EP3891197A2 - Amphipols - Google Patents

Amphipols

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Publication number
EP3891197A2
EP3891197A2 EP19812793.8A EP19812793A EP3891197A2 EP 3891197 A2 EP3891197 A2 EP 3891197A2 EP 19812793 A EP19812793 A EP 19812793A EP 3891197 A2 EP3891197 A2 EP 3891197A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
linear
branched
membrane protein
vinyl polymer
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19812793.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabrice Giusti
Anaïs MARCONNET
Manuela ZOONENS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Paris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Paris filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3891197A2 publication Critical patent/EP3891197A2/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C08F8/32—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups by reaction with amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/44—Preparation of metal salts or ammonium salts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/04—Acids; Metal salts or ammonium salts thereof
    • C08F220/06—Acrylic acid; Methacrylic acid; Metal salts or ammonium salts thereof

Definitions

  • amphipols amphiphilic polymers
  • amphipatic polymers are known in the state of the art for allowing the stabilization of membrane proteins in aqueous solution once they are extracted from the membranes via the use of detergents.
  • Membrane proteins represent around 30% of the proteins encoded by the cell genome and are involved in many important cellular functions (signaling, secretion, migration, adhesion, homeostasis, energy production, etc.).
  • the membrane proteins can be monomeric or oligomeric. By their integration into the membranes, they are strongly structured in helices a or sheets b for the transmembrane parts interacting with the alkyl chains of the membrane lipids.
  • the surface of the extra-membrane domains of these proteins is mainly covered with amino acids with hydrophilic side chains while the surface of their transmembrane domain is covered with amino acids with hydrophobic chains; membrane proteins are therefore highly insoluble in water due to the hydrophobic effect which pushes them to aggregate in solution in order to minimize disturbances of the hydrogen bond network between water molecules.
  • the detergents available on the market make it possible to dissolve the proteins but cause, as mentioned, their more or less rapid denaturation and inactivation in particular due to the dissociating power of the detergents; furthermore it is necessary to maintain these in solution at concentrations above their critical micellar concentration (CMC).
  • CMC critical micellar concentration
  • surfactants such as amphipols (WO 98/27434) make it possible to stabilize proteins but offer much weaker solubilizing properties.
  • Amphipols are amphiphilic polymers defined as being capable of maintaining membrane proteins in their native, soluble conformation, in the form of small complexes (Zoonens & Popot, 2014). The most commonly used and studied amphipol is I ⁇ 8-35.
  • SMAs for Styrene Maleic Acid copolymers, WO2011004158
  • SMAs unlike amphipols which simply purify themselves at the end of their synthesis, always present impurities which pre-empt the subsequent use of proteins for biotechnological applications.
  • Protein purification strategies and in particular membrane proteins, recombinant or not, are generally empirical and difficult to predict, depending in particular on the protein, the (micro) organism or the composition of the membrane; successive tests of different agents are generally carried out to solubilize and / or stabilize the membrane proteins, in order to identify the most effective agent under these conditions.
  • the invention therefore aims to provide new compounds to allow the solubilization and stabilization of membrane proteins. More particularly, the invention relates to new amphipols, amphiphilic vinyl polymers having improved solubilization properties while allowing satisfactory stabilization of membrane proteins.
  • the invention relates to amphiphilic vinyl polymers of formula I,
  • M + is an alkali metal, preferably selected from Li + , Na + , K + ,
  • Ri, R4, R5, Re are, each independently, the hydrogen atom or the methyl radical
  • R2, R 6 , R9 are, each independently, a group selected from the hydrogen atom and the linear or branched (C1-C8) alkyls,
  • R10 is a group selected from linear or branched (C1-C5) alkyls
  • R3 and R 7 are, each independently, a group selected from: hydrogen, X then being a single bond
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from among (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene,
  • a phenyl substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X a single bond or being then selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene, it being understood that when one of the groups R 3 or R 7 is a linear or branched alkyl of at least 6 carbon atoms, a linear or branched alkenyl of at least 6 carbon atoms, or a linear or branched alkynyl of at least 6 carbon atoms, or a d atom hydrogen, X then being a single bond, then the other group R 3 or R 7 is selected from: (C3-C10) cycloalkyls or
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1 -C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylene and (C2-C8) linear or branched alkynylene, and a phenyl, substituted or not by one or radicals selected from linear, cyclic or branched (C1-C8) alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1- C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and the
  • a phenyl substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls,
  • X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene.
  • amphiphilic vinyl polymer of formula I is such that:
  • R 3 and / or R 7 are (C6-C8) cycloalkyls as previously specified, or
  • R 3 and / or R 7 are phenyl, preferably said phenyl is substituted in para by a methyl or ethyl group,
  • X being a single bond, or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene.
  • amphiphilic vinyl polymer of formula I is such that:
  • R 3 and / or R 7 are (C6-C8) cycloalkyls as previously specified, X preferably being a single bond or CH2,
  • R 3 and / or R 7 are phenyl, preferably said phenyl is substituted in para by a methyl or ethyl group, X being a single bond, or R 3 and / or R 7 are a styrenyl group. X being a simple bond.
  • amphiphilic vinyl polymer of formula I is such that: the metal M is Na +,
  • R 10 is an isopropyl group
  • x is less than or equal to 75%
  • - w and / or y is greater than or equal to 25%, w and / or y is between 25% and 50% and z is between 0% and 40%, preferably between 15% and 40%, or
  • affinity tag grafting fluorescent probe or immunostimulatory molecule.
  • the vinyl polymer of formula I is such that:
  • Ri, R2, R4, R5, R6, Re, Rg are the hydrogen atom
  • R3 and / or R7 is a ⁇ Ce-Cs) cycloalkyl and X is a single bond ,
  • R10 is an isopropyl group
  • x is equal to 35% or 50%
  • - w is 0%, or 25%
  • the vinyl polymer of formula I is selected from the compounds listed in Table I.
  • the vinyl polymers of the invention are amphipols, that is to say that they are capable of keeping the membrane proteins soluble in their native conformation, in the form of small complexes.
  • the invention therefore relates to the water-soluble complex formed by i) a membrane protein or else a mixture of membrane proteins and ii) at least one compound, amphiphilic vinyl polymer, as described above.
  • the water-soluble complex thus formed is such that it also comprises lipid compounds.
  • an object of the invention is the water-soluble complex formed by i) a membrane protein or else a mixture of membrane proteins and ii) at least one compound, amphiphilic vinyl polymer of the invention in which the membrane proteins are stabilized in solution aqueous.
  • Another object of the invention is therefore a solution comprising such a complex.
  • the invention also relates to a method for preparing an aqueous solution of membrane protein (s), said method comprising a solubilization and or stabilization step in which the protein fraction originating from a biological or synthetic membrane containing said membrane protein, or said mixture of membrane proteins, is placed in the presence of the vinyl polymer as described above.
  • this process is such that: the membrane protein (s) are recombinant proteins expressed in prokaryotic or eukaryotic cells, and / or native proteins expressed in specialized membranes with high protein density, a step of solubilization of said membrane protein or of said mixture of membrane proteins is previously carried out by means of a detergent medium, a step of melting the protein fraction containing said membrane protein, or said mixture of membrane proteins, is previously carried out by means of vesicles of phospholipids or mixture of phospholipids, preferably 1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), or the protein fraction solution containing said membrane protein is not a solution of membrane protein (s) (s) in a detergent medium in micellar form.
  • DMPC 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • an object of the present invention is also the use of the complexes of the invention as reagents in reagent kits, and in particular a diagnostic kit comprising at least one complex of the invention as an immunological reagent.
  • the complexes of the invention can be attached to a device making use of the activity of said membrane protein thus purified and solubilized by the amphipols of the invention for diagnostic or activity measurement purposes.
  • Figure 2 Complexation of BR with amphipols according to the invention, before (black bars) or after centrifugation (gray bars).
  • Figure 3 Thermal denaturation of BR in different environments.
  • Figure 4 Solubilization of the purple membrane of Halobacterium salinarum before (A) or after (B) fusion with DMPC vesicles with I ⁇ 8-35, the SMAs or amphipols of the invention.
  • Figure 5 Quantification of the BR extracted from the purple membrane, previously fused to the vesicles of DMPC, by I ⁇ 8-35, the SMAs, or of polymers of the invention (A) and analysis of the thermal stability of these complexes after 6 hours incubation at 50 ° C (B). The ratios of the absorbance values measured at the start and at the end of each experiment are reported.
  • Figure 6 Extraction of the purple membrane.
  • A Quantification of the solubilization (gray bars) and thermal stability (black bars) of the BR of the purple membrane, previously fused to the vesicles of DMPC, by I ⁇ 8-35, the SMAs, or of polymers of the invention each condition performed at least in triplicate values +/- SD;
  • B Kinetics of thermal destabilization of complexes formed with SMAs or polymers 19 and 23 over 6 hours of incubation at 50 ° C. The absorbance values measured at 554 nm were normalized with those measured before incubation of the samples.
  • Figure 7 Kinetics of solubilization of the protein YidC-GFP overexpressed in the plasma membrane of Escherichia coli in the presence of SMAs, polymers of the invention or DDM.
  • A Photographs of the electrophoresis gels revealing the fluorescence of the GFP fused with the membrane protein YidC and
  • B graphical representation of the quantification of the fluorescence from the image of the gels taking as reference the fluorescence measured in the presence of DDM after 1 hour of incubation.
  • FIG. 8 Solubilization of the membranes rich in AChR of Torpedo marmorata with I ⁇ 8-35, the SMAs and amphipols of the invention.
  • the samples corresponding to the supernatants (S) and pellets (C) of each condition were deposited on acrylamide gel, which after migration was stained with Coomassie blue.
  • the arrows indicate the location of the bands corresponding to the AchR subunits and to the Torpedo marmorata Na7K + ATPase.
  • the proteins present in the pellets are not solubilized, the proteins in the supernatant correspond to the solubilized proteins.
  • the invention relates to new amphipols which allow the solubilization and stabilization of membrane proteins in an aqueous medium.
  • the new amphipols of the invention have improved solubilization and / or stabilization properties compared to the reference polymers used to solubilize membrane proteins.
  • the complexes thus formed with membrane proteins are particularly suitable for biotechnological applications and the study of these membrane proteins.
  • amphipol designates vinyl polymers capable of keeping the membrane proteins soluble in their native conformation, in the form of small complexes.
  • membrane protein is used in the singular or plural, it includes mixtures of membrane proteins or preparations comprising substantially only one type of protein.
  • a membrane protein is a protein crossing on either side of the membrane, it then comprises at least one transmembrane domain or else a protein comprising at least one hydrophobic domain interacting with the membrane.
  • the membrane protein can be monomeric or else oligomeric, associated or not with cofactors.
  • a “stabilized” membrane protein corresponds to a solubilized membrane protein retaining a native conformation and, preferably, at least part of its biological activity, even if the latter may be temporarily blocked.
  • specialized membranes includes, within the meaning of the invention, the membranes of eukaryotic organelles such as, for example, the crests of the mitochondria, the thylakoids of the chloroplasts, the endoplasmic or sarcoplasmic reticulum; "Specialized membrane” also includes membranes with high protein density comprising at least 50% of membrane proteins, integral or not, or even at least 60% or even at least 70% of membrane proteins, such as, for example, the purple membrane of the bacteria Halobacterium salinarum (which may include up to 75% bacteriorhodopsin), the rest comprising lipids or other molecules.
  • biological membrane means, within the meaning of the invention, any lipid membrane extracted or originating from a cell or from an organism such as bacteria, fungus, eukaryotic cells etc.
  • synthetic biological membrane designates any lipid membrane reconstituted, recomposed or modified with synthetic or naturally occurring lipids.
  • a synthetic membrane may correspond to a lipid membrane extracted from an organism to which one or more synthetic lipids are added, a membrane made from synthetic lipids or a lipid membrane reconstituted from natural and or synthetic lipids intentionally mixed.
  • protein fraction includes, within the meaning of the invention, the cell fraction containing the membrane protein sought or analyzed. Thus it may be a more or less clarified and / or purified cellular homogenate.
  • protein fraction designates in particular a fraction of this homogenate such as the membrane fraction or else the fraction corresponding to a cell compartment.
  • the invention therefore relates to an amphiphilic vinyl polymer of formula I:
  • M + is an alkali metal, preferably selected from Li + , Na + , K + ,
  • Ri , R4, R 5 , Re are, each independently, the hydrogen atom or the methyl radical
  • R2, R 6 , R 9 are, each independently, a group selected from the hydrogen atom and the linear or branched (C1-C8) alkyls,
  • R1 0 is a group selected from linear or branched (C1-C5) alkyls
  • R 3 and R 7 are, each independently, a group selected from: hydrogen, X then being a single bond
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not by one or more radicals selected from among (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1 -C8) linear or branched alkenyls, (C1 -C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene, or
  • a phenyl substituted or not by one or more radicals selected from linear (cyclic or branched) alkyls (C1-C8), linear or branched (C1-C8) alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylene and (C2-C8) linear or branched alkynylene, it being understood that when one of the groups F3 ⁇ 4 or R 7 is a linear or branched alkyl of at least 6 carbon atoms, a linear or branched alkenyl of at least 6 carbon atoms, or a linear or branched alkynyl of at least 6 carbon atoms, or a hydrogen atom , X being a single bond, then, the other group F3 ⁇ 4 or R 7 is selected from: (C3-C10) cycloalkyls or
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene, or
  • a phenyl substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylene and (C2-C8) linear or branched alkynylene, w, x, y, z corresponding to the respective percentages of the units , x being between 20 and 90%,
  • the polymer of formula I is such that: M + is an alkali metal, preferably selected from Li +, Na +, K +,
  • Ri, R 4 , R 5 , Re are, each independently, the hydrogen atom or the methyl radical
  • R 2 , R 6 , R 9 are, each independently, a group selected from the hydrogen atom and the linear or branched (C1-C8) alkyls, Rio is a group selected from (C1-C5) linear or branched alkyls,
  • R 3 and / or R 7 are, each independently, a group selected from: (C3-C10) cycloalkyls or (C3-C10) (hetero) cycloalkyls, substituted or not by one or more radicals selected from (C1-C8 ) linear, cyclic or branched alkyls, the (C1-C8) linear or branched alkenyls and the (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from the (C1-C8) linear or branched alkylene, linear or branched (C2-C8) alkenylenes and linear or branched (C2-C8) alkynylenes,
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from among (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene,
  • a phenyl substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X a single bond or being then selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylene and (C2-C8) linear or branched alkynylene, w, x, y, z corresponding to the respective percentages of the units , x being between 20 and 90%,
  • the polymer of formula I is such that:
  • M + is an alkali metal, preferably selected from Li + , Na + , K + ,
  • Ri , F3 ⁇ 4, R 5 , Re are, each independently, the hydrogen atom or the methyl radical
  • R 2 , R 6 , R 9 are, each independently, a group selected from the hydrogen atom and the linear or branched (C1-C8) alkyls,
  • R 10 is a group selected from (C1-C5) linear or branched alkyls,
  • R 3 and R 7 are, each independently, a group selected from: hydrogen, X then being a single bond
  • a phenyl substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a simple bond or selected from linear or branched (C1-C8) alkylene, (linear or branched C2-C8) and linear or branched (C2-C8) alkynylene, it being understood that when one of the groups F3 ⁇ 4 or R 7 is a linear or branched alkyl of at least 6 carbon atoms, a linear or branched alkenyl of at least 6 carbon atoms, or a linear or branched alkynyl of at least 6 carbon atoms, or a hydrogen atom, X being a single bond, then, the other group F3 ⁇ 4 or R 7 is selected from: (C3-C10) cycloalkyls or (C
  • a phenyl substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylene and (C2-C8) linear or branched alkynylene, w, x, y, z corresponding to the respective percentages of the units , x being between 20 and 90%,
  • F3 ⁇ 4 and / or R 7 is a group selected from linear or branched alkyls of at least 6 carbon atoms, linear or branched alkenyls of at least 6 carbon atoms, or linear or branched alkynyls of at least 6 carbon atoms, X then being a single bond, then said alkyls, alkenyls, or alkynyls have less than 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, or less than 7 carbon atoms.
  • the average molar mass of the amphipols according to the invention is less than 100,000 g. mol 1 , preferably between 2000 and 50,000 g. mol 1 .
  • Embodiments of the invention are indicated below, which may or may not be taken in combination with another or between some of them.
  • M + is Na + .
  • y and / or w is greater than or equal to 25%.
  • R 2 , R 6 , Rg are hydrogen.
  • R 7 is a group selected from (C3-C10) cycloalkyls or (C3-C10) (hetero) cycloalkyls, substituted or not by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, the (C1-C8) linear or branched alkenyls and the (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from among (C1-C8) alkylene linear or branched, the linear or branched (C2-C8) alkenylenes and the linear or branched (C2-C8) alkynylenes.
  • X is a single bond and R 7 is a C6 cycloalkyl, preferably a C7 cycloalkyl, even more preferably a C8 cycloalkyl.
  • R 7 is a C6 cycloalkyl, preferably a C7 cycloalkyl, even more preferably a C8 cycloalkyl.
  • X is a linear or branched (C1-C8) alkylene, preferably methyl or ethyl.
  • R 7 is a phenyl, substituted or not by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls ((C1-C8) linear alkenyls or branched, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) alkynylene linear or branched.
  • X is a single bond and said phenyl is substituted for para.
  • said phenyl is substituted for para by a linear C1-C8 alkyl, even more preferably, said linear alkyl in para position is selected from methyl or ethyl groups.
  • R 7 is a phenyl substituted or not by one or more radicals selected from among (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls ((C1-C8) linear or branched alkenyls , (C1-C8) linear or branched alkynyls and X is selected from linear or branched (C1-C8) alkylene, preferably C1 alkylene or C2 alkylene.
  • w and y are different from 0 and R 3 and R 7 are, independently of one another: the (C3-C10) cycloalkyls or (C3-C10) (hetero) cycloalkyls, substituted or not by one or more radicals selected from linear, cyclic or branched (C1-C8) alkyls, linear or branched (C1-C8) alkenyls and linear or branched (C1-C8) alkynyls, X then being a single bond or selected from linear or branched (C1-C8) alkylene, linear or branched (C2-C8) alkenylenes and linear or branched (C2-C8) alkynylenes, (C3-C10) cycloalkenyls or (C3 -C10) (hetero) cycloalkenyls, poly or monounsaturated, substituted or not by one or more radicals selected from among (C1-C8) linear,
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene, or
  • R 3 and R 7 are then independently of each other: a C6 cycloalkyl, preferably a C7 cycloalkyl, moreover more preferred is a C8 cycloalkyl,
  • a phenyl even more preferably substituted in para by a linear C1-C8 alkyl when it is monosubstituted, even more preferably, said linear alkyl in the para position is selected from methyl or ethyl groups, X then being a single bond, or
  • R3 and / or R7 is a group selected from (C3-C10) cycloalkyls or (C3-C10) (hetero) cycloalkyls, substituted or not by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, the (C1-C8) linear or branched alkenyls and the (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from among (C1-C8) alkylene linear or branched, preferably methyl or ethyl.
  • R 3 and / or R 7 is phenyl, substituted or not by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, X then being a single bond or selected from linear or branched (C1-C8) alkylene, preferably methyl or ethyl.
  • X is a single bond and said phenyl is substituted for para.
  • said phenyl is substituted for para by a linear C1-C8 alkyl, even more preferably, said linear alkyl in para position is selected from methyl or ethyl groups.
  • z is different from 0; preferably Rio is then an isopropyl group, even more preferably, R10 is an isopropyl group and, with regard to the units comprising R 3 and / or R7, X is selected from linear or branched (C1 -C8) alkylene groups, ( C2-C8) linear or branched alkenylenes and the (C2-C8) linear or branched alkynylenes, R3 and / or R7 being selected from: the (C3-C10) cycloalkyls or (C3-C10) (hetero) cycloalkyls, substituted or unsubstituted by one or more radicals selected from linear, cyclic or branched (C1-C8) alkyls, linear or branched (C1-C8) alkenyls and linear or branched (C1-C8) alkynyls,
  • C3-C10 cycloalkenyls or (C3-C10) (hetero) cycloalkenyls, poly or monounsaturated, substituted or not by one or more radicals selected from among (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1- C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls,
  • poly or monounsaturated polycycles substituted or not substituted by one or more radicals chosen from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls, or a phenyl, substituted or not substituted by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear or branched alkynyls.
  • amphiphilic vinyl polymer of formula I is chosen from the compounds listed in table I below, M + being an alkali metal, preferably selected from Li + , Na + , K + ; in a particular embodiment, M + is Na + .
  • the percentages are specified with an accuracy of plus or minus 10%.
  • a percentage for a motif is specified as being 50%, it should be understood that this motif may be present between 45% and 55% in the polymer of the invention.
  • x is less than or equal to 75%.
  • w and / or y is between 25% and 50% and z is between 0% and 40%, preferably between 15% and 40%.
  • w + y is greater than or equal to 25%, preferably less than 50%.
  • the polymers according to the invention are selected from the compounds of Table I with the proportions w, x, y and z as specified in Table II below.
  • the compounds of the invention are new amphipols which are particularly capable of solubilizing and stabilizing membrane proteins, in particular with regard to other polymers such as I ⁇ 8-35 or SMA.
  • the complexes formed with membrane proteins are of particular interest concerning the study of membrane proteins as well as for the biotechnological applications of these proteins.
  • the stabilization of proteins in their native state and / or at least in part the preservation of their activity is essential for these applications; as demonstrated in the experimental part, the polymers of the invention allow the solubilization of membrane proteins and this stabilization.
  • the solubilization can be carried out without detergent, which is particularly advantageous.
  • membrane proteins known to be involved in pathologies, as being drug targets or capable of being immunogenic are particularly preferred.
  • the possible applications for these complexes are therefore, for example: NMR in a liquid or solid medium, electron microscopy, diagnosis: the search for circulating antibodies, soluble or carried by lymphocytes, vaccination or production of antibodies: presentation of membrane proteins as immunogens, detection / use of the enzymatic activity of membrane proteins when these are enzymes , in pharmacology, measurement of the affinity of cellular receptors for molecules of pharmaceutical interest.
  • the functionalized polymers of the invention are particularly advantageous.
  • Those skilled in the art will be able to identify the functionalization means relevant to the intended use of the polymers of the invention.
  • such means can be selected from those presented by Le Bon et al. (2014).
  • an object of the invention is the complexes formed by the polymers of the invention as described in the present application and the membrane proteins.
  • the complexes of the invention may be present in an aqueous solution, in lyophilized form or else immobilized in a matrix or on a surface via the functional groups grafted on the polymer of the invention.
  • the protein: amphipol ratio is between 1: 0.1 and 1: 10, preferably between 1: 1 and 1: 7.5, even more preferably between 1: 1, 5 and 1: 5.
  • this complex is therefore substantially devoid of detergent.
  • the water-soluble complexes of the invention comprise lipids or a mixture of lipids. These can be useful for dilute the membrane proteins, as explained in the experimental part, or else come from the membrane of the organism or from the organelle from which the membrane protein is solubilized and stabilized within the complex.
  • said lipid is 1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC).
  • the water-soluble complex can comprise all of the subunits of a multimeric protein or any cofactor associated with the membrane protein, as shown by the experiments on solubilization and stabilization of bacteriorhodopsin presented in the experimental part.
  • the invention also relates to a process for the preparation of an aqueous solution of stabilized membrane protein (s) present in complexes with the polymers of the invention.
  • the new amphipols of the invention have the capacity to solubilize membrane proteins without this preliminary solubilization step by the use of a detergent preparation.
  • an object of the invention is the use of polymers of the invention to solubilize and / or stabilize the membrane proteins.
  • the method for preparing a membrane protein solution or a mixture of membrane proteins, according to the invention does not include the step of dissolution by means of a detergent preparation , the solubilization being carried out using one of the polymers of the invention.
  • X is a single bond and R 7 is a C6 cycloalkyl, preferably a C7 cycloalkyl, even more preferably a C8 cycloalkyl.
  • w 0 and R 7 is a phenyl, substituted or not by one or more radicals selected from (C1-C8) linear, cyclic or branched alkyls, (C1-C8) linear or branched alkenyls, (C1-C8) linear alkynyls or branched, X then being a single bond or selected from among (C1-C8) linear or branched alkylene, (C2-C8) linear or branched alkenylenes and (C2-C8) linear or branched alkynylene.
  • X is a single bond and said phenyl is substituted for para. Even more preferably, when it is monosubstituted, said phenyl is substituted for para by a linear C1-C8 alkyl, even more preferably, said linear alkyl in para position is selected from methyl or ethyl groups.
  • the amphipols of the invention have polyacrylic acid as a precursor. Their synthesis is therefore very similar to that of other amphipols described in Gohon et al. (2006). Those skilled in the art will be able to adapt without particular difficulty the protocol for randomly grafting the groups specified on the polyacrylic acid precursor via the formation of amide bonds between a primary amine carried by said groups and a fraction of the carboxylate groups carried by the precursor.
  • the reaction is carried out in / ⁇ / - methylpyrrolidone (NMP) in the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC).
  • NMP / ⁇ / - methylpyrrolidone
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • SERCAIa sarco / endoplasmic reticulum Ca2 + -ATPase 1 a
  • SMA Styrene maleic acid copolymer, formula:
  • SMA (2: 1) is made up of two thirds of styrene and one third of maleic acid.
  • the SMA (3: 1) contains three quarters of styrene and one quarter of maleic acid.
  • A8-35 Amphipol of formula:
  • E. coli Escherichia coli
  • GFP green fluorescent protein
  • AChR acetylcholine receptor
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • the experimental data below were obtained using membrane fractions and / or proteins to study the properties of the new amphipols of the invention. These examples are not limiting, in particular, the relative efficacies of the amphipols of the invention can vary as a function of the membrane fraction or of the membrane protein considered. However, the improved solubilization and / or stabilization properties of the amphipols of the invention vis-à-vis the reference polymers are of general application.
  • Example 1 synthesis of the amphipols of the invention
  • the amphipols of the invention have polyacrylic acid as a precursor. Their synthesis is therefore very similar to that of I ⁇ 8-35 described in Gohon et al. (2006). It consists in randomly grafting the groups onto the polyacrylic acid precursor via the formation of amide bonds between a primary amine carried by the groups to be grafted and a fraction of the carboxylate groups carried by the precursor. The reaction is carried out in / V-methylpyrrolidone (NMP) in the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC). The grafting and obtaining of the different patterns can be done sequentially.
  • NMP V-methylpyrrolidone
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • the grafting of the groups corresponding to a fraction of the carboxylate groups of the precursor takes place in a second step, in NMP in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) / DCC.
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • the chemical composition of the polymer is determined by an NMR analysis of the proton and of the carbon, coupled with a pH-metric assay.
  • reaction medium is filtered on sintered glass (porosity 4) and then 1.5 g of sodium methanolate (2 eq., 27.8 mmol) are added to the filtrate. Agitation is continued for approximately 15 minutes.
  • the reaction medium is then poured into 260 ml (10 equivalent volumes) of purified and deionized water (Milli-Q ® ) and the pH is adjusted to 10 (pH paper) with sodium hydroxide (11 N).
  • the solution is kept under vigorous stirring for around thirty minutes then filtered through a sinter (porosity 4).
  • the filtrate obtained is added manually dropwise to 21 ml of 2N hydrochloric acid (3 eq., 42 mmol) with vigorous stirring.
  • the addition is carried out via a syringe, the tip of which is connected to a millipore filter system (0.45 ⁇ m PES prefilter and 0.2 ⁇ m cellulose acetate filter in series).
  • the suspension obtained is filtered through a frit (porosity 4) and the precipitate is dissolved in 50 ml of "Milli-Q ® " water after addition of 1.9 ml (1.5 eq ., 21 mmol) of sodium hydroxide 11 N.
  • This precipitation / solubilization cycle is repeated four times, then the basic solution finally obtained is dialyzed (Spectrapore membrane with cutoff threshold at 8000 g. Mol 1 ) for 24 hours against a solution of soda at 4.5 ⁇ 10 3 N and then lyophilized.
  • Example 2 analysis of the amphipol particles according to the invention by steric exclusion chromatography (SEC).
  • the purple membrane was solubilized in OTG (see example 2), then the BR complexed with the amphipols at a BR / amphipol mass ratio of 1: 5.
  • the column was equilibrated with 20 mM sodium phosphate pH 7.0, 100 mM NaCl.
  • the number of carbon atoms between the amide bond and the cycloalkyl group of the amphipols according to the invention seems to influence the size and the homogeneity of the particles which they form.
  • the addition of a carbon between the amide bond and the cycloalkyl ring results in more homogeneous particles having an elution profile comparable to that of amphipol A8-35.
  • the presence of two carbon atoms results in the formation of larger and less homogeneous particles.
  • Concerning the amphipols grafted with a phenyl group e.g.
  • the elution profiles indicate that the particles formed by these polymers have a size greater than 40 kDa and are less homogeneous compared to GA8-35.
  • the homogeneity is very clearly improved by the addition of an ethyl group (e.g. elution profile of compound 8) and results in particles of size more in relation to those of GA8-35
  • the polymers of the invention therefore constitute customizable tools which have, in an aqueous medium, self-organizing properties in particles compatible with the processes for the purification of proteins in terms of homogeneity. These particles are comparable with those formed by amphipol A8-35 which is a benchmark in the community. 3.
  • Example 3 study of the stabilizing effect.
  • the stabilizing effect for the membrane proteins of the amphipols according to the invention was tested on two model membrane proteins, SERCAI a (sarco / endoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase 1a) and the bacteriorhodopsin of Halobacterium salinarum.
  • SERCAI a is a calcium pump which requires the hydrolysis of an ATP molecule to perform its transport function.
  • This protein belongs to the “P-type” ATPase family and its transmembrane segments adopt conformational changes of large amplitudes to allow the passage of calcium ions.
  • the purple color of the BR is indicative of its native conformation.
  • the BR covalently but reversibly binds the retinal (a chromophore) via the formation of a Schiff base.
  • the protonation of this base causes the displacement of the absorption peak of the retinal from -380 nm (free form) to 570 nm or -555 nm (bound form) depending on whether the BR is embedded in the membrane or dissolved in aqueous solution.
  • the absorbance at 554 nm is therefore indicative of the native conformation of the BR.
  • the vesicles of the rabbit sarcoplasmic reticulum were prepared from muscle tissue according to the protocol described in Champeil et al. (1985). These membranes are very rich in SERCAI a.
  • the ATPase activity of SERCAIa was measured indirectly by coupling several enzymatic reactions.
  • the assay was carried out in the presence of pyruvate kinase (0.1 mg / ml) and lactate dehydrogenase (0.1 mg / ml) in order, on the one hand, to maintain constant the concentration of ATP in the sample and , on the other hand, to monitor ATP consumption by measuring the decrease in absorbance at 340 nm of NADH over time.
  • the sample buffer contains 100 mM KC1, 1 mM Mg 2+ , 0.1 mM Ca 2+ , 50 mM Tes-Tris (pH 7.5 at 20 ° C) and 1-5 mM ATP.
  • the reaction medium also contains 1 mM phosphoenolpyruvate and 0.15 mM NADH. Production of the purple membrane and preparation of BR / amphipol complexes
  • the preparation of the BR / amphipol complexes takes place according to the following stages: i) A culture of Halobacterium salinarum was carried out and the membrane fraction corresponding to the purple membrane was purified according to the protocol already described in Oesterhelt & Stoeckenius (1971 ).
  • the purple membrane was solubilized in 10 mM sodium phosphate buffer, 100 mM NaCl, 100 mM OTG, for a 48 hour incubation in a cold room with shaking and in the dark. The sample was centrifuged for 20 min. at 200,000 g at 6 ° C. The supernatant was diluted with OTG-free buffer to lower the detergent concentration from 100 mM to 18 mM.
  • the concentration of BR was determined by measuring the absorbance at 554 nm. The amount of amphipol added was calculated based on the mass of BR present in the sample, corresponding to a BR / amphipol mass ratio of 1: 5. After 20 min of incubation at 4 ° C, polystyrene beads (Bio-Beads ® SM2, BioRad) were added so that their mass corresponds to 20 times that of the detergent present in the sample. After 2 h of incubation at 4 ° C with shaking, the beads were removed.
  • BR / A8-35 or BR / A8-75 complexes positive controls
  • BR complexes with the amphipols of the invention was carried out according to the protocol of replacement and elimination of the detergent by adsorption on polystyrene beads (Bio-Beads ® , BioRad).
  • Bio-Beads ® were added to the mixture in a weight ratio Bio-Beads ® / OTG 20: 1 and incubated for 2 hours at 4 ° C.
  • the absorbance at 554 nm of each sample was measured before and after centrifugation at 100,000 g for 20 min.
  • the percentage of BR is calculated with reference to the absorbance measured in OTG before centrifugation.
  • the ratio of the BR protein with the various solubilizing agents tested is 1: 5, in a 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, 100 mM NaCl.
  • the samples were incubated at each temperature for 30 min and then cooled on ice before reading the absorbance at 554 nm.
  • Concerning BR samples in detergent (OTG, Octylthioglucoside) one step of centrifugation was performed to remove the protein aggregates.
  • the absorbance of the samples at 554 nm was measured with a UV-visible spectrophotometer taking as reference protein-free buffer. The absorbance values are normalized with respect to the absorbance measured at 4 ° C.
  • the thermal stability of the BR complexed with I ⁇ 8-35, I ⁇ 8-75 or the amphipols of the invention was analyzed.
  • the capacity of these polymers to maintain soluble BR in its native form was analyzed by measuring the absorbance of the supernatants at 554 nm.
  • the influence of the charge of the amphipols of the invention was studied by increasing the grafting rate of the polymers with isopropyl groups, which has the effect of reducing the overall charge of the amphipol. Reducing the load (via a grafting rate of isopropyl groups up to 40%) thus obtained improves the rate of BR present in its native form in the samples after replacement of the detergent by amphipol in the presence of Bio-Beads ® (compare, eg, the absorbances for compounds 7 and 13). Conversely, a lower amount of BR is found in the supernatant when the charge density is reduced (compare eg compound 11 vs. compound 15), which could be due to aggregation of BR.
  • amphipols of the invention grafted with cycloalkyl groups and / or phenyl groups up to 50% have a charge density equivalent to SMA (2: 1) or greater than SMA (3: 1).
  • SMA charge density equivalent to SMA (2: 1) or greater than SMA (3: 1).
  • all the amphipol of the invention tested make it possible to obtain more BR in its native form than the two SMAs. ( Figure 2).
  • the denaturation of the protein takes place in a very narrow temperature range, as indicated by the slope of the sigmoid obtained, with a molecular fusion temperature (Tm) around at 63 ° C ( Figure 3A).
  • Tm molecular fusion temperature
  • Figure 3A The Tm of the protein in the OTG detergent is significantly lower ( ⁇ 47 ° C, Figure 3A), which indicates a lower stabilization of the protein in OTG.
  • SMA 3: 1
  • SMA (2: 1) of ⁇ 45 ° C and ⁇ 49 ° C respectively.
  • the Tm obtained with the amphipols according to the invention are significantly higher than those in SMA and for some comparable or even greater than that of the BR / A8-35 complexes (eg compounds 4 and 3, with Tm ⁇ 57 ° C and ⁇ 66 ° C respectively, Figure 3B).
  • the amphipols according to the invention are more effective than the SMAs and can be at least as effective as the reference amphipol A8-35, or even more effective as the results obtained concerning SERCA1 suggest. . 4.
  • Example 4 evaluation of the solubilizing effect of the amphipols of the invention on membranes with high density of membrane proteins.
  • GA8-35 is known to not effectively dissolve SERCA1 in sarcoplasmic reticulum vesicles (Champeil et al., 2000). Typically, membrane proteins are always solubilized using detergents, which are then exchanged with GA8-35 to stabilize them.
  • SMA Styrene Maleic Acid copolymer
  • SMALPs for SMA lipid particies lipid particles
  • the stability of BR in SMA is relatively poor compared to that of the same protein complexed with I ⁇ 8-35.
  • the solubilization properties of SMA, A8-35 and amphipols according to the invention were compared for different types of membranes more or less rich in membrane proteins (E. coli membrane, electrical organs of T. marmorata , thylakoids of C. reinhardtii, purple membrane of H. salinarum).
  • the results obtained are specific to the membranes tested and illustrate the different properties of the different polymers.
  • a weakly effective polymer for one of these model membranes could be quite effective for another type of membrane because of its specific protein and / or lipid composition.
  • the purple membrane of Halobacterium salinarum is prepared according to the protocol described in Oesterhelt & Stoeckenius (1971).
  • the membranes extracted from electrical organs of Torpedo marmorata naturally rich in acetylcholine receptor (AChR) are prepared according to the protocol described in Sobel et al. (1977).
  • the thylakoid membranes of Chlamydomonas reinhardtti are prepared according to the protocol described in Pierre et al. (1995).
  • the membranes of Escherichia coli overexpressing the YidC protein, fused in the C-terminal position to GFP, are prepared after mechanical lysis of the bacteria with a cell mill (Constant Systems). Cell debris and unbroken cells are removed by low speed centrifugation. The supernatant is recovered and the membranes are pelleted by centrifugation at high speed (100,000 g for one hour).
  • the protocol for preparing the membranes of E. coli is described in Angius et al. (2018).
  • DMPC vesicles (50 mg / ml) were formed by extrusion after 10 passes through a polycarbonate membrane (Whatman) calibrated with pores of 100 nm in diameter.
  • the DMPC vesicles and the purple membrane are mixed so as to obtain a BR: DMPC mass ratio of 1: 5, then incubated for 30 min in a sonication bath according to the protocol already described by Knowles et al. (2009).
  • the sample buffer contains 20 mM sodium phosphate pH 7.0, 100 mM NaCl.
  • the OTG solubilization (100 mM) was carried out as described above.
  • the mass ratio BR / SMA or amphipol is 1: 6.25 and the mass ratio BR / DPMC is 1: 5.
  • the buffer used is 20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 100 mM NaCl as mentioned above.
  • the samples were incubated overnight at room temperature, with shaking, then centrifuged 20 min at 100,000 g, and the absorbance measurements carried out on the supernatants.
  • the absorbances are normalized on the absorbance value measured before the ultracentrifugation step. Solubilization of the membranes of E. a recombinant membrane protein
  • YidC is a membrane protein conserved during evolution which has 6 transmembrane domains in bacteria with gram negative staining.
  • a recombinant form fused with GFP is used as a “reporter” protein for the solubilization of membranes for the study of the properties of the amphipols of the invention.
  • the total membrane proteins present in the extracts of E membranes. coli are dosed using a colorimetric test. The protein concentration is adjusted to 2 mg / ml with 20 mM Tris buffer pH 8, 150 mM NaCl.
  • the total protein / amphipol or SMA mass ratio is 1: 1.
  • the total protein / DDM mass ratio is 1: 5.
  • the buffer used under all conditions is composed of 20 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl.
  • the samples are centrifuged for 10 min at 250,000 g.
  • pellets separated from the supernatants, are resuspended in the initial volume of solubilization with 20 mM Tris buffer pH 8, 150 mM NaCl containing 5% SDS.
  • Charging blue compatible with a measurement of fluorescence on acrylamide gel is added to these samples. It is a charge blue prepared according to the protocol described in Drew et al. (2008). The samples, corresponding to the supernatants and pellets of each condition and taken at the times indicated, are deposited on a 12% acrylamide gel.
  • the electrophoresis is carried out in the presence of SDS in the migration buffer containing Tris-glycine pH 8.3.
  • the proteins are migrated into the gel for 1 hour by applying a current of 100 V and 20 mA per gel.
  • the ImageJ software makes it possible to integrate the areas of each band to quantify the fluorescence. The results are normalized with respect to the fluorescence obtained in detergent (DDM - 1 hour).
  • AChR is an intrinsic membrane protein.
  • the electrical components of Torscherdo Marmorata are particularly rich in this protein. These organs are therefore an important source and model for studying the acetylcholine receptor.
  • the total membrane proteins present in the extracts of Torpedo marmorata membranes are assayed using a colorimetric test.
  • the protein concentration is adjusted to 1 mg / ml with 5 mM NaP buffer pH 7.2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA.
  • the total protein / amphipol or SMA mass ratio is 1: 5.
  • the total protein / CHAPS mass ratio is 1: 4.
  • the samples are incubated for one hour at 4 ° C, with shaking before being centrifuged for 20 min at 100,000 g.
  • the pellets, separated from the supernatants, are resuspended in the initial volume of solubilization with 5 mM NaPi buffer pH 7.2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA.
  • the samples corresponding to the supernatants and pellets of each condition, are mixed with charge blue prepared according to the protocol described in Laemmli (1970) before being deposited on a 10% acrylamide gel.
  • the electrophoresis is carried out in the presence of SDS in the migration buffer containing Tris-glycine pH 8.3.
  • the proteins are migrated into the gel for 1 hour by applying a current of 100 V and 20 mA per gel.
  • each gel is colored with Coomassie blue and a photo of the gels, in white light, is taken.
  • the purple membrane of Halobacterium salinarum comprises 75% of BR for 25% of lipids. Due to this unique composition, its solubilization by SMA is only possible when the membrane is previously fused with DPMC vesicles, in order to “dilute” the BR protein in lipids (Knowles et al., 2009; Orwick- Rydmark et al., 2012). Under these conditions, the amphipol of the invention are also capable of solubilizing BR, while GA8-35 remains ineffective (Figure 4B).
  • amphipols of the invention comprising a grafting with a phenyl group
  • the addition of an ethyl group on the aromatic site makes it possible to increase the solubilization properties (compare the percentage of BR solubilized for compounds 4, 6 and 8).
  • the location of the ethyl group in para (position 4) or ortho (position 1) does not seem to matter, compounds 8 and 24 allowing a comparable solubilization (Figure 4B).
  • amphipols of the invention having a grafting with a cycloalkyl are particularly effective with regard to the solubilization of BR.
  • Compound 23 in particular is found to be as effective as SMA (2: 1) (compare the size of the pellets) but the amount of BR present in its native form in the supernatant is higher than that obtained with SMA (2: 1) or SMA (3: 1); compound 21 being significantly more effective than SMA (2: 1).
  • the amphipol polymers of the invention exhibit better efficiency.
  • extraction of the recombinant protein of interest as I ⁇ 8-35 and SMAs. Indeed, after two hours of incubation, in the presence of the amphipol polymers of the invention, the amount of protein extracted is approximately 80%, against approximately 35% in the presence of A8-35 or SMAs.
  • the kinetics of extraction of the membrane protein of interest is faster (Figure 7).
  • the amphipols of the invention are effective at low concentrations and allow faster extraction, which is particularly advantageous, in particular in the context of production of recombinant membrane proteins.
  • This result indicates that the molecular architecture of the hydrophobic group can play an important role in the amphipols of the invention.
  • amphipols of the invention are also particularly more effective in solubilizing the sodium potassium pump of the membranes of the electrical organs of T. marmorata than A8-50 or A8-35.
  • amphipols of the invention also prove to be more effective in solubilizing AchR or the sodium potassium pump than A8-35, A8-50 and SMA 3-1 (data not shown) .
  • the purple membrane was fused to DMPC vesicles according to the protocol described by Orwick-Rydmark et al. (2012) before initiating the solubilization step with the amphipols. After 24 hours of incubation at room temperature, the samples were centrifuged at 100,000X g for 20 min. The supernatants were separated from the pellet.
  • the polymers of the invention tested make it possible to dissolve BR as effectively as SMA (3: 1) while stabilizing the protein at least as effectively as I ⁇ 8-35 (compare the absorbances for compounds 19 and 23 with the reference polymers, Figures 5 A and B and Figure 6). 6.
  • the new amphipols of the present invention constitute particularly advantageous new polymers.
  • the purification of membrane proteins requires solubilizing them while preserving their conformation and their stability, these two stages can seem contradictory, the solubilization implying in particular the use of surfactants with dissociative power which generally lead in the course of time to denaturation at least partial membrane proteins.
  • the results show that the new amphipols of the invention have interesting solubilization properties for the purification of membrane proteins, while preserving the stability of these proteins and therefore their conformation and their biological activity, which is essential for their study or their use in biotechnological applications and not observed with the polymers of the prior art.
  • the polymers of the invention are also effective at low concentrations, which is particularly advantageous for these applications.

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Abstract

L'invention porte sur de nouveaux composés polymères de formule I (Formule I) qui permettent la solubilisation et/ou la stabilisation de protéines membranaires, elle concerne en particulier les complexes qu'ils forment avec des protéines membranaires et le procédé de solubilisation et/ou stabilisation de protéine membranaire comprenant l'utilisation de ces composés.

Description

NOUVEAUX AMPHIPOLS
[0001] L’invention concerne de nouveaux polymères amphiphiles appelés « amphipols ».
[0002] Ces polymères amphipatiques sont connus dans l’état de l’art pour permettre la stabilisation des protéines membranaires en solution aqueuse une fois celles-ci extraites des membranes via l’utilisation de détergents.
[0003] Les protéines membranaires représentent environ 30% des protéines codées par le génome des cellules et sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires importantes (signalisation, sécrétion, migration, adhérence, homéostasie, production d’énergie, etc). Les protéines membranaires peuvent être monomériques ou oligomériques. De par leur intégration dans les membranes, elles sont fortement structurées en hélices a ou feuillets b pour les parties transmembranaires interagissant avec les chaînes alkyles des lipides membranaires.
[0004] Les nombreuses fonctions et activités enzymatiques qu’elles assument en font des cibles pharmacologiques ou des outils biotechnologiques de choix. Cependant, leur étude fonctionnelle et structurale en solution et leur utilisation dans le développement d’outils thérapeutiques ou biotechnologiques impliquent leur production en quantité importante, leur purification et leur maintien dans une conformation active or celles-ci sont le plus souvent instables une fois extraites de la membrane. Cette instabilité en solution aqueuse est notamment due à l'utilisation obligatoire de tensioactifs pour empêcher leur agrégation. En effet, la surface des domaines extra membranaires de ces protéines est principalement recouverte d’acides aminés à chaînes latérales hydrophiles tandis que la surface de leur domaine transmembranaire est recouverte d’acides aminés à chaînes hydrophobes ; les protéines membranaires sont donc hautement insolubles dans l'eau en raison de l'effet hydrophobe qui les pousse à s'agréger en solution afin de minimiser les perturbations du réseau de liaisons hydrogène entre les molécules d'eau.
[0005] Il existe de nombreuses stratégies pour produire les protéines membranaires en quantité suffisante ainsi qu’un grand choix de molécules chimiques permettant leur purification (les rendements étant souvent limités), solubilisation et stabilisation en solution aqueuse.
[0006] Les détergents disponibles sur le marché permettent de solubiliser les protéines mais provoquent, comme mentionné, leur dénaturation et inactivation plus ou moins rapides notamment du fait du pouvoir dissociant des détergents ; en outre il est nécessaire de maintenir ceux-ci en solution à des concentrations au-dessus de leur concentration micellaire critique (CMC). D’un autre côté, les tensioactifs tels que les amphipols (WO 98/27434) permettent de stabiliser les protéines mais offrent des propriétés de solubilisation beaucoup plus faibles. Les amphipols sont des polymères amphiphiles définis comme étant capables de maintenir les protéines membranaires dans leur conformation native, soluble, sous la forme de petits complexes (Zoonens & Popot, 2014). L’amphipol le plus communément utilisé et étudié est IΆ8-35. Il est constitué d’un squelette d'acide polyacrylique sur lequel sont greffées des chaînes latérales d'octylamine et d'isopropylamine : 35% de groupes acides carboxyliques non greffés, 25% de dérivés carboxyliques greffés avec des chaînes octyle (octylamine) et 40% de groupes carboxyliques greffés avec des groupes isopropyliques (isopropylamine). Les amphipols de type A8-35 nécessitent généralement la solubilisation préalable des membranes en utilisant un détergent, subséquemment remplacé par l’amphipol au moyen de la dilution du détergent sous sa CMC (ce qui a le désavantage de diluer également les protéines) ou de son adsorption sur des billes. D’autres polymères amphiphiles ont été développés. Parmi ceux-ci on peut noter les SMAs (pour Styrene Maleic Acid copolymers, WO2011004158) et leurs dérivés qui présenteraient la particularité de pouvoir solubiliser les protéines membranaires directement à partir des fractions membranaires, sans la solubilisation préalable au moyen d’un détergent. Cependant les SMAs, au contraire des amphipols qui se purifient simplement à l’issue de leur synthèse, présentent toujours des impuretés qui préemptent l’utilisation ultérieure des protéines pour des applications biotechnologiques.
[0007] Les stratégies de purification des protéines et notamment des protéines membranaires, recombinantes ou non, sont généralement empiriques et difficilement prédictibles, dépendant notamment de la protéine, du (micro)organisme ou encore de la composition de la membrane ; il est généralement procédé à des essais successifs de différents agents pour solubiliser et/ ou stabiliser les protéines membranaires, afin d’identifier l’agent le plus efficace dans ces conditions.
[0008] Dans ce contexte, la fourniture de nouveau outils alternatifs pour la production des protéines membranaires d’un haut intérêt biotechnologique est désirable. Notamment, des polymères possédant à la fois des propriétés de solubilisation et de stabilisation des protéines membranaires seraient particulièrement avantageux et n’existent pas à l’heure actuelle. Les nouveaux Amphipols objets de l’invention répondent à ce besoin. RESUME
[0009] L’invention a donc pour but de fournir de nouveaux composés pour permettre la solubilisation et la stabilisation de protéines membranaires. Plus particulièrement l’invention concerne des nouveaux amphipols, polymères vinyliques amphiphiles ayant des propriétés de solubilisation améliorées tout en permettant une stabilisation satisfaisante des protéines membranaires.
[0010] A cet effet, l’invention porte sur des polymères vinyliques amphiphiles de formule I,
Formule I dans laquelle :
M+ est un métal alcalin, de préférence sélectionné parmi Li+, Na+, K+,
Ri, R4, R5, Re sont, chacun indépendamment, l'atome d'hydrogène ou le radical méthyle,
R2, R6, R9 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi l’atome d’hydrogène et les (C1-C8) alkyles linéaires ou ramifiés,
R10 est un groupe sélectionné parmi les (C1-C5) alkyles linéaires ou ramifiés,
R3 et R7 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi : l’hydrogène, X étant alors une simple liaison
les alkyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, les alcényles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, ou les alcynyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, X étant alors une simple liaison,
les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés , X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés , X une simple liaison ou étant alors sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, étant entendu que lorsque que l’un des groupes R3 ou R7 est un alkyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, un alcényle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un alcynyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un atome d’hydrogène, X étant alors une simple liaison, alors, l’autre groupe R3 ou R7 est sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés , X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1 -C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés , X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1 -C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, et un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, w, x, y, z correspondant aux pourcentages respectifs des motifs, x étant compris entre 20 et 90 %,
y étant compris entre 0 et 80 %,
w étant compris entre 0 et 80%, et
z étant compris entre 0 et 60 %, étant entendu que w+x+y+z=100 % et que y ou w est au moins égal à 10%.
Selon une caractéristique optionnelle le polymère vinylique amphiphile de formule I est tel que w=0 et R7 est un groupement sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, ou
- un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés,
X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés.
[001 1] Selon d’autres caractéristiques optionnelles le polymère vinylique amphiphile de formule I est tel que :
R3 et/ou R7 sont des (C6-C8) cycloalkyles tels que précédemment spécifiés, ou
R3 et/ou R7 sont un phényle, préférentiellement ledit phényle est substitué en para par un groupe méthyle ou éthyle,
X étant une simple liaison, ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés.
[0012] Selon d’autres caractéristiques optionnelles le polymère vinylique amphiphile de formule I est tel que :
R3 et/ou R7 sont des (C6-C8) cycloalkyles tels que précédemment spécifiés, X étant préférentiellement une simple liaison ou CH2,
R3 et/ou R7 sont un phényle, préférentiellement ledit phényle est substitué en para par un groupe méthyle ou éthyle, X étant une simple liaison, ou R3 et/ou R7 sont un groupe styrényle. X étant une simple liaison.
[0013] Selon d’autres caractéristiques optionnelles, le polymère vinylique amphiphile de formule I est tel que : le métal M est Na+,
R10 est un groupe isopropyle,
x est inférieur ou égal à 75%,
- w et/ou y est supérieur ou égal 25%, w et/ou y est compris entre 25 % et 50 % et z est compris entre 0 % et 40 %, préférentiellement entre 15 % et 40%, ou
il est fonctionnalisé par greffage de tag d’affinité, de sonde fluorescente ou de molécule immunostimulatrice.
[0014] Selon une autre caractéristique optionnelle, le polymère vinylique de formule I est tel que :
Ri, R2, R4, R5, R6, Re, Rg sont l'atome d'hydrogène,
R3 et/ou R7 est un {Ce-Cs) cycloalkyle et X est une simple liaison,
R10 est un groupe isopropyle,
x est égal à 35% ou 50%,
y est supérieur ou égal à 25 %,
- w est égal à 0 %, ou 25%, et
z est égal à 0%, 15 % ou 40%, étant entendu que w+x+y+z=100 %.
[0015] Selon une autre caractéristique optionnelle, le polymère vinylique de formule I est sélectionné parmi les composés listés dans le tableau I.
[0016] Les polymères vinyliques de l’invention sont des amphipols, c’est à dire qu’ils sont capables de maintenir solubles les protéines membranaires dans leur conformation native, sous la forme de petits complexes. Ainsi, dans un autre de ses aspects, l’invention concerne donc le complexe hydrosoluble formé par i) une protéine membranaire ou bien un mélange de protéines membranaires et ii) au moins un composé, polymère vinylique amphiphile, tel que décrit ci-dessus.
[0017] Selon une caractéristique optionnelle le complexe hydrosoluble ainsi formé est tel qu’il comprend en outre des composés lipidiques.
[0018] En outre les polymères de l’invention permettent de stabiliser les protéines membranaires en solution aqueuse. Ainsi un objet de l’invention est le complexe hydrosoluble formé par i) une protéine membranaire ou bien un mélange de protéines membranaires et ii) au moins un composé, polymère vinylique amphiphile de l’invention au sein duquel les protéines membranaires sont stabilisées en solution aqueuse. Un autre objet de l’invention est donc une solution comprenant un tel complexe.
[0019] L’invention porte également sur un procédé de préparation d’une solution aqueuse de protéine(s) membranaire(s), ledit procédé comprenant une étape de solubilisation et ou stabilisation dans laquelle la fraction protéique provenant d’une membrane biologique ou synthétique contenant ladite protéine membranaire, ou ledit mélange de protéines membranaires, est mis en présence du polymère vinylique tel que décrit ci-dessus.
[0020] Selon des caractéristiques optionnelles, ce procédé est tel que : la ou les protéines membranaires sont des protéines recombinantes exprimées dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, et/ou des protéines natives exprimées dans des membranes spécialisées à haute densité protéique, une étape de solubilisation de ladite protéine membranaire ou dudit mélange de protéines membranaires est préalablement réalisée au moyen d’un milieu détergent, une étape de fusion de la fraction de protéique contenant ladite protéine membranaire, ou ledit mélange de protéines membranaires, est préalablement réalisée au moyen de vésicules de phospholipides ou de mélange de phospholipides, de préférence de 1 ,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), ou la solution de fraction protéique contenant ladite protéine membranaire n’est pas une solution de protéine(s) membranaire(s) en milieu détergent sous forme micellaire.
[0021] Les complexes de l’invention protéine(s) membranaire(s)-amphipols de l’invention en permettant la solubilisation et la stabilisation de ces protéines sous leur forme native, permettent les applications biotechnologiques de ces protéines. Ainsi, un objet de la présente invention est également l’utilisation des complexes de l’invention comme réactifs dans des kits de réactifs, et notamment un kit de diagnostic comprenant au moins un complexe de l’invention à titre de réactif immunologique. Également, les complexes de l’invention peuvent être fixés sur un dispositif faisant usage de l’activité de ladite protéine membranaire ainsi purifiée et solubilisée par les amphipols de l’invention à des fins de diagnostic ou de mesure d’activité.
[0022] D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre d’exemple illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées qui représentent : Figure 1 : Analyse par chromatographie d’exclusion stérique des particules formées par les amphipols de l’invention, IΆ8-35, ainsi que de leur complexe avec la bactériorhodopsine (BR). Vo=volume mort ; =volume total.
Figure 2 : Complexation de la BR avec des amphipols selon l’invention, avant (barres noires) ou après centrifugation (barres grises).
Figure 3 : Dénaturation thermique de la BR dans différents environnements.
Figure 4 : Solubilisation de la membrane pourpre de Halobacterium salinarum avant (A) ou après (B) fusion avec des vésicules de DMPC avec IΆ8-35, les SMAs ou des amphipols de l’invention.
Figure 5 : Quantification de la BR extraite de la membrane pourpre, préalablement fusionnée aux vésicules de DMPC, par IΆ8-35, les SMAs, ou de polymères de l’invention (A) et analyse de la stabilité thermique de ces complexes après 6 heures d’incubation à 50°C (B). Les ratios des valeurs d’absorbance mesurées au début et à la fin de chaque expérience sont reportés.
Figure 6 : Extraction de la membrane pourpre. (A) Quantification de la solubilisation (barres grises) et stabilité thermique (barres noires) de la BR de la membrane pourpre, préalablement fusionnée aux vésicules de DMPC, par IΆ8-35, les SMAs, ou de polymères de l’invention chaque condition réalisée au moins en triplicat valeurs +/- SD ; (B). Cinétique de déstabilisation thermique des complexes formés avec les SMAs ou les polymères 19 et 23 sur 6 heures d’incubation à 50°C. Les valeurs d’absorbance mesurées à 554 nm ont été normalisées avec celles mesurées avant incubation des échantillons.
Figure 7 : Cinétique de solubilisation de la protéine YidC-GFP surexprimée dans la membrane plasmique d’Escherichia coli en présence de SMAs, de polymères de l’invention ou de DDM. (A) Photographies des gels d’électrophorèse révélant la fluorescence de la GFP fusionnée à la protéine membranaire YidC et (B) représentation graphique de la quantification de la fluorescence à partir de l’image des gels en prenant comme référence la fluorescence mesurée en présence de DDM après 1 heure d’incubation.
Figure 8 : Solubilisation des membranes riches en AChR de Torpédo marmorata avec IΆ8-35, les SMAs et des amphipols de l’invention. Les échantillons correspondant aux surnageants (S) et culots (C) de chaque condition ont été déposés sur gel d’acrylamide, qui après migration a été coloré au bleu de Coomassie. Les flèches indiquent l’emplacement des bandes correspondant aux sous-unités de AchR et à la Na7K+ ATPase de Torpédo marmorata. Les protéines présentent dans les culots ne sont pas solubilisées, les protéines dans le surnageant correspondent aux protéines solubilisées.
DESCRIPTION DE L’INVENTION ET AUTRES MODES DE REALISATION
[0023] L’invention concerne de nouveaux amphipols qui permettent la solubilisation et la stabilisation de protéines membranaires en milieu aqueux. Notamment les nouveaux amphipols de l’invention ont des propriétés de solubilisation et/ou de stabilisation améliorées par rapport aux polymères de référence utilisés pour solubiliser les protéines membranaires. Les complexes ainsi formés avec les protéines membranaires sont particulièrement adaptés pour les applications biotechnologiques et l’étude de ces protéines membranaires.
[0024] Dans la suite de la description, l’expression « amphipol » désigne des polymères vinyliques capables de maintenir solubles les protéines membranaires dans leur conformation native, sous la forme de petits complexes.
[0025] L'expression « vinylique » englobe dans sa signification générale les
polymères acryliques.
[0026] L’expression « protéine membranaire » est indifféremment utilisée au singulier ou au pluriel, elle englobe les mélanges de protéines membranaires ou bien des préparations comprenant substantiellement un seul type de protéine. Au sens de l’invention une protéine membranaire est une protéine traversant de part et d’autre la membrane, elle comprend alors au moins un domaine transmembranaire ou bien une protéine comprenant au moins un domaine hydrophobe interagissant avec la membrane. La protéine membranaire peut être monomérique ou bien oligomérique, associée ou non à des cofacteurs.
[0027] Au sens de l’invention, une protéine membranaire « stabilisée » correspond à une protéine membranaire solubilisée conservant une conformation native et, de préférence, au moins une part de son activité biologique, même si celle-ci peut être transitoirement bloquée.
[0028] L’expression « membranes spécialisées » englobe, au sens de l’invention, les membranes des organelles eucaryotes telles que, par exemple, les crêtes des mitochondries, les thylakoïdes des chloroplastes, le réticulum endoplasmique ou sarcoplasmique ; « membrane spécialisée » englobe également des membranes à haute densité protéique comprenant au moins 50% de protéines membranaires, intégrales ou non, voire au moins 60% ou encore au moins 70% de protéines membranaires, telle que, par exemple, la membrane pourpre de la bactérie Halobacterium salinarum (qui peut comprendre jusque 75% de bactériorhodopsine), le reste comprenant des lipides ou autres molécules.
[0029] L’expression « membrane biologique » s’entend, au sens de l’invention, de toute membrane lipidique extraite ou provenant d’une cellule ou d’un organisme tels que bactérie, champignon, cellules eucaryotes etc. L’expression « membrane biologique synthétique » désigne toute membrane lipidique reconstituée, recomposée ou modifiée avec des lipides de synthèse ou d’origine naturelle. Ainsi, par exemple et de manière non limitative, une membrane synthétique peut correspondre à une membrane lipidique extraite d’un organisme à laquelle on adjoint un ou des lipides synthétiques, une membrane fabriquée à partir de lipides synthétiques ou une membrane lipidique reconstituée à partir de lipides naturels et ou synthétiques mélangés à dessein.
[0030] L’expression « fraction protéique » comprend, au sens de l’invention, la fraction cellulaire contenant la protéine membranaire recherchée ou analysée. Ainsi il peut s’agir d’homogénat cellulaire plus ou moins clarifié et/ou purifié. S’agissant de protéines membranaires, l’expression « fraction protéique » désigne notamment une fraction de cet homogénat comme la fraction membranaire ou bien la fraction correspondant à un compartiment cellulaire.
[0031] L’invention concerne donc un polymère vinylique amphiphile de formule I:
Formule I dans laquelle : M+ est un métal alcalin, de préférence sélectionné parmi Li+, Na+, K+,
Ri, R4, R5, Re sont, chacun indépendamment, l'atome d'hydrogène ou le radical méthyle,
R2, R6, R9 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi l’atome d’hydrogène et les (C1-C8) alkyles linéaires ou ramifiés,
R10 est un groupe sélectionné parmi les (C1-C5) alkyles linéaires ou ramifiés, R3 et R7 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi : l’hydrogène, X étant alors une simple liaison
les alkyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, les alcényles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, ou les alcynyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, X étant alors une simple liaison,
les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1 -C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
les polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1 -C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1 -C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1 -C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, étant entendu que lorsque l’un des groupes F¾ ou R7 est un alkyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, un alcényle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un alcynyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un atome d’hydrogène, X étant une simple liaison, alors, l’autre groupe F¾ ou R7 est sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1 - C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1 -C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1 -C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, w, x, y, z correspondant aux pourcentages respectifs des motifs, x étant compris entre 20 et 90 %,
y étant compris entre 0 et 80 %,
w étant compris entre 0 et 80%, et
z étant compris entre 0 et 60 %, étant entendu que w+x+y+z=100 % et que y ou w est au moins égal à 10%.
[0032] Il découle de manière évidente de la définition du paragraphe précédent que, lorsque l’un des groupes R3 ou R7 est un alkyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, un alcényle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un alcynyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un atome d’hydrogène, X étant une simple liaison, alors, l’autre groupe R3 ou R7 étant tel que spécifié et défini ci-dessus, alors w et y sont différents de 0.
[0033] Dans un mode de réalisation particulier, le polymère de formule I est tel que: M+ est un métal alcalin, de préférence sélectionné parmi Li+, Na+, K+,
Ri, R4, R5, Re sont, chacun indépendamment, l'atome d'hydrogène ou le radical méthyle,
R2, R6, R9 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi l’atome d’hydrogène et les (C1-C8) alkyles linéaires ou ramifiés, Rio est un groupe sélectionné parmi les (C1-C5) alkyles linéaires ou ramifiés,
R3 et/ou R7 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés , X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X une simple liaison ou étant alors sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, w, x, y, z correspondant aux pourcentages respectifs des motifs, x étant compris entre 20 et 90 %,
y étant compris entre 0 et 80 %,
w étant compris entre 0 et 80%, et z étant compris entre 0 et 60 %, étant entendu que w+x+y+z=100 % et que y ou w est au moins égal à 10%.
[0034] Dans un mode de réalisation particulier, le polymère de formule I est tel que :
M+ est un métal alcalin, de préférence sélectionné parmi Li+, Na+, K+,
Ri, F¾, R5, Re sont, chacun indépendamment, l'atome d'hydrogène ou le radical méthyle,
R2, R6, R9 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi l’atome d’hydrogène et les (C1-C8) alkyles linéaires ou ramifiés,
R10 est un groupe sélectionné parmi les (C1-C5) alkyles linéaires ou ramifiés,
R3 et R7 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi : l’hydrogène, X étant alors une simple liaison
les alkyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, les alcényles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, ou les alcynyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, X étant alors une simple liaison,
les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, étant entendu que lorsque l’un des groupes F¾ ou R7 est un alkyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, un alcényle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un alcynyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un atome d’hydrogène, X étant une simple liaison, alors, l’autre groupe F¾ ou R7 est sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1 - C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1 -C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1 -C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1 -C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, w, x, y, z correspondant aux pourcentages respectifs des motifs, x étant compris entre 20 et 90 %,
y étant compris entre 0 et 80 %,
w étant compris entre 0 et 80%, et
z étant compris entre 0 et 60 %, étant entendu que w+x+y+z=100 % et que y ou w est au moins égal à 10%. [0035] Dans un mode de réalisation particulier, quand F¾ et/ou R7 est un groupe sélectionné parmi les alkyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, les alcényles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, ou les alcynyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, X étant alors une simple liaison, alors lesdits alkyles, alcényles, ou alcynyles comptent moins de 18, de 17, de 16, de 15, de 14, de 13, de 12, de 11 , de 10, de 9, de 8, ou moins de 7 atomes de carbone.
[0036] La masse molaire moyenne des amphipols selon l’invention est inférieure à100000 g. mol 1, de préférence comprise entre 2000 et 50000 g. mol 1.
[0037] Il est indiqué ci-après des modes de réalisation de l'invention, qui peuvent être pris ou non en combinaison avec un autre ou entre certains d'entre eux.
[0038] Dans un mode de réalisation particulier, M+ est Na+.
[0039] Dans un mode de réalisation particulier, y et/ou w est supérieur ou égal à 25%.
En effet les polymères greffés à ce pourcentage sont particulièrement efficaces, comme le montre la partie expérimentale.
[0040] Dans un mode de réalisation particulier, R2, R6, Rg sont l’hydrogène.
[0041] Dans un mode de réalisation particulier, w=0 et R7 est un groupement sélectionné parmi les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés. De préférence, X est une simple liaison et R7 est un C6 cycloalkyle, de préférence, un C7 cycloalkyle, de manière encore plus préférée un C8 cycloalkyle. Alternativement, X est un (C1-C8) alkylène linéaire ou ramifié, de préférence un méthyle ou un éthyle.
[0042] Dans un autre mode de réalisation particulier w=0 et R7 est un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés. De préférence, X est une simple liaison et ledit phényle est substitué en para. De manière encore plus préférée, lorsqu’il est monosubstitué, ledit phényle est substitué en para par un alkyle linéaire en C1-C8, de manière encore plus préférée, ledit alkyle linéaire en position para est sélectionné parmi les groupes méthyle ou éthyle.
[0043] Dans un mode de réalisation, w=0 et R7 est un phényle substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés et X est sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, de préférence, un C1 alkylène ou un C2 alkylène.
[0044] Dans un mode de réalisation particulier, w et y sont différents de 0 et R3 et R7 sont, indépendamment l’un de l’autre : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2- C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés,
des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou
un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, de manière préférée, R3 et R7 sont alors indépendamment l’un de l’autre : un C6 cycloalkyle, de préférence, un C7 cycloalkyle, de manière encore plus préférée un C8 cycloalkyle,
un phényl, de manière encore plus préférée substitué en para par un alkyle linéaire en C1-C8 lorsqu’il est monosubstitué, de manière encore plus préférée, ledit alkyle linéaire en position para est sélectionné parmi les groupes méthyle ou éthyle, X étant alors une simple liaison, ou
un phényle substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1- C8) alkyle linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés et X est sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, de préférence, un C1 alkylène ou un C2 alkylène, de manière encore plus préférée, R3 et R7 sont différents l’un de l’autre.
[0045] Dans un autre mode de réalisation particulier, R3 et/ou R7 est un groupement sélectionné parmi les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, de préférence un méthyle ou un éthyle.
[0046] Dans un autre mode de réalisation particulier, R3 et/ou R7 est un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, de préférence un méthyle ou un éthyle. De préférence, X est une simple liaison et ledit phényle est substitué en para. De manière encore plus préférée, lorsqu’il est monosubstitué, ledit phényle est substitué en para par un alkyle linéaire en C1-C8, de manière encore plus préférée, ledit alkyle linéaire en position para est sélectionné parmi les groupes méthyle ou éthyle. [0047] Dans un autre mode de réalisation, z est différent de 0 ; de manière préférée Rio est alors un groupe isopropyle, de manière encore plus préférée, R10 est un groupe isopropyle et, concernant les motifs comprenant R3 et/ou R7, X est sélectionné parmi les (C1 -C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, R3 et/ou R7 étant sélectionnés parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés,
- les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés,
des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, ou un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1- C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés. [0048] Dans un mode de réalisation particulier, le polymère vinylique amphiphile de formule I est choisi parmi les composés listés dans le tableau I ci-dessous, M+ étant un métal alcalin, de préférence sélectionné parmi Li+, Na+, K+ ; dans un mode de réalisation particulier, M+ est Na+.
Tableau I
[0049] Comme mentionné, au sein des polymères vinyliques de l’invention, les pourcentages w, x, y et z des différents motifs peuvent varier, étant entendu que w+x+y+z = 100%. Les pourcentages étant spécifiés avec une précision de plus ou moins 10%. Ainsi, par exemple, si un pourcentage pour un motif est spécifié comme étant de 50%, il doit être entendu que ce motif peut être présent entre 45% et 55% dans le polymère de l’invention.
[0050] Dans un mode de réalisation particulier, x est inférieur ou égal à 75%. [0051] Dans un autre mode de réalisation w et/ou y est compris entre 25 % et 50 % et z est compris entre 0 % et 40 %, préférentiellement entre 15 % et 40%.
[0052] Dans un mode de réalisation particulier, w+y est supérieur ou égal à 25%, de préférence inférieur à 50%.
[0053] Dans un autre mode de réalisation particulier, les polymères selon l’invention sont sélectionnés parmi les composés du tableau I avec les proportions w, x, y et z telles que spécifiées dans le tableau II ci-dessous.
Tableau 2
[0054] Comme démontré dans la partie expérimentale les composés de l’invention, polymères vinyliques amphiphiles, sont des nouveaux amphipols particulièrement aptes à solubiliser et stabiliser les protéines membranaires, notamment au regard d’autres polymères tels que IΆ8-35 ou le SMA. Ainsi les complexes formés avec les protéines membranaires sont d’un intérêt particulier concernant l’étude des protéines membranaires ainsi que pour les applications biotechnologiques de ces protéines. La stabilisation des protéines dans leur état natif et/ou au moins en partie la préservation de leur activité est essentielle pour ces applications ; comme démontré dans la partie expérimentale, les polymères de l’invention permettent la solubilisation des protéines membranaires et cette stabilisation. Notamment la solubilisation peut s’opérer sans détergent ce qui est particulièrement avantageux. [0055] Il n’y a pas de limitation quant au type de protéines membranaires au sein des complexes objets de l’invention. D’un point de vue biotechnologique, les protéines membranaires, connues pour être impliquées dans des pathologies, comme étant des cibles médicamenteuses ou susceptibles d’être immunogènes sont particulièrement préférées. [0056] Les applications envisageables pour ces complexes, sont donc, par exemple : la RMN dans un milieu liquide ou solide, la microscopie électronique, le diagnostic : la recherche d'anticorps circulants, solubles ou portés par des lymphocytes, la vaccination ou production d’anticorps: présentation des protéines membranaires comme immunogènes, détection/utilisation de l’activité enzymatique des protéines membranaires lorsque celles-ci sont des enzymes, en pharmacologie, mesure de l'affinité des récepteurs cellulaires pour des molécules d'intérêt pharmaceutique.
[0057] De ce point de vue les polymères de l’invention fonctionnalisés sont particulièrement avantageux. L’homme de l’art saura identifier les moyens de fonctionnalisation pertinents pour l’utilisation envisagée des polymères de l’invention. A titre d’exemple, et de façon non limitative, de tels moyens peuvent être sélectionnés parmi ceux présentés par Le Bon et al. (2014).
[0058] Comme mentionné, un objet de l’invention est les complexes formés par les polymères de l’invention tels que décrits dans la présente demande et les protéines membranaires. Dans un mode de réalisation particulier, pour les applications susmentionnées, les complexes de l’invention peuvent être présents au sein d’une solution aqueuse, sous forme lyophilisée ou bien immobilisés dans une matrice ou sur une surface via les groupements fonctionnels greffés sur le polymère de l’invention.
[0059] L’homme de l’art saura déterminer expérimentalement le ratio massique optimum entre le polymère de l’invention et la protéine membranaire pour obtenir une solubilisation et/ou une stabilisation de la protéine membranaire satisfaisante. Dans un mode de réalisation particulier d’échange du détergent pour l’amphipol A8-35, le ratio protéine:amphipol est compris entre 1 :0,1 et 1 :10, de préférence entre 1 :1 et 1 :7,5, de manière encore plus préférée entre 1 :1 ,5 et 1 :5.
[0060] Comme exposé dans la partie expérimentale, ces composés sont des amphipols, ils permettent la stabilisation et/ou la solubilisation des protéines membranaires sans l’utilisation de détergent qui sont connus pour avoir un effet négatif sur la stabilité et donc l’activité des protéines. Avantageusement, dans un mode de réalisation, ce complexe est donc substantiellement dépourvu de détergent.
[0061] Dans un autre mode de réalisation, les complexes hydrosolubles de l’invention comprennent des lipides ou un mélange de lipides. Ceux-ci peuvent être utiles pour diluer les protéines membranaires, comme exposé dans la partie expérimentale, ou bien provenir de la membrane de l’organisme ou de l’organelle dont provient la protéine membranaire solubilisée et stabilisée au sein du complexe. Dans un mode de réalisation particulier, ledit lipide est de la 1 ,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC).
[0062] Avantageusement, le complexe hydrosoluble peut comprendre l’ensemble des sous-unités d’une protéine multimérique ou tout cofacteur associé avec la protéine membranaire, comme le montrent les expérimentations de solubilisation et de stabilisation de la bactériorhodopsine présentées dans la partie expérimentale.
[0063] Comme évoqué, l’invention concerne également un procédé de préparation d’une solution aqueuse de protéine(s) membranaire(s) stabilisées et présentes au sein de complexes avec les polymères de l’invention.
[0064] Il est connu dans l’art antérieur un procédé de préparation des complexes protéines membranaires avec des amphipols de l’état de l’art tels que A8-35, ce procédé impliquant la solubilisation préalable des protéines membranaires via leur mise en présence avec un milieu détergent. Un tel procédé implique par la suite le remplacement du détergent par l’amphipol en abaissant la concentration du détergent à une concentration inférieure à la concentration micellaire critique. L'abaissement de la concentration du détergent pouvant être réalisée par dilution, adsorption des détergents par exemple sur des billes Bio-Beads® SM-2, dialyse, séparation sur tamis moléculaire ou sur gradient. Cependant cette étape supplémentaire s’effectue la plupart du temps au détriment du rendement ou de la concentration finale en complexe contenant la protéine membranaire.
[0065] Les nouveaux amphipols de l’invention ont la capacité de solubiliser les protéines membranaires sans cette étape préliminaire de solubilisation par l’utilisation d’une préparation détergente. Ainsi un objet de l’invention est l’utilisation de polymères de l’invention pour solubiliser et/ou stabiliser les protéines membranaires.
[0066] Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d’une solution de protéine membranaire ou d’un mélange de protéines membranaires, selon l’invention ne comprend pas l’étape de dissolution au moyen d’une préparation détergente, la solubilisation étant réalisée au moyen d’un des polymères de l’invention. Dans un mode de réalisation encore plus particulier, le polymère est sélectionné parmi les polymères de formule I sélectionnés tels que - w=0 et R7 est un groupe sélectionné parmi les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-
C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés. De préférence, X est une simple liaison et R7 est un C6 cycloalkyle, de préférence, un C7 cycloalkyle, de manière encore plus préférée un C8 cycloalkyle. w=0 et R7 est un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1- C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés. De préférence, X est une simple liaison et ledit phényle est substitué en para. De manière encore plus préférée, lorsqu’il est monosubstitué, ledit phényle est substitué en para par un alkyle linéaire en C1-C8, de manière encore plus préférée, ledit alkyle linéaire en position para est sélectionné parmi les groupes méthyle ou éthyle.
[0067] Dans un mode de réalisation, w=0 et R7 est un phényle substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés et X est sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, de préférence, un C1 alkylène ou un C2 alkylène.
[0068] Les amphipols de l’invention ont pour précurseur l’acide polyacrylique. Leur synthèse est donc très similaire à celle d’autres amphipols décrite dans Gohon et al. (2006). L’homme de l’art saura adapter sans difficulté particulière le protocole pour greffer aléatoirement les groupements spécifiés sur le précurseur d’acide polyacrylique via la formation de liaisons amide entre une amine primaire portée par lesdits groupements et une fraction des groupes carboxylate portés par le précurseur. De préférence, la réaction se fait dans de la /\/-methylpyrrolidone (NMP) en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). La synthèse peut se faire de façon séquentielle, chaque étape consistant dans le greffage d’un motif particulier. EXEMPLES
[0069] Les abréviations suivantes ont été utilisées dans les exemples qui suivent.
OTG : Octylthioglucoside
DMPC : dimyristoylphosphatidylcholine
- BR : bactériorhodopsine
SERCAIa : sarco/endoplasmic réticulum Ca2+-ATPase 1 a
SMA : Styrene maleic acid copolymer, formule :
Le SMA (2:1 ) est composé de deux tiers de styrène et un tiers d’acide maléique. Le SMA (3:1 ) comporte trois quart de styrène et un quart d’acide maléique.
A8-35 : Amphipol de formule :
A8-75 : comme ci-dessus mais avec x=~75%, y=~25% and z= 0%
E. coli : Escherichia coli
DDM : n-dodécyl-/3-D-maltopyranoside
GFP : green fluorescent protein
AChR : récepteur de l’acétylcholine
EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique
CHAPS : 3-[(3-Cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate hydrate
SDS : sodium dodécyl sulfate
Tris : Tris(hydroxyméthyl)aminométhane [0070] Les données expérimentales ci-dessous ont été obtenues en utilisant des fractions membranaires et/ou protéines pour étudier les propriétés des nouveaux amphipols de l’invention. Ces exemples ne sont pas limitatifs, notamment, les efficacités relatives des amphipols de l’invention peuvent varier en fonction de la fraction membranaire ou de la protéine membranaire considérée. Néanmoins, les propriétés de solubilisation et/ou de stabilisation améliorées des amphipols de l’invention vis-à-vis des polymères de référence sont d’application générale.
1. Exemple 1, synthèse des amphipols de l’invention
[0071] Comme mentionné, les amphipols de l’invention ont pour précurseur l’acide polyacrylique. Leur synthèse est donc très similaire à celle de IΆ8-35 décrite dans Gohon et al. (2006). Elle consiste à greffer aléatoirement les groupements sur le précurseur d’acide polyacrylique via la formation de liaisons amide entre une amine primaire portée par les groupements à greffer et une fraction des groupes carboxylate portés par le précurseur. La réaction se fait dans de la /V-méthylpyrrolidone (NMP) en présence de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Le greffage et l’obtention des différents motifs peut se faire de façon séquentielle. Notamment, quand z est différent de 0, le greffage des groupes correspondant à une fraction des groupes carboxylate du précurseur a lieu dans un deuxième temps, dans de la NMP en présence de 1- hydroxybenzotriazole (HOBt)/DCC.
[0072] L’amphipol est alors obtenu sous sa forme acide. Après synthèse, le polymère est purifié par trois cycles de précipitation à pH=3 suivis d’une solubilisation à pH=10. Le polymère est ensuite dialysé contre de l’eau déionisée puis lyophilisé.
[0073] La composition chimique du polymère est déterminée par une analyse RMN du proton et du carbone, couplée à un dosage pH-métrique.
Exemple de synthèse du composé 23
[0074] Dans un ballon bicol de 100 mL, 1 ,00 g d’acide polyacrylique (1 éq., 13,89 mmol) est dissous dans 20 mL de /V-Méthyl-2-pyrrolidone (NMP). Le milieu est placé sous agitation à 60°C pendant 4 heures. 884,3 mg de cyclooctylamine (0,50 éq., 6,94 mmol) sont dissous dans 2 mL de NMP et la solution obtenue est additionnée goutte à goutte au milieu réactionnel sous agitation. Après addition complète de l’amine, l’agitation est poursuivie pendant 10 min puis 1 ,58 g de DCC (0,55 éq., 7,64 mmol) préalablement dissous dans 4 mL de NMP sont ajoutés goutte à goutte au milieu réactionnel. Une fois la totalité du réactif ajoutée, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation à 60°C pendant 1 heure, puis laissé sous agitation sans chauffage pendant 4 heures.
[0075] Une fois à température ambiante, le milieu réactionnel est filtré sur fritté (porosité 4) puis 1 ,5 g de méthanolate de sodium (2 éq., 27,8 mmol) sont ajoutés au filtrat. L’agitation est poursuivie pendant environ 15 minutes.
[0076] Le milieu réactionnel est ensuite versé dans 260 mL (10 volumes équivalents) d’eau purifiée et déionisée (Milli-Q®) et le pH est ajusté à 10 (papier pH) avec de la soude (11 N). La solution est maintenue sous vive agitation pendant une trentaine de minutes puis filtrée sur fritté (porosité 4). Le filtrat obtenu est ajouté manuellement goutte à goutte à 21 mL d’acide chlorhydrique 2N (3 éq., 42 mmol) sous vive agitation. L’addition est effectuée via une seringue dont l’embout est connecté à un système de filtres millipore (préfiltre PES 0,45 pm et filtre acétate de cellulose 0,2 pm en série).
[0077] Une fois l’addition terminée, la suspension obtenue est filtrée sur fritté (porosité 4) et le précipité est dissous dans 50 mL d’eau « Milli-Q®» après addition de 1 ,9 mL (1 ,5 éq., 21 mmol) de soude 11 N. Ce cycle de précipitation / solubilisation est réitéré quatre fois, puis la solution basique finalement obtenue est dialysée (membrane Spectrapore avec seuil de coupure à 8000 g. mol 1) pendant 24 heures contre une solution de soude à 4,5.10 3 N puis lyophilisée.
[0078] L’homme de l’art saura adapter ce protocole pour obtenir les autres amphipols de l’invention sans difficulté particulière, notamment en adaptant le choix des amines devant réagir avec les groupes carboxylate de l’acide polyacrylique.
2. Exemple 2, analyse des particules d’amphipols selon l’invention par chromatographie d’exclusion stérique (SEC).
Matériel et méthodes
[0079] Une colonne Superose 12/HR ou 12 10/300 GL (GE Healthcare) a été utilisée.
[0080] La colonne a été équilibrée en tampon Tris 20 mM pH8.0, 100 mM NaCI (Figure
1A), ou en tampon 20 mM phosphate de sodium pH7.0, 100 mM NaCI (Figure 1 B).
[0081] Concernant les complexes BR/amphipols (Figure 1 C), la membrane pourpre a été solubilisée en OTG (cf exemple 2), puis la BR complexée avec les amphipols à un ratio massique BR/amphipol de 1 :5. La colonne a été équilibrée en 20 mM phosphate de sodium pH 7.0, 100 mM NaCI.
[0082] L’élution a été effectuée en 20mM phosphate de sodium pH 7.0, 100 mM NaCI. Résultats
[0083] Les profils d’élution des polymères de l’invention obtenus par SEC ont été comparés à celui de GA8-35 (Figure 1A et B). En solution, il est connu que IΆ8-35 forme des particules homogènes, compactes et globulaires de 40 kDa comprenant environ 9-10 molécules (Giusti et al., 2014; Gohon et al., 2006). Comparés à GA8-35, les polymères de l'invention testés présentent des pics d'élution plus larges. Ce résultat peut s’expliquer par la présence des cycles dans les amphipols selon l’invention qui sont moins flexibles que les chaînes octyle linéaires de GA8-35 et donc moins favorables à la formation de particules sphériques, résultant en la formation de particules plus grosses et moins homogènes.
[0084] Aussi, le nombre d’atomes de carbone entre la liaison amide et le groupe cycloalkyle des amphipols selon l’invention semble influencer la taille et l’homogénéité des particules qu’ils forment. En effet, l’addition d’un carbone entre la liaison amide et le cycle cycloalkyle (cf. les profils d’élution du composé 3 et du composé 1 1 , Figure 1A) résulte en des particules plus homogènes ayant un profil d’élution comparable à celui de l’amphipol A8-35. Toutefois, la présence de deux atomes de carbone (composé 17, Figure 1A) a pour conséquence la formation de particules plus grosses et moins homogènes. Concernant les amphipols greffés avec un groupe phényle (e.g. composés 2 ou 4), les profils d’élution indiquent que les particules formées par ces polymères ont une taille supérieure à 40 kDa et sont moins homogènes comparativement à GA8-35. L’homogénéité est très nettement améliorée par l’addition d’un groupe éthyle (e.g. profile d’élution du composé 8) et aboutit à des particules de taille plus en rapport avec celles de GA8-35
[0085] De manière intéressante, les profils d’élution des complexes formés par les composés 1 1 et 8 et la bactériorhodopsine (BR) sont d’une homogénéité et d’une taille comparable avec celle des complexes BR/A8-35 (Figure 1 C).
[0086] Les polymères de l’invention constituent donc des outils modulables à façon qui présentent en milieu aqueux des propriétés d’auto-organisation en particules compatibles avec les procédés de purification de protéines en termes d’homogénéité. Ces particules sont comparables avec celles formées par l’amphipol A8-35 qui fait référence dans la communauté. 3. Exemple 3, étude de l’effet stabilisateur.
[0087] L’effet stabilisateur pour les protéines membranaires des amphipols selon l’invention a été testé sur deux protéines membranaires modèles, SERCAI a (sarco/endoplasmic réticulum Ca2+-ATPase 1a) et la bactériorhodopsine de Halobacterium salinarum.
Matériel et méthodes
Protéines membranaires modèles utilisées
[0088] SERCAI a est une pompe à calcium qui nécessite l’hydrolyse d’une molécule d’ATP pour réaliser sa fonction de transport. Cette protéine appartient à la famille des ATPase de“type P” et ses segments transmembranaires adoptent des changements conformationnels de grandes amplitudes pour permettre le passage des ions calcium.
[0089] La couleur violette de la BR est indicatrice de sa conformation native. Dans sa forme repliée la BR lie de façon covalente mais réversible le rétinal (un chromophore) via la formation d’une base de Schiff. La protonation de cette base provoque le déplacement du pic d’absorption du rétinal de -380 nm (forme libre) à 570 nm ou -555 nm (forme liée) selon que la BR est imbriquée dans la membrane ou solubilisée en solution aqueuse. L’absorbance à 554 nm est donc indicative de la conformation native de la BR.
Production de SERCAIa et mesure de l’activité
[0090] Les vésicules du réticulum sarcoplasmique de lapin ont été préparées à partir de tissus musculaires selon le protocole décrit dans Champeil et al. (1985). Ces membranes sont très riches en SERCAI a.
[0091] L’activité ATPasique de SERCAIa a été mesurée de façon indirecte en couplant plusieurs réactions enzymatiques. Le dosage a été fait en présence de pyruvate kinase (0,1 mg/mL) et de lactate déshydrogénase (0,1 mg/mL) afin, d’une part, de maintenir constante la concentration d’ATP dans l’échantillon et, d’autre part, de suivre la consommation d’ATP en mesurant la diminution de l’absorbance à 340 nm du NADH au cours du temps. Le tampon de l’échantillon contient du KC1 100 mM, Mg2+ 1 mM, Ca2+ 0,1 mM, Tes-Tris 50 mM (pH 7,5 à 20°C) et 1-5 mM d’ATP. Pour réaliser le dosage, le milieu réactionnel contient également du phosphoénolpyruvate 1 mM et du NADH 0,15 mM. Production de la membrane pourpre et préparation des complexes BR/amphipol
[0092] La préparation des complexes BR/amphipols a lieu selon les étapes suivantes : i) Une culture de Halobacterium salinarum a été réalisée et la fraction membranaire correspondant à la membrane pourpre a été purifiée selon le protocole déjà décrit dans Oesterhelt & Stoeckenius (1971 ).
ii) La membrane pourpre a été solubilisée en tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCI 100 mM, OTG 100 mM, pour une incubation de 48 heures en chambre froide sous agitation et dans l’obscurité. L’échantillon a été centrifugé 20 min. à 200.000 g à 6°C. Le surnageant a été dilué avec du tampon sans OTG pour abaisser la concentration de détergent de 100 mM à 18 mM.
iii) Remplacement du détergent et préparation des complexes BR/amphipol
La concentration de la BR a été déterminée par mesure de l’absorbance à 554 nm. La quantité d’amphipol ajouté a été calculée en fonction de la masse de BR présente dans l’échantillon, correspondant à un ratio massique BR/amphipol de 1 :5. Après 20 min d’incubation à 4°C, des billes de polystyrène (Bio-Beads®SM2, BioRad) ont été ajoutées de façon à ce que leur masse corresponde à 20 fois celle du détergent présent dans l’échantillon. Après 2 h d’incubation à 4°C sous agitation, les billes ont été retirées.
[0093] La formation de complexes BR/A8-35 ou BR/A8-75 (contrôles positifs) d’une part, et des complexes BR avec les amphipols de l’invention d’autre part, a été effectuée selon le protocole de remplacement et élimination du détergent par adsorption sur des billes de polystyrène (Bio-Beads®, BioRad).
[0094] Après les 20 min d’incubation en présence d’OTG et d’amphipols, les Bio- Beads® ont été rajoutées au mélange dans un ratio massique Bio-Beads®/OTG 20:1 et incubées pendant 2 heures à 4°C. L’absorbance à 554 nm de chaque échantillon a été mesurée avant et après centrifugation à 100000 g pendant 20 min. Le pourcentage de BR est calculé en référence à l’absorbance mesurée en OTG avant centrifugation.
Dénaturation thermique de la BR
[0095] Le ratio de la protéine BR avec les différents agents de solubilisation testés est de 1 :5, dans un tampon phosphate de sodium 20 mM, pH 7.0, NaCI 100 mM. Les échantillons ont été incubés à chaque température pendant 30 min puis refroidis sur glace avant lecture de l’absorbance à 554 nm. Concernant les échantillons de BR en détergent (OTG, Octylthioglucoside) une étape de centrifugation a été effectuée pour supprimer les agrégats de protéine. L’absorbance des échantillons à 554 nm a été mesurée avec un spectrophotomètre UV-visible en prenant comme référence du tampon sans protéine. Les valeurs d’absorbance sont normalisées par rapport à l’absorbance mesurée à 4°C.
Résultats
[0096] Il a été observé que le composé 1 1 semble inhiber de façon plus importante l’activité ATPasique de SERCAI a que GA8-35 (non présenté). L’effet inhibiteur des amphipols pouvant être lié à leur effet stabilisateur, on peut donc supposer que le composé 1 1 stabilise de manière plus efficace SERCAI a que IΆ8-35.
[0097] La stabilité thermique de la BR complexée avec IΆ8-35, IΆ8-75 ou les amphipols de l’invention a été analysée. Dans un premier temps, la capacité de ces polymères à maintenir la BR soluble sous sa forme native a été analysée par la mesure de l’absorbance des surnageants à 554 nm.
[0098] Après avoir éliminé le détergent avec les Bio-Beads®, le pourcentage de BR sous sa forme native dans les échantillons après complexation avec les amphipols de l'invention comprenant 25% de groupes cycliques hydrophobes et 75% de groupes carboxylate non modifiés est plus élevé que celui observé en utilisant GARoI A8-75 comme référence (figure 2 A et B), qui est particulièrement peu efficace pour ce qui est de la stabilisation de la BR. Ce résultat montre que les groupes cycliques augmentent l’effet stabilisateur des amphipols. Les composés 7 et 1 sont plus « doux » que GA8-75 quant à la dénaturation. Cependant, la stabilité de la BR diminue avec le nombre croissant de carbones entre le cycle et la liaison amide jusqu'à atteindre un niveau de déstabilisation similaire à celui de IΆ8-75 (e.g. BR complexé avec le composé 17). Cet effet est plus prononcé avec les amphipols greffés avec des groupes cycloalkyle qu'avec les groupes phényle (figure 2B composés 2, 12, 22).
Effet de la charge de l’amphipol
[0099] L’influence de la charge des amphipols de l’invention a été étudiée en augmentant le taux de greffage des polymères avec des groupes isopropyle, ce qui a pour effet de réduire la charge globale de l’amphipol. La réduction de la charge ( via un taux de greffage des groupes isopropyle jusque 40%) ainsi obtenue améliore le taux de BR présente sous sa forme native dans les échantillons après remplacement du détergent par l’amphipol en présence de Bio-Beads® (comparer, e.g., les absorbances pour composés 7 et 13). Inversement, une plus faible quantité de BR est retrouvée dans le surnageant quand on diminue la densité de charge (comparer e.g. composé 11 vs. composé 15), ce qui pourrait être dû à de l’agrégation de BR.
[00100] Pour les amphipols comprenant un taux de greffage plus important (50% de groupes cycloalkyle et/ou phényle et 50% de groupe carboxylate non modifiés), l’effet déstabilisateur du nombre croissant de carbone entre les cycles et la liaison amide est considérablement diminué (Figure 2C).
[00101] Les amphipols de l’invention greffés avec des groupes cycloalkyle et/ou des groupes phényle à hauteur de 50% ont une densité de charge équivalente au SMA (2 :1 ) ou supérieure au SMA (3 :1 ). Pourtant, exception faite du composé 4, tous les amphipols de l’invention testés permettent d’obtenir plus de BR sous sa forme native que les deux SMAs. (Figure 2).
[00102] La stabilité thermique de la BR complexée avec les amphipols selon l’invention a été testée sur la fraction de BR restée native après échange du détergent par les amphipols en utilisant les Bio-Beads®. L’absorbance à 554 nm des échantillons a été suivie en fonction de la température, une chute d’absorbance signant la dénaturation de la protéine (Figure 3).
[00103] Dans le cas des complexes BR/A8-35, la dénaturation de la protéine a lieu dans un intervalle de température très étroit, comme l’indique la pente de la sigmoïde obtenue, avec une température de fusion moléculaire (Tm) autour de 63°C (Figure 3A). La Tm de la protéine dans le détergent OTG est significativement plus bas (~47 °C, Figure 3A), ce qui indique une plus faible stabilisation de la protéine en OTG. Un Tm similaire est observé pour la protéine complexée au SMA (3:1 ) ou au SMA (2:1 ), respectivement de ~45 °C et ~49 °C. A l’inverse, les Tm obtenues avec les amphipols selon l’invention sont significativement plus élevées que ceux en SMA et pour certains comparables voire plus importants que celui des complexes BR/A8-35 (e.g. composés 4 et 3, avec des Tm ~57 °C et ~66 °C respectivement, Figure 3B).
[00104] Ainsi, en termes de stabilisation, les amphipols selon l’invention sont plus efficaces que les SMAs et peuvent être au moins aussi efficaces que l’amphipol de référence A8-35, voire plus efficaces comme le suggèrent les résultats obtenus concernant SERCA1. 4. Exemple 4, évaluation de l’effet solubilisateur des amphipols de l’invention sur des membranes à haute densité en protéines membranaires.
[00105] A la différence des détergents, GA8-35 est connu pour ne pas solubiliser efficacement SERCA1 des vésicules du réticulum sarcoplasmique (Champeil et al., 2000). Typiquement les protéines membranaires sont toujours solubilisées en utilisant des détergents, qui sont par la suite échangés avec GA8-35 pour les stabiliser.
[00106] A l’inverse, le Styrene Maleic Acid copolymer (SMA) est un polymère connu pour permettre la solubilisation des protéines membranaires, sans nécessiter l’étape de solubilisation avec un détergent, ce qui résulte en la formation de particules lipidiques (SMALPs pour SMA lipid particies) qui comprennent la protéine membranaire et des lipides, entourés par le SMA. Cependant, comme vu plus haut, la stabilité de la BR en SMA est relativement médiocre comparée à celle de la même protéine complexée avec IΆ8-35.
[00107] Les propriétés de solubilisation du SMA, A8-35 et des amphipols selon l’invention ont été comparées pour différents types de membranes plus ou moins riches en protéines membranaires (membrane d’E. coli, des organes électriques de T. marmorata, des thylakoïdes de C. reinhardtii, membrane pourpre de H. salinarum). Les résultats obtenus sont spécifiques des membranes testées et illustrent les propriétés différentes des différents polymères. Ainsi un polymère faiblement efficace pour l’une de ces membranes modèles pourrait être tout à fait efficace pour un autre type de membrane du fait de sa composition spécifique en protéines et/ou lipides.
Matériel et méthodes
Préparation des fractions de membrane pourpre de Halobacterium salinarum, de membranes de thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtii, de membrane d’organes électriques de Torpédo marmorata ou de membrane c/'Escherichia coli.
[00108] Comme mentionné précédemment, la membrane pourpre de Halobacterium salinarum est préparée selon le protocole décrit dans Oesterhelt & Stoeckenius (1971 ).
[00109] Les membranes extraites d’organes électriques de Torpédo marmorata naturellement riches en récepteur d’acétylcholine (AChR) sont préparées selon le protocole décrit dans Sobel et al. (1977). [001 10] Les membranes de thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtti sont préparées selon le protocole décrit dans Pierre et al. (1995).
[00111] Les membranes d’Escherichia coli surexprimant la protéine YidC, fusionnée en position C-terminale à la GFP, sont préparées après lyse mécanique des bactéries avec un broyeur de cellules (Constant Systems). Les débris cellulaires et les cellules non cassées sont éliminés par centrifugation à basse vitesse. Le surnageant est récupéré et les membranes sont culotées par centrifugation à haute vitesse (100000 g pendant une heure). Le protocole de préparation des membranes d’E. coli est décrit dans Angius et al. (2018).
Dilution de la fraction de membrane pourpre avec des vésicules de DMPC
[001 12] Des vésicules de DMPC (50 mg/mL) ont été formées par extrusion après 10 passages à travers une membrane en polycarbonate (Whatman) calibrée avec des pores de 100 nm de diamètre. Les vésicules de DMPC et la membrane pourpre sont mélangées de façon à obtenir un ratio massique BR:DMPC de 1 :5, puis incubées 30 min dans un bain à sonication selon le protocole déjà décrit par Knowles et al. (2009). Le tampon de l’échantillon contient 20 mM phosphate de sodium pH 7.0, 100 mM NaCI.
Solubilisation de la membrane pourpre en OTG
[00113] La solubilisation en OTG (100 mM) a été effectuée comme exposé plus haut.
Les échantillons ont été incubés une heure à 4°C avant centrifugation (20 min 100000 g), et les surnageants prélevés pour la mesure d’absorbance à 544 nm.
Solubilisation de la membrane pourpre avec les SMAs ou les amphipols de l’invention
[001 14] Pour chaque condition, le ratio massique BR/SMA ou amphipol est 1 :6,25 et le ratio massique BR/DPMC est 1 :5. Le tampon utilisé est du phosphate de sodium 20 mM, pH 7.0, NaCI 100 mM comme mentionné ci-dessus.
[00115] Les échantillons ont été incubés sur la nuit à température ambiante, sous agitation, puis centrifugés 20 min à 100000 g, et les mesures d’absorbance effectuées sur les surnageants.
[00116] Les absorbances sont normalisées sur la valeur d’absorbance mesurée avant l’étape d’ultracentrifugation. Solubilisation des membranes d’E. une protéine membranaire recombinante
[001 17] YidC est une protéine membranaire conservée au cours de l’évolution qui compte 6 domaines transmembranaires chez les bactéries à coloration de gram négative. Une forme recombinante fusionnée à la GFP est utilisée comme protéine « reporter » de la solubilisation des membranes pour l’étude des propriétés des amphipols de l’invention.
[00118] Les protéines membranaires totales présentes dans les extraits de membranes d’E. coli sont dosées à l’aide d’un test colorimétrique. La concentration en protéines est ajustée à 2 mg/mL avec du tampon Tris 20 mM pH 8, NaCI 150 mM.
[001 19] Pour la solubilisation, le ratio massique protéine totale/amphipols ou SMA est de 1 :1. Dans le cas de l’échantillon contrôle en présence de détergent, le ratio massique protéine totale/DDM est de 1 :5. Comme mentionné ci-dessus, le tampon utilisé dans toutes les conditions est composé de Tris 20 mM, pH 8.0, NaCI 150 mM.
[00120] Les échantillons sont incubés deux heures à 4°C, sous agitation. Pour suivre la cinétique de solubilisation, un aliquot est prélevé de chacun des tubes tous les quarts d’heure au cours de la première heure d’incubation, puis toutes les demi-heures au cours de la seconde heure.
[00121] A chaque prélèvement, les échantillons sont centrifugés 10 min à 250000 g.
Les culots, séparés des surnageants, sont re-suspendus dans le volume initial de solubilisation avec du tampon Tris 20 mM pH 8, NaCI 150 mM contenant du SDS à 5 %.
[00122] A ces échantillons est ajouté du bleu de charge compatible avec une mesure de fluorescence sur gel d’acrylamide. Il s’agit d’un bleu de charge préparé suivant le protocole décrit dans Drew et al. (2008). Les échantillons, correspondant aux surnageants et culots de chaque condition et prélevés aux temps indiqués, sont déposés sur un gel d’acrylamide 12%.
[00123] L’électrophorèse est faite en présence de SDS dans le tampon de migration contenant du Tris-glycine pH 8,3. La migration des protéines dans le gel est faite pendant 1 heure en appliquant un courant de 100 V et 20 mA par gel.
[00124] Une fois la migration terminée, chaque gel est placé dans de l’eau « Milli-Q® » et une photo de fluorescence des gels, prise grâce à un scanner laser (ÀexCitation = 495 nm ; Àémission = 519 nm), permet de mesurer la fluorescence de la GFP. [00125] Le logiciel ImageJ permet d’intégrer les aires de chaque bande pour quantifier la fluorescence. Les résultats sont normalisés par rapport à la fluorescence obtenue en détergent (DDM - 1 heure).
Solubilisation de la membrane de Torpédo marmorata enrichie en AChR avec les amohipols de l’invention, les SMAs ou le CHAPS -solubilisation de l’AChR.
[00126] AChR est une protéine membranaire intrinsèque. Les organes électriques de Torpédo Marmorata sont particulièrement riches en cette protéine. Ces organes constituent de ce fait une source et un modèle d’étude important du récepteur à l’acétylcholine.
[00127] Les protéines membranaires totales présentes dans les extraits de membranes de Torpédo marmorata sont dosées à l’aide d’un test colorimétrique. La concentration en protéines est ajustée à 1 mg/mL avec du tampon NaP 5 mM pH 7,2, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM.
[00128] Pour la solubilisation, le ratio massique protéine totale/amphipols ou SMA est de 1 :5. Dans le cas de l’échantillon contrôle, c’est à dire en présence de détergent, le ratio massique protéine totale/CHAPS est de 1 :4.
[00129] Les échantillons sont incubés une heure à 4°C, sous agitation avant d’être centrifugés 20 min à 100000 g. Les culots, séparés des surnageants, sont re suspendus dans le volume initial de solubilisation avec du tampon NaPi 5 mM pH 7,2, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM.
[00130] Les échantillons, correspondant aux surnageants et culots de chaque condition, sont mélangés à du bleu de charge préparé suivant le protocole décrit dans Laemmli (1970) avant d’être déposés sur un gel d’acrylamide 10%.
[00131] L’électrophorèse est faite en présence de SDS dans le tampon de migration contenant du Tris-glycine pH 8,3. La migration des protéines dans le gel est faite pendant 1 heure en appliquant un courant de 100 V et 20 mA par gel.
[00132] Une fois la migration terminée, chaque gel est coloré au bleu de Coomassie et une photo des gels, en lumière blanche, est prise.
Résultats
[00133] Il a été observé que l’efficacité de solubilisation des polymères est étroitement liée la composition de la membrane dont on souhaite extraire les protéines membranaires (aussi bien en termes de protéines que de lipides). En effet aucun des polymères testés que ce soit IΆ8-35, les amphipols selon l’invention ou bien même les SMAs, n’est capable de solubiliser les membranes riches en protéines comme la membrane pourpre de Halobacterium salinarum (Figure 4A), ou celle des thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtii (non présenté), alors que la plupart peuvent solubiliser les membranes de E. coli surexprimant une protéine recombinante telle que YidC-GFP (voir Figure 7). Néanmoins les amphipols de l’invention s’avèrent d’une manière générale plus efficaces que le polymères A8-35 ou les SMAs.
[00134] La membrane pourpre de Halobacterium salinarum comprend 75% de BR pour 25% de lipides. Du fait de cette composition singulière, sa solubilisation par le SMA n’est possible que lorsque la membrane est préalablement fusionnée avec des vésicules de DPMC, afin de « diluer » la protéine BR dans des lipides (Knowles et al., 2009; Orwick-Rydmark et al., 2012). Dans ces conditions, les amphipols de l’invention sont également capables de solubiliser la BR, alors que GA8-35 reste inefficace (Figure 4 B).
[00135] Concernant les amphipols de l’invention comprenant un greffage avec un groupe phényle, il est observé que l’ajout d’un groupement éthyle sur le site aromatique permet d’augmenter les propriétés de solubilisation (comparer le pourcentage de BR solubilisée pour les composés 4, 6 et 8). A noter que l’emplacement du groupe éthyle en position para (position 4) ou ortho (position 1 ) ne semble pas avoir d’importance, les composés 8 et 24 permettant une solubilisation comparable (Figure 4B).
[00136] Les amphipols de l’invention présentant un greffage avec un cycloalkyle sont particulièrement efficaces concernant la solubilisation de la BR. Le composé 23 notamment est trouvé aussi efficace que le SMA (2 :1 ) (comparer la taille des culots) mais la quantité de BR présente sous sa forme native dans le surnageant est plus élevée que celle obtenue avec le SMA (2 :1 ) ou le SMA (3 :1 ); le composé 21 étant sensiblement plus efficace que le SMA (2 :1 ).
[00137] En outre, l’analyse en chromatographie d’exclusion stérique des complexes BR/lipides/amphipols selon l’invention montrent que ceux-ci sont beaucoup plus homogènes en taille que ceux obtenus en utilisant du SMA, ce qui est particulièrement avantageux dans les techniques de caractérisation des protéines (non présenté).
[00138] L’efficacité des polymères de l’invention à extraire la protéine membranaire YidC-GFP surexprimée dans les membranes d’E. coli, ici il s’agit de la protéine, a également été testée et comparée avec. GA8-35 et les SMAs. En fixant le ratio protéine/polymère à 1 :1 , c’est à dire en travaillant à des concentrations basses en polymères, les polymères amphipols de l’invention présentent une meilleure efficacité d’extraction de la protéine recombinante d’intérêt que IΆ8-35 et les SMAs. En effet, après deux heures d’incubation, en présence des polymères amphipols de l’invention, la quantité de protéine extraite est d’environ 80 %, contre environ 35 % en présence d’A8-35 ou de SMAs. De plus, la cinétique d’extraction de la protéine membranaire d’intérêt est plus rapide (Figure 7). Ainsi, les amphipols de l’invention sont efficaces à de faibles concentrations et permettent une extraction plus rapide ce qui est particulièrement avantageux, notamment dans le contexte de production de protéines membranaires recombinantes.
[00139] L’efficacité des polymères de l’invention à extraire le récepteur de l’acétylcholine (AChR) de la membrane des organes électriques de Torpédo marmorata a également été testée. A un ratio protéine/polymère fixé à 1 :5, les polymères de l’invention présentent une efficacité d’extraction de la protéine membranaire d’intérêt meilleure que celle de IΆ8-35 et du SMA (2 : 1 ) et comparable à celle du SMA (3 :1 ) (Figure 8, comparer les colonnes notées S). De manière surprenante, le polymère contrôle (A8-50), comportant des chaînes octylamine, donc ayant le même nombre d’atomes de carbone que dans les groupes cyclohexyléthylamine (comme dans le composé 19), et cyclooctylamine (comme dans le composé 23), et greffées au même pourcentage (50%), est moins efficace à extraire AchR que les polymères de l’invention. Ce résultat indique que l’architecture moléculaire du groupe hydrophobe peut jouer un rôle important dans les amphipols de l’invention.
[00140] A noter que les amphipols de l’invention sont également particulièrement plus efficaces à solubiliser la pompe sodium potassium des membranes des organes électriques de T. marmorata que A8-50 ou A8-35.
[00141] A une plus faible concentration en polymère, les amphipols de l’invention s’avèrent là aussi plus efficaces à solubiliser AchR ou la pompe sodium potassium que A8-35, A8-50 et SMA 3-1 (données non présentées).
5. Exemple 5, Etude de l’effet stabilisateur des amphipols sur les protéines membranaires après extraction directe de la membrane
[00142] L’effet stabilisateur des amphipols selon l’invention vis à vis de la BR a été testé directement après solubilisation de la membrane pourpre sans avoir recours aux étapes de solubilisation par l’OTG, puis échange de l’OTG par les amphipols. Deux séries d’expérimentations indépendantes ont été effectuées. Les résultats de la première sont présentés figures 5A et B. Pour la deuxième série d’expérimentation chaque condition a été réalisée au minimum en triplicats (Figure 6).
Matériel et méthodes
[00143] Solubilisation de la membrane pourpre après fusion avec des vésicules de DMPC préformées.
i) Comme mentionné précédemment, la membrane pourpre a été fusionnée à des vésicules de DMPC selon le protocole décrit par Orwick-Rydmark et al. (2012) avant d’initier l’étape de solubilisation avec les amphipols. Après 24 heures d’incubation à température ambiante, les échantillons ont été centrifugés à 100000X g pendant 20 min. Les surnageants ont été séparés du culot.
ii) L’absorbance à 554 nm (qui reflète la quantité de BR native) des surnageants est mesurée. La quantification de l’efficacité de solubilisation a été faite en reportant cette valeur sur celle mesurée avant centrifugation (Figure 5A, barres grises de la Figure 6A). On obtient ainsi le pourcentage de BR native solubilisée dans le surnageant.
[00144] Evaluation de la stabilité de la BR.
Après solubilisation, les échantillons ont été incubés à 50°C pendant 6h puis l’absorbance à 554 nm est mesurée. Les valeurs d’absorbance ont été normalisées sur la valeur de l’absorbance initiale mesurée avant incubation (Figure 5B et figure 6B). Les barres noires de la Figure 6A correspondent à la quantité de BR stable, normalisée par rapport à la quantité initiale de BR avant centrifugation ( i.e avant l’étape de solubilisation). Pour suivre la cinétique de dénaturation de la BR, cette expérience a été répétée en mesurant toutes les heures l’absorbance à 554 nm des échantillons (Figure 6B).
[00145] Lorsque l’on compare les polymères de référence, i.e. IΆ8-35 et les deux SMAs, le pouvoir solubilisateur des SMAs est corrélé à un faible pouvoir stabilisateur de la BR. A l’inverse, IΆ8-35 qui solubilise peu la BR la stabilise efficacement (Figures 5A et B et Figure 6A).
[00146] Les polymères de l’invention testés permettent de solubiliser la BR aussi efficacement que le SMA (3:1 ) tout en stabilisant la protéine au moins aussi efficacement que IΆ8-35 (comparer les absorbances pour les composés 19 et 23 avec les polymères de référence, Figures 5 A et B et Figure 6). 6. Conclusion
[00147] Ainsi, les données expérimentales fournies montrent que les nouveaux amphipols de la présente invention constituent de nouveaux polymères particulièrement avantageux. En effet, la purification de protéines membranaires nécessite de les solubiliser tout en préservant leur conformation et leur stabilité, ces deux étapes peuvent sembler antinomiques, la solubilisation impliquant notamment l’utilisation de tensioactifs au pouvoir dissociant qui généralement conduisent au cours du temps à la dénaturation au moins partielle des protéines membranaires. Basés sur des protéines membranaires modèles, les résultats montrent que les nouveaux amphipols de l’invention présentent des propriétés de solubilisation intéressantes pour la purification des protéines membranaires, tout en préservant la stabilité de ces protéines et donc leur conformation et leur activité biologique, ce qui est essentiel pour leur étude ou leur utilisation dans des applications biotechnologiques et non observé avec les polymères de l’art antérieur. En outre, les polymères de l’invention sont efficaces également à de faibles concentrations, ce qui est particulièrement avantageux pour ces applications.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile caractérisé en ce que ledit polymère vinylique amphiphile est de formule I :
Formule I dans laquelle :
M+ est un métal alcalin, de préférence sélectionné parmi Li+, Na+, K+, Ri, R4, R5, Re sont, chacun indépendamment, l'atome d'hydrogène ou le radical méthyle,
R2, R6, R9 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi l’atome d’hydrogène et les (C1 -C8) alkyles linéaires ou ramifiés,
R10 est un groupe sélectionné parmi les (C1-C5) alkyles linéaires ou ramifiés,
R3 et R7 sont, chacun indépendamment, un groupe sélectionné parmi : - l’hydrogène, X étant alors une simple liaison, les alkyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, les alcényles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, ou les alcynyles linéaires ou ramifiés d’au moins 6 atomes de carbone, X étant alors une simple liaison, les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, les polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, étant entendu que lorsque l’un des groupes R3 ou R7 est un alkyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, un alcényle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone, ou un alcynyle linéaire ou ramifié d’au moins 6 atomes de carbone ou un atome d’hydrogène, X étant une simple liaison, alors, l’autre groupe R3 ou R7est sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, les (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, les (C3-C10) cycloalcényles ou les (C3-C10) (hétéro) cycloalcényles, poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, des polycycles poly ou monoinsaturés, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, ou un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés, w, x, y, z correspondant aux pourcentages respectifs des motifs, x étant compris entre 20 et 90 %,
y étant compris entre 0 et 80 %,
w étant compris entre 0 et 80%, et
z étant compris entre 0 et 60 %, étant entendu que w+x+y+z=100 % et que y ou w est au moins égal à 10%.
2. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon la revendication 1 caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I, M+ est Na+.
3. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon la revendication 1 caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I, w et/ou y est supérieur ou égal à 25%.
4. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I, Rio est un groupe isopropyle.
5. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I, x est inférieur ou égal à 75%.
6. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I, w et/ou y est compris entre 25 % et 50 % et z est compris entre 0 % et 40 %, préférentiellement entre 15 % et 40%.
7. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I:
R3 et/ou R7 sont des {Ce-Cs) cycloalkyles sélectionnés parmi ceux cités dans la revendication 1 , ou
R3 et/ou R7 sont un phényle, préférentiellement ledit phényle est substitué en para par un groupe méthyle ou éthyle,
X étant une simple liaison, ou sélectionné parmi les (C1 -C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés.
8. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I :
Ri, R2, R4, R5, R6, Re, R9, sont l'atome d'hydrogène,
R3 et/ou R7 est un {Ce-Cs) cycloalkyle et X est une simple liaison,
R10 est un groupe isopropyle,
x est égal à 35% ou 50%,
y est supérieur ou égal à 25 %,
- w est égal à 0 %, ou 25%, et z est égal à 0%, 15 % ou 40%, étant entendu que w+x+y+z=100 %.
9. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, le polymère vinylique amphiphile est sélectionné parmi :
10. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que, dans le polymère vinylique amphiphile de formule I est fonctionnalisé par greffage de tag d’affinité, de sonde fluorescente ou de molécule immunostimulatrice.
1 1. Complexe hydrosoluble protéine membranaire-polymère vinylique amphiphile selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend en outre des composés lipidiques.
12. Solution aqueuse comprenant le complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la ou les protéines membranaires sont stabilisées.
13. Procédé de préparation d’une solution de protéine membranaire selon la revendication 12, comprenant une étape de solubilisation et/ou stabilisation dans laquelle la fraction protéique provenant d’une membrane biologique ou synthétique contenant ladite protéine membranaire, ou ledit mélange de protéines membranaires, est mis en présence du dit polymère vinylique de formule I.
14. Procédé de préparation d’une solution de protéine membranaire, ou d’un mélange de protéines membranaires selon la revendication 13, caractérisé en ce que la ou les protéines membranaires sont une ou des protéines recombinantes exprimées dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, et/ou une ou des protéines natives exprimées dans des membranes spécialisées à haute densité protéique.
15. Procédé de préparation d’une solution de protéine membranaire, ou d’un mélange de protéines membranaires, selon la revendication 14, caractérisé en ce qu’il comprend préalablement une étape de solubilisation de ladite protéine membranaire ou dudit mélange de protéines membranaires réalisée par la mise en présence de la fraction de protéine membranaire ou du mélange de protéines membranaires avec un milieu détergent.
16. Procédé de préparation d’une solution de protéine membranaire, ou d’un mélange de protéines membranaires, selon la revendication 14, caractérisé en ce qu’il comprend préalablement une étape de fusion de la fraction de protéique contenant ladite protéine membranaire, ou ledit mélange de protéines membranaires, avec des vésicules de phospholipides ou de mélange de phospholipides, de préférence de 1 ,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC).
17. Procédé de préparation d’une solution de protéine membranaire ou d’un mélange de protéines membranaires, selon l’une quelconque des revendications 14 ou 16, caractérisé en ce que la solution de fraction protéique contenant ladite protéine membranaire n’est pas une solution de protéine(s) membranaire(s) en milieu détergent sous forme micellaire.
18. Polymère de formule I tel que décrit dans l’une quelconque des revendications 1 à 9 dans lequel w=0 et R7 est un groupement sélectionné parmi : les (C3-C10) cycloalkyles ou (C3-C10) (hétéro) cycloalkyles, substitués ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, les (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés et les (C1- C8) alcynyles linéaires ou ramifiés, ou - - un phényle, substitué ou non par un ou des radicaux sélectionnés parmi les (C1-C8) alkyles linéaires, cycliques ou ramifiés, (C1-C8) alcényles linéaires ou ramifiés, (C1-C8) alcynyles linéaires ou ramifiés,
X étant alors une simple liaison ou sélectionné parmi les (C1-C8) alkylènes linéaires ou ramifiés, (C2-C8) alcénylènes linéaires ou ramifiés et les (C2-C8) alcynylènes linéaires ou ramifiés.
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