EP3692162A1 - Procede de detection de molecules d'acides nucleiques par hyperthermie magnetique et ensemble permettant une telle detection - Google Patents

Procede de detection de molecules d'acides nucleiques par hyperthermie magnetique et ensemble permettant une telle detection

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EP3692162A1
EP3692162A1 EP18779397.1A EP18779397A EP3692162A1 EP 3692162 A1 EP3692162 A1 EP 3692162A1 EP 18779397 A EP18779397 A EP 18779397A EP 3692162 A1 EP3692162 A1 EP 3692162A1
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
stranded
nanoparticle
nanoparticles
channel
Prior art date
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Pending
Application number
EP18779397.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Charlotte HORNY
Jean-Michel SIAUGUE
Vincent Dupuis
Mathieu LAZERGES
Jean Gamby
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Sorbonne Universite filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting one or more single molecule nucleic acid molecules, such as DNA or RNA, from a sample to be tested, and the implementation of this detection. using a biosensor.
  • RNAs for example certain microRNAs
  • the quantitative detection of microRNA-122 in a test sample can be used to diagnose liver diseases such as hepatitis B, C, as well as drug-induced diseases.
  • nucleic acid molecules For example at femtomolar concentrations, it is known to:
  • the specific amplification reaction is for example carried out by PCR (Polymerase Chain Reaction) or by amplification of isothermal nucleic acids, such as LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) or RPA (Recombinase Polymerase Amplification);
  • PCR requires time: several temperature conditioning cycles are required to amplify the targeted DNA or RNA.
  • amplification techniques of PCR, LAMP or RPA type can lead to quantization errors limiting the accuracy of a diagnosis resulting from the detection result, in particular when the amplification of RNA molecules comprising substantially ten bases.
  • Electrochemical DNA biosensors based on long- Electron transfer range investigating the efficiency of a microelectrode fluidic channel compared to an ultramicroelectrode in a two-electrode setup, Lab on a Chip, 16 (22), 4373-4381) describe the use of a system comprising two electrodes arranged in a micro-channel for detecting a target microRNA in solution in the micro-channel. At least one of the electrodes comprises a self-assembled monolayer of probed nucleic acid molecules. Hybridization of one or more RNA strands allows the passage of a faradic current in the presence of a redox couple in the solution. This system makes it possible to detect very low concentrations of RNA, for example greater than an attomolar.
  • the concentration of measured target molecules can be very dependent on the diffusion phenomena upstream of the detection, the adsorption phenomena of the target molecules, for example on the walls of the pipes allowing the target molecules to be transported to the electrodes. . These effects are amplified when the concentrations of target molecules are low, and the ratio between the wall surface area and the volume of liquid used increases.
  • An object of the invention is to propose a solution for detecting a quantity of nucleic acids present in a sample to be tested, including at a very low concentration, for example of the order of an attomolar, by limiting or avoiding errors caused by the effects of the diffusion and / or adsorption of the nucleic acids to be tested before their detection.
  • This object is achieved within the scope of the present invention by means of a method for detecting at least one single-stranded target nucleic acid molecule, the method comprising steps of:
  • the denaturation is carried out by magnetic hyperthermia, it is possible to denature duplexes while maintaining and / or limiting an average temperature of the liquid making it possible to avoid the denaturation of other biological compounds in solution in the liquid. , in particular by controlling a physiological temperature of the liquid.
  • the invention is advantageously completed by the following characteristics, taken individually or in any of their technically possible combinations: -
  • the micro-channel has a geometry and the liquid flow has a mean speed such that the nanoparticle or nanoparticles are transported on average for more than 8 seconds in the micro-channel portion;
  • the width L e of the gap is less than 5 mm
  • the nanoparticle comprises a core of ferromagnetic or ferrimagnetic material and a silica shell surrounding the core;
  • the core of the nanoparticle has a length and a width, and the average length of the core of the nanoparticle or nanoparticles is greater than 20 nm;
  • the core of the nanoparticle (s) comprises an aggregate of ferromagnetic or ferrimagnetic nuclei, the aggregate comprising on average at least two nuclei;
  • the average ratio of the length to the width of the nanoparticles is greater than 1.5;
  • the melting temperature of the duplexes is adapted so that more than the majority of the duplexes are denatured during step b) of the process;
  • step c) of detecting the target single-stranded molecule dispersed in the flow is implemented by electrochemistry by imposing an electric potential difference between two electrodes, the electrodes being partly arranged in the micro-channel;
  • At least one pair of electrodes comprising a working electrode and a counter-electrode, is arranged in the micro-channel, downstream of the part of the micro-channel arranged in the gap of the electromagnet, in the direction flow;
  • single-stranded nucleic acid probes are attached to a surface of one of the electrodes, said single-stranded molecules being adapted to be at least partially hybridized to the single-stranded target nucleic acid molecule (s);
  • one of the electrodes comprises at least one thin layer chosen from a thin layer of gold, a thin layer of platinum and a thin layer of carbon;
  • the liquid comprises a redox intercalator of the duplex and a pair of redox compounds;
  • the method comprises a step prior to step a) in which the nanoparticle or nanoparticles provided with single molecule nucleic acid probes are mixed with a sample to be tested: as the single nucleotide target nucleic acid molecules are Concentrating on the surface of the magnetic nanoparticles when mixing with the sample to be tested, it is possible to detect a concentration of single-stranded molecules of target nucleic acids with a better accuracy.
  • Another object of the invention is a set of detection of at least one single-stranded target nucleic acid molecule, the set comprising:
  • micro-channel in which a liquid can flow
  • the micro-channel comprising at least one part arranged in the air gap of the electromagnet, at least one magnetic nanoparticle of the core-shell type, and a plurality of molecules single - stranded nucleic acid probe probes attached to the nanoparticle, each single - stranded nucleic acid probe molecule being adapted to be at least partially hybridized to a single - stranded target nucleic acid molecule by forming a duplex,
  • the electromagnet being adapted to generate an alternating magnetic field having an intensity and a frequency adapted to cause a magnetic hyperthermia of the nanoparticle (s) when the nanoparticle (s) are transported by the liquid in the microparticle portion; channel arranged in the air gap of the electromagnet, so as to cause denaturation of the duplex formed by the single molecule nucleic acid probe and by the single molecule nucleic acid target molecule.
  • the assembly furthermore comprises at least two electrodes arranged at least partly in the microchannel, a voltage difference between the electrodes being adapted to be controlled in order to detect electrochemically the target single-stranded molecule dispersed in the flow;
  • the set comprises single-stranded probing nucleic acid molecules attached to a surface of one of the electrodes, said single-stranded molecules being adapted to be at least partially hybridized to the single-stranded target nucleic acid molecule (s);
  • one of the electrodes comprises at least one thin layer chosen from a thin layer of gold, a thin layer of platinum and a thin layer of carbon.
  • Another object of the invention is a core-shell type magnetic nanoparticle comprising a core made of ferromagnetic or ferrimagnetic material and a silica shell surrounding the core, in which the core of the nanoparticle has a length and a width, and in which the core length of the nanoparticle is greater than 20 nm.
  • the core comprises an aggregate of ferromagnetic or ferrimagnetic nuclei, the aggregate comprising at least three nuclei;
  • the ratio of the length to the width of the nanoparticle is greater than 1.5;
  • Another subject of the invention is a process for manufacturing magnetic nanoparticles of the core-shell type comprising a core of ferromagnetic or ferrimagnetic material and a silica shell surrounding the core, comprising steps of:
  • the saline solution has an ionic strength greater than or equal to 1 mM.
  • FIG. 1 is a transmission electron microscopy image of magnetic nanoparticles in maghemite
  • FIG. 2 illustrates the size of magnetic nanoparticles in maghemite
  • FIG. 3 is a transmission electron microscopy image of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell;
  • FIG. 4 illustrates the size of the core of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • Figure 5 illustrates the size of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • FIG. 6 is an image in transmission electron microscopy of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell;
  • FIG. 7 illustrates the size of the core of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • Figure 8 illustrates the size of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • FIG. 9 is a transmission electron microscopy image of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • Figure 10 illustrates the size of the core of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • FIG. 11 illustrates the size of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • Figure 12 is an image in transmission electron microscopy of magnetic nanoparticles including a core and a shell
  • FIG. 13 illustrates the size of the core of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • Figure 14 illustrates the size of magnetic nanoparticles comprising a core and a shell
  • FIG. 1 illustrates comparatively the hydrodynamic diameter of several types of magnetic nanoparticles
  • FIG. 16 illustrates the magnetization of several types of magnetic nanoparticles
  • FIG. 17 comparatively illustrates the heating power of several types of magnetic nanoparticles
  • FIG. 18 illustrates the proportion between the quantity of DNA released by magnetic nanoparticles with respect to the quantity of DNA initially present on the magnetic nanoparticles
  • FIG. 19 illustrates the evolution of the average temperature of the liquid during the magnetic hyperthermics of magnetic nanoparticles
  • FIG. 20 illustrates a detection array of a single-stranded target nucleic acid molecule
  • FIG. 21 illustrates a micro-channel adapted for the magnetic hyperthermia of magnetic nanoparticles and for the detection of a single-stranded molecule of target nucleic acids
  • FIG. 22 illustrates a method according to the invention
  • Figure 23 illustrates the proportion between the amount of DNA released by magnetic nanoparticles relative to the amount of DNA initially present on the magnetic nanoparticles
  • Figure 24 illustrates a system adapted for electrochemical detection of magnetic nanoparticles
  • Figure 25 illustrates an electrochemical detection of DNA.
  • hydropynamic diameter of a nanoparticle, or Stokes diameter, in a fluid medium, the RH value given by the following formula (1):
  • ke is the Boltzmann constant
  • T is the temperature in Kelvin
  • ⁇ is the viscosity of the medium
  • D is the diffusion coefficient of the nanoparticle in the medium. This radius can be measured for example by dynamic light scattering or DLS.
  • the "diameter” or “physical diameter” of a nanoparticle will be referred to as the diameter that can be observed by imaging the nanoparticle, for example by transmission electron microscopy (TEM).
  • length of a nanoparticle 3 is the maximum size of the nanoparticle, on a straight line passing through the center of inertia of this nanoparticle.
  • width / of a nanoparticle is designated 3 as the minimum size of the nanoparticle, on a straight line passing through the center of inertia of this nanoparticle.
  • any characteristic relating to a nanoparticle size is defined in the "physical" sense, for example observable by TEM, except when the hydropynamic term is specified.
  • air gap denotes a space separating two parts of the heart of an electromagnet locally.
  • the width of the gap L e denotes the minimum distance separating these two parts.
  • length of a channel refers to the size of a channel in the main flow direction of the fluid.
  • width of a channel refers to the maximum size of a channel in a direction transverse to the main flow direction of the fluid.
  • the term "height" of a channel refers to the minimum size of a channel in a direction transverse to the main flow direction of the fluid.
  • micro-channel or "microfluidic channel” denotes a channel comprising at least one input and at least one output, and whose height is less than 500 ⁇ .
  • magnetic nanoparticles in y-Fe 2 O 3 maghemite can be synthesized by the so-called Massart method, from colloidal magnetite.
  • the synthesis making it possible to produce the nanoparticles illustrated in FIG. 1 comprises an inorganic polycondensation step, in which two precursors Fe 2 (OH) 4 and Fe 3 (OH) 6 are formed. When the precursor concentration reaches a limit value, magnetite seeds are formed (nucleation) and grow. The formation of germs is controlled by the precursor concentration, blocking nucleation when it reaches a lower limit value and causes maturation and aging of the seeds. This process is described in more detail by LaMer, VK, & Dinegar, RH in Theory, production and mechanism of formation of monodispersed hydrosols, 1950, Journal of the American Chemical Society, 72 (11), 4847-4854.
  • the size and shape of the synthesized nanoparticles can be controlled, for lengths less than substantially 1 nm, by the ratio between the amount of Fe (II) and Fe (III), the temperature, the pH and the nature of the the base used.
  • the nanoparticles are then oxidized in an acid medium, resulting in the formation of maghemite Y-Fe 2 C
  • the size of the nanoparticles and their surface charge can be characterized, for example, by two techniques: dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM).
  • DLS dynamic light scattering
  • TEM transmission electron microscopy
  • FIG. 1 is a TEM photograph of a set of magnetic nanoparticles synthesized by the method previously described. These nanoparticles are referred to as "nuclei" 21. Nitric acid may be introduced into the medium in such a way as to cause the nuclei 21 of larger diameters to precipitate, and thus to filter them.
  • Figure 1 illustrates the cores 1 of larger diameters. The scale bar of Figure 1 corresponds to a length of 100 nm.
  • the cores 21, whose synthesis is described above have an average hydrodynamic diameter of 18.1 nm (measured by DLS) and an average length of 11 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the (physical) length of the nanoparticles of the sample
  • the curve (b) corresponds to an adjustment of the distribution P (l) of the length of the nanoparticles according to a law lognormal, whose parameters are the average length of nanoparticles and the standard deviation ⁇ , according to formula (2):
  • a magnetic nanoparticle 3 may comprise a core 22 and a shell 23.
  • the core 22 may comprise one or more cores 21.
  • the shell 23 may be manufactured by encapsulating the core 22 of a magnetic nanoparticle 3 in a silica shell 23.
  • the outer surface of the silica magnetic nanoparticle 3 can be functionalized by known methods, for example by using amino and / or carboxyl groups.
  • the silica shell makes it possible to screen the dipolar interactions of the magnetic cores 22.
  • the shell may for example be manufactured using a sol-gel process. This process first comprises a step in which a silica monomer (RSi (OR) 3) is condensed on the surface of a core 21.
  • silanol groups are formed and produce siloxane groups by intermolecular condensation.
  • a siloxane can be condensed on a hydroxyl group on the surface of the ring 21.
  • the silanol groups are then condensed on the silica and crosslinked so as to form a silica network.
  • TEOS added first, allows to initiate the crosslinking of the silica network and facilitates the condensation of APTS and PEOS.
  • the reaction is stopped by introducing ether which causes the nanoparticles to precipitate together by reducing the dielectric constant of the reaction medium.
  • the scale bar of Figure 3 corresponds to a length of 100 nm.
  • the core 22 of a magnetic nanoparticle 3 may be, more generally, made of a ferromagnetic or ferrimagnetic material.
  • the majority of the magnetic nanoparticles 3 illustrated in FIG. 3 have a core comprising a single core 21.
  • magnetic nanoparticles 3 of the core-shell type whose synthesis is described above, have a core 22 of average hydrodynamic diameter substantially equal to 25 nm (illustrated by column (c) and measured by DLS) and of average length substantially equal to 17 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the (physical) length of the nanoparticles of the sample, the curve (b) corresponds to an adjustment of the distribution of the length lo of the nanoparticles according to a log-normal law .
  • the magnetic nanoparticles 3 of the core-shell type have an average hydropynamic diameter substantially equal to 45 nm (illustrated by column (c) and measured by DLS) and of average length lo substantially equal to 42 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the (physical) length of the nanoparticles of the sample, the curve (b) corresponds to an adjustment of the length distribution of the nanoparticles according to a log law. -normal.
  • the size and appearance of the magnetic nanoparticles 3 can be modified.
  • the step of encapsulation in a silica shell 23 is preceded by a step of forming an aggregate 14 of a plurality of cores 21 made of ferromagnetic or ferrimagnetic material by dispersing the nuclei 21 in a saline solution so as to form the core 22.
  • the magnetic nanoparticles 3 are dispersed in a saline solution whose ionic strength is greater than or equal to 1 mM, preferably between 2 mM and 100 mM, and preferably between 4 mM and 50 mM.
  • the magnetic nanoparticles 3 are dispersed, for example, in three solutions comprising ammonium chloride, at concentrations of 2 mM, 4 mM and 5 mM.
  • FIG. 6 illustrates magnetic nanoparticles 3 manufactured according to a process according to the invention comprising a step of dispersing the nuclei 21 in a solution of NH4Cl at a concentration of 2.5 mM.
  • the magnetic nanoparticles 3 present in majority two cores 21 or more.
  • the scale bar of Figure 1 corresponds to a length of 100 nm.
  • magnetic nanoparticles 3 of the heart-shell type have a core 22 of average hydropynamic diameter substantially equal to 36 nm (illustrated by column (c) and measured by DLS ) and of average length substantially equal to 22 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the length of the nanoparticles of the sample, the curve (b) corresponds to an adjustment of the length of the nanoparticles according to a log-normal law.
  • magnetic nanoparticles 3 of the core-shell type have a mean hydropynamic diameter substantially equal to 57 nm (illustrated by column (c) and measured by DLS) and an average length of approximately 44 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the length of the nanoparticles of the sample, the curve (b) corresponds to an adjustment of the length distribution lo of the nanoparticles according to a log-normal law.
  • the magnetic nanoparticles 3 may be manufactured according to a process according to the invention comprising a step of dispersing the nuclei 21 in a solution of NH4Cl at a concentration of 4 mM.
  • the magnetic nanoparticles 3 and the core 22 of the magnetic nanoparticles 3 have an elliptical or ellipsoidal shape.
  • the length of the magnetic nanoparticles 3 is on average 80 nm and the length of the core 22 of the magnetic nanoparticles 3 is on average 49 nm.
  • the magnetic nanoparticles 3 may have a ratio of the length over the width greater than 1.5.
  • the scale bar of FIG. 1 corresponds to a length of 200 nm.
  • magnetic nanoparticles 3 of the core-shell type have a core 22 of average hydropynamic diameter substantially equal to 32 nm (illustrated by column (c) and measuring by DLS) and a mean length of approximately 49 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the length of the magnetic nanoparticles 3 of the sample, the neck (b) corresponds to an adjustment of the length distribution lo of the magnetic nanoparticles 3 according to a log-normal law.
  • magnetic nanoparticles 3 of the core-shell type have an average hydropynamic diameter substantially equal to 82 nm (illustrated by FIG. column (c) and measured by DLS) and a mean length lo substantially equal to 80 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the length of the magnetic nanoparticles 3 of the sample, the curve (b) corresponds to an adjustment of the length distribution lo of the magnetic nanoparticles 3 according to a law lognormal.
  • the magnetic nanoparticles 3 may be manufactured according to a method according to the invention comprising a step of dispersing the nuclei in a solution of NH4Cl at a concentration of 5 mM.
  • the magnetic nanoparticles 3 and the core 22 of the magnetic nanoparticles 3 have an elliptical or ellipsoidal shape.
  • the length of the magnetic nanoparticles 3 is on average 86 nm and the length of the core 22 of the magnetic nanoparticles 3 is on average 55 nm.
  • the scale bar of Figure 1 corresponds to a length of 200 nm.
  • the magnetic nanoparticles 3 of the heart-shell type have a core 22 of average hydropynamic diameter substantially equal to 62 nm (illustrated by column (c) and FIG. by DLS) and a mean length of approximately 55 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the length of the magnetic nanoparticles 3 of the sample, the neck (b) corresponds to an adjustment of the length distribution lo of the magnetic nanoparticles 3 according to a log-normal law.
  • magnetic nanoparticles 3 of the core-shell type have an average hydropynamic diameter substantially equal to 1 12 nm (illustrated by column (c) and measured by DLS. ) and an average length lo substantially equal to 86 nm.
  • the columns (a) of the histogram correspond to a measurement of the length of the magnetic nanoparticles 3 of the sample, the curve (b) corresponds to an adjustment of the length distribution lo of the magnetic nanoparticles 3 according to a law lognormal.
  • nanoparticles 3 of types A, B, C or D will be designated nanoparticles 3 manufactured respectively in the absence of a step of dispersing the nanoparticles 3 in a saline solution of NH 4 Cl, or in saline NH4Cl solutions preceding the encapsulation of the core 22 in the silica shell 23, with concentrations of 2.5 mM, 4 mM and 5 mM, respectively.
  • the hydrodynamic diameter of a nanoparticle 3 can be controlled by the ionic strength of the saline solution in which the nanoparticles 3 are dispersed before the step of growth of the shell 23.
  • the columns (a), (b), (c) and (d) in FIG. 1 illustrate the average hydrodynamic diameter of nanoparticles 3 of type A, B, C and D, respectively.
  • the nanoparticles 3 in accordance with the invention may have a higher magnetization than known magnetic nanoparticles, of which the heart comprises a single nucleus and without a shell. Magnetization is measured in the liquid phase as a function of the applied magnetic field.
  • the curves (a), (b), (c) and (d) in FIG. 16 illustrate the magnetization of nanoparticles 3, respectively of type A, B, C and D.
  • the curve (e) illustrates the magnetization of nanoparticles whose heart includes a single core and without shell.
  • the magnetization measurements are performed using a SQUI D magnetometer (English Superconducting QUANTUM Interference Device).
  • the nanoparticles 3 according to the invention may have a higher heating power than that of nanoparticles.
  • Magnetic known whose heart includes a single nucleus and without shell.
  • the heating power of the nanoparticles 3 driven by an alternating magnetic field is measured using the Magnetherm apparatus of Nanotherics.
  • m 1 is applied at a frequency of 535 kHz on a volume of 500 ⁇ of liquid comprising the nanoparticles 3, designated by volume of ferrofluid.
  • the volume of ferrofluid is introduced into a copper coil, which is part of a resonant RLC circuit, adapted to control a magnetic field AC in a frequency range between 300 and 550 kHz, and whose amplitude may be for example 10.56 kA. m 1 .
  • the coil is cooled by a circulation of water so as to avoid a thermal gradient effect on the measurements.
  • the temperature of the ferrofluid volume is measured using a nonmetallic optical fiber disposed at the center of the sample.
  • the SLP heating power can be increased by using nanoparticles 3 according to the invention, and preferably nanoparticles 3 in which the length of the core 22 of the nanoparticles 3 is greater than 20 nm.
  • the nanoparticles 3 according to the invention can be used to pre-concentrate, transport and release single-stranded target nucleic acid molecules 1 in solution, for example DNA or RNA molecules, in a controlled way by magnetic hyperthermia.
  • a plurality of single stranded nucleic acid probes can be attached to nanoparticle 3, with each single stranded nucleic acid molecule probe being adapted to be at least partially hybridized to a single stranded nucleic acid target molecule. by forming a duplex.
  • the capacity of a nanoparticle 3 to release single-stranded target nucleic acid molecules 1 in solution can be measured by attaching double-stranded DNA molecules to the surface of a nanoparticle 3 and then causing denaturation of the double-stranded DNA molecules. by heating the nanoparticle 3 and / or the solution surrounding the nanoparticle 3 locally by magnetic hyperthermia.
  • the ratio of the amount of target single-stranded DNA 1 released by nanoparticles 3 by magnetic hyperthermia to the amount of initial double-stranded DNA is measured when using Type C nanoparticles, type C compared to a denaturation by heating of double-stranded DNA molecules in solution without nanoparticles (positive control).
  • the attachment of double-stranded DNA molecules to the nanoparticles 3 can be carried out as follows.
  • Single-stranded DNA probes 18 are hybridized with single-stranded target DNA molecules 1 to form a duplex, in a MOPS buffer solution having a NaCl concentration of 0.5 M.
  • 100 equivalents of EDC and of NHS are introduced in solution.
  • a wait of 20 minutes activates the carboxy functions of single-stranded DNA probes 18.
  • a solution comprising nanoparticles 3 of type A or C is introduced into the reaction medium.
  • a type A nanoparticle 3 can present substantially 440 single-stranded DNA molecules probes 18 attached to its surface and a type C nanoparticle 3 can have substantially 1,100 single-stranded DNA probes 18 molecules attached to its surface.
  • a positive control is carried out by conditioning free duplexes in solution at an average temperature of 95 ° C. for 20 min, and then quantifying the number of single-stranded molecules of target DNA 1 in solution.
  • the positive control corresponds to the "95 ° C" column in FIG. 1: the ratio between the number of single-stranded target DNA molecules quantified in solution and the number of duplexes initially introduced is substantially equal to 100%.
  • the nanoparticles 3 types C, and more generally nanoparticles having a core 22 formed by a cluster of cores 21, are adapted, on the one hand, to present a greater quantity of nucleic acid duplexes on the same nanoparticle 3 than nanoparticles 3 of type A (for example, on average 100 DNA duplexes per nanoparticle 3 of type A with respect to 140 DNA duplex by type C nanoparticle), and on the other hand to release a larger proportion of nucleic acids per nanoparticle.
  • the controlled release of target nucleic acid molecules 1 by magnetic hyperthermia can be achieved by limiting the temperature variation of the solution comprising the nanoparticles 3 at 10 ° C., preferably at 5 ° C.
  • the curve of FIG. 19 illustrates the maintenance or the limitation of the temperature of the solution comprising nanoparticles 3 of type C during the control of an alternating magnetic field driving a magnetic hyperthermia of nanoparticles 3 of type C.
  • the magnetic hyperthermia of nanoparticles 3 may result in conditioning at a temperature above the melting temperature of the duplexes of the liquid layer surrounding a nanoparticle 3, the thickness of the layer being for example less than 10 nm.
  • the average temperature of the solution comprising the nanoparticles 3 varies between 22 ° C. and 28 ° C.
  • the release of target nucleic acid molecules 1 by magnetic hyperthermia according to the invention can be carried out at an average temperature. of the solution below the melting temperature of the duplexes, and preferably at a physiological and / or ambient temperature. It is thus possible to avoid the denaturation of other biological species present in an analysis solution comprising the target nucleic acid molecules 1.
  • FIG. 20 illustrates a detection array of single-stranded target nucleic acid molecules 1 comprising an electromagnet
  • the solenoid 10 can be parameterized as described in Lacroix, LM, Carrey, J., & Respaud, M. (2008), A frequency-adjustable electromagnet for hyperthermia measurements on magnetic nanoparticles, Review of scientific instruments, 79 (9), 093909.
  • the width of the gap is less than 5 mm.
  • the assembly also comprises a microsystem 7.
  • the microsystem 7 comprises at least one micro-channel 2, fluidly connecting at least one input 24 and an output 25. At least one part 1 1 of the micro-channel 2 is arranged in the air gap of the electromagnet 10, that is to say in the volume defined by the gap 9 of the electromagnet 10.
  • the microsystem 7 is adapted to be inserted into the air gap of the electromagnet 10.
  • the magnetic field may be generated in an air gap 9 with a width of 1.5 mm.
  • the magnetization coil may be coupled to a capacitor of 1 nF so as to form an LC circuit having a resonance frequency substantially equal to 180 Hz.
  • the resonant circuit is excited at the resonant frequency by an electric signal generator coupled to a resonant.
  • RF power amplifier and allows for example to produce a magnetic field of an amplitude of 370 oe (measured using a single turn coil).
  • the micro-channel 2 may for example be manufactured by isotropic wet etching of a glass slide by a solution of hydrofluoric acid (HF).
  • the engraved plate may be superimposed and sealed to another glass plate, so as to form the wall of a micro-channel 2, for example with a width of 300 ⁇ and for example a height of 50 ⁇ .
  • Each blade may for example have a thickness of 300 ⁇ , and the total thickness of the microsystem 7 a thickness of 600 ⁇ .
  • the microsystem 7 is adapted to be arranged in the gap 9 of an electromagnet 10, the width of the gap being for example 1 mm.
  • the micro-channel 2 can also be manufactured using soft photolithography microfabrication techniques, for example using microstructured PDMS layers, and / or thermo-molding techniques, for example using materials such as COC.
  • the electromagnet 10 comprises a magnetic core and a coil (not shown) forming an integer n of turns around the core of the magnet. the electromagnet.
  • the magnetic field H e can be given by the following formula (4):
  • the intensity of the magnetic field may be preferably greater than 150 G, preferably greater than 250 G and preferably greater than 370 G in the air gap 9. This intensity of the magnetic field is particularly suitable for driving a magnetic hyperthermia magnetic nanoparticles 3 in solution.
  • the micro-channel 2 has a part 1 1 arranged in the gap 9 or adapted to be arranged in the gap 9 of the electromagnet 10.
  • FIG. 21 illustrates a view from above of a micro-channel 2.
  • the micro-channel 2 comprises an input 24 and an output 25.
  • the geometry of the micro-channel 2 can be optimized so that the volume defined by the micro-channel 2 is maximized in the 9. Such an optimization can be implemented for example by a part 1 1 of the micro-channel 2 in coils in the gap 9.
  • the direction of flow 5 is illustrated by a black arrow.
  • the magnetic hyperthermia of the magnetic nanoparticles 3 can make it possible to detect a single-stranded molecule of target nucleic acids 1.
  • magnetic nanoparticles 3 to which single-stranded probes of nucleic acid molecules 18 are attached can be introduced into a test sample.
  • Target molecules in particular, microRNA molecules, such as microRNA molecules 122, whose presence can make it possible to diagnose liver diseases such as hepatitis B, C, as well as diseases caused by drugs.
  • the single-stranded target nucleic acid molecules 1 can, during this step, hybridize on the single-stranded molecules of probe nucleic acids 18 attached to the magnetic nanoparticles 3.
  • single-stranded nucleic acid target molecules 1 present in very small numbers. low concentration in a sample to be tested can be attached to the same place, that is to say on one or more magnetic nanoparticles 3.
  • a flow 5 of a liquid 12 is generated comprising at least one magnetic nanoparticle 3.
  • the nanoparticles 3 may have at their surfaces single-stranded nucleic acid probes and / or duplexes 4 formed by a single-stranded nucleic acid nucleic acid probe and a single-stranded target nucleic acid molecule 1.
  • the liquid flow 12 may for example be controlled by a syringe pump or by a pressure controller between the inlet 24 and the outlet 25 of the micro-channel 2.
  • an alternating magnetic field is generated in the part 1 1 of the micro-channel 2.
  • This alternating magnetic field may be preferentially generated by means of the electromagnet 10 described above.
  • the alternating magnetic field is adapted to cause a magnetic hyperthermia of the magnetic nanoparticles 3 so as to cause a denaturation of the duplexes 4.
  • the geometry of the micro-channel 2, in particular in the part 1 1, as well as the average speed the flow of the magnetic nanoparticles 3 in the liquid 12 are adapted so that the magnetic nanoparticles 3 are transported, on average, at least 8 seconds, preferably 9 seconds and preferably 10 seconds, in the part 1 1 of the micro-channel 2. This time is referred to as "residence time" in Part 11.
  • the denaturation of a duplex has a minimum time, below which, at a temperature allowing the denaturation of the duplex, the duplex is not yet denatured. It is then necessary to condition the duplexes to a temperature adapted to the denaturation longer than this minimum time, between 8 and 12 seconds, preferably between 9 and 1 1 seconds.
  • the geometry of the micro-channel 2 in the air gap 9 and the average speed of the flow make it possible to denature the duplexes 4 and to release the single-molecule molecules of target nucleic acids 1 in solution, into the liquid 12 of the 5.
  • the average residence time of the magnetic nanoparticles 3 in the flow 5 can be calculated by the following formula (5):
  • d is the length of the micro-channel 2 in the part 1 1 in the direction of the flow 5
  • h is the height of the micro-channel 2
  • w is the width of the microchannel 2
  • v is the average speed of the flow.
  • the single molecule or molecules of target nucleic acids 1 released in solution during step 103 is detected.
  • the term “detect” is used to measure the presence or absence of of single - stranded target nucleic acid molecule 1 in solution, and in particular to measure the concentration of single - stranded target nucleic acid molecule 1 in solution.
  • the means for detecting single-stranded nucleic acid target 1 molecules are described later.
  • FIG. 23 illustrates the proportion between the quantity of single-stranded molecules of Released target DNA 1 and the amount of duplex present on the magnetic nanoparticles 3 before the step of generating a magnetic field of the process.
  • the concentration of DNA in solution is measured, for example in the step of detecting the single molecule or molecules of target nucleic acid 1, by fluorimetry.
  • the quantification of DNA can for example be carried out using a fluorimeter having an excitation wavelength of 480 nm and an emission wavelength of 520 nm, and using a marker single-stranded nucleic acid molecules in solution such as Oligreen (registered trademark).
  • the column (a) of the histogram illustrates the proportion of free single-stranded DNA in solution quantized during a negative control, in which the step of generating a magnetic field is not implemented.
  • Column (b) of the histogram illustrates the proportion of free single-stranded DNA in solution quantized upon denaturation of duplex 4 driven by heating to 95 ° C of a static volume solution.
  • Column (c) of the histogram illustrates the proportion of free quaternized single-stranded DNA in a denaturation driven by static volume magnetic hyperthermia, as previously described.
  • Column (d) of the histogram illustrates the proportion of free single-stranded DNA in solution quantified during denaturation driven by magnetic hyperthermia according to a method according to the invention in a microchannel 2 in which a flow of liquid 5 12 comprising the single-stranded nucleic acid target molecules 1 is generated at an average flow rate of 0.1 1 ⁇ . ⁇ 1 .
  • Column (d) of the histogram illustrates the proportion of free single-stranded DNA in solution quantified during denaturation driven by magnetic hyperthermia according to a method according to the invention in a microchannel 2 in which a flow of liquid 5 12 comprising the single-stranded target nucleic acid molecules 1 is generated at an average flow rate of 0.01 ⁇ . ⁇ 1 .
  • Table 2 below presents characteristics of the conditions corresponding to column (d) and column (e):
  • the proportion of released DNA corresponding to the condition (d) is substantially equal to the proportion measured during the negative control.
  • the residence time between conditions (d) and (e) is respectively 3 seconds and 12 seconds.
  • the detection step can be implemented by electrochemical detection. Horny et al. (Horny, M. C, Lazerges, M., Siaugue, JM, Pallandre, A., Rose, D., Bedioui, F., ...
  • FIG. 24 illustrates a system in which electrodes 15 are arranged in the micro-channel 2 downstream of the part 1 1 of the micro-channel 2 with respect to the direction of flow 5.
  • the electrodes may for example be deposited on the portion of a glass slab corresponding to the micro-channel 2.
  • Thin layers of platinum and / or titanium and / or gold and / or carbon may be deposited, for example by a method of deposition by sputtering, or more generally by a physical vapor deposition.
  • a wall of the micro-channel 2 may have electrodes.
  • Single stranded nucleic acid molecules of probes 18 may be attached to the surface of at least one electrode 1 5, said single stranded molecules being adapted to be at least partially hybridized to the single stranded target nucleic acid molecule (s) 1.
  • These single-stranded nucleic acid probes 18 may, for example, be attached to a layer of gold electrode 15 via thiol groups to form a self-assembled layer. However, this type of layer has a maximum level of hybridization with single-chain molecules of target nucleic acids 1 relatively low, for example less than 1 5%.
  • single-stranded nucleic acid probes 18 may preferentially be attached to a thin layer of carbon, for example amorphous carbon of the ⁇ -CNx type, so as to increase the level of single-stranded hybridized target nucleic acid molecules 1 maximum.
  • the different electrodes 15 may be connected to one or more voltage generators, controlled by a control unit, so as to impose an electrical potential difference between a working electrode 16 and a counter electrode 17.
  • step of detecting the single-stranded nucleic acid target 1 molecules dispersed in the liquid 12 can be carried out by introducing an electrolyte comprising a couple of redox compounds Fe '"C N6 3 7 Fe" C N6 4 " , methylene blue as duplex intercalator of the duplex, and NaCl at a concentration of 0.5 M.
  • the curve (a) corresponds to a measurement of the impedance measured before a release of single-stranded molecules of target nucleic acids 1 by magnetic hyperthermia
  • the curve (b) corresponds to a measurement of the impedance measured after a release of single-stranded target nucleic acid molecules 1 by magnetic hyperthermia, according to a method according to the invention, during the which the charge transfer is facilitated by the formation of duplex 4.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de pré-concentration et de détection d'au moins une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible, le procédé comprenant des étapes de génération d'un écoulement de liquide comprenant au moins une nanoparticule magnétique dans un micro-canal et une pluralité de molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes attachées à la nanoparticule, de génération d'un champ magnétique alternatif dans la partie du micro-canal au moyen de l'électroaimant,le champ magnétique présentant une intensité et une fréquence adaptées pour entraîner une hyperthermie magnétique des nanoparticules de sorte à provoquer une dénaturation du duplex formé par la molécule monocaténaire d'acides nucléiques sonde et par la molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible, et une détection de la molécule monocaténaire cible dispersée dans le liquide.

Description

PROCEDE DE DETECTION DE MOLECULES D'ACIDES NUCLEIQUES PAR HYPERTHERMIE MAGNETIQUE ET ENSEMBLE PERMETTANT UNE TELLE
DETECTION DOMAINE DE L' INVENTION
L'invention concerne un procédé de détection d ' une ou plusieurs molécules monocaténaires d 'acides nucléiques, tel que de l'ADN ou de l'ARN , à parti r d ' un échanti llon à tester, et la mise en œuvre de cette détection en uti lisant un biocapteur.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L'identification de marqueurs spécifiques de certains types de cancers et de maladies infectieuses peut permettre un diagnostic précoce, peu coûteux, précis, fiable et rapide d ' une pathologie ciblée. Certains acides nucléiques, en particulier certains ARN, par exemple certains micro-ARN , sont des marqueurs connus de pathologies. Par exemple, la détection quantitative de micro-ARN- 122 dans un échantillon à tester peut permettre de diagnostiquer des maladies du foie comme l' hépatite B, C, ainsi que des maladies entraînées par des médicaments.
Pour détecter de basses concentrations en molécules d 'acides nucléiques, par exemple à des concentrations femtomolai res, il est connu de :
• mettre en œuvre une réaction d 'amplification spécifique d ' une ou plusieurs molécules d 'acides nucléiques à tester. La réaction d 'amplification spécifique est par exemple réalisée par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou par amplification d 'acides nucléiques isotherme, telle que la LAMP (Loop-mediated isothermal Amplification) ou la RPA (Recombinase Polymerase Amplification) ;
• détecter le produit de l'amplification . I l est par exemple connu de détecter le produit de l'amplification en utilisant des puces à ADN .
Toutefois, l' utilisation de la PCR nécessite du temps : plusieurs cycles de conditionnement en température sont nécessai res pou r amplifier l'ADN ou l'ARN ciblé. De plus, les techniques d 'amplification de type PCR, LAMP ou RPA peuvent entraîner des erreurs de quantification limitant la précision d ' un diagnostic issu du résultat de la détection, en particulier lors de l'amplification de molécules d 'ARN comprenant sensiblement une dizaine de bases.
A cet effet, il est connu d 'utiliser des techniques de détection dites directes, ne nécessitant pas d 'étape d 'amplification, pour détecter et/ou quantifier des molécules d 'acides nucléiques cibles. En particulier, il est connu d 'utiliser des méthodes de détection électrochimique. Horny et al. (Horny, M. C , Lazerges, M. , Siaugue, J. M. , Pallandre, A. , Rose, D. , Bedioui, F. , ... & Gamby, J . (2016), Electrochemical DNA biosensors based on long- range électron transfer: investigating the efficiency of a fluidic channel microelectrode compared to an ultramicroelectrode in a two-electrode setup, Lab on a Chip, 16(22), 4373-4381 ) décrivent l'utilisation d 'un système comprenant deux électrodes agencées dans un micro-canal pour détecter un micro-ARN cible en solution dans le micro-canal. Au moins une des électrodes comprend une monocouche autoassemblée de molécules d 'acides nucléiques sondes. L'hybridation d 'un ou plusieurs brins d 'ARN permet le passage d 'un courant faradique en présence d'un couple redox dans la solution. Ce système permet de détecter des concentrations très basses d 'ARN, par exemple supérieure à un attomolaire.
Toutefois, la concentration en molécules cibles mesurées peut être très dépendante des phénomènes de diffusions en amont de la détection, des phénomènes d 'adsorption des molécules cibles, par exemple sur les parois des conduites permettant aux molécules cibles d 'être transportées jusqu'aux électrodes. Ces effets sont amplifiés lorsque les concentrations en molécules cibles sont basses, et que le rapport entre la surface des parois et le volume de liquide utilisé augmente.
RESUME DE L' INVENTION
Un but de l'invention est de proposer une solution pour détecter une quantité d 'acides nucléiques présente dans un échantillon à tester, y compris à une concentration très faible, par exemple de l'ordre d 'un attomolaire, en limitant ou en évitant les erreurs entraînées par les effets de la diffusion et/ou de l'adsorption des acides nucléiques à tester avant leur détection. Ce but est atteint dans le cadre de la présente invention grâce à un procédé de détection d 'au moins une molécule monocaténaire d 'acides nucléiques cible, le procédé comprenant des étapes de :
a) génération d 'un écoulement de liquide comprenant au moins une nanoparticule magnétique de type cœur-coquille dans un micro-canal d 'un microsystème, et une pluralité de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes attachées à la nanoparticule, chaque molécule monocaténaire d 'acides nucléiques sonde étant adaptée pour être au moins partiellement hybridée à une molécule monocaténaire d 'acides nucléiques cible en formant un duplex, au moins une partie du micro-canal étant agencée dans l'entrefer d 'un électroaimant ; b) génération d 'un champ magnétique alternatif dans la partie du micro-canal au moyen de l'électroaimant, le champ magnétique alternatif présentant une intensité et une fréquence adaptées pour entraîner une hyperthermie magnétique des nanoparticules de sorte à provoquer une dénaturation du duplex formé par la molécule monocaténaire d 'acides nucléiques sonde et par la molécule monocaténaire d 'acides nucléiques cible ;
c) détection de la molécule monocaténaire cible dispersée dans le liquide.
Comme les molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles sont transportées par des nanoparticules magnétiques par l'écoulement jusqu 'à un détecteur, les effets d 'adsorption et de diffusion incontrôlées sont évités. Cela permet de détecter une concentration en molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles avec une meilleure précision.
De plus, comme la dénaturation est mise en œuvre par hyperthermie magnétique, il est possible de dénaturer des duplex tout en maintenant et/ou en limitant une température moyenne du liquide permettant d 'éviter la dénaturation d 'autres composés biologiques en solution dans le liquide, en particulier en contrôlant une température physiologique du liquide.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : - le micro-canal présente une géométrie et l'écoulement de liquide présente une vitesse moyenne telles que la ou les nanoparticules sont transportées en moyenne pendant plus de 8 secondes dans la partie du micro-canal ;
- la largeur Le de l'entrefer est inférieure à 5 mm ;
- la nanoparticule comprend un cœur en matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique et une coquille en silice entourant le cœur ;
- le cœur de la nanoparticule est en maghémite ;
- le cœur de la nanoparticule présente une longueur et une largeur, et la longueur moyenne du cœur de la ou des nanoparticules est supérieure à 20 nm ;
- le cœur de la ou des nanoparticules comprend un agrégat de noyaux ferromagnétiques ou ferrimagnétiques, l'agrégat comprenant en moyenne au moins deux noyaux ;
- le rapport moyen de la longueur sur la largeur des nanoparticules est supérieur à 1 ,5 ;
- la température de fusion des duplex est adaptée pour que strictement plus de la majorité des duplex soient dénaturés lors de l'étape b) du procédé ;
- l'étape c) de détection de la molécule monocaténaire cible dispersée dans l'écoulement est mise en œuvre par électrochimie en imposant une différence de potentiel électrique entre deux électrodes, les électrodes étant en partie agencées dans le micro-canal ;
- au moins un couple d 'électrodes, comprenant une électrode de travail et une contre-électrode, est agencé dans le micro-canal, en aval de la partie du micro-canal agencé dans l'entrefer de l'électroaimant, dans le sens de l'écoulement ;
- des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes sont attachées à une surface de l'une des électrodes, lesdites molécules monocaténaires étant adaptées pour être au moins partiellement hybridées à la ou aux molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles ;
- l'une des électrodes comprend au moins une couche mince choisie parmi une couche mince d 'or, une couche mince de platine et une couche mince de carbone ;
- le liquide comprend un intercalant redox du duplex et un couple de composés redox ; - le procédé comprend une étape antérieure à l'étape a) dans laquelle la ou les nanoparticules munie(s) des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes sont mélangées à un échantillon à tester : comme les molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles sont pré-concentrées à la surface des nanoparticules magnétiques lors du mélange avec l'échantillon à tester, il est possible détecter une concentration en molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles avec une meilleure précision.
Un autre objet de l'invention est un ensemble de détection d'au moins une molécule monocaténaire d 'acides nucléiques cible, l'ensemble comprenant :
- un électroaimant présentant un entrefer,
- un micro-canal dans lequel peut s'écouler un liquide, le micro-canal comprenant au moins une partie agencée dans l'entrefer de l'électroaimant, - au moins une nanoparticule magnétique de type cœur-coquille, et une pluralité de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes attachées à la nanoparticule, chaque molécule monocaténaire d 'acides nucléiques sonde étant adaptée pour être au moins partiellement hybridée à une molécule monocaténaire d 'acides nucléiques cible en formant un duplex,
l'électroaimant étant propre à générer un champ magnétique alternatif présentant une intensité et une fréquence adaptées pour entraîner une hyperthermie magnétique de la ou des nanoparticule(s) lorsque la ou les nanoparticule(s) sont transportées par le liquide dans la partie du micro-canal agencée dans l'entrefer de l'électroaimant, de sorte à provoquer une dénaturation du duplex formé par la molécule monocaténaire d 'acides nucléiques sonde et par la molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- l'ensemble comprend en outre au moins deux électrodes agencées au moins en partie dans le micro-canal, une différence de tension entre les électrodes étant propre à être contrôlée pour détecter par électrochimie la molécule monocaténaire cible dispersée dans l'écoulement ; - l'ensemble comprend des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes attachées à une surface de l'une des électrodes, lesdites molécules monocaténaires étant adaptées pour être au moins partiellement hybridées à la ou aux molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles ;
- l'une des électrodes comprend au moins une couche mince choisie parmi une couche mince d 'or, une couche mince de platine et une couche mince de carbone.
Un autre objet de l'invention est une nanoparticule magnétique de type cœur-coquille comprenant un cœur en matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique et une coquille en silice entourant le cœur, dans lequel le cœur de la nanoparticule présente une longueur et une largeur, et dans lequel la longueur du cœur de la nanoparticule est supérieure à 20 nm.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- le cœur est en maghémite ;
- le cœur comprend un agrégat de noyaux ferromagnétiques ou ferrimagnétiques, l'agrégat comprenant au moins trois noyaux ;
- le rapport de la longueur sur la largeur de la nanoparticule est supérieur à 1 ,5 ;
- la nanoparticule est combinée avec une pluralité de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes attachées à la nanoparticule ; Un autre objet de l'invention est procédé de fabrication de nanoparticules magnétiques de type cœur-coquille comprenant un cœur en matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique et une coquille en silice entourant le cœur, comprenant des étapes de :
a) formation d 'un agrégat d 'une pluralité de noyaux en matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique, par dispersion des noyaux dans une solution saline, de manière à obtenir le cœur ;
b) encapsulation du cœur dans la coquille en silice.
Avantageusement, la solution saline présente une force ionique supérieure ou égale à 1 mM. PRESENTATION DES DESSINS
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles : la figure 1 est une image en microscopie électronique à transmission de nanoparticules magnétiques en maghémite ;
la figure 2 illustre la taille de nanoparticules magnétiques en maghémite ; la figure 3 est une image en microscopie électronique à transmission de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 4 illustre la taille du cœur de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 5 illustre la taille de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
- la figure 6 est une image en microscopie électronique à transmission de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 7 illustre la taille du cœur de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 8 illustre la taille de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 9 est une image en microscopie électronique à transmission de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 10 illustre la taille du cœur de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
- la figure 1 1 illustre la taille de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 12 est une image en microscopie électronique à transmission de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 1 3 illustre la taille du cœur de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 14 illustre la taille de nanoparticules magnétiques comprenant un cœur et une coquille ;
la figure 1 5 illustre comparativement le diamètre hydrodynamique de plusieurs types de nanoparticules magnétiques ; la figure 1 6 illustre comparativement la magnétisation de plusieurs types de nanoparticules magnétiques ;
la figure 1 7 illustre comparativement la puissance de chauffe de plusieurs types de nanoparticules magnétiques ;
- la figure 1 8 illustre la proportion entre la quantité d 'ADN relarguée par des nanoparticules magnétiques par rapport à la quantité d 'ADN initialement présente sur les nanoparticules magnétiques ;
la figu re 19 illustre l'évolution de la température moyenne du liquide lors de l' hyperthermique magnétique de nanoparticules magnétiques ;
- la figure 20 illustre un ensemble de détection d ' une molécu le monocaténaire d 'acides nucléiques cible ;
la figure 21 illustre un micro-canal adapté pour l' hyperthermie magnétique des nanoparticu les magnétiques su r puce et pour la détection d ' une molécu le monocaténaire d 'acides nucléiques cible ;
- la figure 22 illustre un procédé conforme à l'invention ;
la figure 23 illustre la proportion entre la quantité d 'ADN relarguée par des nanoparticules magnétiques par rapport à la quantité d 'ADN initialement présente sur les nanoparticules magnétiques ;
la figure 24 illustre un système adapté pour une détection électrochimique de nanoparticules magnétiques ;
la figure 25 illustre une détection électrochimique d 'ADN.
DEFI NITIONS
On désigne par « diamètre hyd rodynamique » d ' une nanoparticule, ou diamètre de Stokes, dans un milieu fluide, la valeur RH donnée par la formule (1 ) suivante :
6πηϋ où ke est la constante de Boltzmann, T est la température en Kelvin , η est la viscosité du milieu, et D le coefficient de diffusion de la nanoparticule dans le milieu. Ce rayon peut être par exemple mesu ré par diffusion dynamique de la lumière ou DLS. On désignera par « diamètre » ou « diamètre physique » d ' une nanoparticule, le diamètre observable par imagerie de la nanoparticu le, par exemple par microscopie électronique à transmission (ou TEM).
On désigne par « longueur » L d ' une nanoparticule 3 la taille maximale de la nanoparticule, sur une d roite passant par le centre d 'inertie de cette nanoparticule.
On désigne par « largeur » / d ' une nanoparticu le 3 la taille minimale de la nanoparticule, sur une d roite passant par le centre d 'inertie de cette nanoparticule.
De manière générale, toute caractéristique se rapportant à une taille de nanoparticule, telle que la longueur ou la largeur, est définie au sens « physique », par exemple observable par TEM, sauf quand le terme hyd rodynamique est précisé.
On désigne par « entrefer » un espace séparant localement deux parties du cœur d ' un électroaimant. On désigne par largeur de l'entrefer Le la distance minimale séparant ces deux parties.
On désigne par « longueur » d'un canal la taille d 'un canal selon la direction principale d 'écoulement du fluide.
On désigne par « largeur » d'un canal la taille maximale d'un canal dans une direction transverse à la direction principale d'écoulement du fluide.
On désigne par « hauteur » d 'un canal la taille minimale d 'un canal dans une direction transverse à la direction principal d'écoulement du fluide.
On désigne par « micro-canal » ou « canal microfluidique » un canal comprenant au moins une entrée et au moins une sortie, et dont la hauteur est inférieure à 500 μιη.
DESCRIPTION DETAILLEE D' UN MODE DE REALISATION DE L' INVENTION
En référence à la figure 1 , des nanoparticules magnétiques en maghémite y- Fe203 peuvent être synthétisées par le procédé dit de Massart, à partir de magnétite colloïdale. La synthèse permettant de produire les nanoparticules illustrées en figure 1 comprend une étape de polycondensation inorganique, dans laquelle on forme deux précurseu rs Fe2(OH )4 et Fe3(OH )6. Quand la concentration en précurseur atteint une valeur limite, des germes de magnétite sont formés (nucléation ) et croissent. La formation des germes est contrôlée par la concentration en précurseur, bloquant la nucléation quand elle atteint une valeur limite inférieure et entraîne la maturation et le vieillissement des germes. Ce procédé est décrit plus en détails par LaMer, V. K. , & Dinegar, R. H. dans Theory, production and mechanism of formation of monodispersed hydrosols, 1950, Journal of the American Chemical Society, 72(1 1 ), 4847-4854.
La taille et la forme des nanoparticules synthétisées peuvent être contrôlées, pour des longueurs inférieures à sensiblement 1 5 nm, par le rapport entre la quantité de Fe (I I ) et de Fe(l l l ), par la température, le pH et la nature de la base utilisée. Les nanoparticules sont ensuite oxydées dans un milieu acide, entraînant la formation de maghémite Y-Fe2C
La taille des nanoparticules et leur charge de surface peuvent être caractérisées par exemple par deux techniques : la diffusion dynamique de la lumière (DLS pour dynamic light scattering en anglais) et la microscopie électronique en transmission (TEM en anglais pour Transmission Electron Microscopy).
La figure 1 est une photographie en TEM d 'un ensemble de nanoparticules magnétiques synthétisées par la méthode précédemment décrite. Ces nanoparticules sont désignées par « noyaux » 21 . On peut introduire dans le milieu de l'acide nitrique de manière à entraîner la précipitation des noyaux 21 de plus grands diamètres, et ainsi les filtrer. La figure 1 illustre les noyaux 1 de plus grands diamètres. La barre d 'échelle de la figure 1 correspond à une longueur de 100 nm. En référence à la figure 2, les noyaux 21 , dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un diamètre hydrodynamique moyen de 18, 1 nm (mesuré par DLS) et une longueur moyenne lo de 1 1 nm. Les colonnes (a) de l'histogramme correspondent à une mesure de la longueur (physique) des nanoparticules de l'échantillon, la courbe (b) correspond à un ajustement de la distribution P(l) de la longueur des nanoparticules selon une loi log- normale, dont les paramètres sont la longueur moyenne des nanoparticules et l'écart type σ, selon la formule (2) :
(2) En référence à la figure 3, une nanoparticule magnétique 3 conforme à l'invention peut comprendre un cœur 22 et une coquille 23. Le cœur 22 peut comprendre un ou plusieurs noyaux 21 . La coquille 23 peut être fabriquée par encapsulation du cœur 22 d'une nanoparticule magnétique 3 dans une coquille 23 en silice. Ainsi, la surface extérieure de la nanoparticule magnétique 3 en silice est fonctionnalisable par des méthodes connues, par exemple en utilisant des groupes aminés et/ou carboxyles. De plus, la coquille en silice permet d'écranter les interactions dipolaires des cœurs 22 magnétiques. La coquille peut par exemple être fabriquée en utilisant un procédé sol-gel. Ce procédé comprend d'abord une étape lors de laquelle on condense un monomère de silice (RSi(OR)3) sur la surface d'un noyau 21 . Il s'en suit des étapes d'hydrolyse et de condensation dans un mélange d'eau et d'éthanol. Pendant l'hydrolyse, des groupements silanols sont formés et produisent des groupements siloxanes par condensation intermoléculaire. Un siloxane peut être condensé sur un groupement hydroxyle à la surface du noyau 21 . Les groupements silanols sont ensuite condensés sur la silice et réticulent de manière à former un réseau de silice. Le TEOS, ajouté en premier, permet d'initier la réticulation du réseau de silice et facilite la condensation d'APTS et de PEOS. La réaction est arrêtée en introduisant de l'éther qui entraînent une précipitation des nanoparticules entre-elles, par une réduction de la constante diélectrique du milieu réactionnel. La barre d'échelle de la figure 3 correspond à une longueur de 100 nm.
Le cœur 22 d'une nanoparticule magnétique 3 peut être, de manière plus générale, fabriqué dans un matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique. La majorité des nanoparticules magnétiques 3 illustrées dans la figure 3 ont un cœur comprenant un seul noyau 21 .
En référence à la figure 4, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un cœur 22 de diamètre hydrodynamique moyen sensiblement égal à 25 nm (illustré par la colonne (c) et mesuré par DLS) et de longueur moyenne sensiblement égale à 17 nm. Les colonnes (a) de l'histogramme correspondent à une mesure de la longueur (physique) des nanoparticules de l'échantillon, la courbe (b) correspond à un ajustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticules selon une loi log-normale. En référence à la figure 5, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 45 nm (illustré par la colonne (c) et mesuré par DLS) et de longueur moyenne lo sensiblement égale à 42 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesure de la longueur (physique) des nanoparticules de l'échantillon, la courbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticu les selon une loi log-normale.
En référence à la figure 6, la tai lle et l'aspect des nanoparticules magnétiques 3 peuvent être modifiés. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention , l'étape d 'encapsu lation dans une coqui lle 23 de silice est précédée d ' une étape de formation d ' un agrégat 14 d ' une pluralité de noyaux 21 en matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique, par dispersion des noyaux 21 dans une solution saline, de manière à former le cœu r 22. Préférentiellement, les nanoparticules magnétiques 3 sont dispersées dans une solution saline dont la force ionique est supérieure ou égale à 1 mM, préférentiellement comprise entre 2 mM et 1 00 mM, et préférentiellement comprise entre 4 mM et 50 mM. On disperse par exemple les nanoparticu les magnétiques 3 dans trois solutions comprenant du chlorure d 'ammonium, aux concentrations de 2 mM, 4 mM et 5 mM. La figure 6 illustre des nanoparticules magnétiques 3 fabriquées selon un procédé conforme à l'invention comprenant une étape de dispersion des noyaux 21 dans une solution de NH4CI à une concentration de 2, 5 mM. Les nanoparticu les magnétiques 3 présentent en majorité deux noyaux 21 ou plus. La barre d 'échelle de la figure 1 correspond à une longueur de 1 00 nm .
En référence à la figure 7, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un cœur 22 de diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 36 nm (illustré par la colonne (c) et mesuré par DLS) et de longueur moyenne sensiblement égale à 22 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesure de la longueur des nanoparticules de l'échantillon, la courbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticu les selon une loi log-normale.
En référence à la figure 8, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 57 nm (illustré par la colonne (c) et mesu ré par DLS) et une longueu r moyenne sensiblement égale à 44 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesure de la longueur des nanoparticules de l'échantillon , la courbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticules selon une loi log-normale.
En référence à la figure 9, les nanoparticules magnétiques 3 peuvent être fabriquées selon un procédé conforme à l'invention comprenant une étape de dispersion des noyaux 21 dans une solution de NH4CI à une concentration de 4 mM. Les nanoparticu les magnétiques 3 et le cœur 22 des nanoparticules magnétiques 3 présentent une forme elliptique ou ellipsoïdale. La longueu r des nanoparticules magnétiques 3 est en moyenne de 80 nm et la longueur du cœur 22 des nanoparticules magnétiques 3 est en moyenne de 49 nm. D' une manière plus générale, les nanoparticules magnétiques 3 peuvent présenter un rapport de la longueu r su r la largeur supérieu r à 1 , 5. La barre d 'échelle de la figure 1 correspond à une longueu r de 200 nm.
En référence à la figure 1 0, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un cœur 22 de diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 32 nm (illustré par la colonne (c) et mesu ré par DLS) et une longueu r moyenne lo sensiblement égale à 49 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesure de la longueu r des nanoparticules magnétiques 3 de l'échantillon, la cou rbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticules magnétiques 3 selon une loi log-normale.
En référence à la figure 1 1 , les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 82 nm (illustré par la colonne (c) et mesu ré par DLS) et une longueur moyenne lo sensiblement égale à 80 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesu re de la longueur des nanoparticules magnétiques 3 de l'échantillon, la courbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticules magnétiques 3 selon une loi log-normale.
En référence à la figure 12, les nanoparticules magnétiques 3 peuvent être fabriquées selon un procédé conforme à l'invention comprenant une étape de dispersion des noyaux dans une solution de NH4CI à une concentration de 5 mM. Les nanoparticules magnétiques 3 et le cœur 22 des nanoparticules magnétiques 3 présentent une forme elliptique ou ellipsoïdale. La longueur des nanoparticules magnétiques 3 est en moyenne de 86 nm et la longueur du cœur 22 des nanoparticules magnétiques 3 est en moyenne de 55 nm. La barre d 'échelle de la figure 1 correspond à une longueu r de 200 nm.
En référence à la figure 1 3, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un cœur 22 de diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 62 nm (illustré par la colonne (c) et mesu ré par DLS) et une longueu r moyenne lo sensiblement égale à 55 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesure de la longueu r des nanoparticules magnétiques 3 de l'échantillon, la cou rbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticules magnétiques 3 selon une loi log-normale. En référence à la figure 14, les nanoparticules magnétiques 3 de type cœur-coquille, dont la synthèse est décrite précédemment, présentent un diamètre hyd rodynamique moyen sensiblement égal à 1 12 nm (i llustré par la colonne (c) et mesu ré par DLS) et une longueur moyenne lo sensiblement égale à 86 nm. Les colonnes (a) de l' histogramme correspondent à une mesu re de la longueur des nanoparticules magnétiques 3 de l'échantillon, la courbe (b) correspond à un aj ustement de la distribution de la longueur lo des nanoparticules magnétiques 3 selon une loi log-normale.
Les longueurs lo des différentes nanoparticules 3 présentées précédemment sont résumées dans le tableau 1 ci -dessous. [NhUCl] nanoparticules 3 longueurs (nm)
(mM) sphériques lo - cœur (nm) lo - nanoparticule (nm)
A 17 42 0
B 22 44 2,5 ellipsoïdales
C 49 80 4
D 55 86 5
Tableau 1 Dans la suite de la description, on désignera par nanoparticules 3 de types A, B, C ou D des nanoparticules 3 fabriquées respectivement en l'absence d'étape de dispersion des nanoparticules 3 dans une solution saline de NH4CI, ou dans des solutions salines de NH4CI précédant l'encapsulation du cœur 22 dans la coquille 23 en silice, de concentrations respectivement égales à 2,5 mM, 4 mM et 5 mM.
En référence à la figure 15, le diamètre hydrodynamique d'une nanoparticule 3 peut être contrôlé par la force ionique de la solution saline dans laquelle les nanoparticules 3 sont dispersées avant l'étape de croissance de la coquille 23. Les colonnes (a), (b), (c) et (d) dans la figure 1 5 illustrent le diamètre hydrodynamique moyen de nanoparticules 3 respectivement de type A, B, C et D.
En référence à la figure 16, les nanoparticules 3 conformes à l'invention, et préférentiellement les nanoparticules 3 conformes à l'invention comprenant un cœur comprenant un agrégat 14 de noyaux 21 , peuvent présenter une magnétisation plus élevée que des nanoparticules magnétiques connues, dont le cœur comprend un seul noyau et sans coquille. La magnétisation est mesurée en phase liquide en fonction du champ magnétique appliqué. Les courbes (a), (b), (c) et (d) dans la figure 16 illustrent la magnétisation de nanoparticules 3 respectivement de type A, B, C et D. La courbe (e) illustre la magnétisation de nanoparticules dont le cœur comprend un seul noyau et sans coquille. Les mesures de magnétisation sont réalisées en utilisant un magnétomètre de type SQUI D (de l'anglais Superconducting QUantum Interférence Device).
En référence à la figure 1 7, les nanoparticules 3 conformes à l'invention, et préférentiellement les nanoparticules 3 conformes à l'invention comprenant un cœur comprenant un agrégat 14 de noyaux 21 , peuvent présenter une puissance de chauffage plus élevée que celle de nanoparticules magnétiques connues, dont le cœur comprend un seul noyau et sans coquille. La puissance de chauffage des nanoparticules 3 entraînée par un champ magnétique alternatif est mesurée en utilisant l'appareil Magnetherm de Nanotherics. Un champ magnétique de 10,56 kA. m 1 est appliqué à une fréquence de 535 kHz sur un volume de 500 μί de liquide comprenant les nanoparticules 3, désigné par volume de ferrofluide. Le volume de ferrofluide est introduit dans une bobine en cuivre, qui fait partie d 'un circuit RLC résonnant, adapté à commander un champ magnétique AC dans un gamme de fréquences comprises entre 300 et 550 kHz, et dont l'amplitude peut être par exemple de 10,56 kA. m 1. La bobine est refroidie par une circulation d 'eau de manière à éviter un effet de gradient thermique sur les mesures. La température du volume de ferrofluide est mesurée en utilisant une fibre optique non-métallique disposée au centre de l'échantillon. L'évolution de la température mesurée au cours de l'expérience dT/dt est linéaire et la puissance de chauffage SLP des nanoparticules 3 est calculée selon la formule (3) : SLP = ^ m ^i- . cv.—
v d (3)
,,Lmag UtL ' où cv est la capacité calorimétrique volumique de l'eau et mtotai et mmag sont respectivement la masse totale de l'échantillon et la masse du cœur 22 des nanoparticules 3. Ainsi, la puissance de chauffage SLP peut être augmentée en utilisant des nanoparticules 3 conformes à l'invention, et préférentiellement des nanoparticules 3 dans lesquelles la longueur du cœur 22 de la nanoparticules 3 est supérieure à 20 nm. Ainsi, une hyperthermie magnétique des nanoparticules 3, par exemple de type A, B, C et D illustrées par les points (a), (b), (c) et (d) dans la figure 1 7, commandée par un champ magnétique alternatif permet, dans des conditions prédéterminées, d'atteindre une température du liquide en contact avec les nanoparticules 3 plus élevée qu'en utilisant des nanoparticules connues, par exemple illustrées par le point (e) dans la figure 17. En effet, l'augmentation de la SLP avec la longueur du cœur 22 d'une nanoparticule 3 peut être expliquée en considérant qu'un ordre magnétique du cœur d'une nanoparticule 3 est gardé, lors de l'agrégation de plusieurs noyaux 21 , par exemple lors de de la formation d'un cœur 22 de forme générale ellipsoïdale plutôt que sphérique.
En référence à la figure 18, les nanoparticules 3 conformes à l'invention peuvent être utilisées pour pré-concentrer, transporter et relarguer des molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 en solution, par exemple des molécules d'ADN ou d'ARN, de manière contrôlée par hyperthermie magnétique. De manière générale, une pluralité de molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes 20 peuvent être attachées à la nanoparticule 3, chaque molécule monocaténaire d'acides nucléiques sonde 20 étant adaptée pour être au moins partiellement hybridée à une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible 1 en formant un duplex.
La capacité d'une nanoparticule 3 à relarguer des molécules monocaténaires d'acides nucléiques cible 1 en solution peut être mesurée en attachant des molécules bicaténaires d'ADN à la surface d'une nanoparticule 3 puis en entraînant la dénaturation des molécules bicaténaires d'ADN en chauffant localement la nanoparticule 3 et/ou la solution entourant la nanoparticule 3 par hyperthermie magnétique. Dans la figure 18, le rapport entre la quantité d'ADN monocaténaire cible 1 relarguée par des nanoparticules 3 par hyperthermie magnétique et la quantité d'ADN bicaténaire initial est mesuré lors de l'utilisation de nanoparticules de type A, de type C comparativement à une dénaturation par chauffage de molécules bicaténaires d'ADN en solution sans nanoparticules (contrôle positif).
L'attache de molécules bicaténaires d'ADN aux nanoparticules 3 peut être réalisée de la manière suivante. Des molécules monocaténaires d'ADN sondes 18 sont hybridées avec des molécules monocaténaires d'ADN cible 1 de manière à former un duplex, dans une solution tampon MOPS présentant une concentration en NaCl égale à 0,5 M. Ensuite, 100 équivalents de EDC et de NHS sont introduits en solution. Une attente de 20 minutes permet d'activer les fonctions carboxy des molécules monocaténaires d'ADN sondes 18. Enfin, une solution comprenant des nanoparticules 3 de type A ou C est introduite dans le milieu réactionnel. Des liaisons peptidiques de type EDC/NHS sont alors formées entre des terminaisons N H2 formées au préalable sur la surface en silice des coquilles 23 et les molécules monocaténaires d'ADN sondes 18, hybridées aux molécules monocaténaires d'ADN cibles 1 . Le nombre de duplex attachés sur une surface est maximisé. Une nanoparticule 3 de type A peut présenter sensiblement 440 molécules monocaténaires d'ADN sondes 18 attachées à sa surface et une nanoparticule 3 de type C peut présenter sensiblement 1 100 molécules monocaténaires d'ADN sondes 18 attachées à sa surface.
Avant de quantifier le nombre de molécules monocaténaires d'ADN cible 1 qui peuvent être relarguées par les nanoparticules 3, un témoin positif est réalisé en conditionnant des duplex libres en solution à une température moyenne de 95° C pendant 20 min, puis en quantifiant le nombre de molécules monocaténaires d'ADN cibles 1 en solution. Le témoin positif correspond à la colonne « 95° C » dans la figure 1 : le rapport entre le nombre de molécules monocaténaires d'ADN cible 1 quantifié en solution et le nombre de duplex introduits initialement est sensiblement égal à 100 %.
La colonne A de l'histogramme illustre un rapport sensiblement égal à
50 % entre le nombre de molécules monocaténaires d'ADN cibles 1 quantifiées en solution après un conditionnement des nanoparticules 3 de type A dans un champ magnétique alternatif entraînant une hyperthermique magnétique, et le nombre de duplex initialement présents sur les nanoparticules 3 de type A.
La colonne C de l'histogramme illustre un rapport sensiblement égal à
88 % entre le nombre de molécules monocaténaires d'ADN cibles 1 quantifiées en solution après un conditionnement des nanoparticules 3 de type C dans un champ magnétique alternatif entraînant une hyperthermique magnétique, et le nombre de duplex initialement présents sur les nanoparticules 3 de type C.
Ainsi, il est possible de relarguer de manière contrôlée par hyperthermie magnétique une proportion supérieure ou égale à 50%, et préférentiellement supérieure ou égale à 80% des molécules d'ADN monocaténaires cibles 1 initialement présentes sur des nanoparticules 3. Préférentiellement, les nanoparticules 3 de types C, et plus généralement les nanoparticules présentant un cœur 22 formé par un agrégat de noyaux 21 , sont adaptées d 'une part pour présenter une quantité plus élevée de duplex d 'acides nucléiques sur une même nanoparticule 3 que les nanoparticules 3 de type A (par exemple en moyenne 100 duplex d 'ADN par nanoparticule 3 de type A au regard de 140 duplex d 'ADN par nanoparticule de type C), et d 'autre part à relarguer une proportion d 'acides nucléiques plus importante par nanoparticule.
En référence à la figure 19, le relargage contrôlé de molécules d 'acides nucléiques cibles 1 par hyperthermie magnétique peut être réalisé en limitant la variation de température de la solution comprenant les nanoparticules 3 à 10° C, préférentiellement à 5° C. La courbe de la figure 19 illustre le maintien ou la limitation de la température de la solution comprenant des nanoparticules 3 de type C pendant la commande d 'un champ magnétique alternatif entraînant une hyperthermie magnétique des nanoparticules 3 de type C. L' hyperthermie magnétique des nanoparticules 3 peut entraîner un conditionnement à une température supérieure à la température de fusion des duplex de la couche de liquide entourant une nanoparticule 3, l'épaisseur de la couche étant par exemple inférieure à 10 nm. En revanche, la température moyenne de la solution comprenant les nanoparticules 3 varie entre 22° C et 28° C. Ainsi, le relargage de molécules d 'acides nucléiques cibles 1 par hyperthermie magnétique conforme à l'invention peut être réalisé à une température moyenne de la solution inférieure à la température de fusion des duplex, et préférentiellement à une température physiologique et/ou ambiante. I l est ainsi possible d 'éviter la dénaturation d 'autres espèces biologiques présentes dans une solution à analyser comprenant les molécules d 'acides nucléiques cibles 1 .
En référence à la figure 20, un relargage contrôlé de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 peut être réalisé dans un écoulement 5 de liquide 12. La figure 20 illustre un ensemble de détection de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 comprenant un électroaimant 10 présentant un entrefer 9. L'électroaimant 10 peut être paramétré tel que décrit dans Lacroix, L. M. , Carrey, J. , & Respaud, M. (2008), A frequency-adjustable electromagnet for hyperthermia measurements on magnetic nanoparticles, Review of scientific instruments, 79(9), 093909. Préférentiellement, la largeur de l'entrefer est inférieure à 5 mm. Ainsi, l'intensité du champ magnétique commandé par l'électroaimant 10, évoluant selon l'inverse de la largeur de l'entrefer 9, peut être adaptée à entraîner la fusion d 'un duplex 4 d 'acides nucléiques attaché à une nanoparticule magnétique 3 par hyperthermie magnétique. L'ensemble comprend également un microsystème 7. Le microsystème 7 comprend au moins un micro-canal 2, reliant fluidiquement au moins une entrée 24 et une sortie 25. Au moins une partie 1 1 du micro-canal 2 est agencée dans l'entrefer de l'électroaimant 10, c'est-à-dire dans le volume défini par l'entrefer 9 de l'électroaimant 10. De fait, le microsystème 7 est adapté à être inséré dans l'entrefer de l'électroaimant 10. Le champ magnétique peut par exemple être généré dans un entrefer 9 d 'une largeur de 1 ,5 mm. Le cœur de l'électroaimant 10 peut être une bague ouverte de ferrite à faible perte, sur laquelle un fil de Litz est enroulé de manière à former n = 55 tours. La bobine de magnétisation peut être couplée à un condensateur de 1 nF de manière à former un circuit LC présentant une fréquence de résonance sensiblement égale à 180 Hz. Le circuit résonant est excité à la fréquence de résonance par un générateur de signal électrique couplé à un amplificateur de puissance RF, et permet par exemple de produire un champ magnétique d 'une amplitude de 370 oe (mesuré en utilisant une bobine à tour unique).
Le micro-canal 2 peut par exemple être fabriqué par gravure humide isotrope d 'une lame en verre par une solution d 'acide fluorhydrique (HF). La lame gravée peut être superposée et scellée à une autre lame en verre, de manière à former la paroi d 'un micro-canal 2, par exemple d ' une largeur de 300 μιη et par exemple d 'une hauteur de 50 μιη. Chaque lame peut par exemple présenter une épaisseur de 300 μιη, et l'épaisseur totale du microsystème 7 une épaisseur de 600 μιη. Ainsi, le microsystème 7 est adapté à être agencé dans l'entrefer 9 d 'un électroaimant 10, la largeur de l'entrefer étant par exemple de 1 mm. Le micro-canal 2 peut également être fabriqué en utilisant les techniques de microfabrication par photolithographie molle, par exemple en utilisant des couches de PDMS microstructurées, et/ou des techniques de thermo-moulage, par exemple en utilisant des matériaux tels que le COC.
L'électroaimant 1 0 comprend un cœur magnétique et une bobine (non représentée) formant un nombre entier n de tours autour du cœur de l'électroaimant. Le champ magnétique He peut être donné par la formule (4) suivante :
où I est l'intensité du courant électrique dans la bobine. Le flux magnétique Φ passant au travers du microsystème 7 peut être donné par la formule (4) suivante : φ = μο^ (4)
Le où μ0 est la perméabilité magnétique du vide et S la surface des spires. Ainsi, l'intensité du champ magnétique peut être préférentiellement supérieure à 150 G, préférentiellement supérieure à 250 G et préférentiellement supérieure à 370 G dans l'entrefer 9. Cette intensité du champ magnétique est particulièrement adaptée à entraîner une hyperthermie magnétique des nanoparticules magnétiques 3 en solution.
En référence à la figure 21 , le micro-canal 2 présente une partie 1 1 agencée dans l'entrefer 9 ou adaptée à être agencée dans l'entrefer 9 de l'électroaimant 10. La figure 21 illustre une vue de dessus d'un micro-canal 2. Le micro-canal 2 comprend une entrée 24 et une sortie 25. Préférentiellement, la géométrie du micro-canal 2 peut être optimisée de manière à ce que le volume défini par le micro-canal 2 soit maximisé dans l'entrefer 9. Une telle optimisation peut être par exemple mise en œuvre par une partie 1 1 du micro-canal 2 en serpentins dans l'entrefer 9. La direction de l'écoulement 5 est illustrée par une flèche noire.
En référence à la figure 22, l'hyperthermie magnétique des nanoparticules magnétiques 3 peut permettre de détecter une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible 1 .
Lors d'une étape 101 , des nanoparticules magnétiques 3 sur lesquelles sont attachées des molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes 18 peuvent être introduites dans un échantillon à tester. Les molécules cibles peuvent être en particulier de molécules de micro-ARN, comme des molécules de micro-ARN 122, dont la présence peut permettre de diagnostiquer des maladies du foie comme l'hépatite B, C, ainsi que des maladies entraînées par des médicaments. Les molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 peuvent, lors de cette étape, s'hybrider sur les molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes 18 attachées sur les nanoparticules magnétiques 3. Ainsi, des molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 présentes en très faible concentration dans un échantillon à tester peuvent être attachées au même endroit, c'est-à-dire sur une ou plusieurs nanoparticules magnétiques 3.
Lors d'une étape 102 du procédé, on génère un écoulement 5 d'un liquide 12 comprenant au moins une nanoparticule magnétique 3. Selon la présence ou non d'une pathologie, ou plus généralement d'un événement physiologique à détecter, les nanoparticules magnétiques 3, peuvent présenter à leurs surfaces des molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes et/ou des duplex 4 formés par une molécule monocaténaire d'acides nucléiques sonde 20 et par une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible 1 . L'écoulement 5 de liquide 12 peut par exemple être contrôlé par un pousse-seringue ou par un contrôleur de pressions entre l'entrée 24 et la sortie 25 du micro-canal 2.
Lors d'une étape 103 du procédé, on génère un champ magnétique alternatif dans la partie 1 1 du micro-canal 2. Ce champ magnétique alternatif peut être préférentiellement généré au moyen de l'électroaimant 10 décrit précédemment. Le champ magnétique alternatif est adapté pour entraîner une hyperthermie magnétique des nanoparticules magnétiques 3 de sorte à provoquer une dénaturation du ou des duplex 4. Préférentiellement, la géométrie du micro-canal 2, en particulier dans la partie 1 1 , ainsi que la vitesse moyenne de l'écoulement des nanoparticules magnétiques 3 dans le liquide 12 sont adapté pour que les nanoparticules magnétiques 3 soient transportées, en moyenne, au moins 8 secondes, préférentiellement 9 secondes et préférentiellement 10 secondes, dans la partie 1 1 du micro-canal 2. On désigne ce temps par « temps de résidence » dans la partie 11 . En effet, la dénaturation d'un duplex présente un temps minimum, en dessous duquel, à une température permettant la dénaturation du duplex, le duplex n'est pas encore dénaturé. Il est alors nécessaire de conditionner les duplex à une température adaptée à la dénaturation plus longtemps que ce temps minimum, compris entre 8 et 12 secondes, préférentiellement compris entre 9 et 1 1 secondes. Ainsi, la géométrie du micro-canal 2 dans l'entrefer 9 et la vitesse moyenne de l'écoulement 5 permettent de dénaturer les duplex 4 et de relarguer les molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 en solution, dans le liquide 12 de l'écoulement 5. Le temps de résidence moyen des nanoparticules magnétiques 3 dans l'écoulement 5 peut être calculé par la formule (5) suivante :
où d est la longueur du micro-canal 2 dans la partie 1 1 dans le sens de l'écoulement 5, h est la hauteur du micro-canal 2, w est la largeur du microcanal 2 et v est la vitesse moyenne de l'écoulement.
Lors d 'une étape 104 du procédé, on détecte la ou les molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 relargué en solution lors de l'étape 103. On entend par « détecter » réaliser une mesure permettant de prendre connaissance de la présence ou non de molécule monocaténaire d 'acide nucléique cible 1 en solution, et en particulier mesurer la concentration en molécule monocaténaire d 'acide nucléique cible 1 en solution. Les moyens de détection des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 sont décrit ultérieurement.
En référence à la figure 23, la proportion de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 relarguées dans un micro-canal 2 peut évoluer avec le débit de l'écoulement 5. La figure 23 illustre la proportion entre la quantité de molécules monocaténaires d 'ADN cibles 1 relarguées et la quantité de duplex présents sur les nanoparticules magnétiques 3 avant l'étape de génération d ' un champ magnétique du procédé. La concentration d 'ADN en solution est mesurée, par exemple dans l'étape de détection de la ou les molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 , par fluorimétrie. La quantification d 'ADN peut par exemple être réalisée en utilisant un fluorimètre présentant une longueur d 'onde d 'excitation de 480 nm et une longueur d'onde d'émission de 520 nm, et en utilisant un marqueur de molécules monocaténaires d'acides nucléiques en solution tel que l'Oligreen (marque déposée).
La colonne (a) de l'histogramme illustre la proportion d'ADN monocaténaire libre en solution quantifiée lors d'un contrôle négatif, dans lequel l'étape de génération d'un champ magnétique n'est pas mise en œuvre. La colonne (b) de l'histogramme illustre la proportion d'ADN monocaténaire libre en solution quantifiée lors d'une dénaturation de duplex 4 entraînée par un chauffage à 95° C d'une solution en volume statique. La colonne (c) de l'histogramme illustre la proportion d'ADN monocaténaire libre en solution quantifiée lors d'une dénaturation entraînée par hyperthermie magnétique en volume statique, comme décrit précédemment. La colonne (d) de l'histogramme illustre la proportion d'ADN monocaténaire libre en solution quantifiée lors d'une dénaturation entraînée par hyperthermie magnétique selon un procédé conforme à l'invention dans un micro-canal 2 dans lequel un écoulement 5 de liquide 12 comprenant les molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 est généré à un débit moyen de 0,1 1 μί.ε 1. La colonne (d) de l'histogramme illustre la proportion d'ADN monocaténaire libre en solution quantifiée lors d'une dénaturation entraînée par hyperthermie magnétique selon un procédé conforme à l'invention dans un micro-canal 2 dans lequel un écoulement 5 de liquide 12 comprenant les molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 est généré à un débit moyen de 0,01 μί.ε 1. Le tableau 2 ci-dessous présente des caractéristiques des conditions correspondant à la colonne (d) et à la colonne (e) :
Tableau 2
La proportion d'ADN relargué correspondant à la condition (d) est sensiblement égale à la proportion mesurée lors du contrôle négatif. Le temps de résidence entre les conditions (d) et (e) est respectivement de 3 secondes et de 12 secondes. Ainsi, il est possible de détecter un relargage d'ADN sensiblement égal aux conditions (b) et (c) pour un temps de résidence suffisant, c'est-à-dire supérieur à 8 secondes, en adaptant le débit de l'écoulement 5 pour un même micro-canal 2. En référence à la figure 24, l'étape de détection peut être mise en œuvre par détection électrochimique. Horny et al. (Horny, M. C , Lazerges, M. , Siaugue, J. M. , Pallandre, A. , Rose, D. , Bedioui, F. , ... & Gamby, J. , 2016, Electrochemical DNA biosensors based on long-range électron transfer: investigating the efficiency of a fluidic channel microelectrode compared to an ultramicroelectrode in a two-electrode setup, Lab on a Chip, 16(22), 4373- 4381 ) décrivent une méthode adaptée à la détection électrochimique de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 dans un micro-canal 2. Ainsi, il est possible de détecter des concentrations basses, par exemple comprises entre 1 aM et 1 μΜ de molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 par détection électrochimique dans un micro-canal 2. La figure 24 illustre un système dans lequel des électrodes 1 5 sont agencées dans le micro-canal 2 en aval de la partie 1 1 du micro-canal 2 par rapport au sens de l'écoulement 5.
Les électrodes peuvent par exemple être déposées sur la partie d 'une galette de verre correspondant au micro-canal 2. Des couches minces de platine et/ou de titane et/ou d 'or et/ou de carbone peuvent être déposées, par exemple par un procédé de dépôt par pulvérisation cathodique, ou plus généralement par un dépôt physique en phase vapeur. Ainsi, une paroi du micro-canal 2 peut présenter des électrodes.
Des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes 18 peuvent attachées à la surface d 'au moins une électrode 1 5, lesdites molécules monocaténaires étant adaptées pour être au moins partiellement hybridées à la ou aux molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 . Ces molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes 18 peuvent par exemple être attachées à une couche de l'électrode 1 5 en or par l'intermédiaire de groupements thiols, de manière à former une couche autoassemblée. Toutefois, ce type de couches présente un taux maximum d 'hybridation avec des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles 1 relativement bas, par exemple inférieur à 1 5 %. A cet effet, des molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes 18 peuvent être préférentiellement attachées à une couche mince de carbone, par exemple en carbone amorphe de type a- CNx, de manière à augmenter le taux de molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 maximum hybridées.
Les différentes électrodes 15 peuvent être reliées à un ou plusieurs générateurs de tension, commandés par une unité de contrôle, de manière à imposer une différence de potentiel électrique entre une électrode de travail 16 et une contre-électrode 17.
En référence à la figure 25, l'impédance entre une électrode de travail 16 et une contre-électrode 17 dépend de l'état d'hybridation des molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes 18 attachées en surface des électrodes 15. En particulier, l'étape de détection des molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 dispersées dans le liquide 12 peut être réalisée en introduisant un électrolyte comprenant un couple de composés redox Fe'"C N637 Fe"C N64" , du bleu de méthylène comme intercalant redox du duplex, et du NaCl à une concentration de 0,5 M. La courbe (a) correspond à une mesure de l'impédance mesurée avant un relargage de molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 par hyperthermie magnétique, et la courbe (b) correspond à une mesure de l'impédance mesurée après un relargage de molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles 1 par hyperthermie magnétique, selon un procédé conforme à l'invention, lors de laquelle le transfert de charge est facilité par la formation de duplex 4.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection d'au moins une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible (1), le procédé comprenant des étapes de : a) génération d'un écoulement (5) de liquide (12) comprenant au moins une nanoparticule (3) magnétique de type cœur-coquille dans un micro-canal (2) d'un microsystème (7), et une pluralité de molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes (20) attachées à la nanoparticule (3), chaque molécule monocaténaire d'acides nucléiques sonde (20) étant adaptée pour être au moins partiellement hybridée à une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible (1) en formant un duplex, au moins une partie (11) du micro-canal (2) étant agencée dans l'entrefer d'un électroaimant (10) ; b) génération d'un champ magnétique (6) alternatif dans la partie (11) du micro-canal (2) au moyen de l'électroaimant (10), le champ magnétique (6) alternatif présentant une intensité et une fréquence adaptées pour entraîner une hyperthermie magnétique des nanoparticules (3) de sorte à provoquer une dénaturation du duplex formé par la molécule monocaténaire d'acides nucléiques sonde (20) et par la molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible (1) ; c) détection de la molécule monocaténaire cible (1) dispersée dans le liquide (12).
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le micro-canal (2) présente une géométrie et l'écoulement (5) de liquide (12) présente une vitesse moyenne telles que la ou les nanoparticules (3) soient transportées en moyenne pendant plus de 8 secondes dans la partie (11) du micro-canal (2).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la largeur Le de l'entrefer est inférieure à 5 mm.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la nanoparticule (3) comprend un cœur en matériau ferromagnétique ou ferrimagnétique et une coquille en silice entourant le cœur.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le cœur de la nanoparticule (3) est en maghémite.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le cœur de la nanoparticule (3) présente une longueur et une largeur, et dans lequel la longueur moyenne du cœur de la ou des nanoparticules (3) est supérieure à 20 nm.
7. Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, dans lequel le cœur de la ou des nanoparticules (3) comprend un agrégat (14) de noyaux (21 ) ferromagnétiques ou ferrimagnétiques, l'agrégat (14) comprenant en moyenne au moins deux noyaux.
8. Procédé selon l'une des revendication 4 à 7, dans lequel le rapport moyen de la longueur sur la largeur des nanoparticules (3) est supérieur à 1 ,5.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la température de fusion des duplex (4) est adaptée pour que strictement plus de la majorité des duplex (4) soient dénaturés lors de l'étape b) du procédé.
10. Procédé selon l' une des revendications 1 à 9, dans lequel, l'étape c) de détection de la molécule monocaténaire cible (1 ) dispersée dans l'écoulement (5) est mise en œuvre par électrochimie en imposant une différence de potentiel électrique entre deux électrodes, les électrodes étant en partie agencées dans le micro-canal (2).
1 1 . Procédé selon la revendication 10, dans lequel au moins un couple d 'électrodes (1 5), comprenant une électrode de travail (16) et une contre- électrode (17), est agencé dans le micro-canal (2), en aval de la partie (1 1 ) du micro-canal (2) agencé dans l'entrefer de l'électroaimant (10), dans le sens de l'écoulement (5).
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel des molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes (18) sont attachées à une surface de l'une des électrodes (15), lesdites molécules monocaténaires étant adaptées pour être au moins partiellement hybridées à la ou aux molécules monocaténaires d'acides nucléiques cibles (1).
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel l'une des électrodes (15) comprend au moins une couche mince (19) choisie parmi une couche mince d'or, une couche mince de platine et une couche mince de carbone.
14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel le liquide (12) comprend un intercalant redox du duplex et un couple de composés redox.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, comprenant une étape antérieure à l'étape a) dans laquelle la ou les nanoparticules (3) munie(s) des molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes (20), sont mélangées à un échantillon à tester.
16. Ensemble de détection d'au moins une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible (1), l'ensemble comprenant :
- un électroaimant (10) présentant un entrefer (9),
- un micro-canal (2) dans lequel peut s'écouler un liquide (12), le micro-canal comprenant au moins une partie (11) agencée dans l'entrefer de l'électroaimant (10),
- au moins une nanoparticule (3) magnétique de type cœur-coquille, et une pluralité de molécules monocaténaires d'acides nucléiques sondes (20) attachées à la nanoparticule (3), chaque molécule monocaténaire d'acides nucléiques sonde (20) étant adaptée pour être au moins partiellement hybridée à une molécule monocaténaire d'acides nucléiques cible (1) en formant un duplex,
dans lequel l'électroaimant (10) étant propre à générer un champ magnétique (6) alternatif présentant une intensité et une fréquence adaptées pour entraîner une hyperthermie magnétique de la ou des nanoparticule(s) (3) lorsque la ou les nanoparticule(s) sont transportées par le liquide dans la partie (1 1 ) du micro-canal agencée dans l'entrefer de l'électroaimant (1 0), de sorte à provoquer une dénaturation du duplex formé par la molécule monocaténaire d 'acides nucléiques sonde (20) et par la molécule monocaténaire d 'acides nucléiques cible (1 ).
17. Ensemble selon la revendication 1 6, comprenant en outre au moins deux électrodes agencées au moins en partie dans le micro-canal (2), une différence de tension entre les électrodes étant propre à être contrôlée pour détecter par électrochimie la molécule monocaténaire cible (1 ) dispersée dans l'écoulement (5).
18. Ensemble selon la revendication 17, comprenant des molécules monocaténaires d 'acides nucléiques sondes (18) attachées à une surface de l'une des électrodes (1 5), lesdites molécules monocaténaires étant adaptées pour être au moins partiellement hybridées à la ou aux molécules monocaténaires d 'acides nucléiques cibles (1 ).
19. Ensemble selon l'une des revendications 17 et 18, dans lequel l'une des électrodes (1 5) comprend au moins une couche mince (19) choisie parmi une couche mince d 'or, une couche mince de platine et une couche mince de carbone.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112949141B (zh) * 2021-03-26 2022-11-04 福州大学 基于有限元方法的磁纳米颗粒浓度分布预测方法
FR3129677B1 (fr) * 2021-11-30 2023-10-20 Univ Paris Saclay Fixation d’acide nucléique sur une électrode de platine

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090023146A1 (en) * 2007-06-22 2009-01-22 Sony Deutschland Gmbh Device for processing an analyte and a method of processing and/or detecting an analyte using said device
US20110215798A1 (en) * 2007-12-27 2011-09-08 Lawrence Livermore National Security, Llc. Signal Enhancement Using a Switchable Magnetic Trap
US20150361483A1 (en) * 2013-01-16 2015-12-17 The Regents Of The University Of California Label free molecular detection methods, systems and devices
US20170183715A1 (en) * 2008-12-19 2017-06-29 President And Fellows Of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506564B1 (en) * 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US7906345B2 (en) * 2003-11-12 2011-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Magnetic nanoparticles, magnetic detector arrays, and methods for their use in detecting biological molecules
WO2007089564A2 (fr) * 2006-01-26 2007-08-09 The Regents Of The University Of California dosage immunomagnétique de microcanal
EP2110175A1 (fr) * 2008-03-20 2009-10-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Procédé et dispositif de commande thermique de réactions biologiques et chimiques sous l'influence de particules ou de billes magnétiques et de champs magnétiques variables
US9030215B2 (en) * 2011-10-04 2015-05-12 The Regents Of The University Of California Corporation Real-time, label-free detection of nucleic acid amplification in droplets using impedance spectroscopy and solid-phase substrate

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090023146A1 (en) * 2007-06-22 2009-01-22 Sony Deutschland Gmbh Device for processing an analyte and a method of processing and/or detecting an analyte using said device
US20110215798A1 (en) * 2007-12-27 2011-09-08 Lawrence Livermore National Security, Llc. Signal Enhancement Using a Switchable Magnetic Trap
US20170183715A1 (en) * 2008-12-19 2017-06-29 President And Fellows Of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
US20150361483A1 (en) * 2013-01-16 2015-12-17 The Regents Of The University Of California Label free molecular detection methods, systems and devices

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIJS ET AL: "Microfluidic applications of magnetic particles for biological analysis and catalysis", CHEMICAL REVIEWS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 110, no. 3, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 1518 - 1563, XP007917138, ISSN: 0009-2665, [retrieved on 20090412], DOI: 10.1021/CR9001929 *
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