EP3764808A1 - Procédé séquentiel de fermentation par voie fongique de ressources ligneuses - Google Patents

Procédé séquentiel de fermentation par voie fongique de ressources ligneuses

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EP3764808A1
EP3764808A1 EP19709069.9A EP19709069A EP3764808A1 EP 3764808 A1 EP3764808 A1 EP 3764808A1 EP 19709069 A EP19709069 A EP 19709069A EP 3764808 A1 EP3764808 A1 EP 3764808A1
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EP
European Patent Office
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fermentation
wood
food product
edible
fungus
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EP19709069.9A
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German (de)
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Inventor
Agnès SAINT-POL
Jean-Philippe Deslys
Gwenaël POSTEC
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Hipofi
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Hipofi
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
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Publication date
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source

Definitions

  • the present invention relates to the valuation of co-products of the forestry industry; more specifically, it aims to develop a process improving the digestibility of wood to make it suitable for consumption by mammals.
  • the present invention thus also relates to a food having advantageous nutritional properties, especially for farm animals.
  • the present invention provides an original process consisting of a sequence of fungal fermentations to make edible woody resources.
  • a first fermentation at room temperature with an edible lignivorous fungus for a few weeks makes it possible to obtain a substrate rich in fungal compounds of interest and depleted in lignin. Stopping this fermentation at the optimum time by a suitable process provides a substrate suitable for a second fermentation of a few days by a high added value edible mushroom.
  • the product thus obtained contains enzymes and fungal compounds of interest and can be used directly as a dietary supplement.
  • Lignin is the second most abundant renewable biopolymer on Earth, and the only source of aromatic carbon generated in nature (on average 20% in hardwoods and 30% in conifers) (Howard, Abotsi, L, & Howard, 2003). Its main functions are to provide rigidity, waterproofness and resistance to decomposition. Lignin is a three-dimensional amorphous polymer composed of methoxylated phenylpropane structures and the isolated lignins generally have a molecular weight of about 2000 to 5000 Da (Wertz, 2010).
  • Lignin has several relatively low value-added applications such as:
  • the present invention also relates to the product obtained by this process which has remarkable nutritional properties because of its composition of vitamins, minerals, essential amino acids and especially because of its content of high value enzymes for animal feed, especially in xylanases. , amylases and proteases.
  • the substrate, or starting material, of the process according to the invention comprises wood residues such as chips (residue size between 1 mm and 2 cm), sawdust (residue size between 1 mm and 2 cm). ), or wood flour (residue size between 20 ⁇ m and 1 mm); depending on the quality of the wood and its digestibility by the lignivorous fungus, the substrate may also include coarser pieces of wood (greater than 2 cm in size).
  • wood residues having different sizes for example between 40 and 80% by weight of sawdust and between 20 and 60% by weight of flour. wood possibly in the presence of larger pieces; this difference in particle size promotes a satisfactory aeration of the substrate without the need for mechanical agitation during the first fermentation.
  • tannins contribute to the defense system that plants have developed against fungi and limit the digestibility and protein absorption of feed rations (Gilani et al., 2017) (Sharma & Arora 2015).
  • the wood residues are mixed with water and heated to a temperature between 50 and 120 ° C, preferably at about 90 ° C; the water is then removed by filtration, for example, on a cellulose filter until a moisture content of between 55 and 70% is reached (Girmay et al., 2016) (Hoa & Wang n.d.).
  • the substrate of the first fermentation of the process according to the invention is prepared by adding, to the wood residues, an alkalizing mineral supplement in an amount of between 1 and 5% by dry weight, preferably between 2 to 3% by dry weight, more preferably about 2.5% by dry weight relative to the total weight of wood residues used in the substrate.
  • the substrate comprising wood residues and optionally an alkalizing mineral supplement is treated to remove any contaminating microorganisms, or strengthen its alkalizing properties if necessary;
  • the substrate is heated before the implementation of the first fermentation; the heating means is chosen by those skilled in the art in particular as a function of the volume of substrate to be treated.
  • An alternative pretreatment mode consists in directly treating the wood residues by a gentle heat treatment using the principle of tyndallization with a 60 to 80 ° C core sequence for at least one hour, two to three times in succession at 24 hours. interval, allowing it to cool naturally in the meantime, thereby destroying the vegetative forms of the contaminants and forcing spore germination before destroying new vegetative forms without the possibility of new spomlation; this mild heat treatment is followed by a lactic fermentation to limit the risk of subsequent uncontrolled contamination while remaining in "msmila" conditions (for example with spraying a mixture of bacterial strains of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • the whole culture is regrind / homogenized to serve as a basis for the second fermentation.
  • This food product also has the advantage of containing essential amino acids at a level of, expressed in mg / g of total protein:
  • Another major advantage of the sequential fermentation process according to the invention is based on the use of the fermented product as an immobilization / adsorption support for the secreted enzymes. Indeed, usually, the incorporation of the fermented product into the animal feed requires its stabilization microbiological and enzymatic for the preservation of the product.
  • the immobilization of enzymes on insoluble support of organic and inorganic origin is described and pure substrates of carbohydrate nature such as cellulose, starch, agar-agar, alginates have been used (Krajewska 2014).
  • the method developed here proposes to use the fermentation product composed of residual lignocellulose and dehydrated mycelium as an immobilization support replacing the traditional supports described above. Surprisingly, the measured enzymatic activity is very well preserved and stable at room temperature after simple dehydration of the fermented product.
  • Figure 1 A. First fermentation; growth of Pleurotus ostreatus on sawdust after 40 days of incubation at 28 ° C in the absence or presence of mineral supplement (CM).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) ash.
  • the activities are expressed in units (pmol product generated / min) / g dry fermented product.
  • Figure 9 measurement of laccase activity of the product from the first fermentation (histogram on the left) and that of the product from the second fermentation (right histogram).
  • the fermented product is stabilized by dehydration: it is placed after homogenization by mechanical stirring in an enclosure at 24 ° C. until a percentage of moisture of 11-12% is obtained, corresponding to a water activity (a w ) less than 0.6 and preventing the growth of microorganism (Assamoi et al 2009), then it is stored at 4 ° C or room temperature.
  • the model chosen for the development of the process was based on the use of coarsely crushed oak sawdust and hot aqueous extraction. After moisture adjustment by filtration and sterilization, the substrate is inoculated with Pleurotus ostreatus and placed for 40 days at 28 ° C to allow the growth of the fungus.
  • the growth of Pleurotus ostreatus on oak sawdust could be optimized by adding a naturally available and readily available mineral supplement (ash).
  • FIG. 1A shows different culture conditions carried out in the absence or in the presence of the mineral supplement.
  • the sequential fermentation process was applied to Aspergillus awamori, a mold of the genus Aspergillus used in the traditional Japanese diet.
  • FIG. 6B shows these same residual activities after storage at 4 ° C. of the fermented and dehydrated product for one, two, three and four weeks. No significant loss of activity is observable regardless of the activities measured.
  • beta-glucans major constituents of the wall of filamentous fungi

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère constitué d'une séquence de fermentations par voie fongique permettant de rendre comestibles des ressources ligneuses; l'invention se rapporte également au produit alimentaire obtenu par ce procédé et à son utilisation.

Description

Procédé séquentiel de fermentation par voie fongique de ressources ligneuses
La présente invention se rapporte à la valorisation de coproduits de l’industrie sylvicole ; plus spécifiquement, elle a pour objet la mise au point d’un procédé améliorant la digestibilité du bois afin de le rendre propre à la consommation par des mammifères. La présente invention se rapporte donc également à un aliment ayant des propriétés nutritionnelles avantageuses notamment pour les animaux d’élevage.
En raison de son importante teneur en lignine qui le rend indigeste (20 à 30%), le bois n’a quasiment pas de débouché alimentaire. La présente invention propose un procédé original constitué d’une séquence de fermentations par voie fongique permettant de rendre comestibles des ressources ligneuses. En pratique une première fermentation à température ambiante avec un champignon comestible lignivore pendant quelques semaines permet d’obtenir un substrat riche en composés fongiques d’intérêt et appauvri en lignine. L’arrêt de cette fermentation au moment optimum par un procédé adapté permet d’obtenir un substrat apte à une seconde fermentation de quelques jours par un champignon comestible à haute valeur ajoutée. Le produit ainsi obtenu contient des enzymes et des composés fongiques d’intérêt et peut être utilisé directement en tant que supplément alimentaire.
La France possède la quatrième forêt d’Europe en superficie (17 millions d’hectares en métropole), derrière la Suède, la Finlande et l’Espagne, mais la récolte, depuis les années 80, ne dépasse pas la moitié de la production annuelle de bois (Alexandre, 2017). Ce sont donc entre 30% et 40% des superficies françaises et européennes qui sont couvertes de forêts. En France, 70% des forêts sont constitués d’arbres à feuilles caduques et 30% à feuilles persistantes avec une prépondérance du chêne sur l’ensemble des essences représentées et un accroissement brut annuel de la forêt française de 85 millions de m3 en bois fort de tiges entre 2001 et 2009 (Agreste 2012) ; ce chiffre est même porté à 120 Mm3 si on inclut les bois de branchaison. Environ 55 millions de m3 ont été récoltés chaque année durant la même période pour une utilisation répartie entre le bois d’énergie et le bois d’œuvre et d’industrie (Agreste 2012).
Les procédés de première transformation associés à cette exploitation génèrent des résidus ou coproduits en quantité massive. Le rendement industriel dans une scierie qui fabrique des planches est d’environ 50% (Alexandre, 2017), l’autre moitié appelée connexes de bois (écorces, sciures, plaquettes, délignures,...) ne trouve que des débouchés à faible valeur ajoutée pour laquelle il serait utile de trouver de nouvelles voies de valorisation (Alexandre, 2017). La lignine est le deuxième biopolymère renouvelable le plus abondant sur la Terre, et la seule source de carbone aromatique généré dans la Nature (en moyenne 20% chez les feuillus et 30% chez les résineux) (Howard, Abotsi, L, & Howard, 2003). Ses principales fonctions sont d'apporter de la rigidité, une imperméabilité à l'eau et une grande résistance à la décomposition. La lignine est un polymère amorphe tridimensionnel composé de structures phénylpropane méthoxylées et les lignines isolées ont généralement un poids moléculaire d’environ 2000 à 5000 Da (Wertz, 2010).
Comme biopolymère, la lignine est inhabituelle en raison de son hétérogénéité et de son manque de structure primaire définie, elle constitue la « colle » qui maintient les parois cellulaires ensemble. Les polymères de lignine rendent la paroi cellulaire rigide et imperméable, permettant le transport de l’eau et des éléments nutritifs à travers le système vasculaire et protégeant les plantes de l’invasion microbienne. La lignine est extrêmement résistante à la dégradation et, en formant des liaisons à la fois avec la cellulose et les hémicelluloses, elle crée une barrière à toutes les solutions ou enzymes (Wertz, 2010), constituant ainsi un des obstacles majeurs à la conversion de la biomasse lignocellulosique en carburants et produits chimiques biobasés.
Dans la nature, la dégradation efficace de la lignine au cours du phénomène de pourriture du bois est possible principalement par les champignons basidiomycètes de la pourriture blanche du bois (Placido & Capareda, 2015), qui produisent des enzymes spécifiques telles que les laccases, Manganèse Peroxydase et lignine peroxydase. De nombreux champignons de la pourriture blanche attaquent simultanément la lignine, les hémicelluloses et la cellulose, tandis que d’autres champignons de la pourriture blanche attaquent la lignine de manière sélective. Contrairement aux champignons de la pourriture blanche, les champignons de la pourriture brune peuvent dégrader les polysaccharides du bois, mais pas la lignine oxydée. Les Ascomycètes sont avant tout capables de dégrader la cellulose et les hémicelluloses, mais leur capacité de dégrader la lignine est limitée (Wertz, 2010).
La lignine a plusieurs applications de relativement basse valeur ajoutée telles que :
- combustible, fournissant plus d’énergie une fois brûlée que la cellulose ;
- additif dans le ciment, en particulier comme agent retardateur de prise du ciment ;
- additif dans l’asphalte, en particulier pour ses caractéristiques anti-oxydantes ;
- liant dans les aliments pour animaux pour plastifier et tenir ensemble les granulés ;
- additif dans les granulés combustibles basés sur la biomasse (Wertz, 2010). Les développements de procédés de traitement et de fermentation de composés lignocellulosiques connaissent un essor depuis plusieurs années notamment pour la production de biocarburants, d’enzymes, de pigments et de métabolites secondaires. (Guerriero et al. 2016) (Dashtban, Schraft, & Qin, 2009) (Soccol et al. 2017). La grande majorité de ces développements est réalisée à partir de composés lignocellulosiques issus de l’agriculture tels que les pailles, les sons, tourteaux (Soccol et al., 2017) et très peu se basent sur l’utilisation de substrats issus de l’exploitation forestière (Thomas, Larroche, & Pandey, 2013) (Ferreira, Mahboubi, Lennartsson, & Taherzadeh, 2016).
Pourtant, sur une planète avec des ressources finies et une population en augmentation continue, la mise en place d’une économie circulaire avec une optimisation de l’utilisation des bioressources à des fins alimentaires doit être une priorité (FAO, 2016). Les terres agricoles ne sont pas indéfiniment extensibles au détriment de la forêt car sinon c’est le poumon de la planète qui serait mis à mal.
La présente invention propose donc la mise au point d’un procédé qui permettrait pour la première fois d’utiliser du bois à des fins alimentaires ; ce procédé est constitué d’une séquence de fermentations par voie fongique permettant de rendre comestibles des ressources ligneuses.
La présente invention se rapporte également au produit obtenu par ce procédé qui présente des propriétés nutritionnelles remarquables de par sa composition en vitamines, minéraux, acides aminés essentiels et surtout de par sa teneur en enzymes à haute valeur pour l’alimentation animale, notamment en xylanases, amylases et protéases.
En pratique, une première fermentation à température ambiante avec un champignon comestible lignivore pendant quelques semaines permet d’obtenir un substrat riche en composés fongiques d’intérêt et appauvri en lignine (semblable au niveau de lignine retrouvé dans la paille). L’arrêt de cette fermentation permet d’obtenir un substrat apte à une seconde fermentation de quelques jours par un champignon comestible à haute valeur ajoutée. Cette première fermentation permet le développement d’un ascomycète tel que Aspergillus oryzae, dans le cadre d’une deuxième fermentation, sur des sciures de bois fermentées dans des conditions où l’ajout d’éléments nutritifs azotés est nul. A l’issue de la seconde fermentation, une stabilisation des enzymes secrétées contenues dans le produit fermenté obtenu est effectuée par déshydratation à basse température.
Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère comprenant les étapes de : 1) optionnellement, prétraitement des résidus de bois tel qu’un broyage et/ou une réduction de la teneur en tanin du bois et/ou l’ajout d’un complément minéral alcalinisant et/ou un traitement thermique destiné à éliminer d’éventuels contaminants et/ou un traitement thermique doux suivi d’une fermentation lactique ;
2) première fermentation d’un substrat composé de résidus de bois et comprenant optionnellement de 1 à 5% en poids sec d’un complément minéral alcalinisant, par un champignon lignivore comestible pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du substrat avant fructification par ledit champignon ; cette durée varie selon la souche de champignon utilisée et la température mise en œuvre ; à titre d’exemple, selon un mode de réalisation optimisé pour Pleurotus ostreatus, cette première fermentation est conduite pendant 30 à 40 jours à une température de 28°C ; si une température inférieure est mise en œuvre, il conviendra de prolonger le temps de fermentation ;
3) arrêt de la première fermentation par inactivation thermique dudit champignon lignivore comestible et broyage du produit obtenu à l’issue de ladite première fermentation ; de préférence, le broyage est réalisé avant l’inactivation thermique ;
4) seconde fermentation du produit obtenu à l’étape 3) par un champignon du genre Aspergillus pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du produit obtenu à l’étape 3) avant sporulation dudit champignon du genre Aspergillus ; à titre d’exemple, selon un mode de réalisation optimisé pour Aspergillus oryzae, cette seconde fermentation est conduite pendant 3 à 4 jours à une température optimale de croissance à 30°C ; si une température inférieure est mise en œuvre, il conviendra de prolonger le temps de fermentation ;
5) optionnellement, stabilisation du produit obtenu à l’issue de ladite seconde fermentation par déshydratation.
Le substrat, ou matériau de départ, du procédé selon l’invention comprend des résidus de bois tels que des copeaux (taille des résidus comprise entre 1 mm et 2 cm), de la sciure (taille des résidus comprise entre 1 mm et 2 cm), ou encore de la farine de bois (taille des résidus comprise entre 20 pm et 1 mm) ; selon la qualité du bois et sa digestibilité par le champignon lignivore, le substrat peut aussi comprendre des morceaux de bois plus grossiers (d’une taille supérieure à 2 cm).
Afin de mettre en œuvre la première fermentation du procédé selon l’invention, il est toutefois préférable de disposer de résidus de bois dont la taille maximale est inférieure ou égale à 2 cm ; ainsi, si les résidus de bois disponibles ont une taille supérieure à 2 cm, un broyage préalable est réalisé. Toute technique de broyage permettant de réduire la taille des résidus de bois peut être utilisée.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, il est avantageux de mélanger des résidus de bois ayant des tailles différentes, par exemple, entre 40 et 80% en poids de sciure de bois et entre 20 et 60% en poids de farine de bois éventuellement en présence de morceaux plus gros ; cette différence de granulométrie favorise une aération satisfaisante du substrat sans qu’il soit nécessaire de procéder à une agitation mécanique au cours de la première fermentation.
Toute essence de bois peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention qu’il s’agisse de bois d’arbres résineux ou de feuillus comme démontré dans la partie expérimentale qui suit ; de préférence, il s’agit d’essences exploitées industriellement. A titre d’exemple, les essences d’arbres résineux utilisables sont le sapin, l’épicéa, le pin maritime, le douglas ; celles d’arbres feuillus utilisables sont le chêne, le peuplier, le hêtre, l’acacia, le châtaigner, l’alisier.
Selon l’essence de l’arbre dont provient le bois utilisé, il peut être préférable de réduire la teneur en tanins de son bois ; les tanins participent en effet au système de défense que les plantes ont développé contre les champignons et limitent la digestibilité et l’absorption des protéines des rations alimentaires des animaux d’élevage (Gilani et al. 2017) (Sharma & Arora 2015). Pour cela, les résidus de bois sont mélangés à de l’eau et chauffés à une température comprise entre 50 et l20°C, de préférence à environ 90°C ; l’eau est ensuite éliminée par filtration, par exemple, sur filtre de cellulose jusqu’à obtention d’un taux d’humidité compris entre 55 et 70% (Girmay et al. 2016) (Hoa & Wang n.d.).
L’objectif de la première fermentation est principalement la dégradation de la lignine présente dans les résidus de bois et la libération de nutriments qui seront consommés dans le cadre de la seconde fermentation.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat de la première fermentation du procédé selon l’invention est préparé par ajout, aux résidus de bois, d’un complément minéral alcalinisant en une quantité comprise entre 1 à 5% en poids sec, de préférence entre 2 à 3% en poids sec, encore préférentiellement d’environ 2,5% en poids sec par rapport au poids total de résidus de bois utilisés dans le substrat.
L’ajout du complément minéral alcalinisant s’avère avantageux en prétraitement des bois difficiles à digérer, par exemple, ceux utilisés pour leur caractère imputrescible (voir le tableau 1 de la partie expérimentale). Ces bois sont généralement ceux des feuillus, par exemple, le chêne et l’acacia. Lorsqu’il est ajouté aux résidus de bois, le complément minéral alcalinisant est de préférence introduit avant un éventuel chauffage humide tel que décrit plus tôt pour favoriser la déstructuration du substrat.
Le complément minéral est alcalinisant, c’est-à-dire qu’il a un pH basique, plus particulièrement un pH supérieur ou égal à 8, de préférence, supérieur ou égal à 9, encore préférentiellement, supérieur ou égal à 10, avant mélange avec les résidus de bois et qu’il permet la préparation d’un substrat dont le pH vaut au moins 7, de préférence 8 avant chauffage. Selon ce mode de réalisation particulier, le complément minéral alcalinisant comprend au moins un minéral alcalinisant qui peut être notamment choisi parmi la potasse, le carbonate de calcium, la soude, l'hydroxyde de calcium, l’hydroxyde de sodium ou l’hydroxyde de potassium.
Préférentiellement, le complément minéral alcalinisant est constitué de cendres issues de la combustion de coproduits de l’industrie du bois (cendres de chaufferies de bois) permettant ainsi d’optimiser leur recyclage.
De préférence, le complément minéral alcalinisant représente un apport de :
- 170 à 330 kg/t de calcium (exprimé sous forme de CaO),
- 20 à 60 kg/t de potassium (exprimé sous forme de K20),
- 25 à 46 kg/t de magnésium (exprimé sous forme de MgO),
- 10 à 61 kg/t de phosphore (exprimé sous forme de P2O5),
- des métaux, dont le Mn, Fe, Cu, Zn qui sont des co-facteurs d’enzymes digestives sécrétées par les champignons, en proportions variables,
et présente un pH, avant mélange avec les résidus de bois, compris entre 10 et 13.
De préférence, le substrat comprenant des résidus de bois et éventuellement un complément minéral alcalinisant est traité pour éliminer les éventuels microorganismes contaminants, voire renforcer ses propriétés alcalinisantes le cas échéant ; selon un mode de réalisation particulier, le substrat est chauffé avant la mise en œuvre de la première fermentation ; le moyen de chauffage est choisi par l’homme du métier notamment en fonction du volume de substrat à traiter.
Un mode de prétraitement alternatif consiste à traiter directement les résidus de bois par un traitement thermique doux en utilisant le principe de la tyndallisation avec une séquence 60 à 80°C à cœur pendant au moins une heure, deux à trois fois de suite à 24h d’intervalle, en laissant refroidir naturellement dans l’intervalle, ce qui permet de détruire les formes végétatives des contaminants et de forcer la germination des spores avant de détruire les nouvelles formes végétatives sans possibilité de nouvelle spomlation ; ce traitement thermique doux est suivi d’une fermentation lactique pour limiter les risques de contamination ultérieure non contrôlée tout en restant dans des conditions « mstiques » (par exemple avec aspersion d’un mélange de souches bactériennes de type Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus et/ou tout autre souche de lactobacille d’intérêt alimentaire avec une fermentation à environ 43°C pendant environ 8h). Un substrat de résidus de bois ainsi préparé est à la fois débarrassé de ses contaminants naturels et plus à même d’être protégé de contaminants indésirables lors de la mise en place de la première fermentation par une souche de champignon lignivore.
Selon un mode de réalisation particulier, aucun autre prétraitement que le broyage, la réduction de la teneur en tanin, l’ajout d’un complément minéral alcalinisant, le traitement thermique destiné à éliminer les éventuels contaminants et/ou un traitement thermique doux suivi d’une fermentation lactique n’est appliqué aux résidus de bois.
Le substrat présente un pourcentage d’humidité compris entre 50 et 70%, de préférence entre 60 et 70%.
Le substrat est inoculé par un champignon lignivore comestible dans sa forme de mycélium primaire qui peut être notamment choisi parmi Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, pleurote de l’orme ( Hypsizygus ulmarius), ou encore Agaricus blasei et Agaricus braziliensis ; de préférence, il s’agit de Pleurotus ostreatus.
Selon un mode de réalisation particulier et afin de faciliter le démarrage de la première fermentation, le champignon lignivore comestible est pré-cultivé sur un milieu de culture approprié avant d’être ensemencé sur le substrat. Les conditions de mises en œuvre de cette pré-culture sont connues de l’homme du métier ; la pré-culture pourra par exemple être effectuée sur du blé, de la drèche issue de brasserie, du riz ou encore un mélange de riz, paille et/ou bois avec ajout de chaux ou de carbonate de calcium.
Le substrat est inoculé avec entre 10 et 20% en poids sec, de préférence de l’ordre de 20% en poids sec de la préculture du champignon lignivore comestible et est ensuite maintenu à une température optimale de croissance pour le champignon lignivore comestible utilisé ; par exemple, la température de culture est comprise entre 20 et 30°C, de préférence de l’ordre de 28°C pour les basidiomycètes Pleurotus ostreatus (Hoa et al. n.d.), Pleurotus pulmonarius (Belletini et al., 2017) et Hypsizygus ulmarius, ou entre 25 et 35°C, de préférence 30°C pour Agaricus blazei ou braziliensis (Colauto et al., 2008).
La durée de la fermentation est conduite jusqu’à colonisation complète du substrat par le champignon lignivore comestible. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de culture de la première fermentation (substrat et population de champignon lignivore comestible) est broyé et/ou mélangé au moins une fois au cours de la première fermentation pour uniformiser le développement dudit champignon.
De façon surprenante, le traitement de résidus de bois par la première fermentation selon l’invention permet la croissance et le développement d’un second champignon du genre Aspergillus sur un substrat sur lequel il ne peut normalement pas se développer.
L’arrêt de cette première fermentation intervient de préférence avant la fructification du champignon lignivore comestible de façon à ce que la première fermentation ne soit réalisée qu’avec le mycélium primaire du champignon lignivore comestible.
A l’issue de cette première fermentation, l’ensemble de la culture est rebroyée/homogénéisée pour de servir de base pour la seconde fermentation.
Ledit champignon lignivore comestible est ensuite inactivé par traitement thermique. L’homme du métier saura choisir le traitement thermique le plus approprié ; à titre d’exemple, selon un mode de réalisation adapté à une mise en œuvre industrielle du procédé de l’invention, le traitement thermique est conduit à environ au moins 70°C en milieu humide (par exemple, dans un dispositif à contre-courant, par traitement à la vapeur d’eau ou encore par traitement à la chaleur vive) pendant environ 1 heure.
Après broyage et inactivation, la culture issue de la première fermentation (substrat de la seconde fermentation) est optionnellement enrichie d’un second complément minéral pour satisfaire les besoins nutritionnels du champignon du genre Aspergillus ; cet enrichissement optionnel peut être mis en œuvre lorsque la première fermentation n’a pas permis une libération de minéraux en quantité suffisante pour la croissance du champignon Aspergillus.
Pour la mise en œuvre de cette variante optionnelle du procédé, et de façon pratique, ce second complément minéral comprend au moins un sel de phosphate ; il peut également comprendre une source de magnésium, de sulfate et/ou de potassium ; il est ajouté au substrat de la seconde fermentation en une quantité comprise entre 1 à 5% en poids sec, de préférence entre 2 à 3% en poids sec, encore préférentiellement d’environ 2,5% en poids sec par rapport au poids total de substrat de la seconde fermentation.
Le substrat de la seconde fermentation est ensemencé avec une quantité de spores d’une espèce de champignon GRAS (« Generally Recognized As Safe ») et couramment utilisé dans la préparation de produits alimentaires, du genre Aspergillus, comprise entre 5.105 et 2.l06/g de substrat. L’espèce de champignon du genre Aspergillus est notamment choisie pour sa capacité à sécréter des enzymes du type hémicellulase.
Le taux d’humidité du substrat de la seconde fermentation ensemencé est ensuite, si nécessaire, ajusté à une valeur comprise entre 55 et 75%, de préférence entre 60 et 70%, encore préférentiellement à environ 65%.
De préférence, l’espèce utilisée pour cette seconde fermentation est choisie parmi Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae ou encore Aspergillus awanori ; la seconde fermentation peut également être réalisée avec un mélange d’au moins deux espèces d’ Aspergillus, par exemple A. oryzae et A. awamori ; encore préférentiellement, il s’agit d’ Aspergillus oryzae.
Selon un mode de réalisation particulier utilisant l’espèce Aspergillus oryzae, les spores d 'Aspergillus oryzae ont été préalablement récoltées après culture par exemple sur milieu PDA contenant 0,6 M de KC1 afin de stimuler la sporulation (Song et al. 2001).
A titre d’exemple, lorsque la seconde fermentation est mise en œuvre avec Aspergillus oryzae, elle est arrêtée après 2 à 3 jours, de préférence 3 jours, d’incubation à une température comprise entre 25 et 40°C, de préférence, entre 28 et 30°C. Le produit fermenté est alors récupéré.
Le but de cette seconde fermentation est l’accroissement de la biomasse fongique globale et la production d’enzymes d’intérêt pour l’alimentation animale (notamment xylanase, amylase, protéase, phytase).
Selon un mode de réalisation particulier, la seconde fermentation est arrêtée lorsque le maximum de sécrétion de xylanases, d’amylases et/ou de protéases est atteint.
Le produit obtenu à l’issue de la seconde fermentation est stabilisé par déshydratation, cette méthode permet avantageusement une stabilisation des enzymes d’intérêt sur le produit fermenté qui sert de support d’immobilisation. Pour cela, il peut par exemple être placé après homogénéisation par agitation mécanique dans une enceinte à environ 24°C jusqu’à obtention d’un taux d’humidité inférieur ou égal à 12%, de préférence compris entre 10 et 12% (correspondant à une activité de l’eau (aw) inférieure à 0,6 et prévenant la croissance de microorganismes), puis stocké au froid ou à température ambiante. Toute autre méthode de séchage connue de l’homme du métier, comme par exemple la lyophilisation, pourrait aussi être mise en œuvre. Le produit fermenté obtenu à l’issue du procédé selon l’invention peut être utilisé directement et dans sa globalité en tant que complément alimentaire pour l’alimentation animale ou humaine, de préférence pour l’alimentation animale.
La présente invention se rapporte également à un produit alimentaire fermenté susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention et à son utilisation, en particulier comme complément alimentaire pour les animaux d’élevage.
Le produit alimentaire selon l’invention se caractérise par une composition nutritionnelle particulièrement intéressante, notamment pour l’alimentation animale.
En effet, les enzymes sécrétées par les champignons filamenteux en présence de substrats lignocellulosiques ou riches en amidon sont largement employées dans l’alimentation animale pour améliorer la digestibilité des aliments et augmenter les performances de croissance principalement des animaux d’élevage monogastriques (Asmare 2014).
En particulier, les activités xylanases, protéases, amylases, glucanases et phytases sont les activités les plus recherchées pour l’alimentation animale (Shallom & Shoham 2003; Kuhad et al. 2011; Asmare 2014).
Le bénéfice d’un tel cocktail enzymatique a été précédemment évalué sur la croissance de poulets (Cowieson and Ravindran, 2008). Ceux-ci ont été nourris pendant 21 jours avec une alimentation à base de maïs et soja complétée ou non par un cocktail d’amylase, protéase et xylanase (avizyme® de la société Danisco). Les activités enzymatiques ajoutées ont été de 300U de xylanase, 400U d’amylase et de 4000U de protéase par kg d’aliments. Le gain de poids observé pour l’échantillon de poulets dont les rations alimentaires ont été complétées par ce cocktail a été évalué à 2% et la conversion des aliments (calculée par le ratio consommation/gain de poids) a été augmentée de 8% en comparaison d’un échantillon de poulets ne recevant pas ce complément ; ces données montrent le potentiel d’amélioration de ce type de cocktails enzymatiques sur la digestibilité de ces compléments.
Dans le cas présent, le procédé selon l’invention permet l’obtention d’un produit alimentaire qui comprend avantageusement les enzymes suivantes :
- entre 5 et 10 U de xylanases/g de produit fermenté sec,
- entre 5 et 10 U d’amylases/g de produit fermenté sec et
- entre 30 et 100 U de protéases/g de produit fermenté sec. Outre l’apport d’enzymes, le produit fermenté selon l’invention est naturellement riche en mycélium, structure filamentaire des champignons filamenteux entourée d’une paroi. Ces parois sont des structures complexes essentiellement composées de polysaccharides dont les plus abondants, les beta-glucanes (Bowman & Free, 2006), ont des propriétés immuno-modulatrices reconnues (Volman, Ramakers, & Plat, 2008).
Avantageusement, le produit alimentaire selon l’invention contient également des vitamines, en particulier de la vitamine B3 en une teneur comprise entre 20 et 40 mg/g de produit alimentaire.
Ce produit ali entaire présente également l’avantage de contenir des acides aminés essentiels à raison de, exprimé en mg/g de protéines totales :
- entre 10 et 15 mg d’Histidine,
- entre 30 et 45 mg d’ Isoleucine,
- entre 40 et 65 mg de Leucine,
- entre 20 et 30 mg de Lysine,
- entre 10 et 15 mg de Méthionine,
- entre 25 et 40 mg de Phénylalanine,
- entre 12 et 19 mg de Tyrosine,
- entre 35 et 54 mg de Thréonine,
- entre 25 et 40 mg de Valine et
- entre 8 et 12,5 mg de Tryptophane,
avec une teneur en protéines totales comprise entre 2,5 et 4,0% de préférence, d’environ 3,0% en poids par rapport au poids sec dudit produit.
Enfin, grâce à son procédé d’obtention, ce produit ali entaire présente une bonne digestibilité car ses teneurs en lignine, cellulose et hémicellulose sont réduites. La teneur en lignine du produit alimentaire selon l’invention dépend bien entendu de la teneur en lignine du produit de départ (résidus de bois) ; le procédé selon l’invention permet de réduire la teneur en lignine du produit de départ d’au moins 30%, de préférence d’au moins 40% et encore préférentiellement d’au moins 50%. A titre de comparaison, la teneur en lignine du produit alimentaire selon l’invention est comparable à celle de la paille.
La présente invention se rapporte donc à un produit alimentaire comprenant :
- entre 5 et 10 U de xylanases/g de produit alimentaire sec ;
- entre 5 et 10 U d’amylases/g de produit alimentaire sec ; - entre 30 et 100 U de protéases/g de produit alimentaire sec ;
- entre 20 et 40 mg de vitamine B3/g de produit ali entaire sec ;
- un profil d’acides aminés comprenant entre 10 et 15 mg d’Histidine, entre 30 et 45 mg d’Isoleucine, entre 40 et 65 mg de Leucine, entre 20 et 30 mg de Lysine, entre 10 et 15 mg de Méthionine, entre 25 et 40 mg de Phénylalanine, entre 12 et 19 mg de Tyrosine, entre 35 et 54 mg de Thréonine, entre 25 et 40 mg de Valine et entre 8 et 12,5 mg de Tryptophane / g de protéines totales dudit produit alimentaire ;
- une teneur en lignine inférieure à 18%, de préférence inférieure à 15%, encore préférentiellement inférieure à 12,5% et tout préférentiellement inférieure à 11% en poids.
De préférence, ce produit comporte une teneur en protéines totales comprise entre 2,5 et 4,0% de préférence, d’environ 3,0% en poids par rapport au poids sec dudit produit.
La présente invention se rapporte également à l’utilisation du produit alimentaire comme complément alimentaire par ajout de 3 à 4 % en poids dans une ration alimentaire animale.
Ainsi, le procédé séquentiel de fermentation en phase solide selon la présente invention permet l’utilisation de ressources ligneuses comme substrat et l’incorporation du produit fermenté in toto dans l’alimentation et notamment l’alimentation animale. Le règlement n°68/2013 du 16 janvier 2013 de la commission européenne établit la liste des matières premières pour l’alimentation animale (RÈGLEMENT (UE) N°68/20l3 DE LA COMMISSION du 16 janvier 2013 relatif au catalogue des matières premières pour aliments des animaux, http://eur-lex.europa.eu/eli/reg/2013/68/oj) et y inclut la lignocellulose de bois, obtenue par transformation mécanique de bois brut naturel (partie C tableau et ligne 7.8.1), le bois mur ou fibre de bois (partie C tableau et ligne 7.14.1) et le charbon de bois végétal (partie C tableau et ligne 7.13.1). Néanmoins, la nature lignocellulosique du bois, sa rigidité et sa teneur en lignine ne font pas du bois un candidat fréquemment sélectionné pour l’alimentation animale ainsi que pour la fermentation de composés lignocellulosiques. Le procédé selon l’invention corrige cet inconvénient.
Un autre avantage majeur du procédé de fermentation séquentielle selon l’invention repose sur l’utilisation du produit fermenté comme support d’immobilisation/adsorption des enzymes sécrétées. En effet, habituellement, l’incorporation du produit fermenté dans l’alimentation animale nécessite sa stabilisation microbiologique et enzymatique pour la conservation du produit. L’immobilisation des enzymes sur support insoluble d’origine organique et inorganique est décrite et des substrats purs de nature glucidique tels que la cellulose, l’amidon, Pagar-agar, les alginates ont été utilisés (Krajewska 2014). Le procédé développé ici propose d’utiliser le produit de fermentation composé de lignocellulose résiduelle et du mycélium déshydratés comme support d’immobilisation se substituant aux supports traditionnels décrits ci-dessus. De manière surprenante, l’activité enzymatique mesurée est très bien conservée et stable à température ambiante après déshydratation simple du produit fermenté.
Figures
Figure 1 : A. Première fermentation ; croissance de Pleurotus ostreatus sur sciure de chêne après 40 jours d’incubation à 28°C en absence ou en présence de complément minéral (CM). B. Seconde fermentation : croissance à' Aspergillus oryzae après 3 jours d’incubation à 30°C après différentes conditions de première fermentation.
Figure 2 : A. Croissance à Aspergillus oryzae sur sciure de chêne non fermentée par Pleurotus ostreatus avec et sans combinaison avec un complément minéral et/ou un complément azoté (sous forme de protéine dans le cas présent) (l’encart présente la croissance d’Æ oryzae après fermentation séquentielle). B. Croissance à' Aspergillus oryzae sur un milieu de culture renfermant 1,5% de glucose, 0,6% de NaN03, 0,15% KH2PO4, 0,05% MgS04, 0,05% KC1 et des minéraux sous forme de trace (Mn, Co, Zn et Fe) ajusté à différents pH. C. Croissance à' Aspergillus oryzae sur un milieu de culture minimal (1,5% de glucose, 0,6% de NaN(¾), complété tel indiqué sur la figure et ajusté à pH 6,1.
Figure 3 : A. Croissance de Pleurotus ostreatus sur sciures de chêne après 40 jours d’incubation à 28°C après combinaison avec différents compléments alcalins et/ou minéraux. B. Développement & Aspergillus oryzae à la suite de cette première fermentation après 3 jours d’incubation à 30°C.
Figure 4 : Comparaison des activités xylanases (A), amylases (B) et protéases (C) sécrétées par Pleurotus ostreatus (à l’issue de la première fermentation) (PO, gris clair) et par Aspergillus oryzae (à l’issue de la seconde fermentation) (PO/AO, noir) en fonction du pourcentage de complément minéral ajouté avant la première fermentation. Les activités sont exprimées en Unité (pmol de produit généré/min)/g de produit fermenté sec.
Figure 5 : Comparaison des activités xylanases (A), amylases (B), protéases (C) sécrétées par Pleurotus ostreatus (PO, gris clair) et par Aspergillus oryzae (PO/AO, noir) après différents temps de culture de Pleurotus ostreatus sur sciure de chêne combinée à 2,5% de
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) cendre. Les activités sont exprimées en Unité (pmol de produit généré/min)/ g de produit fermenté sec.
Figure 6 : Effet de la déshydratation (A) et de la conservation (B et C) du produit fermenté sur les activités xylanases, amylases et protéases. (MC : moisture content / pourcentage d’humidité).
Figure 7 : Activités enzymatiques (A - amylase et xylanase et B - protéase) mesurées à l’issue du procédé séquentiel de fermentation utilisant Aspergillus oryzae ou Aspergillus awamori lors de la seconde fermentation.
Figure 8 : Activités enzymatiques (A - amylase et xylanase et B - protéase) mesurées à l’issue du procédé séquentiel de fermentation utilisant Aspergillus oryzae et Aspergillus awamori lors de la seconde fermentation, seuls ou en coculture.
Figure 9 : mesure de l’activité laccase du produit issu de la première fermentation (histogramme de gauche) et celle du produit issu de la seconde fermentation (histogramme de droite).
EXEMPLES
Exemple 1 - Procédé séquentiel de fermentations de bois de chêne avec Pleurotus ostreatus puis Aspergillus oryzae selon l’invention
1. Matériels et méthodes
1.1. Procédé de fermentation séquentiel
Prétraitement du bois
Les résidus de bois de chêne obtenus sous forme de sciures ont été broyés grossièrement à l’aide d’un broyeur à hélice pour obtenir une fraction mineure sous forme de farine (environ 20%). L’objectif est de réduire la taille (entre 50 mhi et 1 mm) et la cristallinité d’une fraction de la lignocellulose du bois dans le but d’augmenter sa surface d’échange et ainsi faciliter la dégradation enzymatique (Saritha et al. 2012; Ravindran & Jaiswal 2015).
Ils ont été ensuite soumis à un prétraitement par chauffage à 90°C en milieu aqueux afin d’extraire une partie des extractibles dont les tannins hydrosolubles.
Après filtration sur filtre de cellulose jusqu’à obtention d’un pourcentage d’humidité compris entre 55 et 70% (Girmay et al. 2016) (Hoa & Wang n.d.), un complément minéral alcalin (cendre) est éventuellement ajouté puis le substrat est autoclavé.
Première fermentation
Le substrat est alors inoculé par Pleurotus ostreatus précultivé sur riz. Le substrat inoculé est ensuite placé à 28°C, température optimale de croissance (Boa et al.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) n.d.) pour une période comprise entre 30 et 40 jours jusqu’à colonisation complète du substrat par Pleurotus ostreatus (Hoa & Wang n.d.).
Seconde fermentation
A l’issue de cette première fermentation, la culture est broyée à l’aide d’un broyeur à hélice dans le but de la rendre homogène et de servir de base pour la seconde fermentation. Les pleurotes sont ensuite inactivées par chauffage (entre 70°C et l20°C), puis 2.106 spores d’Aspergillus oryzae sont ajoutées par gramme de produit fermenté sec avec ajustement de l’humidité entre 60 et 70%.
Les spores d ' Aspergillus oryzae ont été préalablement récoltées après culture sur milieu PDA contenant 0,6 M de KC1 afin de stimuler la sporulation (Song et al. 2001).
La culture est arrêtée après 3 jours d’incubation à 30°C, le produit fermenté est récupéré.
Stabilisation
Le produit fermenté est stabilisé par déshydratation : il est placé après homogénéisation par agitation mécanique dans une enceinte à 24°C jusqu’à obtention d’un pourcentage d’humidité de 11-12%, correspondant à une activité de l’eau (aw) inférieure à 0,6 et prévenant la croissance de microorganisme (Assamoi et al. 2009), puis il est stocké à 4°C ou température ambiante.
1.2. Caractérisation du produit fermenté alimentaire obtenu
1.2.1 Mesure des activités enzymatiques
Préparation de l’extrait brut enzymatique
Les enzymes sécrétées par les champignons sont isolées du produit fermenté directement après l’arrêt de la période d’incubation ou après stabilisation. L’équivalent de 0,1 g de produit fermenté sec est prélevé dans un tube eppendorf puis placé dans 2 ml de tampon acétate 50 mM pH 5,0 et mis à agiter (agitateur incubateur 150 rpm) 30 min à 30°C (Chancharoonpong et al. 2012). Le surnageant contenant les enzymes sécrétées est récolté après centrifugation 10 min à 10000 g (4°C).
Mesure des activités xylanase, amylase et protéase
Les activités xylanase sont mesurées en utilisant comme substrat, le xylan de hêtre à 1% dans un tampon acétate 50 mM pH 5,0. Typiquement, 50 pl d’extrait enzymatique brut sont ajoutés à 150 pl de substrat puis incubés 50 min à 50°C (van den Brink et al. 2013). L’apparition d’extrémités réductrices après coupure enzymatique est mesurée par dosage colorimétrique à 405 nm après réaction avec le p-4- hydroxybenzhydrazide (Szilagyi, et al., 2010).
Les activités amylase sont mesurées en utilisant comme substrat, l’amidon à 0,2% dans un tampon acétate 50 mM pH 5,0. Typiquement, 50 pl d’extrait enzymatique brut sont ajoutés à 150 pl de substrat puis incubés 50 min à 50 °C (van den Brink et al. 2013).
Les activités protéase sont mesurées en utilisant l’azocaséine comme substrat comme décrit (Janser et al. 2014) avec quelques modifications : 200 pl d’extrait enzymatique sont ajoutés à 200 pl d’ azocaséine à 0,5% dans un tampon acétate 50 mM pH5,0. L’incubation est réalisée pendant 1 heure à 55°C, puis les protéines sont précipitées par addition de 400 pl d’ acide trichloroacétique 10%. Après 10 min dans la glace, les tubes sont centrifugés à 10000g pendant 10 min. 100 pl de surnageant contenant les azopeptides et azo acides aminés sont transférés dans une microplaque contenant 100 pl de NaOH 5M. L’absorbance est mesurée à 428 nm pour déterminer l’activité protéasique de l’extrait brut. Mesure de l’activité laccase
L’activité laccase est mesurée en utilisant l’ABTS 0,2 mM (2,2'-Azino- bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) comme substrat (Valâskovâ & Baldrian, 2006) dans un tampon acétate 50mM pH 5,0. Typiquement 20 pl d’extrait enzymatique brut sont ajoutés à 140pl de tampon acétate pH 5,0 et 40 pl d’ABTS 1 mM. L’activité enzymatique est ensuite évaluée immédiatement par mesure d’absorbance à 420 nm, correspondant à l’oxydation de l’ABTS par l’activité laccase et, réalisation d’une cinétique sur 90 minutes. 1.2.2. Détermination des teneurs en lignine et béta-glucanes
La détermination de la teneur en lignine a été réalisée par gravimétrie après hydrolyse acide : l’échantillon subit une succession d’attaques par différentes solutions (détergent neutre, puis détergent acide) dans un appareil de type Fibertec. (Ébullition pendant 1 heure). A la fin de chaque attaque, l’échantillon est soigneusement rincé, séché et pesé. Une attaque avec un acide très concentré est alors réalisé, et l’échantillon contenant la fraction de lignine est séché puis pesé pour déterminer la teneur en lignine en comparaison avec le poids sec de départ.
La détermination de la teneur en beta-glucanes est réalisée après hydrolyse enzymatique spécifique. Les échantillons subissent des digestions enzymatiques successives. Le glucose, contenu dans les béta-glucanes 1.3- 1.6, est ainsi libéré et dosé par chromatographie ionique.
2. Résultats Le développement d’Aspergillus oryzae sur les résidus de bois est dépendant du développement préalable de Pleurotus ostreatus.
Le modèle choisi pour le développement du procédé s’est basé sur l’utilisation de sciures de chêne broyées grossièrement et soumises à une extraction aqueuse à chaud. Après ajustement de l’humidité par filtration et stérilisation, le substrat est inoculé par Pleurotus ostreatus et placé 40 jours à 28°C pour permettre le développement du champignon. La croissance de Pleurotus ostreatus sur sciures de chêne a pu être optimisée par ajout d’un complément minéral alcalinisant naturel et facilement disponible (cendres). La figure 1A présente différentes conditions de cultures réalisées en absence ou en présence du complément minéral.
Après 40 jours de culture, Pleurotus ostreatus s’est faiblement développé sur sciure de chêne en absence de complément minéral (CM 0%) alors que la croissance, visible par l’extension du mycélium blanc, augmente avec le pourcentage de complément minéral jusqu’à se stabiliser aux environs de 5% de CM. L’utilisation d’un broyeur permet alors d’homogénéiser le produit fermenté tandis que l’inactivation par chauffage permet d’empêcher un nouveau développement des pleurotes. Après ces conditions de traitement, le substrat fermenté retrouve un aspect, une couleur brune caractéristique du bois (le mycélium n’est plus visible à l’œil nu) (voir figure 1A colonne 3 et figure IB, colonne 1) et la croissance est ineffective sans nouvelle inoculation (figure 1B, colonne 1).
Des spores d’Aspergillus oryzae sont ajoutées aux sciures fermentées puis le taux d’humidité est amené à une valeur comprise entre 60 et 70% avant d’initier une seconde fermentation pendant 3 jours à 30°C en chambre humide. La figure 1B montre la croissance d’Aspergillus oryzae à l’issue de cette seconde fermentation. Celle-ci est indétectable si les spores sont ajoutées sur des sciures n’ayant pas été soumises à une première fermentation (figure IB, colonne 2) et son niveau est corrélé positivement au niveau de croissance de Pleurotus ostreatus obtenu lors de la première fermentation (comparer la quantité de mycélium blanc sur la figure 1A colonnes 1 à 4 et figure IB colonnes 3 à 6).
Ces résultats montrent donc que la croissance d’Aspergillus oryzae sur sciure de chêne seule est dépendante d’une première fermentation par Pleurotus ostreatus.
Un certain nombre de facteurs pourrait expliquer cette dépendance.
D’une part, une diminution de la teneur en lignine est attendue compte- tenu du caractère lignivore de Pleurotus ostreatus, diminution et dégradation partielle facilitant l’accès de l’holocellulose aux enzymes sécrétées par Aspergillus oryzae. A ceci s’ajoute une dégradation partielle de l’holocellulose par Pleurotus ostreatus lui-même conduisant à la libération de sucres réducteurs facilement assimilables par Aspergillus oryzae. La mesure des sucres réducteurs après la première fermentation a été évaluée à 20 mg/g de produit fermenté sec contre 2 mg/g de sciure sèche avant fermentation. Elle a été estimée à 10 mg/g de produit fermenté sec à l’issue de la seconde. Ces résultats montrent donc que la première fermentation permet la libération de sucres réducteurs qui pourraient être en partie utilisés lors de la seconde fermentation pour la croissance ά' Aspergillus oryzae.
D’autre part, il est possible que certains composés sécrétés par le champignon servent de source de carbone supplémentaire (tels que les acides organiques) et source d’azote (protéines synthétisées pa Pleurotus ostreatus).
Les conditions minimales de fermentation de sciure de chêne par Aspergillus oryzae sont présentées sur la figure 2 et permettent de souligner la pertinence du procédé séquentiel sur sciures de chêne. Les sciures de bois ont été soumises à un prétraitement similaire à celui opéré avant inoculation par Pleurotus ostreatus à savoir un broyage grossier puis une extraction en milieu aqueux à 90°C. Après stérilisation (autoclavage), un nouveau broyage est réalisé avant inoculation par les spores d 'Aspergillus oryzae et incubation 3 jours à 30°C. Comme le montre la figure 2A, aucune croissance n’est observable sur du bois prétraité seul (colonne 1), sur du bois prétraité combiné à 2,5% de complément minéral alcalinisant et 2,5% de complément minéral neutre (ici la cendre dont le pH a été ajusté à 7,5 par ajout d’HCl) (colonnes 2 et 3), sur du bois prétraité combiné à 1,25% de potasse alcalinisante (colonne 4) et sur du bois prétraité combiné à 3% de complément azoté (colonne 5). Par contre, une croissance est observée sur du bois prétraité après addition de 2,5% de complément minéral alcalinisant ou neutre et 3% de complément azoté (protéines) (colonnes 6 et 7). Le niveau de croissance observée est supérieur lorsque le complément minéral est alcalinisant en comparaison du complément minéral neutre mais inférieur à celui observé après une première fermentation par Pleurotus ostreatus (comparer l’encart et les colonnes 6 et 7). Ces résultats suggèrent donc qu’ Aspergillus oryzae peut se développer sur sciures de chêne en présence d’un complément minéral et d’un complément azoté avec un développement préférentiel à pH alcalin. La combinaison du complément azoté et de potasse alcalinisante ne permet pas de visualiser un développement à’ Aspergillus oryzae sur sciure de chêne (colonne 8), confirmant une dépendance sur la présence des éléments minéraux, absents dans cette condition expérimentale. Les conditions optimales de croissance d’A. oryzae combinant les compléments azoté et minéral alcalinisant ne sont pas en adéquation avec les données bibliographiques présentant un pH optimal de croissance de cet ascomycète compris entre 6 et 7,5 (Krijgsheld et al., 2013). La figure 2B confirme une diminution de croissance d’A. oryzae à pH alcalin (le pH du bois prétraité combiné à 2,5% de complément minéral alcalinisant est d’environ 8,0) et suggère donc que l’effet positif de l’alcalinisation observé sur la croissance d’Aspergillus résulterait d’un effet sur le bois (figure 2A colonne 7) qui fragilise la lignocellulose du bois et faciliterait sa dégradation par les enzymes sécrétées par Aspergillus (Rabemanolontsoa & Saka, 2015). La dépendance d’ Aspergillus oryzae vis-à-vis d’éléments minéraux présents dans le complément minéral ajouté sous forme de cendre est soulignée sur la figure 2C. En comparaison à un milieu complet et un milieu minimal contenant uniquement une source carbonée et azotée et pour lequel une croissance très faible est observée, le retrait de phosphate limite tout développement significatif d 'Aspergillus oryzae. Le retrait de magnésium et de sulfate n’est pas limitant pour la croissance du champignon mais entraîne une sporulation suggérant un stress de G ascomycète (résultat non présenté).
Ces résultats montrent donc qu’ spergillus oryzae est capable de se développer sur des sciures de chêne à condition d’ajouter au substrat un complément minéral et azoté, la croissance est favorisée si le complément minéral est alcalinisant avec un effet pouvant être attribué à une fragilisation de la lignocellulose (lors du chauffage en présence du complément minéral). Néanmoins, l’efficacité de croissance est inférieure à celle observée lors du procédé de fermentation séquentielle.
Dans leur ensemble, ces résultats montrent que la croissance d’ Aspergillus oryzae sur sciure de chêne (sans ajout) est dépendante d’une première fermentation par Pleurotus ostreatus et suggèrent que cette première fermentation, en fragilisant le bois et notamment la lignine, rend disponibles des éléments nutritifs nécessaires à son développement dont très probablement une source d’azote accessible et indispensable à la croissance d 'Aspergillus oryzae ainsi que les éléments minéraux indispensables à son développement en particulier le phosphate.
Effet du complément minéral sur la conduite du procédé selon l’invention
La pertinence du procédé séquentiel de fermentation peut être également soulignée à travers l’analyse de l’impact du complément minéral alcalinisant sur la fermentation par Pleurotus ostreatus. La figure 3A présente le développement de Pleurotus ostreatus sur sciures de chêne combinée à 2,5% de complément minéral (colonne 1), à 2,5% de complément minéral dont le pH a été ajusté à 7,5 (colonne 2), à 1,25 % de potasse (colonne 3) et à 1,25% de carbonate de Calcium (colonne 4) (1,25% de KOH ont été ajoutés car la cendre renferme environ 50% de CaO majoritairement responsable de l’alcalinité). Les résultats obtenus montrent que la potasse ou le carbonate de Calcium peuvent se substituer à la cendre (comparer les colonnes 1, 3 et 4). Par contre, l’ajustement du complément minéral à pH 7,5 entraîne une diminution notable du développement de Pleurotus sur les sciures de chêne avec toutefois un développement des pleurotes bien supérieur dans ces conditions à celui observé sans ajout de complément minéral (comparer avec la figure 1, colonne 1).
Ainsi, ces résultats montrent que l’alcalinité des cendres a un effet plus déterminant sur la croissance des pleurotes que l’ajout de minéraux.
Il est probable que l’effet alcalinisant intervienne ici aussi sur le bois et non sur la croissance du champignon, elle-même. En effet, différentes études ont montré un pH optimum de croissance des pleurotes compris entre 5 et 7 lors de culture sur milieu synthétique ou paille (Romero-Arenas et al., 2012, Tripathi and Yadav, 1992, Belletini et al., 2016).
Finalement, la figure 3B présente le développement d’ Aspergillus oryzae en seconde fermentation dans ces conditions expérimentales. De façon plus surprenante, ces résultats montrent que la présence d’éléments minéraux supplémentaires n’est pas indispensable à la croissance d 'Aspergillus oryzae lors de la seconde fermentation puisque les cendres peuvent être substituées par la potasse ou le carbonate de calcium (comparer figure 3B, colonnes 1, 3 et 4) et renforcent l’importance de la qualité de la première fermentation sur la seconde par la mise à disposition d’éléments nutritifs azotés et minéraux puisés dans le bois pour Aspergillus oryzae.
Le procédé selon l’invention peut être appliqué à différentes essences de bois
Des expériences complémentaires ont été réalisées sur différentes essences de bois. Les modèles d’essence ont été choisis en fonction de leur niveau d’exploitation, de leur classement en essence précieuse et de leur disponibilité immédiate : épicéa, hêtre et alisier ont ainsi servi de modèle d’étude. Le hêtre est le troisième feuillu le plus exploité après le chêne et le peuplier, l’épicéa fait partie des conifères les plus récoltés, et l’alisier est une essence précieuse.
Les conditions expérimentales se sont basées sur le protocole de référence développé sur le chêne. Les conditions de prétraitement du bois, les conditions de première fermentation (avec et sans complément alcalin) et de seconde fermentation ont été similaires à celles utilisées pour le chêne.
L’efficacité du procédé a été évaluée à l’issue de la seconde fermentation par mesure des activités xylanase, protéase et amylase et présentée dans le tableau 1. Pour faciliter la comparaison des résultats, ceux-ci ont été rapportés aux valeurs obtenues lors de l’utilisation du chêne comme substrat (1 Unité arbitraire).
Tableau 1 : Activités enzymatiques mesurées à l 'issue du procédé de fermentation séquentielle utilisant des sciures provenant de différentes essences de bois.
Les résultats obtenus montrent que i) le procédé développé sur les sciures de chêne peut être appliqué aux autres essences avec ii) une amélioration significative de la production des activités amylase, xylanase et protéase lors de la seconde fermentation si le procédé est conduit en présence de complément alcalin pendant l’étape de prétraitement des sciures avant la première fermentation, que iii) la production de ces activités est moins tributaire de l’ajout du complément alcalin pour les essences de hêtre, alizier et épicéa en comparaison avec le chêne, iv) la production d'amylase, xylanase et protéase est globalement inférieure lorsque l’épicéa est utilisé comme substrat.
Le prétraitement à l’eau n’a pas d’effet délétère sur la teneur en xylanase et amylase du produit obtenu par le procédé selon l’invention
Des expériences complémentaires ont été réalisées afin d’évaluer l’éventuel effet de différentes conditions de prétraitement.
FEUI LLE DE REM PLACEM ENT ( RÈG LE 26) L’effet de la température d’extraction a été évalué en premier lieu. Pour cela, les résidus de bois (chêne) mélangés à l’eau ont été chauffés à 50°C, 90°C et l20°C ou ont été mélangés à l’eau sans chauffage avant de procéder à l’étape de filtration puis ajout de complément alcalin avant stérilisation avant l’inoculation par Pleurotus ostreatus pour la première fermentation. L’efficacité du procédé a été évaluée à l’issue de la seconde fermentation par mesure des activités xylanase et amylase. Les deux étapes de fermentation ont été conduites comme décrit précédemment pour les résidus de chêne.
Aucune différence significative n’a été observée sur le niveau de sécrétion des activités amylase et xylanase à l’issue de la seconde fermentation, confirmant la possibilité d’utiliser une plage de température assez large lors de l’étape d’extraction. Influence de l’humidité du substrat sur le conduite du procédé selon l’invention
Des expériences complémentaires ont été réalisées afin de confirmer l’impact du pourcentage d’humidité du substrat sur le procédé de fermentation séquentielle. Pour cela, l’humidité du substrat (résidus de chêne tels qu’utilisés dans le procédé de référence) à l’issue de la filtration a été ajustée à 40%, 50%, 60%, 70% et 80% avant ajout du complément alcalin, stérilisation et inoculation. L’efficacité du procédé tel que décrit précédemment a été évaluée à l’issue de la seconde fermentation par mesure des activités xylanase et amylase. Aucune différence significative n’a été observée sur le niveau de sécrétion des activités amylase et xylanase à l’issue de la seconde fermentation, confirmant la possibilité d’utiliser des taux d’humidité compris entre 40 et 80%.
Mise en œuvre du procédé selon l’invention avec d’autres souches de basibiomycète
Le procédé séquentiel de fermentation a été mis en œuvre selon le protocole décrit précédemment avec Pleurotus pulmonarius et Hypsizygus ulmarius en substitution de Pleurotus ostreatus. Comme précédemment, l’efficacité du procédé a été évaluée à l’issue de la seconde fermentation par mesure des activités xylanase et amylase sécrétées par Aspergillus oryzae. Le tableau ci-dessous présente les résultats obtenus sur ces activités. Pour faciliter la comparaison des résultats, ceux-ci ont été rapportés aux valeurs obtenues lors de l’utilisation de Pleurotus ostreatus pour la première fermentation (1 Unité arbitraire).
Tableau 2 : Mesure des activités xylanase et amylase à l’issue de la fermentation par Aspergillus otyzae en fonction du basidiomycète utilisé pour la première fermentation.
Les résultats obtenus montrent que le procédé séquentiel de fermentation selon l’invention peut être appliqué à Pleurotus pulmonarius et Hypsizygus ulmarius, deux champignons lignivores n’ entraînant pas de différence significative sur la production d’amylase par Aspergillus oryzae.
La régulation de la sécrétion des activités xylanase a été largement étudiée et celle-ci est contrôlée par les niveaux respectifs d’inducteurs (xylan, xylose à faible concentration, azote...) et de répresseurs (xylose à forte concentration, glucose...) potentiellement présents dans le milieu. Il est possible que la première fermentation conduise à la production/libération de composés inducteurs et/ou répresseurs variant suivant l’espèce de champignon utilisée, ce qui expliquerait la différence de production de xylanase lorsque la première fermentation est effectuée en présence de Hypsizygus ulmarius.
En conclusion, le procédé de fermentation séquentielle peut être appliqué à différentes espèces de champignons lignivores en s’assurant du niveau de sécrétion des activités enzymatiques recherchées.
Mise en œuvre du procédé selon l’invention avec Aspergillus awamori et en co-culture de Aspergillus oryzae et Aspergillus awamori
Le procédé de fermentation séquentielle a été appliqué à Aspergillus awamori, une moisissure du genre Aspergillus utilisée dans l’alimentation traditionnelle japonaise.
Les étapes de prétraitement des sciures de chêne puis d’inoculation par Pleurotus ostreatus ont été réalisées suivant le protocole de référence. Le substrat issu de la première fermentation a été ajusté à 65% d’humidité avant d’être inoculé par 2.106 spores d 'Aspergillus awamori ou Aspergillus oryzae par gramme de produit fermenté sec puis incubé 3 jours à 30°C (protocole de référence). L’efficacité du procédé a été évaluée par mesure des activités xylanases, amylases et protéases à l’issue de la seconde
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) fermentation. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 7. Ils sont exprimés en U/g de produit fermenté sec.
Ceux-ci montrent que la sécrétion d’amylase par Aspergillus oryzae et awamori est comparable (panel A). Par contre, les activités xylanase et protéase sont significativement différentes entre les deux espèces. L’activité xylanase est supérieure pour Aspergillus awamori (2,5 fois environ) (panel A) alors que l’activité protéase est inférieure pour A. awamori (3,5 fois environ) (panel B).
Dans leur ensemble, ces résultats montrent i) qu’une autre espèce du genre Aspergillus peut se développer sur les résidus de bois fermentés en suivant les étapes établies pour Aspergillus oryzae, permettant de proposer que le procédé est applicable à d’autres espèces du genre Aspergillus, ii) que les activités enzymatiques recherchées initialement, à savoir les activités xylanase, amylase et protéase sont présentes à l’issue de la fermentation pour les deux espèces utilisées, awamori et oryzae et iii) que le niveau de sécrétion des activités xylanase et protéase est variable suivant l’espèce considérée.
Suivant cette dernière observation, il peut donc être envisagé de moduler le niveau des activités xylanase et protéase en combinant les espèces. La figure 8 montre les résultats des mesures des activités amylase, xylanase et protéase obtenus en réalisant des cocultures d 'Aspergillus awamori et Aspergillus oryzae lors de la seconde fermentation, le pourcentage de chaque moisissure variant entre 100, 75, 50 et 25% de la coculture. De façon attendu, le niveau de sécrétion des activités amylase est similaire quel que soit le pourcentage respectif d’A. oryzae ou awamori (panel A). Le niveau de sécrétion d’activité xylanase augmente lorsque le pourcentage à' Aspergillus awamori augmente pour se stabiliser lorsque le ratio A. oryzae /A. awamori est identique (autour de l2U/g de produit fermenté) (panel A).
De façon corrélée aux résultats présentés sur la figure 7, le niveau d’activité protéase diminue lorsque le pourcentage d’A. awamori augmente, cette diminution étant significative à partir d’un ratio A. awamori / A. oryzae identique (50/50). Dans leur ensemble, ces résultats montrent que i) la coculture de moisissures du genre Aspergillus sur les résidus de bois fermenté peut être envisagée et ii) une coculture contrôlée au moment de l’inoculation permet de moduler le niveau respectif d’enzymes sécrétées. Par exemple, A. oryzae peut être utilisé seul si les activités protéase sont recherchées et en combinaison avec A. awamori afin d’ accroître le niveau de sécrétion des activités xylanases. La première fermentation du procédé conduit à la production de laccase par P. ostreatus
La présence d’activité laccase est détectée à l’issue de la première fermentation ; en revanche, cette enzyme n’est peu ou pas détectée à l’issue de la seconde fermentation (voir figure 9).
Sachant que cette activité est responsable de la dégradation de la lignine et que la teneur en lignine du bois à l’issue du procédé est de 12% (contre une teneur théorique entre 17 et 25% avant fermentation), la diminution de la teneur en lignine peut être associée à cette première fermentation.
La fermentation séquentielle permet la production de xylanases, amylases et protéases par Aspergillus oryzae.
Les enzymes sécrétées par les champignons filamenteux sont largement employées dans l’alimentation animale pour améliorer la digestibilité des aliments et augmenter les performances de croissance des ani aux d’élevage (Asmare 2014). Aspergillus oryzae est employé dans G alimentation humaine depuis plusieurs millénaires et décrit pour sa capacité à synthétiser et sécréter des enzymes impliquées dans la dégradation de substrats riches en amidon mais aussi lignocellulosiques (Brink & Vries 2011; Kobayashi et al. 2007; Vries & Visser 2001).
Les activités xylanases, protéases, amylases, glucanases et phytases sont les activités les plus recherchées pour l’alimentation animale (Shallom & Shoham 2003; Kuhad et al. 2011; Asmare 2014). Des dosages des activités xylanases, protéases et amylases ont été mis au point afin d’évaluer le niveau de sécrétion de ces enzymes par Aspergillus oryzae tout en le comparant à celui de Pleurotus ostreatus.
La figure 4 présente les activités xylanases, amylases et protéases sécrétées par Pleurotus ostreatus à l’issue de la première fermentation et Aspergillus oryzae à l’issue de la seconde. Trois conditions de culture ont été comparées, une réalisée sans ajout de complément minéral et deux réalisées avec ajout de 1 et 5% de complément minéral, deux conditions stimulant le développement de Pleurotus ostreatus et en conséquence celui à' Aspergillus oryzae.
Ainsi, si la fermentation réalisée par Pleurotus ostreatus est une condition sine qua non à la croissance d’ Aspergillus oryzae, la seconde fermentation amène au produit fermenté une valeur ajoutée notamment par la présence d’enzymes digestives. Il est important de noter que le niveau de sécrétion de ces enzymes par Pleurotus ostreatus reste largement inférieur à celui à' Aspergillus oryzae quelle que soit la durée de la première fermentation. La figure 5A et B montre une sécrétion de xylanases et d’amylases quasiment nulle après 20, 30, 40, 50 et 60 jours de fermentation par Pleurotus ostreatus en présence de 2,5% de cendre. Les activités xylanases et amylases sécrétées par Aspergillus oryzae augmentent entre 20 et 30 jours de première fermentation (par Pleurotus ostreatus ) pour se stabiliser ensuite (la durée d’incubation à' Aspergillus oryzae est restée constante à 3 jours). Les différences dans les niveaux de sécrétion des activités protéases sont moins prononcées entre Pleurotus ostreatus et Aspergillus oryzae quelle que soit la durée de la première fermentation mais sont toujours en faveur à’ Aspergillus oryzae dans les conditions où le complément minéral a été ajouté à hauteur de 2,5 % (voir figure 5C) et 5% (voir figure 4C).
Dans leur ensemble, ces résultats montrent que le procédé de fermentation séquentielle sur résidus de bois utilisant Pleurotus ostreatus puis Aspergillus oryzae permet la production d’enzymes, telles que les xylanases, amylases et protéases.
La fermentation séquentielle permet la dégradation de la lignine.
Un des freins à l’utilisation des composés lignocellulosiques et particulièrement du bois pour l’alimentation animale est sa rigidité due à sa teneur en lignine d’environ 25% (Guerriero et al. 2016).
La teneur en lignine du produit fermenté à l’issue de la fermentation séquentielle a été évaluée et représente 11% de lignine, valeur très inférieure à la teneur en lignine des résidus de bois (produit de départ).
Les activités enzymatiques du produit fermenté peuvent être stabilisées sur le substrat
La sécrétion d’enzymes digestives lors de la seconde fermentation ouvrant des perspectives de valorisation des sciures de bois fermentées, il est apparu essentiel de développer un procédé de stabilisation et de conservation de ces enzymes simple et peu coûteux.
Dans le procédé mis en œuvre, à l’issue de la seconde fermentation, le produit fermenté dont le taux d’humidité avoisine les 60% est rendu homogène par agitation mécanique puis placé dans une enceinte à 24°C jusqu’ à obtenir un pourcentage d’humidité de 12%, taux d’humidité stabilisant le produit d’un point de vue microbiologique et prévenant une reprise de croissance ou le développement d’autres types de micro-organismes (Assamoi et al. 2009). La figure 6A présente les activités enzymatiques résiduelles après déshydratation à 12% et montre qu’une déshydratation réalisée dans ces conditions n’ entraîne aucune perte d’activités xylanases, amylases et protéases.
La figure 6B présente ces mêmes activités résiduelles après conservation à 4°C du produit fermenté et déshydraté durant une, deux, trois et quatre semaines. Aucune perte significative d’activité n’est observable quelles que soient les activités mesurées.
La figure 6C présente les activités xylanases, amylases et protéases résiduelles après conservation à température ambiante du produit fermenté et déshydraté durant une, deux, trois et quatre semaines. Comme précédemment, aucune perte significative d’activité n’est observable quelles que soient les activités mesurées.
Ces résultats confirment donc la possibilité d’utiliser le substrat fermenté comme support de stabilisation/immobilisation des enzymes sécrétées.
La teneur en beta-glucanes (composés majoritaires de la paroi des champignons filamenteux) présents dans le produit fermenté final est évaluée à environ 8%.
3. Conclusion
Les données expérimentales mettent en évidence la production d’un produit fermenté de qualité alimentaire à partir de bois ; ce produit est complexe et composé de lignocellulose digérées résiduelle (dans une proportion similaire à celle de la paille), de mycélium et de composés sécrétés par les champignons comprenant des enzymes. Ces enzymes d’intérêt sont habituellement ajoutées à la ration ali entaire animale (Asmare 2014). Dans les procédés actuels, les enzymes purifiées doivent être « diluées » par mélange à des farines ou matrices minérales avant d’être incorporées aux aliments. Les enzymes sécrétées et stabilisées sur le produit fermenté final selon l’invention sont déjà « diluées » par la présence du substrat résiduel et du mycélium, un « prémélange » avec une farine ou une matrice pourrait être évité facilitant la production et limitant le coût de production des aliments enrichis.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de transformation de résidus de bois en produit alimentaire comestible pour un mammifère comprenant les étapes de :
1) optionnellement, prétraitement de résidus de bois ;
2) première fermentation d’un substrat composé de résidus de bois et comprenant optionnellement de 1 à 5% en poids sec d’un complément minéral alcalinisant, par un champignon lignivore comestible pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du substrat avant fructification par ledit champignon ;
3) arrêt de la première fermentation par inactivation thermique dudit champignon lignivore comestible et broyage du produit obtenu à l’issue de ladite première fermentation ;
4) seconde fermentation du produit obtenu à l’étape 3) par un champignon du genre Aspergillus pendant une durée adaptée correspondant à la colonisation maximale du substrat avant sporulation par ledit champignon du genre Aspergillus ;
5) optionnellement, stabilisation du produit obtenu à l’issue de ladite seconde fermentation par déshydratation.
2. Procédé de transformation de résidus de bois en produit ali entaire comestible pour un mammifère selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étape 1) de prétraitement comprend un broyage des résidus de bois de façon à obtenir une taille de résidus du bois inférieure ou égale à 2 cm et/ou un chauffage à une température d’au moins 70°C en milieu humide.
3. Procédé de transformation de résidus de bois en produit ali entaire comestible pour un mammifère selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits résidus de bois comprennent un mélange de entre 40 et 80% en poids de sciure de bois et entre 20 et 60% en poids de farine de bois.
4. Procédé de transformation de résidus de bois en produit ali entaire comestible pour un mammifère selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit complément minéral alcalinisant représente un apport de :
- 170 à 330 kg/t de calcium (exprimé sous forme de CaO), - 20 à 60 kg/t de potassium (exprimé sous forme de K20),
- 25 à 46 kg/t de magnésium (exprimé sous forme de MgO),
- 10 à 61 kg/t de phosphore (exprimé sous forme de P2O5),
- des métaux, dont le Mn, Fe, Cu, Zn qui sont des co-facteurs d’enzymes digestives sécrétées par les champignons, en proportions variables,
et présente un pH, avant mélange avec les résidus de bois, compris entre 10 et 13.
5. Procédé de transformation de résidus de bois en produit ali entaire comestible pour un mammifère selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le champignon lignivore comestible est choisi parmi Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, pleurote de l’orme ( Hypsizygus ulmarius ), Agaricus blasei et Agaricus braziliensis.
6. Procédé de transformation de résidus de bois en produit ali entaire comestible pour un mammifère selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit champignon du genre Aspergillus est choisi parmi Aspergillus oryzae, Aspegillus niger, Aspergillus sojae et Aspergillus awanori.
7. Produit alimentaire fermenté susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Produit ali entaire fermenté selon la revendication 7, caractérisé en ce qu’il a la composition suivante :
- entre 5 et 10 U de xylanases/g de produit alimentaire sec ;
- entre 5 et 10 U d’amylases/g de produit alimentaire sec ;
- entre 30 et 100 U de protéases/g de produit alimentaire sec ;
- entre 20 et 40 mg de vitamine B3/g de produit ali entaire sec ;
- un profil d’acides aminés composé de 10 et 15 mg d’Histidine, entre 30 et 45 mg d’Isoleucine, entre 40 et 65 mg de Leucine, entre 20 et 30 mg de Lysine, entre 10 et 15 mg de Méthionine, entre 25 et 40 mg de Phenylalanine, entre 12 et 19 mg de Tyrosine, entre 35 et 54 mg de Thréonine, entre 25 et 40 mg de Valine et entre 8 et 12,5 mg de Tryptophane / g de protéines totales dudit produit alimentaire ;
- une teneur en lignine inférieure à 18% en poids.
9. Utilisation du produit alimentaire selon la revendication 7 ou la revendication 8 comme complément ali entaire dans une ration alimentaire animale.
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