EP3924462A1 - Procede d'obtention d'une solution aqueuse enrichie en pigment bleu - Google Patents

Procede d'obtention d'une solution aqueuse enrichie en pigment bleu

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Publication number
EP3924462A1
EP3924462A1 EP19868210.6A EP19868210A EP3924462A1 EP 3924462 A1 EP3924462 A1 EP 3924462A1 EP 19868210 A EP19868210 A EP 19868210A EP 3924462 A1 EP3924462 A1 EP 3924462A1
Authority
EP
European Patent Office
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blue pigment
aqueous solution
haslea
filtration
filter
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19868210.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Charlotte FALAISE
Lila ZEBIRI
Boris JACQUETTE
Pamela PASETTO
Jean-Luc Mouget
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Le Mans Universite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Le Mans Universite
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Le Mans Universite filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3924462A1 publication Critical patent/EP3924462A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B67/00—Influencing the physical, e.g. the dyeing or printing properties of dyestuffs without chemical reactions, e.g. by treating with solvents grinding or grinding assistants, coating of pigments or dyes; Process features in the making of dyestuff preparations; Dyestuff preparations of a special physical nature, e.g. tablets, films
    • C09B67/0071—Process features in the making of dyestuff preparations; Dehydrating agents; Dispersing agents; Dustfree compositions
    • C09B67/0083—Solutions of dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B61/00—Dyes of natural origin prepared from natural sources, e.g. vegetable sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B67/00—Influencing the physical, e.g. the dyeing or printing properties of dyestuffs without chemical reactions, e.g. by treating with solvents grinding or grinding assistants, coating of pigments or dyes; Process features in the making of dyestuff preparations; Dyestuff preparations of a special physical nature, e.g. tablets, films
    • C09B67/0096—Purification; Precipitation; Filtration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention relates to the field of processes for obtaining an aqueous solution enriched with blue pigment, for example the "marennine" pigment. It relates more particularly to a process for obtaining an aqueous solution enriched in blue pigment comprising the steps a) of supplying an aqueous solution comprising a blue pigment derived from at least one microorganism of the genus Haslea, b) of precipitation of the blue pigment with sodium hydroxide, c) separation of the precipitated phase from the aqueous phase, d) solubilization of the blue pigment included in the precipitated phase, and e) dialysis.
  • Certain species of diatom from the genus Haslea are known for their capacity to produce a water-soluble blue pigment, responsible for the greening phenomenon of the gills and other pallial organs of oysters. This greening is based on the erratic proliferation of diatoms in oyster basins (clear to oysters) and is of great economic interest for oyster farmers, green oysters (ie "clear green” or “clear green fines”) being rarer and more expensive than non-green oysters ripened in the clears.
  • the interest of the blue pigment for its applications in aquaculture is increasing in particular taking into account the production and the marketing of green oysters on an international level.
  • Haslea diatom in mass Methods for cultivating the Haslea diatom in mass have been described in particular in patent applications FR 2837833 and FR 2654743. Methods for extracting the blue pigment, in particular the blue pigment called "marennine" produced by the species H. ostrearia, from a culture medium have also been described (cf.
  • the subject of the present invention is a process for obtaining an aqueous solution enriched in blue pigment comprising in particular a step of precipitation of the blue pigment with sodium hydroxide, a step of separation of the precipitated phase from the aqueous phase, a step of solubilization of the precipitated phase and a step of dialysis.
  • the inventors have demonstrated that a process for obtaining an aqueous solution enriched with blue pigment comprising these steps makes it possible to avoid any step of ultrafiltration and column chromatography .
  • the process of the invention is advantageous because an aqueous solution enriched with blue pigment can be obtained, with a final concentration of blue pigment equal to or greater than that obtained in the prior art, while limiting the costs of the process. Indeed, it is estimated that the ultrafiltration steps according to the method of Pouvreau et al., 2006a leads to a loss of the blue pigment of approximately 30 to 40% of the starting mass.
  • the process is very easy to implement and can be used on large volumes of aqueous solution. This process is also advantageous since it makes it possible to reduce the total time for implementing the process necessary for obtaining an aqueous solution enriched with blue pigment.
  • the process of the invention also makes it possible to obtain an aqueous solution enriched with blue pigment suitable for use in the greening of oysters.
  • the present invention therefore relates to a process for obtaining an aqueous solution enriched with blue pigment comprising:
  • Steps b) and c) make it possible to obtain a precipitate of the blue pigment which can then be dissolved, in order to obtain a solution enriched in blue pigment without an intermediate stage of ultrafiltration or column chromatography.
  • the separation step (step c)) advantageously makes it possible to remove the soluble impurities not precipitated with sodium hydroxide.
  • step e) of dialysis makes it possible to obtain an aqueous solution of blue pigment while reducing the impurities (e.g. elimination of salts).
  • step c) of separation comprises decantation and / or centrifugation, preferably decantation followed by centrifugation. This removes most, if not all, of the aqueous phase.
  • the blue pigment is precipitated by the addition of at least 0.3 to 0.4 volumes of 1M sodium hydroxide.
  • the blue pigment is thus included in the precipitated phase while unwanted water-soluble compounds are kept in the aqueous phase.
  • the blue pigment included in the precipitated phase is dissolved in step d) with carboxylic acid, preferably formic acid.
  • the method further comprises a sterilizing filtration step, preferably on a filter having a porosity of 0.22 pmn before step e).
  • the method further comprises at least one step of filtration through a filter having an average pore size of at least 1.2 ⁇ m before step b), preferably, a first filtration through a filter having an average pore size of between 12 and 15 ⁇ m followed by a second filtration through a filter having an average pore size of 1.2 ⁇ m.
  • this first filtration makes it possible to avoid clogging during the second filtration.
  • the aqueous solution enriched with blue pigment obtained in step e) comprises a concentration of blue pigment of at least 90 mg / L.
  • the aqueous phase obtained in step c) is subjected to a new precipitation step according to step b) followed by a separation step according to step c).
  • the dialysis membrane has a cutoff threshold of between 1 and 3.5 kDa.
  • the aqueous solution provided in step a) is a supernatant of a culture of at least one diatom selected from: Haslea ostrearia, Haslea karadagensis, Haslea provincialis, Haslea nusantara, Haslea silbo sp nov, and Haslea acoran sp nov, preferably from a culture of diatomaceous Haslea ostrearia NCC 497 deposited with the BEA 1 October 2018 under the number BEA_IDA_0065B.
  • the present invention relates to an aqueous solution enriched with blue pigment capable of being obtained by the process as described here.
  • Fig. 1 Diagram illustrating the process according to the invention.
  • the dotted frames represent optional steps.
  • FIG. 2 shows the characterization of the aqueous solution enriched with blue pigment of the “marermine” type called “MCPN” obtained according to the present invention by:
  • Fig. 2A Ultraviolet (UV) -visible absorption spectrum of concentrated marennin obtained according to the present invention (diluted 6 times), with comparison to the spectrum obtained with a solution of purified marennine according to the method of Pouvreau et al 2006a ("pure marermine" ) at 0.2 mg / mL
  • Fig. 2C is a size exclusion chromatography analysis (SEC-HPLC).
  • AU stands for "absorbance units”, ppm for "parts per million”.
  • FIG. 3 is a comparison of the characteristics of the blue pigment of “marennine” type prepared according to the method of the present invention (called “MCPN”) or according to the method of Turcotte et al 2016 (“blue water” or “BW”) or again according to Pouvreau et al 2006a ("pure marennine”)
  • Fig. 3A is an ultraviolet (UV) -visible absorption spectrum
  • Fig. 3B is a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum
  • Fig. 3C is a size exclusion chromatography analysis (SEC-HPLC).
  • AU stands for "absorbance units”, ppm for "parts per million”.
  • the inventors have demonstrated a new process for obtaining an aqueous solution enriched with blue pigment comprising the steps of precipitation of the blue pigment with sodium hydroxide, of separation of the precipitated phase of the aqueous phase, of solubilization of the precipitated phase, and of dialysis.
  • a process comprising these steps advantageously makes it possible to avoid any step of ultrafiltration and column chromatography.
  • the process according to the invention has the advantage of obtaining an aqueous solution enriched in blue pigment with a final concentration of blue pigment at least equal to that obtained using the existing processes, while limiting the costs of the process.
  • the process is very easy to carry out, and can be used on large volumes of aqueous solution.
  • the yield of blue pigment obtained by the process of the invention is, advantageously, higher than that obtained by the processes according to the prior art. This process also makes it possible to reduce the time necessary to obtain an aqueous solution enriched with blue pigment.
  • a first aspect of the invention therefore relates to a process for obtaining an aqueous solution enriched with blue pigment comprising: a) the supply of an aqueous solution comprising a blue pigment derived from at least one microorganism of the genus Haslea,
  • Steps a) to e) are implemented in order a), then b), then c), then d), then e).
  • additional steps excluding any ultrafiltration and / or column chromatography step may be used:
  • step a) may be preceded by a step of culturing the diatoms of the genus Haslea and, optionally, by a step of lysis of the diatoms of the genus Haslea present in the aqueous solution. • Between steps a) and b)
  • a filtration step can be added between steps a) and b).
  • the aqueous phase obtained in step c) can be resubmitted in steps b) and c) and the precipitate obtained grouped with that obtained previously.
  • a filtration step can be added between steps d) and e).
  • a concentration or formulation step can be added after step e).
  • the purification process according to the invention is in particular implemented from an aqueous solution comprising a blue pigment derived from at least one microorganism of the genus Haslea, preferably from a supernatant from a culture medium d '' at least one microorganism of the genus Haslea.
  • blue pigment is meant, within the meaning of the present invention, a water-soluble blue pigment produced by a diatom of the genus Haslea.
  • Said blue pigment can in particular be the blue pigment called “marennine” produced by the diatom H. ostrearia or any other blue pigment produced by a diatom of the genus Haslea, such as
  • Said blue pigment can comprise or consists of several blue pigments produced by different diatoms.
  • the blue pigment according to the invention comprises marennine. According to a particular mode, the blue pigment according to the invention consists of marennine.
  • the intracellular form that present in the diatom
  • the extracellular form of the blue pigment which is released into the marine environment.
  • the intracellular form of marennine has a different molar mass than the extracellular form (Pouvreau et al., 2006a).
  • the blue pigment can comprise blue pigment in its intracellular form and / or its extracellular form.
  • the blue pigment essentially consists of its extracellular form.
  • the blue pigment consists of its extracellular form.
  • the blue pigment comprises both the intracellular form and the extracellular form.
  • the blue pigment essentially consists of its intracellular form.
  • the blue pigment consists of its intracellular form.
  • Step a) of the process according to the invention is a step of supplying an aqueous solution comprising a blue pigment derived from at least one microorganism of the genus Haslea.
  • aqueous solution any solution comprising blue pigment derived from at least one microorganism of the genus Haslea.
  • said aqueous solution is a diatom culture.
  • the diatom culture includes the diatoms themselves and the supernatant (i.e. the culture medium without the diatoms).
  • said aqueous solution comprises the supernatant. This would be the case, for example, if the supernatant is mixed with another solution before step a), for example water.
  • said aqueous solution consists essentially of the supernatant.
  • said aqueous solution is the supernatant.
  • said diatom is selected from the group consisting of: H. ostrearia, H. karadagensis, H. provincialis, H. nusantara, H. silbo sp nov, H. acoran sp nov.
  • said diatom is H. ostrearia, more preferably H. ostrearia NCC 497 even more preferably H. ostrearia NCC 497 deposited with the “Banco Espanoi de Algas” (BEA), Universidad de Las Palmas de GC, Muelle de Taliarte s / n, 35214 Telde - Las Palmas, Spain on 1 October 2018 under the BEA_IDA_0065B number.
  • the aqueous solution can comprise water-soluble blue pigment produced by at least two species of diatoms, or by at least two strains of a given species (eg two strains of H. ostrearia). Said diatoms may have been grown together, or grown individually.
  • the culture, preferably the culture supernatants, of each diatom are added together in step a).
  • one of the two species is H. ostrearia.
  • one of the two strains is H. ostrearia NCC 497, preferably H. ostrearia NCC 497 deposited with the "Banco Espanoi de Algas" (BEA) on 1 October 2018 under the number BEA_IDA_0065B.
  • the aqueous solution supplied in step a) comprises lysed diatoms.
  • a lysis step can therefore precede step a).
  • a lysis step is particularly advantageous when a solution comprising both extracellular and intracellular forms of the blue pigment is desired.
  • a lysis step in fact makes it possible to release intracellular blue pigment in the supernatant or in any other aqueous solution.
  • the lysis of diatoms can be carried out according to the method described in Pouvreau et al., 2006a as described on page 770.
  • the concentration of blue pigment in the aqueous solution in step a) is between 2 and 7 mg / L, more advantageously between 3 and 5 mg / L. According to a particular embodiment, the concentration of blue pigment in the aqueous solution in step a) is at least 2 mg / L, preferably at least 3 mg / L.
  • the concentration of blue pigment in the aqueous solution can be determined by the skilled person in the light of his general knowledge. By way of nonlimiting example, the concentration of blue pigment can be determined by spectrophotometry, by the Lowry method (Pouvreau, et al., 2006b), or by HPLC by gel filtration connected to a photodiode detector (Pouvreau et al., 2007). Preferably, the concentration of blue pigment is determined by spectrophotometry using the extinction coefficient published in Pouvreau, et al. (2006b).
  • the pH of the aqueous solution comprising blue pigment is between 7 and 9, more preferably around 8 (+/- 0.2).
  • the aqueous solution comprising the blue pigment supplied in step a) has not undergone any prior filtration step.
  • the aqueous solution supplied in step a) is however filtered before step b).
  • This additional step is particularly preferred when the aqueous solution comprises aggregates or any other non-water-soluble particle because the filtration step makes it possible to separate these impurities upstream of the precipitation, thus improving the purity of the precipitate obtained in step b).
  • a filtration step is inserted between steps a) and b) when the aqueous solution is a diatom culture, the filtration step making it possible to separate the supernatant from the diatoms before any other step.
  • the porosity of the filter preferably makes it possible to retain the diatoms, without however retaining other compounds (eg blue pigment).
  • the methods and filters suitable for such a filtration step are well known to the person skilled in the art. Such a step can in particular be carried out using filters of the glass microfiber type (sold by Whatman, for example of the GF / C type).
  • At least one filtration step is carried out, more preferably, at least two filtration steps are carried out.
  • the filtration is carried out through a filter having an average pore size of at least 1.2 ⁇ m, preferably 1.4 ⁇ m.
  • the filtration step is carried out through two filters of different size, the second filter having an average pore size smaller than the first filter and at least 1.2 ⁇ m (for example . of 1, 4 pm).
  • the first filtration makes it possible to avoid clogging during the second filtration.
  • the filtration step comprises a first filtration through a filter having an average pore size of between 12 and 15 ⁇ m followed by a second filtration through a filter having an average pore size 1, 2 pm or 1, 4 pm.
  • step a) of supplying an aqueous solution comprising the blue pigment said blue pigment is precipitated with sodium hydroxide.
  • the solution is called "mixture" because it comprises both a precipitated phase and an aqueous phase.
  • step b the majority of the blue pigment is precipitated and is therefore found in solid form, in the precipitated phase.
  • sodium hydroxide is added until the blue pigment has completely precipitated.
  • the amount of sodium hydroxide to be added varies depending on the concentration of the blue pigment in the aqueous solution of step a) as well as the volume of the aqueous solution. Complete precipitation leads to discoloration of the aqueous phase.
  • the precipitation step by adding sodium hydroxide corresponds to a step easily achievable by the person skilled in the art, taking into account its visual appearance.
  • the unwanted water-soluble compounds present in the aqueous solution such as proteins and carbohydrates, or even other compounds having no absorption in the visible spectrum, remain in the aqueous phase.
  • the final percentage (mass / mass) of sodium hydroxide relative to the aqueous solution is between 0.02 and 0.04%.
  • the concentration of the sodium hydroxide solution added to the aqueous solution is less than or equal to 10 M, preferably less than or equal to 2 M, more preferably between 1 M and 2 M, even more preferably more than 1 M or 2 M.
  • said final percentage of sodium hydroxide relative to the aqueous solution may vary depending on the initial concentration or quantity of blue pigment in the aqueous solution supplied in step a ).
  • complete precipitation can be observed by adding 5 to 10 mL of 1 M sodium hydroxide to an aqueous solution having a volume of 1 L and a blue pigment concentration of a few mg / L.
  • the pH of the mixture obtained following step b) is at least 12.
  • the sodium hydroxide is added in several stages, advantageously drop by drop.
  • the mixture may or may not be stirred.
  • the mixture is stirred.
  • the aqueous solution can be maintained between 4 ° C and 25 ° C, for example between 4 ° C and 8 ° C or at room temperature, for example between 20 and 25 ° vs.
  • step b) precipitation of the blue pigment with sodium hydroxide
  • step c) makes it possible to limit the volume of the mixture to be treated downstream.
  • the methods suitable for such a separation step are well known to the person skilled in the art.
  • Such a step can in particular be carried out by decantation and / or by centrifugation.
  • the separation step can be carried out between 4 ° C and 25 ° C, for example between 4 ° C and 8 ° C or at room temperature, for example between 20 and 25 ° C.
  • the separation according to step c) comprises decantation.
  • decantation is meant, within the meaning of the present invention, an operation which consists in allowing the mixture to stand for a given period of time, so that the precipitate is deposited by difference in gravity, in order to remove the aqueous phase .
  • the decantation therefore comprises a step of resting the mixture before the physical separation of the precipitated phase from the aqueous phase.
  • the mixture is left to stand, it is not stirred.
  • the mixture is left to stand for a period of time equal to or greater than 5 hours, more preferably equal to or greater than 10 hours, even more preferably 15 hours or more.
  • the mixture is left to stand for a period of time equal to 5 hours.
  • resting the mixture for a period of time equal to or greater than 5 hours makes it possible to optimize the formation of the precipitate in addition to allowing the deposition of the precipitate at the bottom of the container. In some cases (eg when the amount of precipitate is small), it would be advantageous to allow the mixture to stand for a period of 16 hours or more.
  • the mixture can be left to stand at between 4 ° C and 25 ° C, for example between 4 ° C and 8 ° C or at room temperature, for example between 20 and 25 ° C.
  • part of the aqueous phase is removed from the mixture.
  • at least 80%, at least 85%, at least 90% of the aqueous part is removed from the mixture.
  • the aqueous phase thus removed can be stored for later use or eliminated.
  • the aqueous phase is preferably stored at a temperature between 4 ° C and 25 ° C, for example between 4 ° C and 8 ° C or at room temperature, for example between 20 and 25 ° C.
  • the volume of the mixture to be treated is further reduced. This is particularly advantageous when large volumes (e.g. greater than 25, 50 or 100 L) are supplied as the starting aqueous solution (i.e. in step a)).
  • the separation is carried out by centrifugation.
  • centrifugation is meant the separation of the precipitated phase from the aqueous phase by centrifugal force (by rapid rotation). The mixture can also be left to stand under the conditions described above before centrifugation.
  • the mixture can be centrifuged at an acceleration of at least 4000 xg, preferably at least 12000 x g.
  • the mixture is centrifuged at an acceleration of at least 4000 xg for at least 5 minutes, preferably at an acceleration of 4000 xg for 5 minutes.
  • the duration of the centrifugation is advantageously at least 20 min, preferably at least 30 min, preferably for 20 to 35 min.
  • the mixture can undergo one or more centrifugations, which can be the same or different condition (ie with increasing duration or acceleration).
  • the mixture undergoes a single centrifugation step.
  • the mixture is centrifuged at an acceleration to 4000 xg for 5 minutes or between 12,000 and 13,000 xg for 30 minutes.
  • the precipitated phase comprising the blue pigment forms the pellet while the non-precipitated water-soluble components remain in the aqueous phase.
  • a large part of the aqueous phase is removed following centrifugation. The aqueous phase thus removed can be stored for later use or eliminated.
  • the centrifugation takes place at a temperature between 4 ° C and 25 ° C, more preferably between 4 ° C and 8 ° C or at room temperature, for example between 20 and 25 ° C.
  • the separation step comprises decantation and centrifugation, preferably according to the above conditions.
  • the mixture is decanted before being centrifuged.
  • decantation makes it possible to reduce the volume of the mixture to be centrifuged, a large part of the aqueous phase can now be removed before centrifugation.
  • the aqueous phases can then be combined together.
  • step c At the end of step c), two separate phases are obtained: the precipitated phase and the aqueous phase.
  • the precipitated phase may be advantageous to carry out the precipitation and separation steps (corresponding to steps b) and c) above) on the aqueous phase thus obtained.
  • the aqueous phase comprises a residual quantity of blue pigment and makes it possible to improve the final yield of blue pigment.
  • the aqueous phase subjected to steps b) and c) comprises all of the aqueous phases obtained during the separation in step c).
  • step c) the mixture is left to stand for a period of time equal to or greater than 3 hours, more preferably for a period of time equal to or greater than 16 hours. This allows in particular to improve the recovery yield of the blue pigment obtained by the process according to the invention.
  • step c) of separation of the precipitated phase from the aqueous phase the precipitated phase comprising the blue pigment is dissolved.
  • the person skilled in the art will be able to identify an appropriate solution making it possible to dissolve the precipitated blue pigment.
  • the blue pigment of the precipitated phase is dissolved by the addition of a weak acid, such as a carboxylic acid.
  • carboxylic acid is meant any acid comprising a carboxyl group, such as acetic acid, formic acid, carbonic acid, propenoic acid, etc.
  • the blue pigment is dissolved by the addition of formic acid (CAS no. 64-18-6).
  • the blue pigment is dissolved by the addition of a 5% carboxylic acid solution (m / m), more preferably by the addition of a 5% formic acid solution (m / m).
  • the volume ratio of the aqueous solution supplied in step a) and the aqueous solution enriched with blue pigment in step d) is at least 29/1, more preferably at least 30/1, even more preferably at least 40/1.
  • the ratio between the volume of the aqueous solution supplied in step a) and the volume of the aqueous solution enriched in blue pigment obtained in step d) is between 29/1 and 40/1.
  • said ratio between the volume of aqueous solution supplied in step a) and the volume of the solution enriched in blue pigment in step d) may vary depending on the initial concentration of blue pigment in the aqueous solution provided in step a). Also, a higher concentration of blue pigment in the aqueous solution provided in step a) (eg greater than 7 mg / mL) may require the addition of a larger volume of the solubilizing solution (eg acid formic), and thus a ratio lower than 29/1.
  • solubilizing solution eg acid formic
  • the solution enriched with blue pigment obtained in step d) has a pH of between 3.0 and 4.0, preferably between 3.0 and 3.5.
  • the blue pigment present in solution at a concentration equal to or greater than 90 mg / L.
  • the solution enriched with blue pigment obtained at the end of step d) is advantageously enriched with blue pigment at least 12-fold, advantageously at least 18-fold, more advantageously at least 30- times relative to the aqueous solution provided in step a).
  • a filtration step such as a sterilizing filtration step
  • a filtration step is carried out, more preferably on a filter having a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • This filtration step advantageously makes it possible to remove any remaining cellular debris quickly and inexpensively.
  • additional filtration and / or centrifugation steps can be carried out.
  • at least one step of filtration through a filter having an average pore size of between 0.45 ⁇ m and 15 is carried out.
  • At least one filtration step can be followed by at least one centrifugation step.
  • at least one filtration step can be carried out before and / or after a centrifugation step.
  • At least one filtration step is carried out, more preferably, at least two filtration steps are carried out.
  • the filtration is carried out through a filter having an average pore size of at least 1, 2 ⁇ m, preferably 1, 4 ⁇ m or 15 ⁇ m.
  • the filtration step is carried out through two filters of different size, the second filter having an average pore size smaller than the first filter and at least 1.2 ⁇ m (e.g. . of 1, 4 pm).
  • the filtration step comprises a first filtration through a filter having an average pore size of between 12 and 15 ⁇ m followed by a second filtration through a filter having an average pore size 1, 2 pm or 1, 4 pm.
  • a centrifugation step can be carried out.
  • the solution enriched in blue pigment can be centrifuged at an acceleration of at least 4000 x g, preferably at least 10,000 x g.
  • the duration of the centrifugation is preferably at least 10 min, preferably 10 min.
  • the solution can undergo one or more centrifugations, which can be the same or different condition (i.e. with increasing duration or acceleration).
  • the solution undergoes a single centrifugation step.
  • the solution is centrifuged at an acceleration at 10,000 x g for 10 minutes.
  • At least one filtration step can be carried out.
  • at least one filtration step is carried out, more preferably, at least two filtration steps are carried out.
  • filtration is carried out through a filter having an average pore size of at least 0.45 ⁇ m, preferably 0.45 ⁇ m or 0.7 ⁇ m. When several filters are used, they preferably have different average porosities.
  • at least one filtration step is carried out, more preferably, at least two filtration steps are carried out after a centrifugation step.
  • the filtration step is carried out through two filters of different size, the second filter having an average pore size smaller than the first filter and at least 0.45 ⁇ m.
  • the filtration step carried out after a centrifugation step comprises a first filtration through a filter having an average pore size of between 0.7 and 1.2 ⁇ m, preferably 0 , 7 ⁇ m followed by a second filtration through a filter having an average pore size of 0.45 ⁇ m.
  • the solution enriched with blue pigment is:
  • step d) of solubilization the solution enriched in blue pigment is subjected to a dialysis step.
  • the solution enriched with blue pigment obtained in step d) can be dialyzed against any suitable aqueous solution, such as, for example, distilled water.
  • suitable aqueous solution such as, for example, distilled water.
  • the methods and membranes suitable for dialysis are well known to the person skilled in the art. Such a step can in particular be carried out using a dialysis membrane having a cutoff threshold of between 1 and 3.5 kDa.
  • the dialysis membrane has a cutoff threshold of between 1 and 3.5 kDa, preferably a cutoff threshold of 1 kDa, 2 kDa, or 3.5 kDa.
  • the dialysis step is carried out for a minimum duration of 48 hours, more advantageously 72 hours.
  • the appropriate aqueous solution used during dialysis eg water
  • the appropriate aqueous solution used during dialysis is changed approximately every 12 hours.
  • dialysis of the solution enriched with blue pigment is carried out against approximately 1 L to 2 L of the appropriate aqueous solution (eg water), more preferably against about 1 L or 2 L of the appropriate aqueous solution (eg water).
  • the aqueous solution used for dialysis is ultra pure water.
  • the dialysis step notably makes it possible to increase the pH of the solution.
  • the dialysis step also makes it possible to eliminate the salts and the precipitating agents present in this aqueous solution (eg Mg (OH) 2 ).
  • the aqueous solution enriched with blue pigment comprises a concentration equal to or greater than 90 mg / L of blue pigment, more preferably equal or greater than 100 mg / L, equal or greater than 1 10 mg / L, equal or greater than 120 mg / L, equal or greater than 130 mg / L, equal or greater than 140 mg / L, even more preferably equal or greater than 150 mg / L .
  • the solution enriched with blue pigment obtained in step e) has a pH of between 4.5 and 5.5.
  • Said aqueous solution enriched in blue pigment is preferably stored at approximately 4 ° C (4 ⁇ 2 ° C) and in the dark at the end of step e) of dialysis or at the end of any other step when an additional step is present after step e). Indeed, the inventors have demonstrated that the blue pigment contained in the solution is stable for several months at this temperature and in the dark. It would therefore not be mandatory to add any excipient, such as a stabilizing agent, at the end of the process of the invention. Other optional subsequent steps
  • the method according to the invention can thus also comprise at least one additional step and subsequent to step e) of concentration or formulation.
  • the composition can undergo a formulation step, for example by the addition of an excipient and / or of a vehicle and / or by any other change in composition of said aqueous solution enriched in blue pigment, such as adding a buffer solution.
  • the formulation step can be a drying step, for example, making it possible to obtain the blue pigment in powder form.
  • the method according to the invention further comprises, after step e) of dialysis, one or more of the following steps aiming to adapt the composition to a particular formulation and / or to increase the purity of the product :
  • Each optional step identified above may be present as a single additional step in the process, in combination with one or more other optional steps, or with all other optional steps.
  • Another subject of the present invention is the aqueous solution obtained by the process described here.
  • the enriched blue pigment solution obtained by the process of the invention can in particular be used as a source of natural blue pigment intended for the food industry and for cosmetics, or as an antimicrobial substance for use in aquaculture.
  • Another subject of the present invention is the use of the aqueous solution enriched with blue pigment obtained by the process described here as a source of natural blue pigment intended for the food industry and for cosmetics, or as an antimicrobial substance for use in aquaculture.
  • Example 1 Process according to the invention A process perfected making it possible to obtain an aqueous solution enriched in blue pigment, here marennine, without any step of ultrafiltration or column chromatography is described below. Materials and methods
  • Haslea ostrearia strains were isolated from oyster farms in Bourneuf Bay (France) and identified by scanning electron microscopy (strain NCC 497). Batch cultures were carried out in 200 ml Erlenmeyer flasks using an artificial seawater medium adapted from Harrison et al. (Harrison et al. 1980) and sterilized by autoclaving (final salinity of the medium 31 ⁇ 1 ppm and pH 7.6 ⁇ 0.2). The cultures of H. ostrearia were kept in a culture chamber at a controlled temperature at 16 ° C under an illumination of 200 pmol of rsf photons 2 s 1 delivered by white fluorescent tubes with a day / night cycle of 14/10 hours.
  • the culture supernatant containing the extracellular marennine was recovered after settling out of the cells and coarsely filtered through a rapid filtration filter with a porosity of 15 ⁇ m (150 mm Filter paper, Fisher Scientific®). The filtered supernatant was kept in the temperature-controlled chamber in the dark before proceeding to the steps described in the general procedures.
  • the culture medium of Haslea ostrearia is filtered at 1.2 pm (GF / C filters).
  • Culture medium ⁇ . ostrearia comprising marennine at a concentration of approximately 3 to 4 mg / L, is then placed under moderate stirring and subjected to precipitation by adding 5 ml of sodium hydroxide (1 M) per 1 liter of filtered culture drop by drop then allowed to settle until a greenish layer appears at the bottom of the bottle and the coloring of the aqueous phase disappears (about 5 hours) at room temperature without stirring.
  • a large part of the aqueous phase (e.g. from 80 to 90%) is removed.
  • the aqueous phase is set aside for further processing.
  • the mixture comprising the remainder of the aqueous phase and the precipitated phase is centrifuged at 12,880 xg (10,000 rpm) for 30 minutes. The remaining aqueous phase is then separated from the precipitated phase.
  • the aqueous phases are combined and resubmitted to precipitation by adding sodium hydroxide and then allowed to settle as described above, decanting for at least 3 hours, or even overnight (eg 16 hours), to improve the recovery yield. of marennine and further reduce the volume of work.
  • the precipitated phase obtained is dissolved in a 5% solution of formic acid (HCOOH).
  • HCOOH formic acid
  • the solubilization is carried out in a volume of 250 to 350 ml of formic acid.
  • the solution obtained is filtered at 0.22 ⁇ m on a regenerated cellulose membrane. Finally, dialysis against 2 L of water is carried out in a 1 kDa dialysis rod for 72 hours by changing the dialysis water 2 times a day.
  • aqueous solution enriched in marennine (90 mg / L minimum) with a pH between 4.5 and 5.5 denoted “MCPN” is obtained. Also, very advantageously, the marennine in the enriched aqueous solution is concentrated 26-fold.
  • the aqueous solution enriched in marennin was characterized by UV-Visible spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR) and exclusion-diffusion chromatography (HPLC-SEC).
  • a solution of marennine considered pure and obtained according to the method of Pouvreau et al (2006a) was also analyzed for comparison.
  • UV-visible absorption spectra were performed on a UV-3100PC spectrophotometer (VWR). The analysis is performed in scan mode from 190 to 800 nm.
  • the NMR analysis was carried out on the liquid NMR platform of the Le Mans Institute of Molecules and Materials at the University of Le Mans.
  • the device used is a Bruker AVANCE 400MHz spectrometer with BBFO + 5mm wideband probes (1 H, 19F and from 15N to 31 P, z-gradient, automatic tuning) and QNP 5mm (1 H, 19F, 31 P, 13C, z-gradient) and a B-ACS 60 sample changer.
  • the chromatographic analysis was carried out on a Waters Alliance 2690 HPLC chain equipped with a PAD 996 pulsed amperometry detector and Empower software.
  • the aqueous solution enriched with blue pigment (here, marennine) obtained by the process of the invention has the same characteristics as those of pure marennine.
  • the process developed advantageously makes it possible to obtain a product of high purity without an ultrafiltration or column chromatography step.
  • Example 3 Evaluation of variants of the process according to Example 1
  • the culture of different species of Haslea producing blue pigment can be used as an aqueous solution in step a) of the process according to the invention, including the culture of the species described above.
  • Gastineau 201 1. Biodiversity, reproduction and phylogeny of blue diatoms of the genus Haslea and development of their pigments of the marennine type. Agricultural Sciences, University of Maine.
  • Haslea karadagensis (Bacillariophyta): a second blue diatom, recorded from the Black Sea and producing a novel blue pigment. Eur. J. Phycol., 47: 469-479
  • Haslea nusantara a new blue diatom from the Java Sea, Indonesia: Morphology, biometry and molecular characterization. Crypt. & Algol (in press)

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Abstract

La présente demande concerne un procédé d'obtention d'une solution aqueuse enrichie en pigment bleu,comprenantles étapes a) de fourniture d'une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d'au moins un microorganisme du genre Haslea, b) de précipitation du pigment bleu à l'hydroxydedesodium, c) de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, d) de solubilisation du pigment bleu compris dans la phase précipitéeet e) de dialyse.

Description

PROCEDE D’OBTENTION D’UNE SOLUTION AQUEUSE ENRICHIE EN PIGMENT BLEU
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine des procédés d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu, par exemple du pigment « marennine ». Elle concerne plus particulièrement un procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprenant les étapes a) de fourniture d’une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea, b) de précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium, c) de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, d) de solubilisation du pigment bleu compris dans la phase précipitée, et e) de dialyse.
ART ANTERIEUR
Certaines espèces de diatomée du genre Haslea sont connues pour leur capacité à produire un pigment bleu hydrosoluble, responsable du phénomène de verdissement des branchies et autres organes palléaux des huîtres. Ce verdissement repose sur la prolifération erratique de la diatomée dans les bassins ostréicoles (claires à huîtres) et présente un grand intérêt économique pour les ostréiculteurs, les huîtres vertes (i.e. de type « vertes de claire » ou « fines de claire vertes ») étant plus rares et plus chères que les huîtres non vertes affinées dans les claires. L’intérêt du pigment bleu pour ses applications dans l’aquaculture est croissant notamment compte tenu de la production et de la commercialisation des huîtres vertes au niveau international.
Des procédés permettant de cultiver la diatomée Haslea en masse ont notamment été décrits dans les demandes de brevet FR 2837833 et FR 2654743. Des procédés pour l’extraction du pigment bleu, notamment le pigment bleu nommé « marennine » produit par l’espèce H. ostrearia, à partir d’un milieu de culture ont également été décrits (cf.
Pouvreau et al., 2006a, Pouvreau et al., 2006b, Pouvreau et al., 2007, Turcotte et al.,
2016). Néanmoins, ces procédés présentent de nombreuses limitations, notamment compte tenu des étapes d’ultrafiltration et de chromatographie d’échange d’anions sur colonne. De plus, du fait que ces étapes augmentent le coût et le temps de réalisation du procédé, l’étape d’ultrafiltration n’est pas adaptée à de grands volumes (e.g. une vingtaine de litres et plus, par exemple de surnageant) qui sont nécessaires afin d’obtenir des solutions aqueuses enrichies en pigment bleu à l’échelle industrielle. Par ailleurs, une part importante du pigment bleu semble être également perdue dans la fraction écartée par l’ultrafiltration dans le procédé décrit par Pouvreau et al., 2006a, réduisant le rendement final du pigment.
Il existe donc, à l’heure actuelle, un besoin pour de nouveaux procédés d’obtention de solutions aqueuses enrichies en pigment bleu, en particulier à partir de grands volumes. Il existe également un besoin pour de nouveaux procédés plus simples et plus rapides que ceux utilisés à ce jour. En particulier, il existe un besoin pour de nouveaux procédés ne comprenant pas d’étape d’ultrafiltration ou de chromatographie sur colonne, de préférence sans impact néfaste sur le rendement et/ou sur la qualité du pigment bleu. Il existe également un besoin pour de nouveaux procédés permettant de diminuer le coût de l’enrichissement. Enfin, il existe un besoin pour de nouveaux procédés à partir desquels une solution aqueuse comprenant le pigment bleu peut être directement utilisée dans des applications industrielles, telles que le verdissement des huîtres.
RESUME DE L’INVENTION
La présente invention a pour objet un procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprenant notamment une étape de précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium, une étape de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, une étape de solubilisation de la phase précipitée et une étape de dialyse.
En effet, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en évidence qu’un procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprenant ces étapes permet d’éviter toute étape d’ultrafiltration et de chromatographie sur colonne. Le procédé de l’invention est avantageux car une solution aqueuse enrichie en pigment bleu peut être obtenue, avec une concentration finale en pigment bleu égale ou supérieure à celle obtenue dans l’art antérieur, tout en limitant les coûts du procédé. En effet, il est estimé que les étapes d’ultrafiltration selon la méthode de Pouvreau et al., 2006a entraîne une perte du pigment bleu d’environ 30 à 40% de la masse du départ. De plus, le procédé est très facile à mettre en oeuvre et peut être utilisé sur des grands volumes de solution aqueuse. Ce procédé est également avantageux car il permet de réduire le temps total de mise en oeuvre du procédé nécessaire à l’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu.
Le procédé de l’invention permet également d’obtenir une solution aqueuse enrichie en pigment bleu adaptée pour une utilisation dans le verdissement des huîtres.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc un procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprenant :
a) la fourniture d’une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea, b) une étape de précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium, c) une étape de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, d) une étape de solubilisation du pigment bleu compris dans la phase précipitée, et
e) une étape de dialyse.
Les étapes b) et c) permettent d’obtenir une précipitât du pigment bleu qui peut ensuite être solubilisé, afin d’obtenir une solution enrichie en pigment bleu sans étape intermédiaire d’ultrafiltration ou de chromatographie sur colonne. L’étape de séparation (étape c)) permet avantageusement d’éliminer les impuretés solubles non-précipitées à l’hydroxyde de sodium. Avantageusement, l’étape e) de dialyse permet d’obtenir une solution aqueuse de pigment bleu tout en réduisant les impuretés (e.g. élimination de sels).
De préférence, l’étape c) de séparation comprend une décantation et/ou une centrifugation, de préférence une décantation suivie par une centrifugation. Ceci permet d’éliminer la majorité, voire l’intégralité, de la phase aqueuse.
De préférence, le pigment bleu est précipité par l’ajout d’au moins 0,3 à 0,4 volumes d’hydroxyde de sodium 1 M. Le pigment bleu est ainsi compris dans la phase précipitée alors que des composés hydrosolubles non-désirés sont conservés dans la phase aqueuse.
De préférence, le pigment bleu compris dans la phase précipitée est solubilisé à l’étape d) par de l’acide carboxylique, de préférence de l’acide formique.
De préférence, le procédé comprend en outre une étape de filtration stérilisante, de préférence sur un filtre ayant une porosité de 0,22 pmn avant l’étape e).
De préférence, le procédé comprend en outre au moins une étape de filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores d’au moins 1 ,2 pm avant l’étape b), de préférence, une première filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 12 et 15 pm suivie par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de 1 ,2 pm. Avantageusement, cette première filtration permet d’éviter le colmatage lors de la deuxième filtration.
De préférence, la solution aqueuse enrichie en pigment bleu obtenue à l’étape e) comprend une concentration en pigment bleu d’au moins 90 mg/L.
De préférence, la phase aqueuse obtenue à l’étape c) est soumise à une nouvelle étape de précipitation selon l’étape b) suivie d’une étape de séparation selon l’étape c).
De préférence, lors de l’étape e) de dialyse, la membrane de dialyse a un seuil de coupure compris entre 1 et 3,5 kDa. De préférence, la solution aqueuse fournie à l’étape a) est un surnageant d’une culture d’au moins une diatomée sélectionnée parmi : Haslea ostrearia, Haslea karadagensis, Haslea provincialis, Haslea nusantara, Haslea silbo sp nov, et Haslea acoran sp nov, de préférence à partir d’une culture de diatomée Haslea ostrearia NCC 497 déposée auprès du BEA le 1er octobre 2018 sous le numéro BEA_IDA_0065B.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne une solution aqueuse enrichie en pigment bleu susceptible d’être obtenue par le procédé tel que décrit ici.
DESCRIPTION DES FIGURES
Fig. 1 Schéma illustrant le procédé selon l’invention. Les cadres en pointillés représentent des étapes optionnelles.
La figure 2 présente la caractérisation de la solution aqueuse enrichie en pigment bleu de type « marermine » appelé « MCPN » obtenue selon la présente invention par :
Fig. 2A Spectre d’absorption ultraviolet (UV)-visible de la marennine concentrée obtenue selon la présente invention (diluée 6 fois), avec comparaison au spectre obtenu avec une solution de marennine purifiée selon le procédé de Pouvreau et al 2006a (« marermine pure ») à 0,2 mg/mL
Fig. 2B Spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) avec comparaison au spectre obtenu avec une solution de « marennine pure »
Fig. 2C est une analyse de chromatographie d'exclusion de taille (SEC-HPLC). AU correspond aux « unités d’absorbance », ppm aux « parties par million ».
La figure 3 est une comparaison des caractéristiques du pigment bleu de type « marennine » préparé selon le procédé de la présente invention (appelé « MCPN ») ou selon le procédé de Turcotte et al 2016 (« blue water » ou « BW ») ou encore selon Pouvreau et al 2006a (« marennine pure ») Fig. 3A est un spectre d’absorption ultraviolet (UV)-visible
Fig. 3B est un spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Fig. 3C est une analyse de chromatographie d'exclusion de taille (SEC-HPLC). AU correspond aux « unités d’absorbance », ppm aux « parties par million ». DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Comme indiqué précédemment, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en évidence un nouveau procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprenant les étapes de précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium, de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, de solubilisation de la phase précipitée, et de dialyse. En effet, les inventeurs ont démontré que, de façon surprenante, un procédé comprenant ces étapes permet avantageusement d’éviter toute étape d’ultrafiltration et de chromatographie sur colonne.
Le procédé selon l’invention présente l’avantage d’obtenir une solution aqueuse enrichie en pigment bleu avec une concentration finale en pigment bleu au moins égale à celle obtenue en utilisant les procédés existants, tout en limitant les coûts du procédé. De plus, le procédé est très facile à mettre en oeuvre, et peut être utilisé sur de grands volumes de solution aqueuse. Le rendement en pigment bleu obtenu par le procédé de l’invention est, de façon intéressante, supérieur à celui obtenu par les procédés selon l’art antérieur. Ce procédé permet de plus de réduire le temps nécessaire pour obtenir une solution aqueuse enrichie en pigment bleu.
Procédé d’obtention
Un premier aspect de l’invention concerne donc un procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprenant : a) la fourniture d’une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea,
b) une étape de précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium,
c) la séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse,
d) une étape de solubilisation de la phase précipitée, et
e) une étape de dialyse.
Les étapes a) à e) sont mises en oeuvre dans l’ordre a), puis b), puis c), puis d), puis e). Dans certain cas (voir ci-dessous), des étapes supplémentaires (à l’exclusion de toute étape d’ultrafiltration et/ou de chromatographie sur colonne) peuvent s’intercaler :
• Avant l’étape a)
Par exemple, l’étape a) peut être précédée d’une étape de culture des diatomées du genre Haslea et, optionnellement, par une étape de lyse des diatomées du genre Haslea présentes dans la solution aqueuse. • Entre les étapes a) et b)
Par exemple, une étape de filtration peut être ajoutée entre les étapes a) et b).
• Entre les étapes c) et d)
Par exemple, la phase aqueuse obtenue à l’étape c) peut être resoumise aux étapes b) et c) et le précipité obtenu groupé avec celui obtenu auparavant.
• Entre les étapes d) et e)
Par exemple, une étape de filtration peut être ajoutée entre les étapes d) et e).
• Après l’étape e)
Par exemple, une étape de concentration ou de formulation peut être ajoutée après l’étape e).
Ces différentes étapes supplémentaires optionnelles sont détaillées ci-dessous.
Le procédé de purification selon l’invention est notamment mis en oeuvre à partir d’une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea, de préférence à partir d’un surnageant d’un milieu de culture d’au moins un microorganisme du genre Haslea.
Pigment bleu
Par « pigment bleu » on entend, au sens de la présente invention, un pigment bleu hydrosoluble produit par une diatomée du genre Haslea. Ledit pigment bleu peut notamment être le pigment bleu appelé « marennine » produit par la diatomée H. ostrearia ou toute autre pigment bleu produit par une diatomée du genre Haslea, telle que
H. karadagensis (Gastineau et al., 2012), H. provincialis (Gastineau et al., 2016), H. nusantara (Prasetiya et al., 2018), H. silbo sp nov (Gastineau et al., 2011 ), ou H. acoran sp nov (Gastineau et al., 201 1 ). Ledit pigment bleu peut comprendre ou consiste en plusieurs pigments bleus produits par différentes diatomées. De préférence, le pigment bleu selon l’invention comprend la marennine. Selon un mode particulier, le pigment bleu selon l’invention consiste en la marennine.
Une distinction peut généralement être faite entre la forme intracellulaire (celle présente dans la diatomée) et la forme extracellulaire du pigment bleu qui est relarguée dans le milieu marin. À titre d’exemple, la forme intracellulaire de la marennine a une masse molaire différente de la forme extracellulaire (Pouvreau et al., 2006a).
Dans le cadre de la présente invention, le pigment bleu peut comprendre du pigment bleu en sa forme intracellulaire et/ou sa forme extracellulaire. Selon un premier mode de réalisation, le pigment bleu consiste essentiellement en sa forme extracellulaire. De préférence, le pigment bleu consiste en sa forme extracellulaire. Selon un autre mode de réalisation, le pigment bleu comprend à la fois la forme intracellulaire et la forme extracellulaire. Selon un autre mode de réalisation, le pigment bleu consiste essentiellement en sa forme intracellulaire. De préférence, le pigment bleu consiste en sa forme intracellulaire.
Étape a)
L’étape a) du procédé selon l’invention est une étape de fourniture d’une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea.
Par « solution aqueuse » on entend toute solution comprenant du pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea. Selon un mode de réalisation préféré, ladite solution aqueuse est une culture de diatomée. La culture de diatomée comprend les diatomées elles-mêmes et le surnageant (i.e. le milieu de culture sans les diatomées). De préférence, ladite solution aqueuse comprend le surnageant. Ceci serait le cas, par exemple, si le surnageant est mélangé avec une autre solution avant l’étape a), par exemple de l’eau. Selon un autre mode de réalisation préféré, ladite solution aqueuse consiste essentiellement en le surnageant. De préférence, ladite solution aqueuse est le surnageant. Les méthodes adaptées à séparer les diatomées du milieu de culture, afin de fournir le surnageant sont bien connues par la personne du métier. Une telle étape peut notamment être réalisée par centrifugation avec récupération du surnageant ou par filtration.
De préférence, ladite diatomée est sélectionnée dans le groupe consistant en : H. ostrearia, H. karadagensis, H. provincialis, H. nusantara, H. silbo sp nov, H. acoran sp nov. De façon préférentielle, ladite diatomée est H. ostrearia, de façon plus préférentielle H. ostrearia NCC 497 de façon encore plus préférentielle H. ostrearia NCC 497 déposée auprès du « Banco Espanoi de Algas » (BEA), Universidad de Las Palmas de GC, Muelle de Taliarte s/n, 35214 Telde - Las Palmas, Espagne le 1er octobre 2018 sous le numéro BEA_IDA_0065B.
Selon un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse peut comprendre du pigment bleu hydrosoluble produit par au moins deux espèces de diatomées, ou par au moins deux souches d’une espèce donnée (e.g. deux souches de H. ostrearia). Lesdites diatomées peuvent avoir été cultivées ensemble, ou cultivées individuellement. Lorsque les diatomées sont cultivées individuellement, la culture, de préférence les surnageants de culture, de chaque diatomée sont additionnées ensemble à l’étape a). Selon un mode de réalisation préféré, lorsque au moins deux espèces sont cultivées ensemble, l’une des deux espèces est H. ostrearia. Selon un mode de réalisation préféré, lorsqu’au moins deux souches de H. ostrearia sont cultivées ensemble, l’une des deux souches est H. ostrearia NCC 497, de préférence H. ostrearia NCC 497 déposée auprès du « Banco Espanoi de Algas » (BEA) le 1er octobre 2018 sous le numéro BEA_IDA_0065B.
Dans certains cas, la solution aqueuse fournie à l’étape a) comprend des diatomées lysées. Une étape de lyse peut donc précéder l’étape a). Une étape de lyse est notamment avantageuse lorsqu’une solution comprenant à la fois des formes extracellulaires et intracellulaires du pigment bleu est désirée. Une étape de lyse permet en effet de libérer du pigment bleu intracellulaire dans le surnageant ou dans toute autre solution aqueuse. À titre d’exemple, la lyse des diatomées peut être effectuée selon la méthode décrite dans Pouvreau ét al., 2006a telle que décrite à la page 770.
Selon un mode de réalisation particulier, la concentration en pigment bleu de la solution aqueuse à l’étape a) est comprise entre 2 et 7 mg/L, plus avantageusement entre 3 et 5 mg/L. Selon un mode de réalisation particulier, la concentration en pigment bleu de la solution aqueuse à l’étape a) est d’au moins 2 mg/L, de préférence d’au moins 3 mg/L. La concentration en pigment bleu dans la solution aqueuse peut être déterminée par la personne de métier au vu de ses connaissances générales. À titre d’exemple non-limitatif, la concentration en pigment bleu peut être déterminée par spectrophotométrie, par la méthode de Lowry (Pouvreau, ét al., 2006b), ou par HPLC par filtration sur gel reliée à un détecteur à photodiode (Pouvreau et al., 2007). De préférence, la concentration en pigment bleu est déterminée par spectrophotométrie en utilisant le coefficient d'extinction publié dans Pouvreau, ét al. (2006b).
De préférence, le pH de la solution aqueuse comprenant du pigment bleu est compris entre 7 et 9, plus préférentiellement d’environ 8 (+/- 0,2).
Selon un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse comprenant le pigment bleu fournie à l’étape a) n’a subi aucune étape préalable de filtration. De manière optionnelle, la solution aqueuse fournie à l’étape a) est toutefois filtrée avant l’étape b). Cette étape supplémentaire est particulièrement préférée lorsque la solution aqueuse comprend des agrégats ou toute autre particule non hydrosoluble car l’étape de filtration permet de séparer ces impuretés en amont de la précipitation, améliorant ainsi la pureté du précipité obtenu à l’étape b). Selon un mode préférentiel, une étape de filtration est intercalée entre les étapes a) et b) lorsque la solution aqueuse est une culture de diatomée, l’étape de filtration permettant de séparer le surnageant des diatomées avant toute autre étape. La porosité du filtre permet de préférence de retenir les diatomées, sans toutefois retenir d’autres composés (e.g. le pigment bleu). Les méthodes et les filtres adaptés à une telle étape de filtration sont bien connus par la personne du métier. Une telle étape peut notamment être réalisée en utilisant des filtres de type microfibre de verre (commercialisés par Whatman, par exemple de type GF/C).
Selon un mode de réalisation particulier, au moins une étape de filtration est réalisée, plus préférentiellement, au moins deux étapes de filtration sont réalisées. Selon un premier mode de réalisation, la filtration est effectuée à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores d’au moins 1 ,2 pm, de préférence de 1 ,4 pm. Selon un deuxième mode de réalisation, l’étape de filtration est réalisée à travers deux filtres de taille différente, le deuxième filtre ayant une taille moyenne de pores plus petite que le premier filtre et d’au moins de 1 ,2 pm (par ex. de 1 ,4 pm). Avantageusement, la première filtration permet d’éviter le colmatage lors de la deuxième filtration.
Aussi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’étape de filtration comprend une première filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 12 et 15 pm suivi par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de 1 ,2 pm ou de 1 ,4 pm.
Étape b)
Après l’étape a) de fourniture d’une solution aqueuse comprenant le pigment bleu, ledit pigment bleu est précipité à l’hydroxyde de sodium. A partir du moment où l’hydroxyde de sodium est ajouté à la solution aqueuse selon l’étape b), la solution est appelée « mélange », car comprenant à la fois une phase précipitée et une phase aqueuse.
Lors de l’étape b), la majorité du pigment bleu est précipitée et se retrouve donc sous forme solide, dans la phase précipitée. Avantageusement, l’hydroxyde de sodium est ajouté jusqu’à la complète précipitation du pigment bleu. La quantité d’hydroxyde de sodium à ajouter varie en fonction de la concentration du pigment bleu dans la solution aqueuse de l’étape a) ainsi que le volume de la solution aqueuse. La précipitation complète conduit à la décoloration de la phase aqueuse. Aussi, l’étape de précipitation par ajout d’hydroxyde de sodium correspond à une étape facilement réalisable par la personne du métier, compte tenu de l’aspect visuel de celle-ci. Avantageusement, les composés hydrosolubles non-désirés présents dans la solution aqueuse tels protéines et glucides, voire d’autres composés n’ayant pas d’absorption dans le spectre visible, restent dans la phase aqueuse.
Selon un mode de réalisation particulier, le pourcentage final (masse/masse) d’hydroxyde de sodium par rapport à la solution aqueuse (masse d’hydroxyde de sodium / masse de la solution aqueuse x 100) mis en oeuvre à l’étape b) est compris entre 0,02 et 0,04 %. De préférence, la concentration de la solution d’hydroxyde de sodium ajoutée à la solution aqueuse est inférieure ou égale à 10 M, de préférence inférieure ou égale à 2 M, plus préférentiellement comprise entre 1 M et 2 M, plus encore plus préférentiellement égale à 1 M ou à 2 M. La personne du métier reconnaîtra que ledit pourcentage final d’hydroxyde de sodium par rapport à la solution aqueuse peut varier en fonction de la concentration ou quantité initiale en pigment bleu dans la solution aqueuse fournie à l’étape a).
À titre d’exemple, une complète précipitation peut être observée par l’ajout de 5 à 10 mL d’hydroxyde de sodium 1 M à une solution aqueuse ayant un volume de 1 L et une concentration en pigment bleu de quelques mg/L.
De préférence, le pH du mélange obtenu suite à l’étape b) est d’au moins 12.
Selon un mode de réalisation, l’hydroxyde de sodium est ajouté en plusieurs fois, avantageusement goutte par goutte. Pendant le temps d’ajout de l’hydroxyde de sodium, le mélange peut être sous agitation ou non. De préférence, le mélange est sous agitation. Pendant le temps d’ajout de l’hydroxyde de sodium, la solution aqueuse peut être maintenue entre 4°C et 25°C, par exemple entre 4°C et 8°C ou à température ambiante, par exemple entre 20 et 25°C.
Étape c)
Après l’étape b) précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium, la phase précipitée et la phase aqueuse du mélange sont séparées. Par « séparation » on entend ici la séparation physique des deux phases. Avantageusement, en plus de séparer les deux phases, l’étape c) permet de limiter le volume du mélange à traiter en aval. Les méthodes adaptées à une telle étape de séparation sont bien connues par la personne du métier. Une telle étape peut notamment être réalisée par décantation et/ou par centrifugation. À titre d’exemple non-limitatif, l’étape de séparation peut être effectuée entre 4°C et 25°C, par exemple entre 4°C et 8°C ou à température ambiante, par exemple entre 20 et 25°C.
De préférence, la séparation selon l’étape c) comprend une décantation. Par « décantation » on entend, au sens de la présente invention, une opération qui consiste à laisser reposer le mélange pendant une période de temps donnée, de manière à ce que le précipité se dépose par différence de gravité, afin de retirer la phase aqueuse. De préférence, la décantation comprend donc une étape de repos du mélange avant la séparation physique de la phase précipitée de la phase aqueuse. De préférence, pendant que le mélange est laissé au repos, il n’est pas sous agitation.
Selon un mode préférentiel, le mélange est laissé au repos pendant une durée de temps égale ou supérieure à 5 heures, de façon plus préférée égale ou supérieure à 10 heures, de façon encore plus préférée égale ou supérieure à 15 heures. Selon un autre mode de réalisation préféré, le mélange est laissé au repos pendant une durée de temps égale à 5 heures. Avantageusement, le repos du mélange pendant une durée de temps égale ou supérieure à 5 heures permet d’optimiser la formation du précipité en plus de permettre le dépôt du précipité au fond du récipient. Dans certains cas (par ex. lorsque la quantité de précipité est faible), il serait avantageux de laisser reposer le mélange pendant une durée égale ou supérieure à 16 heures.
Le mélange peut être laissé au repos entre 4°C et 25°C, par exemple entre 4°C et 8°C ou à température ambiante, par exemple entre 20 et 25°C.
De préférence, une partie de la phase aqueuse (par exemple, 80 % à 90 % de la phase aqueuse) est retirée du mélange. De préférence, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 % de la partie aqueuse est retirée du mélange. La phase aqueuse ainsi retirée peut être conservée pour une utilisation ultérieure ou éliminée. La phase aqueuse est conservée, de préférence, à une température comprise entre 4°C et 25°C, par exemple entre 4°C et 8°C ou à température ambiante, par exemple entre 20 et 25°C.
Comme indiqué ci-dessus, en retirant une partie de la phase aqueuse, le volume du mélange à traiter est réduit d’autant. Ceci est particulièrement avantageux lorsque de grands volumes (par ex. supérieurs à 25, 50 ou 100 L) sont fournis comme solution aqueuse de départ (c-à-d. à l’étape a)).
Selon un autre mode de réalisation, la séparation est effectuée par centrifugation. Par « centrifugation » on entend la séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse par la force centrifuge (par rotation rapide). Le mélange peut également être laissé au repos dans les conditions décrites ci-dessus avant la centrifugation.
La personne du métier saura déterminer les conditions de centrifugation adéquates pour obtenir la séparation de la phase précipitée comprenant le précipité du pigment bleu de la phase aqueuse. À titre d’exemple non-limitatif, le mélange peut être centrifugé à une accélération d’au moins 4000 x g, de préférence d’au moins 12 000 x g. Selon un mode de réalisation préféré, le mélange est centrifugé à une accélération d’au moins 4000 x g pendant au moins 5 minutes, de préférence à une accélération de 4000 x g pendant 5 minutes. Lorsque le mélange est centrifugé à une accélération d’au moins 12 000 x g (e.g. entre 12 000 et 13 000 x g), la durée de la centrifugation est avantageusement d’au moins 20 min, de préférence d’au moins 30 min, de préférence pendant 20 à 35 min. Le mélange peut subir une ou plusieurs centrifugations, qui peuvent être à condition identique ou différente (i.e. à durée ou accélération croissante). De préférence, le mélange subit une seule étape de centrifugation. De préférence, le mélange est centrifugé à une accélération à 4000 x g pendant 5 minutes ou comprise entre 12 000 et 13 000 x g pendant 30 minutes.
Lors de la centrifugation, la phase précipitée comprenant le pigment bleu forme le culot alors que les composants hydrosolubles non-précipités restent dans la phase aqueuse. Comme lors de la décantation, une grande partie de la phase aqueuse est retirée suite à la centrifugation. La phase aqueuse ainsi retirée peut être conservée pour une utilisation ultérieure ou éliminée.
De préférence, la centrifugation a lieu à une température comprise entre 4°C et 25°C, de façon plus préférentielle entre 4°C et 8°C ou à température ambiante, par exemple entre 20 et 25°C.
Selon un mode de réalisation préférentiel, l’étape de séparation comprend la décantation et la centrifugation, de préférence selon les conditions précitées. De façon préférentielle, le mélange est décanté avant d’être centrifugé. La combinaison de ces deux techniques est particulièrement avantageuse car la décantation permet de réduire le volume du mélange à centrifuger, une grande partie de la phase aqueuse pouvant désormais être retirée avant centrifugation. Lorsqu’une partie de la phase aqueuse est retirée lors de la décantation et une autre partie de la phase aqueuse est retirée suite à la centrifugation, les phases aqueuses peuvent ensuite être combinées ensemble.
Étape optionnelle À l’issue de l’étape c), deux phases séparées sont obtenues : la phase précipitée et la phase aqueuse. Dans certains cas, il peut être avantageux d’effectuer les étapes de précipitation et de séparation (correspondant aux étapes b) et c) précitées) sur la phase aqueuse ainsi obtenue. Ceci est particulièrement préféré lorsque la phase aqueuse comprend une quantité résiduelle de pigment bleu et permet d’améliorer le rendement final en pigment bleu.
De préférence, la phase aqueuse soumise aux étapes b) et c) comprend l’ensemble des phases aqueuses obtenues lors de la séparation à l’étape c).
De préférence, lors de l’étape c), le mélange est laissé au repos pendant une durée de temps égale ou supérieure à 3 heures, de façon plus préférentielle pendant une durée de temps égale ou supérieure à 16 heures. Ceci permet notamment d’améliorer le rendement de récupération du pigment bleu obtenu par le procédé selon l’invention. Étape d)
Après l’étape c) de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, la phase précipitée comprenant le pigment bleu est solubilisée. La personne du métier saura identifier une solution appropriée permettant de solubiliser le pigment bleu précipité.
De préférence, le pigment bleu de la phase précipitée est solubilisé par l’ajout d’un acide faible, tel qu’un acide carboxylique. Par « acide carboxylique » on entend tout acide comprenant un groupement carboxyle, tel que l’acide acétique, l’acide formique, l’acide carbonique, l’acide propénoïque, etc. De préférence, le pigment bleu est solubilisé par l’ajout d’acide formique (CAS no. 64-18-6). De préférence, le pigment bleu est solubilisé par l’ajout d’une solution d’acide carboxylique à 5% (m/m), de façon plus préférentielle par l’ajout d’une solution d’acide formique à 5% (m/m).
De préférence, le ratio en volume de la solution aqueuse fournie à l’étape a) et la solution aqueuse enrichie en pigment bleu à l’étape d) (solution fournie à l’étape a) / solution obtenue à l’étape d)) est d’au moins 29 / 1 , de façon plus préférentielle d’au moins 30 / 1 , de façon encore plus préférentielle d’au moins 40 / 1. Selon un mode préférentiel, le ratio entre le volume de la solution aqueuse fournie à l’étape a) et le volume de la solution aqueuse enrichie en pigment bleu obtenu à l’étape d) est compris entre 29 / 1 et 40 / 1. La personne du métier reconnaîtra toutefois que ledit ratio entre le volume de solution aqueuse fournie à l’étape a) et le volume de la solution enrichie en pigment bleu à l’étape d) peut varier en fonction de la concentration initiale en pigment bleu dans la solution aqueuse fournie à l’étape a). Aussi, une concentration plus élevée du pigment bleu dans la solution aqueuse fournie à l’étape a) (e.g. supérieure à 7 mg/mL) pourrait nécessiter l’ajout d’un volume supérieur de la solution solubilisant (par ex. l’acide formique), et ainsi un ratio inférieur à 29 / 1.
De préférence, la solution enrichie en pigment bleu obtenue à l’étape d) a un pH compris entre 3,0 et 4,0, de préférence entre 3,0 et 3,5.
De préférence, à l’issue de l’étape d), le pigment bleu présent en solution à une concentration égale ou supérieure à 90 mg/L. Aussi, la solution enrichie en pigment bleu obtenue à l’issue de l’étape d) est avantageusement enrichie en pigment bleu d’au moins 12-fois, avantageusement d’au moins 18-fois, plus avantageusement d’au moins 30-fois par rapport à la solution aqueuse fournie à l’étape a).
Étape optionnelle
À l’issue de l’étape d), une ou plusieurs étapes optionnelles peuvent être présentes. À titre d’exemple, une étape de filtration, telle qu’une étape de filtration stérilisante, est effectuée. De préférence, à l’issue de l’étape d), une étape de filtration, de préférence une étape de filtration stérilisante, est effectuée, plus préférentiellement sur un filtre ayant une porosité de 0,22 pm. Cette étape de filtration permet, de façon avantageuse, de retirer tout débris cellulaire restant de manière rapide et peu coûteuse. À l’issue de l’étape d) et avant l’étape de filtration stérilisante, des étapes supplémentaires de filtration et/ou de centrifugation peuvent être réalisées. A titre d’exemple, au moins une étape de filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores compris entre 0,45 pm et 15 est réalisée. Au moins une étape de filtration peut être suivie par au moins une étape de centrifugation. Dans certains cas, au moins une étape de filtration peut être effectuée avant et/ou après une étape de centrifugation.
Selon un mode de réalisation particulier, au moins une étape de filtration est réalisée, plus préférentiellement, au moins deux étapes de filtration sont réalisées. Selon un premier mode de réalisation, la filtration est effectuée à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores d’au moins 1 ,2 pm, de préférence de 1 ,4 pm ou de 15 pm. Lorsque plusieurs filtres sont utilisés ils ont de préférence des porosités moyennes différentes. Selon un mode de réalisation particulier, au moins une étape de filtration est réalisée, plus préférentiellement, au moins deux étapes de filtration sont réalisées. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de filtration est réalisée à travers deux filtres de taille différente, le deuxième filtre ayant une taille moyenne de pores plus petite que le premier filtre et d’au moins de 1 ,2 pm (par ex. de 1 ,4 pm). Aussi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’étape de filtration comprend une première filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 12 et 15 pm suivi par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de 1 ,2 pm ou de 1 ,4 pm.
Optionnellement, une étape de centrifugation peut être effectuée. À titre d’exemple non- limitatif, la solution enrichie en pigment bleu peut être centrifugée à une accélération d’au moins 4000 x g, de préférence d’au moins 10 000 x g. Lorsque la solution est centrifugée à une accélération d’au moins 10 000 x g, la durée de la centrifugation est préférentiellement d’au moins 10 min, de préférence de 10 min. La solution peut subir une ou plusieurs centrifugations, qui peuvent être à condition identique ou différente (i.e. à durée ou accélération croissante). De préférence, la solution subit une seule étape de centrifugation. De préférence, la solution est centrifugée à une accélération à 10 000 x g pendant 10 minutes.
Après une étape de centrifugation, au moins une étape de filtration peut être réalisée. Selon un mode de réalisation particulier, au moins une étape de filtration est réalisée, plus préférentiellement, au moins deux étapes de filtration sont réalisées. Selon un premier mode de réalisation, la filtration est effectuée à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores d’au moins 0,45 pm, de préférence de 0,45 pm ou de 0,7 pm. Lorsque plusieurs filtres sont utilisés ils ont de préférence des porosités moyennes différentes. Selon un mode de réalisation particulier, au moins une étape de filtration est réalisée, plus préférentiellement, au moins deux étapes de filtration sont réalisées après une étape de centrifugation. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de filtration est réalisée à travers deux filtres de taille différente, le deuxième filtre ayant une taille moyenne de pores plus petite que le premier filtre et d’au moins de 0,45 pm. Aussi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’étape de filtration effectuée après une étape de centrifugation comprend une première filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 0,7 et 1 ,2 pm, de préférence de 0,7 pm suivi par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de 0,45 pm.
Aussi, selon un mode de réalisation particulier, avant l’étape de filtration stérilisante, la solution enrichie en pigment bleu est :
- filtrée à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 12 et 15 pm, suivi par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de 1 ,4 pm,
- centrifugée à une accélération 10 000 x g pendant 10 min, et ensuite
- filtrée à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 0,7 et 1 ,2 pm, suivi par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de
0,45 pm.
Étape e)
Après l’étape d) de solubilisation, la solution enrichie en pigment bleu est soumise à une étape de dialyse. La solution enrichie en pigment bleu obtenue à l’étape d) peut être dialysée contre toute solution aqueuse appropriée, telle que, par exemple, de l’eau distillée. Les méthodes et les membranes adaptées à la dialyse sont bien connues par la personne du métier. Une telle étape peut notamment être réalisée en utilisant une membrane de dialyse ayant un seuil de coupure compris entre 1 et 3,5 kDa.
Selon un mode préféré, la membrane de dialyse a un seuil de coupure compris entre 1 et 3,5 kDa, de préférence un seuil de coupure de 1 kDa, de 2 kDa, ou de 3,5 kDa.
De préférence, l’étape de dialyse est réalisée pendant une durée minimale de 48 heures, plus avantageusement de 72 heures. De préférence, la solution aqueuse appropriée utilisée pendant la dialyse (e.g. de l’eau) est changée toutes les 12 heures environ. De préférence, la dialyse de la solution enrichie en pigment bleu est réalisée contre environ 1 L à 2 L de la solution aqueuse appropriée (e.g. de l’eau), plus préférentiellement contre environ 1 L ou 2 L de la solution aqueuse appropriée (e.g. de l’eau). De préférence, la solution aqueuse utilisée pour la dialyse est de l’eau ultra pure. L’eau « ultra pure » satisfait les critères établis dans au moins une des spécifications suivantes, décrivant des normes de qualité d’eau : ASTM (« American Society for Testing and Materials ») D1193, ISO (« International Organization for Standardization ») 3696, ou CLSI-CLRW (« Clinical and Laboratory Standards Institute-Clinical Laboratory Reagent Water »).
L’étape de dialyse permet notamment d’augmenter le pH de la solution. L’étape de dialyse permet également d’éliminer les sels et les agents précipitants présents dans cette solution aqueuse (e.g. Mg(OH)2).
De manière préférée, à l’issue de l’étape e), la solution aqueuse enrichie en pigment bleu comprend une concentration égale ou supérieure à 90 mg/L en pigment bleu, de manière plus préférée égale ou supérieure à 100 mg/L, égale ou supérieure à 1 10 mg/L, égale ou supérieure à 120 mg/L, égale ou supérieure à 130 mg/L, égale ou supérieure à 140 mg/L, de manière encore plus préférée égale ou supérieure à 150 mg/L.
De préférence, la solution enrichie en pigment bleu obtenue à l’étape e) a un pH compris entre 4,5 et 5,5.
Ladite solution aqueuse enrichie en pigment bleu est préférablement conservée à environ 4°C (4 ± 2°C) et à l'obscurité à l’issue de l’étape e) de dialyse ou à l’issue de toute autre étape lorsqu’une étape supplémentaire est présente après l’étape e). En effet, les inventeurs ont démontré que le pigment bleu contenu dans la solution est stable pendant plusieurs mois à cette température et à l’obscurité. Il ne serait donc pas obligatoire d’ajouter un excipient quelconque, tel qu’un agent stabilisant, à l’issue du procédé de l’invention. Autres étapes ultérieures optionnelles
Même si le procédé décrit ci-dessus permet d’obtenir une solution aqueuse enrichie en pigment bleu ayant une pureté et un rendement élevés, dans certains cas, il peut toutefois être avantageux d’effectuer une ou plusieurs étapes supplémentaires, par exemple de concentration ou de formulation. Le procédé selon l'invention peut ainsi en outre comprendre au moins une étape supplémentaire et postérieure à l’étape e) de concentration ou de formulation.
À titre d’exemple non-limitatif, il peut être avantageux de concentrer par la suite le pigment bleu compris dans la composition, par exemple par une étape d’évaporation, notamment afin d’obtenir une concentration plus élevée en pigment bleu. À titre d’exemple non-limitatif, il peut également être avantageux de formuler le pigment bleu dans une composition. Afin d’adapter la solution aqueuse enrichie en pigment bleu issue du procédé selon l’invention à une utilisation particulière, la composition peut subir une étape de formulation, par exemple par l’addition d’un excipient et/ou d’un véhicule et/ou par tout autre changement de composition de ladite solution aqueuse enrichie en pigment bleu, tel qu’un ajout d’une solution tampon. Dans d’autres cas, l’étape de formulation peut être une étape de séchage, par exemple, permettant d’obtenir le pigment bleu en forme de poudre.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre, après l'étape e) de dialyse, une ou plusieurs des étapes suivantes visant à adapter la composition à une formulation particulière et/ou à augmenter la pureté du produit :
• une étape de concentration ; et/ou
• une étape de formulation.
Chaque étape optionnelle identifiée ci-dessus peut être présente en tant qu’étape supplémentaire unique du procédé, en combinaison avec une ou plusieurs autres étapes optionnelles, ou avec toutes les autres étapes optionnelles.
La présente invention a pour autre objet la solution aqueuse obtenue par le procédé décrit ici.
La solution de pigment bleu enrichie obtenue par le procédé de l’invention peut notamment être utilisée comme source de pigment bleu naturel à destination de l'agro- alimentaire et de la cosmétique, ou comme substance antimicrobienne pour usage en aquaculture. La présente invention a pour autre objet l’utilisation de la solution aqueuse enrichie en pigment bleu obtenue par le procédé décrit ici comme source de pigment bleu naturel à destination de l'agro-alimentaire et de la cosmétique, ou comme substance antimicrobienne pour usage en aquaculture. EXEMPLES
L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Ces enseignements comprennent des alternatives, des modifications et des équivalents, qui pourront être appréciés par une personne du métier.
Exemple 1 : Procédé selon l’invention Un procédé mis au point permettant d’obtenir une solution aqueuse enrichie en pigment bleu, ici de la marennine, sans aucune étape d’ultrafiltration ou de chromatographie sur colonne est décrit ci-dessous. Matériels et méthodes
Matériel biologique
Les souches d’Haslea ostrearia ont été isolées dans des claires ostréicoles de la baie de Bourneuf (France) et identifiées par microscopie électronique à balayage (souche NCC 497). Des cultures en batch ont été réalisées dans des Erlenmeyers de 200 mL en utilisant un milieu d’eau de mer artificielle adapté de Harrison et al. (Harrison et al. 1980) et stérilisé par autoclavage (salinité finale du milieu 31 ± 1 ppm et pH 7,6 ± 0,2). Les cultures d’H. ostrearia ont été maintenues dans une chambre de culture à température contrôlée à 16°C sous un éclairement de 200 pmol de photons rrf2 s 1 délivrés par des tubes fluorescents blancs avec un cycle jour/nuit de 14/10 heures. Lorsque les cultures atteignaient le début de la phase stationnaire de croissance, le surnageant de culture contenant la marennine extracellulaire était récupéré après décantation des cellules et filtré grossièrement au travers d’un filtre à filtration rapide de porosité 15 pm (150 mm Filter paper, Fisher Scientific®). Le surnageant filtré était gardé dans la chambre à température contrôlée sous obscurité avant de passer aux étapes décrites dans les procédures générales.
Procédé d’enrichissement du pigment bleu en solution aqueuse
Optionnellement, le milieu de culture d’Haslea ostrearia est filtré à 1 ,2 pm (filtres GF/C).
Le milieu de culture ύΉ. ostrearia, comprenant de la marennine à une concentration d’environ 3 à 4 mg/L, est ensuite placé sous agitation modérée et soumis à une précipitation par ajout de 5 mL d’hydroxyde de sodium (1 M) par 1 litre de culture filtrée en goutte à goutte puis laissé décanter jusqu’à apparition d’une couche verdâtre au fond de la bouteille et disparition de la coloration de la phase aqueuse (environ 5 heures) à température ambiante sans agitation.
Après la décantation, une grande partie de la phase aqueuse (e.g. de 80 à 90 %) est retirée. Optionnellement, la phase aqueuse est mise de côté pour traitement ultérieur.
Le mélange comprenant le reste de la phase aqueuse et la phase précipitée est centrifugé à 12 880 x g (10 000 rpm) pendant 30 minutes. La phase aqueuse restante est ensuite séparée de la phase précipitée. Optionnellement, les phases aqueuses sont rassemblées et resoumises à une précipitation par ajout d’hydroxyde de sodium puis laissées décanter comme décrit ci-dessus, en décantant au moins 3h, voire toute une nuit (e.g. 16 heures), pour améliorer le rendement de récupération de la marennine et diminuer encore le volume de travail. Après la centrifugation, la phase précipitée obtenue est solubilisée dans une solution d’acide formique (HCOOH) à 5%. La solubilisation est réalisée dans un volume de 250 à 350 mL d’acide formique.
La solution obtenue est filtrée à 0,22 pm sur membrane de cellulose régénérée. Enfin, une dialyse contre 2 L d’eau est réalisée dans un boudin de dialyse de 1 kDa pendant 72 heures en changeant l’eau de dialyse 2 fois par jour.
Résultats
Une solution aqueuse enrichie en marennine (90 mg/L minimum) avec un pH compris entre 4,5 à 5,5 notée « MCPN » est obtenue. Aussi, de façon très avantageuse, la marennine dans la solution aqueuse enrichie est concentré de 26-fois.
Exemple 2 : Caractérisation de la solution « MCPN »
La solution aqueuse enrichie en marennine a été caractérisée par la spectrométrie UV- Visible, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la chromatographie d’exclusion- diffusion (HPLC-SEC). Une solution de marennine considérée pure et obtenue selon la méthode de Pouvreau et al (2006a) a également été analysée à titre comparatif.
Matériels et méthodes
Les spectres d’absorption UV-visible ont été réalisés sur un spectrophotomètre UV- 3100PC (VWR). L’analyse est effectuée en mode scan de 190 à 800 nm.
L’analyse RMN a été effectuée sur la plateforme RMN liquide de l’Institut des Molécules et Matériaux du Mans à l’Université du Mans. L’appareil utilisé est un Spectromètre Bruker AVANCE 400MHz avec les sondes BBFO+ 5mm large bande (1 H, 19F et de 15N à 31 P, z-gradient, accord automatique) et QNP 5mm (1 H, 19F, 31 P, 13C, z-gradient) et un passeur d’échantillon de type B-ACS 60.
L’analyse chromatographique a été réalisée sur une chaîne HPLC Waters Alliance 2690 équipée d'un détecteur par ampéromètrie pulsée PAD 996 et du logiciel Empower.
Une colonne Xbridge® Protein BEH SEC 125 A°, 3,5 pm, 7,8 * 300 mm (Waters) a été utilisée avec une élution isocratique (Na2C03 250 mM, NaN3 0,05%, pH 8) et un débit de 0,5 mL / min.
Résultats
Le spectre d’absorption et le spectre RMN de la solution MCPN sont très similaires à ceux de la marennine pure (Figure 2A et 2B). De plus, le chromatogramme de la solution MCPN, ne représente qu’une autre impureté (pic à 10,963 min) et un petit épaulement sur le pic de la marennine à 17,607 minutes (Figure 2C).
Avantageusement, la solution aqueuse enrichie en pigment bleu (ici, la marennine) obtenue par le procédé de l’invention possède les mêmes caractéristiques que celles de la marennine pure. Aussi, le procédé mis au point permet avantageusement d’obtenir un produit de pureté élevée sans étape d’ultrafiltration ou de chromatographie sur colonne.
Exemple 3 : Evaluation de variantes du procédé selon l’Exemple 1
Une série d’essais a été réalisée en variant les conditions des différentes étapes, selon le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1
Conditions opératoires des essais représentatifs
On constate que les différentes variantes testées du procédé ne modifient pas la solution aqueuse enrichie en pigment bleu, à l’exception de la phase de re-solubilisation par acide chlorhydrique.
Exemple 4 : Enrichissement du pigment bleu produit par d’autres espèces d’Haslea
Le procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu tel que décrit ici a été testé en utilisant le surnageant de différentes espèces d’Haslea produisant le pigment bleu comme solution aqueuse de départ (à l’étape a)) (cf. Tableau 2). Tableau 2
Espèces d’ astea testées
On constate que la culture de différentes espèces d’Haslea produisant du pigment bleu peut être utilisée en tant que solution aqueuse à l’étape a) du procédé selon l’invention, dont la culture des espèces décrites ci-dessus.
Exemple 5 : Essai comparatif
Le procédé selon l’invention a été effectué en parallèle au procédé actuellement utilisé tel que décrit par Pouvreau (Pouvreau ét al., 2006a).
Matériels et méthodes Le procédé d’enrichissement du pigment bleu selon l’invention a été effectué tel que décrit à l’Exemple 1. Les procédés de Pouvreau et al., 2006a et de T urcotte et al., 2016 ont été réalisés en parallèle. Brièvement, ces procédés débutent par une étape de filtration sur filtre Whatman GF/F (0,45 pm) du surnageant d’une culture d’Haslea ostrearia, suivie par une étape d’ultrafiltration (récupération de la fraction comprise entre 3 kDa et 30 kDa) (Turcotte et al., 2016), suivi pour Pouvreau et al., 2006a d'une étape de chromatographie semi-préparative par échange d’anions (passage sur colonne contenant une résine Sepharose). Le pigment retenu sur la résine est élué par une solution saline puis la solution est dialysée.
Les spectres d’absorption UV-visibles, les spectres RMN, et la chromatographie d’exclusion-diffusion (HPLC-SEC) de la solution aqueuse obtenue par le procédé décrit ici (la solution « MCPN ») et celle obtenue par les procédés de Pouvreau et al., 2006a (« marennine pure » et Turcotte et al. 2016 (solution appelée « blue water, BW ») ont ensuite été déterminés et comparés ensemble. Ces techniques sont détaillées à l’exemple 2, ci-dessus. Résultats
Comme indiqué dans le Tableau 3 ci-dessus, on constate que la durée du procédé selon la présente invention est plus courte que celle de l’art antérieur, que le coût est fortement réduit. Par ailleurs, on constate que les spectres d’absorption de la « BW», de la « marennine pure » et de la « MCPN » sont très comparables. Le décalage observé au niveau de la zone 640-680 m est dû à la différence du pH entre les solutions. De plus, les chromatogrammes obtenus par HPLC-SEC montrent que la « MCPN » est plus pure que la « BW ».
Tableau 3
Comparaison des procédés
LISTE DES DOCUMENTS CITES
Gastineau, 201 1. Biodiversité, reproduction et phylogénie des diatomées bleues du genre Haslea et valorisation de leurs pigments de type marennine. Sciences agricoles, Université du Maine.
Gastineau, et al., 2012. Haslea karadagensis (Bacillariophyta): a second blue diatom, recorded from the Black Sea and producing a novel blue pigment. Eur. J. Phycol., 47: 469-479
Gastineau, et al., 2016. A new blue-pigmented hasleoid diatom, Haslea provincialis, from the Mediterranean Sea. Eur. J. Phycol, 51 : 156-170
Harrison, et al., 1980. A broad spectrum artificial sea water medium for Coastal and open océan phytoplankton. J. Phycol. 16, 28-35.
Pouvreau, et al., 2006a. Purification of the blue-green pigment - marennine from the marine tychopelagic diatom Haslea ostrearia (Gaillon/Bory) Simonsen. J. Appl. Phycol., 18, 769-781.
Pouvreau, et al., 2006b. Preliminary characterization of the blue-green pigment - marennine from the marine tychopelagic diatom Haslea ostrearia (Gaillon/Bory)
Simonsen. J. Appl. Phycol., 18, 757-767.
Pouvreau, ét al., 2007. Method for the quantification of the blue-green pigment marennine synthesized by the marine diatom Haslea ostrearia (Gaillon/Bory) Simonsen using HPLC gel-filtration and photodiode-array détection. J. Appl. Phycol. 19, 263-270.
Prasetiya, ét al., 2018. Haslea nusantara, a new blue diatom from the Java Sea, Indonesia: Morphology, biometry and molecular characterization. Crypt. & Algol (sous presse)
Robert, ét al., 2002. Extraction and quantitative analysis of the blue pigment
"marennine" synthesized by the diatom Haslea ostrearia. Journal of Applied Phycology,
14: 299-305.
Turcotte, ét al., 2016. Prophylactic effect of Haslea ostrearia supernatant culture containing the pigment marennine to stabilize bivalve hatchery production. Aquatic Living Resources, 29: 401 (9 pages).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d’obtention d’une solution aqueuse enrichie en pigment bleu, comprenant : a) la fourniture d’une solution aqueuse comprenant un pigment bleu issu d’au moins un microorganisme du genre Haslea, b) une étape de précipitation du pigment bleu à l’hydroxyde de sodium, c) une étape de séparation de la phase précipitée de la phase aqueuse, d) une étape de solubilisation du pigment bleu compris dans la phase précipitée, et e) une étape de dialyse.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l’étape de séparation c) comprend une décantation et/ou une centrifugation, de préférence une décantation suivie par une centrifugation.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le pigment bleu est précipité à l’étape b) par l’ajout de 0,02 et 0,04 % (m/m) d’hydroxyde de sodium.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le pigment bleu compris dans la phase précipitée obtenue à l’étape c) est solubilisé à l’étape d) par de l’acide carboxylique, de préférence de l’acide formique.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape de filtration stérilisante, de préférence sur un filtre ayant une porosité de 0,22 pm, avant l’étape e).
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend en outre au moins une étape de filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores d’au moins 1 ,2 pm avant l’étape b), de préférence une première filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores comprise entre 12 et 15 pm suivie par une deuxième filtration à travers un filtre ayant une taille moyenne de pores de 1 ,2 pm.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase aqueuse obtenue à l’étape c) est soumise à une nouvelle étape de précipitation selon l’étape b) suivie d’une séparation selon l’étape c).
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la membrane de dialyse a un seuil de coupure compris entre 1 et 3,5 kDa.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la solution aqueuse fournie à l’étape a) est un surnageant d’une culture d’au moins une diatomée sélectionnée parmi : Haslea ostrearia, Haslea karadagensis, Haslea provincialis, Haslea nusantara, Haslea silbo sp nov, Haslea acoran sp nov, de préférence à partir d’une culture de diatomée Haslea ostrearia NCC 497 déposée auprès du BEA le 1er octobre 2018 sous le numéro BEA_IDA_0065B.
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