EP3749955A1 - Verfahren zur quantifizierung von gesamtgluten aus getreide in lebensmittelproben - Google Patents

Verfahren zur quantifizierung von gesamtgluten aus getreide in lebensmittelproben

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EP3749955A1
EP3749955A1 EP19701280.0A EP19701280A EP3749955A1 EP 3749955 A1 EP3749955 A1 EP 3749955A1 EP 19701280 A EP19701280 A EP 19701280A EP 3749955 A1 EP3749955 A1 EP 3749955A1
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EP
European Patent Office
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gluten
wheat
total
antibodies
antibody
Prior art date
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Pending
Application number
EP19701280.0A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Weiss
Markus LACORN
Thomas Hektor
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R Biopharm AG
Original Assignee
R Biopharm AG
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants

Definitions

  • the invention relates to a method for quantifying total gluten from cereals in food samples. Areas of application are above all the food industry, service laboratories and state control laboratories or biotechnology.
  • Celiac disease is a partially autoimmune disease that causes damage to the small intestine resulting in diarrhea, vomiting, nutritional deficiencies and weight loss. Since the disease is not curable, only the strict gluten-free diet remains for the patient. Celiac patients who follow such a diet live largely symptom-free. The patients are thus dependent on food containing no or very little gluten.
  • Codex Alimentarius describes the requirement for foods that are considered “gluten-free”.
  • the current standards define foods as "gluten-free” if they are less than 20 mg gluten per kg of food (Codex Standard 118 - 1979).
  • Other countries and regions such as For example, the EU, US and Canada have adopted their legal regulations to this Codex limit. Food manufacturers wishing to provide celiac disease patients with "gluten-free" products need to review and comply with this limit on their products.
  • Gluten is a heterogeneous protein mixture of alcohol-soluble prolamins and alcohol-insoluble glutelins.
  • Gluten proteins are found in all Triticum species (eg wheat, spelled, emmer, einkorn), rye and barley, as well as in their crosses and are differentiated depending on the type of cereal.
  • prolamins are called gliadins and glutelinins are subdivided into low molecular weight glutenin subunit (LMW) proteins and high molecular weight glutenin subunit (HMW) proteins.
  • LMW low molecular weight glutenin subunit
  • HMW high molecular weight glutenin subunit
  • Gluten proteins is currently the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Extraction solutions containing the reducing substances (eg ⁇ -mercaptoethanol, sulfite, thiosulfite), denaturing substances (eg guanidine hydrochloride, urea) and / or detergents (eg Tween , Triton-X100, sodium dodecyl sulfate).
  • reducing substances eg ⁇ -mercaptoethanol, sulfite, thiosulfite
  • denaturing substances eg guanidine hydrochloride, urea
  • detergents eg Tween , Triton-X100, sodium dodecyl sulfate.
  • cocktail extraction solution EP 1 424 345 A1, license from R-Biopharm AG. All extraction solutions are used together with ethanol or isopropanol.
  • the color reaction is carried out by adding a substrate / chromogen solution.
  • the reaction is stopped by sulfuric acid and the optical density (OD) measured by photometer.
  • the quantification is carried out using calibrators of known gliadin content. From the gliadin content thus obtained, the total gluten content is calculated by multiplication by the factor 2. This multiplication is prescribed according to Codex-Alimentarius (CODEX-STAN 118 - 1979). However, it is becoming increasingly clear that a general factor 2 leads in many cases to a miscalculation (Wieser and Köhler, 2009). So z. B. wheat flour both in the total protein content as well as in the composition of gluten proteins significantly different (Hajas et al., 2017). If only the prolamine content is determined, this may lead to falsified results in the calculation of the total gluten content in the case of different composition of the individual gluten protein fractions.
  • gluten fractions can be selectively ablated or enriched so that only a partial determination of the gluten fractions can lead to significant incorrect determinations (Wieser and Köhler 2009).
  • EP 1 1779 115 B1 discloses antibodies against T-cell recognition sequences in gliadin (prolamine in wheat) or in LMW and HMW (gluteline in wheat) and their use in ELISA assays.
  • gliadin prolamine in wheat
  • LMW and HMW gluteline in wheat
  • ELISA assays there is no common detection, but only either detection of prolamin or LMW or HMW.
  • the Separate detection is also highlighted as particularly beneficial. There is therefore no adequate quantification of total gluten from wheat and / or rye and / or barley in an ELISA.
  • Skerritt et al. (1989) published several antibody combinations that can partially detect prolamins, LMW and HMW.
  • the aim of the invention is to determine the total gluten content in foods quickly and cheaply with only one measurement, whereby each gluten protein fraction is to be quantified according to its mass fraction.
  • the object of the present invention is derived to develop a method with which, based on the detection of prolamins and glutelins, all potentially celiac-relevant gluten protein fractions in food samples are quantified according to their masses as a sum, wherein the quantification by combination multiple antibodies in a well and in a conjugate.
  • the method should be used to determine the total gluten content from wheat samples.
  • Related gluten fractions in other Triticum species, rye and barley should also be quantifiable by the method.
  • the present method is based on the common use of specific prolamin and glutelin antibodies as a combination conjugate according to the invention for the detection of total gluten.
  • a combination of specific binding reagents against prolamins and glutelin is used in a single analytical run, these specific binding reagents being mixed in one unit.
  • a dilution of the individual antibody conjugates takes place in such a way that the contribution of the individual antibodies to the total signal strength corresponds to the fraction of the gluten fraction which they each detect.
  • the total gluten determination is preceded by the extraction of gluten proteins from the food.
  • an extraction method is used, which under reductive conditions with the addition of chaotropic salts in the presence of aliphatic short-chain alcohols, gluten proteins from the food matrix dissolves.
  • the extract obtained is then used for the total gluten determination in an antibody-based detection method z. B. in an ELISA (sandwich or competitive or direct format) or lateral flow format or flow through used.
  • ELISA sandwich or competitive or direct format
  • the antigen is specifically bound by two antibodies.
  • the first antibody (capture antibody) is bound to the solid phase of the wells (wells) of a microtiter plate.
  • the sample with the antigen to be detected is then added to the wells and incubated. During this time, the antibody bound to the plate binds the antigen present in the sample. After the incubation phase, the plate is washed. The unbound components of the sample are thereby removed. This leaves only the antigen bound to the capture antibody.
  • a second antibody for detection (detection antibody) is added, which binds to a site in the antigen other than the capture antibody and at the end of which a reporter enzyme is bound.
  • This second antibody thus also binds to the antigen, only at a different position, and results in an antibody-antigen-antibody complex, which is also referred to as a sandwich complex.
  • a substrate suitable for the reporter enzyme also called "chromogen”
  • chromogen is added, which is converted by the reporter enzyme to a reaction product and thus enables its detection by color change.
  • reporter enzyme instead of the reporter enzyme would be direct fluorescence or chemoluminescence labeling of the detector antibody.
  • a series of known antigen concentrations (standard series) is usually carried along in order to obtain a calibration curve for the measured signal.
  • standard series a series of known antigen concentrations
  • a microtiter plate is coated with a combination of antibodies to wheat prololamine, LMW and HMW proteins, each cavity being coated with the mixture of antibodies. Subsequently, the extracted sample is added. The extracted gluten proteins bind specifically to these capture antibodies.
  • the combined addition according to the invention of detection antibodies to wheat prololamine, LMW and HMW proteins takes place, the conjugated antibodies being present in a solution (combination conjugate).
  • detection antibodies are conjugated so that their binding becomes quantifiable. This can be z. B. be made by conjugation with a dye-forming reporter enzyme.
  • the conjugated detection antibodies used against prolamins and glutelin in the combination conjugate according to the invention are mixed in such a way that all gluten fractions are measured at the same mass fraction with comparable signal strength.
  • the quantification is done by comparing the total signal strength of a sample with the signal strengths of gluten calibrators of known content.
  • As an extract of wheat flour can be used.
  • the total gluten determination is preceded by the extraction of the gluten proteins from the sample to be investigated with the addition of chaotropic salts in the presence of aliphatic short-chain alcohols.
  • a cocktail extraction solution [0.76 g / L NaCl, 0.244 g / L KCl, 1.42 g / L Na 2 HPO 4 * 2H 2 O, 0.272 g / LH 2 K0 4 P, 191 g / L guanidine-HCl, 18.2 ml / L ⁇ -mercaptoethanol] (EP 1 424 345 A1).
  • - Thoroughly homogenise a sufficiently large amount of the sample (at least 5 g or 5 ml) (carefully crush, finely grind and mix well or mix the solution well).
  • Tannin and polyphenol-containing food samples (eg chocolate, coffee, cocoa, chestnut flour, buckwheat, millet and spices): Weigh out 0.25 g of the homogenised sample, 0.25 g skimmed milk powder and 2.5 ml cocktail extraction solution (EP 1 424 345 A1), close the container and mix well
  • the gluten distribution can be very uneven, in addition, these samples are difficult to homogenize. For this reason, homogenize 200 g of sample, then sample at least four times: Weigh out 1 g of the homogenized sample and add 10 ml of cocktail extraction solution, close the tube and mix well.
  • the sample 1 25 (40 ml + 960 ml) with buffer, z. B. pH neutral phosphate buffer further diluted: the final dilution factor is 1000.
  • the samples thus obtained are then used for total gluten determination, preferably in a sandwich ELISA.
  • the following describes by way of example the performance of a sandwich ELISA for the determination of total gluten of wheat-containing samples.
  • An essential advantage of the invention is that the total gluten content is determined with a single measurement step in a single cavity.
  • LMW and HMW glutenin wheat gluteline
  • Bindings are saturated by block and stabilization solutions known from the literature, and then the extracted sample or the standard (calibrator) is preferably added as double samples into the individual wells.
  • the gluten proteins from a wheat flour are isolated by means of modified Osborne fractionation (Schalk et al., 2017). To improve the durability, the gluten isolate thus obtained is brought to dryness and stored. To prepare the calibrators, this isolate is weighed in, dissolved by means of cocktail extraction solution (EP 1 424 345 A1) R-Biopharm (product number R7006) and diluted to the desired concentrations in a pH-neutral phosphate buffer.
  • the detection antibodies against gliadin wheat prolamine
  • LMW and HMW glutenin wheat gluteline
  • a reporter enzyme conjugated with a reporter enzyme.
  • This mixture of detection antibodies which bind to gluten proteins at different sites than the capture antibodies is referred to below as a combination conjugate.
  • the microtiter plate with a gluten extract, z. B. coated from a wheat flour In a competitive ELISA with antigen coating, the microtiter plate with a gluten extract, z. B. coated from a wheat flour.
  • the calibrator is identical to the one used in the sandwich ELISA procedure.
  • the preparation and adjustment of the individual conjugates and the combination conjugate are carried out as in the sandwich ELISA method, however, the OD decreases in a competitive ELISA with increasing gluten concentrations.
  • the sample extraction is identical to that in the sandwich ELISA method.
  • the color reagent is added.
  • the reaction is stopped by adding the stop solution.
  • a competitive ELISA with antibody coating the microtiter plate is coated with a solution of prolamine, LMW and HMW antibodies so that all antibodies are bound in each well.
  • the calibrator is identical to the one used in the sandwich ELISA procedure.
  • conjugates the single protein fractions Prolamine, LMW and HMW are coupled to horseradish peroxidase.
  • the individual conjugates and the combination conjugate are adjusted analogously to the sandwich ELISA method, but the OD decreases in a competitive ELISA with increasing gluten concentrations.
  • the sample extraction is identical to that in the sandwich ELISA method.
  • calibrators or samples are added to the wells and incubated in the first step. After an optional washing step, the combination conjugate is pipetted into the wells and incubated. After a (re) washing step, the color reagent is added and incubated. In the last step, the reaction is stopped by adding the stop solution.
  • the horseradish peroxidase is not stable to the cocktail extraction solution in the samples. Therefore, the prolamine, LMW and HMW fractions must be conjugated differently in this case, e.g. B. to biotin.
  • the detection of streptavidin coupled via horseradish peroxidase takes place.
  • the color reagent is added and incubated. In the last step, the reaction is stopped by adding the stop solution.
  • a direct ELISA an uncoated microtiter plate is used.
  • the calibrator is identical to the one used in the sandwich ELISA procedure.
  • the preparation and adjustment of the individual conjugates and the combination conjugate are carried out as in the sandwich ELISA method.
  • the sample extraction is identical to that in the sandwich ELISA method.
  • the uncoated microtiter plate is incubated with the calibrators or the samples. After a washing step, the combination conjugate is next added and incubated. After a new washing step, the color reagent is added and incubated. In the last step, the reaction is stopped by adding the stop solution.
  • Lateral flow formats can follow the sandwich or competitive principle.
  • the surface of a strip-shaped membrane is coated with a solution of a mixture of prolamine, LMW and HMW antibodies in the form of a narrow line across the direction of flow (see Fig. 1).
  • the gluten-containing sample solution is transported via an absorbent material into the area of the lateral flow, in which a mixture of labeled prolamin, LMW and HMW antibodies are in dried form.
  • the conjugated detection antibodies used against prolamins and glutelin in the combination conjugate according to the invention are mixed in such a way that all gluten fractions are measured at the same mass fraction with comparable signal strength.
  • the labeling of the antibodies follows the methods known to the experts (eg in the form of colloidal gold, colored, fluorescent or phosphorescent nanoparticles).
  • the gluten proteins react with the respective labeled specific antibody and are transported by capillary forces further to the area of the membrane which has been coated with membrane-bound prolamin, LMW and HMW antibodies as described above.
  • the gluten-antibody complexes react with the membrane-bound antibodies to form a sandwich, which becomes visible through the formation of a colored band.
  • the signal strength of the band corresponds to the amount of gluten in the sample.
  • Another band serves as a control band and indicates the general functionality of the lateral flow.
  • the competitive lateral-flow format follows the principles of the competitive ELISA described above, wherein the gluten from the sample is first reacted with labeled specific antibodies and then transported along the membrane by capillary forces until it encounters a sample band of immobilized gluten. A reduction in the intensity of the sample band indicates the presence of gluten.
  • the labeled antibodies used against prolamins and glutelin in the combination conjugate according to the invention are mixed in such a way that all gluten fractions are measured at the same mass fraction with comparable signal strength.
  • marked gluten is located on the starting line of the lateral flow, which together with the non-labeled gluten from the Sample transported by capillary forces onto the test band with immobilized specific unlabeled antibodies.
  • a competition reaction takes place around the antibody binding sites.
  • the mixed antibodies used against prolamins and glutelin in the test band and the labeled, mixed gluten proteins on the starting line of the lateral flow are mixed according to the invention such that all gluten fractions are measured with the same mass fraction with comparable signal strength. As a result, the band becomes more intense when there is less gluten in the sample.
  • flow-through formats follow the functional principles of lateral-flow formats already described, differing only in the fact that the mass transfer does not take place along a membrane but through it. Adjustments to the described lateral flow rates can be found in the relevant literature or are known to the expert.
  • Microarray and microfluidic formats follow the principles of ELISA and lateral flow formats already described. Further specific details can be found in the relevant literature or are known to the expert.
  • a gliadin antibody against the epitope QQPFP is used as a prolamine detection antibody and as glutelin
  • Detection antibody used an antibody against the LMW fraction extracted from wheat flour and an antibody against HMW with the epitope recognition sequence GYYPTS.
  • the various detection antibodies are coupled separately to horseradish peroxidase using commercial conjugation reagents (eg, Pierce TM Conjugate Purification Kit catalog number 44920).
  • the antibody conjugates thus obtained are then mixed according to the invention in such a way that all gluten fractions are measured at the same mass fraction with comparable signal strength.
  • the individual conjugates are mixed in a small batch and the reactivity of the combination conjugate is checked as described above and, if appropriate, the dilution factors of the individual conjugates are further adjusted. Only after a successful approach in the small-scale approach, the individual conjugates are combined as a whole.
  • Table 1 shows the example of such a pre-test.
  • the specific antibody conjugates are first tested individually with the above-mentioned coated microtiter plate.
  • Wheat whole gluten extract is diluted to three different concentrations, each containing the same amount of either prolamine, LMW or HMW proteins.
  • a total gluten extract with the concentration 15.5 ng / ml total gluten protein contains 10 ng / ml gliadin.
  • a total gluten extract containing 44.5 ng / ml total gluten protein contains 10 ng / ml LMW proteins
  • a total glutinous extract containing 80 ng / ml contains 10 ng / ml HMW proteins (see Table 1).
  • Table 1 Selection of total gluten concentrations at which the concentration of the individual fractions has the same value. All data in ng / ml.
  • the gliadin, LMW and HMW-specific antibody conjugates are now adjusted so that the gliadin antibody with the 15.5 ng / ml total glutinous extract has the same signal strength (in the example in Table 2: 2.0) as the LMW Antibody with the 44.5 ng / ml total gluteal extract and the HMW antibody with the 80 ng / ml total glutinous extract (Table 2).
  • Table 2 Example of pre-testing of single conjugate dilutions.
  • the combination conjugate is checked with calibration series of the individual fractions (wheat prolamine, LMW and HMW proteins) (see Figure 2 and Figure 3). Possibly. there is a further adaptation of the composition of the combination conjugate.
  • the individual fractions are obtained by extraction of all proteins from a wheat flour and subsequent separation by HPLC (Schalk et al., 2017). To improve the shelf life, the resulting protein isolates are brought to dryness and stored. To prepare the stock solutions, the fractions are weighed, dissolved by means of cocktail extraction solution (EP 1 424 345 A1) and diluted in a pH neutral phosphate buffer to the desired concentrations.
  • Wheat flours can be significantly different both in the total protein content and in the composition of the gluten proteins (Hajas et al., 2017). Due to the setting of the individual conjugates, differences in the composition of the gluten proteins should have no influence on the measurement, since the same amount of single fraction protein leads to a comparable signal, no matter which wheat protein fraction it is (see Figure 2). The fact that all celiac-relevant gluten protein fractions are determined, in contrast to conventional test methods (see prior art), the total gluten content is not falsified with different gluten protein composition.
  • LMW proteins do not have any homologous proteins in rye and barley, so that cross-reactivity can not be expected here.
  • the barley glutelinels have little homology to wheat and rye proteins, so detection of this fraction with antibodies to prolamins, HMW and LMW proteins is not likely.
  • barley flours show a greater range of variation ( Figures 8 and 9). This is probably due to the fact that the barley fractions are detected differently in contrast to the wheat and rye fractions. As was to be expected, barley gluten infraction is not significantly detected by any of the antibodies used, while prolamins are detected very well. Accordingly, slight shifts in the protein fractions in the various flours would lead to significant differences. In a general over-or under-determination of cereals compared to a Wheat Calibrator can be used for more accurate gluten content determination, a calibrator with material from the corresponding other crops.
  • the claimed method makes possible the simultaneous determination of prolamin and glutelin proteins by the use of the combination conjugate according to the invention and thus for the first time allows a quantification of the actual total gluten content.
  • This method of co-determination of prolamine and glutelins is much more accurate than previously known methods, in which only the prolamine content is determined, from which in turn the total gluten content is calculated.
  • the celiac disease-relevant glutelin have not been determined, which could lead to wrong results in the past. The claimed method closes this gap.
  • the method of the invention is not only suitable for determining the total gluten content of wheat-containing food samples, but also for the determination of the total gluten content of other Triticum species, and / or rye and / or barley-containing food samples.
  • FIG. 1 Schematic operation of a lateral-flow assay in
  • Fig. 3 Testing the reactivity of the combination conjugate against the different wheat flour fractions. Measured concentrations for various wheat flour fractions at a target value of 20 ng / ml
  • Fig. 5 Testing the reactivity of the combination conjugate against various commercial wheat flours and pure wheat varieties whose gluten protein content was determined by FIPLC.
  • Fig. 7 Testing the reactivity of the combination conjugate against various commercial rye flours and pure rye varieties whose gluten protein content was determined by HPLC and purified rye fractions. Measured concentrations at a target value of 20 ng / ml Fig. 8 Testing of the reactivity of the combination conjugate against various commercial barley flours and pure barley varieties, whose gluten protein content was determined in each case by HPLC, and purified barley fractions
  • Tye-Din J., Stewart, J., Dromey, J., Beissbarth, T., van Heel, D., Tatham, A., Henderson, K., Mannering, S., Gianfrani, C., Jewell , D., Hill, A., McCluskey, J., Rossjohn, J. and Anderson, R. (2010) Comprehensive, Quantitative Mapping of T Cell Epitopes in Gluten in Celiac Disease. Be. Trans. Med. 2: 41 ra51.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Gesamtgluten aus Getreide in Lebensmittelproben. Anwendungsgebiete sind vor allem die Lebensmittelindustrie, Servicelabore und staatliche Kontrolllabore oder die Biotechnologie. Die Erfindung hat das Ziel, den Gesamt-Glutengehalt in Lebensmitteln mit nur einer Messung schnell und preiswert zu bestimmen. Daraus leitet sich die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ab, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem, basierend auf der Detektion von Prolaminen und Glutelinen, alle potentiell Zöliakie-relevanten Gluten-Proteinfraktionen in Lebensmittelproben entsprechend ihren Massen als Summe quantifiziert werden. Das vorliegende Verfahren basiert auf der gemeinsamen Verwendung spezifischer Prolamin- und Glutelinantikorper als erfindungsgemäßes Kombinationskonjugat zur Detektion von Gesamtgluten. Dabei erfolgt eine Verdünnung der einzelnen Antikörperkonjugate derart, dass der Beitrag der einzelnen Antikörper zur Gesamtsignalstärke dem Anteil der Gluten-Fraktion entspricht, die sie jeweils detektieren.

Description

Verfahren zur Quantifizierung von Gesamtgluten aus Getreide in Lebensmittelproben
Beschreibung Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Gesamtgluten aus Getreide in Lebensmittelproben. Anwendungsgebiete sind vor allem die Lebensmittelindustrie, Servicelabore und staatliche Kontrolllabore oder die Biotechnologie.
Hintergrund der Erfindung
Mit einer Jahresernte von 2,5 Milliarden Tonnen ist Getreide das wichtigste Nahrungsmittel des Menschen. Die Bandbreite der Lebensmittel, die aus Getreide hergestellt, mit Getreideprodukten ergänzt oder mit Getreideinhaltsstoffen behandelt werden, ist unüberschaubar. Einige Getreide, wie z.B. Weizen, Gerste und Roggen, enthalten große Mengen Klebereiweiße, das sogenannte Gluten, das zwar für den Backvorgang vorteilhaft ist, bei bestimmten Personen jedoch eine Unverträglichkeit auslöst, die man als Zöliakie bezeichnet. Zusätzlich wurde eine weitere Unverträglichkeit in Form der „Non Celiac Gluten Sensitivity“ (nicht zöliakie- assoziierte Glutensensitivität) beobachtet, die jedoch noch nicht vollständig erforscht ist.
Die Prävalenz der Zöliakie schwankt je nach Kulturkreis; im weltweiten Durchschnitt liegt sie bei 1 :270, das sind also ca. 250 Mio. Menschen. Die Zöliakie ist eine teilweise autoimmune Krankheit, die zu einer Schädigung des Dünndarms führt, was sich in Durchfall, Erbrechen, Mangelernährungserscheinungen und Gewichtsverlust manifestiert. Da die Krankheit nicht heilbar ist, bleibt für den Erkrankten nur die strikte Gluten-freie Diät. Zöliakie-Patienten, die sich an eine solche Diät halten, leben weitgehend symptomfrei. Die Erkrankten sind somit auf Lebensmittel angewiesen, die kein oder sehr wenig Gluten enthalten.
Der 1963 durch die World Health Organization (WHO) und Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO) ins Leben gerufene Codex Alimentarius beschreibt die Anforderung an Lebensmittel, die als„Gluten-frei“ gelten. Die aktuell gültigen Standards definieren Lebensmittel als„Gluten-frei“, wenn sie weniger als 20 mg Gluten pro kg Lebensmittel enthalten (Codex Standard 118 - 1979). Andere Länder und Regionen wie z. B. die EU, USA und Kanada haben ihre gesetzlichen Verordnungen an diesen Codex-Grenzwert übernommen. Lebensmittelhersteller, die die Versorgung von Zöliakie-Patienten mit„Gluten-freien“ Produkten gewährleisten möchten, müssen diesen Grenzwert für ihre Produkte überprüfen und einhalten.
Gluten ist ein heterogenes Proteingemisch aus alkohollöslichen Prolaminen und alkoholunlöslichen Glutelinen. Glutenproteine kommen in allen Triticum-Spezies (z. B. Weizen, Dinkel, Emmer, Einkorn), Roggen und Gerste vor, sowie in deren Kreuzungen und werden je nach Getreideart unterschieden. So werden im Weizen die Prolamine als Gliadine bezeichnet und die Gluteline in Low Molecular Weight Glutenin Subunit (LMW)-Proteine und High Molecular Weight Glutenin Subunit (HMW)-Proteine unterteilt. Historisch wurden nur die Prolamine als „toxisch“ für Zöliakiepatienten angesehen. In letzter Zeit wurde jedoch festgestellt, dass auch LMW- und HMW- Proteine toxisch wirken (Tye-Din et al. 2010).
Stand der Technik
Die am meisten verbreitete Detektionsmethode zum Nachweis von
Glutenproteinen ist momentan der Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA). Für die Extraktion der Lebensmittel proben werden Extraktionslösungen benutzt, die reduzierende Substanzen (z. B. ß-Mercaptoethanol, Sulfit, Thiosulfit), denaturierende Substanzen (z. B. Guanidin-Hydrochlorid, Harnstoff) und/oder Detergenzien (z. B. Tween, Triton-X100, Natriumdodecylsulfat) enthalten. Eine dieser Extraktionsmethoden ist die sog. Cocktail-Extraktionslösung (EP 1 424 345 A1 ; Lizenz bei R-Biopharm AG). Alle Extraktionslösungen werden zusammen mit Ethanol oder Isopropanol verwendet.
Kommerziell erhältliche immunologische Detektionssysteme basieren meist auf monoklonalen Antikörpern (z. B. Skerritt, R5, G12 und Alpha20). Die meisten dieser Antikörper detektieren hauptsächlich oder ausschließlich die besser löslichen Prolamine (Wieser et al. 2014).
Beispielhaft wird nachfolgend eines der am häufigsten verwendeten Messsysteme zur Quantifizierung von Gluten näher erläutert, das sogenannten Mendez System bestehend aus Cocktail Extraktion und R5 ELISA. Dieses System ist z. B. kommerziell erhältlich als Cocktail (patented EP 1 424 345 A1 ) R7006 (R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland) und RIDASCREEN® Gliadin R7001 (R-Biopharm AG). Die homogenisierte Lebensmittel probe wird mittels Cocktail (patented) bei 50°C extrahiert und anschließend mit Ethanol versetzt. Nach Verdünnung des erhaltenen Extraktes wird die so vorbereitete Probe auf einer, mit dem monoklonalen Antikörper R5, beschichteter Mikrotiterplatte inkubiert. Nach Waschen wird ein R5- Meerrettichperoxidase-Konjugat inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt erfolgt die Farbreaktion durch Zusatz einer Substrat/Chromogen Lösung. Die Reaktion wird durch Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte (OD) mittels Photometer gemessen. Die Quantifizierung erfolgt anhand mitgeführter Kalibratoren bekannten Gliadingehaltes. Aus dem so erhaltenen Gliadin-Gehalt wird durch Multiplikation mit dem Faktor 2 der Gesamt-Glutengehalt errechnet. Diese Multiplikation ist gemäß Codex-Alimentarius vorgeschrieben (CODEX-STAN 118 - 1979). Zunehmend wird jedoch deutlich, dass ein allgemeiner Faktor 2 in vielen Fällen zu einer Fehlkalkulation führt (Wieser und Köhler, 2009). So können sich z. B. Weizenmehle sowohl im Gesamtproteingehalt als auch in der Zusammensetzung der Glutenproteine deutlich unterscheiden (Hajas et al., 2017). Wird allein der Prolamin-Gehalt bestimmt, so kann dies bei unterschiedlicher Zusammensetzung der einzelnen Glutenproteinfraktionen zu verfälschten Ergebnissen bei der Berechnung des Gesamt-Glutengehalts führen.
Weiterhin können je nach Aufbereitung des Getreides zum„Gluten-freien“ Produkt bestimmte Glutenfraktionen (Prolamine und Gluteline) selektiv ab- oder angereichert werden, so dass bei einer nur teilweisen Bestimmung der Glutenfraktionen es zu signifikanten Fehlbestimmungen kommen kann (Wieser und Köhler 2009).
Ein gemeinsamer Nachweis von Prolaminen und Glutelinen, der diese Probleme beheben könnte, wird im Stand der Technik nicht beschrieben. So offenbart beispielsweise EP 1 1779 115 B1 Antikörper gegen T-Zell Erkennungssequenzen in Gliadin (Prolamin in Weizen) bzw. in LMW und HMW (Gluteline in Weizen) und deren Verwendung in ELISA-Assays. Allerdings erfolgt kein gemeinsamer Nachweis, sondern nur entweder ein Nachweis von Prolamin oder LMW oder HMW. Der getrennte Nachweis wird auch als besonders vorteilhaft hervorgehoben. Es findet daher keine ausreichende Quantifizierung von Gesamtgluten aus Weizen und/oder Roggen und/oder Gerste in einem ELISA statt. Daneben wurden durch Skerritt et al. (1989) mehrere Antikörperkombinationen publiziert, die teilweise Prolamine, LMW und HMW detektieren können. Allerdings wurde jeweils nur mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet und ein monoklonaler Antikörper im Konjugat verwendet; es fand also keine Kombination mehrerer Antikörper in einer Kavität bzw. in einem Konjugat statt. Entsprechend zeigt auch keines der getesteten Systeme eine ausreichend gleichmäßige Detektion der unterschiedlichen Glutenfraktionen und damit auch keine ausreichende Quantifizierung von Gesamtgluten. Tatsächlich handelt es sich vermutlich nur um Kreuzreaktivitäten der eingesetzten Antikörper gegen die weiteren Glutenfraktionen, da es nicht vorgesehen war spezifische Antikörper gegen die einzelnen Fraktionen herzustellen. Aus einer der durch Skerritt et al. (1989) beschriebenen Antikörperkombinationen wurde der kommerzielle ELISA ALLER-TEK™ Gluten ELISA Assay entwickelt (Anonymus, 2014). Die oben beschriebenen
Einschränkungen der durch Skerritt et al. beschriebenen ELISA Systeme gelten folglich auch für dieses kommerzielle System.
Tatsächlich wurde dies durch Lexhaller et al. (2016) für den kommerziellen ELISA ALLER-TEK™ Gluten ELISA Assay sowie für vier andere kommerzielle Sandwich ELISA Systeme bestätigt, dass alle fünf kommerziellen ELISA Systeme Gesamtgluten nicht zufriedenstellend bestimmen können.
Wenige kommerzielle ELISA Assays verwenden polyklonale Antikörper (Wieser et al. 2014). Selbst bei Immunisierung mit Gesamtgluten wird die Antikörper-Reaktivität zufällig erzeugt. Dadurch ist es nicht möglich, im Nachhinein eine Einstellung des Systems vorzunehmen, so dass jede Glutenproteinfraktion entsprechend ihres Masseanteils quantifiziert werden kann.
Aufgrund der genannten Nachteile sind diese Methoden nicht mehr Mittel der Wahl, um den tatsächlichen und genauen Gesamtgehalt von Glutenproteinen in Lebensmittel zu bestimmen. Ziel und Aufgabe der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, den Gesamt-Glutengehalt in Lebensmitteln mit nur einer Messung schnell und preiswert zu bestimmen, wobei jede Glutenproteinfraktion entsprechend ihres Massenanteils quantifiziert werden soll.
Daraus leitet sich die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ab, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem, basierend auf der Detektion von Prolaminen und Glutelinen, alle potentiell Zöliakie-relevanten Gluten-Proteinfraktionen in Lebensmittelproben entsprechend ihren Massen als Summe quantifiziert werden, wobei die Quantifizierung durch Kombination mehrere Antikörper in einer Kavität und in einem Konjugat erfolgt. Das Verfahren soll zur Bestimmung des Gesamt-Glutengehaltes aus Weizenproben genutzt werden. Verwandte Glutenfraktionen in anderen Triticum- Spezies, Roggen und Gerste sollen mit dem Verfahren ebenfalls quantifizierbar sein.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere mögliche Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Beispielen. Wesen der Erfindung
Das vorliegende Verfahren basiert auf der gemeinsamen Verwendung spezifischer Prolamin- und Glutelinantikörper als erfindungsgemäßes Kombinationskonjugat zur Detektion von Gesamtgluten. Zur Quantifizierung des Gesamtglutengehalts wird eine Kombination spezifischer Bindungsreagenzien gegen Prolamine und Gluteline in einem einzigen analytischen Lauf eingesetzt, wobei diese spezifischen Bindungsreagenzien gemischt in einer Einheit vorliegen. Dabei erfolgt eine Verdünnung der einzelnen Antikörperkonjugate derart, dass der Beitrag der einzelnen Antikörper zur Gesamtsignalstärke dem Anteil der Gluten-Fraktion entspricht, die sie jeweils detektieren.
Kurzbeschreibung des Verfahrens:
Der Gesamt-Glutenbestimmung vorgeschaltet ist die Extraktion der Glutenproteine aus dem Lebensmittel. Dazu wird eine Extraktionsmethode verwendet, die unter reduktiven Bedingungen unter Zusatz von chaotropen Salzen in Anwesenheit von aliphatischen kurzkettigen Alkoholen, Glutenproteine aus der Lebensmittelmatrix herauslöst.
Der erhaltene Extrakt wird anschließend zur Gesamt-Glutenbestimmung in einem antikörperbasierten Nachweisverfahren z. B. in einem ELISA (Sandwich oder kompetitives oder direktes Format) oder Lateral-Flow Format bzw. Flow Through eingesetzt.
Zum besseren Verständnis wird nachfolgend das allgemeine Prinzip eines Sandwich- ELISAs erläutert. Bei einem Sandwich-ELISA wird das Antigen (Analyt) sandwichartig von zwei Antikörpern spezifisch gebunden. Der erste Antikörper (Fänger-Antikörper) wird an die feste Phase der Vertiefungen (Kavitäten) einer Mikrotiterplatte gebunden. Die Probe mit dem nachzuweisenden Antigen wird dann in die Kavitäten gegeben und inkubiert. Während dieser Zeit bindet der an die Platte gebundene Antikörper das in der Probe vorhandene Antigen. Nach Ablauf der Inkubationsphase wird die Platte gewaschen. Die ungebundenen Bestandteile der Probe werden dadurch entfernt. Zurück bleibt nur das am Fänger-Antikörper gebundene Antigen. Im nächsten Schritt wird ein zweiter Antikörper zur Detektion (Detektionsantikörper) zugegeben, der an eine andere Stelle im Antigen als der Fänger-Antikörper bindet und an dessen Ende ein Reporterenzym gebunden ist. Dieser zweite Antikörper bindet also ebenfalls an das Antigen, nur an einer anderen Position, und es entsteht ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex, der auch als Sandwich-Komplex bezeichnet wird. Durch erneutes Waschen der Platte wird überschüssiger, nicht gebundener Detektionsantikörper entfernt. Anschließend kann das Antigen detektiert und quantifiziert werden: Es wird ein zum Reporterenzym passendes Substrat (auch „Chromogen“ genannt) zugegeben, das vom Reporterenzym zu einem Reaktionsprodukt umgesetzt wird und auf diese Weise dessen Nachweis durch Farbumschlag ermöglicht. Weitere Möglichkeiten anstelle des Reporterenzyms wären direkte Fluoreszenz- oder Chemolumineszenz- markierung des Detektorantikörpers. Für eine quantitative Bestimmung wird üblicherweise eine Serie mit bekannten Antigenkonzentrationen ( Standardreihe ) mitgeführt, um eine Kalibrationskurve für das gemessene Signal zu erhalten. Im Fall der vorliegenden Erfindung wird zur Durchführung eines Sandwich-ELISAs vor der Assay-Durchführung eine Mikrotiterplatte mit einer Kombination aus Antikörpern gegen Weizenprolamin, LMW- und HMW-Proteinen beschichtet, wobei jede Kavität mit dem Gemisch der Antikörper beschichtet wird. Anschließend wird die extrahierte Probe zugegeben. Die extrahierten Gluten-Proteine binden spezifisch an diese Fänger-Antikörper. Nach einem Waschschritt erfolgt die erfindungsgemäße kombinierte Zugabe von Detektions-Antikörpern gegen Weizenprolamin, LMW- und HMW-Proteinen, wobei die konjugierten Antikörper in einer Lösung vorliegen (Kombinationskonjugat). Diese Detektionsantikörper sind so konjugiert, dass deren Bindung quantifizierbar wird. Dies kann z. B. durch Konjugation mit einem farbstoffbildenden Reporterenzym vorgenommen werden. Darüber hinaus werden die verwendeten konjugierten Detektionsantikörper gegen Prolamine und Gluteline im Kombinationskonjugat erfindungsgemäß derart gemischt, dass alle Glutenfraktionen bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden.
Die Quantifizierung erfolgt durch Vergleich der Gesamtsignalstärke einer Probe mit den Signalstärken von Glutenkalibratoren bekannten Gehaltes. Als Kalibratormaterial kann z. B. ein Extrakt aus Weizenmehl verwendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend mit konkreten Ausführungsbeispielen näher erläutert, welche jedoch nicht beschränkend für den Schutzumfang der Erfindung sein sollen. Für einen Fachmann naheliegende Abwandlungen und Änderungen der Erfindung fallen dementsprechend unter den Schutzumfang der Patentansprüche.
Wie bereits in einem der oberen Abschnitte erwähnt, ist der Gesamt- Glutenbestimmung die Extraktion der Glutenproteine aus der zu untersuchenden Probe unter Zusatz von chaotropen Salzen in Anwesenheit von aliphatischen kurzkettigen Alkoholen vorgeschaltet. Beispielhaft wird nachfolgend die Extraktion von Weizen-Glutenproteinen aus Lebensmittelproben verschiedenster Art mit einer Cocktail-Extraktionslösung [0,76 g/L NaCI, 0,224 g/L KCl, 1 ,42 g/L Na2HP04 * 2H20, 0,272 g/L H2K04P, 191 g/L Guanidin-HCI, 18,2 ml/L ß-Mercaptoethanol] (EP 1 424 345 A1 ) stichpunktartig beschrieben. - Eine ausreichend große Menge der Probe (mind. 5 g bzw. 5 ml) gut homogenisieren (sorgfältig zerstoßen, fein zermahlen und gut mischen bzw. die Lösung gut mischen).
- bei flüssigen Proben: zu 0,25 ml der homogenisierten Probe 2,5 ml Cocktail- Extraktionslösung (EP 1 424 345 A1 ) hinzugeben, Gefäß verschließen und gut mischen
- sonstige Proben (z.B. soja- und quinoahaltige Lebensmittelproben): 0,25 g der homogenisierten Probe einwiegen und 2,5 ml Cocktail-Extraktionslösung (EP 1 424 345 A1 ) hinzugeben, Gefäß verschließen und gut mischen
- tannin- und polyphenolhaltige Lebensmittelproben: (z.B. Schokolade, Kaffee, Kakao, Kastanienmehl, Buchweizen, Hirse und Gewürze): 0,25 g der homogenisierten Probe einwiegen, 0,25 g Magermilchpulver und 2,5 ml Cocktail-Extraktionslösung (EP 1 424 345 A1 ) hinzugeben, Gefäß verschließen und gut mischen
- Fleisch- und Wurstwarenproben: die Glutenverteilung kann in diesen
Lebensmitteln sehr ungleich sein, deshalb 50 g Probe einwiegen und homogenisieren: 0,25 g der homogenisierten Probe einwiegen und 2,5 ml Cocktail-Extraktionslösung hinzugeben, Gefäß verschließen und gut mischen
- Haferproben: die Glutenverteilung kann sehr ungleich sein, zusätzlich sind diese Proben schwer zu homogenisieren. Deshalb 200 g Probe homogenisieren, die Probenaufarbeitung sollte dann mindestens mit dem vierfachen Ansatz durchgeführt werden: 1 g der homogenisierten Probe einwiegen und 10 ml Cocktail-Extraktionslösung hinzugeben, Gefäß verschließen und gut mischen.
Alle Proben werden wie im Folgenden beschrieben weiter behandelt:
- 40 min bei 50 °C inkubieren
- Probe abkühlen lassen und anschließend mit 7,5 ml 80 % Ethanol versetzen (bei Haferproben: 30 ml 80 % Ethanol)
Gefäß verschließen und 1 h bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) über Kopf schütteln oder mittels Rotator rotieren lassen
- zentrifugieren: 10 min, mind. 2500 g, bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) und/oder filtrieren (alternativ 2 ml des Extraktes in ein Reaktionsgefäß überführen und in einer Mikrozentrifuge für 10 min hochtourig zentrifugieren) - den Überstand in ein verschließbares Röhrchen überführen
- die Probe 1 :25 (40 mI + 960 mI) mit Puffer, z. B. pH neutralem Phosphatpufferweiter verdünnen: der finale Verdünnungsfaktor ist 1000. Die so erhaltenen Proben werden anschließend zur Gesamt-Glutenbestimmung vorzugsweise in einem Sandwich-ELISA eingesetzt. Nachfolgend wird beispielhaft die Durchführung eines Sandwich-ELISAs zur Bestimmung von Gesamt-Gluten von weizenhaltigen Proben beschrieben. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, dass der Gesamt-Glutengehalt mit einem einzelnen Messschritt in einer einzelnen Kavität ermittelt wird. Dazu werden zunächst die Kavitäten einer handelsübliche Mikrotiterplatte mit spezifischen Fänger-Antikörpern gegen Gliadin (Weizenprolamin), LMW- und HMW-Glutenin (Weizengluteline) beschichtet; typischerweise mit Konzentrationen zwischen 0,5 und 5 pg/ml, wobei jede Kavität mit allen Antikörpern beschichtet wird. Unspezifische
Bindungen werden durch, aus der Literatur bekannten, Block- und Stabilisierungslösungen abgesättigt und anschließend die extrahierte Probe bzw. der Standard (Kalibrator) vorzugsweise als Doppelproben in die einzelnen Kavitäten zugegeben. Für die Herstellung des Kalibrators werden die Glutenproteine aus einem Weizenmehl mittels modifizierte Osborne Fraktionierung isoliert (Schalk et al. 2017). Zur Verbesserung der Haltbarkeit wird das so erhaltene Glutenisolat zur Trockne gebracht und gelagert. Zum Ansetzen der Kalibratoren wird dieses Isolat eingewogen, mittels Cocktail-Extraktionslösung (EP 1 424 345 A1 ) R-Biopharm (Produktnummer R7006) gelöst und in einem pH neutralem Phosphatpuffer auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt.
Nach erfolgter Proben- bzw. Kalibratorzugabe und einem anschließenden Waschschritt mit einem gängigen Waschpuffer (z. B. PBS/Tween) erfolgt die Zugabe von Detektions-Antikörpern gegen Gliadin (Weizenprolamin), LMW- und HMW- Glutenin (Weizengluteline), die alle jeweils mit einem Reporterenzym konjugiert sind. Dieses Gemisch von Detektionsantikörpern, die an anderen Stellen der Glutenproteine binden als die Fängerantikörper, wird nachfolgend als Kombinationskonjugat bezeichnet. (Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung des erfindungsgemäßen Kombinationskonjugats erfolgt im Abschnitt“Herstellung des Antikörper-Kombinationskonjugats“.) Nach anschließender Inkubation werden die einzelnen Kavitäten geleert, gewaschen, mit Substratreagenz aufgefüllt und für die Quantifizierung des Glutengehalts, also die quantitative Bestimmung des Anteils der an die Detektionsantikörper gebundenen Glutenproteine, durch Messung des Substratumsatzes durch die an die Detektionsantikörper gekoppelten
Reporterenzyme bestimmt.
Das oben näher erläuterte Ausführungsbeispiel mit einem Sandwich ELISA ist ein mögliches Verfahren. Weitere mögliche Verfahren sind z. B. ein kompetitiver ELISA (Antigenbeschichtung oder Antikörperbeschichtung), ein direkter ELISA sowie
Lateral-Flow-, Flow-Through-, Mikroarray- und mikrofluidische Formate. Diese Verfahren werden im folgenden kurz beschrieben.
Bei einem kompetitiven ELISA mit Antigenbeschichtung wird die Mikrotiterplatte mit einem Glutenextrakt, z. B. aus einem Weizenmehl beschichtet. Der Kalibrator ist identisch mit dem beim Sandwich-ELISA-Verfahren. Die Herstellung sowie die Einstellung der Einzelkonjugate und des Kombinationskonjugates erfolgen wie beim Sandwich-ELISA-Verfahren, allerdings nimmt die OD bei einem kompetitiven ELISA bei zunehmenden Glutenkonzentrationen ab. Die Probenextraktion ist identisch mit der beim Sandwich-ELISA-Verfahren.
Bei der ELISA-Testdurchführung werden im ersten Schritt Kalibratoren bzw. Proben in die Mikrotiterplattenvertiefungen gegeben und direkt anschließend wird das Kombinationskonjugat zugegeben und Kalibrator bzw. Proben und Konjugat werden gemeinsam inkubiert. Allerdings ist die Meerrettich-Peroxidase nicht stabil gegenüber der Cocktail Extraktionslösung in den Proben. Daher müssen die Antikörper in diesem Fall anders konjugiert werden, z. B. an Biotin. Nach einem weiteren Waschschritt erfolgt die Detektion über Meerrettich-Peroxidase gekoppeltes
Streptavidin. Alternativ werden unkonjugierte Antikörper verwendet und nach dem Waschschritt erfolgt die Detektion über Meerrettich-Peroxidase gekoppelten
Sekundärantikörper. In beiden Fällen erfolgt nach einem erneuten Waschschritt die Zugabe des Farbreagenz. Im letzten Schritt wird die Reaktion durch Zugabe der Stopp-Lösung beendet. Bei einem kompetitiven ELISA mit Antikörperbeschichtung wird die Mikrotiterplatte mit einer Lösung von Prolamin-, LMW- und HMW-Antikörper beschichtet, so dass in jeder Kavität alle Antikörper gebunden sind. Der Kalibrator ist identisch mit dem beim Sandwich-ELISA-Verfahren. Als Konjugate werden die Einzelproteinfraktionen Prolamine, LMW und HMW an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt. Die Einstellung der Einzel konjugate und des Kombinationskonjugates erfolgen analog zum Sandwich- ELISA-Verfahren, allerdings nimmt die OD bei einem kompetitiven ELISA bei zunehmenden Glutenkonzentrationen ab. Die Probenextraktion ist identisch mit der beim Sandwich-ELISA-Verfahren.
Bei der ELISA-Testdurchführung werden im ersten Schritt Kalibratoren bzw. Proben in die Kavitäten gegeben und inkubiert. Nach einem optionalen Waschschritt wird das Kombinationskonjugat in die Kavitäten pipettiert und inkubiert. Nach einem (erneuten) Waschschritt wird das Farbreagenz zugegeben und inkubiert. Im letzten Schritt wird die Reaktion durch Zugabe der Stopp-Lösung beendet.
Alternativ kann auch eine gemeinsame Inkubation von Kalibratoren bzw. Proben mit dem Kombinationskonjugat erfolgen. Allerdings ist die Meerrettich-Peroxidase nicht stabil gegenüber der Cocktail Extraktionslösung in den Proben. Daher müssen die Prolamin-, LMW- und HMW-Fraktion in diesem Fall anders konjugiert werden, z. B. an Biotin. Nach einem weiteren Waschschritt erfolgt die Detektion über Meerrettich- Peroxidase gekoppeltes Streptavidin. Nach einem erneuten Waschschritt wird das Farbreagenz zugegeben und inkubiert. Im letzten Schritt wird die Reaktion durch Zugabe der Stopp-Lösung beendet.
Bei einem direkten ELISA wird eine unbeschichtete Mikrotiterplatte verwendet. Der Kalibrator ist identisch mit dem beim Sandwich-ELISA-Verfahren. Die Herstellung sowie die Einstellung der Einzel konjugate und des Kombinationskonjugates erfolgen wie beim Sandwich-ELISA-Verfahren. Die Probenextraktion ist identisch mit der beim Sandwich-ELISA-Verfahren.
Im ersten Schritt der ELISA-Testdurchführung wird die unbeschichtete Mikrotiterplatte mit den Kalibratoren bzw. den Proben inkubiert. Nach einem Waschschritt wird als nächstes das Kombinationskonjugat zugegeben und inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt wird das Farbreagenz zugegeben und inkubiert. Im letzten Schritt wird die Reaktion durch Zugabe der Stopp-Lösung beendet.
Lateral-Flow Formate können dem Sandwich- oder kompetitiven Prinzip folgen. Bei Ersterem wird die Oberfläche einer streifenförmig zugeschnittenen Membran mit einer Lösung eines Gemisches von Prolamin-, LMW- und HMW-Antikörpern in Form einer schmalen Linie quer zur Laufrichtung beschichtet (Vgl Abb. 1 ). Die glutenhaltige Probenlösung wird über ein saugfähiges Material in den Bereich des Lateral-Flows transportiert, in dem sich ein Gemisch markierter Prolamin-, LMW- und HMW-Antikörper in getrockneter Form befinden. Die verwendeten konjugierten Detektionsantikörper gegen Prolamine und Gluteline im Kombinationskonjugat werden erfindungsgemäß derart gemischt, dass alle Glutenfraktionen bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden. Die Markierung der Antikörper folgt den Experten bekannten Methoden (z.B. in Form von kolloidalem Gold, farbigen, fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Nanopartikeln). Die Glutenproteine reagieren mit dem jeweiligen markierten spezifischen Antikörper und werden durch Kapillarkräfte weiter zum Bereich der Membran transportiert, der wie oben beschrieben mit membrangebundenen Prolamin-, LMW- und HMW-Antikörpern beschichtet wurde. Dort reagieren die Gluten-Antikörper-Komplexe mit den membrangebundenen Antikörpern und bilden so einen Sandwich, der durch die Ausbildung einer gefärbten Bande sichtbar wird. Die Signalstärke der Bande entspricht der Menge an Gluten in der Probe. Eine weitere Bande dient als Kontrollbande und zeigt die generelle Funktionalität des Lateral-Flows an. Das kompetitive Lateral-Flow Format folgt den Prinzipien des bereits beschriebenen kompetitiven ELISA, wobei das Gluten aus der Probe mit markierten spezifischen Antikörpern zuerst reagiert und dann durch Kapillarkräfte entlang der Membran transportiert wird, bis es auf eine Probenbande mit immobillisertem Gluten trifft. Eine Verringerung der Intensität der Probenbande zeigt die Anwesenkeit von Gluten an. Die verwendeten markierten Antikörper gegen Prolamine und Gluteline im Kombinationskonjugat werden erfindungsgemäß derart gemischt, dass alle Glutenfraktionen bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden. Alternativ befindet sich auf der Startlinie des Lateral-Flows markiertes Gluten, welches zusammen mit dem nicht-markierten Gluten aus der Probe durch Kapillarkräfte transportiert auf die Testbande mit immobiliserten spezifischen unmarkierten Antikörpern trifft. Hier findet eine Konkurrenzreaktion um die Antikörperbindungstellen statt. Dabei werden die verwendeten, gemischten Antikörper gegen Prolamine und Gluteline in der Testbande sowie die markierten, gemischten Glutenproteine auf der Startlinie des Lateral-Flows erfindungsgemäß derart gemischt, dass alle Glutenfraktionen bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden. Als Ergebnis färbt sich die Bande intensiver, wenn sich weniger Gluten in der Probe befindet. Flow-Through Formate folgen im Prinzip den bereits beschriebenen Funktionsprinzipien von Lateral-Flow Formaten, unterscheiden sich lediglich in der Tatsache, das der Stofftransport nicht entlang einer Membran sondern durch sie hindurch („through“) erfolgt. Anpassungen gegenüber den beschriebenen Lateral- Flow-Fomraten sind der einschlägigen Literatur zu entnehmen oder sind dem Experten bekannt.
Mikroarray- und mikrofluidische Formate folgen den bereits beschriebenen Prinzipien von ELISA und Lateral-Flow-Formaten. Weitere spezifische Einzelheiten sind der einschlägigen Literatur zu entnehmen oder sind dem Experten bekannt.
Herstellung des Antikörper-Kombinationskonjugats:
Für das Ausführungsbeispiel der Bestimmung des Gesamt-Glutengehaltes aus weizenhaltigen Proben, werden als Prolamin-Detektionsantiköper ein Gliadin- Antikörper gegen das Epitop QQPFP eingesetzt und als Glutelin-
Detektionsantikörper ein Antikörper gegen die LMW-Fraktion extrahiert aus Weizenmehl und ein Antikörper gegen HMW mit der Epitoperkennungssequenz GYYPTS eingesetzt.
Die verschiedenen Detektionsantikörper werden unter Einsatz kommerzieller Konjugationsreagenzien (z. B. Pierce™ Conjugate Purification Kit Katalognummer 44920) separat an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt. Anschließend werden die so erhaltenen Antikörperkonjugate erfindungsgemäß derart gemischt, dass alle Glutenfraktionen bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden. Dazu wird das Kombinationskonjugat mit Verdünnungsreihen von Prolamin-, LMW- und HMW-Fraktionen aus Weizen getestet. Falls keine vergleichbare Signalstärke erreicht wird, wird das Mischungsverhältnis der Einzel konjugate entsprechend ihrer Reaktivitäten mit den Weizenfraktionen im Kombinationskonjugat angepasst. Dazu kann es hilfreich sein, die Einzelkonjugate zunächst getrennt voneinander anzusetzen und die Verdünnungsfaktoren der Einzelkonjugate in einer Vortestung abzuschätzen (siehe Tabelle 1 ). Anschließend werden die Einzel konjugate im Kleinansatz gemischt und die Reaktivität des Kombinationskonjugates wie oben beschrieben überprüft und ggf. werden die Verdünnungsfaktoren der Einzelkonjugate weiter angepasst. Erst nach erfolgreicher Einstellung im Kleinansatz werden die Einzelkonjugate auch insgesamt kombiniert.
Tabelle 1 zeigt das Beispiel einer solchen Vortestung. Flierzu werden die spezifischen Antikörperkonjugate zunächst einzeln mit der oben genannten beschichteten Mikrotiterplatte getestet. Ein Weizengesamtglutenextrakt wird auf drei verschiedene Konzentrationen verdünnt, bei denen jeweils dieselbe Menge an entweder Prolamin-, LMW- oder HMW-Proteine enthalten sind. So enthält ein Gesamtglutenextrakt mit der Konzentration 15,5 ng/ml Gesamtglutenprotein umgerechnet 10 ng/ml Gliadin. Entsprechend enthält ein Gesamtglutenextrakt mit der Konzentration 44,5 ng/ml Gesamtglutenprotein 10 ng/ml LMW-Proteine und ein Gesamtglutenextrakt mit der Konzentration 80 ng/ml 10 ng/ml HMW-Proteine (siehe Tabelle 1 ).
Tabelle 1: Auswahl von Gesamtglutenkonzentrationen, bei denen die Konzentration der jeweiligen Einzelfraktionen denselben Wert besitzt. Alle Angaben in ng/ml.
Die Gliadin-, LMW- und HMW-spezifischen Antikörperkonjugate werden nun so eingestellt d. h. derart verdünnt, dass der Gliadin-Antikörper mit dem 15,5 ng/ml Gesamtglutenextrakt dieselbe Signalstärke besitzt (im Beispiel in Tabelle 2: 2,0) wie der LMW-Antikörper mit dem 44,5 ng/ml Gesamtglutenextrakt und der HMW- Antikörper mit dem 80 ng/ml Gesamtglutenextrakt (Tabelle 2).
Tabelle 2: Beispiel der Vortestung von Einzelkonjugatverdünnungen.
Anschließend wird das Kombinationskonjugat mit Kalibrationsreihen der Einzelfraktionen (Weizenprolamine, LMW- und HMW-Proteine) überprüft (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). Ggf. erfolgt eine weitere Anpassung der Zusammensetzung des Kombinationskonjugates. Die Einzelfraktionen werden durch Extraktion aller Proteine aus einem Weizenmehl und anschließender Auftrennung in der HPLC erhalten (Schalk et al. 2017). Zur Verbesserung der Haltbarkeit werden die so erhaltenen Proteinisolate zur Trockne gebracht und gelagert. Zum Ansetzen der Stocklösungen werden die Fraktionen eingewogen, mittels Cocktail- Extraktionslösung (EP 1 424 345 A1 ) gelöst und in einem pH neutralen Phosphatpuffer auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt.
Im Anschluss ist noch einmal ein detailliertes Ausführungsbeispiel eines Sandwich ELISAs zur quantitativen Glutenbestimmung von einer Getreide oder Lebensmittelprobe z. T. aufgeführt:
- Je 100 pl der Standardlösung bzw. der vorbereiteten Proben in Doppelbestimmung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren und 20 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) inkubieren. - Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 pl Waschpuffer (PBS/Tween) waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen.
- Je 100 pl des Kombinationskonjugates in die entsprechenden Kavitäten pipettieren und weitere 20 min bei Raumtemperatur (20 25 °C) inkubieren.
- Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 mI Waschpuffer waschen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen.
- Je 100 mI einer handelsüblichen Meerrettich-Peroxidase Substrat/Chromogenlösung in die Kavitäten pipettieren. Vorsichtig manuell mischen und 10 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) im Dunkeln inkubieren. Je 100 mI Stopp Lösung in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell mischen. Die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stopp Lösung in einem handelsüblichen Photometer messen.
Quantifizierung des Gesamt-Glutengehalts von verschiedenen Weizenmehlen:
Weizenmehle können sich sowohl im Gesamtproteingehalt als auch in der Zusammensetzung der Glutenproteine deutlich unterscheiden (Hajas et al. 2017). Aufgrund der Einstellung der Einzelkonjugate sollten Unterschiede in der Zusammensetzung der Glutenproteine keinen Einfluss auf die Messung haben, da dieselbe Menge an Einzelfraktionprotein zu einem vergleichbaren Signal führt, egal um welche Weizenproteinfraktion es sich handelt (siehe Abbildung 2). Dadurch, dass alle Zöliakie-relevanten Glutenproteinfraktionen bestimmt werden, wird im Gegensatz zu herkömmlichen Testmethoden (siehe Stand der Technik) der Gesamtglutengehalt bei unterschiedlicher Glutenproteinzusammensetzung nicht verfälscht.
Für die Bestimmung des Gesamt-Glutengehalts von verschiedenen Weizenmehlen wurden neun Weizenmehle und ein Weizenmehlmix mit der Cocktail- Extraktionslösung aus EP 1 424 345 A1 extrahiert. Die Extrakte wurden im Extraktionsmedium und einem pH neutralen Probenverdünnungspuffer auf die Konzentrationen 0; 5; 10; 20; 40 und 80 ng/ml Gesamtglutenprotein verdünnt. Die Glutenproteingehalte der verschiedenen Mehle waren zuvor mittels HPLC ermittelt worden (Schalk et al. 2017). Abbildungen 4 und 5 zeigen, dass alle Weizenmehle innerhalb akzeptabler Schwankungsbereiten gefunden werden, insbesondere wenn der extrem hohe Verdünnungsfaktor berücksichtigt wird, der für die Messung der Extrakte erforderlich war.
Quantitative Bestimmung des Gesamt-Glutengehalts in anderen Getreiden. Auch andere Getreidemehle können sich sowohl im Gesamtproteingehalt als auch in der Zusammensetzung der Glutenproteine deutlich unterscheiden. Die Gesamtreaktivität des Messsystems hängt dabei von der Stärke der einzelnen Kreuzreaktivitäten der eingesetzten Antikörper zu den anderen Getreiden ab. So zeigen z. B. die Prolamine aus Weizen, Roggen und Gerste sehr große Sequenzhomologien, so dass hier mit einem hohen Level an Kreuzreaktivität des Prolaminantikörpers zu rechnen ist. Weiterhin zeigen die HMW-Proteine aus Weizen und Roggen große Sequenzhomologien, so dass auch hier von einer hohen Kreuzreaktivität des Weizen-HMW-Antikörpers auszugehen ist. Je nachdem, welche Sequenzen genau die Prolamin- und HMW-Antikörper erkennen und wie häufig diese Sequenzen in den Getreiden Vorkommen, ist auch mit einer Reaktivität der
Antikörper zu rechnen, die die Reaktivität gegenüber Weizen übersteigt. LMW- Proteine haben keine homologen Proteine in Roggen und Gerste, so dass hier nicht mit einer Kreuzreaktivität zu rechnen ist. Die Gerstengluteline besitzen kaum Homologien zu Weizen- und Roggenproteinen, so dass eine Detektion dieser Fraktion mit Antikörpern gegen Prolamine, HMW- und LMW Proteine nicht wahrscheinlich ist.
Für die Überprüfung der Reaktivität gegenüber Roggen- und Gerstenmehlen werden verschiedene kommerzielle Mehle und reine Sorten mit der Cocktail- Extraktionslösung aus EP 1 424 345 A1 extrahiert. Die Extrakte werden im
Extraktionsmedium und einem pH neutralen Probenverdünnungspuffer auf die Konzentrationen 0; 5; 10; 20; 40 und 80 ng/ml Gesamtglutenprotein verdünnt. Die Glutenproteingehalte der verschiedenen Mehle waren zuvor mittels HPLC ermittelt worden (Schalk et al. 2017). Abbildung 6 zeigt, dass alle Roggenmehle relativ ähnlich detektiert werden. Bei einer Berechnung der gemessenen Konzentrationen zeigt sich, dass alle Roggenmehle überbestimmt werden (Abbildung 7). Dies liegt in der erhöhten Reaktivität des eingesetzten Prolaminantikörpers gegenüber Roggenprolaminen begründet.
Im Gegensatz zu den Weizen- und Roggenmehlen zeigen die Gerstenmehle eine größere Schwankungsbreite (Abbildungen 8 und 9). Dies liegt vermutlich daran, dass die Gerstenfraktionen im Gegensatz zu den Weizen- und Roggenfraktionen unterschiedlich detektiert werden. Wie zu erwarten war, wird die Gerstenglutelinfraktion von keinem der eingesetzten Antikörper nennenswert detektiert, während die Prolamine sehr gut detektiert werden. Entsprechend würden geringe Verschiebungen in den Proteinfraktionen bei den verschiedenen Mehlen zu deutlichen Unterschieden führen. Bei einer generellen Über- oder Unterbestimmung von Getreiden gegenüber einem Weizenkalibratormaterial kann zur genaueren Glutengehaltsbestimmung ein Kalibrator mit Material aus dem entsprechenden anderen Getreide eingesetzt werden. Das beanspruchte Verfahren ermöglicht durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kombinationskonjugates die gleichzeitige Bestimmung von Prolamin und Glutelinproteinen und erlaubt damit erstmalig eine Quantifizierung des tatsächlichen Gesamt-Glutengehaltes. Dieses Verfahren einer gemeinsamen Bestimmung von Prolamin und Glutelinen ist sehr viel genauer als die bisher bekannten Methoden, bei denen nur der Prolamin-Gehalt bestimmt wird, aus dem anschließend wiederum der Gesamt-Glutengehalt berechnet wird. Die ebenfalls Zöliakie-relevanten Gluteline wurden bisher nicht mit bestimmt, was in der Vergangenheit zu falschen Ergebnissen führen konnte. Das beanspruchte Verfahren schließt diese Lücke.
Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur zur Bestimmung des Gesamt-Glutenhaltes weizenhaltiger Lebensmittelproben geeignet, sondern auch für die Bestimmung des Gesamt-Glutengehaltes anderer Triticum-Spezies-, und/oder Roggen- und/oder Gerste-haltigen Lebensmittel proben. Legende zu den Abbildungen
Abb. 1 Schematische Funktionsweise eines Lateral-Flow Assays im
Sandwichformat
Abb. 2 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber den verschiedenen Weizenmehlfraktionen
Abb. 3 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber den verschiedenen Weizenmehlfraktionen. Gemessene Konzentrationen für verschiedene Weizenmehlfraktionen bei einem Zielwert von 20 ng/ml
Abb. 4 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber verschiedenen kommerziellen Weizenmehlen und einigen reinen Weizensorten, deren Glutenproteingehalt jeweils mittels HPLC bestimmt wurde
Abb. 5 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber verschiedenen kommerziellen Weizenmehlen und reinen Weizensorten, deren Glutenproteingehalt jeweils mittels FIPLC bestimmt wurde.
Gemessene Konzentrationen bei einem Zielwert von 20 ng/ml
Abb. 6 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber verschiedenen kommerziellen Roggenmehlen und reinen Roggensorten, deren Glutenproteingehalt jeweils mittels HPLC bestimmt wurde, sowie aufgereinigter Roggenfraktionen
Abb. 7 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber verschiedenen kommerziellen Roggenmehlen und reinen Roggensorten, deren Glutenproteingehalt jeweils mittels HPLC bestimmt wurde, sowie aufgereinigten Roggenfraktionen. Gemessene Konzentrationen bei einem Zielwert von 20 ng/ml Abb. 8 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber verschiedenen kommerziellen Gerstenmehlen und reinen Gerstensorten, deren Glutenproteingehalt jeweils mittels HPLC bestimmt wurde, sowie aufgereinigten Gerstenfraktionen
Abb. 9 Testung der Reaktivität des Kombinationskonjugates gegenüber verschiedenen kommerziellen Gerstenmehlen und reinen Gerstensorten, deren Glutenproteingehalt jeweils mittels HPLC bestimmt wurde, sowie aufgereinigten Gerstenfraktionen. Gemessene Konzentrationen bei einem Zielwert von 20 ng/ml
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Quantifizierung von Gesamt-Gluten aus Getreide in Lebensmittelproben, bei dem eine Extraktion der Gesamt-Glutenproteine aus Lebensmittelproben und deren anschließende quantitative
Konzentrationsbestimmung mittels spezifischer Affinitätsbindung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung des Gesamtglutengehaltes in einem einzigen analytischen Lauf eine Kombination spezifischer Bindungsreagenzien gegen Prolamine und Gluteline eingesetzt wird, wobei die spezifischen Bindungsreagenzien gemischt in einer Einheit vorliegen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von Gesamt-Gluten mit einem ELISA, einem immunturbidimetrischen Assay, einem Lateral-Flow Assay, einem Flow-Through Assay, einem Mikroarray Assay oder einem mikrofluidischen Assay erfolgt, unter Verwendung der
Kombination spezifischer Bindungsreagenzien gegen Prolamine und Gluteline, wobei die spezifischen Bindungsreagenzien in einem homogenen bzw. einheitlichen Gemisch nicht physisch getrennt voneinander vorliegen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass als
Bindungsreagenzien, welche spezifisch gegen unterschiedliche Glutenfraktionen erzeugt wurden, Antikörper, Antikörperfragmente, Nanobodies, Aptamere, spezifische Rezeptoren, T-Zellrezeptoren und/oder Molecularly Imprinted Polymers (MIP); vorzugsweise Antikörper verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung von Gesamt-Gluten mit einem Sandwich-ELISA unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit einer gewünschten Anzahl von Kavitäten erfolgt, wobei jede einzelne Kavität der Mikrotiterplatte mit einem
Gemisch der spezifischen Fängerantikörper vorzugsweise gegen Prolamine und gegen Gluteline beschichtet wird, die extrahierte Lebensmittel probe oder ein Kalibrator in die jeweilige Kavität gegeben wird, nach einer Inkubation ungebundenes Proben-Material entfernt, anschließend ein einheitliches Kombinationskonjugat aus konjugierten Detektionsantikörpern gegen Prolamine und Gluteline in die Kavität zugegeben und durch Messung der Signalstärke der Detektionsantikörper die Gesamt-Glutenmenge einer einzelnen Kavität im Vergleich zu mitgeführten Kalibratoren bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten konjugierten Detektionsantikörper gegen Prolamine und Gluteline im Kombinationskonjugat derart gemischt werden, dass alle Glutenfraktionen (Gliadine, LMW-Glutenin Subunits und HMW-Glutenin Subunits jeweils aus Weizen, Prolamine aus Roggen und Gerste sowie HMW-
Secaline aus Roggen) bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Prolamin- Detektionsantiköper ein Antikörper gegen das Epitop QQPFP eingesetzt wird, als LMW-Detektionsantikörper ein Antikörper gegen die LMW-Fraktion extrahiert aus Weizenmehl und als FIMW-Detektionsantikörper ein Antikörper gegen das Epitop GYYPTS eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8 dadurch gekennzeichnet, dass ein Kalibrator mit Glutenproteinen aus Weizen, und/oder anderen Triticum- Spezies, und/oder Roggen und/oder Gerste verwendet wird.
8. Verwendung eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 - 7 zur Quantifizierung von Gesamtglutenproteinen aus Weizen-, und/oder anderen
Triticum-Spezies- und/oder Roggen- und/oder Gerste-haltigen Lebensmittelproben.
9. Testkit zur Quantifizierung von Gesamtgluten aus Weizen, und/oder Triticum- Spezies, und/oder Gerste und/oder Roggen in Lebensmittelproben, umfassend eine Mikrotiterplatte beschichtet mit Fängerantikörpern gegen Gliadine, LMW-Glutenin Subunits und HMW-Glutenin Subunits jeweils aus Weizen, Prolamine aus Roggen und Gerste sowie HMW-Secaline aus Roggen, Weizenmehlextrakt als Kalibrator, ein Kombinationskonjugat mit Meerettichperoxidase-konjugierten Detektionsantikörpern gegen oben genannte Proteinfraktionen aus Weizen, Roggen und Gerste, die derart verdünnt sind, dass alle Glutenfraktionen bei gleichem Massenanteil mit vergleichbarer Signalstärke gemessen werden, Farbreagenz (Substrat), Stopplösung, Probenverdünnungspuffer und Waschpuffer.
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