EP3888094A1 - Procede de detection et suivi de la formation de biofilms - Google Patents

Procede de detection et suivi de la formation de biofilms

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Publication number
EP3888094A1
EP3888094A1 EP19805705.1A EP19805705A EP3888094A1 EP 3888094 A1 EP3888094 A1 EP 3888094A1 EP 19805705 A EP19805705 A EP 19805705A EP 3888094 A1 EP3888094 A1 EP 3888094A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
particles
biofilm
observation
particle
displacements
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19805705.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Héloïse BOUDAREL
Jean-Denis Mathias
Benoît BLAYSAT
Michel Grediac
Stéphanie BADEL-BERCHOUX
Christian Provot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Biofilm Control SAS
Universite Clermont Auvergne
Sigma Clermont
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Biofilm Control SAS
Universite Clermont Auvergne
Sigma Clermont
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Biofilm Control SAS, Universite Clermont Auvergne, Sigma Clermont, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3888094A1 publication Critical patent/EP3888094A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G16H10/40—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data for data related to laboratory analysis, e.g. patient specimen analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H30/00—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images
    • G16H30/40—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images for processing medical images, e.g. editing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1027—Determining speed or velocity of a particle
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and / or monitoring and / or characterizing the formation of a biofilm.
  • the present invention also relates to a device for detecting and / or characterizing the formation of a biofilm capable of implementing the above method.
  • the present invention finds an application in particular in the analytical fields, biological, enzymological research, in the pharmaceutical field and / or in the medical field.
  • Biofilm is the main way of life for bacteria since it represents the preferred form of life for 90% of bacteria in the wild. Unlike the planktonic way of life in which bacteria live in suspension, biofilm forms a heterogeneous and complex community of bacteria which attach to a surface and which bind to each other through the secretion of an extracellular matrix composed of proteins. , sugars and water. Biofilm formation is a common feature of many bacteria. Also, it has been accepted by the community of microbiologists that the biofilm lifestyle is a fully-fledged stage in the life of the bacteria. The planktonic form would only be a transition to biofilm. As with many living species, community is necessary for their survival. This form of community life gives bacteria significant metabolic benefits.
  • Biofilms are indeed very resistant to chemical stress (antibiotics for example) and mechanical stress (fluid for example). Resistance increased biofilms makes them ubiquitous. Although they can be used for innovative processes of bioremediation or synthesis of chemical compounds for example, biofilms can prove to be a real nuisance in various fields where bacterial contamination is to be banished as in the medical environment, food industry and in some human environments. In France, biofilms are responsible for 50 to 60% of nosocomial infections (Bryers, 2008) and 40% of food poisoning.
  • biofilms In particular, the study of biofilms is crucial in the hospital environment, for which the difficulties of elimination of biofilm are a public health problem.
  • the recalcitrance of biofilms comes largely from the mechanical integrity provided by the extracellular matrix. This material ensures cohesion between bacteria and adhesion to surfaces. Bacteria protected by extracellular polymeric substances (EPS) in biofilms can survive even after a decontamination procedure and represent a source of infection for humans and animals.
  • EPS extracellular polymeric substances
  • the viscoelastic nature of the matrix allows the biofilm to adapt to shear stresses which the biofilm's natural environment can induce.
  • the matrix serves as a means of protection for bacteria and allows them to acquire a great resistance to their environment.
  • biofilms make it possible to predict their influences on certain systems.
  • One of the benefits of determining the mechanical properties of biofilms is to be able to predict and control the formation, accumulation and spread of bacteria that spread infections.
  • the first observations of biofilms date back to the 17th century but investigations around biofilms remain relatively recent (35 years) with their definition proposed by Costerton et al. (1978).
  • Bacteria have long been studied in their free, isolated and planktonic form. However, in a survival principle, the bacteria attach themselves to a solid support and secrete viscous substances to form a biofilm.
  • Biofilms consist of bacterial communities adhering to each other and to a surface through the secretion of a polymer matrix.
  • biofilm behavior of organisms is increasingly taken into consideration in particular in the health field where biofilms develop on very many surfaces such as catheters, valves, prostheses, teeth, skin or mucous membranes. ...
  • reversible adhesion suspended in a fluid, bacteria approach a surface and adhere to it in a reversible manner by means of physicochemical attraction forces such as Van der Waals forces. This proximity to a surface is favored by Brownian agitation, gravity or agitation of the fluid.
  • Certain microorganisms are provided with their own propulsion means which ensure their motility. These means of propulsion consist of protein structures (flagellum, pili) located at the level of the bacteria's envelopes and allow the bacteria to move autonomously;
  • bacteria multiply by cell division and continue to bond to the surface. Furthermore, the modification of the expression profile of the genes of adhered bacteria leads to the synthesis of structures on the surface of the bacteria and the secretion of extracellular polysaccharides irreversibly binding the bacteria to each other and to the surface;
  • microcolonies formation of microcolonies: the growth of microorganisms in biofilm and the adhesion of new bacteria to the biofilm formed create microcolonies; • maturation: the microcolonies develop and the biofilm is structured in a three-dimensional way according to environmental conditions. Channels allowing nutrient-laden fluids to flow through the microcolonies;
  • a biofilm is mainly made up of microorganisms embedded in an EPS matrix secreted by microorganisms.
  • Microorganisms represent 10% of the dry mass of the biofilm (Flemming and Wingender, 2010).
  • Flemming et al. (2007) see biofilms as cities of microbes living in houses, represented by the extracellular matrix, sheltering them from their physical and chemical environment.
  • Biofilms are highly hydrated since 90 to 99% of the biofilm is made up of water.
  • the rest of the biofilm is made up of biological macromolecules. Among these compounds are polysaccharides, proteins, extracellular DNA (eDNA) and RNA.
  • the matrix or the EPS compounds represent 90% of the dry mass.
  • the matrix acts as a binder for bacteria and EPS play an important role in the development and life of the biofilm (Das et al., 2013). Depending on their strain of origin and the growth conditions in terms of nutrients and physical and chemical stress, the rate of production of extracellular matrix and its composition are different. Also, the proportion of each of the elements contained in a biofilm is determined by a number of factors, among which the type of nutrient, the hydrodynamic conditions and the temperature.
  • Biofilm bacteria develop properties that planktonic bacteria do not have. Quorum sensing allows bacteria to communicate and organize themselves to collaborate. This collaboration is also characterized by the horizontal transfer of genes (Madsen et al., 2012). Bacteria in biofilms are more resistant to biocides than their planktonic analogs. While in the 1990s tolerance to antibiofilm agents was attributed to diffusion problems, it was later found that other phenomena were responsible for tolerance to anti-infective agents. For example, the ability of bacteria to adapt and differentiate allows them to evolve in the direction of their preservation. In general, biofilms are more resistant to cleaning, whether chemical or mechanical.
  • biofilms are present in all environments, that they are resistant and that they become reservoirs of infections by the release of germs.
  • bioreactors where they are used for the production of alcohol, acids or polysaccharides.
  • biofilms are studied to make nylon.
  • they serve as an alternative to mechanical finishes on certain denim garments (sanding ).
  • studies on biofilms are becoming more numerous and often at the interface of several disciplines. The study of biofilms from a mechanical point of view is complex because of its multi-scale and multi- physical nature. However, it represents a real scientific issue. The results of mechanical studies on biofilms reported in the literature remain ambiguous. Few protocols are standardized and the multiple test models developed by research teams make comparison of results difficult.
  • microbiological enumeration on solid medium The enumeration of colony-forming units (English acronym CFU - “Colony-Forming Units”) allows a count of the microorganisms of a microbiological culture on a solid medium. This protocol is limited to bacteria that grow on an agar plate. This method is also very time consuming.
  • Microtitre plate Tissue Culture Plates: In this method, no flow circulates and growth takes place in a closed environment. The biomass present in the wells is made visible using dyes. The importance of the coloration, linked to the amount of biofilm, is read from the optical density of the well.
  • MBECTM system Calgary device: The MBECTM system (Minimal Biofilm Eradication Concentration) is part of a category of system allowing the production of reproducible biofilms for the simple and simultaneous evaluation of several biocidal agents at different concentrations.
  • MBECTM system Minimal Biofilm Eradication Concentration
  • the Calgary model was developed to avoid bias due to bacteria sedimentation (Ceri et al., 1999; Harrison et al., 2010).
  • the device Calgary consists of a two-part container.
  • the lower part is composed of a 96-well micro-plate.
  • the upper part is a cover made up of pins which coincide with the center of the wells and which are inserted into each of the wells of the plate.
  • the biofilm is formed on the pins.
  • the device is used to characterize the formation of the biofilm and to assess the susceptibility to biocides (Melchior et al., 2007; Arias-Moliz et al., 2010).
  • the dynamic models under flow are methods where the culture medium is open, that is to say that there is a continuous supply of nutrients. Hydrodynamic flows influence the formation of the biofilm.
  • the type of flow as well as the shear stress generated by the flow have an effect on the adhesion strength of the biofilm.
  • Robbins apparatus It consists of a series of coupons inserted in a chamber in which the bacterial medium circulates (Kharazmi et al., 1999) (Fig. 1.3). The coupons can be removed (and replaced) to be studied without disturbing the flow and in a sterile manner (Coenye et al., 2008). This model was used in particular for the study of catheter material (Nickel et al., 1985). However, this process involves destruction of the biofilm and does not allow its mechanistic study.
  • Infusion Reactor This device simulates an environment with low shear stresses. It is used for applications in the medical environment (catheter, pulmonary disease, oral-dental biofilm). It only allows the formation and study of biofilms at the air-liquid interface.
  • Microfermenters Several types of microfermenters are available and sold commercially:
  • ⁇ CDC (Center for Disease Control) biofilm reactor (CBR): this reactor consists of a cylindrical container constantly replenished with nutrients, in which are placed plastic tubes. These tubes have locations dedicated to the placement of coupons which will be colonized by the biofilm.
  • the glass container is placed on a magnetic stirrer to create circular agitation of the fluid.
  • the flow generated by the rotation is adjustable so that it can be laminar or turbulent. This agitation makes it possible to generate a constant shear stress of moderate to high intensity.
  • the coupons are removable once the surface has been colonized with a biofilm.
  • This reactor allows the repeatable formation of biofilm samples from various strains (Goeres et al., 2005);
  • Rotating disk biofilm reactor in this system, the coupons are placed on the bottom of the cylindrical glass container.
  • the platform on which the coupons are placed is rotated while the bacterial medium is regenerated by circulation within the container.
  • the shear stress generated by the rotation of the platform is of moderate to high intensity. However, it remains less important than for the CDC;
  • Rotating annular reactors in this configuration, the reactor is made up of two concentric cylinders, one of which is rotating. The samples are blades attached to the rotating cylinder.
  • Flow-cell The main drawback of the dynamic models presented above is the difficulty of monitoring the formation of the biofilm live.
  • the flow chambers are transparent cells in which the bacterial medium circulates.
  • the material used for the chamber is suitable for visualization by microscopy and allows observation of the development of the biofilm.
  • its implementation requires great technicality.
  • the nucleation of bubbles formed by the fluid constitutes an important problem.
  • observation in a flow chamber is not very suitable for broadband because relatively few samples are analyzed simultaneously.
  • Microfluidic platform These highly integrated or even automated devices have been developed to be able to observe the behavior of bacteria in a controlled environment, both hydrologically and chemically. Small channel systems distribute the growth fluids to the biofilm formation area. The quantities to be analyzed involved in this type of model are very limited.
  • the test is available in several derivatives corresponding to different applications: high throughput screening of antibacterial agents and preventive and curative antibiotics, characterization of anti biofilm coating agents, study of the impact of enzymatic activity on the formation of biofilm and degradation.
  • the application of BRT for the screening of antibiotic molecules is called Antibiofilmogramme®.
  • This test leads to the determination of the MIC (minimum inhibitory concentration for biofilm) allowing to select among antibiotics effective on planktonic bacteria (MIC) those having in addition a preventive activity on the formation of biofilm.
  • MIC planktonic bacteria
  • this method does not make it possible to determine the kinetics of biofilm formation, for example continuously, without time bias. This process also does not allow specific characterization of the mechanics of biofilms.
  • biofilms are composites.
  • bacteria have the ability to modulate dynamically mechanical properties in response to stress they feel.
  • mechanical properties of biofilms are equivocal.
  • the parameters reported in the literature are difficult to interpret and compare given the lack of standardization in the various ways in which biofilms are tested.
  • the definition of standardized protocols appears essential to grant an interdisciplinary community.
  • the spatio-temporal heterogeneity of biofilms represents a real scientific challenge, but the problems linked to the living nature of this type of material are real problems. Living materials represent fragile samples that should be handled with care.
  • the present invention makes it possible to solve the problems and drawbacks of the methods of the prior art by providing a method for detecting and / or monitoring and / or characterizing the formation of a biofilm comprising the following steps
  • the inventors have surprisingly demonstrated that the process of the invention makes it possible to observe biofilm formation in real time, without altering the biofilm and advantageously makes it possible to determine the kinetics of biofilm formation, continuously, without time bias.
  • the formation of the biofilm is accompanied by the development of a material whose three-dimensional structure can be composed by entanglements of bacteria in a polymer matrix whose mechanical behavior turns out to be viscoelastic.
  • the method of the invention is a non-destructive method advantageously making it possible to determine the evolution of the state of the biofilm over time, in particular by analysis of its material properties.
  • the method of the invention makes it possible to study and determine the mechanical properties of the extracellular matrix of biofilms.
  • the inventors have demonstrated that the process of the invention advantageously makes it possible in particular by incorporating particles and / or microbeads into the culture medium, in particular the bacterial medium, and in particular by recording their movement, for example with a optical device, for example viewed under a microscope, to study and determine the mechanical properties of biofilms, in particular the mechanical properties of the extracellular matrix of biofilms.
  • the inventors have demonstrated that the results of such a process are dynamic and local, for example by means of the kinematics of the movement of each of the microbeads / particles observed and / or filmed.
  • the inventors have taken advantage of the displacement of the microbeads / particles in the biofilm in order to characterize the development of the latter.
  • the vectors or displacements are independently noted in the form n or n, n being an example of designation of a vector.
  • temporal succession of observations is understood to mean at least two observations over time.
  • the method can comprise from 1 to 1000 observation steps, for example from 1 to 100 observation steps that the solution is maintained under conditions allowing the development of a biofilm by said at least one microorganism.
  • the observation steps can be carried out at regular time intervals.
  • the observation steps can be carried out according to a time interval of 1 to 10 minutes, 2 to 8 minutes, 3 to 6 minutes, equal to 5 minutes.
  • the temporal succession of observations can be carried out at regular time intervals.
  • the observation steps can be carried out according to a time interval of 1 to 10 minutes, 2 to 8 minutes, 3 to 6 minutes, equal to 5 minutes.
  • the observation can be carried out by any means known to the person skilled in the art. It can be for example an optical device, for example a microscope, for example an Olympus CKX53 inverted light microscope equipped with a 40x lens, a camera, a scanner, a camera, for example PCO Edge or a Basler Ace camera.
  • an optical device for example a microscope, for example an Olympus CKX53 inverted light microscope equipped with a 40x lens, a camera, a scanner, a camera, for example PCO Edge or a Basler Ace camera.
  • the observation can include at least two images of the solution. It can be for example an observation comprising a taking of at least two images. It can be, for example, an observation comprising a series of images taken, for example from 2 to 100,000 images, from 2 to 50,000 images, for example from 2 to 300 images.
  • the time interval between two successive images during an observation can be noted D ⁇ .
  • the time interval At must be> 0.
  • each observation can comprise, for each particle of a set of particles observed during said observation, a determination of a trajectory corresponding to successive displacements carried out by said particle during said observation.
  • an observation 0 * can, for example, be obtained by determining the trajectories of n particles / beads, along a series of N + 1 images, for example N is greater than or equal to 1, for example ranging from 1 to 3000, for example ranging from 1000 to 3000.
  • N can be such that 1 ⁇ N, preferably 1000 ⁇ N + 1 ⁇ 3000.
  • the observation of the solution can be carried out for a given time.
  • the observation can be carried out for a time and / or a duration ranging from 0.01 ms to 15 s, for example from 0.1 ms to 10 seconds.
  • the observation can be carried out by taking images at any suitable frequency known to those skilled in the art. It can be taking pictures with a frequency of 1 to 1000 images per second, for example 100 to 300 images per second, for example 200 images per second.
  • the image can be a digital image.
  • digital image means any digital image known to those skilled in the art.
  • the smallest constituent entity of this grid is called pixel ("picture element" in English).
  • the digital image can therefore be a matrix of pixels quantified by their coordinates and their gray level. The magnitude of the pixel values may depend on the number of bits on which the image is encoded. If the image is coded on
  • a pixel can be quantified by 2N different shades of gray. These can for example be images coded in 16 bits, which represents a range of 65536 different gray level values. This sampling of the information in space and in the depth of the gray levels defines the dynamics of the image.
  • the linear transposition of a continuous signal of the material observed in a sampled signal can be constituted by a matrix of pixels can require some precautions.
  • the surface observed can be and remain plane during the observation in order advantageously not to introduce differences in scales in the images.
  • the lighting can be constant and the dynamic range of the image adapted to the desired measurement.
  • the displacement ü can be calculated in each pixel over a small portion of the surface of the material. This portion is commonly referred to by its acronym King of English “Region of Interest”.
  • a selection of an area of the image where the calculation is made can advantageously allow on the one hand to get rid of the image edge pixels which are liable to disappear during the mechanical test and on the other hand, set aside areas where mechanical information is not relevant.
  • the trajectory can be determined by any process and / or method known to those skilled in the art. It may for example be a particle trajectory, for example the set of successive displacements carried out by a particle, for example during an observation.
  • trajectory for example trajectory of a ball
  • trajectory for example trajectory of a particle
  • the trajectory can be in at least two dimensions, for example in two dimensions or three dimensions.
  • the positions can be given by the Cartesian coordinates, x (t) and y (t), in an orthogonal coordinate system, for example centered on the particle.
  • n particle can be observed, with n greater than 1, for example ranging from 1 to 350, for example ranging from 150 to 350.
  • n may be such that 1 ⁇ n, preferably 150 ⁇ n ⁇ 350 particles, for example present in the sample and / or the solution.
  • each observation can comprise a set of n trajectories of n particles, for example greater than 1, for example comprised from 1 to 350, for example comprised from 150 to 350.
  • n can be such that 1 ⁇ n , preferably 150 ⁇ n ⁇ 350 particles present in the sample and / or the solution.
  • n is greater than or equal to 1, for example ranging from 1 to 350, for example from 150 to 350.
  • displacement vector is meant, for example, a vector of components according to the formula [(x (t + At) - x (t), (y (t + At) - y (t))], Vt, 0 ⁇ t £ NAt
  • the position of the particles for example during observation, can be determined by any method known to a person skilled in the art.
  • the position of the particles can be determined by identification of any point on the particle, for example by identification of the circumference and / or periphery of said particles or of the center of said particles.
  • the method for detecting and / or monitoring and / or characterizing the formation of a biofilm can for example comprise the following steps:
  • the method for detecting and / or monitoring and / or characterizing the formation of a biofilm can for example comprise the following steps:
  • the detection of particles, in particular on an image can be carried out by any suitable method known to those skilled in the art. It can for example be a method of comparing images with at least one reference image (imagev). According to the invention, the reference image (imagev) can be determined by any method known to those skilled in the art. It can for example be a process comprising the following steps:
  • imagette b is the raw thumbnail of the area around a ball
  • image b T is the transpose of imageb
  • image b Rh is the horizontal symmetry of imagette b
  • imageb Rv is vertical symmetry of the imagetteb.
  • the transposition of the imagetteb can be carried out by any suitable method known to those skilled in the art.
  • A ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ) a matrix of M np
  • horizontal symmetry of the imagetteb can be achieved by any suitable method known to those skilled in the art.
  • A (a ⁇ ⁇ ) a matrix of M np
  • vertical symmetry of the imagetteb can be achieved by any suitable method known to those skilled in the art.
  • the comparative statistical analysis of the displacements of the particles can be carried out by any suitable method known to those skilled in the art.
  • the comparative statistical analysis of the displacements of the particles may include in particular a step of comparing the observations.
  • the comparison step can be carried out by any image comparison method known to a person skilled in the art. It can be, for example, a method of comparing images, for example for a grayscale image, comprising an aggregation of gray levels, a distribution of gray levels, or for example for a gray image colors, a method of comparing images comprising an aggregation of color levels. It may, for example, be a method of comparing images, for example a method of comparing a digital image, for example a digital image in grayscale.
  • the image comparison method, in particular digital (CIN) can for example be based on the principle of conservation of the gray levels between two images of the same surface at successive instants.
  • the images used for CIN may correspond to the intact and distorted surfaces of the object of study. They can be represented by 2D functions f and g.
  • the comparison can be based on a comparison of the amplitude of the signal between the reference image and the image of the deformed state.
  • the functions f and g can represent the gray levels interpolated at the pixel whose position is identified by its coordinates (x, y).
  • the problem to translate consists in determining ü, the field of displacements sought in the center of a King surface element.
  • a point x in the reference image f moves to X (x) in the distorted image g.
  • the conservation of the gray levels between the two moments can be written:
  • a distance between f and g can be introduced.
  • the minimization of this distance can then be implemented.
  • the amplitude of the signals over an area, here in 1 D can be compared between the reference image and the image of the deformed state.
  • determining displacement ü is an ill-posed problem. It can be regularized for example by adding a priori information on the solution of the inverse problem. It can be for example a kinematic regularization. For example, a kinematic base to which the displacement belongs is defined. In practical terms, the displacement can be approached by a set of families of simple transformations.
  • the _i are the functions of forms forming a base describing the field of displacement.
  • F ⁇ is the degree of freedom associated with the function of form F ,
  • a spatial regularization, by the choice of the size of the zones, support of the kinematics can also be used. Determining the optimal coefficients of the approximate transformation may require minimizing the distance between f and g. This distance can be formalized in the form of a cost function.
  • Various functions can be used as described in Pan et al., 2010. It can be for example the standard S 2 in which the conservation of the gray levels is sought by minimizing the square of the difference in gray levels: This function is non-linear. Assuming they are small displacements, it can be linearized by performing a first order Taylor expansion. The previous equation then becomes:
  • M and b are known data which depend on the gradient of the reference image, and on the residue between the initial image and the “back-deformed” image.
  • the regularization can be carried out iteratively by updating the displacement increment by a Gauss-Newton algorithm.
  • the displacement increment can be obtained by solving the linearized system equation
  • the resolution of the system makes it possible D ⁇ “to find and thus, to calculate the field of displacement on the element King when the d is found. +! - Sa 4- D1 ⁇ 2 + i
  • the Gauss-Newton algorithm can operate until the stopping criterion is reached, for example when AS it ⁇ 10 -5 .
  • the images can be discretized and therefore known to the nearest pixel.
  • the calculated displacement takes a value in N2.
  • an interpolation of gray levels at non-integer coordinates can be carried out, for example a bi-cubic or “spline” interpolation.
  • the method can comprise, during the comparison of the observations, the determination of the statistical distribution of the possible trajectory of particles and / or of the geometry of the possible trajectory of particles.
  • the method can comprise, during the comparison of the observations, the determination independently by particle of the statistical distribution of the possible trajectory of each of the particles and of the geometry of the possible trajectory of each of the particles present.
  • the method can also comprise an overall statistical analysis of the displacements made by the particles observed during each observation and / or a calculation of times characteristic of the formation of the biofilm on the basis of the results of the statistical analysis. overall.
  • global statistical analysis any statistical analysis known to a person skilled in the art suitable for a displacement analysis, for example of particles. It can be for example an analysis of the distribution, for example based on the variance, for example the sobol index, an analysis of the variance on the distribution, hypothesis tests on the type of statistical law representative of the motion / displacement distribution.
  • the global statistical analysis can comprise the calculation of a value of at least one statistical parameter of a distribution of the displacements carried out respectively by the particles of the plurality of particles and an analysis of the variations as a function of the time of the values of said at least one statistical parameter obtained for the succession of observations.
  • the at least one statistical parameter of a displacement distribution can be any statistical parameter known to those skilled in the art. he for example, it may be the determination of the standard deviation of the distribution of displacements and / or trajectories, of statistical moments. For example the determination of the standard deviation of the distribution of displacements can be established according to the following formula:
  • the particle displacement vector can correspond to the vector connecting an old position to a new position of the particle, therefore the final position vector minus the initial position vector.
  • the vector can also be designated here by trajectory.
  • the displacement vector and / or trajectory of each of the particles can be determined during each of the observations, for example by determining the position of the particles on each of the images obtained during said observation.
  • MSD (At) Ar 2 in which Ar is the radial displacement of the particles and At the time interval .
  • the time interval At may correspond to the time interval between two images.
  • the coordinates of the vector can be expressed in pixels.
  • the method can include determining the statistical distribution of all the particles.
  • the method can include determining the geometry of the trajectory of all the particles.
  • the determination of the geometry of the trajectory can be carried out by any method known to a person skilled in the art.
  • the variation of the value of the standard deviation of the displacements and / or trajectories, preferably as a function of time, for example of the observation time T *, can make it possible to characterize the possible biofilm.
  • the inventors have demonstrated that during the production of a biofilm, the value of the standard deviation of the distributions of the displacements carried out by the particles varies over time.
  • the inventors have surprisingly demonstrated that when a biofilm is produced, the value of the standard deviation of the distribution of displacements increases over time to a maximum value before decreasing, while in the absence of biofilm production, once the maximum value of the standard deviation of the displacement distribution reached, this does not vary over time.
  • the inventors have also surprisingly demonstrated that the variation in the value of the standard deviation of the distributions of the displacements made by the particles over time during the formation of biofilm can be modeled, making it possible advantageously to determine the time or times increase and / or decrease in the value of the standard deviation of the distributions and / or the slope (s) of the curve represented by the variations in the value of the standard deviation of the distributions of displacements as a function of time.
  • the inventors also demonstrated that the variations in the slope of the curve for the evolution of the standard deviation of the distribution of displacements as a function of time corresponded to variations in the "behavior" of the particles in the medium and / or in the solution.
  • the method can further comprise a statistical analysis of the individual contributions of the particles observed from the displacements made by each particle observed during each observation and an identification of at least a percentage of particles performing the same type of movement based on the results of the statistical analysis of individual contributions.
  • the statistical analysis of the contributions of each of the particles and / or of the individual contributions of the particles observed can be carried out by any suitable statistical analysis method known to those skilled in the art. It may for example be a method of statistical analysis as mentioned above. According to the invention, the statistical analysis of the contributions of each of the particles and / or of the individual contributions of the particles observed can be carried out for each observation.
  • the statistical analysis of the individual contributions of the particles can include, for each observation:
  • the characteristic parameters of the displacements can be at least one characteristic parameter is chosen from the group comprising
  • mean (21) returns the mean of the components of vector 21 - the standard deviation c3 of the velocity distribution of each particle at each point of the trajectory
  • skw (A) returns the asymmetry coefficient of the components of the vector A
  • max corresponds to the largest component
  • std corresponds to the standard deviation
  • mean corresponds to the mean
  • skw corresponds to the asymmetry coefficient
  • cumsum corresponds to the cumulative sum
  • min corresponds to the smallest component of the vector.
  • the statistical analysis of the contributions of each of the particles and / or of the individual contributions of the particles observed can comprise the determination of the mean displacement squared (MSD) according to the following formula: ⁇ Ar 2 (At)> in which Ar is the radial displacement of the particle and At the time interval.
  • the vector composed of parameter values characteristic of the displacements defining the trajectory concerned can be calculated by any method known to those skilled in the art. It can for example be a process comprising a concatenation of all the values of characteristic parameters.
  • the constitution of a matrix from calculated vectors can be achieved by any suitable method known to those skilled in the art.
  • This may for example be a principal component analysis.
  • the principal component analysis can be any principal component analysis known to those skilled in the art.
  • it can be an analysis allowing the selection of the components of the values which express the maximum variance.
  • the identification of at least one predominant main component among the main components resulting from the decomposition can be carried out by any process and / or means known to those skilled in the art.
  • the predominant main component or components can come to correspond to the components preferably corresponding to at least 40% of the sets of values, preferably to 60% of the sets of values.
  • the generation of a diagram in at least one dimension of the projections of the different vectors corresponding to the trajectories of the particles observed on said at least one predominant main component identified can be produced by any process known to those skilled in the art.
  • the diagram can be a one-dimensional, two-dimensional, three-dimensional or four-dimensional diagram, preferably one-dimensional, two-dimensional or three-dimensional.
  • the number of dimensions of the diagram can be a function of the number of predominant main components identified.
  • the diagram can be a two-dimensional diagram, each of the dimensions of the diagram independently corresponding to a main component, the third main component being reported in the diagram.
  • the method can comprise from the diagram generated a step of identifying a cluster of points in said diagram.
  • the identification of a point cluster in said diagram can be carried out by any method and / or method of analysis known to those skilled in the art. It may, for example, be any suitable clustering method known to those skilled in the art. It can for example be a visual analysis of the distribution of points, a K-mean, k-Medoides analysis.
  • the method can comprise a calculation of the percentage of particles from a percentage of points belonging to a given cluster.
  • the calculation of the percentage of particles from a percentage of points belonging to a given cluster can be carried out by any suitable method known to those skilled in the art. The person skilled in the art, by virtue of his general knowledge, will know how to choose the method according to the diagram.
  • the percentage of particles calculated from a percentage of points belonging to a given cluster makes it possible to classify and / or characterize the biofilm formed.
  • the method can further comprise a step of analyzing a change over time in said percentage of particles for the different observations.
  • the analysis of the evolution over time of said percentage of particles for the various observations makes it possible to determine the dynamics of formation of the biofilm, from a quantitative and qualitative point of view.
  • the microorganism can be any microorganism known to those skilled in the art. It can for example be a bacteria, a fungus. They can also be prokaryotic cells, for example any bacterium known to a person skilled in the art, for example bacteria included in the group, without being limited to this group, consisting of Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bordonetella bronchiella, Bacteroides melaninellaellae, Bartonidesella bronchiella, , Branhamella catarrhal
  • fungus known to a person skilled in the art, for example pathogenic or non-pathogenic fungi, for example fungi responsible for pathologies, for example in human health or not, environmental fungi, fungi chosen from the group comprising yeasts, for example Candida and / or Cryptococcus, for example yeasts responsible for pathologies, for example in human health, for example candidiasis and / or cryptococcosis, and / or the group comprising molds, for example Aspergillus, for example mold responsible for pathology, for example in human health, for example of aspergillosis and / or pulmonary mycosis.
  • yeasts for example Candida and / or Cryptococcus
  • yeasts responsible for pathologies for example in human health, for example candidiasis and / or cryptococcosis
  • molds for example Aspergillus, for example mold responsible for pathology, for example in human health, for example of aspergillosis and / or pulmonary mycosis.
  • the microorganism can be introduced into the solution at a concentration of from 1.10 6 to 2.10 8 CFU / ml (CFU: Colony-Forming Unit; Colony-forming Unit; Colony-forming Unit), for example 1.10 7 at 8.10 7 CFU / ml.
  • CFU Colony-Forming Unit; Colony-forming Unit; Colony-forming Unit
  • the amount of microorganism can be from 2.10 5 to 4.10 7 CFU, for example from 2.10 6 to 1, 6.10 7 CFU.
  • the solution can be contained in a container and / or present on a surface. It can for example be any container known to the person skilled in the art. It can be for example a culture container.
  • the surface is meant any culture surface known to the skilled person. It can for example be a glass slide, Plexiglas or other suitable material. It can be, for example, a glass slide to which a drop of medium and bacteria can be added.
  • culture container means any culture container known to a person skilled in the art. It can be for example a culture reactor, wells, tubes or wells for example microdilution plates.
  • the culture container can for example be an enclosure with a closed end, of the tube, well, etc. type. or an enclosure with two openings. It can also be a container comprising a closed end so as to form a flat bottom, a container with a closed end so as to form a hemispherical bottom, a container comprising two open ends. When the container has two open ends, said container can be configured to allow a flow of the culture medium in constant flow or in discontinuous flow.
  • microdilution plate it can for example be a microdilution plate, the type of plate defined for example by the American National Standards Institute and the Society for Biomolecular Screening (“microplates”) carrying 96 wells, 384 and even 1536, or conversely 48 or 24 wells or any other number of wells.
  • microplates the type of plate defined for example by the American National Standards Institute and the Society for Biomolecular Screening (“microplates”) carrying 96 wells, 384 and even 1536, or conversely 48 or 24 wells or any other number of wells.
  • It may for example be a culture container constituted by any material known to a person skilled in the art. It can for example be plastic, for example polycarbonate, polypropylene, polystyrene, etc., glass, metal.
  • microplates made of polycarbonate or polypropylene with a flat, conical or round bottom.
  • polystyrene container for example any polystyrene known to a person skilled in the art.
  • the solution can also be on a surface. It can be any surface known to a person skilled in the art on which a microorganism can be incubated and / or can grow and / or on which a biofilm can form. It can be, for example, a biotic or abiotic surface. It may, for example, be a surface of a medical device and / or supports, for example dental implants, catheter, prostheses and / or any medical device known to those skilled in the art on which microorganisms can develop.
  • biotic surface is understood to mean any biotic surface known to a person skilled in the art.
  • abiotic surface means any abiotic surface known to a person skilled in the art. It can also be any device surface known to a person skilled in the art on which a bacteria is capable of forming a biofilm. It can be for example the surface of a medical device, for example a catheter, a needle, a catheter with an implantable chamber (or Porth-a-Cath), a valve, for example a heart valve, a prosthesis, for example a joint prosthesis, a ligament prosthesis, a dental implant, a urinary tract prosthesis, the peritoneal membrane, peritoneal dialysis catheters, synthetic vascular grafts, stents, internal fixation devices, percutaneous sutures and / or tracheal, ventilation tubes.
  • a medical device for example a catheter, a needle, a catheter with an implantable chamber (or Porth-a-Cath), a valve, for example a heart valve, a prosthesis, for example a joint prosthesis, a ligament prosthesis, a dental implant
  • the solution can be any solution and / or medium known to those skilled in the art suitable for the cultivation of microorganisms.
  • the solution can be any solution known to a person skilled in the art in which a microorganism can be incubated and / or can grow and / or on which a biofilm can form. It may, for example, be a culture medium, for example any culture medium known to a person skilled in the art and / or commercially available in which at least one microorganism is liable to develop. It can be for example a natural environment or synthetic.
  • a culture medium for bacterial growth for example the BHI medium (“Brain Heart Infusion”), the LB medium (“Lysogeny broth” also called “Luria Bertani”) , MH medium (“Mueller-Hinton medium”), glucose broth, yeast culture medium, for example Sabouraud medium.
  • BHI medium Brain Heart Infusion
  • LB medium Lysogeny broth
  • MH medium MH medium
  • glucose broth yeast culture medium
  • Sabouraud medium for example Sabouraud medium
  • plurality of particles means at least two particles.
  • said at least two particles can be any particle making it possible to implement the present invention.
  • said particle can be a particle of any shape suitable for the implementation of the present invention, for example in the form of a ball, of a puck, of asymmetrical geometric shape, for example with a flat face, etc.
  • the shape of the particles can be identical or different.
  • the shape of the particles is identical.
  • the particle can be of any suitable material known to a person skilled in the art. It can be for example a metal particle, a plastic particle.
  • any suitable particle size can be used.
  • the size can be chosen for example according to the size of the container of the solution and / or of the microorganism.
  • the particle size may be less than a tenth of the size of the container, preferably less than a hundredth, even more preferably less than a thousandth of the size of the container.
  • the particle may have a size of, for example, 10 nm to 100 nm, from 0.1 to 100 ⁇ m.
  • the method of the invention can be implemented with at least 2 particles, with for example from 2 to 10,000,000, from 1,000 to 1,000,000, from 10,000 to 1,000,000, from 100 000 to 1,000,000, 10,000 to 100,000.
  • the plurality of particles advantageously makes it possible to observe a plurality of trajectories of said particles.
  • said particles when the method is implemented with a plurality of particles, said particles can be of identical or different size.
  • the particle size is identical.
  • the small particles can have a size, for example, of 10 nm to 1 pm, for example of 100 at 500nm
  • the large particles can have a size, for example, from 1 pm to 100pm, for example from 1 pm to 10 pm, for example from 1 pm to 5 pm.
  • the particles can generate a detectable signal.
  • the detection of this signal will depend on the properties of the particle.
  • said at least one particle may be fluorescent, phosphorescent, chemiluminescent, reflective or colored.
  • the fluorescence emitted by the particle can be detected for example visually, and / or by any optical means known to those skilled in the art.
  • Said at least one particle can be, for example, illuminated to follow its movement by means of a light source, for example by a laser beam.
  • this particle can be viewed, for example visually, by any optical means known to a person skilled in the art.
  • the detection of the particle can be formed by adding chemical reagents to the medium, allowing the emission of light energy by the particles.
  • said at least one particle can, for example, be lit, to follow its movement by means of a light source, for example by a laser beam.
  • the method can comprise beforehand and / or during the step of maintaining the solution obtained in (c) under conditions allowing the development of a biofilm by said at least one microorganism, the introduction of at least one compound chosen from an antibiotic, an antifungal and / or mixture thereof.
  • compound any compound, for example natural or obtained by synthesis, chemical hemi-synthesis, or obtained by extraction, known those skilled in the art capable of modifying the growth / development of microorganisms and / or capable of killing a microorganism. It may for example be a biocide, for example a disinfectant, a protection product, a product for combating so-called harmful species and the like and / or any biocide included in the list according to Directive 98/8 / EC or Regulation (EU) No 528/2012, an antibiotic, an anti-fungal.
  • a biocide for example a disinfectant, a protection product, a product for combating so-called harmful species and the like and / or any biocide included in the list according to Directive 98/8 / EC or Regulation (EU) No 528/2012, an antibiotic, an anti-fungal.
  • antibiotics chosen from the group comprising fusidic acid, aminoglycosides, beta-lactams, penicillins, beta-lactamase inhibitors, cephalosporins, carbapenems, monobactams, cycloserine , daptomycin, fosfomycin, lincosamides, macrolides and ketolides, mupirocin, nitroimidazoles, nitrofurans, oligosaccharides, oxazolidinones, polypeptides: bacitracin, glycopeptides, polymyxins and colistin, quinolones, quinolones sulfonamides and diaminopyridines, synergistins, tetracyclines, antifungals, or any mixture thereof.
  • It may for example be an anti-fungal selected from the group comprising Miconazole, Ketoconazole, Clotrimazole, Econazole, Bifonazole, Butoconazole, Fenticonazole, Isoconazole, Oxiconazole, Sertaconazole , Sulconazole, Thiabendazole, Tioconazole, Fluconazole, Itraconazole, Isavuconazole, Ravuconazole, Posaconazole, Voriconazole, Terbinafine, Amorolfine, Naftifine, Butenafine, Mycosubtiline or any these.
  • the antibiotic and / or the anti-fungal may be in solution in the solution, for example in the culture medium, or in dehydrated or lyophilized form, and / or fixed on the surface immersed in said middle.
  • the fixing means which can be used for the antibiotic and / or the anti-fungal can be any means known to a person skilled in the art for fixing an antibiotic and / or an anti-fungal on a surface. It can be for example means or device available on the market, for example supports of the microplate type, for example means or device marketed by the company NUNC (Denmark), Corning (United States), and Greiner Bio -One (Austria). According to the invention, one or more compounds, for example one or more antibiotics, can be introduced into the culture medium.
  • the method according to the invention makes it possible to test different antibiotics and / or anti-fungal alone and / or to search for a combination or combination effect of antibiotics and / or anti-fungal in a commonly used format called "chessboard" (or checkerboard in English).
  • the implementation of the method of the invention with a mixture of antibiotics and / or anti-fungal (combination, combination) can advantageously make it possible to detect possible additive, synergistic and / or antagonistic effects.
  • additive effect is meant the addition of the actions of at least two antibiotics making it possible, for example, to find a combination of antibiotics having the same antibiotic effect as an antibiotic alone, but with lower concentrations.
  • synergistic effect is meant an improvement in the effectiveness of an antibiotic and / or anti-fungal by adding at least a second antibiotic and / or anti-fungal, this mixture of antibiotics and / or anti-fungal having an effect greater than the addition of the effect of each antibiotic and / or anti-fungal alone.
  • anti-fungal effect means the inhibition of the action of an antibiotic and / or an anti-fungal on the microorganism by the addition of at least one second antibiotic and / or anti-fungal.
  • This embodiment can make it possible to select combinations, combinations of antibiotics and / or anti-fungals ("co-drugs") relevant for, for example, inhibiting the development of the microorganism.
  • antibiotics and / or anti-fungals can also be introduced successively into the medium in order to identify additive, synergistic or antagonistic effects as described above.
  • the method according to the invention makes it possible to determine / detect and / or identify the sensitivity of microorganisms to compounds. Also, the method according to the invention advantageously makes it possible to identify a new biocide, for example a new antibiotic and / or antifungal. In addition, the method according to the invention can advantageously make it possible to determine the specificity of a compound, for example if it is an antibiotic and / or an antifungal.
  • the present invention also relates to a device for detecting and / or characterizing the formation of a biofilm capable of implementing the above method.
  • detection means for example optical detection means, for example a camera, an electron microscope, analysis means, for example a calculation module, means of graphical representation, for example a visual representation module.
  • Figure 1 shows an example of digital image comparison.
  • the abscissa represents the pixels and the ordinate the gray level.
  • FIG. 2 represents an experimental diagram of a study of the formation of biofilm by means of microbeads trapped in the bacterial medium
  • FIG. 3 represents diagrams representing the relative BioFilm indices (rBFI) (ordered) as a function of the incubation time (abscissa) for P. aeruginosa (cross or vertical lines), S. aureus (cross or circles) and without bacteria ( cross or triangle).
  • the shaded areas on the left graph represent the standard deviation for the two replicas.
  • FIG. 4 represents diagrams illustrating the different velocities of the balls for four different types of movement encountered during the growth of the biofilm, namely passive movement (a), an ejected / dredged movement (b), an idle movement (c) or movement of linked balls (d).
  • FIG. 5 represents the mean square displacement (MSD: “Mean Square Displacement) (ordered) as a function of time in seconds (abscissa) for beads taken in a suspension of P. aeruginosa for different incubation times: 0.45, 75 or 105 minutes.
  • MSD mean Square Displacement
  • FIG. 6 represents the average square displacement (ordered) as a function of time in seconds (abscissa) for beads taken in a suspension of S aureus for different incubation times: 0, 40, 120 or 160 minutes.
  • FIG. 7 represents a diagram representing the evolution of the standard deviation of displacements of all the particles (ordinate) as a function of the incubation time in minutes (abscissa) of S aureus or not.
  • FIG. 8 represents two diagrams representing two models of evolution of the standard deviation of the displacements of the particles as a function of the incubation time.
  • a and b respectively represent the slope of the first linear part and the vertical interception, t1 a first break in the slope and t2 a second break in the slope.
  • the ordinate corresponds to the standard deviation of the displacements of the particles and the abscissa to the incubation time.
  • FIG. 9 represents the results obtained after analysis in principal components after incubation with bacteria
  • FIG. 9 (a) represents a bar diagram representing the result of analysis in principal component of the displacement parameters or trajectories of the particles
  • FIG. 9 (b) represents a graph as a function of the first (PCA1) (abscissa) and second principal components (PCA2) (ordinate).
  • FIG. 9 (c) represents the proportion of particles / beads as a function of the distribution of the points as a function of time in FIG. 9 (b).
  • the light gray dots correspond to the particles / beads having blocked movements
  • the ordinate corresponds to the percentage of beads and the abscissa the incubation time in minutes.
  • FIG. 10 represents the results obtained after analysis in principal components after incubation without bacteria
  • FIG. 10 (a) represents a histogram representing the result of analysis in principal component of the displacement parameters or trajectories of the particles
  • FIG. 10 (b) represents a graph according to the first and second main components.
  • FIG. 10 (c) represents the proportion of particles / beads as a function of the distribution of the points as a function of time in FIG. 10 (b).
  • the light gray dots correspond to the particles / beads having blocked movements, the ordinate corresponds to the percentage of beads and the abscissa the incubation time in minutes.
  • FIG. 11 represents the results obtained after analysis in principal components after incubation in the presence of S. aureus:
  • FIG. 11 (a) represents a bar diagram representing the result of analysis in principal component of the displacement parameters or trajectories of the particles
  • Figure 1 1 (b) represents a graph according to the first and second components main.
  • Figure 11 (c) shows the proportion of particles / beads as a function of the distribution of points as a function of time in Figure 1 1 (b).
  • the light gray dots correspond to the particles / balls having blocked movements.
  • Figure 12 corresponds to a diagram representing the evolution of the (standard) standard deviation as a function of the incubation time for P. aeruginosa. Slope change occurs at 34 minutes
  • Figure 13 represents the results obtained after analysis in principal components after incubation with P. aeruginosa
  • figure 13 (a) represents a histogram representing the result of analysis in principal component of the parameters of displacements or trajectories of the particles
  • the ordinate represents the percentage of variance
  • the abscissa the components
  • figure 13 (b) represents a graph according to the first (abscissa) and second principal components (ordinate).
  • Figure 13 (c) shows the proportion of particles / beads as a function of the distribution of points as a function of time in Figure 13 (b).
  • the light gray dots correspond to the particles / balls having blocked movements.
  • FIG. 14 represents two diagrams (A and B) representing the evolution of the standard deviation of displacements of all the particles (ordinate) as a function of the incubation time in minutes (abscissa) of the medium alone (white) , S aureus alone, S aureus with vancomycin, or S aureus and fusidic acid.
  • the indicators on the diagrams indicate the corresponding curves.
  • FIG. 15 represents the results obtained after analysis in principal components after incubation of S aureus with vancomycin
  • FIG. 15 (a) represents a bar diagram representing the result of analysis in principal component of the parameters of displacements or trajectories of the particles
  • the ordinate represents the percentage of variance
  • the abscissa the components
  • FIG. 15 (b) represents a graph as a function of the first (abscissa) and second principal components (ordinate).
  • FIG. 15 (c) represents the proportion of particles / beads as a function of the distribution of the points as a function of time in FIG. 15 (b).
  • the light gray dots correspond to the particles / balls having blocked movements
  • FIG. 16 represents the results obtained after analysis in principal components after incubation of S aureus with vancomycin
  • FIG. 16 (a) represents a bar diagram representing the analysis result in principal component of the displacement parameters or trajectories of the particles
  • the ordinate represents the percentage of variance
  • the abscissa the components
  • figure 16 (b) represents a graph according to the first (abscissa) and second principal components (ordinate)
  • Figure 16 (c) shows the proportion of particles / beads as a function of the distribution of points as a function of time in Figure 16 (b).
  • the light gray dots correspond to the particles / balls having blocked movements.
  • FIG. 17 represents diagrams representing the relative BioFilm indices (rBFI) (ordinate) as a function of the incubation time (abscissa) for S. aureus alone, with vancomycin, with fusidic acid and without bacteria (white) .
  • the indicators in the figure indicate the corresponding curves.
  • FIG. 18 represents diagrams representing the number of colonies formed per well (CFU / well) (ordered) as a function of the incubation time (abscissa) for S. aureus alone, with vancomycin, with fusidic acid.
  • the indicators in the figure indicate the corresponding curves.
  • FIG. 19 represents diagrams of the mean square displacement (ordinate) as a function of time in seconds (abscissa).
  • FIG. 20 represents two images of a particle, the image on the left corresponds to the raw image and the image on the right to the image after transformation.
  • FIG. 21 represents an image of a well comprising a medium with bacteria and particles.
  • FIG. 22 is a representation of an example of an area of interest (particle) used to track and / or calculate the movements of the particles, in particular by image correlation.
  • Figure 23 is an image of a grayscale well illustrating the background noise of the sensor.
  • FIG. 24 is a diagram representing a point cloud representing the variance as a function of the average of the gray level distribution of a pixel over 1000 images.
  • FIG. 25 represents diagrams of the mean square displacement (ordinate) as a function of time in seconds (abscissa) for the trajectories of 19 beads diffusing in a 68% glycerol solution. The slopes of the curves in the right graph were approximately equal to 1 (1.5 ⁇ 0.1)
  • FIG. 26 represents diagrams of the mean square displacement (ordinate) as a function of time in seconds (abscissa) the trajectories of 39 balls diffusing in a BHI solution. The slopes of the curves in the right graph are approximately equal to 1 (0.98 ⁇ 0.11)
  • FIG. 27 represents a photograph (FIG. 27 a)) of a well of a trajectory of a ball diffusing in the liquid N350 with the presence of a bias due to a flow of the medium and a diagram of the mean square displacement ( ordinate) as a function of time in seconds (abscissa) ( Figure 27b)) of seven ball trajectories present in the same medium.
  • FIG. 28 represents diagrams representing the displacement of a particle (ordered) as a function of the frequency of image taking per second (fps) during an observation (abscissa)
  • Figure 29 represents histograms representing the displacement of a particle (ordered) according to the frequency of image taking (abscissa), namely for 1000 fps (line 1), 500 fps (line 2) and 200 fps ( line 3), during the same observation
  • the particles are independently designated beads, particles, microparticles.
  • the microbead tracking method presented here is applied to the study of biofilms of P. aeruginosa and S. aureus. For its strains, biofilm growth kinetics were performed. Series of microscopic images were extracted at successive times during the growth of the biofilm. The trials therefore focused on the first stages of formation of the biofilms studied, from the characterization of the BHI medium containing the planktonic bacteria and the microbeads, to the determination of the first signs of biofilm formation via the movements of the microbeads. In the example below, the dynamics of microbeads have been studied rather than calculating mechanical parameters based on the theory of pure Brownian motion.
  • the experimental laboratory was in containment class P2 (“Concerns non-genetically modified microorganisms of class 2 which can cause diseases in humans but whose dissemination in the environment is unlikely, which are without risk for community and against whom effective prophylaxis or treatments are known ”).
  • An Olympus CX53 reference optical microscope was used and the manipulation was carried out under a microbiological safety cabinet. The dynamics of microbeads within the bacterial fluid over time have been observed.
  • the control consisted of a solution of microbeads in the BHI used for the tests. The free movement of the microbeads in the bacterial medium was visualized at room temperature (20 ° C) in transmitted light.
  • the objective of the analyzes was to detect changes in dynamics in the trajectories of the beads over time. For this, series of images at a frequency of 200 images per second were taken at successive times of the biofilm growth of P. aeruginosa and S. aureus in BHI and in the presence of microbeads, preferably paramagnetic, with a diameter of 1 pm. The portion of the bottom of the well observed varies between 600 pm 2 and 1000 pm 2 .
  • FIG. 2 represents an experimental diagram of the steps implemented. A few tens to a few hundred microbeads could be viewed and followed in the same series of images.
  • the material used was as follows: 1 box of bacteria transplanted twice; TON4 (paramagnetic microbeads); BHI (Brain Heart Infusion) medium; as many 96-well microplates as incubation times read.
  • the protocol included the following steps:
  • step 6 Repeat the protocol from step 4 for all incubation times by removing a plate from the oven at the desired time.
  • the material used was as follows: 1 box of bacteria transplanted twice; 1 ⁇ m bead solution (TON4); BHI medium; antibiotics in solution: Vancomycin at 4 pg / mL and Fusidic Acid at 2pg / mL (final concentrations in the wells); as many 96-well microplates as the incubation time observed.
  • the protocol included the following steps:
  • the antibiotics were supplied by a deposit of 20 pL. As this deposit was diluted by adding the bacterial suspension (180 pL / well), the solutions deposited had to be 10 times more concentrated than the desired value, ie 40 pg / mL for Vancomycin and 20pg / mL for Fusidic Acid .
  • the deposition solutions were prepared from existing solutions prepared according to ISO 20776-1: 2006. The solutions were then deposited in the microplates according to an established plan / distribution of plate, at a rate of 20 ⁇ L / well. Water for injection (EPPI) is placed in the control wells.
  • EPPI Water for injection
  • the Toner was added to IBS to obtain a final concentration of 10mI / ml.
  • the mixture was homogenized by vortex and 96-well polystyrene microplates were inoculated with 200 mI / well of IBS. A plate was prepared for each reading incubation time. Cultures grow at 37 ° C without agitation. The lower part of the wells has a diameter of 6 mm and is uncoated. The plates were not touched during growth until they were used for the experiments.
  • S. aureus the effect of two antibiotics was studied in order to detect the capacities of the antibiotics.
  • the two antibiotics tested were vancomycin and fusidic acid at a concentration of 4pg / ml and 2pg / ml respectively.
  • the adhesion kinetics were analyzed every 5 minutes for P. aeruginosa and every 10 minutes for S. aureus until the beads were immobilized.
  • a plate was removed from the incubator and placed on an Olympus CKX53 inverted light microscope equipped with a 40x objective. This magnification was a good compromise between the number of particles observed, plotted and the resolution of the particles.
  • the devices used, in particular for image capture were a PCO Edge camera sold by the company PCO or a Basler Ace camera, the camera being connected to the video output of the microscope. The first is equipped with a 4.2 million pixel CCD sensor and the other with a CMOS sensor with 1.3 million pixels. The difference between the two sensors had no impact on the study.
  • the image series were captured at a rate of 200 images per second with 0.5 ms of lighting time per image to respect the economy capacity of computer and frequency of measurements.
  • Several thousand images per series were taken for each well, at a different location, near the center of the wells.
  • the surface area of the bottom of the well taken by the image represented between 600 pm 2 and 1000 pm 2 depending on the size of the image.
  • the movement of the particles was confined vertically by observing the lower part of the well. However, the particles were allowed to leave the field of vision.
  • the first microplate was read immediately, without being placed in the incubator. The tracking of the movement of the particles was determined according to the method described below making it possible to determine the displacement of the centers of beads between two consecutive images.
  • Nt, i is the length of the trajectory i.
  • Nb is the number of beads for a given incubation time.
  • P has been reshaped so that it is a vector of one-dimensional size
  • the displacement vector provided by tracking the movements of all of the beads / particles constitutes a set of data for the observation of hundreds of beads / particles throughout the duration of the observation of the growth of the biofilm.
  • the tracking vectors have been replaced by characteristic criteria describing the distribution of displacements along the movement.
  • Each criterion brings together the information given by each movement of the balls / particles measured according to the aforementioned comparison method, in particular by comparison of image observations digital. The movement could be analyzed more quantitatively using these different criteria. For each track, discriminating parameters were calculated.
  • each track / trajectory has been associated with a n-tuples of seven parameters:
  • microbeads / particles were cultured in BHI medium in microplates at 37 ° C. in the presence of microbeads / particles. The movement of microbeads / particles moving directly above the bottom of the well was observed. These microbeads / inert particles have a spherical geometry, of homogeneous size and constitute indeformable probes of the behavior of the medium surrounding the bacteria.
  • the two selected strains have different capacities and specificities for biofilm formation as shown in Figure 3.
  • the kinetics of biofilm growth deduced with BRT for S. aureus shows that the immobilization of the beads occurs at 120 minutes.
  • the blocking begins at 40 minutes.
  • the P. aeruginosa strain curve with vertical lines
  • blocking of the beads begins at the start of incubation.
  • the total disappearance of the spot which means a total blockage of the beads, occurred in about 80 minutes.
  • P. aeruginosa produces a very mucous matrix in a short time compared to S. aureus which forms a biofilm over time.
  • the rBFI for P. aeruginosa increased from the start unlike S. aureus.
  • the movement of the particles was monitored by taking images of the particles / beads incorporated in the bacterial medium with a high magnification, just above the bottom of the wells, individually, at short time scales, for each time. incubation. Different movements of the beads could be observed in the bacterial media from the different strains.
  • the first bacterial suspension was made with a strain of P. aeruginosa while the second was made with a strain of S. aureus.
  • Experimental observations have shown that the movement of the beads in a suspension bacterial at 37 ° C was a combination of active and thermal movements.
  • the movement of the beads differed according to the type of bacteria in the growth medium. The trajectory of the beads which results from the medium comprising P.
  • aeruginosa differed from the purely Brownian movement.
  • Visual observations on the trajectory of the beads inside the bacterial suspension during the growth of the biofilm showed that the beads tended to move in a preferred direction.
  • the beads present in the control solution (composed of beads in the same nutrient medium) underwent a characteristic Brownian movement
  • the beads in a solution / bacterial medium showed an increase in diffusion in their movements, especially at the start of incubation .
  • the "increased" diffusion phenomena could be erased.
  • the beads / particles seemed less mobile. They experienced random movement, possibly disturbed by interactions with other particles.
  • the beads slowed down to a complete blockage.
  • Table 1 and Figure 4 illustrate the speeds of the balls with different types of movement.
  • the Brownian motion is characterized by the mean displacement squared (MSD) (Ar 2 (At)) proportional to the time interval At between the positions.
  • Ar is the radial displacement during a time interval At.
  • MSD mean displacement squared
  • (Ar 2 (At)) 4DAt, where D is the diffusion coefficient.
  • (Ar 2 A (t)) 4Dt a with a> 1.
  • the mean values of the displacement squared of the microbeads incorporated in the bacterial solutions were calculated during the growth of the biofilm. For each trajectory, the mean displacement squared was calculated and the curves of MSD as a function of the time interval were plotted.
  • Figures 5 and 6 show the curves of the mean of the squared displacement as a function of the time interval for the two strains during the formation of the biofilm.
  • Figure 5 For P. aeruginosa ( Figure 5), some beads show superdiffusive movements, while for S. aureus, these behaviors have hardly been observed. As shown in the figures above, it appears that the movements of the beads can provide indications on the microbiological activity of bacteria. While the movement of the ball taken in a biofilm of S. aureus is relatively simple, the balls in the biofilm of P. aeruginosa exhibit different characteristics / behavior.
  • FIG. 7 represents the standard deviation of the distribution of the movements / trajectories of the beads as a function of the incubation time for two replicates of suspension of S. aureus and for the two replicas of control wells (composed of the same microbeads in BHI medium ).
  • the standard deviation increases at the start of biofilm growth. This increasing period was also observed in the control blank. Then, at 20 minutes, the standard deviation decreases for the beads in the bacterial medium while it stabilizes for the control blank. After about 140 minutes, the standard deviation of travel drops. The curves were approximated by piecewise linear functions.
  • PCA principal component analysis
  • FIG. 12 represents the standard deviation of the distribution of the movements of the balls as a function of the incubation time.
  • the variation of the standard deviation was modeled by a linear function.
  • the bi-linear model made it possible to detect a change in trend at 34 minutes, where the standard deviation stops increasing. After 34 minutes, the values of the standard deviation seem to decrease overall, with great variability in these values for the last incubation times. This variability may be due to the heterogeneity of the biofilm formation of P. aeruginosa.
  • the characterization of the effect of antibiotics is an important question in the pharmaceutical field.
  • the same processing of the experimental data is carried out.
  • the figure below shows the evolution of the standard deviation as a function of the incubation time for a suspension of S. aureus, including antibiotics.
  • the standard deviation increased during the first periods of biofilm growth and the standard deviation increased, then decreased more slowly than without antibiotic.
  • the bi-linear functions adapt to the curves of the standard deviation equation for the bacterial suspension with antibiotics.
  • aeruginosa was followed thanks, for example, to an optical device coupled to a digital image correlation algorithm. Due to the large number of data generated by the measurement of the trajectories, these have been advantageously characterized by specific characteristics / parameters. On the one hand, all the displacements during the elementary time intervals of all the trajectories followed have been mixed for each reading incubation time. On the other hand, the balls were taken into account individually and the parameters / criteria determined make it possible to describe the behavior of the ball. Thanks to this monitoring and analysis methodology, quantitative characteristic times during biofilm growth have been determined. For the analysis of the global displacements as well as the analysis of the individual displacements of the beads, we detect a biological event at around 140 minutes of incubation for S. aureus.
  • the classification of the balls into two groups in a well-chosen framework allows fine detection of the start of blocking of the balls.
  • the start of the blockage appears between approximately 71 minutes and 97 minutes depending on the response in question.
  • a second event appears between approximately 143 and 160 minutes.
  • the process of the invention advantageously makes it possible, unlike the known processes, to obtain a result continuously over time thanks to its non-destructive nature.
  • the method of the invention allows obtaining a result without any action and / or addition of compounds, for example contrast agents, during bacterial culture.
  • the method of the invention can be implemented without direct contact with the culture and thus is advantageously a non-invasive and non-destructive test while allowing the obtaining of numerous parameters which may be useful in order to characterize the biofilm in real time.
  • the method of the invention advantageously makes it possible at the end of the culture incubation time to obtain the results, to dispense with the use of products / consumables, which advantageously makes it possible to reduce the time of analysis, as well as costs in terms of consumables and labor.
  • the method of the invention makes it possible, by monitoring the movement of the particles inserted within a biofilm, to bring a temporal dimension to the measurement.
  • the method of the invention allows non-destructive detection of the formation of biofilm.
  • the method of the invention advantageously makes it possible to detect biological events occurring during the formation of biofilm and / or discriminating phenomena by means of the characteristics of the microscopic trajectories of inert beads.
  • the process of the invention advantageously allows an almost continuous temporal monitoring of the kinetics of biofilm formation.
  • the method of the invention allows control of the kinetics of biofilm growth, non-invasive and non-destructive.
  • the process of the invention advantageously allows multiple observation of the bacterial culture during its incubation, for example it advantageously allows to multiply the observations at incubation times as close as desired as opposed to known methods.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to obtain reliable and comparable results.
  • the method of the invention by the use of inert microbeads within a bacterial medium and the observation of the passive movements of said inert microbeads within a bacterial medium makes it possible to discriminate characteristic phenomena and times during the growth kinetics of biofilms of bacteria, for example of P. aeruginosa and S. aureus.
  • Example 2 example of a particle tracking method
  • the CIN requires the use of digital images which can translate information on the placement of material points on the surface of the material studied. This information can be materialized by a grayscale marking. For many engineering materials and hard bone-like living materials, the application of a speckle to the surface of the test samples is required. Living materials sometimes have a natural grain due to their texture, which makes the use of digital image correlation suitable. This is the case, for example, for biofilm images taken via a microscope (Mathias and Stoodley, 2009) or for the soft tissue of the leg (Bouten, 2009).
  • the use of the proper texture of living material to obtain quantitative information on its mechanical behavior can be biased. Due to its living nature, this type of material is capable of reacting actively to the mechanical stress induced by the stress during the test. In the present passive microbeads are arranged randomly within the material.
  • the CIN can advantageously be used for the purpose of monitoring particles incorporated in a heterogeneous and dynamic medium.
  • the medium studied was placed in a small volume container which allows observation under an inverted optical microscope without solicitation. The free movements of the beads located directly at the bottom of the container are observed. Series of images were recorded via the video output of the inverted microscope
  • the Brownian movement consists of a perpetual movement (no damping due to friction phenomena), without privileged orientation of micrometric particles in a fluid. It is the incessant collisions of the particle with the molecules of the fluid which cause the displacement of the colloid particle.
  • the driving force is thermal, with an energy of the order of kBT, kB being the Boltzmann constant and 71a temperature, expressed in Kelvin (Wirtz, 2009). Brownian motion is related to the probability of impact with the molecules of the solvent. On average, the particle remains stationary since it goes as often in one direction as in the other.
  • D Einstein's diffusion coefficient. It is related to the dynamic viscosity h of the solvent.
  • the MSD is proportional to
  • Figure 19 represents three diagrams of variation of the MSD as a function of time and movement: Brownian, super-diffusive or under-diffusive
  • Example 3 example of a method for monitoring particles in an example of material, locating region of interest, reducing the region of interest and validating the metrology of particle tracking
  • the beads / particles were observed under an optical microscope using a x40 objective (x400 magnification). These were beads / particles identical to those used in Example 1.
  • the x400 magnification made it possible to have a good compromise between the resolution of the information on the balls (the balls were then coded on 10 pixels (px) in diameter) and the number of visible balls in an image. Series of a few thousand images have been recorded.
  • the beads were tracked individually using a Digital Image Comparison (CIN) algorithm.
  • the formulation of the CIN in its local version was used: we are interested in a portion of the image reduced to a square of 51x51 px 2 around a ball and the area is calculated in its entirety.
  • the kinematics of the displacement remains simple and has been defined on this portion of the image.
  • the image correlation algorithm measures the displacement in pixels between a reference image and a subsequent image in the series, this sequentially. This calculation was carried out along the series of images in order to reconstruct the trajectory of the ball. This tracing by CIN allows a fast follow-up, suitable and whose error is known. If the algorithm shows difficulties in converging, different explanations are possible:
  • the coordinates of the ball make it possible to consider that the trajectory leaves the image.
  • the calculation is initialized with a previous image in the series then the calculation resumes between this new initial image and the images that follow it.
  • the tracking of the beads / particles was also carried out individually for each particle.
  • the objective of this part was to detect the presence of balls in the image in order to restrict the region of interest around a ball.
  • a number of beads was observed ranging from a few tens to a few hundred. It was agreed to be able to detect the beads systematically.
  • an automatic process based on image processing techniques has been implemented. For each sequence images, the first image is open. The center of a ball among the image has been manually selected by the user. A 20x20 px 2 Imagetteb thumbnail of this ball and the surrounding area has been created.
  • This new virtual image was composed of a linear combination of simple transformations of the basic thumbnail.
  • the new virtual image is thus created according to the following combination:
  • FIG. 20 represents two images of a particle, the image on the left corresponds to the raw image and the image on the right to the image after transformation. Based on the OpenCV library, the algorithm of localization of the areas of interest proceeds to the research of the maximum of correlation between the whole image and the imagette lmagettev which represents an independent ball.
  • Correlation maximums can be present on several pixels around a ball.
  • the center of gravity of each of the clusters formed by the set of correlation maximums around a ball was chosen to designate the center of the ball, by means of a translation of half the width and the height of the thumbnail . This process makes it possible to detect the centers of the beads present in the image.
  • Figure 21 corresponds to an image on which particles (black circles) are detected. 3. Reduction of the area of interest
  • the bottom of the well images represent a 2D view of the three-dimensional beads. Given the sphericity of the balls, they are not coded on homogeneous gray levels. In fact, the center of the balls has been coded on lighter pixels so that the image of a ball is seen as a dark crown. In order to get rid of the clearest pixels located in the center, the area of interest taken into account in the image correlation algorithm has been reduced to the crown formed by the dark pixels around the bead. The ball was coded on 10 pixels (px) in diameter. On the 51x51 size region of interest px 2 , the clear pixels within a 3 px radius around the center of the ball have been hidden.
  • FIG. 22 is a representation of an area of interest (particle) used to track the movements of the particles, in particular by image correlation.
  • the clear pixels in the center of the ball have been hidden because they do not provide relevant information for the CIN calculation.
  • the bottom pixels of the well beyond a small periphery around the ball did not take into account in the calculation. 4. Validation of the metrology of particle tracking
  • the images of a stationary scene are identical.
  • the images taken by the optical measurement system can be altered by a sensor noise inherent in the electronic operation of image taking.
  • the noise generated by the sensor can propagate in the measurement of the displacement calculated by CIN and directly impact the measurement resolution.
  • 1000 images of a sample of dried beads on a petri dish were acquired.
  • the focus on the aggregates of dried beads has been shifted slightly in depth to deliberately create a blur that smooths the grayscale gradient on the images.
  • the average of the gray levels Imi as well as the variance Ivi over the 1000 images was calculated.
  • FIG. 23 corresponds to an image illustrating the background noise of the sensor. As shown, the focus has been intentionally shifted to smooth the grayscale gradients of the image and remove / reduce background noise.
  • FIG. 24 is a diagram representing a point cloud representing the variance as a function of the average of the gray level distribution of a pixel over 1000 “identical” images.
  • the CIN has been used for the appropriate monitoring of balls / particles for which variations and / or errors and / or inaccuracies, for example related to background noise, in terms of displacement measurement has been mastered.
  • the consideration of material heterogeneity was ensured by monitoring several microbeads dispersed within the medium. . Validation in different types of environments
  • BHI Brain Infusion
  • the MSD curves as a function of the time interval confirmed the qualitative observations of the trajectories ( Figures 24 and 25). Indeed, the MSD is dependent on At.
  • the experimental viscosity measured by this test was 3.2 mPa.s ⁇ 1, 3 mPa.s.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de détection et/ou de suivi et/ou caractérisation de la formation d'un biofilm. La présente invention se rapporte également à un dispositif de détection et/ou de caractérisation de la formation d'un biofilm susceptible de mettre en oeuvre le procédé. La présente invention trouve une application notamment dans les domaines analytiques, de la recherche biologique, enzymologique, dans le domaine pharmaceutique et/ou dans le domaine médical.

Description

TITRE : PROCEDE DE DETECTION ET SUIVI DE LA FORMATION DE
BIOFILMS
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de détection et/ou de suivi et/ou caractérisation de la formation d’un biofilm.
La présente invention se rapporte également à un dispositif de détection et/ou de caractérisation de la formation d’un biofilm susceptible de mettre en oeuvre le procédé précité.
La présente invention trouve une application notamment dans les domaines analytiques, de la recherche biologique, enzymologique, dans le domaine pharmaceutique et/ou dans le domaine médical.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Le biofilm constitue le principal mode de vie des bactéries puisqu’il représente la forme de vie privilégiée pour 90% des bactéries en milieu naturel. Contrairement au mode de vie planctonique dans lequel les bactéries vivent en suspension, le biofilm forme une communauté hétérogène et complexe de bactéries qui se fixent à une surface et qui se lient entre elles par le biais de la sécrétion d’une matrice extracellulaire composée de protéines, de sucres et d’eau. La formation de biofilm est une caractéristique commune à un grand nombre de bactéries. Aussi, il a été admis par la communauté des microbiologistes que le mode de vie en biofilm est un stade à part entière de la vie de la bactérie. La forme planctonique ne serait qu’une transition vers le biofilm. Comme pour de nombreuses espèces vivantes, la collectivité est nécessaire à leur survie. Cette forme de vie en communauté confère aux bactéries des avantages métaboliques importants. La capacité d’adhésion des biofilms sur des surfaces naturelles ou artificielles est très grande et leur résistance à toute sorte de stress les rend difficile à éliminer. Les biofilms résistent en effet très bien aux stress chimique (antibiotiques par exemple) et mécanique (fluide par exemple). La résistance accrue des biofilms rend ces derniers ubiquitaires. Bien qu’ils puissent être utilisés pour des procédés innovants de bioremédiation ou de synthèse de composés chimiques par exemple, les biofilms peuvent s’avérer être une réelle nuisance dans divers domaines où la contamination bactérienne est à bannir comme dans le milieu médical, l’industrie agroalimentaire et dans certains environnements humains. En France, les biofilms sont responsables de50 à 60% des infections nosocomiales (Bryers, 2008) et de 40% des toxi-infections alimentaires.
Des études montrent qu’en 2050, le nombre de décès liés à une infection récalcitrante pourrait dépasser les chiffres des décès causés par un cancer (O’Neill, 2014). Par ailleurs, de nombreuses industries souffrent aussi de la récalcitrance des biofilm. La présence de couche épaisse de biofilms sur les coques de bateaux augmente la friction sur l’eau et entraîne une surconsommation de 35 à 50% de carburant (Schultz et al., 201 1 ). Ces quelques chiffres prouvent que l’étude des biofilms représente un enjeu socio-économique considérable.
Notamment, l’étude des biofilms est capitale dans le milieu hospitalier, pour lequel les difficultés d’élimination de biofilm sont un problème de santé publique. La récalcitrance des biofilms provient en grande partie de l’intégrité mécanique que procure la matrice extracellulaire. Ce matériau assure la cohésion entre les bactéries et l’adhérence sur les surfaces. Les bactéries protégées par les substances polymériques extracellulaires (EPS) dans les biofilms peuvent survivre même après une procédure de décontamination et représentent une source d’infection pour les humains et les animaux. De plus, le caractère viscoélastique de la matrice permet au biofilm de s’adapter à des contraintes de cisaillement que peut induire l’environnement naturel du biofilm. La matrice sert de moyen de protection aux bactéries et leur permet d’acquérir une grande résistance à leur environnement.
Aussi, les études sur les biofilms permettent de déterminer comment les biofilms se développent, changent et se détachent. Ainsi, il est nécessaire d’étudier leur structure et le phénomène de détachement afin de contrôler leur développement. La connaissance des structures des biofilms permet de prédire leurs influences sur certains systèmes. L’un des intérêts de déterminer les propriétés mécaniques des biofilms est de pouvoir prédire et contrôler la formation, l’accumulation et la dissémination de bactéries propageant les infections. Les premières observations des biofilms remontent au 17ème siècle mais les investigations autour des biofilms demeurent relativement récentes (35 ans) avec leur définition proposée par Costerton et al. (1978). Les bactéries ont longtemps été étudiées sous leur forme libre, isolée et planctonique. Néanmoins, dans un principe de survie, les bactéries se fixent sur un support solide et sécrètent des substances visqueuses pour former un biofilm. Les biofilms se composent de communautés bactériennes adhérant entre elles et à une surface par le biais de la sécrétion d’une matrice polymère. À la fin des années 90, on assiste à une explosion exponentielle du nombre de publications qui traitent des biofilms. Le comportement biofilm des organismes est de plus en plus pris en considération notamment dans le domaine de la santé où les biofilms se développent sur de très nombreuses surfaces telles que les cathéters, les valves, les prothèses, les dents, la peau ou encore les muqueuses...
La formation d’un biofilm est un processus dynamique et non-figé qui se déroule en plusieurs étapes détaillées ci-dessous :
• adhésion réversible : suspendues dans un fluide, des bactéries approchent une surface et y adhèrent de manière réversible par le biais de forces d’attraction physicochimiques de type forces de Van der Waals. Cette proximité avec une surface est favorisée par l’agitation brownienne, la gravité ou l’agitation du fluide. Certains microorganismes sont dotés de moyens de propulsion propre qui leur assurent une motilité. Ces moyens de propulsion sont constitués de structures protéiques (flagelle, pili) situés au niveau des enveloppes des bactéries et permettent à la bactérie de se déplacer de manière autonome ;
· adhésion irréversible : les bactéries se multiplient par division cellulaire et continuent à se lier à la surface. Par ailleurs, la modification du profil d’expression des gènes des bactéries adhérées entraîne la synthèse de structures à la surface de la bactérie et la sécrétion de polysaccharides extracellulaires liant irréversiblement les bactéries entre elles et à la surface ;
• formation de microcolonies : la croissance des microrganismes en biofilm et l’adhésion de nouvelles bactéries au biofilm formé créent des microcolonies ; • maturation : les microcolonies se développent et le biofilm se structure de manière tridimensionnelle suivant les conditions environnementales. Des canaux laissant circuler des fluides chargés en nutriments se dessinent à travers les microcolonies ;
· détachement : libération de cellules libres spécialisées ou d’agrégats de biofilm qui permettent de coloniser une autre surface, commençant un nouveau cycle (Davies and Marques, 2009). Les bactéries dispersées ont des prédispositions pour former des microcolonies (Kragh et al., 2016).
Un biofilm est principalement constitué de microorganismes enchâssés dans une matrice EPS sécrétée par les microorganismes. Les microorganismes représentent 10% de la masse sèche du biofilm (Flemming and Wingender, 2010). Par analogie, Flemming et al. (2007) voient les biofilms comme des cités de microbes vivant dans des maisons, représentées par la matrice extracellulaire, les abritant de leur environnement physique et chimique. Les biofilms sont hautement hydratés puisqu’une proportion de 90 à 99% du biofilm est composée d’eau. Le reste du biofilm est composé de macromolécules biologiques. Parmi ces composés, on retrouve des polysaccharides, des protéines, de l’ADN extracellulaire (eDNA) et de l’ARN. La matrice ou les composés EPS représentent 90% de la masse sèche. La matrice agit comme un liant des bactéries et les EPS jouent un rôle important dans le développement et la vie du biofilm (Das et al., 2013). Selon leur souche de provenance et les conditions de croissance en termes de nutriments et de stress physiques et chimiques, le taux de production de matrice extracellulaire et sa composition sont différents. Aussi, la proportion de chacun des éléments contenus dans un biofilm est déterminée par un certain nombre de facteurs, parmi lesquels le type de nutriment, les conditions hydrodynamiques et la température.
Des observations de sections de biofilms au microscope montrent que la composition du biofilm est hautement hétérogène (Lawrence et al., 1991 ). Les colonies de bactéries sont parcourues par des canaux par lesquels circulent des fluides assurant l’apport en nutriment. Le comportement du biofilm est piloté par une micro-structure très complexe et dynamique.
Les bactéries en biofilm développent des propriétés que n’ont pas les bactéries planctoniques. Le quorum sensing permet aux bactéries de communiquer et de s’organiser pour collaborer. Cette collaboration est aussi caractérisée par le transfert horizontal de gènes (Madsen et al., 2012). Les bactéries en biofilms sont plus résistantes aux biocides que leurs analogues planctoniques. Alors que, dans les années 90, la tolérance aux agents antibiofilms était attribuée à des problèmes de diffusion, il s’est avéré par la suite que d’autres phénomènes étaient responsables de la tolérance aux agents anti-infectieux. Par exemple, la capacité d’adaptation et de différenciation des bactéries permet leur évolution dans le sens de leur préservation. De manière générale, les biofilms sont plus résistants au nettoyage, qu’il soit chimique ou mécanique. Par ailleurs, l’exposition fréquente et répétée à des antibiotiques peut entraîner un phénomène de bactérie multirésistante, c’est- à-dire que les traitements antibiotiques n’ont plus d’effet contre elle. Toutes ces caractéristiques font que les biofilms sont présents dans tous les environnements, qu’ils sont résistants et qu’ils deviennent des réservoirs d’infections par la libération de germes. Dans l’industrie alimentaire, ils sont présents dans les bioréacteurs où ils sont utilisés pour la production d’alcool, d’acides ou de polysaccharides. Dans l’industrie textile, les biofilms sont étudiés pour fabriquer du nylon. D’autre part, ils servent d’alternative aux finitions mécaniques sur certains vêtements en jean (sablage...). Aussi, les études sur les biofilms se font de plus en plus nombreuses et souvent à l’interface de plusieurs disciplines. L’étude des biofilms d’un point de vue mécanique est complexe en raison de son caractère multi-échelle et multi- physique. Pour autant, elle représente un véritable enjeu scientifique. Les résultats des études mécaniques sur les biofilms reportés dans la littérature restent équivoques. Peu de protocoles sont standardisés et les multiples modèles d’essais développés par les équipes de recherche rendent la comparaison des résultats difficile.
Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un procédé permettant une étude reproductible et comparable de la mécanique des biofilms.
La recherche des éléments qui caractérisent exclusivement les biofilms est aussi d’un grand intérêt. Parmi les sujets de recherche proches ou futurs, on peut citer les problématiques suivantes : localiser les bactéries au sein des biofilms, quantifier les flux, visualiser l’intérieur des biofilms et comprendre les interactions au sein des biofilm multi-espèces. La capacité des bactéries à former un biofilm est d’intérêt pour développer des stratégies pour lutter contre les biofilms ou pour utiliser positivement les biofilms, dans des applications de bioremédiation par exemple. La prévention de la formation de biofilm est un enjeu majeur dans le domaine de la santé. Actuellement, les doses usuelles de substances biocides efficaces dans le cas d’infections bactériennes s’avèrent bien souvent inefficaces une fois le biofilm installé. Dès lors, la détection de la formation de biofilm in vitro est une information cruciale, notamment pour l’élaboration de traitements prophylactiques. De nombreux protocoles ont été proposés pour l’analyse de la formation de biofilms (Azeredo et al., 2017). Toutefois leur variabilité et leur nombre ne permet pas, notamment, une comparaison des résultats obtenus et/ou une uniformité de résultats.
Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un procédé uniformisé permettant une rapide et fiable de la formation de biofilm.
II existe des procédés utilisés pour essayer de caractériser les biofilms. Par exemple les procédés suivant peuvent être mentionnés : dénombrement microbiologique sur milieu solide : Le dénombrement des unités formant colonies (acronyme anglais CFU -“Colony-Forming Units”) permet un comptage des micro organismes d’une culture microbiologique sur un milieu solide. Ce protocole est limité aux bactéries qui croissent sur plaque d’agar. Cette méthode est par ailleurs très chronophage. Plaque microtitre (Tissue Culture Plates) : Dans cette méthode, aucun flux ne circule et la croissance se fait en milieu fermé. La biomasse présente dans les puits est rendue visible à l’aide de colorants. L’importance de la coloration, liée à la quantité de biofilm, est lue à partir de la densité optique du puits. Les résultats sont classés en trois catégories : inoculum non formateur de biofilm, inoculum modéré, ou inoculum fortement formateur de biofilm. Cette méthode est indirecte. Néanmoins, le manque de protocole normalisé et le manque de reproductibilité sont les inconvénients notables de cette méthode. System MBECTM (Calgary device) : Le système MBECTM (Minimal Biofilm Eradication Concentration) fait partie d’une catégorie de système permettant la production de biofilms reproductibles pour l’évaluation simple et simultanée de plusieurs agents biocides à différentes concentrations. À partir des méthodes basées sur les plaques microtitres, le modèle Calgary a été développé pour éviter le biais dû à la sédimentation des bactéries (Ceri et al., 1999; Harrison et al., 2010). Le dispositif Calgary consiste en un récipient en deux parties. La partie inférieure est composée d’une micro-plaque de 96 puits. La partie supérieure est un couvercle composé de picots qui coïncident avec le centre des puits et qui viennent s’insérer dans chacun des puits de la plaque. Le biofilm est formé sur les picots. Le dispositif est utilisé pour caractériser la formation du biofilm et évaluer la susceptibilité aux biocides (Melchior et al., 2007; Arias-Moliz et al., 2010). Les modèles dynamiques sous écoulement sont des méthodes où le milieu de culture est ouvert, c’est-à-dire qu’il y a apport continu en éléments nutritifs. Les écoulements hydrodynamiques influencent la formation du biofilm. Le type d’écoulement ainsi que la contrainte de cisaillement engendrée par l’écoulement ont un effet sur la force d’adhésion du biofilm. Ces éléments sont donc des contraintes à la reproductibilité des résultats et également à une reproductibilité des biofilms tels qu’ils sont dans la nature. Appareil de Robbins : Il consiste en une série de coupons insérés dans une chambre dans laquelle circule le milieu bactérien (Kharazmi et al., 1999) (Fig. 1.3). Les coupons peuvent être prélevés (et remplacés) pour être étudiés sans perturbation du flux et de manière stérile (Coenye et al., 2008). Ce modèle a notamment été utilisé dans le cadre de l’étude de matériau de cathéter (Nickel et al., 1985). Toutefois, ce procédé implique une destruction du biofilm et ne permet pas son étude mécanistique. Réacteur à perfusion : Ce dispositif permet de simuler un environnement avec des contraintes de cisaillement faibles. Il est utilisé pour des applications en milieu médical (cathéter, maladie pulmonaires, biofilm buccaux- dentaire). Il permet uniquement la formation et l’étude de biofilms à l’interface air- liquide. Microfermenteurs : Plusieurs types de microfermenteurs sont disponibles et vendus dans le commerce :
· CDC (Center for Disease Control) biofilm reactor (CBR) : ce réacteur est composé d’un récipient cylindrique constamment réapprovisionné en nutriment, dans lequel sont placés des tubes en plastique. Ces tubes possèdent des emplacements dédiés à la mise en place de coupons qui seront colonisés par le biofilm. Le récipient en verre est posé sur un agitateur magnétique permettant de créer une agitation circulaire du fluide. Le flux engendré par la rotation est réglable pour pouvoir être laminaire ou turbulent. Cette agitation permet d’engendrer une contrainte de cisaillement constante d’intensité modérée à forte. Les coupons sont amovibles une fois la surface colonisée par un biofilm. Ce réacteur permet la formation, répétable, d’échantillons de biofilm issue de diverses souches (Goeres et al., 2005) ;
• Rotating disk biofilm reactor : dans ce système, les coupons sont placés sur le fond du récipient cylindrique en verre. La plateforme sur laquelle sont placés les coupons est mise en rotation alors que le milieu bactérien est régénéré par circulation au sein du récipient. La contrainte de cisaillement générée par la rotation de la plateforme est d’intensité modérée à forte. Elle reste cependant moins importante que pour le CDC;
• Rotating annular reactors : dans cette configuration, le réacteur est composé de deux cylindres concentriques dont l’un est en rotation. Les échantillons sont des pales fixées au cylindre en rotation.
Chambre à flux (Flow-cell) :. Les modèles dynamiques présentés ci-dessus ont pour inconvénient principal la difficulté de suivre la formation du biofilm en direct. Les chambres à flux sont des cellules transparentes dans lesquelles circule le milieu bactérien Le matériau utilisé pour la chambre est adapté à la visualisation par microscopie et permet une observation du développement du biofilm. Toutefois, sa mise en place requiert une grande technicité. La nucléation des bulles formées par le fluide constitue une problématique importante. Par ailleurs, l’observation en chambre à flux est peu adaptée au haut débit car relativement peu d’échantillons sont analysés simultanément. Plateforme microfluidique : Ces dispositifs hautement intégrés voire automatisés ont été développés pour pouvoir observer le comportement des bactéries dans un environnement contrôlé aussi bien hydrologiquement que chimiquement. Des systèmes de canaux de petites tailles diffusent les liquides de croissance jusqu’à la zone de formation du biofilm. Les quantités à analyser mises en jeu dans ce type de modèles sont très restreintes.
Ces méthodes restent peu pratiquées car elles sont coûteuses, peu réutilisables et requièrent une grande technicité. Par conséquent, peu de publications font état de l’utilisation de plateformes microfluidiques et il y a donc peu de retour d’expérience.
Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de ces procédés.
Il existe également un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un procédé utilisable quelques que soient notamment les conditions de culture des bactéries et rapide. Le BioFilm Ring Test®, basé sur les dispositifs en microplaque, le BioFilm Ring Test® (BRT) développé par la société BioFilm Control permet d’évaluer à grand rendement l’aptitude de microorganismes à former un biofilm. Il ne nécessite pas de coloration de l’échantillon, ni aucun lavement, limitant ainsi l’altération du biofilm. Les applications du BRT se trouvent en microbiologie et dans l’industrie pharmaceutique. Le test se décline en plusieurs dérivés correspondant à des applications différentes : criblage à haut débit d’agents antibactériens et antibiotiques préventifs et curatifs, caractérisation des agents de revêtement anti biofilm, étude de l’impact de l’activité enzymatique sur la formation du biofilm et la dégradation. L’application du BRT pour le criblage de molécules antibiotiques est nommée Antibiofilmogramme®. Ce test aboutit à la détermination de la CMIb (Concentration minimale inhibitrice pour le biofilm) permettant de sélectionner parmi les antibiotiques efficaces sur les bactéries planctoniques (CMI) ceux possédant en plus une activité préventive sur la formation de biofilm. Toutefois, ce procédé ne permet pas de déterminer la cinétique de formation de biofilms, par exemple de manière continue, sans biais temporel. Ce procédé ne permet pas non plus de caractérisation spécifiquement la mécanique des biofilms II existe des liens inhérents entre le métabolisme des bactéries vivant sous forme de biofilm et les propriétés mécaniques du matériau constitué de la communauté de bactéries et de la matrice. Le développement de stratégies efficaces pour contrôler la présence de biofilms ou la mise au point de procédés biotechnologiques basés sur l’utilisation de biofilms requièrent la compréhension des mécanismes inhérents au mode de vie en biofilm et la connaissance des paramètres mécaniques décrivant le comportement du biofilm dans son environnement. Dans ce contexte, de nombreuses méthodes d’essais ont vu le jour pour évaluer ces paramètres. Elles sont adaptées des méthodes de test et d’identification de paramètres de matériaux classiques de l’ingénierie ou de fluides inertes. Cependant, le manque de normalisation tant dans le domaine des essais mécaniques que dans les méthodes d’identification des paramètres mécaniques pour la caractérisation des matériaux vivants reste un verrou scientifique. La quête de normalisation est problématique étant donné que les biofilms sont des structures vivantes. Cette caractéristique entraîne une complexité dans l’étude des propriétés mécaniques. Celles-ci sont hétérogènes spatialement et temporellement. En effet, de par leur composition, les biofilms sont des composites. Par ailleurs, les bactéries ont la capacité de moduler dynamiquement les propriétés mécaniques en réponse à un stress qu’elles ressentent. À l’heure actuelle, les propriétés mécaniques des biofilms sont équivoques. Les paramètres reportés dans la littérature sont difficilement interprétables et comparables étant donné le manque de normalisation dans les diverses façons dont les biofilms sont testés. La définition de protocoles normalisés apparaît essentielle pour accorder une communauté interdisciplinaire. L’hétérogénéité spatio-temporelle des biofilms représente un véritable enjeu scientifique mais les problématiques liées au caractère vivant de ce type de matériau sont des problématiques réelles. Les matériaux vivants représentent des échantillons fragiles qu’il convient de manipuler avec précaution. Les essais in vitro des échantillons vivants peuvent entraîner des remaniements qui biaisent les résultats. D’autre part, il faut s’attendre à une plus grande variabilité dans les résultats en comparaison aux matériaux courants de l’ingénierie qui sont quant à eux inertes. Dans le cas des biofilms, les conditions physiologiques requièrent souvent des méthodes d’imagerie non invasives mais la caractérisation précise de la géométrie de l’échantillon peut être difficile à atteindre. Aussi, la planéité des surfaces souvent requise pour les mesures de champs et le contrôle des mouvements hors-plan représentent des contraintes spécifiques à ces matériaux.
Il existe donc un réel besoin de trouver un moyen et/ou procédé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un procédé permettant d’obtenir des résultats fiables, reproductibles, comparable et également réduire les coûts et le temps d’obtention desdits résultats
Description de l’invention
La présente invention permet de résoudre les problèmes et inconvénients des procédés de l’état de la technique en fournissant un procédé de détection et/ou de suivi et/ou caractérisation de la formation d’un biofilm comprenant les étapes suivantes
a) réalisation d’une succession temporelle d’observations d’une solution comprenant au moins un micro-organisme et une pluralité de particules pendant que la solution est maintenue dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un micro-organisme, b) détection de la présence du biofilm et/ou une caractérisation de la cinétique de formation du biofilm par une analyse statistique comparative des déplacements des particules observées lors des différentes observations.
Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que le procédé de l’invention permet d’observer en temps réel la formation de biofilm, sans altération du biofilm et permet avantageusement de déterminer la cinétique de formation de biofilms, de manière continue, sans biais temporel.
La formation du biofilm s’accompagne du développement d’un matériau dont la structure tridimensionnelle peut être composée par des enchevêtrements de bactéries dans une matrice polymère dont le comportement mécanique s’avère être viscoélastique.
Avantageusement le procédé de l’invention est un procédé non-destructif permettant avantageusement de déterminer l’évolution de l’état du biofilm dans le temps, notamment par analyse de ses propriétés matérielles.
Avantageusement le procédé de l’invention permet d’étudier et de déterminer les propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire de biofilms.
Avantageusement, les inventeurs ont démontré que le procédé de l’invention permet avantageusement de par notamment l’incorporation de particules et/ou de microbilles dans le milieu de culture, notamment le milieu bactérien, et notamment en enregistrant leur mouvement, par exemple avec un dispositif optique, par exemple visualisé au microscope d’étudier et de déterminer les propriétés mécaniques des biofilms, en particulier les propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire de biofilms.
Avantageusement, les inventeurs ont démontré que les résultats d’un tel procédé sont dynamiques et locaux, par exemple par le biais de la cinématique du mouvement de chacune des microbilles/particules observées et/ou filmées.
Avantageusement, les inventeurs ont tiré parti du déplacement des microbilles/particules dans le biofilm afin de caractériser le développement de celui- ci.
Dans la présente, les vecteurs ou déplacements sont indépendamments noté sous la forme n ou n , n étant un exemple de désignation d’un vecteur.
Selon l’invention par succession temporelle d’observations on entend au moins deux d’observations dans le temps. En particulier on entend au moins deux étapes d’observations pendant que la solution est maintenue dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un microorganisme. Par exemple le procédé peut comprendre de 1 à 1000 étapes d’observation, par exemple de 1 à 100 étapes d’observation que la solution est maintenue dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un microorganisme
Selon l’invention, les étapes observations peuvent être réalisées à intervalles de temps réguliers. Par exemple les étapes d’observation peuvent être réalisées selon intervalle de temps compris de 1 à 10 minutes, de 2 à 8 minutes, de 3 à 6 minutes, égale à 5 minutes.
En d’autres termes, la succession temporelle d’observations peuvent être réalisées à intervalle de temps régulier. Par exemple les étapes d’observation peuvent être réalisées selon intervalle de temps compris de 1 à 10 minutes, de 2 à 8 minutes, de 3 à 6 minutes, égale à 5 minutes.
Selon l’invention, l’observation peut être réalisée par tout moyen connue de l’homme du métier adapté. Il peut s’agir par exemple d’un dispositif optique, par exemple un microscope, par exemple microscope à lumière inversée Olympus CKX53 équipé d’un objectif 40x, un appareil photo, d’un scanner, une caméra, par exemple PCO Edge ou une caméra Basler Ace.
Selon l’invention, l’observation peut comprendre au moins deux prises d’image de la solution. Il peut s’agir par exemple d’une observation comprenant une prise d’au moins deux images. Il peut s’agir par exemple d’une observation comprenant une série de prises d’images, par exemple de 2 à 100 000 images, de 2 à 50 000 images, par exemple de 2 à 300 images.
Selon l’invention l’intervalle de temps entre deux images successives lors d’une observation peut être noté Dί . Dans la présente, l’intervalle de temps At doit être >0.
Selon l’invention, chaque observation peut comprendre, pour chaque particule d’un ensemble de particules observées lors de ladite observation, une détermination d’une trajectoire correspondant à des déplacements successifs effectués par ladite particule lors de ladite observation.
En d’autres termes Selon l’invention, une observation 0* peut, par exemple être obtenue en déterminant les trajectoires de n particules/billes, le long d’une série de N+1 images, par exemple N est supérieur ou égal à 1 , par exemple compris de 1 à 3000, par exemple compris de 1000 à 3000. Par exemple N peut être tel que 1 < N, de préférence 1000<N+1 <3000. Selon l’invention, l’observation de la solution peut être réalisée pendant un temps donné. Par exemple l’observation peut être réalisée pendant un temps et/ou une durée comprise de 0,01 ms à 15s, par exemple de 0,1 ms à 10 secondes.
Selon l’invention, l’observation peut être réalisée par une prise d’images à toute fréquence adaptée connue de l’homme du métier. Il peut s’agir de prise d’images avec une fréquence de 1 à 1000 images par seconde, par exemple 100 à 300 images par seconde, par exemple de 200 images par seconde.
Selon l’invention, l’image peut être une image numérique.
Dans la présente par image numérique on entend toute image numérique connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une image numérique formée d’un quadrillage orthogonal à deux dimensions. La plus petite entité constitutive de ce quadrillage est appelée pixel (« picture element » en anglais). L’image numérique peut donc une matrice de pixels quantifiés par leurs coordonnées et leur niveau de gris. L’amplitude des valeurs des pixels peut dépendre du nombre de bits sur lequel est codée l’image. Si l’image est codée sur
N bits, un pixel peut être quantifié par 2N nuances de gris différentes. Il peut s’agir par exemple d’images codées en 16 bits, ce qui représente un éventail de 65536 valeurs de niveaux de gris différentes. Cet échantillonnage de l’information dans l’espace et dans la profondeur des niveaux de gris définit la dynamique de l’image. La transposition linéaire d’un signal continu du matériau observé en un signal échantillonné peut être constituée par une matrice de pixels peut nécessiter quelques précautions. De préférence, pour pouvoir appliquer la Cl N, la surface observée peut être et rester plane durant l’observation afin avantageusement de ne pas introduire des différences d’échelles dans les images. De préférence, l’éclairage peut être constant et la dynamique de l’image adaptée à la mesure désirée. L’objectif de la Cl N est de trouver le déplacement mesuré ü correspondant au déplacement vrai ütd’un élément de surface entre un état initial (t = 0) et un état déformé (t). Le calcul du déplacement ü peut être réalisé en chaque pixel sur une portion restreinte de la surface du matériau. Cette portion est couramment désignée par son acronyme Roi de l’anglais“Région of Interest”. Une sélection d’une zone de l’image où se fait le calcul peut permettre avantageusement d’une part de s’affranchir des pixels de bord d’image qui sont susceptibles de disparaître lors de l’essai mécanique et d’autre part, de mettre de côté les zones où l’information mécanique n’est pas pertinente. Selon l’invention, la trajectoire peut être déterminée par tout procédé et/ou méthode connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple par exemple de trajectoire de particules, par exemple de l’ensemble des déplacements successifs effectués par une particule, par exemple lors d’une observation.
Selon l’invention par trajectoire, par exemple trajectoire d’une bille, on peut également entendre l’ensemble des positions successives occupées, par exemple par le centre de la bille au cours d’une série d’images, par exemple successives. Selon l’invention par la trajectoire peut être en deux dimensions, les positions peuvent être données par les coordonnées cartésiennes, x(t) et y(t), dans un repère orthogonal centré sur la bille, par exemple au temps t=0.
En d’autres termes, selon l’invention par trajectoire, par exemple trajectoire d’une particule, on peut entendre l’ensemble des positions successives occupées, par exemple par le centre de la particule, au cours d’une série d’images, par exemple successives. Selon l’invention par la trajectoire peut être en au moins deux dimensions, par exemple en deux dimensions ou trois dimensions. Par exemple lorsque la trajectoire est en deux dimensions les positions peuvent être données par les coordonnées cartésiennes, x(t) et y(t), dans un repère orthogonal, par exemple centré sur la particule.
Selon l’invention par observation, par exemple par observation O on peut observer et/ou entendre un ensemble de trajectoires de n particule. Par exemple on peut observer n particule, avec n supérieur à 1 , par exemple compris de 1 à 350, par exemple compris de 150 à 350. Par exemple n peut être tel que 1 <n , de préférence 150< n<350 particules, par exemple présentes dans l’échantillon et/ou la solution.
En d’autres termes chaque observation peut comprendre un ensemble de n trajectoires de n particules, par exemple supérieur à 1 , par exemple compris de 1 à 350, par exemple compris de 150 à 350. Par exemple n peut être tel que 1 <n , de préférence 150< n<350 particules présentes dans l’échantillon et/ou la solution.
Selon l’invention par observation Oi ; on peut entendre un ensemble de trajectoires à un temps TjCorrespondant à l’âge de l’échantillon (T£ > 0), par exemple de n particule, par exemple n est supérieur ou égal à 1 , par exemple compris de 1 à 350, par exemple compris de 150 à 350. Selon l’invention, par vecteur déplacement on entend, par exemple, un vecteur de composantes selon la formule [(x(t+At)- x(t) , (y(t+At)- y(t))], Vt, 0 < t £ NAt
Selon l’invention, la position des particules, par exemple lors de l’observation peut être déterminée par tout procédé connu de l’homme du métier. Par exemple la position des particules peut être déterminée par identification de tout point de la particule, par exemple par identification de la circonférence et/ou périphérie desdites particules ou du centre desdites particules.
Selon l’invention, le procédé de détection et/ou de suivi et/ou caractérisation de la formation d’un biofilm peut par exemple comprendre les étapes suivantes :
a. introduction dans une solution d’au moins un microorganisme, b. introduction dans la solution obtenue en (a) d’au moins deux particules,
c. observation 01 de la solution obtenue en (b) à un temps (t1 ), d. maintien de la solution obtenue en (c) dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un microorganisme, e. observation 02 de la solution obtenue en (d), à un temps (t2), f. comparaison des observations 01 et 02,
g. détermination de la présence et/ou caractérisation d’un biofilm par comparaison de trajectoires des particules observées lors des observations 01 et 02.
Selon l’invention, le procédé de détection et/ou de suivi et/ou caractérisation de la formation d’un biofilm peut par exemple comprendre les étapes suivantes :
a. introduction dans une solution d’au moins un microorganisme, b. introduction dans la solution obtenue en (a) d’au moins deux particules,
c. observation 01 de la solution obtenue en (b) à un temps (T-L), d. maintien de la solution obtenue en (c) dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un microorganisme, e. observation 02 de la solution obtenue en (d), à un temps (T2), f. détermination de la présence et/ou caractérisation d’un biofilm par comparaison des observations 01 et 02,
Selon l’invention la détection des particules, notamment sur une image, par exemple une image numérique, peut être effectuée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé de comparaison d’images avec au moins une image de référence (imagev). Selon l’invention, l’image de référence (imagev) peut être déterminée par tout procédé connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé comprenant les étapes suivantes :
identification du centre d’une particule sur une image, par exemple dans une zone d’intérêt,
sélection d’une zone image particule (imageb) correspondant à un carré centrée sur ladite particule, et
obtention d’une image de référence (imagev) selon la formule suivante :
dans laquelle imagetteb est l’imagette brute de la zone autour d’une bille, imageb T est la transposée de l’imageb, l’imageb Rh est la symétrie horizontal de imagetteb, l’imagebRv est la symétrie verticale de l’imagetteb.
Selon l’invention, la transposée de l’imagetteb peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Par exemple pour A = (<¾·) une matrice de Mn p, la transposée de A, notée s est la matrice à p lignes et n colonnes de terme général bk l défini par: k, l £ k £ p , v l, l £ l £ n bk l = al,k
Selon l’invention, symétrie horizontal de l’imagetteb peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Par exemple pour A = (aί ·) une matrice de Mn p, la symétrie horizontal de A, notée ARh est la matrice à n lignes et p colonnes de terme général bk l défini par: v k, l £ k £ n , v Z, l < l £ P bk:i = ak:P_i+1 Selon l’invention, symétrie verticale de l’imagetteb peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Par exemple pour A = une matrice de Mn p, la symétrie verticale de A, notée ARv est la matrice à n lignes et p colonnes de terme général bk l défini par: v k, l £ k £ n , v Z, l < l £ p bk i = an-fe+1 i
Selon l’invention l’analyse statistique comparative des déplacements des particules peut être réalisée par tout procédé adapté connu de l’homme du métier.
Selon l’invention l’analyse statistique comparative des déplacements des particules peut comprendre notamment une étape de comparaison des observations.
Selon l’invention, l’étape de comparaison peut être réalisée par tout procédé de comparaison d’images connu de l’homme du métier adapté. Il peut s’agir par exemple d’un procédé de comparaison d’images, par exemple pour une image en en nuance de gris, comprenant une agrégation des niveaux de gris, une distribution des niveaux de gris, ou par exemple pour une image en couleurs, un procédé de comparaison d’images comprenant une agrégation des niveaux de couleurs. Il peut s’agir par exemple d’un procédé de comparaison d’images, par exemple un procédé de comparaison d’image numérique, par exemple d’image numérique en niveaux de gris. Par exemple, le procédé de comparaison d’image, notamment numérique (CIN) peut par exemple se baser sur le principe de conservation des niveaux de gris entre deux images d’une même surface à des instants successifs. Par exemple, les images utilisées pour la CIN peuvent correspondre aux surfaces intactes et déformées de l’objet d’étude. Elles peuvent être représentées par des fonctions 2D f et g. La comparaison peut être basée sur une comparaison de l’amplitude du signal entre l’image de référence et l’image de l’état déformé. Les fonctions f et g peuvent représenter les niveaux de gris interpolés au pixel dont la position est repérée par ses cordonnées {x, y). Le problème à traduire consiste à déterminer ü, le champ de déplacements recherché au centre d’un élément de surface Roi. Lors d’une transformation X, un point x dans l’image de référence f se déplace en X (x) dans l’image déformée g. Pour tout point de coordonnées x appartenant à la Roi, la conservation des niveaux de gris entre les deux instants peut s’écrire :
f l r ! = g x -f u)
Avantageusement, par exemple lorsqu’il y des perturbations externes des niveaux de gris, par exemple engendrées par des différences d’éclairage ou par le bruit de capteur, entre les deux images f et g, une distance entre f et g peut être introduite. La minimisation de cette distance peut être ensuite mise en oeuvre. Par exemple, l’amplitude des signaux sur une zone, ici en 1 D, peut être comparée entre l’image de référence et l’image de l’état déformé. En l’état, la détermination du déplacement ü est un problème mal posé. Il peut être régularisé par exemple par l’ajout d’une information a priori sur la solution du problème inverse. Il peut s’agir par exemple d’une régularisation cinématique. Par exemple une base cinématique à laquelle appartient le déplacement est définie. De manière pratique, le déplacement peut être approché par un ensemble de familles de transformations simples. Le champ de déplacement ü peut être décomposé, a priori, sur une base de N fonctions de forme arbitrairement choisies notées F,, où / = 1, ..,N. Les _i sont les fonctions de formes formant une base décrivant le champ de déplacement.
où, Fί, est le degré de liberté associé à la fonction de forme F,,
Une régularisation spatiale, par le choix de la taille des zones, support de la cinématique peut être également utilisé. La détermination des coefficients optimaux de la transformation approchée peut nécessiter une minimisation de la distance entre f et g. Cette distance peut être formalisée sous la forme d’une fonction-coût. Diverses fonctions peuvent être utilisées tel que décrit dans Pan ét al., 2010. Il peut s’agir par exemple de la norme S 2 dans laquelle la conservation des niveaux de gris est recherchée en minimisant le carré de la différence des niveaux de gris : Cette fonction est non-linéaire. En supposant qu’ils s’agissent de petits déplacements, elle peut être linéariser en effectuant un développement de Taylor au premier ordre. L’équation précédente devient alors :
En injectant ü sous sa forme de combinaison linéaire dans le sous espace d’approximation ce système peut être mis sous forme matricielle :
[-«.,]'¾] - [¾]
Dans laquelle les termes M et b sont des données connues qui dépendent du gradient de l’image de référence, et du résidu entre l’image initiale et l’image “back-deformed”.
correspond au produit scalaire Euclidien entre deux vecteurs.
La régularisation peut être effectuée de manière itérative en mettant à jour l’incrément de déplacement par un algorithme de Gauss-Newton. L’incrément de déplacement peut être obtenu par la résolution du système linéarisé équation
La résolution du système permet de Dί« trouver et ainsi, de calculer le champ de déplacement sur l’élément Roi lorsque le d est trouvé. +! — Sa 4- D½+i L’algorithme de Gauss-Newton peut s’opérer jusqu’à ce que le critère d’arrêt soit atteint, par exemple lorsque ASit < 10-5.
Avantageusement, les images peuvent être discrétisées et donc connues au pixel près. En l’état, le déplacement calculé prend une valeur dans N2. Pour atteindre une précision sub-pixélique, une interpolation des niveaux de gris aux coordonnées non entières peut être réalisée, par exemple une interpolation bi- cubique ou“spline”. Selon l’invention, le procédé peut comprendre lors de la comparaison des observations la détermination de la distribution statistique de la trajectoire éventuelle de particules et /ou de la géométrie de la trajectoire éventuelle de particules.
Selon l’invention, le procédé peut comprendre lors de la comparaison des observations la détermination indépendamment par particule la distribution statistique de la trajectoire éventuelle de chacune des particules et de la géométrie de la trajectoire éventuelle de chacune des particules présentes.
Selon l’invention, le procédé peut comprendre en outre une analyse statistique globale des déplacements effectués par les particules observées au cours de chaque observation et/ou un calcul de temps caractéristiques de la formation du biofilm sur la base des résultats de l’analyse statistique globale.
Dans la présente, par analyse statistique globale, on entend toute analyse statistique connue de l’homme du métier adapté pour une analyse de déplacement, par exemple de particules. Il peut s’agir par exemple d’une analyse de la distribution, par exemple basée sur la variance, par exemple l’indice de sobol, une analyse de la variance sur la distribution, de tests d’hypothèse sur le type de loi statistique représentative de la distribution de mouvement/déplacement.
Selon l’invention l’analyse statistique globale peut comprendre le calcul d’une valeur d’au moins un paramètre statistique d’une distribution des déplacements effectués respectivement par les particules de la pluralité de particules et une analyse des variations en fonction du temps des valeurs dudit au moins un paramètre statistique obtenues pour la succession d’observations.
Selon l’invention, le au moins un paramètre statistique d’une distribution des déplacements peut être tout paramètre statistique connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple de la détermination de l’écart type de la distribution des déplacements et/ou des trajectoires, de moments statistiques. Par exemple la détermination de l’écart type de la distribution des déplacements peut être établie selon la formule suivante :
dans lequel P correspond au vecteur de déplacement des particules, m = longueur (P), et P = moyenne(P).
Dans la présente, le vecteur de déplacement des particules peut correspondre au vecteur reliant une ancienne position à une nouvelle position de la particule, donc le vecteur position final moins le vecteur position initiale. En d’autres termes, le vecteur peut également être désigné dans la présente par trajectoire.
Dans la présente le vecteur de déplacement et/ou trajectoire de chacune des particules peut être déterminé lors de chacune des observations, par exemple par détermination de la position des particules sur chacune des images obtenues lors de ladite observation.
Selon l’invention, l’analyse statistique globale peut comprendre le calcul du déplacement moyen au carré (MSD) selon la formule suivante : MSD(At)= Ar2 dans laquelle Ar est le déplacement radial des particules et At l’intervalle de temps. Dans la présente, l’intervalle de temps At peut correspondre à l’intervalle de temps entre deux images.
Dans la présente, lorsque l’observation comprend plusieurs prises d’images numériques, les coordonnées du vecteur peuvent être exprimées en pixel.
En d’autres termes, selon l’invention, le procédé peut comprendre la détermination de la distribution statistique de l’ensemble des particules.
En outre, selon l’invention, le procédé peut comprendre la détermination de la géométrie de la trajectoire de l’ensemble des particules. Selon l’invention, la détermination de la géométrie de la trajectoire peut être réalisée par tout procédé connu de l’homme du métier adapté. Avantageusement, la variation de la valeur de l’écart type des déplacements et/ou trajectoires, de préférence en fonction du temps, par exemple du temps d’observation T*, peut permettre de caractériser l’éventuelle biofilm.
Avantageusement, les inventeurs ont démontré que lors que la production d’un biofilm, la valeur de l’écart type de la distributions des déplacements effectués par les particules varient dans le temps. En particulier, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que lorsqu’un biofilm est produit, la valeur de l’écart type de la distribution des déplacements augmentent dans le temps jusqu’à une valeur maximale avant de décroître, alors qu’en l’absence de production de biofilm, une fois la valeur maximale de l’écart type de la distribution des déplacements atteinte celle-ci ne varie pas dans le temps.
Avantageusement, les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la variation de la valeur de l’écart type de la distributions des déplacements effectués par les particules dans le temps lors de la formation de biofilm peut être modélisée permettant avantageusement de déterminer les ou les temps de croissance et/ou décroissance de la valeur de l’écart type de la distributions et/ou la ou les pente(s) de la courbe représentée(s) par les variations de la valeur de l’écart type de la distributions des déplacements en fonction du temps. Les inventeurs ont également démontré que les variations de la pente de la courbe d’évolution de la valeur de l’écart type de la distribution des déplacements en fonction du temps correspondaient à des variations du « comportement » des particules dans le milieu et/ou dans la solution.
Selon l’invention, le procédé peut comprendre en outre une analyse statistique des contributions individuelles des particules observées à partir des déplacements effectués par chaque particule observée au cours de chaque observation et une identification d’au moins un pourcentage de particules effectuant un même type de mouvement sur la base des résultats de l’analyse statistique des contributions individuelles.
Selon l’invention, l’analyse statistique des contributions de chacune des particules et/ou des contributions individuelles des particules observées peut être réalisée par tout procédé d’analyse statistique adapté connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé d’analyse statistique tel que mentionné ci-dessus. Selon l’invention l’analyse statistique des contributions de chacune des particules et/ou des contributions individuelles des particules observées peut être réalisée pour chaque observation.
Selon l’invention, l’analyse statistique des contributions individuelles des particules peut comprendre pour chaque observation :
un calcul, pour chaque trajectoire suivie par une particule observée lors de ladite observation, d’un vecteur composé de valeurs de paramètres caractéristiques des déplacements définissant la trajectoire concernée; une constitution d’une matrice à partir des vecteurs calculés pour les particules observées lors de ladite observation ;
une décomposition de ladite matrice par une analyse en composantes principales ;
une identification d’au moins une composante principale prépondérante parmi les composantes principales résultant de la décomposition;
une génération d’un diagramme en au moins une dimension des projections des différents vecteurs correspondant aux trajectoires des particules observées sur ladite au moins une composante principale identifiée.
Selon l’invention les paramètres caractéristique des déplacements peut être au moins un paramètre caractéristique est choisi dans le groupe comprenant
- longueur c1 de la diagonale du rectangle comprenant ladite trajectoire selon la formule suivante :
cl
= ( m ax ( cumsum (A-) )— m\n(cumsum(X)))2 + (ma
où max(21) retourne la plus grande composante du vecteur A, min(21) retourne la plus petite composante du vecteur 21 et cumsum(B) retourne la somme cumulée du vecteur B.
- la vitesse moyenne c2 sur la trajectoire :
où mean(21) retourne la moyenne des composantes du vecteur 21 - l'écart type c3 de la distribution des vitesses de chaque particule à chaque point de la trajectoire
où std(A) retourne l’écart type des composantes du vecteur !
- l'écart-type de la distribution des trajectoires selon l’axe transversal c4 ou vertical c5 :
c4 = std.{X )
c5 = std(Y )
où std(A) retourne l’écart type des composantes du vecteur A
- la distribution asymétrique des trajectoires selon l’axe transversal c6 ou vertical c7 :
c 6 = skw(X )
cl = skw(Y )
où skw(A) retourne le coefficient d’asymétrie des composantes du vecteur A Dans la présente, max correspond à la plus grande composante, std correspond à l’écart type, mean correspond à la moyenne, et skw correspond au coefficient d’asymétrie, cumsum correspond à la somme cumulée, min correspond à la plus petite composante du vecteur.
Selon l’invention, l’analyse statistique des contributions de chacune des particules et/ou des contributions individuelles des particules observées peut comprendre la détermination du déplacement moyen au carré (MSD) selon la formule suivante : < Ar2(At) > dans laquelle Ar est le déplacement radial de la particule et At l’intervalle de temps.
Selon l’invention, le vecteur composé de valeurs de paramètres caractéristiques des déplacements définissant la trajectoire concernée peut être calculé par tout procédé connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un procédé comprenant une concaténation de l’ensemble des valeurs de paramètres caractéristiques.
Selon l’invention, la constitution de matrice à partir de vecteurs calculés peut être réalisé par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une analyse en composante principale . Selon l’invention, l’analyse en composante principale peut être toute analyse en composante principale connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une analyse permettant de sélectionner les composantes des valeurs qui expriment le maximum de variance.
Selon l’invention, l’identification d’au moins une composante principale prépondérante parmi les composantes principales résultant de la décomposition peut être réalisée par tout procédé et/ou moyen connu de l’homme du métier.
Selon l’invention, la ou les composantes principales prépondérante(s) peu(ven)t correspondre aux composantes correspondant préférentiellement à au moins 40% des ensembles des valeurs, de préférence à 60% des ensembles des valeurs.
L’homme du métier de par ses connaissances générales saura choisir et/ou déterminer les composantes principales, par exemple les composantes principales prépondérantes.
Selon l’invention, la génération d’un diagramme en au moins une dimension des projections des différents vecteurs correspondant aux trajectoires des particules observées sur ladite au moins une composante principale prépondérante identifiée peut être réalisé par tout procédé connu de l’homme du métier.
Selon l’invention, le diagramme peut être un diagramme en une dimension, en deux dimensions, en trois dimensions ou en quatre dimensions, de préférence en une dimension, en deux dimensions ou en trois dimensions.
Selon l’invention, le nombre de dimension du diagramme peut être fonction du nombre de composantes principales prépondérantes identifiées. Par exemple, lorsque que trois composantes principales sont identifiées, le diagramme peut être un diagramme en deux dimensions, chacune des dimensions du diagramme correspondant indépendamment à une composante principale, la troisième composante principale étant rapportée dans le diagramme.
Selon l’invention, le procédé peut comprendre à partir du diagramme généré une étape d’identification d’un cluster de points dans ledit diagramme. Selon l’invention, l’identification d’un cluster de point dans ledit diagramme peut être réalisée par tout procédé et/ou méthode d’analyse connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple de toute méthode de clustering adaptée connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une analyse visuelle de la répartition des points, d’une analyse K-mean, k-Medoides. Selon l’invention, le procédé peut comprendre un calcul du pourcentage de particules à partir d’un pourcentage de points appartenant à un cluster donné. Selon l’invention, le calcul du pourcentage de particules à partir d’un pourcentage de points appartenant à un cluster donné peut être réalisé par tout procédé adapté connu de l’homme du métier. L’homme du métier, de par ses connaissances générales, saura choisir la méthode en fonction du diagramme.
Avantageusement, le pourcentage de particules calculé à partir d’un pourcentage de points appartenant à un cluster donné permet de classifier et/ou caractériser le biofilm formé.
Selon l’invention, le procédé peut comprendre en outre une étape d’analyse d’une évolution au cours du temps dudit pourcentage de particules pour les différentes observations.
Avantageusement, l’analyse de l’évolution au cours du temps dudit pourcentage de particules pour les différentes observations permet de déterminer la dynamique de formation du biofilm, d’un point de vue quantitatif et qualitatif.
Selon l’invention, le microorganisme peut être tout microorganisme connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une bactérie, d’un champignon. Il peut s’agir également de cellules procaryotes, par exemple toute bactérie connu de l’homme du métier, par exemple les bactéries comprises dans le groupe, sans être limité à celui-ci, constitué de Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Hélicobacter pylori Klebsiella pneumoniae, Klebseilla rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus férus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica,Yersinia pestis et Yersinia pseudotuberculosis, etc.
Il peut par exemple de tout champignon connu de l’homme du métier, par exemple de champignons pathogènes ou non pathogènes, par exemple de champignons responsables de pathologies, par exemple en santé humaine ou non, de champignons environnementaux, des champignons choisis dans le groupe comprenant les levures, par exemple Candida et/ou Cryptococcus, par exemple de levures responsables de pathologies, par exemple en santé humaine, par exemple de candidoses et/ou de cryptococcose, et/ou le groupe comprenant les moisissures, par exemple Aspergillus, par exemple de moisissures responsable de pathologie, par exemple en santé humaine, par exemple d’aspergillose et/ou mycose pulmonaire.
Selon l’invention, le microorganisme peut être introduit dans la solution à une concentration comprise de 1 .106 à 2.108 CFU/ml (CFU : Colony-Forming Unit ; Unité Formant Colonie ; Unité Formant Colonie), par exemple de 1.107 à 8.107 CFU/ml. Par exemple dans un volume de 200mI la quantité de microorganisme peut être comprise de 2.105 à 4.107 CFU par exemple de 2.106 à 1 ,6.107 CFU.
Selon l’invention, la solution peut être contenue dans un contenant et/ou présente sur une surface. Il peut s’agir par exemple de tout contenant connu de l’homme du métier adapté. Il peut s’agir par exemple d’un contenant de culture.
Selon l’invention par « la surface» on entend toute surface de culture connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une lame de verre, en Plexiglas ou autre matière adaptée. Il peut s’agir par exemple d’une lame de verre sur laquelle peut être ajouté une goutte de milieu et des bactéries.
Selon l’invention par « contenant de culture » on entend tout contenant de culture connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple un réacteur de culture, des cupules, des tubes ou des puits par exemple de plaques de microdilution.
Selon l’invention le contenant de culture peut être par exemple une enceinte avec une extrémité fermée, du type tube, puits, etc. ou une enceinte présentant deux ouvertures. Il peut s’agir également d’un contenant comprenant une extrémité fermée de sorte à former un fond plat, un contenant avec une extrémité fermée de sorte à former un fond hémisphérique, un contenant comprenant deux extrémités ouvertes. Lorsque le contenant comprend deux extrémités ouvertes ledit contenant peut être configuré afin de permettre un écoulement du milieu de culture en flux constant ou en flux discontinu.
Il peut s’agir par exemple de plaque de microdilution le type de plaque défini par exemple par l’American National Standards Institute et la Society for Biomolecular Screening (« microplates ») portant 96 puits, 384 et même 1536, ou à l’inverse 48 ou 24 puits ou tout autre nombre de puits.
Il peut s’agir par exemple d’un contenant de culture constitué par tout matériau connu de l’homme du métier adapté. Il peut s’agir par exemple de plastique, par exemple du polycarbonate, du polypropylène, polystyrène, etc., de verre, de métal.
Il peut s’agir par exemple de microplaques en polycarbonate ou polypropylène à fond plat, conique ou rond.
Il peut s’agir par exemple de contenant en polystyrène, par exemple tout polystyrène connu de l’homme du métier.
Selon l’invention, la solution peut être également sur une surface. Il peut s’agir de toute surface connue de l’homme du métier sur laquelle un microorganisme peut être incubé et/ou peut se développer et/ou sur laquelle un biofilm peut se former. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique ou abiotique. Il peut s’agir par exemple d’une surface de dispositif et/ou de supports médicaux, par exemple d’implants dentaires, de cathéter, de prothèses et/ou de tout dispositif médicaux connu de l’homme du métier sur lequel des microorganismes peuvent se développer.
Dans la présente par surface biotique on entend toute surface biotique connue de l’homme du métier.
Dans la présente par surface abiotique on entend toute surface abiotique connue de l’homme du métier. Il peut s’agir également de toute surface de dispositif connue de l’homme du métier sur laquelle une bactérie est susceptible de former un biofilm. Il peut s’agir par exemple de la surface d’un dispositif médical, par exemple un cathéter, une aiguille, un cathéter à chambre implantable (ou Porth- a-Cath), une valve, par exemple une valve cardiaque, une prothèse, par exemple une prothèse articulaire, une prothèse ligamentaire, un implant dentaire, une prothèse de voies urinaires, la membrane péritonéale, des cathéters de dialyse péritonéale, des greffes vasculaires synthétiques, des stents, les dispositifs de fixation interne, des sutures percutanées et/ou trachéale, des tubes de ventilation.
Selon l’invention, la solution peut être toute solution et/ou milieu connu de l’homme du métier adapté à la culture de microorganismes.
Selon l’invention, la solution peut être toute solution connue de l’homme du métier adapté dans laquelle un microorganisme peut être incubé et/ou peut se développer et/ou sur laquelle un biofilm peut se former. Il peut s’agir par exemple d’un milieu de culture, par exemple tout milieu de culture connu de l’homme du métier et/ou disponible dans le commerce dans lequel au moins un microorganisme est susceptible de se développer. Il peut s’agir par exemple d'un milieu naturel ou synthétique. Il peut s’agir par exemple d’un milieu de culture pour la croissance bactérienne, par exemple le milieu BHI (« Brain Heart Infusion »; bouillon cœur cerveau), le milieu LB (« Lysogeny broth » également appelé « Luria Bertani »), le milieu MH (« milieu Mueller-Hinton »), de bouillon glucosé, de milieu de culture de levures, par exemple le milieu Sabouraud L’homme du métier de part ces connaissances générales saura choisir le milieu de culture adapté en fonction du microorganisme.
Selon l’invention, par pluralité de particules on entend au moins deux particules. Selon l'invention, lesdites au moins deux particules, peuvent être toute particule permettant de mettre en œuvre la présente invention. Avantageusement, ladite particule peut être une particule de toute forme adaptée à la mise en œuvre de la présente invention, par exemple sous forme de bille, de palet, de forme géométrique asymétrique, par exemple avec une face plane, etc.
Selon l’invention, la forme des particule peut être identique ou différente.
Avantageusement la forme des particules est identique.
Selon l’invention, la particule peut être en tout matériau adapté connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple de particule en métal, en plastique.
Toute taille appropriée de particule peut être utilisée. La taille peut être choisie par exemple en fonction de la taille du contenant de la solution et/ou du microorganisme. Par exemple, la taille des particules peut être inférieure au dixième de la taille du contenant, de préférence inférieure au centième, de manière encore plus préférée inférieure au millième de la taille du contenant. Par exemple la particule peut présenter une taille de, par exemple, 10 nm à 100 nm, de 0,1 à 100 pm.
Selon l’invention, le procédé de l’invention peut être mis en œuvre avec au moins 2 particules, avec par exemple de 2 à 10 000 000, de 1000 à 1 000 000, de de 10 000 à 1 000 000, de 100 000 à 1 000 000, de 10 000 à 100 000.
La pluralité de particules permet avantageusement d’observer une pluralité de trajectoires desdites particules. Selon l’invention, lorsque le procédé est mis en œuvre avec une pluralité de particules, lesdites particules peuvent être de taille identique ou différente. Avantageusement la taille des particules est identique.
Lorsque les particules sont de tailles différentes, les petites particules peuvent présenter une taille, par exemple, de 10 nm à 1 pm, par exemple de 100 à 500nm, et les grosses particules peuvent présenter une taille, par exemple, de 1 pm à 100pm, par exemple de 1 pm à 10 pm, par exemple de 1 pm à 5 pm.
Selon l’invention, on peut également utiliser une pluralité de particules de tailles identiques.
Selon l’invention, les particules peuvent être génératrices d’un signal détectable. La détection de ce signal sera fonction des propriétés de la particule. À titre d’exemple, ladite, au moins une, particule peut être fluorescente, phosphorescente, chimioluminescente, réfléchissante ou colorée.
Par exemple dans le cas où ladite, au moins une, particule est fluorescente, la fluorescence émise par la particule peut être détectée par exemple visuellement, et/ou par tous moyens optiques connus de l’homme du métier. Ladite, au moins une, particule peut être par exemple éclairée, pour suivre son mouvement au moyen d’une source lumineuse, par exemple par un faisceau laser.
Par exemple dans le cas où la, au moins une, particule est phosphorescente, cette particule peut être visualisée par exemple visuellement, par tous moyens optiques connus de l’homme du métier.
Par exemple dans le cas où là, au moins une, particule est chimioluminescente la détection de la particule peut se former par ajout dans le milieu du réactif chimique permettant l’émission d’énergie lumineuse par les particules.
Avantageusement, ladite, au moins une, particule peut être par exemple éclairée, pour suivre son mouvement au moyen d’une source lumineuse, par exemple par un faisceau laser.
L’homme du métier comprendra aisément que pour la réalisation de la présente invention, le choix des propriétés visuelles desdites, au moins deux, particules peut également se faire en fonction de la solution.
Selon l’invention, le procédé peut comprendre préalablement et/ou lors de l’étape de maintien de la solution obtenue en (c) dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un microorganisme, l’introduction d’au moins un composé choisi parmi un antibiotique, un antifongique et/ou mélange de ceux-ci.
Selon l’invention, par composé, on entend tout composé, par exemple naturel ou obtenu par synthèse, hémi-synthèse chimique, ou obtenu par extraction, connu de l’homme du métier susceptible de modifier la croissance/développement de microorganismes et/ou capable de tuer un microorganisme. Il peut s’agir par exemple d’un biocide, par exemple un désinfectant, un produit de protection, un produit de lutte contre les espèces dites nuisibles et autre et/ou tout biocide inclus dans la liste selon la directive 98/8/CE ou le règlement (UE) n°528/2012, d’un antibiotique, d’un anti-fongique.
Il peut s’agir par exemple d’un antibiotique choisi dans le groupe comprenant l’acide fusidique, les aminosides, les bêta-Lactamines, les pénicillines, les inhibiteurs de bêta-lactamases, les céphalosporines, les carbapénèmes, les monobactames, la cyclosérine, la daptomycine, la fosfomycine, les lincosamides, les macrolides et kétolides, la mupirocine, les nitro-imidazolés, les nitrofuranes, les oligosaccharides, les oxazolidinones, les polypeptides: bacitracine, glycopeptides, polymyxines et colistine, les quinolones, les rifamycines, les sulfamides et les diaminopyridines, les synergistines, les tétracyclines, les antifongiques, ou un quelconque mélange de ceux-ci.
Il peut s’agir par exemple d’un anti-fongique choisi dans le groupe comprenant le Miconazole, le Kétoconazole, le Clotrimazole, l’Éconazole, le Bifonazole, le Butoconazole, le Fenticonazole, l’Isoconazole, l’Oxiconazole, le Sertaconazole, le Sulconazole, le Thiabendazole, le Tioconazole, le Fluconazole, l’Itraconazole, l’Isavuconazole, le Ravuconazole, le Posaconazole, le Voriconazole, la Terbinafine, l’Amorolfine, la Naftifine, la Butenafine, la Mycosubtiline ou un quelconque mélange de ceux-ci.
Il peut s’agir également de tout nouveau composé dont on cherche à mettre en évidence une éventuelle activité antibiotique et/ou antifongique, seule ou en association avec un ou plusieurs autres composés.
Selon l’invention, l’antibiotique et/ou l’anti-fongique peut-être en solution dans la solution, par exemple dans le milieu de culture, ou sous forme déshydratée ou lyophilisée, et/ou fixé sur la surface immergée dans ledit milieu.
Les moyens de fixation utilisables de l’antibiotique et/ou de l’anti-fongique peuvent être tout moyen connus de l’homme du métier pour la fixation d’un antibiotique et/ou d’un anti-fongique sur une surface. Il peut s’agir par exemple de moyens ou dispositif disponibles dans le commerce,, par exemple des supports de type microplaque, par exemple de moyens ou dispositif commercialisé par la société NUNC (Danemark), Corning (Etats-Unis), et Greiner Bio-One (Autriche). Selon l’invention, on peut introduire dans le milieu de culture un ou plusieurs composés, par exemple un ou plusieurs antibiotiques
Avantageusement, lorsque le procédé selon l’invention permet de de tester différents antibiotiques et/ou anti-fongiques seuls et/ou de rechercher un effet de combinaison ou d’association d’antibiotiques et/ou d’anti-fongique dans un format couramment appelé « échiquier » (ou checkerboard en anglais). La mise en oeuvre du procédé de l’invention avec un mélange d’antibiotiques et/ou d’anti-fongique (combinaison, association) peut permettre avantageusement de détecter d’éventuels effets additifs, synergiques et/ou antagonistes.
Par « effet additif », on entend l’addition des actions d’au moins deux antibiotiques permettant, par exemple, de trouver une combinaison d’antibiotiques ayant un même effet antibiotique qu’un antibiotique seul, mais avec des concentrations inférieures.
Par « effet synergique », on entend une amélioration de l’efficacité d’un antibiotique et/ou d’anti-fongique par ajout d’au moins un deuxième antibiotique et/ou d’anti-fongique, ce mélange d’antibiotiques et/ou d’anti-fongique ayant un effet supérieur à l’addition de l’effet de chaque antibiotique et/ou anti-fongique seul.
Enfin par « effet antagoniste » on entend l’inhibition de l’action d’un antibiotique et/ou d’un anti-fongique sur le microorganisme par l’ajout d’au moins un deuxième antibiotique et/ou anti-fongique. Ce mode de réalisation peut permettre de sélectionner des combinaisons, des associations d’antibiotiques et/ou d’anti-fongiques (« co-drug ») pertinentes pour, par exemple, inhiber le développement du microorganisme.
Selon l’invention, les antibiotiques et/ou anti-fongiques peuvent également être introduits successivement dans le milieu afin d’identifier des effets additifs, synergiques ou antagonistes tels que décrit précédemment.
Avantageusement, le procédé selon l’invention permet de déterminer/détecter et/ou d’identifier la sensibilité de microorganismes à des composés. Aussi, le procédé selon l’invention permet avantageusement d’identifier de nouveau biocide, par exemple de nouveau antibiotique et/ou antifongique. En outre, le procédé selon l’invention peut avantageusement permettre de déterminer la spécificité d’un composé, par exemple s’il s’agit d’un antibiotique et/ou un antifongique. La présente invention a également pour object un dispositif de détection et/ou de caractérisation de la formation d’un biofilm susceptible de mettre en oeuvre le procédé précité.
Il peut s’agir de tout dispositif adapté connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un dispositif comprenant des moyens de détection, par exemple des moyens de détections optiques, par exemple une caméra, un microscope électronique, des moyens d’analyses, par exemple un module de calcul, des moyens de représentation grahique, par exemple un module de représentation visuelle.
D’autres avantages pourront encore apparaître à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
La figure 1 représente un exemple de comparaison d’image numérique. Sur les diagrammes l’abscisse représente les pixels et l’ordonnée le niveau de gris.
La figure 2 représente un schéma expérimental d’une étude de la formation de biofilm par le biais de microbilles piégées dans le milieu bactérien
La figure 3 représente des diagrammes représentant les indices BioFilm relatifs (rBFI) (ordonné) en fonction du temps d'incubation (abscisse) pour P. aeruginosa (croix ou traits verticaux), S. aureus (croix ou ronds) et sans bactéries (croix ou triangle). Les zones grisées sur le graphique de gauche représentent l'écart-type pour les deux réplicas.
La figure 4 représente des diagrammes illustrant les différentes vitesses des billes pour quatre types de mouvements différents rencontrés pendant la croissance du biofilm, à savoir mouvement passif (a), un mouvement éjecté/dragué(b), un mouvement ralenti (c) ou un mouvement de billes liées (d).
La figure 5 représente le déplacement carré moyen (MSD : « Mean Square Displacement) (ordonnée) en fonction du temps en seconde (abscisse) pour des billes prises dans une suspension de P. aeruginosa pour différents temps d'incubation : 0, 45, 75 ou 105 minutes.
La figure 6 représente le déplacement carré moyen (ordonnée) en fonction du temps en seconde (abscisse) pour des billes prises dans une suspension de S aureus pour différents temps d'incubation : 0, 40, 120 ou 160 minutes. La figure 7 représente un diagramme représentant l’évolution de l’écart-type de déplacements de l’ensemble des particules (ordonnée) en fonction du temps d’incubation en minute (abscisse) de S aureus ou non.
La figure 8 représente deux diagrammes représentant deux modèles d’évolution de l’écart-type des déplacements des particules en fonction du temps d’incubation. Sur la figure, a et b représentent respectivement la pente de la première partie linéaire et l'interception verticale, t1 une première rupture dans la pente et t2 une seconde rupture dans la pente. Sur les diagrammes, l’ordonné correspond à l’écart- type des déplacements des particules et l’abscisse au temps d’incubation.
La figure 9 représente les résultats obtenus après analyse en composantes principales après incubation avec des bactéries, la figure 9 (a) représente un diagramme en bâton représentant le résultat d’analyse en composante principale des paramètres de déplacements ou trajectoires des particules, la figure 9 (b) représente un graphique en fonction de la première (PCA1 ) (abscisse) et seconde composantes principales (PCA2) (ordonnée). La figure 9 (c) représente la proportion de particules/billes en fonction de la répartition des points en fonction du temps de la figure 9(b). Les points gris clairs correspondent au particules/billes ayant des mouvements bloqués, l’ordonnée correspond au pourcentage de billes et l’abscisse le temps d’incubation en minutes.
La figure 10 représente les résultats obtenus après analyse en composantes principales après incubation sans bactéries, la figure 10(a) représente un histogramme représentant le résultat d’analyse en composante principale des paramètres de déplacements ou trajectoires des particules, la figure 10 (b) représente un graphique en fonction de la première et seconde composantes principales. La figure 10(c) représente la proportion de particules/billes en fonction de la répartition des points en fonction du temps de la figure 10(b). Les points gris clairs correspondent au particules/billes ayant des mouvements bloqués, l’ordonnée correspond au pourcentage de billes et l’abscisse le temps d’incubation en minutes.
La figure 11 représente les résultats obtenus après analyse en composantes principales après incubation en présence de S. aureus :, la figure 11 (a) représente un diagramme en bâton représentant le résultat d’analyse en composante principale des paramètres de déplacements ou trajectoires des particules, la figure 1 1 (b) représente un graphique en fonction de la première et seconde composantes principales. La figure 11 (c) représente la proportion de particules/billes en fonction de la répartition des points en fonction du temps de la figure 1 1 (b). Les points gris clairs correspondent au particules/billes ayant des mouvements bloqués.
La figure 12 correspond à un diagramme représentant l’évolution de l’écart-type (ordonnée) en fonction du temps d'incubation pour P. aeruginosa. La rupture de pente se produit à 34 minutes
La figure 13 représente les résultats obtenus après analyse en composantes principales après incubation avec P. aeruginosa, la figure 13 (a) représente un histogramme représentant le résultat d’analyse en composante principale des paramètres de déplacements ou trajectoires des particules, l’ordonné représente le pourcentage de variance, l’abscisse les composantes, la figure 13 (b) représente un graphique en fonction de la première (abscisse) et seconde composantes principales (ordonnée). La figure 13 (c) représente la proportion de particules/billes en fonction de la répartition des points en fonction du temps de la figure 13(b). Les points gris clairs correspondent au particules/billes ayant des mouvements bloqués.
La figure 14 représente deux diagrammes (A et B) représentant l’évolution de l’écart-type de déplacements de l’ensemble des particules (ordonnée) en fonction du temps d’incubation en minute (abscisse) du milieu seul (blanc), de S aureus seule, de S aureus avec de la vancomycine, ou de S aureus et de l’acide fusidique. Les indicateurs sur les diagrammes indiquent les courbes correspondantes.
La figure 15 représente les résultats obtenus après analyse en composantes principales après incubation de S aureus avec de la vancomycine, la figure 15 (a) représente un diagramme en bâton représentant le résultat d’analyse en composante principale des paramètres de déplacements ou trajectoires des particules, l’ordonné représente le pourcentage de variance, l’abscisse les composantes, la figure 15 (b) représente un graphique en fonction de la première (abscisse) et seconde composantes principales (ordonnée). La figure 15 (c) représente la proportion de particules/billes en fonction de la répartition des points en fonction du temps de la figure 15(b). Les points gris clairs correspondent au particules/billes ayant des mouvements bloqués
La figure 16 représente les résultats obtenus après analyse en composantes principales après incubation de S aureus avec de la vancomycine, la figure 16 (a) représente un diagramme en bâton représentant le résultat d’analyse en composante principale des paramètres de déplacements ou trajectoires des particules, l’ordonné représente le pourcentage de variance, l’abscisse les composantes, la figure 16 (b) représente un graphique en fonction de la première (abscisse) et seconde composantes principales (ordonnée). La figure 16 (c) représente la proportion de particules/billes en fonction de la répartition des points en fonction du temps de la figure 16(b). Les points gris clairs correspondent au particules/billes ayant des mouvements bloqués.
La figure 17 représente des diagrammes représentant les indices BioFilm relatifs (rBFI) (ordonnée) en fonction du temps d'incubation (abscisse) pour S. aureus seule, avec de la vancomycine, avec de l’acide fusidique et sans bactéries (blanc). Les indicateurs la figure indiquent les courbes correspondantes.
La figure 18 représente des diagrammes représentant le nombre de colonies formées par puits (CFU/puits) (ordonné) en fonction du temps d'incubation (abscisse) pour S. aureus seule, avec de la vancomycine, avec de l’acide fusidique. Les indicateurs la figure indiquent les courbes correspondantes.
La figure 19 représente des diagrammes du déplacement carré moyen (ordonnée) en fonction du temps en seconde (abscisse).
La figure 20 représente deux images d’une particule, l’image de gauche correspond à l’image brute et l’image de droite à l’image après transformation.
La figure 21 représente une image d’un puit comprenant un milieu avec des bactéries et des particules.
La figure 22 est une représentation d’un exemple de d’une zone d’intérêt (particule) utilisé pour suivre et/ou calculer les déplacements des particules, notamment par corrélation d’images.
La figure 23 est une image d’un puit en nuance de gris illustrant le bruit de fond du capteur.
La figure 24 représente est un diagramme représentant un nuage de points représentant la variance en fonction de la moyenne de la distribution du niveau de gris d’un pixel sur 1000 images.
La figure 25 représente des diagrammes du déplacement carré moyen (ordonnée) en fonction du temps en seconde (abscisse) pour les trajectoires de 19 billes diffusant dans une solution de glycérol à 68%. Les pentes de courbes du graphe de droite étaient environ égales à 1 (1,5 ± 0,1 ) La figure 26 représente des diagrammes du déplacement carré moyen (ordonnée) en fonction du temps en seconde (abscisse) les trajectoires de 39 billes diffusant dans une solution de BHI. Les pentes de courbes du graphe de droite sont environ égales à 1 (0,98 ± 0,11 )
La figure 27 représente une photographie (figure 27 a))d’un puit d’une trajectoire d’une bille diffusant dans le liquide N350 avec la présence d’un biais dû à un écoulement du milieu et un diagramme du déplacement carré moyen (ordonnée) en fonction du temps en seconde (abscisse) (figure 27b)) de sept trajectoires de billes présentes dans le même milieu. La tendance polynomiale du second degré traduisant un écoulement dans le milieu.
La figure 28 représente des diagrammes représentant le déplacement d’une particule (ordonnée) en fonction de la fréquence de prise d’image par seconde (fps) lors d’une observation (abscisse)
La figure 29 représente des histogrammes représentant le déplacement d’une particule (ordonnée) en fonction de la fréquence de prise d’image (abscisse), à savoir pour 1000 fps (ligne 1 ), 500 fps (ligne 2) et 200 fps (ligne 3), lors d’une même observation
EXEMPLES
Exemple 1. Suivi de microbilles in situ pour la détection de la formation de biofilm
Dans l’exemple ci-dessous, les, particules sont indépendamment désignées billes, particules, microparticules.
La méthode de suivi de microbilles exposée ici est appliquée à l’étude de biofilms de P. aeruginosa et de S. aureus. Pour ses souches, des cinétiques de croissance de biofilm ont été exécutées. Des séries d’images microscopiques ont été extraites à des temps successifs de la croissance du biofilm. Les essais se sont donc focalisés sur les premiers stades de formation des biofilms étudiés, depuis la caractérisation du milieu BHI contenant les bactéries planctoniques et les microbilles, jusqu’à la détermination des premiers signes de formation du biofilms via les mouvements des microbilles. Dans l’exemple ci-dessous, les changements de dynamique des microbilles ont été étudiés plutôt que de calculer des paramètres mécaniques fondés sur la théorie des mouvements browniens purs. En effet, il est avantageux de pouvoir discriminer les différents mouvements des billes sur un autre critère que celui de la comparaison de MSD (déplacement moyen au carré ou « Mean Square Displacement ») qui est valable dans des milieux homogènes et inertes. Il s’agit donc d’étudier la formation de biofilms d’un point de vue mécanique, en déterminant un paramètre révélateur de la genèse d’un biofilm. En tirant parti de l’observation des mouvements de microbilles introduites dans le milieu bactérien, des changements de profil de trajectoires ont été déterminés et sont reliés à l’activité de bactéries sessiles (adhésion ou formation de matériel extracellulaire). Le laboratoire d’expérimentation était en classe de confinement P2 (“Concerne les micro-organismes non génétiquement modifiés de classe 2 qui peuvent provoquer des maladies chez l’homme mais dont la dissémination dans l’environnement est peu probable, qui sont sans risque pour la collectivité et contre lesquels une prophylaxie ou des traitements efficaces sont connus”). Un microscope optique de référence Olympus CX53 a été utilisé et la manipulation a été réalisée sous poste de sécurité microbiologique. Les dynamiques des microbilles au sein du liquide bactérien au cours du temps ont été observées. Le témoin était constitué d’une solution de microbilles dans le BHI utilisé pour les essais. Le mouvement libre des microbilles dans le milieu bactérien a été visualisé à température ambiante (20 °C) en lumière transmise. À partir des enregistrements par séries d’images des observations des billes se déplaçant librement (sans sollicitation extérieures) dans le milieu bactérien, l’objectif des analyses était de déceler des changements de dynamique dans les trajectoires des billes au cours du temps. Pour cela, des séries d’images à une fréquence de 200 images par seconde ont été prises à des temps successifs de la croissance de biofilm de P. aeruginosa et de S. aureus dans du BHI et en présence de microbilles, de préférence paramagnétiques, de diamètre 1 pm. La portion du fond du puits observée varie entre 600 pm2 et 1000 pm2. La figure 2 représente un schéma expérimental des étapes mises en oeuvre. Quelques dizaines à quelques centaines de microbilles ont pu être visualisées et suivies dans une même série d’images. Des séries d’images du fond des puits ont été enregistrées jusqu’à avoir une immobilisation de l’ensemble des billes au sein du biofilm, ou bactéries adhérées. Le temps de blocage/immobilisation pour une majeure partie des billes était dépendant de la souche. Un test BRT, dans le même milieu de culture, a été effectué en parallèle pour la souche étudiée correspondant ainsi à une référence en termes de formation de biofilm. Les résultats sur les analyses des mouvements des billes extraits par Cl N sont exposés ci-dessous.
1. Matériels et Méthodes
Les matériels et méthodes mis en oeuvre étaient les suivants :
a) Le protocole de cinétique de formation de biofilm sans antibiotique était comme suit et était basé sur l’observation, jusqu’à l’immobilisation des billes (quelques heures), toutes les 5 ou 10 minutes, le fond d’un puits test et d’un puits témoin.
Le matériel utilisé était le suivant : 1 boîte de bactéries repiquées 2 fois ; du TON4 (microbilles paramagnétiques) ; du milieu BHI (Brain Heart Infusion) ; autant de microplaques de 96 puits que de temps d’incubation lus.
Le protocole comprenait les étapes suivantes :
1. Préparer 2 mélanges :
• Mélange pour BRT test : une solution bactérienne à DO(600nm) 0,004 et I OmI/ml de TON4;
• Mélange pour BRT témoin : un mélange BHI + TON 4 à 10/jl/ml.
2. Remplir 4 puits de chacun des mélanges dans chacune des plaques (200jivl/puits) selon un plan de plaque établi au préalable ;
3. Mettre toutes les plaques, sauf une, à l’étuve.
4. Avec la plaque restante, prendre une série d’image pour le puits test et pour le puits témoin ;
5. Ajouter liquide de contraste sur les puits et réaliser un BRT (image + analyse BFI) ;
6. Répéter le protocole depuis l’étape 4 pour tous les temps d’incubations en sortant une plaque de l’étuve au temps désiré.
Analyse : Les trajectoires de toutes les billes présentes sur les séries d’images pour le puits test et le puits témoin ont été suivies, pour chaque temps d’incubation. L’évolution de la tendance des mouvements libres des billes au cours du temps est recherchée. Les résultats obtenus avec le BRT ont servi de référence. b) Le protocole de cinétique de formation de biofilm en présence d’antibiotique était le suivant et était basé sur l’observation, jusqu’à l’immobilisation des billes (quelques heures), toutes les 5 ou 10 minutes, le fond d’un puits test et d’un puits témoin. Le matériel utilisé était le suivant : 1 boîte de bactéries repiquées 2 fois ; solution de billes 1 pm (TON4) ; du milieu BHI ; des antibiotiques en solution : Vancomycin à 4 pg/mL et Acide Fusidique à 2pg/mL (concentrations finales dans les puits) ; autant de microplaques de 96 puits que de temps d’incubation observés. Le protocole comprenait les étapes suivantes :
Préparation des plaques d’antibiotiques : dans les plaques, les antibiotiques ont été apportés par un dépôt de 20 pL. Comme ce dépôt a été dilué par ajout de la suspension bactérienne (180 pL / puits), les solutions déposées devaient être 10 fois plus concentrées que la valeur désirée, soit 40 pg/mL pour la Vancomycin et 20pg/mL pour l’Acide Fusidique. Les solutions de dépôt ont été préparées à partir de solutions existantes préparées selon la norme ISO 20776-1 :2006. Les solutions ont été ensuite déposées dans les microplaques selon un plan/une répartition de plaque établi, à raison de 20 pL /puits. L’eau pour préparation injectable (EPPI) est déposée dans les puits témoin.
Inoculation des plaques :
1. Préparer un mélange“Témoin” avec du BHI et du TON4 à raison de 10 muhhu,
2. Préparer un mélange“Souche” avec du BHI et du TON4 à raison de 10 muhhu,
3. À partir du second repiquage de la souche, prélever quelques colonies à l’oese et les remettre en suspension dans un tube avec 3ml de BHI ;
4. Mesurer la DO à 600 nm (DO600 nm) de la suspension et calculer le volume d’inoculum à ajouter au mélange“Souche” afin d’avoir une DO600nm = 1/225 = 0,004444 (la DO600 nm en puits sera de 0,004). Calcul inoculum = 0,004444 VmélangeSouche/DOQOOnm
5. Inoculer le mélange“Souche” avec la souche.
6. Après homogénéisation des mélange“Témoin” et“Souche”, les répartir dans les microplaques antibiotiques selon un plan de plaque établi, à raison de 180 mZ. / puits ;
7. Les plaques sont mises immédiatement à incuber à 37°C.
À chaque temps, une plaque est sortie de l’étuve et est observée au microscope. Une série d’images d’un puits pour chaque condition testée est enregistrée. La plaque est ensuite lue au BRT après ajout du liquide de contraste et l’aimantation de la plaque pendant 1 minute. c) Souches bactériennes et conditions de croissance P. aeruginosa CIP 104 116 et S. aureus CIP 76 25 ont été analysés. Les cellules bactériennes ont été remises en suspension dans 100 mL de milieu de perfusion stérile BHI (Brain Heart Infusion medium) jusqu'à une densité optique à 600 nm OD600 = 0,004. Ceci correspondait à la Suspension Bactérienne Initiale (IBS). La même IBS a été utilisé pour le BioFilm Ring Test® et pour les tests microscopiques. Le Toner a été ajouté dans IBS pour obtenir une concentration finale de 10mI/ml. Le mélange a été homogénéisé par vortex et des microplaques de polystyrène à 96 puits ont été inoculées avec 200 mI/puits d'IBS. Une plaque a été préparée pour chaque temps d'incubation de lecture. Les cultures poussent à 37°C sans l'agitation. La partie inférieure des puits a un diamètre de 6 mm et est sans revêtement. Les plaques n’ont pas été touchées pendant la croissance jusqu'à ce qu'elles soient utilisées pour les expériences. Pour S. aureus, l'effet de deux antibiotiques a été étudié afin de détecter les capacités des antibiotiques. Les deux antibiotiques testés étaient la vancomycine et l'acide fusidique à une concentration respective de 4pg/mL et de 2pg/mL, Dans ces cas, les puits ont été inoculés après avoir été chargés avec 20pL d'antibiotiques aux concentrations précités. Ces deux antibiotiques sont connus pour avoir différents mécanismes d'action. La vancomycine agit sur la paroi bactérienne tandis que l'acide fusidique modifie la synthèse protéique. d) Microscopie et traitement d'images
La cinétique d'adhérence a été analysée toutes les 5 minutes pour P. aeruginosa et toutes les 10 minutes pour S. aureus jusqu'à l'immobilisation des billes. Pour chaque temps d'incubation de lecture, une plaque a été prélevée hors de l’incubateur et placé sur un microscope à lumière inversée Olympus CKX53 équipé d’un objectif 40x. Ce grossissement était un bon compromis entre le nombre de particules observées, tracées et la résolution des particules. Les dispositifs utilisés, notamment pour la prise d’image, était une caméra PCO Edge commercialisée par la société PCO ou une caméra Basler Ace, la caméra étant connectée à la sortie vidéo du microscope. Le premier est équipé d'un capteur CCD de 4,2 millions de pixels et l'autre d'un capteur CMOS avec 1 ,3 millions de pixels. La différence entre les deux capteurs n'a pas d'impact sur l'étude. Les séries d'images ont été capturées à une cadence de 200 images par seconde avec 0,5 ms de temps d'éclairage par image pour respecter la capacité d'économie de l'ordinateur et la fréquence des mesures. Plusieurs milliers d'images par série ont été prises pour chaque puits, à un endroit différent, près du centre des puits. La surface du fond du puits prise par l’image représentait entre 600 pm2 et 1000 pm2 selon la taille de l'image. Le mouvement des particules a été confiné verticalement en observant la partie inférieure du puits. Néanmoins, les particules étaient autorisées à quitter le champ de vision. La première microplaque a été lue immédiatement, sans être mise dans l’incubateur. Le suivi du mouvement des particules a été déterminé selon le procédé décrit ci-dessous permettant de déterminer le déplacement du centres de billes entre deux images consécutives. Le suivi des particules sur une série de plusieurs images a permis de déterminer et obtenir la trajectoire de chacune d'elles. La résolution du suivi du et de suivi optique a été évalué à ±0,045 pixel. e) Vérification de la formation du biofilm avec le BioFilm Ring Test (BRT) La vérification de la formation du biofilm a été effectuée après chaque capture microscopique à l'aide de ce que l'on appelle le Biofilm Ring Test® (BRT). Il s'agit du procédé décrit dans Chavant et al « A new device for rapid évaluation of biofilm formation potential by bacteria. J Microbiol Methods. 2007 Mar;68(3):605-12 [29] basé sur l'immobilisation de billes magnétiques inoculé en suspension bactérienne grâce à des cellules adhérentes. Les puits de la bande ont été couverts avec un liquide de contraste. Ensuite, la plaque a été placée pendant une minute sur un bloc d'essai constitué d'aimants permanents placés sous chaque centre des puits. Après magnétisation, la plaque a été numérisée pour obtenir une image du fond de la plaque. La capacité d'adhérence de chaque souche a été exprimée sous la forme de l'indice de biofilm (BFI) calculé par le logiciel BioFilm Elément software. f) Dénombrement des bactéries adhérées
Un dénombrement des bactéries adhérentes a été effectué pour lier la formation du biofilm à l'activité microbiologique de la souche de S. aureus. L'effet des antibiotiques a été évalué par le nombre de colonies qui ont adhéré pendant la croissance du biofilm. g) Analyse des trajectoires - Analyse globale : une première analyse sur les trajectoires de billes était l'étude de l'évolution de l'écart-type de la distribution des déplacements de toutes les billes suivies pour chaque temps d'incubation. La trajectoire pi observée était constituée de Nt,i déplacements successifs parcourus par les particules ou billes pendant un intervalle de temps constant correspondant à l'intervalle de temps entre deux images en tant que pi = (xi, yi), i = 1 , ... ,Nt,i. Nt,i est la longueur de la trajectoire i. Les valeurs des déplacements parcourus par chaque bille ont été concaténées dans un vecteur P comme P = {p1 , p2, pNb}. Nb est le nombre de billes pour un temps d'incubation donné. P a été remodelé de sorte qu'il s'agit d'un vecteur de taille unidimensionnel
Pour chaque période d'incubation, une évaluation de l’écart-type de la distribution du déplacement (vecteur P) a été effectuée et calculé selon la formule suivante : avec m = longueur(P) et P = moyenne(P). Pour chaque temps d'incubation, une valeur agrégée représentant l'état global de la croissance du biofilm était disponible. h) Apports individuels de chaque particules/billes
Au fur et à mesure que chaque trajectoire fournit des informations sur son environnement, les mouvements billes ont été également individuellement évalués. Le vecteur de déplacements fourni par le suivi des déplacements de l’ensemble des billes/particules constituent un lot de données pour l'observation des centaines de billes/particules pendant toute la durée de l'observation de la croissance du biofilm. Pour décrire ces trajectoires avec un petit nombre de valeurs, les vecteurs de suivi ont été remplacés par des critères caractéristiques décrivant la distribution des déplacements le long du mouvement. Chaque critère regroupe les informations données par chaque déplacement des billes/particules mesurées selon le procédé de comparaison précité, notamment par comparaisons des observations d’images numérique. Le mouvement a pu être analysé plus quantitativement en utilisant ces différents critères. Pour chaque piste, des paramètres discriminants ont été calculés.
Ces paramètres sont basés sur la distribution statistique des déplacements et des déplacements et la géométrie de toute la trajectoire. A partir du déplacement en fonction du temps[X(t), Y(t)]. de chaque particules/billes, chaque piste / trajectoire a été associée à un n-uplets de sept paramètres :
- longueur c1 de la diagonale du rectangle comprenant ladite trajectoire selon la formule suivante: ci = (max(eum tm(X))— min(cumsum(X)))2 + (max(cumsum(Y))— min{cumsum(Y)))^
La vitesse moyenne c2 le long / sur la trajectoire
l'écart type de la distribution des vitesses de la particule /bille à chaque point de la trajectoire
l'écart-type de la distribution des trajectoires selon les directions/axes transversale et verticale (un paramètre pour chaque composant)
C4 = st<IiX ) c¾ = std(Y)
l'asymétrie de la distribution du déplacement le long des axes transversal et vertical (un paramètre pour chaque composant).
f, = skm(X)
Cy = skw(Y) Ces 7 paramètres ont permis d'évaluer la façon dont le mouvement et/ou la trajectoire des billes à l'intérieur d’une suspension bactérienne. Il ont permis de démonter qu’il ne s’agit par d’un mouvement et/ou trajectoire normale. Ensuite, ils ont permis et peuvent être utilisés pour classer les trajectoires en grappes, également dénommé cluster, afin de différencier clairement les mouvements actifs, les trajectoires aléatoires et les particules bloquées. Afin de conserver, parmi ces critères, les informations les plus discriminantes, une analyse en composante principale (ACP) a été effectuée sur l’ensemble des données. L’ACP est une méthode d’analyse bien connue par ailleurs. Elle permet avantageusement de conserver le maximum d’information pour décrire les trajectoires en ne conservant qu’un nombre limité de composantes, à savoir celles qui influencent le plus le phénomène observé. À partir de sept paramètres, trois composantes principales ont été construites. Le choix de trois composantes principales a été effectué de manière à conserver les composantes qui expriment le maximum de variance dans l’information. En d’autres termes, à partir d’une base de vecteurs définis par les critères physiques c£, le problème est traduit dans une base de vecteurs orthogonaux PC£. Ces derniers sont construits à partir de combinaisons linéaires des critères c£. Les coefficients de la décomposition linéaire donnent une information sur la contribution des critères c£ dans la description des trajectoires. Néanmoins, les dimensions des vecteurs PC£ représentent une information abstraite, qui n’est pas pertinente pour l’analyse. De plus, les unités des composantes des vecteurs PC£ peuvent varier d’une analyse à l’autre.
Chaque trajectoire a été ensuite représentée dans le système de coordonnées des trois composantes principales (PC1 , PC2, PC3). Des trois principales composantes ci-dessus, un regroupement spatial d'applications basé sur la densité de points avec l'algorithme DBSCAN (« Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise » ) (Ester et al., 1996) a été utilisé pour déceler deux clusters non supervisées dans le graphique à partir des 3 premières composantes principales. Ces principaux éléments ont été par la suite liés à la forme des trajectoires et donc au comportement des billes. i) Test de reproductibilité Chaque expérience pour la souche de S. aureus a été effectuée deux fois. Dans ce qui suit, les deux réplicats des essais sont appelés réplicat 1 et réplicat 2. Pour la souche de P. aeruginosa, la cinétique de croissance n'a été effectuée qu'une seule fois. La sensibilité de la croissance du biofilm est très dépendante des conditions environnementales.
2. Résultats
S. aureus et P. aeruginosa ont été cultivés en milieu BHI en microplaques à 37°C en présence de microbilles/particules. Le mouvement des microbilles/particules qui se déplaçaient directement au-dessus du fond du puits a été observé. Ces microbilles/particules inertes ont une géométrie sphérique, de taille homogène et constituent des sondes indéformables du comportement du milieu entourant la bactérie.
2.1. Cinétique de la croissance des biofilms
Les deux souches choisies ont différentes capacités et spécificités de formation de biofilms comme le montre la figure 3. La cinétique de la croissance du biofilm déduite avec le BRT pour S. aureus (courbe points ronds) montre que l'immobilisation des billes se produit à 120 minutes. En outre, le début du blocage se produit à 40 minutes. Pour la souche de P. aeruginosa (courbe points trait verticaux) , le blocage des billes commence dès le début de l'incubation. La disparition totale de spot, ce qui signifie un blocage total des billes, s’est produit à environ 80 minutes. Qualitativement, P. aeruginosa produit une matrice très muqueuse dans un temps court par rapport à S. aureus qui forme un biofilm dans le temps. La rBFI pour P. aeruginosa augmentait dès le début contrairement à S. aureus.
2.2. Analyse qualitative du mouvement des billes
Le suivi du mouvement des particules a été réalisé par la prise d’images des particules/billes incorporées dans le milieu bactérien avec un fort grossissement, juste au-dessus du fond des puits, individuellement, à des échelles de temps courtes, pour chaque temps d'incubation. Des mouvements différents des billes ont pu être observés dans les milieux bactériens issus des différentes souches. La première suspension bactérienne a été faite avec une souche de P. aeruginosa tandis que la seconde a été faite avec une souche de S. aureus. Les observations expérimentales ont montré que le mouvement des billes dans une suspension bactérienne à 37°C était une combinaison de mouvements actifs et thermiques. De plus, le mouvement des billes différait selon le type de bactérie dans le milieu de croissance. La trajectoire des billes qui résulte du milieu comprenant de P. aeruginosa différait du mouvement purement brownien. Les observations visuelles sur la trajectoire des billes à l'intérieur de la suspension bactérienne pendant la croissance du biofilm ont montré que les billes avaient tendance à se déplacer selon une direction privilégiée. Pendant que les billes présentes dans la solution témoin (composée de billes dans le même milieu nutritif) subissaient un mouvement brownien caractéristique, les billes dans une solution/milieu bactérien présentaient une augmentation de la diffusion dans leurs mouvements, notamment au début de l'incubation. Pour des temps longs, les phénomènes de diffusion « augmentée » pouvaient être effacés. Pour S. aureus, les billes/particules semblaient moins mobiles. Elles faisaient l'expérience du mouvement aléatoire, possiblement perturbé par des interactions avec d'autres particules. Au fur et à mesure que le biofilm se développait, les billes ralentissaient jusqu'à un blocage complet. Quatre scénarios de mouvement des billes ont été observés pendant la croissance du biofilm :
- mouvement purement passif : billes dans un milieu quasi-homogène ;
- traîné ou éjecté : billes à activité homogène ou partiellement propulsée;
- ralenti : billes dans une matière visqueuse ;
- passive délimitée : billes dans une matière plus visqueuse, où l'énergie thermique kBT n’est pas suffisante.
Ces types de mouvement ont été observés de différentes manières dans les deux suspensions de déformation. Le tableau 1 et la figure 4 illustre les vitesses des billes avec différent types de mouvement.
Tableau 1 : Types de mouvements observés pour deux souches
Les mouvements traînés et éjectés apparaissent induits par des bactéries en peu de temps. Des micro-organismes comme P. aeruginosa nagent et balayent la surface. Alors que les particules inertes subissent un mouvement brownien lorsqu'elles sont noyées dans un milieu liquide, les bactéries actives étaient capables de se propulser avec un mouvement dirigé, et donc d’aller en dehors de l'équilibre, entraînant les billes/particules. Le mouvement des billes/particules encastrées dans une solution de milieu BHI et de bactéries S. aureus correspondaient une diffusion aléatoire à vitesse uniforme. Il n'y avait pas de mouvement superdiffusif erratique. Au fur et à mesure que le biofilm se développait, l'amplitude du mouvement diminuait tout en conservant des caractéristiques aléatoires. Sans l'action des bactéries, les billes passives avaient un mouvement brownien. Le mouvement brownien est caractérisé par le déplacement moyen au carré (MSD) (Ar2(At)) proportionnel à l'intervalle de temps At entre les positions. Ar est le déplacement radial pendant un intervalle de temps At. La théorie prédit que, pour une bille avec un mouvement brownien purement bidimensionnel, (Ar2(At)) = 4DAt, où D est le coefficient de diffusion. Pour un mouvement superdiffusif, (Ar2A(t) )= 4Dta avec a > 1. Dans cette expérimentation, les valeurs moyennes du déplacement au carré des microbilles incorporées dans les solutions bactériennes ont été calculées pendant la croissance du biofilm. Pour chaque trajectoire, le déplacement moyen au carré a été calculé et les courbes de MSD en fonction de l'intervalle de temps ont été tracées. Les figures 5 et 6 représentent les courbes de la moyenne du déplacement au carré en fonction de l'intervalle de temps pour les deux souches pendant la formation du biofilm. Pour P. aeruginosa (figure 5), quelques billes présentent des mouvements superdiffusifs, alors que pour S. aureus, ces comportements ont été à peine été observés. Tel que démontré dans les figures ci-dessus, il apparaît que les mouvements des billes peuvent fournir des indications sur l’activité microbiologique des bactéries. Alors que le mouvement de la bille prise dans un biofilm de S. aureus est relativement simple, les billes dans le biofilm de P. aeruginosa présentent des caractéristiques/comportement différents. Cela concorde avec les observations visuelles des figures 5 et 6 qui montrent que les pistes de particules se composaient de segments droits de différentes longueurs (mouvement type balistique) plus ou moins important selon les interactions avec les bactéries et les milieux environnants. Le mouvement aléatoire dû à l'agitation thermique est biaisé par la motilité active de la bactérie. L'observation de trajectoires de billes est une étape pour l'étude du mouvement des billes. Une analyse quantitative par la définition de critères quantitatifs pour décrire le mouvement des billes a été réalisée. 2.3 S. aureus : analyse quantitative de la formation du biofilm
L'analyse de la distribution des déplacements globaux de toutes les billes suivies pour chaque temps d'incubation de lecture a été effectuée comme décrit ci-dessus. La figure 7 représente l'écart-type de la distribution des déplacements/trajectoires des billes en fonction du temps d'incubation pour deux réplicats de suspension de S. aureus et pour les deux réplicas de puits témoin (composés des mêmes microbilles en milieu BHI). Tel que représenté sur cette figure, l'écart-type augmente au début de la croissance du biofilm. Cette période croissante a été également observée dans le blanc de contrôle. Ensuite, à 20 minutes, l'écart-type diminue pour les billes dans le milieu bactérien alors qu'il se stabilise pour le blanc de contrôle. Après environ 140 minutes, l'écart-type des déplacements chute. Les courbes ont été approximées par des fonctions linéaires par morceaux. Des fonctions bilinéaires ou trilinéaires ont été utilisées pour approximées les courbes en fonction de la condition testée. Une première approximation des courbes avec une fonction bilinéaire a été effectuée. Si le coefficient R2 est trop faible, une fonction tri-linéaire a été choisie pour s'adapter aux courbes. Les équations des deux types de courbes d'ajustement sont :
f a.t + b for t < ri
Bi-linear régression : <
1 a>i(t ri) + a.ti + b for T < t <
La régression a permis d'identifier les paramètres analytiques et décrit l’évolution de l'écart-type avec peu d'indicateurs. Les modèles et leurs paramètres sont décrits schématiquement dans la figure 8. Les pentes des deuxième et troisième parties des approximations multilinéaires cd et a2 ainsi que les temps de rupture des pentes t1 et x2 ont été rapportés. a1 et a2 représentent un changement dans le comportement des billes ; t1 et x2 sont les temps de ces changements. Leurs valeurs numériques pour les deux répétitions sont indiquées dans le tableau 2 ci- dessous. Tableau 2 : Paramètres déduits des courbes d'écart-type de la figure 8
En modélisant le changement de l'écart-type en fonction du temps d'incubation par diverses courbes régulières, deux séries de conditions ont été distinguées.
Une analyse des contributions individuelles des billes a été effectuée afin de prendre en compte les différences des comportements des billes. Pour chaque trajectoire, sept critères basés sur la distribution des déplacements ont été mesurés tel que décrit ci-dessus. Une analyse en composante principales (ACP) a été mise en oeuvre afin de réduire la dimension de l'ensemble de données. La première composante principale (PC1 ) représentait environ 60% de l'information totale alors que PC2 et PC3 représentaient chacune 14% de l'information (figure 9). Toutes les trajectoires suivies pour tous les temps d'incubation ont été représentées dans le nouveau système de coordonnées constitué de (PC1 ,PC2,PC3). Toutes les trajectoires ont pu être divisées en deux groupes, tel que démontré sur la figure 9. Toutes les billes se comportaient de la même manière pendant la croissance du biofilm. La proportion de billes dans chaque grappe en fonction du temps d'incubation a été calculée et reporté sur un graphique (Figure 9 (c) ci-dessous). La variation de la proportion des billes dans chaque grappe était très douce et pouvait être divisé en trois étapes. Les temps de ces changements ont été indiqués dans le tableau 3 ci-dessous. Pour le puits témoin, on ne distinguait qu'un seul groupe, comme illustré Figure 10. L'analyse du deuxième réplica (figure 11 ) a démontré des résultats similaires.
Tableau 3: Paramètres déduits des courbes des proportions
2.4. P. aeruginosa: analyse quantitative de la formation du biofilm Une analyse de la distribution des déplacements en masse de toutes les billes suivies pour chaque temps d'incubation de P. aeruginosa en suspension a été effectuée. La figure 12 représente l'écart-type de la distribution des déplacements des billes en fonction du temps d'incubation. Comme pour la suspension de S. aureus, la variation de l'écart-type a été modélisée par une fonction linéaire. Le modèle bi-linéaire a permis de détecter un changement de tendance à 34 minutes, où l'écart type s'arrête d’augmenter. Après 34 minutes, les valeurs de l'écart-type semblent globalement diminuer, avec une grande variabilité dans ces valeurs pour les derniers temps d'incubation. Cette variabilité peut être due à l'hétérogénéité de la formation du biofilm de P. aeruginosa. Une analyse du mouvement des billes individuelles a été également effectuée. Les sept paramètres, précédemment définis ont été calculés pour chaque particule. Après une ACP sur l'ensemble des données des sept paramètres de chaque trajectoire, toutes les trajectoires rapportées au cours de la formation du biofilm ont été dans un nouveau système de coordonnées final construit selon trois composantes principales (PC1 ,PC2,PC3). Comme précédemment, des clusters ont été réalisés pour rassembler les billes correspondant aux mêmes caractéristiques de mouvement. Le nombre de trajectoires dans chaque grappe en fonction du temps d'incubation a été dénombré. Tout comme ce qui a été fait pour S. aureus, la figure 13 (b) ci-dessous montre la répartition des groupes de points (cluster). La figure ci- dessous 13 (c) montre l'évolution du nombre de billes appartenant à un groupe pendant la croissance du biofilm pour P. aeruginosa. Au fur et à mesure que le biofilm se développe, la tendance générale montre une augmentation du nombre de billes bloquées. Néanmoins, la diminution n'est pas régulière. La variabilité de la proportion de billes bloquées à travers le temps de croissance montre que le nombre de billes bloquées peut varier de manière significative. Les résultats sur P. aeruginosa peuvent expliquer que la formation du biofilm est plus hétérogène. Nous constatons que l'analyse du comportement individuel des billes montre qu’au début une activité particulière dans la suspension bactérienne n’est observée et apparaît après les premières minutes de croissance.
2.5. S. aureus : effet des antibiotiques sur la formation du biofilm
La caractérisation de l'effet des antibiotiques est une question importante dans le domaine pharmaceutique. Nous avons testé ici deux antibiotiques pour détecter leur capacité à retarder ou à arrêter la formation du biofilm. Le même traitement des données expérimentales est réalisé. La figure ci-dessous montre l'évolution de l'écart-type en fonction du temps d'incubation pour une suspension de S. aureus, y compris les antibiotiques. Au fur et à mesure que le biofilm se développait en présence de Vancomycine ou d’Acide Fusidique, l'écart-type augmentait au cours des premières périodes de croissance du biofilm et l'écart type s'accroît, puis diminue plus lentement que sans antibiotique. Les fonctions bi linéaires s'adaptent aux courbes de l'équation écart-type pour la suspension bactérienne avec antibiotiques. Les paramètres a1 et t1 de l’approximation bi- linéaire de la suspension bactérienne avec des antibiotiques ont été rapportés et comparés avec le témoin (blanc) et la suspension de S. aureus sans antibiotique dans le tableau 4 ci-dessous. Le changement de l'écart-type de la distribution des déplacements permet de discriminer la présence d'antibiotiques dans la suspension/milieu bactérien. En présence d'antibiotiques, les courbes de l'écart- type ressemblent à celles du témoin à blanc.
Tableau 4: Paramètres déduits des courbes d'écart-type
L'analyse du mouvement des billes individuelles après analyse en composantes principales des 7 paramètres telle que mentionnée ci-dessus (PC1 , PC2, PC3) a montré que l'algorithme DBSCAN permet de détecter un cluster principal et un autre plus petit (Figures 15). Le diagramme de dispersion des points (figures 15(b)) est plus déplacé dans la direction de la première composante principale que le diagramme de dispersion résultant pour le témoin (BHI + billes seulement). Tels que démontré les deux antibiotiques évitent l'immobilisation des billes, et ceci est clairement illustré et démontré sur les figures obtenues, notamment après analyse des composantes principales. Un BRT a été réalisé afin de comparer les résultats du procédé avec l'évolution de IΊAB en fonction du temps d'incubation. Pour la suspension de S. aureus en présence d'antibiotiques, les courbes de rBFI en fonction du temps d'incubation (Figure 17) montrent que les antibiotiques limitent l'adhésion des billes. Le dénombrement des bactéries adhérentes dans les puits de S. aureus avec ou sans antibiotiques (Figure 18) a démontré l'action des deux antibiotiques sur l'activité de l’adhésion bactérienne.
3. Discussion
Les observations qualitatives du mouvement des billes pendant la croissance du biofilm de P. aeruginosa et S. aureus révèlent différents types de déplacement des billes. Pour les deux souches, la formation d'un biofilm induit la formation de billes piégées. Pour la souche de S. aureus, l'amplitude du mouvement diminue avec la croissance du biofilm tout en conservant des caractéristiques aléatoires alors que les billes incorporées dans la suspension de P. aeruginosa subissent souvent une éjection erratique. Le procédé de l’invention permet avantageusement de détecter, à l'échelle microscopique, des événements biologiques qui peuvent être liés à l'adhésion bactérienne ou à la croissance du biofilm. À cet effet, le mouvement de billes microscopiques incorporées dans des suspensions bactériennes de S. aureus ou P. aeruginosa a été suivi grâce, par exemple, à un dispositif optique couplé à un algorithme de corrélation d’images numériques. En raison du grand nombre de données générées par la mesure des trajectoires, celles-ci ont été avantageusement caractérisées par des caractéristiques / paramètre spécifiques. D'une part, tous les déplacements pendant les intervalles de temps élémentaires de toutes les trajectoires suivies ont été mélangés pour chaque temps d'incubation de lecture. D'autre part, les billes ont été prises en compte individuellement et les paramètres/critères déterminés permettent de décrire le comportement de la bille. Grâce à cette méthodologie de suivi et d'analyse, des temps caractéristiques quantitatifs pendant la croissance du biofilm ont été déterminés. Pour l'analyse des déplacements globaux ainsi que l'analyse des déplacements individuels des billes, nous détectons un événement biologique à environ 140 minutes d'incubation pour S. aureus. De plus, la classification des billes en deux groupes dans un cadre bien choisi permet de détecter de manière fine le début du blocage des billes. Pour S. aureus, le début du blocage apparaît entre environ 71 minutes et 97 minutes selon la réplique en jeu. Un deuxième événement apparaît entre environ 143 et 160 minutes. Ces tendances concordent avec les résultats du BRT. Aucune adhérence ne se produit dans les premiers temps (rBFI = 0), puis le blocage des billes apparaît progressivement (augmentation de rBFI) jusqu'à ce qu'une partie importante des billes soit bloquée (rBFI maximum). L'étude de l'action de deux antibiotiques sur le biofilm de S. aureus a montré que l'analyse des déplacements microscopiques de billes inertes permet de discriminer l'efficacité des antibiotiques par rapport à une suspension bactérienne sans antibiotiques. En effet, en présence d'antibiotiques (indifféremment pour l'un ou l'autre antibiotique), la variation de l'écart-type des déplacements en fonction du temps d'incubation suit la même tendance que le témoin. Tel que démontré ci-dessus, les résultats obtenus sont conformes au test BioFilm Ring Test® et au dénombrement, sur plaque d’agar, de bactéries adhérées. De plus il apparaît clairement que le procédé de l’invention permet avantageusement et contrairement aux procédés connus d’obtenir un résultat de manière continue dans le temps grâce à son caractère non-destructif. En particulier, le procédé de l’invention permet l’obtention de résultat sans aucune action et/ou adjonction de composés, par exemple d’agents de contraste, lors de la culture bactérienne. De plus, le procédé de l’invention peut être mise en oeuvre sans contact direct avec la culture et ainsi est avantageusement un test non invasif et non destructif tout en permettant l’obtention de nombreux paramètres qui peuvent être utiles afin de caractériser le biofilm en temps réel. De plus, le procédé de l’invention permet avantageusement à la fin du temps d’incubation de la culture d’obtenir les résultats, de s’affranchir de l’utilisation de produits/consommables, qui permet avantageusement de réduire le temps d’analyse, ainsi que les coûts tant au niveau des consommables et que de la main d'œuvre. Avantageusement, le procédé de l’invention permet de par le suivi du mouvement des particules insérées au sein d’un biofilm permet d’apporter une dimension temporelle à la mesure.
Avantageusement, le procédé de l’invention permet une détection non- destructive de la formation de biofilm. En outre le procédé de l’invention permet avantageusement de détecter des évènements biologiques intervenant lors de la formation de biofilm et/ou de phénomènes discriminants par le biais des caractéristiques des trajectoires microscopiques de billes inertes. Le procédé de l’invention permet avantageusement un suivi temporel, quasi continu, de la cinétique de formation du biofilm.
Avantageusement, le procédé de l’invention permet un contrôle de la cinétique de croissance de biofilm, non invasif et non-destructif. Le procédé de l’invention permet avantageusement de multiple observation de la culture bactérienne pendons son incubation, par exemple il permet avantageusement de multiplier les observations à des temps d’incubation aussi rapprochés que souhaités contrairement aux méthodes connues. Aussi, le procédé selon l’invention permet avantageusement d’obtenir des résultats fiables et comparables.
Avantageusement, le procédé de l’invention de par l’utilisation de microbilles inertes au sein d’un milieu bactérien et l’observation des mouvements passifs desdites microbilles inertes au sein d’un milieu bactérien permet de discriminer des phénomènes et des temps caractéristiques lors de la cinétique de croissance de biofilms de bactéries, par exemple de P. aeruginosa et de S. aureus.
Les tableaux 5 à 13 ci-dessous, récapitulent les paramètres des expériences et des séries d’images correspondantes
Exemple 2 : exemple de procédé de suivi de particules
La CIN nécessite utilise des images numériques qui peuvent traduire une information sur le placement des points matériels de la surface du matériau étudié. Cette information peut être matérialisée par un marquage de niveaux de gris. Pour de nombreux matériaux de l’ingénierie et pour les matériaux vivants durs de type os, l’application au préalable d’un mouchetis à la surface des échantillons à tester est requise. Les matériaux vivants possèdent parfois un grain naturel dû à leur texture qui rend propice l’utilisation de la corrélation d’images numériques. C’est le cas, par exemple, pour les images de biofilms prises via un microscope (Mathias and Stoodley, 2009) ou pour les tissus mous de la jambe (Bouten, 2009).
Néanmoins, l’utilisation de la texture propre du matériau vivant pour obtenir une information quantitative sur son comportement mécanique peut comporter des biais. Par son caractère vivant, ce type de matériau est susceptible de réagir de manière active au stress mécanique induit par la sollicitation lors du test. Dans la présente des microbilles passives sont disposées de manière aléatoire au sein du matériau. La CIN peut être avantageusement utilisée à des fins de suivi de particules incorporées dans un milieu hétérogène et dynamique. Le milieu étudié a été déposé dans un contenant de faible volume et qui permet l’observation au microscope optique inversé sans sollicitation. Les mouvements libres des billes situées directement au fond du contenant sont observés. Des séries d’images ont été enregistrées via la sortie vidéo du microscope inversé
Le mouvement brownien consiste en un mouvement perpétuel (pas d’amortissement dû à des phénomènes de frottement), sans orientation privilégiée de particules micrométriques dans un fluide. Ce sont les collisions incessantes de la particule avec les molécules du fluide qui entraînent le déplacement de la particule colloïde. Dans ce cas, la force motrice est thermique, avec une énergie de l’ordre de kBT, kB étant la constante de Boltzmann et 71a température, exprimée en Kelvin (Wirtz, 2009). Le mouvement brownien est lié à la probabilité de choc avec les molécules du solvant. En moyenne, la particule reste immobile puisqu’elle va aussi souvent dans l’une direction que dans l’autre.
Pour un mouvement brownien pur, la moyenne arithmétique des déplacements est nulle (Qian et al., 1991 ). Ce qui caractérise un mouvement brownien est la moyenne quadratique des déplacements, en anglais“Mean Square Displacement” (MSD). Il a été démontré dans la littérature que cette grandeur est dépendante des caractéristiques du milieu contenant les microbilles. Pour une diffusion brownienne pure, le déplacement carré moyen des particules de rayon a varié linéairement en fonction de l’intervalle de temps de mesure At du déplacement. Le coefficient de linéarité dépend de paramètres mécaniques du fluide dans lequel diffusent les particules. La relation entre le MSD et l’intervalle de temps At pour une trajectoire bidimensionnelle r(t) = ( x(t ), y(f)) est donnée par :
D est le coefficient de diffusion d’Einstein. Il est relié à la viscosité dynamique h du solvant.
¼ T
ïDa
Ces équations sont pour un mouvement brownien non biaisé. Par ailleurs, l’allure de la courbe du MSD des particules en fonction de l’intervalle de temps de déplacement peut être caractéristique du milieu dans lequel sont plongées les microbilles. Pour un mouvement qualifié de sous-diffusif, le MSD est proportionnel
Pour un mouvement dit super-diffusif, le MSD est proportionnel à
Plus l’intervalle de temps élevé, plus la barre d’erreur peut être grande. En effet, plus l’intervalle de temps entre deux positions est grand, moins on a de termes pour calculer la moyenne.
La figure 19 représente trois schémas de variation du MSD en fonction du temps et du mouvement : brownien, super-diffusif ou sous-diffusif
Exemple 3 : exemple de procédé de suivi de particules dans un exemple de matériau, de localisation de région d’intérêt, de réduction de la région d’intérêt et de validation de la métrologie du suivi de particules
. Suivi de particules
Les billes/particules ont été observées au microscope optique à l’aide d’un objectif x40 (grossissement x400). Il s’agissaient de billes/particules identiques à celles utilisées dans l’exemple 1. Le grossissement x400 a permis d’avoir un bon compromis entre la résolution de l’information sur les billes (les billes étaient alors codées sur 10 pixels (px) de diamètre) et le nombre de billes visibles dans une image. Des séries de quelques milliers d’images ont été enregistrées. Les billes ont été suivies individuellement à l’aide d’un algorithme de Comparaison d’image numérique (CIN). La formulation de la CIN dans sa version locale a été utilisée: on s’intéresse à une portion de l’image réduite à un carré de 51x51 px2 autour d’une bille et la zone est calculée dans son entièreté. La cinématique du déplacement reste simple et a été définie sur cette portion de l’image. Elle est composée d’une composante de déplacement verticale et d’une composante de déplacement horizontale. Pour chaque bille, l’algorithme de corrélation d’images mesure le déplacement en pixels entre une image de référence et une image qui suit dans la série, ceci de manière séquentielle. Ce calcul a été effectué le long de la série d’images afin de reconstituer la trajectoire de la bille. Ce tracé par CIN permet un suivi rapide, idoine et dont l’erreur est connue. Si l’algorithme montre des difficultés à converger, différentes explications sont possibles :
• la bille est sortie du cadre de l’image ;
• la bille est sortie de la profondeur de champ, l’image déformée est alors trop différente de l’image initiale ;
• la bille a effectué un trop grand déplacement entre l’image initiale et
l’image déformée,
• l’algorithme aurait alors besoin d’une initialisation non nulle.
Pour le premier cas, les coordonnées de la bille permettent de considérer que la trajectoire sort de l’image. Pour les deux autres cas, le calcul est initialisé avec une image précédente dans la série puis le calcul reprend entre cette nouvelle image initiale et les images qui la suivent.
2. Localisation d’une région d’intérêt
Tel que mentionné ci-dessus, le suivi des billes/ particules a été également effectué individuellement pour chaque particule. L’objectif de cette partie a été de détecter la présence de billes dans l’image afin de restreindre la région d’intérêt autour d’une bille. Dans chaque série d’images, on a observé un nombre de billes allant de quelques dizaines à quelques centaines. Il a été convenu de pouvoir détecter les billes de manière systématique. Pour cela, un processus automatique basé sur des techniques de traitement d’images a été implémenté. Pour chaque séquence d’images, la première image est ouverte. Le centre d’une bille parmi l’image a été sélectionné manuellement par l’utilisateur. Une imagette Imagetteb de 20x20 px2 de cette bille et de la zone environnante a été créée. Afin d’enlever la spécificité intrinsèque due au choix d’une bille particulière, une nouvelle image lmagettev a été créée à partir de l’imagette sélectionnée. Cette nouvelle image virtuelle était composée d’une combinaison linéaire de transformations simples de l’imagette de base. La nouvelle image virtuelle est ainsi créée selon la combinaison suivante :
où Imagetteb est l’imagette brute de la zone autour d’une bille, lmagetteT b est la transposée de l’imagette brute, lmagetteRh b correspond à la symétrie horizontale de l’imagette brute et lmagetteRv b est la symétrie verticale de l’imagette brute. Ces transformations ont apporté une correction sur la symétrie du motif codant la bille. La figure 20 représente deux images d’une particule, l’image de gauche correspond à l’image brute et l’image de droite à l’image après transformation. Basé sur la librairie OpenCV, l’algorithme de localisation des zones d’intérêt procède à la recherche des maximums de corrélation entre l’image entière et l’imagette lmagettev qui représente une bille indépendante. Les maximums de corrélation peuvent être présents sur plusieurs pixels aux alentours d’une bille. Le centre de gravité de chacun des clusters formés par l’ensemble des maximums de corrélation autour d’une bille a été choisi pour désigner le centre de la bille, moyennant une translation de la moitié de la largeur et de la hauteur de l’imagette. Ce processus permet de détecter les centres des billes présentes dans l’image. La figure 21 correspond à une image sur laquelle sont détectées des particules (ronds noirs). 3. Réduction de la zone d’intérêt
Les images du fond des puits représentent une vue 2D des billes tri dimensionnelles. Étant donnée la sphéricité des billes, celles-ci ne sont pas codées sur des niveaux de gris homogènes. En effet, le centre des billes a été codé sur des pixels plus clairs de telle façon que l’image d’une bille est vue comme une couronne sombre. Afin de s’affranchir des pixels les plus clairs situés au centre, la zone d’intérêt prise en compte dans l’algorithme de corrélation d’images a été réduite à la couronne formée par les pixels sombres du pourtour de la bille. La bille a été codée sur 10 pixels (px) de diamètre. Sur la région d’intérêt de taille 51x51 px2, les pixels clairs dans un rayon de 3 px autour du centre de la bille ont été masqués. De même, les pixels codant le fond du puits au-delà de 13 px autour du centre de la bille ont été masqués. La figure 22 est une représentation d’une zone d’intérêt (particule) utilisé pour suivre les déplacements des particules, notamment par corrélation d’images. Les pixels clairs du centre de la bille ont été masqués car ils n’apportent pas d’information pertinente pour le calcul par CIN. De même, les pixels de fond du puits au-delà d’une petite périphérie autour de la bille n’ont pas pris en compte dans le calcul. 4. Validation de la métrologie du suivi de particules
Dans le cas où le capteur est parfait (et que la source de lumière est constante), les images d’une scène immobile sont identiques. Réellement, les images prises par le système de mesure optique peuvent être altérées par un bruit de capteur inhérent au fonctionnement électronique de prises d’images. Le bruit engendré par le capteur peut se propager dans la mesure du déplacement calculé par CIN et impacter directement la résolution de mesure. Pour calculer le bruit de capteur, 1000 images d’un échantillon de billes séchées sur une boite de pétri ont été acquise. La mise au point sur les agrégats de billes séchées a été légèrement décalée en profondeur pour créer volontairement un flou qui permet de lisser le gradient de niveaux de gris sur les images. Pour chaque pixel p, de position (xi, yi ), la moyenne des niveaux de gris Imi ainsi que la variance Ivi sur les 1000 images a été calculé. Pour une série d’images de taille 300x200 px2, 60000 couples (Imi, Ivi) ont été calculés. Ils ont été reportés sur un graphe variance fonction de la moyenne du niveau de gris du pixel en question. La dispersion des points de mesure dans le repère (Im, Iv) a montré que, comme attendu, les pixels les plus clairs présentaient le plus de variabilité. Ce profil de graphe (Im, Iv) était attendu pour les caméras utilisées en mesure de champs. Le nuage de points forme un faisceau orienté selon une droite affine. D’autre part, le bombé au centre du faisceau était dû à des mouvements de solide rigide (Grediac and Sur). Pour être conservatif, l’écart-type des niveaux de gris sur l’image a été arbitrairement choisi comme étant le maximum de variance observée sur cet exemple. On a donc : Les images étaient codées en 16 bits. La résolution de mesure en déplacement a été ensuite déterminée par l’équation suivante (Réthoré et al., 2008; Blaysat et al., 2016) :
De manière pratique, les valeurs de la matrice de corrélation A/fyfont en sorte qu’en moyenne, la résolution de mesure du calcul par CIN pour les deux composantes du déplacement était :
pour la composante horizontale du déplacement
¾ = 0.0464 par
pour la composante verticale du déplacement
La figure 23 correspond à une image illustrant le bruit de fond du capteur. Tel que représenté, la mise au point a été volontairement décalée pour lisser les gradients de niveaux de gris de l’image et supprimer/réduire le bruit de fond. La figure 24 est un diagramme représentant un nuage de points représentant la variance en fonction de la moyenne de la distribution du niveau de gris d’un pixel sur 1000 images“identiques”.
Tel que démontré, dans le présent exemple la CIN a été utilisée pour le suivi idoine de billes/particules pour lesquelles les variations et/ou erreurs et/ou imprécisions, par exemple liées au bruit de fond, en termes de mesure de déplacement a été maîtrisée. En outre, la prise en compte de l’hétérogénéité matérielle a été assurée par le suivi de plusieurs microbilles dispersées au sein du milieu. . Validation dans différent type de milieux
Des essais de validation ont été effectués avec des liquides étalons qui avaient pour but de simuler le matériau biofilm. Plusieurs essais préliminaires de calculs de mouvement libre de billes se déplaçant dans un milieu homogène de viscosité connue ont été réalisés. Dans cet exemple, le mouvement des microbilles de 1 pm dans des liquides standards, de viscosité connue a été étudié. Une première solution de glycérol à 68% (pourcentage massique) a été étudiée. Pour cette solution, les valeurs de viscosité sont tabulées (Takamura et al., 2012). Entre 20°C et 25°C, la viscosité d’une telle solution était d’environ 16,4 mPa.s±4,8 mPa.s. La valeur expérimentale de la viscosité pour ce milieu a été calculée en calculant au préalable le coefficient de diffusion D, obtenu grâce à la courbe MSD = f(At). Ces courbes ont été tracées pour 19 billes diffusant dans la solution de glycérol. En échelle log-log, les pentes des droites sont environ égales à 1 (1 ,05 ± 0,1 ). Les valeurs de MSD étaient donc proportionnelles à At et les billes diffusaient bien selon une tendance aléatoire, sans écoulement, ni confinement. À partir de ces courbes, les valeurs de viscosités calculées pour ces 19 billes étaient en moyenne de 16.6 mPa.s±5 mPa.s. La même démarche a été effectuée pour retrouver la viscosité du milieu BHI (Brain Heart Infusion) utilisé pour les suspensions bactériennes initiales. Bien que la valeur théorique d’une solution de BHI n’était pas connue, l’ordre de grandeur de cette valeur était de 10 3 Pa.s. Le BHI étant fabriqué à partir de la mise en solution d’une poudre dans un grand volume d’eau (37g/L), le liquide qui en résulte a une texture proche de celle de l’eau. De manière analogue à la démarche mise en place pour la solution de glycérol, les courbes de MSD en fonctions du At ont été tracées pour 39 billes diffusant dans une solution de BHI. Les mouvements des billes dans cette solution sont de type mouvement brownien.
Les courbes de MSD en fonction de l’intervalle de temps ont confirmé les observations qualitatives des trajectoires (Figures 24 et 25). En effet, le MSD est dépendant de At. La viscosité expérimentale mesurée par cet essai était de 3,2 mPa.s ± 1 ,3 mPa.s. Ces premiers essais ont permis de confirmer la mesure d’un paramètre mécanique en conditions expérimentales, pour des matériaux inertes de viscosité faible.
Des mesures ont été faites dans des milieux de viscosités plus élevées, deux autres liquides standards cent fois plus visqueux ont été utilisés. Les viscosités de ces deux échantillons s’échelonnent environ entre 500 et 700 mPa.s. Les liquides utilisés ont pour référence D500 et N350 (Sigma-Aldrich) de viscosité respective 498,4 mPa.s et 712,9 mPa.s (valeurs à 25°C). Des trajectoires de billes ont été extraites de séries d’images. Un séchage des billes pour ne pas modifier la viscosité du liquide avec la solution de billes a été réalisé afin d’éviter des interactions physico-chimiques supplémentaires entre les billes et le liquide. Des observations de billes diffusant dans le liquide N350 ont montré des trajectoires de billes qui semblent emmenées par un écoulement de fluide non volontaire (figure 26). Les courbes de MSD, en fonction de l’intervalle de temps considéré, associées aux trajectoires de six billes dans ce milieu étaient typiques de milieux visqueux avec présence d’écoulement (figure 27). D’autre part, pour ces viscosités, les déplacements moyens d’une bille de 1 mhi étaient plus petits que pour les liquides étudiés précédemment. Les trajectoires de billes dans le liquide D500 étaient des mouvements de très faibles amplitudes. La fréquence d’acquisition des images a donc été d’augmentée afin de capter des changements de direction des billes, de manière plus fine (figure 29). La Figure 28 montre une composante du déplacement d’une bille piégée dans le liquide D500 pour différentes fréquences d’acquisition. La composante horizontale du déplacement de la bille était augmentée lorsque la fréquence d’acquisition des images était plus forte
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Claims

Revendications:
[Revendication 1] Procédé de détection et/ou de suivi et/ou caractérisation de la formation d’un biofilm comprenant les étapes suivantes
a) réalisation d’une succession temporelle d’observations d’une solution comprenant au moins un micro-organisme et une pluralité de particules pendant que la solution est maintenue dans des conditions permettant le développement d’un biofilm par ledit au moins un micro-organisme, b) détection de la présence du biofilm et/ou une caractérisation de la
cinétique de formation du biofilm sur la base d’une analyse statistique comparative des déplacements des particules observées lors des différentes observations.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 , dans lequel chaque observation comprend, pour chaque particule d’un ensemble de particules observées lors de ladite observation, une détermination d’une trajectoire correspondant à des déplacements successifs effectués par ladite particule lors de ladite observation.
[Revendication 3] Procédé selon la revendication 1 ou 2 comprenant une analyse statistique globale des déplacements effectués par les particules observées au cours de chaque observation et un calcul de temps caractéristiques de la formation du biofilm sur la base des résultats de l’analyse statistique globale.
[Revendication 4] Procédé selon la revendication 3, dans lequel l’analyse statistique globale comprend un calcul pour chaque observation d’une valeur d’au moins un paramètre statistique d’une distribution des déplacements effectués respectivement par les particules de la pluralité de particules et une analyse des variations en fonction du temps des valeurs dudit au moins un paramètre statistique obtenues pour la succession d’observations.
[Revendication 5] Procédé selon la revendication 4, dans lequel le paramètre statistique est l’écart type de la distribution des déplacements effectués par les particules observées lors de ladite observation
[Revendication 6] Procédé selon la revendication 1 ou 2 comprenant en outre une analyse statistique des contributions individuelles des particules observées à partir des déplacements effectués par chaque particule observée au cours de chaque observation et une identification d’au moins un pourcentage de particules effectuant un même type de mouvement sur la base des résultats de l’analyse statistique des contributions individuelles.
[Revendication 7] Procédé selon la revendication 6, dans lequel l’analyse statistique des contributions individuelles des particules comprend pour chaque observation :
un calcul, pour chaque trajectoire suivie par une particule observée lors de ladite observation, d’un vecteur composé de valeurs de paramètres caractéristiques des déplacements définissant la trajectoire concernée; une constitution d’une matrice à partir des vecteurs calculés pour les particules observées lors de ladite observation ;
une décomposition de ladite matrice par une analyse en composantes principales ;
une identification d’au moins une composante principale prépondérante parmi les composantes principales résultant de la décomposition;
- une génération d’un diagramme en au moins une dimension des projections des différents vecteurs correspondant aux trajectoires des particules observées sur ladite au moins une composante principale prépondérante identifiée.
[Revendication 8] Procédé selon la revendication 7 dans lequel ledit au moins un paramètre caractéristique est choisi dans le groupe comprenant
- longueur c1 de la diagonale du rectangle comprenant ladite trajectoire selon la formule suivante :
cl
= ( m ax ( cumsum (A-) )— m\n(cumsum(X)))2 + (ma
où max(71) retourne la plus grande composante du vecteur A, min(71) retourne la plus petite composante du vecteur 71 et cumsum(B) retourne la somme cumulée du vecteur B.
- la vitesse moyenne c2 sur la trajectoire :
où mean(71) retourne la moyenne des composantes du vecteur 21 - l'écart type c3 de la distribution des vitesses de chaque particule à chaque point de la trajectoire
où std(74) retourne l’écart type des composantes du vecteur 4
- l'écart-type de la distribution des trajectoires selon l’axe transversal c4 ou vertical c5 :
c4 = std(X )
c5 = std(Y )
où std(74) retourne l’écart type des composantes du vecteur !
- la distribution asymétrique des trajectoires selon l’axe transversal c6 ou vertical c7 :
c 6 = skw(X )
cl = skw(Y )
où skw(74) retourne le coefficient d’asymétrie des composantes du vecteur 4
[Revendication 9] Procédé selon la revendication 7 ou 8, comprenant en outre une identification d’au moins un cluster de points dans ledit diagramme et un calcul dudit pourcentage de particules à partir d’un pourcentage de points appartenant à un cluster donné.
[Revendication 10] Procédé selon la revendication 9, comprenant une analyse d’une évolution au cours du temps dudit pourcentage de particules pour les différentes observations.
[Revendication 1 1 ] Procédé selon la revendication 5, comprenant le calcul l’écart type de la distribution des déplacements des particules selon la formule suivante :
dans lequel P correspond au vecteur de déplacement des particules sur l’ensemble des observations, m = longueur (P), et P = moyenne(P ).]
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