EP3902903A1 - Système fluidique de production de vésicules extracellulaires comprenant un agent thérapeutique ou d'imagerie et procédé associé - Google Patents

Système fluidique de production de vésicules extracellulaires comprenant un agent thérapeutique ou d'imagerie et procédé associé

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EP3902903A1
EP3902903A1 EP19850768.3A EP19850768A EP3902903A1 EP 3902903 A1 EP3902903 A1 EP 3902903A1 EP 19850768 A EP19850768 A EP 19850768A EP 3902903 A1 EP3902903 A1 EP 3902903A1
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EP
European Patent Office
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container
therapeutic
liquid medium
extracellular vesicles
imaging agent
Prior art date
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Pending
Application number
EP19850768.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Iris MARANGON
Marie MILLARD
Lina BOLOTINE
Amanda SILVA
Alice GRANGIER
Florence GAZEAU
Claire WILHELM
Max PIFFOUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National Polytechnique de Lorraine
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National Polytechnique de Lorraine
Universite de Paris
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National Polytechnique de Lorraine, Universite de Paris filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3902903A1 publication Critical patent/EP3902903A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/42—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of agitation speed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Definitions

  • the invention relates generally to the production of extracellular vesicles and the loading of at least one therapeutic or imaging agent.
  • the invention relates more precisely to a system for loading extracellular vesicles from producer cells and from a therapeutic or imaging agent, a method for loading a therapeutic or imaging agent and recovery of such vesicles and vesicles produced by such a system, the extracellular vesicles may for example be of interest as vectors for the delivery of therapeutic or imaging agents, as an alternative to cell therapy and in regenerative medicine.
  • Extracellular vesicles are known to release extracellular vesicles into their environment, for example, in vivo, into the biological fluids of an organism. Extracellular vesicles have been identified as effective means of delivering drugs, in a personalized or targeted manner, into the human body. First, they have native biocompatibility and immune tolerance. They can also internalize theranostic nanoparticles, making it possible both to image certain parts of the body and to deliver active principles having therapeutic functions. Extracellular vesicles also have a function of intercellular communication: they allow, for example, to transport lipids, membrane and cytoplasmic proteins and / or nucleotides of the cell cytoplasm, such as non-coding mRNA, microRNA or long RNA , between different cells.
  • Extracellular vesicles also have a function of intercellular communication: they allow, for example, to transport lipids, membrane and cytoplasmic proteins and / or nucleotides of the cell cytoplasm, such as non-coding mRNA, micro
  • extracellular vesicles can make it possible to solve known problems during the therapeutic use of cells, such as cell replication, differentiation, vascular occlusions, the risks of rejection and the difficulties of storage and freezing.
  • functionalized cell vesicles that is to say charged with a compound of interest
  • EVs extra cellular vesicles
  • biological tolerance are now considered to be benefits in delivering biologically active macromolecules, while protecting them from enzymes circulating in body fluids.
  • the two main challenges for therapeutic use are (i) the generation of EVs in sufficient quantity for clinical use and (ii) the loading efficiency of biologically active compounds of interest.
  • the electroporation method is the method that can be used for charging EVs after production.
  • This method was used to load various compounds into EVs such as siRNA (Shtam et al., 2013) DNA (Lamihhane et al., 2015) and doxorubicin (Tian et al., 2014).
  • siRNA Shtam et al., 2013
  • DNA Lihhane et al., 2015
  • doxorubicin Tian et al., 2014
  • International application WO 2004/083379 also describes a method of charging an exogenous agent in extracellular vesicles comprising the application of an electric charge.
  • Another method for obtaining functionalized EVs (that is to say vesicles charged with a compound of interest) consists in destroying the EVs in order to functionalize them (Haney et al., 2015). This method is easy to implement, but does not preserve the bladder structure, which causes the loss of asymmetry of the membrane and of the proteins with a poor rearrangement of the membrane proteins.
  • Smyth et al. disclose a method of loading EVs by chemistry-click. This method consists in charging the membrane proteins of the EVs with a specific functional group in order to fix to these proteins the compound of interest. However, this method does not charge the lumen of the vesicles.
  • An object of the invention is to provide a solution for loading therapeutic and / or imaging agents into the membrane or into the lumen of the extracellular vesicles and thus functionalize extracellular vesicles in large quantities from producer cells, more quickly and More effectively than with known methods, under conditions conforming to GMP standards.
  • Another object of the invention is to provide a solution making it possible to increase the yield of the system for loading therapeutic and / or imaging agent in vesicles, that is to say the ratio between the number of vesicles loaded with therapeutic and / or imaging agent and the number of uncharged vesicles.
  • Another object of the invention is to provide a solution for loading, producing and recovering extracellular vesicles loaded with therapeutic agent and / or imaging continuously or discontinuously.
  • another object of the invention is to simplify the structure of the fluidic system for loading and producing vesicles loaded with therapeutic and / or imaging agent and to reduce its manufacturing cost.
  • the invention provides a solution for loading the extracellular vesicles produced by the fluidic system with a therapeutic agent and / or imaging agent.
  • an object of the invention is a fluid system for loading a therapeutic and / or imaging agent into the membrane or into the lumen of the extracellular vesicles (EVs) from producer cells, comprising at least one container. , a liquid medium contained in the container, producer cells, a liquid medium agitator suitable for the growth of producer cells, characterized in that it also comprises means for controlling the speed of the agitator, the agitator, and the dimensions of the container being adapted to generate a turbulent flow of the liquid medium in the container to exert shear stresses on the producing cells in order to achieve loading a therapeutic and / or imaging agent into the membrane or into the lumen of the extracellular vesicles (EV) produced simultaneously by the fluidic system.
  • the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 100 ⁇ m, and preferably less than or equal to 70 ⁇ m; more preferably less than or equal to 60 ⁇ m;
  • the fluidic system comprises an outlet and a connector connected to the outlet, the connector being capable of comprising liquid medium and extracellular vesicles;
  • the fluidic system includes microcarriers on which will attach adherent producer cells;
  • the agitator is preferably a rotary agitator whose rotation speed (s), shape, size are adapted, with the shape and dimensions of the container, to the generation of a turbulent flow of the liquid medium in the container;
  • the microcarriers are microbeads, the diameter of the microbeads being between 100 ⁇ m and 300 ⁇ m;
  • the fluid system includes a separator of extracellular vesicles, fluidly connected to the container so as to be capable of reintroducing into the container a liquid medium depleted in extracellular vesicles (EV).
  • the fluid system can include a closure means upstream of the separator making it possible to close or open the connectors and thus obtain a continuous or discontinuous vesicle recovery system.
  • Another object of the invention is a method of loading a therapeutic and / or imaging agent into the membrane or into the lumen of the extracellular vesicles (EV) from producer cells, comprising:
  • the Kolmogorov length of the flow being less than 100 pm, preferably less than or equal to 70 pm, more preferably less than or equal to 60 pm in a container, the container comprising an outlet, the liquid medium comprising the therapeutic and / or imaging agent, producer cells, and
  • the agitator is controlled to cause a flow of the constant, intermittent liquid medium, of increasing or decreasing intensity, the Kolmogorov length of the flow being less than 100 ⁇ m, preferably less than or equal to 70 ⁇ m, more preferably less than or equal to 60 pm; - A separator which makes it possible to deplete part of the liquid medium collected at the outlet of the container in extracellular vesicles, and the liquid thus depleted being reintroduced part of the liquid medium in the container.
  • an ultracentrifugation or tangential filtration step is carried out after collection to separate the vesicles, the producing cells and the therapeutic and / or imaging agents in the liquid medium.
  • the extracellular vesicles (EV) at the outlet of the container comprise a mixture of extracellular vesicles loaded with a therapeutic and / or imaging agent or uncharged extracellular vesicles.
  • the flow makes it possible to simultaneously load the therapeutic agent and produce the extracellular vesicles (EV) in a container.
  • EV extracellular vesicles
  • an object of the invention is a method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent directly using a suspension of previously produced extracellular vesicles.
  • An object of the invention is therefore a method of loading into the membrane or into the lumen of extracellular vesicles (EV), comprising:
  • Another subject of the invention is a process for loading at least one therapeutic and / or imaging agent into the membrane or into the cytoplasm of producer cells, comprising:
  • the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 100 ⁇ m, preferably less than or equal to 70 ⁇ m, more preferably less than or equal to 60 ⁇ m in a container, the container comprising an outlet , the liquid medium comprising the therapeutic and / or imaging agent, producer cells, and
  • the agitator is controlled to cause a flow of the constant, intermittent liquid medium, of increasing or decreasing intensity, the Kolmogorov length of the flow being less than 100 ⁇ m, preferably less than or equal to 70 ⁇ m, more preferably less than or equal to 60 pm.
  • the system or the methods of the invention make it possible to obtain vesicles and / or producer cells charged with at least one therapeutic and / or imaging agent at particularly higher concentrations (the increases measured vary from 39% to 592%) compared to vesicles and / or cells charged / passively produced.
  • said producing cells and extracellular vesicles are of very particular interest and therefore constitute an object of the present invention.
  • the vesicles of the invention are more particularly of interest as a vector for at least one therapeutic and / or imaging agent. These uses also constitute an object of the invention.
  • vesicles loaded according to the methods of the invention exhibit improved pharmacodynamic and therapeutic properties compared to liposomal formulations, as the data relating to temoporfin show.
  • a particular object of the invention is the method according to the invention in any of its embodiments, an extracellular vesicle, producer cell obtained according to this method for which said therapeutic agent is selected from temoporfine, amphotericin B, daunorubicin, irinotecan, vincristine, cytarabine.
  • extracellular vesicle generally designates a vesicle released endogenously by a producer cell, the diameter of which is between 30 nm and 5000 nm.
  • An extracellular vesicle corresponds in particular to an exosome and / or a microvesicle and / or a cellular apoptotic body. It is known in the art that the extracellular vesicles contain the membrane and / or cytoplasmic markers originating from the producer cells. These markers allow on the one hand to identify and characterize these vesicles and are the guarantors of their functionality.
  • the vesicles according to the invention are more effective than liposomes for example, and allow an improvement in the pharmacokinetics / pharmacodynamics (PK / PD) of the molecules which they vectorize.
  • the term producer cell generally independently designates either a cell which is not adherent to a medium, or a cell adherent to a medium and which can divide and multiply.
  • the term producer cells denotes cells of human, animal or plant origin or coming from bacteria or other microorganisms capable of secreting extracellular vesicles. In the case of adherent cells, these can be adherent to microcarriers themselves suspended in the liquid culture medium.
  • the term producer cells denotes cell aggregates.
  • the term cellular aggregates designates an assembly of several producer cells which adhere firmly to one another. A gentle mixture created by the agitator allows the producing cells, adherent or not, to remain in suspension in the liquid culture medium.
  • microcarrier and microsupport designate a spherical matrix allowing the growth of producer cells adherent to its surface or inside and whose size is between 50 pm and 500 pm, and preferably between 100 pm and 300 pm.
  • the microcarriers are generally beads whose density is chosen to be substantially close to that of the liquid culture medium of the producer cells. Thus, a gentle mixture allows the beads to remain in suspension in the liquid culture medium.
  • therapeutic agent or imaging agent generally designates any agent of interest which can be charged, inserted into the extracellular vesicles. These agents can be therapeutic, imaging molecules, nanoparticles for therapeutic purposes, imaging, etc. As the experimental data show, the invention is capable of allowing improved loading of a large variety of sizes of therapeutic or imaging agent, such as small molecules, polymers, proteins, etc. regardless of the type of producer cell.
  • the vesicles according to the invention can be used for any kind of therapy; for example, and in a nonlimiting manner, it can be the therapy of infectious, inflammatory, immunological, metabolic, cancerous, genetic, degenerative or secondary diseases to surgeries or traumas.
  • the vectorization of molecules of low bioavailability is particularly preferred.
  • imaging agents and / or tracers can be loaded into the extracellular vesicles according to the invention, for example, and in a nonlimiting manner, fluorescent, luminescent agents, radioactive isotopes, contrast agents with magnetic, plasmonic, acoustic or radio opaque properties. It may also be proteins or other biological or synthetic molecules coupled to these agents including targeting agents in order to change the biodistribution of the vesicles.
  • agitator very generally designates a means of agitating the liquid. It can be a mechanical part at least partially in contact with part of the liquid and which makes it possible to set this liquid in motion. This is for example the case with a rotary agitator.
  • a shake-flask type reactor uses a shaking movement to induce movement of the liquid and its mixture; an air-lift reactor uses the injection of gas bubbles into the liquid to produce movement of the liquid and its mixture.
  • reactor configurations which may take advantage of the use of a flexible enclosure to contain the liquid, associated with a deformation of the enclosure. flexible to produce liquid movement and mixing.
  • a mixing movement can be obtained by means of a cyclic variation of inclination of the reactor with respect to gravity, so as to create waves in the liquid, and promote flow and mixing.
  • static structures present in the reactor for example baffles, or structures forming partial barriers to the movement of the liquid, such as those used in a static mixer, can naturally also be used.
  • agitator must be understood in an extremely general sense, which is that of a means or a combination of any means allowing to generate the combination of a flow, of the mixture of the medium, and the generation of turbulence in a liquid media.
  • FIG. 1 schematically illustrates a fluidic system for loading an agent therapeutic and / or imaging in the membrane or in the lumen of extracellular vesicles from producer cells in suspension;
  • FIG. 2 schematically illustrates a fluidic system for loading a therapeutic and / or imaging agent into the membrane or into the lumen of extracellular vesicles from adherent producer cells and comprising microcarriers;
  • FIGS. 3A, 3B respectively illustrate the size distribution of the EVs obtained by NTA, the morphological analysis by cryo-TEM;
  • Figure 4 illustrates the fluorimetric analysis of vesicles loaded with mTHPC.
  • Figure 5 illustrates the biodistribution of a liposomal formulation of the commercial mTHPC (Foslip ®, A and B) and vesicles with mTHPC (C and D) studied as a function of the intensity of fluorescence in selected tissues according long after intravenous injection (0.3 mg / kg of the agent of interest) in mice carrying HT29 tumors.
  • FIG. 6 illustrates the biodistribution of the loaded vesicles according to the invention with mTHPC (A and B) studied as a function of the intensity of the fluorescence in tissues selected as a function of the time after intravenous injection (0.3 mg / kg of l agent of interest) in mice carrying HT29 tumors.
  • FIG. 7 illustrates the plasma concentration of mTHPC expressed as a function of time after the intravenous injection of the liposomal formulation of mTHPC or of mTHPC-EV (0.3 mg / kg of mTHPC) in mice carrying HT29 tumors.
  • Figure 8 illustrates Kaplan-Meier diagrams of HT29 tumor growth retardation after treatment with free mTHPC; the liposomal formulation of mTHPC (Liposome mTHPC) and mTHPC vesicles with laser activation of the drug (photodynamic therapy), compared to the same groups without laser activation (control, dotted lines).
  • FIG. 9 illustrates the impact of the Kolmogorov length on the doxorubicin loading of the HUVECs (cellular doxorubicin concentration).
  • FIG. 10 illustrates the impact of the Kolmogorov length on the doxorubicin loading of the HUVEC extracellular vesicles (doxorubicin concentration for 10 6 vesicles).
  • FIG. 11 illustrates the impact of the Kolmogorov length on the number of extracellular vesicles of HUVEC formed, measured in NTA (gray bars) or in an arbitrary luciferase luminescence unit. A comparable number of vesicles is obtained for an L k of 48 pm, whether in the absence or in the presence of the cargo ship (FITC-dextran 70kDa).
  • Figure 12 illustrates the impact of the Kolmogorov length on the FITC-dextran 70kDa loading of HUVEC extracellular vesicles measured by the fluorescence of FITC (arbitrary units) contained in the vesicles.
  • the Kolmogorov length (or Kolmogorov dimension or Adeddy length) is the length from which the viscosity of a fluid makes it possible to dissipate the kinetic energy of a flow of this fluid.
  • the Kolmogorov length corresponds to the size of the smallest vortices in a turbulent flow.
  • This length L k is calculated in the publication by Kolmogorov (Kolmogorov, AN, 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) and described by the following formula (I):
  • L k n 3/4. e - 1/4 (I) wherein is the kinematic viscosity of the liquid flowing medium and e is the average rate of energy dissipation in the fluid per unit mass (or energy injection rate in the fluid) .
  • N p is the dimensionless power number (or Newton number) of the agitator in the liquid medium
  • D is the diameter of the agitator (in meters)
  • N is the speed of rotation (in number of revolutions per second)
  • V is the volume of liquid medium (in cubic meters).
  • the skilled person with his general knowledge and with alternative calculation methods can calculate the Kolmogorov length based on an average rate of energy dissipation per unit volume.
  • the calculation presented above is only one way among many known to those skilled in the art to calculate the length by Kolmogorov and illustrates an embodiment of the invention without limiting its scope.
  • the skilled person will be able to apply the N p supplied by the supplier of the agitator and thus determine how to obtain a desired L k .
  • Figures 1 and 2 schematically illustrate a fluidic system (1) for loading extracellular vesicles (EV).
  • the fluidic system (1) for loading extracellular vesicles (EV) aims at producing a large quantity of extracellular vesicles (EV) loaded in a container (4).
  • the invention is not limited to this embodiment and may include a series of containers (4) fluidly connected in parallel or in series.
  • the container (4) contains a liquid medium (5).
  • the container (4) can in particular be a tank, a flange, for example made of glass or plastic, or any other container adapted to contain a liquid medium (5).
  • the volume of the container (4) is one of the factors making it possible to produce extracellular vesicles (EV) in large quantities: this volume can be between 50 mL and 500 L, preferably between 100 mL and 100 L, and preferably between 300 mL and 40 L.
  • the volume of the container (4) illustrated diagrammatically in FIG. 1 or 2 is 1 L. In the nonlimiting example of the embodiment presented in FIG.
  • the liquid medium (5) can be extracted from the container (4) by a first pump (16), via a connector (13), so as to transport the liquid medium (5) in a collector (19).
  • Another pump (16 ') allows the liquid medium (5) contained in the collector (19) to be conveyed to the inlet (10) of the separator (15), via another connector.
  • the first outlet (11) of the separator (15) is connected to the container (4) via a connector, so as to reintroduce liquid medium 5 depleted in extracellular vesicles (EV) in the container (4).
  • the second outlet (12) of the separator (15) is connected to the collector (19) via a connector, so as to enrich the liquid medium (5) contained in the collector (19) in extracellular vesicles (EV).
  • the inlet (10) of the separator (15) can be directly connected to the outlet (9) of the container (4) (or via a first pump (16)).
  • the first outlet (11) of the separator (15) is connected to the container (4) and the second outlet (12) of the separator (15) is connected to the collector (19).
  • separators can also be arranged in series to vary the degree of separation into extracellular vesicles EV in the liquid medium 5, and / or in parallel to adapt the flow of liquid medium 5 in each separator 15 to the flow of a first pump 16
  • a filter (18) can be arranged at the outlet (9) so as to filter the producer cells (6) and the cellular debris during the extraction of extracellular EV vesicles from the container (4).
  • the container (4) typically comprises one or more gaseous inlets and one or more gaseous outlets, through which an atmosphere comprising air, N2, O2 and CO2 concentrations suitable for cell culture, for example comprising 5%, can flow. of CO2.
  • This atmosphere can come from a suitable gas injector / mixer or from an oven with controlled CO2 atmosphere.
  • a pump (17) controls this gas flow in the container (4).
  • the container (4) also includes an outlet (9) capable of comprising liquid medium (5) and extracellular vesicles (EV). This outlet can be completed with a means of separation and / or filtration of the cells in suspension making it possible not to recover cells in suspension outside the container (4). This outlet (9) makes it possible to extract from the container (4) the extracellular vesicles (EV) produced.
  • the container (4) can also include at least one inlet (8) adapted to introduce the liquid medium (5) into the container (4).
  • the liquid medium (5) can generally be a saline solution, for example isotonic.
  • the liquid medium 5 is either a liquid culture medium with the addition of compounds allowing the culture of the cells of interest, or a medium supplemented with serum or platelet lysate previously purified from the extracellular vesicles or a medium without serum, making it possible not to contaminate the extracellular vesicles (EV) produced by fluid system 1 by proteins or other vesicles from a serum.
  • a liquid medium (5) of DMEM type without serum can be used.
  • the maximum volume of liquid medium (5) is partly determined by the container (4).
  • This maximum volume can also be between 50 mL and 500 L, preferably between 100 mL and 100 L, and more preferably between 300 mL and 40 L.
  • the minimum volume of liquid medium (5) contained by the container (4) is part determined by the choice of the agitator (7) allowing the liquid medium (5) to be agitated.
  • the fluidic system (1) can comprise, according to a particular embodiment of the microcarriers (3) suspended in the liquid medium (5).
  • Microcarriers are particularly advantageous when the producer cells (6) are adherent cells.
  • the microcarriers (3) can be microbeads (14), for example made of Dextran, each microbead (14) being able to be covered with a layer of collagen or other material necessary for the culture of cells.
  • Other materials can be used for the manufacture of microcarriers (3), such as glass, polystyrene, polyacrylamide, collagen and / or alginate.
  • all of the microcarriers (3) adapted for cell culture are adapted to the production of extracellular vesicles (EV).
  • the density of the microcarriers (3) may for example be slightly higher than that of the liquid medium (5).
  • the density of the microbeads (14) in Dextran is for example 1.04. This density allows the microbeads (14) to be suspended in the liquid medium (5) by slightly agitating the liquid medium (5), the drag of each microcarrier (3) in the liquid medium (5) being dependent on the density of the microcarrier (3).
  • the maximum size of microcarriers (3) can be between 50 pm and 500 pm, preferably between 100 pm and 300 pm, and preferably between 130 pm and 210 pm.
  • the microcarriers (3) can for example be microbeads (14) of Cytodex 1 type (registered trademark).
  • a powder formed by these microbeads (14) can be rehydrated and sterilized before use. They can be rehydrated in PBS, then transferred to a culture medium (for example DMEM) without serum, in which the microbeads are stored at 4 ° C. before use.
  • a culture medium for example DMEM
  • the fluid system (1) also includes producer cells (6).
  • the producing cells (6) can be, according to one embodiment, cells adhering to the microcarriers (3) or according to another embodiment of the cells in suspension.
  • the EV extracellular vesicles are loaded and produced by the fluidic system (1) from these producer cells (6) (adherent or in suspension).
  • the producer cells (6) can be cultured, before loading and producing extracellular vesicles (EV) loaded by the fluid system (1), on the surface of the microcarriers (3) in a suitable cell culture medium or in suspension in a cell culture medium suitable for cells in suspension.
  • EV extracellular vesicles
  • the majority of producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), even if a minority proportion of producer cells (6) can be detached, for example by agitation of the liquid medium ( 5).
  • the other producing cells are then and suspended in the liquid medium (5) or sedimented at the bottom of the container (4).
  • at least 50% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably at least 60% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably at least 70% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3) , preferably at least 80% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably at least 85% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably to the at least 90% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably at least 95% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably at least 96% of the producer cells (6) are adherent to the surface of the microcarriers (3), preferably at least 97%
  • less than 50% of the producer cells (6) are in suspension preferably less than 40% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 30% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 20% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 15% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 10% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 5% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 4% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 3% of the producer cells (6) are in suspension, preferably less than 2% producer cells (6) are in suspension, preferably less than 1% of producer cells (6) are in suspension, preferably producer cells (6) are not in suspension.
  • the fluidic system (1) is adapted so as to generate gentle agitation making it possible to homogenize the producer cells 6 in the medium.
  • liquid (5) within the container (4) In general, any type of producer cell (6) can be used, including non-adherent producer cells.
  • the producing cells in suspension are then suspended in the liquid medium (5) or sedimented at the bottom of the container (4).
  • the container (4) also includes an agitator (7) for agitating the liquid medium (5).
  • the agitator (7) can be a blade such as a paddle wheel, the blades of which are at least partly immersed in the liquid medium (5), and set in motion by a transmission of magnetic or mechanical forces.
  • the agitator (7) can also be a liquid medium infusion system (5) at a rate sufficient to agitate the liquid medium (5) contained by the container, or a system with rotating walls (for example arranged on rollers) .
  • the agitator (7) can alternatively be of the bottle roller or bottle roller type, orbital agitator for Erlenmeyers, with or without baffles (shaken flask), rocker agitator (wave), bioreactor with pneumatic agitation (air lift) or a rotary paddle agitator such as a marine propeller type agitator, Rushton turbine, stirring anchors, barrier agitator, helical ribbon propeller.
  • a preferred rotary agitator is a turbine with vertical blades.
  • static structures can be present in the container (4), for example baffles, or structures forming partial barriers to liquid movement, such as those used in a static mixer, can naturally also be used.
  • the agitator (7) and the dimensions of the container (4) are adapted to control a turbulent flow of the liquid medium (5) in the container (4).
  • the person skilled in the art by his general knowledge knows how to calculate the length of Kolmogorov L k adapted for each type of agitator (7) as a function of the dimensions of the container (4), the geometry of the agitator (7) and the intensity of the agitation.
  • turbulent flow is meant a flow whose Reynolds Re number is greater than 2000.
  • the number of Reynolds can for example be calculated by formula (IV).
  • the Reynolds Re number of the flow of liquid medium (5) is greater than 7,000, preferably over 10,000 and preferably over 12,000.
  • agitators (7) for controlling a turbulent flow according to the present invention are agitators well known to those skilled in the art and capable of being implanted in the system according to the present invention.
  • the agitator (7) used in the exemplary embodiments of the invention comprises a blade such as a paddle wheel arranged in a container 4 and set in motion by a magnetic force transmission system.
  • the speed of the blade in the liquid medium (5) causes the liquid medium (5) to flow.
  • the agitator is adapted to control a flow, which, taking into account the dimensions of the container (4), is turbulent. In the case of the agitator (7) illustrated in FIG.
  • the agitator (7) is adapted to control a flow in which the length L k is less than 100 ⁇ m, preferably less than or equal to 80 ⁇ m. Even more preferably, the agitator 7 is adapted to control a flow in which the length L k is less than or equal to 70 ⁇ m and very preferably less than or equal to 60 ⁇ m. So particularly preferred, the flow has an L k less than or equal to 55 ⁇ m, also preferably less than or equal to 50 ⁇ m.
  • the speed of rotation of the agitator (7) is capable of being controlled at 100 rpm (rotations per minute), the diameter of a blade such as, for example, a paddle wheel is 10.8 cm and the volume of liquid medium contained by the container (4) is 400 mL.
  • the number of NP power measured from the blade in the liquid medium 5, by formula (III), is substantially equal to 3.2.
  • the energy dissipated per unit of mass e, calculated, by formula (II), is equal to 5.44.10 1 J. kg -1 .
  • the Kolmogorov length L k calculated by formula (I) is thus equal to 41.8 ⁇ m.
  • the container (4) can be for single use or sterilized before any introduction of liquid medium (5), microcarriers (3), producer cells (6) and the therapeutic agent or imaging agent.
  • the microcarriers (3) in this case microbeads (14), are also sterilized.
  • the microbeads (14) are incubated in the culture medium of the producer cells (6), comprising serum, in the container (4). This incubation makes it possible to oxygenate the culture medium and to cover the surface of the microbeads (14) with an at least partial layer of proteins, promoting the adhesion of the producer cells (6) to the surface of the microbeads (14). .
  • the producing cells (6) before being introduced into the fluidic system (1), are suspended by means of a medium comprising trypsin. They can then be centrifuged at 300 ⁇ for five minutes to be concentrated in the pellet of a tube, so as to replace the medium comprising trypsin with a DMEM medium.
  • the producer cells (6) are then introduced into the container (4), comprising culture medium and the microbeads (14), in an amount corresponding substantially to 5 to 20 producer cells (6) by microbead (14).
  • the producer cells (6) and the microbeads (14) are then agitated and then sedimented, so as to bring the microbeads (14) into contact with the producer cells (6), and promote the adhesion of the producer cells (6) to the surface of the microbeads (14). Agitation can resume periodically, so as to promote the homogeneity of the adhesion of the producer cells (6) to the surface of the microbeads (14), for example every 45 minutes for 5 to 24 hours.
  • the culture of the producer cells is then carried out with gentle agitation of the culture medium (for example the rotation of a blade such as a paddle wheel at a speed of 20 rpm), as well as a regular replacement of the culture medium. (for example a replacement of 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% or 40% of the culture medium each day).
  • the fluidic system (1) for the loading and production of extracellular vesicles (EV) aims at the production in large quantity of extracellular vesicles (EV) in a container (4).
  • the invention is not limited to this embodiment and also makes it possible to load a large quantity of therapeutic and / or imaging agents into the extracellular vesicles (EV) produced according to the invention.
  • the producer cells (6) and the therapeutic or imaging agent are simultaneously suspended in the liquid medium (5) and mixed in the container (4).
  • the producer cells (6) can be added sequentially to the liquid medium (5), that is to say before or after the addition of the therapeutic agents and / or imaging agents to the said liquid medium (5) .
  • any type of therapeutic and / or imaging agent can be used, the therapeutic agents possibly being in particular molecules or particles for treating infectious diseases, inflammatory diseases, metabolic diseases, degenerative diseases, diseases traumatic, post-surgical diseases, genetic diseases, malignant tumors, orphan diseases, diseases of the vascular system, diseases of the lymphatic system, diseases of the locomotor system, diseases of the digestive system, diseases of the nervous system, diseases of the reproductive system, diseases of the excretory system and / or agents (molecules or particles ) nuclear, magnetic, optical and acoustic imaging.
  • the container (4) also comprises an agitator (7) as described above and making it possible to agitate the liquid medium (5) comprising the producing cells in suspension (6) and the therapeutic or imaging agent.
  • the fluid system (1) is adapted so as to generate a sufficiently gentle stirring to homogenize the medium without damaging the producing cells but sufficient to induce shear stresses allowing in the liquid medium (5) within the container
  • the invention is also a process for the ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells (6), comprising:
  • a centrifugation the speed of which is adapted to separate the extracellular vesicles on the one hand and the producer cells and / or the producer cells adhering to the microcarriers on the other hand is applied.
  • the Kolmogorov length of the flow is less than or equal to 80 ⁇ m, or even less than or equal to 70 ⁇ m and, preferably, less than or equal to 60 ⁇ m. In a particularly preferred mode, said Kolmogorov length is less than or equal to 55 ⁇ m. In a mode also preferred, said Kolmogorov length is less than or equal to 50 ⁇ m.
  • the method according to the invention comprises a step of loading a therapeutic and / or imaging agent.
  • this step can also be implemented before the step of producing extracellular vesicles.
  • the vesicle producing cells are therefore loaded into their membrane and / or their cytoplasm with a therapeutic and / or imaging agent of interest prior to the implementation of the process for producing extracellular vesicles.
  • the loading takes place either by methods known in the art, such as for example passive loading, or, preferably, according to the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent in the membrane or in the cytoplasm of producer cells (6), comprising:
  • a speed control of an agitator (7) causing a turbulent flow of a liquid medium (5) in a container (4) to exert shear stresses on the producer cells (6) in order to carry out the loading of a therapeutic and / or imaging agent in the membrane or in the cytoplasm of producer cells (6), the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 100 ⁇ m, in a container (4), the container comprising a outlet (9), the middle liquid (5) comprising the therapeutic and / or imaging agent, producer cells (6), and
  • the Kolmogorov length of the flow is less than or equal to 80 ⁇ m, or even less than or equal to 70 ⁇ m and, preferably, less than or equal to 60 ⁇ m.
  • L k is less than or equal to 55 ⁇ m.
  • L k is less than or equal to 50 ⁇ m.
  • the loading step can be implemented after the step of producing extracellular vesicles.
  • This embodiment may be of interest in cases where it is desired to obtain a 1 st generation uncharged vesicles followed by a 2 nd production of extracellular loaded vesicles of said therapeutic agent and / or imaging, and in as part of the establishment of a fluidic system with a collection of the liquid medium (5) continuously.
  • the vesicles are loaded by being subjected to shear stresses by controlling the speed of an agitator (7) causing a turbulent flow of a liquid medium (5) in the container (4) in which are the extracellular vesicles in order to effect the loading, into the lumen or the membrane of the extracellular vesicles (EV), of a therapeutic and / or imaging agent also contained in the liquid medium (5), the Kolmogorov length of the flow being less than 100 ⁇ m in a container (4).
  • the Kolmogorov length of the flow is less than or equal to 80 ⁇ m, or even less than or equal to 70 ⁇ m and, so preferred, less than or equal to 60 ⁇ m.
  • L k is less than or equal to 55 ⁇ m.
  • L k is less than or equal to 50 ⁇ m.
  • the flow which allows the producer cells (6) to produce extracellular vesicles also makes it possible to simultaneously load the therapeutic or imaging agent into the producer cells (6) and by Consequently, producing said extracellular vesicles (EV) in a container (4) loaded with the therapeutic and / or imaging agent.
  • the step of loading said therapeutic and / or imaging agent is simultaneous with the step of producing extracellular vesicles.
  • An object of the invention is therefore also the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent into the membrane and / or into the cytoplasm of producer cells (6) and / or into the membrane or the lumen extracellular vesicles of said cells, comprising:
  • a speed control of an agitator (7) causing a turbulent flow of a liquid medium (5) in a container (4) to exert shear stresses on the producing cells (6) and the extracellular vesicles in order to produce loading of a therapeutic and / or imaging agent in the membrane or in the cytoplasm of the producer cells (6) and the lumen and / or the membrane of the vesicles of said cells, the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 100 ⁇ m, in a container (4), the container comprising an outlet (9), the liquid medium (5) comprising the therapeutic and / or imaging agent, producer cells (6), and
  • the Kolmogorov length of the flow is less than or equal to 80 ⁇ m, or even less than or equal to 70 ⁇ m and, preferably, less than or equal to 60 ⁇ m.
  • L k is less than or equal to 55 ⁇ m.
  • L k is less than or equal to 50 ⁇ m.
  • the extracellular vesicles (EV) at the outlet (9) of the container (4) comprise a mixture of extracellular vesicles loaded with a therapeutic and / or imaging agent and extracellular vesicles not loaded with a therapeutic agent and / or d 'imagery.
  • Extracellular vesicles are produced in a container (4) containing a liquid medium (5), for example without serum, producer cells (6).
  • the stirring of the liquid medium (5) is then controlled by the stirrer (7) so as to cause a turbulent flow in the container (4).
  • the agitation is preferably adjusted so as to control a flow of the liquid medium (5) in which the Kolmogorov length L k is less than 100 ⁇ m and preferably less than or equal to 60 ⁇ m.
  • the stirring of the liquid medium (5) is controlled at least for 20 minutes, preferably for more than an hour, and preferably for more than two hours. According to a particular aspect, the agitation lasts two hours.
  • the loading and production of charged extracellular vesicles (EV) cannot be measured during production. To this end, the agitation can be temporarily interrupted.
  • the producing cells 6 are allowed to sediment and / or centrifuged at the bottom of the container (4), then a sample of liquid medium 5 comprising extracellular vesicles is taken. (EV). Centrifugation of the sample is carried out at 2000 g for 10 minutes, so as to remove cellular debris.
  • the supernatant is analyzed by an individual particle tracking method (or NTA, acronym for Nanoparticle Tracking Analysis) so as to count the number of extracellular vesicles (EV) and to deduce the concentration of extracellular vesicles (EV) in the samples. . It can be checked that the concentration of extracellular vesicles (EV) at the start of agitation is close to zero or negligible.
  • NTA acronym for Nanoparticle Tracking Analysis
  • the extracellular vesicles (EV) produced can also be observed and / or counted by cryo-transmission electron microscopy.
  • a drop of 2.7 ⁇ L of solution comprising EV extracellular vesicles is deposited on a grid suitable for cryo-microscopy, then immersed in liquid ethane, causing said drop to be almost instantaneous, avoiding the formation of ice crystals.
  • the grid supporting the extracellular vesicles (EV) is introduced into the microscope and the extracellular vesicles (EV) are observed at a temperature of the order of -170 ° C.
  • the extracellular vesicles (EV) loaded and produced in the container 4 can be extracted from the container (4) by the outlet (9) of the container (4), suspended in liquid medium (5).
  • a filter (18) can be arranged at the outlet (9) so as to filter the producer cells 6 and the cellular debris during the extraction of EV extracellular vesicles from the container (4).
  • a connector (13) is fluidly connected to the outlet (9), allowing the transport of the liquid medium (5) comprising the extracellular vesicles (EV) produced.
  • the fluid system (1) may further include a separator (15) of extracellular vesicles (EV).
  • the separator (15) comprises an inlet to the separator (10), in which the liquid medium (5) comprising extracellular vesicles (EV) from the container (4) can be routed directly or indirectly.
  • the separator (15) may also include a first outlet (11) from the separator, through which the liquid medium (5) is capable of leaving the separator (15) with a concentration of extracellular EV vesicles smaller than at the inlet (10) of the separator (15), or even substantially zero.
  • the separator (15) can also include a second outlet (12) from the separator (15), through which the liquid medium (5) is capable of leaving the separator (15) with a higher concentration of extracellular vesicles (EV) than at the inlet (10) of the separator (15).
  • a second outlet (12) from the separator (15) through which the liquid medium (5) is capable of leaving the separator (15) with a higher concentration of extracellular vesicles (EV) than at the inlet (10) of the separator (15).
  • the separator (15) of EV extracellular vesicles can be fluidly connected to the container (4) so as to be capable of reintroducing a liquid medium (5) depleted in EV vesicles in the container (4), for example by l 'inlet (8) of the container (4).
  • the production and / or extraction of charged extracellular vesicles (EV) can be carried out continuously, with a substantially constant volume of liquid medium (5) in the container (4).
  • the fluidic system does not include a separator (15) of extracellular vesicles (EV) or the fluidic system comprises a separator (15) of extracellular vesicles (EV) which can be connected fluidically or not, for example by via a means for closing said separator (15), to the container (4).
  • a separator (15) of extracellular vesicles (EV) which can be connected fluidically or not, for example by via a means for closing said separator (15), to the container (4).
  • the production and / or extraction of charged extracellular vesicles (EV) can be carried out discontinuously or continuously depending on the opening or closing of the closure means disposed upstream of the separator ( 15).
  • the liquid medium (5) can be extracted from the container 4 by a first pump (16), via a connector (13), of so as to transport the liquid medium (5) in a collector (19).
  • Another pump (16 ') allows the liquid medium (5) contained in the collector (19) to be conveyed to the inlet (10) of the separator (15), via another connector.
  • the first outlet (11) of the separator (15) is connected to the container 4 via a connector, so as to reintroduce liquid medium (5) depleted in extracellular vesicles (EV) in the container (4).
  • the second outlet (12) of the separator (15) is connected to the collector (19) via a connector, so as to enrich the liquid medium (5) contained in the collector (19) with extracellular vesicles (EV).
  • the inlet (10) of the separator (15) can be directly connected to the outlet (9) of the container (4) (or via a first pump (16)).
  • the first outlet (11) of the separator (15) is connected to the container (4) and the second outlet (12) of the separator (15) is connected to the manifold 19.
  • Several separators can also be arranged in series to vary the degree of separation into extracellular vesicles (EV) in the liquid medium (5), and / or in parallel to adapt the flow of liquid medium 5 in each separator (15) to the flow of a first pump (16).
  • Figure 3 illustrates the size distribution of EVs obtained by NTA (Nanoparticle Tracking Analysis, NS300, Malvern) (A) and morphological analysis by cryo-TEM (Cryogenics Transmission Electron Microscopy (B) The size distribution of EVs triggered by turbulence from HUVECs was analyzed by NTA and cryo-TEM ( Figure 3) showing the shape of the vesicles and the typical size range of polydispersed EVs (C). The results show that the EVs obtained at a Kolmogorov length of 35 ⁇ m displayed a conventional size range (100 to 400 nm).
  • the average size of the EVs were 236 nm and 200 nm respectively.
  • mTHPC metal - tetra (hydroxyphenyl) chlorine, INN: temoporfin, temoporfine in French
  • fluorometry with an emission peak around 650 nm characteristic of this molecule (following excitation around 400-410 nm) (Figu re 4).
  • the quantification of mTHPC was carried out for the samples of EVs produced by producer cells incubated with 100 mM mTHPC with shaking.
  • Loading experiments were carried out at a Kolmogorov length of 100 and 35 ⁇ m in order to determine the effect of turbulence on the internalization of the agents of interest on the producer cells and subsequently on the released EVs.
  • the loading step at 100 ⁇ m was followed by washing and vesiculation at 35 ⁇ m in Kolmogorov length, according to the experimental protocol of table 1 below. below.
  • Table 1 protocol for loading vesicles from HUVEC to mTHPC
  • the purified EVs (EV) samples obtained after loading the cells at a Kolmogorov length of 100 and 35 ⁇ m contained an mTHPC concentration of 1, 3 mM and 7.8 mM, respectively, which means an increase of more 5 times the EV load with mTHPC. Furthermore, when we compare the amount of EV obtained at 35 pm to 100 pm, we obtain an increase of 10 times, attesting to the effect and the importance of the length of Kolmogorov to, on the one hand, trigger and increase the release of EVs and, on the other hand, also increase their loading of the cargo molecule of interest.
  • HUVECs HUVECs
  • MSCs murine mesenchymal stem cells
  • C3HT1 / 2, ATCC murine mesenchymal stem cells
  • the cells were cultured in DMEM containing 10% fetal calf serum (SVF) and 1% penicillin-streptomycin (PenStrep, Gibco) at 37 ° C (5% CO2).
  • the vesicles were isolated and concentrated by ultracentrifugation (Beckman Optima MAX XP, 150,000 g for 1 h 30). The cell concentration was determined with the NC200 cell counter (Chemometec) and the concentration and size distribution of the vesicles were calculated by NTA. The markers present in the vesicles or their membrane have been analyzed by flow cytometry using the MACSPlex kit (Miltenyi Biotec).
  • Vesicles and cells were then chemically lysed (0.3% Triton) and then analyzed using a fluorescence spectrophotometer (Hitachi F7000). Doxorubicin was quantified using its excitation wavelengths at 485 nm and emission wavelengths at 560 nm.
  • Figure 9 confirms the importance of L k in the loading of HUVEC on the one hand: the loading of HUVEC cells is 2.4 times greater (+140%) using an L k of 55 pm than at a L k of 283 pm, and on the other hand in the loading of the vesicles (FIG. 10): a 39% increase in the concentration of doxorubicin in the vesicles is observed when an L k of 55 pm is used, compared to an L k of 283 pm, which corresponds to passive loading of cells or vesicles (FIG. 10).
  • Analysis by flow cytometry shows that the vesicles obtained according to the two conditions have conventional markers for extracellular vesicles, in particular CD9, CD63 and CD81 (not shown).
  • vesiculation at an L k of less than 40 ⁇ m has no impact on the presence of the conventional markers of the vesicles; we can therefore expect vectorization functionality at least as effective as the passively produced vesicles.
  • MTHPC and doxorubicin are small therapeutic agents (680.7 and 543.5 kDa, respectively).
  • the conditions identified by the inventors are more effective than the condition of passive loading without agitation or with very weak agitation at 283 ⁇ m for example.
  • the effect of the variation of L k for the production of extracellular vesicles for agents of larger size was also tested ( Figures 1 1, 12, 13). The 10 kDa and 70 kDa dextran-FITC probes were used.
  • RNAs which have a molecular weight of the order of 13 kDa (Whitehead et al., 2009) or “small” therapeutic proteins whose molecular weight is close to 70 kDa (Strohl, 2015). Similar results are obtained, whether for the dextran-FITC probes of 70 kDa or 10 kDa.
  • HeLa cells genetically modified to express the luciferase linked to the HSP70 protein (HSP70 is a marker for extracellular vesicles, Théry et al. 2018)
  • HSP70 is a marker for extracellular vesicles, Théry et al. 2018
  • DMEM fetal calf serum
  • PenStrep penicillin-streptomycin
  • These cells were seeded on Cytodex 1 microcarriers (GE Healthcare) at 6 g of beads / L in 100 ml spinner flask (Bellco) at a rate of 6700 cells / cm 2 , then cultured at 3 g of beads / L with stirring. 34 rpm until confluence.
  • the microcarriers comprising the confluent cells were washed 3 times with DMEM without serum to eliminate traces of serum, then incubated with FITC-dextran probes of 10 or 70 kDa (references FD10S and 90718 respectively, Sigma) at 1.43 mM for 2 hours at L k of 245 or 48 pm (Table 3).
  • Table 3 protocol for production and loading of vesicles of HeLa cells with dextran 10 or 70 kDa coupled to FITC.
  • Vesicles and cells were then chemically lysed (Triton 0.3%) and the amount of FITC determined with a fluorescence spectrophotometer (Hitachi F7000), using the excitation wavelengths at 495 nm, and emission at 520 nm from FITC.
  • the extracellular vesicles obtained were also analyzed by flow cytometry imaging (Amnis® ImageStream®) using anti-CD 63 PE and anti-CD 81 APC (Biolegend) antibodies. A total of 100,000 events were analyzed.
  • the positive events with the FITC marking were then classified in the “gates corresponding to apoptotic bodies (AB for apoptotic bodies), large vesicles (lEVs) and small vesicles (sEV) according to their granularity or relative internal complexity (“ side scatter in English).
  • the luminescent (luciferase) and fluorescent (FITC) signal for the vesicles obtained at an L k of 245 pm and 48 pm using the 70 kDa FITC-dextran probe was evaluated.
  • the luminescent signal is an indicator of the number of vesicles produced by HeLa cells, it corresponds to the luciferase linked to the protein HSP70, which is a cytosolic marker of vesicles, and produced by mother cells.
  • the fluorescence of FITC reflects the amount of FITC-dextran internalized in the vesicles and therefore the load of the vesicles in FITC-dextran.
  • the extracellular vesicles produced according to the invention have a higher concentration of imaging agent and / or therapeutic agent than the extracellular vesicles produced according to currently known methods, such as passive loading (without or with very low agitation).
  • the method according to the invention does not include the application of electrical stress to the cells via the application of a potential difference like the electroporation method.
  • FIGS. 5 and 6 illustrate the biodistribution of a liposomal formulation of mTHPC (FIG. 5) and of mTHPC-EV (FIG. 6) as a function of the intensity of the fluorescence in tissues selected as a function of the time after intravenous injection ( 0.3 mg / kg of the agent of interest) in mice carrying HT29 tumors.
  • the fate of mTHPC EVs at a Kolmogorov length of 35 ⁇ m was studied in a mouse tumor model.
  • Biodistribution following intravenous administration has been compared to a liposomal formulation of mTHPC (a liposomal formulation mTHPC) by taking advantage of the imaging properties of the drug.
  • the biodistribution data ( Figures 5 and 6) indicate that the mTHPC EVs reached a maximum concentration in the tumor more quickly (between 6 and 15 h after the injection) than the liposomal formulation of mTHPC (between 24 and 48 h after the injection). Pulmonary absorption was higher for mTHPC EVs than for the liposomal formulation of mTHPC. An equally high absorption in the liver was observed for mTHPC EVs and the liposomal formulation of mTHPC.
  • FIG. 7 illustrates the plasma concentration of mTHPC expressed as a function of time after the intravenous injection of the liposomal formulation of mTHPC or of mTHPC-EV (0.3 mg / kg of mTHPC) in mice carrying HT29 tumors.
  • a pharmacokinetic study revealed a decrease in mTHPC in the circulation after the injection of the liposomal formulation of mTHPC after a peak of 30 minutes after the injection ( Figure 7).
  • blood concentrations of mTHPC increased surprisingly with a peak at 6 h after injection.
  • the decrease in plasma concentrations of mTHPC to almost 0.2 ng / ml reached 6 h and 24 h after injection of the liposomal formulation of mTHPC and mTHPC, respectively.
  • Figure 8 illustrates Kaplan-Meier diagrams of HT29 tumor growth retardation after treatment with free mTHPC; the liposomal formulation of mTHPC and mTHPC-EVs with laser activation of the drug (photodynamic therapy, three-dimensional therapies), compared to the same groups without laser activation (control, dashed lines).
  • the inventors compared the therapeutic effect of mTHPC EVs, the liposomal formulation of mTHPC and free mTHPC in terms of tumor growth, 90 days after treatment.
  • Kaplan-Meier diagrams show that, without laser induced drug activation, mTHPC EV, the liposomal formulation of mTHPC and free mTHPC had the same therapeutic effect.
  • the vesicles loaded with active agents obtained according to the methods of the present invention can constitute a very advantageous alternative both from the point of view of pharmacodynamic properties and of the effectiveness of the treatment carried out.
  • Liposomes are known for the vectorization of various biomolecules such as enzymes, hormones, antisense oligonucleotides, ribozymes, proteins or DNA peptides, anticancer molecules (Farjadian et al. 2018).
  • Such molecules can therefore advantageously be vectorized by the charged vesicles according to the method of the invention like mTHPC.
  • active agents in lipid formulations are subject to marketing authorization by the health authorities, for example:
  • amphotericin B (AmBisome ® , authorized for the treatment of fungal infections)
  • daunorubicin (Daunoxome ® , authorized for the treatment of extensive or visceral cutaneous mucosal Kaposi's sarcoma),
  • a particular object of the invention is therefore a process for the production of extracellular vesicles charged with one of these molecules and as described in the present application in any of its embodiments.
  • the vesicles or cells advantageously loaded by these agents by said process also constitute objects of the present invention.
  • a particular object is a loading process according to the invention, an extracellular vesicle or a cell loaded according to this process, characterized in that the therapeutic agent used in this process and loaded in the vesicles and / or producing cells, is selected from temoporfin, amphotericin B, daunorubicin, irinotecan, vincristine and cytarabine.
  • Lamichhane TN Lamichhane TN, Raiker RS, Jay SM. Exogenous DNA Loading into Extracellular Vesicles via Electroporation is Size-Dependent and Enables Limited Gene Delivery. Mol Pharm. 2015 Oct 5; 12 (10): 3650-7.

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Abstract

L'invention concerne un système fluidique de chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices, un agitateur de milieu liquide et des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur et l'agitateur dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d'un agent thérapeutique ou d'imagerie dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) produites simultanément par le système fluidique.

Description

SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VESICULES EXTRACELLULAIRES COMPRENANT UN AGENT THERAPEUTIQUE OU D’IMAGERIE ET PROCEDE
ASSOCIE DOMAINE DE L’INVENTION
L’invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires et le chargement d’au moins un agent thérapeutique ou d’imagerie. L’invention se rapporte plus précisément à un système de chargement de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices et d’un agent thérapeutique ou d’imagerie, un procédé de chargement d’agent thérapeutique ou d’imagerie et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d’intérêt comme vecteurs pour la délivrance d’agents thérapeutiques ou d’imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d’un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d’abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également internaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d’imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules. En particulier, l’utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l’utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires fonctionnalisées (c’est- à-dire chargées d’un composé d’intérêt) en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires. Les propriétés uniques des vésicules extra cellulaires (EVs) et leur tolérance biologique sont maintenant considérées comme des avantages pour délivrer des macromolécules biologiquement actives, tout en les protégeant des enzymes circulant dans les fluides corporels.
Les deux principaux défis pour une utilisation thérapeutique sont (i) la génération des EVs en quantité suffisante pour une utilisation clinique et (ii) l’efficacité de chargement de composés biologiquement actifs d’intérêt.
Aujourd’hui, deux principaux types de techniques de chargement sont décrits, (i) les modifications biologiques des cellules-mères, ou (ii) le chargement des EVs après leur production par des moyens physiques. En ce qui concerne le chargement des cellules-mères, ont été décrit des techniques de chargement spontané ou par transfection. Par exemple, des cellules ont été conçues pour exprimer un peptide RVG sur la partie extracellulaire de la protéine lamp2b surexprimée sur les EVs (Alvarez- Erviti et al., 201 1 ). Cependant, une telle stratégie de transfection des cellules- mères par des plasmides codant le Lamp2b fusionné au peptide d’intérêt prend du temps, pose des défis et peut être difficile à respecter dans un processus évolutif de bonnes pratiques de manipulation (BPF). En parallèle, la méthode d’électroporation est la méthode qui peut être utilisée pour le chargement des EVs après la production. Cette méthode a été utilisée pour charger divers composés dans des EVs tel que l’ARNsi (Shtam et al. , 2013) l’ADN (Lamihhane et al., 2015) et la doxorubicine (Tian et al., 2014). Toutefois, la charge d’ARNsi s’est avérée peu efficace en raison de la formation d’agrégats d’ARNsi. La demande internationale WO 2004/083379 décrit également une méthode de chargement d'un agent exogène dans des vésicules extracellulaires comprenant l'application d'une charge électrique. Une autre méthode pour obtenir des EVs fonctionnalisés (c’est-à-dire des vésicules chargées d’un composé d’intérêt) consiste à détruire les EVs afin de les fonctionnaliser (Haney et al., 2015). Cette méthode est facile à mettre en œuvre, mais ne permet pas de préserver la structure vésicale, ce qui provoque la perte de l’asymétrie de la membrane et des protéines avec un mauvais réarrangement des protéines membranaires. Smyth et al. divulguent une méthode de chargement des EVs par chimie-click. Cette méthode consiste à charger les protéines membranaires des EVs avec un groupe fonctionnel spécifique afin de fixer à ces protéines le composé d’intérêt. Toutefois, cette méthode ne permet pas de charger la lumière des vésicules.
Il est donc nécessaire de fournir une méthode pour obtenir des vésicules extracellulaires fonctionnalisées (EVs) dans lesquelles la topologie et les propriétés originales des vésicules sont préservées et permettant de charger la lumière des vésicules. Il est également nécessaire que cette méthode permette de charger des EVs avec toutes sortes de composés, avec tout type de volume d’échantillon. Enfin, il est également nécessaire que cette méthode permette de charger des EVs pour une utilisation clinique compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (B. P. F. ou Good Manufacturing Practices, G.M. P. en anglais), soit facile à mettre en œuvre avec un nombre d’étapes réduites, et permette une obtention d’EVs chargées en grande quantité et contenant une quantité en cargo important, etc. RESUME DE L’INVENTION
Un but de l’invention est de proposer une solution pour charger des agents thérapeutiques et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires et ainsi fonctionnaliser des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement et plus efficacement qu’avec les méthodes connues, dans des conditions conformes aux normes B. P. F. Un autre but de l’invention est de proposer une solution permettant d’augmenter le rendement du système de chargement d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans des vésicules, c’est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie et le nombre de vésicules non chargées. Un autre but de l’invention est de proposer une solution pour charger, produire et récupérer des vésicules extracellulaires chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie en continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l’invention est de simplifier la structure du système fluidique pour le chargement et la production de vésicules chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie et de réduire son coût de fabrication.
Ainsi, l’invention propose une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d’un agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie.
En particulier, un objet de l’invention est un système fluidique de chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EVs) à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices, un agitateur de milieu liquide adaptés pour la croissance des cellules productrices, caractérisé en ce qu’il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur, l'agitateur, et les dimensions du récipient étant adaptés à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) produites simultanément par le système fluidique.
On comprend qu’avec un tel système, il est possible de produire des vésicules chargées d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie en grande quantité, et dans un système adapté aux normes G.M. P. On comprend également qu’un tel système est plus simple et moins coûteux à fabriquer que les systèmes connus pour charger et fonctionnaliser des vésicules extracellulaires, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale 100 pm, et préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm ;
- le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ;
- le système fluidique comprend des microporteurs sur lesquels vont se fixer des cellules productrices adhérentes ;
- l’agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme, la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ;
- les microporteurs sont des microbilles, le diamètre des microbilles étant compris entre 100 pm et 300 pm ;
- le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires, relié fluidiquement au récipient de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique pouvant comprendre un moyen de fermeture en amont du séparateur permettant de fermer ou ouvrir la connectique et ainsi obtenir un système de récupération de vésicules en continu ou discontinu.
Un autre objet de l’invention est un procédé de chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant :
• des moyens de commande de la vitesse d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices, et
• une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient.
Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on agite le milieu liquide pendant plus de vingt minutes ;
- on commande l’agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant, intermittent, d’intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm ; - un séparateur qui permet d’appauvrir une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et le liquide ainsi appauvri étant réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient.
- on réalise une étape d’ultracentrifugation ou de filtration tangentielle après la collecte pour séparer les vésicules, les cellules productrices et les agents thérapeutiques et/ou d’imagerie dans le milieu liquide.
- les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées.
- l’écoulement permet de, simultanément, charger l’agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient.
Le chargement des vésicules extracellulaires selon le procédé de l’invention peut également s’effectuer indépendamment de leur production. Ainsi un objet de l’invention est un procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie en utilisant directement une suspension de vésicules extracellulaires préalablement produites. Un objet de l’invention est donc un procédé de chargement dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV), comprenant :
- une fourniture de vésicules extracellulaires dans le milieu liquide (5),
- une commande de la vitesse d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les vésicules afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, le milieu liquide comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Un autre objet de l’invention est un procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme de cellules productrices, comprenant :
• une commande de la vitesse d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide dans un récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices, et
• une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires en sortie du récipient.
Ce procédé de chargement de cellules productrices est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on agite le milieu liquide pendant plus de vingt minutes ;
- on commande l’agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant, intermittent, d’intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 70 pm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm.
Comme le démontrent les expérimentations, le système ou les procédés de l’invention permettent d’obtenir des vésicules et/ou cellules productrices chargées d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à des concentrations particulièrement plus importantes (les augmentations mesurées varient de 39% à 592%) comparées au vésicules et/ou cellules chargées/produites passivement. Ainsi lesdites cellules productrices et vésicules extracellulaires sont d’un intérêt tout particulier et constituent donc un objet de la présente invention. Les vésicules de l’invention sont plus particulièrement d’intérêt comme vecteur d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Ces utilisations constituent également un objet de l’invention.
Plus particulièrement, les vésicules chargées selon les procédés de l’invention présentent des propriétés de pharmacodynamie et thérapeutiques améliorées comparées aux formulations liposomales, comme le montrent les données relatives à la témoporfine. Ainsi un objet particulier de l’invention est le procédé selon l’invention dans l’un quelconque de ses modes de réalisation, une vésicule extracellulaire, cellule productrice obtenue selon ce procédé pour lesquels ledit agent thérapeutique est sélectionné parmi la témoporfine, l’amphotéricine B, la daunorubicine, l’irinotécan, la vincristine, la cytarabine.
DEFINITIONS
Le terme « vésicule extracellulaire désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule extracellulaire correspond en particulier à un exosome et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire. Il est connu de l’art que les vésicules extracellulaires contiennent les marqueurs membranaires et/ou cytoplasmiques provenant des cellules productrices. Ces marqueurs permettent d’une part d’identifier et caractériser ces vésicules et sont les garant de leur fonctionnalité. Comme le montre la partie expérimentale, les vésicules selon l’invention sont plus efficaces que les liposomes par exemple, et permettent une amélioration de la pharmacocinétique/pharmacodynamie (PK/PD) des molécules qu’elles vectorisent. Le terme cellule productrice désigne de manière générale indépendamment soit une cellule qui n’est pas adhérente sur un milieu, soit une cellule adhérente sur un milieu et qui peut se diviser et se multiplier. Selon un autre aspect de l’invention, le terme cellules productrices désigne des cellules d’origine humaine, animale ou végétale ou provenant de bactéries ou d’autres micro-organismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Dans le cas des cellules adhérentes, celles-ci peuvent être adhérentes sur des microporteurs eux-mêmes en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de l’invention, le terme cellules productrices désigne des agrégats cellulaires. Le terme agrégats cellulaires désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices qui adhèrent solidement entre elles. Un mélange doux créé par l’agitateur permet aux cellules productrices adhérentes ou non de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.
Les termes microporteur et microsupport désignent une matrice sphérique permettant la croissance de cellules productrices adhérentes à sa surface ou à l’intérieur et dont la taille est comprise entre 50 pm et 500 pm, et préférentiellement entre 100 pm et 300 pm. Les microporteurs sont généralement des billes dont la densité est choisie sensiblement proche de celle du milieu liquide de culture des cellules productrices. Ainsi, un mélange doux permet aux billes de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.
Le terme agent thérapeutique ou agent d’imagerie désigne de manière générale tout agent d’intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des molécules thérapeutiques, d’imagerie, des nanoparticules à visée thérapeutique, d’imagerie etc. Comme le montrent les données expérimentales, l’invention est apte à permettre le chargement amélioré d’une grande variété de taille d’agent thérapeutique ou d’imagerie, tels que des petites molécules, des polymères, des protéines, etc... et ce quel que soit le type de cellules productrice. Ainsi, du fait de la diversité possible d’agent thérapeutique incorporable par le procédé selon l’invention et donc vectorisable par les vésicules extracellulaires de l’invention et également du fait de la grande variété des cellules productrices utilisables, les vésicules selon l’invention sont utilisables pour tout genre de thérapie ; par exemple, et de manière non limitative, il peut s’agir de la thérapie de maladies infectieuses, inflammatoires, immunologiques, métaboliques, cancéreuses, génétiques, dégénératives ou secondaires à des chirurgies ou traumas. La vectorisation de molécules de faible biodisponibilité est particulièrement préférée. De la même manière, une grande variété d’agent d’imagerie et/ou traceurs peut être chargée dans les vésicules extracellulaires selon l’invention, par exemple, et de manière non limitative, des agents fluorescents, luminescents, des isotopes radioactifs, des produits de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques. Il peut s’agir également de protéines ou autres molécules biologique ou de synthèse couplées à ces agents y compris des agents de ciblage afin de changer la biodistribution des vésicules.
Le terme agitateur désigne de manière très générale un moyen d’agiter le liquide. Ce peut être une pièce mécanique au moins partiellement en contact avec une partie du liquide et qui permet de mettre ce liquide en mouvement. C’est par exemple le cas avec un agitateur rotatif. L’homme de l’art sait qu’il est possible d’utiliser de nombreuses variantes pour produire un mouvement liquide et un mélange, que ce soit en variant les caractéristiques de forme de l’agitateur rotatif, ou soit en utilisant d’autres types d’actions, que ce soit isolément ou en action conjointe, dans la façon d’induire du mouvement dans le liquide. Ainsi un réacteur de type shake-flask utilise un mouvement de secouage pour induire un mouvement du liquide et son mélange ; un réacteur air-lift utilise l’injection de bulles gazeuses dans le liquide pour produire un mouvement du liquide et son mélange. D’autres configurations de réacteurs existent qui mettent éventuellement à profit l’utilisation d’une enceinte souple pour contenir le liquide, associée à une déformation de l’enceinte souple pour produire un mouvement liquide et un mélange. De même, un mouvement de mélange peut être obtenu au moyen d’une variation cyclique d’inclinaison du réacteur par rapport à la gravité, de façon à créer des vagues dans le liquide, et promouvoir écoulement et mélange. Enfin, des structures statiques présentes dans le réacteur, par exemple des baffles, ou encore des structures formant des barrières partielles au mouvement du liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées.
Le terme « agitateur doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d’un moyen ou d’une combinaison de moyens quelconques permettant de générer la combinaison d’un écoulement, du mélange du milieu, et la génération de turbulence dans un milieux liquide.
PRESENTATION DES FIGURES
D’autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles : La figure 1 illustre schématiquement un système fluidique pour le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension ;
La figure 2 illustre schématiquement un système fluidique pour le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices adhérentes et comprenant des microporteurs ;
Les figures 3A, 3B illustrent respectivement la distribution de taille des EVs obtenues par NTA, l’analyse morphologique par cryo-TEM ;
La figure 4 illustre l’analyse par fluorimétrie des vésicules chargées au mTHPC. La figure 5 illustre la biodistribution d’une formulation liposomale du commerce de la mTHPC (foslip®, A et B) et des vésicules avec mTHPC (C et D) étudiée en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l’agent d’intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29.
La figure 6 illustre la biodistribution des vésicules chargées selon l’invention avec mTHPC (A et B) étudiée en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l’agent d’intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29.
La figure 7 illustre la concentration plasmatique en mTHPC exprimée en fonction du temps après l'injection intraveineuse de la formulation liposomale de la mTHPC ou de mTHPC-EV (0,3 mg / kg de mTHPC) chez des souris porteuses de tumeurs HT29.
La figure 8 illustre des diagrammes de Kaplan-Meier du retard de croissance tumorale HT29 après traitement avec de la mTHPC libre ; la formulation liposomale de la mTHPC (Liposome mTHPC) et vésicules mTHPC avec activation laser du médicament (thérapie photodynamique), comparés aux mêmes groupes sans activation laser (contrôle, lignes en pointillés).
La figure 9 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en doxorubicine des HUVEC (concentration cellulaire en doxorubicine).
La figure 10 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en doxorubicine des vésicules extracellulaires d’HUVEC (concentration en doxorubicine pour 106 vésicules).
La figure 1 1 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le nombre de vésicules extracellulaires d’HUVEC formées, mesuré en NTA (barres grises) ou en unité arbitraire de luminescence de la luciférase. Un nombre comparable de vésicules est obtenu pour une Lk de 48 pm, que ce soit en l’absence ou en présence du cargo (FITC-dextran 70kDa).
La figure 12 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en FITC-dextran 70kDa des vésicules extracellulaires d’HUVEC mesurée par la fluorescence du FITC (unités arbitraires) contenu dans les vésicules.
La figure 13 illustre l’impact de la longueur de Kolmogorov sur le chargement en FITC-dextran 70kDa (fig. 13A) ou en FITC-dextran 10kDa (fig. 13B) en fonction de la taille des vésicules extracellulaires d’HUVEC formées, mesurée par la fluorescence du FITC (unités arbitraires) contenu dans les vésicules. Barres noires, chargement à une Lk=245 pm, barres blanches, chargement à une Lk=48 pm.
DESCRIPTION DETAILLEE
Eléments théoriques
La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d’eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d’un fluide permet de dissiper l’énergie cinétique d’un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur Lk est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941 , January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301 -305) et décrite par la formule (I) suivante :
Lk = n3/4. e- 1/4 (I) dans laquelle est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et e est le taux moyen de dissipation d’énergie dans le fluide par unité de masse (ou taux d’injection d’énergie dans le fluide).
Zhou ét al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impe tiers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre e moyen et la géométrie d’un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (II) suivante :
NV.D5.N3
e = — - v (II) dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l’agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l’agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de e moyen correspondant à la géométrie d’un récipient et d’un agitateur utilisés pour la mise en œuvre de l’invention. Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (III) : dans laquelle P est la puissance apportée par l’agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (III) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., & Miles, D., 1971 , Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1 ), 41 -43) ou Zhou et al. (Zhou, G. , Kresta, S. M. , 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de Reynolds de l’écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (IV) suivante :
N.D 2
Re =
V (iv)
Alternativement, l’homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov basée sur un taux moyen de dissipation d’énergie par unité de volume. En tout état, le calcul présenté ci-dessus n’est qu’une façon parmi tant d’autres connues de l’homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov et illustre un mode de réalisation de l'invention sans en limiter la portée. De manière générale, pour un récipient et un agitateur choisis, l’homme du métier saura appliquer le Np fourni par le fournisseur de l’agitateur et ainsi déterminer comment obtenir une Lk souhaitée.
Architecture générale du système fluidique
Les figures 1 et 2 illustrent schématiquement un système fluidique (1 ) pour le chargement de vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique (1 ) de chargement de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) chargées dans un récipient (4). Toutefois, l’invention n’est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients (4) reliés fluidiquement en parallèle ou en série.
Le récipient (4) contient un milieu liquide (5). Le récipient (4) peut notamment être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide (5). Le volume du récipient (4) est l’un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires (EV) en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume du récipient (4) illustré schématiquement dans la figure 1 ou 2 est de 1 L. Dans l’exemple, non limitatif, de mode de réalisation présenté figure 1 , qui permet la séparation en continu des vésicules produites, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient (4) par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19). Une autre pompe (16’) permet d’acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l’entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide 5 appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l’entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l’intermédiaire d’une première pompe (16)). La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19). Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires EV dans le milieu liquide 5, et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur 15 au débit d’une première pompe 16. Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à filtrer les cellules productrices (6) et les débris cellulaires lors de l’extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient (4).
Le récipient (4) comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s’écouler une atmosphère comprenant des concentrations en air, N2, O2 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d’un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d’une étuve à atmosphère contrôlée en CO2. Une pompe (17) permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient (4). Le récipient (4) comprend également une sortie (9) susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV). Cette sortie peut être complétée d’un moyen de séparation et/ou de filtration des cellules en suspension permettant de ne pas récupérer des cellules en suspension en dehors du récipient (4). Cette sortie (9) permet d’extraire hors du récipient (4) les vésicules extracellulaires (EV) produites. Le récipient (4) peut également comprendre au moins une entrée (8) adaptée à introduire le milieu liquide (5) dans le récipient (4). Le milieu liquide (5) peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide 5 est soit un milieu liquide de culture avec adjonction de composés permettant la culture des cellules d’intérêt, soit un milieu complémenté en sérum ou lysat plaquettaire préalablement purifié des vésicules extracellulaires soit un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires (EV) produites par le système fluidique 1 par des protéines ou d’autres vésicules provenant d’un sérum. Un milieu liquide (5) de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide (5) est déterminé en partie par le récipient (4). Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) est en partie déterminé par le choix de l’agitateur (7) permettant d’agiter le milieu liquide (5).
Le système fluidique (1 ) peut comprendre, selon un mode de réalisation particulier des microporteurs (3) en suspension dans le milieu liquide (5). Les microporteurs sont particulièrement avantageux lorsque les cellules productrices (6) sont des cellules adhérentes. Les microporteurs (3) peuvent être des microbilles (14), par exemple en Dextran, chaque microbille (14) pouvant être recouverte d’une couche de collagène ou autre matériau nécessaire à la culture de cellules. D’autres matériaux peuvent être utilisés pour la fabrication des microporteurs (3), tels que le verre, le polystyrène, le polyacrylamide, le collagène et/ou l’alginate. De manière générale, l’ensemble des microporteurs (3) adaptés pour la culture cellulaire est adapté à la production de vésicules extracellulaires (EV). La densité des microporteurs (3) peut être par exemple légèrement supérieure à celle du milieu liquide (5). La densité des microbilles (14) en Dextran est par exemple de 1 ,04. Cette densité permet aux microbilles (14) d’être suspendues dans le milieu liquide (5) en agitant faiblement le milieu liquide (5), la traînée de chaque microporteur (3) dans le milieu liquide (5) étant dépendante de la densité du microporteur (3). La taille maximale des microporteurs (3) peut être comprise entre 50 pm et 500 pm, préférentiellement entre 100 pm et 300 pm, et préférentiellement entre 130 pm et 210 pm.
Les microporteurs (3) peuvent par exemple être des microbilles (14) de type Cytodex 1 (marque déposée). On peut réhydrater et stériliser une poudre formée par ces microbilles (14) avant utilisation. On peut utiliser les réhydrater dans du PBS, puis les transférer dans un milieu de culture (par exemple du DMEM) sans sérum, dans lequel les microbilles sont conservées à 4°C avant une utilisation.
Le système fluidique (1 ) comprend également des cellules productrices (6). Les cellules productrices (6) peuvent être selon un mode de réalisation, des cellules adhérentes sur les microporteurs (3) ou selon un autre mode de réalisation des cellules en suspension. Les vésicules extracellulaires EV sont chargées et produites par le système fluidique (1 ) à partir de ces cellules productrices (6) (adhérentes ou en suspension).
Les cellules productrices (6) peuvent être cultivées, avant le chargement et la production de vésicules extracellulaires (EV) chargées par le système fluidique (1 ), sur la surface des microporteurs (3) dans un milieu de culture cellulaire adapté ou en suspension dans un milieu de culture cellulaires adapté pour des cellules en suspension. Ainsi, aucun transfert de cellules n’est nécessaire entre la culture des cellules productrices (6) et le chargement des vésicules extracellulaires (EV), ce qui permet d’éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. Selon un mode de réalisation, la majorité des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), même si une proportion minoritaire de cellules productrices (6) peut être décollée, par exemple par l’agitation du milieu liquide (5). Les autres cellules productrices sont alors et en suspension dans le milieu liquide (5) ou sédimentées au fond du récipient (4). Selon un mode réalisation particulier de l’invention au moins 50% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 60% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 70% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 80% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 85% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 90% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 95% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 96% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 97% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 98% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence au moins 99% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3), de préférence 100% des cellules productrices (6) sont adhérentes à la surface des microporteurs (3). Ainsi, moins de 50% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 40% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 30% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 20% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 15% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 10% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 5% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 4% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 3% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 2% des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence moins de 1 % des cellules productrices (6) sont en suspension, de préférence les cellules productrices (6) ne sont pas en suspension. Préférentiellement, le système fluidique (1 ) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d’homogénéiser les cellules productrices 6 dans le milieu liquide (5) au sein du récipient (4). De manière générale, tout type de cellules productrices (6) peut être utilisé, y compris des cellules productrices non adhérentes. Les cellules productrices en suspension sont alors en suspension dans le milieu liquide (5) ou sédimentées au fond du récipient (4).
Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) permettant d’agiter le milieu liquide (5). L’agitateur (7) peut être une pale telle qu’une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide (5), et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L’agitateur (7) peut également être un système de perfusion de milieu liquide (5) à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide (5) contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L’agitateur (7) peut alternativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers à bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles ( shaken flask), agitateur à bascule (wave), bioréacteur avec agitation pneumatique ( air- lift ) ou un agitateur rotatif à pales tel qu’un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d’agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient (4), par exemple des baffles, ou encore des structures formant des barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L’agitateur (7) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4). L’homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov Lk adaptée pour chaque type d’agitateur (7) en fonction des dimensions du récipient (4), de la géométrie de l’agitateur (7) et de l’intensité de l’agitation. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds Re est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (IV). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l’écoulement de milieu liquide (5) est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000.
D’autres agitateurs (7) permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l’homme du métier et susceptibles d’être implantés dans le système selon la présente invention.
L’agitateur (7) utilisé dans les exemples de réalisation de l’invention comprend une pale telle qu’une roue à aube agencée dans un récipient 4 et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques. La vitesse de la pale dans le milieu liquide (5) entraîne un écoulement du milieu liquide (5). L’agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient (4), est turbulent. Dans le cas de l’agitateur (7) illustré en figure 1 ou 2, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide (5), en particulier la viscosité cinématique v du milieu liquide (5), les dimensions du récipient (4) et en particulier le volume V de milieu liquide (5) contenu dans le récipient (4), le nombre de puissance Np correspondant à la partie immergée de la pale, le diamètre D de l’agitateur et en particulier de la roue, la vitesse N de rotation de la roue. L’utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l’écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov Lk, telle que donnée par les équations (I), (II) et (III). En particulier, l’agitateur (7) est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur Lk est inférieure à 100 pm, de préférence inférieure ou égale à 80 pm. De manière encore plus préférée l’agitateur 7 est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur Lk est inférieure ou égale à 70 pm et très préférentiellement à inférieure ou égale 60 pm. De manière particulièrement préférée, l’écoulement a une Lk inférieure ou égale à 55 pm, de manière également préférée inférieure ou égale à 50 pm.
Dans un exemple de réalisation du système fluidique (1 ), la vitesse de rotation de l’agitateur (7) est susceptible d’être commandée à 100 rpm (rotations par minute), le diamètre d’une pale telle que, par exemple, une roue à aube est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient (4) est de 400 mL. Le nombre de puissance N P mesuré de la pale dans le milieu liquide 5, par la formule (III), est sensiblement égal à 3,2. L’énergie dissipée par unité de masse e, calculée, par la formule (II), est égale à 5,44.10 1 J. kg-1. La longueur de Kolmogorov Lk calculée par la formule (I) est ainsi égale à 41 ,8 pm.
Préparation des microporteurs et des cellules productrices
Le récipient (4) peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide (5), de microporteurs (3), de cellules productrices (6) et de l’agent thérapeutique ou agent d’imagerie. Les microporteurs (3), en l’occurrence des microbilles (14), sont également stérilisés. Les microbilles (14) sont incubées dans le milieu de culture des cellules productrices (6), comprenant du sérum, dans le récipient (4). Cette incubation permet d’oxygéner le milieu de culture et de recouvrir la surface des microbilles (14) d’une couche, au moins partielle, de protéines, favorisant l’adhésion des cellules productrices (6) à la surface des microbilles (14).
Les cellules productrices (6), avant d’être introduites dans le système fluidique (1 ), sont mises en suspension au moyen d’un milieu comprenant de la trypsine. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 § pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d’un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices (6) sont ensuite introduites dans le récipient (4), comprenant du milieu de culture et les microbilles (14), dans une quantité correspondant sensiblement à 5 à 20 cellules productrices (6) par microbille (14). Les cellules productrices (6) et les microbilles (14) sont ensuite agitées puis sédimentées, de manière à mettre en contact les microbilles (14) et les cellules productrices (6), et favoriser l’adhésion des cellules productrices (6) sur la surface des microbilles (14). L’agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l’homogénéité de l’adhésion des cellules productrices (6) à la surface des microbilles (14), par exemple toutes les 45 minutes pendant 5 à 24 heures. La culture des cellules productrices est ensuite réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d’une pale telle qu’une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu’un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% du milieu de culture chaque jour).
Aspect chargement d’agent thérapeutique ou d’imagerie
Le système fluidique (1 ) pour le chargement et production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4). Toutefois, l’invention n’est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques et /ou d’imagerie dans les vésicules extracellulaires (EV) produites selon l’invention. Ainsi, les cellules productrices (6) et l’agent thérapeutique ou d’imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide (5) et mélangés dans le récipient (4). Alternativement, les cellules productrices (6) peuvent être ajoutées séquentiellement dans le milieu liquide (5), c’est-à-dire avant ou après l’ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie dans ledit milieu liquide (5). De manière générale, tout type d’agent thérapeutique et/ou d’imagerie peut être utilisé, les agents thérapeutiques pouvant notamment être des molécules ou particules pour traiter des maladies infectieuses, des maladies inflammatoires, des maladies métaboliques, des maladies dégénératives, des maladies traumatiques, des maladies post-chirurgicales, des maladies génétiques, des tumeurs malignes, des maladies orphelines, des maladies du système vasculaire, des maladies du système lymphatique, des maladies du système locomoteur, des maladies du système digestif, des maladies du système nerveux, des maladies du système reproducteur, des maladies du système excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d’imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) tel que décrit précédemment et permettant d’agiter le milieu liquide (5) comprenant les cellules productrices en suspension (6) et l’agent thérapeutique ou d’imagerie. Préférentiellement, le système fluidique (1 ) est adapté de manière à générer une agitation suffisamment douce pour homogénéiser le milieu sans abîmer les cellules productrices mais suffisante pour induire des contraintes de cisaillement permettant dans le milieu liquide (5) au sein du récipient
(4) et ce afin de charger efficacement les agents thérapeutiques et/ou d’imagerie dans les cellules productrices (6) et dans les vésicules extracellulaires.
Selon un autre objet, l’invention est également un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices (6), comprenant :
· la commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement et la production d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide 5 comprenant des cellules productrices (6), et
• une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV), par exemple en sortie (9) du récipient (4). La collecte peut se faire alternativement par transvasement de l’ensemble du liquide
(5) contenu dans le récipient dans un autre récipient. Eventuellement, une centrifugation dont la vitesse est adaptée pour séparer les vésicules extracellulaires d’une part et les cellules productrices et/ou les cellules productrices adhérentes sur les microporteurs d’autre part est appliquée.
Dans un mode de réalisation particulier, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale à 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Dans un mode particulièrement préféré ladite la longueur de Kolmogorov est inférieure ou égale à 55 pm. Dans un mode également préféré ladite la longueur de Kolmogorov est inférieure ou égale à 50 pm.
Selon un objet de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de chargement d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Bien entendu, cette étape peut également être mise en œuvre avant l’étape de production de vésicules extracellulaires. Dans ce mode de réalisation particulier, les cellules productrices de vésicules sont donc chargées dans leur membrane et/ou leur cytoplasme en agent thérapeutique et/ou d’imagerie d’intérêt préalablement à la mise en œuvre du procédé de production de vésicules extracellulaires. Le chargement s’opère soit par des méthodes connues de l’art, comme par exemple chargement passif, soit, de manière préférée, selon le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme de cellules productrices (6), comprenant :
une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices (6), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 100 pm, dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices (6), et
une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4), et
- optionnellement, une collecte des cellules productrices chargées.
Selon un mode de réalisation particulier, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Selon une caractéristique encore plus particulière, Lk est inférieure ou égale à 55 pm. Selon une autre caractéristique particulière, Lk est inférieure ou égale à 50 pm.
Alternativement, dans un autre mode de réalisation, l’étape de chargement peut être mise en œuvre après l’étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d’intérêt dans le cas où l’on souhaite obtenir une 1 ère production de vésicules non chargées suivie d’une 2ème production de vésicules extracellulaire chargées dudit agent thérapeutique et/ou d’imagerie, et ce dans le cadre de la mise en place d’un système fluidique avec une collecte du milieu liquide (5) en continu. Dans ce mode de réalisation, une fois produites, et ce de manière indépendante de leur production, les vésicules sont chargées en étant soumises à des contraintes de cisaillement en commandant de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans le récipient (4) dans lequel sont les vésicules extracellulaires afin de réaliser le chargement, dans la lumière ou la membrane des vésicules extracellulaires (EV), d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie contenu également dans le milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm dans un récipient (4). Selon une caractéristique particulière, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Selon une caractéristique particulièrement préférée, Lk est inférieure ou égale à 55 pm. Selon une caractéristique également préférée, Lk est inférieure ou égale à 50 pm.
De manière surprenante, comme démontré dans la partie expérimentale, l’écoulement qui permet aux cellules productrices (6) de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l’agent thérapeutique ou d’imagerie dans les cellules productrices (6) et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4) chargé de l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Ainsi, alternativement, et selon un autre de réalisation, l’étape de chargement dudit agent thérapeutique et/ou d’imagerie est simultanée à l’étape de production de vésicules extracellulaires. Un objet de l’invention est donc également le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane et/ou dans le cytoplasme de cellules productrices (6) et/ou dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires desdites cellules, comprenant :
une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) et les vésicules extracellulaires afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices (6) et la lumière et/ou la membrane des vésicules desdites cellules, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 100 pm, dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices (6), et
une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Selon un mode de réalisation particulier, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, voire inférieure ou égale 70 pm et, de manière préférée, inférieure ou égale à 60 pm. Selon une caractéristique encore plus particulière, Lk est inférieure ou égale à 55 pm. Selon une autre caractéristique également particulière, Lk est inférieure ou égale à 50 pm.
Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4) comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d’un agent thérapeutique et/ou d’imagerie.
Exemple de production des vésicules extracellulaires EV avec chargement d’agent thérapeutique ou agent d’imagerie
Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites dans un récipient (4) contenant un milieu liquide (5), par exemple sans sérum, des cellules productrices (6). Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices (6) comprenant du sérum et des agents thérapeutiques et/ou d’imagerie, on lave trois à quatre fois le récipient (4) avec du milieu liquide 5 DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d’environ 400 mL. On commande ensuite l’agitation du milieu liquide (5) par l’agitateur (7) de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient (4). L’agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur de Kolmogorov Lk est inférieure à 100 pm et préférentiellement inférieure ou égale à 60 pm. L’agitation du milieu liquide (5) est commandée au moins pendant 20 minutes, préférentiellement pendant plus d’une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures. Selon un aspect particulier, l’agitation dure deux heures. Le chargement et la production de vésicules extracellulaires (EV) chargées peu(ven)t être mesuré(s) pendant la production. A cet effet, l’agitation peut être momentanément interrompue. On laisse sédimenter et/ou on centrifuge les cellules productrices 6 au fond du récipient (4), puis on prélève un échantillon de milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires (EV). On réalise une centrifugation de l’échantillon à 2000 g pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticle Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires (EV) et d’en déduire la concentration en vésicules extracellulaires (EV) des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires (EV) au début de l’agitation est proche de zéro ou négligeable.
Les vésicules extracellulaires (EV) produites peuvent également être observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 pL de solution comprenant des vésicules extracellulaires EV est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l’éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires (EV) est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires (EV) sont observées à une température de l’ordre de -170° C.
Séparation des vésicules extracellulaires
Les vésicules extracellulaires (EV) chargées et produites dans le récipient 4 sont susceptibles d’être extraites du récipient (4) par la sortie (9) du récipient (4), suspendues dans du milieu liquide (5). Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à filtrer les cellules productrices 6 et les débris cellulaires lors de l’extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient (4). Une connectique (13) est fluidiquement reliée à la sortie (9), permettant le transport du milieu liquide (5) comprenant les vésicules extracellulaires (EV) produites.
Le système fluidique (1 ) peut en outre comprendre un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV). Le séparateur (15) comprend une entrée du séparateur (10), dans laquelle le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) issu du récipient (4) peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur (15) peut également comprendre une première sortie (11 ) du séparateur, par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus petite qu’en entrée (10) du séparateur (15), voire sensiblement nulle. Le séparateur (15) peut également comprendre une deuxième sortie (12) du séparateur (15), par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus élevée qu’en entrée (10) du séparateur (15).
De manière générale, le séparateur (15) de vésicules extracellulaires EV peut être relié fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide (5) appauvri en vésicules EV dans le récipient (4), par exemple par l’entrée (8) du récipient (4). Ainsi, la production et/ou l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) chargées peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide (5) sensiblement constant dans le récipient (4). Selon un mode de réalisation alternatif, le système fluidique ne comprend pas de séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) ou le système fluidique comprend un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l’intermédiaire d’un moyen de fermeture dudit séparateur (15), au récipient (4). Ainsi, la production et/ou l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) chargées peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou continu en fonction de l’ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en amont du séparateur (15).
Dans l’exemple de réalisation d’un système fluidique (1 ) illustré dans la figure 1 ou 2, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient 4 par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19). Une autre pompe (16’) permet d’acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l’entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient 4 via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l’entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l’intermédiaire d’une première pompe (16)). La première sortie (11 ) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur 19. Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires (EV) dans le milieu liquide (5), et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur (15) au débit d’une première pompe (16).
Influence de l’agitation sur le chargement des vésicules extracellulaires EV La figure 3 illustre la distribution de taille des EVs obtenues par NTA (Nanoparticle Tracking Analysis, NS300, Malvern) (A) et l’analyse morphologique par cryo-TEM ( Cryogénie Transmission Electron Microscopy (B). La répartition de la taille des EVs déclenchés par la turbulence provenant des HUVEC a été analysée par NTA et cryo-TEM (Figure 3) montrant la forme des vésicules et la plage de taille type des EVs polydispersés (C). Les résultats montrent que les EVs obtenues à une longueur de Kolmogorov de 35 pm affichaient une plage de taille classique (100 à 400 nm). La taille moyenne des EVs étaient respectivement de 236 nm et de 200 nm. La présence de mTHPC ( meta - tetra(hydroxyphenyl)chlorine, INN : temoporfin, témoporfine en Français) dans la fraction des EVs isolées est démontrée par fluorométrie avec un pic d’émission vers 650 nm caractéristique de cette molécule (suite à excitation vers 400-410 nm) (Figure 4). La quantification de mTHPC a été effectuée pour les échantillons d’EVs produits par des cellules productrices incubées avec 100 mM mTHPC sous agitation. Des expériences de chargement ont été effectuées à une longueur de Kolmogorov de 100 et 35 pm afin de déterminer l’effet de la turbulence sur l’internalisation des agents d’intérêt sur les cellules productrices et par la suite sur les EVs libérées. Afin d’établir une comparaison à une quantité équivalente d’EVs, l’étape de chargement à 100 pm a été suivie d’un lavage et d’une vésiculation à 35 pm de longueur Kolmogorov, selon le protocole expérimental du tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : protocole de chargement de vésicules d’HUVEC au mTHPC
Les échantillons d’EVs purifiés (EV) obtenus suite à une charge des cellules à une longueur de Kolmogorov de 100 et 35 pm contenaient une concentration mTHPC de 1 ,3 mM et 7,8 mM, respectivement, ce qui signifie une augmentation de plus de 5 fois de la charge d’EVs avec le mTHPC. Par ailleurs, lorsqu’on compare la quantité d’EV obtenue à 35 pm à 100 pm, on obtient une augmentation de 10 fois, attestant l’effet et de l’importance de la longueur de Kolmogorov pour, d’une part, déclencher et augmenter la libération des EVs et, d’autre part également augmenter leur chargement en molécule cargo d’intérêt.
La même expérience a été réalisée en utilisant des HUVEC (ATCC, figures 9 et 10) et de Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) murines (C3HT1 /2, ATCC) en utilisant des Lk différentes. Brièvement, les cellules ont été cultivées dans du DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PenStrep, Gibco) à 37° C (5% de CO2). Elles ont été ensemencées sur des microporteurs Cytodex 1 (GE Healthcare) à 12g de billes/ L en micro-carrier spinner flask (Bellco) de 100 mL, à raison de 13300 cellules/cm2, puis cultivées à 6g de billes/ L avec une agitation de 34 rpm jusqu’à confluence. Avant le chargement en doxorubine, les microporteurs comportant les cellules confluentes ont été lavés 3 fois avec du DMEM afin d’éliminer toute trace de sérum. Après équilibration dans du DMEM sans sérum, la doxorubicine a été ajoutée à une concentration finale de 5mM. Le chargement et la vésiculation ont été effectués à 37° C (5% CO2) suivant le protocole du tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : protocole de chargement de vésicules d’HUVEC ou CSM murines à la doxorubicine
En fin de culture, les cellules ont été isolées des billes par trypsine
10 min à 37°C (5% CO2), et séparée des billes par passage sur tamis cellulaire 70 pm, puis lavées en PBS pour éliminer la doxorubicine libre. Après une première étape de centrifugation à 2000 g durant 10 minutes, les vésicules ont été isolées et concentrées par ultracentrifugation (Beckman Optima MAX XP, 150 000 g pendant 1 h30). La concentration en cellules a été déterminée avec le compteur de cellules NC200 (Chemometec) et la concentration et distribution en taille des vésicules ont été calculées par NTA. Les marqueurs présents dans les vésicules ou leur membrane ont été analysés par cytométrie en flux utilisant le kit MACSPlex (Miltenyi Biotec). Vésicules et cellules ont été ensuite lysées chimiquement (Triton 0,3%) puis analysées au spectrophotomètre à fluorescence (Hitachi F7000). La doxorubicine a été quantifiée en utilisant ses longueurs d’ondes d’excitation à 485 nm et d’émission à 560 nm.
La figure 9 confirme l’importance de la Lk dans le chargement des HUVEC d’une part : le chargement des cellules HUVEC est 2,4 fois plus important (+140 %) en utilisant une Lk de 55 pm qu’à une Lk de 283 pm, et d’autre part dans le chargement des vésicules (figure 10): une augmentation de 39% de la concentration en doxorubicine des vésicules est observée quand une Lk de 55 pm est utilisée, par rapport à une Lk de 283 pm, qui correspond à un chargement passif des cellules ou vésicules (figure 10).
Des résultats similaires sont obtenus pour les CSM murines (non montré) avec notamment une augmentation de 485% de la concentration des vésicules en doxorubicine quand une Lk de 55 pm est utilisée, par rapport à un chargement passif à une Lk de 283 pm. Le chargement des cellules est également augmenté de 592%.
Concernant les caractéristiques des vésicules produites, les données de NTA montrent une distribution en taille similaire entre les conditions de chargement (passif et pour une Lk = 55 pm), respectivement 106,9 nm et 109,7 nm pour les vésicules des HUVEC, qui correspondent à une taille classique de vésicules extracellulaires (non montré). L’analyse par cytométrie en flux montre que les vésicules obtenues selon les deux conditions présentent des marqueurs classiques des vésicules extracellulaires notamment CD9, CD63 et CD81 (non montré). Ainsi la vésiculation à une Lk inférieure à 40 pm n’a pas d’impact sur la présence des marqueurs classiques des vésicules ; on peut donc attendre une fonctionnalité de vectorisation au moins aussi performante que les vésicules produites passivement. Les résultats montrent l’influence de Lk dans la production et le chargement de vésicules sur différents types de cellules utilisées. Le mTHPC et la doxorubicine sont des agents thérapeutiques de petite taille (respectivement 680,7 et 543,5 kDa). Les conditions identifiées par les inventeurs sont plus efficaces que la condition de chargement passif sans agitation ou à très faible agitation à 283 pm par exemple. L’effet de la variation de Lk pour la production de vésicules extracellulaires pour des agents de taille plus importante a également été testé (Figures 1 1 , 12, 13). Les sondes dextran-FITC de 10 kDa et 70 kDa ont été utilisées. Elles peuvent être considérées comme des modèle d’agents d’imagerie et comme également des modèles pour des agents thérapeutiques qui seraient de poids moléculaire plus important, tel que, par exemple des polymères, des siRNAs qui ont un poids moléculaire de l’ordre de 13 kDa (Whitehead et al., 2009) ou des « petites >> protéines thérapeutiques dont le poids moléculaire est proche de 70 kDa (Strohl, 2015). Des résultats similaires sont obtenus que ce soit pour les sondes dextran-FITC de 70 kDa ou 10 kDa.
Brièvement, des cellules HeLa (ATCC), modifiées génétiquement pour exprimer la luciférase liée à la protéine HSP70 (HSP70 est un marqueur des vésicules extracellulaires, Théry et al. 2018), ont été cultivées avec du DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline- streptomycine (PenStrep, Gibco) à 37° C (5% de CO2). Ces cellules ont été ensemencées sur des microporteurs Cytodex 1 (GE Healthcare) à 6g de billes/L en spinner flask (Bellco) de 100 mL à raison de 6700 cellules/cm2, puis cultivées à 3g de billes/L avec une agitation de 34 rpm jusqu’à confluence. Avant le chargement, les microporteurs comportant les cellules confluentes ont été lavés 3 fois avec du DMEM sans sérum pour éliminer des traces de sérum, puis incubés avec des sondes de FITC-dextran de 10 ou 70 kDa (références FD10S et 90718 respectivement, Sigma) à 1 ,43 mM pendant 2 heures à des Lk de 245 ou 48 pm (tableau 3). Tableau 3 : protocole de production et chargement de vésicules de cellules HeLa avec du dextran 10 ou 70 kDa couplé au FITC.
Après une première centrifugation pour éliminer les débris cellulaires (2000 g durant 10 minutes), et une ultracentrifugation (Beckman Optima MAX XP, 1 10 000 g pendant 1 h). La concentration cellulaire a été déterminée avec le compteur de cellules NC200 (Chemometec), et la concentration et distribution en taille des vésicules a été calculée par NTA) (NS300, Malvern). Le signal luminescent des vésicules a été analysé par un lecteur de plaques (EnSpire, PerkinElmer). Vésicules et cellules ont été ensuite lysées chimiquement (Triton 0,3%) et la quantité en FITC déterminée au spectrophotomètre à fluorescence (Hitachi F7000), en utilisant les longueurs d’ondes d’excitation à 495 nm, et d’émission à 520 nm du FITC. Les vésicules extracellulaires obtenues ont été également analysées en imagerie par cytométrie en flux (Amnis® ImageStream®) en utilisant des anticorps anti-CD 63 PE et anti-CD 81 APC (Biolegend). Au total, 100000 événements ont été analysés. Les événements positifs au marquage FITC ont été ensuite classés dans les « gates correspondantes aux corps apoptotiques (AB pour apoptotic bodies), grandes vésicules (lEVs) et petites vésicules (sEV) en fonction de leur granularité ou complexité interne relative (« side scatter en anglais).
Le signal luminescent (luciférase) et fluorescent (FITC) pour les vésicules obtenues à une Lk de 245 pm et 48 pm en utilisant la sonde de FITC-dextran de 70 kDa a été évalué. Le signal luminescent est indicateur du nombre de vésicules produites par les cellules HeLa, il correspond à la luciférase liée à la protéine HSP70, qui est un marqueur cytosolique des vésicules, et produite par les cellules-mères. La fluorescence du FITC reflète la quantité de FITC-dextran internalisé dans les vésicules et donc la charge des vésicules en FITC-dextran.
Concernant la production de vésicules avec le FITC-dextran de 70 kDa (figure 1 1 ), une augmentation de la production de vésicules d’un facteur 2 en utilisant une Lk de 48 pm par rapport aux cellules chargées à une Lk de 245 pm est observée, que ce soit en NTA ou en signal luminescent (qui est trouvé proportionnel au nombre de vésicules compté en NTA). Une condition contrôle a été préparée à une LK de 48 pm mais en l’absence de la sonde de FITC-dextran de 70 kDa. La même augmentation du nombre de vésicules est observée en l’absence du cargo de 70kDa. En outre, l’analyse du signal fluorescent, indicatif de la présence de la sonde de FITC-dextran de 70 kDa, indique, à nombre égal de vésicules, une augmentation de 27% du signal fluorescent (figure 12), signant ainsi un chargement des vésicules plus important quand Lk=48 pm, par rapport aux conditions où Lk=245 pm.
L’augmentation de l’efficacité de chargement est observée quelle que soit la taille de la vésicule extracellulaire produite par les cellules (petites vésicules, grosses vésicule, corps apoptotique). Les différents types de vésicules et leur marquage ont été visualisés par imagerie en cytométrie en flux (ImageStream®, non montré) indiquant la présence des marqueurs fluorescents CD81 et CD63 et permettant de confirmer que les données de NTA correspondent bien à des vésicules extracellulaires et non pas des agrégats de débris cellulaires. L’analyse de cytométrie en flux (en plotant l’intensité du side scatter et l’intensité de marquage FITC) est indicative de leur chargement par les sondes FITC-dextran (figure 13 A et B). Les résultats chiffrés d’augmentation du chargement des vésicules extracellulaires quand une Lk inférieure à 100 mM est utilisée sont reportés dans le tableau 4 ci- dessous : Tableau 4
Augmentation du chargement en cargo Taille de vésicule (Lk=48 miti vs Lk= 245 mm)
FITC-dextran 10 kDa FITC-dextran 70kDa
Petites vésicules +75,0% +46,3%
Grosses vésicules +263, 1% +460,0%
Corps apoptotiques +52,6% +92,0
Globalement, l’analyse de cytométrie en flux pour le marquage avec les anticorps anti-CD 63 PE et anti-CD 81 APC montre un nombre sensiblement également de vésicules extracellulaires marquées par l’un ou l’autre des anticorps (non montré). Ainsi l’augmentation de production de vésicules extracellulaires ne se fait pas au détriment de la qualité vésicules en termes de présence des marqueurs classiques des vésicules extracellulaires.
Ces résultats montrent que le choix d’une longueur de Kolmogorov(Lk) selon l’invention permet d’augmenter le rendement de production de vésicule de cellule HeLa, que le cargo n’a pas d’influence sur ce rendement et également un effet important de la Lk dans le chargement des vésicules. Il permet donc la production en plus grand nombre de vésicules mieux chargées, cela de manière indépendante quant au type de cellules (cultures primaire ou cellules immortelles cancéreuses, cellules souches, endothéliales, épithéliales, humaines ou animales) et sur un large intervalle de taille de cargo.
II découle de l’ensemble des résultats que le choix d’une longueur de
Kolmogorov adaptée, inférieure à 100 pm, permet d’optimiser significativement la production et le chargement de vésicules extracellulaires quelle que soit la taille du cargo envisagé et le type de cellules. Ainsi les vésicules extracellulaires produites selon l’invention ont une concentration en agent d’imagerie et/ou en agent thérapeutique plus importante que les vésicules extracellulaires produites selon les méthodes actuellement connues, telles que le chargement passif (sans ou à très faible agitation). En outre, la méthode selon l’invention ne comprend pas l’application d’un stress électrique sur les cellules via l’application d’une différence de potentiel comme la méthode d’électroporation.
Les figures 5 et 6 illustrent la biodistribution d’une formulation liposomale de la mTHPC (figure 5) et de mTHPC-EV (figure 6) en fonction de l'intensité de la fluorescence dans des tissus sélectionnés en fonction du temps après injection intraveineuse (0,3 mg/kg de l’agent d’intérêt) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. Le devenir des EVs mTHPC à une longueur de Kolmogorov de 35 pm a été étudié dans un modèle tumoral de souris. La biodistribution à la suite d’une administration intraveineuse a été comparée à une formulation liposomale de la mTHPC (une formulation liposomique mTHPC) en tirant parti des propriétés d’imagerie du médicament. Les données sur la biodistribution (Figures 5 et 6) indiquent que les EVs mTHPC ont atteint une concentration maximale dans la tumeur plus rapidement (entre 6 et 15 h après l’injection) que la formulation liposomale de la mTHPC (entre 24 et 48 h après l’injection). L’absorption pulmonaire était plus élevée pour les EVs mTHPC que pour la formulation liposomale de la mTHPC. On a observé une absorption dans le foie aussi élevée pour les EVs mTHPC et la formulation liposomale de la mTHPC.
La figure 7 illustre la concentration plasmatique en mTHPC exprimée en fonction du temps après l'injection intraveineuse de la formulation liposomale de la mTHPC ou de mTHPC-EV (0,3 mg / kg de mTHPC) chez des souris porteuses de tumeurs HT29. Une étude pharmacocinétique a révélé une diminution de la mTHPC dans la circulation après l’injection de la formulation liposomale de la mTHPC après un pic de 30 minutes après l’injection (Figure 7). À l’inverse, les concentrations sanguines de mTHPC ont augmenté étonnamment avec un pic à 6 h après l’injection. La diminution des concentrations plasmatiques de mTHPC à près de 0,2 ng/ml a atteint 6 h et 24 h après l’injection de la formulation liposomale de la mTHPC et mTHPC, respectivement.
La figure 8 illustre des diagrammes de Kaplan-Meier du retard de croissance tumorale HT29 après traitement avec de la mTHPC libre ; la formulation liposomale de la mTHPC et mTHPC-EVs avec activation laser du médicament (thérapie photodynamique, thérapies tridimensionnelles), comparés aux mêmes groupes sans activation laser (contrôle, lignes en pointillés). Les inventeurs ont comparé l’effet thérapeutique des EVs mTHPC, de la formulation liposomale de la mTHPC et de mTHPC libre en termes de croissance de la tumeur, 90 jours après le traitement. Les diagrammes de Kaplan-Meier montrent que, sans activation médicamenteuse induite par laser, le mTHPC EV, la formulation liposomale de la mTHPC et le mTHPC libre avaient le même effet thérapeutique. Toutefois, la thérapie photodynamique pour les EVs mTHPC suivie de l’activation laser a permis d’obtenir un effet thérapeutique amélioré par rapport à la formulation liposomale de la mTHPC activée par laser et au mTHPC libre. Les résultats montrent que 0 % des tumeurs témoins ou du groupe traité par la thérapie photodynamique avec formulation liposomale de la mTHPC, ainsi que 20 % des tumeurs traitées par la thérapie photodynamique à la mTHPC, affichaient une croissance 10 fois plus élevée, tandis que cette valeur était de 33 % pour le groupe traité par le TDP de EV mTHPC au jour 90 (Figure 8).
Ainsi, comparées aux liposomes, les vésicules chargées d’agents actifs obtenues selon les procédés de la présente invention peuvent constituer une alternative très avantageuse tant du point de vue des propriétés de pharmacodynamie que de l’efficacité du traitement réalisé. Les liposomes sont connus pour la vectorisation de diverses biomolécules telles que des enzymes, hormones, oligonucléotides antisens, ribozymes, protéines ou peptides ADN, molécules anticancéreuses (Farjadian et al. 2018). De telles molécules peuvent donc avantageusement être vectorisées par les vésicules chargées selon le procédé de l’invention à l’instar de la mTHPC. En effet, des agents actifs dans des formulations lipidiques font l’objet d’autorisation de mise sur le marché par les autorités de santé, par exemple :
- l’amphotéricine B (AmBisome®, autorisé dans le traitement des infections fongiques),
- la daunorubicine (Daunoxome®, autorisé dans le traitement du sarcome de Kaposi cutanéomuqueux extensif ou viscéral),
- l’irinotécan (Onivyde® autorisé dans le traitement des adénocarcinomes),
- la vincristine (Marqibo® autorisé dans le traitement leucémie aigüe lymphoblastique Phi négatif ou du lymphome lymphoblastique),
- la cytarabine (DepoCyte®, autorisé dans le traitement de la méningite lymphomateuse).
Un objet particulier de l’invention est donc un procédé de production de vésicules extracellulaires chargées par l’une de ces molécules et tel que décrit dans la présente demande dans l’un quelconque de ses modes de réalisation. Les vésicules ou cellules avantageusement chargées par ces agents par ledit procédé constituent également des objets de la présente invention. Un objet particulier est un procédé de chargement selon l’invention, une vésicule extracellulaire ou une cellule chargée selon ce procédé, caractérisé en ce que l’agent thérapeutique utilisé dans ce procédé et chargé dans les vésicules et/ou cellules productrices, est sélectionné parmi la témoporfine, l’amphotéricine B, la daunorubicine, l’irinotécan, la vincristine et la cytarabine. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Système fluidique (1 ) de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant au moins un récipient (4), un milieu liquide (5) contenu par le récipient (4), des cellules productrices (6), un agitateur (7) de milieu liquide (5) adaptés pour la croissance des cellules productrices (6), caractérisé en ce qu’il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur (7) et en ce que l'agitateur (7) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique ou d'imagerie dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires (EV) produites simultanément par le système fluidique (1 ), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm.
2. Système fluidique (1 ) selon la revendication 1 , dans lequel la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, de préférence est inférieure ou égale à 70 pm, de manière encore plus préférée est inférieure ou égale à 60 pm.
3. Système fluidique (1 ) selon la revendication 1 ou 2, comprenant une sortie (9) et une connectique (13) reliée à la sortie (9), la connectique (13) étant susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV).
4. Système fluidique (1 ) selon l’une des revendications 1 à 3, dans lequel un agitateur (7) de milieu liquide est un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient (4), à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient.
5. Système fluidique (1 ) selon l’une des revendications 1 à 4 comprenant un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV), relié fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient (4) un milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV).
6. Procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant :
- une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices (6), et
- une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
7. Procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV), comprenant :
- une fourniture de vésicules extracellulaires (EV) dans le milieu liquide (5),
- une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les vésicules afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou la lumière des vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie.
8. Procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme de cellules productrices (6), comprenant :
- une commande de la vitesse d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5) dans un récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser le chargement d’un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme des cellules productrices (6), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure à 100 pm, dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant l’agent thérapeutique et/ou d’imagerie, des cellules productrices (6), et
- une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4), et
- optionnellement, une collecte des cellules productrices chargées.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la longueur de Kolmogorov de l’écoulement est inférieure ou égale à 80 pm, de préférence est inférieure ou égale à 70 pm, de manière encore plus préférée est inférieure ou égale à 60 pm.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à
9 dans lequel le milieu liquide (5) est agité pendant plus de vingt minutes.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 10 l’agitateur est commandé pour entraîner un écoulement du milieu liquide à vitesse constante, intermittente, d’intensité croissante ou décroissante.
12. Procédé selon l’une des revendications 6 ou 8 dans lequel un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide (5) collecté en sortie du récipient (4) en vésicules extracellulaires (EV), et dans lequel on réintroduit la partie du milieu liquide (5) dans le récipient (4).
13. Vésicule extracellulaire chargée d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie obtenue par la mise en œuvre du système fluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, et/ou par le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans la lumière de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6) selon l’une quelconque des revendications 6, 7 ou 9 à 12.
14. Cellule productrice (6) chargée d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie obtenue par la mise en œuvre du système fluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, et/ou par le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans la membrane ou dans le cytoplasme de cellules productrices (6) selon la revendication 8.
15. Vésicule extracellulaire chargée d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie selon la revendication 13 pour son utilisation en tant que vecteur pour l’administration dudit au moins un agent d’imagerie et/ou au moins un agent thérapeutique.
16. Vésicule extracellulaire chargée d’au moins un agent thérapeutique pour son utilisation selon la revendication 15 dans la thérapie de maladies infectieuses, inflammatoires, immunologiques, métaboliques, cancéreuses, génétiques, dégénératives ou secondaires à des chirurgies ou traumas.
17. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à
12, caractérisé en ce que ledit agent thérapeutique est sélectionné parmi la témoporfine, l’amphotéricine B, la daunorubicine, l’irinotécan, la vincristine, la cytarabine.
18. Vésicule extracellulaire selon la revendication 13, cellule productrice selon la revendication 14 ou vésicule extracellulaire chargée d’au moins un agent thérapeutique pour son utilisation selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisée en ce que ledit agent thérapeutique est sélectionné parmi la témoporfine, l’amphotéricine B, la daunorubicine, l’irinotécan, la vincristine, la cytarabine.
19. Utilisation de la vésicule extracellulaire chargée d’au moins un agent d’imagerie selon la revendication 15, en tant que vecteur pour l’administration dudit au moins un agent d’imagerie médicale, telle que l’imagerie par fluorescence, luminescence, ou l’imagerie via la détection d’isotopes radioactifs, d’agents de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio-opaques.
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