EP4240375A1 - Antiseptic composition - Google Patents
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- EP4240375A1 EP4240375A1 EP21814686.8A EP21814686A EP4240375A1 EP 4240375 A1 EP4240375 A1 EP 4240375A1 EP 21814686 A EP21814686 A EP 21814686A EP 4240375 A1 EP4240375 A1 EP 4240375A1
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Abstract
The invention relates to a composition for use as a medicament, comprising at least silver in colloidal form, an extract of Sambucus Nigra, an extract of Primulae flos cum calycibus and/or an extract of Hypericum perforatum, an extract of Pelargonium sidoides. Preferably, the composition is used in antiviral, antibacterial and antifungal treatment and/or prophylaxis. More preferably still, said composition is in the form of an antifungal and antibacterial cream.
Description
Description Description
COMPOSITION ANTISEPTIQUE ANTISEPTIC COMPOSITION
[0001] L’invention concerne une composition pour utilisation comme médicament comprenant au moins de l’argent sous forme colloïdale, un extrait de Sambucus Nigra, un extrait de Pri- mulae flos cum calycibus et/ou un extrait d’Hypericum perforatum, un extrait de pélargonium sidoides. De manière préférée, ladite composition est utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antiviral, antibactérien et antifongique. De manière encore plus préférée, ladite composition est sous forme de crème antifongique et antibacterienne. [0001] The invention relates to a composition for use as a medicament comprising at least silver in colloidal form, an extract of Sambucus Nigra, an extract of Primulae flos cum calycibus and/or an extract of Hypericum perforatum, a pelargonium sidoides extract. Preferably, said composition is used in antiviral, antibacterial and antifungal prophylaxis and/or treatment. Even more preferably, said composition is in the form of an antifungal and antibacterial cream.
[0002] L’invention a attrait au domaine des traitements antifongiques, antivirales et antibactériens. The invention relates to the field of antifungal, antiviral and antibacterial treatments.
ART ANTERIEUR PRIOR ART
[0003] Les propriétés thérapeutiques de l'argent étaient déjà connues à l'époque de la Grèce antique : on savait en effet que dans les familles où les couverts en argent étaient utilisés pour manger, les infections étaient moins fréquentes. L'argent présente d'importantes propriétés antimicrobiennes puisque la présence d'une partie sur 100 millions d'argent élémentaire en solution est suffisante pour obtenir une action antimicrobienne efficace. Il est également bien connu que les ions ou les radicaux libres de l'argent sont un agent antimicrobien actif. [0003] The therapeutic properties of silver were already known at the time of ancient Greece: it was indeed known that in families where silver cutlery was used to eat, infections were less frequent. Silver has significant antimicrobial properties since the presence of one part in 100 million of elemental silver in solution is sufficient to obtain an effective antimicrobial action. It is also well known that silver ions or free radicals are an active antimicrobial agent.
[0004] Pour rendre l'argent soluble dans l'eau, il est nécessaire d'utiliser une forme ionique colloïdale (une suspension dans l'eau de particules d'argent extrêmement fines), qui a été obtenue pour la première fois en 1920 grâce à un processus d'hydrolyse dans lequel deux électrodes d'argent pur sont utilisées, immergées dans de l'eau déminéralisée ou distillée, à laquelle est appliquée une différence de potentiel. [0004] To make silver soluble in water, it is necessary to use a colloidal ionic form (a suspension in water of extremely fine silver particles), which was first obtained in 1920 through a hydrolysis process in which two pure silver electrodes are used, immersed in demineralized or distilled water, to which a potential difference is applied.
[0005] Avant l'apparition des antibiotiques en 1938, l'argent colloïdal ainsi obtenu, était prescrit pour une grande variété de maladies et d'infections : en effet, il avait été prouvé qu'il était efficace contre plus de 650 agents pathogènes différents. [0005] Before the appearance of antibiotics in 1938, the colloidal silver thus obtained was prescribed for a wide variety of diseases and infections: in fact, it had been proven to be effective against more than 650 pathogens different.
[0006] L'argent colloïdal permet en effet d'améliorer le fonctionnement du système immunitaire, car il agit comme un catalyseur, en désactivant les enzymes spécifiques nécessaires au métabolisme de nombreuses espèces bactériennes, fongiques et virales. [0006] Colloidal silver makes it possible to improve the functioning of the immune system, because it acts as a catalyst, by deactivating the specific enzymes necessary for the metabolism of numerous bacterial, fungal and viral species.
[0007] Ce succès est dû au fait qu'il s'agit d'un antiseptique sûr ; en effet, lorsqu'il est utilisé sous forme colloïdale, l'argent est absorbé très lentement par les tissus afin de ne pas provoquer d'effets toxiques. Il peut donc être pris par voie orale et faire partie des préparations qui peuvent être prises quotidiennement par les adultes et les enfants sans risque d'apparition d'une quelconque intolérance, même si l'utilisation se prolonge dans le temps. This success is due to the fact that it is a safe antiseptic; in fact, when used in colloidal form, silver is absorbed very slowly by the tissues so as not to cause toxic effects. It can therefore be taken orally and be part of the preparations which can be taken daily by adults and children without the risk of the appearance of any intolerance, even if the use is prolonged over time.
[0008] L'argent colloïdal est principalement utilisé comme antiseptique en dermatologie pour le traitement de certains types de lésions. Il est également connu pour son application comme agent potabilisant de l'eau et comme conservateur dans l'industrie cosmétique. [0008] Colloidal silver is mainly used as an antiseptic in dermatology for the treatment of certain types of lesions. It is also known for its application as a potabilizing agent for water and as a preservative in the cosmetics industry.
[0009] L'argent colloïdal n’est cependant pas efficace contre l’ensemble des fongiques, virus et bactéries. [0009] However, colloidal silver is not effective against all fungi, viruses and bacteria.
[0010] Aujourd’hui, et encore plus depuis l’épidémie mondiale liée au virus SARS-CoV-2, il per-
dure le besoin d’une alternative aux compositions existantes, qui soit efficace contre l’ensemble des virus, fongiques et bactéries pathogènes existants et futurs. [0010] Today, and even more so since the global epidemic linked to the SARS-CoV-2 virus, it per- There remains the need for an alternative to existing compositions which is effective against all existing and future pathogenic viruses, fungi and bacteria.
[0011] Il perdure également un besoin d’alternatives dans les traitements topiques antifongiques et/ou antibactériens. [0011] There also remains a need for alternatives in topical antifungal and/or antibacterial treatments.
[0012] En outre, un besoin existant est également d’identifier de nouvelles compositions antibiotiques, permettant de traiter les patients antibioresistants. [0012] In addition, an existing need is also to identify new antibiotic compositions, making it possible to treat antibiotic-resistant patients.
[0013] De manière inattendue, le demandeur a découvert que la combinaison d’argent colloïdal avec plusieurs extraits de plantes permettait d’obtenir une composition efficace dans la prophylaxie et le traitement antiviral, antibactérien et antifongique. [0013] Unexpectedly, the applicant discovered that the combination of colloidal silver with several plant extracts made it possible to obtain an effective composition in the prophylaxis and the antiviral, antibacterial and antifungal treatment.
DESCRIPTION DESCRIPTION
[0014] Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne une composition pour utilisation comme médicament comprenant : Thus, according to a first aspect, the invention relates to a composition for use as a medicament comprising:
- De l’argent sous forme colloïdale ; - Silver in colloidal form;
- Un extrait de Sambucus Nigra ; - An extract of Sambucus Nigra;
- Un extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou un extrait d’Hypericum perforatum ;- An extract of Primulae flos cum calycibus and/or an extract of Hypericum perforatum;
- Un extrait de pélargonium sidoides. - An extract of pelargonium sidoides.
[0015] Par argent ionique colloïdal est entendu selon l’invention une suspension dans l’eau de particules d’argent extrêmement fines. By colloidal ionic silver is understood according to the invention a suspension in water of extremely fine silver particles.
[0016] De manière préférée, ledit argent sous forme colloïdale a une taille de particules comprise entre 0,1 et 30 nanomètres. Preferably, said silver in colloidal form has a particle size of between 0.1 and 30 nanometers.
[0017] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent sous forme colloïdale par litre de composition. - Between 20 mg and 250 mg of silver in colloidal form per liter of composition.
[0018] Par convention, il est généralement considéré que Img d’argent équivaut à Ippm dans une solution d’ 1 Litre, soit 20mg à 250mg par litre de solution. [0018] By convention, it is generally considered that Img of silver is equivalent to Ippm in a 1 liter solution, i.e. 20mg to 250mg per liter of solution.
[0019] Sambucus Nigra, ou Sureau noir, est une plante prenant la forme d’arbustes, de la famille des Caprifoliacées. Les extraits provenant de cette plante peuvent provenir de ses fleurs ou de ses fruits, et être des extraits sec, aqueux et/ou alcooliques. [0019] Sambucus Nigra, or Black Elder, is a shrub-like plant from the Caprifoliaceae family. The extracts from this plant can come from its flowers or its fruits, and be dry, aqueous and/or alcoholic extracts.
[0020] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra. - Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition.
[0021] Primulae flos cum calycibus, ou Primevère officinale est une plante herbacée vivace de la famille des Primulacées. Lesdits extraits proviennent de broyage des fleurs et/ou du calice de cette plante, optionnellement dans de l’eau et/ou de l’alcool. Ces extraits peuvent également être des extraits secs. Primulae flos cum calycibus, or Primrose officinale is a perennial herbaceous plant of the Primulaceae family. Said extracts come from grinding the flowers and/or calyx of this plant, optionally in water and/or alcohol. These extracts can also be dry extracts.
[0022] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus. - Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract.
[0023] Hypericum perforatum ou millepertuis perforé, plus communément appelé Millepertuis, est une plante herbacée vivace de la famille des Clusiacées. Lesdits extraits proviennent de la plante ou des sommités fleuries qui peuvent être broyées, optionnellement dans de l’eau et/ou de l’alcool. [0023] Hypericum perforatum or perforated St. John's wort, more commonly known as St. John's wort, is a perennial herbaceous plant of the Clusiaceae family. Said extracts come from the plant or the flowering tops which can be ground, optionally in water and/or alcohol.
[0024] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend :
- Entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’un extrait d’Hypericum perforatum. Preferably, said composition for use according to the invention comprises: - Between 0.5 and 11% by weight of the composition of an extract of Hypericum perforatum.
[0025] La pélargonium sidoides, ou Umckaloabo, est une plante native d’Afrique du Sud. Les extraits de cette plante peuvent prendre la forme d’extraits secs, aqueux et/ou alcoolique, des racines ou d’autres parties de la plante. [0025] Pelargonium sidoides, or Umckaloabo, is a plant native to South Africa. Extracts from this plant can take the form of dry, aqueous and/or alcoholic extracts of the roots or other parts of the plant.
[0026] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[0027] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : According to one embodiment, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent sous forme colloïdale par litre de composition.; - Between 20 mg and 250 mg of silver in colloidal form per liter of composition;
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra ; - Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition;
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’un extrait d’Hypericum perforatum ;- Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract and/or between 0.5 and 11% by weight of the composition of an extract of Hypericum perforatum;
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[0028] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend en outre : According to one embodiment, said composition for use according to the invention further comprises:
- De l’argent sous forme ionique ; - Silver in ionic form;
[0029] Par argent ionique est entendu selon l’invention de l’argent dont les particules ont été dissoutes dans l’eau, a contrario de l’argent colloïde où lesdites particules sont en suspension dans l’eau. By ionic silver is understood according to the invention silver whose particles have been dissolved in water, on the contrary colloidal silver where said particles are suspended in water.
[0030] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon ce dernier mode de réalisation comprend : According to one embodiment, said composition for use according to this latter embodiment comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent total par litre de composition, réparti en i. Entre 70 et 99,99% en poids total d’argent, d’argent sous forme colloïdale ; ii. Entre 0,01 et 30% en poids total d’argent, d’argent sous forme ionique.- Between 20 mg and 250 mg of total silver per liter of composition, divided into i. Between 70 and 99.99% by total weight of silver, silver in colloidal form; ii. Between 0.01 and 30% by total weight of silver, silver in ionic form.
[0031] Par argent total est entendu selon l’invention l’ensemble de l’argent compris dans la composition selon l’invention, quelle que soit sa forme. By total silver is understood according to the invention all of the silver included in the composition according to the invention, whatever its form.
[0032] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation comprend : According to one embodiment, said composition for use comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent total par litre de composition, réparti en i. Entre 70 et 99,99% en poids total d’argent, d’argent sous forme colloïdale ; ii. Entre 0,01 et 30% en poids total d’argent, d’argent sous forme ionique ;- Between 20 mg and 250 mg of total silver per liter of composition, divided into i. Between 70 and 99.99% by total weight of silver, silver in colloidal form; ii. Between 0.01 and 30% by total weight of silver, silver in ionic form;
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra ; - Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition;
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’extrait d’Hypericum perforatum ;- Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract and/or between 0.5 and 11% by weight of the composition of Hypericum perforatum extract;
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[0033] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention, comprend en outre :
- Un extrait d’Echinacea, et/ou According to one embodiment, said composition for use according to the invention further comprises: - An extract of Echinacea, and/or
- De la Propolis et/ou - Propolis and/or
- Un extrait d’ Artemisia et/ou - An extract of Artemisia and/or
- Un extrait d’ Allium sativum. - An extract of Allium sativum.
[0034] Les Echinacea, ou échinacées, désignent un genre de plantes de la famille des Astéracées. Lesdits extraits prennent la forme d’extraits secs, aqueux et/ou alcoolique, produits à partir de la racine, de la plante entière ou des parties aériennes. Echinacea, or coneflowers, designate a genus of plants of the Asteraceae family. Said extracts take the form of dry, aqueous and/or alcoholic extracts, produced from the root, the whole plant or the aerial parts.
[0035] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 8% en poids de la composition d’extrait d’Echinacea. - Between 0.01 and 8% by weight of the Echinacea extract composition.
[0036] Allium sativum, plante plus communément appelée « Ail » est une espèce de plante vivace. Les extraits peuvent prendre la forme d’un extrait sec, aqueux et/ou alcoolique, ou d’un extrait d’ail vieilli. [0036] Allium sativum, a plant more commonly known as "garlic", is a species of perennial plant. Extracts can take the form of a dry, aqueous and/or alcoholic extract, or an aged garlic extract.
[0037] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 10% en poids de la composition d’extrait d’ Allium sativum. - Between 0.01 and 10% by weight of the Allium sativum extract composition.
[0038] La « propolis » est un produit dérivé de résines et d'exsudats végétaux, qui peut être secrété par les végétaux ou fabriqué par les abeilles à partir de résine végétale et de cire. Comme la propolis dépend des espèces de plantes à partir desquelles elle est produite, de la propolis standardisée est produite, souvent définie par leur couleur. De manière préférée, on utilisera ici de la propolis jaune, verte, ou rouge. Ledit propolis peut être présenté sous forme d’extrait sec, purifié, aqueux et/ou alcoolique. [0038] “Propolis” is a product derived from plant resins and exudates, which can be secreted by plants or produced by bees from plant resin and wax. As propolis depends on the species of plants from which it is produced, standardized propolis is produced, often defined by their color. Preferably, yellow, green or red propolis will be used here. Said propolis can be presented in the form of a dry, purified, aqueous and/or alcoholic extract.
[0039] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 7% en poids de la composition de propolis. - Between 0.01 and 7% by weight of the propolis composition.
[0040] L’artémisia ou Armoise, est un genre d’espèces végétales comprenant des herbacées, des arbrisseaux et des arbustes, dotés des feuilles pennées. De manière préférée, l’espèce utilisée selon l’invention est Artemisia annua. Cette dernière est une plante herbacée ramifiée aromatique. Les extraits provenant de cette plante peuvent provenir de la plante entière ou des parties aériennes, et être des extraits sec, aqueux et/ou alcooliques. Artemisia or Mugwort is a genus of plant species comprising herbaceous plants, shrubs and shrubs, with pinnate leaves. Preferably, the species used according to the invention is Artemisia annua. The latter is an aromatic branched herbaceous plant. Extracts from this plant can come from the whole plant or from the aerial parts, and be dry, aqueous and/or alcoholic extracts.
[0041] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 0,5 et 3% en poids de la composition d’extrait d’ Artemisia. - Between 0.5 and 3% by weight of the Artemisia extract composition.
[0042] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend : Preferably, said composition for use according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 8% en poids de la composition d’extrait d’Echinacea, et/ou - Between 0.01 and 8% by weight of the Echinacea extract composition, and/or
- Entre 0,01 et 7% en poids de la composition de Propolis, et/ou - Between 0.01 and 7% by weight of the Propolis composition, and/or
- Entre 0,5 et 3% en poids de la composition d’extrait d’ Artemisia, et/ou - Between 0.5 and 3% by weight of the Artemisia extract composition, and/or
- Entre 0,01 et 10% en poids de la composition d’extrait d’ Allium sativum. - Between 0.01 and 10% by weight of the Allium sativum extract composition.
[0043] De manière préférée selon l’invention, ladite composition pour utilisation selon l’invention comprend au moins un autre agent dermatologiquement et/ou pharmaceutiquement acceptable.
[0044] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention est destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antiviral, antibactérien et antifongique. Preferably according to the invention, said composition for use according to the invention comprises at least one other dermatologically and/or pharmaceutically acceptable agent. According to one embodiment, said composition for use according to the invention is intended to be used in prophylaxis and/or antiviral, antibacterial and antifungal treatment.
[0045] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention est destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antiviral. According to one embodiment, said composition for use according to the invention is intended to be used in prophylaxis and/or antiviral treatment.
[0046] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention est destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antibactérien. According to one embodiment, said composition for use according to the invention is intended to be used in prophylaxis and/or antibacterial treatment.
[0047] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention est destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antifongique. According to one embodiment, said composition for use according to the invention is intended to be used in prophylaxis and/or antifungal treatment.
[0048] Selon un mode de réalisation, ladite composition pour utilisation selon l’invention est destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antibactérien et antifongique. According to one embodiment, said composition for use according to the invention is intended to be used in prophylaxis and/or antibacterial and antifungal treatment.
[0049] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention peut être administrée par voie orale, en intraveineuse, en sous-cutanée, par voie nasale, par voie ophtalmique, par voie auriculaire, par voie rectale, par voie vaginale, par voie respiratoire, ou par application sur la peau. Preferably, said composition for use according to the invention can be administered orally, intravenously, subcutaneously, nasally, ophthalmically, auricularly, rectally, vaginally, via the respiratory route, or by application to the skin.
[0050] De manière encore plus préférée, la voie orale peut prendre la forme d’un comprimé, d’un sirop, d’une solution ou d’une suspension buvable, une gélule, Even more preferably, the oral route can take the form of a tablet, a syrup, a drinkable solution or suspension, a capsule,
[0051] De manière encore plus préférée, la voie intraveineuse peut prendre la forme d’une solution. Even more preferably, the intravenous route can take the form of a solution.
[0052] De manière encore plus préférée, la voie sous-cutanée peut prendre la forme d’une solution. Even more preferably, the subcutaneous route can take the form of a solution.
[0053] De manière encore plus préférée, la voie d’application sur la peau peut prendre la forme d’une pommade, une crème, un patch ou un gel. [0053] Even more preferably, the route of application to the skin can take the form of an ointment, a cream, a patch or a gel.
[0054] De manière préférée, l’administration est réalisée par voie respiratoire ou nasale. Preferably, the administration is carried out by the respiratory or nasal route.
[0055] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention est administrée par voie respiratoire ou nasale, sous la forme de gouttes nasales, spray nasal, de poudre nasale, d’aérosol, par exemple des aérosols et/ou spray nasal à gaz comprimé, ou d’un nébuli- seur. Preferably, said composition for use according to the invention is administered by the respiratory or nasal route, in the form of nasal drops, nasal spray, nasal powder, aerosol, for example aerosols and/or nasal spray compressed gas, or a nebulizer.
[0056] Avantageusement, lorsque la composition pharmaceutique est adaptée pour une administration nasale ou par voie respiratoire, elle peut avantageusement être à visées broncho-pulmonaires ou sinusale. Advantageously, when the pharmaceutical composition is suitable for nasal or respiratory administration, it can advantageously be for broncho-pulmonary or sinus purposes.
[0057] De manière préférée, ladite composition pour utilisation selon l’invention est administrée par aérosol dans les voies nasales. Preferably, said composition for use according to the invention is administered by aerosol in the nasal passages.
[0058] La composition selon la présente invention peut être administrée à un patient quotidiennement, une fois par jour, deux fois par jour, trois fois par jour ou encore plus de fois par jour. De manière préférée, la composition de la présente invention est administrée à un patient deux fois par jour et toutes les 12 heures. The composition according to the present invention can be administered to a patient daily, once a day, twice a day, three times a day or even more times a day. Preferably, the composition of the present invention is administered to a patient twice a day and every 12 hours.
[0059] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend, en poids de la composition : According to one embodiment of the invention, said composition comprises, by weight of the composition:
- Eau Purifiée de grade pharmaceutique : qsp - Purified water of pharmaceutical grade: qsp
- 20 mg d’ Argent au total à hauteur de 20% d’argent sous forme ionique et 80% d’argent
sous forme colloïde, de taille de particule moyenne 0,8nm ; - 20 mg of silver in total up to 20% silver in ionic form and 80% silver in colloid form, with an average particle size of 0.8 nm;
- 0,9% d’extrait de Sambucus Nigra ; - 0.9% Sambucus Nigra extract;
- 5% d’extrait d’Hypericum perforatum ; - 5% Hypericum perforatum extract;
- 1,5% d’extrait sec Pélargonium sidoides ; - 1.5% Pelargonium sidoides dry extract;
- 3% extrait sec Echinacea ; - 3% Echinacea dry extract;
- 4% extrait purifié Propolis. - 4% purified Propolis extract.
[0060] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend, en poids de la composition : According to one embodiment of the invention, said composition comprises, by weight of the composition:
- Eau Purifiée de grade pharmaceutique : qsp - Purified water of pharmaceutical grade: qsp
- 20 mg d’ Argent au total à hauteur de 20% d’argent sous forme ionique et 80% d’argent sous forme colloïde, de taille de particule moyenne 0,8nm ; - 20 mg of silver in total up to 20% silver in ionic form and 80% silver in colloid form, with an average particle size of 0.8 nm;
- 0,9% d’extrait de Sambucus Nigra ; - 0.9% Sambucus Nigra extract;
- 5% d’extrait sec Primulae flos cum calycibus ; - 5% Primulae flos cum calycibus dry extract;
- 5% d’extrait d’Hypericum perforatum ; - 5% Hypericum perforatum extract;
- 1,5% d’extrait sec Pélargonium sidoides ; - 1.5% Pelargonium sidoides dry extract;
- 3% extrait sec Echinacea ; - 3% Echinacea dry extract;
- 4% extrait purifié Propolis. - 4% purified Propolis extract.
[0061] De manière plus préférée, la composition pour utilisation selon l’invention prend la forme d’une crème à application topique. More preferably, the composition for use according to the invention takes the form of a cream for topical application.
[0062] Selon un mode de réalisation, ladite crème à application topique est une crème antifongique. According to one embodiment, said topical application cream is an antifungal cream.
[0063] Selon un mode de réalisation, ladite crème à application topique est une crème antibactérienne. According to one embodiment, said topical application cream is an antibacterial cream.
[0064] De manière encore plus préférée, ladite crème à application topique est une crème antifongique et antibactérienne. [0064] Even more preferably, said topical application cream is an antifungal and antibacterial cream.
[0065] La composition pour utilisation selon la présente invention, sous forme de crème antifongique et/ou antibactérienne à application topique, peut être appliquée topiquement à un patient quotidiennement, une fois par jour, deux fois par jour, trois fois par jour ou encore plus de fois par jour. De manière préférée, la composition de la présente invention est administrée à un patient deux fois par jour et toutes les 12 heures. The composition for use according to the present invention, in the form of an antifungal and/or antibacterial cream for topical application, can be applied topically to a patient daily, once a day, twice a day, three times a day or even more times a day. Preferably, the composition of the present invention is administered to a patient twice a day and every 12 hours.
[0066] Selon un mode de réalisation différent, ladite composition est utilisée en tant qu’ antibiotique. [0066] According to a different embodiment, said composition is used as an antibiotic.
[0067] De manière préférée, ladite composition est utilisée en tant qu’ antibiotique pour traiter les patients antibioresistants. Preferably, said composition is used as an antibiotic to treat antibiotic-resistant patients.
[0068] L’antibiorésistance est un phénomène qui consiste, pour un organisme pathogène, à devenir résistant aux antibiotiques. Ces organismes évoluent et développent des mécanismes de défense leur permettant d’empêcher le fonctionnement des traitements antibiotiques. Ces traitements deviennent de fait inefficaces. Antibiotic resistance is a phenomenon which consists, for a pathogenic organism, in becoming resistant to antibiotics. These organisms evolve and develop defense mechanisms that allow them to prevent antibiotic treatments from working. These treatments become ineffective.
[0069] De manière préférée, ladite composition pour utilisation en tant qu’ antibiotique peut être administrée par voie orale, en intraveineuse, en sous-cutanée, par voie nasale, par voie ophtalmique, par voie auriculaire, par voie rectale, par voie vaginale, par voie respiratoire,
ou par application sur la peau. Preferably, said composition for use as an antibiotic can be administered orally, intravenously, subcutaneously, nasally, ophthalmically, auricularly, rectally, vaginally. , through the respiratory tract, or by application to the skin.
[0070] De manière encore plus préférée, la voie orale peut prendre la forme d’un comprimé, d’un sirop, d’une solution ou d’une suspension buvable, une gélule, Even more preferably, the oral route can take the form of a tablet, a syrup, a drinkable solution or suspension, a capsule,
[0071] De manière encore plus préférée, la voie intraveineuse peut prendre la forme d’une solution. Even more preferably, the intravenous route can take the form of a solution.
[0072] De manière encore plus préférée, la voie sous-cutanée peut prendre la forme d’une solution. Even more preferably, the subcutaneous route can take the form of a solution.
[0073] De manière encore plus préférée, la voie d’application sur la peau peut prendre la forme d’une pommade, une crème, un patch ou un gel. [0073] Even more preferably, the route of application to the skin can take the form of an ointment, a cream, a patch or a gel.
[0074] Selon un deuxième aspect, l’invention concerne une composition comprenant : According to a second aspect, the invention relates to a composition comprising:
- De l’argent sous forme colloïdale ; - Silver in colloidal form;
- Un extrait de Sambucus Nigra ; - An extract of Sambucus Nigra;
- Un extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou un extrait d’Hypericum perforatum ;- An extract of Primulae flos cum calycibus and/or an extract of Hypericum perforatum;
- Un extrait de pélargonium sidoides. - An extract of pelargonium sidoides.
[0075] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent sous forme colloïdale par litre de composition. - Between 20 mg and 250 mg of silver in colloidal form per liter of composition.
[0076] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra. - Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition.
[0077] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus. - Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract.
[0078] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’un extrait d’Hypericum perforatum. - Between 0.5 and 11% by weight of the composition of an extract of Hypericum perforatum.
[0079] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[0080] Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend : According to one embodiment, said composition comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent sous forme colloïdale par litre de composition.; - Between 20 mg and 250 mg of silver in colloidal form per liter of composition;
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra ; - Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition;
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’un extrait d’Hypericum perforatum ; - Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract and/or between 0.5 and 11% by weight of the composition of an extract of Hypericum perforatum;
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[0081] Selon un mode de réalisation, ladite composition selon l’invention comprend en outre : According to one embodiment, said composition according to the invention further comprises:
- De l’argent sous forme ionique ; - Silver in ionic form;
[0082] Selon un mode de réalisation, ladite composition selon ce dernier mode de réalisation comprend : According to one embodiment, said composition according to this latter embodiment comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent total par litre de composition, réparti en i. Entre 70 et 99,99% en poids total d’argent, d’argent sous forme colloïdale ; ii. Entre 0,01 et 30% en poids total d’argent, d’argent sous forme ionique.
[0083] Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend : - Between 20 mg and 250 mg of total silver per liter of composition, divided into i. Between 70 and 99.99% by total weight of silver, silver in colloidal form; ii. Between 0.01 and 30% by total weight of silver, silver in ionic form. According to one embodiment, said composition comprises:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent total par litre de composition, réparti en i. Entre 70 et 99,99% en poids total d’argent, d’argent sous forme colloïdale ; ii. Entre 0,01 et 30% en poids total d’argent, d’argent sous forme ionique ; - Between 20 mg and 250 mg of total silver per liter of composition, divided into i. Between 70 and 99.99% by total weight of silver, silver in colloidal form; ii. Between 0.01 and 30% by total weight of silver, silver in ionic form;
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra ; - Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition;
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’extrait d’Hypericum perforatum ; - Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract and/or between 0.5 and 11% by weight of the composition of Hypericum perforatum extract;
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[0084] Selon un mode de réalisation, ladite composition selon l’invention, comprend en outre : According to one embodiment, said composition according to the invention further comprises:
- Un extrait d’Echinacea, et/ou - An extract of Echinacea, and/or
- De la Propolis et/ou - Propolis and/or
- Un extrait d’ Artemisia et/ou - An extract of Artemisia and/or
- Un extrait d’ Allium sativum. - An extract of Allium sativum.
[0085] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 8% en poids de la composition d’extrait d’Echinacea. - Between 0.01 and 8% by weight of the Echinacea extract composition.
[0086] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 10% en poids de la composition d’extrait d’ Allium sativum. - Between 0.01 and 10% by weight of the Allium sativum extract composition.
[0087] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 7% en poids de la composition de propolis. - Between 0.01 and 7% by weight of the propolis composition.
[0088] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,5 et 3% en poids de la composition d’extrait d’ Artemisia. - Between 0.5 and 3% by weight of the Artemisia extract composition.
[0089] De manière préférée, ladite composition selon l’invention comprend : Preferably, said composition according to the invention comprises:
- Entre 0,01 et 8% en poids de la composition d’extrait d’Echinacea, et/ou - Between 0.01 and 8% by weight of the Echinacea extract composition, and/or
- Entre 0,01 et 7% en poids de la composition de Propolis, et/ou - Between 0.01 and 7% by weight of the Propolis composition, and/or
- Entre 0,5 et 3% en poids de la composition d’extrait d’ Artemisia, et/ou - Between 0.5 and 3% by weight of the Artemisia extract composition, and/or
- Entre 0,01 et 10% en poids de la composition d’extrait d’ Allium sativum. - Between 0.01 and 10% by weight of the Allium sativum extract composition.
[0090] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend, en poids de la composition : According to one embodiment of the invention, said composition comprises, by weight of the composition:
- Eau Purifiée de grade pharmaceutique : qsp - Purified water of pharmaceutical grade: qsp
- 20 mg d’ Argent au total à hauteur de 20% d’argent sous forme ionique et 80% d’argent sous forme colloïde, de taille de particule moyenne 0,8nm ; - 20 mg of silver in total up to 20% silver in ionic form and 80% silver in colloid form, with an average particle size of 0.8 nm;
- 0,9% d’extrait de Sambucus Nigra ; - 0.9% Sambucus Nigra extract;
- 5% d’extrait d’Hypericum perforatum ; - 5% Hypericum perforatum extract;
- 1,5% d’extrait sec Pélargonium sidoides ;
- 3% extrait sec Echinacea ; - 1.5% Pelargonium sidoides dry extract; - 3% Echinacea dry extract;
- 4% extrait purifié Propolis. - 4% purified Propolis extract.
[0091] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend, en poids de la composition : According to one embodiment of the invention, said composition comprises, by weight of the composition:
- Eau Purifiée de grade pharmaceutique : qsp - Purified water of pharmaceutical grade: qsp
- 20 mg d’ Argent au total à hauteur de 20% d’argent sous forme ionique et 80% d’argent sous forme colloïde, de taille de particule moyenne 0,8nm ; - 20 mg of silver in total up to 20% silver in ionic form and 80% silver in colloid form, with an average particle size of 0.8 nm;
- 0,9% d’extrait de Sambucus Nigra ; - 0.9% Sambucus Nigra extract;
- 5% d’extrait sec Primulae flos cum calycibus ; - 5% Primulae flos cum calycibus dry extract;
- 5% d’extrait d’Hypericum perforatum ; - 5% Hypericum perforatum extract;
- 1,5% d’extrait sec Pélargonium sidoides ; - 1.5% Pelargonium sidoides dry extract;
- 3% extrait sec Echinacea ; - 3% Echinacea dry extract;
- 4% extrait purifié Propolis. - 4% purified Propolis extract.
[0092] Selon un troisième aspect, l’invention concerne l’utilisation de la composition selon le second aspect de l’invention pour désinfecter une surface. According to a third aspect, the invention relates to the use of the composition according to the second aspect of the invention for disinfecting a surface.
[0093] On entend ici par désinfecter une surface l’application sur des surfaces inertes de la composition selon l’invention pour obtenir un effet anti-fongique et/ou antiviral et/ou antibacte- rien sur la surface sur laquelle elle est utilisée. [0093] The term disinfecting a surface here means the application to inert surfaces of the composition according to the invention to obtain an anti-fungal and/or antiviral and/or antibacterial effect on the surface on which it is used.
[0094] Les surfaces sur lesquelles sont utilisées cette composition peuvent généralement se trouver dans tous les lieux où il peut être nécessaire de nettoyer et de désinfecter une surface ou des objets ou appareils, par exemple dans l'industrie agro-alimentaire, les magasins, les restaurants, un environnement médical ou même chez les particuliers. The surfaces on which this composition is used can generally be found in all places where it may be necessary to clean and disinfect a surface or objects or devices, for example in the food industry, stores, restaurants, a medical environment or even in private homes.
[0095] De manière préférée selon l’invention, ladite surface est une surface présente dans un environnement médical, par exemple dans un cabinet médical, un hôpital, un laboratoire d’analyses, un cabinet vétérinaire. Preferably according to the invention, said surface is a surface present in a medical environment, for example in a doctor's office, a hospital, an analysis laboratory, a veterinary office.
[0096] Par surface présente dans un environnement médical on entend notamment les sols, les murs, les paillasses et les instruments médicaux. By surface present in a medical environment is meant in particular the floors, the walls, the benches and the medical instruments.
Exemples : Examples:
[0097] Exemple 1 : Exemple de composition : [0097] Example 1: Example of composition:
[0098] La composition comprend, pour 100 mL de composition : The composition comprises, for 100 mL of composition:
- 20 mg d’ Argent au total à hauteur de 20% d’argent sous forme ionique et 80% d’argent sous forme colloïde, de taille de particule moyenne 0,8nm. - 20 mg of silver in total up to 20% silver in ionic form and 80% silver in colloid form, with an average particle size of 0.8 nm.
- 0,9% d’extrait de Sambucus Nigra - 0.9% Sambucus Nigra extract
- 5% d’extrait sec Primulae flos cum calycibus et/ou d’Hypericum perforatum - 5% Primulae flos cum calycibus and/or Hypericum perforatum dry extract
- 1,5% d’extrait sec Pélargonium sidoides. - 1.5% Pelargonium sidoides dry extract.
- 3% extrait sec Echinacea - 3% Echinacea dry extract
- 4% extrait purifié Propolis. - 4% purified Propolis extract.
[0099] Exemple 2 : Activité antibactérienne de la composition de l’exemple 1. Example 2: Antibacterial activity of the composition of Example 1.
[0100] L’activité antibactérienne est étudiée en surveillant in vitro les densités de Staphylococcus aureus cultivables après l’ensemencement de souches testées et mise en contact avec la composition de l’exemple 1.
[0101] Les densités exprimées en UFC/ml sont mesurées pour des durées de 1, 3 et 24 heures, et permettent de caractériser un effet bactéricide. The antibacterial activity is studied by monitoring in vitro the densities of cultivable Staphylococcus aureus after seeding the strains tested and bringing them into contact with the composition of example 1. The densities expressed in CFU/ml are measured for periods of 1, 3 and 24 hours, and make it possible to characterize a bactericidal effect.
[0102] Les résultats montrent que la composition présente un effet bactéricide. The results show that the composition exhibits a bactericidal effect.
[0103] Exemple 3 : Effet anti-viral de la composition de l'exemple 1. Example 3: Anti-viral effect of the composition of example 1.
[0104] La composition de l'exemple 1 est testée selon le test d'évaluation de l'activité potentielle contre le HRV-A16 (un rhinovirus responsable des rhumes) sur une culture de cellules épithéliales des voies respiratoires humaines entièrement différenciées. Les compositions sont d'abord appliquées avant l'infection pendant une heure et la réplication est effectuée pendant 4 heures. 3 étapes de rinçage avec les formulations sont effectuées. Le reste est recueilli et l'ARN est dosé après la lyse des cellules. La même étape de collecte est effectuée 24 heures après et la même étape de dosage est effectuée. Le pourcentage exprime les changements dans l'ARN viral, résultant en pourcentage d'inhibition de la réplication du HRV-A16, conduisant à l'efficacité anti-virale. La composition selon l’exemple 1 est testée contre le rupintrivir (un composé antiviral connu, fournissant une réponse presque complète). Les résultats sont supérieurs pour la composition selon l’exemple 1. The composition of example 1 is tested according to the test for evaluating potential activity against HRV-A16 (a rhinovirus responsible for colds) on a culture of fully differentiated human airway epithelial cells. The compositions are first applied before infection for one hour and replication is carried out for 4 hours. 3 rinsing steps with the formulations are carried out. The rest is collected and the RNA is assayed after cell lysis. The same collection step is performed 24 hours later and the same assay step is performed. The percentage expresses the changes in viral RNA, resulting in percentage inhibition of HRV-A16 replication, leading to anti-viral efficacy. The composition according to example 1 is tested against rupintrivir (a known antiviral compound, providing an almost complete response). The results are superior for the composition according to Example 1.
[0105] Exemple 4 : Activité antifongique de la composition selon l’exemple 1 : Example 4: Antifungal activity of the composition according to Example 1:
[0106] Une souche de Scytalidium dimidiatum est obtenue par séparation et identification de couche cornée de patients atteints de mycose superficielle. Les champignons pré-cultivés sur un milieu SDA sont mis en suspension dans une solution saline stérile contenant du Tween 80 à 0,1% (p/v) et la suspension est filtrée à travers une gaze pour recueillir les arthrospores. Celle-ci est mise en suspension dans une solution saline stérile contenant du Tween 80 à 0,1 % (p/v), puis ajoutée à un milieu contenant du bleu d'Alamar à 20 % à 2 x 104 cellules/ml pour donner une solution d'inoculum fongique. [0106] A strain of Scytalidium dimidiatum is obtained by separation and identification of the stratum corneum of patients suffering from superficial mycosis. Fungi pre-cultivated on SDA medium are suspended in a sterile saline solution containing 0.1% (w/v) Tween 80 and the suspension is filtered through cheesecloth to collect the arthrospores. This is suspended in a sterile saline solution containing 0.1% (w/v) Tween 80, then added to a medium containing 20% Alamar blue at 2 x 10 4 cells/ml to give fungal inoculum solution.
[0107] La composition selon l’exemple 1 a été utilisé, ainsi que du luliconazole. The composition according to Example 1 was used, as well as luliconazole.
[0108] Méthode d'essai [0108] Test method
[0109] La concentration minimale inhibitrice (CMI ou MIC) est mesurée par une méthode de microdilution du bouillon. C'est-à-dire que le milieu RPMI1640 (Sigma-Aldrich) a été tamponné avec de l'acide morpholine propanesulfonique 0,165 M (MOPS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) à pH 7,0, et une quantité donnée d'une solution de la composition selon l’exemple 1 ou de luliconazole est ajoutée pour préparer des séries de dilutions doubles dans la gamme de 0,00098-4 pg/mL. Sont ajoutés 100 pl à une microplaque de 96 puits, puis une solution d'inoculum fongique (100 pl, concentration finale des champignons à ajouter : 1,0 x 104 cellules/ml) et le mélange est cultivé à 35°C. Un réactif au bleu d'Alamar est préalablement ajouté au milieu de culture (concentration finale de l'addition : 10 %) et, au moment où le réactif au bleu d'Alamar dans le groupe témoin de croissance sans médicament passe du bleu au rouge, la culture est interrompue et l'absorbance (densité optique différentielle à 570 nm sur la base de 590 nm a servi de référence) mesurée. La concentration minimale de la composition selon l’exemple 1 ou de luliconazole qui a inhibé la croissance du champignon dans le groupe de contrôle de croissance de 80% ou plus est prise comme CMI. La concentration devant être la CMI (CMI90) dans 9 souches sur les 10 souches mesurées (90 %) est déterminée.
[0110] Documents de référence pour la méthode de mesure : Takako Shinoda et autres : avis proposé par le Comité des normes de laboratoire clinique de la Société japonaise de mycologie médicale (1995 - 1997), Method for antifungal susceptibility testing of filamentous fungus, Medical Mycology Journal, 40 : 239-257, 1999. Institut des normes de laboratoire clinique / Comité national des normes de laboratoire clinique. Méthode de référence pour les essais de sensibilité aux antifongiques des champignons filamenteux par dilution dans un bouillon de culture. Norme approuvée M38-A2. Wayne, PA : Comité national pour les normes de laboratoire clinique, 2008. The minimum inhibitory concentration (MIC or MIC) is measured by a broth microdilution method. That is, RPMI1640 medium (Sigma-Aldrich) was buffered with 0.165 M morpholine propanesulfonic acid (MOPS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at pH 7.0, and a given amount of A solution of the composition according to Example 1 or luliconazole is added to prepare two-fold dilution series in the range of 0.00098-4 pg/mL. 100 μl are added to a 96-well microplate, then a solution of fungal inoculum (100 μl, final concentration of fungi to be added: 1.0×10 4 cells/ml) and the mixture is cultured at 35°C. An Alamar blue reagent is previously added to the culture medium (final concentration of the addition: 10%) and, at the moment when the Alamar blue reagent in the growth control group without drug changes from blue to red , the culture is interrupted and the absorbance (differential optical density at 570 nm on the basis of 590 nm served as a reference) measured. The minimum concentration of the composition according to Example 1 or of luliconazole which inhibited the growth of the fungus in the growth control group by 80% or more is taken as the MIC. The concentration to be the MIC (MIC90) in 9 strains out of the 10 strains measured (90%) is determined. [0110] Reference documents for the measurement method: Takako Shinoda et al.: opinion proposed by the Clinical Laboratory Standards Committee of the Japanese Society of Medical Mycology (1995 - 1997), Method for antifungal susceptibility testing of filamentous fungus, Medical Mycology Journal, 40: 239-257, 1999. Clinical Laboratory Standards Institute/National Clinical Laboratory Standards Committee. Reference method for testing the antifungal susceptibility of filamentous fungi by dilution in culture broth. Standard approved M38-A2. Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2008.
[OU I] Résultats [OR I] Results
[0112] La CMI de la composition selon l’exemple 1 est supérieur au luliconazole, démontrant une activité antifongique spécifiquement forte. The MIC of the composition according to example 1 is higher than luliconazole, demonstrating a specifically strong antifungal activity.
[0113] Exemple 5 : Test d’efficacité in vivo antivirale, antibactérienne, antifongique Example 5: In vivo antiviral, antibacterial, antifungal efficacy test
[0114] Deux groupes de 20 patients chacun, souffrant d’infection virale, fongique et/ou bactérienne, ont été traités avec la composition décrite dans l'exemple 1 ou par une solution saline (PLACEBO). Le traitement consistait à pulvériser la composition de l’exemple 1 et PLACEBO deux fois par jour. Le traitement a duré deux semaines. L'efficacité du traitement a été évaluée au moyen d'un score total en fonction des symptômes, en lien avec des prélèvements réalisés par écouvillons. Les scores, évalués au début et à la fin du traitement avec le t-test de Student, ont été utilisés pour attribuer un score d’efficacité avec la même méthode statistique. Two groups of 20 patients each, suffering from viral, fungal and/or bacterial infection, were treated with the composition described in Example 1 or with a saline solution (PLACEBO). The treatment consisted of spraying the composition of example 1 and PLACEBO twice a day. The treatment lasted two weeks. Efficacy of treatment was assessed using a total symptom score, linked to swab samples. The scores, evaluated at the beginning and at the end of the treatment with the Student's t-test, were used to assign an efficacy score with the same statistical method.
[0115] Les résultats ont démontré que la composition de l'exemple 1 était plus efficace que la solution saline. The results demonstrated that the composition of example 1 was more effective than the saline solution.
[0116] Exemple 6 : Protocole d’études de l’activité antimicrobienne in vitro pour la combinaison d’extraits de pélargonium sidoides, de Sambucus Nigra et d’Hypericum perforatum avec de l’argent sous forme colloïdale : Example 6: Protocol for studies of the in vitro antimicrobial activity for the combination of extracts of pelargonium sidoides, Sambucus nigra and Hypericum perforatum with silver in colloidal form:
[0117] Les présentes études ont été réalisées pour tester et évaluer l'activité antimicrobienne d'extraits de Pelargonium sidoides, Hypericum perforatum et de fruits de Sambucus nigra combinés dans de l’argent colloïdal contre des micro-organismes Gram-négatifs et Gram-positifs, l'une des causes les plus courantes d'infections difficiles à traiter chez les humains et les animaux. [0117] The present studies were carried out to test and evaluate the antimicrobial activity of extracts of Pelargonium sidoides, Hypericum perforatum and Sambucus nigra fruits combined in colloidal silver against Gram-negative and Gram- positive, one of the most common causes of hard-to-treat infections in humans and animals.
[0118] Matériels et méthodes [0118] Materials and methods
[0119] Extraits de plantes : L'effet antimicrobien d'extraits de géranium africain (Pelargonium sidoides DC.), de millepertuis (Hypericum perforatum L.) et de sureau noir (Sambucus nigra L.) dans de l’argent sous forme colloïdale (AgNPs) à une concentration de 30 ppm a été testé. [0119] Plant extracts: The antimicrobial effect of extracts of African geranium (Pelargonium sidoides DC.), St. John's wort (Hypericum perforatum L.) and black elderberry (Sambucus nigra L.) in colloidal silver (AgNPs) at a concentration of 30 ppm was tested.
[0120] Préparation de la combinaison de plantes dans les AgNPs : A 80 ml d’argent colloïdal 30 ppm ont été ajoutés : 2 g d'extrait de géranium africain (10 capsules de 200 mg) ; 2 g d'extrait de sureau noir (5 ml de sirop de sucre concentré) ; 20 ml d'extrait aqueux de millepertuis - 0,4 g (1 g de fleurs séchées bouillies dans 50 ml d'eau pendant 3 minutes et trempées pendant 30 minutes. [0120] Preparation of the combination of plants in the AgNPs: To 80 ml of 30 ppm colloidal silver were added: 2 g of African geranium extract (10 capsules of 200 mg); 2 g of black elderberry extract (5 ml of concentrated sugar syrup); 20 ml of water extract of St. John's wort - 0.4 g (1 g of dried flowers boiled in 50 ml of water for 3 minutes and soaked for 30 minutes.
[0121] Contrôle. L'antibiotique à large spectre thiamphénicol (Nikovet - Sofia) a été utilisé comme témoin positif, auquel les micro-organismes testés n'ont pas montré de résistance.
[0122] Micro-organismes. Des cultures pures de 7 souches pathogènes ont été testées : Esherichia coli ATCC - 8739 (NBIMCC 3397), Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 1304 (NBIMCC 8691), Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC - 6538 (NBIMCC 3359), Clostridium perfringens ATCC 13124 (NBIMCC 8615) et Candida albicans ATCC 10231 (NBIMCC 74). Les deux autres (Pseudominas aeruginosa et Streptococcus pyogenes) ont été isolés à partir de sécrétions inflammatoires cutanées de chiens dans le laboratoire de microbiologie de la clinique universitaire de la faculté de médecine vétérinaire de l'université de foresterie à Sofia. [0121] Control. The broad-spectrum antibiotic thiamphenicol (Nikovet - Sofia) was used as a positive control, to which the microorganisms tested did not show resistance. [0122] Microorganisms. Pure cultures of 7 pathogenic strains were tested: Esherichia coli ATCC - 8739 (NBIMCC 3397), Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 1304 (NBIMCC 8691), Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC - 6538 (NBIMCC 3359), Clostridium perfringens ATCC 13124 (NBIMCC 8615) and Candida albicans ATCC 10231 (NBIMCC 74). The other two (Pseudominas aeruginosa and Streptococcus pyogenes) were isolated from inflammatory skin secretions of dogs in the microbiology laboratory of the University Clinic of the Faculty of Veterinary Medicine of the University of Forestry in Sofia.
[0123] Milieux nutritifs. La gélose et le bouillon de culture Mueller Hinton (BUL BIO NCIPD - Sofia), la gélose de sang Columbia (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utra 43) ont été utilisés, ainsi que des milieux sélectifs : gélose Endo (Antisel - Sharlau Chemie SA, Espagne) pour E. coli et S. enterica, gélose au cétrimide (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utr.) pour P. aeruginosa, gélose Perfringens TSC (MkB Test as, République slovaque), ainsi que gélose Zeissler (BUL BIO NCIPD - Sofia) pour C. perfringens et gélose Sabouraud dextrose au chloramphénicol (Antisel - Sharlau Chemie SA, Espagne) pour C. albicans. Nutrient media. Mueller Hinton agar and culture broth (BUL BIO NCIPD - Sofia), Columbia blood agar (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utra 43) were used, as well as selective media: Endo agar (Antisalt - Sharlau Chemie SA, Spain) for E. coli and S. enterica, cetrimide agar (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utr.) for P. aeruginosa, Perfringens TSC agar (MkB Test as, Slovak Republic), as well as Zeissler agar (BUL BIO NCIPD - Sofia) for C. perfringens and Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol (Antisel - Sharlau Chemie SA, Spain) for C. albicans.
[0124] La culture des micro-organismes a été réalisée à 35-37° C pendant 18-24 et 72 heures en milieu anaérobie pour C. perfringens et en conditions aérobies pour les autres espèces microbiennes. Le système Anaerob Pack avec catalyseur au palladium - H2 + CO2 (BUL BIO NCIPD - Sofia) en bocal a été utilisé pour créer des conditions anaérobies. L'indicateur Indic Strip (BUL BIO NCIPD - Sofia) a été utilisé pour prouver la réalisation de l'anaéro- biose. The culture of the microorganisms was carried out at 35-37° C. for 18-24 and 72 hours in an anaerobic medium for C. perfringens and in aerobic conditions for the other microbial species. The Anaerob Pack system with palladium catalyst - H2 + CO2 (BUL BIO NCIPD - Sofia) in a jar was used to create anaerobic conditions. The Indic Strip indicator (BUL BIO NCIPD - Sofia) was used to prove the achievement of anaerobiosis.
[0125] Les études préliminaires des substances ont été réalisées par la méthode classique de diffusion sur gélose de Bauer et al. (1966) et selon le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M2 -A3 (1997, 1999). Des suspensions de micro-organismes d'essai ont été inoculées en phase de croissance exponentielle à une dose de 2 106 cellules/ml dans un volume de 0,1 ml dans des boîtes de Petri de 9 cm de diamètre sur gélose Zeissler pour C. perfringens et sur gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, avec un pH de 7,2 - 7,4 et une épaisseur de couche de 4 mm. Les extraits de plantes en argent colloïdal et l'antibiotique témoin ont été appliqués par 0,1 ml dans des puits de 9 mm de diamètre dans la gélose. La combinaison d'extraits végétaux contient 2 mg de P. sidoides, 2 mg de S. nigra, 0,4 mg de H. perforatum et 24 ppm d'AgNPs dans 0,1 ml, et du thiamphé- nicol - 30 pg dans 0,1 ml (selon les besoins). Après une incubation de 3-4 heures à température ambiante pour la diffusion, les cultures ont été incubées à 35-37° C pendant 18-24 et 72 heures. Les résultats ont été lus en mesurant les diamètres des zones inhibitrices en millimètres, y compris le diamètre du puits à 1 mm près, avec une règle transparente à l'extérieur du fond des plaques. Selon les trois étapes du Système Bauer-Kirby, un effet inhibiteur des extraits de plantes avec des AgNP a été observé dans les zones > 12 mm, et du thiamphénicol - à > 17 mm. La sensibilité des microorganismes testés a été déterminée comme pour les préparations non antibiotiques telles que les sulfamides, à savoir : résistante (R) - dans les zones de diamètre < 12 mm, modérément sensible - intermédiaire (I) - dans les zones de 13 à 16 mm et sensible (S) à > 17 mm. Pour le thiamphénicol, les limites correspondantes sont les suivantes : R < 12 mm, 1 - 13 - 17 mm et S - > 18 mm (NCCLS,
1997, 1999). The preliminary studies of the substances were carried out by the classic method of diffusion on agar of Bauer et al. (1966) and according to the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M2 -A3 (1997, 1999). Suspensions of test microorganisms were inoculated in the exponential growth phase at a dose of 2×10 6 cells/ml in a volume of 0.1 ml in Petri dishes 9 cm in diameter on Zeissler agar for C perfringens and on Mueller-Hinton agar for other microorganisms, with a pH of 7.2 - 7.4 and a layer thickness of 4 mm. The colloidal silver plant extracts and the control antibiotic were applied by 0.1 ml in 9 mm diameter wells in the agar. The combination of plant extracts contains 2 mg of P. sidoides, 2 mg of S. nigra, 0.4 mg of H. perforatum and 24 ppm of AgNPs in 0.1 ml, and thiamphenicol - 30 pg in 0.1ml (as needed). After a 3-4 hour incubation at room temperature for diffusion, the cultures were incubated at 35-37°C for 18-24 and 72 hours. Results were read by measuring the diameters of the inhibitory zones in millimeters, including the diameter of the well to the nearest 1 mm, with a transparent ruler outside the bottom of the plates. According to the three stages of the Bauer-Kirby System, an inhibitory effect of plant extracts with AgNPs was observed in areas > 12 mm, and of thiamphenicol - at > 17 mm. The susceptibility of the microorganisms tested was determined as for non-antibiotic preparations such as sulfonamides, namely: resistant (R) - in areas of diameter < 12 mm, moderately sensitive - intermediate (I) - in areas of 13 to 16 mm and susceptible (S) to > 17 mm. For thiamphenicol, the corresponding limits are as follows: R < 12 mm, 1 - 13 - 17 mm and S - > 18 mm (NCCLS, 1997, 1999).
[0126] Les concentrations minimales inhibitrices (CMI ou MIC) ont été déterminées par la méthode des dilutions sérielles doubles dans la gélose Zeissler pour C. perfringens et la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, décrite par Ericsson et Sherris (1971) et NCCLS (1999). Des suspensions bactériennes ont été appliquées à une dose de 106 cel- lules/ml. La combinaison d'extraits de plantes testée, composée de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum, ainsi que l'antibiotique témoin ont été administrés à différentes concentrations finales doublement croissantes par ml de gélose. Après incubation à 35-37° C pendant 18-24 heures, le nombre de colonies développées a été déterminé. Les CIM50 ont été calculées mathématiquement sur la base du nombre de colonies inhibées sur la gélose avec la dilution respective du composé testé par rapport aux colonies sur les milieux avec témoins sans extraits de plantes ni antibiotique. La plage d'inhibition de la croissance (D) a été définie comme la concentration sans croissance visible. The minimum inhibitory concentrations (MIC or MIC) were determined by the method of double serial dilutions in Zeissler agar for C. perfringens and Mueller-Hinton agar for the other microorganisms, described by Ericsson and Sherris (1971 ) and NCCLS (1999). Bacterial suspensions were applied at a dose of 10 6 cells/ml. The combination of plant extracts tested, composed of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum, as well as the control antibiotic were administered at different doubling increasing final concentrations per ml of agar. After incubation at 35-37°C for 18-24 hours, the number of colonies developed was determined. The MIC50s were calculated mathematically based on the number of colonies inhibited on the agar with the respective dilution of the test compound compared to the colonies on the media with controls without plant extracts or antibiotics. The growth inhibition range (D) was defined as the concentration with no visible growth.
[0127] Détermination du temps d'action antimicrobienne de la combinaison d'extraits de plantes dans les AgNP. Chaque millilitre de la combinaison contient 20 mg de P. sidoides, 20 mg de S. nigra et 4 mg de H. perforatum dans les AgNPs 30 ppm. [0127] Determination of the antimicrobial action time of the combination of plant extracts in the AgNPs. Each milliliter of the combination contains 20 mg of P. sidoides, 20 mg of S. nigra and 4 mg of H. perforatum in 30 ppm AgNPs.
- Une suspension de chacune des souches microbiennes testées à une concentration de 105 cellules/ml dans une quantité de 1 ml a été ajoutée à 9 ml de la combinaison d'extraits de plantes dans des AgNPs, atteignant une concentration finale de 104 cellules/ml.- A suspension of each of the tested microbial strains at a concentration of 10 5 cells/ml in an amount of 1 ml was added to 9 ml of the combination of plant extracts in AgNPs, reaching a final concentration of 10 4 cells /ml.
- Une suspension de chacune des souches microbiennes testées à une concentration de 107 cellules/ml dans une quantité de 1 ml a été ajoutée à 9 ml de la combinaison d'extraits de plantes dans les AgNP, atteignant une concentration finale de 106 cellules/ml. - A suspension of each of the tested microbial strains at a concentration of 10 7 cells/ml in an amount of 1 ml was added to 9 ml of the combination of plant extracts in AgNPs, reaching a final concentration of 10 6 cells /ml.
- Les contrôles suivants ont été appliqués : de l'eau distillée stérile (sans extraits de plantes et AgNPs) avec la même teneur de chacune des souches microbiennes étudiées, ainsi qu'un extrait de plantes et AgNPs de 30 ppm, sans microorganismes. - The following controls were applied: sterile distilled water (without plant extracts and AgNPs) with the same content of each of the microbial strains studied, as well as a plant extract and AgNPs of 30 ppm, without microorganisms.
[0128] Après homogénéisation pendant 1 min sur un appareil Vortex (Heidolph - Labimex, Bulgarie) et différents intervalles de temps pour l'exposition des micro-organismes aux extraits de plantes dans les AgNPs (1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 2 h et 24 h), des cultures ont été réalisées à partir de chacun des échantillons sur gélose Zeissler pour C. perfringens et sur gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, qui ont été cultivés à 37° C pendant 24 - 48 h dans des conditions aérobies et anaérobies. Après la culture, la croissance des bactéries testées a été signalée et le nombre de colonies développées a été déterminé. [0128] After homogenization for 1 min on a Vortex device (Heidolph - Labimex, Bulgaria) and different time intervals for the exposure of the microorganisms to the plant extracts in the AgNPs (1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 2 h and 24 h), cultures were carried out from each of the samples on Zeissler agar for C. perfringens and on Mueller-Hinton agar for the other microorganisms, which were cultured at 37° C for 24 - 48 h under aerobic and anaerobic conditions. After cultivation, the growth of the tested bacteria was reported and the number of developed colonies was determined.
[0129] Toutes les expériences ont été réalisées à trois reprises. [0129] All the experiments were carried out three times.
[0130] Le traitement statistique des résultats a été effectué selon la méthode classique de Student et Fisher. The statistical processing of the results was carried out according to the classic Student and Fisher method.
[0131] Résultats [0131] Results
[0132] Dans les études réalisées par la méthode de diffusion par disque, un très bon effet inhibiteur de la combinaison végétale testée de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum dans les AgNPs 30 ppm (diamètres des zones inhibitrices entre 18,3 + 3,3 et 28,7 + 3,1 mm) a été signalé dans tous les microorganismes testés. Les résultats résumés sont présentés dans le
tableau 1. In the studies carried out by the disk diffusion method, a very good inhibitory effect of the plant combination tested of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum in the 30 ppm AgNPs (diameters of the inhibitory zones between 18. 3 + 3.3 and 28.7 + 3.1 mm) was reported in all microorganisms tested. The summarized results are presented in the table 1.
[0133] Les bactéries Gram-négatives étudiées ont montré une plus grande sensibilité en comparaison aux micro-organismes Gram-positifs (P>0,05, critère t de Student). La sensibilité la plus faible par cette méthode a été signalée chez C. perfringens et S. aureus, et la plus élevée - chez E. coli et P. aeruginosa. Tous les micro-organismes testés ont montré une sensibilité élevée au thiamphénicol utilisé comme témoin positif, même la souche de C. albicans testée. Cependant, les différences de diamètre des zones inhibitrices des micro-organismes étudiés entre l'antibiotique et la combinaison testée avec de l’argent colloïdal n'étaient pas statistiquement significatives (P> 0,05, critère t de Student). The Gram-negative bacteria studied showed greater sensitivity compared to Gram-positive microorganisms (P>0.05, Student's t criterion). The lowest sensitivity by this method was reported in C. perfringens and S. aureus, and the highest - in E. coli and P. aeruginosa. All microorganisms tested showed high sensitivity to thiamphenicol used as a positive control, even the strain of C. albicans tested. However, the differences in the diameter of the inhibitory zones of the microorganisms studied between the antibiotic and the combination tested with colloidal silver were not statistically significant (P > 0.05, Student's t criterion).
[0134] [Tableau 1] : Effet antimicrobien des extraits végétaux testés de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum avec des AgNPs 30 ppm contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram- négatifs dans la méthode de diffusion sur gélose
[0134] [Table 1]: Antimicrobial effect of tested plant extracts of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum with 30 ppm AgNPs against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in the agar diffusion method
[0135] Toutefois, lors de la détermination des concentrations minimales inhibitrices des extraits de plantes testés par rapport aux souches utilisées, les différences de sensibilité entre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs ont été mieux exprimées et ont été significatives (P>0,001, critère t de Student). Les résultats sont présentés dans le tableau 2. La croissance des bactéries Gram-négatives est complètement inhibée par des concentrations bien inférieures des extraits de plantes (les CMI50 de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum étaient respectivement de 5,0 + 0,0, 5,0 + 0,0 et 50,0 + 0,0) par rapport aux bactéries Gram-positives et à C. albicans (les CMI50 de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum étaient respectivement de 10,0 + 0,0, 10,0 + 0,0 et 100,0 + 0,0). Dans cette méthode, la sensibilité du champignon C. albicans à la combinaison testée d'extraits de plantes n'a pas différé de celle des bactéries Gram-positives.
[0136] [Tableau 2] : Concentrations minimales inhibitrices d'une combinaison des extraits de plantes testés dans l'eau contre les microorganismes Gram-positifs et Gram-négatifs
However, when determining the minimum inhibitory concentrations of the plant extracts tested compared to the strains used, the differences in sensitivity between the Gram-positive and Gram-negative microorganisms were better expressed and were significant (P >0.001, Student's t criterion). The results are shown in Table 2. The growth of Gram-negative bacteria is completely inhibited by much lower concentrations of the plant extracts (the MIC50s of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum were 5.0 + 0.0, 5.0 + 0.0 and 50.0 + 0.0) compared to Gram-positive bacteria and C. albicans (MIC50 of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum were respectively 10.0 + 0.0, 10.0 + 0.0 and 100.0 + 0.0). In this method, the sensitivity of C. albicans fungus to the tested combination of plant extracts did not differ from that of Gram-positive bacteria. [0136] [Table 2]: Minimum inhibitory concentrations of a combination of plant extracts tested in water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms
CMI50 -50% d'inhibition de la croissance ; D - diapason d'inhibition de la croissance complète ; P. - P. sidoides ; S. - S. nigra ; H. - H. perforatum ; Th - Thiamphenicol MIC50 -50% growth inhibition; D - full growth inhibition tuning fork; P. - P. sidoides; S. - S. nigra; H. - H. perforatum; Th-Thiamphenicol
[0137] Les résultats des études réalisées pour déterminer la sensibilité des micro-organismes Gram-positif et Gram-négatif testés à la combinaison de plantes dans les AgNP, examinés à une concentration finale de 106 cellules/ml par la méthode de suspension, sont présentés dans le tableau 3. The results of the studies carried out to determine the sensitivity of the Gram-positive and Gram-negative microorganisms tested to the combination of plants in the AgNPs, examined at a final concentration of 10 6 cells/ml by the suspension method, are shown in Table 3.
[0138] Les données montrent que la combinaison de plantes dans les AgNPs a inactivé toutes les souches microbiennes testées en 24 h. Toutes les souches de bactéries Gram-négatives étudiées ont montré une sensibilité particulièrement élevée. Elles sont mortes dans un délai de 1 à 15 minutes. Parmi les microorganismes à Gram positif, les cellules de C. perfringens ont survécu le moins longtemps - jusqu'à 60 min, ainsi que celles de S. pyogenes. Dans les autres (S. aureus et C. albicans), les cellules individuelles restent viables pendant plus de 2 heures. [0138] The data show that the combination of plants in the AgNPs inactivated all the microbial strains tested in 24 h. All strains of Gram-negative bacteria studied showed a particularly high sensitivity. They died within 1 to 15 minutes. Among gram-positive microorganisms, cells of C. perfringens survived the shortest - up to 60 min, as well as those of S. pyogenes. In the others (S. aureus and C. albicans), individual cells remain viable for more than 2 hours.
[0139] [Tableau 3] : Concentrations minimales inhibitrices d'une combinaison des extraits de plantes testés dans l'eau contre les microorganismes Gram-positifs et Gram-négatifs
[0139] [Table 3]: Minimum inhibitory concentrations of a combination of plant extracts tested in water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms
[0140] [Tableau 4] : Effet antimicrobien des extraits végétaux testés de P. sidoides, S. nigra et E perforatum avec des AgNPs 30 ppm contre les microorganismes Gram-positifs et Gram- négatifs en suspension avec une densité de 104 cellules/ml
[0140] [Table 4]: Antimicrobial effect of plant extracts tested from P. sidoides, S. nigra and E perforatum with 30 ppm AgNPs against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspension with a density of 10 4 cells/ ml
[0141] Un effet bactéricide nettement plus rapide a été démontré par la combinaison testée de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum dans de l’argent colloïdal par rapport aux micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs étudiés, lorsqu'ils ont été appliqués à une concentration finale de 104 cellules/ml. Les données de synthèse sont présentées dans le tableau 4. [0141] A markedly faster bactericidal effect was demonstrated by the tested combination of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum in colloidal silver compared to the Gram-positive and Gram-negative microorganisms studied, when they were applied at a final concentration of 10 4 cells/ml. The summary data is presented in Table 4.
[0142] Les résultats obtenus montrent qu'en suspension avec cette densité plus faible, les bactéries Gram-négatives sont mortes en 1 minute en présence de la combinaison de plantes. Parmi les espèces Gram-positives, C. perfringens (jusqu'à 15 min) et S. pyogenes (jusqu'à 30 min) ont survécu le moins longtemps. Les cellules individuelles de C. albicans et de S. aureus sont restées viables pendant 1 h et 2 h, respectivement. The results obtained show that in suspension with this lower density, the Gram-negative bacteria died in 1 minute in the presence of the combination of plants. Of the Gram-positive species, C. perfringens (up to 15 min) and S. pyogenes (up to 30 min) survived the shortest. Single C. albicans and S. aureus cells remained viable for 1 h and 2 h, respectively.
[0143] Les études actuelles de l'activité antimicrobienne de la combinaison de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum dans les AgNPs 30 ppm ont montré une sensibilité significative des microorganismes étudiés de différents groupes, qui est particulièrement élevée chez les bactéries Gram-négatives, y compris P. aeruginosa - espèce qui développe rapidement une résis-
tance aux facteurs chimiques. Il convient également de souligner la sensibilité particulièrement élevée de l'anaérobie strict C. perfringens, établie par toutes les méthodes de recherche utilisées. [0143] Current studies of the antimicrobial activity of the combination of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum in 30 ppm AgNPs have shown a significant sensitivity of the studied microorganisms of different groups, which is particularly high in bacteria. Gram-negative species, including P. aeruginosa - a species that rapidly develops resistance resistance to chemical factors. It is also worth highlighting the particularly high sensitivity of the strict anaerobe C. perfringens, established by all the research methods used.
[0144] Ces résultats démontrent une application réussie de cette combinaison comme antiseptique, ainsi que pour le traitement topique des infections impliquant ces bactéries. L'effet antifongique de la combinaison est également significatif. These results demonstrate a successful application of this combination as an antiseptic, as well as for the topical treatment of infections involving these bacteria. The antifungal effect of the combination is also significant.
[0145] Conclusions : [0145] Conclusions:
[0146] 1. La combinaison de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum dans des AgNPs 30 ppm a montré un très bon effet inhibiteur contre tous les micro-organismes testés (diamètres des zones inhibitrices entre 18,3 + 3,3 et 28,7 + 3,1 mm) dans la méthode de diffusion sur gélose. Les bactéries à Gram négatif, en particulier E. coli et P. aeruginosa, ont montré une sensibilité plus élevée, et C. perfringens et S. aureus - plus faible. 1. The combination of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum in 30 ppm AgNPs showed a very good inhibitory effect against all the microorganisms tested (diameters of the inhibitory zones between 18.3 + 3, 3 and 28.7 + 3.1 mm) in the agar diffusion method. Gram-negative bacteria, especially E. coli and P. aeruginosa, showed higher sensitivity, and C. perfringens and S. aureus - lower.
[0147] 2. Les microorganismes testés ont été supprimés par de très faibles concentrations des extraits de plantes appliqués en combinaison. Les CMI50 de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum étaient respectivement de 5,0 + 0,0, 5,0 + 0,0 et 50,0 + 0,0 pour les bactéries Gram- négatives. Pour les bactéries à Gram positif et C. albicans, la CMI50 de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum étaient respectivement de 10,0 + 0,0, 10,0 + 0,0 et 100,0 + 0,0. 2. The microorganisms tested were suppressed by very low concentrations of the plant extracts applied in combination. The MIC50s of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum were 5.0 + 0.0, 5.0 + 0.0 and 50.0 + 0.0 respectively for Gram-negative bacteria. For Gram-positive bacteria and C. albicans, the MIC50 of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum were 10.0 + 0.0, 10.0 + 0.0 and 100.0 + 0 respectively, 0.
[0148] 3. Dans les études sur les suspensions, la combinaison de plantes dans les AgNP s'est avérée inactive pour toutes les souches bactériennes testées dans les 24 heures lorsqu'elle est examinée à une concentration finale de 106 cellules/ml. Les souches bactériennes Gram- négatives ont montré une sensibilité particulièrement élevée (mortes dans un délai de 1 à 15 minutes). Parmi les micro-organismes à Gram positif, les cellules de C. perfringens ont survécu le moins longtemps - jusqu'à 60 minutes - ainsi que celles de S. pyogenes. Les cellules individuelles de S. aureus et de C. albicans sont restées viables pendant plus de 2 heures. 3. In suspension studies, the combination of plants in AgNPs was found to be inactive for all bacterial strains tested within 24 hours when examined at a final concentration of 10 6 cells/ml. Gram-negative bacterial strains showed particularly high susceptibility (dead within 1-15 minutes). Among the Gram-positive microorganisms, the cells of C. perfringens survived the shortest time - up to 60 minutes - as well as those of S. pyogenes. Single cells of S. aureus and C. albicans remained viable for more than 2 hours.
[0149] 4. Un effet bactéricide nettement plus rapide est démontré par la combinaison testée de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum dans de l’argent colloïdal par rapport aux micro-organismes étudiés, lorsqu'ils sont appliqués à une concentration finale de 104 cellules/ml. Les bactéries gram-négatives meurent en 1 minute. Parmi les espèces à Gram positif, C. perfringens (jusqu'à 15 min) et S. pyogenes (jusqu'à 30 min) ont survécu le moins longtemps. Les cellules individuelles de C. albicans et de S. aureus sont restées viables pendant 1 h et 2 h, respectivement. [0149] 4. A significantly faster bactericidal effect is demonstrated by the tested combination of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum in colloidal silver compared to the microorganisms studied, when applied to a final concentration of 10 4 cells/ml. Gram-negative bacteria die within 1 minute. Of the Gram-positive species, C. perfringens (up to 15 min) and S. pyogenes (up to 30 min) survived the shortest. Single C. albicans and S. aureus cells remained viable for 1 h and 2 h, respectively.
[0150] 5. Les résultats obtenus révèlent une efficacité de cette combinaison de plantes avec des AgNP pour l'antisepsie, ainsi que pour la thérapie locale des infections bactériennes et fongiques. 5. The results obtained reveal an efficacy of this combination of plants with AgNPs for antisepsis, as well as for the local therapy of bacterial and fungal infections.
[0151] Exemple 7 : Protocole d’études complémentaire de l’activité antimicrobienne in vitro pour la combinaison d’extraits de pélargonium sidoides, de Sambucus Nigra et d’Hypericum perforatum avec de l’argent sous forme colloïdale : Example 7: Additional study protocol of the in vitro antimicrobial activity for the combination of extracts of pelargonium sidoides, Sambucus nigra and Hypericum perforatum with silver in colloidal form:
[0152] Le but de ce travail était de réaliser des études pour évaluer l'activité antimicrobienne in vitro des extraits des combinaisons suivantes - géranium africain (Pelargonium sidoides DC.) & sureau noir (Sambucus nigra L.), millepertuis (Hypericum perforatum L.) & sureau noir (Sambucus nigra L.) et géranium africain (Pelargonium sidoides DC.) & millepertuis
(Hypericum perforatum L.) sous forme de nano-argent colloidal et sous forme d'extraits aqueux. ) et le géranium africain (Pelargonium sidoides DC.) & le millepertuis (Hypericum perforatum L.) en nano-argent colloïdal et sous forme d'extraits aqueux contre les microorganismes Gram-négatifs et Gram-positifs, l'une des causes les plus courantes d'infections difficiles à traiter chez les humains et les animaux. The aim of this work was to carry out studies to evaluate the in vitro antimicrobial activity of extracts of the following combinations - African geranium (Pelargonium sidoides DC.) & black elderberry (Sambucus nigra L.), St. John's wort (Hypericum perforatum L. .) & black elderberry (Sambucus nigra L.) and African geranium (Pelargonium sidoides DC.) & St. John's wort (Hypericum perforatum L.) in the form of colloidal nano-silver and in the form of aqueous extracts. ) and African geranium (Pelargonium sidoides DC.) & St. John's wort (Hypericum perforatum L.) in colloidal nano-silver and aqueous extracts against Gram-negative and Gram-positive microorganisms, one of the most common causes common hard-to-treat infections in humans and animals.
[0153] Matériels et méthodes [0153] Materials and methods
[0154] Extraits de plantes. L'effet antimicrobien des extraits aqueux de géranium africain (Pelargonium sidoides DC.), de millepertuis (Hypericum perforatum L.) et de sureau noir (Sam- bucus nigra L.) a été testé. Les mêmes extraits ont été examinés et avec des nanoparticules d'argent colloïdales (AgNPs) à une concentration de 30 ppm. [0154] Plant extracts. The antimicrobial effect of aqueous extracts of African geranium (Pelargonium sidoides DC.), St. John's wort (Hypericum perforatum L.) and black elderberry (Sambucus nigra L.) was tested. The same extracts were examined and with colloidal silver nanoparticles (AgNPs) at a concentration of 30 ppm.
[0155] Contrôle. L'antibiotique à large spectre thiamphénicol (Nikovet - Sofia) a été utilisé comme contrôle positif, auquel les microorganismes testés n'ont pas montré de résistance. [0155] Control. The broad-spectrum antibiotic thiamphenicol (Nikovet - Sofia) was used as a positive control, to which the microorganisms tested did not show resistance.
[0156] Micro-organismes. Des cultures pures de 7 souches pathogènes ont été testées. Cinq d'entre elles sont des références provenant de la Banque nationale bulgare de micro-organismes industriels et de cultures cellulaires (NBIMCC) : Esherichia coli ATCC - 8739 (NBIMCC 3397), Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 1304 (NBIMCC 8691), Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC - 6538 (NBIMCC 3359), Clostridium perfringens ATCC 13124 (NBIMCC 8615) et Candida albicans ATCC 10231 (NBIMCC 74). Les deux autres (Pseu- dominas aeruginosa et Streptococcus pyogenes) ont été isolés à partir de sécrétions inflammatoires cutanées de chiens dans le laboratoire de microbiologie de la clinique universitaire de l'Université de Foresterie, Faculté de Médecine Vétérinaire de Sofia. [0156] Microorganisms. Pure cultures of 7 pathogenic strains were tested. Five of them are references from the Bulgarian National Bank of Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBIMCC): Esherichia coli ATCC - 8739 (NBIMCC 3397), Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 1304 (NBIMCC 8691), Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC - 6538 (NBIMCC 3359), Clostridium perfringens ATCC 13124 (NBIMCC 8615) and Candida albicans ATCC 10231 (NBIMCC 74). The other two (Pseudominas aeruginosa and Streptococcus pyogenes) were isolated from inflammatory skin secretions of dogs in the microbiology laboratory of the university clinic of the University of Forestry, Faculty of Veterinary Medicine in Sofia.
[0157] Milieux nutritifs. La gélose et le bouillon Mueller Hinton (BUL BIO NCIPD - Sofia), la gélose au sang Columbia (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utra 43) ont été utilisés, ainsi que des milieux sélectifs : gélose Endo (Antisel - Sharlau Chemie SA, Espagne) pour E. coli et S. enterica, gélose au Cetrimide (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utr.) pour P. aeruginosa, la gélose TSC Perfringens (MkB Test as, Slovaquie), ainsi que la gélose Zeis- sler (BUL BIO NCIPD - Sofia) pour C. perfringens et la gélose Sabouraud dextrose avec chloramphénicol (Antisel - Sharlau Chemie SA, Espagne) pour C. albicans. Nutrient media. Mueller Hinton agar and broth (BUL BIO NCIPD - Sofia), Columbia blood agar (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utra 43) were used, as well as selective media: Endo agar (Antisel - Sharlau Chemie SA, Spain) for E. coli and S. enterica, Cetrimide agar (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utr.) for P. aeruginosa, TSC Perfringens agar (MkB Test as, Slovakia), as well as Zeissler agar (BUL BIO NCIPD - Sofia) for C. perfringens and Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol (Antisel - Sharlau Chemie SA, Spain) for C. albicans.
[0158] La culture des micro-organismes a été réalisée à 35-37° C pendant 18-24 et 72 heures dans un environnement anaérobie pour C. perfringens et dans des conditions aérobies pour les autres espèces microbiennes. Le système Anaerob Pack avec catalyseur au palladium - H2 + CO2 (BUL BIO NCIPD - Sofia) en pot a été utilisé pour créer des conditions anaérobies. L'indicateur Strip (BUL BIO NCIPD - Sofia) a été utilisé pour prouver la réalisation de l'anaérobiose. The culture of the microorganisms was carried out at 35-37° C. for 18-24 and 72 hours in an anaerobic environment for C. perfringens and under aerobic conditions for the other microbial species. The Anaerob Pack system with palladium catalyst - H2 + CO2 (BUL BIO NCIPD - Sofia) in pot was used to create anaerobic conditions. The Strip indicator (BUL BIO NCIPD - Sofia) was used to prove the achievement of anaerobiosis.
[0159] Les études préliminaires des substances ont été réalisées par la méthode classique de diffusion sur gélose de Bauer et al. (1966) et selon le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M2 -A3 (1997, 1999). Des suspensions de micro-organismes à tester ont été inoculées en phase de croissance exponentielle à une dose de 2.106 cellules / ml dans un volume de 0, 1 ml dans des boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre sur de la gélose Zeissler pour C. perfringens et de la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, avec un pH de 7,2 - 7,4 et une épaisseur de couche de 4 mm. Les extraits de plantes dans du nanoargent colloïdal et dans de l'eau, ainsi que l'antibiotique témoin ont été
appliqués par 0,1 ml dans des puits de 9 mm dans la gélose. Les extraits de plantes seuls et en combinaison contenaient respectivement 2 mg de P. sidoides, 2 mg de S. nigra, 0,4 mg de H. perforatum et 24 ppm d'AgNPs ou d'eau dans 0,1 ml, et du thiamphénicol - 30 pg dans 0,1 ml (comme nécessaire). Après une incubation de 3-4 heures à température ambiante pour la diffusion, les cultures ont été incubées à 35-37° C pendant 18-24 et 72 heures. Les résultats ont été lus en mesurant les diamètres des zones inhibitrices en millimètres, y compris le diamètre du puits à 1 mm près, avec une règle transparente sur l'extérieur du fond des plaques. Selon le système de Bauer-Kirby en trois étapes, un effet inhibiteur des extraits de plantes avec ou sans AgNPs a été observé dans des zones > 12 mm, et du thiamphénicol - à > 17 mm. La sensibilité des micro-organismes testés a été déterminée comme pour les préparations non antibiotiques telles que les sulfamides, à savoir : résistante (R) - dans les zones dont le diamètre est < 12 mm, modérément sensible - intermédiaire (I) - dans les zones comprises entre 13 et 16 mm et sensible (S) à > 17 mm. Pour le thiamphénicol, les limites correspondantes sont les suivantes : R < 12 mm, I - 13 - 17 mm et S - > 18 mm (NCCLS, 1997, 1999). The preliminary studies of the substances were carried out by the classic agar diffusion method of Bauer et al. (1966) and according to the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M2 -A3 (1997, 1999). Suspensions of microorganisms to be tested were inoculated in the exponential growth phase at a dose of 2.10 6 cells/ml in a volume of 0.1 ml in Petri dishes 9 cm in diameter on Zeissler agar for C perfringens and Mueller-Hinton agar for other microorganisms, with a pH of 7.2 - 7.4 and a layer thickness of 4 mm. The plant extracts in colloidal nanosilver and in water, as well as the control antibiotic were applied by 0.1 ml in 9 mm wells in the agar. Plant extracts alone and in combination contained 2 mg of P. sidoides, 2 mg of S. nigra, 0.4 mg of H. perforatum and 24 ppm of AgNPs or water in 0.1 ml, respectively, and thiamphenicol - 30 µg in 0.1 ml (as needed). After a 3-4 hour incubation at room temperature for diffusion, the cultures were incubated at 35-37°C for 18-24 and 72 hours. Results were read by measuring the diameters of the inhibitory zones in millimeters, including the diameter of the well to the nearest 1 mm, with a transparent ruler on the outside of the bottom of the plates. According to the three-step Bauer-Kirby system, an inhibitory effect of plant extracts with or without AgNPs was observed in areas > 12 mm, and of thiamphenicol - at > 17 mm. The susceptibility of the microorganisms tested was determined as for non-antibiotic preparations such as sulfonamides, namely: resistant (R) - in areas with a diameter of < 12 mm, moderately sensitive - intermediate (I) - in areas between 13 and 16 mm and sensitive (S) to > 17 mm. For thiamphenicol, the corresponding limits are as follows: R < 12 mm, I - 13 - 17 mm and S - > 18 mm (NCCLS, 1997, 1999).
[0160] Les concentrations minimales inhibitrices (CMI ou MIC) ont été déterminées par la méthode des dilutions en série double dans la gélose Zeissler pour C. perfringens et la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, décrite par Ericsson et Sherris (1971) et NCCLS (1999). Les suspensions bactériennes ont été appliquées à une dose de 106 cel- lules/ml. Les extraits de plantes testés de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum, seuls ou en combinaison, dans l'eau ou avec des AgNPs, ainsi que l'antibiotique de contrôle ont été administrés en différentes concentrations finales doublement croissantes par ml de gélose. Après incubation à 35-37° C pendant 18-24 heures, le nombre de colonies développées a été déterminé. Les CMI50 ont été calculées mathématiquement sur la base du nombre de colonies inhibées sur la gélose avec la dilution respective du composé testé par rapport aux colonies sur les milieux avec les contrôles sans extraits de plantes ou antibiotique. L'intervalle d'inhibition de la croissance (D) a été défini comme la concentration sans croissance visible. The minimum inhibitory concentrations (MIC or MIC) were determined by the method of double serial dilutions in Zeissler agar for C. perfringens and Mueller-Hinton agar for the other microorganisms, described by Ericsson and Sherris ( 1971) and NCCLS (1999). The bacterial suspensions were applied at a dose of 10 6 cells/ml. The tested plant extracts of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum, alone or in combination, in water or with AgNPs, as well as the control antibiotic were administered in different doubling increasing final concentrations per ml of agar. After incubation at 35-37°C for 18-24 hours, the number of colonies developed was determined. The MIC50s were calculated mathematically based on the number of colonies inhibited on the agar with the respective dilution of the test compound compared to the colonies on the media with the controls without plant extracts or antibiotic. The growth inhibition range (D) was defined as the concentration with no visible growth.
[0161] Détermination du temps d'action antimicrobienne des extraits aqueux de plantes et de ceux avec du nano argent colloïdal. Chaque millilitre des extraits contenait 20 mg de P. sidoides, 20 mg de S. nigra et 4 mg de H. perforatum, respectivement, et lorsque les AgNPs ont été ajoutés, leur concentration finale était de 24 ppm. [0161] Determination of the antimicrobial action time of aqueous plant extracts and of those with nano colloidal silver. Each milliliter of the extracts contained 20 mg of P. sidoides, 20 mg of S. nigra and 4 mg of H. perforatum, respectively, and when the AgNPs were added, their final concentration was 24 ppm.
- Une suspension de chacune des souches microbiennes testées avec une concentration de 105 cellules/ml dans une quantité de 1 ml a été ajoutée à 9 ml de la combinaison d'extraits de plantes dans l'eau, ainsi qu'à 9 ml d'extraits aqueux de chacune de ces plantes séparément, où la concentration finale est devenue 104 cellules/ml. La même chose a été faite avec les extraits contenant des AgNPs seuls et séparément. - A suspension of each of the tested microbial strains with a concentration of 10 5 cells/ml in an amount of 1 ml was added to 9 ml of the combination of plant extracts in water, as well as to 9 ml of aqueous extracts of each of these plants separately, where the final concentration became 10 4 cells/ml. The same was done with the extracts containing AgNPs alone and separately.
- Une suspension de chacune des souches microbiennes testées avec une concentration de 107 cellules/ml dans une quantité de 1 ml a été ajoutée à 9 ml de la combinaison d'extraits de plantes, ainsi qu'à 9 ml d'extraits de chacun de ces extraits de plantes séparément, où la concentration finale de 106 cellules/ml a été atteinte. La même chose a été faite avec les
extraits contenant des AgNPs seuls et séparément. - A suspension of each of the tested microbial strains with a concentration of 10 7 cells/ml in an amount of 1 ml was added to 9 ml of the combination of plant extracts, as well as to 9 ml of extracts of each of these plant extracts separately, where the final concentration of 10 6 cells/ml was reached. The same was done with the extracts containing AgNPs alone and separately.
- Les contrôles suivants ont été appliqués : de l'eau distillée stérile (sans extraits de plantes et AgNPs) avec le même contenu de chacune des souches microbiennes étudiées, ainsi qu'un extrait de plantes et AgNPs 30 ppm, sans microorganismes. - The following controls were applied: sterile distilled water (without plant extracts and AgNPs) with the same content of each of the microbial strains studied, as well as a plant extract and AgNPs 30 ppm, without microorganisms.
[0162] Après homogénéisation pendant 1 min sur un appareil Vortex (Heidolph - Labimex, Bulgarie) et différents intervalles de temps pour l'exposition des micro-organismes aux extraits de plantes testés (1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 2 h et 24 h), des cultures ont été faites à partir de chacun des échantillons sur de la gélose Zeissler pour C. perfrin- gens et de la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, qui ont été cultivés à 37° C pendant 24 - 48 h dans des conditions aérobies et anaérobies. Après la culture, la croissance des bactéries testées a été rapportée et le nombre de colonies développées a été déterminé. After homogenization for 1 min on a Vortex device (Heidolph - Labimex, Bulgaria) and different time intervals for the exposure of the microorganisms to the plant extracts tested (1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 2 h and 24 h), cultures were made from each of the samples on Zeissler agar for C. perfringens and Mueller-Hinton agar for the other microorganisms, which were cultured at 37°C for 24 - 48 h under aerobic and anaerobic conditions. After cultivation, the growth of the tested bacteria was reported and the number of developed colonies was determined.
[0163] Toutes les expériences ont été réalisées trois fois. [0163] All experiments were performed three times.
[0164] Le traitement statistique des résultats a été effectué selon la méthode classique de Student et Fisher. The statistical processing of the results was carried out according to the classic Student and Fisher method.
[0165] Résultats [0165] Results
[0166] Dans les études réalisées par la méthode de diffusion sur disque de gélose, un très bon effet inhibiteur des extraits de toutes les plantes testées examinées avec les AgNPs (diamètres des zones inhibitrices entre 16,0 + 0,6 et 24,3 + 1,3 mm) et la combinaison entre eux a été rapporté (zones inhibitrices entre 18,3 + 3,3 et 28,7 + 3,1 mm) dans tous les microorganismes testés. Les données résumées sont présentées dans le tableau 5. L'effet de la combinaison des extraits des trois plantes avec les AgNPs était plus élevé que celui des extraits avec les AgNPs appliqués séparément. Les différences des diamètres moyens des zones inhibitrices (sans croissance microbienne) entre les extraits des plantes individuelles et la combinaison entre elles n'étaient pas significatives (P> 0,05). In the studies carried out by the agar disk diffusion method, a very good inhibitory effect of the extracts of all the plants tested examined with the AgNPs (diameters of the inhibitory zones between 16.0 + 0.6 and 24.3 + 1.3 mm) and the combination between them was reported (inhibitory zones between 18.3 + 3.3 and 28.7 + 3.1 mm) in all the microorganisms tested. The summarized data are shown in Table 5. The effect of combining the extracts of the three plants with the AgNPs was higher than that of the extracts with the AgNPs applied separately. The differences in the mean diameters of the inhibitory zones (without microbial growth) between the extracts of the individual plants and the combination between them were not significant (P > 0.05).
[0167] [Tableau 5] : Effet antimicrobien des extraits de plantes testés (P. sidoides &. S. nigra ; S. nigra & H.perforatum ; H. perforatum & P.sidoides) avec des AgNPs contre des micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans la méthode de diffusion agar-gel.
[0167] [Table 5]: Antimicrobial effect of plant extracts tested (P. sidoides &. S. nigra; S. nigra &H.perforatum; H. perforatum & P.sidoides) with AgNPs against Gram microorganisms -positive and Gram-negative in the agar-gel diffusion method.
[0168] Les extraits aqueux de toutes les plantes testées, ainsi que la combinaison entre elles (diamètres des zones inhibitrices entre 16,0 + 0,6 et 26,0 + 3,7 mm) ont également montré un effet inhibiteur élevé sur tous les microorganismes étudiés dans les études réalisées par la méthode de diffusion sur disque. Les résultats sont présentés dans le tableau 6. L'effet de la combinaison entre les extraits des trois plantes était plus élevé que celui des extraits appliqués séparément. Les différences dans les diamètres moyens des zones de non-croissance entre les extraits des plantes individuelles et la combinaison entre elles n'étaient pas significatives (P> 0,05). [0168] The aqueous extracts of all the plants tested, as well as the combination between them (diameters of the inhibitory zones between 16.0 + 0.6 and 26.0 + 3.7 mm) also showed a high inhibitory effect on all the microorganisms studied in the studies carried out by the disk diffusion method. The results are shown in Table 6. The effect of the combination between the extracts of the three plants was higher than that of the extracts applied separately. The differences in the average diameters of the non-growth zones between the extracts of the individual plants and the combination between them were not significant (P > 0.05).
[0169] [Tableau 6] : Effet antimicrobien des extraits de plantes testés (P. sidoides &. S. nigra ; S. nigra & H.perforatum ; H. perforatum & P.sidoides) dans l'eau testés contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans la méthode de diffusion agar-gel
[0170] Une sensibilité légèrement plus élevée à toutes les plantes étudiées, ainsi qu'à la combinaison de celles-ci, a été démontrée par les bactéries Gram-négatives testées par rapport aux micro-organismes Gram-positifs (P> 0,05). La sensibilité la plus élevée dans cette méthode a été trouvée chez E. coli et P. aeruginosa. Le champignon C. albicans a également montré une sensibilité à toutes les plantes étudiées. Tous les micro-organismes testés ont montré une sensibilité élevée au thiamphénicol, utilisé comme contrôle positif. Les différences dans les diamètres des zones inhibitrices de toutes les souches dans l'antibiotique et les extraits étudiés étaient statistiquement significatives (P <0,05). [0169] [Table 6]: Antimicrobial effect of plant extracts tested (P. sidoides &. S. nigra; S. nigra & H. perforatum; H. perforatum & P.sidoides) in water tested against micro- Gram-positive and Gram-negative organisms in the agar-gel diffusion method [0170] A slightly higher susceptibility to all the plants studied, as well as to the combination thereof, was demonstrated by the Gram-negative bacteria tested compared to the Gram-positive microorganisms (P > 0.05 ). The highest sensitivity in this method was found in E. coli and P. aeruginosa. The fungus C. albicans also showed sensitivity to all plants studied. All microorganisms tested showed high sensitivity to thiamphenicol, used as a positive control. The differences in the diameters of the inhibitory zones of all the strains in the antibiotic and the extracts studied were statistically significant (P<0.05).
[0171] Les résultats obtenus lors de la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI ou MIC) sont présentés dans le tableau 7. Ils correspondent à ceux de la méthode de diffusion agar-gel. Les extraits étudiés des trois plantes ont montré une activité antimicrobienne significative. L'effet de P. sidoides et de S. nigra était similaire. Leur CMI50 pour les bactéries Gram-négatives était faible - 10 mg/ml, et pour les micro-organismes Gram- positifs - 20 mg/ml. La croissance des souches microbiennes étudiées a été inhibée par des concentrations plus élevées de H. perforatum - 50 mg/ml pour les souches Gram-négatives et 100 mg/ml pour les souches Gram-positives. The results obtained during the determination of the minimum inhibitory concentrations (MIC or MIC) are presented in table 7. They correspond to those of the agar-gel diffusion method. The studied extracts of the three plants showed significant antimicrobial activity. The effect of P. sidoides and S. nigra was similar. Their MIC50 for Gram-negative bacteria was low - 10 mg/ml, and for Gram-positive microorganisms - 20 mg/ml. The growth of the microbial strains studied was inhibited by higher concentrations of H. perforatum - 50 mg/ml for Gram-negative strains and 100 mg/ml for Gram-positive strains.
[0172] Lorsqu'ils sont appliqués en combinaison, ces extraits ont montré une activité synergique. Le même effet antimicrobien a été obtenu à des concentrations deux fois plus faibles. Les différences de CMI50 de P. sidoides et S. nigra, testés seuls et en combinaison, étaient significatives (P <0,01) en faveur de la combinaison. [0172] When applied in combination, these extracts showed synergistic activity. The same antimicrobial effect was obtained at twice the lower concentrations. The differences in MIC50 of P. sidoides and S. nigra, tested alone and in combination, were significant (P<0.01) in favor of the combination.
[0173] [Tableau 7] : Les concentrations minimales inhibitrices des extraits de plantes testés (P. sidoides &. S. nigra ; S. nigra & H.perforatum ; H. perforatum & P.sidoides) dans l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs.
[0173] [Table 7]: The minimum inhibitory concentrations of the plant extracts tested (P. sidoides &. S. nigra; S. nigra &H.perforatum; H. perforatum & P.sidoides) in water against micro -gram-positive and gram-negative organisms.
CMI50 -50% inhibition de la croissance ; D - diapason de l'inhibition totale de la croissanceMIC50 -50% growth inhibition; D - tuning fork of total growth inhibition
[0174] Les données des études par la méthode de suspension ont montré que les extraits aqueux de plantes testés, appliqués en combinaison, présentaient une activité antimicrobienne significative (Tableau 8). Lorsque la combinaison de plantes contenait des AgNPs, l'effet bactéricide était plus rapide que lorsque l'argent était absent. Comme le montrent les données du tableau, lorsqu'elles sont en suspension avec une densité de 106 cellules/ml, les bactéries Gram-négatives étudiées sont mortes rapidement - E. coli pendant 1 min avec l'argent et jusqu'à 5 min sans argent, P. aeruginosa respectivement pendant 15 - 30 min, et S. enterica en 30 min. Data from studies using the suspension method showed that the aqueous plant extracts tested, applied in combination, exhibited significant antimicrobial activity (Table 8). When the plant combination contained AgNPs, the bactericidal effect was faster than when the silver was absent. As shown by the data in the table, when in suspension with a density of 10 6 cells/ml, the Gram-negative bacteria studied died rapidly - E. coli for 1 min with silver and up to 5 min without silver, P. aeruginosa respectively for 15 - 30 min, and S. enterica in 30 min.
[0175] La combinaison d'extraits végétaux a également inactivé les micro-organismes Gram positif étudiés dans une suspension d'une densité de 106 cellules/ml, mais pendant une durée plus longue - C. perfringens pendant 30 à 60 min, S. pyogenes pendant au moins 1 heure, C. albicans - pendant au moins deux heures et S. aureus - pendant plus de deux heures. Dans les extraits aqueux sans argent, la réduction des micro-organismes testés de tous les groupes s'est produite plus lentement que lorsque la combinaison de plantes contenait du nanoargent colloïdal. [0175] The combination of plant extracts also inactivated the Gram-positive microorganisms studied in a suspension with a density of 106 cells/ml, but for a longer period - C. perfringens for 30 to 60 min, S. pyogenes for at least 1 hour, C. albicans - for at least two hours, and S. aureus - for more than two hours. In aqueous extracts without silver, the reduction of the tested microorganisms of all groups occurred more slowly than when the plant combination contained colloidal nanosilver.
[0176] [Tableau 8] : Effet antimicrobien des extraits de plantes testés (P. sidoides & S. nigra) (S. nigra & H.perforatum )( H. perforatum & P.sidoides) en combinaison avec des AgNPs et dans l'eau contre des micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 106 cellules/ml.
[0176] [Table 8]: Antimicrobial effect of the plant extracts tested (P. sidoides & S. nigra) (S. nigra & H.perforatum )( H. perforatum & P.sidoides) in combination with AgNPs and in the water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells/ml.
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans
l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in the water.
[0177] En suspension à une densité de 104 cellules/ml, les micro-organismes testés ont montré une plus grande sensibilité aux extraits de plantes testés appliqués en combinaison. Leurs quantités ont diminué plus rapidement sous l'action des moyens examinés. Lorsque la combinaison de plantes contenait des AgNPs, son effet bactéricide était plus rapide que lorsque l'argent était absent. Les résultats de cette recherche sont présentés dans le tableau 9. Dans ce dispositif expérimental, les bactéries Gram-négatives testées sont mortes en un temps beaucoup plus court. En présence de nanoargent - pendant 1 min, et sans nanoargent - pendant 5 min. In suspension at a density of 10 4 cells/ml, the microorganisms tested showed greater sensitivity to the plant extracts tested applied in combination. Their quantities decreased faster under the influence of the considered means. When the plant combination contained AgNPs, its bactericidal effect was faster than when the silver was absent. The results of this research are shown in Table 9. In this experimental device, the Gram-negative bacteria tested died in a much shorter time. In the presence of nanosilver - for 1 min, and without nanosilver - for 5 min.
[0178] [Tableau 9] : Effet antimicrobien de l'extrait de P. sidoides & S.Nigra avec AgNPs et dans l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 104 cellules/ml
[0178] [Table 9]: Antimicrobial effect of the extract of P. sidoides & S. Nigra with AgNPs and in water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 4 cells /ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0179] La combinaison d'extraits végétaux a également inactivé les micro-organismes Gram positif étudiés dans une suspension d'une densité de 104 cellules/ml, mais pendant une durée plus longue - l'anaérobie C. perfringens pendant 30 minutes, et les autres espèces bactériennes et le champignon ovale C. albicans pendant plus de deux heures. Comme on peut le voir dans les données du tableau, dans les extraits aqueux sans argent, la réduction des micro-organismes testés de tous les groupes s'est produite plus lentement que lorsque la combinaison de plantes contenait du nanoargent colloïdal. [0179] The combination of plant extracts also inactivated the Gram-positive microorganisms studied in a suspension with a density of 10 4 cells/ml, but for a longer period - the anaerobic C. perfringens for 30 minutes, and other bacterial species and the oval fungus C. albicans for more than two hours. As can be seen from the data in the table, in the aqueous extracts without silver, the reduction of the tested microorganisms of all groups occurred more slowly than when the plant combination contained colloidal nanosilver.
[0180] Les résultats des études de l'extrait de géranium africain (P. sidoides) & H. perforatum dans la méthode de suspension sont présentés dans le tableau 10. L'extrait de cette plante a montré une activité antimicrobienne significative, qui a augmenté avec l'ajout de nano argent colloïdal. Les bactéries Gram-négatives étudiées en suspension avec une densité de 106
cellules/ml sont mortes en un temps relativement court - E. colt et S. enterica jusqu'à 5 minutes en présence de nanoargent et jusqu'à 15 minutes sans argent, et P. aeruginosa - en 15 minutes avec argent et environ 30 minutes sans nanoargent. L'extrait de P. sidoides & H. perforatum a inactivé les micro-organismes Gram-positifs étudiés, mais pendant plus de deux heures. [0180] The results of studies of African geranium (P. sidoides) & H. perforatum extract in the suspension method are shown in Table 10. The extract of this plant showed significant antimicrobial activity, which increased with the addition of nano colloidal silver. Gram-negative bacteria studied in suspension with a density of 106 cells/ml died in a relatively short time - E. colt and S. enterica up to 5 minutes in the presence of nanosilver and up to 15 minutes without silver, and P. aeruginosa - in 15 minutes with silver and around 30 minutes without nanosilver. The extract of P. sidoides & H. perforatum inactivated the Gram-positive microorganisms studied, but for more than two hours.
[0181] [Tableau 10] : Effet antimicrobien de l'extrait de P. sidoides & H.perforatum avec AgNPs et avec de l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans des suspensions avec une densité de 106 cellules/ml.
[0181] [Table 10]: Antimicrobial effect of P. sidoides & H.perforatum extract with AgNPs and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells/ml.
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0182] Le tableau 11 montre les résultats des tests de la méthode de suspension de l'extrait de sureau noir (S. nigra) & H. perforatum et de l'extrait de H. perforatum & P. sidoides. Toutes les bactéries Gram-négatives testées dans une suspension avec une densité de 106 cellules/ml sont mortes dans les 15 à 30 minutes, mais beaucoup plus rapidement lorsque l'extrait contenait du nanoargent. Ces extraits ont également inactivé les micro-organismes Gram positif étudiés, mais pendant une période plus longue - plus de deux heures. Dans le cas des extraits contenant de l'argent, la réduction des micro-organismes testés de tous les groupes s'est produite plus rapidement par rapport à l'extrait aqueux. [0182] Table 11 shows the results of the suspension method tests of the extract of black elderberry (S. nigra) & H. perforatum and the extract of H. perforatum & P. sidoides. All Gram-negative bacteria tested in a suspension with a density of 106 cells/ml died within 15-30 minutes, but much faster when the extract contained nanosilver. These extracts also inactivated the Gram-positive microorganisms studied, but for a longer period - more than two hours. In the case of the silver-containing extracts, the reduction of the tested microorganisms of all groups occurred faster compared to the aqueous extract.
[0183] [Tableau 11] : Effet antimicrobien de l'extrait de S. Nigra & H. perforatum avec AgNPs 30 ppm et avec de l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans des suspensions avec une densité de 106 cellules/ml.
[0183] [Table 11]: Antimicrobial effect of S. Nigra & H. perforatum extract with AgNPs 30 ppm and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells/ml.
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs 30 ppm ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs 30 ppm; W - combination of plant extracts in water.
[0184] [Tableau 12] : Effet antimicrobien de l'H. perforatum & P.sidoides avec AgNPs 30 ppm contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 104 cellules/ml
[0184] [Table 12]: Antimicrobial effect of H. perforatum & P.sidoides with AgNPs 30 ppm against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 4 cells/ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs 30 ppm ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs 30 ppm; W - combination of plant extracts in water.
[0185] En suspension à une densité de 104 cellules/ml (Tableau 12), sous l'influence des extraits, toutes les bactéries Gram-négatives examinées sont mortes en moins de temps - en 15 minutes. Les quantités de micro-organismes Gram-positifs testés ont diminué plus rapidement que lorsqu'ils étaient en suspension à une concentration de 106 cellules/ml, mais des cellules uniques de C. perfringens sont restées viables pendant plus de 60 minutes, et les
autres - plus de 2 heures en présence des extraits. La réduction de toutes les souches microbiennes s'est produite plus rapidement en présence de AgNPs dans l'extrait. In suspension at a density of 10 4 cells/ml (Table 12), under the influence of the extracts, all the Gram-negative bacteria examined died in less time - in 15 minutes. The amounts of Gram-positive microorganisms tested decreased more rapidly than when they were in suspension at a concentration of 10 6 cells/ml, but single cells of C. perfringens remained viable for more than 60 minutes, and the others - more than 2 hours in the presence of the extracts. The reduction of all microbial strains occurred faster in the presence of AgNPs in the extract.
[0186] Conclusion : [0186] Conclusion:
[0187] Les extraits testés de géranium africain (Pelargonium sidoides DC.) & sureau noir (Sambu- cus nigra L.), de millepertuis (Hypericum perforatum L.) & sureau noir (Sambucus nigra L.) et de géranium africain (Pelargonium sidoides DC.) & millepertuis (Hypericum perforatum L.) ont montré une activité antimicrobienne significative in vitro. Les combinaisons étudiées ont eu un effet synergique contre les micro-organismes Gram-négatifs et Gram- positifs. La présence de nano-argent colloïdal dans les extraits et dans la combinaison entre eux a augmenté leur activité antimicrobienne. Cette combinaison d'extraits et d' AgNPs 30 ppm pourrait être un agent antimicrobien fiable avec un effet significatif en particulier contre les bactéries Gram-négatives, l'une des causes les plus courantes d'infections difficiles à traiter chez les humains et les animaux. Parmi les micro-organismes Gram-positifs, la bactérie anaérobie obligatoire C. perfringens et le champignon ovale C. albicans y étaient plus sensibles. The tested extracts of African geranium (Pelargonium sidoides DC.) & black elderberry (Sambucus nigra L.), St. John's wort (Hypericum perforatum L.) & black elderberry (Sambucus nigra L.) and African geranium (Pelargonium sidoides DC.) & St. John's wort (Hypericum perforatum L.) showed significant antimicrobial activity in vitro. The combinations studied had a synergistic effect against Gram-negative and Gram-positive microorganisms. The presence of colloidal nano-silver in the extracts and in the combination between them increased their antimicrobial activity. This combination of extracts and 30 ppm AgNPs could be a reliable antimicrobial agent with significant effect especially against Gram-negative bacteria, one of the most common causes of hard-to-treat infections in humans and animals. . Among Gram-positive microorganisms, the obligate anaerobic bacterium C. perfringens and the oval fungus C. albicans were more susceptible.
[0188] Références : [0188] References:
- Bauer, A. W., W. M. Kirby, J. C. Cherris, M. Truck. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. The Am. J. of Clin. Pathol., 1966, 45, 4, 493 - 496.- Bauer, A.W., W.M. Kirby, J.C. Cherris, M. Truck. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. The Am. J. of Clin. Pathol., 1966, 45, 4, 493-496.
- Ericsson, H. M., J. S. Sherris. Antibiotic sensitivity testing. Acta Path. Microb. Scand. Suppl., 1971, 217, 3 - 86. - Ericsson, H.M., J.S. Sherris. Antibiotic sensitivity testing. ActaPath. Microb. scand. Suppl., 1971, 217, 3 - 86.
- National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 6-th ed. Approved Standard. NCCLS Document M2 -A6, Vol. 17, No 1, 1997. - National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 6-th ed. Approved Standard. NCCLS Document M2-A6, Vol. 17, No. 1, 1997.
- National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Ninths Informational Supplement. NCCLS Document M100 - S9, Vol. 18, No 1, 1999. - National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Ninths Informational Supplement. NCCLS Document M100 - S9, Vol. 18, No. 1, 1999.
[0189] Exemple 8 : Protocole d'études complémentaires de l'activité antimicrobienne in vitro d'extraits de géranium africain, de sureau noir et de millepertuis dans du nano argent colloïdal : [0190] L'objectif du présent travail était de réaliser des études pour évaluer l'activité antimicrobienne in vitro d'extraits de baies de Pelargonium sidoides, Hypericum perforatum et Sambucus nigra, seuls et en combinaison les uns avec les autres, sous forme de nano-argent colloïdal et sous forme d'extraits aqueux, contre des micro-organismes Gram-négatifs et Gram-positifs, qui sont parmi les causes les plus courantes d'infections difficiles à traiter chez les humains et les animaux. [0189] Example 8: Protocol for additional studies of the in vitro antimicrobial activity of extracts of African geranium, black elderberry and St. John's wort in nano colloidal silver: [0190] The objective of the present work was to carry out studies to evaluate the in vitro antimicrobial activity of extracts from the berries of Pelargonium sidoides, Hypericum perforatum and Sambucus nigra, alone and in combination with each other, in the form of colloidal nano-silver and in the form of aqueous extracts, against Gram-negative and Gram-positive microorganisms, which are among the most common causes of difficult-to-treat infections in humans and animals.
[0191] Matériels et méthodes [0191] Materials and methods
[0192] Extraits de plantes. L'effet antimicrobien des extraits aqueux de géranium africain (Pelargonium sidoides DC.), de millepertuis (Hypericum perforatum L.) et de sureau noir (Sambucus nigra L.) a été testé. Les mêmes extraits ont été examinés et avec des nanoparticules d'argent colloïdales (AgNPs) à une concentration de 30 ppm. [0192] Plant extracts. The antimicrobial effect of aqueous extracts of African geranium (Pelargonium sidoides DC.), St. John's wort (Hypericum perforatum L.) and black elderberry (Sambucus nigra L.) was tested. The same extracts were examined and with colloidal silver nanoparticles (AgNPs) at a concentration of 30 ppm.
[0193] Contrôle. L'antibiotique à large spectre thiamphénicol (Nikovet - Sofia) a été utilisé comme contrôle positif, auquel les microorganismes testés n'ont pas montré de résistance.
[0194] Micro-organismes. Des cultures pures de 7 souches pathogènes ont été testées. Cinq d'entre elles sont des références provenant de la Banque nationale bulgare de micro-organismes industriels et de cultures cellulaires (NBIMCC) : Esherichia coli ATCC - 8739 (NBIMCC 3397), Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 1304 (NBIMCC 8691), Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC - 6538 (NBIMCC 3359), Clostridium perfringens ATCC 13124 (NBIMCC 8615) et Candida albicans ATCC 10231 (NBIMCC 74). Les deux autres (Pseu- dominas aeruginosa et Streptococcus pyogenes) ont été isolés à partir de sécrétions inflammatoires cutanées de chiens dans le laboratoire de microbiologie de la clinique universitaire de l'Université de Foresterie, Faculté de Médecine Vétérinaire de Sofia. [0193] Control. The broad-spectrum antibiotic thiamphenicol (Nikovet - Sofia) was used as a positive control, to which the microorganisms tested did not show resistance. [0194] Microorganisms. Pure cultures of 7 pathogenic strains were tested. Five of them are references from the Bulgarian National Bank of Industrial Microorganisms and Cell Cultures (NBIMCC): Esherichia coli ATCC - 8739 (NBIMCC 3397), Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 1304 (NBIMCC 8691), Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC - 6538 (NBIMCC 3359), Clostridium perfringens ATCC 13124 (NBIMCC 8615) and Candida albicans ATCC 10231 (NBIMCC 74). The other two (Pseudominas aeruginosa and Streptococcus pyogenes) were isolated from inflammatory skin secretions of dogs in the microbiology laboratory of the university clinic of the University of Forestry, Faculty of Veterinary Medicine in Sofia.
[0195] Milieux nutritifs. La gélose et le bouillon Mueller Hinton (BUL BIO NCIPD - Sofia), la gélose au sang Columbia (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utra 43) ont été utilisés, ainsi que des milieux sélectifs : gélose Endo (Antisel - Sharlau Chemie SA, Espagne) pour E. coli et S. enterica, gélose au Cetrimide (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utr.) pour P. aeruginosa, la gélose TSC Perfringens (MkB Test as, Slovaquie), ainsi que la gélose Zeis- sler (BUL BIO NCIPD - Sofia) pour C. perfringens et la gélose Sabouraud dextrose avec chloramphénicol (Antisel - Sharlau Chemie SA, Espagne) pour C. albicans. Nutrient media. Mueller Hinton agar and broth (BUL BIO NCIPD - Sofia), Columbia blood agar (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utra 43) were used, as well as selective media: Endo agar (Antisel - Sharlau Chemie SA, Spain) for E. coli and S. enterica, Cetrimide agar (Biolab Zrt. H-1141, Budapest Ov. Utr.) for P. aeruginosa, TSC Perfringens agar (MkB Test as, Slovakia), as well as Zeissler agar (BUL BIO NCIPD - Sofia) for C. perfringens and Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol (Antisel - Sharlau Chemie SA, Spain) for C. albicans.
[0196] La culture des micro-organismes a été réalisée à 35-37° C pendant 18-24 et 72 heures dans un environnement anaérobie pour C. perfringens et dans des conditions aérobies pour les autres espèces microbiennes. Le système Anaerob Pack avec catalyseur au palladium - H2 + CO2 (BUL BIO NCIPD - Sofia) en pot a été utilisé pour créer des conditions anaérobies. L'indicateur Strip (BUL BIO NCIPD - Sofia) a été utilisé pour prouver la réalisation de l'anaérobiose. The culture of the microorganisms was carried out at 35-37° C. for 18-24 and 72 hours in an anaerobic environment for C. perfringens and under aerobic conditions for the other microbial species. The Anaerob Pack system with palladium catalyst - H2 + CO2 (BUL BIO NCIPD - Sofia) in pot was used to create anaerobic conditions. The Strip indicator (BUL BIO NCIPD - Sofia) was used to prove the achievement of anaerobiosis.
[0197] Les études préliminaires des substances ont été réalisées par la méthode classique de diffusion sur gélose de Bauer et al. (1966) et selon le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M2 -A3 (1997, 1999). Des suspensions de micro-organismes à tester ont été inoculées en phase de croissance exponentielle à une dose de 2.106 cellules / ml dans un volume de 0, 1 ml dans des boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre sur de la gélose Zeissler pour C. perfringens et de la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, avec un pH de 7,2 - 7,4 et une épaisseur de couche de 4 mm. Les extraits de plantes dans du nanoargent colloïdal et dans de l'eau, ainsi que l'antibiotique témoin ont été appliqués par 0,1 ml dans des puits de 9 mm dans la gélose. Les extraits de plantes seuls et en combinaison contenaient respectivement 2 mg de P. sidoides, 2 mg de S. nigra, 0,4 mg de H. perforatum et 24 ppm d'AgNPs ou d'eau dans 0,1 ml, et du thiamphénicol - 30 pg dans 0,1 ml (comme nécessaire). Après une incubation de 3-4 heures à température ambiante pour la diffusion, les cultures ont été incubées à 35-37° C pendant 18-24 et 72 heures. Les résultats ont été lus en mesurant les diamètres des zones inhibitrices en millimètres, y compris le diamètre du puits à 1 mm près, avec une règle transparente sur l'extérieur du fond des plaques. Selon le système de Bauer-Kirby en trois étapes, un effet inhibiteur des extraits de plantes avec ou sans AgNPs a été observé dans des zones > 12 mm, et du thiamphénicol - à > 17 mm. La sensibilité des micro-organismes testés a été déterminée comme pour les préparations non antibiotiques telles que les sulfamides, à savoir : résis-
tante (R) - dans les zones dont le diamètre est < 12 mm, modérément sensible - intermédiaire (I) - dans les zones comprises entre 13 et 16 mm et sensible (S) à > 17 mm. Pour le thiamphénicol, les limites correspondantes sont les suivantes : R < 12 mm, I - 13 - 17 mm et S - > 18 mm (NCCLS, 1997, 1999). The preliminary studies of the substances were carried out by the classic agar diffusion method of Bauer et al. (1966) and according to the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M2 -A3 (1997, 1999). Suspensions of microorganisms to be tested were inoculated in the exponential growth phase at a dose of 2.10 6 cells/ml in a volume of 0.1 ml in Petri dishes 9 cm in diameter on Zeissler agar for C perfringens and Mueller-Hinton agar for other microorganisms, with a pH of 7.2 - 7.4 and a layer thickness of 4 mm. The plant extracts in colloidal nanosilver and in water, as well as the control antibiotic were applied by 0.1 ml in 9 mm wells in the agar. Plant extracts alone and in combination contained 2 mg of P. sidoides, 2 mg of S. nigra, 0.4 mg of H. perforatum and 24 ppm of AgNPs or water in 0.1 ml, respectively, and thiamphenicol - 30 µg in 0.1 ml (as needed). After a 3-4 hour incubation at room temperature for diffusion, the cultures were incubated at 35-37°C for 18-24 and 72 hours. Results were read by measuring the diameters of the inhibitory zones in millimeters, including the diameter of the well to the nearest 1 mm, with a transparent ruler on the outside of the bottom of the plates. According to the three-step Bauer-Kirby system, an inhibitory effect of plant extracts with or without AgNPs was observed in areas > 12 mm, and of thiamphenicol - at > 17 mm. The susceptibility of the microorganisms tested was determined as for non-antibiotic preparations such as sulfonamides, i.e.: resistance aunt (R) - in areas with a diameter of < 12 mm, moderately susceptible - intermediate (I) - in areas between 13 and 16 mm and susceptible (S) at > 17 mm. For thiamphenicol, the corresponding limits are as follows: R < 12 mm, I - 13 - 17 mm and S - > 18 mm (NCCLS, 1997, 1999).
[0198] Les concentrations minimales inhibitrices (CMI ou MIC) ont été déterminées par la méthode des dilutions en série double dans la gélose Zeissler pour C. perfringens et la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, décrite par Ericsson et Sherris (1971) et NCCLS (1999). Les suspensions bactériennes ont été appliquées à une dose de 106 cel- lules/ml. Les extraits de plantes testés de P. sidoides, S. nigra et H. perforatum, seuls ou en combinaison, dans l'eau ou avec des AgNPs, ainsi que l'antibiotique de contrôle ont été administrés en différentes concentrations finales doublement croissantes par ml de gélose. Après incubation à 35-37° C pendant 18-24 heures, le nombre de colonies développées a été déterminé. Les CMI50 ont été calculées mathématiquement sur la base du nombre de colonies inhibées sur la gélose avec la dilution respective du composé testé par rapport aux colonies sur les milieux avec les contrôles sans extraits de plantes ou antibiotique. L'intervalle d'inhibition de la croissance (D) a été défini comme la concentration sans croissance visible. The minimum inhibitory concentrations (MIC or MIC) were determined by the method of double serial dilutions in Zeissler agar for C. perfringens and Mueller-Hinton agar for the other microorganisms, described by Ericsson and Sherris ( 1971) and NCCLS (1999). The bacterial suspensions were applied at a dose of 10 6 cells/ml. The tested plant extracts of P. sidoides, S. nigra and H. perforatum, alone or in combination, in water or with AgNPs, as well as the control antibiotic were administered in different doubling increasing final concentrations per ml of agar. After incubation at 35-37°C for 18-24 hours, the number of colonies developed was determined. The MIC50s were calculated mathematically based on the number of colonies inhibited on the agar with the respective dilution of the test compound compared to the colonies on the media with the controls without plant extracts or antibiotic. The growth inhibition range (D) was defined as the concentration with no visible growth.
[0199] Détermination du temps d'action antimicrobienne des extraits aqueux de plantes et de ceux avec du nano argent colloïdal. Chaque millilitre des extraits contenait 20 mg de P. sidoides, 20 mg de S. nigra et 4 mg de H. perforatum, respectivement, et lorsque les AgNPs ont été ajoutés, leur concentration finale était de 24 ppm. [0199] Determination of the antimicrobial action time of aqueous plant extracts and of those with nano colloidal silver. Each milliliter of the extracts contained 20 mg of P. sidoides, 20 mg of S. nigra and 4 mg of H. perforatum, respectively, and when the AgNPs were added, their final concentration was 24 ppm.
- Une suspension de chacune des souches microbiennes testées avec une concentration de 105 cellules/ml dans une quantité de 1 ml a été ajoutée à 9 ml de la combinaison d'extraits de plantes dans l'eau, ainsi qu'à 9 ml d'extraits aqueux de chacune de ces plantes séparément, où la concentration finale est devenue 104 cellules/ml. La même chose a été faite avec les extraits contenant des AgNPs seuls et séparément. - A suspension of each of the tested microbial strains with a concentration of 10 5 cells/ml in an amount of 1 ml was added to 9 ml of the combination of plant extracts in water, as well as to 9 ml of aqueous extracts of each of these plants separately, where the final concentration became 10 4 cells/ml. The same was done with the extracts containing AgNPs alone and separately.
- Une suspension de chacune des souches microbiennes testées avec une concentration de 107 cellules/ml dans une quantité de 1 ml a été ajoutée à 9 ml de la combinaison d'extraits de plantes, ainsi qu'à 9 ml d'extraits de chacun de ces extraits de plantes séparément, où la concentration finale de 106 cellules/ml a été atteinte. La même chose a été faite avec les extraits contenant des AgNPs seuls et séparément. - A suspension of each of the tested microbial strains with a concentration of 10 7 cells/ml in an amount of 1 ml was added to 9 ml of the combination of plant extracts, as well as to 9 ml of extracts of each of these plant extracts separately, where the final concentration of 10 6 cells/ml was reached. The same was done with the extracts containing AgNPs alone and separately.
- Les contrôles suivants ont été appliqués : de l'eau distillée stérile (sans extraits de plantes et AgNPs) avec le même contenu de chacune des souches microbiennes étudiées, ainsi qu'un extrait de plantes et AgNPs 30 ppm, sans microorganismes. - The following controls were applied: sterile distilled water (without plant extracts and AgNPs) with the same content of each of the microbial strains studied, as well as a plant extract and AgNPs 30 ppm, without microorganisms.
[0200] Après homogénéisation pendant 1 min sur un appareil Vortex (Heidolph - Labimex, Bulgarie) et différents intervalles de temps pour l'exposition des micro-organismes aux extraits de plantes testés (1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 2 h et 24 h), des cultures ont été faites à partir de chacun des échantillons sur de la gélose Zeissler pour C. perfringens et de la gélose Mueller-Hinton pour les autres micro-organismes, qui ont été cultivés à 37° C pendant 24 - 48 h dans des conditions aérobies et anaérobies. Après la culture, la croissance des bactéries testées a été rapportée et le nombre de colonies développées a été
déterminé. [0200] After homogenization for 1 min on a Vortex device (Heidolph - Labimex, Bulgaria) and different time intervals for the exposure of the microorganisms to the plant extracts tested (1 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 2 h and 24 h), cultures were made from each of the samples on Zeissler agar for C. perfringens and Mueller-Hinton agar for the other microorganisms, which were grown at 37°C for 24 - 48 h under aerobic and anaerobic conditions. After cultivation, the growth of the tested bacteria was reported and the number of developed colonies was determined.
[0201] Toutes les expériences ont été réalisées trois fois. [0201] All the experiments were carried out three times.
[0202] Le traitement statistique des résultats a été effectué selon la méthode classique de Student et Fisher. The statistical processing of the results was carried out according to the classic Student and Fisher method.
[0203] Résultats [0203] Results
[0204] Dans les études réalisées par la méthode de diffusion sur disque d'agar, un fort effet inhibiteur des extraits de toutes les plantes testées examinées avec les AgNPs (diamètres des zones inhibitrices entre 16.0 + 0.6 et 24.3 + 1.3 mm) et la combinaison entre eux a été rapporté (zones inhibitrices entre 18.3 + 3.3 et 28.7 + 3.1 mm) dans tous les microorganismes testés. Les données résumées sont présentées dans le tableau 13. L'effet de la combinaison des extraits des trois plantes avec les AgNPs était plus élevé que celui des extraits avec les AgNPs appliqués séparément. Les différences des diamètres moyens des zones inhibitrices (sans croissance microbienne) entre les extraits des plantes individuelles et la combinaison entre elles n'étaient pas significatives (P> 0,05). [0204] In the studies carried out by the agar disk diffusion method, a strong inhibitory effect of the extracts of all the plants tested examined with the AgNPs (diameters of the inhibitory zones between 16.0 + 0.6 and 24.3 + 1.3 mm) and the combination between them has been reported (inhibitory zones between 18.3 + 3.3 and 28.7 + 3.1 mm) in all microorganisms tested. The summarized data are shown in Table 13. The effect of combining the extracts of the three plants with the AgNPs was higher than that of the extracts with the AgNPs applied separately. The differences in the mean diameters of the inhibitory zones (without microbial growth) between the extracts of the individual plants and the combination between them were not significant (P > 0.05).
[0205] [Tableau 13] : Effet antimicrobien des extraits de plantes testés avec des AgNPs testés seuls et en combinaison contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans la méthode de diffusion agar-gel.
[0205] [Table 13]: Antimicrobial effect of plant extracts tested with AgNPs tested alone and in combination against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in the agar-gel diffusion method.
[0206] Les extraits aqueux de toutes les plantes testées, ainsi que la combinaison entre elles (diamètres des zones inhibitrices entre 16,0 + 0,6 et 26,0 + 3,7 mm) ont également montré un effet inhibiteur élevé sur tous les microorganismes étudiés dans les études
réalisées par la méthode de diffusion sur disque. Les résultats sont présentés dans le tableau 14. L'effet de la combinaison entre les extraits des trois plantes était plus élevé que celui des extraits appliqués séparément. Les différences dans les diamètres moyens des zones de non-croissance entre les extraits des plantes individuelles et la combinaison entre elles n'étaient pas significatives (P> 0,05). [0206] The aqueous extracts of all the plants tested, as well as the combination between them (diameters of the inhibitory zones between 16.0 + 0.6 and 26.0 + 3.7 mm) also showed a high inhibitory effect on all the microorganisms studied in the studies carried out by the disc diffusion method. The results are shown in Table 14. The effect of the combination between the extracts of the three plants was higher than that of the extracts applied separately. The differences in the average diameters of the non-growth zones between the extracts of the individual plants and the combination between them were not significant (P > 0.05).
[0207] [Tableau 14] : Effet antimicrobien des extraits de plantes testés avec des AgNPs testés seuls et en combinaison contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans la méthode de diffusion agar-gel.
[0207] [Table 14]: Antimicrobial effect of plant extracts tested with AgNPs tested alone and in combination against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in the agar-gel diffusion method.
[0208] Une sensibilité légèrement plus élevée à toutes les herbes étudiées, ainsi qu'à la combinaison de celles-ci, a été démontrée par les bactéries Gram-négatives testées par rapport aux micro-organismes Gram-positifs (P> 0,05). La sensibilité la plus élevée dans cette méthode a été trouvée chez E. coli et P. aeruginosa. Le champignon C. albicans a également montré une sensibilité à toutes les herbes étudiées. Tous les micro-organismes testés ont montré une sensibilité élevée au thiamphénicol, utilisé comme contrôle positif. Les différences dans les diamètres des zones inhibitrices de toutes les souches dans l'antibiotique et les extraits étudiés étaient statistiquement significatives (P <0,05). [0208] A slightly higher susceptibility to all the herbs studied, as well as the combination thereof, was demonstrated by the Gram-negative bacteria tested compared to the Gram-positive microorganisms (P > 0.05 ). The highest sensitivity in this method was found in E. coli and P. aeruginosa. The fungus C. albicans also showed sensitivity to all the herbs studied. All microorganisms tested showed high sensitivity to thiamphenicol, used as a positive control. The differences in the diameters of the inhibitory zones of all the strains in the antibiotic and the extracts studied were statistically significant (P<0.05).
[0209] Les résultats obtenus lors de la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont présentés dans le tableau 15. Ils correspondent à ceux de la méthode de diffusion agar-gel. Les extraits étudiés des trois herbes ont montré une activité antimicrobienne significative. L'effet de P. sidoides et de S. nigra était similaire. Leur CMI5o pour les bactéries Gram-négatives était faible - 10 mg/ml, et pour les micro-organismes Gram-positifs -
20 mg/ml. La croissance des souches microbiennes étudiées a été inhibée par des concentrations plus élevées de H. perforatum - 50 mg/ml pour les souches Gram-négatives et 100 mg/ml pour les souches Gram-positives. The results obtained during the determination of the minimum inhibitory concentrations (MIC) are presented in table 15. They correspond to those of the agar-gel diffusion method. The studied extracts of the three herbs showed significant antimicrobial activity. The effect of P. sidoides and S. nigra was similar. Their MIC5o for Gram-negative bacteria was low - 10 mg/ml, and for Gram-positive microorganisms - 20mg/ml. The growth of the microbial strains studied was inhibited by higher concentrations of H. perforatum - 50 mg/ml for Gram-negative strains and 100 mg/ml for Gram-positive strains.
[0210] [Tableau 15] : Concentrations minimales inhibitrices des extraits de plantes testés dans l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs.
[0210] [Table 15]: Minimum inhibitory concentrations of plant extracts tested in water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms.
MIC50 -inhibition de la croissance à 50 % ; D -diapason de l'inhibition totale de la croissanceMIC50 -50% growth inhibition; D-tuning for total growth inhibition
[0211] Lorsqu'ils sont appliqués en combinaison ces extraits ont montré une activité synergique. Le même effet antimicrobien a été obtenu à des concentrations deux fois plus faibles. Les différences de CMI50 de P. sidoides et S. nigra, testés seuls et en combinaison, étaient significatives (P <0,01) en faveur de la combinaison (les données sont présentées dans le tableau 2 du protocole précédent). [0211] When applied in combination these extracts showed synergistic activity. The same antimicrobial effect was obtained at twice the lower concentrations. The differences in MIC50 of P. sidoides and S. nigra, tested alone and in combination, were significant (P < 0.01) in favor of the combination (the data are presented in Table 2 of the previous protocol).
[0212] Les données des études par la méthode de suspension ont montré que les extraits aqueux de plantes testés, appliqués en combinaison, présentaient une activité antimicrobienne significative (Tableau 16). Lorsque la combinaison de plantes contenait des AgNPs, l'effet bactéricide était plus rapide que lorsque l'argent était absent. Comme le montrent les données du tableau, lorsqu'elles sont en suspension avec une densité de 106 cellules/ml, les bactéries Gram-négatives étudiées sont mortes rapidement - E. coli pendant 1 min avec l'argent et jusqu'à 5 min sans argent, P. aeruginosa respectivement pendant 15 - 30 min, et S. enterica en 30 min. La combinaison des extraits de plantes a également inactivé les micro-organismes Gram-positifs étudiés dans une suspension avec une densité de 106 cellules/ml, mais pendant plus longtemps -C. perfringens pendant 1 heure, et S. aureus, S.
pyogenes et C. albicans pendant plus de deux heures. Dans les extraits aqueux sans argent, la réduction des micro-organismes testés de tous les groupes s'est produite plus lentement que lorsque la combinaison de plantes contenait du nanoargent colloïdal. [0212] Data from suspension method studies showed that the aqueous plant extracts tested, applied in combination, exhibited significant antimicrobial activity (Table 16). When the plant combination contained AgNPs, the bactericidal effect was faster than when the silver was absent. As shown by the data in the table, when in suspension with a density of 106 cells/ml, the Gram-negative bacteria studied died rapidly - E. coli for 1 min with the silver and up to 5 min without silver, P. aeruginosa respectively for 15 - 30 min, and S. enterica in 30 min. The combination of plant extracts also inactivated the Gram-positive microorganisms studied in a suspension with a density of 106 cells/ml, but for longer -C. perfringens for 1 hour, and S. aureus, S. pyogenes and C. albicans for more than two hours. In aqueous extracts without silver, the reduction of the tested microorganisms of all groups occurred more slowly than when the plant combination contained colloidal nanosilver.
[0213] [Tableau 16] : Effet antimicrobien des extraits de plantes testés en combinaison avec des AgNPs et dans l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 106 cellules/ml
[0213] [Table 16]: Antimicrobial effect of plant extracts tested in combination with AgNPs and in water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells/ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0214] En suspension à une densité de 104 cellules/ml, les micro-organismes testés ont montré une plus grande sensibilité aux extraits de plantes testés appliqués en combinaison. Leurs quantités ont diminué plus rapidement sous l'action des moyens examinés. Lorsque la combinaison de plantes contenait des AgNPs, son effet bactéricide était plus rapide que lorsque l'argent était absent. Les résultats de cette recherche sont présentés dans le tableau 17. Dans ce dispositif expérimental, les bactéries Gram-négatives testées sont mortes en un temps beaucoup plus court. En présence de nanoargent - pendant 1 min, et sans nanoargent - pendant 5 min. La combinaison d'extraits végétaux a également inactivé les micro-organismes Gram positif étudiés dans une suspension d'une densité de 104 cellules/ml, mais pendant une durée plus longue - l'anaérobie C. perfringens pendant 30 minutes, et les autres espèces bactériennes et le champignon ovale C. albicans pendant plus de deux heures. Comme on peut le voir dans les données du tableau, dans les extraits aqueux sans argent, la réduction des micro-organismes testés de tous les groupes s'est produite plus lentement que lorsque la combinaison de plantes contenait du nanoargent colloïdal. In suspension at a density of 10 4 cells/ml, the microorganisms tested showed greater sensitivity to the plant extracts tested applied in combination. Their quantities decreased faster under the influence of the considered means. When the plant combination contained AgNPs, its bactericidal effect was faster than when the silver was absent. The results of this research are shown in Table 17. In this experimental device, the Gram-negative bacteria tested died in a much shorter time. In the presence of nanosilver - for 1 min, and without nanosilver - for 5 min. The combination of plant extracts also inactivated the Gram-positive microorganisms studied in a suspension with a density of 104 cells/ml, but for a longer period - the anaerobic C. perfringens for 30 minutes, and the other species bacteria and the oval fungus C. albicans for more than two hours. As can be seen from the data in the table, in the aqueous extracts without silver, the reduction of the tested microorganisms of all groups occurred more slowly than when the plant combination contained colloidal nanosilver.
[0215] [Tableau 17] : Effet antimicrobien de l'extrait de P. sidoides avec des AgNPs et dans l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité
de 104 cellules/ml
[0215] [Table 17]: Antimicrobial effect of P. sidoides extract with AgNPs and in water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 4 cells/ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0216] Les résultats des études de l'extrait de géranium africain (P. sidoides) dans la méthode de suspension sont présentés dans les tableaux 18 et 19. L'extrait de cette plante a montré une activité antimicrobienne significative, qui augmente avec l'ajout de nanoargent colloïdal. Les bactéries Gram-négatives étudiées en suspension avec une densité de 106 cellules/ml sont mortes en un temps relativement court - E. coli jusqu'à 5 minutes en présence de nanoargent et jusqu'à 15 min sans argent, et S. enterica et P. aeruginosa - en 15 min avec argent et 30 min sans nanoargent. L'extrait de P. sidoides a inactivé les micro-organismes Gram-positifs étudiés, mais pendant plus longtemps - C. perfringens pendant plus d'une heure, et les autres espèces bactériennes et le champignon C. albicans pendant plus de deux heures. [0216] The results of studies of the extract of African geranium (P. sidoides) in the suspension method are presented in Tables 18 and 19. The extract of this plant showed significant antimicrobial activity, which increased with addition of colloidal nanosilver. Gram-negative bacteria studied in suspension with a density of 106 cells/ml died in a relatively short time - E. coli up to 5 min in the presence of nanosilver and up to 15 min without silver, and S. enterica and P. aeruginosa - in 15 min with silver and 30 min without nanosilver. The extract of P. sidoides inactivated the Gram-positive microorganisms studied, but for longer - C. perfringens for more than one hour, and the other bacterial species and the fungus C. albicans for more than two hours.
[0217] [Tableau 18] : Effet antimicrobien de l'extrait de P. sidoides avec AgNPs et avec de l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 106 cellules/ml
[0217] [Table 18]: Antimicrobial effect of the extract of P. sidoides with AgNPs and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells/ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0218] [Tableau 19] : Effet antimicrobien de l'extrait de P. sidoides avec AgNPs et avec de l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de cellules/ml
[0218] [Table 19]: Antimicrobial effect of P. sidoides extract with AgNPs and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of cells/ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0219] Lorsqu'elles sont en suspension avec une densité de 104 cellules/ml (Tableau 19) sous l'influence de l'extrait de P. sidoides, les bactéries Gram-négatives sont mortes en un temps plus court - E. coli en 5 min, et S. enterica et P. aeruginosa - en moins de 5 min en présence de nanoargent et jusqu'à 15 min sans argent. Les quantités de micro-organismes à Gram positif ont diminué plus rapidement que dans une suspension de densité plus élevée, mais des cellules uniques de C. perfringens sont restées viables pendant plus de 30 minutes et les autres pendant plus de 2 heures en présence de cet extrait. [0219] When suspended with a density of 104 cells/ml (Table 19) under the influence of P. sidoides extract, Gram-negative bacteria died in a shorter time - E. coli in 5 min, and S. enterica and P. aeruginosa - in less than 5 min in the presence of nanosilver and up to 15 min without silver. The amounts of Gram-positive microorganisms decreased more rapidly than in a higher density suspension, but single cells of C. perfringens remained viable for more than 30 minutes and the others for more than 2 hours in the presence of this extract.
[0220] Les tableaux 20 et 21 montrent les résultats des tests dans la méthode de suspension de l'extrait de baies de sureau noir (S. nigra) Toutes les bactéries Gram-négatives testées dans une suspension avec une densité de 106 cellules/ml sont mortes
en 30 min, mais beaucoup plus rapidement lorsque l'extrait contenait du nanoargent. L'extrait de baies de S. nigra a également inactivé les micro-organismes Gram-positifs étudiés dans une suspension avec une densité de 106 cellules/ml, mais pendant plus longtemps - C. perfringens pendant 2 heures, et les autres espèces bactériennes et le champignon ovale C. albicans pendant plus de deux heures (Tableau 20). Dans le cas de l'extrait de baies de S. nigra avec une teneur en argent, la réduction des micro-organismes testés de tous les groupes s'est produite plus rapidement par rapport à l'extrait aqueux. [0220] Tables 20 and 21 show the results of the tests in the suspension method of the extract of black elderberries (S. nigra) All the Gram-negative bacteria tested in a suspension with a density of 10 6 cells/ ml are dead in 30 min, but much faster when the extract contained nanosilver. S. nigra berry extract also inactivated the Gram-positive microorganisms studied in a suspension with a density of 10 6 cells/ml, but for longer - C. perfringens for 2 hours, and the other bacterial species and the oval fungus C. albicans for more than two hours (Table 20). In the case of S. nigra berry extract with silver content, the reduction of the tested microorganisms of all groups occurred faster compared to the aqueous extract.
[0221] [Tableau 20] : Effet antimicrobien de l'extrait de S. nigra avec AgNPs 30 ppm et avec de l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs dans des suspensions avec une densité de 106 cellules/ml.
[0221] [Table 20]: Antimicrobial effect of S. nigra extract with AgNPs 30 ppm and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells /ml.
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0222] Lorsqu'elles sont en suspension avec une densité de 104 cellules/ml sous l'influence de l'extrait de baies de S. nigra (Tableau 21), les bactéries Gram-négatives sont mortes en un temps plus court - jusqu'à 15 min. Les quantités de micro-organismes Gram-positifs ont diminué plus rapidement que lors d'une suspension à une concentration de 106 cellules/ml, mais des cellules uniques de C. perfringens sont restées viables pendant plus de 30 minutes et les autres - pendant plus de 2 heures sous l'influence de cet extrait. La présence de nanoargent dans l'extrait a entraîné une réduction plus rapide des cellules microbiennes. When they are in suspension with a density of 10 4 cells/ml under the influence of S. nigra berry extract (Table 21), the Gram-negative bacteria died in a shorter time - up to 15 mins. The amounts of Gram-positive microorganisms decreased faster than when suspended at a concentration of 106 cells/ml, but single cells of C. perfringens remained viable for more than 30 minutes, and the others - for more 2 hours under the influence of this extract. The presence of nanosilver in the extract resulted in faster reduction of microbial cells.
[0223] [Tableau 21] : Effet antimicrobien de l'extrait de S. nigra avec AgNPs 30 ppm et avec de l'eau contre les micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatives en suspensions avec une densité de 104 cellules/ml.
[0223] [Table 21]: Antimicrobial effect of S. nigra extract with AgNPs 30 ppm and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 104 cells/ml .
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0224] Les résultats des tests de l'extrait jaune de millepertuis (H. perforatum) contre les suspensions microbiennes sont présentés dans les tableaux 22 et 23. Cet extrait a également montré une activité antimicrobienne significative, en particulier en présence de nanoargent colloïdal. Les bactéries Gram-négatives étudiées sont mortes en peu de temps - 15 minutes en présence d'argent et un peu plus lentement sans argent. L'extrait de H. perforatum a inactivé les micro-organismes Gram-positifs étudiés dans une suspension avec une densité de 106 cellules/ml, mais pendant une période plus longue -C. perfringens pendant 2 heures, et les autres espèces bactériennes et C. albicans - pendant plus de deux heures. En présence de nanoargent dans l'extrait, une réduction plus rapide des cellules microbiennes de tous types a été obtenue. The results of the tests of the yellow extract of St. John's wort (H. perforatum) against microbial suspensions are presented in Tables 22 and 23. This extract also showed significant antimicrobial activity, in particular in the presence of colloidal nanosilver. The Gram-negative bacteria studied died within a short time - 15 minutes in the presence of silver and somewhat more slowly without silver. H. perforatum extract inactivated the Gram-positive microorganisms studied in a suspension with a density of 106 cells/ml, but for a longer period -C. perfringens for 2 hours, and other bacterial species and C. albicans - for more than two hours. In the presence of nanosilver in the extract, a faster reduction of microbial cells of all types was obtained.
[0225] [Tableau 22] : Effet antimicrobien de l'extrait de H. perforatum avec AgNPs 30 ppm et avec de l'eau contre des micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 106 cellules/ml
[0225] [Table 22]: Antimicrobial effect of the extract of H. perforatum with AgNPs 30 ppm and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 6 cells/ ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0226] [Tableau 23] : Effet antimicrobien de l'extrait de H. perforatum avec AgNPs 30 ppm et avec de l'eau contre des micro-organismes Gram-positifs et Gram-négatifs en suspensions avec une densité de 104 cellules/ml
[0226] [Table 23]: Antimicrobial effect of the extract of H. perforatum with AgNPs 30 ppm and with water against Gram-positive and Gram-negative microorganisms in suspensions with a density of 10 4 cells/ ml
Ag - combinaison d'extraits de plantes avec AgNPs ; W - combinaison d'extraits de plantes dans l'eau. Ag - combination of plant extracts with AgNPs; W - combination of plant extracts in water.
[0227] Lorsqu'elles sont en suspension avec une densité de 104 cellules/ml sous l'influence de H. perforatum, toutes les bactéries Gram-négatives examinées sont mortes en moins de temps - en 15 minutes. Les quantités de micro-organismes Gram-positifs testés ont diminué plus rapidement que lorsqu'ils étaient en suspension à une concentration de 106 cellules/ml, mais des cellules uniques de S. pyogenes et de C. perfringens sont restées viables pendant plus de 60 minutes, et des autres - plus de 2 heures en présence de l'extrait de H. perforatum. La réduction de toutes les souches microbiennes s'est produite plus rapidement en présence de AgNPs dans l'extrait.
[0228] Conclusion : [0227] When suspended with a density of 10 4 cells/ml under the influence of H. perforatum, all Gram-negative bacteria examined died in less time - in 15 minutes. The amounts of Gram-positive microorganisms tested decreased more rapidly than when suspended at a concentration of 10 6 cells/ml, but single cells of S. pyogenes and C. perfringens remained viable for more than 60 minutes, and another - more than 2 hours in the presence of H. perforatum extract. The reduction of all microbial strains occurred faster in the presence of AgNPs in the extract. [0228] Conclusion:
[0229] Les extraits testés de baies de Pelargonium sidoides, Hypericum perforatum et Sambucus nigra ont montré une activité antimicrobienne significative in vitro à la fois seuls et en combinaison. La combinaison étudiée des trois extraits a eu un effet synergique contre les micro-organismes Gram-négatifs et Gram-positifs. La présence de nano-argent colloïdal dans les extraits et dans la combinaison entre eux a augmenté leur activité antimicrobienne. Cette combinaison d'extraits et d'AgNPs 30 ppm pourrait être un agent antimicrobien fiable avec un effet significatif en particulier contre les bactéries Gram-négatives, l'une des causes les plus courantes d'infections difficiles à traiter chez les humains et les animaux. Parmi les micro-organismes Gram-positifs, la bactérie anaérobie obligatoire C. perfringens et le champignon ovale C. albicans y étaient plus sensibles.
[0229] The tested extracts of Pelargonium sidoides, Hypericum perforatum and Sambucus nigra berries showed significant antimicrobial activity in vitro both alone and in combination. The studied combination of the three extracts had a synergistic effect against Gram-negative and Gram-positive microorganisms. The presence of colloidal nano-silver in the extracts and in the combination between them increased their antimicrobial activity. This combination of extracts and 30 ppm AgNPs could be a reliable antimicrobial agent with significant effect especially against Gram-negative bacteria, one of the most common causes of hard-to-treat infections in humans and animals. . Among Gram-positive microorganisms, the obligate anaerobic bacterium C. perfringens and the oval fungus C. albicans were more susceptible.
Claims
[Revendication 1] Composition pour utilisation comme médicament comprenant : [Claim 1] A composition for use as a medicament comprising:
- De l’argent sous forme colloïdale ; - Silver in colloidal form;
- Un extrait de Sambucus Nigra ; - An extract of Sambucus Nigra;
- Un extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou un extrait d’Hypericum perforatum ; - An extract of Primulae flos cum calycibus and/or an extract of Hypericum perforatum;
- Un extrait de pélargonium sidoides. - An extract of pelargonium sidoides.
[Revendication 2] Composition pour utilisation comme médicament selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit argent sous forme colloïdale a une taille de particules comprise entre 0,1 et 30 nanomètres. [Claim 2] Composition for use as a medicament according to the preceding claim, characterized in that the said silver in colloidal form has a particle size of between 0.1 and 30 nanometers.
[Revendication 3] Composition pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant : [Claim 3] A composition for use according to any preceding claim, comprising:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent sous forme colloïdale par litre de composition ; - Between 20 mg and 250 mg of silver in colloidal form per liter of composition;
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra ;- Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition;
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’extrait d’Hypericum perforatum ; - Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract and/or between 0.5 and 11% by weight of the composition of Hypericum perforatum extract;
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[Revendication 4] Composition pour utilisation selon les revendications 1 et 2, comprenant en outre : [Claim 4] A composition for use according to claims 1 and 2, further comprising:
- De l’argent sous forme ionique ; - Silver in ionic form;
[Revendication 5] Composition pour utilisation comme médicament selon la revendication précédente, comprenant : [Claim 5] Composition for use as a medicament according to the preceding claim, comprising:
- Entre 20 mg et 250 mg d’argent total par litre de composition, réparti en i. Entre 70 et 99,99% en poids total d’argent, d’argent sous forme colloïdale ; ii. Entre 0,01 et 30% en poids total d’argent, d’argent sous forme ionique. - Between 20 mg and 250 mg of total silver per liter of composition, divided into i. Between 70 and 99.99% by total weight of silver, silver in colloidal form; ii. Between 0.01 and 30% by total weight of silver, silver in ionic form.
- Entre 0,3 et 5% en poids de la composition d’Extrait de Sambucus Nigra ;- Between 0.3 and 5% by weight of the Sambucus Nigra Extract composition;
- Entre 1 et 9% en poids de la composition d’Extrait de Primulae flos cum calycibus et/ou entre 0,5 et 11% en poids de la composition d’extrait d’Hypericum perforatum ;
- Entre 1 et 6% en poids de la composition d’Extrait de pélargonium sidoides. - Between 1 and 9% by weight of the composition of Primulae flos cum calycibus extract and/or between 0.5 and 11% by weight of the composition of Hypericum perforatum extract; - Between 1 and 6% by weight of the composition of Pelargonium sidoides extract.
[Revendication 6] Composition pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre : [Claim 6] A composition for use according to any preceding claim, further comprising:
- Un extrait d’Echinacea, et/ou - An extract of Echinacea, and/or
- De la Propolis et/ou - Propolis and/or
- Un extrait d’ Artemisia et/ou - An extract of Artemisia and/or
- Un extrait d’ Allium sativum. - An extract of Allium sativum.
[Revendication 7] Composition pour utilisation selon la revendication précédente, comprenant : [Claim 7] Composition for use according to the preceding claim, comprising:
- Entre 0,01 et 8% en poids de la composition d’extrait d’Echinacea, et/ou- Between 0.01 and 8% by weight of the Echinacea extract composition, and/or
- Entre 0,01 et 7% en poids de la composition de Propolis, et/ou - Between 0.01 and 7% by weight of the Propolis composition, and/or
- Entre 0,5 et 3% en poids de la composition d’extrait d’ Artemisia, et/ou- Between 0.5 and 3% by weight of the Artemisia extract composition, and/or
- Entre 0,01 et 10% en poids de la composition d’extrait d’ Allium sativum.- Between 0.01 and 10% by weight of the Allium sativum extract composition.
[Revendication 8] Composition pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est sous une forme adaptée pour une administration par voie orale, en intraveineuse, en sous-cutanée, par voie nasale, par voie ophtalmique, par voie auriculaire, par voie rectale, par voie vaginale, par voie respiratoire, ou par application sur la peau. [Claim 8] Composition for use according to any one of the preceding claims, characterized in that it is in a form suitable for administration by the oral route, by the intravenous route, by the subcutaneous route, by the nasal route, by the ophthalmic route, by the auricular route, by the rectal route, by the vaginal route, by the respiratory route, or by application to the skin.
[Revendication 9] Composition pour utilisation selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la voie d’application sur la peau prend la forme d’une pommade, une crème, un patch ou un gel. [Claim 9] Composition for use according to the preceding claim, characterized in that the route of application to the skin takes the form of an ointment, a cream, a patch or a gel.
[Revendication 10] Composition pour utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antiviral, antibactérien et antifongique. [Claim 10] A composition for use according to any preceding claim, for use in antiviral, antibacterial and antifungal prophylaxis and/or treatment.
[Revendication 11] Composition pour utilisation selon la revendication 9, destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antifongique, par application sur la peau sous forme de crème. [Claim 11] A composition for use according to claim 9, for use in the prophylaxis and/or antifungal treatment, by application to the skin in the form of a cream.
[Revendication 12] Composition pour utilisation selon la revendication 9, destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antibactérien, par application sur la peau sous forme de crème. [Claim 12] A composition for use according to claim 9, for use in the prophylaxis and/or antibacterial treatment, by application to the skin in the form of a cream.
[Revendication 13] Composition pour utilisation selon la revendication 9, destinée à être utilisée dans la prophylaxie et/ou le traitement antifongique et antibactérien, par application sur la peau sous forme de crème. [Claim 13] A composition for use according to claim 9, for use in the prophylaxis and/or antifungal and antibacterial treatment, by application to the skin in the form of a cream.
[Revendication 14] Composition pour utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, destinée à être utilisée en tant qu’ antibiotique.
[Revendication 15] Composition pour utilisation selon la revendication précédente, destinée à être utilisée chez les patients antibioresistants.
[Claim 14] A composition for use according to any of claims 1 to 9 for use as an antibiotic. [Claim 15] Composition for use according to the preceding claim, intended for use in antibiotic-resistant patients.
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