einem Parylen-C-Polymer.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterteilung in Schritt V) durch einschneiden des Substrates erfolgt, bevorzugt dergestalt, dass die Gesamtzahl der Elektroden gleichmäßig auf die resultierenden Elektrodensets verteilt ist.
13. Verfahren zur Bestimmung von Biomarkern in Körperflüssigkeiten, bevorzugt in Blutproben oder Schleimproben, letztere insbesondere aus Rachen und/oder Nase, umfassend die folgenden Schritte oder bestehend aus den folgenden Schritten i) Bereitstellen eines Biomarkersensors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, oder eines gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 hergestellten Biomarkersensors, ii) Aufbringen einer Körperflüssigkeitsprobe auf den Biomarkersensor, iii) Verbinden des Biomarkersensors mit einer Messvorrichtung für Strom Spannung, Widerstand oder Frequenz, iv) Detektion des Messsignals und der Ausgabe der Messwerte durch die Messvorrichtung, v) Analyse der Ausgabewerte, bevorzugt mittels Computern, transportablem Lesegerät, bevorzugt mittels Software und/oder Kalibrierdaten, und vi) optional Speichern, Anzeigen und/oder Übertragen der analysierten Ergebnisse.
14. Biomarkersensor-Kit umfassend oder bestehend aus
A) mindestens einen Biomarkersensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 ohne dass bereits Aptamere gebunden sind,
B) einer Zubereitung umfassend mindestens ein Biomarker-spezifisches Aptamer,
C) optional weiterem Analysenmaterial, bevorzugt Pipetten, Biosensorchips, transportablen Lesegeräten, Chemikalien, Präparationsröhrchen (Eppendorf Tubes) und ähnlichem.
15. Verwendung der Biosensoren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 hergestellten Biomarkersensoren, oder der Biomarkersensor-Kits gemäß Anspruch 14 zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von krankheitsspezifischen Biomarkern, bevorzugt Malaria- Biomarkern oder SARS-CoV-2-Biomarkern, besonders bevorzugt in Körperflüssigkeitsproben, insbesondere bevorzugt in Blutproben oder Schleimproben, letztere insbesondere aus Rachen- und/oder Nase, höchst bevorzugt als Substrat in automatisierten Multititerplatten oder in PoC-Geräten.
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