EP3908295A2 - Cellules stromales neonatales felines et leurs utilisations - Google Patents

Cellules stromales neonatales felines et leurs utilisations

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EP3908295A2
EP3908295A2 EP20700707.1A EP20700707A EP3908295A2 EP 3908295 A2 EP3908295 A2 EP 3908295A2 EP 20700707 A EP20700707 A EP 20700707A EP 3908295 A2 EP3908295 A2 EP 3908295A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
feline
cells
csns
population
csn
Prior art date
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Pending
Application number
EP20700707.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Stéphane MADDENS
Nathalie SAULNIER
Marine FEBRE
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Vetbiobank
Original Assignee
Vetbiobank
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Filing date
Publication date
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Publication of EP3908295A2 publication Critical patent/EP3908295A2/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources

Definitions

  • the invention relates to a population of feline neonatal stromal cells, a pharmaceutical composition and an injectable solution comprising said cells, as well as a process for obtaining this composition from neonatal tissues.
  • the invention also relates to the use of these cells and compositions in cell therapy in the feline, in particular for the treatment of stomatitis.
  • GSC feline chronic gingivostomatitis
  • stomatitis chronic gingivostomatitis
  • lympho-plasmocytic stomatitis granulomatous stomatitis
  • GSC results in several symptoms such as mouth ulcers, inflammatory lesions, hyper salivation, loss of animal weight or bleeding. This debilitating disease is responsible for pain, stopping feeding, infectious complications and is the first cause of dental avulsion in cats. This operation is heavy and expensive and requires additional therapy in 69% of cases. Furthermore, among the subjects who underwent this avulsion, 32.6% of cats remained refractory to treatment (3) (Jennings et al., 2015). The etiology of GSC is still poorly understood, but it seems multifactorial and mainly underlies a local dysimmunity component (4). The strong presence of T cells at the lesion sites suggests an exacerbation of the host's immune response to the mucous membranes.
  • a treatment consisting of a double administration of 20 ⁇ 10 6 feline stromal cells derived from adipose tissue at one month apart has shown an effectiveness of the order of 70% in the context of autologous therapies and of the order of 57% in the context of allogenic therapies (7; US20160199414A1) and this on pathological subjects not responding to conventional therapies.
  • the cells used in these documents are fresh cells, that is to say cells which have not undergone a cryopreservation step or which are returned to culture after cryopreservation in the case of the second injection to the subject.
  • feline stromal cells require the removal of adipose tissue from an individual and therefore surgical intervention is necessary limiting the industrializable nature of a therapy exploiting the properties of these cells.
  • feline GSC When observing symptoms of feline GSC, very often all of the animal's teeth are extracted. In some cases, partial dental avulsion may be performed. For example, when oral lesions are not generalized, canines can be preserved. Likewise, when the inflammation is localized, it is possible that tooth extraction only concerns the teeth affected by the lesions.
  • the invention aims to provide a product for the treatment of feline stomatitis, easy to use, available at any time and which can be industrialized.
  • the invention also aims to provide a population of cells intended for cell therapy, in particular for allogenic therapeutic applications, and more particularly for the treatment of tissue damage to the mucous membranes in the feline such as feline stomatitis.
  • Another objective of the invention is to provide a population of cells having a good proliferation capacity to be able to be produced on an industrial scale and which retains all of its biological properties following a cryopreservation step.
  • Another objective is to provide a process for obtaining a pharmaceutical composition ready for use, comprising said cell population.
  • Another objective is to provide a pharmaceutical composition comprising said cell population.
  • Another objective of the invention is to develop a ready-to-use injectable solution which is directly usable for a therapeutic application, without the need to put the cells back in culture or to change the cellular medium before injection in the subject.
  • feline neonatal stromal cells make it possible to treat oral inflammation of the mucous membranes in the feline in an effective and lasting manner, in an allogenic context, in particular by injecting a single dose to the subject treat.
  • this cell population is capable of exerting a localized and / or global anti-inflammatory action making it possible to substantially reduce oral lesions.
  • This anti-inflammatory activity is linked, among other things, to the immunomodulatory properties of feline neonatal stromal cells. These properties can be defined as the ability of feline neonatal stromal cells to inhibit the differentiation, proliferation and / or activity of immune cells that cause the inflammatory context of a tissue or when these immune cells are cultured in vitro.
  • a first object of the present disclosure relates to a population of feline neonatal stromal cells (CSN).
  • feline means any animal of the Félidés family, in particular any animal of the genus
  • the feline according to the invention is a cat.
  • neonatal stromal cells all cells having one, more or all of the characteristics of mesenchymal stem cells and having a neonatal origin.
  • the term “neonatal” means that feline CSNs can be isolated from all tissue sources and / or biological fluids, from extra-embryonic appendages and which can be recovered during the parturition / cesarean phase or during the gestation period. .
  • these neonatal tissue sources correspond to the umbilical cord and more particularly to the umbilical cord matrix such as Wharton jelly, the perivascular zone of the arteries and / or the umbilical vein.
  • the neonatal tissues correspond to the amniotic membrane or more particularly to the epithelium of the amniotic membrane and / or of the amnion.
  • the neonatal tissues correspond to the placenta which is of the endotheliochorial type or more particularly to the chorionic mesoderm / chorionic plate, to the chorionic trophoblast / trophoblast, to the chorionic villi, to the placental cotyledons, to the placental decidua and / or to the perivascular system of the placenta.
  • the extra embryonic tissue is immediately transferred to a transport box containing for example a phosphate buffered saline solution from Dulbecco to be transported to the laboratory.
  • the tissues of extra embryonic appendages can be recovered during the entire gestation period of the cat (on average lasting 64-69 days) in the context of an ovary.
  • Hysterectomy of convenience which is a routine operation with an abortive and sterilizing aim.
  • biological fluids fluids from extra embryonic appendages such as umbilical cord blood or amniotic fluid and / or placental blood.
  • Umbilical cord blood can be recovered by puncturing the umbilical cord.
  • amniotic fluid it can be recovered by puncturing the liquid contained in the amniotic sac or by piercing the amniotic sac and by pouring the amniotic fluid which it contains in a tube, a petri dish or any other container. adapted.
  • said population of feline CSN comes from a neonatal tissue sample, in particular from one or more placentas and / or from one or more umbilical cords; or a sample of neonatal fluid, particularly blood from one or more umbilical cords or amniotic fluids.
  • feline CSNs from these tissues and fluids have the advantage of having been only slightly exposed to exogenous stresses which can induce epigenetic changes.
  • the feline CSNs are placental feline CSNs.
  • the CSNs of placentas come from placentas recovered during the gestation period. In another embodiment, the CSNs of placentas come from placentas recovered at the end of gestation.
  • the feline CSNs are characterized by the presence on their surface of the markers CD44 and CD29. In a particular embodiment, the feline CSNs are characterized by the absence on their surface of the markers CD8, CMH-I and CMH-II.
  • the analysis of these markers can be done by protein and / or transcriptional analysis.
  • markers CD44, CD29, CD8, CMH-I and / or CMH-II can be respectively analyzed by measuring the expression of the genes Cd44, Itgbl, C5arl and / or the family of "human leukocyte antigen gene complex" (HLA) genes HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, and HLA-DR or the corresponding feline homologous genes such as "feline leukocyte antigen gene complex ”(FLA).
  • HLA human leukocyte antigen gene complex
  • FLA feline leukocyte antigen gene complex
  • Analysis of the expression of the various genes can be carried out by techniques of final time PCR, RTqPCR, digital PCR and / or RNA microarray.
  • the expression of these markers can be studied by the use of antibodies or antibody fragments (monoclonal or polyclonal) specifically directed against one or more epitopes of the proteins CD44, CD29, CD8, MHC- I and / or CMH-II.
  • the techniques associated with these antibodies include, among others, cytometric analysis, Western blots, ELISA, immunofluorescence and / or immunohistochemistry.
  • marker proteins such as ligands or inhibitors can be used as analytical tools.
  • Other technologies using probe-labeled oligonucleotides can be used to assess this expression such as the use of aptamers, RNA probes and / or DNA probes.
  • feline CSNs can be characterized by their biological characteristics.
  • the feline CSN population is characterized in that at least 80% of the cells of said population have a capacity for consecutive cell doublings greater than 20 cumulative doublings.
  • cell doubling capacity is meant that a population of feline CSNs is able to double in number, more than 20 times in total.
  • feline CSNs have a capacity for consecutive cell doublings of between 20 and 50 cumulative doublings, in particular from 20 to 40, more particularly from 20 to 30.
  • This significant proliferation capacity allows cell amplification of the scale up type / scale out and industrializes a manufacturing process using this population cellular.
  • the significant proliferation capacity also means that the population of feline CSNs allows amplification over several passages ranging from 1 to more than 15 passages.
  • Nb of doublings LOG (Nf / Ni) / LOG (2) (Nf: number of final cells and Ni: number of initial cells).
  • the total number of cell doublings is equal to the sum of the number of doublings accumulated during each cell passage.
  • mesenchymal stem / stromal cells derived from adult feline tissue may have limits to the industrializable nature of the invention because of a possible infection with a Foamy virus type virus, the prevalence of 20 to 80% of cats, as has been demonstrated for mesenchymal stem cells from adipose tissue (8; 9; 10).
  • the latter limits cell proliferation by inducing premature cell death during the cell proliferation phase.
  • the fact of using cells of neonatal origin makes it possible to limit the use of cells infected with this virus and thus to confer an advantage for the industrialization of cell culture.
  • the fetal-maternal barrier has been shown to decrease the transmission of certain pathogens from mother to fetus (77).
  • the feline CSNs have an adhesion capacity to the plastic.
  • adhesion capacity on plastic support is meant that the population of CSN is characterized by its adhesion property on plastic support.
  • the feline CSNs have a fibroblastic type morphology.
  • fibroblastic type morphology is meant mononuclear cells having a spindle morphology; that is to say cells stretched in length in culture on a plastic support and the ends of which have cytoplasmic extensions. This morphology shows an ability for these cells to spread in order to ensure focal type adhesion on support and cell polarization. This aspect can be assessed by studying the maximum Feret diameter and minimum of the cells, of the surface occupied by the cells on 2D support and of the corresponding aspect ratio (minimum Feret / maximum Feret).
  • the feline CSNs have an immunomodulatory potential.
  • immunomodulatory potential is meant that in a specific embodiment, the population of feline CSN is characterized in that at least 80% of the cells of said population of feline CSN have an immunomodulatory potential.
  • This immunomodulation property can be characterized by the ability of feline CSNs to express a set of immunomodulatory factors such as PGE2, IL-6, IL-10, TGF-b, IDO, iNOS, HGF, KGF , CCL2 and / or TSG-6.
  • feline CSNs can modify their phenotype.
  • the inflammatory context can be mimicked in vitro by stimulation of the cells by means of cytokines and / or growth factors such as IFN-g, IL-1, IL-6 and / or TNF-a.
  • a change in the phenotype of feline CSNs results in the ability of feline CSNs to modify the transcriptional and / or protein expression of markers involved in immunomodulation.
  • the immunomodulatory potential of feline CSNs can also be characterized by the antiproliferative effect of feline CSNs on peripheral blood mononuclear cells (PBMC) treated with a mitogenic agent such as phytohemagglutinin, concanavalin A and / or lipopolysaccharides. Immunomodulation of feline CSNs can also be assessed by the ability of feline CSNs to inhibit the proliferation, secretion of pro-inflammatory cytokines and / or differentiation of T, NK, B Lymphocytes, monocytes and / or macrophages.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the feline CSNs have a capacity for chondrogenic differentiation.
  • capacity for chondrogenic differentiation it is meant that the CSNs have the capacity to be able to differentiate into chondrocytes.
  • the expressions “chondrocyte differentiation” and “chondrocyte differentiation” can also be used interchangeably.
  • This capacity for differentiation into chondrocytes can be evaluated by the protein and / or transcriptional study of specific markers of cartilage such as Collagen type II (COL2A1), SOX-9 (SOX9), aggrecan (ACAN), cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP), Collagen type IX (COL9A1), collagen type XI (COL11A1) collagen type IIB (COL2B) after induction of chondrogenesis.
  • cartilage Oligomeric Matrix Protein COMP
  • Collagen type IX (COL9A1)
  • collagen type XI collagen type IIB
  • visco-elastic properties of the extracellular matrix expressed by the differentiated CSNs, approaching the visco-elastic properties of cartilage, can serve as a characteristic for the evaluation of chondrogenesis.
  • the CSNs are detached from their support by trypsination and used to form micromasses by gravitation in a drop of amplification medium such as for example DMEM (lg / L of glucose) supplemented with 10% FCS (vol: vol), 2 mM glutamine and 0 to 20 ng / ml fibroblastic growth factor (FGFb).
  • amplification medium such as for example DMEM (lg / L of glucose) supplemented with 10% FCS (vol: vol), 2 mM glutamine and 0 to 20 ng / ml fibroblastic growth factor (FGFb).
  • FGFb fibroblastic growth factor
  • This micromass is recovered and placed in the presence, for 7 to 28 days, of a chondrocyte differentiation medium composed of DMEM with 4.5 g / L of glucose and supplemented with TGF- b3 or a combination TGF- bI / BMR -2, in particular 10 ng / ml of TGF ⁇ 3 or 10 ng / mlTGF-bI and 50 ng / ml of BMP-2.
  • a chondrocyte differentiation medium composed of DMEM with 4.5 g / L of glucose and supplemented with TGF- b3 or a combination TGF- bI / BMR -2, in particular 10 ng / ml of TGF ⁇ 3 or 10 ng / mlTGF-bI and 50 ng / ml of BMP-2.
  • an RNA or protein extraction is carried out in order to analyze the expression of specific markers of the chondrogenic lineage such as collagen type II, aggrecan, COMP, SO
  • the feline CSN population is characterized in that at least 80% of the cells of said feline CSN population have a potential for osteogenic differentiation. We also talk about osteogenic differentiation potential or osteogenesis.
  • This osteogenic differentiation potential can be assessed by the protein and / or transcriptional study of specific bone markers (ALPL, RUNX2 ...) or by analysis of calcium deposits after induction of osteogenesis in 7 to 15 days.
  • This osteogenic induction can be carried out by culturing CSNs in a monolayer in the presence of an osteogenic differentiation medium containing a corticosteroid, such as dexamethasone (0.1-ImM), a reducing agent such as ascorbic acid 2-phosphate ( between 0 and 200 pg / ml) and b-glycerophosphate (0-50 mM).
  • a corticosteroid such as dexamethasone (0.1-ImM)
  • a reducing agent such as ascorbic acid 2-phosphate ( between 0 and 200 pg / ml) and b-glycerophosphate (0-50 mM).
  • BMP-2 can for example replace dexamethasone.
  • APL a protein and / or transcriptional study of specific markers of bone (ALPL, RUNX2) can be carried out.
  • composition and injectable solution comprising feline CSNs
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a population of feline CSNs as described above.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a population of feline CSNs as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the feline CSNs of said composition come from a sample of neonatal tissue, in particular from one or more placentas and / or from one or more umbilical cords, or from a sample neonatal biological fluid, in particular the blood of one or more umbilical cords or amniotic fluid.
  • said pharmaceutical composition comprises a population of feline CSNs between 3 million and 20 million cells for 0.5 ml to 10 ml of solution, and more specifically between 5 and 15 million cells for 1 to 2 ml of solution, and even more specifically 10 million cells for 1.5 ml of solution.
  • the pharmaceutical composition comprises between 3.10 5 and 4.10 7 cells / ml, in particular 2.5 ⁇ 10 6 and 1.5 ⁇ 10 7 cells / ml, more particularly 1.10 7 cells / ml.
  • the pharmaceutical composition comprises between 5 and 15 million feline CSNs, in particular 10 million.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle of this composition and / or the packaging makes it possible to maintain this proportion of viable CSNs for a sufficient time and this in a frozen or thawed manner according to the following methods.
  • the vehicle can be all types of liquids, gels, solid polymers capable of containing these CSNs without deteriorating their desired properties, in particular an aqueous saline solution, serum, culture medium, a cryopreservation medium.
  • the packaging can be all types of receptacles, containers, medical devices capable of aseptically isolating pharmaceutical preparations from the external environment and / or the transport environment and / or the manipulator.
  • the packaging makes it possible to maintain the integrity and the formulation of the pharmaceutical composition and / or to facilitate the distribution / transport of the pharmaceutical composition.
  • the vehicle and / or the packaging can be used to improve the properties of feline CSNs for their therapeutic use.
  • growth factors, cytokines, active principles can be incorporated into the vehicle or linked to the packaging and thus act on the properties of feline CSNs so as to improve them.
  • the availability and / or release of these chemical and / or biological actors can be of kinetic nature.
  • said pharmaceutically acceptable vehicle is a solution comprising a cryoprotective.
  • the solution can be any solution allowing the freezing and / or thawing of cells while limiting the biological influence of these processes on cells such as the induction of cell death, differentiation, the induction of cell senescence , osmotic shocks, induction of membrane porosity, modification of the membrane composition and / or phenotypic changes.
  • the solution corresponds to DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), MEM (Minimum Essential Media), a solution comprising fetal calf serum ( SVF), a solution comprising animal serum, and / or any other isotonic solution.
  • said solution comprises between 0 and 20% of FCS, more particularly between 5 and 20%, even more particularly 10%.
  • cryopreservation solution in a particular embodiment, is free of animal product.
  • cryopreservation solution can be used as an injectable solution for the treatments concerned by the pharmaceutical composition described in said invention.
  • cryoprotective means any compound making it possible to perform the cryopreservation function.
  • said cryoprotector is chosen from glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol, proteogly canes, trehalose, "Bovine serum albumin” (BSA), gelatin, polyethylene glycol (PEG), polyacrylic-acid, poly-L-lysine, ethylene glycol or a combination of several of these cryoprotectors.
  • said solution comprises from 0.5 to 30% of glycerol, from 0.5 to 30% of DMSO, from 0.5 to 30% propylene glycol or from 0.5 to 20% poly-L-lysine.
  • said solution comprising a cryoprotective is a solution comprising from 2 to 10% of DMSO, more particularly 5% of DMSO.
  • said solution comprising a cryoprotective is a solution comprising 2 to 20% of glycerol.
  • one or more adjuvants can be added to the pharmaceutical composition such as ammonium chloride, Ringer's lactate or BSA.
  • said solution comprising a cryoprotector is a DMEM solution comprising SVF, in particular from 5 to 20% of SVF and more particularly 10%, and comprising from 1 to 90% of DMSO, more particularly from 0.5 to 20%, more particularly from 5 to 10%, in particular 5%.
  • said solution comprising a cryoprotector is a DMEM solution comprising SVF, in particular from 5 to 20% of SVF and more particularly 10%, and from 2 to 20% of glycerol.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is in frozen form.
  • the pharmaceutical composition can be cryogenized with the use of a suitable cryoprotective, capable of guaranteeing the integrity and the formulation of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can then be stored at -196 ° C, for long-term storage (more than 12 months). To be used, it undergoes thawing, as described below.
  • said composition is a ready-to-use composition.
  • ready to use is meant that the pharmaceutical composition comprising feline CSNs is ready to be injected into the individual. Recultivation of cells before use in the individual is not necessary and the cells do not need to be resuspended in a physiological medium, even when they are formulated with a cryoprotector as described above .
  • the expression “ready to use” means that only a thawing step is necessary when the composition is in frozen form, before injection into the patient.
  • This pharmaceutical composition which can be frozen can thus be mobilized at any time.
  • the latter has the advantage of making treatment available as soon as possible while limiting the human intervention necessary for its effectiveness and limiting the risk of contamination inherent in each manipulation by an operator. Thus, it is possible to separate the process for obtaining the pharmaceutical composition from its final clinical use.
  • Another aspect of the invention relates to a ready-to-use injectable solution comprising a population of feline CSNs as described above and a cryoprotector as defined above.
  • said ready-to-use injectable solution comprises a unit dose of 5 to 15 million CSN, more particularly 10 million, and a solution comprising a cryoprotector as defined above.
  • cryoprotective in said injectable solution is DMSO.
  • the solution comprises between 0.5 and 30% of DMSO, in particular between 2 and 10%, more particularly 5%.
  • the injected solution ready for use at a volume between 1 and 5 ml, more particularly 1.5 ml.
  • feline CSNs The characteristics of the feline CSNs described above, allow the use of these cells in cell therapy.
  • cell therapy is meant a therapeutic treatment comprising G administration of cells capable of inducing a beneficial therapeutic effect in the feline.
  • this cell therapy is likely to directly (cell differentiation) or indirectly (secretion of biological factors, activation or inhibition of environmental cells) recovery, homeostatic and / or immune balance of one or more tissues or organs in a feline individual awaiting such treatment.
  • the present invention relates to a population of feline CSNs, a pharmaceutical composition or an injectable solution as described above for their use in cell therapy.
  • This use in cell therapy can be an autologous, allogenic, syngeneic or xenogenic therapeutic use.
  • the use in cell therapy is an allogeneic therapeutic use, also called heterologous.
  • the use in cell therapy is a xenogenic therapeutic use.
  • the present invention relates to a population of feline CSNs, a pharmaceutical composition or an injectable solution as described above for their use in the treatment of feline stomatitis.
  • stomatitis means an inflammation of the oral cavity. Stomatitis is designated by different terms depending on the etiology, therapeutic approach and / or clinical signs observed. For example and in a non-exhaustive manner, the stomatitis are gingivitis, periodontitis, caudal stomatitis, buccostomatitis, chronic stomatitis, lympho-plasmocytic stomatitis or granulomatous stomatitis.
  • the stomatitis can have an infectious (bacterial, fungal), autoimmune, inflammatory origin, following chemotherapy and / or radiotherapy and / or consecutive to organic, metabolic drug treatment.
  • the pathological origin of the stomatitis is viral and in a non-exhaustive manner, generated following an infection by the feline Calicivirus, by the Herpes virus or by the feline immunodeficiency virus.
  • feline stomatitis is chronic stomatitis, in particular chronic gingivostomatitis (GSC).
  • 5.10 5 to 10.10 6 cells / kg more particularly 1.10 6 to 5.10 6 cells / kg are administered.
  • 5.10 5 to 2.10 7 feline CSN in particular from 5.10 6 to 1.5.10 7 , more particularly 1.10 7 , or a composition or solution for injection comprising such a dose, are administered.
  • the subject is treated with the administration of a single dose as defined above.
  • a single dose of 3.10 6 to 2.10 7 Feline CSN, in particular from 5.10 6 to 1.5.10 7 , more particularly 1.10 7 is sufficient to treat the subject.
  • treating the subject is meant that the subject to whom feline CSNs have been administered as described in the present application, shows a reduction in symptoms for a period of at least 2 months, in particular at least 4 months, especially at least 6 months. The subject's condition is then improved by the treatment. It is also understood that the subject to whom the feline CSNs have been administered presents an improvement in their condition in the sense that this allows a reduction in the frequency and / or the dose, or the total freedom from other known conventional therapeutic or analgesic solutions. by the skilled person.
  • compositions known to those skilled in the art are meant, in a non-exhaustive manner, total or partial dental avulsion, ciclosporin, anti-inflammatory drugs of steroid or non-steroid type, antibiotics, Omega Interferon (IFN), corticosteroids, gabapentin, morphine and / or buprenophine.
  • administration to the subject is carried out at least once to treat said subject.
  • At least two administrations on the subject are carried out, two administrations being spaced at least 2 months from each other, in particular spaced from 2 months to 5 years, by 2 months at 4 years, from 2 months to 3 years, from 2 months to 2 years, from 2 months to 1 year, or from 2 months to 6 months.
  • the CSNs can be administered locally or in a particular embodiment intravenously (IV).
  • IV administration is meant administration of the CSNs directly into the venous system of the animal using a catheter or a needle or, for example, via an infusion bag or, for example, through the infusion set with a particular speed of administration.
  • administration speed is understood to mean an infusion rate in a particular embodiment of 2.5 ⁇ 10 4 to 1.10 6 of CSN / min.
  • the CSNs can be administered at the rate of 5.10 5 CSN / min.
  • the administration is carried out intravenously, for example using an infusion.
  • said population of feline CSNs or said pharmaceutical composition for the use as described above is characterized in that the administration is carried out in the form of a single dose of 5.10 5 to 2.10 7 Feline CSN, in particular from 5.10 6 to 1.5.10 7 , more particularly 1.10 7 , to treat the subject, in particular by intravenous route.
  • this use can be combined with other types of treatment / interventions.
  • it can be carried out following total dental avulsion; and / or during or following a drug treatment or during anesthesia.
  • this use can be carried out in subjects who have not undergone dental avulsion or in subjects who have undergone partial dental avulsion.
  • partial dental avulsion is meant any surgical operation aimed at extracting between 1 and 29 teeth, more particularly between 1 and 26 teeth, more particularly between 1 and 16 teeth.
  • partial avulsion can represent the only extraction of teeth specifically affected by oral lesions or G extraction of all teeth except the canines.
  • the present invention relates to feline CSNs, the pharmaceutical composition or the solution for injection as described above for their use in the treatment of feline stomatitis, in combination with the administration of one or more anti-inflammatory, analgesic, immunomodulatory, anti-infectious and / or antiviral treatments linked or not to stomatitis.
  • the present invention relates to feline CSNs, the pharmaceutical composition or the solution for injection as described above for their use in the treatment of stomatitis in felines, in combination with the administration of a anti-inflammatory.
  • This anti-inflammatory can be an anti-inflammatory of the steroid or non-steroid type.
  • steroidal anti-inflammatory we can cite glucocorticoids and steroid corticoids.
  • non-steroidal anti-inflammatory we can cite buprenorphine, aspirin, ibuprofen, ketoprofen, methylprednisolone acetate.
  • As a therapeutic with an anti-inflammatory action we can also cite laser therapy.
  • As analgesics we can cite morphine and alpha2-agonists.
  • immunomodulator we can cite cyclosporins and rapamycin.
  • anti-infective and antiviral we can cite recombinant antibiotics and interferons.
  • the feline CSNs are administered for the treatment of feline stomatitis in subjects refractory to one or more of the therapeutic or analgesic solutions previously mentioned.
  • refractory means any medical management of feline GSC which is not satisfactory, which has a lack of effectiveness, an upsurge of clinical signs, which generates unwanted side effects, which generates intolerance or an adverse immune reaction, inducing a lack of compliance, requiring use of a drug dose that is too high compared to conventional treatment and / or the use of too complex and unsuitable polypharmacy.
  • feline CSNs allows at least clinical improvement or complete remission in more than 50%, more particularly 70%, more particularly 80% of animals suffering from GSC, having undergone dental avulsion total and / or refractory to conventional therapies.
  • this evolution is observed without prior selection of cats based on their blood phenotype and more particularly without selection of the proportion of cells having a low level of expression of the CD8 marker (CD8 + low) within a population expressing this marker (CD8 + global).
  • the effectiveness of the treatment can be evaluated in different ways.
  • the effectiveness of the treatment is measured using an evaluation system established by a veterinarian, based on the GSC activity index (The Stomatitis Disease Activity Index: SD AI).
  • SD AI score takes into account the following parameters: oral inflammation (maxillary and mandibular), gingival inflammation (maxillary and mandibular), inflammation in the palatal arch, inflammation of the salivary gland, oropharyngeal inflammation, lingual inflammation or sublingual.
  • the evaluation of the SDAI can be carried out at the inclusion and then at different times after the infusion or injection of the pharmaceutical preparation.
  • SDAI clinical score
  • the recovery percentage is obtained by the formula ⁇ 1- (SDAI f / SDAL) ⁇ x 100 where SDAI f corresponds to the final SDAI obtained, and SD AL corresponds to the initial SDAI obtained.
  • the effectiveness of the treatment can be assessed during a time interval by calculating a recovery percentage using as an analysis variable an SDAI at a given intermediate time (SDAI t ) instead of d 'an SDAI f and a formula of the type of (1- (SDAI t / SDAL) ⁇ xl00.
  • a percentage greater than or equal to 15% is considered to be a clinical improvement not due to a placebo effect (13).
  • clinical remission is meant, animals whose SD AI score is less than 2 at the time of the clinical evaluation (Dental Vêts, 2015).
  • the effectiveness of the treatment can be evaluated by monitoring the progress of the symptoms linked to the disease.
  • the treatment will thus be considered effective if it makes it possible to dispense with the other conventional therapeutic or analgesic solutions known by the person skilled in the art or to reduce the frequency of use or the dose thereof, if it contributes to reducing eating disorders (dysorexia) in animals with a symptom of undernutrition, if it allows gain in activity and weight gain in treated subjects with an initial loss of activity, if it allows the intensity of pain caused by the subject's medical status. All or part of these parameters can be monitored by the owners in monitoring forms (Example 2).
  • the present invention also relates to a method of treatment of feline stomatitis comprising the administration of feline CSNs, of a pharmaceutical composition or of an injectable solution comprising feline CSNs as described above, to a subject.
  • Another aspect of the invention relates to an in vitro process for obtaining a pharmaceutical composition according to the invention.
  • the present invention also relates to an in vitro process for obtaining a ready-to-use pharmaceutical composition comprising feline CSNs as described above, said process comprising the following steps:
  • step d at least one step of cryopreservation of the population of feline CSNs obtained following step b and / or c., to constitute a cell bank;
  • step f optionally, a step of stimulation by a chemical and / or biological physical effector of the feline CSNs to increase their biological and therapeutic properties, during step f;
  • step b. at least one step for verifying the biological properties of feline CSNs following step b., c., d., e., f., and / or g .;
  • feline neonatal biological samples from which the feline CSNs may have been described have been described previously.
  • isolation means the means used to extract the cells from their original source of tissue nature and / or biological fluid. Typically these means correspond to the mechanical dissection of the tissues making it possible to obtain tissue fractions which can be used in the laboratory. These tissue fractions are then cultured for explantation type isolation, thus exploiting the migration capacities of the resident cells.
  • Another means of isolation is for example the use of digestion enzymes leading to the catabolism of the extracellular matrix and the release of the cells over a given time from 10 min to 16 h under controlled temperature. Among these digestion enzymes, it is possible to cite, in a non-exhaustive manner, collagenases, pronase, hyaluronidases and / or other matrix proteases.
  • Another means of isolation, for biological liquid sources and / or cell suspensions obtained from enzymatic tissue digestion, consists in the use of cell purification by centrifugation on a density gradient of the Ficoll, Percol and / or glucose type. .
  • the methods mentioned above can be used alone or in combination.
  • the result of these isolation methods must favor the isolation of CSNs independently of cells. hematopoietic, blood cells or other contaminating cell types which do not correspond to CSNs or CSNs which do not have the abovementioned biological properties.
  • a step of amplifying the cells by adhesion to the plastic can be carried out.
  • a plastic support treated or not for cell adhesion, and / or in the presence or not of fibroblast growth factor (FGF, FGF-2, FGFb), dexamethasone and / or ascorbic acid 2 phosphate (A2P), and in a cell culture medium properly defined by those skilled in the art, is used.
  • amplification step is meant any step allowing proliferation of CSNs on plastic or polymer support. This phase must be able to promote the presence of CSNs to the detriment of other cell types which do not meet the characteristics of CSNs. It must also ensure optimal proliferation of cells while limiting the phenomena of dedifferentiation, differentiation and / or senescence. This step involves conditions in a controlled atmosphere such that a person skilled in the art is able to establish, for example with 90% humidity and comprising 5% CO2.
  • the amplification temperature must be constant and between 35-40 ° C, more precisely between 37-39 ° C.
  • the culture media in a non-exhaustive manner, it is possible to cite the media of the Alpha-MEM, DMEM, RPMI, IMDM, Opti-MEM, EGM, EGM-2 type, synthetic media adapted to the culture of CSM lacking endotoxin and / or serum, synthetic media adapted to good manufacturing practices, whether or not supplemented with fetal calf serum (SVF) from 0.1% to 20%, platelet lysate, insulin-transferin-selenium , defined commercial supplements and / or other growth factors and / or molecules promoting the proliferation of CSNs while limiting their senescence such as FGF, EGF, VEGF, dexamethasone and / or A2P.
  • SVF fetal calf serum
  • This amplification phase can be carried out on different supports once the population of CSN is obtained following the isolation step.
  • These different supports can be 2D or 3D in nature.
  • amplification on 2D support is meant any cell culture method allowing amplification of feline CSNs on monolayer support and properly developed by those skilled in the art.
  • the cells can be cultured in plastic culture dishes treated or not to promote cell adhesion, of flaccid type, with one or more stages and / or of multilayer type with or without continuous perfusion, with or without optimization of the flow of 'air.
  • the CSNs can be amplified in shaking, axial and / or pendulum bioreactors, in wave shaking, in rotating bed shaking, in static and / or infused bioreactors.
  • the biomaterials and / or microcarriers can be of several natures and according to particular embodiments can be of sizes between 50-500 ⁇ m in diameter, have a porosity of different nature, have a treated surface, charged or not negatively or positively charged, include growth factors or recombinant proteins of the integrin and / or extracellular matrix type or any other biological / chemical molecules promoting cell adhesion and / or cell proliferation.
  • cell passage of the CSNs may be necessary and carried out by a method correctly developed by those skilled in the art.
  • These cell passages can be carried out by detachment of the cells under the effect of mechanical action, enzymes and / or inhibitors such as, in a non-exhaustive manner, recombinant or animal trypsin, EDTA and / or accutase.
  • a clonal selection can take place during the first passages from PI to P4 such (11) and result in a relatively stable population such as the clonogenicity of the population of CSN n 'evolves only weakly.
  • these first passages can allow the isolation of a CSN population devoid of other contaminating cell types such as lymphocytes and other blood cells, macrophage, neutrophils, polynuclear cells, endothelial cells and / or fibroblasts.
  • the cells are for example treated with trypsin-EDTA, then taken up in an amplification medium and centrifuged. After taking up in amplification medium, they are seeded at the level of 1500 to 5000 cells / cm 2 or 3D equivalent and cultivated in amplification medium with or without monitored monitoring of the microenvironment and / or culture atmosphere.
  • the feline CSNs obtained are suspended with a pharmaceutically acceptable vehicle as defined above.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is a solution comprising a cryoprotective.
  • cryopreservation is meant the cell freezing and storage stage for a period ranging from 1 day to 5 years and more.
  • the cell bank is conditioned to guarantee the integrity and biological properties of cell populations. Banks can be of several natures and play several roles. It is possible to cite in a non-exhaustive manner the cellular reserve banks (“master bank” or “seed unit”), cellular working banks (“working bank”), legal bank, retention bank and / or unit banks ready-to-use therapeutic products for therapeutic use. Note that this latter bank of therapeutic units may correspond to a pharmaceutical preparation described later.
  • the cryopreservation step is carried out after the suspension of the CSNs in a solution comprising a cryoprotector.
  • this freezing or cryopreservation step corresponds to a gradual descent of the temperature of the cell suspension (-1 ° C / minutes) to reach the storage temperature ranging from -70 ° C to - 195 ° C.
  • the cells can be frozen at a freezing rate of between -0.3 ° C / minutes and -99 ° C / minutes.
  • the same freezing protocol can include one or more different freezing speeds as in the case of a gradual increase in freezing speed.
  • the cells are directly frozen without temperature control in a storage enclosure whose temperature is between -70 ° C and 195 ° C.
  • Final storage can be in liquid phase (liquid nitrogen type) or gas phase (enclosure type -140 ° C, -80 ° C or nitrogen storage in gas phase).
  • a thawing step is carried out following the freezing step, in the case where the CSNs used for the administration are in the form of units of bank. This thawing is carried out so as to pass from the stage of frozen cells to the stage of thawed cells during an embodiment limiting cell death by drying, mechanical damage to the plasma membrane, osmotic shock.
  • the CSN units are heated by manual friction for less than 10 min.
  • the CSN units are placed in a liquid or dry water bath, set at a temperature between 30 and 40 ° C for less than 10 min, in particular at 37 ° C for 3 to 5 min.
  • the CSN units are placed in an automatic thawing apparatus.
  • the CSN units are thawed at room temperature for less than 10 min if the cryoprotector used allows it.
  • the thawed cells can be amplified. After thawing, the cells are then resuspended in washing medium (DPBS, DMEM or DMEM + SVF) or in cell amplification medium. In a particular embodiment, the volume of suspension is gradually adjusted in order to limit the osmotic shocks that the cells can undergo. The cells are then returned to culture in order to carry out a new amplification phase.
  • washing medium DPBS, DMEM or DMEM + SVF
  • cell amplification medium In a particular embodiment, the volume of suspension is gradually adjusted in order to limit the osmotic shocks that the cells can undergo.
  • the feline CSNs can undergo an exogenous stimulation / modification step during the amplification phase by means of physical, biological and / or chemical effectors.
  • exogenous stimulation also called “priming”
  • treatment with cytokines in concentrations between 1 and 500 ng / ml of IFN-g, IL-Ib, 11-6 and / or TNF-a makes it possible to significantly increase expression molecules with immunomodulatory activity.
  • mechanical stimulation and / or the induction of a chondrogenic predifferentiation can make it possible to favor the tissue reconstruction properties in vitro.
  • At least one step of verifying the biological properties of the isolated feline CSNs is carried out.
  • the presence of the markers CD29 and CD44 and the absence of the markers CD8, CMH-I and CMH-II are verified.
  • the cell proliferation capacity comprised of at least 20 consecutive cell doublings, as described above, is verified.
  • the capacity for chondrogenic differentiation of the feline CSNs is verified.
  • FIG. IA shows the analysis of feline CSNs by flow cytometry according to the FSC-A / FSC-H parameters allowing the selection of single cells.
  • An analysis according to the FSC-A / SSC-A parameters subsequently makes it possible to select the population of CSNs of interest.
  • Figs. IB, IC, 1D, 1E, 1F represent the evaluation of the expression of the marker of interest by the population of feline CSNs by fluorescence analysis for the corresponding fluorochrome.
  • the graph represents the results of the surface markers (in light gray, the specific marker of interest; in dark gray the corresponding isotype).
  • the positivity threshold is placed using cells marked with the corresponding isotype.
  • the table indicates the number of events analyzed as well as the median fluorescence of the CSN population.
  • FIG. IB shows the positivity of the expression of the surface marker CD44.
  • FIG. IC shows the positivity of the expression of the CD8 surface marker.
  • FIG. 1D shows the positivity of the expression of the CMH-II surface marker.
  • FIG. 1E shows the positivity of the expression of the surface marker CD29.
  • FIG. IG shows the analysis of PBMC by flow cytometry according to the FSC-A / FSC-H parameters allowing the selection of single cells.
  • An analysis according to the FSC-A / SSC-A parameters subsequently makes it possible to select lymphocytes.
  • FIGS. 1H and II represent the evaluation of the expression of the marker of interest by the lymphocytes, by analysis of the fluorescence for the corresponding fluorochrome.
  • the graph represents the results of the surface markers (in light gray, the specific marker of interest; in dark gray the corresponding isotype).
  • the positivity threshold is placed using cells marked with the corresponding isotype.
  • the table indicates the number of events analyzed as well as the median fluorescence of lymphocytes.
  • FIG. 1H shows the validation of the specificity of the CMH-II marker on cat lymphocytes.
  • FIG. II shows the validation of the specificity of the CMH-I marker on cat lymphocytes.
  • FIG. 2 shows the proliferative activity illustrated by the accumulation of the number of cell doublings during the passages
  • FIG. 3 shows a representative photograph of the MSCs cultivated for 2 weeks in osteogenic differentiation medium and marked with red alizarin. The presence of calcium deposits is highlighted by the red coloring;
  • FIG. 4 shows a monitoring sheet completed by the owners of the animals included in the study
  • FIG. 5 shows a photo of the mouth of a cat having undergone dental avulsion and treated by Feline CSNs. This photo shows the reduction in visible oral lesions before (photo on the left) and after treatment (photo on the right);
  • FIG. 6 shows the evolution of the SD AI score of cats having undergone dental avulsion and treated with feline CSNs over time (days after infusion). The median is represented by a horizontal line in the center of the boxplot;
  • FIG. 7 shows the evolution of the SD AI score over time presented for each cat included and followed, having undergone dental avulsion and treated by the feline CSNs;
  • FIG. 8 shows the clinical recovery rate calculated at each follow-up visit (D60, D90, DI 80) for the 7 cats having undergone dental avulsion and treated by the feline CSNs of the study;
  • FIG. 9 shows the proprietary score (/ 12) evaluated over time (injection D0, 15 days, 2 months, 3 months and 6 months) for each cat having undergone dental avulsion and treated with feline CSN.
  • FIG. 10 shows a photo of the mouth of a cat with partial dental avulsion treated with Feline CSNs. This photo shows the reduction in visible oral lesions 15 days after treatment (photo on the left) and 1 month after treatment (photo on the right);
  • FIG. 11 shows the evolution of the SD AI score of cats having undergone partial dental avulsion and treated with feline CSNs over time (days after infusion).
  • Fig. 12 shows the evolution of the SD AI score of cats having undergone partial dental avulsion and treated with feline CSNs over time (days after infusion).
  • FIG. 12 shows the clinical recovery rate calculated at each follow-up visit (D60, D90, DI 80) for the 2 cats having undergone partial dental avulsion and treated by the feline CSNs of the study;
  • FIG. 13 shows the proprietary score (/ 12) evaluated over time (day of the infusion, 15 days, 2 months, 3 months and 6 months) for each cat having undergone partial dental avulsion and treated with Feline CSNs.
  • Example 1 Obtaining and characterizing feline neonatal stromal cells (CSN)
  • the extra feline embryonic appendages (placenta, umbilical cord) are removed aseptically during a suitable ovario-hysterectomy performed on cats during pregnancy.
  • a suitable ovario-hysterectomy performed on cats during pregnancy.
  • the uterus more or less the clamped ovarian ducts are placed in a transport box containing a buffered saline solution such as Dulbecco phosphate (D-PBS) to be sent to the temperature-controlled laboratory (4-12 ° C).
  • D-PBS Dulbecco phosphate
  • the processing of the extra embryonic tissue is carried out at most within 72 hours of the sample. All of the tissue processing steps are carried out in a controlled environment, under a microbiological safety station (PSM).
  • PSM microbiological safety station
  • the tissue is aseptically removed from its transport box and transferred to a 100 cm 2 petri dish.
  • the amniotic sac containing the fetus is removed by dissection.
  • the red placenta is transferred to a sterile beaker.
  • the fabric is washed 3 to 5 times in successive D-PBS baths.
  • the placental tissue is dissected into fragments of approximately 10-20 mm 2 then subjected to an enzymatic digestion by incubating the tissue fragments in a solution composed of DMEM (modified Eagle medium from Dulbecco) containing 0.5-4 mg / ml of type I collagenase, and more specifically a concentration of 1 mg / ml of type I collagenase.
  • DMEM modified Eagle medium from Dulbecco
  • the enzymatic digestion takes place at 37 ° C for 45 min but digestion between 15 min and 16 h can be carried out by reducing the incubation temperature (room temperature (18-22 ° C or 4 ° C).
  • the enzymatic activity is stopped by dilution, by adding DMEM containing at least 10% of fetal calf serum (SVF) in an amount equivalent to the enzymatic digestion solution. filtered on a 70-100 ⁇ m sieve. The recovered cells are centrifuged at 800 g for 10 min. The cell pellet containing the neonatal stromal cells is rinsed with DMEM and again centrifuged at 800 g for 10 min. culture medium con containing DMEM, 10% FCS, 2 mM glutamine and 0 to 20 ng / ml of fibroblast growth factor (FGF).
  • FGF fibroblast growth factor
  • the cells are counted and seeded in culture dishes at a density of between 10 4 and 2.10 4 cells / cm 2 .
  • the cells are then cultured in the culture medium described above in a controlled atmosphere at 37 ° C. and containing 5% of CO2.
  • the medium is changed after 48 hours and then every 2-3 days.
  • the cells are passed when the confluence reaches 70-80%.
  • Culture medium consisting of DMEM, 10% FCS, 2 mM glutamine and 0 to 20 ng / ml of fibroblast growth factor (FGF) is added to the amniotic fluid at a minimum level of 50% of the volume sampled.
  • the suspension can be rinsed with DPBS and centrifuged to centrifuged at 800 g for 10 min.
  • the volume of liquid or cells re suspended in an equivalent volume in the culture medium is placed directly in the culture dish at a height of 100 to 300 m 300 per cm 2 .
  • the culture dishes are then cultivated in the culture medium described above in a controlled atmosphere at 37 ° C. and containing 5% of CO2. The medium is changed after 48 hours and then every 2-3 days. After 1-2 weeks of cultures, the feline CSN colonies are passed to allow cell amplification.
  • the cells undergo cell passage and optionally, an amplification procedure.
  • the feline CSNs are rinsed with D-PBS and treated with 0.05% trypsin-EDTA for 2-5 min at 37 ° C. This helps detach the cells and form a population of isolated cells.
  • the cells are then taken up with amplification medium consisting of DMEM, 10% of S VF, 2 mM glutamine and from 0 to 20 ng / ml of fibroblast growth factor (FGF) and centrifuged between 300-500 g for 5 to 10 minutes.
  • the feline CSNs are taken up in amplification medium, and counted by manual counting (tryan blue and Malassez cells) or using an electronic counter.
  • cells are then seeded at a height of 1500 to 5000 cells / cm 2 and cultivated on a plastic cell culture support in amplification medium and in a controlled atmosphere at 37 ° C. and containing 5% of CO2. During the amplification process, cells can undergo between 0 and 15 cell passages.
  • the cells can be cryopreserved in cellular seed units.
  • the feline CSNs are centrifuged between 300-500 g for 5 to 10 min and the cell pellet is taken up in freezing medium composed either of DMEM medium enriched with 5-20% of SVF and 5-10 % (vol: vol) of DMSO or in a commercial cryopreservation medium, whether or not containing a fraction of DMSO.
  • the cell concentration is between 1.10 6 and 15.10 6 cells per ml of freezing medium.
  • the cells are frozen under conditions of controlled temperature reduction, for example using a CoolCell® Cell Freezing Containers (BioCision) and following the freezing procedure as described by the manufacturer. Cells are then transferred for negative cold storage at temperatures such as -196 ° C for long-term storage (more than 1 year).
  • the cell seed units are used to generate cell units for therapeutic purposes.
  • the cellular seed units are thawed at 37 ° C for 3-6 min and amplified in vitro.
  • the cells are seeded in culture medium at a density of 1500-3000 cells / cm 2 .
  • the cells are amplified by successive passage in vitro. When a significant number of cells is produced (for example> 150 ⁇ 10 6 cells), the cells are frozen according to the protocol described above.
  • the cells are distributed in hermetically sealed sealable bottles at a rate of 1.10 6 -1.5.10 7 cells / ml in freezing medium free of product of animal origin (such as, for example, the cryopreservation medium Recovery TM Cell culture freezing medium (Thermo Fisher), Cryostem TM freezing medium (Biological Industries), Cryostor TM (Biolife Solution).
  • the vials are lowered in temperature according to a controlled temperature lowering protocol, at -l ° C / min to -80 ° C
  • the bottles are then transferred to -80 ° C for storage for a maximum of 24 months.
  • tests are carried out on aliquots of cells during amplification or after freezing / thawing of a seeding unit or of a therapeutic unit.
  • feline CSN surface markers is carried out by flow cytometry using the following anti-feline antibodies: CD8 (vpg9; Biorad), CMH2 (vpg3; Biorad); and antibodies specific to other species and crossing with cats: CD44 (IM7; Biolegend); CD29 (TS2 / 16; Biolegend).
  • CD8 vpg9; Biorad
  • CMH2 vpg3; Biorad
  • CD44 IM7; Biolegend
  • CD29 TS2 / 16; Biolegend
  • a secondary mouse anti-immunoglobulin (IgG) antibody coupled to allophycocyanin (APC) is used in a second step.
  • Isotypic controls are used to adjust the background noise for each fluorochrome used: anti-mouse IgG2a (COL2002 / CQLI205C; Monoclonal Antibody Center); anti-mouse IgG1 coupled to PE (MOPC-21; Biolegend); anti-rat IgG2b coupled to APC (IM7, Biolegend).
  • the feline CSNs in culture are detached from their plastic support by trypsination and are rinsed with D-PBS. The cells are divided into tubes at the rate of 10 5 -5.10 5 cells / tube.
  • the cells are centrifuged (500 g / 5 min) and taken up in 25-100 m ⁇ of labeling buffer (D-PBS and of 0.5-1% (v / v) of bovine serum albumin (BSA) or of 0.5-2% (v / v) fetal calf serum).
  • labeling buffer D-PBS and of 0.5-1% (v / v) of bovine serum albumin (BSA) or of 0.5-2% (v / v) fetal calf serum.
  • BSA bovine serum albumin
  • the optimal concentration of antibody used for labeling must be determined beforehand by a person skilled in the art.
  • the incubation required for labeling must also be determined by a person skilled in the art and between 15 min and 10 h at 4 ° C. protected from light. In particular, the cells are incubated for 30 min at 4 ° C. protected from light.
  • Labeling with a secondary antibody targeting the primary antibody can be carried out, after washing with D-PBS, in the case where the primary antibody is not directly coupled to a fluorochrome.
  • the cells are washed twice in 1 ml of D-PBS and centrifuged (500 g / 5 min). The cell pellets are taken up in a volume of 100-500 m 3 of labeling buffer for reading with a flow cytometer (Accuri C6, BD Biosciences).
  • FIGS. IA to III show a representative example of the results of cytometric analysis of the feline CSNs.
  • the proliferation of feline CSNs is evaluated for 6 to 15 consecutive cell passages to determine the proliferative activity of the cells.
  • the cells are detached from their culture support using 0.5% trypsin / EDTA for 2-3 min.
  • Culture medium is added and the cells are centrifuged for 5 min / 300 g.
  • the cell pellet is taken up in a defined volume of culture medium and the cells are counted by trypan blue exclusion technique using an electronic counter.
  • the total number of cell doublings is equal to the sum of the number of doublings accumulated during each cell passage.
  • FIG. 2 illustrates the number of doublings cumulated on 8 cell passages of a line of feline CSN.
  • feline CSNs are capable of 30 consecutive doublings in the space of 7 weeks (at the rate of one passage per week).
  • the feline CSNs are detached from their plastic support by trypsination and counted.
  • the feline CSNs are seeded at a density of between 1500 and 5000 cells / cm 2 in a 6-well plate in amplification medium under a controlled atmosphere at 37 ° C. and containing 5% CO 2.
  • the proliferation medium is removed and replaced by osteogenic differentiation medium composed of DMEM, 10% of SVF, 2 mM glutamine, 0.1 mM dexamethasone (Sigma), 50 mM acid. ascorbic 2-phosphate (Sigma) and 10 mM b-glycerophosphate (Sigma).
  • the medium is renewed 2 times / week, for a period between 10 and 15 days.
  • the wells are washed with D-PBS and the cells are fixed with, for example, a neutral buffered formalin solution 10% for at least 1 hour. Staining with a 1% Alizarin red solution (weight / volume) is carried out to demonstrate the presence of calcium deposits.
  • the wells are then rinsed in H 2 0 and the coloration is analyzed under a microscope. The presence of calcium deposits allows us to conclude that we can differentiate our in the osteogenic lineage.
  • FIG. 3 represents an example of feline CSN cultured for 14 days in osteogenic differentiation medium and stained with G red alizarin.
  • Example 2 Evaluation of the clinical effect of a single injection of cryopreserved feline CSNs for the management of feline GSC refractory to conventional treatments and having undergone total dental avulsion or partial dental avulsion. [0191] A. Study program
  • Inclusion criteria 1- Present specific inflammatory lesions of GSC (confirmed by a specialist in dentistry); 2- Having tried other ciclosporin-type treatments, NSAIDs, antibiotics, omega IFN without success; 3- Show persistence of clinical signs after 2 months of treatment; 4- Dental extraction (partial or total) required and dating back more than 3 months; 5- Stop IFN or corticosteroid treatments
  • Non-inclusion criteria 1 - Informed consent not signed by the owner; 2- Gestation, progressive tumor process, systemic infectious process, intercurrent disease which may interfere with the evaluation of treatment; 3- Extreme physical impairment involving the life of the animal; 4- Administration of unauthorized treatment during the study period (IFN or corticosteroid therapy)
  • Criteria for leaving the study 1 - Resumption of treatment including ciclosporin, IFN, corticoids, lactoferrin during the study period; 2-Deterioration of the general condition during the test leading to an extreme weakening involving the life of the animal; 3- Appearance of other intercurrent affections which can interfere with the follow-up of the evolution: evolutionary tumor process, systemic infectious process
  • the animals included in the study are evaluated by a veterinarian who ranks the degree of severity of the pathology using the "stomatitis Disease Activity Index" (SD AI). This score gives a score of 0 (healthy animals) to 24 (severe GSC). Pictures of the cat's mouth are taken on D0 and at the end of the study (6 months (M)) to check the evolution of the lesions.
  • SD AI stomatitis Disease Activity Index
  • M median health of the cat's mouth
  • M 6 months
  • the owners of the animals included in the study receive a questionnaire to complete to assess the activity, appetite, behavior and comfort of their animal.
  • the animals receive cell treatment on the day of inclusion.
  • the follow-up of the animals is planned at 15 days, 2 months, 3 months and 6 months post-inclusion.
  • animals are allowed to continue their nonsteroidal anti-inflammatory therapy (NSAIDs) at provided that the dose is specified in the study documents. Monitoring the doses and the frequency of administration of treatments during the study is an analysis criterion.
  • Table 1 summarizes the schedule of the study and the different analyzes performed at each follow-up.
  • the clinical evaluation is carried out by a veterinarian specialized in dentistry, holder of the specialist diploma of the European College (European Veterinary Dental College (EVDC)).
  • EVDC European College
  • Follow-ups are scheduled at 2 weeks, 2 months, 3 months and 6 months post-treatment.
  • the veterinarian fills out a clinical follow-up sheet including the evaluation criteria detailed below, the weight, the treatments in progress.
  • the main criterion for evaluating effectiveness is the improvement of clinical signs. This assessment is based on the GSC activity index (SDAI) taking into account different parameters:
  • the owners are also asked to carry out an evaluation of their cat on the criteria of activity, appetite, behavior and comfort. Each parameter is scored from 0 to 3, resulting in a score of 12.
  • FIG. 4 represents the monitoring sheet completed by the owners of the animals included in the study.
  • a dose of feline CSN cryopreserved at -196 ° C. is thawed at 37 ° C. for 3-5 minutes in the laboratory the day before the administration of the treatment under conditions guaranteeing the asepsis of the product.
  • An aliquot of the cell product is taken to verify the viability and the quantity of cells by the trypan blue exclusion technique.
  • the specifications of the post-thaw product are as follows: viability greater than 80%, and total number of viable cells of at least 10 7 . The precise number of viable cells counted is presented in Table 2.
  • Table 2 illustrates the results of the thaw cell viability tests.
  • the cells conforming to the specifications are transferred to a sterile sealable bottle.
  • the product packaged in its bottle is transferred to a temperature-controlled transport box (4-12 ° C).
  • the treatment is sent to the veterinary clinic for administration to the patient on D + 1 or D + 2.
  • the animal can be sedated to control the smooth running of the infusion.
  • the veterinarian chooses the most suitable site to fix the venous route to the animal.
  • An infusion bag (Ringer lactate) is used in combination with heparin. The bag is then homogenized by inversion then the veterinarian connects the infuser to the solution bag.
  • the cellular product (between 1.0 ⁇ 10 7 and 1.4 ⁇ 10 7 viable cells for an average of 1.2 ⁇ 10 7 ) is removed from its packaging 15 min before the injection.
  • the veterinarian homogenizes the cell suspension inside the bottle by rotation.
  • a syringe of suitable volume with an 18 G-20 G (70 mm) needle is prepared to aspirate the cell suspension inside the vial.
  • the syringe is then connected to the injection site at the bottom of the tubing.
  • the veterinarian slowly pushes the plunger to expel approximately 0.2-0.5 ml of the suspension every 5 min.
  • the entire feline CSN is administered in approximately 20-30 min.
  • the animals are awakened and kept in the clinic for at least 4 hours to check their physiological parameters. Data analysis
  • the main evaluation criterion is the SD AI clinical score defined by the veterinarian during each follow-up.
  • the significance of the variability of the SD AI over time is compared with the score on inclusion in the study (OJ) using a non-parametric Friedman test.
  • Table 3 details the characteristics of the animals included in the study with complete or partial dental avulsion.
  • Table 4 summarizes the treatments administered by the owners of the cats during the 6 months of follow-up. [0223] [Table 4]
  • FIG. 6 illustrates the evolution of the SD AI score over time.
  • a non-significant decrease in SD AI was observed 15 days post-treatment (median score on D15: 9.5 [4; 14] vs median score on D0: 11 [9; 13]).
  • FIG. 7 illustrates the evolution of SDAI per cat during the study. Complete resolution of clinical signs 2 months post administration in a cat (# 4 is observed. In this cat, a slight oropharyngeal inflammation is observed which reappears at 3 and 6 months (score 2/24). At follow-up at 3 months, a slight degradation in a cat (# 3, score goes from 5 to 9) is observed then the score decreases again to reach 7 to 6 months An improvement in the state of the other cats is also observed.
  • FIG. 8 represents the clinical recovery rate of each animal having undergone total avulsion at the different follow-up times.
  • the recovery rate corresponds to the difference (in percentage) between the SD AI score evaluated at a follow-up time (2 months, 3 months, 6 months) and the SD AI score on the inclusion of the same animal, divided by SD AI score at inclusion.
  • This report takes into account the improvement that has occurred, if it takes place.
  • One cat (# 4) shows complete recovery (clinical remission) at follow-up at 2 months.
  • the owner evaluation is based on 4 main criteria: appetite, activity, comfort and behavior. Each criterion is noted on / 3, and therefore makes it possible to obtain a score / 12. The more the score decreases the more the behavior of the cat improves.
  • Figure 10 shows a reduction in oral lesions at 1 month following the injection.
  • FIG. 11 showing the evolution of the SD AI for the two cats having undergone a partial dental avulsion, shows an almost complete resolution of the clinical signs at 6 months post administration with a score of 3. While the cat # 1 showed rapid clinical improvement after two weeks, cat # 2 showed an increase in symptoms at 2 months which then diminished sharply.
  • FIG. 12 represents the clinical recovery rate of each animal having undergone a partial avulsion at the different follow-up times. For the two cats, an improvement in the recovery rate is observable from 90 days.
  • FIG. 13 shows the evolution of the owner score for the two cats with partial dental avulsion. Again, cat # 2 showed a transient decrease in symptoms to be considered healthy at 6 months after injection. Cat # 1's health improved quickly after two weeks to reach a home score of 2 to 6 months.
  • Feline Foamy Virus Adversely Affects Feline Mesenchymal Stem Cell Culture and Expansion: Implications for Animal Model Development. Stem Cells Dev. 24, 814-823.

Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN) félines et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, en particulier une solution comprenant un cryoprotecteur. L'invention porte également sur une population de CSN ou une composition pharmaceutique comprenant une telle population pour une utilisation en thérapie cellulaire, en particulier en thérapie cellulaire allogénique, et plus particulièrement pour le traitement de stomatites félines. L'invention concerne également une solution injectable prête à l'emploi comprenant des CSN félines.

Description

Cellules stromales néonatales félines et leurs utilisations
Domaine technique
[0001] L’invention concerne une population de cellules stromales néonatales félines, une composition pharmaceutique et une solution injectable comprenant lesdites cellules, ainsi qu’un procédé d’obtention de cette composition à partir de tissus néonataux. L’invention concerne également l’utilisation de ces cellules et compositions en thérapie cellulaire chez le félin, en particulier pour le traitement de stomatites.
Technique antérieure [0002] Les affections bucco-dentaires sont courantes chez le chat et sont associées en général avec une halitose, une dysphagie et une dysorexie qui peuvent entraîner une déshydratation et un amaigrissement de l’animal. En outre, il existe des manifestations inflammatoires (ulcératives, ulcéroprolifératives) de la muqueuse buccale, particulièrement en région caudale, évoluant vers la chronicité et résistantes aux traitements conventionnels. Ces phénomènes sont communément désignés gingivostomatite chronique (GSC) féline, ou encore stomatite chronique, stomatite lympho-plasmocytaire ou stomatite granulomateuse. La prévalence de la GSC est de l’ordre de 0,7 à 12% de la population féline selon les études (7 ; 2). La GSC se traduit par plusieurs symptômes comme des ulcères buccaux, des lésions inflammatoires, une hyper salivation, une perte de poids de l’animal ou des saignements. Cette maladie débilitante est responsable de douleurs, d’arrêt d’alimentation, de complications infectieuses et est la première cause d’avulsion dentaire chez le chat. Cette opération est lourde et coûteuse et nécessite un complément thérapeutique dans 69% des cas. Par ailleurs, parmi les sujets ayant subi cette avulsion, 32,6% des chats restent réfractaires au traitement (3) (Jennings et al., 2015). L’étiologie de la GSC est encore mal connue mais elle semble multifactorielle et sous-tend principalement une composante dysimmunitaire locale ( 4 ). La forte présence de cellules T au niveau des sites lésionnels suggère une exacerbation de la réaction immunitaire de l’hôte vis-à-vis des muqueuses. Les traitements comme l’utilisation d’antibiotiques, de corticoïdes, d’interféron, d’ anti-inflammatoire ou d’ anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), ne montrent pas une efficacité reproductible sur la GSC et en font une maladie dont l’évolution n’est pas maîtrisable. Les cellules stromales représentent une alternative prometteuse dans ce contexte pathologique. Ces dernières possèdent une capacité d’immunomodulation et sont capables de réguler l’activité immunitaire locale et/ou systémique en limitant la prolifération et la différenciation des cellules responsables de l’inflammation (lymphocytes T, B, polynucléaires, monocytes, cellules dendritiques) (5). Dans le cadre de la GSC, des cellules stromales félines ont déjà été utilisées par l’homme de l’art en tant que thérapie cellulaire (6 ; WO2017/062475A1 ). Dans ces documents, un traitement consistant en une double administration de 20.106 cellules stromales félines issues de tissu adipeux à un mois d’intervalle a montré une efficacité de l’ordre de 70% dans le cadre de thérapies autologues et de l’ordre de 57% dans le cadre de thérapies allogéniques (7 ; US20160199414A1 ) et ce sur des sujets pathologiques ne répondant pas aux thérapies conventionnelles. Les cellules utilisées dans ces documents sont des cellules fraîches c’est-à-dire n’ayant pas subi d’étape de cryoconservation ou qui sont remises en culture après cryoconservation dans le cas de la seconde injection au sujet. Par ailleurs, dans ces documents, la collecte des cellules stromales félines nécessite le prélèvement de tissu adipeux chez un individu et donc une intervention chirurgicale est nécessaire limitant le caractère industrialisable d’une thérapie exploitant les propriétés de ces cellules. Lors de l’observation de symptômes de GSC féline, très souvent l’ensemble des dents de l’animal sont extraites. Dans certains cas, une avulsion dentaire partielle peut être effectuée. Par exemple, lorsque les lésions buccales ne sont pas généralisées, les canines peuvent être préservées. De même, lorsque l’inflammation est localisée, il est possible que l’extraction dentaire ne concerne que les dents touchées par les lésions.
[0003] A l’heure actuelle, le traitement de GSC féline par administration de cellules stromales félines est systématiquement précédé d’une avulsion dentaire totale.
Objectifs
[0004] L’invention a pour objectif de fournir un produit pour le traitement des stomatites félines, facile d’emploi, disponible à tout moment et qui soit industrialisable.
[0005] L’invention a également pour objectif de fournir une population de cellules destinée à la thérapie cellulaire, en particulier pour des applications thérapeutiques allogéniques, et plus particulièrement pour le traitement des atteintes tissulaires des muqueuses chez le félin telles que les stomatites félines. [0006] Un autre objectif de l’invention est de fournir une population de cellules possédant une bonne capacité de prolifération pour pouvoir être produite à échelle industrielle et qui conserve toutes ses propriétés biologiques suite à une étape de cryoconservation.
[0007] Un autre objectif est de fournir un procédé d’obtention d’une composition pharmaceutique prête à l’emploi, comprenant ladite population cellulaire.
[0008] Un autre objectif est de fournir une composition pharmaceutique comprenant ladite population cellulaire.
[0009] Un autre objectif de l’invention est de développer une solution injectable prête à l’emploi qui est directement utilisable pour une application thérapeutique, sans besoin de remettre les cellules en culture ou de changer le milieu cellulaire avant injection chez le sujet.
[0010] Les Inventeurs ont découvert de manière surprenante que les cellules stromales néonatales félines permettaient de traiter des inflammations buccales des muqueuses chez le félin de manière efficace et durable, dans un contexte allogénique, notamment par l’injection d’une dose unique au sujet à traiter.
[0011] De plus, ils ont découvert que ce traitement était efficace chez des sujets ayant subi ou pas une avulsion dentaire totale, ou ayant subi une avulsion dentaire partielle.
[0012] En effet, cette population cellulaire est capable d’exercer une action anti- inflammatoire localisée et/ou globale permettant de diminuer substantiellement les lésions buccales. Cette activité anti-inflammatoire est liée, entre autres, aux propriétés immunomodulatrices des cellules stromales néonatales félines. Ces propriétés peuvent se définir comme la capacité des cellules stromales néonatales félines à inhiber la différenciation, la prolifération et/ou l’activité des cellules immunitaires à l’origine du contexte inflammatoire d’un tissu ou lorsque ces cellules immunitaires sont cultivées in vitro.
[0013] Ces cellules possèdent également un fort potentiel de prolifération permettant ainsi leur multiplication in vitro à l’échelle industrielle. De plus, le prélèvement de ce type cellulaire, ne nécessite pas obligatoirement d’étape invasive. Exposé de l’invention
[0014] Population cellulaire
[0015] Un premier objet de la présente divulgation porte sur une population de cellules stromales néonatales (CSN) félines. Au sens de la présente invention, on entend par « félin », tout animal de la famille des Félidés, en particulièrement tout animal du genre
Felis , et plus particulièrement le chat, Felis silvestris catus.
[0016] Dans un mode de réalisation préférentiel, le félin selon l’invention est un chat.
[0017] Origine des CSN félines
[0018] Par « cellules stromales néonatales » on entend toutes cellules possédant une, plusieurs ou toutes les caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses et ayant une origine néonatale. Le terme « néonatal » signifie que les CSN félines peuvent être isolées de l’ensemble des sources tissulaires et/ou liquides biologiques, issus des annexes extra-embryonnaires et pouvant être récupérées lors de la phase de parturition/césarienne ou durant la période de gestation.
[0019] Dans un mode de réalisation particulier, ces sources tissulaires néonatales, issues des annexes extra-embryonnaires également appelées annexes foetales, correspondent au cordon ombilical et plus particulièrement à la matrice du cordon ombilical comme la gelée de Wharton, la zone périvasculaire des artères et/ou de la veine ombilicale. Dans un autre mode de réalisation particulier, les tissus néonataux correspondent à la membrane amniotique ou plus particulièrement à l’épithélium de la membrane amniotique et/ou de l’amnion. Dans un autre mode de réalisation particulier, les tissus néonataux correspondent au placenta qui est de type endothéliochorial ou plus particulièrement au mésoderme chorionique/plaque chorionique, au trophoblaste chorionique/trophoblaste, au villi chorionique, aux cotylédons placentaires, à la décidua placentaire et/ou au système périvasculaire du placenta.
[0020] Ces tissus néonataux sont considérés comme des déchets opératoires lors des naissances et, de ce fait, n’impliquent pas d’intervention chirurgicale additionnelle pour leur récupération.
[0021] Ainsi, ils peuvent être récupérés de manière aseptique lors de césariennes ou de façon post-partum lors d’une mise bas par voie naturelle chez des femelles gestantes. Par exemple, dès que le nouveau-né est sorti du sac amniotique et mis en sécurité, le tissu extra embryonnaire est immédiatement transféré dans une boite de transport contenant par exemple une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco pour être acheminé en laboratoire.
[0022] Dans un mode de réalisation alternatif, les tissus d’annexes extra embryonnaires peuvent être récupérés durant toute la période de gestation de la chatte (en moyenne d’une durée de 64-69 jours) dans le cadre d’une ovario-hysterectomie de convenance qui est une opération de routine à visée abortive et stérilisante.
[0023] Par « liquides biologiques », on entend des fluides d’annexes extra embryonnaires tels que le sang de cordon ombilical ou le liquide amniotique et/ou le sang placentaire. Le sang de cordon ombilical peut être récupéré en ponctionnant le cordon ombilical. Le liquide amniotique, quant-à-lui, peut être récupéré en ponctionnant le liquide contenu dans le sac amniotique ou en perçant le sac amniotique et en déversant le liquide amniotique qu’il contient dans un tube, une boite de pétri ou tout autre contenant adapté.
[0024] Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, ladite population de CSN félines est issue d’un échantillon tissulaire néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux ; ou d’un échantillon de fluide néonatal, en particulier de sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux ou de liquides amniotiques.
[0025] Les CSN félines issues de ces tissus et fluides présentent l’avantage de n’avoir été que faiblement exposées aux stress exogènes pouvant induire des modifications épigénétiques. Dans un mode de réalisation particulier, les CSN félines sont des CSN félines placentaires.
[0026] Dans un mode de réalisation particulier, les CSN de placentas proviennent de placentas récupérés durant la période de gestation. Dans un autre mode de réalisation, les CSN de placentas proviennent placentas récupérés au terme de la gestation.
[0027] Caractéristiques des CSN félines
[0028] Dans un mode de réalisation particulier, les CSN félines sont caractérisées par la présence à leur surface des marqueurs CD44 et CD29. [0029] Dans un mode de réalisation particulier, les CSN félines sont caractérisées par l'absence à leur surface des marqueurs CD8, CMH-I et CMH-II.
[0030] L’analyse de ces marqueurs peut être faite par analyse protéique et/ou transcriptionnelle.
[0031] Au niveau transcriptionnel, l’expression des marqueurs CD44, CD29, CD8, CMH-I et/ou CMH-II peut être respectivement analysée par mesure de l’expression des gènes Cd44, Itgbl , C5arl et/ou la famille de gènes de type « human leukocyte antigen gene complexe » (HLA) HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, and HLA-DR ou les gènes homologues félins correspondants de type « félin leukocyte antigen gene complexe » (FLA). L’analyse de l’expression des différents gènes peut être effectuée par des techniques de PCR en temps final, RTqPCR, PCR digitales et/ou RNA microarray.
[0032] Au niveau protéique, l’expression de ces marqueurs peut être étudiée par l’utilisation d’anticorps ou fragments d’anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) spécifiquement dirigés contre un ou plusieurs épitopes des protéines CD44, CD29, CD8, CMH-I et/ou CMH-II. Les techniques associées à ces anticorps comprennent entre autres, l’analyse cytométrique, les Western-blots, le test ELISA, l’immunofluorescence et/ou l’immunohistochimie. Alternativement des protéines marqueurs de type ligands ou inhibiteurs, peuvent être utilisées comme outils d’analyse. D’autres technologies utilisant des oligonucléotides marqués par une sonde peuvent servir à évaluer cette expression tels que l’utilisation d’aptamères, sondes ARN et/ou sondes ADN.
[0033] Outre leurs caractéristiques phénotypiques, les CSN félines peuvent être caractérisées par leurs caractéristiques biologiques.
[0034] Dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN félines est caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population possèdent une capacité de doublements cellulaires consécutifs supérieure à 20 doublements cumulés.
[0035] Par « capacité de doublement cellulaire », on entend qu’une population de CSN félines est capable de doubler en nombre, plus de 20 fois au total. En particulier, les CSN félines possèdent une capacité de doublements cellulaires consécutifs comprise entre 20 et 50 doublements cumulés, en particulier de 20 à 40, plus particulièrement de 20 à 30. Cette capacité importante de prolifération, permet une amplification cellulaire de type scale up/scale out et rend industrialisable un procédé de fabrication utilisant cette population cellulaire. La capacité importante de prolifération signifie également que la population de CSN félines permet une amplification sur plusieurs passages allant de 1 à plus de 15 passages.
[0036] Pour évaluer le nombre de doublements, à chaque passage cellulaire, les cellules sont détachées de leur support, centrifugées puis comptabilisées, par exemple par la technique d’exclusion au bleu trypan à l’aide d’un compteur électronique. Le nombre de doublement à chaque passage cellulaire est calculé selon la formule suivante : Nb de doublements = LOG (Nf/Ni)/LOG(2) (Nf : nombre de cellules finales et Ni : nombre de cellules initiales). Le nombre total de doublements cellulaires est égal à la somme du nombre de doublements cumulés à chaque passage cellulaire.
[0037] Par ailleurs les cellules souches/stromales mésenchymateuses issues de tissus félins adulte peuvent présenter des limites au caractère industrialisable de l’invention à cause d’une possible infection par un virus de type Foamy virus dont la prévalence de 20 à 80% des chats, comme il l’a pu être démontré pour les cellules souches mésenchymateuses issues de tissu adipeux ( 8 ; 9 ; 10). Ce dernier limite la prolifération des cellules par l’induction d’une mort cellulaire prématurée au cours de la phase de prolifération cellulaire. Le fait d’utiliser des cellules d’origine néonatale permet de limiter l’utilisation de cellules infectées par ce virus et ainsi de conférer un avantage pour l’industrialisation de la culture cellulaire. Il a été montré que la barrière fœto-maternelle permettait une diminution de la transmission de certains pathogènes de la mère au fœtus (77).
[0038] Dans un mode particulier de réalisation, les CSN félines présentent une capacité d’adhésion au plastique. Par « capacité d’adhésion sur support plastique », on entend que la population de CSN est caractérisée par sa propriété d’adhérence sur support plastique.
[0039] Dans un mode particulier de réalisation, les CSN félines présentent une morphologie de type fibroblastique. Par « morphologie de type fibroblastique », on entend des cellules mononuclées présentant une morphologie fusiforme ; c’est-à-dire des cellules étirées en longueur en culture sur support plastique et dont les extrémités présentent des prolongements cytoplasmiques. Cette morphologie témoigne d’une capacité ces cellules à s’étaler afin d’assurer une adhésion de type focal sur support et une polarisation cellulaire. Cet aspect peut être évalué par étude du diamètre de Feret maximal et minimal des cellules, de la surface occupée par les cellules sur support 2D et du ratio d’aspect correspondant (Feret minimal / Feret maximal).
[0040] Dans un mode particulier de réalisation, les CSN félines présentent un potentiel immunomodulateur. Par « potentiel immunomodulateur », on entend que dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN félines est caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN félines présentent un potentiel immunomodulateur.
[0041] Cette propriété d’immunomodulation peut se caractériser par la capacité qu’ont les CSN félines à exprimer un ensemble de facteurs immunomodulateurs tels que PGE2, IL-6, IL- 10, TGF-b, IDO, iNOS, HGF, KGF, CCL2 et/ou TSG-6. En effet, en présence d’un contexte inflammatoire, les CSN félines peuvent modifier leur phénotype. Le contexte inflammatoire peut être mimé in vitro par stimulation des cellules par le biais de cytokines et/ou facteurs de croissance tels que l’IFN-g, IL-1, IL-6 et/ou TNF-a. Une modification du phénotype des CSN félines se traduit par la capacité des CSN félines à modifier l’expression transcriptionnelle et/ou protéique de marqueurs intervenant dans l’immunomodulation. Parmi ces marqueurs il est possible de citer PGE2, IL-6, IL-10, TGF-b, IDO, iNOS, HGF, KGF, TSG-6, CCL2, CMH-I, CMH-II, HLA-E.
[0042] Le potentiel immunomodulateur des CSN félines peut également se caractériser par l’effet antiprolifératif des CSN félines sur des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) traitées avec un agent mitogène tel que la phytohémagglutinine, la concanavaline A et/ou au lipopolysaccharides. L’immunomodulation des CSN félines peut également être évaluée par la capacité des CSN félines à inhiber la prolifération, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et/ou la différenciation des lymphocytes T, NK, Lymphocytes B, des monocytes et/ou macrophages.
[0043] Dans un mode particulier de réalisation, les CSN félines présentent une capacité de différenciation chondrogénique. Par « capacité de différenciation chondrogénique », on entend que les CSN ont la capacité de pouvoir se différencier en chondrocytes. Les expressions « différenciation chondrocytaire » et « différenciation en chondrocytes » peuvent également être utilisées de manière indifférente.
[0044] Cette capacité de différenciation en chondrocytes peut être évaluée par l’étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques du cartilage tels que le Collagène de type II ( COL2A1 ), SOX-9 (SOX9), l’aggrécane ( ACAN ), le cartilage Oligomeric Matrix Protein ( COMP ), le Collagène de type IX ( COL9A1 ), le collagène de type XI ( COL11A1 ), le collagène de type IIB ( COL2B ) après induction de la chondrogenèse. D’autre part, des propriétés visco-élastiques de la matrice extracellulaires, exprimée par les CSN différenciées, se rapprochant des propriétés visco-élastiques du cartilage, peuvent servir de caractéristique pour l’évaluation de la chondrogenèse.
[0045] Dans un mode de culture privilégié, pour induire la chondrogénèse, les CSN sont détachées de leur support par trypsination et utilisées pour former des micromasses par gravitation dans une goutte de milieu d’amplification comme par exemple le DMEM (lg/L de glucose) supplémenté avec 10% de SVF (vol :vol), 2 mM de glutamine et 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique (FGFb). Une micromasse de CSN se forme alors après 24h d’incubation, à la base de la goutte. Cette micromasse est récupérée et mise en présence, pendant 7 à 28 jours, d’un milieu de différenciation chondrocytaire composé de DMEM avec 4,5 g/L de glucose et additionné de TGF- b3 ou d’une combinaison TGF- bI/BMR-2, en particulier de 10 ng/ml de TGF^3 ou de 10 ng/mlTGF-bI et 50 ng/ml de BMP-2. A l’issue, une extraction ARN ou protéique est réalisée afin d’analyser l’expression de marqueurs spécifiques du lignage chondrogénique tels que le collagène de type II, l’aggrécane, les COMP, SOX9.
[0046] Dans un mode de réalisation spécifique, la population de CSN félines est caractérisée en ce qu’au moins 80% des cellules de ladite population de CSN félines présentent un potentiel de différenciation ostéogénique. On parle également de potentiel de différenciation ostéogénique ou d’ostéogenèse.
[0047] Ce potentiel de différenciation ostéogénique peut être évalué par l’étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques de l’os (ALPL, RUNX2...) ou par analyse des dépôts calciques après induction de l’ostéogenèse sous 7 à 15 jours. Cette induction ostéogénique peut être réalisée par culture des CSN en monocouche en présence d’un milieu de différenciation ostéogénique contenant un corticostéroïde, tel que la déxaméthasone (0,1-ImM), un agent réducteur tel que l’acide ascorbique 2-phosphate (entre 0 et 200 pg/ml) et du b-glycérophosphate (0-50 mM). La BMP-2 peut par exemple remplacer la dexaméthasone.
[0048] A l’issue du processus de différenciation, la présence de dépôts calciques dans la boite de culture est mise en évidence par coloration avec une solution de rouge Alizarine 1% (poids/volume) sous microscope. La présence de dépôts révèle le potentiel de différenciation ostéogénique.
[0049] Alternativement ou en complément, une étude protéique et/ou transcriptionnelle des marqueurs spécifiques de l’os (ALPL, RUNX2) peut être réalisée.
[0050] Composition pharmaceutique et solution injectable comprenant des CSN félines
[0051] Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une population de CSN félines telles que décrite précédemment.
[0052] Ainsi, la présente invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant une population de CSN félines telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
[0053] Dans un mode de réalisation particulier, les CSN félines de ladite composition sont issues d’un échantillon de tissu néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou d’un échantillon de liquide biologique néonatal, en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux ou le liquide amniotique.
[0054] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition pharmaceutique comporte une population de CSN félines comprise entre 3 millions et 20 millions de cellules pour 0,5 ml à 10 ml de solution, et plus spécifiquement comprise entre 5 et 15 millions de cellules pour 1 à 2 ml de solution, et encore plus spécifiquement 10 millions de cellules pour 1,5 ml de solution. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprend entre 3.105 et 4.107 cellules/ml, en particulier 2,5.106 et 1,5.107 cellules/ml, plus particulièrement 1.107 cellules/ml. Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprend entre 5 et 15 millions de CSN félines, en particulier 10 millions.
[0055] Typiquement, le véhicule pharmaceutiquement acceptable de cette composition et/ou le conditionnement permet de maintenir cette proportion de CSN viables pendant un temps suffisant et ce de façon congelée ou décongelée selon les modalités suivantes. Le véhicule peut être tous types de liquides, gels, polymère solides capable de contenir ces CSN sans détériorer leurs propriétés désirées, notamment une solution aqueuse saline, du sérum, du milieu de culture, un milieu de cryoconservation. Le conditionnement peut être tous types de réceptacles, contenants, dispositifs médicaux capables d’isoler de manière aseptique les préparations pharmaceutiques de l’environnement extérieur et/ou de l’environnement de transport et/ou du manipulateur. En particulier, le conditionnement permet de maintenir l’intégrité et la formulation de la composition pharmaceutique et/ou de faciliter la distribution/transport de la composition pharmaceutique. Par ailleurs, dans un mode de réalisation particulier, le véhicule et/ou le conditionnement peuvent servir à améliorer les propriétés des CSN félines pour leur utilisation thérapeutique. A titre illustratif, des facteurs de croissance, cytokines, principes actifs peuvent être incorporés au véhicule ou liés au conditionnement et ainsi agir sur les propriétés des CSN félines de façon à les améliorer. La disponibilité et/ou libération de ces acteurs chimiques et/ou biologiques peuvent être de caractère cinétique.
[0056] Dans un mode de réalisation particulier, ledit véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution comprenant un cryoprotecteur.
[0057] La solution peut être toute solution permettant la congélation et/ou la décongélation des cellules tout en limitant l’influence biologique de ces procédés sur les cellules comme l’induction de mort cellulaire, la différenciation, l’induction de la sénescence cellulaire, les chocs osmotiques, l’induction de porosité membranaire, la modification de la composition membranaire et/ou les changements phénotypiques.
[0058] Dans un mode de réalisation particulier, la solution correspond à du DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), du MEM (Minimum Essential Media), une solution comprenant du sérum de veau fœtal (SVF), une solution comprenant du sérum animal, et/ou tout autre solution isotonique.
[0059] Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend entre 0 et 20% de SVF, plus particulièrement entre 5 et 20%, encore plus particulièrement 10%.
[0060] Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution est exempte de produit d’origine animale. Dans la mesure où l’ensemble de la formulation de la solution est compatible avec une injection in vivo, la solution de cryoconservation peut être utilisée comme solution injectable pour les traitements concernés par la composition pharmaceutique décrite dans ladite invention. [0061] Par cryoprotecteur, on entend tous composés permettant d’assurer la fonction de cryoconservation. Selon un mode de réalisation plus particulier, ledit cryoprotecteur est choisi parmi le glycerol, le Diméthyl sulfoxyde (DMSO), le propylène glycol, les protéogly canes, le tréhalose, la « Bovine sérum albumin » (BSA), la gélatine, du polyéthylène glycol (PEG), du polyacrylic-acide, du poly-L-lysine, de l’éthylène glycol ou une combinaison de plusieurs de ces cryoprotecteurs.
[0062] Des solutions commerciales comprenant un cryoprotecteur utilisables dans la composition pharmaceutique sont des solutions synthétiques de cryoprotection pré formulées du type StemAlpha, CryoStor® CS2, CS5 ou CS10.
[0063] Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprend de 0,5 à 30 % de glycérol, de 0,5 à 30 % de DMSO, de 0,5 à 30 % propylène glycol ou de 0,5 à 20% de poly-L-lysine. En particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution comprenant de 2 à 10% de DMSO, plus particulièrement 5% de DMSO. En particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution comprenant 2 à 20% de glycérol.
[0064] Dans un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs adjuvants peuvent être ajoutés à la composition pharmaceutique comme du chlorure d’ammonium, de lactate de Ringer ou du BSA.
[0065] Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution de DMEM comprenant du SVF, en particulier de 5 à 20% de SVF et plus particulièrement 10%, et comprenant de 1 à 90% de DMSO, plus particulièrement de 0,5 à 20%, plus particulièrement de 5 à 10%, en particulier 5%.
[0066] Dans un autre mode de réalisation particulier, ladite solution comprenant un cryoprotecteur est une solution de DMEM comprenant du SVF, en particulier de 5 à 20% de SVF et plus particulièrement 10%, et de 2 à 20% de glycérol.
[0067] Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu’elle est sous forme congelée.
[0068] La composition pharmaceutique peut être cryogénisée avec l’utilisation d’un cryoprotecteur adéquat, capable de garantir l’intégrité et la formulation de la composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique peut alors être conservée à -196°C, pour un stockage à long terme (supérieur à 12 mois). Pour être utilisée, elle subit une décongélation, telle que décrite plus loin.
[0069] Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est une composition prête à l’emploi.
[0070] Par « prête à l’emploi », on entend que la composition pharmaceutique comprenant des CSN félines est prête à être injectée à l’individu. La remise en culture des cellules avant utilisation chez l’individu n’est pas nécessaire et les cellules n’ont pas besoin d’être ressuspendues dans un milieu physiologique, et ceci même lorsqu’elles sont formulées avec un cryoprotecteur comme décrit ci-dessus. L’expression « prête à l’emploi » signifie que seule une étape de décongélation est nécessaire lorsque la composition est sous forme congelée, avant une injection chez le patient.
[0071] Cette composition pharmaceutique pouvant être congelée est ainsi mobilisable à tous moments. Cette dernière a l’avantage de rendre disponible dans les plus brefs délais le traitement tout en limitant l’intervention humaine nécessaire à son efficacité et en limitant le risque de contamination inhérent à chaque manipulation par un opérateur. Ainsi, il est possible de séparer le procédé d’obtention de la composition pharmaceutique de son utilisation clinique finale.
[0072] Un autre aspect de l’invention concerne une solution injectable prête à l’emploi comprenant une population de CSN félines telles que décrites précédemment et un cryoprotecteur tel que défini précédemment.
[0073] Dans un mode de réalisation particulier, ladite solution injectable prête à l’emploi comprend une dose unitaire de 5 à 15 millions de CSN, plus particulièrement 10 millions, et une solution comprenant un cryoprotecteur telle que définie précédemment.
[0074] Dans un mode réalisation particulier, le cryoprotecteur dans ladite solution injectable est le DMSO. Dans un mode particulier, la solution comprend entre 0,5 et 30 % de DMSO, en particulier entre 2 et 10 %, plus particulièrement 5%.
[0075] Dans un mode de réalisation particulier, la solution injectée prête à l’emploi à un volume compris entre 1 et 5 ml, plus particulièrement 1,5 ml. [0076] Utilisation thérapeutique des CSN félines
[0077] Les caractéristiques des CSN félines décrites précédemment, permettent une utilisation de ces cellules en thérapie cellulaire.
[0078] Par « thérapie cellulaire », on entend un traitement thérapeutique comprenant G administration de cellules susceptibles d’induire un effet thérapeutique bénéfique chez le félin.
[0079] Dans le cadre d’une approche de médecine régénérative, cette thérapie cellulaire est susceptible de favoriser directement (différenciation cellulaire) ou indirectement (sécrétion de facteurs biologiques, activation ou inhibition de cellules de l’environnement) une récupération, de l’équilibre homéostatique et/ou immunitaire d’un ou plusieurs tissus ou organe chez un individu félin en attente d’un tel traitement.
[0080] Ainsi, dans un autre aspect la présente invention concerne une population de CSN félines, une composition pharmaceutique ou une solution injectable telles que décrites précédemment pour leur utilisation en thérapie cellulaire.
[0081] Cette utilisation en thérapie cellulaire peut être une utilisation thérapeutique autologue, allogénique, syngénique ou xénogénique.
[0082] Dans un mode de réalisation particulier, l’utilisation en thérapie cellulaire est une utilisation thérapeutique allogénique, aussi dit hétérologue.
[0083] Dans un mode de réalisation particulier, l’utilisation en thérapie cellulaire est une utilisation thérapeutique xénogénique.
[0084] Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une population de CSN félines, une composition pharmaceutique ou une solution injectable telles que décrites précédemment pour leur utilisation dans le traitement d’une stomatite féline.
[0085] Par « stomatite », on entend une inflammation de la cavité buccale. Les stomatites sont désignées par différents termes en fonction de l’étiologie, de l’approche thérapeutique et/ou des signes cliniques observés. Par exemple et de manière non exhaustive, les stomatites sont des gingivites, parodontites, stomatites caudales, buccostomatites, stomatites chroniques, stomatites lympho-plasmocytaires ou stomatites granulomateuses. [0086] Les stomatites peuvent avoir une origine infectieuse (bactérien, fongique), auto immune, inflammatoire, consécutive à une chimio thérapie et/ou radiothérapie et/ou consécutive à un traitement médicamenteux organique, métabolique. Dans un mode de réalisation particulier, l’origine pathologique des stomatites est virale et de manière non exhaustive, générée suite à une infection par le Calicivirus félin, par l’Herpes virus ou par le virus d’immunodéficience félin.
[0087] Dans un mode de réalisation plus particulier, la stomatite féline est une stomatite chronique, en particulier une gingivostomatite chronique (GSC).
[0088] Dans un mode de réalisation particulier, 5.105 à 10.106 cellules/kg plus particulièrement 1.106 à 5.106 cellules/kg sont administrées.
[0089] Dans un mode de réalisation particulier, 5.105 à 2.107 CSN félines, en particulier de 5.106 à 1,5.107, plus particulièrement 1.107, ou une composition ou solution injectable comprenant une telle dose, sont administrées.
[0090] Dans un mode de réalisation particulier, le sujet est traité avec l’administration d’une dose unique telle que définie ci-dessus. Cela signifie qu’une dose unique de 3.106 à 2.107 CSN félines, en particulier de 5.106 à 1,5.107, plus particulièrement 1.107, suffit à traiter le sujet.
[0091] Par « traiter le sujet » on entend que le sujet auquel ont été administrées des CSN félines comme décrit dans la présente demande, montre une réduction des symptômes pendant une durée d’au moins 2 mois, en particulier au moins 4 mois, en particulier au moins 6 mois. La condition du sujet est alors améliorée par le traitement. On entend également que le sujet auquel ont été administrées les CSN félines présentent une amélioration de leur condition dans le sens où cela permet une réduction de la fréquence et/ou de la dose, ou l’affranchissement total des autres solutions thérapeutiques ou analgésiques conventionnelles connues par l’homme du métier.
[0092] Par « solutions thérapeutiques ou analgésiques conventionnelles connues par l’homme du métier », on entend de manière non exhaustive l’avulsion dentaire totale ou partielle, la ciclosporine, les anti-inflammatoires de type stéroïdien ou non stéroïdien, les antibiotiques, l’Interféron (IFN) oméga, les corticoïdes, la gabapentine, la morphine et/ou le buprenophine. [0093] Dans un mode de réalisation particulier, radministration au sujet est réalisée au moins une fois pour traiter ledit sujet.
[0094] Dans certains cas, plusieurs administrations dans le temps au sujet sont réalisées.
[0095] Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux administrations au sujet sont réalisées, deux administrations étant espacées d’au moins 2 mois l’une de l’autre, en particulier espacées de 2 mois à 5 ans, de 2 mois à 4 ans, de 2 mois à 3 ans, de 2 mois à 2 ans, de 2 mois à 1 an, ou de 2 mois à 6 mois.
[0096] Les CSN peuvent être administrées localement ou dans un mode de réalisation particulier en intra-veineux (IV). Par administration IV on entend une administration des CSN directement dans le système veineux de l’animal à l’aide d’un cathéter ou d’une aiguille ou par exemple via une poche de soluté de perfusion ou par exemple par la tubulure du perfuseur avec une vitesse d’administration particulière. On entend par vitesse d’administration, un débit de perfusion dans un mode de réalisation particulier de 2,5.104 à 1.106 de CSN/min. Par exemple les CSN peuvent être administrées à la vitesse de 5.105 CSN /min.
[0097] De préférence, l’administration est réalisée par voie intraveineuse, par exemple à l’aide d’une perfusion.
[0098] Dans un mode de réalisation particulier, ladite population de CSN félines ou ladite composition pharmaceutique pour l’utilisation telle que décrite précédemment, est caractérisée en ce que l’administration est réalisée sous la forme d’une dose unique de 5.105 à 2.107 CSN félines, en particulier de 5.106 à 1,5.107, plus particulièrement 1.107, pour traiter le sujet, en particulier par voie intraveineuse.
[0099] Dans un mode de réalisation particulier, cette utilisation peut être combinée à d’autres types de traitement/interventions. En particulier, elle peut être réalisée suite à une avulsion dentaire totale; et/ou pendant ou suite à un traitement médicamenteux ou pendant une anesthésie.
[0100] Dans un mode de réalisation particulier, cette utilisation peut être réalisée chez des sujets n’ayant pas subi d’avulsion dentaire ou chez des sujets ayant subi une avulsion dentaire partielle. [0101] Par « avulsion dentaire partielle » on entend toute opération chirurgicale visant à extraire entre 1 et 29 dents, plus particulièrement entre 1 et 26 dents, plus particulièrement entre 1 et 16 dents. Dans un mode opératoire alternatif, une avulsion partielle peut représenter la seule extraction des dents spécifiquement touchées par les lésions buccales ou G extraction de toutes les dents à l’exception des canines.
[0102] Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne les CSN félines, la composition pharmaceutique ou la solution injectable telles que décrites précédemment pour leur utilisation dans le traitement des stomatites félines, en combinaison avec l’administration d’un ou plusieurs traitements anti-inflammatoires, antalgiques, immunomodulateurs, anti-infectieux et/ou antiviral liés ou non à la stomatite.
[0103] Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne les CSN félines, la composition pharmaceutique ou la solution injectable telles que décrites précédemment pour leur utilisation dans le traitement de stomatites chez le félin, en combinaison avec l’administration d’un anti-inflammatoire.
[0104] Cet anti-inflammatoire peut être un anti-inflammatoire de type stéroïdien ou non stéroïdien.
[0105] En tant qu’anti-inflammatoire stéroïdien nous pouvons citer les glucocorticoïdes et cortico stéroïde s. Comme anti-inflammatoire non stéroïdien nous pouvons citer la buprénorphine, l’aspirine, l’ibuprofène, le kétoprofène, l’acétate de méthylprednisolone. Comme thérapeutique avec une action anti-inflammatoire nous pouvons également citer la thérapie au laser. Comme antalgique nous pouvons citer les morphiniques et alpha2- agonistes. Comme immunomodulateur nous pouvons citer les cyclosporines et la rapamycine. Comme anti-infectieux et antiviral nous pouvons citer les antibiotiques et interférons recombinants.
[0106] Dans un mode de réalisation particulier, les CSN félines sont administrées pour le traitement de stomatite féline chez des sujets réfractaires à une ou plusieurs des solutions thérapeutiques ou analgésiques précédemment citées.
[0107] Par « réfractaire », on entend toute prise en charge médicale de la GSC féline qui n’est pas satisfaisante, qui présente un défaut d’efficacité, une recrudescence de signes cliniques, qui génère des effets secondaires non désirés, qui génère une intolérance ou une réaction immunitaire adverse, induisant un défaut d’observance, nécessitant d’avoir recours à une dose médicamenteuse trop élevée par rapport à un traitement conventionnel et/ou le fait d’avoir recours à une polymédication trop complexe et inadaptée.
[0108] L’utilisation des CSN félines selon l’invention, permet à minima une amélioration clinique ou une rémission complète chez plus de 50%, plus particulièrement 70%, plus particulièrement 80% des animaux souffrant de GSC, ayant subi une avulsion dentaire totale et/ou réfractaires aux thérapies conventionnelles. En particulier, cette évolution est observée sans sélection préalable des chats basée sur leur phénotype sanguin et plus particulièrement sans sélection de la proportion de cellules ayant un taux d’expression faible du marqueur CD8 (CD8+low) au sein d’une population exprimant ce marqueur (CD8+ globale).
[0109] L’efficacité du traitement peut être évaluée de différentes manières. Dans un mode de réalisation particulier, l’efficacité du traitement est mesurée en utilisant un système d’évaluation établi par un vétérinaire, basé sur l’index d’activité de la GSC (The Stomatitis Disease Activity Index : SD AI). Le score SD AI prend en compte les paramètres suivants : inflammation buccale (maxillaire et mandibulaire), inflammation gingivale (maxillaire et mandibulaire), inflammation au niveau de l’arc palatoglosse, inflammation de la glande salivaire, inflammation oro-pharyngée, inflammation linguale ou sublinguale. L’évaluation du SDAI peut être réalisée à l’inclusion puis à différents temps après la perfusion ou l’injection de la préparation pharmaceutique.
[0110] Par amélioration clinique, on entend une amélioration du score clinique (SDAI) exprimée sous forme de pourcentage de récupération. Le pourcentage de récupération est obtenu par la formule { l-(SDAIf/SDAL)} x 100 où SDAIf correspond au SDAI final obtenu, et SD AL correspond au SDAI initial obtenu. De façon alternative, l’efficacité du traitement peut être appréciée au cours d’un intervalle de temps par le calcul d’un pourcentage de récupération utilisant comme variable d’analyse un SDAI à un temps intermédiaire donné (SDAIt) à la place d’un SDAIf et une formule du type de ( 1- (SDAIt/SDAL)}xl00.
[0111] Dans un mode de réalisation particulier, un pourcentage supérieur ou égal à 15% est considéré comme une amélioration clinique non due à un effet placebo (13). Considérant ce seuil de réponse, la composition pharmaceutique selon l’invention permet une amélioration clinique dans 83,3% des cas à 2 mois (n=5 chats) ; dans 83,3% des cas à 3 mois (n=5 chats) ; dans 100% des cas à 6 mois (n=6 chats) post-traitement. [0112] Par rémission clinique on entend, les animaux dont le score SD AI est inférieur à 2 au moment de l’évaluation clinique (Dental Vêts, 2015). Dans un mode réalisation particulier, on parle également de rémission clinique lorsque le pourcentage de récupération tel que décrit précédemment est supérieur ou égal à 90% entre l’évaluation finale (SDAIf) et l’évaluation initiale (SD Ali).
[0113] Dans un autre mode de réalisation particulier, l’efficacité du traitement peut être évaluée par le suivi de l’évolution des symptômes liés à la maladie. Le traitement sera ainsi considéré comme efficace s’il permet de s’affranchir des autres solutions thérapeutiques ou analgésiques conventionnelles connues par l’homme du métier ou d’en diminuer la fréquence d’utilisation ou la dose, s’il contribue à réduire les troubles alimentaires (dysorexie) des animaux présentant un symptôme de sous nutrition, s’il permet un gain d’activité et un gain de poids chez les sujets traités présentant une perte initiale d’activité, s’il permet de diminuer l’intensité des douleurs causées par le statut pathologique du sujet. L’ensemble ou partie de ces paramètres peuvent être monitorés par les propriétaires dans des formulaires de suivi (Exemple 2).
[0114] Méthode de traitement de la stomatite féline
[0115] La présente invention concerne également une méthode de traitement de la stomatite féline comprenant l’administration de CSN félines, d’une composition pharmaceutique ou d’une solution injectable comprenant des CSN félines telles que décrites précédemment, à un sujet.
[0116] L’ensemble des modes de réalisation décrits ci-dessus portant sur les CSN félines, une composition pharmaceutique ou une solution injectable comprenant lesdites cellules pour leur utilisation en thérapie cellulaire, s’appliquent à la méthode de traitement.
[0117] Procédé d’obtention d’une composition comprenant des CSN félines
[0118] Un autre aspect de l’invention concerne un procédé in vitro d’obtention d’une composition pharmaceutique selon l’invention.
[0119] Ainsi, la présente invention porte également sur un procédé in vitro d’obtention d’une composition pharmaceutique prête à l’emploi comprenant des CSN félines telles que décrites précédemment, ledit procédé comprenant, les étapes suivantes :
a. une étape de fourniture d’un ou plusieurs échantillons biologiques néonataux félins, le ou les échantillons biologiques ayant été préalablement obtenus à partir d’un ou plusieurs individus ;
b. une étape d’isolement de la population de CSN félines présentes dans le ou les échantillons biologiques ;
c. optionnellement, l’amplification ex vivo des CSN obtenues à l’étape b. ;
d. au moins une étape de cryoconservation de la population de CSN félines obtenues à la suite de l’étape b et/ou c., pour constituer une banque cellulaire ;
e. une étape de décongélation de la population de CSN félines à la suite de l’étape d ;
f. optionnellement, l’amplification ex vivo des CSN suite à l’étape e. ;
g. optionnellement, une étape de stimulation par un effecteur physique chimique et/ou biologique des CSN félines pour augmenter leurs propriétés biologiques et thérapeutiques, pendant à l’étape f ;
h. au moins une étape de vérification des propriétés biologiques des CSN félines à la suite de l’étape b., c., d., e., f., et/ou g.;
i. une étape de cryoconservation de la population de CSN félines obtenues avec un véhicule acceptable pour l’administration au patient.
[0120] Les échantillons biologiques néonataux félins dont peuvent être issues les CSN félines ont été décrits précédemment.
[0121] Par « isolement », on entend les moyens mis en œuvre pour extraire les cellules de leur source d’origine de nature tissulaires et/ou fluide biologique. Typiquement ces moyens correspondent à la dissection mécanique des tissus permettant d’aboutir à des fractions tissulaires exploitables en laboratoire. Ces fractions tissulaires sont ensuite mises en culture pour un isolement de type explantation, exploitant ainsi les capacités de migration des cellules résidentes. Un autre moyen d’isolement est par exemple l’utilisation d’enzymes de digestion aboutissant au catabolisme de la matrice extracellulaire et la libération des cellules sur un temps donné de 10 min à 16h sous température contrôlée. Parmi ces enzymes de digestion il est possible de citer de façon non exhaustive les collagénases, pronase, hyaluronidases et/ou autres protéases matricielles. Un autre moyen d’isolement, pour les sources liquides biologiques et/ou suspensions cellulaires obtenues à partir de digestion enzymatique de tissus, consiste en l’utilisation de purification de cellules par centrifugation sur gradient de densité de type Ficoll, Percol et/ou glucose. Les méthodes citées précédemment peuvent être utilisées seules ou combinées. La résultante de ces méthodes d’isolement doit favoriser l’isolement des CSN indépendamment des cellules hématopoïétiques, cellules sanguines ou autre types cellulaires contaminants ne correspondant pas à des CSN ou des CSN ne possédant pas les propriétés biologiques précédemment citées.
[0122] Afin d’obtenir des quantités plus importantes de CSN félines, une étape d’amplification des cellules par adhésion au plastique peut être réalisée. Dans un mode particulier de réalisation, un support plastique traité ou non pour l’adhésion cellulaire, et/ou en présence ou non de fibroblast growth factor (FGF, FGF-2, FGFb), dexamethasone et/ou d’acide ascorbique 2 phosphate (A2P), et dans un milieu de culture cellulaire correctement défini par l’homme de l’art, est utilisé.
[0123] Par « étape d’amplification », on entend toute étape permettant une prolifération des CSN sur support plastique ou polymère. Cette phase doit être capable de favoriser la présence des CSN au détriment d’autres types cellulaires ne répondant pas aux caractéristiques des CSN. Elle doit également assurer une prolifération optimale des cellules tout en limitant les phénomènes de dédifférenciation, de différenciation et/ou de sénescence. Cette étape implique des conditions en atmosphère contrôlé telles que l’homme de l’art est capable d’établir comme par exemple avec 90% d’humidité et comportant 5% de CO2. La température d’amplification doit être constante et comprise entre 35-40°C, plus précisément entre 37-39°C. Parmi les milieux de culture, de façon non exhaustive, il est possible de citer les milieux de type Alpha-MEM, DMEM, RPMI, IMDM, Opti-MEM, EGM, EGM-2, milieux synthétiques adaptés à la culture de CSM dépourvus d’endotoxine et/ou de sérum, milieux synthétiques adaptés aux bonnes pratiques de fabrication, complémentés ou non avec du sérum de veau fœtal (SVF) de 0,1% à 20%, du lysat plaquettaire, de l’insuline-transferine-sélénium, des compléments commerciaux définis et/ou autres facteurs de croissance et/ou molécules favorisant la prolifération des CSN tout en limitant leur sénescence comme le FGF, EGF, VEGF, dexamethasone et/ou A2P.
[0124] Cette phase d’amplification peut être réalisée sur différents supports une fois que la population de CSN est obtenue suite à l’étape d’isolement. Ces différents supports peuvent être de nature 2D ou 3D.
[0125] Par amplification sur support 2D, on entend toutes méthodes de culture cellulaire permettant une amplification des CSN félines sur support monocouche et correctement mis au point par l’homme de l’art. Dans des modes de réalisation particuliers les cellules peuvent être cultivées dans des boites de culture en plastique traitées ou non pour favoriser l’adhésion cellulaire, de type flasque, à un ou plusieurs étages et/ou de type multicouches avec ou sans perfusion continue, avec ou sans optimisation du flux d’air.
[0126] Par amplification sur support 3D, on entend toutes techniques connues par l’homme de l’art utilisant des biomatériaux, microporteurs et/ou polymères capables d’assurer une amplification des CSN en bioréacteur et correctement mise au point par l’homme de l’art. Dans des modes de réalisation particuliers, les CSN peuvent être amplifiés en bioréacteurs sous agitation, axiale et/ou pendulaire, sous agitation à vagues, sous agitation à lit tournant, en bioréacteurs statiques et/ou perfusés. Les biomatériaux et/ou microporteurs peuvent être de plusieurs natures et selon des modes de réalisation particuliers peuvent être de tailles comprises entre 50-500 pm de diamètre, ont une porosité de différente nature, présentent une surface traitée, chargée ou non négativement ou positivement, comportent des facteurs de croissance ou protéines recombinantes de type intégrines et/ou matrice extracellulaire ou toutes autres molécules biologiques/chimique favorisant l’adhésion cellulaires et/ou la prolifération cellulaire.
[0127] Afin d’assurer la phase de prolifération, un passage cellulaire des CSN peut être nécessaire et réalisé par une méthode correctement mise au point par l’homme de l’art. Ces passages cellulaires peuvent être réalisés par détachement des cellules sous l’effet d’action mécanique, d’enzymes et/ou inhibiteurs comme, de façon non exhaustive, la trypsine, EDTA et/ou accutase recombinantes ou animales. Par ailleurs, il est possible de réaliser ces passages cellulaires par l’utilisation de biomatériaux/microporteurs dissolvables selon un procédé mis au point par l’Homme de l’art. Il est à noter qu’au cours de la succession des passages, une sélection clonale peut s’opérer durant les premiers passages de PI à P4 tels (11) et aboutir à une population relativement stable telle que la clonogénicité de la population de CSN n’évolue que faiblement. Par ailleurs, ces premiers passages peuvent permettre l’isolement d’une population de CSN dépourvue d’autres types cellulaires contaminants tels que les lymphocytes et autres cellules sanguines, macrophage, neutrophiles, polynucléaires, cellules endothéliales et/ou fibroblastes.
[0128] Dans un mode de réalisation particulier, pour la phase d’amplification, les cellules sont par exemple traitées avec de la trypsine-EDTA, puis reprises dans un milieu d’amplification et centrifugées. Après reprise dans du milieu d’amplification, elles sont ensemencées à hauteur de 1500 à 5000 cellules/cm2 ou équivalent 3D et cultivées dans du milieu d’amplification avec ou sans suivi monitoré du microenvironnement et/ou atmosphère de culture.
[0129] Au cours du procédé, les CSN félines obtenues sont mises en suspension avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable tel que défini précédemment. Dans un mode particulier, le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution comprenant un cryoprotecteur.
[0130] Au cours du procédé, il est possible de procéder à une étape de cryoconservation, afin de créer une banque de cellules telle qu’elle peut être définie en industrie et établie par l’homme de l’art. Par « cryoconservation », on entend l’étape de congélation des cellules et de stockage pour une durée allant de 1 jour à 5 ans et plus. La banque de cellules est conditionnée de façon à garantir l’intégrité et les propriétés biologiques des populations cellulaires. Les banques peuvent être de plusieurs natures et jouer plusieurs rôles. Il est possible de citer de façon non exhaustives les banques cellulaires de réserves (« master bank » ou « seed unit »), banques cellulaires de travail (« working bank »), banque légale, banque de rétention et/ou banques d’unités thérapeutiques prêtes à l’emploi à vocation thérapeutiques. A noter que cette dernière banque d’unités thérapeutiques peut correspondre à une préparation pharmaceutique décrite ultérieurement.
[0131] L’étape de cryoconservation est réalisée après la mise en suspension des CSN dans une solution comprenant un cryoprotecteur.
[0132] Dans un mode de réalisation particulier, cette étape de congélation ou cryoconservation correspond à une descente progressive de la température de la suspension cellulaire (-1°C / minutes) pour atteindre la température de stockage allant de -70°C à - 195°C. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules peuvent être congelées à une vitesse de congélation comprise entre -0,3°C / minutes et -99°C / minutes. Un même protocole de congélation peut comprendre une ou plusieurs vitesses de congélation différentes comme dans le cas d’une montée graduelle de vitesse de congélation. Dans un mode de réalisation alternatif, les cellules sont directement congelées sans contrôle de température dans une enceinte de stockage dont la température est comprise entre -70°C et 195°C. Le stockage final peut être en phase liquide (de type azote liquide) ou phase gazeuse (de type enceinte -140°C, -80°C ou stockage en azote en phase gazeuse). [0133] Afin de rendre disponible les cellules cryoconservées pour une administration thérapeutique au sujet, une étape de décongélation est réalisée suite à l’étape de congélation, dans le cas où les CSN utilisées pour l’administration sont sous la forme d’unités de banque. Cette décongélation est réalisée de façon à passer du stade de cellules congelées au stade de cellules décongelées au cours d’un mode de réalisation limitant la mort cellulaire par dessiccation, lésion mécanique de la membrane plasmique, choc osmotique. Dans un mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont réchauffées par friction manuelle durant moins de 10 min. Dans un autre mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont placées au bain marie liquide ou sec, réglé à une température comprise entre 30 et 40°C pendant moins de 10 min, en particulier à 37°C pendant 3 à 5 min. Dans un autre mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont placées dans un appareil de décongélation automatique. Dans un autre mode de réalisation particulier, les unités de CSN sont décongelées à température ambiante pendant moins de 10 min si le cryoprotecteur utilisé le permet.
[0134] Dans le cas échéant, pour les banques autres que celles d’unités thérapeutiques prêtes à l’emploi, les cellules décongelées peuvent être réamplifiées. Après décongélation, les cellules, sont alors ressuspendues dans du milieu de lavage (DPBS, DMEM ou DMEM+SVF) ou dans du milieu d’amplification cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, le volume de suspension est progressivement ajusté afin de limiter les chocs osmotiques que peuvent subir les cellules. Les cellules sont ensuite remises en culture afin de réaliser une nouvelle phase d’amplification.
[0135] Optionnellement, les CSN félines peuvent subir une étape de stimulation/modification exogène pendant la phase d’amplification par le biais d’effecteurs physiques, biologiques et/ou chimiques. Par stimulation exogène (également appelée « priming »), on entend toutes stimulations/modifications des cellules et/ou de leur microenvironnement déclenchant chez elles un changement phénotypique favorisant leurs propriétés biologiques dans le cadre de thérapies spécifiques. Par exemple, un traitement avec des cytokines en concentrations comprises entre 1 et 500 ng/ml d’IFN-g, d’IL-Ib, 11-6 et/ou de TNF-a permet d’augmenter de façon significative l’expression de molécules exerçant une activité immunomodulatrice. Dans un autre exemple, des stimulations mécaniques et/ou l’induction d’une prédifférenciation chondrogénique peut permettre de favoriser les propriétés de reconstruction tissulaire in vitro. [0136] Dans le procédé, au moins une étape de vérification des propriétés biologiques des CSN félines isolées est réalisée. Dans un mode de réalisation particulier, la présence des marqueurs CD29 et CD44 et l’absence des marqueurs CD8, CMH-I et CMH-II sont vérifiées. Dans un mode de réalisation particulier, la capacité de prolifération cellulaire comprise d’au moins 20 doublements cellulaires consécutifs, comme décrit précédemment, est vérifiée. Dans un mode de réalisation particulier, la capacité de différenciation chondrogénique des CSN félines est vérifiée. Ces modes de réalisation particuliers peuvent être combinés entre eux.
Brève description des dessins
Fig. IA
[0137] [Fig. IA] montre l’analyse des CSN félines par cytométrie en flux selon les paramètres FSC-A/FSC-H permettant de sélectionner les cellules uniques. Une analyse selon les paramètres FSC-A/SSC-A permet, par la suite, de sélectionner la population de CSN d'intérêt.
[0138] Les fig. IB, IC, 1D, 1E, 1F représentent l’évaluation de l'expression du marqueur d’intérêt par la population de CSN félines par analyse de la fluorescence pour le fluorochrome correspondant. Le graphique représente les résultats des marqueurs de surface (en gris clair, le marqueur spécifique d’intérêt ; en gris foncé l’isotype correspondant). Le seuil de positivité est placé à l'aide des cellules marquées par l'isotype correspondant. Le tableau indique le nombre d'évènements analysés ainsi que la médiane de fluorescence de la population de CSN.
Fig. IB
[0139] [Fig. IB] montre la positivité de l’expression du marqueur de surface CD44.
Fig. IC
[0140] [Fig. IC] montre la positivité de l’expression du marqueur de surface CD8.
Fig. 1D
[0141] [Fig. 1D] montre la positivité de l’expression du marqueur de surface CMH-II.
Fig. 1E
[0142] [Fig. 1E] montre la positivité de l’expression du marqueur de surface CD29. Fig. IF
[0143] [Fig. IF] montre la positivité de l’expression du marqueur de surface CMH-F
Fig. IG
[0144] [Fig. IG] montre l’analyse des PBMC par cytométrie en flux selon les paramètres FSC-A/FSC-H permettant de sélectionner les cellules uniques. Une analyse selon les paramètres FSC-A/SSC-A permet, par la suite, de sélectionner des lymphocytes.
[0145] Les fig. 1H et II représentent l’évaluation de l'expression du marqueur d’intérêt par les lymphocytes, par analyse de la fluorescence pour le fluorochrome correspondant. Le graphique représente les résultats des marqueurs de surface (en gris clair, le marqueur spécifique d’intérêt ; en gris foncé l’isotype correspondant). Le seuil de positivité est placé à l'aide des cellules marquées par l'isotype correspondant. Le tableau indique le nombre d'évènements analysés ainsi que la médiane de fluorescence des lymphocytes.
Fig. 1H
[0146] [Fig. 1H] montre la validation de la spécificité du marqueur CMH-II sur des lymphocytes de chat.
Fig. II
[0147] [Fig. II] montre la validation de la spécificité du marqueur CMH-I sur des lymphocytes de chat.
Fig. 2
[0148] [Fig. 2] montre l’activité proliférative illustrée par l’accumulation du nombre de doublements cellulaires au cours des passages;
Fig. 3
[0149] [Fig. 3] montre une photographie représentative des CSM cultivées 2 semaines en milieu de différenciation ostéogénique et marquées à l’alizarin rouge. La présence de dépôts calciques est mise en évidence pas la coloration rouge;
Fig. 4
[0150] [Fig. 4] montre une fiche de suivi complétée par les propriétaires des animaux inclus dans l’étude; Fig. 5
[0151] [Fig. 5] montre une photo de la gueule d’un chat ayant subi une avulsion dentaire et traité par les CSN félines. Cette photo montre la diminution des lésions buccales visibles avant (photo de gauche) et après traitement (photo de droite);
Fig. 6
[0152] [Fig. 6] montre l’évolution du score SD AI des chats ayant subi une avulsion dentaire et traités par les CSN félines au cours du temps (jours après perfusion). La médiane est représentée par un trait horizontal au centre des boxplot ;
Fig. 7
[0153] [Fig. 7] montre l’évolution du score SD AI au cours du temps présentée pour chaque chat inclus et suivi, ayant subi une avulsion dentaire et traités par les CSN félines;
Fig. 8
[0154] [Fig. 8] montre le taux de récupération clinique calculé à chaque visite de suivi (D60, D90, DI 80) pour les 7 chats ayant subi une avulsion dentaire et traités par les CSN félines de l’étude;
Fig. 9
[0155] [Fig. 9] montre le score propriétaire (/12) évalué au cours du temps (injection J0, 15 jours, 2 mois, 3 mois et 6 mois) pour chaque chat ayant subi une avulsion dentaire et traité par les CSN félines.
Fig. 10
[0156] [Fig. 10] montre une photo de la gueule d’un chat ayant subi une avulsion dentaire partielle et traité par des CSN félines. Cette photo montre la diminution des lésions buccales visibles 15 jours après traitement (photo de gauche) et 1 mois après traitement (photo de droite);
Fig. 11
[0157] [Fig. 11] montre l’évolution du score SD AI des chats ayant subi une avulsion dentaire partielle et traités par les CSN félines au cours du temps (jours après perfusion). Fig. 12
[0158] [Fig. 12] montre le taux de récupération clinique calculé à chaque visite de suivi (D60, D90, DI 80) pour les 2 chats ayant subi une avulsion dentaire partielle et traités par les CSN félines de l’étude;
Fig. 13
[0159] [Fig. 13] montre le score propriétaire (/12) évalué au cours du temps (jour de la perfusion, 15 jours, 2 mois, 3 mois et 6 mois) pour chaque chat ayant subi une avulsion dentaire partielle et traité par les CSN félines.
Exemples
[0160] Exemple 1 : Obtention et caractérisation des cellules stromales néonatales (CSN) félines
[0161] A. Procédé d’obtention d’une population de CSN félines
[0162] Collecte d’annexes embryonnaires félines
[0163] Les annexes extra embryonnaires félines (placenta, cordon ombilical) sont prélevées de manière aseptique lors d’ovario-hystérectomie de convenance pratiquées chez des chattes en cours de gravidation. Dans le cadre d’une ovario-hysterectomie ou hysterectomie, l’utérus plus ou moins les conduits ovariens clampés sont déposés dans une boité de transport contenant une solution saline tamponnée comme par exemple du phosphate de Dulbecco (D-PBS) pour être acheminé au laboratoire à température contrôlée (4-12°C).
[0164] Isolement des CSN félines à partir de tissu extra embryonnaire
[0165] Le traitement du tissu extra embryonnaire est réalisé au maximum dans les 72h suivant le prélèvement. L’ensemble des étapes de traitement du tissu est réalisé dans un environnement contrôlé, sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). Le tissu est prélevé de manière aseptique de sa boîte de transport et transféré dans une boite de Pétri de 100 cm2. Le sac amniotique contenant le fœtus est éliminé par dissection. Le placenta de couleur rouge est transféré dans un bêcher stérile. Le tissu est lavé 3 à 5 fois dans des bains successifs de D-PBS. Le tissu placentaire est disséqué en fragments de 10-20 mm2 environ puis soumis à une digestion enzymatique en incubant les fragments de tissu dans une solution composée de DMEM (milieu de Eagle modifié de Dulbecco) contenant 0,5-4 mg/ml de collagénase de type I, et plus spécifiquement une concentration de 1 mg/ml de collagénase de type I. La digestion enzymatique se déroule à 37°C durant 45 min mais une digestion comprise entre 15 min et 16 h peut être réalisée en diminuant la température d’incubation (température ambiante (18-22°C ou 4°C). Au terme de la digestion, l’activité enzymatique est arrêtée par dilution, en ajoutant du DMEM contenant au moins 10% de sérum de veau fœtal (SVF) en quantité équivalente à la solution de digestion enzymatique. La solution est alors filtrée sur tamis de 70-100 pm. Les cellules récupérées sont centrifugées à 800 g durant 10 min. Le culot cellulaire contenant les cellules stromales néonatales est rincé au DMEM et de nouveau centrifugé à 800 g durant 10 min. Le culot cellulaire est repris dans du milieu de culture constitué de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblast growth factor (FGF). Les cellules sont comptées et ensemencées dans des boites de culture à une densité comprise entre 104 et 2.104 cellules/cm2. Les cellules sont alors cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de CO2. Le milieu est changé au bout de 48h puis tous les 2-3 jours. Les cellules sont passées lorsque la confluence atteint 70-80%.
[0166] Isolement des CSN félines à partir de liquide amniotique
[0167] Le traitement du liquide amniotique
[0168] est réalisé au maximum dans les 24h suivant le prélèvement. L’ensemble des étapes de traitement du liquide est réalisé dans un environnement contrôlé, sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). L’utérus clampé ou suturé, pour éviter les contaminations microbiologiques, est transféré sous PSM dans une boite de pétri de 100 mm. Le sac amniotique est séparé de l’utérus et transféré dans une nouvelle boite de pétri de 100 mm. Le sac intègre contenant donc encore le fœtus est percé à l’aide d’un ciseau ou scalpel pour libérer le liquide amniotique. Le sac amniotique et le fœtus sont transférés dans une autre boite et le liquide est récolté. Optionnellement, les liquides amniotiques de plusieurs sacs amniotiques peuvent être combinés afin d’augmenter le volume de liquide à traiter. Du milieu de culture constitué de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblast growth factor (FGF) est ajouté au liquide amniotique à hauteur minimale de 50% du volume prélevé. Optionnellement, la suspension peut être rincée par du DPBS et centrifugée à centrifugées à 800 g durant 10 min. Le volume de liquide ou de cellules re suspendues dans un volume équivalent en milieu de culture est disposé directement en boite de culture à hauteur de 100 à 300 mΐ par cm2. Les boites de cultures sont alors cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de CO2. Le milieu est changé au bout de 48h puis tous les 2-3 jours. Après 1-2 semaines de cultures, les colonies de CSN félines sont passées pour permettre une amplification cellulaire.
[0169] Passage cellulaire et amplification
[0170] A sub-confluence, les cellules subissent un passage cellulaire et optionnellement, une procédure d’amplification. Les CSN félines sont rincées au D-PBS et traitées par 0,05% de trypsine-EDTA durant 2-5 min à 37°C. Cela permet de détacher les cellules et de former une population de cellules isolées. Les cellules sont ensuite reprises avec du milieu d’amplification constitué de DMEM, 10% de S VF, 2 mM glutamine et de 0 à 20 ng/ml de facteur de croissance fibroblaste (FGF) et centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min. Les CSN félines sont reprises dans du milieu d’amplification, et comptées par comptage manuel (bleu tryan et cellules de Malassez) ou à l’aide d’un compteur électronique. Elles sont ensuite ensemencées à hauteur de 1500 à 5000 cellules/cm2 et cultivées sur support plastique de culture cellulaire dans du milieu d’amplification et en atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de CO2. Au cours du processus d’amplification les cellules peuvent subir entre 0 et 15 passages cellulaires.
[0171] Congélation et cryoconservation des CSN félines
[0172] A l’issue du premier ou second passage cellulaire (P1-P2), les cellules peuvent être cryoconservées en unités cellulaires d’ensemencement (seed units). Pour ce faire, après comptage, les CSN félines sont centrifugées entre 300-500 g durant 5 à 10 min et le culot cellulaire est repris dans du milieu de congélation composé soit de milieu DMEM enrichi avec 5-20% de SVF et 5-10% (vol : vol) de DMSO ou dans un milieu de cryopréservation commercial, contenant ou non une fraction de DMSO. La concentration cellulaire est comprise entre 1.106 et 15.106 cellules par ml de milieu de congélation. La congélation des cellules est réalisée en condition de descente en température contrôlée, en utilisant par exemple un container CoolCell® Cell Freezing Containers (BioCision) et en suivant la procédure de congélation telle qu’elle est décrite par le fabricant. Les cellules sont alors transférées pour stockage en froid négatif à des températures telles que -196°C pour un stockage à long terme (supérieur à 1 an).
[0173] Les unités cellulaires d’ensemencement sont utilisées pour générer des unités cellulaires à visée thérapeutique. Les unités cellulaires d’ensemencement sont décongelées à 37°C pendant 3-6 min et amplifiées in vitro. Les cellules sont ensemencées en milieu de culture à la densité de 1500-3000 cellules/cm2. Les cellules sont amplifiées par passage successif in vitro. Lorsqu’un nombre significatif de cellules est produit (par exemple >150.106 cellules), les cellules sont congelées selon le protocole décrit précédemment. Les cellules sont distribuées dans des flacons operculables scellés hermétiquement à raison de 1.106-1,5.107 cellules/ml en milieu de congélation exempt en produit d’origine animale (comme par exemple le milieu de cryoconservation Recovery™ Cell culture freezing medium (Thermo Fisher), Cryostem™ freezing medium (Biological Industries), Cryostor™ (Biolife Solution). Les flacons sont descendus en température selon un protocole de descente en température contrôlée, à raison de -l°C/min jusqu’à -80°C. Les flacons sont ensuite transférés à -80°C pour stockage pour une durée maximale de 24 mois.
[0174] B. Caractérisation de la population de CSN félines
[0175] Afin d’évaluer la pureté et la fonctionnalité des CSN félines isolées de placenta félins, des tests sont réalisées sur des aliquotes de cellules en cours d’amplification ou après congélation/décongélation d’une unité d’ensemencement ou d’une unité thérapeutique.
[0176] Analyse cytométrique des CSN félines
[0177] L’expression de marqueurs de surface des CSN félines est réalisée par cytométrie en flux en utilisant les anticorps anti-félin suivants : CD8 (vpg9 ; Biorad), CMH2 (vpg3 ; Biorad); et les anticorps spécifiques à d’autres espèces et croisant avec le chat : CD44 (IM7 ; Biolegend) ; CD29 (TS2/16 ; Biolegend). Pour l’anticorps anti-CMH2 non conjugué, un anticorps secondaire anti-immunoglobulin (IgG) de souris couplé à l’allophycocyanin (APC) (eBiosciences) est utilisé dans un second temps. Des contrôles isotypiques sont utilisés pour régler le bruit de fond pour chaque fluorochrome utilisé : anti-souris IgG2a (COL2002/CQLI205C ; Monoclonal Antibody Center) ; anti-souris IgGl couplé au PE (MOPC-21 ; Biolegend) ; anti-rat IgG2b couplé à l’APC (IM7, Biolegend). [0178] En bref, les CSN félines en culture sont détachées de leur support plastique par trypsination et sont rincées avec du D-PBS. Les cellules sont réparties en tubes à raison de 105-5.105 cellules/tube. Les cellules sont centrifugées (500 g/ 5 min) et reprises dans 25- 100 mΐ de tampon de marquage (D-PBS et de 0,5-1% (v/v) d’albumine de sérum bovin (BSA) ou de 0,5-2% (v/v) de sérum de veau fœtal). L’anticorps primaire couplé ou non à un fluorochrome et ciblant spécifiquement le marqueur membranaire d’intérêt est ajouté. La concentration optimale d’anticorps utilisé pour le marquage doit être préalablement déterminée par un homme du métier. L’incubation nécessaire au marquage doit également être déterminée par l’homme du métier et comprise entre 15 min et 10 h à 4°C à l’abri de la lumière. En particulier, les cellules sont incubées 30 min à 4°C à l’abri de la lumière. Un marquage avec un anticorps secondaire ciblant l’anticorps primaire peut être réalisé, après lavage au D-PBS, dans le cas où l’anticorps primaire n’est pas directement couplé à un fluorochrome. A l’issue de chaque incubation avec un anticorps (primaire et secondaire) ou l’isotype correspondant, les cellules sont lavées 2 fois dans 1ml de D-PBS et centrifugées (500 g/5 min). Les culots cellulaires sont repris dans un volume de 100-500 mΐ de tampon de marquage pour lecture au cytomètre de flux (Accuri C6, BD Biosciences).
[0179] Les figures IA àll montrent un exemple représentatif des résultats d’analyse cytométrique des CSN félines.
[0180] Ainsi, il est mis en évidence la présence des marqueurs CD44 et CD29, et l’absence des marqueurs CMH-II et CD8 à la surface des CSN félines selon l’invention.
[0181] Evaluation de l’activité proliférative des CSN félines
[0182] La prolifération des CSN félines est évaluée pendant 6 à 15 passages cellulaires consécutifs pour déterminer l’activité proliférative des cellules. A chaque passage cellulaire (1 fois par semaine ; soit tous les 6 à 8 jours), les cellules sont détachées de leur support de culture à l’aide de trypsine/EDTA 0,5% pendant 2-3 min. Du milieu de culture est ajouté et les cellules sont centrifugées 5 min/300 g. Le culot cellulaire est repris dans un volume défini de milieu de culture et les cellules sont comptées par technique d’exclusion au bleu trypan à l’aide d’un compteur électronique. Le nombre de doublement à chaque passage cellulaire est calculé selon la formule suivante : Nb de doublements = LOG(Nf/Ni)/LOG(2) (Nf : nombre de cellules finales et Ni : nombre de cellules initiales). Le nombre total de doublements cellulaires est égal à la somme du nombre de doublements cumulés à chaque passage cellulaire. [0183] La figure 2 illustre le nombre de doublements cumulés sur 8 passages cellulaires d’une lignée de CSN félines.
[0184] Ainsi, les CSN félines sont capables de 30 doublements consécutifs en l’espace de 7 semaines (à raison d’un passage par semaine).
[0185] Potentiel de différenciation ostéogénique des CSN félines
[0186] Les CSN félines sont détachées de leur support plastique par trypsination et comptées. Les CSN félines sont ensemencées à une densité comprise entre 1500 et 5000 cellules/cm2 en plaque 6 puits dans du milieu d’amplification sous atmosphère contrôlé à 37°C et contenant 5% de CO2. Lorsque les cellules atteignent 50-75% de confluence, le milieu de prolifération est retiré et remplacé par du milieu de différenciation ostéogénique composé de DMEM, 10% de SVF, 2 mM glutamine, 0,1 mM dexaméthasone (Sigma), 50 mM acide ascorbique 2-phosphate (Sigma) et 10 mM b-glycérophosphate (Sigma). Le milieu est renouvelé 2 fois/semaine, pour une période comprise entre 10 et 15 jours.
[0187] A l’issue du processus de différenciation, les puits sont lavés au D-PBS et les cellules sont fixées avec par exemple une solution de formaline tamponnée neutre 10% pendant lh au minimum. Une coloration avec une solution de rouge Alizarine 1% (poids/volume) est effectuée pour mettre en évidence la présence de dépôts calciques. Les puits sont ensuite rincés en H20 et la coloration est analysée sous microscope. La présence de dépôts calciques permet de conclure à la capacité de se différencier dans le lignage ostéogénique.
[0188] La figure 3 représente un exemple de CSN félines cultivées 14 jours en milieu de différenciation ostéogénique et colorées à G alizarine rouge.
[0189] La présence de dépôts calciques démontre que les CSN félines sont dotées d’une capacité de différenciation ostéogénique.
[0190] Exemple 2 : Evaluation de l’effet clinique d’une injection unique de CSN félines cryoconservées pour la prise en charge de la GSC féline réfractaire aux traitements conventionnels et ayant subi une avulsion dentaire totale ou une avulsion dentaire partielle. [0191] A. Programme des études
[0192] Cette étude clinique pilote est multicentrique, non randomisée. Les chats inclus dans ces études (6 pour avulsion totale et 2 pour avulsion partielle) sont des animaux de propriétaires atteints de GSC, en situation d’échec thérapeutique tel que précisé dans les critères d’inclusion ci-après. Les critères d’inclusion sont précisés dans le paragraphe suivant. Il n’y a pas de restriction en termes de sexe, de race, de poids des animaux.
[0193] Critères d’inclusion : 1- Présenter des lésions inflammatoires spécifiques de GSC (confirmée par un spécialiste en dentisterie) ; 2- Avoir essayé d’autres traitements type ciclosporine, AINS, antibiotiques, IFN oméga sans succès ; 3- Montrer une persistance des signes cliniques après 2 mois de traitement ; 4- Extraction dentaire (partielle ou totale) nécessaire et datant de plus de 3 mois ; 5- Arrêter les traitements à l’IFN ou corticothérapie
[0194] Critères de non-inclusion : 1 -Consentement éclairé non signé par le propriétaire ; 2- Gestation, processus tumoral évolutif, processus infectieux systémique, maladie intercurrente pouvant interférer avec l’évaluation du traitement ; 3- Affaiblissement physique extrême mettant en jeu la vie de l’animal ; 4- Administration d’un traitement non autorisé durant la période d’étude (IFN ou corticothérapie)
[0195] Critères de sortie d’étude : 1 -Reprise d’un traitement incluant ciclosporine, IFN, corticoïdes, lactoferrine durant la période d’étude ; 2-Dégradation de l’état général durant l’essai conduisant à un affaiblissement extrême mettant en jeu la vie de l’animal ; 3- Apparition d’autres affections intercurrentes pouvant interférer avec le suivi de l’évolution : processus tumoral évolutif, processus infectieux systémique
[0196] Les animaux inclus dans l’étude sont évalués par un vétérinaire qui grade le degré de sévérité de la pathologie en utilisant le « stomatitis Disease Activity Index » (SD AI). Ce score permet d’attribuer un score de 0 (animaux sains) à 24 (GSC sévère). Des photos de la gueule du chat sont prises à J0 et à la fin de l’étude (6 mois (M)) pour vérifier l’évolution des lésions. Les propriétaires des animaux inclus dans l’étude reçoivent un questionnaire à remplir pour évaluer l’activité, l’appétit, le comportement et le confort de leur animal. Les animaux reçoivent le traitement cellulaire le jour de l’inclusion. Le suivi des animaux est planifié à 15 jours, 2 mois, 3 mois et 6 mois post-inclusion. Durant l’étude, les animaux sont autorisés à continuer leur traitement anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) à condition que la dose soit précisée dans les documents de l’étude. Le suivi des doses et la fréquence d’administration des traitements au cours de l’étude est un critère d’analyse.
[0197] Le tableau 1 récapitule le calendrier de l’étude et les différentes analyses réalisées à chaque suivi.
[0198] [Tableau 1]
[0199] Les critères d’évaluation d’efficacité sont :
1. L’évaluation du score clinique (SD AI) au cours de l’étude (15j, 2M, 3M, 6M)
2. L’évaluation du score propriétaire au cours de l’étude (15j, 2M, 3M, 6M)
3. L’évolution des besoins médicamenteux des chats au cours de l’étude.
[0200] B. Evaluation du traitement
[0201] Evaluation vétérinaire
[0202] L’évaluation clinique est réalisée par un vétérinaire spécialisé en dentisterie, titulaire du diplôme de spécialiste du collège Européen (European Veterinary Dental College (EVDC)). Les suivis sont programmés à 2 semaines, 2 mois, 3 mois et 6 mois post-traitement. Le vétérinaire remplit une fiche de suivi clinique incluant les critères d’évaluation détaillés ci-après, le poids, les traitements en cours.
[0203] Le critère principal d’évaluation de l’efficacité est l’amélioration des signes cliniques. Cette évaluation est basée sur l’index d’activité de la GSC (SDAI) prenant en compte différents paramètres :
- L’inflammation buccale (maxillaire et mandibulaire) (0 aucun, 1 léger, 2 modéré, 3 sévère) ; - L’inflammation gingivale (maxillaire et mandibulaire) (0 aucun, 1 léger, 2 modéré, 3 sévère) ;
- L’inflammation au niveau de l’arc palatoglosse (0 aucun, 1 léger, 2 modéré, 3 sévère) ;
- L’inflammation de la glande salivaire (0 aucun, 1 léger, 2 modéré, 3 sévère) ;
- L’inflammation oro-pharyngée (0 aucun, 1 léger, 2 modéré, 3 sévère) ;
- L’inflammation linguale ou sublinguale (0 aucun, 1 léger, 2 modéré, 3 sévère).
[0204] Evaluation propriétaire
[0205] Les propriétaires sont également sollicités pour réaliser une évaluation de leur chat sur les critères d’activité, d’appétit, de comportement et de confort. Chaque paramètre est scoré de 0 à 3, aboutissant à un score de 12.
[0206] La figure 4 représente la fiche de suivi complétée par les propriétaires des animaux inclus dans l’étude.
[0207] Préparation du produit cellulaire
[0208] Une dose de CSN félines cryoconservée à -196°C est décongelée à 37°C pendant 3-5 minutes au laboratoire le jour précédent l’administration du traitement dans des conditions garantissant l’asepsie du produit. Un aliquote du produit cellulaire est prélevé pour vérifier la viabilité et la quantité de cellules par la technique d’exclusion au bleu trypan. Les spécifications du produit post-décongélation sont les suivantes : viabilité supérieure à 80%, et nombre total de cellules viables d’au moins 107. Le nombre précis de cellules viables comptées est présenté dans le tableau 2.
[0209] Le tableau 2 ci-dessous illustre les résultats des tests de viabilité cellulaire à décongélation.
[Tableau 2]
[0210] Les cellules conformes aux spécifications sont transférées dans un flacon operculable stérile. Le produit conditionné dans son flacon est transféré dans une boite de transport à température contrôlée (4-12°C). Le traitement est acheminé à la clinique vétérinaire pour une administration au patient à J+l ou J+2.
[0211] Administration des CSN félines
[0212] L’animal peut être sédaté pour le contrôle du bon déroulement de la perfusion. Le vétérinaire choisit le site le plus adapté pour fixer la voie veineuse à T animal. Une poche de soluté de perfusion (Ringer lactate) est utilisée en combinaison avec de l’héparine. La poche est ensuite homogénéisée par retournements puis le vétérinaire connecte le perfuseur à la poche de soluté.
[0213] Le produit cellulaire (entre 1,0.107 et 1,4.107 cellules viables pour une moyenne de 1,2.107.) est sorti de son emballage 15 min avant l’injection. Le vétérinaire homogénéise la suspension cellulaire à l’intérieur du flacon par rotation. Une seringue de volume adapté avec une aiguille de 18 G-20 G (70 mm) est préparée pour aspirer la suspension cellulaire à l’intérieur du flacon. La seringue est ensuite connectée sur le site d’injection en bas de la tubulure. Le vétérinaire pousse lentement le piston afin d’expulser environ 0,2-0, 5 ml de la suspension toutes les 5 min. L’intégralité des CSN félines est administrée en 20-30 min environ. Les animaux sont réveillés et gardés à la clinique pendant 4h minimum pour vérifier leurs paramètres physiologiques. [0214] Analyse des données
[0215] Le critère principal d’évaluation est le score clinique SD AI défini par le vétérinaire lors de chaque suivi. La significativité de la variabilité du SD AI au cours du temps est comparée au score à l’inclusion dans l’étude (JO) à l’aide d’un test non paramétrique de Friedman.
[0216] G Résultats de l’étude
[0217] Information sur les sujets inclus dans l’étude avec avulsion dentaire complète ou partielle.
[0218] Huit chats ont été recrutés sur une période de 10 mois dans 3 centres investigateurs ; 6 femelles et 2 mâles. L’âge moyen des chats inclus dans l’étude est 6,8 ans (3-11 ans). Aucun chat n’a été exclu de l’étude au cours des 6 mois. Parmi les chats inclus dans l’étude, 6 avaient subi une avulsion dentaire totale et 2 chats une avulsion dentaire partielle. Quatre chats ne prenaient aucun anti-inflammatoire (AINS) à l’inclusion ; 2 chats prenaient des AINS à la demande ; et 2 chats suivaient un traitement continu avec des AINS.
[0219] Le tableau 3 détaille les caractéristiques des animaux inclus dans l’étude avec avulsion dentaire complète ou partielle.
[0220] [Tableau 3]
[0221] Durant l’administration du produit, un chat a vomi. Un médicament anti-vomitif lui a été prescrit. Aucun autre évènement indésirable n’a été observé lors des perfusions et des suivis des animaux inclus. Les animaux monitorés pendant ou après la perfusion n’ont pas montrés de modifications de leur paramètres physiologique : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire.
[0222] Le tableau 4 résume les traitements administrés par les propriétaires des chats au cours des 6 mois de suivi. [0223] [Tableau 4]
[0224] Quatre des six chats avec avulsion totale ne prenaient pas d’AINS lors de l’inclusion. Trois de ces 4 chats n’ont pris aucun traitement au cours des 6 mois de suivi (#1, 4 et 5). Un chat a eu recours à 2 traitements AINS au cours des deux premiers mois puis n’en a pas repris (#6).
[0225] Deux chats avec avulsion partielle et deux chats avec avulsion totale étaient sous traitement AINS lors de l’inclusion. Un des chats avec avulsion totale a nettement diminué la dose et la fréquence d’administration (#2), un chat avec avulsion totale ne prend plus d’AINS à 6 mois (#3). Les chats avec avulsion partielle ont soit diminué la dose et la fréquence d’AINS (#1) soit arrêter la prise d’AINS à 6 mois (#2)
[0226] Evolution du score clinique vétérinaire des chats inclus avec avulsion dentaire complète.
[0227] Sur les 6 chats ayant subi une avulsion dentaire complète, 100% ont montré une évolution clinique favorable à la suite de l’administration de CSN félines. Les observations cliniques ont montré une diminution des lésions buccales tel qu’illustré dans la figure 5.
[0228] La diminution du score clinique SD AI confirme l’évolution favorable des animaux traités. La figure 6 illustre l’évolution du score SD AI au cours du temps. Une diminution non significative du SD AI a été observée 15 jours post-traitement (score médian à J15 : 9,5 [4 ; 14] vs score médian à J0 : 11 [9 ;13]). Deux mois post-traitement, une diminution significative du score est observée (score médian à M2 : 5 [0 ; 13] vs score médian à J0 : 11 [9 ; 13] ; p=0,0325). A trois mois post-traitement, une diminution significative du score est observée (score médian à M3 : 6,5 [2 ;9] vs score médian à J0 : 11 [9 ;13] ; p=0,0325). A 6 mois, la signicativité disparait (p=0,143) mais l’effet du traitement semble se poursuivre.
[0229] La figure 7 illustre l’évolution du SDAI par chat au cours de l’étude. Une résolution complète des signes cliniques 2 mois post administration chez un chat (#4 est observée. Chez ce chat, on observe une légère inflammation oropharyngé qui réapparaît à 3 et 6 mois (score 2/24). Au suivi à 3 mois, une légère dégradation chez un chat (#3, score passe de 5 à 9) est observée puis le score diminue à nouveau pour atteindre 7 à 6 mois. Une amélioration de l’état des autres chats est également observée. [0230] La figure 8 représente le taux de récupération clinique de chaque animal ayant subi une avulsion totale aux différents temps de suivi. Le taux de récupération correspond à la différence (en pourcentage) entre le score SD AI évalué à un temps de suivi (2 mois, 3 mois, 6 mois) et le score SD AI à l’inclusion d’un même animal, divisé par le score SD AI à l’inclusion. Ce rapport tient compte de l’amélioration qui s’est produite, si elle a lieu. On observe qu’un seul chat (#6) se dégrade légèrement à 2 mois puis s’améliore de 30% par rapport à l’inclusion dès le suivi à 3 mois. Un chat (#4) présente une récupération complète (rémission clinique) au suivi à 2 mois.
[0231] Suivi propriétaire des chats inclus avec avulsion dentaire complète.
[0232] L’évaluation propriétaire est basée sur 4 critères principaux : l’appétit, l’activité, le confort et le comportement. Chaque critère est noté sur / 3, et permet donc d’obtenir un score /12. Plus le score diminue plus le comportement du chat s’améliore. L’évolution est représentée dans la figure 9. Entre l’inclusion et le suivi à 6 mois, une amélioration du score de tous les chats inclus est observée excepté pour le chat #5 qui n’a montré qu’une amélioration transitoire. Trois chats sont considérés comme sains dès 15 jours (#4), dès 2 mois (#1) ou dès 6 mois (#6). Un chat (#6) inclus avec un score de 2 (peu de signe clinique) se dégrade à J15 et à 2 mois pour finalement atteindre un score de chat sain à 6 mois (score=0). Enfin comme observé avec les scores SD AI, le chat #3 se dégrade à 3 mois pour revenir à son score d’inclusion puis s’améliore de nouveau entre 3 et 6 mois.
[0233] Evolution du score clinique vétérinaire des chats inclus avec avulsion dentaire Partielle.
[0234] Les 2 chats ayant subi une avulsion dentaire partielle ont également montré une évolution clinique favorable à la suite de l’administration de CSN félines. La figure 10 montre une dimintion des lésions buccales à 1 mois suite à l’injection.
[0235] La figure 11, présentant l’évolution du SD AI pour les deux chats ayant subi une avulsion dentaire partielle, montre une résolution quasi complète des signes cliniques à 6 mois post administration avec un score de 3. Alors que le chat #1 a montré une amélioration clinique rapide dès deux semaines, le chat #2 a montré une recrudescence des symptômes à 2 mois qui se sont fortement diminués par la suite. [0236] La Figure 12 représente le taux de récupération clinique de chaque animal ayant subi une avulsion partielle aux différents temps de suivi. Pour les deux chats, une amélioration du taux de récupération est observable à partir de 90 jours.
[0237] Suivi propriétaire des chats inclus avec avulsion dentaire partielle.
[0238] La figure 13 présente l’évolution du score propriétaire pour les deux chats avec avulsion dentaire partielle. Là encore, le chat #2 a montré une diminution transitoire des symptômes pour être considéré par la suite comme sain à 6 mois après injection. L’état de santé du chat #1 s’est rapidement amélioré après deux semaines pour atteindre un score propriétaire de 2 à 6 mois.
[0239] Conclusion
[0240] L’ensemble de ces données montrent qu’une perfusion unique de CSN félines est sûre pour l’animal et entraîne une amélioration clinique chez tous les chats diagnostiqués avec une gingivo stomatite chronique et n’ayant pas répondu aux différents traitements conventionnels. De plus, cette amélioration clinique est observable dès 2 mois et le bénéfice clinique s’observe sur une période d’au moins 6 mois.
Liste des documents cités
Documents brevets
[0241] A toute fin utile, le(s) document(s) brevet(s) suivant(s) est (sont) cité(s) :
- US20160199414A1 (numéro de publication) ; et
- WO2017062475A1 (numéro de publication).
Littérature non-brevet
[0242] A toute fin utile, le(s) élément(s) non-brevet(s) suivant(s) est (sont) cité(s) :
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Claims

Revendications
[Revendication 1] Composition pharmaceutique comprenant une population de cellules stromales néonatales (CSN) félines et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, en particulier une solution comprenant un cryoprotecteur.
[Revendication 2] Composition pharmaceutique selon la revendication 1, dans laquelle lesdites CSN félines sont issues d’un échantillon de tissu néonatal, en particulier d’un ou plusieurs placentas et/ou d’un ou plusieurs cordons ombilicaux, ou sont issues d’un échantillon de liquide biologique néonatal, en particulier le sang d’un ou plusieurs cordons ombilicaux ou le liquide amniotique.
[Revendication 3] Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle lesdites CSN félines proviennent de félins en période de gestation ou de félins au terme de la gestation.
[Revendication 4] Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdites CSN félines sont des CSN félines placentaires.
[Revendication 5] Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant entre 5.104 et 4.107 cellules/ml, en particulier 2,5.106 et 1,5.107 cellules/ml, plus particulièrement 1.107 cellules/ml.
[Revendication 6] Composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu’elle est sous forme congelée.
[Revendication 7] Population de CSN félines ou composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation en thérapie cellulaire chez un sujet.
[Revendication 8] Population de CSN félines ou composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite utilisation est une utilisation thérapeutique allogénique.
[Revendication 9] Population de CSN félines ou composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite utilisation est une utilisation thérapeutique xénogénique.
[Revendication 10] Population de CSN félines ou composition pharmaceutique selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation selon l’une des revendications 6 à 9, dans le traitement d’une stomatite féline.
[Revendication 11] Population de CSN félines ou composition selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation selon la revendication 10, dans laquelle la stomatite féline est une gingivostomatite chronique (GSC) féline.
[Revendication 12] Population de CSN félines ou composition selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation selon l’une des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que une dose unique de 3.106 à 2.107 CSN félines, en particulier de 5.106 à 1,5.107, plus particulièrement 1.107, est administrée, en particulier par voie intraveineuse.
[Revendication 13] Population de CSN félines ou composition selon l’une des revendications 1 à 6, pour une utilisation selon l’une des revendications 10 à 12, dans laquelle le traitement de la stomatite féline est réalisé chez un félin n’ayant pas subi d’avulsion dentaire ou ayant subi une avulsion dentaire partielle.
[Revendication 14] Solution injectable prête à l’emploi comprenant une dose unitaire de 5.105 à 2.107 de CSN félines, plus particulièrement 1.107, en solution avec un cryoprotecteur.
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