EP4017272A1 - Method for producing collagen peptides from bones, and produced collagen peptides - Google Patents

Method for producing collagen peptides from bones, and produced collagen peptides

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EP4017272A1
EP4017272A1 EP20785702.0A EP20785702A EP4017272A1 EP 4017272 A1 EP4017272 A1 EP 4017272A1 EP 20785702 A EP20785702 A EP 20785702A EP 4017272 A1 EP4017272 A1 EP 4017272A1
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EP
European Patent Office
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bones
collagen peptides
collagen
weight
less
Prior art date
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Application number
EP20785702.0A
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Inventor
Ralf PÖRSCHKE
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Gelita AG
Original Assignee
Gelita AG
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Publication date
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing collagen peptides from bones.
  • the invention also relates to collagen peptides which are produced according to this method.
  • Collagen peptides are formed during the hydrolysis of the animal structural protein collagen, in particular through enzymatic hydrolysis. Alternative names are therefore collagen hydrolyzate or hydrolyzed collagen. In the case of animal bones as the starting material, it is particularly type I collagen.
  • Collagen peptides are used in a variety of ways, especially in the food industry, on the one hand because of their physiological effect in food supplements or so-called "functional food", but also from the point of view of food technology such as, for example, as an emulsifier, stabilizer, binder, etc.
  • a characteristic property of collagen peptides is their solubility in cold water and their inability to form a gel. This allows collagen peptides to be differentiated from gelatin, which is denatured and only slightly hydrolyzed collagen.
  • Collagen peptides have a molecular weight of less than 25,000 Da, mostly even less than 10,000 Da, while the molecular weights of gelatine are significantly higher.
  • Collagen peptides are normally made from gelatin as an intermediate product (see, for example, R. Schrieber and H. Gareis: Gelatin Handbook, 2007, chapter 2.2.11).
  • gelatine is again produced from bones in a multistage process, the essential steps of which are demineralization of the bones in a strongly acidic environment (Maceration) and a subsequent treatment in a strongly alkaline environment (liming) in order to then be able to extract the gelatine at an elevated temperature (typically between 50 and 100 ° C) in several stages (see Gelatin Handbook, Chapter 2.2.5 ).
  • the crushed bones are treated with dilute hydrochloric acid in a countercurrent process over a period of about one week in order to remove the mineral components (calcium carbonate and calcium phosphate) from the bone tissue (see Gelatin Handbook, Chapter 2.2.1.1).
  • the product obtained by this process is called ossein.
  • a relevant cost factor in maceration is the required cooling due to the exothermic reaction of the hydrochloric acid with the calcium minerals.
  • Another disadvantage is the high chloride load in the wastewater.
  • the subsequent liming of the ossification is necessary to enable the gelatine to be extracted effectively.
  • the typical liming process involves treatment with a calcium hydroxide suspension (pH value above 12) over a period of several months (see Gelatin Handbook, Chapter 2.2.4.1).
  • the use of stronger alkalis can shorten the treatment time (e.g. to a few days when using sodium hydroxide), but this leads to a loss of yield.
  • type B bone gelatin which is characterized by an isoelectric point (IEP) of less than 5.6, typically in the range of 4.8 to 5.5.
  • the IEP corresponds to that pH value at which the polypeptide chains of the gelatin (or the collagen peptides produced from it) have a neutral overall charge.
  • the relatively low IEP of type B gelatin results from the fact that the amino acids asparagine and glutamine are almost completely converted to aspartic acid and glutamic acid during liming.
  • Type B gelatine has a significantly higher viscosity than type A gelatine with the same gel strength and is therefore preferred for most fields of application.
  • Type A gelatine in which the osseous is extracted in an acidic environment without liming, therefore only plays a subordinate role.
  • Type A gelatins have an IEP of over 6, in the case of type A bone gelatin typically in the range between 6 and 8 (in the case of pork skin gelatin in the range 8 to 9).
  • the invention is based on the object of proposing an alternative method for the production of collagen peptides, in which the disadvantages of the method described above using bone gelatin of type B as an intermediate product can be entirely or partially avoided.
  • this object is achieved according to the invention in that it comprises the following steps: a) providing bones from vertebrates; b) mechanical comminution of the bones down to a particle size of less than 1,000 ⁇ m, preferably less than 500 ⁇ m, more preferably less than 300 ⁇ m, at a temperature of less than 70 ° C.
  • step c) heating the comminuted bones in an aqueous suspension to a temperature of over 100 ° C., preferably over 120 ° C., more preferably over 130 ° C., for a period of 1 to 30 min, preferably 2 to 10 min, more preferably 4 to 8 minutes; d) adding one or more proteases to the suspension in order to obtain an aqueous solution of collagen peptides; and e) separating the aqueous solution of collagen peptides from the crushed bones, the method comprising neither maceration of the bones with an acid nor liming of the bones with a base, and wherein the boiling provided in step a) does not include maceration and liming were subjected.
  • collagen peptides can be produced by direct enzymatic treatment of the bone material by means of proteases, without the detour via the production of bone gelatin.
  • the method according to the invention therefore explicitly dispenses with maceration and / or liming of the bones, which drastically shortens the entire duration of the process until the collagen peptides are obtained: while maceration and liming can take several months in extreme cases, but at least several days the inventive method can be carried out within a few hours.
  • the energy requirement and the wastewater pollution are significantly reduced in the method according to the invention compared to the prior art.
  • the term "maceration” refers to a treatment with an acid at a pH of less than 1
  • the term “liming” refers to a treatment with a base at a pH of over 12 Roger that.
  • bones from any vertebrate animal can be used as the starting material for the method according to the invention, e.g. also from birds or fish.
  • the method is preferably carried out with bones from mammals, in particular with bones from cattle.
  • the cleaning of the bones preferably includes a treatment with one or more enzymes, preferably with proteases and / or lipases. While the lipases are used for defatting, non-collagenous proteins can be broken down and removed by means of proteases. A hydrolysis of the collagen through the proteases do not occur to any significant extent before the bones are comminuted.
  • the bones Before being comminuted, the bones advantageously have a fat content of less than 4% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0.5% by weight.
  • the bones have a collagen content in relation to the total protein content of at least 55%, preferably from 70 to 90%, before comminution.
  • the collagen content is determined using the hydroxyproline content multiplied by the factor 7.3, and the total protein content is determined using the Kjeldahl nitrogen content multiplied by the factor 6.25.
  • the factors mentioned take into account the proportion of hydroxyproline and nitrogen in collagen, which differs from the corresponding proportions in the total protein.
  • the mechanical comminution of the preferably cleaned bones down to a particle size of less than 1,000 ⁇ m is an essential feature of the method according to the invention. Due to the small particle size, direct enzymatic hydrolysis of the collagen in the bone material is made possible without the need for the pretreatment procedures known from the prior art, such as maceration or liming.
  • the mechanical comminution can include dry milling or wet milling of the bones, with wet milling in an aqueous suspension being preferred. During the shredding, the temperature is kept below 70 ° C in order to avoid local overheating of the material.
  • the minced bones are heated in an aqueous suspension to a temperature of over 100 ° C., a maximum of 30 minutes being sufficient for this thermal pretreatment.
  • the collagen is denatured and made accessible for enzymatic hydrolysis.
  • the weight fraction of crushed Bone in the aqueous suspension is preferably from 0.05 to 0.5 kg / l, preferably from 0.1 to 0.3 kg / l, more preferably from 0.15 to 0.2 kg / l.
  • the thermal pretreatment of the comminuted bones can be further accelerated and / or intensified by an additional energy input by means of cavitation, e.g. by ultrasound or a high-pressure homogenizer.
  • cavitation e.g. by ultrasound or a high-pressure homogenizer.
  • Another possibility is to apply alternating electric fields to the suspension.
  • Another advantage of the method according to the invention is that the isoelectric point of the collagen peptides produced can be influenced in a simple manner by setting a corresponding pH value in the aqueous suspension while the comminuted bones are being heated.
  • collagen peptides with a high or low IEP may be preferred, whereby the differences in the properties are less serious here than with gelatine of type A or type B.
  • the pH of the aqueous suspension is adjusted to a range from 5 to 7, preferably from 6 to 7, before heating. if the pH value is not adjusted.
  • the pH of the aqueous suspension is adjusted to a range from 7 to 9, preferably from 7.9 to 8.6, before heating.
  • the aqueous suspension is cooled to a temperature in the range from 40 to 60 ° C. before the one or more proteases are added.
  • the activity optima of the proteases, which are typically used for the enzymatic hydrolysis of the collagen, are in this temperature range.
  • the one or more proteases which are added to the aqueous suspension after heating are favorably selected from microbial endoproteases, preferably serine proteases, in particular from Bacillus subtilis.
  • the use of such enzymes for the hydrolysis of collagen is known from the prior art.
  • a protease that is frequently used is, for example, subtilisin.
  • the one or more proteases are typically added in an amount of from 0.01 to 0.5% by weight, based on the dry mass of the comminuted bones, preferably from 0.02 to 0.2% by weight, more preferably from 0 .03 to 0.1% by weight.
  • the enzymatic reaction is preferably carried out for a period of from 0.5 to 4 hours, more preferably from 1 to 3 hours.
  • the minced bones are subjected once more to steps c) to e) after the aqueous solution of collagen peptides has been separated off.
  • steps c) to e) after the aqueous solution of collagen peptides has been separated off.
  • the separation of the aqueous solution of collagen peptides from the pulverized bones preferably comprises a filtration, in particular a membrane filtration. This means that even the smallest particles of the crushed bones and other solids can be removed.
  • the aqueous solution of collagen peptides can preferably be subjected to an ion exchange, in particular desalination.
  • the method according to the invention further comprises drying the aqueous solution of collagen peptides in order to obtain a powder of collagen peptides, in particular by means of Spray drying.
  • the aqueous solution can be concentrated beforehand with the aid of evaporators.
  • the present invention also relates to collagen peptides which are produced by the method according to the invention.
  • the collagen peptides according to the invention typically have a weight average molecular weight of less than 25,000 Da, preferably less than 10,000 Da, more preferably less than 5,000 Da.
  • the collagen peptides have a high isoelectric point of over 5.6, in particular of over 6.0.
  • the collagen peptides have a low isoelectric point of below 5.6, in particular from 5.2 to 5.6.
  • Fig. 1 Charge distributions of collagen peptides according to the prior art
  • Example 1 Production of collagen peptides from bone on a laboratory scale
  • Cattle bones are pre-cleaned using hot water and defleading and degreasing supported by proteases and then ground to a bone powder with a particle size distribution of d50 ⁇ 350 ⁇ m and d90 ⁇ 700 ⁇ m.
  • the bone powder is then mixed with the same mass of water and heated in a microwave oven with stirring for approx. 1 min at 120 to 130 ° C. After cooling (approx. 20 min) to below 100 ° C, 0.1% by weight (based on the bone powder mass) of the protease subtilisin is added and the suspension is stirred at 60 ° C. Due to the enzymatic reaction with the formation of soluble collagen peptides, the concentration of the aqueous phase increases over time, as indicated in Table 1. The concentration is measured with a refractometer which is calibrated to the unit ° Brix for measuring sucrose.
  • the supernatant is filtered and desalted.
  • the collagen peptides are concentrated and dried.
  • the IEP of the collagen peptides is 6.23.
  • the distribution of the molecular charges of these collagen peptides according to the invention can be determined by means of isoelectric focusing. A corresponding chromatogram is shown in FIG. 1, the pH value in the gel being indicated on the left and the three traces being covered as follows:
  • Lane No. 2 Bone gelatin collagen peptides of type B according to the prior art (with maceration and liming)
  • Lane no. 3 collagen peptides according to the invention according to the above example
  • the charges of the molecules are in principle similar in both samples, the collagen peptides according to the invention in this case also showing bands of negative, ie alkaline, molecules.
  • the pH value during denaturation determines the position of the bands and thus the isoelectric point of the collagen peptides.
  • Example 2 Production of collagen peptides from bone on a pilot scale
  • a 15% strength by weight aqueous suspension of cleaned bone powder (d90 ⁇ 700 ⁇ m) from cattle bones is placed in a stirred container, the bones having been cleaned beforehand as in Example 1.
  • the ratio of total protein to collagen is 1.7 (normalized to dry matter minus fat content).
  • the pH of the suspension is adjusted to 6.5.
  • the suspension is pumped through a heat exchanger and heated to 130 ° C. This temperature is held for about 6 minutes.
  • the suspension is then cooled to approx. 60 ° C. using a heat exchanger and collected in a stirred tank. 0.05% by weight (based on the dry bone mass) of the protease subtilisin are added.
  • the enzymatic hydrolysis is terminated by heating the suspension to 85 ° C. for 5 minutes.
  • the aqueous phase is separated off with a decanter centrifuge and collected in a container.
  • the solid phase is treated again in the same way as described above for the bone powder (preparation of a suspension, thermal pretreatment, cooling, enzymatic hydrolysis and separation of the aqueous phase by decanting).
  • aqueous phases (collagen peptide solutions) from both runs are combined and, for further purification, filtered, desalted, concentrated and dried using suitable methods.
  • the yield of this process is approx. 16 to 19% by weight of collagen peptides, based on the bone mass used.
  • the quality of the collagen peptides can be e.g. B. on the basis of high transmission values of aqueous solutions with a concentration of 20 wt.% At the wavelengths 450 nm and 620 nm can be evaluated.
  • the measured values and the respective quality standard are given in table 2:
  • the weight average molecular weight of the collagen peptides according to the example 2 is in the range of 3,000 ⁇ 500 Da.
  • the molecular weight distribution of the collagen peptides according to the invention can be influenced by the choice of enzyme, the amount of enzyme and the reaction time.

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Abstract

The present invention relates to a method for producing collagen peptides from bones, comprising the following steps: a) providing bones from vertebrates; b) mechanically comminuting the bones to a particle size of less than 1. 000 pm, preferably less than 500 pm, more preferably less than 300 pm, at a temperature of less than 70°C during comminution; c) heating the comminuted bones in an aqueous suspension to a temperature above 100°C, preferably above 120°C, more preferably above 130°C, for a period of 1 to 30 min, preferably 2 to 10 min, more preferably 4 to 8 min; d) adding one or more proteases to the suspension to obtain an aqueous solution of collagen peptides; and e) separating the aqueous solution of collagen peptides from the comminuted bones. The method does not comprise maceration of the bones with an acid or liming of the bones with a base, and bones provided in step a) have not been subjected to maceration and liming. The invention further relates to collagen peptides produced by this method.

Description

Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptiden aus Knochen, und hergestellte Kollagenpeptide Process for the production of collagen peptides from bone, and produced collagen peptides
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kollagen peptiden aus Knochen. The present invention relates to a method for producing collagen peptides from bones.
Die Erfindung betrifft ferner Kollagenpeptide, die gemäß diesem Verfahren hergestellt sind. The invention also relates to collagen peptides which are produced according to this method.
Kollagenpeptide entstehen bei der Hydrolyse des tierischen Strukturproteins Kollagen, insbesondere durch enzymatische Hydrolyse. Alternative Bezeich nungen sind daher Kollagenhydrolysat oder hydrolysiertes Kollagen. Im Fall von tierischen Knochen als Ausgangsmaterial handelt es sich insbesondere um Kollagen vom Typ I. Collagen peptides are formed during the hydrolysis of the animal structural protein collagen, in particular through enzymatic hydrolysis. Alternative names are therefore collagen hydrolyzate or hydrolyzed collagen. In the case of animal bones as the starting material, it is particularly type I collagen.
Kollagenpeptide werden insbesondere in der Lebensmittelindustrie vielfältig eingesetzt, zum einen wegen ihrer physiologischen Wirkung in Nahrungser gänzungsmitteln oder sogenanntem "Functional Food", aber auch unter lebensmitteltechnischen Gesichtspunkten wie z.B. als Emulgator, Stabilisator, Bindemittel usw. Eine charakteristische Eigenschaft von Kollagenpeptiden ist ihre Löslichkeit auch in kaltem Wasser und ihre mangelnde Fähigkeit, ein Gel auszubilden. Dadurch lassen sich Kollagenpeptide von Gelatine abgrenzen, bei der es sich um denaturiertes und nur geringfügig hydrolysiertes Kollagen han delt. Kollagenpeptide weisen ein Molekulargewicht von weniger als 25.000 Da auf, meistens sogar von weniger als 10.000 Da, während die Molekularge wichte von Gelatine deutlich höher liegen. Collagen peptides are used in a variety of ways, especially in the food industry, on the one hand because of their physiological effect in food supplements or so-called "functional food", but also from the point of view of food technology such as, for example, as an emulsifier, stabilizer, binder, etc. A characteristic property of collagen peptides is their solubility in cold water and their inability to form a gel. This allows collagen peptides to be differentiated from gelatin, which is denatured and only slightly hydrolyzed collagen. Collagen peptides have a molecular weight of less than 25,000 Da, mostly even less than 10,000 Da, while the molecular weights of gelatine are significantly higher.
Kollagenpeptide werden normalerweise aus Gelatine als Zwischenprodukt her gestellt (siehe z.B. R. Schrieber und H. Gareis: Gelatin Handbook, 2007, Ka pitel 2.2.11). Die Herstellung von Gelatine aus Knochen erfolgt gemäß dem Stand der Technik wiederum in einem mehrstufigen Prozess, der als wesentli che Schritte eine Entmineralisierung der Knochen in einem stark sauren Milieu (Mazeration) und eine anschließende Behandlung in einem stark alkalischen Milieu (Äschern) umfasst, um dann die Gelatine bei erhöhter Temperatur (typi scherweise zwischen 50 und 100 °C) in mehreren Stufen extrahieren zu kön nen (siehe Gelatin Handbook, Kapitel 2.2.5). Collagen peptides are normally made from gelatin as an intermediate product (see, for example, R. Schrieber and H. Gareis: Gelatin Handbook, 2007, chapter 2.2.11). According to the state of the art, gelatine is again produced from bones in a multistage process, the essential steps of which are demineralization of the bones in a strongly acidic environment (Maceration) and a subsequent treatment in a strongly alkaline environment (liming) in order to then be able to extract the gelatine at an elevated temperature (typically between 50 and 100 ° C) in several stages (see Gelatin Handbook, Chapter 2.2.5 ).
Bei der Mazeration werden die geschroteten Knochen über einen Zeitraum von ca. einer Woche in einem Gegenstromverfahren mit verdünnter Salzsäure be handelt, um die mineralischen Bestandteile (Calciumcarbonat und Calcium phosphat) aus dem Knochengewebe herauszulösen (siehe Gelatin Handbook, Kapitel 2.2.1.1). Das mit diesem Verfahren erhaltene Produkt wird als Ossein bezeichnet. Ein relevanter Kostenfaktor bei der Mazeration ist, neben den Chemikalien, die erforderliche Kühlung wegen der exothermen Reaktion der Salzsäure mit den Calciummineralen. Nachteilig ist ferner die hohe Chlorid fracht im Abwasser. During maceration, the crushed bones are treated with dilute hydrochloric acid in a countercurrent process over a period of about one week in order to remove the mineral components (calcium carbonate and calcium phosphate) from the bone tissue (see Gelatin Handbook, Chapter 2.2.1.1). The product obtained by this process is called ossein. In addition to the chemicals, a relevant cost factor in maceration is the required cooling due to the exothermic reaction of the hydrochloric acid with the calcium minerals. Another disadvantage is the high chloride load in the wastewater.
Das anschließende Äschern des Osseins ist notwendig, um eine effektive Ex traktion der Gelatine zu ermöglichen. Das typische Äscherverfahren umfasst eine Behandlung mit einer Calciumhydroxidsuspension (pH-Wert von über 12) über einen Zeitraum von mehreren Monaten (siehe Gelatin Handbook, Kapitel 2.2.4.1). Durch die Verwendung von stärkeren Laugen kann die Behandlungs zeit zwar verkürzt werden (z.B. auf einige Tage bei Verwendung von Natrium hydroxid), dies führt jedoch zu Ausbeuteverlusten. The subsequent liming of the ossification is necessary to enable the gelatine to be extracted effectively. The typical liming process involves treatment with a calcium hydroxide suspension (pH value above 12) over a period of several months (see Gelatin Handbook, Chapter 2.2.4.1). The use of stronger alkalis can shorten the treatment time (e.g. to a few days when using sodium hydroxide), but this leads to a loss of yield.
Das vorstehend beschriebene Verfahren führt zu Knochengelatine vom Typ B, die sich durch einen isoelektrischen Punkt (IEP) von unter 5,6 auszeichnet, typischerweise im Bereich von 4,8 bis 5,5. Der IEP entspricht demjenigen pH- Wert, bei dem die Polypeptidketten der Gelatine (oder die daraus hergestellten Kollagenpeptide) eine neutrale Gesamtladung aufweisen. Der relativ niedrige IEP von Gelatine vom Typ B ergibt sich dadurch, dass beim Äschern die Ami nosäuren Asparagin und Glutamin fast vollständig zu Asparaginsäure bzw. Glutaminsäure umgewandelt werden. Gelatine vom Typ B weist bei gleicher Gelstärke eine deutlich höhere Viskosität auf als Gelatine vom Typ A und ist deshalb für die meisten Anwendungsfelder bevorzugt. Die Herstellung von Knochengelatine vom Typ A, bei der das Osse in ohne Äschern im sauren Milieu extrahiert wird, spielt daher nur eine unter geordnete Rolle. Gelatinen vom Typ A weisen einen IEP von über 6 auf, im Fall von Typ-A-Knochengelatine typischerweise im Bereich zwischen 6 und 8 (bei Schweineschwartengelatine im Bereich von 8 bis 9). The process described above results in type B bone gelatin, which is characterized by an isoelectric point (IEP) of less than 5.6, typically in the range of 4.8 to 5.5. The IEP corresponds to that pH value at which the polypeptide chains of the gelatin (or the collagen peptides produced from it) have a neutral overall charge. The relatively low IEP of type B gelatin results from the fact that the amino acids asparagine and glutamine are almost completely converted to aspartic acid and glutamic acid during liming. Type B gelatine has a significantly higher viscosity than type A gelatine with the same gel strength and is therefore preferred for most fields of application. The production of type A bone gelatine, in which the osseous is extracted in an acidic environment without liming, therefore only plays a subordinate role. Type A gelatins have an IEP of over 6, in the case of type A bone gelatin typically in the range between 6 and 8 (in the case of pork skin gelatin in the range 8 to 9).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren für die Herstellung von Kollagenpeptiden vorzuschlagen, bei dem die Nachteile des oben beschriebenen Verfahrens über Knochengelatine vom Typ B als Zwi schenprodukt ganz oder teilweise vermieden werden können. The invention is based on the object of proposing an alternative method for the production of collagen peptides, in which the disadvantages of the method described above using bone gelatin of type B as an intermediate product can be entirely or partially avoided.
Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art erfin dungsgemäß dadurch gelöst, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen von Knochen von Wirbeltieren; b) mechanisches Zerkleinern der Knochen bis zu einer Partikelgröße von weniger als 1.000 pm, bevorzugt weniger als 500 pm, weiter bevorzugt weniger als 300 pm, bei einer Temperatur von weniger als 70 °C wäh rend der Zerkleinerung; c) Erhitzen der zerkleinerten Knochen in einer wässrigen Suspension auf eine Temperatur von über 100 °C, bevorzugt über 120 °C, weiter bevor zugt über 130 °C, für einen Zeitraum von 1 bis 30 min, bevorzugt 2 bis 10 min, weiter bevorzugt 4 bis 8 min; d) Zugabe einer oder mehrerer Proteasen zu der Suspension, um eine wässrige Lösung von Kollagenpeptide zu erhalten; und e) Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden von den zerklei nerten Knochen, wobei das Verfahren weder eine Mazeration der Knochen mit einer Säure noch ein Äschern der Knochen mit einer Base umfasst, und wobei die in Schritt a) bereitgestellten Kochen keiner Mazeration und keinem Äschern unterzogen wurden. Es wurde im Rahmen der Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass sich Kollagenpeptide durch eine unmittelbare enzymatische Behandlung des Knochenmaterials mittels Proteasen hersteilen lassen, ohne den Umweg über die Herstellung von Knochengelatine. Das erfindungsgemäße Verfahren ver zichtet daher explizit auf eine Mazeration und/oder ein Äschern der Knochen, wodurch die gesamte Verfahrensdauer bis zur Gewinnung der Kollagenpeptide drastisch verkürzt wird: Während die Mazeration und das Äschern im Extrem fall mehrere Monate beanspruchen, mindestens aber mehrere Tage, kann das erfindungsgemäße Verfahren innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden. Auch der Energiebedarf und die Abwasserbelastung sind bei dem er findungsgemäßen Verfahren gegenüber dem Stand der Technik deutlich ver ringert. In the method of the type mentioned at the outset, this object is achieved according to the invention in that it comprises the following steps: a) providing bones from vertebrates; b) mechanical comminution of the bones down to a particle size of less than 1,000 μm, preferably less than 500 μm, more preferably less than 300 μm, at a temperature of less than 70 ° C. during the comminution; c) heating the comminuted bones in an aqueous suspension to a temperature of over 100 ° C., preferably over 120 ° C., more preferably over 130 ° C., for a period of 1 to 30 min, preferably 2 to 10 min, more preferably 4 to 8 minutes; d) adding one or more proteases to the suspension in order to obtain an aqueous solution of collagen peptides; and e) separating the aqueous solution of collagen peptides from the crushed bones, the method comprising neither maceration of the bones with an acid nor liming of the bones with a base, and wherein the boiling provided in step a) does not include maceration and liming were subjected. It was surprisingly found within the scope of the invention that collagen peptides can be produced by direct enzymatic treatment of the bone material by means of proteases, without the detour via the production of bone gelatin. The method according to the invention therefore explicitly dispenses with maceration and / or liming of the bones, which drastically shortens the entire duration of the process until the collagen peptides are obtained: while maceration and liming can take several months in extreme cases, but at least several days the inventive method can be carried out within a few hours. The energy requirement and the wastewater pollution are significantly reduced in the method according to the invention compared to the prior art.
Unter dem Begriff "Mazeration" wird im Rahmen der vorliegenden Beschrei bung eine Behandlung mit einer Säure bei einem pH-Wert von unter 1 ver standen, und unter dem Begriff "Äschern" wird eine Behandlung mit einer Base bei einem pH-Wert von über 12 verstanden. In the context of the present description, the term "maceration" refers to a treatment with an acid at a pH of less than 1, and the term "liming" refers to a treatment with a base at a pH of over 12 Roger that.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren können prinzipiell Knochen von jeglichen Wirbeltieren eingesetzt werden, also z.B. auch von Vö geln oder Fischen. Bevorzugt wird das Verfahren aber mit Knochen von Säu getieren durchgeführt, insbesondere mit Knochen von Rindern. In principle, bones from any vertebrate animal can be used as the starting material for the method according to the invention, e.g. also from birds or fish. However, the method is preferably carried out with bones from mammals, in particular with bones from cattle.
Günstig ist es, wenn die Knochen vor dem Zerkleinern gereinigt werden, ins besondere entfettet werden. Die Reinigung des Ausgangsmaterials begünstigt den effizienten Ablauf der enzymatischen Hydrolyse und ermöglicht die Her stellung von qualitativ hochwertigen Kollagenpeptiden. It is beneficial if the bones are cleaned, in particular degreased, before they are minced. The purification of the starting material favors the efficient process of the enzymatic hydrolysis and enables the production of high quality collagen peptides.
Die Reinigung der Knochen umfasst vorzugsweise eine Behandlung mit einem oder mehreren Enzymen, bevorzugt mit Proteasen und/oder Lipasen. Während die Lipasen der Entfettung dienen, können mittels Proteasen nicht-kollagene Proteine abgebaut und entfernt werden. Eine Hydrolyse des Kollagens durch die Proteasen erfolgt vor dem entsprechenden Zerkleinern der Knochen nicht in nennenswertem Ausmaß. The cleaning of the bones preferably includes a treatment with one or more enzymes, preferably with proteases and / or lipases. While the lipases are used for defatting, non-collagenous proteins can be broken down and removed by means of proteases. A hydrolysis of the collagen through the proteases do not occur to any significant extent before the bones are comminuted.
Die Knochen weisen vor dem Zerkleinern günstigerweise einen Fettgehalt von weniger als 4 Gew.% auf, bevorzugt von weniger als 1 Gew.%, weiter bevor zugt von weniger als 0,5 Gew.%. Before being comminuted, the bones advantageously have a fat content of less than 4% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0.5% by weight.
Im Hinblick auf die Entfernung von nicht-kollagenen Proteinen ist es vorteil haft, wenn die Knochen vor dem Zerkleinern einen Gehalt an Kollagen im Ver hältnis zum Gesamtproteingehalt von mindestens 55% aufweisen, bevorzugt von 70 bis 90%. Dabei wird der Kollagengehalt über den Hydroxyprolingehalt multipliziert mit dem Faktor 7,3 bestimmt, und der Gesamtproteingehalt wird über den Kjeldahl-Stickstoffgehalt multipliziert mit dem Faktor 6,25 bestimmt. Durch die genannten Faktoren wird der Anteil an Hydroxyprolin und Stickstoff in Kollagen berücksichtigt, der sich von den entsprechenden Anteilen im Gesamtprotein unterscheidet. With regard to the removal of non-collagenous proteins, it is advantageous if the bones have a collagen content in relation to the total protein content of at least 55%, preferably from 70 to 90%, before comminution. The collagen content is determined using the hydroxyproline content multiplied by the factor 7.3, and the total protein content is determined using the Kjeldahl nitrogen content multiplied by the factor 6.25. The factors mentioned take into account the proportion of hydroxyproline and nitrogen in collagen, which differs from the corresponding proportions in the total protein.
Die mechanische Zerkleinerung der vorzugsweise gereinigten Knochen bis zu einer Partikelgröße von weniger als 1.000 pm ist ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens. Aufgrund der geringen Partikelgröße wird eine direkte enzymatische Hydrolyse des Kollagens in dem Knochenmaterial er möglicht, ohne dass die aus dem Stand der Technik bekannten Vorbehand lungen wie Mazeration oder Äschern erforderlich sind. Das mechanische Zer kleinern kann eine Trockenvermahlung oder eine Nassvermahlung der Kno chen umfassen, wobei eine Nassvermahlung in einer wässrigen Suspension bevorzugt ist. Während der Zerkleinerung wird die Temperatur bei unter 70 °C gehalten, um lokale Überhitzungen des Materials zu vermeiden. The mechanical comminution of the preferably cleaned bones down to a particle size of less than 1,000 μm is an essential feature of the method according to the invention. Due to the small particle size, direct enzymatic hydrolysis of the collagen in the bone material is made possible without the need for the pretreatment procedures known from the prior art, such as maceration or liming. The mechanical comminution can include dry milling or wet milling of the bones, with wet milling in an aqueous suspension being preferred. During the shredding, the temperature is kept below 70 ° C in order to avoid local overheating of the material.
Zur Vorbereitung auf die enzymatische Hydrolyse werden die zerkleinerten Knochen in einer wässrigen Suspension auf eine Temperatur von über 100 °C erhitzt, wobei für diese thermische Vorbehandlung ein Zeitraum von maximal 30 min ausreichend ist. Dabei wird das Kollagen denaturiert und der enzymati schen Hydrolyse zugänglich gemacht. Der Gewichtsanteil an zerkleinerten Knochen in der wässrigen Suspension beträgt dabei vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 kg/l, bevorzugt von 0,1 bis 0,3 kg/l, weiter bevorzugt von 0,15 bis 0,2 kg/l. In preparation for the enzymatic hydrolysis, the minced bones are heated in an aqueous suspension to a temperature of over 100 ° C., a maximum of 30 minutes being sufficient for this thermal pretreatment. The collagen is denatured and made accessible for enzymatic hydrolysis. The weight fraction of crushed Bone in the aqueous suspension is preferably from 0.05 to 0.5 kg / l, preferably from 0.1 to 0.3 kg / l, more preferably from 0.15 to 0.2 kg / l.
Optional kann die thermische Vorbehandlung der zerkleinerten Knochen weiter beschleunigt und/oder intensiviert werden durch einen zusätzlichen Energie eintrag mittels Kavitation, z.B. durch Ultraschall oder einen Hochdruckhomo genisator. Eine weitere Möglichkeit ist die Beaufschlagung der Suspension mit elektrischen Wechselfeldern. Optionally, the thermal pretreatment of the comminuted bones can be further accelerated and / or intensified by an additional energy input by means of cavitation, e.g. by ultrasound or a high-pressure homogenizer. Another possibility is to apply alternating electric fields to the suspension.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der isoelektrische Punkt der hergestellten Kollagenpeptide auf einfache Weise be einflusst werden kann, indem während des Erhitzens der zerkleinerten Kno chen in der wässrigen Suspension ein entsprechender pH-Wert eingestellt wird. Je nach Anwendungsfeld können Kollagenpeptide mit einem hohen oder niedrigen IEP bevorzugt sein, wobei die Unterschiede in den Eigenschaften hier weniger gravierend sind als bei Gelatine vom Typ A bzw. Typ B. Another advantage of the method according to the invention is that the isoelectric point of the collagen peptides produced can be influenced in a simple manner by setting a corresponding pH value in the aqueous suspension while the comminuted bones are being heated. Depending on the field of application, collagen peptides with a high or low IEP may be preferred, whereby the differences in the properties are less serious here than with gelatine of type A or type B.
Um Kollagenpeptide mit einem hohen IEP von über 5,6 zu erhalten, wird der pH-Wert der wässrigen Suspension vor dem Erhitzen auf einen Bereich von 5 bis 7 eingestellt, bevorzugt von 6 bis 7. Ein hoher IEP ergibt sich in der Regel auch, wenn keine Einstellung des pH-Wertes vorgenommen wird. In order to obtain collagen peptides with a high IEP of over 5.6, the pH of the aqueous suspension is adjusted to a range from 5 to 7, preferably from 6 to 7, before heating. if the pH value is not adjusted.
Um Kollagenpeptide mit einem niedrigen IEP von unter 5,6 zu erhalten, wird der pH-Wert der wässrigen Suspension vor dem Erhitzen auf einen Bereich von 7 bis 9 eingestellt, bevorzugt von 7,9 bis 8,6. In order to obtain collagen peptides with a low IEP of below 5.6, the pH of the aqueous suspension is adjusted to a range from 7 to 9, preferably from 7.9 to 8.6, before heating.
Nach der thermischen Vorbehandlung wird die wässrige Suspension auf eine Temperatur im Bereich von 40 bis 60 °C abgekühlt, bevor die eine oder meh reren Proteasen zugegeben werden. In diesem Temperaturbereich liegen die Aktivitätsoptima der Proteasen, die für die enzymatische Hydrolyse des Kolla- gens typischerweise zum Einsatz kommen. Günstigerweise sind die eine oder mehreren Proteasen, die nach dem Erhitzen der wässrigen Suspension zugegeben werden, ausgewählt aus mikrobiellen Endoproteasen, bevorzugt Serinproteasen, insbesondere aus Bacillus subtilis. Die Verwendung solcher Enzyme zur Hydrolyse von Kollagen ist aus dem Stand der Technik bekannt. Eine häufig eingesetzte Protease ist z.B. Subtilisin. After the thermal pretreatment, the aqueous suspension is cooled to a temperature in the range from 40 to 60 ° C. before the one or more proteases are added. The activity optima of the proteases, which are typically used for the enzymatic hydrolysis of the collagen, are in this temperature range. The one or more proteases which are added to the aqueous suspension after heating are favorably selected from microbial endoproteases, preferably serine proteases, in particular from Bacillus subtilis. The use of such enzymes for the hydrolysis of collagen is known from the prior art. A protease that is frequently used is, for example, subtilisin.
Typischerweise werden die eine oder mehreren Proteasen in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.%, bezogen auf die Trockenmasse der zerkleinerten Kno chen, zugegeben, bevorzugt von 0,02 bis 0,2 Gew.%, weiter bevorzugt von 0,03 bis 0,1 Gew.%. The one or more proteases are typically added in an amount of from 0.01 to 0.5% by weight, based on the dry mass of the comminuted bones, preferably from 0.02 to 0.2% by weight, more preferably from 0 .03 to 0.1% by weight.
Die enzymatische Reaktion wird nach der Zugabe der einen oder mehreren Proteasen bevorzugt für einen Zeitraum vom 0,5 bis 4 Stunden durchgeführt, weiter bevorzugt von 1 bis 3 Stunden. After the addition of the one or more proteases, the enzymatic reaction is preferably carried out for a period of from 0.5 to 4 hours, more preferably from 1 to 3 hours.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die zerkleiner ten Knochen nach dem Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden ein weiteres Mal den Schritten c) bis e) unterzogen. Durch dieses zweimalige Erhitzen und Behandeln mit Protease der zerkleinerten Knochen kann die Aus beute an Kollagenpeptiden erhöht werden. In a preferred embodiment of the invention, the minced bones are subjected once more to steps c) to e) after the aqueous solution of collagen peptides has been separated off. By heating the crushed bones twice and treating them with protease, the yield of collagen peptides can be increased.
Das Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden von den zerklei nerten Knochen umfasst bevorzugt eine Filtration, insbesondere eine Mem branfiltration. Dadurch können auch kleinste Partikel der zerkleinerten Kno chen und andere Feststoffe entfernt werden. The separation of the aqueous solution of collagen peptides from the pulverized bones preferably comprises a filtration, in particular a membrane filtration. This means that even the smallest particles of the crushed bones and other solids can be removed.
Nach einer Filtration kann die wässrige Lösung von Kollagenpeptiden bevor zugt einem Ionenaustausch unterzogen werden, insbesondere einer Entsal zung. After filtration, the aqueous solution of collagen peptides can preferably be subjected to an ion exchange, in particular desalination.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner ein Trocknen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden, um ein Pulver von Kollagenpeptiden zu erhalten, insbesondere mittels Sprühtrocknung. Zuvor kann die wässrige Lösung mit Hilfe von Verdampfern aufkonzentriert werden. According to a preferred embodiment, the method according to the invention further comprises drying the aqueous solution of collagen peptides in order to obtain a powder of collagen peptides, in particular by means of Spray drying. The aqueous solution can be concentrated beforehand with the aid of evaporators.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Kollagenpeptide, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind. The present invention also relates to collagen peptides which are produced by the method according to the invention.
Die erfindungsgemäßen Kollagenpeptide weisen typischerweise ein gewichts mittleres Molekulargewicht von weniger als 25.000 Da auf, bevorzugt von we niger als 10.000 Da, weiter bevorzugt von weniger als 5.000 Da. Besonders günstig ist ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 500 bis 5.000 Da, ins besondere von 2.000 bis 4.000 Da. The collagen peptides according to the invention typically have a weight average molecular weight of less than 25,000 Da, preferably less than 10,000 Da, more preferably less than 5,000 Da. A weight-average molecular weight of 500 to 5,000 Da, in particular 2,000 to 4,000 Da, is particularly favorable.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Kollagen peptide einen hohen isoelektrischen Punkt von über 5,6 auf, insbesondere von über 6,0. In a preferred embodiment of the invention, the collagen peptides have a high isoelectric point of over 5.6, in particular of over 6.0.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die Kollagen peptide einen niedrigen isoelektrischen Punkt von unter 5,6 auf, insbesondere von 5,2 bis 5,6. According to a further embodiment of the invention, the collagen peptides have a low isoelectric point of below 5.6, in particular from 5.2 to 5.6.
Diese und weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgend beschriebenen Beispielen. These and other advantages of the invention emerge from the examples described below.
Es zeigt: It shows:
Fig. 1: Ladungsverteilungen von Kollagenpeptiden gemäß dem Stand derFig. 1: Charge distributions of collagen peptides according to the prior art
Technik und gemäß der Erfindung mittels isoelektrischer Fokussierung. Beispiel 1: Herstellung von Kollaaenpeptiden aus Knochen im Labormaßstab Technique and according to the invention by means of isoelectric focusing. Example 1: Production of collagen peptides from bone on a laboratory scale
Rinderknochen werden mittels Heißwasser und durch Proteasen unterstützte Entfleischung und Entfettung vorgereinigt und anschließend zu einem Kno chenpulver mit einer Partikelgrößenverteilung von d50 < 350 pm und d90 < 700 pm gemahlen. Das Knochenpulver wird dann mit gleicher Masse Wasser vermischt und im Mikrowellenherd unter Rühren für ca. 1 min auf 120 bis 130 °C erhitzt. Nach Abkühlung (ca. 20 min) auf unter 100 °C werden 0,1 Gew.% (bezogen auf die Knochenpulvermasse) der Protease Subtilisin zugegeben und die Suspension bei 60 °C gerührt. Aufgrund der enzymatischen Reaktion unter Bildung von löslichen Kollagenpeptiden steigt die Konzentration der wässrigen Phase mit der Zeit an, wie in der Tabelle 1 angegeben. Die Konzentration wird mit einem Refraktometer gemessen, das auf die Einheit °Brix zur Messung von Saccharose kalibriert ist. Cattle bones are pre-cleaned using hot water and defleading and degreasing supported by proteases and then ground to a bone powder with a particle size distribution of d50 <350 μm and d90 <700 μm. The bone powder is then mixed with the same mass of water and heated in a microwave oven with stirring for approx. 1 min at 120 to 130 ° C. After cooling (approx. 20 min) to below 100 ° C, 0.1% by weight (based on the bone powder mass) of the protease subtilisin is added and the suspension is stirred at 60 ° C. Due to the enzymatic reaction with the formation of soluble collagen peptides, the concentration of the aqueous phase increases over time, as indicated in Table 1. The concentration is measured with a refractometer which is calibrated to the unit ° Brix for measuring sucrose.
Tabelle 1 Table 1
Nach Sedimentation des Knochenpulvers wird der Uberstand filtriert und ent salzt. Die Kollagenpeptide werden aufkonzentriert und getrocknet. Der IEP der Kollagenpeptide liegt bei 6,23. After sedimentation of the bone powder, the supernatant is filtered and desalted. The collagen peptides are concentrated and dried. The IEP of the collagen peptides is 6.23.
Die Verteilung der molekularen Ladungen dieser erfindungsgemäßen Kollagen peptide kann mittels isoelektrischer Fokussierung bestimmt werden. Ein ent sprechendes Chromatogramm ist in der Figur 1 dargestellt, wobei links der pH-Wert im Gel angegeben ist und die drei Spuren wie folgt belegt sind: The distribution of the molecular charges of these collagen peptides according to the invention can be determined by means of isoelectric focusing. A corresponding chromatogram is shown in FIG. 1, the pH value in the gel being indicated on the left and the three traces being covered as follows:
Spur Nr. 1: Markerpeptide Lane No. 1: marker peptides
Spur Nr. 2: Kollagenpeptide aus Knochengelatine vom Typ B gemäß dem Stand der Technik (mit Mazeration und Äschern) Lane No. 2: Bone gelatin collagen peptides of type B according to the prior art (with maceration and liming)
Spur Nr. 3: erfindungsgemäßen Kollagenpeptide gemäß dem obigen Beispiel Die Ladungen der Moleküle sind prinzipiell bei beiden Proben ähnlich, wobei die erfindungsgemäßen Kollagenpeptide in diesem Fall auch Banden von nega tiven, d.h. alkalischen Molekülen zeigen. Der pH-Wert bei der Denaturierung bestimmt die Lage der Banden und damit den isoelektrischen Punkt der Kolla genpeptide. Lane no. 3: collagen peptides according to the invention according to the above example The charges of the molecules are in principle similar in both samples, the collagen peptides according to the invention in this case also showing bands of negative, ie alkaline, molecules. The pH value during denaturation determines the position of the bands and thus the isoelectric point of the collagen peptides.
Beispiel 2: Herstellung von Kollaaenpeptiden aus Knochen im Pilotmaßstab Example 2: Production of collagen peptides from bone on a pilot scale
In einem Rührbehälter wird eine 15 Gew.%ige wässrige Suspension von gerei nigtem Knochenpulver (d90 < 700 pm) aus Rinderknochen vorgelegt, wobei die Knochen zuvor wie im Beispiel 1 gereinigt wurden. Das Verhältnis von Gesamtprotein zu Kollagen beträgt 1,7 (normiert auf Trockenmasse minus Fettgehalt). Der pH-Wert der Suspension wird auf 6,5 eingestellt. A 15% strength by weight aqueous suspension of cleaned bone powder (d90 <700 μm) from cattle bones is placed in a stirred container, the bones having been cleaned beforehand as in Example 1. The ratio of total protein to collagen is 1.7 (normalized to dry matter minus fat content). The pH of the suspension is adjusted to 6.5.
Die Suspension wird mit einer Pumpe durch einen Wärmetauscher gepumpt und dadurch auf 130 °C erhitzt. Diese Temperatur wird ca. 6 min gehalten. Anschließend wird die Suspension durch einen Wärmetauscher auf ca. 60 °C abgekühlt und in einem Rührbehälter gesammelt. Es werden 0,05 Gew.% (bezogen auf die trockene Knochenmasse) der Protease Subtilisin zugegeben. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird die enzymatische Hydrolyse durch Erhitzen der Suspension auf 85 °C für 5 min abgebrochen. The suspension is pumped through a heat exchanger and heated to 130 ° C. This temperature is held for about 6 minutes. The suspension is then cooled to approx. 60 ° C. using a heat exchanger and collected in a stirred tank. 0.05% by weight (based on the dry bone mass) of the protease subtilisin are added. After a reaction time of 2 hours, the enzymatic hydrolysis is terminated by heating the suspension to 85 ° C. for 5 minutes.
Die wässrige Phase wird mit einer Dekantierzentrifuge abgetrennt und in ei nem Behälter gesammelt. Die feste Phase wird noch einmal in derselben Weise behandelt wir oben für das Knochenpulver beschrieben (Herstellen einer Sus pension, thermische Vorbehandlung, Abkühlung, enzymatische Hydrolyse und Abtrennen der wässrigen Phase durch Dekantieren). The aqueous phase is separated off with a decanter centrifuge and collected in a container. The solid phase is treated again in the same way as described above for the bone powder (preparation of a suspension, thermal pretreatment, cooling, enzymatic hydrolysis and separation of the aqueous phase by decanting).
Die wässrigen Phasen (Kollagenpeptidlösungen) aus beiden Durchgängen wer den vereinigt und zur weiteren Aufreinigung mit geeigneten Verfahren filtriert, entsalzt, aufkonzentriert und getrocknet. Die Ausbeute dieses Verfahrens liegt bei ca. 16 bis 19 Gew.% Kollagenpepti- den, bezogen auf die eingesetzte Knochenmasse. The aqueous phases (collagen peptide solutions) from both runs are combined and, for further purification, filtered, desalted, concentrated and dried using suitable methods. The yield of this process is approx. 16 to 19% by weight of collagen peptides, based on the bone mass used.
Die Qualität der Kollagenpeptide kann z. B. anhand von hohen Transmissions werten von wässrigen Lösungen mit einer Konzentration von 20 Gew.% bei den Wellenlängen 450 nm und 620 nm bewertet werden. Die gemessenen Werte und der jeweilige Qualitätsstandard sind in der Tabelle 2 angegeben: The quality of the collagen peptides can be e.g. B. on the basis of high transmission values of aqueous solutions with a concentration of 20 wt.% At the wavelengths 450 nm and 620 nm can be evaluated. The measured values and the respective quality standard are given in table 2:
Tabelle 2 Table 2
Das gewichtsmittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide gemäß dem Bei spiel 2 liegt im Bereich von 3.000±500 Da. Durch die Wahl des Enzyms, die Enzymmenge und die Reaktionszeit kann die Molekulargewichtsverteilung der erfindungsgemäßen Kollagenpeptide beeinflusst werden. The weight average molecular weight of the collagen peptides according to the example 2 is in the range of 3,000 ± 500 Da. The molecular weight distribution of the collagen peptides according to the invention can be influenced by the choice of enzyme, the amount of enzyme and the reaction time.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patent claims
1. Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptiden aus Knochen, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von Knochen von Wirbeltieren; b) mechanisches Zerkleinern der Knochen bis zu einer Partikelgröße von weniger als 1.000 pm, bevorzugt weniger als 500 pm, weiter bevorzugt weniger als 300 pm, bei einer Temperatur von weniger als 70 °C während der Zerkleinerung; c) Erhitzen der zerkleinerten Knochen in einer wässrigen Suspension auf eine Temperatur von über 100 °C, bevorzugt über 120 °C, weiter bevorzugt über 130 °C, für einen Zeitraum von 1 bis 30 min, bevorzugt 2 bis 10 min, weiter bevorzugt 4 bis 8 min; d) Zugabe einer oder mehrerer Proteasen zu der Suspension, um eine wässrige Lösung von Kollagenpeptide zu erhalten; und e) Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden von den zerkleinerten Knochen, wobei das Verfahren weder eine Mazeration der Knochen mit einer Säure noch ein Äschern der Knochen mit einer Base umfasst, und wobei die in Schritt a) bereitgestellten Kochen keiner Mazeration und keinem Äschern unterzogen wurden. A method for producing collagen peptides from bones, comprising the following steps: a) providing vertebrate bones; b) mechanical comminution of the bones down to a particle size of less than 1,000 μm, preferably less than 500 μm, more preferably less than 300 μm, at a temperature of less than 70 ° C. during the comminution; c) heating the comminuted bones in an aqueous suspension to a temperature of over 100 ° C., preferably over 120 ° C., more preferably over 130 ° C., for a period of 1 to 30 min, preferably 2 to 10 min, more preferably 4 up to 8 min; d) adding one or more proteases to the suspension in order to obtain an aqueous solution of collagen peptides; and e) separating the aqueous solution of collagen peptides from the comminuted bones, the method comprising neither maceration of the bones with an acid nor liming of the bones with a base, and wherein the boiling provided in step a) does not undergo maceration or liming were.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Knochen von Säugetieren stammen, insbesondere von Rindern. 2. The method according to claim 1, wherein the bones come from mammals, in particular from cattle.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochen vor dem Zerkleinern gereinigt werden, insbesondere entfettet werden. 3. The method according to any one of the preceding claims, wherein the bones are cleaned, in particular degreased, before comminution.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Reinigung der Knochen eine Behandlung mit einem oder mehreren Enzymen umfasst, bevorzugt mit Proteasen und/oder Lipasen. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochen vor dem Zerkleinern einen Fettgehalt von weniger als 4 Gew.% aufweisen, bevorzugt von weniger als 1 Gew%, weiter bevorzugt von weniger als 0,4. The method according to claim 3, wherein the cleaning of the bones comprises a treatment with one or more enzymes, preferably with proteases and / or lipases. 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the bones have a fat content of less than 4% by weight, preferably less than 1% by weight, more preferably less than 0, before comminuting.
5 Gew.%. 5% by weight.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochen vor dem Zerkleinern einen Gehalt an Kollagen im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt von mindestens 55% aufweisen, bevorzugt von 70 bis 90%, wobei der Kollagengehalt bestimmt wird über den Hydroxyprolingehalt multipliziert mit dem Faktor 7,3 und der Gesamt proteingehalt bestimmt wird über den Kjeldahl-Stickstoffgehalt multipli ziert mit dem Faktor 6,25. 6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the bones have a collagen content in relation to the total protein content of at least 55% in relation to the total protein content, preferably from 70 to 90%, the collagen content being determined by the hydroxyproline content multiplied by a factor of 7, 3 and the total protein content is determined using the Kjeldahl nitrogen content multiplied by a factor of 6.25.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mechanische Zerkleinern eine Trockenvermahlung oder eine Nassver mahlung der Knochen umfasst, bevorzugt eine Nassvermahlung in einer wässrigen Suspension. 7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the mechanical comminution comprises dry grinding or wet grinding of the bones, preferably wet grinding in an aqueous suspension.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erhit zen in einer wässrigen Suspension mit einem Gewichtsanteil an zerklei nerten Kochen von 0,05 bis 0,5 kg/l durchgeführt wird, bevorzugt von 0,1 bis 0,3 kg/l, weiter bevorzugt von 0,15 bis 0,2 kg/l. 8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the heating is carried out in an aqueous suspension with a weight fraction of crushed boiling of 0.05 to 0.5 kg / l, preferably 0.1 to 0.3 kg / l , more preferably from 0.15 to 0.2 kg / l.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei vor dem Erhitzen der pH-Wert der wässrigen Suspension auf einen Bereich von 5 bis 7 eingestellt wird, bevorzugt von 6 bis 7, um Kollagenpeptide mit einem isoelektrischen Punkt von über 5,6 zu erhalten, oder wobei vor dem Erhitzen der pH-Wert der wässrigen Suspension auf einen Bereich von 7 bis 9 eingestellt wird, bevorzugt von 7,9 bis 8,6, um Kollagen peptide mit einem isoelektrischen Punkt von unter 5,6 zu erhalten. 9. The method according to any one of the preceding claims, wherein, before heating, the pH of the aqueous suspension is adjusted to a range from 5 to 7, preferably from 6 to 7, in order to obtain collagen peptides with an isoelectric point of above 5.6, or wherein, before heating, the pH of the aqueous suspension is adjusted to a range from 7 to 9, preferably from 7.9 to 8.6, in order to obtain collagen peptides with an isoelectric point of below 5.6.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäss rige Suspension vor der Zugabe der einen oder mehreren Proteasen auf eine Temperatur im Bereich von 40 bis 60 °C abgekühlt wird. 10. The method according to any one of the preceding claims, wherein the aqueous suspension is cooled to a temperature in the range from 40 to 60 ° C before the addition of the one or more proteases.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder mehreren Proteasen, die nach dem Erhitzen der wässrigen Suspen sion zugegeben werden, ausgewählt sind aus mikrobiellen Endopro- teasen, bevorzugt Serinproteasen, insbesondere aus Bacillus subtilis. 11. The method according to any one of the preceding claims, wherein the one or more proteases which are added to the aqueous suspension after heating are selected from microbial endoproteases, preferably serine proteases, in particular from Bacillus subtilis.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder mehreren Proteasen in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew%, bezo gen auf die Trockenmasse der zerkleinerten Knochen, zugegeben werden, bevorzugt von 0,02 bis 0,2 Gew%, weiter bevorzugt von 0,03 bis 0,1 Gew.%. 12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the one or more proteases are added in an amount of 0.01 to 0.5% by weight, based on the dry matter of the comminuted bones, preferably from 0.02 to 0.2 % By weight, more preferably from 0.03 to 0.1% by weight.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die enzymatische Reaktion nach der Zugabe der einen oder mehreren Proteasen für einen Zeitraum von 0,5 bis 4 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt von 1 bis 3 Stunden. 13. The method according to any one of the preceding claims, wherein the enzymatic reaction is carried out after the addition of the one or more proteases for a period of 0.5 to 4 hours, preferably from 1 to 3 hours.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zerkleinerten Knochen nach dem Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden ein weiteres Mal den Schritten c) bis e) unterzogen werden. 14. The method according to any one of the preceding claims, wherein the comminuted bones are subjected to steps c) to e) a further time after the aqueous solution of collagen peptides has been separated off.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden eine Filtration umfasst, insbesondere eine Membranfiltration. 15. The method according to any one of the preceding claims, wherein the separation of the aqueous solution of collagen peptides comprises a filtration, in particular a membrane filtration.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend ein Trocknen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden, um ein Pulver von Kollagenpeptiden zu erhalten, insbesondere mittels Sprühtrocknung. 16. The method according to any one of the preceding claims, further comprising drying the aqueous solution of collagen peptides in order to obtain a powder of collagen peptides, in particular by means of spray drying.
17. Kollagenpeptide, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche. 17. Collagen peptides produced according to the method according to any one of the preceding claims.
18. Kollagenpeptide nach Anspruch 17 mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von weniger als 25.000 Da aufweisen, bevorzugt von weniger als 10.000 Da, weiter bevorzugt von weniger als 5.000 Da. 18. Collagen peptides according to claim 17 with a weight average molecular weight of less than 25,000 Da, preferably less than 10,000 Da, more preferably less than 5,000 Da.
19. Kollagenpeptide nach Anspruch 18 mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von 500 bis 5.000 Da, insbesondere von 2.000 bis 4.000 Da. 19. Collagen peptides according to claim 18 with a weight average molecular weight of 500 to 5,000 Da, in particular 2,000 to 4,000 Da.
20. Kollagenpeptide nach einem der Ansprüche 17 bis 19 mit einem isoelektrischen Punkt von über 5,6, insbesondere von über 6,0. 20. Collagen peptides according to one of claims 17 to 19 with an isoelectric point of more than 5.6, in particular of more than 6.0.
21. Kollagenpeptide nach Anspruch 17 oder 18 mit einem isoelektrischen Punkt von unter 5,6, insbesondere von 5,2 bis 5,6. 21. Collagen peptides according to claim 17 or 18 with an isoelectric point of below 5.6, in particular from 5.2 to 5.6.
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