EP4045521A2 - Levures oenologiques permettant le contrôle de la teneur en acide des vins et méthodes de sélection de telles levures - Google Patents

Levures oenologiques permettant le contrôle de la teneur en acide des vins et méthodes de sélection de telles levures

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Publication number
EP4045521A2
EP4045521A2 EP20803632.7A EP20803632A EP4045521A2 EP 4045521 A2 EP4045521 A2 EP 4045521A2 EP 20803632 A EP20803632 A EP 20803632A EP 4045521 A2 EP4045521 A2 EP 4045521A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
protein encoded
amino acid
ygl008c
malic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20803632.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Emilien PELTIER
Philippe Marullo
Joana Coulon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biolaffort
Original Assignee
Biolaffort
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Filing date
Publication date
Application filed by Biolaffort filed Critical Biolaffort
Priority to EP22182904.7A priority Critical patent/EP4101863A1/fr
Publication of EP4045521A2 publication Critical patent/EP4045521A2/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine

Definitions

  • the present invention relates to the field of yeasts intended for use in the food industry, and in particular relates to yeasts intended for use in the biotransformation of grape juice into wine.
  • Grape juice suitable for winemaking is commonly referred to as grape must.
  • the present invention relates more particularly, but not exclusively, to a process for the selection of sourdoughs of the genus Saccharomycese ⁇ in particular of the species Saccharomyces cere visiae in order to better control the pH of the product of the fermentation of grape juice into wine and this by selecting their ability to degrade (or produce) organic acids and in particular malic acid and succinic acid.
  • the content of all the organic acids in wine contributes significantly to its final acidity and therefore to the final pH, which is an important parameter of its organoleptic quality.
  • Grape juice naturally contains many organic substances, including organic acids such as malic acid and tartaric acid.
  • the acidity of grape juice and wines prepared from this juice is closely dependent on the content of these two acids.
  • the malic acid content in the grape decreases during its ripening to reach values of 2 to 7 g / L at the time of maturity.
  • the yeasts can partially degrade the malic acid and produce other organic acids such as succinic acid and pyruvic acid which will in turn modify the acidity.
  • the malic acid content is mainly controlled by the malolactic fermentation carried out by lactic bacteria in particular by Oenococcus oeni.This fermentation takes place after alcoholic fermentation, and can be initiated using industrial leaven inoculated into the wine or in the fermenting must.
  • Patent EP 2 183364 describes the use of the species Saccharomyces cerevisiae with a selection within the genetic variability of the species. oenological characteristics linked to the production of volatile phenols.
  • the species Saccharomyces cerevisiae exhibits a particularly attractive natural genetic variability, but so far no candidate allowing a significant reduction of malic acid has been suitably selected and no strain capable of consuming almost all of the malic acid, with at the very least a significant reduction in malic acid of at least 50% could not be properly identified.
  • this species can in certain cases produce small amounts of malic acid as described in Yeramian et al. J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 3, 2007 912-919. However, the level of malic acid production of these strains remains less than or equal to 0.7 g / L.
  • the present invention relates to a yeast strain of the species Saccharomyces cerevisiae comprising at least one peptide sequence polymorphism in at least one of the protein sequences encoded by the genes selected from the eleven genes YLL041C (SDH2), YGL008C (PMA 1), YDL054C (MCH1), YKL029C (MAE 1), YDL021W (GPM2), YOR380W (RDR1), YOR090C (PTC5), YBR218C , YGL037C (PNC1), YBL036C and YDL237W (AiM6), which are located on chromosomes (chr) 2, 4, 7, 11, 12 and 15.
  • a polymorphism of a peptide sequence is preferably linked to a single sequence polymorphism (known by the English acronym “SNP”, meaning “single nucleotide polymorphism”) or a succession of several polymorphisms. unique in sequence to the nucleic acid sequence of the gene encoding this protein.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the genetic and / or peptide sequences are those identified in the Saccharomyces GENOME DATABASE (SGD) database for the S288C strain and correspond, more particularly, to the sequences detailed in the “sequence listing” part of the present description. .
  • the yeast strain according to the invention comprises at least one, preferably from one to six, peptide sequence polymorphisms at the level of the amino acids selected from the following positions in the reference genome: the acid l ' amino acid (Lys158) of the protein encoded by the YLL041C gene, the amino acid (Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene, the amino acid (Asp200) of the protein encoded by the YGL008C gene, the amino acid (Ser63) of the protein encoded by the YDL054C gene, the amino acid (Ile605) at the level of the protein encoded by the YKL029C gene, the amino acid (Met419) at the level of the protein encoded by the YOR090C gene, the amino acid (Glu722) of the protein encoded by the YBR218C gene and the amino acid (Glu 165) of the protein encoded by the YDL237W gene.
  • said strain comprises the peptide sequence polypeptide sequence poly
  • the yeast strain of the species Saccharomyces cerevisiae comprises at least one peptide sequence polymorphism in the sequence of each of the proteins encoded by the two genes YLL041C and YGL008C located on chromosomes 7 and 12
  • Such a selection of individuals makes it possible to obtain an average content of malic acid consumed, which is taken over the entire population, and which is greater than 51%, being expressed as a percentage by mass calculated relative to the total mass of malic acid present at the beginning.
  • said strain comprises two sequence polymorphisms peptide at the level of two amino acids selected from the following positions in the reference genome: the amino acid (Lys 158) of the protein encoded by the YLL041C gene, the amino acid (Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene , the amino acid (Asp200) of the protein encoded by the gene and YGL008C and the amino acid (Ile605) at the level of the protein encoded by the YKL029C gene.
  • the yeast strain of the Saccharomyces cerevisiae species according to the invention comprises at least one peptide sequence polymorphism in the sequence of each of the proteins encoded by the four genes YLL041C, YGL008C, YDL054C and YDL237W located on the chromosomes 4, 7 and 12.
  • YLL041C YGL008C
  • YDL054C YDL237W located on the chromosomes 4, 7 and 12.
  • said strain comprises four peptide sequence polymorphisms at the level of four amino acids selected from the following positions in the reference genome: the amino acid (Lys 158) of the protein encoded by the YLL041C gene, the amino acid ( Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene, the amino acid (Ser63) of the protein encoded by the YDL054C gene and the amino acid (Glu 165) of the protein encoded by the YDL237W gene.
  • the yeast strain of the species Saccharomyces cerevisiae comprises at least one peptide sequence polymorphism in each of the sequences of five to six proteins encoded by the seven genes YLL041C, YGL008C, YDL054C, YKL029C, YOR090C , YBR218C and YDL237W located on chromosomes 2, 4, 7, 11, 12 and 15.
  • YLL041C YGL008C, YDL054C, YKL029C, YOR090C , YBR218C and YDL237W located on chromosomes 2, 4, 7, 11, 12 and 15.
  • said strain comprises five peptide sequence polymorphisms at the level of five amino acids selected from the following positions in the reference genome: the amino acid (Lys158) of the protein encoded by the YLL041C gene, the acid amino (Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene, the amino acid (Ser63) of the protein encoded by the YDL054C gene, the amino acid (Ile605) at the level of the protein encoded by the YKL029C gene, the acid amino (Met419) at the level of the protein encoded by the YOR090C gene and the amino acid (Glu 165) of the protein encoded by the YDL237W gene.
  • the amino acid (Lys158) of the protein encoded by the YLL041C gene the acid amino (Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene
  • the amino acid (Ser63) of the protein encoded by the YDL054C gene the amino acid (Ile605) at the level
  • said strain comprises six peptide sequence polymorphisms at the level of six amino acids selected from the following positions in the reference genome: the amino acid (Lys158) of the protein encoded by the YLL041C gene, the acid amino (Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene, the amino acid (Ser63) of the protein encoded by the YDL054C gene, the amino acid (Ile605) at the level of the protein encoded by the YKL029C gene, the acid amino (Met419) at the protein encoded by the YOR090C gene, the amino acid (Glu722) of the protein encoded by the YBR218C gene and the amino acid (Glu165) of the protein encoded by the YDL237W gene.
  • the amino acid (Lys158) of the protein encoded by the YLL041C gene the acid amino (Pro74) of the protein encoded by the YGL008C gene
  • said strain comprises two to six substitutions of amino acids in the reference genome among the following: (Glu 158) of the protein encoded by the YLL041C gene, (Leu74) of the protein encoded by the gene YGL008C, (Leu63) of the protein encoded by the YDL054C gene, (Leu419) of the protein encoded by the YOR090C gene, (Lys722) of the protein encoded by the YBR218C gene and (Ala165) of the protein encoded by the YDL237W gene.
  • Such a strain selection is advantageously used to obtain a strong reduction in the level of malic acid, and to increase the pH of a wine.
  • Such a selection of individuals makes it possible to obtain a content of malic acid consumed in excess of 80% and which produce a wine whose pH is modified by a value of up to 0.4 units depending on the strain from the same starting grape juice.
  • said strain comprises from one to two substitutions of amino acids in the reference genome from among the following: (Glu200) of the protein encoded by the gene and YGL008C and (Val605) at the level of the protein encoded by the YKL029C gene.
  • Such strain selection makes it possible to obtain a strong increase in malic acid, and to decrease the pH of a wine.
  • Such a strain selection is advantageously used to obtain a strong increase in the level of malic acid, and to reduce the pH of a wine.
  • Such selection of individuals makes it possible to obtain a production of malic acid greater than 35% of the value of malic acid initially present. This production makes it possible to reduce the pH of the wine by a value of up to 0.4 units depending on the strains used from the same starting grape juice.
  • the present invention also relates to a method for selecting oenological yeast strains as described above in the context of the present invention, comprising the steps of:
  • step 3- obtain meiotic descendants from the hybrids of step 1- by induction of sporulation and isolation of spores;
  • 6- carry out genotyping of the genome of the descendants making it possible to know the genotype of at least two loci; 7- carry out a genetic mapping from the data obtained in step 4- and in step 6-; and
  • 8- select at least one group of individuals among individuals carrying demalicizing alleles and individuals carrying missing alleles.
  • selection means the identification and isolation of oenological yeasts, that is to say yeasts involved in the process of making wine, and in particular in the metabolism of acids and bases present in wines.
  • malignant allele means the allele which confers lower consumption of malic acid content during alcoholic fermentation, or even production of malic acid during alcoholic fermentation.
  • genotyping means determining the inheritance of a portion of DNA at a specific point in the genome. In the context of the present invention, genotyping corresponds to the identification of a nucleotide sequence which is associated with the demalicizing character or the malignant character.
  • Step 1- preferably consists in obtaining a hybrid by crossing two strains A and B of the species Saccharomyces cerevisiae according to the method of pairing spores with the micromanipulator described in the article by Marullo et al. (Marullo et al. 2009 FEMS Yeast Research, 9, 8: 1148-1160).
  • the resulting hybrid is called H1, it is the product of the conjugation of spores resulting from the cross between strain A and strain B.
  • the resulting hybrid H1 is heterozygous at many points of its genome.
  • the technique of hemizygous hybrids implemented in step 2- is the method described in the article by Steinmetz et al., 2002, Nature, 416, 6878: 326-330.
  • the principle of said method consists of eliminate by homologous recombination one of the two parental copies of the studied gene, by inserting at the locus of said studied gene, a gene for resistance to an antibiotic.
  • hemizygous hybrids express only one of the two parental copies of the gene studied. If there is a significant difference (at the 10% threshold) between the two hybrids, the allele has an effect on the studied phenotype.
  • the genes tested, the effect of which is significant on the percentage of malic acid consumption at the end of alcoholic fermentation are presented in Table 1.
  • L-malic acid is quantified by enzymatic assay after having observed the complete cessation of the alcohol. alcoholic fermentation according to the method described in Peltier, et al., 2018, PLOS ONE, 13 (1), 191353 (https://doi.org/10.1101/191353).
  • the allele noted DEMAL is the one which consumes the most malic acid
  • the allele noted MAL is the one which preserves the malic acid content the most.
  • the results presented were measured in a Merlot must (Merlot 2 sample from Table 1) and in a Sauvignon must (Sauvignon Blanc 1 sample from Table 1) whose initial malic acid contents are respectively estimated at 2.28 and 4. , 32 g / L.
  • step 3- is carried out by microdissection or mass purification of spores.
  • Step 3- involves induction of sporulation of a hybrid, the aforementioned H1 hybrid, on a medium preferably comprising 1% potassium acetate for 3 days at 24 ° C.
  • the use of microdissection of ascospores is preferably carried out using a micromanipulator, for example according to the method published in Marullo et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8: 1148-1160.
  • ascospores are isolated in bulk after partial purification, preferably using the method published in the article by Curran B.P.G. et al., 2006, “Basic Investigations in Saccharomyces cerevisiae”, Methods in Molecular Biology, vol 313, 1-13.
  • step 4- the level of malic acid consumed is measured at the end of alcoholic fermentation by an enzymatic test.
  • the measurement of the percentage of malic acid consumed for a set of 94 descendants of the H1 hybrid is carried out by enzymatic assay of L-malic acid after having observed the complete cessation of alcoholic fermentation according to the method described in Peltier and al., 2018, PLOS ONE, 13 (1), 191353 (https://doi.Org/10.1101/191353).
  • step 5- the DNA of the descendants is extracted.
  • the DNA of each descendant is advantageously extracted using extraction kits such as the DNA-Wizard Promega kit according to the protocol described in Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • amplification of the genomic DNA is carried out between steps 5- and 6-.
  • Amplification is carried out with a kit, preferably the Nextera XT kit or any other kit suitable for sequencing small genomes.
  • the procedure used makes it possible to index, using specific DNA primers, 96 individuals and to amplify their DNA in order to build a Library for Illumina sequencing.
  • the protocol used is that provided by the manufacturer, it is described in Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • the genotyping carried out in step 6 - implements sequencing, which sequencing is preferably carried out using a sequencing kit which consists firstly in amplifying the DNA in order to construct a Library for Illumina MySeq sequencing using the MySeq Reagent Kit V2 sequencing kit (Pair End 2x250 bases) according to the instructions provided by the manufacturer as described in Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • the sequence reads obtained are preferably filtered by bioinformatics methods using the FASTX-Toolkit suite (http: // hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  • the readings retained (quality Q> 20) are then aligned with the BWA software (Li, H., and R. Durbin, 2010.
  • SAM tools suite described in the article by Li, H. et al., 2009, Bioinformatics, 25, 2078-2079, the SNPs of each of the descendants are identified and positioned on the genome by Pileup software. These SNPs allow the construction of a very dense genetic map made up of 1000 bi-allelic markers. The method of construction of this type of map and the bioinformatic tools used are described in the article Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • the genetic mapping used in step 7- of the method according to the invention is a method which establishes a statistical link between the inheritance of genetic markers and the variation of a quantitative character.
  • the genetic markers which are statistically linked are “quantitative character loci” (the English translation of which is “Quantitative Trait Loci”, with the associated acronym “QTL”) such as those described in application EP 2 183 364.
  • Quantitative character loci the English translation of which is “Quantitative Trait Loci”, with the associated acronym “QTL”
  • QTL Quantitative Trait Loci
  • step 7- the bi-allelic markers (they are in the order of a thousand) from step 6- are used to perform genetic mapping.
  • a statistical link is found between the variation in quantitative character and four genetic markers with a very high significance level (ll_150, XV_1052, IV_31 and IV_360).
  • the statistical test used is based on mapping by the so-called "interval mapping” method using a Haley-Knott regression (Peltier et al. 2018., BMC Genomics 19, 772).
  • the genomic position of the markers, the gene concerned and the value of the probability of the test (risk of the first species) are listed in table 2.
  • the effect of the MAL and DEMAL allele is also indicated, expressed as a percentage of malic acid consumed.
  • the DEMAL allele corresponds to the "demalicizing trait" which means the allele that confers the phenotype responsible for the elimination of the highest content of malic acid (unlike the MAL allele).
  • step 2- of the method the genes and / or the QTLs exhibiting nucleotide variations which are linked to the percentage by mass of consumption of malic acid during the alcoholic fermentation of grape juice by the yeast Saccharomyces cerevisiae are directly identified.
  • nucleotide variations affect the sequence of genes YDL237W, YDL054C, YKL029C, YDL021W, YOR380W, YBR218C, YOR090C, YLL041C i YGL037C, YGL008C and YBL036C.
  • These nucleotide sequence variations can easily be genotyped within a large population of individuals by genetic typing methods, that is to say any biochemistry or molecular biology method capable of identifying the presence of a variation.
  • nucleotide or protein sequence such as PCR, DNA sequencing, protein sequencing, and / or a method based on the detection of SNP using mass spectrometry, according to the technology qualified as sequenom® Gabriel, S., 2009, Current Protocol in Human Genetics, Suppl. (60. doi.org/10.1002/ 0471142905. hg0212s60).
  • the MAL and DEMAL alleles used are determined from the reference sequence sacCer3 (sacCer3, version April 2011) derived from the strain S288C and available on the SGD database ("Saccharomyces Genome Data base") with a link accessible via https://www.yeastgenome.org/.
  • the nomenclature used is that of the description of the genetic mutations described in the article by den Dunnen JT et al., 2000, Human Genome Variation Society, Hum.Mutat. 15: 7-12.
  • pools of alleles are determined which will make it possible to reduce or preserve the malic acid content of the wines at the end of alcoholic fermentation.
  • pools of alleles are defined and are designated by the following acronyms: Q2demal, Q2mal, Q4demal, Q4mal, Q6demal, Q6mal, Q7demal, Q7mal, Q6c and Q7c.
  • the numbers (2, 4, 6 or 7) correspond to the number of locations taken into account in each pool.
  • the Q2demal, Q4demal, Q6demal and Q7demal pools contain only alleles linked to the demalizing trait.
  • the Q2mal, Q4mal, Q6mal and Q7mal pools only contain alleles linked to the malignant trait.
  • the Q6c and Q7c pools contain the pooled Q4demal alleles with 2 and 3 missing alleles, respectively.
  • the method according to the invention advantageously comprises genotyping implementing a detection of polymorphism at the level of a nucleotide (SNP) by mass spectrometry, preferably according to the technology qualified as sequenom® ( sequenom®IPLEX® Gold) with the MassARRAY® Analyzer Chip Prep Module 384 apparatus, marketed by the company Agena Biosciences® and according to the protocol described in the article by Gabriel S. et al., 2009, Current Protoco / s in Human Genetics, Suppl. 60. (doi.org/10.1002/ 0471142905. hg0212s60).
  • SNP nucleotide
  • the design of the primers is carried out by the MassARRAY® Assay Design tool (version 4.0.0.2) allowing to amplify fragments of less than 120 bases and by selecting mass differences between alleles between 16 and 70 Da. About 15 ng of DNA are needed to genotype individuals using the MassARRAY® iPLEX® platform (Agena Biosciences®).
  • the method according to the invention advantageously comprises a step of isolating at least one strain.
  • the method according to the invention advantageously comprises a step of isolating at least two strains, respectively designated by the letters X and Z, for example the X28 and Z8 clones, from the descendants of two populations from hybrids obtained: for example, by crossing strains A and B on the one hand, and strains C and D on the other hand.
  • the hybrids and their descendants are obtained according to steps 1 and 3 as described above in the context of the invention.
  • said two clones X28 and Z8, obtained according to the method according to the invention are crossed and the resulting hybrid is sporulated in order to obtain large offspring by implementing steps 1 and 3 as described above. .
  • the DNA of this progeny is extracted by a method described by Albertin et al.
  • the present invention also relates to a use of a Saccharomyces cerevisiae yeast comprising a strain as described above in the context of the present invention for modifying the pH of a wine, and preferably for increasing the pH of a wine.
  • the method according to the invention advantageously comprises a step of isolating at least two strains, respectively designated by the letters X and Z, for example the clones X8 and Z1, derived from the progeny of two populations resulting from hybrids obtained: for example, by crossing strains A and B on the one hand, and strains C and D on the other hand.
  • the hybrids and their descendants are obtained according to steps 1 and 3 as described above in the context of the invention.
  • said two clones X8 and Z1, obtained according to the method according to the invention are crossed and the resulting hybrid is sporulated in order to obtain a large progeny by implementing steps 1 and 3 as described above. .
  • the DNA of this progeny is extracted by a method described by Albertin et al. which allows rapid extraction compatible with the sequenom® genotyping technique (Albertin et al., 2018, Yeast, 35, 141-156).
  • sequenom® described in detail in the experimental part.
  • the selection of clones having an appropriate genotype makes it possible to choose individuals with an extreme phenotype without resorting to fermentation tests.
  • the present invention also relates to a use of a Saccharomyces cerevisiae yeast comprising a strain as described above in the context of the present invention for reducing the pH of a wine.
  • YGL037C, and YBL036C are those described in the SGD database (Saccharomyce Genome Database - www.yeastgenome.org-).
  • H2 hybrid by crossing two strains C and D of the species Saccharomyces cerevisiae according to a method described in Marullo, P. et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8: 1148-1160 : the H2 hybrid obtained is the product of the conjugation of spores resulting from the crossing between strain C and strain D.
  • Isolation of an X28 clone From the H1 hybrid resulting from the crossing of strains A and B, the X28 descendant from a population of 94 descendants isolated by micromanipulation is isolated (Marullo et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8: 1148-1160). This technique consists of dissecting yeast asci formed from a culture on Potassium Acetate ACK medium for 3 days at 24 ° C. The asci are digested with cytohelicase (2mg / mL) and the spores are isolated using a micromanipulator (Singer TM MS200). The malic acid content of the 94 descendants is measured at the end of alcoholic fermentation, which fermentation is carried out as follows:
  • the fermentations were carried out in 20 ml flasks marketed by the company Fisher Scientific® under the reference 20-HSV. They were used to ferment 10 mL of must from the Merlot 2 sample with a starting malic acid content of 2.280 g / L.
  • the vials were closed with screw caps with a 3 mm HT silicone / PTFE septum marketed by Fisher Scientific®. Hypodermic needles were inserted into the septum for the release of CO 2 .
  • the fermentations were initiated with the inoculation of 2.10E6 viable cells.mL -1 of culture in liquid phase (YPD) carried out in 1 mL deepwell microplates marketed by the company Fisher Scientific®.
  • the concentration of viable cells was estimated by flow cytometry using an apparatus of the Cell Lab Quanta TM brand sold by the company Beckman Coulter®.
  • the fermentation temperature was maintained at 24 ° C. using an incubator sold by the company Binder TM GmbH.
  • the flasks are placed under agitation at 175 rpm. / min. during fermentation using an orbital stirrer such as that marketed by the company Stuart® under the reference SSL1. Details of the method are given in the article by Peltier et al. , 2018, PLOS ONE, 13 (1), 191353. (https://doi.org/10.1101/191353).
  • the percentages of consumption indicated in the present description are calculated relative to the total content of malic acid present at the start in the sample considered.
  • the distribution of the content of malic acid consumed - on the abscissa, expressed as a percentage by mass calculated relative to the total mass of malic acid present at the start - is shown in FIG. 1 for the progeny of H1 and in particular for the X28 clone in the Merlot must of the Merlot 2 sample.
  • Isolation of a Z8 clone In the same way as for the H1 hybrid, the H2 hybrid obtained by crossing the strain C and D. From its progeny (obtained as described above in the context of obtaining X28) the Z8 clone is isolated, which also exhibits an extreme phenotype for the consumption of malic acid.
  • the distribution of the content (said content being expressed as a percentage by mass calculated relative to the total mass of malic acid present at the start) of malic acid consumed is shown in FIG. 1 for the progeny of H2 and in particular for the Z8 clone. in the Merlot must of the Merlot 2 sample.
  • Strain B is a strain which degrades the most malic acid with 45% degraded malic acid in comparison with strains A, C and D.
  • the level of malic acid consumption of strains X28 and Z8 is shown in Figure 2 (in which the values read on the ordinate correspond to the average percentage of malic acid consumed in a must of Merlot (Merlot 2) and Sauvignon Blanc (Sauvignon Blanc 1), the initial malic acid contents of which are respectively estimated at 2.28 and 4.32 g / L); malic acid consumption values are also shown for the four parental strains A, B, C and D and for the H1 and H2 hybrids.
  • the selected X28 clone shows a consumption percentage of 66%, which illustrates the effectiveness of the crossing / selection methods implemented within the framework of the invention to improve the quantitative characteristics.
  • the level of malic acid consumption of strains X8 and Z1 is shown in Figure 12 (in which the values read on the ordinate correspond to the average percentage of malic acid consumed in a must of Merlot (Merlot 2) and Sauvignon White (Sauvignon Blanc 1), the initial malic acid contents of which are respectively estimated at 2.28 and 4.32 g / L); malic acid consumption values are also shown for the four parental strains A, B, C and D and for the H1 and H2 hybrids.
  • FIG. 12 shows that the consumption phenotype is extreme for the strains X8 and Z1, in comparison with the consumption phenotype of the other strains.
  • the selected X8 clone shows a slight production of malic acid at the end of fermentation, which results in a negative content of the consumption percentage of -10%.
  • cassettes are amplified by PCR (acronym for “Polymerase Chain Reaction”) using as template the genomic DNA of the strains of the Euroscarf deletion collection (http://euroscarf.de) previously deleted for the gene in question. .
  • the cassettes were amplified with the 500 bases upstream and downstream of the target gene, 5 'and 3' of the coding sequence.
  • the H1 hybrid was transformed with the cassettes using the protocol described by Gietz, et al., 2007, Nature Protocols, 2 (1), 31-34. (https://doi.org/10.1038/nprot.2007.13).
  • the DNA of each descendant is advantageously extracted using extraction kits such as the DNA-Wizard Promega kit according to the protocol described in Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • Amplification is carried out with a kit, preferably the Nextera XT kit or any other kit suitable for the sequencing of small genomes.
  • the procedure used makes it possible to index 96 individuals using specific DNA primers and to amplify the DNA in order to construct a Library for Illumina sequencing.
  • the protocol used is that provided by the manufacturer, it is described in Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • Genotyping is then carried out which implements sequencing, which sequencing is carried out using a sequencing kit which consists firstly in amplifying the DNA in order to construct a Library for Illumina sequencing such as described above.
  • the amplification described above is carried out, and, it is followed by the complete sequencing of the genome of each descendant using an Illumina MySeq apparatus using the MySeq Reagent Kit V2 sequencing kit (Pair End 2x250 bases) according to the prescriptions supplied by the manufacturer as described in Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
  • the sequence reads obtained are preferably filtered by bioinformatics methods using the FASTX-Toolkit suite (http: // hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  • the readings selected have the quality parameter Q> 20, which defines an error rate of less than 1%. These readings are then aligned with the BWA software (Li, H., and R. Durbin, 2010. Bioinformatics 26 (5): 589-595) on the reference genome S288C (sacCer3, version April 2011) available on the basis of SGD data (https://www.yeastgenome.org/).
  • the SAM tools suite described in the article by Li, H. et al., 2009, Bioinformatics, 25, 2078-2079, the SNPs of each of the descendants are identified and positioned on the genome by the pileup software. These SNPs allow the construction of a very dense genetic map made up of 1000 bi-allelic markers. The method of construction of this type of map and the bioinformatic tools used are described in the article Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-
  • a genetic mapping is then carried out, which mapping establishes a statistical link between the inheritance of genetic markers and the variation of a quantitative trait.
  • the genetic markers which are statistically related are "quantitative trait loci" which the English translation is “Quantitative Trait Loci”, with a commonly used acronym which is "QTL”; such QTLs are described in particular in application EP 2 183364.
  • the methods for detecting QTL in yeasts are described in the literature, for example in the article published by Peltier et al., 2018, BMC Genomics 19, 772.
  • Bi-allelic markers identified during genotyping are used to carry out genetic mapping.
  • a statistical link is found between the variation in quantitative character and four genetic markers with a very high significance level (ll_150, XV_1052, IV_31 and IV_360, see table 2).
  • H3 hybrid Genetic selection of the progeny of the H3 hybrid: a cross between the Z8 and X28 clones is then carried out to give the H3 hybrid according to the same protocol as that described above for obtaining the H1 and H2 hybrids . From this H3 hybrid, bulk spores are isolated by a process using the hydrophobicity of their wall, and which is detailed in the description which follows directly.
  • a spore preparation is obtained after 3 days of culture on potassium acetate (ACK) medium at 1% by mass at a temperature of 24 ° C .; then these spores are digested in a cytohelicase preparation (2 mg / mL) and the spores are purified by carrying out successive washings with water and with an aqueous solution of Nonidet P40 (also known by its name given by the IUPAC classification: " octylphenoxypolyethoxyethanol ') at 0.01%.
  • the degree of spore enrichment varies from 80 to 99% depending on the samples. From this preparation, colonies are isolated on a petri dish. In the present case, substantially 1000 descendants are isolated. The DNA of these descendants is extracted by a method described by Albertin et al. (Albertin et al., 2018, Yeast, 35, 141-156) which allows rapid extraction compatible with the sequenom® genotyping technique.
  • the phenotypes of the 1000 descendants isolated from the H3 hybrid are evaluated by the sequenom® method according to the protocol described by Gabriel S. et al., 2009, Current Protocol in Human Genetics, Suppl. 60. (doi.org/10.1002/ 0471142905. hg0212s60): the design of the primers is carried out by the MassARRAY® Assay Design version 4.0.0.2 tool allowing to amplify fragments of less than 120 bases and by selecting mass differences between alleles between 16 and 70 Da. Approximately 15 ng of DNA is required to genotype individuals using the MassARRAY® IPLEX platform (Agena Bioscience®).
  • the PCR products are analyzed by mass spectrometry and the size of the alleles of each amplifiate is estimated using software from the MassARRAY® System suite.
  • the genotyping is carried out on the allelic pools Q2demal, Q4demal, Q6demal and Q7demal which contain only alleles linked to the demalinizing trait.
  • the individuals who are sought individuals carrying the Q4demal allelic pool which comprises the following alleles: Q4demal: YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p .Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala).
  • the individuals exhibiting the Q4demal allelic combination are analyzed for their fermentation properties. These 53 individuals have an average value of 56.15% degraded malic acid with 25% of individuals showing malic acid consumption.
  • Met419Leu degrade more malic acid at the end of fermentation than those carrying the Q6c control pool: YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C ( p.lle605Val) + YOR090C (p. Met419).
  • the selection on the basis of the genotype of the descendants of the H3 and H4 hybrids using the Q2demal, Q4demal, Q6demal and Q7demal pools makes it possible to identify individuals who have a very high degraded malic acid value.
  • the selection of individuals from the same populations exhibiting the Q2mal, Q4mal, Q6c and Q7c pools allows the selection of individuals degrading a smaller mass of malic acid calculated in relation to the total mass present at the start (see Table 4). The numbers and average values of the pools are presented in Table 4.
  • L-malic acid is quantified by enzymatic assay after observing the complete cessation of alcoholic fermentation according to the method described in Peltier, et al., 2018, PLOS ONE, 13 (1), 191353 (https: // doi .org / 10.1101 / 191353) using an enzymatic kit in accordance with the OIV-OENO-599-2018 method (Compendium of international methods of analysis - International Organization of Vine and Wine).
  • This colorimetric assay is based on the measurement of the absorbance at 340 nm by UV spectrophotometry.
  • H5 hybrid Genetic selection of a strain producing malic acid in the progeny of the H5 hybrid: a cross between the Z1 and X8 clones is then carried out to give the H5 hybrid according to the same protocol as that described above for obtaining the hybrids H1 and H2, H3 and H4. From this H5 hybrid, a preparation of spores is obtained according to the protocol linked to the hydrophobicity of their wall according to the method detailed for progeny of hybrids H3 and H4. From this preparation, 1000 progeny are isolated from which DNA is extracted according to details given for the progeny of the H3 and H4 hybrids.
  • the genotype of the descendants isolated from the H3 H4 and H5 hybrids is evaluated by the sequenom® method and relates to the allelic pools Q6mal and Q7mal which contain only alleles linked to the missing trait.
  • the numbers and average values of the pools are presented in Table 5.
  • the average value reached for the Q6mal pool is -8%, that is to say that the yeast produces 8% more malic acid than that initially contained in the must. This production is greater than that of all the commercial yeasts, the distribution of which is shown in figure 3.
  • the results synthesized in figure 13 show the difference in malic acid at the end of fermentation which exists between the strains carrying the allelic pools Q6mal and Q6demal overall descendants. These results are confirmed by the Wilcoxon statistical test, under the conditions described in Frank Wilcoxon, “Individuel compensons by ranking methods”, Biométries Bulletin (en), vol. 1, n ° 6, 1945, p. 80-83, which indicates a significant difference between the groups.
  • the individuals which present the allelic combination Q7mal YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W (p .Glu165) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419) + YBR218C (p.Glu722) are analyzed for their fermentation properties. Individuals carrying the Q7mal pool show an additional production of malic acid compared to the initial quantity of malic acid contained in the must. This parameter is expressed as a final mass percentage calculated relative to the total mass of malic acid present at the start.
  • the average value reached for the Q7mal pool is -22%, that is to say that the yeast produces 22% more malic acid than that initially contained in the must. Quite remarkably, individuals FMGS3_191 and FMGS3_13 respectively produce 37 and 42% more malic acid than the content initially contained in the must.
  • Figure 13 it is shown that there is a difference between the strains carrying the Q7mal and Q7demal allelic pools in all the offspring.
  • a cabemet sauvignon must is vinified with the strains FMGS3_191 and FMGS3_13 which carry the Q7mal pool as well as the control strains A, B and X8.
  • the malic acid content is measured at the end of alcoholic fermentation.
  • the values of the y-axis are expressed in mass concentration of acid malic per liter.
  • the horizontal line indicates the initial malic acid content of the must, which is 3.34 g / L.
  • the strains FMGS3_191 and FMGS3_13 produce a remarkable quantity of malic acid much greater than that of the strain X8 which is the best performing descendant of the H1 and H2 hybrids.

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Abstract

Souche de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae comprenant au moins un polymorphisme de séquence peptidique dans au moins une des séquences des protéines codées par les gènes sélectionnés parmi les onze gènes YLL041C, YGL008C, YDL054C, YKL029C, YDL021W, YOR380W, YOR090C, YBR218C, YGL037C, YBL036C et YDL237W.

Description

Description
Titre de l'invention : Levures œnologiques permettant le contrôle de la teneur en acide des vins et méthodes de sélection de telles levures
[0001] La présente invention est du domaine des levures destinées à être utilisées dans l’industrie agroalimentaire, et vise en particulier des levures destinées à être utilisées dans la biotransformation du jus de raisin en vin. Le jus de raisin adapté à la vinification étant communément qualifié de moût de raisin. La présente invention concerne plus particulièrement, mais non exclusivement, un procédé de sélection de levains du genre Saccharomycese\ en particulier de l’espèce Saccharomyces cere visiae afi n de mieux contrôler le pH du produit de la fermentation du jus de raisin en vin et ceci en sélectionnant leur aptitude à dégrader (ou à produire) des acides organiques et en particulier l’acide malique et l’acide succinique.
[0002] La teneur de l’ensemble des acides organiques du vin contribue de manière importante à son acidité finale et donc au pH final ce qui est un paramètre important de sa qualité organoleptique. Le jus de raisin comporte naturellement de nombreuses substances organiques, et entre-autres des acides organiques tels que l’acide malique et l’acide tartrique. L’acidité du jus de raisin et des vins préparés à partir de ce jus, est étroitement dépendante de la teneur de ces deux acides. Les teneurs en acide malique dans le raisin diminuent au cours de sa maturation pour atteindre des valeurs de 2 à 7 g/L au moment de la maturité. De plus, lors de la transformation du jus de raisin en vin, les levures peuvent dégrader partiellement l’acide malique et produire d’autres acides organiques tel que l’acide succinique et l’acide pyruvique qui vont à leur tour modifier l’acidité du vin. A noter que, dans la plupart des vins rouges et certains vins blancs il est important de dégrader complètement l’acide malique afin de maîtriser l’équilibre acide des vins. En œnologie, la teneur en acide malique est principalement contrôlée par la fermentation malo-lactique réalisée par les bactéries lactiques en particulier par Oenococcus oeni Cette fermentation a lieu après la fermentation alcoolique, et peut être initiée en utilisant des levains industriels inoculés dans le vin ou dans le moût en fermentation.
Cependant, le succès de l’implantation de telles bactéries dans le vin n’est pas facilement reproductible, surtout dans des conditions extrêmes comme par exemple avec un pH faible, une présence de SO2, et/ou un degré alcoolique fort.
[0003] D’autres méthodes ont été mise en œuvre, telles que l’expression dans la levure Saccharomyces cerevisiae à la fois de l’enzyme malo-lactique de Oenococcus oeni et du transporteur d’acide malique de Schizosaccharomyces pombe, qui permettent à la levure de dégrader de manière complète l’acide malique lors de la fermentation alcoolique comme cela est décrit dans l'article de Volschenk et al., publié dans Nat. Biotechnol, 1997, Mar, 15(3), 253-257. Les contraintes réglementaires liées au statut d’organisme génétiquement modifié (OGM) de la souche de levure, interdisent l’utilisation de cette méthode dans la plupart les pays producteurs de vins, et des alternatives efficaces doivent donc être trouvées. Une de ces alternatives consistant à employer d’autres espèces de levure comme la fermentation du vin par la levure Schizosaccharomyces pombe qui est capable de consommer la totalité de l’acide malique, est décrite dans l’article de Taillandier et al., Journal of Biotechnoiogy, 1995, 40, 3, 199-205. Cependant, cette espèce Schizosaccharomyces pombe produit des composés indésirables qui ne sont pas compatibles avec la production industrielle de vin, et son utilisation ne peut donc pas être considérée comme une alternative efficace.
[0004] Le brevet EP 2 183364 décrit l’utilisation de l’espèce Saccharomyces cerevisiae avec une sélection au sein de la variabilité génétique de l’espèce de caractères œnologiques liés à la production de phénols volatils. L’espèce Saccharomyces cerevisiae présente une variabilité génétique naturelle particulièrement attractive, mais jusqu’alors aucun candidat permettant une réduction significative de l’acide malique n’a été convenablement sélectionné et aucune souche pouvant consommer la quasi-totalité de l’acide malique, avec à tout le moins une réduction significative de l’acide malique d’au moins 50% n’a pu être convenablement identifiée. Par ailleurs cette espèce peut dans certain cas produire de faibles quantités d’acide malique tel que décrit dans Yeramian et al. J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 3, 2007 912-919. Cependant le niveau de production d’acide malique de ces souches reste inférieur ou égal à 0.7 g/L.
[0005] Pour remédier à tout ou partie des inconvénients de l’état de la technique précitée, la présente invention concerne une souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae comprenant au moins un polymorphisme de séquence peptidique dans au moins une des séquences des protéines codées par les gènes sélectionnés parmi les onze gènes YLL041C (SDH2), YGL008C (PMA 1), YDL054C (MCH1), YKL029C (MAE 1), YDL021W (GPM2), YOR380W (RDR1), YOR090C (PTC5), YBR218C (PYC2), YGL037C (PNC1), YBL036C et YDL237W (AiM6), lesquels sont localisés sur les chromosomes (chr) 2, 4, 7, 11, 12 et 15 . Dans le cadre de l’invention, un polymorphisme d’une séquence peptidique est de préférence lié à un polymorphisme unique de séquence (connu sous l’acronyme anglo saxon « SNP », signifiant « single nucléotide polymorphism ») ou une succession de plusieurs polymorphismes unique de séquence au niveau de la séquence nucléique du gène codant pour cette protéine. Les séquences génétiques et/ou peptidiques sont celles identifiées dans la base de donnée Saccharomyces GENOME DATABASE (SGD) pour la souche S288C et correspondent, plus particulièrement, aux séquences détaillées dans la partie « liste de séquences » ( sequence listing) de la présente description. [0006] Les inventeurs ont mis en évidence de manière tout à fait inattendue que l’utilisation de marqueurs génétiques permettait d’accélérer la sélection d’individus performants sans réaliser des tests fermentaires. Une telle sélection permet d’obtenir pour sensiblement la moitié des individus concernés, une nette modification du taux d’acide malique consommé et une modification du pH du vin résultant.
[0007] Avantageusement, la souche de levure selon l’invention comprend au moins un, de préférence de un à six, polymorphismes de séquence peptidique au niveau des acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Asp200) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C, l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C, l’acide aminé (Met419) au niveau de la protéine codée par le gène YOR090C, l’acide aminé (Glu722) de la protéine codée par le gène YBR218C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W. De préférence, ladite souche comporte le polymorphisme de séquence peptidique au niveau de l’acide aminé (Asp200) de la protéine codée par le gène YGL008C.
[0008] Avantageusement, la souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae comprend au moins un polymorphisme de séquence peptidique dans la séquence de chacune des protéines codées par les deux gènes YLL041C et YGL008C localisés sur les chromosomes 7 et 12 Une telle sélection des individus permet d’obtenir une teneur d’acide malique consommée moyenne, qui est prise sur l’ensemble de la population, et qui est supérieure à 51%, en étant exprimée en pourcentage massique calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ. De préférence, ladite souche comprend deux polymorphismes de séquence peptidique au niveau de deux acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys 158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Asp200) de la protéine codée par le gène et YGL008C et l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C.
[0009] Avantageusement, la souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’invention comprend au moins un polymorphisme de séquence peptidique dans la séquence de chacune des protéines codées par les quatre gènes YLL041C, YGL008C, YDL054C et YDL237W localisés sur les chromosomes 4, 7 et 12 . Une telle sélection des individus permet d’obtenir une teneur d’acide malique moyenne (prise sur l’ensemble de la population) consommée supérieure à 54% calculée par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ. De préférence, ladite souche comprend quatre polymorphismes de séquence peptidique au niveau de quatre acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys 158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
[0010] Avantageusement, la souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’invention comprend au moins un polymorphisme de séquence peptidique dans chacune des séquences de cinq à six protéines codées par les sept gènes YLL041C, YGL008C, YDL054C, YKL029C, YOR090C, YBR218C et YDL237W localisés sur les chromosomes 2, 4, 7, 11, 12 et 15. Une telle sélection des individus permet d’obtenir une teneur d’acide malique consommée supérieure à 58.5% (prise sur l’ensemble de la population) calculée par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ. [0011] De préférence, ladite souche comprend cinq polymorphismes de séquence peptidique au niveau de cinq acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C, l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C, l’acide aminé (Met419) au niveau de la protéine codée par le gène YOR090C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
[0012] De préférence, ladite souche comprend six polymorphismes de séquence peptidique au niveau de six acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C, l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C, l’acide aminé (Met419) au niveau de la protéine codée par le gène YOR090C, l’acide aminé (Glu722) de la protéine codée par le gène YBR218C et l’acide aminé (Glu165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
[0013] De préférence, ladite souche comprend de deux à six substitutions d’acides aminés dans le génome de référence parmi les suivantes: (Glu 158) de la protéine codée par le gène YLL041C, (Leu74) de la protéine codée par le gène YGL008C, (Leu63) de la protéine codée par le gène YDL054C, (Leu419) de la protéine codée par le gène YOR090C, (Lys722) de la protéine codée par le gène YBR218C et (Ala165) de la protéine codée par le gène YDL237W. Une telle sélection de souche est avantageusement utilisée pour obtenir une forte diminution du taux d’acide malique, et augmenter le pH d’un vin. Une telle sélection des individus permet d’obtenir une teneur d’acide malique consommée au delà de 80% et qui produisent un vin dont le pH est modifié d’une valeur pouvant atteindre 0.4 unités selon les souches à partir du même jus de raisin de départ.
[0014] De préférence, ladite souche comprend de une à deux substitutions d’acides aminés dans le génome de référence parmi les suivantes : (Glu200) de la protéine codée par le gène et YGL008C et (Val605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C. Une telle sélection de souche permet d’obtenir une forte augmentation d’acide malique, et de diminuer le pH d’un vin. Une telle sélection de souche est avantageusement utilisée pour obtenir une forte augmentation du taux d’acide malique, et diminuer le pH d’un vin. Une telle sélection des individus permet d’obtenir une production d’acide malique supérieure à 35 % de la valeur d’acide malique initialement présent. Cette production permet de diminuer le pH du vin d’une valeur pouvant atteindre 0.4 unités selon les souches utilisées à partir du même jus de raisin de départ.
[0015] La présente invention concerne également un procédé de sélection de souches de levures œnologiques telles que décrites précédemment dans le cadre de la présente invention comportant les étapes consistant à :
1- réaliser une hybridation par croisement de deux souches œnologiques A et B de l’espèce Saccharomyces cerevisiae ;
2- identifier les allèles responsables de la consommation de l’acide malique en éliminant une des deux copies parentales en réalisant un hybride hémizygote par insertion d’un gène de résistance à un antibiotique ;
3- obtenir des descendants méiotiques issus des hybrides de l’étape 1- par l’induction de la sporulation et isolement des spores ;
4- déterminer le phénotype des descendants obtenus dans l’étape 3- pour la consommation d’acide malique ;
5- extraire l’ADN des descendants obtenus à l’étape 3- ;
6- effectuer un génotypage du génome des descendants permettant de connaître le génotype d’au moins deux locus ; 7- réaliser une cartographie génétique à partir des données obtenues à l’étape 4- et à l’étape 6- ; et
8- sélectionner au moins un groupe d’individus parmi les individus porteurs d’allèles démaliquants et les individus porteurs d’allèles manquants.
[0016] Dans le cadre de la présente invention, le terme « sélection » signifie l’identification et l’isolement de levures œnologiques, c'est-à-dire des levures intervenant dans le processus de fabrication du vin, et notamment dans le métabolisme des acides et des bases présentes dans les vins.
[0017] Le terme « allèle démaliquant » signifie l’allèle qui confère une plus forte consommation de la teneur d’acide malique au cours de la fermentation alcoolique. Alternativement, le terme « allèle maliquant » signifie l’allèle qui confère une plus faible consommation de la teneur d’acide malique au cours de la fermentation alcoolique, voire une production d’acide malique au cours de la fermentation alcoolique.
[0018] Le terme « génotyper », signifie déterminer l’hérédité d’une portion d’ADN à un point précis du génome. Dans le cadre de la présente invention, le génotypage correspond à l’identification d’une séquence nucléotidique qui est associée au caractère démaliquant ou au caractère maliquant.
[0019] L’étape 1- consiste, de préférence, en l’obtention d’un hybride par croisement de deux souches A et B de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon la méthode d’appariement de spores au micromanipulateur décrite dans l’article de Marullo et al. (Marullo et al. 2009 FEMS Yeast Research, 9, 8 :1148-1160). L’hybride obtenu est appelé H1, il est le produit de la conjugaison de spores issues du croisement entre la souche A et la souche B. L’hybride H1 obtenu est hétérozygote en de nombreux points de son génome.
[0020] Avantageusement, la technique des hybrides hémizygotes mise en œuvre à l’étape 2- est la méthode décrite dans l’article de Steinmetz et al., 2002, Nature, 416, 6878 :326-330. Le principe de ladite méthode consiste à éliminer par recombinaison homologue une des deux copies parentales du gène étudié, en insérant au locus dudit gène étudié, un gène de résistance à un antibiotique. Ainsi les hybrides hémizygotes n’expriment qu’une seule des deux copies parentales du gène étudié. S’il existe une différence significative (au seuil de 10%) entre les deux hybrides, l’allèle a un effet sur le phénotype étudié. Les gènes testés dont l’effet est significatif sur le pourcentage de consommation d’acide malique en fin de fermentation alcoolique sont présentés dans le tableau 1. L’acide L-malique est quantifié par dosage enzymatique après avoir observé l’arrêt complet de la fermentation alcoolique selon la méthode décrite dans Peltier, et al., 2018, PLOS ONE, 13(1), 191353 (https://doi.org/10.1101/191353). L’allèle noté DEMAL est celui qui consomme le plus d’acide malique, l’allèle noté MAL est celui qui préserve le plus la teneur en acide malique. Les résultats présentés ont été mesurés dans un moût de Merlot (échantillon Merlot 2 du tableau 1) et dans un moût de Sauvignon (échantillon Sauvignon Blanc 1 du tableau 1) dont les teneurs en acides maliques initiales sont respectivement estimées à 2,28 et 4,32 g/L.
[0021] [Tableau 1]
[0022] *La colonne (a) représente le nombre de répétitions par groupes
[0023] Ainsi les inventeurs ont mis en évidence de manière tout à fait inattendue que l’utilisation de variations génétiques naturelles peut permettre de diminuer ou d’augmenter la teneur en acide malique des vins en fin de fermentation alcoolique.
[0024] Avantageusement, l’étape 3- est réalisée par une microdissection ou une purification en masse de spores. L’étape 3- comporte une induction de la sporulation d’un hybride, le susdit hybride H1, sur un milieu comprenant de préférence de l’acétate de potassium à 1% pendant 3 jours à 24°C. L’utilisation de la microdissection des ascospores est de préférence réalisée à l’aide d’un micromanipulateur, par exemple selon la méthode publiée dans Marullo et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8 :1148-1160. Alternativement, les ascospores sont isolés en masse après une purification partielle en utilisant de préférence la méthode publiée dans l’article de Curran B.P.G. et al., 2006, « Basic Investigations in Saccharomyces cerevisiae », Methods in Molecular Biology, vol 313, 1-13.
[0025] Chacunes des variations hétérozygotes retrouvées chez l’hybride H1 ségrégé au sein de sa descendance.
[0026] De préférence, à l’étape 4- le niveau d’acide malique consommé est mesuré en fin de fermentation alcoolique par un test enzymatique. La mesure du pourcentage d’acide malique consommé pour un ensemble de 94 descendants de l’hybride H1 est réalisé par dosage enzymatique de l’acide L-malique après avoir observé l’arrêt complet de la fermentation alcoolique selon la méthode décrite dans Peltier et al., 2018, PLOS ONE, 13(1), 191353 (https://doi.Org/10.1101/191353). [0027] A l’étape 5- l’ADN des descendants est extrait. L’ADN de chaque descendant est avantageusement extrait en utilisant des kits d’extraction tels que le kit DNA-Wizard Promega selon le protocole décrit dans Marti- Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
[0028] Avantageusement, une amplification de l’ADN génomique est réalisée entre les étapes 5- et 6-. Une amplification est réalisée avec un kit, de préférence le kit Nextera XT ou tout autre kit adapté pour le séquençage de petits génomes. La procédure utilisée permet d’indexer grâce à des amorces d’ADN spécifiques, 96 individus et d’amplifier leur ADN afin de construire une Library pour un séquençage Illumina. Le protocole utilisé est celui fourni par le fabricant, il est décrit dans Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399- 412.
[0029] Avantageusement, le génotypage effectué à l’étape 6- met en œuvre un séquençage, lequel séquençage est réalisé de préférence à l’aide d’un kit de séquençage qui consiste dans un premier temps à amplifier l’ADN afin de construire une Library pour le séquençage Illumina MySeq à l’aide du kit de séquençage (Pair End 2x250 bases) MySeq Reagent Kit V2 selon les prescriptions fournies par le constructeur comme décrit dans Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412. Les lectures de séquences obtenues sont de préférence filtrées par des méthodes bio-informatiques en utilisant la suite FASTX-Toolkit (http:// hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). Les lectures retenues (qualité Q>20) sont ensuite alignées avec le logiciel BWA (Li, H., and R. Durbin, 2010. Bioinformatics 26(5): 589-595) sur le génome de référence S288C (sacCer3, version avril 2011). A l’aide de la suite d’outils SAM tools décrite dans l’article de Li, H. et al., 2009, Bioinformatics, 25, 2078-2079, les SNP de chacun des descendants sont identifiés et positionnés sur le génome par le logiciel Pileup. Ces SNP permettent la construction d’une carte génétique très dense constituée de 1000 marqueurs bi alléliques. La méthode de construction de ce type de carte et les outils bioinformatiques utilisés sont décrits dans l’article Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
[0030] Avantageusement, la cartographie génétique utilisée à l’étape 7- du procédé selon l’invention est une méthode qui établit un lien statistique entre l’hérédité de marqueurs génétiques et la variation d’un caractère quantitatif. Les marqueurs génétiques qui sont statistiquement liés sont des « locus de caractère quantitatifs » (dont la traduction anglaise est « Quantitative Trait Loci », avec l’acronyme associé « QTL ») tels que ceux décrit dans la demande EP 2 183 364. Les méthodes de détection de QTL chez les levures sont décrites dans la littérature, par exemple dans l’article publié par Peltier et al., 2018, BMC Genomics 19, 772.
A l’étape 7- les marqueurs bi-alléliques (ils sont de l’ordre du millier) de l’étape 6- sont utilisés pour réaliser la cartographie génétique. Un lien statistique est trouvé entre la variation du caractère quantitatif et quatre marqueurs génétiques avec un seuil de significativité très important (ll_150, XV_1052, IV_31 et IV_360). Un seuil de significativité avec un taux de fausse découverte de 5% est calculé à partir des données permutées : il est de pval = 0.0004 pour le pourcentage d’acide malique consommé. Le test statistique utilisé est basé sur cartographie par la méthode dite de " interval mapping" en utilisant une régression de Haley-Knott (Peltier et al. 2018. , BMC Genomics 19, 772). La position génomique des marqueurs, le gène concerné et la valeur de la probabilité du test (risque de première espèce) sont listés dans le tableau 2. Pour chaque marqueur on indique également l’effet de l’allèle MAL et DEMAL exprimé en pourcentage d’acide malique consommé. L’allèle DEMAL correspondant au « caractère démaliquant » qui signifie l’allèle qui confère le phénotype responsable de l’élimination de la plus forte teneur d’acide malique (à l’inverse de l’allèle MAL).
[0031] [Tableau 2]
[0032] *NP : non pertinent
[0033] Ainsi, à partir des résultats obtenus suite à l’identification des allèles MAL et DEMAL (étape 2- du procédé) et de la cartographie des QTL chez l’hybride H1 (étapes 3- à 7-) les gènes et/ou les QTL présentant des variations nucléotidiques qui sont liées au pourcentage massique de consommation de l’acide malique au cours de la fermentation alcoolique du jus de raisin par la levure Saccharomyces cerevisiae sont directement identifiés.
[0034] Ces variations nucléotidiques affectent la séquence des gènes YDL237W, YDL054C, YKL029C, YDL021W, YOR380W, YBR218C, YOR090C, YLL041C i YGL037C, YGL008C et YBL036C. Ces variations de séquence nucléotidique peuvent être aisément génotypées au sein d’une large population d’individus par des méthodes de typage génétique, c'est-à-dire toute méthode de biochimie ou de biologie moléculaire capable de renseigner la présence d’une variation de séquence nucléotidique ou protéique tel que la PCR, le séquençage d’ADN, le séquençage de protéine, et/ou une méthode basée sur la détection de SNP mettant en œuvre de la spectrométrie de masse, selon la technologie qualifiée de sequenom® Gabriel, S., 2009, Current Protocole in Human Genetics, Suppl. (60. doi.org/10.1002/ 0471142905. hg0212s60).
[0035] A partir de la séquence génomique des souches A et B de l’espèce Saccharomyces cerevisiae, présentées précédemment dans le cadre de l’invention, certaines variations nucléotidiques qui affectent la séquence des protéines codées par les gènes présentés précédemment dans le cadre de l’invention ( YDL237W, YDL054C, YKL029C, YDL021W, YOR380W, YBR218C, YOR090C, YLL041C, YGL037C, YGL008C et YBL036C), sont déduites. Le tableau 3 établit le lien entre les allèles et un phénotype observé. [0036] Les allèles MAL et DEMAL utilisés sont déterminés à partir de la séquence de référence sacCer3 ( sacCer3, version avril 2011) issue de la souche S288C et disponible sur la base de données SGD (« Saccharomyces Genome Data base ») avec un lien accessible via https://www.yeastgenome.org/. La nomenclature utilisée est celle de la description des mutations génétiques décrite dans l’article de den Dunnen JT et al., 2000, Human Genome Variation Society, Hum.Mutat. 15:7-12.
[0037] [Tableau 3]
[0038] Afin d’utiliser ces variations de séquences nucléotidiques pour améliorer les souches de levure, on détermine des pools d’allèles qui vont permettre de diminuer ou de préserver la teneur en acide malique des vins en fin de fermentation alcoolique. Plusieurs pools d’allèles sont définis et sont désignés par les acronymes suivants : Q2demal, Q2mal, Q4demal, Q4mal, Q6demal, Q6mal, Q7demal, Q7mal, Q6c et Q7c. Les chiffres (2, 4, 6 ou 7) correspondent au nombre de locus pris en compte dans chaque pool. Les pools Q2demal, Q4demal, Q6demal et Q7demal contiennent uniquement des allèles liés au caractère démaliquant. Les pools Q2mal, Q4mal, Q6mal et Q7mal contiennent uniquement des allèles liés au caractère maliquant. Les pools Q6c et Q7c contiennent le pools d’allèles Q4demal complétés avec respectivement 2 et 3 allèles manquants.
[0039] Pools de deux allèles
[0040] Q2demal : YLL041C(p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu)
[0041] Q2mal : YLL041C(p.Lys158) + YGL008C(p.Asp200Glu)
[0042] Pools de 4 allèles
[0043] Q4demal : YLL041C(p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W(p.Glu165Ala)
[0044] Q4mal : YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W (p.Glu165)
[0045] Pools de 6 allèles
[0046] Q6demal : YLL041C(p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W(p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605)+ YOR090C (p.Met419Leu)
[0047] Q6c : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419)
[0048] Q6mal : YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W (p.Glu165) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419)
[0049] Pool de 7 allèles
[0050] Q7demal : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605)+ YOR090C (p.Met419Leu) + YBR218C( p.Glu722Lys) [0051] Q7c : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p. Met419) + YBR218C (p.Glu722)
[0052] Q7mal : YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W (p.Glu165) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419) + YBR218C (p.Glu722)
[0053] A l’étape 8- le procédé selon l’invention comporte avantageusement un génotypage mettant en œuvre une détection de polymorphisme au niveau d’un nucléotide (SNP) par spectrométrie de masse, de préférence selon la technologie qualifiée de sequenom® (sequenom®IPLEX® Gold) avec l’appareillage MassARRAY® Analyzer Chip Prep Module 384, commercialisé par la société Agena Biosciences® et selon le protocole décrit dans l’article de Gabriel S. et al., 2009, Current Protoco/s in Human Genetics, Suppl. 60. (doi.org/10.1002/ 0471142905. hg0212s60). Le design des primers est réalisé par l’outil MassARRAY® Assay Design (version 4.0.0.2) permettant d’amplifier des fragments de moins de 120 bases et en sélectionnant des différences de masse entre allèles comprises entre 16 et 70 Da. Environ 15 ng d’ADN sont nécessaires pour génotyper les individus en utilisant la plateforme MassARRAY® iPLEX® (Agena Biosciences®).
[0054] Le procédé selon l’invention comporte avantageusement une étape d’isolation d’au moins une souche.
[0055] Le procédé selon l’invention comporte avantageusement une étape d’isolation d’au moins deux souches, respectivement désignées par les lettres X et Z, par exemple les clones X28 et Z8, issus de la descendance de deux populations issues d’hybrides obtenus : par exemple, en croisant les souches A et B d’une part, et des souches C et D d’autre part. Les hybrides et leur descendance sont obtenus selon les étapes 1 et 3 telles que décrites précédemment dans le cadre de l’invention. [0056] Avantageusement, lesdits deux clones X28 et Z8, obtenus selon le procédé selon l’invention, sont croisés et l’hybride résultant est mis à sporuler pour obtenir une vaste descendance en mettant en oeuvre les étapes 1 et 3 telles que décrites précédemment. L’ADN de cette descendance est extrait par une méthode décrite par Albertin et al. qui permet une extraction rapide compatible avec la technique de génotypage du sequenom® (Albertin et al., 2018, Yeast, 35, 141-156). La descendance et ensuite génotypée par la technologie qualifiée de sequenom® décrite en détail dans la partie expérimentale. La sélection de clones ayant un génotype approprié permet de choisir des individus au phénotype extrême sans avoir recours à des tests fermentaires.
[0057] La présente invention concerne aussi une utilisation d’une levure de Saccharomyces cerevisiae comportant une souche telle que décrite précédemment dans le cadre de la présente invention pour modifier le pH d’un vin, et de préférence pour augmenter le pH d’un vin.
[0058] De manière alternative à ce qui précède, le procédé selon l’invention comporte avantageusement une étape d’isolation d’au moins deux souches, respectivement désignées par les lettres X et Z, par exemple les clones X8 et Z1, issus de la descendance de deux populations issues d’hybrides obtenus : par exemple, en croisant les souches A et B d’une part, et des souches C et D d’autre part. Les hybrides et leur descendance sont obtenus selon les étapes 1 et 3 telles que décrites précédemment dans le cadre de l’invention.
[0059] Avantageusement, lesdits deux clones X8 et Z1, obtenus selon le procédé selon l’invention, sont croisés et l’hybride résultant est mis à sporuler pour obtenir une vaste descendance en mettant en oeuvre les étapes 1 et 3 telles que décrites précédemment. L’ADN de cette descendance est extrait par une méthode décrite par Albertin et al. qui permet une extraction rapide compatible avec la technique de génotypage du sequenom® (Albertin et al., 2018, Yeast, 35, 141-156). La descendance et ensuite génotypée par la technologie qualifiée de sequenom® décrite en détail dans la partie expérimentale. La sélection de clones ayant un génotype approprié permet de choisir des individus au phénotype extrême sans avoir recours à des tests fermentaires.
[0060] La présente invention concerne aussi une utilisation d’une levure de Saccharomyces cerevisiae comportant une souche telle que décrite précédemment dans le cadre de la présente invention pour diminuer le pH d’un vin.
[0061] La partie expérimentale qui suit détaille les protocoles mis en œuvre.
[0062] PARTIE EXPERIMENTALE
[0063] Séquences
[0064] Les séquences dénommées :
YDL237W,
YDL054C,
YKL029C,
YDL021W,
YOR380W,
YBR218C,
YOR090C ,
YLL041C,
YGL008C ,
YGL037C, et YBL036C, sont celles décrites dans la base de donnée SGD (Saccharomyce Genome Database - www.yeastgenome.org-).
[0065] Matériels et Méthodes
[0066] Obtention d'un hybride H1 : par croisement de deux souches A et B de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon une méthode d’appariement de spores décrite dans l’article de Marullo, P. et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8 :1148-1160: l’hybride H1 obtenu est le produit de la conjugaison de spores issues du croisement entre la souche A et la souche
B.
[0067] Obtention d'un hybride H2 : par croisement de deux souches C et D de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon une méthode décrite dans Marullo, P. et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8 : 1148-1160: l’hybride H2 obtenu est le produit de la conjugaison de spores issues du croisement entre la souche C et la souche D.
[0068] Isolation d'un clone X28 : A partir de l’hybride H1 issu du croisement des souches A et B on isole le descendant X28 issu d’une population de 94 descendants isolés par micromanipulation (Marullo et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8 :1148-1160). Cette technique consiste à disséquer des asques de levures formés à partir d’une culture sur milieu Acétate de Potassium ACK pendant 3 jours à 24°C. Les asques sont digérés par de la cytohélicase (2mg/mL) et les spores sont isolées à l’aide d’un micromanipulateur (Singer™ MS200). La teneur en acide malique des 94 descendants est mesurée en fin de fermentation alcoolique, laquelle fermentation est réalisée de la manière suivante :
[0069] Les fermentations ont été réalisées dans des flacons de 20 mL commercialisés par la société Fisher Scientific® sous la référence 20-HSV. Ils ont été utilisés pour fermenter 10 mL de moût de l’échantillon Merlot 2 dont la teneur en acide malique de départ est de 2,280 g/L. Les flacons ont été fermés par des bouchons à vis avec un septum en silicone / PTFE HT de 3 mm commercialisé par la société Fisher Scientific®. Des aiguilles hypodermiques ont été insérées dans le septum pour le dégagement du CO2. Les fermentations ont été initiées avec l’inoculation de 2.10E6 cellules viables.mL-1 de culture en phase liquide (YPD) réalisée dans des microplaques deepwell de 1 mL commercialisées par la société Fisher Scientific®. La concentration de cellules viables a été estimée par cytométrie en flux en utilisant un appareil de la marque Cell Lab Quanta™ commercialisé par la société Beckman Coulter®. La température de fermentation a été maintenue à 24°C à l'aide d'un incubateur vendu par la société Binder™ GmbH. Les flacons sont placés sous agitation à 175 tr. / min. au cours de la fermentation à l'aide d'un agitateur orbital tel que celui commercialisé par la société Stuart® sous la référence SSL1. Le détail de la méthode est donnée dans l’article de Peltier et al. , 2018, PLOS ONE, 13(1), 191353. (https://doi.org/10.1101/191353).
[0070] Les pourcentages de consommation indiqués dans la présente description sont calculés par rapport à la teneur totale d’acide malique présent au départ dans l’échantillon considéré.
[0071] La distribution de la teneur en acide malique consommé - en abscisse, exprimée en pourcentage massique calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ - est montrée à la figure 1 pour la descendance de H1 et en particulier pour le clone X28 dans le moût de Merlot de l’échantillon Merlot 2.
[0072] Isolation d'un clone Z8 : De la même manière que pour l’hybride H1 on obtient l’hybride H2 issu du croisement de la souche C et D. De sa descendance (obtenue comme décrit ci-dessus dans le cadre de l’obtention de X28) on isole le clone Z8 qui présente également un phénotype extrême pour la consommation d’acide malique. La distribution de la teneur (ladite teneur étant exprimée en pourcentage massique calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ) en acide malique consommé est montrée sur la figure 1 pour la descendance de H2 et en particulier pour le clone Z8 dans le moût de Merlot de l’échantillon merlot 2.
[0073] La souche B est une souche qui dégrade le plus d’acide malique avec 45% d’acide malique dégradé en comparaison avec les souches A, C et D. Le niveau de consommation d’acide malique des souches X28 et Z8 est reporté à la figure 2 (dans laquelle les valeurs lues en ordonnée correspondent au pourcentage en acide malique consommé moyen dans un moût de Merlot (Merlot 2) et de Sauvignon Blanc (Sauvignon Blanc 1) dont les teneurs en acide malique initiales sont respectivement estimées à 2,28 et 4,32 g/L) ; les valeurs de consommation d’acide malique sont également indiquées pour les quatre souches parentales A, B, C et D et pour les hybrides H1 et H2. La figure 2 montre que le phénotype de consommation est extrême pour les souches X28 et Z8, en comparaison avec le phénotype de consommation des autres souches. Ainsi, le clone X28 sélectionné montre un pourcentage de consommation de 66% ce qui illustre l’efficacité des méthodes de croisement/sélection mises en œuvre dans le cadre de l’invention pour améliorer les caractères quantitatifs.
[0074] Isolation d'un clone X8 : A partir de l’hybride H1 issu du croisement des souches A et B on isole le descendant X8 issu d’une population de 94 descendants isolés par micromanipulation (Marullo et al., 2009, FEMS Yeast Research, 9, 8 :1148-1160) de la même façon que celle utilisée pour l’obtention du descendant X28. La teneur en acide malique final exprimée en pourcentage massique calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ - est montrée à la figure 11 pour la descendance de H1 et en particulier pour le clone X8 dans le moût de Merlot de l’échantillon Merlot 2. Le descendant X8 présente une très faible consommation d’acide malique par rapport à la teneur initiale.
[0075] Isolation d'un clone Z1 : De la même manière que pour le descendant Z8 de l’hybride H2 on isole le clone Z1 qui présente également un phénotype extrême. La distribution de la teneur en acide malique finale (ladite teneur étant exprimée en pourcentage massique calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ) est montrée sur la figure 12 pour la descendance de H2 et en particulier pour le clone Z1 dans le moût de Merlot de l’échantillon merlot 2. Le descendant Z8 produit une faible quantité d’acide malique en fin de fermentation ce qui est un caractère remarquable.
[0076] Le niveau de consommation d’acide malique des souches X8 et Z1 est reporté à la figure 12 (dans laquelle les valeurs lues en ordonnée correspondent au pourcentage en acide malique consommé moyen dans un moût de Merlot (Merlot 2) et de Sauvignon Blanc (Sauvignon Blanc 1) dont les teneurs en acide malique initiales sont respectivement estimées à 2,28 et 4,32 g/L) ; les valeurs de consommation d’acide malique sont également indiquées pour les quatre souches parentales A, B, C et D et pour les hybrides H1 et H2. La figure 12 montre que le phénotype de consommation est extrême pour les souches X8 et Z1, en comparaison avec le phénotype de consommation des autres souches. Ainsi, le clone X8 sélectionné montre une légère production d’acide malique en fin de fermentation ce qui se traduit par une teneur négative du pourcentage de consommation de -10%.
[0077] Mise en œuvre de la technique des hybrides hemizygotes. La technique des hybrides hémizygotes est ensuite mise en œuvre selon la méthode décrite dans l’article de Steinmetz et al., 2002, Nature, 416, 6878 :326-330. Une recombinaison homologue permet d’éliminer une des deux copies parentales du gène étudié en insérant une cassette conférant à la levure la résistance à la généticine (G418) : à partir de l'hybride H1 , les allèles testés sont remplacés par des cassettes de délétion Kan-MX4 qui confèrent une résistance à la généticine (G418), comme cela est décrit dans l’article de Goldstein et al., 1999, - Yeast- Wiley Online Library., 15(14), 1541-1553. Ces cassettes sont amplifiées par PCR (acronyme anglo-saxon de « Polymerase Chain Reaction ») en utilisant comme matrice l'ADN génomique des souches de la collection de délétion Euroscarf (http://euroscarf.de) préalablement délétées pour le gène en question. Les cassettes ont été amplifiées avec les 500 bases en amont et en aval du gène visé, en 5’ et 3’ de la séquence codante. L’hybride H1 a été transformé avec les cassettes en utilisant le protocole décrit par Gietz, et al., 2007, Nature Protocols, 2(1), 31-34. (https://doi.org/10.1038/nprot.2007.13). L’insertion correcte des cassettes dans les mutants obtenus a été vérifiée par l’amplification positive par PCR d’un fragment qui comporte une centaine de paires de bases (pb) en amont de la zone d’insertion de la cassette, et se terminant au milieu de la cassette. Avec cette stratégie, une transformation réussie remplace l'un des deux allèles de l'hybride. Pour les transformants obtenus, l’identité de l’allèle restant a été déterminée par :
- la méthode de RFLP (de l’acronyme anglo-saxon de « Restriction Fragment Length Polymorphism ") telle que décrite dans l’article de Botstein D. et al., 1980, Am. J. Hum. Genet., 32:314-331 ; ou
- la méthode de Sanger telle que décrite dans l’article de Sanger, F. et al. « Nucléotide sequence of bactériophage phi X174 DNA », Nature, vol. 265, 1977, p. 687-695.
[0078] Lorsqu’il existe une différence d’au moins 5% entre les deux hybrides sur le pourcentage d’acide malique consommé, l’allèle est considéré comme ayant un effet sur le phénotype étudié. Les gènes testés dont l’effet est significatif sur le pourcentage de consommation d’acide malique en fin de fermentation alcoolique sont présentés dans le tableau 1. L’allèle noté DEMAL est celui qui consomme le plus d’acide malique, l’allèle noté MAL est celui qui préserve le plus la teneur en acide malique. Les résultats présentés ont été mesurés dans le moût de Merlot 2 et de Sauvignon Blanc 1 dont les teneurs en acides maliques initiales sont respectivement estimées à 2,28 et 4,32 g/L.
[0079] Cartographie de QTL.
[0080] L’ADN de chaque descendant est avantageusement extrait en utilisant des kits d’extraction tels que le kit DNA-Wizard Promega selon le protocole décrit dans Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412. [0081] Une amplification est réalisée avec un kit, de préférence le kit Nextera XT ou tout autre kit adapté pour le séquençage de petits génomes. La procédure utilisée permet d’indexer grâce à des amorces d’ADN spécifiques 96 individus et d’amplifier l’ADN afin de construire une Library pour un séquençage Illumina. Le protocole utilisé est celui fourni par le fabricant, il est décrit dans Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412.
[0082] Un génotypage est ensuite effectué qui met en œuvre un séquençage, lequel séquençage est réalisé à l’aide d’un kit de séquençage qui consiste dans un premier temps à amplifier l’ADN afin de construire une Library pour le séquençage Illumina comme décrit ci-avant. L’amplification décrite précédemment est mise en œuvre, et, elle est suivie par le séquençage complet du génome de chaque descendant en utilisant un appareillage Illumina MySeq à l’aide du kit de séquençage (Pair End 2x250 bases) MySeq Reagent Kit V2 selon les prescriptions fournies par le constructeur comme décrit dans Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-412. Les lectures de séquences obtenues sont de préférence filtrées par des méthodes bio-informatiques en utilisant la suite FASTX-Toolkit (http:// hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). Les lectures retenues présentent le paramètre de qualité Q>20, ce qui définit un taux d’erreur inférieur à 1%. Ces lectures sont ensuite alignées avec le logiciel BWA (Li, H., and R. Durbin, 2010. Bioinformatics 26(5): 589-595) sur le génome de référence S288C (sacCer3, version avril 2011) disponible sur la base de données SGD (https://www.yeastgenome.org/). A l’aide de la suite d’outils SAM tools décrite dans l’article de Li, H. et al., 2009, Bioinformatics, 25, 2078-2079, les SNP de chacun des descendants sont identifiés et positionnés sur le génome par le logiciel pileup. Ces SNP permettent la construction d’une carte génétique très dense constituée de 1000 marqueurs bi alléliques. La méthode de construction de ce type de carte et les outils bioinformatiques utilisés sont décrits dans l’article Marti-Raga et al. 2017, G3 February, 399-
412.
[0083] Une cartographie génétique est ensuite réalisée, laquelle cartographie établit un lien statistique entre l’hérédité de marqueurs génétiques et la variation d’un caractère quantitatif. Les marqueurs génétiques qui sont statistiquement liés sont des « locus de caractère quantitatifs » dont la traduction anglaise est « Quantitative Trait Loci », avec un acronyme anglo- saxon communément utilisé qui est « QTL » ; de tels QTL sont notamment décrits dans la demande EP 2 183364. Les méthodes de détection de QTL chez les levures sont décrites dans la littérature, par exemple dans l’article publié par Peltier et al., 2018, BMC Genomics 19, 772.
[0084] Des marqueurs bi-alléliques identifiés lors du génotypage sont utilisés pour réaliser la cartographie génétique. Un lien statistique est trouvé entre la variation du caractère quantitatif et quatre marqueurs génétiques avec un seuil de significativité très important (ll_150, XV_1052, IV_31 et IV_360, voir le tableau 2).
[0085] Sélection génétique de la descendance de l'hybride H3 : un croisement entre les clones Z8 et X28 est ensuite effectué pour donner l’hybride H3 selon le même protocole que celui décrit ci-avant pour l’obtention des hybrides H1 et H2. A partir de cet hybride H3, des spores en masse sont isolés par un procédé faisant appel à l’hydrophobicité de leur paroi, et qui est détaillé dans la description qui suit directement. Une préparation de spores est obtenue après 3 jours de culture sur milieu acétate de potassium (ACK) à 1% en masse à une température de 24°C ; puis ces spores sont digérées dans une préparation de cytohélicase (2mg/mL) et les spores sont purifiées en réalisant des lavages successifs à l’eau et avec une solution aqueuse de Nonidet P40 (également connu sous son nom donné par la classification IUPAC: « octylphenoxypolyethoxyethanol ») à 0.01%. Le degré d’enrichissement en spores varie de 80 à 99% selon les échantillons. A partir de cette préparation, on isole des colonies sur boite de pétri. Dans le cas présent, sensiblement 1000 descendants sont isolés. L’ADN de ces descendants est extrait par une méthode décrite par Albertin et al. (Albertin et al., 2018, Yeast, 35, 141-156) qui permet une extraction rapide compatible avec la technique de génotypage du sequenom®.
[0086] Les phénotypes des 1000 descendants isolés de l’hybride H3 est évalué par la méthode du sequenom® selon le protocole décrit par Gabriel S. et al., 2009, Current Protocole in Human Genetics, Suppl. 60. (doi.org/10.1002/ 0471142905. hg0212s60) : le design des primers est réalisé par l’outil MassARRAY® Assay Design version 4.0.0.2 permettant d’amplifier des fragments de moins de 120 bases et en sélectionnant des différences de masse entre allèles comprise entre 16 et 70 Da. Environ 15 ng d’ADN sont nécessaires pour génotyper les individus en utilisant la plateforme MassARRAY® IPLEX (Agena Bioscience®). Après une amplification en multiple, les produits de PCR sont analysés en spectrométrie de masse et la taille des allèles de chaque amplifiât est estimée à l’aide du logiciel de la suite MassARRAY® System. Le génotypage porte sur les pools alléliques Q2demal, Q4demal, Q6demal et Q7demal qui contiennent uniquement des allèles liés au caractère démaliquant.
[0087] Exemple 1 :
[0088] Dans le cas de la descendance de H3, les individus qui sont recherchés : les individus porteurs du pool allélique Q4demal qui comporte les allèles suivants : Q4demal : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W ( p.Glu165Ala). Parmi l’ensemble des descendants de H3 isolés, les individus présentant la combinaison allélique Q4demal sont analysés pour leurs propriétés fermentaires. Ces 53 individus présentent une valeur moyenne de 56.15% d’acide malique dégradé avec 25% des individus qui montrent une consommation d’acide malique supérieure à 61,72% d’acide malique dégradé ce qui est très supérieur à la valeur moyenne des populations H1 et H2 et à celle de levures commerciales (figure 3, sur laquelle la valeur en ordonnée correspond au pourcentage d’acide malique consommé calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ, pour chacun des pools indiqués en abscisse).
[0089] Un des descendants de l’hybride H3, W647, est croisé avec un descendant de l’hybride H1 : X41. Le croisement entre W647 et X41 donne l’hybride H4. Ce nouveau croisement permet d’incorporer les allèles démaliquants des gènes YKL029C, YOR090C et YBR218C dans l’hybride H4. A partir de cet hybride des spores sont isolées par le même procédé faisant appel à l’hydrophobicité de leur paroi que le procédé décrit ci-avant. Dans le cas de cet hybride H4, plus de 1000 descendants sont isolés. Leur ADN est extrait et les individus sont génotypés par la méthode de sequenom®.
[0090] Exemple 2 :
[0091] Dans la descendance de l’hybride H4 on sélectionne les individus porteurs des pools alléliques Q2demal, et de préférence des pools alléliques Q4demal, et de manière d’avantage préférée des pools alléliques Q6demal, voire des pools alléliques Q7demal.
[0092] Parmi l’ensemble des descendants de H4 isolés, les individus qui présentent la combinaison allélique Q7demal : YLL041C(p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605) + YOR090C (p.Met419Leu) + YBR218C (p.Glu722Lys) sont analysés pour leur propriétés fermentaires. Ces 10 individus présentent une valeur moyenne de 58.59 % d’acide malique dégradé avec 25% des individus qui montrent une consommation d’acide malique supérieure à 64.42% d’acide malique dégradé (voir sur la figure 3), ce qui est très supérieur à la valeur moyenne des population H1 et H2 et à celle de levures commerciales (voir la figure 2). [0093] Synthèse de l’ensemble des résultats obtenus dans les conditions des exemples 1 et 2 :
[0094] Les résultats reportés sur la figure 3 (figure 3, sur laquelle la valeur en ordonnée correspond au pourcentage d’acide malique consommé calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ, pour chacun des pools indiqués en abscisse) montrent que la sélection des individus de H3 et de H4 par les pools Q2demal, Q4demal, Q6demal et Q7demal permet d’obtenir des clones bien plus performants qu’un panel de 34 souches industrielles (pool indiqué tout à gauche du diagramme sur la figure 3) dont les valeurs d’acide malique dégradé en fin de fermentation sont comprises entre 5 et 35%. La valeur des levures industrielles a été mesurée dans les conditions de fermentation décrites dans l’article de
Peltier et al., 2018, PLOS ONE, 13(1), 191353.
(https://doi.org/10.1101/191353). Ces résultats sont confirmés par le test statistique de Wilcoxon, selon les conditions décrites dans Frank Wilcoxon, « Individual compensons by ranking methods », Biométries Bulletin (en), vol. 1, n°6, 1945, p. 80-83, qui indique une différence très significative entre les levures industrielles et les clones H3 et H4.
[0095] Les résultats reportés sur la figure 4 (figure 4, sur laquelle la valeur en ordonnée correspond au pourcentage d’acide malique consommé calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ, pour chacun des pools indiqués en abscisse) montrent que les individus de H3 et de H4 porteurs du pool Q2demal : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu), dégradent plus d’acide malique en fin de fermentation que ceux porteurs du pool Q2mal : YLL041C (p. Lys 158) + YGL008C (p.Asp200Glu). Ces résultats sont confirmés par le test statistique de Wilcoxon qui indique une différence très significative entre les groupes.
[0096] Les résultats reportés sur la figure 5 (figure 5, sur laquelle la valeur en ordonnée correspond au pourcentage d’acide malique consommé calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ, pour chacun des pools indiqués en abscisse) montrent que les individus de H3 et de H4 porteurs du pool Q4demal : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) dégradent plus d’acide malique en fin de fermentation que ceux porteurs du pool Q4mal : YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W (p.Glu165). Ces résultats sont confirmés par le test statistique de Wilcoxon, selon les conditions décrites dans Frank Wilcoxon, « Individuel comparisons by ranking methods », Biométries Bulletin (en), vol. 1, n°6, 1945, p. 80-83, qui indique une différence significative entre les groupes,
[0097] Les résultats reportés sur la figure 6 (figure 6, sur laquelle la valeur en ordonnée correspond au pourcentage d’acide malique consommé calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ, pour chacun des pools indiqués en abscisse) montrent que, au sein de la descendance des hybrides H3 et H4, les allèles des gènes YKL029C et YOR090C ont un effet très significatif sur la dégradation de l’acide malique quelque soit les autres génotypes (visible dans les deux premières séries à gauche de la figure : le pool qualifié de DEMAL pour YKL029C (p.lle605)+ YOR090C (p.Met419Leu), et le pool qualifié de MAL pour YKL029C (p.lle605Val)+ YOR090C (p.Met419)). Ces résultats montrent l’intérêt d’incorporer les allèles YKL029C (p.lle605Val) et YOR090C (p. Met419Leu) au pool Q4demal : ce pool correspond au pool Q6demal. Ainsi, les individus de H4 porteurs du pool Q6demal : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605) + YOR090C (p.Met419Leu) dégradent plus d’acide malique en fin de fermentation que ceux porteurs du pool contrôle Q6c : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p. Met419). Ces résultats sont confirmés par le test statistique de Wilcoxon qui indique une différence significative entre les groupes au seuil de 10%.
[0098] Les résultats reportés sur figure 7 montrent que, au sein de la descendance des hybrides H3 et H4, les allèles des gènes YKL029C, YOR090C et YBR218C ont un effet significatif sur la dégradation de l’acide malique quelque soit les autres génotypes (visible dans les deux premières séries à gauche de la figure : le pool qualifié de DEMAL pour YKL029C (p.lle605)+ YOR090C (p. Met419Leu)+ YBR218C (p.Glu722Lys) et le pool qualifié de MAL pour YKL029C (p.lle605Val)+ YOR090C (p.Met419)+ YBR218C (p.Glu722)). Ces résultats montrent l’intérêt d’incorporer les allèles YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419Leu) + YBR218C (p.Glu722Lys) au pool Q4demal. Ce nouveau pool est nommé Q7demal. Ainsi, les individus de H4 porteurs du pool Q7demal : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419Leu) + YBR218C (p.Glu722Lys) dégradent plus d’acide malique en fin de fermentation que ceux porteur du pool contrôle Q7c : YLL041C (p.Lys158Glu) + YGL008C (p.Pro74Leu) + YDL054C (p.Ser63Leu) + YDL237W (p.Glu165Ala) + YKL029C (p.lle605Va\) + YOR090C( p.Met419) + YBR218C (p.Glu722).
[0099] Ainsi, la sélection sur la base du génotype des descendants des hybrides H3 et H4 à l’aide des pools Q2demal, Q4demal, Q6demal et Q7demal permet d’identifier des individus qui présentent une valeur d’acide malique dégradé très importante. Par contraste, la sélection d’individus parmi les mêmes populations présentant les pools Q2mal, Q4mal, Q6c et Q7c permet la sélection d’individus dégradant une masse d’acide malique moins importante calculée par rapport à la masse totale présente au départ (voir le tableau 4). Les effectifs et les valeurs moyennes des pools sont présentés dans le tableau 4.
[00100] [Tableau 4]
[00101] Les résultats obtenus et réportés sur la figure 8 montrent que la proportion d’individus qui consomment plus de 55% d’acide malique (valeur en ordonnée sur le diagramme de la figure 8) augmente selon que l’on utilise le pool d’allèle Q2demal, Q4demal Q6demal et Q7demal. Ce résultat est validé par un test de contingence au seil de 5% (test de khi2). Avec le pool Q7demal, la proportion de clones au-dessus de 55 est de 70% : ces résultats sont montrés sur la figure 8 ou les bâtons du diagramme correspondent au nombre d’individus testés, et la courbe le nombre d’individus identifiés comme étant au dessus dudit seuil de 55%.
[00102] Grâce au procédé de croisement et de sélection mis en œuvre tel que décrit ci-dessus, trois individus remarquables sont identifiés : FMGS_215, FMGS_889 et FMGS2_107. Les pourcentages de consommation d’acide malique de ces trois individus sont supérieurs à 65 % dans le vin issu du Merlot 2. On peut voir sur la figure 9 (les valeurs en ordonnées correspondant au pourcentage en acide malique) le comportement des souches sur trois moûts de Sauvignon blanc et trois moûts de Merlot (désignés sur la figure : « must 1 à 6 ») présentant des teneurs en d’acide malique initiales décroissantes : de 9.3 g/L à 2.3 g/L. Dans tous les cas les souches sélectionnées consomment plus d’acide malique que la souche B qui est la meilleure souche de notre collection pour ce caractère. L’acide L- malique est quantifié par dosage enzymatique après avoir observé l’arrêt complet de la fermentation alcoolique selon la méthode décrite dans Peltier, ét al., 2018, PLOS ONE, 13(1), 191353 (https://doi.org/10.1101/191353) en utilisant un kit enzymatique conforme à la méthode OIV-OENO-599-2018 (Recueil des méthodes internationales d’analyses - Organisation internationale de la vigne et du vin). Ce dosage colorimétrique est basé sur la mesure de l’absorbance à 340 nm en spectrophotométrie UV.
[00103] Dans certaines conditions, le pourcentage d’acide malique consommé dépasse 80% (figure 9).
[00104] Par ailleurs, des expérimentations ont été réalisées en mesurant le pH des trois moûts de Sauvignon blanc et des trois moûts de Merlot (désignés sur les figures 9 et 10 : « must 1 à 6 ») qui montre que l’utilisation des trois souches FMGS_215, FMGS_889 et FMGS2_107 dans six matrices différentes permet de contrôler de façon remarquable le pH final des vins (voir la figure 10, où les valeurs en ordonnée correspondent au pH final qui est mesuré directement en utilisant un pH mètre préalablement étalonné). Entre les souches démaliquantes et la souche témoin A l’écart de pH peut atteindre 0.4 unités de potentiel Hydrogène.
[00105] Sélection génétique d'une souche productrice d'acide malique dans la descendance de l'hybride H5: un croisement entre les clones Z1 et X8 est ensuite effectué pour donner l’hybride H5 selon le même protocole que celui décrit ci-avant pour l’obtention des hybrides H1 et H2, H3 et H4. A partir de cet hybride H5, une préparation de spores est obtenue selon le protocole lié à l’hydrophobicité de leur paroi selon la méthode détaillée pour les descendances des hybrides H3 et H4. A partir de cette préparation, on isole 1000 descendants dont l’ADN est extrait selon des détails donnés pour la descendance des hybrides H3 et H4. Le génotype des descendants isolés des hybrides H3 H4 et H5 est évalué par la méthode du sequenom® et porte sur les pools alléliques Q6mal et Q7mal qui contiennent uniquement des allèles liés au caractère manquant. Les effectifs et les valeurs moyennes des pools sont présentés dans le tableau 5.
[00106] Tableau 5
[00107] Parmi L’ensemble des descendants de H3, H4 et H5 isolés, les individus qui présentent la combinaison allélique Q6mal : YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W( p.Glu165) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p. Met419) sont analysés pour leurs propriétés fermentaires. Certains individus porteurs du pool Q6mal présentent une production suplémentaire d’acide malique par rapport à la quantité initiale contenue dans le moût. Le paramètre est exprimé en pourcentage massique final calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ. La valeur moyenne atteinte pour le pool Q6mal est de -8% c’est-à-dire que la levure produit 8 % de plus d’acide malique que celui initialement contenu dans le moût. Cette production est supérieure à celle de l’ensemble des levures commerciales dont la distribution est présentée figure 3. Les résultats synthétisés sur la figure 13 montrent la différence d’acide malique en fin de fermentation qui existe entre les souches porteuses des pools alléliques Q6mal et Q6demal chez l’ensemble des descendants. Ces résultats sont confirmés par le test statistique de Wilcoxon, selon les conditions décrites dans Frank Wilcoxon, « Individuel compensons by ranking methods », Biométries Bulletin (en), vol. 1, n°6, 1945, p. 80-83, qui indique une différence significative entre les groupes.
[00108] Parmi l’ensemble des descendants de H3, H4 et H5 isolés, les individus qui présentent la combinaison allélique Q7mal : YLL041C (p.Lys158) + YGL008C (p.Asp200Glu) + YDL054C (p.Ser63) + YDL237W (p.Glu165) + YKL029C (p.lle605Val) + YOR090C (p.Met419) + YBR218C (p.Glu722) sont analysés pour leurs propriétés fermentaires. Les individus porteurs du pool Q7mal présentent une production supplémentaire d’acide malique par rapport à la quantité d’acide malique initiale contenue dans le moût. Ce paramètre est exprimé en pourcentage massique final calculé par rapport à la masse totale d’acide malique présent au départ. La valeur moyenne atteinte pour le pool Q7mal est de -22% c’est-à-dire que la levure produit 22% de plus d’acide malique que celui initialement contenu dans le moût. De façon tout a fait remarquable, les individus FMGS3_191 et FMGS3_13 produisent respectivement 37 et 42 % d’acide malique en plus que la teneur initialement contenue dans le moût. Sur la figure 13, on montre qu’il existe une différence entre les souches porteuses des pools alléliques Q7mal et Q7demal chez l’ensemble des descendants. Ces résultats sont confirmés par le test statistique de Wilcoxon, selon les conditions décrites dans Frank Wilcoxon, « Individuel comparisons by ranking methods », Biométries Bulletin (en), vol. 1, n°6, 1945, p. 80-83, qui indique une différence significative entre les groupes.
[00109] Dans l’exemple suivant, on vinifie un moût de cabemet sauvignon avec les souches FMGS3_191 et FMGS3_13 qui sont porteuses du pool Q7mal ainsi que les souches témoins A, B et X8. On mesure la teneur en acide malique en fin de la fermentation alcoolique. Sur la figure 14 les valeurs de l’axe des ordonnées sont exprimées en concentration massique d’acide malique par litre. Le trait horizontal indique la teneur initiale du moût en acide malique qui est de 3.34 g/L. Les souches FMGS3_191 et FMGS3_13 produisent une quantité remarquable d’acide malique très supérieure à celle de la souche X8 qui est le descendant le plus performant des hybrides H1 et H2. Ainsi ces deux souches produisent plus de 1.2 g/L voire plus de 1.4 g/L par rapport à la valeur initiale du moût. Cette production d’acide malique a un effet direct sur le pH des vins en fin de fermentation. Les résultats synthétisés sur la figure 15 montrent que les vins obtenus avec les souches manquantes sélectionnées ont des valeurs de pH inférieures de 0.2 unité de pH par rapport à la souche témoin A, voire de 0,4 unité de pH par rapport à la souche témoin B.

Claims

Revendications
Revendication 1. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae comprenant au moins un polymorphisme de séquence peptidique dans au moins une des séquences des protéines codées par les gènes sélectionnés parmi les onze gènes YLL041C, YGL008C, YDL054C, YKL029C, YDL021W, YOR380W, YOR090C, YBR218C, YGL037C, YBL036C et YDL237W
Revendication 2. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, comprenant au moins un polymorphisme de séquence peptidique au niveau des acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys 158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Asp200) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C, l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C, l’acide aminé (Met419) au niveau de la protéine codée par le gène YOR090C, l’acide aminé (Glu722) de la protéine codée par le gène YBR218C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
Revendication 3. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’une des revendications 1 ou 2, comprenant deux polymorphismes de séquence peptidique au niveau de deux acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Asp200) de la protéine codée par le gène et YGL008C et l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C.
Revendication 4. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant quatre polymorphismes de séquence peptidique au niveau de quatre acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
Revendication 5. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant cinq polymorphismes de séquence peptidique au niveau de cinq acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C, l’acide aminé (Ile605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C, l’acide aminé (Met419) au niveau de la protéine codée par le gène YOR090C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
Revendication 6. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant six polymorphismes de séquence peptidique au niveau de six acides aminés sélectionnés parmi les positions suivantes dans le génome de référence : l’acide l’acide aminé (Lys158) de la protéine codée par le gène YLL041C, l’acide aminé (Pro74) de la protéine codée par le gène YGL008C, l’acide aminé (Ser63) de la protéine codée par le gène YDL054C, l’acide aminé (Met419) au niveau de la protéine codée par le gène YOR090C, l’acide aminé (Glu722) de la protéine codée par le gène YBR218C et l’acide aminé (Glu 165) de la protéine codée par le gène YDL237W.
Revendication 7. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’une des revendications 1 à 6, comprenant de deux à six substitutions d’acides aminés dans le génome de référence parmi les suivantes: (Glu 158) de la protéine codée par le gène YLL041C, (Leu74) de la protéine codée par le gène YGL008C, (Leu63) de la protéine codée par le gène YDL054C, (Leu419) de la protéine codée par le gène YOR090C, (Lys722) de la protéine codée par le gène YBR218C et (Ala165) de la protéine codée par le gène YDL237W. Revendication 8. Souche de levure de l’espèce Saccharomyces cerevisiae selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant de une à deux substitutions d’acides aminés dans le génome de référence parmi les suivantes : (Glu200) de la protéine codée par le gène et YGL008C et (Val605) au niveau de la protéine codée par le gène YKL029C.
Revendication 9. Utilisation d’une souche selon l’une des revendications 1 à 8, pour modifier le pH d’un vin.
Revendication 10. Utilisation d’une souche selon la revendication 9 combinée à la revendication 7, pour augmenter le pH d’un vin.
Revendication 11. Utilisation d’une souche selon la revendication 9 combinée à la revendication 8, pour diminuer le pH d’un vin.
Revendication 12. Procédé de sélection de souches de levures œnologiques selon l’une des revendications 1 à 6 comportant les étapes consistant à :
1- réaliser une hybridation par croisement de deux souches œnologiques A et B de l’espèce Saccharomyces cerevisiae ;
2- identifier les allèles responsables de la consommation de l’acide malique en éliminant une des deux copies parentales en réalisant un hybride hémizygote par insertion d’un gène de résistance à un antibiotique ;
3- obtenir des descendants méiotiques issus des hybrides de l’étape 1- par l’induction de la sporulation et isolement des spores ;
4- déterminer le phénotype des descendants obtenus dans l’étape 3- pour la consommation d’acide malique ;
5- extraire l’ADN des descendants obtenus à l’étape 3- ;
6- effectuer un génotypage du génome des descendants permettant de connaître le génotype d’au moins deux locus ;
7- réaliser une cartographie génétique à partir des données obtenues à l’étape 4- et à l’étape 6- ; et
8- sélectionner au moins un groupe d’individus parmi les individus porteurs d’allèles démaliquants et les individus porteurs d’allèles manquants.
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