EP4135694A1 - Bromodomain inhibitors for the prevention and/or treatment of coronavirus infections and diseases caused thereby - Google Patents

Bromodomain inhibitors for the prevention and/or treatment of coronavirus infections and diseases caused thereby

Info

Publication number
EP4135694A1
EP4135694A1 EP21720218.3A EP21720218A EP4135694A1 EP 4135694 A1 EP4135694 A1 EP 4135694A1 EP 21720218 A EP21720218 A EP 21720218A EP 4135694 A1 EP4135694 A1 EP 4135694A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
infection
inhibitor
sars
cov
coronavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21720218.3A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Michael Schindler
Natalia RUETALO BUSCHINGER
Ramona Businger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen, Universitaetsklinikum Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of EP4135694A1 publication Critical patent/EP4135694A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a new active ingredient for the prophylactic and therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, a pharmaceutical composition containing this active ingredient and a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or any illness caused by this infection.
  • the present invention relates to the field of molecular medicine, in particular the field of antiviral substances.
  • coronaviruses colloquially also called coronaviruses, are a virus family within the order Nidovirales. Their representatives cause very different diseases in different vertebrates such as mammals, birds and fish. The first coronaviruses were described as early as the mid-1960s. Coronaviruses are genetically highly variable. Individual species from the Coronaviridae family can also infect several species of hosts by overcoming the species barrier. By overcoming the species barrier, infections with the SARS-associated coronavirus (SARS-CoV, sometimes also referred to as SARS-CoV-1) - the causative agent of the SARS pandemic 2002/2003 - as well as the 2012 new one are among other things Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV).
  • SARS-CoV SARS-associated coronavirus
  • the COVID-19 pandemic emanating from the Chinese city of Wuhan is attributed to a previously unknown coronavirus that was given the name SARS-CoV-2.
  • the virus causes the viral disease COVID-19 (for corona virus disease 2019) and was the trigger of the COVID-19 pandemic, which the World Health Organization (WHO) identified on January 30, 2020 as a "health emergency of international concern" and on March 11 2020 was classified as a pandemic.
  • WHO World Health Organization
  • the course of the disease is unspecific, diverse and varies greatly. In addition to asymptomatic infections, predominantly mild to moderate courses were observed, but also severe ones with bilateral pneumonia up to lung failure and death.
  • the invention is based on the object of providing an active ingredient which reduces the disadvantages of the prior art, preferably avoids.
  • an active ingredient is to be provided that preferably also in low concentrations of infection with Coronaviruses can counteract and thus is suitable for the production of a medicament for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
  • the present invention addresses these and other needs.
  • This object is achieved by providing an inhibitor of the bromodomain-containing protein (BRD) for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
  • BBD bromodomain-containing protein
  • coronaviruses include all species that belong to the virus family Coronavirusidae, in particular SARS-CoV-2 (Sars-CoV-2, severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2, “Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2”).
  • SARS-CoV-2 Sars-CoV-2, severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2, “Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2”.
  • treatment of an infection or disease is understood to mean, in particular, a therapeutic intervention with the aim of positively influencing the overall health of the living being treated, which is determined by the infection and / or disease.
  • the treatment comprises alleviating and / or relieving symptoms of the disease, reducing the viral load, eliminating the virus and / or curing the disease.
  • prophylaxis of an infection or disease is understood in particular as a measure which serves to counteract an impairment of the overall health of the living being treated, which is determined by the infection and / or disease.
  • prophylaxis includes preventing a disease.
  • bromodomain or bromodomain is a protein domain of approximately 110 amino acids that recognizes acetylated lysine residues, such as those on the N-terminal tails of histones. As “readers” of lysine acetylation, bromodomains are responsible for transducing the signal transmitted by acetylated lysine residues and converting it into various normal or abnormal phenotypes. "Bromodomain-containing proteins” (BRD) can exert a multitude of biological functions, ranging from histone acetyltransferase activity and chromatin remodeling to transcription mediation and co-activation. Of the 43 BRD known in 2015, 11 had two bromodomains and one protein had 6 bromodomains.
  • the so-called BET family (bromodomain and extra-terminal domain), a subgroup of the bromodomain family, includes, for example, the members BRD2, BRD3, BRD4 and BRDT.
  • BRD2, BRD3, BRD4 and BRDT Production, biochemical analysis and structure determination of the bromodomain-containing proteins have been described in detail. Ren et al. (2016), Preparation, Biochemical Analysis, and Structure Determination of the Bromodomain, an Acetyl-Lysine Binding Domain, Methods in Enzymology 573: 321-43. According to the invention, all bromomain-containing proteins are included.
  • an "inhibitor" of the FRG which is also referred to synonymously as a FRG inhibitor, is understood to mean an agent which leads to a selective and specific inhibition of the FRG.
  • BRD inhibitors are described, for example, in Bechter and Schöffski (2020), Make your best BET the emerging role of BET inhibitor treatment in malignant tumors, Pharmacology & Therapeutics 208: 107479, but exclusively there under the synonymous name BET inhibitors for their anti-tumor activity.
  • the inhibition can take place by reducing the activity, functionality, expression or other phenomena which lead to an inhibition of BRD.
  • the agent can be in any conceivable material form, such as a small molecule, a peptide, an antibody, a nucleic acid molecule, etc.
  • the inventors were able to surprisingly show experimentally that BRD inhibitors not only prevent the cytopathic effect caused by the virus but also reduce the viral load and the number of virus-infected cells. These effects are already evident at very low concentrations, which are in the nanomolar range.
  • the BRD inhibitor is therefore used in a concentration which at the cellular level (for example in human cells of the lung epithelium) in the range of ⁇ 1 mM, preferably ⁇ 0.5 mM, more preferably ⁇ 0.4 pM, more preferably 0.3 pM, more preferably 0.2 pM.
  • the infection and disease is an infection with a SARS-associated coronavirus (SARS-CoV) and a disease caused by this infection, preferably a SARS-CoV-2 infection and / or about COVID-19.
  • SARS-CoV SARS-associated coronavirus
  • an active substance is provided in an advantageous manner, which, according to the inventors' findings, is superior to the substances currently being tested and some of which have already been clinically tested. This is an advantageous way of meeting the urgent need for active ingredients to combat COVID-19.
  • the inhibitor is an inhibitor of the bromodomain-containing protein 2 (BRD2).
  • the inhibitor is an inhibitor of the bromodomain-containing protein 4 (BRD4).
  • BRD4 bromodomain-containing protein 4
  • a BRD2 inhibitor and a BRD4 inhibitor can be two substances.
  • it can also be a substance that inhibits both target structures and is referred to, for example, as a BRD2 / 4 inhibitor.
  • the "BRD4" protein is encoded by the BRD4 gene in humans. It has two bomodomains called BD1 and BD2. It is homologous to the mouse protein MCAP, which associates with chromosomes during mitosis, and homologous to the human BRD2 (RING3) protein, a serine / threonine kinase. Each of these proteins contains two bromodomains, a conserved sequence motif that can be involved in chromatin targeting. BRD4 is often required for the expression of Myc and other "tumor-driving" oncogenes in hematologic cancers, including multiple myeloma, acute myeloid leukemia, and acute lymphoblastic leukemia.
  • the "BRD2" protein is encoded by the BRD2 gene in humans. Early descriptions indicated that the BRD2 gene product is a mitogen-activated kinase that resides in the nucleus. The gene is mapped to the class II region of the major histocompatibility complex (MHC) on chromosome 6p21.3, but sequence comparison suggests that the protein is not involved in the immune response. The homology to the female sterile homeotic of the Drosophila gene suggests that this human gene may be part of a signal transduction pathway involved in growth control. BRD2 is involved in cancer and forms of obesity.
  • MHC major histocompatibility complex
  • BRD2 and / or BRD4 inhibitors are still effective even in a particularly low concentration in the nanomolar range, whereas no effect whatsoever is observed with active substances such as chloroquine.
  • active substances such as chloroquine.
  • the inventors were able to demonstrate this for two low molecular weight compounds in a cell culture experiment.
  • the inhibitor is a low molecular weight compound.
  • a class of substances with low molecular weight is referred to as a low molecular compound (English small molecule). They form the opposite group to larger, high molecular substances, for example long-chain polymers. It comprises active ingredients whose molecular mass does not exceed about 800 g-mol -1 Due to their small size, low-molecular compounds are partially able to penetrate cells and develop their effects there.
  • the inhibitor is GSK2820151 (IBET151).
  • the inhibitor is R06870810 / TEN-010 (CPI203).
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, which has the inhibitor according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. They include, for example, binders, disintegrants, fillers, lubricants as well as buffers, salts and other substances suitable for the formulation of medicaments; see Rowe et al. (2012), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7 th Edition Pharmaceutical Press; or Bauer et al. (2017), Textbook of Pharmaceutical Technology, 10th edition, Academicliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. The content of the present publications is part of the present application by reference.
  • the inhibitor is present per dosage unit in a concentration which, after administration into a living being, leads to a concentration which counteracts the coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
  • the inhibitor is present per dosage unit in a concentration which, after administration into a living being, leads to a concentration in the coronavirus-infected cells, preferably the lung epithelial cells, which is approximately ⁇ 10 mM, preferably approximately ⁇ 1 pM, more preferably approximately ⁇ 500 nM, more preferably approximately ⁇ 400 nM, more preferably approximately ⁇ 300 nM.
  • the inventors' knowledge is taken into account in an advantageous manner that the BRD inhibitor shows prophylactic or therapeutic effect in the case of a coronavirus infection even in very low concentrations. Side effects can thereby be reduced or even avoided if necessary. This measure also contributes to the cost-effective production of the pharmaceutical composition.
  • composition according to the invention has, in addition to the inhibitor according to the invention, a further active ingredient, preferably a further antiviral active ingredient.
  • inhibitor according to the invention can be present as the sole active ingredient, this measure has the advantage that additive and possibly synergistic effects can lead to an increase in the prophylactic and therapeutic success.
  • Another object of the present invention relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, characterized by the administration of the inhibitor according to the invention and / or the pharmaceutical composition according to the invention to a Living being, preferably a human.
  • Fig. 1 Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 mM and 1 pM of the BRD2 / 4 inhibitor BET151.
  • Fig. 2 Brightfield microscopy images of Calu3 cells that have remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM and 1 pM of the BRD2 / 4 inhibitor CPI203.
  • Fig. 3 Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM and 1 pM of the CDK inhibitor RCB were treated.
  • 4 Brightfield microscopic images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 mM and 1 pM of the CDK inhibitor ACB were treated.
  • Fig. 5 Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM and 1 pM hydroxychloroquine (HChl) were treated.
  • Fig. 6 Brightfield microscopy images of Calu3 cells that have remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (inf) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM, 5 pM and 2, 5 pM of I BET 151, CPI203 and HChl were treated.
  • FIG. 8 Effects of BRD2 / 4 inhibitors on SARS-CoV-2 infection.
  • Calu3 cells were infected with SARS-CoV-2 and treated with IBET151, CPI203 or hydroxychloroquin (HChl). 24 hpi (hours after infection) the cells were fixed with 80% acetone and stained with DAPI and immunofluorescence against SARS-CoV-2. The number of cells was analyzed with a Cytation3 multiplication imager.
  • FIG. 10 Diagram illustrating the effect of BRD2 / 4 inhibitors on the total number or the survival of Calu3 cells after a SARS-CoV-2 infection.
  • Lung epithelial cells Calu3 show a flat structure in the cell culture under the microscope. After infection of the cells with SARS-CoV-2 (recordings titled "SARS-CoV-2" or “inf '), a clear cytopathic effect becomes apparent, which is visible in the morphological change in the cell formations in the form of" clumps ", see e.g. Fig. 1-5, second column.
  • the BRD2 / 4 inhibitors IBET151 and CPI203 show at concentrations of 10 and 1 mM a significant reduction in the cytopathic effect caused by the virus infection (compared to mock / uninfected and SARS-CoV-2 infected); see Figures 1 and 2, 3rd and 4th columns. In contrast, show equal concentrations of Hyrdoxychloroquine
  • DMEM + 5% FCS (infection medium) per well 170 ⁇ l DMEM + 5% FCS (infection medium) per well. Creation of inhibitor dilutions so that the desired final concentration is achieved after adding 20 ⁇ l of the dilution. Then add 10 - 5 ml of virus stock (1:20, MOLO, 4 - 1:40, MOLO.2) to the total volume of 200 ml. Incubation for an additional 24-48 h. After 24 and 48 h, recording of transmitted light images via automatic microscopy (4x magnification) using a multiplate reader. Evaluation of the cytopathic effect of the virus infection by visual assessment of the cell lawn.
  • the BRD2 / 4 inhibitors IBET151 and CPI203 show at concentrations of 10 and 1 mM a significant reduction in the cytopathic effect caused by the virus infection (compared to mock / uninfected and SARS-CoV-2 infected); see Figures 1 and 2, 3rd and 4th columns.
  • the same concentrations of hydroxychloroquine (HChl, FIG. 5) and the clinically approved CDK inhibitors ribociclib (RCB; FIG. 3) and abemaciclib (ACB; FIG. 4) show no inhibitory effects. 15th
  • MOI 2
  • the inventors could not find any reduction in infected cells or in the total amount of viral protein, although the virus-induced cytopathic effects were completely blocked.
  • the infection rate was reduced (FIG. 8B). This suggests that BRD proteins do not affect virus entry and infection or production of virus proteins, but could affect the late steps of virus replication. This assumption is consistent with a possible role for the E protein in the assembly and release of coronaviruses.
  • a SARS-CoV-2 infection appears to induce an apoptotic signal cascade, which is evident from the induction of caspase 6/7 cleavage and AKT phosphorylation. All of these events are specifically addressed by BRD2 / 4-ln- 16 inhibitor inhibitors are blocked, which may explain the lack of SARS-CoV-2-induced cell death in the treatment with the compounds (FIG. 9).
  • FIG. 10 the effect of the BRD2 / 4 inhibitors on the total number or the survival of the Calu3 cells after a SARS-CoV-2 infection is illustrated again in summary.
  • Calu-3 cells were infected or mock-infected with the clinical SARS-CoV-2 isolate.
  • the cells were treated with the two BRD2 / 4 inhibitors IBET151 and CPI203 and hydroxychloroquine (HCQN) as the reference active ingredient in the given concentrations.
  • HQN hydroxychloroquine
  • the average number of mock and infected cells is indicated with a dotted line. It turns out that in the experiments carried out, positive effects on the total number or survival of the Calu3 cells occur after a SARS-CoV-2 infection from a concentration of the BRD2 / 4 inhibitors of approx. 20 nM. This is not observed in HQCN-treated cells. This observation was confirmed by the inventors in further experiments (not shown).
  • BBD bromodomain-containing protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

The invention relates to bromodomain inhibitors for the prophylactic and therapeutic treatment of a coronavirus infection and/or a disease caused by this infection, a pharmaceutical composition containing said agent, and a method for the prophylactic and/or therapeutic treatment of a coronavirus infection and/or a disease caused by this infection.

Description

BROMODOMAIN-INHIBITOREN ZUR PROPHYLAXE UND/ODER BEHANDLUNG VON CORONAVIRUS-INFEKTIONEN UN D DADURCH VERURSACHTEN ERKRANKUNGEN BROMODOMAIN INHIBITORS FOR THE PROPHYLAXIS AND / OR TREATMENT OF CORONAVIRUS INFECTIONS AND DISEASES CAUSED BY
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Wirkstoff zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung einer Coronavirus- Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, eine diesen Wrkstoff enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung. The present invention relates to a new active ingredient for the prophylactic and therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, a pharmaceutical composition containing this active ingredient and a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or any illness caused by this infection.
GEBIET DER ERFINDUNG FIELD OF THE INVENTION
[0002] Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der molekularen Medizin, insbesondere den Bereich der antiviralen Substanzen. The present invention relates to the field of molecular medicine, in particular the field of antiviral substances.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG BACKGROUND OF THE INVENTION
[0003] Die Coronaviridae, umgangssprachlich auch Coronaviren genannt, sind eine Virusfamilie innerhalb der Ordnung Nidovirales. Ihre Vertreter verursachen bei verschiedenen Wrbel- tieren wie Säugetieren, Vögeln und Fischen sehr unterschiedliche Erkrankungen. Die ersten Coronaviren wurden bereits Mitte der 1960er Jahre beschrieben. Coronaviren sind genetisch hochvariabel. Einzelne Arten aus der Familie der Coronaviridae können durch Überwindung der Artenbarriere auch mehrere Arten von Wirten infizieren. Durch die Über windung der Artenbarriere sind beim Menschen unter anderem Infektionen mit dem SARS-assoziierten Coronavirus (SARS-CoV, gelegentlich auch als SARS-CoV-1 bezeich net) - dem Erreger der SARS-Pandemie 2002/2003 - sowie mit dem 2012 neu aufgetre tenen Middle East respiratory syndrome Coronavirus (MERS-CoV) entstanden. The Coronaviridae, colloquially also called coronaviruses, are a virus family within the order Nidovirales. Their representatives cause very different diseases in different vertebrates such as mammals, birds and fish. The first coronaviruses were described as early as the mid-1960s. Coronaviruses are genetically highly variable. Individual species from the Coronaviridae family can also infect several species of hosts by overcoming the species barrier. By overcoming the species barrier, infections with the SARS-associated coronavirus (SARS-CoV, sometimes also referred to as SARS-CoV-1) - the causative agent of the SARS pandemic 2002/2003 - as well as the 2012 new one are among other things Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV).
[0004] Die von der chinesischen Stadt Wuhan ausgegangene COVID-19-Pandemie wird auf ein bis dahin unbekanntes Coronavirus zurückgeführt, das den Namen SARS-CoV-2 erhielt. Das Virus verursacht die Viruserkrankung COVID-19 (für corona virus disease 2019) und war Auslöser der COVID-19-Pandemie, die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) am 30. Januar 2020 als "gesundheitliche Notlage von internationaler Tragweite" und am 11. März 2020 als Pandemie eingestuft wurde. Die Krankheitsverläufe sind unspezifisch, vielfältig und variieren stark. Neben symptomlosen Infektionen wurden überwiegend milde bis moderate Verläufe beobachtet, jedoch auch schwere mit beidseitigen Lungenentzün dungen bis hin zu Lungenversagen und Tod. The COVID-19 pandemic emanating from the Chinese city of Wuhan is attributed to a previously unknown coronavirus that was given the name SARS-CoV-2. The virus causes the viral disease COVID-19 (for corona virus disease 2019) and was the trigger of the COVID-19 pandemic, which the World Health Organization (WHO) identified on January 30, 2020 as a "health emergency of international concern" and on March 11 2020 was classified as a pandemic. The course of the disease is unspecific, diverse and varies greatly. In addition to asymptomatic infections, predominantly mild to moderate courses were observed, but also severe ones with bilateral pneumonia up to lung failure and death.
[0005] Derzeit steht keine spezifische Behandlung von COVID-19 zur Verfügung, allenfalls können Symptome gelindert werden. Diskutiert werden einige bereits existierende Virosta tika, die zum Beispiel gegen MERS-CoV und HIV eingesetzt werden. Dazu gehören Proteasehemmer wie Indinavir, Saquinavir, Lopinavir/Ritonavir und Interferon-beta sowie der RNA-Polymerasehemmer Remdesivir. [0005] There is currently no specific treatment for COVID-19 available, at best symptoms can be alleviated. Some existing antivirals that are used against MERS-CoV and HIV, for example, will be discussed. These include protease inhibitors such as indinavir, saquinavir, lopinavir / ritonavir and interferon-beta as well as the RNA polymerase inhibitor remdesivir.
[0006] Mit Stand 15. Februar 2020 befanden sich in China Remdesivir, Favipiravir und Chloroquin, ein Wirkstoff gegen Malaria, in der Erprobung am Menschen. Am 20. März 2020 startete die WHO die Studie SOLIDARITY, in deren Rahmen Remdesivir, Chloro quin beziehungsweise Hydroxychloroquin, Lopinavir/Ritonavir sowie Lopinavir/Ritonavir mit Interferon-beta an tausenden Patienten weltweit evaluiert werden sollen. As of February 15, 2020, remdesivir, favipiravir and chloroquine, an active ingredient against malaria, were being tested on humans in China. On March 20, 2020, the WHO started the SOLIDARITY study, within the framework of which remdesivir, chloroquine or hydroxychloroquine, lopinavir / ritonavir and lopinavir / ritonavir with interferon-beta are to be evaluated in thousands of patients worldwide.
[0007] Die bislang gewonnenen Daten konnten keine überzeugende Wrksamkeit der getesteten Verbindungen belegen. Aus diesem Grunde wird intensiv nach neuen Wrkstoffen gegen eine Coronavirus-Infektion, insbesondere eine solche mit SARS-CoV-2 (COVID-19) gesucht; siehe auch Gordon et al. (2020), A SARS-CoV-2-Human Protein-Protein Interac tion Map Reveals Drug Targets and Potential Drug-Repurposing; bioRxiv, preprint doi.org/10.1101/2020.03.22.002386. Vielversprechende Kandidaten wurden bislang nicht gefunden. The data obtained so far could not prove any convincing effectiveness of the tested compounds. For this reason, we are intensively looking for new active ingredients against a coronavirus infection, especially one with SARS-CoV-2 (COVID-19) sought; see also Gordon et al. (2020), A SARS-CoV-2-Human Protein-Protein Interac tion Map Reveals Drug Targets and Potential Drug-Repurposing; bioRxiv, preprint doi.org/10.1101/2020.03.22.002386. Promising candidates have not yet been found.
[0008] Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Wirkstoff bereit zu stellen, der die Nachteile aus dem Stand der Technik reduziert, vorzugsweise vermei det, Insbesondere soll ein Wirkstoff bereitgestellt werden, der vorzugsweise auch in nied rigen Konzentrationen einer Infektion mit Coronaviren entgegen wirken kann und somit zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavi rus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung geeignet ist. Against this background, the invention is based on the object of providing an active ingredient which reduces the disadvantages of the prior art, preferably avoids. In particular, an active ingredient is to be provided that preferably also in low concentrations of infection with Coronaviruses can counteract and thus is suitable for the production of a medicament for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
[0009] Die vorliegende Erfindung befriedigt diese und andere Bedürfnisse. The present invention addresses these and other needs.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG SUMMARY OF THE INVENTION
[0010] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Inhibitors des Bromodomain-enthalten- den Proteins (BRD) zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung gelöst. This object is achieved by providing an inhibitor of the bromodomain-containing protein (BRD) for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
[0011] Erfindungsgemäß umfassen "Coronaviren" sämtliche Spezies, die der Virusfamilie Coro- naviridae angehören, insbesondere SARS-CoV-2 (Sars-CoV-2, severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2, "Schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2“). According to the invention, “coronaviruses” include all species that belong to the virus family Coronavirusidae, in particular SARS-CoV-2 (Sars-CoV-2, severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2, “Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2”).
[0012] Erfindungsgemäß wird unter "Behandlung" einer Infektion bzw. Erkrankung insbesondere eine therapeutische Intervention mit der Zielsetzung einer positiven Beeinflussung des Gesamtgesundheitszustandes des behandelten Lebewesens, der durch die Infektion und/oder Erkrankung bestimmt ist, verstanden. In Ausführungsformen der Erfindung um fasst die Behandlung die Linderung und/oder Aufhebung von Krankheitssymptomen, die Reduzierung der Viruslast, die Eliminierung des Virus und/oder die Heilung der Erkran kung. [0013] Erfindungsgemäß wird unter "Prophylaxe" einer Infektion bzw. Erkrankung insbesondere eine Maßnahme verstanden, die dazu dient, einer Beeinträchtigung des Gesamtgesund heitszustandes des behandelten Lebewesens, der durch die Infektion und/oder Erkran kung bestimmt ist, entgegen zu wirken. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Prophylaxe die Verhinderung einer Erkrankung. According to the invention, “treatment” of an infection or disease is understood to mean, in particular, a therapeutic intervention with the aim of positively influencing the overall health of the living being treated, which is determined by the infection and / or disease. In embodiments of the invention, the treatment comprises alleviating and / or relieving symptoms of the disease, reducing the viral load, eliminating the virus and / or curing the disease. According to the invention, "prophylaxis" of an infection or disease is understood in particular as a measure which serves to counteract an impairment of the overall health of the living being treated, which is determined by the infection and / or disease. In embodiments of the invention, prophylaxis includes preventing a disease.
[0014] "Bromodomain" oder Bromodomäne ist eine Proteindomäne mit ungefähr 110 Aminosäuren, die acetylierte Lysinreste erkennt, wie jene an den N-terminalen Schwän zen von Histonen. Bromodomänen sind als "Leser" der Lysinacetylierung dafür verant wortlich, das von acetylierten Lysinresten übertragene Signal zu transduzieren und in verschiedene normale oder abnormale Phänotypen umzuwandeln. "Bromodomain-enthal- tende Proteine" (BRD) können eine Vielzahl von biologische Funktionen ausüben, die von Histon-Acetyltransferase-Aktivität und Chromatin-Remodelling bis hin zu Transkriptions vermittlung und Co-Aktivierung reichen. Von den 43 im Jahr 2015 bekannten BRD wiesen 11 zwei Bromodomänen und ein Protein 6 Bromodomänen auf. Die sogenannte BET-Fa- milie (Bromodomäne und extraterminale Domäne), eine Untergruppe der Bromodomain- Familie, beinhaltet bspw. die Mitglieder BRD2, BRD3, BRD4 und BRDT. Herstellung, biochemische Analyse und Strukturbestimmung der Bromodomänen-enthaltenden Proteine wurden ausführlich beschrieben Ren et al. (2016), Preparation, Biochemical Analysis, and Structure Determination of the Bromodomain, an Acetyl-Lysine Binding Domain, Methods in Enzymology 573: 321-43. Erfindungsgemäß sind sämtliche Bromo- domain-enthaltenden Proteine erfasst. "Bromodomain" or bromodomain is a protein domain of approximately 110 amino acids that recognizes acetylated lysine residues, such as those on the N-terminal tails of histones. As "readers" of lysine acetylation, bromodomains are responsible for transducing the signal transmitted by acetylated lysine residues and converting it into various normal or abnormal phenotypes. "Bromodomain-containing proteins" (BRD) can exert a multitude of biological functions, ranging from histone acetyltransferase activity and chromatin remodeling to transcription mediation and co-activation. Of the 43 BRD known in 2015, 11 had two bromodomains and one protein had 6 bromodomains. The so-called BET family (bromodomain and extra-terminal domain), a subgroup of the bromodomain family, includes, for example, the members BRD2, BRD3, BRD4 and BRDT. Production, biochemical analysis and structure determination of the bromodomain-containing proteins have been described in detail. Ren et al. (2016), Preparation, Biochemical Analysis, and Structure Determination of the Bromodomain, an Acetyl-Lysine Binding Domain, Methods in Enzymology 573: 321-43. According to the invention, all bromomain-containing proteins are included.
[0015] Erfindungsgemäß wird unter einem "Inhibitor" des BRD, der synonym auch als BRD- Inhibitor bezeichnet wird, ein Agens verstanden, das zu einer selektiven und spezifischen Hemmung von BRD führt. BRD-Inhibitoren sind bspw. beschrieben in Bechter und Schöff- ski (2020), Make your best BET the emerging role of BET inhibitor treatment in malignant tumors, Pharmacology & Therapeutics 208:107479, dort unter der synonymen Bezeich nung BET-Inhibitoren jedoch ausschließlich hinsichtlich ihrer Anti-Tumor-Aktivität. According to the invention, an "inhibitor" of the FRG, which is also referred to synonymously as a FRG inhibitor, is understood to mean an agent which leads to a selective and specific inhibition of the FRG. BRD inhibitors are described, for example, in Bechter and Schöffski (2020), Make your best BET the emerging role of BET inhibitor treatment in malignant tumors, Pharmacology & Therapeutics 208: 107479, but exclusively there under the synonymous name BET inhibitors for their anti-tumor activity.
[0016] Erfindungsgemäß kann die Hemmung durch Verminderung der Aktivität, Funktionalität, Expression oder anderen Phänomenen erfolgen, die zu einer Inhibierung von BRD führen. Das Agens kann sich in jeder denkbaren stofflichen Form darstellen, wie eines kleinen Moleküls, eines Peptids, eines Antikörpers, eines Nucleinsäuremoleküls, etc. According to the invention, the inhibition can take place by reducing the activity, functionality, expression or other phenomena which lead to an inhibition of BRD. The agent can be in any conceivable material form, such as a small molecule, a peptide, an antibody, a nucleic acid molecule, etc.
[0017] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. The object on which the invention is based is hereby completely achieved.
[0018] Die Erfinder konnten anhand von zwei Modellverbindungen überraschenderweise experi mentell zeigen, dass BRD-Inhibitoren nicht nur den durch das Virus verursachten zytopa- thischen Effekt verhindern sondern auch die Viruslast und die Anzahl von virusinfizierten Zellen verringern. Diese Effekte zeigen sich bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen, die in Nanomolarbereich liegen. Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird deshalb der BRD-Inhibitor in einer Konzentration eingesetzt, die auf zellulärer Ebene (bspw. in menschlichen Zellen des Lungenepithels) im Bereich von < 1mM, vorzugsweise < 0,5 mM, weiter vorzugsweise < 0,4 pM, weiter vorzugsweise 0,3 pM, weiter vorzugsweise 0,2 pM, liegt. Using two model compounds, the inventors were able to surprisingly show experimentally that BRD inhibitors not only prevent the cytopathic effect caused by the virus but also reduce the viral load and the number of virus-infected cells. These effects are already evident at very low concentrations, which are in the nanomolar range. According to one embodiment of the invention, the BRD inhibitor is therefore used in a concentration which at the cellular level (for example in human cells of the lung epithelium) in the range of <1 mM, preferably <0.5 mM, more preferably <0.4 pM, more preferably 0.3 pM, more preferably 0.2 pM.
[0019] Nach einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Infektion und Erkran kung um eine Infektion mit einem SARS-assoziierten Coronavirus (SARS-CoV) und um eine durch diese Infektion verursachte Erkrankung, vorzugsweise um eine SARS-CoV-2- Infektion und/oder um COVID-19. According to one embodiment of the invention, the infection and disease is an infection with a SARS-associated coronavirus (SARS-CoV) and a disease caused by this infection, preferably a SARS-CoV-2 infection and / or about COVID-19.
[0020] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise eine Wirksubstanz bereitgestellt, die nach Erkenntnissen der Erfinder den derzeit im Test befindlichen und auch bereits z.T. klinisch getesteten Substanzen überlegen ist. Damit wird dem derzeit dringenden Bedarf an Wirkstoffen zur Bekämpfung von COVID-19 auf vorteilhafte Art und Weise begegnet. With this measure, an active substance is provided in an advantageous manner, which, according to the inventors' findings, is superior to the substances currently being tested and some of which have already been clinically tested. This is an advantageous way of meeting the urgent need for active ingredients to combat COVID-19.
[0021] Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um einen Inhibitor des Bromodomain-enthaltenden Proteins 2 (BRD2). According to a further embodiment of the invention, the inhibitor is an inhibitor of the bromodomain-containing protein 2 (BRD2).
[0022] In einer noch weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Inhibitor um einen Inhibi tor des Bromodomain-enthaltenden Proteins 4 (BRD4). [0023] Diese Maßnahmen haben den Vorteil, dass Zielstrukturen gehemmt werden, die nach Erkenntnissen der Erfinder für die Interaktion des Virus mit dem infizierten Wirt und damit für die Pathogenität von besonderer Wchtigkeit sind. Damit mit auf vorteilhafte Art und Weise ein besonders wirksamer Inhibitor bereitgestellt. Dabei kann es sich erfindungsge mäß bei einem BRD2-lnhibitor und einem BRD4-lnhibitor um zwei Substanzen handeln. Alternativ kann es sich auch um eine Substanz handelt, die beide Zielstrukturen hemmt und bspw. als BRD2/4-lnhibitor bezeichnet wird. In yet another embodiment, the inhibitor is an inhibitor of the bromodomain-containing protein 4 (BRD4). These measures have the advantage that target structures are inhibited which, according to the inventors' findings, are of particular importance for the interaction of the virus with the infected host and thus for the pathogenicity. A particularly effective inhibitor is thus provided in an advantageous manner. According to the invention, a BRD2 inhibitor and a BRD4 inhibitor can be two substances. Alternatively, it can also be a substance that inhibits both target structures and is referred to, for example, as a BRD2 / 4 inhibitor.
[0024] Das "BRD4"-Protein wird beim Menschen von dem BRD4- Gen codiert. Es weist zwei Bomodomänen auf, die als BD1 und BD2 bezeichnet werden. Es ist homolog zum Mausprotein MCAP, das während der Mitose mit Chromosomen assoziiert, und homolog zum humanen BRD2 (RING3) -Protein, einer Serin/Threonin-Kinase. Jedes dieser Protei ne enthält zwei Bromodomänen, ein konserviertes Sequenzmotiv, das am Chromatin-Tar- geting beteiligt sein kann. BRD4 wird häufig für die Expression von Myc und anderen "Tumor-treibenden" Onkogenen bei hämatologischen Krebsarten benötigt, einschließlich dem multiplem Myelom, akuter myeloischer Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie. The "BRD4" protein is encoded by the BRD4 gene in humans. It has two bomodomains called BD1 and BD2. It is homologous to the mouse protein MCAP, which associates with chromosomes during mitosis, and homologous to the human BRD2 (RING3) protein, a serine / threonine kinase. Each of these proteins contains two bromodomains, a conserved sequence motif that can be involved in chromatin targeting. BRD4 is often required for the expression of Myc and other "tumor-driving" oncogenes in hematologic cancers, including multiple myeloma, acute myeloid leukemia, and acute lymphoblastic leukemia.
[0025] Das "BRD2"-Protein wird beim Menschen von dem BRD2- Gen codiert. Frühe Beschreibungen zeigten, dass das BRD2-Genprodukt eine mitogenaktivierte Kinase ist, die sich im Kern befindet. Das Gen ist auf die Klasse-Il-Region des Haupthistokompatibili- tätskomplexes (MHC) auf Chromosom 6p21.3 abgebildet, aber ein Sequenzvergleich legt nahe, dass das Protein nicht an der Immunantwort beteiligt ist. Die Homologie zum weiblichen sterilen Homöotikum des Drosophila-Gens legt nahe, dass dieses menschliche Gen Teil eines Signaltransduktionsweges sein könnte, der an der Wachstumskontrolle beteiligt ist. BRD2 ist in die Krebsentstehung und in Formen der Fettleibigkeit involviert. The "BRD2" protein is encoded by the BRD2 gene in humans. Early descriptions indicated that the BRD2 gene product is a mitogen-activated kinase that resides in the nucleus. The gene is mapped to the class II region of the major histocompatibility complex (MHC) on chromosome 6p21.3, but sequence comparison suggests that the protein is not involved in the immune response. The homology to the female sterile homeotic of the Drosophila gene suggests that this human gene may be part of a signal transduction pathway involved in growth control. BRD2 is involved in cancer and forms of obesity.
[0026] Als besonders vorteilhaft bei der Erfindung hat sich herausgestellt, dass BRD2- und/oder BRD4-lnhibitoren selbst in einer besonders niedrigen Konzentration im Nanomolarbereich noch Wirksamkeit zeigen, wohingegen bei Wrksoffen wie Chloroquin keinerlei Effekt beobachtet werden. Dies konnten die Erfinder beispielhaft für zwei niedermolekulare Verbindungen in einem Zellkulturexperiment nachweisen. [0027] Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um eine niedermolekulare Verbindung. It has been found to be particularly advantageous in the invention that BRD2 and / or BRD4 inhibitors are still effective even in a particularly low concentration in the nanomolar range, whereas no effect whatsoever is observed with active substances such as chloroquine. The inventors were able to demonstrate this for two low molecular weight compounds in a cell culture experiment. According to a further embodiment of the invention, the inhibitor is a low molecular weight compound.
[0028] Als niedermolekulare Verbindung (englisch small molecule, dt. "kleines Molekül“) wird erfindungsgemäß eine Klasse von Stoffen mit niedriger Molekülmasse bezeichnet. Sie bilden die Gegengruppe zu größeren, hochmolekularen Stoffen, z. B. langkettigen Poly meren. Sie umfasst Wirkstoffe, deren Molekülmasse etwa 800 g-mol-1 nicht übersteigt. Durch ihre geringe Größe sind niedermolekulare Verbindungen teilweise in der Lage, in Zellen einzudringen und dort ihre Wrkung zu entfalten. According to the invention, a class of substances with low molecular weight is referred to as a low molecular compound (English small molecule). They form the opposite group to larger, high molecular substances, for example long-chain polymers. It comprises active ingredients whose molecular mass does not exceed about 800 g-mol -1 Due to their small size, low-molecular compounds are partially able to penetrate cells and develop their effects there.
[0029] Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um GSK2820151 (IBET151). According to a further embodiment of the invention, the inhibitor is GSK2820151 (IBET151).
[0030] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein nach Erkenntnissen der Erfinder besonders wirksamer Inhibitor bereitgestellt wird. Dieser befindet ich bereits in klinischer Erprobung als Anti-Tumormittel (Trail# NCT02630251) und steht deshalb rasch zur Verfügung. Er wird derzeit von dem Unternehmen GlaxoSmithKline hergestellt. Er ist beschrieben in Gadgeel et al. (2017), Abstract CT104: A first-in-human phase I dose escalation study of BET inhibitor GSK2820151 in patients with advanced or recurrent solid tumors cancers, Cancer Research 77, CT104, sowie in Bechter und Schöffski (a.a.O.). This measure has the advantage that an inhibitor that is particularly effective according to the inventors' knowledge is provided. This is already in clinical trials as an anti-tumor agent (Trail # NCT02630251) and is therefore available quickly. It is currently manufactured by GlaxoSmithKline. It is described in Gadgeel et al. (2017), Abstract CT104: A first-in-human phase I dose escalation study of BET inhibitor GSK2820151 in patients with advanced or recurrent solid tumors cancers, Cancer Research 77, CT104, and in Bechter and Schöffski (loc. Cit.).
[0031] Nach einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Inhibitor um R06870810/TEN-010 (CPI203). According to yet another embodiment of the invention, the inhibitor is R06870810 / TEN-010 (CPI203).
[0032] Auch diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein nach Erkenntnissen der Erfinder besonders wirksamer Inhibitor bereitgestellt wird. Dieser befindet ich bereits in klinischer Erprobung als Anti-Tumormittel (Trail# NCT01987362) und steht deshalb rasch zur Verfügung. Er wird derzeit von dem Unternehmen Hoffmann-La Roche hergestellt. Er ist beschrieben in Shapiro et al. (2015), Abstract A49: Clinically efficacy of the BET bromod- omain inhibitor TEN-010 in an open-label substudy with patients with documented NUT- midline carcinoma (NMC), Molecular Cancer Therapeutics 14 (12 Supplement 2), A49, sowie in Bechter und Schöffski (a.a.O.). [0033] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zu sammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, die den erfindungsgemä ßen Inhibitor sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist. This measure also has the advantage that, according to the inventors' knowledge, a particularly effective inhibitor is provided. This is already in clinical trials as an anti-tumor agent (Trail # NCT01987362) and is therefore available quickly. It is currently being manufactured by the Hoffmann-La Roche company. It is described in Shapiro et al. (2015), Abstract A49: Clinically efficacy of the BET bromodomain inhibitor TEN-010 in an open-label substudy with patients with documented NUT-midline carcinoma (NMC), Molecular Cancer Therapeutics 14 (12 Supplement 2), A49, and in Bechter and Schöffski (loc. cit.). Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, which has the inhibitor according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0034] Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung gleicher maßen. The features, properties, advantages and embodiments of the inhibitor according to the invention apply equally to the pharmaceutical composition according to the invention.
[0035] Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Sie umfassen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel sowie Puffer, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe et al. (2012), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th Edition Pharmaceutical Press; oder Bauer et al. (2017), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 10. Auflage, Wissen schaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. Der Inhalt der vorliegenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. They include, for example, binders, disintegrants, fillers, lubricants as well as buffers, salts and other substances suitable for the formulation of medicaments; see Rowe et al. (2012), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7 th Edition Pharmaceutical Press; or Bauer et al. (2017), Textbook of Pharmaceutical Technology, 10th edition, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. The content of the present publications is part of the present application by reference.
[0036] Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung der pharmazeutischen Zusammensetzung liegt der Inhibitor pro Dosiereinheit in einer Konzentration vor, die nach Verabreichung in ein Lebewesen zu einer Konzentration führt, die der Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung entgegenwirkt. According to an embodiment of the pharmaceutical composition according to the invention, the inhibitor is present per dosage unit in a concentration which, after administration into a living being, leads to a concentration which counteracts the coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
[0037] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die pharmazeutische Zusammensetzung dasThis measure has the advantage that the pharmaceutical composition
Optimum an Wrkstoffmenge enthält, die zur Erreichung eines therapeutischen und/oder prophylaktischen Effekts notwendig ist. Zur genauen Einstellung dieser Konzentration stehen dem Fachmann eine Vielzahl von Testsystemen zur Verfügung, über die sich, in Abhängigkeit des zu behandelnden Lebewesens, insbesondere des Alters, Gewichts, etwaiger Vorerkrankungen, individuell die gesuchte Konzentration ermitteln lässt. Contains the optimum amount of active ingredients that is necessary to achieve a therapeutic and / or prophylactic effect. To set this concentration precisely, the person skilled in the art has a large number of test systems at his disposal, which can be used to individually determine the desired concentration depending on the living being to be treated, in particular age, weight, and any previous illnesses.
[0038] Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung der pharmazeutischen Zusammensetzung liegt der Inhibitor pro Dosiereinheit in einer Konzentration vor, die nach Verabreichung in ein Lebewesen zu einer Konzentration in den Coronavirus-infizierten Zellen, vorzugsweise den Lungenepithelzellen führt, die bei ca. < 10 mM, vorzugsweise bei ca. < 1 pM, weiter vorzugsweise bei ca. < 500 nM, weiter vorzugsweise bei ca. < 400 nM, weiter vorzugswei se bei ca. < 300 nM liegt. According to an embodiment of the pharmaceutical composition according to the invention, the inhibitor is present per dosage unit in a concentration which, after administration into a living being, leads to a concentration in the coronavirus-infected cells, preferably the lung epithelial cells, which is approximately <10 mM, preferably approximately <1 pM, more preferably approximately <500 nM, more preferably approximately <400 nM, more preferably approximately <300 nM.
[0039] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise der Erkenntnis der Erfinder Rechnung getragen, dass der BRD-Inhibitor bereits in sehr niedrigen Konzentrationen prophylaktische bzw. therapeutische Wirkung bei einer Coronavirus-Infektion zeigt. Ne benwirkungen lassen sich dadurch reduzieren, ggf. sogar vermeiden. Auch trägt diese Maßnahme zur kostengünstigen Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung bei. With this measure, the inventors' knowledge is taken into account in an advantageous manner that the BRD inhibitor shows prophylactic or therapeutic effect in the case of a coronavirus infection even in very low concentrations. Side effects can thereby be reduced or even avoided if necessary. This measure also contributes to the cost-effective production of the pharmaceutical composition.
[0040] Nach einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusam mensetzung weist diese neben dem erfindungsgemäßen Inhibitor einen weiteren Wirk stoff, vorzugsweise einen weiteren antiviralen Wirkstoff auf. According to a further embodiment of the pharmaceutical composition according to the invention, it has, in addition to the inhibitor according to the invention, a further active ingredient, preferably a further antiviral active ingredient.
[0041] Obgleich der erfindungsgemäße Inhibitor als alleiniger Wirkstoff vorliegen kann, hat diese Maßnahme den Vorteil, dass additive und ggf. synergistische Effekte zu einer Verstärkung des prophylaktischen und therapeutischen Erfolgs führen können. Although the inhibitor according to the invention can be present as the sole active ingredient, this measure has the advantage that additive and possibly synergistic effects can lead to an increase in the prophylactic and therapeutic success.
[0042] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur prophylakti schen und/oder therapeutischen Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, gekennzeichnet durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen Inhibitors und/oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, vorzugsweise einen Menschen. Another object of the present invention relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, characterized by the administration of the inhibitor according to the invention and / or the pharmaceutical composition according to the invention to a Living being, preferably a human.
[0043] Die Merkmale, Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Inhibitors und der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen. The features, properties, advantages and embodiments of the inhibitor according to the invention and the pharmaceutical composition according to the invention apply equally to the method according to the invention.
[0044] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläutern den Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in ande- ren Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorlie genden Erfindung zu verlassen. It goes without saying that the features mentioned above and those still to be explained below not only in the respectively specified combination, but also in other Ren combinations or can be used alone without departing from the scope of the present invention.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE EXEMPLARY EMBODIMENTS
[0045] Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind dabei nicht einschränkend. The present invention will now be explained in more detail with reference to exemplary embodiments, from which further features, properties and advantages of the invention result. The exemplary embodiments are not restrictive.
[0046] Es versteht sich außerdem, dass einzelne Merkmale, die in den Ausführungsbeispielen offenbart sind, nicht nur im Kontext der jeweiligen spezifischen Ausführungsform sondern in einer Allgemeingültigkeit offenbart sind und für sich genommenen einen eigenen Beitrag zur Erfindung liefern. Der Fachmann kann deshalb diese Merkmale frei mit anderen Merkmalen der Erfindung kombinieren. It is also understood that individual features that are disclosed in the exemplary embodiments are disclosed not only in the context of the respective specific embodiment but in general validity and, taken by themselves, make their own contribution to the invention. The person skilled in the art can therefore freely combine these features with other features of the invention.
[0047] In den Ausführungsbeispielen wir Bezug auf die beiliegenden Figuren genommen. Dort ist Folgendes dargestellt: In the exemplary embodiments, reference is made to the accompanying figures. The following is shown there:
Fig. 1: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 mM und 1 pM des BRD2/4-lnhibitors BET151 behandelt wurden. Fig. 1: Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 mM and 1 pM of the BRD2 / 4 inhibitor BET151.
Fig. 2: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 pM und 1 pM des BRD2/4-lnhibitors CPI203 behandelt wurden. Fig. 2: Brightfield microscopy images of Calu3 cells that have remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM and 1 pM of the BRD2 / 4 inhibitor CPI203.
Fig. 3: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 pM und 1 pM des CDK-Inhibitors RCB behandelt wurden. Fig. 4: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 mM und 1 pM des CDK-Inhibitors ACB behandelt wurden. Fig. 3: Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM and 1 pM of the CDK inhibitor RCB were treated. 4: Brightfield microscopic images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 mM and 1 pM of the CDK inhibitor ACB were treated.
Fig. 5: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (SARS-CoV-2) und zusätzlich zur SARS-CoV- 2-lnfektion mit 10 pM und 1 pM Hydroxychloroquin (HChl) behandelt wurden. Fig. 5: Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM and 1 pM hydroxychloroquine (HChl) were treated.
Fig. 6: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (inf) und zusätzlich zur SARS-CoV-2-lnfektion mit 10 pM, 5 pM und 2,5 pM von I BET 151, CPI203 und HChl behandelt wurden. Fig. 6: Brightfield microscopy images of Calu3 cells that have remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (inf) and in addition to the SARS-CoV-2 infection with 10 pM, 5 pM and 2, 5 pM of I BET 151, CPI203 and HChl were treated.
Fig. 7: Hellfeld-Mikroskopieaufnahmen von Calu3-Zellen, die unbehandelt (mock) geblie ben sind, mit SARS-CoV-2 infiziert (inf) und zusätzlich zur SARS-CoV-2-lnfektion mit 1,25 pM, 0,612 pM und 0,306 pM von IBET151, CPI203 und HChl behandelt wurden. 7: Brightfield microscopy images of Calu3 cells that remained untreated (mock), infected with SARS-CoV-2 (inf) and, in addition to the SARS-CoV-2 infection, with 1.25 pM, 0.612 pM and 0.306 pM of IBET151, CPI203 and HChl were treated.
Fig. 8 Auswirkungen von BRD2/4-lnhibitoren auf die SARS-CoV-2-lnfektion. Calu3-Zellen wurden mit SARS-CoV-2 infiziert und mit IBET151, CPI203 oder Hydroxychloro quin (HChl) behandelt. 24 hpi (Stunden nach der Infektion) wurden die Zellen mit 80% Aceton fixiert und mit DAPI und Immunfluoreszenz gegen SARS-CoV-2 ge färbt. Die Anzahl der Zellen wurde mit einem Cytation3-Multiplikationsbildgeber analysiert. (A) Repräsentative Aufnahmen, (B) Quantifizierung der Gesamtzellzahl (DAPI +), infizierter Zellen (IF +) und der Infektionsrate (IF + / DAPI + -Zellen), (C) Westernblot-Analyse von Calu3-Zelllysaten unter Verwendung von Serum eines rekonvaleszenten COVID-19-Patienten zum Nachweis von SARS-CoV-2-Protei- nen. Figure 8 Effects of BRD2 / 4 inhibitors on SARS-CoV-2 infection. Calu3 cells were infected with SARS-CoV-2 and treated with IBET151, CPI203 or hydroxychloroquin (HChl). 24 hpi (hours after infection) the cells were fixed with 80% acetone and stained with DAPI and immunofluorescence against SARS-CoV-2. The number of cells was analyzed with a Cytation3 multiplication imager. (A) Representative recordings, (B) Quantification of the total cell number (DAPI +), infected cells (IF +) and the infection rate (IF + / DAPI + cells), (C) Western blot analysis of Calu3 cell lysates using serum of a convalescent COVID-19 patient for the detection of SARS-CoV-2 proteins.
Fig. 9 Interaktion der BRD2/4-lnhibitoren mit den zellulären SARS-CoV-2-Signalwegen. Calu3-Zellen wurden mit SARS-CoV-2 infiziert und mit 2,5 pM IBET151 und CPI203 behandelt. 24 hpi wurden die Zellen lysiert und die Pellets wurden Digi- West-Analysen unterzogen (n = 2, mock; n = 6, inf. ; n = 2, IBET151; n = 1, CPI203). 9 Interaction of the BRD2 / 4 inhibitors with the cellular SARS-CoV-2 signaling pathways. Calu3 cells were infected with SARS-CoV-2 and treated with 2.5 pM IBET151 and CPI203. The cells were lysed 24 hpi and the pellets were digi- Subjected to West analyzes (n = 2, mock; n = 6, inf.; N = 2, IBET151; n = 1, CPI203).
Fig.10: Schaubild, das die Wirkung von BRD2/4-lnhibitoren auf die Gesamtzahl bzw. das Überleben der Calu3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-lnfektion illustriert. FIG. 10: Diagram illustrating the effect of BRD2 / 4 inhibitors on the total number or the survival of Calu3 cells after a SARS-CoV-2 infection.
1. Material 1. Material
Testsubstanzen Test substances
BRD2/4-lnhibitor GSK2820151 (IBET151), GlaxoS ithKline BRD2 / 4 inhibitor GSK2820151 (IBET151), GlaxoS ithKline
BRD2/4-lnhibitor R06870810/TEN-010 (CPI203), Hoffmann-La Roche CDK-Inhibitor Ribociclib (RCB) BRD2 / 4 inhibitor R06870810 / TEN-010 (CPI203), Hoffmann-La Roche CDK inhibitor ribociclib (RCB)
CDK-Inhibitor Abemaciclib (ACB) CDK inhibitor abemaciclib (ACB)
Hydroxychloroquin (HChl, HCQN) Hydroxychloroquine (HChl, HCQN)
2. Methodik 2. Methodology
Etablierung eines SARS-CoV-2 Patientenisolat Establishment of a SARS-CoV-2 patient isolate
[0048] -200 mI Rachenabstrich eines SARS-CoV2 positiv getesteten Patienten wurde mit 1 ml-200 mI throat swab of a SARS-CoV2 positive tested patient with 1 ml
DM EM aufgefüllt, steril filtriert (0,22 mM) und auf Caco2 Zellen kultiviert. 2 Tage später Abnahme des Überstands, Zellernte und Lysat für Westernblot generiert. Detektion der SARS-CoV-2-Proteine im Westernblot über Serum eines COVID-19 Rekonvaleszenten. Bestätigung SARS-CoV-2 über qRT-PCR Anayse des Überstandes. [0049] Restlicher Überstand auf neue Caco2 Zellen über 2-5 Tage kultiviert. Kontinuierliche Ernte des Überstandes als Virusstock. Aliquotierung und Lagerung bei -80°C. DM EM filled in, sterile filtered (0.22 mM) and cultivated on Caco2 cells. 2 days later, a decrease in the supernatant, cell harvest and lysate generated for Western blot. Detection of SARS-CoV-2 proteins in a Western blot using serum from a COVID-19 convalescent. Confirmation of SARS-CoV-2 via qRT-PCR analysis of the supernatant. Remaining supernatant cultured on new Caco2 cells for 2-5 days. Continuous harvest of the supernatant as a virus stock. Aliquot and store at -80 ° C.
Testung von Substanzen auf antivirale Aktivität Testing of substances for antiviral activity
[0050] Calu3 (50.000 Zellen / Well) in 96-Well-Platte aussäen. 24h später Mediumwechsel zuSeed Calu3 (50,000 cells / well) in 96-well plate. 24h later medium change to
170 mI DMEM+5%FCS (Infektionsmedium) pro Well. Erstellen von Inhibitorverdünnungen so dass nach Zugabe von 20 mI Verdünnung die gewünschte Endkonzentration erreicht wird. Dann Zugabe von 10 - 5 mI Virusstock (1:20, MOI:0,4 - 1:40, MOI:0,2) zum Gesamtvolumen von 200 mI. Inkubation für weitere 24-48 h. Nach jeweils 24 und 48 h Aufnahme von Durchlichtbildern über automatische Mikroskopie (4-fache Vergrößerung) mittels Multiplate-Reader. Evaluierung des zytopathischen Effekts der Virusinfektion über visuelle Beurteilung des Zellrasens. 170 mI DMEM + 5% FCS (infection medium) per well. Creation of inhibitor dilutions so that the desired final concentration is achieved after adding 20 ml of the dilution. Then 10 - 5 ml of virus stock (1:20, MOI: 0.4 - 1:40, MOI: 0.2) are added to the total volume of 200 ml. Incubation for an additional 24-48 h. After 24 and 48 h, recording of transmitted light images via automatic microscopy (4x magnification) using a multiplate reader. Evaluation of the cytopathic effect of the virus infection by visual assessment of the cell lawn.
Datenreihe 1: Data series 1:
Calu3 50.000 Zellen/ Inf 9/4/20 Vertiefung Calu3 50,000 cells / Inf 9/4/20 well
Wir säten die Zellen in 170 mI, 1 Tag später Hinzugegeben von 10 pl der Virus- Stammlösung (Tü1) und 20 mI oder vorverdünnte Komponenten zu jeder Vertiefung We sowed the cells in 170 ml, 1 day later added 10 μl of the virus stock solution (Tü1) and 20 ml or prediluted components to each well
Nix IBET151 CPL203 HChl IBET151 CPL203 HChl Nix Nix IBET151 CPL203 HChl IBET151 CPL203 HChl Nix
PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Mock 10 10 10 10 10 10 Mock PBS PBS Mock 5 5 5 5 5 5 Mock PBS PBS Mock 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Mock PBS PBS inf 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 1 ,25 inf PBS PBS inf 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 inf PBS PBS inf 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 inf PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS beobachten der Zellen, bei 1 dpi oder potenziell 2 dpi ernte SN (in 96- Vertiefung-Platte). Von den Zellen Aufnahmen und Lysate präparieren für Zelltiter glo (oder MTT oder SRB) Speicher die SNs. PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Mock 10 10 10 10 10 10 Mock PBS PBS Mock 5 5 5 5 5 5 Mock PBS PBS Mock 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Mock PBS PBS inf 1, 25 1, 25 1, 25 1, 25 1, 25 1, 25 inf PBS PBS inf 0.625 0.625 0.625 0.625 0.625 0.625 inf PBS PBS inf 0.3125 0.3125 0.3125 0.3125 0, 3125 0.3125 inf PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Observe the cells, at 1 dpi or potentially 2 dpi harvest SN (in 96-well plate). From the cells recordings and lysates prepare the SNs for cell titers glo (or MTT or SRB) memory.
Tabelle 1: Datenreihe 1 Datenreihe 2: Table 1: Data series 1 Data series 2:
Calu3 50.000 Zellen/ Inf 9/4/20 Vertiefung Calu3 50,000 cells / Inf 9/4/20 well
Wir säten die Zellen in 170 mI, 1 Tag später Hinzugegeben von 10 pl der Virus- Stammlösung (Tü1) und 20 mI oder vorverdünnte Komponenten zu jeder Vertiefung We sowed the cells in 170 ml, 1 day later added 10 μl of the virus stock solution (Tü1) and 20 ml or prediluted components to each well
Nix IBET151 CPL203 HChl IBET151 CPL203 HChl Nix Nix IBET151 CPL203 HChl IBET151 CPL203 HChl Nix
PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Mock 10 10 10 10 10 10 Mock PBS PBS Mock 5 5 5 5 5 5 Mock PBS PBS Mock 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Mock PBS PBS inf 1 ,25 1,25 1,25 1 ,25 1 ,25 1,25 inf PBS PBS inf 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 0,625 inf PBS PBS inf 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 0,3125 inf PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS beobachten der Zellen, bei 1 dpi oder potenziell 2 dpi ernte SN (in 96-Vertiefung-Platte). Von den Zellen Aufnahmen und Lysate präparieren für Zelltiter glo (oder MTT oder SRB) Speicher die SNs. PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Mock 10 10 10 10 10 10 Mock PBS PBS Mock 5 5 5 5 5 5 Mock PBS PBS Mock 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Mock PBS PBS inf 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 inf PBS PBS inf 0.625 0.625 0.625 0.625 0.625 0.625 inf PBS PBS inf 0.3125 0.3125 0.3125 0.3125 0, 3125 0.3125 inf PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS Observe the cells, at 1 dpi or potentially 2 dpi, harvest SN (in 96-well plate). From the cells recordings and lysates prepare the SNs for cell titers glo (or MTT or SRB) memory.
Tabelle 2: Datenreihe 2 Table 2: Data series 2
3- Ergebnis 3- result
[0051] In den Figuren ist unter "mock" der Kontrollansatz dargestellt. Die eingesetztenIn the figures, the control approach is shown under "mock". The used
Lungenepithelzellen Calu3 zeigen in der Zellkultur unter dem Mikroskop ein flächiges Gebilde. Nach Infektion der Zellen mit SARS-CoV-2 (Aufnahmen überschrieben mit "SARS-CoV-2" oder "inf') zeigt sich ein deutlicher zytopathischer Effekt, der in der morphologischen Veränderung der Zellformationen in Form von "Verklumpungen" sichtbar wird, siehe z.B. Fig. 1-5, zweite Spalte. Lung epithelial cells Calu3 show a flat structure in the cell culture under the microscope. After infection of the cells with SARS-CoV-2 (recordings titled "SARS-CoV-2" or "inf '), a clear cytopathic effect becomes apparent, which is visible in the morphological change in the cell formations in the form of" clumps ", see e.g. Fig. 1-5, second column.
Datenreihe 1 : Data series 1:
[0052] Die BRD2/4 Inhibitoren IBET151 und CPI203 zeigen bei Konzentrationen von 10 und 1 mM eine deutliche Reduktion des zytopathischen Effekts, verursacht durch die Virusinfektion (Vergleich zu mock/nicht infiziert und SARS-CoV-2 infiziert); siehe Fig. 1 und 2, 3. und 4. Spalte. Im Gegensatz dazu zeigen gleiche Konzentrationen von HyrdoxychloroquinThe BRD2 / 4 inhibitors IBET151 and CPI203 show at concentrations of 10 and 1 mM a significant reduction in the cytopathic effect caused by the virus infection (compared to mock / uninfected and SARS-CoV-2 infected); see Figures 1 and 2, 3rd and 4th columns. In contrast, show equal concentrations of Hyrdoxychloroquine
(HChl, Fig. 5), sowie der klinisch zugelassenen CDK-Inhibitoren Ribociclib (RGB; Fig. 3) und Abemaciclib (AGB; Fig. 4) keine hemmenden Effekte. 13 (HChl, Fig. 5), as well as the clinically approved CDK inhibitors ribociclib (RGB; Fig. 3) and Abemaciclib (AGB; Fig. 4) no inhibitory effects. 13th
[0049] Restlicher Überstand auf neue Caco2 Zellen über 2-5 Tage kultiviert. Kontinuierliche Ernte des Überstandes als Virusstock. Aliquotierung und Lagerung bei -80°C. Remaining supernatant cultured on new Caco2 cells for 2-5 days. Continuous harvest of the supernatant as a virus stock. Aliquot and store at -80 ° C.
Testung von Substanzen auf antivirale Aktivität Testing of substances for antiviral activity
[0050] Calu3 (50.000 Zellen / Well) in 96-Well-Platte aussäen. 24h später Mediumwechsel zuSeed Calu3 (50,000 cells / well) in 96-well plate. 24h later medium change to
170 pl DMEM+5%FCS (Infektionsmedium) pro Well. Erstellen von Inhibitorverdünnungen so dass nach Zugabe von 20 pl Verdünnung die gewünschte Endkonzentration erreicht wird. Dann Zugabe von 10 - 5 mI Virusstock (1:20, MOLO, 4 - 1:40, MOLO.2) zum Gesamt volumen von 200 mI. Inkubation für weitere 24-48 h. Nach jeweils 24 und 48 h Aufnahme von Durchlichtbildern über automatische Mikroskopie (4-fache Vergrößerung) mittels Mul- tiplate-Reader. Evaluierung des zytopathischen Effekts der Virusinfektion über visuelle Beurteilung des Zellrasens. 170 μl DMEM + 5% FCS (infection medium) per well. Creation of inhibitor dilutions so that the desired final concentration is achieved after adding 20 μl of the dilution. Then add 10 - 5 ml of virus stock (1:20, MOLO, 4 - 1:40, MOLO.2) to the total volume of 200 ml. Incubation for an additional 24-48 h. After 24 and 48 h, recording of transmitted light images via automatic microscopy (4x magnification) using a multiplate reader. Evaluation of the cytopathic effect of the virus infection by visual assessment of the cell lawn.
Datenreihe 1: Data series 1:
Tabelle 1: Datenreihe 1 Table 1: Data series 1
14 14th
Datenreihe 2 Data series 2
Tabelle 2: Datenreihe 2 Table 2: Data series 2
3. Ergebnis 3. Result
[0051] In den Figuren ist unter "mock" der Kontrollansatz dargestellt. Die eingesetzten Lungenepithelzellen Calu3 zeigen in der Zellkultur unter dem Mikroskop ein flächiges Gebilde. Nach Infektion der Zellen mit SARS-CoV-2 (Aufnahmen überschrieben mit "SARS-CoV-2" oder "inf") zeigt sich ein deutlicher zytopathischer Effekt, der in der mor phologischen Veränderung der Zellformationen in Form von "Verklumpungen" sichtbar wird, siehe z.B. Fig. 1-5, zweite Spalte. In the figures, the control approach is shown under "mock". The Calu3 lung epithelial cells used show a flat structure in the cell culture under the microscope. After infection of the cells with SARS-CoV-2 (recordings overwritten with "SARS-CoV-2" or "inf"), a clear cytopathic effect is evident, which becomes visible in the morphological change in the cell formations in the form of "clumps". see, for example, Fig. 1-5, second column.
Datenreihe 1: Data series 1:
[0052] Die BRD2/4 Inhibitoren IBET151 und CPI203 zeigen bei Konzentrationen von 10 und 1 mM eine deutliche Reduktion des zytopathischen Effekts, verursacht durch die Virusinfekti on (Vergleich zu mock/nicht infiziert und SARS-CoV-2 infiziert); siehe Fig. 1 und 2, 3. und 4. Spalte. Im Gegensatz dazu zeigen gleiche Konzentrationen von Hyrdoxychloroquin (HChl, Fig. 5), sowie der klinisch zugelassenen CDK-Inhibitoren Ribociclib (RCB; Fig. 3) und Abemaciclib (ACB; Fig. 4) keine hemmenden Effekte. 15 The BRD2 / 4 inhibitors IBET151 and CPI203 show at concentrations of 10 and 1 mM a significant reduction in the cytopathic effect caused by the virus infection (compared to mock / uninfected and SARS-CoV-2 infected); see Figures 1 and 2, 3rd and 4th columns. In contrast, the same concentrations of hydroxychloroquine (HChl, FIG. 5) and the clinically approved CDK inhibitors ribociclib (RCB; FIG. 3) and abemaciclib (ACB; FIG. 4) show no inhibitory effects. 15th
Datenreihe 2: Data series 2:
[0053] Bei einer Dosis-abhängigen Reduktion der Konzentrationen von IBET151 und CPI203 von 10 mM - 0,3125 mM zeigen sich selbst bei niedrigsten Konzentrationen noch inhibierende Effekte auf den Virus-verursachten zytopathischen Effekt, anders als bei gleichen Kon zentration von Hydroxychloroquin (Fig. 6 und 7). With a dose-dependent reduction in the concentrations of IBET151 and CPI203 from 10 mM - 0.3125 mM, inhibiting effects on the virus-caused cytopathic effect are shown even at the lowest concentrations, in contrast to the same concentration of hydroxychloroquine (Fig . 6 and 7).
[0054] In weiteren Experimenten konnten die Erfinder zeigen, dass die BRD2/4-lnhibitor- Behandlung von Calu3-Zellen, die mit einer hohen Multiplizität der Infektion (MOI = 2) von SARS-CoV-2 infiziert sind, den virusinduzierten Zelltod vollständig blockiert, die Viruspro duktion jedoch nicht beeinträchtigt (Fig. 8). Bei Verwendung hoher MOIs konnten die Erfinder keine Verringerung der infizierten Zellen oder der Gesamtmenge an viralem Protein feststellen, obwohl die virusinduzierten zytopathischen Effekte vollständig blockiert waren. Bei einer Infektion mit niedrigeren MOIs war die Infektionsrate jedoch verringert (Fig. 8B). Dies legt nahe, dass BRD-Proteine keinen Einfluss auf den Viruseintritt und die Infektion oder die Produktion von Virusproteinen haben, aber die späten Schritte der Virusreplikation beeinflussen könnten. Diese Annahme ist mit einer möglichen Rolle des E-Proteins bei der Assemblierung und Freisetzung von Coronaviren vereinbar. In further experiments, the inventors were able to show that the BRD2 / 4 inhibitor treatment of Calu3 cells infected by SARS-CoV-2 with a high multiplicity of infection (MOI = 2) completely eliminates virus-induced cell death blocked, but the virus production is not impaired (Fig. 8). When using high MOIs, the inventors could not find any reduction in infected cells or in the total amount of viral protein, although the virus-induced cytopathic effects were completely blocked. However, when infected with lower MOIs, the infection rate was reduced (FIG. 8B). This suggests that BRD proteins do not affect virus entry and infection or production of virus proteins, but could affect the late steps of virus replication. This assumption is consistent with a possible role for the E protein in the assembly and release of coronaviruses.
[0055] In weiteren Experimenten haben die Erfinder untersucht, inwiefern die BRD2/4-lnhibitoren in die zellulären Signalwege eingreifen, die von SARS-CoV-2 zur Induktion von zytopathi schen Effekten genutzt werden. Die Erfinder haben mehrere Kontrollen eingeschlossen, die wiederum bestätigen, dass die BRD2/4-lnhibitoren, wenn hohe MOIs zur Infektion verwendet werden, die virale Proteinproduktion nicht reduzieren, was durch die Menge des produzierten viralen Nucleocapsids belegt wird. Wie beobachtet blockieren BRD2/4- Inhibitoren die Phosphorylierung von Histon H3, unabhängig von der SARS-CoV-2-lnfekti- on. Bemerkenswerterweise scheint eine SARS-CoV-2-lnfektion eine apoptotische Signal kaskade zu induzieren, was durch die Induktion der Caspase-6/7-Spaltung und der AKT- Phosphorylierung deutlich wird. Alle diese Ereignisse werden spezifisch durch BRD2/4-ln- 16 hibitoren Inhibitoren blockiert, was das Fehlen von SARS-CoV-2-induziertem Zelltod bei der Behandlung mit den Verbindungen erklären kann (Fig. 9). In further experiments, the inventors investigated the extent to which the BRD2 / 4 inhibitors intervene in the cellular signaling pathways that are used by SARS-CoV-2 to induce cytopathic effects. The inventors included several controls which in turn confirm that when high MOIs are used for infection, the BRD2 / 4 inhibitors do not reduce viral protein production, as evidenced by the amount of viral nucleocapsid produced. As observed, BRD2 / 4 inhibitors block the phosphorylation of histone H3, regardless of the SARS-CoV-2 infection. Remarkably, a SARS-CoV-2 infection appears to induce an apoptotic signal cascade, which is evident from the induction of caspase 6/7 cleavage and AKT phosphorylation. All of these events are specifically addressed by BRD2 / 4-ln- 16 inhibitor inhibitors are blocked, which may explain the lack of SARS-CoV-2-induced cell death in the treatment with the compounds (FIG. 9).
[0056] In der Fig. 10 ist die Wirkung der BRD2/4-lnhibitoren auf die Gesamtzahl bzw. das Überle ben der Calu3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-lnfektion nochmals zusammenfassend il lustriert. Calu-3-Zellen wurden mit dem klinischen SARS-CoV-2-lsolat infiziert oder scheininfiziert (mock). Gleichzeitig wurden die Zellen mit den beiden BRD2/4-lnhibitoren IBET151 und CPI203 und Hydroxychloroquin (HCQN) als Referenzwirkstoff in den ange gebenen Konzentrationen behandelt. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit 80% Aceton fixiert und die Kerne mit DAPI-Lösung (2 mg/ml) 10 Minuten bei RT gegenge färbt. Zur Quantifizierung wurde die Gesamtmenge an Zellen (DAPI +) durch automatisier te Mikroskopie analysiert. Die durchschnittliche Anzahl von Schein- und infizierten Zellen ist mit einer gepunkteten Linie angegeben. Es zeigt sich, dass in den durchgeführten Ex perimenten ab einer Konzentration der BRD2/4-lnhibitoren von ca. 20 nM positive Effekte auf die Gesamtzahl bzw. das Überleben der Calu3-Zellen nach einer SARS-CoV-2-lnfekti- on auftreten. Bei HQCN-behandelten Zellen ist dies nicht zu beobachten. Diese Beobach tung wurde von den Erfindern in weiteren Experimenten bestätigt (nicht gezeigt). In FIG. 10, the effect of the BRD2 / 4 inhibitors on the total number or the survival of the Calu3 cells after a SARS-CoV-2 infection is illustrated again in summary. Calu-3 cells were infected or mock-infected with the clinical SARS-CoV-2 isolate. At the same time, the cells were treated with the two BRD2 / 4 inhibitors IBET151 and CPI203 and hydroxychloroquine (HCQN) as the reference active ingredient in the given concentrations. 48 hours after infection, the cells were fixed with 80% acetone and the nuclei were counter-stained with DAPI solution (2 mg / ml) for 10 minutes at RT. For quantification, the total amount of cells (DAPI +) was analyzed by automated microscopy. The average number of mock and infected cells is indicated with a dotted line. It turns out that in the experiments carried out, positive effects on the total number or survival of the Calu3 cells occur after a SARS-CoV-2 infection from a concentration of the BRD2 / 4 inhibitors of approx. 20 nM. This is not observed in HQCN-treated cells. This observation was confirmed by the inventors in further experiments (not shown).
4. Fazit 4. Conclusion
[0057] Die Erfinder konnten anhand von zwei ausgewählten Beispielverbindungen zeigen, dass Inhibitoren des Bromodomain-enthaltenden Proteins (BRD) eine wirksame prophylakti sche und therapeutische Behandlung einer Coronavirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung ermöglicht und damit insbesondere im Hinblick auf eine SARS-CoV-2-lnfektion (COVID-19) eine vielversprechende pharmakologische Option darstellen. Using two selected example compounds, the inventors were able to show that inhibitors of the bromodomain-containing protein (BRD) enable an effective prophylactic and therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection and thus in particular with regard to SARS-CoV-2 infection (COVID-19) represent a promising pharmacological option.

Claims

17 Patentansprüche 17 claims
1. Inhibitor des Bromodomain-enthaltenden Proteins (BRD) zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavirus- Infektion und/oder einer durch diese Infektion ver ursachten Erkrankung. 1. Inhibitor of the bromodomain-containing protein (BRD) for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
2. Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Infekti on mit einem SARS-assoziierten Coronavirus (SARS-CoV) und eine durch diese Infektion verursachte Erkrankung, vorzugsweise um eine SARS-CoV-2- Infektion und/oder um COVID-19 handelt. 2. Inhibitor according to claim 1, characterized in that it is an infection with a SARS-associated coronavirus (SARS-CoV) and a disease caused by this infection, preferably a SARS-CoV-2 infection and / or COVID-19 acts.
3. Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Inhibitor des Bromodomain-enthaltenden Proteins 2 (BRD2) handelt. 3. Inhibitor according to claim 1 or 2, characterized in that it is an inhibitor of the bromodomain-containing protein 2 (BRD2).
4. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Inhibitor des Bromodomain-enthaltenden Proteins 4 (BRD4) handelt. 4. Inhibitor according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is an inhibitor of the bromodomain-containing protein 4 (BRD4).
5. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine niedermolekulare Verbindung handelt. 5. Inhibitor according to one of the preceding claims, characterized in that it is a low molecular weight compound.
6. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um GSK2820151 (IBET151) handelt. 6. Inhibitor according to one of the preceding claims, characterized in that it is GSK2820151 (IBET151).
7. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um R06870810/TEN-010 (CPI203) handelt. 7. Inhibitor according to one of the preceding claims, characterized in that it is R06870810 / TEN-010 (CPI203).
8. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Coronavirus- Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkran kung, die den Inhibitor nach einem der Patentansprüche 1 bis 7 sowie einen phar mazeutisch akzeptablen Träger aufweist. 18 8. A pharmaceutical composition for the prophylaxis and / or treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, which comprises the inhibitor according to one of claims 1 to 7 and a pharmaceutically acceptable carrier. 18th
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor pro Dosiereinheit in einer Konzentration vorliegt, die nach Verab reichung in ein Lebewesen zu einer Konzentration führt, die die Coronavirus Infek tion und/oder einer durch diese Infektion verursachte Erkrankung inhibiert. 9. Pharmaceutical composition according to claim 8, characterized in that the inhibitor is present per dosage unit in a concentration which, after administration in a living being, leads to a concentration which inhibits the coronavirus infection and / or a disease caused by this infection.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekenn zeichnet, dass der Inhibitor pro Dosiereinheit in einer Konzentration vorliegt, die nach Verabreichung in ein Lebewesen zu einer Konzentration in den Coronavirus infizierten Zellen führt, die bei ca. < 10 pM, vorzugsweise bei ca. < 1 pM, weiter vorzugsweise bei ca. < 500 nM, weiter vorzugsweise bei ca. < 400 nM liegt. 10. Pharmaceutical composition according to claim 8 or 9, characterized in that the inhibitor is present per dosage unit in a concentration which, after administration into a living being, leads to a concentration in the coronavirus-infected cells that is approximately <10 pM, preferably at approx. <1 pM, more preferably approx. <500 nM, more preferably approx. <400 nM.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Coronavirus-infizierten Zellen um Lungenepithelzellen han delt. 11. A pharmaceutical composition according to claim 10, characterized in that the coronavirus-infected cells are lung epithelial cells.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen weiteren Wirkstoff, vorzugsweise einen weiteren anti-viralen Wirkstoff aufweist. 12. Pharmaceutical composition according to one of claims 8 to 10, characterized in that it has a further active ingredient, preferably a further anti-viral active ingredient.
13. Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Coro navirus-Infektion und/oder einer durch diese Infektion verursachten Erkrankung, gekennzeichnet durch die Verabreichung des Inhibitors nach einem der Patentan sprüche 1 bis 7 und/oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 12 an ein Lebewesen. 13. A method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a coronavirus infection and / or a disease caused by this infection, characterized by the administration of the inhibitor according to one of claims 1 to 7 and / or the pharmaceutical composition according to one of claims 8 up to 12 to a living being.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Lebewesen ein Mensch ist. 14. The method according to claim 13, characterized in that the living being is a human.
EP21720218.3A 2020-04-17 2021-04-16 Bromodomain inhibitors for the prevention and/or treatment of coronavirus infections and diseases caused thereby Pending EP4135694A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102020110573.8A DE102020110573A1 (en) 2020-04-17 2020-04-17 Active ingredients against coronavirus infections and diseases caused by them
PCT/EP2021/059898 WO2021209594A1 (en) 2020-04-17 2021-04-16 Bromodomain inhibitors for the prevention and/or treatment of coronavirus infections and diseases caused thereby

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4135694A1 true EP4135694A1 (en) 2023-02-22

Family

ID=75588211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP21720218.3A Pending EP4135694A1 (en) 2020-04-17 2021-04-16 Bromodomain inhibitors for the prevention and/or treatment of coronavirus infections and diseases caused thereby

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230084839A1 (en)
EP (1) EP4135694A1 (en)
JP (1) JP2023522880A (en)
CN (1) CN115968287A (en)
DE (1) DE102020110573A1 (en)
WO (1) WO2021209594A1 (en)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0919432D0 (en) * 2009-11-05 2009-12-23 Glaxosmithkline Llc Use
JP2017526741A (en) * 2014-08-08 2017-09-14 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド Diazepan derivatives and uses thereof
CN110101705B (en) * 2019-05-07 2022-01-14 河南农业大学 Antiviral use of BET family protein inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
US20230084839A1 (en) 2023-03-16
CN115968287A (en) 2023-04-14
DE102020110573A1 (en) 2021-10-21
JP2023522880A (en) 2023-06-01
WO2021209594A1 (en) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69837474T2 (en) Antimicrobial Prevention and Treatment of AIDS and Other Infectious Diseases
Chu et al. Paeoniflorin attenuates schistosomiasis japonica-associated liver fibrosis through inhibiting alternative activation of macrophages
DE69327642T2 (en) METHOD FOR TREATING VIRAL INFECTIONS
US9511104B2 (en) Anti-cancer extract and compounds
Chang et al. Prodigiosin inhibits gp91phox and iNOS expression to protect mice against the oxidative/nitrosative brain injury induced by hypoxia–ischemia
EP1617858B1 (en) Caspase 3, 8, 9 or 10 inhibitors in combination with MEK inhibitors for the treatment of influenza
WO2004060360A1 (en) Use of active ingredients for the prophylaxis and/or therapy of viral diseases
EP3349741A1 (en) Composition having antiviral effect
EP3324989A1 (en) Anti-herpes composition and anti-herpes pharmaceutical formulation
EP1531826A2 (en) Prophylaxis and treatment of infectious diseases
DE60118592T2 (en) PHYLLANTHUS COMPOUNDS FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF DISEASES RELATED TO A RETROVIRUS
Li-Li et al. 5, 7, 2’, 4’, 5’-Pentamethoxyflavanone regulates M1/M2 macrophage phenotype and protects the septic mice
EP4135694A1 (en) Bromodomain inhibitors for the prevention and/or treatment of coronavirus infections and diseases caused thereby
DE69328667T2 (en) COMPOSITION CONTAINING FLAVOPEREIRINE AND THEIR USE IN THE TREATMENT AGAINST HIV VIRUSES
DE69004451T2 (en) Prophylaxis and treatment of herpes virus infections.
KR102456307B1 (en) Composition for preventing or treating of multiple organ failure related to infection comprising 3&#39;-Sialyllactose, 6&#39;-Sialyllactose or Derivatives Thereof
EP2670420A1 (en) Antiviral agent containing recombinant mistletoe lectins
EP3352763B1 (en) Substance for prophylaxis and treatment of infections by influenza viruses
EP1096947A1 (en) Topical drug for the treatment of viral infections
US20170273938A1 (en) Use of flavonoids in manufacturing compositions for wound healing
Wu et al. Beneficial herb-drug interaction of rhein in Jinhongtang and Imipenem/Cilastatin mediated by organic anion transporters
JP4589126B2 (en) Use of cumin extract and piperine to influence the biological effectiveness of anti-infectives
CN110801455B (en) Pharmaceutical composition for treating MRSA and application thereof
JP2002510640A (en) Herbal composition for prevention and treatment of AIDS
Bafghi et al. Antileishmanial Activity of Carum Copticum Essential Oil Against Leishmania Major [MRHO/IR/75/ER]: An In Vitro Study

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20221115

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20240418