EP3649235A1 - Nouvelles souches attenuees d'apicomplexes et leur utilisation comme vecteurs d'antigene pour la prevention de maladies infectieuses - Google Patents

Nouvelles souches attenuees d'apicomplexes et leur utilisation comme vecteurs d'antigene pour la prevention de maladies infectieuses

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EP3649235A1
EP3649235A1 EP18753445.8A EP18753445A EP3649235A1 EP 3649235 A1 EP3649235 A1 EP 3649235A1 EP 18753445 A EP18753445 A EP 18753445A EP 3649235 A1 EP3649235 A1 EP 3649235A1
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EP
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Withdrawn
Application number
EP18753445.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Anne-France BOUSSEMART-PROUVOST
Edouard SECHE
Thi-Kim-Chi NGUYEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Tours
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Universite de Tours
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Publication date
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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated

Definitions

  • the present invention relates to novel attenuated strains of apicomplexes and their use as an antigen vector for the prevention of infectious diseases.
  • Apicomplexes are obligate, mostly intracellular parasites that have a life cycle that can involve multiple hosts.
  • the phylum of these parasites is subdivided into several families.
  • Toxoplasma gondii belongs to the family Sarcocystidae.
  • the cat the definitive host, excretes the parasite into the environment as oocysts.
  • Intermediate hosts i.e. all homeotherms
  • definitive may become infected by ingesting oocysts present on the food.
  • the parasite is then transformed into tachyzoites which spread in the body and which, under the pressure of the immune system, encyst with a preferential tropism for the central nervous system, retina or muscles. Ingestion of encysted tissue is the second leading cause of contamination of final and intermediate hosts.
  • Toxoplasma gondii the parasite responsible for toxoplasmosis
  • This strain called Toxo tgmicl-3 KO, generates a strong and specific immune response against Toxoplasma gondii and makes it possible to prevent the effects of a subsequent infection in mice (Ismael et al., 2006, J. Infect Dis., 194 ( 8): 1176-83) and in ewes (Mévelec et al., 2010, Vet Res., 41 (4): 49).
  • Neospora caninum (N. caninum) is an intracellular parasite responsible for neosporosis. It belongs also to the Sarcocystidae family. The life cycle of Neospora caninum is very close to that of T. gondii with two distinct phases: a sexual phase in the final host (ie canids and the dog in particular) which leads to the production of oocysts eliminated in the feces and an asexual phase in an intermediate host (ie sheep, goats, cattle, equines, etc.) which leads to the production of tachyzoites and cysts containing the bradyzoites.
  • a sexual phase in the final host ie canids and the dog in particular
  • oocysts eliminated in the feces and an asexual phase in an intermediate host (ie sheep, goats, cattle, equines, etc.) which leads to the production of tachyzoites and cysts containing the bra
  • Neospora caninum Neo strain ncmicl-3 KO
  • Neo strain ncmicl-3 KO a live attenuated strain of Neospora caninum
  • This mutant strain has been shown to possess infectious and immunogenic properties conferring on mammals vaccine protection against the deleterious effects of neosporosis.
  • Parasites of the Sarcocystidae family such as Toxoplasma gondii and Neospora caninum can be used to express heterologous proteins from other parasites such as Plasmodium spp, Cryptosporidium parvum or Leishmania spp.
  • the wild strain RH of Toxoplasma gondii was used as a vector of the CSP (Plasmodium knowlesi protein Circum Sporozoite) antigen (Di Carlos et al., 1999, Infect Immun., 67 (4): 1677-82). .
  • the recombinant strain was inoculated into Rhesus monkeys and induced in the animal a humoral immune response specific for the CSP protein.
  • the thermosensitive strain ts-4 HXGPR " of Toxoplasma gondii was used as vector of Plasmodium yoelii CSP antigen (Charest et al., 2000, J. Immunol, 165 (4): 2084-92).
  • the recombinant parasites were inoculated into the mouse inducing a humoral immune response specific for the CSP antigen but insufficient to induce protection against infection with Plasmodium yoelii.
  • a strain of Toxoplasma gondii has also been used to express the gp40, gp15 and gp40 / gp15 precursor genes of Cryptosporidium parvum, the parasite responsible for cryptosporidiosis (O'Connor et al., Infect Immun., 2003 71 (10): 6027-35, O'Connor et al., 2007, Mol Biochem Parasitol, 152 (2): 148-58).
  • the gp40 / gp15, gp40 and gp15 genes were cloned, placed under the control of a T. gondii promoter and randomly integrated into the parasite genome.
  • Another team was also interested in the use of Toxoplasma gondii as a vector for Cryptosporidium parvum antigen and in particular for the immunodominant surface protein P23 (Shirafuji et al, 2005, J. Parasitol, 91 (2): 476- 9). The molecular weight and antigenic properties of recombinant P23 are similar to those of Native protein and mice immunized with lysed tachyzoites expressing P23 protein produced neutralizing antibodies directed against C. parvum.
  • T. gondii was used as an expression vector for Leishmania Kmpl I antigen.
  • the recombinant strain obtained allows a significant protection of the animals during a challenge with L. major (Ramirez et al., 2001, Vaccine, 20: 455-61).
  • Neospora caninum was also used as a heterologous antigen vector and a recombinant N. caninum strain stably expressing T. gondii S AGI antigen was constructed (Zhang et al, 2010, Vaccine, 60 (1): 105-7).
  • the expression level, the molecular weight and the antigenic properties of the AGI S protein expressed in N. caninum are similar to those of the native S AGI protein and the immunized mice produce a Th1 type S1-specific immune response of T gondii and are protected against a lethal challenge with T. gondii.
  • the Cre / loxP system has been used in mammalian cell gene activation or inactivation strategies (Fukushige and Sauer, 1992, PNAS, 89 (17): 7905-9) or transgenic mice (Tsien et al. , 1996, Cell, 87 (7): 1317-26.).
  • Cre Recombinase is an enzyme derived from the bacteriophage PI (Sternberg and Hamilton, 1981, J. Mol Biol, 150 (4): 487-507) of the family of integrases which recognize very specific sites and allow recombination between two identical sites.
  • the Cre Recombinase restriction site is the loxP site, a 34 base pair nucleotide sequence (SEQ ID NO: 12) that includes two small 13-base pair repeated and inverted sequences and a spacer region (in bold) of 8 base pairs.
  • SEQ ID NO: 12 a 34 base pair nucleotide sequence
  • spacer region in bold
  • Cre / LoxP In Toxoplasma gondii, the Cre / Lox system was first used in 1999 (Brecht et al., 1999, Gene, 234 (2): 239-47). Following the random insertion of a reporter gene flanked by LoxP sites oriented in an identical direction, the action of Cre Recombinase allowed the deletion of the reporter gene and the formation of a LoxP scar. Cre Recombinase was then used to integrate a new heterologous transgene at this LoxP scar. More recently ; the Cre / LoxP system has been used for the production of a Toxoplasma gondii strain deleted for the morn1 gene (Heaslip et al., 2010, PloS Pathog, 6 (2): el000754).
  • T. gondii KO (knockout) strains have been created using a dimerizable form of inducible Cre Recombinase only after addition of a ligand: rapamycin (Andenmatten et al., 2013, Nat. 2): 125-7, Rugarabamu et al., 2015, Mol Microbiol, 97 (2): 244-62).
  • the present invention relates to novel attenuated strains of Sarcocystidae (Toxoplasma gondii and Neospora caninum).
  • the present invention also relates to the use of novel attenuated strains of Sarcocystidae (Toxoplasma gondii and Neospora caninum) as an antigen vector for the prevention of infectious diseases.
  • Sarcocystidae Toxoplasma gondii and Neospora caninum
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which at least one of the honey or mic3 genes is deleted, containing a specific recombination site of an enzyme allowing specific recombination, at the locus of said at least one deleted gene, and in in the case where the two genes honey and mic3 are deleted, the site of specific recombination of the enzyme allowing a specific recombination at the locus of the deleted honey gene is potentially different from that at the locus of the mic3 deleted gene.
  • enzyme allowing specific recombination is meant enzyme catalyzing the recombination of DNA in a defined direction, between specific sites determined by sequences specific to each enzyme. They allow in particular the excision, insertion, inversion or translocation of a nucleotide sequence flanked by specific sites.
  • an enzyme allowing specific recombination mention may be made, for example, of Cre recombinase, FLP recombinase, Tre recombinase, RecA and Hin recombinase proteins (bacteria).
  • the genes honey and mic3 make it possible to code the proteins MIC1 and MIC3. These are micronemal proteins, secretory organelles of apicomplexes that play a central role in recognition and adhesion to host cells.
  • the enzyme allowing specific recombination is the cre-recombinase.
  • the mutant strain of Sarcocystidae in which at least one of the honey or mic3 genes is deleted contains a recombination site specific for the cre-recombinase, at the locus of said at least one deleted gene. and in the case where the two genes honey and mic3 are deleted, the specific recombination site of the cre-recombinase at the locus of the deleted honey gene is different from that at the locus of the deleted mic3 gene.
  • deletion of the gene is understood to mean the deletion of the entire coding sequence (introns and exons), the deletion of the promoter region and the deletion of the 5 'and 3' untranslated transcribed regions, called 5 'and 3' UTR, the term “gene” designates the promoter region (also called promoter), the coding sequence and the 5 'and 3' UTR regions.
  • Cre recombinase is a topoisomerase derived from bacteriophage PI, this enzyme is functional in parasites.
  • the possible use of several lox sites that do not interact with one another makes it possible to envisage several deletions.
  • recombination sites specific for Cre-recombinase the sites ⁇ , ⁇ , 1 ⁇ 2272, 1 ⁇ 71, 1 ⁇ 6, lox511, lox5171 and loxM2 can be cited in a non-exhaustive manner.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes honey and mic3 are deleted containing two specific recombination sites of an enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, said specific recombination sites being at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes, the specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular of Cre-recombinase, at the locus of the deleted honey gene, being different from that at the locus of the deleted mic3 gene.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said enzyme allowing a specific recombination is Cre-recombinase and in which in the case where the two genes honey and mic3 are deleted, the Specific recombination site of the enzyme allowing specific recombination at the locus of the deleted honey gene is different from that at the locus of the deleted mic3 gene.
  • said mutant strain of Sarcocystidae is a strain of the genus Toxoplasma spp.
  • This genus includes the species Toxoplasma gondii.
  • said mutant strain of Sarcocystidae is a strain of the species Toxoplasma gondii.
  • said mutant strain of Sarcocystidae is a strain of the genus Toxoplasma spp., In particular a strain of the species Toxoplasma gondii.
  • said mutant strain of Sarcocystidae is a strain of the genus Neospora spp.
  • Neospora caninum Neospora hughesi.
  • said mutant strain of Sarcocystidae is a strain of the species Neospora caninum.
  • said mutant strain of Sarcocystidae is a strain of the genus Neospora spp., In particular a strain of the species Neospora caninum.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two mic 1 and mic 3 genes are deleted, and which contains an enzyme-specific recombination site allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase. at the locus of the deleted mic 1 gene, and a specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular of Cre recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene, the site of recombination specific to the locus of the deleted honey gene being different of the recombination site specific to the locus of the deleted mic3 gene.
  • an enzyme-specific recombination site allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase. at the locus of the deleted mic 1 gene, and a specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular of Cre recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene, the
  • said mutant strain Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted contains a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of the mic 1 gene deleted, and a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene, the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted honey gene being different from that at the mic3 gene locus deleted.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted, and containing two sites of recombination specific for an enzyme allowing specific recombination, in particular the Cre- recombinase, each of the two sites being respectively at the locus of each of the aforementioned deleted genes, the specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the mic3 gene deleted.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two mic 1 and mic 3 genes are deleted, and which contains an enzyme-specific recombination site allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase.
  • a specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular of Cre recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene, the site of recombination specific to the locus of the deleted honey gene being different of the recombination site specific to the locus of the deleted mic3 gene, and said strain containing no heterologous DNA, other than those corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, at the respective locus of each of the aforementioned genes deleted.
  • the strain may contain as single heterologous DNA (s), one or several sequences corresponding to a specific recombination site of an enzyme allowing specific recombination.
  • said mutant strain Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted contains a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of the mic 1 gene deleted, and a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene, the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted honey gene being different from that at the mic3 gene locus deleted, said strain containing no heterologous DNA, other than those corresponding to Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes honey and mic3 are deleted, and containing two sites of recombination specific for an enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, each of two sites being respectively at the locus of each of the above-mentioned deleted genes, the specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the deleted mic3 gene, and not containing heterologous DNA, other than those corresponding to enzyme-specific recombination sites allowing a specific recombination including Cre-recombinase at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted, and containing a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of the mic 1 gene deleted, and a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene, the Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the deleted mic3 gene.
  • said strain not containing heterologous DNA, other than those corresponding to the Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes,
  • each of the Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of the deleted honey and mic3 genes are selected from the following sites: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68, the Cre-recombinase recombination site, at the deleted honey gene locus being different from that at the deleted mic3 gene locus.
  • the present invention relates to a mutant strain according to the invention, in which the two genes honey and mic3 are deleted, containing two sites of specific recombination of an enzyme allowing a specific recombination, at the respective locus of each one.
  • the site of specific recombination of the enzyme allowing a specific recombination, at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the deleted mic3 gene, and not containing heterologous DNA, other than heterologous DNAs corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes, in particular said enzyme allowing a specific recombination being Cre-recombinase, and the recombination-specific recombination sites.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two honey and mic3 genes are deleted, and not containing heterologous DNA, other than those corresponding to the specific recombination sites of an enzyme allowing a specific recombination, in particular of Cre-recombinase, at the respective locus of each of the above-mentioned deleted genes and containing two specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination, said enzyme being Cre-recombinase, each of the two sites being respectively at locus of each of the aforementioned deleted genes, said specific recombination sites being cre-recombinase specific recombination sites chosen from: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68, the Cre-recombinase recombination site at the deleted honey gene locus being different from that at the gene locus m
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two mic 1 and mic 3 genes are deleted, and containing an enzyme-specific recombination site allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted mic 1 gene, and a specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination including Cre recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene, the site of recombination specific to the deleted honey gene locus being different from the recombination site specific to the locus of the deleted mic3 gene, and said strain containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, at the respective locus of each of the genes honey and mi c3 deleted
  • a first recombination site specific for the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, corresponding to the specific recombination site of the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted honey gene, and
  • a first recombination site specific for the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, corresponding to the specific recombination site of the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene, and
  • This embodiment targets the production of a heterologous RNA from said heterologous DNA in a mutant strain as described above.
  • telomere By “telomeres necessary for the transcription of said heterologous DNA” is meant a promoter, a transcription initiation site, TATA box, a transcription terminator.
  • the RNA thus transcribed may be a messenger RNA, an interfering RNA, a long non-coding RNA, a stem-loop RNA (in English "Hairpin RNA”),
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes honey and mic3 are deleted, and containing two sites of recombination specific for an enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, each of two sites being respectively at the locus of each of the above-mentioned deleted genes, the specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the deleted mic3 gene, and containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination, in particular the Cre-recombinase, at the respective locus of each of the aforementioned genes deleted, said heterologous DNA being flanked: a
  • the present invention relates to a strain according to the invention, containing a heterologous DNA at the location of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the sites of specific recombination of the enzyme. allowing a specific recombination at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes,
  • heterologous DNA being flanked:
  • said enzyme allowing specific recombination being Cre-recombinase and the specific Cre-recombinase recombination sites being chosen from: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO : 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two mic 1 and mic 3 genes are deleted, and containing an enzyme-specific recombination site allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted mic 1 gene, and a recombination site specific to the enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase at the locus of the mic3 gene deleted, the recombination site specific to the locus of the deleted gene honey being different from the locus of recombination specific to the locus of the mic3 gene deleted, said strain containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, other than those corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, at the respective locus of each of the genes honey and mic3 deleted, such that: when said
  • a first recombination site specific for the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, corresponding to the specific recombination site of the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted honey gene, and
  • a first recombination site specific for the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, corresponding to the specific recombination site of the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene, and
  • said mutant strain also comprises the means necessary for the expression of the aforementioned heterologous DNA .
  • the present invention targets the protein expression of said heterologous DNA in a mutant as previously described.
  • the present invention relates to a strain according to the invention containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination at the respective locus of each of the aforementioned honey and mic3 genes deleted, said heterologous DNA coding for a protein and being flanked:
  • said enzyme allowing a specific recombination being Cre-recombinase and, the specific Cre-recombinase recombination sites being chosen from: lox N of SEQ ID NO: 5 , lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes honey and mic3 are deleted, containing two sites of recombination specific for an enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, each of them sites being respectively at the locus of each of the above-mentioned deleted genes, the site of specific recombination of the enzyme allowing a specific recombination including Cre-recombinase, at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the mic3 gene deleted, and containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the specific recombination sites of the enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes; , said heterologous DNA encoding at least one protein and
  • a first recombination site specific for the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, corresponding to the specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase at the locus of the deleted honey gene, or that at the locus of the mic3 gene deleted, and
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted, and containing a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of the mic 1 gene deleted, and a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene, the Cre-recombinase specific recombination site, at the deleted honey gene locus (called site A) being different from that at the locus of the mic3 gene deleted (called site B), and said heterologous DNA-containing strain at the deleted honey gene locus or the deleted mic3 gene locus, different from those corresponding to Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of each of the genes honey and mic3 deleted, such that: when said heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted gene honey, it is flanked:
  • site C a second specific recombination site identical to the first specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene (site A),
  • heterologous DNA when said heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted mic3 gene, it is flanked:
  • a first recombination site specific for the enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, corresponding to the site of specific recombination of the enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of the deleted mic3 gene (site B), and
  • site C a second specific recombination site identical to the first specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene (site B),
  • said three specific recombination sites A, B and C being chosen from the following sites: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68, such as
  • said site A and said site B are different, and
  • said site C is identical to said site A or B, it being understood that said strain comprises the elements necessary for the transcription of said heterologous DNA, or the means necessary for the expression of said heterologous DNA when said heterologous DNA encodes at least one protein.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae containing a heterologous DNA at the location of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the recombination sites specific for an enzyme allowing recombination.
  • said enzyme is Cre-recombinase, at the respective locus of each of the aforementioned honey and mic3 deleted genes, and containing three specific recombination sites which are respectively:
  • said site A and said site B are different, and
  • said site C is identical to said site A or said site B.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted, and containing a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of the mic 1 gene deleted, and a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene, such as the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus (designated site A) corresponds to a loxN site SEQ ID NO : 5 and that at the locus of the deleted mic3 gene (called site B) corresponds to a loxP site SEQ ID NO: 12,
  • a first Cre-recombinase specific recombination site corresponding to the Cre-recombinase specific recombination site, at the deleted honey gene locus (site A) corresponding to a loxN site SEQ ID NO: 5, and
  • site C a second specific recombination site corresponding to a loxN site SEQ ID NO: 5, identical to the first specific recombination site located at the location of the deleted honey gene (site A), when said heterologous DNA is inserted at locus gene mic3 deleted, it is flanked:
  • a first Cre-recombinase specific recombination site corresponding to a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene (site B) corresponding to a loxP site SEQ ID NO: 12, and
  • a second specific recombination site (site C) corresponding to a loxP site SEQ ID NO: 12, identical to the first specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene (site B), it being understood that said strain comprises the elements necessary for the transcription of said heterologous DNA, or the means necessary for the expression of said heterologous DNA when said heterologous DNA codes for at least one protein.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which the two genes mic 1 and mic 3 are deleted, and containing a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of the mic 1 gene deleted, and a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene, such as the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus (designated site A) corresponds to a loxP site SEQ ID NO : 12 and that at the locus of the deleted mic3 gene (called site B) corresponds to a loxN site SEQ ID NO: 5, and said strain containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the DNAs heterologous corresponding to Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of each of the honey and mic3 genes deleted,
  • a first Cre-recombinase specific recombination site corresponding to the Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted honey gene (site A) corresponding to a loxP site SEQ ID NO: 12, and
  • site C a second specific recombination site corresponding to a loxP site SEQ ID NO: 12, identical to the first specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene (site A), when said heterologous DNA is inserted at locus gene mic3 deleted, it is flanked:
  • a first Cre-recombinase specific recombination site corresponding to a Cre-recombinase specific recombination site, at the locus of the deleted mic3 gene (site B) corresponding to a loxN site SEQ ID NO: 5, and
  • a second specific recombination site (site C) corresponding to a loxN site SEQ ID NO: 5, identical to the first specific recombination site located at the locus of the mic3 gene (site B) deleted, it being understood that said strain comprises the elements necessary for the transcription of said heterologous DNA, or the means necessary for the expression of said heterologous DNA when said heterologous DNA codes for at least one protein.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae containing a heterologous DNA at the location of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, different from the heterologous DNAs corresponding to the recombination sites specific for an enzyme allowing recombination.
  • said enzyme is Cre-recombinase, at the respective locus of each of the aforementioned honey and mic3 deleted genes, and containing three specific recombination sites which are respectively:
  • said site A is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site B is the site lox P SEQ ID NO: 12, and
  • said C site is the lox N SEQ ID NO: 5 site, said first Cre-recombinase specific recombination site being site A; or such
  • said site A is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site B is the site lox P SEQ ID NO: 12, and
  • said C site is the lox P SEQ ID NO: 12 site, said first Cre-recombinase specific recombination site being the B site; or such
  • said site A is the site lox P SEQ ID NO: 12
  • said site B is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said C site is the lox site SEQ ID NO: 12, said first Cre-recombinase specific recombination site being site A; or such
  • said site A is the site lox P SEQ ID NO: 12
  • said site B is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site C is the lox site N SEQ ID NO: 5, said first Cre-recombinase specific recombination site being site B.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which both the mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted, and which contains at the locus of each of these deleted genes a site of specific recombination of an enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, such as the site of recombination specific to the locus of the deleted honey gene, is different from the site of recombination specific to the locus of the deleted mic3 gene, and the site of recombination specific to the
  • the locus of the roplol gene deleted is different from the specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene and the specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene.
  • the ropl6 gene is used to code the Ropl6 protein, which is a protein of rophiae. This protein is a serine threonine kinase.
  • ROPs proteins are secreted to allow invagination of the plasma membrane of the host cell and formation of the parasitophorous vacuole.
  • the ROPs released into the cytosol of the host cell can migrate to the surface of the parasitophorous vacuole (ROP5, ROP18, ROP2) or in the nucleus (ROP16, protein phosphatase 2C or PP2C-hn), allowing a modulation of the expression of genes involved in the immune response of the host.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said mutant strain is a mutant strain of Toxoplasma spp., And in which the roplol gene is deleted, and which contains an enzyme-specific recombination site. allowing a specific recombination including Cre-recombinase, at the locus of said deleted roplol gene, said site being different from said specific recombination site located at the deleted honey gene locus and said specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which both the mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted, and which contains at the locus of each of these deleted genes a site of specific recombination of an enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, such as the site of recombination specific to the locus of the deleted honey gene, is different from the site of recombination specific to the locus of the deleted mic3 gene, and the site of recombination specific to the
  • the locus of the roplol gene deleted is different from the specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene and the specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene.
  • mutant strain also contains at the locus of the roplol gene, downstream of said recombination site specific to the locus of the roplol gene deleted, a gene coding for the GRA15II protein, as well as the means necessary for the expression of said protein,
  • GRAs proteins are associated with the membranous nanotubular network and the parasitophorous vacuole membrane (Mercier et al, Int J Parasitol, 2005 Jul; 35 (8): 829-49.) Erratum in: Int J Parasitol, 2005 Dec; 35 (14): 1611-2). They participate in the exchange of nutrients between the parasite and the organelles (mitochondria and endoplasmic reticulum) of the host cell (Sibley, Immunol Rev. 2011 Mar; 240 (l): 72-91).
  • GRA15 has a polymorphism according to the typology of the parasite (I, II, III ).
  • said gene coding for the GRA15II protein at the locus of the deleted rop 161 gene is thus flanked upstream by the above-mentioned recombination site specific for an enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of said gene.
  • rop 161 deleted is thus flanked upstream by the above-mentioned recombination site specific for an enzyme allowing specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of said gene.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said mutant strain is a mutant strain of Toxoplasma spp., And in which the rop gene 161 is deleted and contains an enzyme-specific recombination site allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of said deleted rop gene 161,
  • said site being different from said specific recombination site located at the deleted honey gene locus and said specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene, and said strain comprising a gene encoding the GRA15II protein and the means necessary for the expressing said protein at the locus of said deleted rop gene 161,
  • said gene coding for the GRA15II protein at the locus of said deleted rop gene 161, being flanked upstream by the aforesaid specific recombination site of the enzyme allowing a specific recombination, in particular Cre-recombinase, at the locus of said rop gene 161 deleted.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which the two mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted,
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus is different from the locus of the mic3 gene-deleted recombination site, and the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted is different from the Cre-recombinase specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene and the Cre-recombinase specific recombination site located at the locus. deleted mic3 gene
  • Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted is chosen from the following sites: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which the two mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted,
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus is different from the locus of the mic3 gene-deleted recombination site
  • Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted is different from the Cre-recombinase specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene and the Cre-recombinase specific recombination site located at the locus. deleted mic3 gene
  • Cre-recombinase specific recombination sites at the locus of the genes miel, mic3 and roplôl deleted are chosen from the following sites: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68,
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which both the mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted, and which contains at the locus of each of these deleted genes a site of specific recombination of Cre-recombinase, such as the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus, is different from the locus of the mic3 gene-deleted recombination site, and the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted is different from the Cre-recombinase specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene and the Cre-recombinase specific recombination site located at the locus. deleted mic3 gene,
  • said mutant strain also contains at the locus of the roplol gene, downstream of said recombination site specific to the locus of the roplol gene deleted, a gene coding for the GRA15II protein as well as the means necessary for the expression of said protein, said site Specific recombination of Cre-recombinase at the locus of the roplol gene deleted is chosen from the following sites: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said enzyme allowing a specific recombination is Cre-recombinase, and said site of specific recombination of an enzyme allowing a specific recombination at the locus of said gene roplol deleted.
  • said enzyme allowing a specific recombination is Cre-recombinase
  • said site of specific recombination of an enzyme allowing a specific recombination at the locus of said gene roplol deleted is a recombination site specific for Cre-recombinase chosen from the following sites: lox N of SEQ ID NO: 5, lox P of SEQ ID NO: 12 and lox 2272 of SEQ ID NO: 68, this specific recombination site being different from the Cre-recombinase specific recombination sites at the deleted honey gene locus and at the deleted mic3 gene locus.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which the two mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted,
  • site A the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus
  • site B the mic3 gene-specific locus-specific recombination site
  • site D the specific Cre-specific recombination site.
  • said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or such
  • said site A corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said site B corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site D corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said mutant strain is a mutant strain of Toxoplasma spp., In which both mic 1 and mic 3 genes are deleted, and containing two sites of specific recombination of the Cre-recombinase, each of the two sites being respectively at the locus of each of the above-mentioned deleted genes, the Cre recombinase-specific recombination site, at the locus of the deleted honey gene being different from that at the locus of the deleted mic3 gene .
  • roplol gene is deleted and said strain contains a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of said deleted roplol gene,
  • said strain containing three specific recombination sites which are respectively:
  • said site A is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site B is the site lox P SEQ ID NO: 12,
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68; or such
  • said site A is the site lox P SEQ ID NO: 12
  • said site B is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain, wherein said mutant strain is a mutant strain of Toxoplasma spp.,
  • the roplol gene is deleted and contains an enzyme-specific recombination site allowing locus-specific recombination of said deleted roplol gene, said site being different from said specific recombination site located at the deleted honey gene locus and said site specific recombination at the locus of the deleted mic3 gene
  • said mutant strain comprising a gene coding for the GRA15II protein, as well as the means necessary for the expression of said protein, at the locus of said deleted roplol gene,
  • said gene coding for the GRA15II protein at the locus of said deleted roplol gene being flanked upstream by the aforesaid recombination site specific for the enzyme allowing a specific recombination at the locus of said deleted roplol gene, in particular in which said enzyme allowing a specific recombination is , Cre-recombinase, and said site for recombination specific for an enzyme allowing locus-specific recombination of said deleted roplol gene, is a specific recombination site of Cre-recombinase chosen from the following sites: lox N SEQ ID NO: 5, lox P SEQ ID NO: 12 and lox 2272 SEQ ID NO: 68, this specific recombination site being different from the Cre recombinase specific recombination sites at the locus of the deleted honey gene and at the locus of the deleted mic3 gene, said strain containing three specific recombination sites which are respectively:
  • said site A is the lox N site
  • said site B is the lox P site
  • said site D is the site lox 2272.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which the two mic 1 and mic 3 genes, and the roplol gene are deleted,
  • site A the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus
  • site B the site of recombination specific to the locus of the deleted mic3 gene
  • site D Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted
  • site A Cre recombinase-specific recombination site located at the deleted honey gene locus
  • site B site of the specific recombination of the Cre-recombinase located at the locus of the deleted mic3 gene
  • said strain optionally containing a coding for the GRA15II protein as well as the means of expression necessary for the expression of said protein,
  • said strain containing a heterologous DNA at the deleted honey gene locus or the deleted mic3 gene locus or at the roplol gene locus deleted, different from the hetero-log DNA corresponding to the Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of each genes honey, mic3 and roplol deleted, so that: when said heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted gene honey, it is flanked: a first Cre-recombinase specific recombination site, corresponding to a Cre-recombinase specific recombination site, at the deleted honey gene locus (site A), and
  • site C a second specific recombination site identical to the first specific recombination site located at the deleted honey gene locus (site A), when said heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted mic3 gene, it is flanked:
  • site C a second specific recombination site identical to the first specific recombination site located at the locus of the mic3 gene (site B) deleted, when said heterologous DNA is inserted at the locus of the roplol gene deleted, it is flanked:
  • a second specific recombination site identical to the first specific recombination site located at the locus of the roplol gene (site D) deleted, it being understood that said strain comprises the elements necessary for the transcription of said heterologous DNA, or the means necessary for the expression of said heterologous DNA when said heterologous DNA codes for at least one protein.
  • said mutant strain then contains four recombination-specific recombination sites defined as follows: the site A corresponding to said Cre-recombinase specific recombination site at the location of the honey gene deleted the site B corresponding to said Cre recombinase-specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene, and the site C corresponding to a Cre recombinase-specific recombination site at the deleted honey gene locus (site A) when the heterologous DNA is inserted at the deleted honey gene locus or corresponding to a Cre-specific recombination site; recombinase at the locus of the deleted mic3 gene (site B) when the heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted mic3 gene, or corresponding to a Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted (site D) when the Heterologous DNA is inserted at the locus of
  • said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said site C corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or said site A corresponds to a lox site P, SEQ ID NO: 12
  • said site B corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site C corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68;
  • said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said site C corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or said site A corresponds to a lox site P, SEQ ID NO: 12
  • said site B corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site C corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or such that when the hetero logue DNA is inserted at the locus of the roplol gene deleted, said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said site C corresponds to a site lox 2272, SEQ ID NO: 68
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or said site A corresponds to a lox site P, SEQ ID NO: 12
  • said site B corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site C corresponds to a lox 2272, SEQ ID NO: 68
  • said site D corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said mutant strain is a mutant strain of Toxoplasma spp., Said enzyme allowing a specific recombination is Cre-recombinase, in which the roplol gene is deleted and said strain contains a recombination site specific for Cre-recombinase, at the locus of said deleted roplol gene, said strain containing four specific recombination sites which are respectively:
  • said first Cre-recombinase specific recombination site corresponding to the aforementioned Cre-recombinase specific recombination site at the gene locus deleted honey (site A) or at the aforementioned Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene (site B), or at the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the roplol gene deleted (site D)
  • said site A is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site B is the site lox P SEQ ID NO: 12,
  • said C site is the lox N SEQ ID NO: 5 site, said first Cre-recombinase specific recombination site being the A site, and
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68; or such
  • said site A is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site B is the site lox P SEQ ID NO: 12,
  • said site C is the lox site SEQ ID NO: 12, said first Cre-recombinase specific recombination site being site B, and
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68; or such
  • said site A is the site lox P SEQ ID NO: 12
  • said site B is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said C site is the lox site SEQ ID NO: 12, said first Cre-recombinase specific recombination site being site A, and
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68; or such
  • said site A is the site lox P SEQ ID NO: 12
  • said site B is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site C is the lox site N SEQ ID NO: 5, said first Cre-recombinase specific recombination site being site B, and
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68; or such
  • said site A is the site lox P SEQ ID NO: 12
  • said site B is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said C site is the lox 2272 SEQ ID NO: 68 site, said first Cre-recombinase specific recombination site being the D site, and
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68; or such said site A is the lox site N SEQ ID NO: 5
  • said site B is the site lox P SEQ ID NO: 12,
  • said C site is the lox 2272 SEQ ID NO: 68 site, said first Cre-recombinase specific recombination site being the D site, and
  • said site D is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae comprising a heterologous DNA as defined above, wherein said heterologous DNA encodes a protein of interest.
  • said heterologous DNA cited in any one of the previously described embodiments is chosen from:
  • sequence SEQ ID NO: 212 which codes for the protein SEQ ID NO: 208
  • sequence SEQ ID NO: 213 which codes for the protein SEQ ID NO: 209
  • sequence SEQ ID NO: 214 which codes for the protein SEQ ID NO: 210
  • sequence SEQ ID NO: 215 which codes for the protein SEQ ID NO: 211
  • sequence SEQ ID NO: 173 which codes for the protein SEQ ID NO: 167
  • sequence SEQ ID NO: 168 which codes for the protein SEQ ID NO: 165.
  • said heterologous DNA cited in any one of the previously described embodiments is chosen from:
  • a sequence coding for the protein SEQ ID NO: 208 a sequence coding for the protein SEQ ID NO: 209, a sequence coding for the protein SEQ ID NO: 210, a sequence coding for the protein SEQ ID NO: 211, a sequence coding for the protein SEQ ID NO: 167, or a sequence coding for the protein SEQ ID NO: 165, according to the degeneracy of the genetic code.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae comprising a heterologous DNA as defined above, wherein said protein of interest is an immunogenic heterologous antigen.
  • immunological heterologous antigen any peptide or protein from an organism different from said mutant strain and capable of eliciting an immune response.
  • an antigen may be an epitope or several epitopes.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said heterologous DNA codes for at least two proteins of interest and comprises the means necessary for their expressions, each of said at least two proteins of interest being translated. independently, that is to say that they are each controlled by elements necessary for their independent translation.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said heterologous DNA codes for at least two proteins of interest and comprises the means necessary for their expressions, each of said at least two proteins of interest being translated. independently, and wherein said at least two proteins of interest are immunogenic heterologous antigens.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae comprising a heterologous DNA in which said heterologous DNA encodes at least one protein of interest and a resistance protein and the means necessary for the expression of said proteins, each said proteins of interest and resistance being translated independently.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae comprising a heterologous DNA in which said heterologous DNA encodes at least one protein of interest and a resistance protein and the means necessary for the expression of said proteins, each said proteins of interest and resistance being translated independently, and wherein said at least one protein of interest is an immunogenic heterologous antigen.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae comprising a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, wherein said immunogenic heterologous antigen is an immunogenic heterogenic virus antigen.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae comprising a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above in which said immunogenic heterologous antigen is an immunogenic heterologous antigen of the influenza virus.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above, comprising a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen, wherein said immunogenic heterologous antigen is an immunogenic heterologous antigen of the Influenza virus selected from: protein of SEQ ID NO: 208 (N-ter fragment of a human influenza virus I), or the protein of SEQ ID NO: 209 (N-ter fragment of the protein M2 of a swine influenza virus), or the protein of SEQ ID NO: 201 (N-ter fragment of the M2 protein of an avian influenza virus) or the protein of SEQ ID NO: 211 (N-ter fragment of the M2 protein of an avian influenza virus) or the protein of SEQ ID NO: 167, corresponding to the fusion, in the order, of two proteins SEQ ID NO: 208, a protein SEQ ID NO: 209, a protein SEQ ID NO: 210 and a protein SEQ ID NO: 211
  • the two proteins SEQ ID NO: 208, the protein SEQ ID NO: 209, the protein SEQ ID NO: 210 and the protein SEQ ID NO: 211 can be fused in one of the sequences following, always ensuring that they are spaced by a linker:
  • the protein resulting from the fusion of these proteins may also be expressed in fusion with the T. gondii SAG1 protein SEQ ID NO: 166.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above, wherein said immunogenic heterologous antigen is an immunogenic heterogenic bacterial antigen.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above, in which said immunogenic heterologous antigen is an immunogenic heterogenic parasite antigen.
  • said heterologous DNA encodes an immunogenic heterologous antigen of virus, parasite or bacterium, and in particular consists of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 173, coding for the influenza virus antigen SEQ ID NO: 167.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above in which said mutant strain is a strain of Toxoplasma gondii and in which the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the recombination site Cre-recombinase specificity at the deleted honey gene locus is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox P site of SEQ ID NO: 12.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above in which said mutant strain is a strain of Toxoplasma gondii, in which the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the recombination site Cre-recombinase specificity at the deleted honey gene locus is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox P site of SEQ ID NO: 12.
  • Said strain comprising a heterologous DNA SEQ ID NO: 168 allowing the expression of a protein SEQ ID NO : 165,
  • said heterologous DNA being at the deleted honey gene locus, and being flanked upstream by a first recombination site corresponding to said Cre recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and downstream by a second recombination site specific for Cre-recombinase lox N of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above in which said mutant strain is a strain of Toxoplasma gondii, in which the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the recombination site Cre-recombinase specificity at the deleted honey gene locus is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox P site of SEQ ID NO: 12.
  • Said strain comprising a heterologous DNA SEQ ID NO: 168 allowing the expression of a protein SEQ ID NO : 165,
  • said heterologous DNA being at the locus of the deleted mic3 gene, and being flanked upstream by a first recombination site corresponding to said Cre recombinase-specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox P site of SEQ ID NO: 12 and downstream by a second recombination site specific for Cre-recombinase lox P of SEQ ID NO: 12.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae, said mutant strain being a strain of Toxoplasma gondii, in which the mic 1 genes, the mic 3 gene, and the roplol gene are deleted, and in which the Cre-recombinase specific recombination site at the deleted honey gene locus is the lox N site of SEQ ID NO: 5, and
  • the specific recombination site of the Cre-recombinase at the locus of the deleted mic3 gene is the lox P site of SEQ ID NO: 12, and
  • the specific recombination site of Cre-recombinase at the locus of the roplol gene deleted is the lox 2272 site of SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain according to the invention, wherein said mutant strain is a strain of Toxoplasma gondii selected from
  • the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the site of Cre recombinase-specific recombination at the locus of the deleted honey gene is the lox site N SEQ ID NO: 5 and
  • the specific recombination site of the Cre-recombinase at the locus of the deleted mic3 gene is the lox site SEQ ID NO: 12.
  • said gene encoding the GRA15II protein at the locus of said deleted roplol gene, being flanked upstream by a Cre recombinase specific recombination site,
  • the site of recombination specific for Cre-recombinase at the locus of the deleted honey gene is the lox site N SEQ ID NO: 5, and
  • the specific recombination site of the Cre-recombinase at the locus of the deleted mic3 gene is the lox P site SEQ ID NO: 12, and o said Cre recombinase-specific recombination site which upstream flanks said gene encoding the GRA15II protein at the locus of the roplol gene deleted, is the site lox 2272 SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Toxoplasma spp., In which the genes honey, mic3 and roplol are deleted, containing three Cre-recombinase specific recombination sites, at the respective locus of each of the aforesaid genes deleted, the Cre-recombinase specific recombination site, at the deleted honey gene locus being different from that at the locus of the deleted mic3 gene and the site of recombination specific to the roplol gene locus deleted being different from the specific recombination sites located at the loci of honey and mic3 gene deleted and said strain containing a heterologous DNA at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene or at the locus of the roplol gene deleted, said heterologous DNA being different from the heterologous DNA corresponding to the specific recombination sites Cre-recombinase, at the respective locus of each of the genes honey,
  • heterologous DNA When said heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted honey gene, it is flanked:
  • site C a second Cre-recombinase specific recombination site identical to the first Cre-recombinase specific recombination site located at the deleted honey gene locus (site A),
  • site C a second Cre-recombinase specific recombination site identical to the first Cre-recombinase specific recombination site located at the locus of the deleted mic3 gene (site B), when said heterologous DNA is inserted at the locus of the roplol gene deleted, it is flanked:
  • a second Cre-recombinase specific recombination site identical to the first Cre-recombinase specific recombination site located at the locus of the roplol gene (site D) deleted, said strain comprising the elements necessary for the transcription of said heterologous DNA, or the means necessary for the expression of said heterologous DNA when said heterologous DNA codes for at least one protein, said mutant strain then containing four Cre recombinase specific recombination sites defined as follows:
  • said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P
  • said site C corresponds to a lox N site
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or such that when heterologous DNA is inserted at the locus of the deleted mic3 gene,
  • said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said site C corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said D site corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68; or such that when the heterologous DNA is inserted at the locus of the roplol gene deleted, said site A corresponds to a lox N site, SEQ ID NO: 5
  • said site B corresponds to a site lox P, SEQ ID NO: 12
  • said site C corresponds to a site lox 2272, SEQ ID NO: 68
  • said site D corresponds to a lox 2272 site, SEQ ID NO: 68.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae in which said mutant strain is a Neospora caninum strain and in which the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the Cre specific recombination site is deleted.
  • -recombinase at the deleted honey gene locus is the lox P site of SEQ ID NO: 12 and
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox N site of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above in which said mutant strain is a strain of Neospora caninum, in which the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the recombination site Cre-recombinase specificity at the deleted honey gene locus is the lox P site of SEQ ID NO: 12.
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and said strain comprising a heterologous DNA SEQ ID NO: 168 allowing the expression of a protein SEQ ID NO : 165, said heterologous DNA being at the deleted honey gene locus, and being flanked upstream by a first recombination site corresponding to said Cre recombinase-specific recombination site at the deleted honey gene locus is the lox P site of SEQ ID NO: 12 and downstream by a second recombination site specific for Cre-recombinase lox P of SEQ ID NO: 12.
  • the present invention relates to a mutant strain of Sarcocystidae as defined above in which said mutant strain is a strain of Neospora caninum, in which the honey gene and the mic3 gene are deleted and in which the recombination site Cre-recombinase specificity at the deleted honey gene locus is the lox P site of SEQ ID NO: 12.
  • the Cre-recombinase specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and said strain comprising a heterologous DNA SEQ ID NO: 168 allowing the expression of a protein SEQ ID NO : 165,
  • said heterologous DNA being at the locus of the deleted mic3 gene, and being flanked upstream by a first recombination site corresponding to said Cre recombinase-specific recombination site at the locus of the deleted mic3 gene is the lox N site of SEQ ID NO: 5 and downstream by a second recombination site specific for Cre-recombinase lox N of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention also relates to the use of a mutant strain as defined above, containing no heterologous DNA other than the heterologous DNAs corresponding to the specific Cre-recombinase recombination sites at the respective locus of each of the aforementioned deleted genes, for the targeted insertion of heterologous DNA, except for therapeutic use.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use as a medicament, in particular as a vaccine or as an immunostimulant.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of infectious pathologies of viral, parasitic or bacterial origin.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of infectious pathologies of viral, parasitic or bacterial origin in a mammal or birds.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of infectious pathologies of viral, parasitic or bacterial origin in a mammal said mammal being in particular selected from humans, ovines, goats, pigs, cattle, equines, camelids, canines or felids.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of infectious pathologies of viral, parasitic or bacterial origin in a bird , said bird being in particular chosen from chickens, turkeys, guinea fowl, ducks, geese, quails, pigeons, pheasants, partridges, ostriches, rheas, emus and kiwis bred or kept in captivity for the purpose of reproduction, the production of meat or eggs for consumption or the supply of game for restocking.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of an infectious disease affecting the digestive system, causing diarrhea , affecting food digestibility or intestinal absorption.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of an infectious pathology affecting the central or peripheral nervous system and all the consequences for other systems associated with it.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of an infectious disease affecting the musculoskeletal system, in particular affecting the musculoskeletal or articular system, particularly infectious diseases causing myositis, arthritis or theft.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, its use in the prevention of an infectious pathology affecting the respiratory system and in particular catarrhal fevers. , obstructive abscesses, perforations and emphysema of infectious origin, tracheitis, bronchitis, pneumonia, pleurisy or in the particular case of birds, aerosacculitis.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of an infectious pathology affecting the reproductive system, fertility and Fertility, in particular, an infectious pathology affecting the normal development of the reproductive system of the male or female, the physiology of the reproductive cycle in females, affecting the smooth progress of pregnancy in mammals including fetal development or affecting Egg quality, in particular, infectious pathologies inducing metritis, salpingitis, mastitis or oviposition syndrome.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA coding for an immunogenic heterologous antigen. as defined above, for its use in the prevention of a pathology of infectious origin affecting the cardio-circulatory system, bone marrow or blood, particularly in the prevention of infections of infectious origin causing an alteration of the genesis of figured elements of blood and sepsis including associated consequences on other organs.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in preventing the animal from carrying viruses, bacteria or parasites. by an animal or a by-product derived and having a potentially zoonotic character, in particular, for use in the prevention of animal carriage of Salmonella spp., Escherichia spp. zoonotic, Clostridia, mycobacteria including tuberculosis.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of an infectious pathology of viral origin caused by a virus belonging to to the following groups:
  • Group I, II of the Baltimore classification including viruses whose genomes are made of DNA that is likely to infect a mammal or a bird, in particular a natural virus belonging to the family Herpesviridae, and more particularly the Epstein- Barr responsible for human mononucleosis, bovine herpes virus type I responsible for infectious bovine rhinotracheitis or Marek disease virus in domestic hen.
  • Group III, IV and V of the Baltimore Classification including viruses with a single-stranded or double-stranded RNA genome that may affect a mammal or bird, particularly viruses belonging to the family of Orthomyxoviridae and more particularly human, avian and porcine influenza viruses.
  • Retroviridae such as the virus of the human immunodeficiency (HIV), feline immunodeficiency virus (FIV), caprine arthritis and encephalitis virus or feline leukemia virus FELV.
  • Group VII of the Baltimore classification including DNA viruses requiring reverse transcription to RNA for viral propagation and likely to infect a mammal or a bird, particularly viruses of the family Hepadnaviridae, and more particularly the virus of the human hepatitis B or the Beijing duck hepatitis virus (DHBV).
  • DNA viruses requiring reverse transcription to RNA for viral propagation and likely to infect a mammal or a bird particularly viruses of the family Hepadnaviridae, and more particularly the virus of the human hepatitis B or the Beijing duck hepatitis virus (DHBV).
  • DHBV Beijing duck hepatitis virus
  • the present invention relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding a heterologous antigen SEQ ID NO: 165, for its use in the prevention of influenza caused by Influenza virus.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of an infectious pathology of bacterial origin (or caused by a toxin from a bacterium), said bacterium being able to belong to the following groups:
  • GRAM positive shells that are likely to affect directly or through one of these by-products, a mammal or a bird.
  • GRAM positive bacilli that are likely to affect directly or by one of these by-products, a mammal or a bird, particularly bacteria belonging to the genus Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium or Bacillus;
  • Mycoplasma-type bacteria that are likely to directly or by one of these by-products, a mammal or a bird, in particular bacteria belonging to the genus Mycoplasma and Ureaplasma;
  • Bacteria not mentioned above having the ability to invade a cell of a mammal or a bird, especially bacteria belonging to the genus Chlamydia, Rickettsia or Micobacterium.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use in the prevention of a pathology originating from a parasitic infection, the parasite being able to belong to the following groups:
  • Protozoa likely to directly affect a mammal or a bird, particularly protozoa belonging to the branch of sporozoites, Rhizoflagellates, ciliates or belonging to the genera Encephalitozoon, Enterocytozoon or blastocystis;
  • Nemathelminthes that may directly affect a mammal or a bird, particularly Nemathelminthes belonging to the genus Trichuris, Ascaris, Anisakis, Necator, Strongyloids, Toxocara, Ancylostoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, or Enterobius;
  • Plathelminths that may directly affect a mammal or a bird, especially Plathelminthes belonging to the genus Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis and Shistosoma;
  • Arthropods that may be responsible for a disease or vectorization of an infectious agent to a mammal or a bird, in particular arthropods belonging to the order of Anoploures of Heteroptera, Shiphonaptera, Diptera, Brachycera or Mites.
  • the present invention also relates to a mutant strain containing a heterologous DNA encoding an immunogenic heterologous antigen as defined above, for its use as an immunostimulant.
  • immunogenic heterologous antigen makes it possible to stimulate the immune defenses (such as a vaccine, for example).
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a mutant strain as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, comprising at least one product chosen from: an adjuvant, a stabilizer or a preservative, or a mixture thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, formulated in unit dose form varying from 10 2 to 10 9 tachyzoites of a mutant strain as defined above.
  • the present invention also relates to a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising a mutant strain as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to a method for preventing an infectious pathology of viral, parasitic or bacterial origin comprising a step of administering to a mammal or a bird of a mutant strain.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a mutant strain of Sarcocystidae in which the honey and mic3 genes are deleted, from a wild-type strain, comprising:
  • step A comprising or consisting of the deletion of the mic3 gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said selection cassette by the cre recombinase, following which only one of the two specific recombination sites surrounding the cassette remains integrated in the locus of said deleted mic3 gene,
  • a step B comprising or consisting of the deletion of the honey gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said selection cassette by the cre recombinase, following which only one of the two specific recombination sites flanking the cassette remains integrated with the locus of said deleted honey gene
  • steps A and B can be carried out in an A followed by B or B followed by A, and the two specific recombination sites flanking the selection cassette inserted at the honey gene locus being different from the two specific recombination sites surrounding the cassette inserted at the locus of the mic3 gene.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a mutant strain of Sarcocystidae in which the genes honey, mic3 and roplol are deleted and in which a gene encoding the GRA15II protein is integrated into the locus of the roplol gene deleted, from a wild strain, comprising:
  • a step A comprising or consisting of the deletion of the mic3 gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said selection cassette by the cre-recombinase, continued to which only one of the two specific recombination sites surrounding the cassette remains integrated with the locus of said deleted mic3 gene,
  • a step B comprising or consisting of the deletion of the honey gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by a step of excision of said selection cassette by the cre-recombinase , following which only one of the two specific recombination sites flanking the cassette remains integrated with the locus of said deleted honey gene, the two specific recombination sites flanking the selection cassette inserted at the locus of the honey gene being different from the two specific recombination sites surrounding the cassette. selection inserted at the mic3 gene locus
  • a step C comprising or consisting of the deletion of the roplol gene by homologous recombination and insertion of a cassette comprising a selection cassette flanked by two specific recombination sites, and comprising, downstream of this selection cassette, a sequence encoding the gene; gral5II, followed by a step of excision of said selection cassette by the cre-recombinase, following which said sequence coding for the gral5II gene is then integrated into the locus of the roplol gene deleted downstream of a single specific recombination site the two specific recombination sites surrounding the selection cassette inserted at the locus of the roplol gene being different from the two specific recombination sites surrounding the selection cassettes inserted at the loci of the honey and mic3 genes.
  • steps A, B and C can be carried out in an A followed by B followed by C, or A followed by C followed by B, or B followed by A followed by C, or B followed by C followed by A, or C followed by A followed by B, or C followed by B followed by A.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a mutant Sarcocystidae strain in which the honey and mic3 genes are deleted and in which a heterologous DNA is integrated at the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene, from a wild strain, comprising:
  • step A comprising or consisting of the deletion of the mic3 gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said selection cassette by the cre-recombinase, continued to which only one of the two specific recombination sites surrounding the cassette remains integrated with the locus of said deleted mic3 gene,
  • a step B comprising or consisting of the deletion of the honey gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said cre-recombinase selection cassette, following which only one of the two specific recombination sites flanking the cassette remains integrated with the locus of said deleted honey gene, the two specific recombination sites surrounding the selection cassette inserted at the honey gene locus being different. of the two specific recombination sites flanking the selection cassette inserted at the locus of the mic3 gene, steps A and B being able to be carried out in an A order followed by B or B followed by A,
  • a step D comprising or consisting of the targeted insertion of a heterologous DNA flanked by a specific recombination site, said heterologous DNA is integrated at the locus of the deleted honey gene when the specific recombination site which the flank corresponds to the recombination site at the locus of the deleted honey gene,
  • heterologous DNA is integrated at the locus of the deleted mic3 gene when the specific recombination site which flanks it corresponds to the specific recombination site situated at the locus of the deleted mic3 gene
  • heterologous DNA once integrated, said heterologous DNA will therefore be flanked by two specific recombination sites.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a mutant strain of Sarcocystidae in which the honey, mic3 and roplol genes are deleted and in which a heterologous DNA is integrated into the locus of the deleted honey gene or at the locus of the deleted mic3 gene and a gene coding for the GRA15II protein is integrated into the locus of the roplol gene deleted, from a wild-type strain, comprising:
  • a step A comprising or consisting of the deletion of the mic3 gene by homologous recombination and insertion of a first selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said selection cassette by the cre-recombinase, after which only one of the two specific recombination sites surrounding the cassette remains integrated in the locus of said deleted mic3 gene,
  • a step B comprising or consisting of the deletion of the honey gene by homologous recombination and insertion of a selection cassette flanked by two identical specific recombination sites, followed by the excision of said selection cassette by the cre-recombinase,
  • a step C comprising or consisting of the deletion of the roplol gene by homologous recombination and insertion of a cassette comprising a selection cassette flanked by two specific recombination sites, these two specific recombination sites being different from the two specific recombination sites the selection cassette inserted at the locus of the honey gene and those surrounding the selection cassette inserted at the locus of the mic3 gene, and comprising, downstream of this selection cassette, a sequence coding for the gral5II gene,
  • steps A, B and C can be performed in an A followed by B followed by C, followed by C followed by B, or B followed by A followed by C, or B followed by C followed by A, or C followed by A followed by B, or C followed by B followed by A, then
  • a step D comprising or consisting of the targeted insertion of a heterologous DNA flanked by a specific recombination site, said heterologous DNA is integrated into the locus of the deleted honey gene when the specific recombination site which the flank corresponds to the specific recombination site located at the locus of the deleted honey gene,
  • said heterologous DNA is integrated at the locus of the deleted mic3 gene when the specific recombination site which flanks it corresponds to the specific recombination site situated at the locus of the deleted mic3 gene, said hetero logue DNA is integrated at the locus of the deleted ropl6 gene when the specific recombination site which flanks it corresponds to the specific recombination site located at the locus of the deleted ropl6 gene,
  • heterologous DNA once integrated, said heterologous DNA will therefore be flanked by two specific recombination sites.
  • FIG. 1 this figure is a schematic representation of recombination by the Cre / loxP system applied to the X gene flanked by the identical loxP sites
  • FIG. 2- A This figure is a schematic representation of plasmid pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN.
  • This 10063 base pair plasmid comprises the selection gene coding for the CAT-GFP chimeric protein placed under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter to allow expression of the gene in the parasite.
  • This selection cassette is flanked by two identical loxN sites of the same orientation, added by PCR. On either side of the cassette were inserted the homologous regions flanking the ncmic3 gene.
  • FIG. 2-B This figure is a schematic representation of plasmid pNcMIC1-KO-CAT-GFP loxP.
  • This 10069 base pair plasmid comprises the selection gene coding for the CAT-GFP chimeric protein placed under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter to allow expression of the gene in the parasite.
  • This selection cassette is flanked by two identical loxP sites of the same orientation, added by PCR. On either side of the cassette were inserted homologous regions flanking the ncmicl gene.
  • FIG. 2-C This figure is a schematic representation of the plasmid pTSAG1-Cre Recombinase.
  • This 4,694 base pair plasmid comprises the gene coding for the CRE-Recombinase protein placed under the control of the promoter of the sagl gene of Toxoplasma gondii to allow expression of the gene in the parasite. Downstream of the gene encoding Cre Recombinase, the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii is inserted to stabilize the mRNA encoding the Cre Recombinase protein.
  • Figure 3-A This figure illustrates the 4 steps to obtain the strain Neo ncmicl-3 KO 2G.
  • the first step of homologous recombination allows the integration of the gene coding for the CAT-GFP enzyme at the locus of the mic3 gene. A selection by chloramphenicol makes it possible to amplify the simple mutant strain Neo ncmic3 KO.
  • the gene coding for the CAT-GFP protein is deleted by the action of Cre Recombinase.
  • the third step allows the integration of the gene coding for the CAT-GFP enzyme at the gene locus of the honey gene. Selection by chloramphenicol amplifies the single mutant strain Neo ncmicl-3 KO.
  • the gene coding for the CAT-GFP protein is deleted by the action of Cre Recombinase.
  • FIG. 3-B this figure represents the electrophoretic profiles of the PCR products obtained with the wild-type NC-1 strain of Neospora caninum, the Neo ncmic3 KO strain, the Neo ncmic3 KO 2G strain, the Neo ncmicl-3 KO strain and the strain respectively.
  • Figure 3-C This figure represents the results of sequencing obtained on the strain Neo ncmicl-3 KO 2G and confirms that the genes honey and mic3 were deleted and replaced respectively by scars LoxP and LoxN.
  • FIG. 4A this figure illustrates the immunofluorescence analysis of the detection of the MIC3 protein obtained respectively with the wild-type NC-1 strain of Neospora caninum and Neo ncmicl-3 KO 2G strain using an antibody specifically directed against the protein MIC3.
  • FIG. 4-B This figure illustrates the immunofluorescence analysis of the detection of the CATGFP protein obtained respectively with the wild-type NC-1 strain of Neospora caninum and the mutant strains of Neospora caninum using the intrinsic fluorescence of the CATGFP protein. This figure makes it possible to demonstrate the presence of the CATGFP protein or the absence of the CATGFP protein following the action of Cre Recombinase.
  • Figure 5-A This figure is a schematic representation of the plasmid pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP.
  • This 9,931 base pair plasmid comprises the selection gene coding for the CAT-GFP chimeric protein placed under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter to allow expression of the gene in the parasite.
  • This selection cassette is flanked by two identical loxP sites of the same orientation, added by PCR. On either side of the cassette were inserted the homologous regions flanking the tgmic3 gene.
  • FIG. 5-B This figure is a schematic representation of the plasmid pTgMIC1-KO-CAT-GFP loxN.
  • This 10 285 base pair plasmid comprises the selection gene coding for the CAT-GFP chimeric protein placed under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter to allow expression of the gene in the parasite.
  • This selection cassette is flanked by two identical loxN sites of the same orientation, added by PCR. On either side of the cassette were inserted the homologous regions flanking the tgmicl gene.
  • Figure 6-A This figure illustrates the 4 steps to obtain the strain Toxo tgmicl-3 KO 2G.
  • the first step of homologous recombination allows the integration of the gene coding for the CAT-GFP enzyme at the locus of the mic3 gene. Chloramphenicol selection amplifies the single mutant strain Toxo tgmic3 KO.
  • the gene coding for the CAT-GFP protein is deleted by the action of Cre Recombinase.
  • the third step allows the integration of the gene coding for the CAT-GFP enzyme at the gene locus of the honey gene. Chloramphenicol selection amplifies the single strain mutant Toxo tgmicl-3 KO.
  • the gene coding for the CAT-GFP protein is deleted by the action of Cre Recombinase.
  • FIG. 6-B this figure represents the electrophoretic profiles of the PCR products obtained respectively with the wild strain RH of Toxoplasma gondii, the strain Toxo tgmic3 KO, the strain Toxo tgmic3 KO 2G, the strain Toxo tgmicl-3 KO and the final strain Toxo tgmic1-3 KO 2G using PCR primers in Table 7.
  • FIG. 7 this figure illustrates the immunofluorescence analysis of the detection of the MIC1, MIC3 or CAT-GFP proteins obtained respectively with the wild strain RH of Toxoplasma gondii, the strain Toxo tgmic3 KO, the strain Toxo tgmic3 KO 2G, the strain Toxo tgmicl-3 KO and strain Toxo tgmicl-3 KO 2G using an antibody specifically directed against the protein MIC1, MIC3 or directly with the intrinsic fluorescent properties of the CAT-GFP protein.
  • FIG. 8 This figure is a schematic representation of the plasmid pTgRopl6KO-Gral5nKI-CAT-GFP lox2272.
  • This 12721 base pair plasmid comprises the selection gene coding for the CAT-GFP chimeric protein placed under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter to allow expression of the gene in the parasite.
  • This selection cassette is flanked by two identical lox2272 sites of the same orientation, added by PCR. Downstream of this cassette was integrated the expression cassette for coding the Gra51HAII protein. Then on either side of these cassettes were inserted the homologous regions flanking the tgropl6 gene.
  • Figure 9-A This figure illustrates the 2 steps to obtain the strain Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G.
  • the first step of homologous recombination allows the integration of the gene coding for the CAT-GFP enzyme and the gral5IIHA gene at the locus of the ropl6 gene. Selection with chloramphenicol amplifies the mutant strain Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl.
  • the gene coding for the CAT-GFP protein is deleted by the action of Cre Recombinase to obtain the strain Toxo tgmicl-KO ropl6 KO GRA15 n KI-2G.
  • Figure 9-B This figure shows the electrophoretic profiles of the PCR products obtained respectively with strains Toxo tgmicl-3 KO 2G, Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 n Kl and Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 n Kl 2G.
  • Figure 9-C This figure represents the results of sequencing obtained on the strain Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl 2G and confirms that the ropl6 and cat-gfp genes were deleted and replaced by the scar Lox2272 and the gral5HAII gene.
  • FIG. 10 this figure illustrates the immunofluorescence analysis of the detection of the GRA15 protein (via the HA tag) obtained respectively with the strains Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15 n KI and Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 n KI-2G using an antibody specifically directed against the HA tag.
  • This figure also illustrates the removal of the CATGFP cassette with the disappearance of the GFP fluorescence for the strain Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15 n KI-2G.
  • FIG. 11-A this figure illustrates the position of the nucleic primers used in the present invention for detecting the presence of the three ncmic3, ncmicl, cat-gfp genes in wild-type strains and / or Neo ncmic3 KO and / or Neo mutant strains.
  • the numbers represent the numbering of the primer sequences (SEQ ID NO: x) defined in the present application.
  • Figure 11-B This figure illustrates the position of the nucleic primers used in the present invention for detecting the presence of the three genes tgmic3, tgmic1, cat-gfp in wild-type strains and / or mutant strains of Toxo tgmic3 KO and / or Toxo tgmic3 KO 2G and / or Toxo tgmicl-3 KO and / or Toxo tgmicl-3 KO 2G Toxoplasma gondii.
  • the numbers represent the numbering of the primer sequences (SEQ ID NO: x) defined in the present application.
  • Figure 11-C This figure illustrates the position of the nucleic primers used in the present invention for detecting the presence of the three genes tgroplo, gral511, cat-gfp in wild-type strains and / or mutant strains of Toxo tgmicl-3 KO roplo KO Gral5II Kl of Toxoplasma gondii.
  • the numbers represent the numbering of the primer sequences (SEQ ID NO: x) defined in the present application.
  • Figure 13-A This figure illustrates the follow-up of clinical scores observed for mice.
  • Figure 13-B This figure illustrates the specific antibody titration against T. gondii in mouse serum at D-2, D28 and D129. ANOVA one way (****: pO.0001, *: p ⁇ 0.05).
  • Figure 13-C This figure illustrates the assay of IFNy following restimulation of splenocytes with the total extract of T. gondii 72h after restimulation. ANOVA one way (****: p ⁇ 0.0001, *: p ⁇ 0.05).
  • Lot 1 corresponds to the control group
  • Lot 2 corresponds to the challenge group 76K
  • Lot 3 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G
  • Lot 4 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
  • Figure 13-D This figure illustrates the number of cerebral cysts detected in mothers. ANOVA one way (*: p ⁇ 0.05). Lot 1 corresponds to the control group, Lot 2 corresponds to the challenge group 76K, Lot 3 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G and Lot 4 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
  • FIG. 13-E This figure illustrates the prolificity obtained for each batch.
  • Figure 13-F This figure illustrates the sex ratio obtained for each batch. Two-way ANOVA (**: p ⁇ 0.01), *: p ⁇ 0.05).
  • FIG. 13-G This figure illustrates the results obtained for the mortinality.
  • Figure 13-H This figure illustrates the results obtained for the observed mortality per litter for each batch. ANOVA one way (****: p ⁇ 0.0001, ***: p ⁇ 0.001). Lot 1 corresponds to the control group, Lot 2 corresponds to the challenge group 76K, Lot 3 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3KO 2G and Lot 4 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
  • Figure 13-1 This figure illustrates the survival percentage obtained for 32-day old mice. Log-rank (Mantel-Cox) test (****: p ⁇ 0.0001). Lot 1 corresponds to the control group, Lot 2 corresponds to the challenge group 76K, Lot 3 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G and Lot 4 corresponds to the group Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
  • Figure 13-J This figure illustrates the follow-up of observed clinical scores for young mice.
  • Figure 13-K This figure illustrates the specific IgM titration against T. gondii in the mouse serum of each lot. ANOVA one way (****: p ⁇ 0.0001, **: p ⁇ 0.01).
  • Neospora caninum during the proliferative phase allows the invalidation of a gene in a single homologous recombination.
  • Neospora caninum strain All tachyzoites of the Neospora caninum strain used were produced in human fibroblasts (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) grown in Dulbecco's minimal medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (FV S), 2mM glutamine , 100 U / mL penicillin and 100 U / mL streptomycin. They were harvested after mechanical lysis of the host cells by 3 passages in 25G syringe.
  • DMEM Dulbecco's minimal medium
  • FV S fetal calf serum
  • FV S fetal calf serum
  • the plasmid pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 1 contains a CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 comprising the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 coding for the CAT-GFP fusion protein allowing both chloramphenicol resistance (CAT) and green fluorescence (GFP), under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter SEQ ID NO: 3 to allow expression of the gene in the parasite.
  • Downstream of the cat-gfp SEQ ID: 2 gene the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4is inserted. This sequence aims to stabilize the mRNA encoding the CAT / GFP fusion protein.
  • This selection cassette SEQ ID NO: 6 is flanked by two identical loxN SEQ ID NO: 5 sites of the same orientation.
  • the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 was amplified by PCR on the plasmid pT230 CAT-GFP SEQ ID NO: 9 with the cat-gfp primers LoxN For SEQ ID NO: 7 and catgfp loxN SEQ ID NO: 8 (2380bp), digested with Clal and XbaI restriction enzymes (2348bp) and cloned into plasmid pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO: 10 digested with ClaI and XbaI (7715bp).
  • the plasmid then obtained is the plasmid pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 1.
  • the sequences of the primers are shown in Table 1 below.
  • the pNcMic3KO-CAT-GFP loxN plasmid thus contains a CAT-GFP SEQ ID NO: 6 cassette flanked by a 5 'HR sequence of the ncmic3 gene SEQ ID NO: 98 and a 3'HR sequence of the ncmic3 gene SEQ ID NO: 97.
  • Table 1 List of primers used for the construction of the pNcMIC3-KO-CAT-GFP plasmid loxN catgfp loxN For SEQ ID NO: 7
  • the plasmid pNcMic1 KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 11 contains a CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 comprising the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 coding for a CAT-GFP fusion protein allowing both chloramphenicol resistance (CAT) and green fluorescence (GFP), under the control of the toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter SEQ ID NO: 3 to allow expression of the gene in the parasite. Downstream of the CAT-GFP coding sequence, the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 is inserted. This sequence aims to stabilize PARNm encoding the CAT / GFP fusion protein.
  • This selection cassette SEQ ID NO: 6 is flanked by two identical loxP SEQ ID NO: 12 sites of the same orientation.
  • the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 was amplified by PCR on the plasmid pT230 CAT-GFP SEQ ID NO: 9 with primers CN10 SEQ ID NO: 13 and CN11 SEQ ID NO: 14 allowing the addition of loxP sites SEQ ID NO: 12 (2394 bp), digested with the HindIII and BamHI restriction enzymes (2339 bp) and cloned into the plasmid pT230-ble SEQ ID NO: 37 digested with HindIII and BamHI (293) lpb).
  • the plasmid then obtained is the plasmid pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 113.
  • the 3 HR region of the ncmicl gene was amplified by PCR from the genomic DNA of the NC-1 strain of Neospora caninum.
  • the primers 3 HR NCmicl F KpnI and 3 HR NCmicl R HindIII allow the amplification of the 3 HR region of the ncmicl gene and the creation of two restrictions that were used to clone the 3HR fragment upstream of the CAT-GFP selection cassette in pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 113.
  • the resulting plasmid is named pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO: 118.
  • the HR region of the ncmicl gene was amplified by PCR from the genomic DNA of the NC-1 strain of Neospora caninum.
  • the primers 5 HR NCmicl F BamHI and HR NCmicl R NotI allow the amplification of the 5'UTR region of the ncmicl gene and the creation of two restriction sites which have been used to clone the 5HR fragment.
  • downstream of the CAT-GFP selection cassette in the plasmid pNcmic1-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO: 118 (BamHI-Not).
  • the plasmid then obtained is the plasmid pNcMic1KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 11.
  • the plasmid pNcMic1KO-CAT-GFP loxP thus contains a CAT-GFP cassette SEQ ID NO: 6 flanked by a 5'HR sequence of the gene ncmicl SEQ ID NO: 96 and a 3'HR sequence of the ncmicl gene SEQ ID NO: 95.
  • Table 2 List of primers used for the construction of the plasmid pNcmicl KO CATGFP loxP
  • the plasmid pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO: 15 was constructed to transiently express in the parasite Toxoplasma gondii and its genetically modified derivatives the gene coding for Cre recombinase-derived Cre Recombinase protein (Brecht et al., 1999 , same reference as above).
  • the plasmid pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO: 15 is derived from the plasmid pUC18 (commercial plasmid). which contains an expression cassette of Cre Recombinase of bacteriophage Pl.
  • the gene encoding Cre Recombinase SEQ ID NO: 16 is placed under the control of the promoter of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 17, which allows the expression of Cre Recombinase protein in transfected Toxoplasma gondii parasites.
  • the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 is inserted. This sequence aims to stabilize the mRNA encoding the Cre Recombinase protein.
  • Neo ncmicl - 3 KO - 2G The construction of the second generation live attenuated strain, called Neo ncmicl - 3 KO - 2G, is made in 4 distinct steps:
  • the wild-type NC-1 strain of Neospora caninum is electroporated with the plasmid pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO: 1.
  • 20 ⁇ g of plasmid purified then linearized with KpnI are added to 10 7 parasites put suspended in CYTOMIX electroporation medium containing ⁇ (3 mM) and Glutathione (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun 11; 20 (11): 2902), and electroporation was made in a 4 mm gap, in a volume of 800 on a BioRad device (Parameters: 2000V, 50 ohms, 25 ⁇ , with two electric shocks).
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenicol 20 ⁇ l), 24 hours after the electroporation.
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a HFF cell monolayer and the clones of interest are identified by PCR after having carried out a DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Neo ncmic3 KO.
  • the mic3 gene was deleted and replaced by the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing the CATGFP selection cassette is SEQ ID NO: 101. Since the honey gene is not deleted, the sequence of the honey gene SEQ ID NO: 106 is present in the genome of strain.
  • the transiently expressed enzyme will allow excision of the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6.
  • the electroporation protocol is similar to the previous protocol. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. After 2 to 7 days of culture, the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest. . The strain obtained is called Neo ncmic3 KO - 2G.
  • the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P SEQ ID NO: 12 site is SEQ ID NO: 18.
  • the honey gene is not deleted, the honey gene sequence SEQ ID NO: 106 is present in the genome of the strain.
  • Neo ncmic3 KO-2G strain is electroporated with the plasmid pNcMIC1-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO: 11 linearized with KpnI, according to the protocol previously described. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. For the selection of the mutants, the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenicol 20 ⁇ l), 24 hours after electroporation.
  • the selection agent chloramphenicol 20 ⁇ l
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Neo ncmicl-3 KO
  • the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12 is SEQ ID NO: 18.
  • the honey gene was deleted and replaced by the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6.
  • the theoretical sequence at the deleted honey gene locus containing the CATGFP selection cassette is SEQ ID NO: 102.
  • the transiently expressed enzyme will allow excision of the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6.
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest. .
  • the strain obtained is called Neo ncmicl-3 KO-2G.
  • the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12, is SEQ ID NO: 18.
  • the honey gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted honey gene containing a single lox site SEQ ID NO: 12 is SEQ ID NO: 91.
  • PCR analyzes are carried out using the genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for the PCRs are described in Figure 11-A and are detailed in Table 3 below.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis (FIG. 3-B). Their expected size and observed size are also described in Table 4 below. For the sake of clarity in FIG.
  • the electrophoreses of the PCR products carried out with the primers c SEQ ID NO: 22 and d SEQ ID NO: 23 (mix 1) make it possible to demonstrate a band at 850 base pairs for the strain NC-1, according to the size of the band expected and confirming the presence of the gene ncmic3 SEQ ID NO: 105 in this strain.
  • This band is not detected in the strains Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, Neo ncmicl - 3 KO and Neo ncmic 1-3 KO - 2G confirming the suppression of the gene in these strains.
  • the electrophoreses of the PCR products carried out with the primers SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 and the primers k SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 respectively make it possible to highlight a band. at 2960 and 3668 base pairs for the Neo strain ncmic3 KO, according to the expected band size and confirming the presence of the cat-gfp selection gene in this strain in place of the ncmic3 gene.
  • This band is not detected in the NC-1, Neo ncmic3 KO-2G, Neo ncmic1-3 KO and Neo ncmic 1- 3 KO-2G strains confirming the absence of the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 at the ncmic 3 locus in these strains.
  • Neo ncmic3 KO - 2G Neo ncmicl - 3 KO and Neo ncmicl - 3 KO - 2G strains confirming the deletion of the cat - gfp selection gene SEQ ID NO: 2 in these groups. strains, leaving a scar loxN SEQ ID NO: 5 in the genome.
  • the electrophoreses of the PCR products made with the primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 make it possible to demonstrate a 644 base pair band for the strains NC-1, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, in accordance with the expected band sizes and confirming the presence of the ncmic 1 SEQ ID NO: 106 gene in these strains. These bands are not detected in Neo ncmicl-3 KO and Neo ncmicl-3 KO-2G strains confirming the deletion of the gene in these strains.
  • the electrophoreses of the PCR products carried out with the primers m SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 25 and the primers k SEQ ID NO: 26 and n SEQ ID NO: 29 make it possible respectively to highlight a 3359 and 3421 base pair band for the Neo strain ncmic1-3 KO, according to the expected band size and confirming the presence of the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 in this strain in place of the ncmic 1 gene This band is not detected in wild strains NC-1 of N.
  • Neo ncmic3 KO caninum, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, and Neo ncmic 1-3 KO - 2G confirming the absence of the at - gfp selection gene SEQ ID NO: 2 at the ncmic 1 locus in these strains.
  • the electrophoreses of the PCR products made with the primers SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 make it possible to highlight different bands according to the expected band size.
  • a 2182 base pair band for the NC-1, Neo ncmic3 KO and Neo ncmic3 KO-2G strains confirms the presence of the ncmic 1 gene in these strains.
  • a 2560 base pair band is demonstrated for the Neo ncmicl-3 KO strain confirming the presence of the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 in place of the ncmic gene 1.
  • the glass coverslips are mounted on a slide with Immu-Mount TM and observed under a fluorescence microscope.
  • the primary antibody Tgmic3 allows recognition of the Ncmic3 protein, it makes it possible to detect the expression of the NcMIC3 protein SEQ ID NO: 118 in the parasite (anti-mic3 rabbit antibody: rnAb anti-MIC3 s3) and the antibody secondary trading is used fluorine Alexa ® 594 goat anti-rabbit (ref Life technologies. al 1012). The results show that no fluorescence is detectable at the apical pole of the parasite revealing the absence of MIC3 proteins ( Figure 4- A).
  • the primary antibody Tgmic1 does not allow recognition of the NcMIC1 protein SEQ ID NO: 119.
  • the haploid genome of Toxoplasma gondii during the proliferative phase allows the invalidation of a gene in a single homologous recombination.
  • HFF Hs27 ATCC CRL-1634 human fibroblasts grown in Dulbecco's minimal medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (VF S), 2mM glutamine , 100 U / mL penicillin and 100 U / mL streptomycin. They were harvested after mechanical lysis of the host cells by 3 passages in 25G syringe.
  • Plasmid pTgMIC3-KO-CAT-GFP LoxP SEQ ID NO: 34 was constructed to delete the gene encoding Toxoplasma gondii TgMIC3 protein (ATCC reference: RH Pra310 strain) by homologous recombination.
  • the plasmid pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 34 contains a CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 comprising a cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 coding for a CAT-GFP fusion protein allowing both chloramphenicol resistance (CAT) and green fluorescence (GFP), under the control of the Toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter SEQ ID NO: 3. Downstream of the cat-gfp gene SEQ ID NO: 2, the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 is inserted.
  • CAT chloramphenicol resistance
  • GFP green fluorescence
  • SEQ ID NO: 6 was amplified from plasmid pT230 CAT-GFP SEQ ID NO: 9 using primers SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 which allow the addition of loxP sites (SEQ ID NO: 12) and HindIII and Spel restriction sites.
  • the amplified nucleotide sequence by PCR 2389 bp was then cloned into the plasmid pT230TUB Ble SEQ ID NO: 37 by enzymatic digestion with restriction enzymes HindIII and SpeI.
  • the plasmid obtained is called pCATGFP loxP SEQ ID NO: 38.
  • the 3'HR region of the tgmic3 gene SEQ ID NO: 39 was obtained by the enzymatic double digestion of the plasmid pmic3KO-2 SEQ ID NO: 40 with the restriction enzymes KpnI and HindIII (2145pb), and then cloned into the plasmid pCATGFP loxP SEQ ID NO: 38 digested with KpnI and HindIII (5238bp).
  • the plasmid obtained is called p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO: 41.
  • the 5'HR region of the tgmic3 gene SEQ ID NO: 42 was amplified by PCR from the genomic DNA of the T. gondii RH strain.
  • the primers SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 allow the amplification of the 5'UTR region of the tgmic3 gene and the creation of two restriction sites (2568bp / Spel and XbaI sites).
  • Table 5 Sequences of the primers used for the construction of the plasmid pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP.
  • Plasmid pTgMIC1-KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 45 ( Figure 5-B) was constructed to delete the gene encoding Toxoplasma gondii TgMIC 1 protein by homologous recombination.
  • the plasmid pTgMic1 KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO: 45 contains a CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 comprising the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 coding for the CAT-GFP fusion protein allowing both the chloramphenicol resistance (CAT) and a green fluorescence (GFP: Green Fluorescent Protein), under the control of the toxoplasma gondii ⁇ -tubulin promoter SEQ ID NO: 3. Downstream of the cat-gfp gene SEQ ID NO : 2, the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 was inserted.
  • CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 comprising the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 coding for the CAT-GFP fusion protein allowing both the chloramphenicol resistance (CAT) and a green fluorescence (GFP: Green Fluorescent Protein),
  • SEQ ID NO: 6 was amplified from plasmid pT230 CAT-GFP SEQ ID NO: 9 using primers SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 which allow the addition of loxN sites (SEQ ID NO: 5) and Clal and Xbal restriction sites.
  • the PCR amplified nucleotide sequence was then cloned into plasmid pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO: 10 digested with Clal and XbaI (7715 bp) by enzymatic digestion with restriction enzymes ClaI and XbaI.
  • the plasmid obtained is called pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO: 48.
  • the 5HR tgmicl SEQ ID NO: 49 fragment was amplified by PCR with the primers SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51 (2364bp), the KpnI and ClaI restriction sites were added by PCR.
  • the amplified fragment is digested with the restriction enzymes KpnI and ClaI (2337bp) and cloned into the plasmid pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO: 48 (see Example 1 for obtaining the plasmid pNCmic3KO CATGFP LoxN) digested with KpnI and ClaI (7740bp). ) to replace the 5HR ncmic3 fragment (fragment digested with KpnI and ClaI).
  • the plasmid obtained is called pTgmiclK05HR-NCmic3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO: 111.
  • the 3HR tgmicl SEQ ID NO: 52 fragment was amplified by PCR with the primers SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 (2750bp), the XbaI and NotI restriction sites were added by PCR.
  • the amplified fragment is digested with the restriction enzymes XbaI and NotI (2720 bp) and then cloned into the plasmid pTgmic1K05HR-NCmic3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO: 111 digested with restriction enzymes XbaI and NotI (7565 bp) to replace the 3HR fragment.
  • ncmic3 fragment digested with Xbal and NotI.
  • the plasmid obtained is called pTgmiclKO CAT-GFP LoxN SEQ ID NO: 45.
  • the primers used for the PCRs are detailed in Table 6 below.
  • the plasmid pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO: 15 was constructed to transiently express in the parasite Toxoplasma gondii and its genetically modified derivatives the gene coding for Cre recombinase-derived Cre Recombinase protein (Brecht et al, 1999, same reference as before).
  • the plasmid pT-SAG1-Cre-Recombinase SEQ ID NO: 15 is derived from the plasmid pUC18 (commercial plasmid) which contains an expression cassette of Cre Recombinase of bacteriophage Pl.
  • the gene encoding Cre Recombinase SEQ ID NO: 16 is placed under the control of the promoter of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 17, which allows expression of Cre Recombinase protein in transfected Toxoplasma gondii parasites.
  • Toxo tgmicl-3 KO-2G The construction of the second generation live attenuated strain, called Toxo tgmicl-3 KO-2G, is done in 4 distinct steps ( Figure 6-A): Deletion by homologous recombination of the tgmic3 gene and its replacement with the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 flanked by LoxP sequences SEQ ID NO: 12.
  • the wild strain of Toxoplasma gondii RH (ATCC reference: PRA-310) is electroporated with the plasmid pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO: 34.
  • 20 ⁇ g of plasmid purified and then linearized with KpnI are added to 10 7 parasites suspended in the CYTOMIX electroporation medium containing ⁇ (3 mM) and Glutathione (3 mM) (Van den Hoff et al, Nucleic Acid Research, Jun 11; 20 (11): 2902), and the electroporation was carried out in a 4 mm gap, in a volume of 800 on a BioRad device (Parameters: 2000V, 50 ohms, 25 ⁇ , with two electric shocks ).
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenicol 20 ⁇ l), 24 hours after the electroporation.
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a HFF cell monolayer and the clones of interest are identified by PCR after carrying out DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmic3 KO.
  • the mic3 gene was deleted and replaced by the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing the CATGFP selection cassette is SEQ ID NO: 103. Since the honey gene is not deleted, the sequence of the honey gene SEQ ID NO: 108 is present in the genome of strain.
  • the transiently expressed enzyme will allow excision of the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6.
  • the electroporation protocol is similar to the previous protocol. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. After 2 to 7 days of culture, the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest. . The strain obtained is called Toxo igmic3 KO - 2G. In this strain, the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12, is SEQ ID NO: 19.
  • the honey gene is not deleted, the honey gene sequence SEQ ID NO: 108 is present in the genome of the strain. Deletion by homologous recombination of the tgmicl gene and its replacement with the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 flanked by Lox N SEQ ID NO: 5 sequences.
  • the strain Toxo tgmic3 KO-2G is electroporated with the plasmid pTgMIC1-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO: 45 linearized by Pcil, according to the previously described protocol.
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenicol 20 ⁇ l), 24 hours after electroporation.
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO.
  • the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12, is SEQ ID NO: 19.
  • the honey gene was deleted and replaced by the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6.
  • the theoretical sequence at the deleted honey gene locus containing the CATGFP selection cassette is SEQ ID NO: 104.
  • the strain Toxo tgmic1-3 KO obtained is electroporated with the plasmid pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO: 15.
  • the transiently expressed enzyme will allow the excision of the selection cassette CAT-GFP SEQ ID NO: 6.
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. After 2 to 7 days of culture, the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest. .
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO-2G.
  • the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12 is SEQ ID NO: 19.
  • the honey gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted honey gene containing a single lox site N SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: 92.
  • PCR analyzes are carried out from genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for the PCRs are described in Figure 11-B and are detailed in Table 7 below.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis (FIG. 6-B). Their expected size and observed size are also described in Table 8 below. For the sake of clarity in FIG.
  • Table 7 list of primers used for validation of strains.
  • the electrophoreses of the PCR products made with the primers SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62 make it possible to demonstrate an 808 base pair band for the strain RH, according to the expected band size. and confirming the presence of the tgmic3 gene in this strain. This band is not detected in the strains Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl - 3 KO and Toxo tgmicl - 3 KO - 2G confirming the suppression of the gene in these strains.
  • the electrophoreses of the PCR products carried out with the primers SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 25, and the primers k SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 58 (mixes 6 and 7) make it possible to highlight respectively a 3040 and 3593 base pair band for the Toxo tgmic1-3 KO strain, according to the expected band size and confirming the presence of the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2 in this strain in place of the gene tgmic3 SEQ ID NO: 107. This band is not detected in the RH wild strains of T.
  • the electrophoreses of the PCR products made with the primers SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60 8 (mix 8) can highlight different bands in accordance with the expected band size.
  • a 4198 bp band for the RH, Toxo tgmic3 KO and Toxo tgmic3 KO-2G strains confirms the presence of the tgmicl SEQ ID NO: 108 gene in these strains.
  • a 3129 base pair band is demonstrated for the Toxo tgmic1-3 KO strain confirming the presence of the CATGFP selection cassette SEQ ID NO: 6 in place of the tgmic1 gene.
  • the tachyzoites are grown 24h on glass slides covered with a monolayer of HFF cells. Infected cells were washed twice with PBS1X, and fixed with 4% formaldehyde for 30 min. After 3 washes in PBS1X, infected HFF cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS1X for 5 min. After 3 washes with PB IX, a saturation step is carried out with a 10% PB S 1X / SVF solution for 30 min. The cells were then incubated with the primary antibody diluted in 2%> FCS for 1 hour, washed 3 times with PBS1X and then incubated with secondary antibody diluted in 2% PBS / FCS solution for 1 hour. After 2 washes with PBS1X, the glass coverslips are mounted on a slide with Immu-Mount TM and observed under a fluorescence microscope.
  • the primary antibody Tgmic3 used is an antibody which makes it possible to detect the expression of the TgMIC3 protein SEQ ID NO: 121 in the parasite (anti-mic3 rabbit antibody: rnAb anti-MIC3 s3) and the commercial secondary antibody used is Alexa fluor ® 594 goat anti-rabbit (Life Technologies Ref Al 1012).
  • the Tgmicl primary antibody used is an antibody that makes it possible to detect the expression of the TgMIC1 protein SEQ ID NO: 122 in the parasite (anti-honey mouse antibody: anti-MIC1 mAb T104F8E12) and the commercial secondary antibody used is Alexa fluor ® 594 goat anti-mouse, Life technologies ref. Al 1005).
  • the haploid genome of Toxoplasma gondii during the proliferative phase allows the invalidation of a gene in a single homologous recombination.
  • HFF human fibroblasts
  • DMEM Dulbecco's minimal medium
  • FV S fetal calf serum
  • 2mM glutamine 100 U / mL of penicillin and 100 U / mL streptomycin. They were harvested after mechanical lysis of the host cells by 3 passages in 25G syringe.
  • the plasmid pTgRopl6KO-Gral5 n KI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO: 67 contains the CAT-GFP selection cassette SEQ ID NO: 6 comprising the cat-gfp selection gene SEQ ID NO: 2, coding for the CAT-GFP fusion protein conferring resistance to chloramphenicol (CAT) and green fluorescence (GFP), under the control of the ⁇ -tubulin promoter of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 3 to allow expression of the gene in the parasite .
  • CAT chloramphenicol
  • GFP green fluorescence
  • the 3'UTR sequence of the sagl gene of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 4 is inserted. This sequence aims to stabilize the mRNA encoding the CAT-GFP fusion protein.
  • the selection cassette SEQ ID NO: 6 is flanked by two Lox2272 SEQ ID NO: 68 sites, recognition sites specifically recognized by Cre Recombinase and that will be used later to remove the CAT-GFP selection cassette.
  • an expression cassette of the gral5n gene SEQ ID NO: 69 was cloned.
  • This expression cassette consists of the ampl 15u promoter amplified from the genomic DNA of the ME49 strain and the gral5n gene SEQ ID NO: 70 amplified at from the genomic DNA of the ME49 strain, including a 3 'HA tag SEQ ID NO: 72 to facilitate localization and the 3' UTR sequence of the T. gondii sagl SEQ ID NO: 4 gene amplified from the genomic DNA of the RH strain.
  • This plasmid therefore allows the simultaneous production of a mutant roploKO lox2272 CATGFP lox2272 and the insertion of gral5IIHA at locus ropl6.
  • the plasmid pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO: 73 contains a CAT-td Tomato SEQ ID NO: 125 cassette flanked by a 5'HR sequence of the tgroplo gene SEQ ID NO: 99 and a 3'HR sequence of the tgroplo gene. SEQ ID NO: 100.
  • Cloning was done from plasmid pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO: 73 digested with SphI and Agel enzymes (6073bp). This cloning required 4 independent PCRs.
  • the first PCR allowed amplification from the plasmid pCATGFP lox P SEQ ID NO: 38, of a CAT-GFP screening cassette SEQ ID NO: 6 comprising the aTubulin promoter, the cat-gfp selection gene and the region. 3'UTR of sagl of T. gondii, with addition of the site lox2272 SEQ ID NO: 68 with the primers tub F Agel SEQ ID NO: 74 and 3 UTR lox2272 R SEQ ID NO: 75 (2090pb).
  • the second PCR allowed the amplification from the plasmid pT230 2G gral5II SEQ ID NO: 76, of the gral5II promoter SEQ ID NO: 71 with 5 'addition of the site lox2272 SEQ ID NO: 68 with the primers pGral5 F lox2272 SEQ ID NO: 77 and P Gral5 R SEQ ID NO: 78 (1975bp).
  • the third PCR allowed amplification from the plasmid pT230 2G gral5II SEQ ID NO: 1
  • the last PCR allowed the amplification of a part of 3'Ropl6 SEQ ID NO: 80 with the primers Ropl6F SEQ ID NO: 81 and Ropl6R SphI SEQ ID NO: 82 (570pb) on the plasmid pTgroplo KO CAT-tdTomato SEQ ID NO: 73 as a matrix.
  • the 4 amplified PCR fragments were directly cloned into the pTgroplo KO CAT-tdTomato SEQ ID NO: 73 vector digested with Agel and SphI using the Ozyme In-Fusion® kit (In-Fusion® HD Cloning Kit - Clonetech).
  • In-Fusion® cloning technology allows one-step cloning without purification or digestion of one or more PCR products in a linearized vector. Complementary ends at the ends of adjacent fragments are added by PCR. The reaction is done according to the manufacturer's recommendations.
  • the plasmid obtained is called pTgRopl6KO-Gral5 n KI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO: 67.
  • the plasmid called pTgRopl6KO-Gral5 n KI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO: 67 therefore contains a CAT-GFP cassette SEQ ID NO: 6 and an expression cassette of gral5HAII SEQ ID NO: 69, flanked by a 5'HR sequence of the tgroplo SEQ ID NO: 99 gene and a 3'HR sequence of the tgroplo SEQ ID NO: 100 gene.
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GralSII KL
  • the ropl6 gene was deleted and replaced by the CATGFP selection cassette SEQ ID NO: 6 and the gral5HAII expression cassette SEQ ID NO: 69.
  • the theoretical sequence at the locus of the ropl6 deleted gene containing the CATGFP selection cassette and the gral5HAII expression cassette is SEQ ID NO: 112.
  • the mic3 gene has been deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 has been excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12 is SEQ ID NO: 19.
  • the honey gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted honey gene containing a single lox N site SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: 92.
  • Suppression of the selection cassette the strain Toxo tgmic1-3 KO ropl6 KO Gral5II K1 obtained is electroporated with the plasmid pT-SAG1-CRE-Recombinase SEQ ID NO: 15 (FIG. 2-C).
  • the transiently expressed enzyme will allow excision of the CAT-GFP selection cassette. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a DNAzol genomic DNA extraction of the clones of interest. .
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GralSII Kl -2G.
  • the ropl6 gene was deleted and replaced by the gral5HAII expression cassette SEQ ID NO: 69 and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted ropl6 gene containing the single-site cassette lox 2272 SEQ ID NO: 68 and the gral5HAII expression cassette is SEQ ID NO: 93.
  • the mic3 gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted mic3 gene containing a single lox P site SEQ ID NO: 12, is SEQ ID NO: 19.
  • the honey gene was deleted and the selection cassette CATGFP SEQ ID NO: 6 was excised.
  • the theoretical sequence at the locus of the deleted honey gene containing a single lox site N SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: 92.
  • PCR analyzes are carried out from the genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for the PCRs are described in Figure 11-C and are detailed in Table 10 below.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis (FIG. 9-B). Their expected size and observed size are also described in Table 11 below.
  • Table 10 List of primers used for the validation of the Toxo strain tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G.
  • Table 11 Expected size of the amplicons (in base pairs) of the different validation PCRs for the construction of the Toxo tgmicl-3 KO strain ropl6 KO Gral5II Kl 2G
  • the tachyzoites are grown 24h on glass slides covered with a monolayer of HFF cells. Infected cells were washed twice with PBS1X, and fixed with 4% formaldehyde for 30 min. After 3 washes in PBS1X, infected HFF cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS1X for 5 min. After 3 washes with PB IX, a saturation step is carried out with a 10% PB S 1X / SVF solution for 30 min. The cells were then incubated with the primary antibody diluted in 2%> FCS for 1 hour, washed 3 times with PBS1X and then incubated with secondary antibody diluted in 2% PBS / FCS solution for 1 hour. After 2 washes with PBS1X, the glass coverslips are mounted on a slide with Immu-Mount TM and observed under a fluorescence microscope.
  • the primary antibody used is the mouse anti-HA antibody which makes it possible to detect the expression of the GRA15n-HA protein SEQ ID NO: 123 in the parasite.
  • the secondary antibody is the commercial secondary antibody: Alexa fluor® 594 goat anti rabbit (Life Technologies A-1012). The antibodies are diluted 1/1000 in PBS 2% FCS.
  • the Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II K1 strain expresses a green fluorescent reflecting the expression of the CATGFP protein SEQ ID NO: 120, whereas after the action of Cre recombinase, the Toxo tgmicl-3 KO strain ropl6 KO gral5II Kl lox2272 no longer fluorescent ( Figure 10).
  • EXAMPLE 4 Construction of Recombinant Strains Expressing the M2eGPI Protein After Targeted Integration
  • the objective of this experiment is to evaluate whether the Toxo tstnicl-3 KO 2G and Neo ncmicl-3 KO 2G strains can express heterologous antigens.
  • HFF human fibroblasts
  • DMEM Dulbecco's minimal medium
  • F S fetal calf serum
  • 2mM glutamine 100 U / mL of penicillin and 100 U / mL streptomycin. They were harvested after mechanical lysis of the host cells by 3 passages in 25G syringe.
  • the plasmid pUC 4G2 ICrel SEQ ID NO: 156 was constructed to allow the integration of a heterologous transgene in the strains Toxo tgmicl-3 KO 2G, Neo ncmicl-3 KO 2G and Toxo tgmicl-3 KO roplo KO gral5II Kl.
  • the plasmid is in particular composed of:
  • a selection cassette dhfr * -ty-tk SEQ ID NO: 229 (Donald & Roos, Proc Natl Acad Sci US A 1993 Dec 15; 90 (24): 11703-7; Scahill et al, (Mol Biochem Parasitol, 2008 Jan, 157 (1): 73-82, Epub 2007 Oct 6.)), placed under the control of the T. gondii dhfr * SEQ ID NO: 230 promoter and downstream of the 3'UTR sequence. of the dhfr gene * SEQ ID NO: 231 from Toxoplasma gondii.
  • This selection cassette encodes the DHFR * TYTK SEQ ID NO: 207 fusion protein and allows positive selection by pyrimethamine and negative selection by ganciclovir.
  • 2- an expression cassette consisting of the ⁇ -Tub8 promoter SEQ ID NO: 128 (Soldati et al., Mol Cell Biol., 1995 Jan. 15 (1): 87-93 - fusion of part of the Tgsag1 and Tgtub promoter), a multiple cloning site MCS to allow the future integration of heterologous transgene and the 3'UTR sequence of the tgsagl gene SEQ ID NO: 4 which should make it possible to stabilize the mRNA of the heterologous gene .
  • the dhfr * -ty-tk selection cassette was made from 3 PCR fragments obtained with the primers of Table 20:
  • the amplification of the first PCR fragment SEQ ID NO: 129 was carried out on the plasmid pUC18DHFR * SEQ ID NO: 130 (Donald & Roos 1993, same reference as above) with the primers Dhtk1 SEQ ID NO: 131 and Dhtk2 SEQ ID NO: 132 (674bp) and allows the amplification of the end of the coding sequence of DHFR * SEQ ID NO: 133 and to add the sequence encoding the TY in 3 'SEQ ID NO: 134.
  • the second PCR was carried out on a synthesized sequence of the gene encoding the Thymidine Kinase of Human herpesvirus 1 (TK) SEQ ID NO: 135 with the primers Dhtk3 SEQ ID NO: 136 and Dhtk4 SEQ ID NO: 137 (1161pb) and allows the amplification of the coding sequence of Thymidine Kinase with the addition of the TY coding sequence at 5 'SEQ ID NO: 138.
  • TK Human herpesvirus 1
  • the amplification of the third PCR fragment was carried out on pUC18DHFR * SEQ ID NO: 130 with primers Dhtk5 SEQ ID NO: 139 and Dhtk6 SEQ ID NO: 140 (363pb) and allows the amplification of the end of the sequence coding for Thymidine Kinase and 3'UTR of DHFR * SEQ ID NO: 141.
  • the second and third PCR fragments are fused by overlapping PCR with the primers Dhtk3 SEQ ID NO: 136 and Dhtk6 SEQ ID NO: 140 (1501pb) to give the sequence SEQ ID NO: 191.
  • the first fragment SEQ ID NO: 129 digested with BamHI and BglII (646bp) and fusion of the other two BamHI and XbaI digested PCR (SEQ ID NO: 191) (1474bp) were cloned into plasmid pUC18DHFR * SEQ ID NO: 130 digested with BglII and XbaI (5258bp).
  • the plasmid obtained is called pUC 18DHFR * TYTK SEQ ID NO: 142.
  • the expression cassette is composed of the Pa-Tub8 promoter SEQ ID NO: 128 (Soldati et al, 1995, same reference as above), a multiple cloning site to allow future integration of heterologous transgene and the 3'UTR sequence of the sagl gene SEQ ID NO: 4 which should make it possible to stabilize the mRNA of the heterologous gene.
  • the promoter portion of ⁇ -Tub8 SEQ ID NO: 128 was obtained by PCR with primers K7mcs1 SEQ ID NO: 143 and K7mcs2 SEQ ID NO: 144 (530pb) on pTUB8TY TAIL SEQ ID NO: 145 (Meissner and al., J Cell Sci., 2002: 115: 563-574).
  • the 3 'UTR sequence of the sagI gene SEQ ID NO: 4 was obtained by PCR with primers K7mcs3 SEQ ID NO: 146 and K7mcs4 SEQ ID NO: 147 (395 bp).
  • the two PCR fragments were fused by overlapping PCR with primers K7mcs1 SEQ ID NO: 143 and K7mcs4 SEQ ID NO: 147 (914pb) to give the sequence SEQ ID NO: 192.
  • the overlapping PCR SEQ ID NO: 192 digested by KpnI and SacI (902bp) was cloned into pUC18 (commercial plasmid) KpnI SacI (2682bp).
  • the primers used for the PCRs are detailed in Table 12 below.
  • the resulting plasmid is pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 148.
  • Table 12 List of primers used for the construction of the expression cassette
  • the Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 149 expression cassette obtained by digestion of the pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO: 148 with the XbaI enzyme (890bp) was then cloned into the plasmid pUC18 DHFR * TYTK SEQ ID NO: 142 digested with XbaI and dephosphorylated (7378bp).
  • the resulting plasmid has its Tub8MCS 3UTR expression cassette transcribed in the opposite direction to the DHFR * TYTK cassette.
  • the plasmid obtained is named pUC4G2 SEQ ID NO: 150.
  • the two fragments PCR SEQ ID NO: 193 and SEQ ID NO: 194 were directly cloned into the pUC4G2 plasmid SEQ ID NO: 150 digested with the restriction enzymes Pml I and KasI (7990bp) with the In-Fusion technique of Ozyme.
  • the primers used for PCR are detailed in Table 21 below.
  • This plasmid will make it possible to produce a M2eGPI sagI fusion protein SEQ ID NO: 165, comprising the Toxoplasma gondii S AGI protein SEQ ID NO: 166, a repetition of 5 M2e (Nter fragment of the Influenza virus M 2 protein). spaced by linkers (Lee et al, 2015, PLoS ONE 10 (9): e0137822, doi: 10.1371 / journal.pone.0137822) SEQ ID NO: 167 and Cter a GPI anchoring sequence of the AGI protein S of Toxoplasma gondii SEQ ID NO: 169. The amplification of 3 PCR fragments was necessary for this construction.
  • the amplification of the first PCR fragment SEQ ID NO: 197 was performed on the genomic DNA of Toxoplasma gondii of the sagl coding sequence SEQ ID NO: 170 with the primers of SEQ ID NO: 171 and db SEQ ID NO: 172 (906bp).
  • the second PCR SEQ ID NO: 198 was performed on a synthesized sequence comprising a repetition of M2e SEQ ID NO: 173 (Lee et al) with the primers of SEQ ID NO: 174 and dd SEQ ID NO: 175 (588pb) . This M2e sequence has been optimized for expression in Toxoplasma gondii.
  • the amplification of the third PCR fragment SEQ ID NO: 199 was carried out on the genomic DNA of Toxoplasma gondii of the sagl coding sequence (GPI anchor portion) SEQ ID NO: 176 with the primers of SEQ ID NO: 177 and SEQ ID NO: 178 (98bp).
  • the primers used for the PCRs are detailed in Table 13 below.
  • Table 13 List of primers used for the construction of plasmids pUC 4G2 Icrel M2eGPI
  • PCR fragments were directly cloned into the plasmid p4G2 ICrel SEQ ID NO: 156 digested with the enzymes Pmel and NotI (8344pb) with the In-Fusion technique of Ozyme.
  • the LoxP site SEQ ID NO: 12 was introduced by PCR into plasmid PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO: 164 digested Pcil and PmeI (8901 bp).
  • the PCR fragment SEQ ID NO: 200 obtained with the primers aa SEQ ID NO: 180 and ab SEQ ID NO: 181 (438bp) and the PCR fragment SEQ ID NO: 201 obtained with primers ac SEQ ID NO: 182 and ad SEQ ID NO: 183 (534bp) ) were cloned with the In-Fusion technique of Ozyme in plasmid PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO: 164 digested Pcil and Pmel. Primers used for PCR are detailed in Table 14 below.
  • Table 14 List of primers used for the introduction of the loxP site
  • the loxN site SEQ ID NO: 5 was introduced by PCR into the plasmid PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO: 164 digested Pcil and PmeI (8901 bp).
  • the PCR fragment SEQ ID NO: 202 obtained with the primers aa SEQ ID NO: 180 and bb SEQ ID NO: 181 (438pb) and the PCR fragment SEQ ID NO: 203 obtained with the primers bc SEQ ID NO: 182 and ad SEQ ID NO: 183 (534bp) were cloned with the In-Fusion technique of Ozyme in the plasmid PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO: 164 digested Pcil and Pmel.
  • the primers used for PCR are detailed in Table 15 below.
  • Table 15 List of primers used for the introduction of the loxN site
  • the strain ToxoKO micI-3KO 2G is electroporated with 20 ⁇ g of circular plasmids purified pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO: 179 and pTsagI Cre recombinase SEQ ID NO: 15 according to the protocol previously described. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. For selection of the mutants, the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (20 ⁇ M chloramphenol), 24 hours after electroporation.
  • the selection agent (20 ⁇ M chloramphenol
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP.
  • the strain ToxoKO micI-3KO 2G is electroporated with 20 ⁇ g of the circular plasmids purified pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO: 184 and pTsagI Cre recombinase SEQ ID NO: 15 according to the protocol previously described. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. For the selection of the mutants, the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenol 20 ⁇ l), 24 hours after electroporation.
  • the selection agent chloramphenol 20 ⁇ l
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN. Random integration
  • the strain ToxoKO -3KO honey 2G is electroporated with 20 ⁇ g of the purified linearized plasmid pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO: 179 or pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO: 184 according to the protocol previously described.
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenicol 20 ⁇ l), 24 hours after electroporation. 10 to 15 days after selection, the parasites are analyzed for the expression of the SAG1 M2eGPI fusion protein SEQ ID NO: 165 (analysis on the total population).
  • PCR analyzes are carried out from genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for the PCRs are detailed in Table 16 below.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the clones having integrated the plasmid were validated by PCR with the primers SEQ ID NO: 187 and eb SEQ ID NO: 188 by obtaining the fragment SEQ ID NO: 204 (1719pb).
  • the second PCR makes it possible to validate the location of the insertion of the plasmid at the Tgmic3 loxP locus.
  • the clones having integrated one of the plasmids were validated by PCR with the primers ec SEQ ID NO: 189 and eb SEQ ID NO: 188 by obtaining the fragment SEQ ID NO: 205 (2704 bp).
  • Table 16 List of primers used for validation of clones
  • MCS F AACCCGCGCAGAAGACATCC MCS R ATGGGGCACATGCTGCACGAA
  • PCR analyzes are carried out from genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for the PCRs are detailed in Table 17 below.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the clones having integrated one of the plasmids were validated by PCR with the primers ea SEQ ID NO: 187 and eb SEQ ID NO: 188 (1719pb) by obtaining the fragment SEQ ID NO: 204.
  • the second PCR makes it possible to validate the location of the insertion of the plasmid at the Tgmicl loxN locus.
  • the clones having integrated one of the plasmids were validated by PCR with the primers ed SEQ ID NO: 55 and eb SEQ ID NO: 54 (2366pb) by obtaining the fragment SEQ ID NO: 206.
  • Table 17 List of primers used for validation of clones
  • M2eGPI SEQ ID NO: 165 The expression level of M2eGPI SEQ ID NO: 165 was analyzed for different populations of recombinant parasites following specific labeling with an anti-M2 antibody (anti-influenza A virus M2 Protein antibody ab5416 - Abcam). Expression of the M2eGPI transgene is similar or slightly higher for clones whose transgene is targeted (localized at the LoxP and LoxN scars at the honey locus or mic3) than for populations whose transgene is inserted randomly. . This result demonstrates that the Toxo tgmic1-3 KO 2G strain is an optimized expression vector for transgene expression.
  • Example 5 Construction of recombinant strains of Toxo ts iclS KO expressing the CAT-GFP protein after targeted or random integration of the transgene cat-sfp
  • the objective of this experiment is to study the level of expression of the cat-gpf gene after random or targeted integration at the LoxP or LoxN site of the transgene.
  • HFF human fibroblasts
  • DMEM Dulbecco's minimal medium
  • F S fetal calf serum
  • 2mM glutamine 100 U / mL of penicillin and 100 U / mL streptomycin. They were harvested after mechanical lysis of the host cells by 3 passages in 25G syringe.
  • the CATGFP fragment SEQ ID NO: 222 was amplified by PCR with the primers ca SEQ ID NO: 223 and cb SEQ ID NO: 224 (1488 bp) on pCATGFP SEQ ID NO: 9. This PCR fragment was cloned with the Ozyme In-Fusion technique in the plasmid pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO: 179 was digested with PmeI and NotI (8372pb-replacement of M2eGPI by CATGFP). The primers used for the PCRs are detailed in Table 18 below.
  • Table 18 List of primers used for the construction of plasmids pUC 4G2 Icrel CAT ⁇
  • the CATGFP fragment SEQ ID NO: 222 was amplified by PCR with the primers ca SEQ ID NO: 223 and cb SEQ ID NO: 224 (1488 bp) on pCATGFP SEQ ID NO: 9. PCR was cloned with the In-Fusion technique of Ozyme in plasmid pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO: 184 was digested with Pmel and NotI (8372pb-replacement of M2eGPI by CATGFP). Primers used for PCR are detailed in Table 18 above.
  • the ToxoKO mic1-3KO 2G strain is electroporated with 20 ⁇ g of the circular plasmids purified pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO: 221 and pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO: 15 according to the protocol previously described. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. For selection of the mutants, the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (20 ⁇ M chloramphenol), 24 hours after electroporation.
  • the selection agent (20 ⁇ M chloramphenol
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP loxP.
  • the ToxoKO mic1-3KO 2G strain is electroporated with 20 ⁇ g of the purified circular plasmids pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO: 225 and pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO: 15 according to the protocol previously described. After electroporation, the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture. For the selection of the mutants, the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenol 20 ⁇ l), 24 hours after electroporation.
  • the selection agent chloramphenol 20 ⁇ l
  • the parasites are subcloned into a 96-well plate on a monolayer of HFF cells and the clones of interest are identified by PCR after carrying out a genomic DNA extraction of the clones of interest.
  • the strain obtained is called Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP loxN.
  • the ToxoKO-3KO 2G strain is electroporated with 20 ⁇ g of the purified linearized plasmid pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO: 221 or pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO: 225 according to the protocol previously described.
  • the tachyzoites are deposited on a monolayer of HFF cells in culture.
  • the culture medium is replaced and supplemented with the selection agent (chloramphenol 20 ⁇ l), 24 hours after electroporation. 10 to 15 days after selection, the parasites are analyzed for the expression of the CATGFP protein SEQ ID NO: 120 (analysis on the total population).
  • PCR analyzes are carried out from genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for PCR are detailed in Table 16 previously cited.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the clones having integrated the plasmid were validated by PCR with the primers ea SEQ ID NO: 187 and eb SEQ ID NO: 188 and obtaining a fragment SEQ ID NO: 226 (1647pb).
  • the second PCR makes it possible to validate the location of the insertion of the plasmid at the Tgmic3 loxP locus.
  • the clones having integrated one of the plasmids were validated by PCR with the primers ec SEQ ID NO: 189 and eb SEQ ID NO: 188 and obtaining a fragment SEQ ID NO: 227 (2600 bp).
  • Primers used for PCR are detailed in Table 16.
  • PCR analyzes are carried out from genomic DNA extracted with DNAzol from a parasitic pellet consisting of 10 7 parasites.
  • the primers used for PCRs are detailed in Table 17 previously cited.
  • the PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the clones having integrated one of the plasmids were validated by PCR with the primers ea SEQ ID NO: 187 and eb SEQ ID NO: 188 and obtaining a fragment SEQ ID NO: 226 (1647pb).
  • Primers used for PCR are detailed in Table 16.
  • the second PCR makes it possible to validate the location of the insertion of the plasmid at the TgmicI loxN locus.
  • the clones having integrated one of the plasmids were validated by PCR with the primers ed SEQ ID NO: 190 and eb SEQ ID NO: 188 and obtaining a fragment SEQ ID NO: 228 (2294 bp).
  • Primers used for PCR are detailed in Table 17.
  • the level of expression of CAT-GFP SEQ ID NO: 120 was analyzed in the different populations of recombinant parasites (Table 19).
  • the expression of the CATGFP transgene is systematically slightly higher for clones whose transgene is inserted in a targeted manner (located at the LoxP and LoxN scars at the honey locus or mic3) than for populations whose transgene is inserted at random.
  • strain Toxo tgmic1-3KO is an optimized expression vector for transgene expression.
  • Neo ncmicl-3 KO-2G was tested as a preventative vaccine for neosporosis.
  • the objective is to determine whether or not the Neo ncmicl-3 KO-2G vaccine strain prevents spread and acute infection in a mouse model of lethal neosporosis.
  • Neo ncmicl-3 KO-2G parasites and Nc-1 strain Production of Neo ncmicl-3 KO-2G parasites and Nc-1 strain.
  • Neo ncmic1-3 KO-2G and Ne- not used for challenge parasites are produced on a confluent mat of VERO cells (ATCC CCL81) in a complete medium containing DMEM 1.5 g / L NaHCO3, 12% (v / v). SVF decomplemented, 100 IU / mL Penicillin-100 IU / mL Streptomycin.
  • the cells are maintained independently of the parasites.
  • the carpet is washed three times with 5 mL of HBSS, taken off with 1 mL of pure trypsin, re-suspended in complete medium, distributed at a rate of
  • the cell layer is infected with 1.10 6 parasites per 25 cm 2 of cell culture at confluence.
  • Vaccine parasites are harvested 4 days later. Briefly, the parasite-infected cell layer is washed with complete medium to remove extracellular parasites. The cell layer, containing parasites, is scrapped and passed through a 27G syringe. The preparation is centrifuged for 10 min at 1500 g. The supernatant is removed and the pellet is resuspended in a DMEM solution supplemented with 0.1 M sucrose, 0.1 M trehalose, 2.5% inulin, 0.1 M GSH, 1% proline and 1% ectoin. . The solution is prepared extemporaneously the day of the vaccination. The exact parasite concentration and viability are estimated by flow cytometric counting of parasites with or without propidium iodide (P4864-10ML, Sigma). The final solution prepared was diluted to contain 2.10 7 parasites per milliliter.
  • mice were immunized on day 0 by intraperitoneal (IP) route with a single dose of 1.10 7 tachyzoites of the strain Neo ncmicl-3 KO-2G.
  • IP intraperitoneal
  • Control mice were inoculated by the vehicle.
  • Two mice of each genetic background were inoculated per group, ie four mice per group.
  • mice On day 60, the immunized mice were infected intraperitoneally at the lethal dose of 2.10 7 tachyzoites of virulent strain Nc-1. Two criteria are used to evaluate the efficacy of the vaccine, the evaluation of the mortality rate and the humoral response directed against Neospora caninum at D30 post vaccination. Animals
  • the production of total IgG specific for N. caninum at the serum level was determined by ELISA.
  • the total parasite extract of strain Nc-1 was diluted in 0.05M carbonate / bicarbonate buffer pH9.6 to obtain a final concentration of 1 ⁇ g / ml / 100 of this mixture was deposited on a 96-well flat-bottomed plate (Nunc MaxiSorp) After one night at + 4 ° C., the wells were washed three times with 300 ⁇ l of PBS buffer, Tween 20 0.05% (v / v), and then saturated with 200 ⁇ l. of PBS, Tween 20 0.05%, BSA 4% (w / v) for 1h30 at 37 ° C.
  • the total serum IgG levels specific for Neospora caninum were expressed as antibody titers. Two methods were used for the titration.
  • the IgG titre corresponds to the inverse of the highest dilution of the serum of interest whose OD is at least 2.5 times higher than that obtained with the negative control, or whose OD was 0.2.
  • Neo ncmicl-3 KO-2G The efficacy of Neo ncmicl-3 KO-2G has been estimated on a lethal murine model. Clinical sign
  • mice After vaccination, the vaccinated animals showed no specific clinical signs, no alteration of the weight and no significant increase in body temperature, suggesting a good tolerance of the mice vis-à-vis the strain Neo ncmicl-3 KO-2G.
  • mice were inoculated with the wild strain Nc-1 at a lethal dose, ie at 2 ⁇ 10 7 tachyzoites per animal. All the mice that received the control solution died during the experiment, ie 100% lethality. In contrast, 100% of the vaccinated mice survived until the end of the experiment, sixty days later. In addition, none of these vaccinated mice showed significant clinical signs, suggesting a complete protective effect, both on morbidity and mortality.
  • the main aim of this study is to study the efficacy of the Toxo tgmicl-3 KO-2G vaccine strain against congenital toxoplasmosis in a mouse model.
  • Toxo tgmicl-3 KO-2G strains are produced in human fibroblasts (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) grown in Dulbecco's minimal medium (DMEM) supplemented with 12% Australian fetal calf serum (FCS aust). Tachyzoites were harvested from the supernatant. The parasites were enumerated on Malassez cell and diluted in DMEM medium to reach a concentration of 500 parasites per mL.
  • DMEM Dulbecco's minimal medium
  • FCS aust Australian fetal calf serum
  • Vaccination (100 tachyzoites in a volume of 200 DMEM) is performed on female mice on D0 subcutaneously using a 27G needle.
  • mice Before injection (D-2) and 28 days post-injection, peripheral venous blood was removed and left at room temperature for a minimum of one hour. The serum was obtained by centrifugation at 5000 g for 10 minutes. The prepared sera were stored at -20 ° C. Eight weeks after vaccination, 23 seroconverted mice (for T. gondii) per batch were challenged and challenged by oral gestation with 15 cysts of T. gondii strain 76K. The mothers are then isolated, the farrowing followed. The mice are followed over a period of about one month and then euthanized. A small number of young mice will be analyzed after sacrifice. Then the mothers will be sacrificed, their spleen returned to culture to study the cellular response.
  • mice per batch needed for the study is 16 pregnant mice to allow a statistical study.
  • the analysis of the immune response in 16 pregnant mice requires a total of 50 mice per batch, taking into account the following parameters: the pregnancy rate and the potential mortality related to the injection of the parasite (the mouse is a relatively sensitive to an injection of Toxoplasma gondii and vaccination allowing to obtain an effective seroconversion can generate mortality).
  • vaccinated lots contain 50 animals initially.
  • the mice of lots 1 and 2 are not vaccinated, 23 mice are sufficient for these batches.
  • the analysis is performed on 16 pregnant mice per batch. Supernumerary mice are sacrificed.
  • Table 20 Distribution of animals in the different lots.
  • mice After a period of 7 days of acclimation, the mice were individually identified and randomly divided into 4 groups.
  • a 96-well plate was adsorbed with protein extract of strain RH of Toxoplasma gondii (10 ⁇ g / ml) diluted in carbonate buffer pH 9.6 overnight at 4 ° C. After 2 washes in PBS IX / Tween 0.05% and washing in PBS IX, the plate was saturated with PBS 3% BSA for 1h30 at room temperature. Then, for the titration, the serial dilutions 2 of 2 in, in PBS + 3% BSA of the murine sera to be tested were deposited.
  • the plate was washed twice (PBS IX / 0.05% Tween), then the secondary antibody (anti-mouse IgG coupled to alkaline phosphatase (Sigma A3562) or anti-mouse IgM coupled to alkaline phosphatase (Sigma A9688) is added and diluted 1/30 000 in PBS ⁇ / Tween 0.05%, before a new incubation at 37 ° C for 1h30.
  • the secondary antibody anti-mouse IgG coupled to alkaline phosphatase (Sigma A3562) or anti-mouse IgM coupled to alkaline phosphatase (Sigma A9688) is added and diluted 1/30 000 in PBS ⁇ / Tween 0.05%, before a new incubation at 37 ° C for 1h30.
  • pNPP 4-nitrophenyl phosphate disodium hexahydrate
  • the spleen was crushed on a 100 ⁇ sieve placed over a tube
  • the tube was incubated for 3 min at 4 ° C, and the reaction was stopped with addition of 1X PBS / 2% excess SVF, and then the cells were centrifuged for 10 min at 400g. The resulting cell pellets were then taken up in 5 ml of stimulation medium. The cells were counted on Malassez cell in the presence of trypan blue which stains the dead cells.
  • the cells were cultured in 96-well plates at a rate of 5.10 5 cells / well.
  • the plates were cultured in an oven at 37 ° C, 5%> C0 2 for 72 hours.
  • the IFN-gamma assay was performed on the culture supernatants of the splenocytes in the presence of these different stimulants.
  • the assay was carried out by an ELISA test according to the kit protocol
  • the collection of brains from mothers and young mice is done to determine the presence or absence of cerebral cysts. Following the sacrifice of the mice, the brains are removed and crushed. The number of cysts is then counted by microscopic observation of the totality of the crushed brain. Results
  • mice in nonvaccinated lots did not show clinical signs, whereas mice in vaccinated lots showed some moderate clinical signs with a clinical score of less than 2. The peak of clinical signs was observed on D18. These clinical signs were observed until D33.
  • the IFN- ⁇ (cytokine indicating the establishment of a Th1-type response) secreted in the culture supernatants of the splenocytes following various stimuli, was dosed 72 hours after culturing.
  • the concentration of IFN- ⁇ is increased after a challenge compared to the control group.
  • Toxo tgmicl-3 KO-2G having been challenged (lot 4) or not (lot3)
  • significant concentrations of IFN- ⁇ are measured when the cells are stimulated with antigenic extracts of strain RH Toxoplasma gondii, compared to unvaccinated mice. This suggests an implementation of a cell response induced by vaccination.
  • the results are shown in Figure 13-C.
  • the mothers were sacrificed on D129.
  • the number of cysts is obtained by microscopic observation of all the brain seed (4 brains per lot). No cysts were detected for batch 1 (unvaccinated, not challenged) whereas after challenge, an average of 2250.75 cysts per brain was obtained for batch 2 (unvaccinated, challenged). In lot 3 (only vaccinated), a very small number of cysts are observed (0.75 cysts per brain). In the 4th batch (vaccinated then challenged), there is a sharp decrease in the number of cysts compared to the non-vaccinated lot (lot 2), with an average of 52 cysts per brain.
  • the mice vaccinated with the strain Toxo tgmicl-3 KO-2G form very few cerebral cysts following a challenge with the T. gondii strain 76K. The results are shown in Figure 13-D. Effectiveness of vaccination on young mice
  • Stillbirth and mortality were increased following challenge in the absence of vaccination (lot 2 versus lot 1).
  • the vaccinated and challenged group (lot 4) has a significant reduction in the number of stillbirths and mortality compared to the challenged non-vaccinated group (lot 2). Vaccination of mothers thus protects the offspring of an increase in stillbirths and mortality following a challenge.
  • the results are shown in Figures 13-G and 13-H.
  • mice were followed over a 32-day period to study the effectiveness of vaccination.
  • mice decreases significantly for the batch whose mothers were challenged but not vaccinated.
  • the other groups have a survival rate close to that obtained for the control lot (lot 1). Vaccination of mothers therefore increases the survival rate of young mice following a challenge during pregnancy.
  • the results are shown in Figure 13-1.
  • mice are observed daily for 30 days and clinical signs are noted. An overall clinical score is calculated according to the score scorecard (see below, Table 22). Mobility Score 2
  • mice 1 Isolation from mother / nest / young mice 1
  • mice from the challenged group had a higher clinical score than the mice in the control group (lot 1). This clinical score is due in particular to a slow growth of young mice in this group.
  • the clinical score is similar to the control group. Vaccination of mothers has prevented the growth retardation induced by the challenge in young mice. The results are shown in Figure 13-J.
  • the 32-day IgM assay reflects the immunity of the mice developed in response to T. gondii (vaccine strain or challenge strain) transmitted by the mother.
  • the humoral response developed by the young mice is therefore evaluated by ELISA immunoglobulin IgM assay at 32 days of age. The results are shown in Figure 13-K.
  • the IgM titer is increased for the mice of the group from the challenged mice (batch 2) compared with those from the non-challenged mice (batch 1).
  • the IgM titre is close to the detection limit, which indicates a lack of vertical transmission of the strain to the young mice.
  • the IgM titre assayed for suckling mice is signi fi cantly reduced in comparison with the titre obtained for young mice from the challenged group (lot 2). The vaccination of the mice thus made it possible to reduce the vertical transmission of the strain of challenge to the young mice.
  • the strain Toxo tgmicl-3 KO-2G thus allowed the establishment in mice of a humoral and cellular immune response directed against the parasite T. gondii.
  • the vaccination of the mice with the strain Toxo tgmicl-3 KO-2G allowed a significant decrease in the cerebral parasite load observed after a challenge with the virulent strain 76K.
  • the strain Toxo tgmicl-3 KO-2G has a good safety.
  • the Toxo tgmicl-3 KO-2G strain protected the offspring of a congenital toxoplasmosis (after a challenge with the virulent 76K strain at midgestation) with a decrease in stillbirths and mortality, a better clinical score. for young mice.
  • the objective of this experiment is to determine if the strain Toxo tgmicl-3 KO-2G expressing the antigen influenza M2eGPI antigen makes it possible to obtain a humoral and cellular immune response towards the vector Toxoplasma gondii and against the viral antigen. target.
  • Toxo tgmicl-3 KO-2G strains expressing influenza virus antigen (Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN and Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI total population-random insertion - Example 4) are produced in human fibroblasts (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) grown in Dulbecco's minimal medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (S VF), 2mM glutamine, 100 U / mL penicillin and 100 U / mL of streptomycin.
  • HFF Hs27 ATCC CRL-1634 human fibroblasts
  • S VF fetal calf serum
  • S VF fetal calf serum
  • the tachyzoites were harvested after mechanical lysis of the host cells by 3 passages in 25G syringe.
  • the parasites were enumerated on Malassez cell and diluted in DMEM medium to reach a concentration of 500 parasites per mL. Animals
  • mice After a period of 15 days of acclimation, the mice were individually identified and randomly divided into 5 groups.
  • tachyzoites were injected intraperitoneally in a volume of 200 DMEM. The animals were then monitored and sacrificed 5 weeks post-injection (day 35) and the rats were removed. Before (D-1) and 34 days post-injection, peripheral venous blood was removed and left at room temperature for a minimum of 30 minutes. The serum was obtained by centrifugation at 3000 g for 10 minutes. The prepared sera were stored at -20 ° C.
  • a 96-well plate was adsorbed with a mixture of 4 synthetic M2e peptides at 10 ⁇ g / ml (Anaspec) corresponding to the 4 M2e present in the construction of the saglM2eGP1 fusion protein or the Toxo tgmicl-3 KO protein extract.
  • 2G (10 ⁇ g / ml) diluted in carbonate buffer pH 9.6 overnight at 4 ° C.
  • PBS IX / 0.05% Tween the plate was saturated with PBS IX / Tween 0.05% - BSA 4% for 1 h 30 at 37 ° C.
  • serial dilutions 2 of 2 in, in PBS IX / Tween 0.05%> murine sera to be tested were deposited.
  • the plate was washed, then the secondary antibody (IgG anti-mouse IgG coupled to alkaline phosphatase) was added and diluted to 1/30 000 in PBS IX / Tween 0, 05%>, before a new incubation at 37 ° C for 1h30.
  • pNPP was used at a concentration of 1 mg / ml diluted in DEA-HCL buffer for visualization, and the plate was incubated for 1 h at 37 ° C.
  • the spleen was ground on a 100 ⁇ sieve placed over a 50 ml Falcon tube with the addition of 5 ml of RPMI medium. The crushed material was then centrifuged for 10 minutes at 400 g. The pellet was taken up in 300 ⁇ l of RPMI and then 1 ml of lysis buffer was added. The tube was incubated for 3 min at 4 ° C, and the reaction was stopped with addition of 1X PBS / 2% excess SVF, and then the cells were centrifuged for 10 min at 400g. The resulting cell pellets were then taken up in 5 ml of stimulation medium. The cells were counted on Malassez cell in the presence of trypan blue which stains the dead cells.
  • the cells were cultured in 96-well plates at a rate of 5.10 5 cells / well.
  • Various stimulants could be added: antigenic extracts of Toxo tgmicl-3 KO-2G (10 ⁇ g / ml), a mix of 4 synthetic M2e peptides at 10 ⁇ g / ml (Anaspec) corresponding to the 4 M2e present in the construction of the saglM2eGPI fusion protein or concanavalin A (5 ⁇ g / ml) which serves as a positive control.
  • the plates were cultured in an oven at 37 ° C., 5% CO 2 for 72 hours.
  • the IFN-gamma assay was performed on the culture supernatants of the splenocytes in the presence of different stimulants.
  • the assay was carried out by an ELISA test according to the protocol of the kit "Mouse IFN- ⁇ ELISA Ready-set-go® (Ebiosciences).
  • mice show clinical signs such as ruffled hair, swelling of the abdomen and prostration with the exception of mice that have not received parasitic strains.
  • Toxo tgmicl-3 KO-2G strains expressing M2eGPL Following the injection of Toxo tgmicl-3 KO-2G strains expressing M2eGPL, a production of antibodies specific for the M2e antigen expressed by the Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO strains is observed.
  • -2G M2eGPI loxN and Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI total population-random insertion, but no production of antibodies specific for the M2e antigen for the strain Toxo tgmicl-3 KO-2G.
  • the IFN- ⁇ (cytokine indicating the establishment of a Th1-type response) secreted in the culture supernatants of the splenocytes following various stimuli, was dosed 72 hours after culturing.
  • mice vaccinated with Toxo tgmicl-3 KO-2G or Toxo tgmicl-3 KO-2G M2eGPI targeted insertion in loxP, loxN or randomly integrated
  • significant concentrations of IFN- ⁇ are measured when the cells are stimulated with antigenic extracts of Toxo tgmicl-3 KO-2G, compared to unvaccinated mice.
  • mice no production of IFN- ⁇ is detectable for all mice, whether they are naive, vaccinated with Toxo tgmicl-3 KO-2G or with Toxo tgmicl-3 KO-2G M2eGPI (targeted insertion in loxP, loxN or integrated randomly).

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Abstract

La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic1 et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène mic1 délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.

Description

NOUVELLES SOUCHES ATTENUEES D'APICOMPLEXES ET LEUR UTILISATION COMME VECTEURS D'ANTIGENE POUR LA PREVENTION DE
MALADIES INFECTIEUSES
La présente invention concerne de nouvelles souches atténuées d'apicomplexes et leur utilisation comme vecteur d'antigène pour la prévention de maladies infectieuses.
Les Apicomplexes sont des parasites majoritairement intracellulaires obligatoires qui possèdent un cycle de vie pouvant faire intervenir plusieurs hôtes. Le phylum de ces parasites se subdivise en plusieurs familles.
Toxoplasma gondii (T. gondii) appartient à la famille des Sarcocystidae. Le chat, hôte définitif, excrète le parasite dans l'environnement sous forme d'oocystes. Les hôtes intermédiaires (i.e. l'ensemble des homéothermes) et définitif peuvent s'infecter en ingérant des oocystes présents sur les aliments. Le parasite se transforme alors en tachyzoïtes qui se disséminent dans l'organisme et qui, sous la pression du système immunitaire, s'enkystent avec un tropisme préférentiel pour le système nerveux central, la rétine ou les muscles. L'ingestion de tissus enkystés est la deuxième cause de contamination des hôtes définitifs et intermédiaires.
Récemment, une souche vivante atténuée de Toxoplasma gondii, le parasite responsable de la toxoplasmose a été mise au point par invalidation de deux gènes codant pour les protéines TgMICl et TgMIC3 (Cérède et al, 2005, J. Exp. Med, 201(3) : 453-63). Cette souche, dénommée Toxo tgmicl-3 KO génère une réponse immunitaire forte et spécifique contre Toxoplasma gondii et permet de prévenir les effets d'une infection ultérieure chez la souris (Ismael et al., 2006, J. Infect. Dis., 194(8) : 1176-83) et chez la brebis (Mévelec et al., 2010, Vet. Res., 41(4) :49).
Neospora caninum (N. caninum) est un parasite intracellulaire, responsable de la néosporose. Il appartient également à la famille des Sarcocystidae. Le cycle de vie de Neospora caninum est très proche de celui de T. gondii avec deux phases distinctes : une phase sexuée chez l'hôte final {i.e. les canidés et le chien en particulier) qui conduit à la production d'oocystes éliminés dans les fèces et une phase asexuée chez un hôte intermédiaire {i.e. les ovins, les caprins, les bovins, les équidés, etc ..) qui conduit à la production de tachyzoïtes puis de kystes contenant les bradyzoïtes. Plus récemment, il a été obtenu une souche vivante atténuée de Neospora caninum, la souche Neo ncmicl-3 KO, qui a été invalidée pour les gènes ncmicl et ncmic3 par recombinaison homologue. Il a été montré que cette souche mutante possède des propriétés infectieuses et immunogènes conférant aux mammifères une protection vaccinale vis-à-vis des effets délétères de la néosporose.
Les parasites de la famille Sarcocystidae tels que Toxoplasma gondii et Neospora caninum peuvent être utilisés pour exprimer des protéines hétéro logues provenant d'autres parasites tels que Plasmodium spp, Cryptosporidium parvum ou Leishmania spp.
Ainsi, la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii a été utilisée comme vecteur de l'antigène CSP (Protéine Circum Sporozoïte) de Plasmodium knowlesi (Di Cristina et al., 1999, Infect Immun., 67(4) : 1677-82,). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, la souche recombinante a été inoculée à des singes Rhésus et induit chez l'animal une réponse immunitaire humorale spécifique de la protéine CSP. En la souche thermosensible ts-4 HXGPR " de Toxoplasma gondii a été utilisé comme vecteur de l'antigène CSP de Plasmodium yoelii (Charest et al., 2000, J. Immunol, 165(4) : 2084-92). Après intégration aléatoire de la séquence d'intérêt, les parasites recombinants ont été inoculés à la souris induisant une réponse immunitaire humorale spécifique de l'antigène CSP mais insuffisante pour induire une protection contre une infection avec Plasmodium yoelii.
Une souche de Toxoplasma gondii a également été utilisée pour exprimer les gènes gp40, gpl5 et le précurseur gp40/gpl5 de Cryptosporidium parvum, le parasite responsable de la cryptosporidiose (O'Connor et al, Infect. Immun., 2003 71(10) :6027-35 ; O'Connor et al, 2007, Mol Biochem Parasitol, 152(2) : 148-58). Les gènes gp40/gpl5, gp40 et gpl5 ont été clonés, placés sous le contrôle d'un promoteur de T. gondii et intégrés de manière aléatoire dans le génome du parasite. Les auteurs ont montré que les parasites recombinants exprimaient les protéines d'intérêt et que la glycosylation de la protéine GP40 exprimée par T. gondii était similaire à la glycosylation de la protéine native. Cependant, les auteurs ont démontré que le clivage de la pré-protéine GP40/GP15 était inefficace dans les tachyzoïtes bien que des enzymes permettant le clivage soient présentes chez le parasite T. gondii. Une autre équipe s'est également intéressée à l'utilisation de Toxoplasma gondii comme vecteur d'antigène de Cryptosporidium parvum et notamment de la protéine de surface immunodominante P23 (Shirafuji et al, 2005, J. Parasitol, 91(2) :476-9). Le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de P23 recombinantes sont similaires à ceux de protéine native et des souris immunisées avec des tachyzoïtes lysés exprimant la protéine P23 produisent des anticorps neutralisant dirigés contre C. parvum.
Enfin, T. gondii a été utilisé comme vecteur d'expression de l'antigène Kmpl l de Leishmania. La souche recombinante obtenue permet une protection significative des animaux lors d'un challenge avec L. major (Ramirez et al ., 2001, Vaccine, 20:455-61).
Neospora caninum a également été utilisé comme vecteur d'antigènes hétérologues et une souche recombinante de N. caninum exprimant de manière stable l'antigène S AGI de T. gondii a été construite (Zhang et al, 2010, Vaccine, 60(1) : 105-7). Le niveau d'expression, le poids moléculaire et les propriétés antigéniques de la protéine S AGI exprimée dans N. caninum sont similaires à ceux de la protéine S AGI native et des souris immunisées produisent une réponse immunitaire de type Thl spécifique de S AGI de T. gondii et sont protégées contre un challenge létal avec T. gondii.
Le système Cre/loxP a été utilisé dans les stratégies d'activation ou d'inactivation des gènes de cellules de mammifères (Fukushige et Sauer, 1992, PNAS, 89(17) : 7905-9) ou de souris transgéniques (Tsien et al, 1996, Cell, 87(7) : 1317-26.).
La Cre Recombinase est une enzyme issue du bactériophage PI (Sternberg and Hamilton, 1981, J. Mol Biol, 150(4) : 487-507) de la famille des intégrases qui reconnaissent des sites très spécifiques et permettent une recombinaison entre deux sites identiques. Le site de restriction de la Cre Recombinase est le site loxP, une séquence nucléotidique de 34 paires de bases (SEQ ID NO : 12) qui comprend deux petites séquences de 13 paires de bases répétées et inversées et une région spacer (en gras) de 8 paires de bases. Plusieurs mutants du site loxP sont décrits et 3 sites ont été identifiés comme étant incompatibles entre eux (Livet et al, 2007, Nature, 450(7166) : 56-62). Il s'agit des sites LoxP (SEQ ID NO : 12), LoxN (SEQ ID NO :5) et Lox 2272 (SEQ ID NO :68).
Les propriétés de la Cre recombinase sont multiples et peuvent être utilisés pour (Figure 1) :
• Supprimer une séquence d'ADN présente entre deux sites Lox identiques et avec la même orientation,
• Inverser une séquence d'ADN présente entre deux sites Lox identiques et avec l'orientation inverse,
• Intégrer au niveau d'un site LoxP ou LoxN une séquence d'ADN contenant le site LoxP ou LoxN.
Chez Toxoplasma gondii, le système Cre/Lox a été utilisé la première fois en 1999 (Brecht et al, 1999, Gene, 234(2) :239-47). Suite à l'insertion aléatoire d'un gène rapporteur encadré de sites LoxP orientés dans un sens identique, l'action de la Cre Recombinase a permis la délétion du gène rapporteur et la formation d'une cicatrice LoxP. La Cre Recombinase a ensuite été utilisée pour intégrer un nouveau transgène hétérologue au niveau de cette cicatrice LoxP. Plus récemment ; le système Cre/LoxP a été utilisé pour la réalisation d'une souche de Toxoplasma gondii délétée pour le gène mornl (Heaslip et al., 2010, PloS Pathog, 6(2) : el000754). Enfin dernièrement, des souches KO (knockout) de T. gondii ont été créées en utilisant une forme dimérisable de la Cre Recombinase inductible seulement après ajout d'un ligand : la rapamycine (Andenmatten et al., 2013, Nat. Methods, 10(2) : 125-7 ; Rugarabamu et al., 2015, Mol. Microbiol, 97(2) :244-62).
La présente invention concerne de nouvelles souches atténuées de Sarcocystidae {Toxoplasma gondii et Neospora caninum).
La présente invention concerne également l'utilisation de nouvelles souches atténuées de Sarcocystidae (Toxoplasma gondii et Neospora caninum), comme vecteur d'antigène pour la prévention de maladies infectieuses.
La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle l'un au moins des gènes miel ou mic3 est délété, contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus dudit au moins un gène délété, et dans le cas où les deux gènes miel et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété est potentiellement différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Par « enzyme permettant une recombinaison spécifique », on entend enzyme catalysant la recombinaison d'ADN dans un sens défini, entre des sites spécifiques déterminés par des séquences propres à chaque enzyme. Elles permettent notamment l'excision, l'insertion, l'inversion ou la translocation d'une séquence nucléotidique flanquée de sites spécifiques. Comme exemple d'enzyme permettant une recombinaison spécifique, on peut citer par exemple la Cre recombinase, la FLP recombinase, la Tre recombinase, les protéines RecA et Hin recombinase (bactérie). Les gènes miel et mic3 permettent de coder les protéines MIC1 et MIC3. Ce sont sont des protéines des micronèmes, organelles sécrétoires des Apicomplexes qui jouent un rôle central dans la reconnaissance et l'adhésion aux cellules hôtes.
Dans un mode de réalisation particulier, l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la cre-recombinase. Ainsi, dans ce cas la souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle l'un au moins des gènes miel ou mic3 est délété contient un site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase, au locus dudit au moins un gène délété. et dans le cas où les deux gènes miel et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase, au locus du gène miel délété est différent de celui au locus du gène mic3 délété.
On entend par « délétion du gène », la délétion de la séquence codante entière (introns et exons), la délétion de la région promotrice et la délétion des régions transcrites non traduites 5' et 3', dites 5' et 3'UTR, le terme « gène » désignant la région promotrice (également appelée promoteur), la séquence codante et les régions 5' et 3' UTR.
La Cre recombinase est une topoisomerase dérivée du bacteriophage PI, cette enzyme est fonctionnelle chez les parasites. L'utilisation possible de plusieurs sites lox n'interagissant pas entre eux permet d'envisager plusieurs délétions.
Comme exemples de sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (sites lox), on peut citer de manière non exhaustive, les sites ΙοχΡ, ΙοχΝ, 1οχ2272, 1οχ71, 1οχ66, lox511, lox5171 et loxM2.
La présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase et dans laquelle dans le cas où les deux gènes miel et mic3 sont délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété est différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Toxoplasma spp..
Ce genre comprend entre l'espèce Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche de l'espèce Toxoplasma gondii.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii.
Selon un autre mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Neospora spp..
Ce genre comprend entre autres les espèces suivantes : Neospora caninum, Neospora hughesi.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche de l'espèce Neospora caninum.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite souche mutante de Sarcocystidae est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété. Dans le cas où l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, ladite souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés. Par « ne contenant pas d'ADN hétérologue autres que les ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique», on entend que la souche peut contenir comme seul(s) ADN hétérologue(s), une ou plusieurs séquences correspondant à un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique.
Dans le cas où l'enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, ladite souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés.
Par « contenant un ADN hétérologue, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison de la cre-recombinase », on entend que ladite souche contient un ADN hétérologue qui ne correspond pas à une séquence d'un site de recombinaison spécifique de la cre-recombinase et qui ne comprend pas de séquence correspondant à un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété. ladite souche ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés,
et dans laquelle chacun des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif des gènes miel et mic3 délétés sont choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, le site de recombinaison de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante selon l'invention, dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase, et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés et contenant deux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, ladite enzyme étant la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, lesdits sites de recombinaison spécifique étant des sites de recombinaison spécifique de la cre-recombinase choisis parmi : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, le site de recombinaison de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre- recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété, et
- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété, ce second site étant apporté de manière additionnelle aux sites déjà présents dans la souche, en raison de la recombinaison spécifique supplémentaire lors de l'ajout de l'ADN hétérologue. lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, et
- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ladite souche comprenant les moyens nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue. Ce mode de réalisation cible la production d'un ARN hétérologue à partir dudit ADN hétérologue dans une souche mutante telle que décrite ci-dessus.
Par « moyens nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue », on entend un promoteur, un site d'initiation de la transcription, TATA box, un terminateur de transcription.
L'ARN ainsi transcrit peut être un ARN messager, un ARN interfèrent, un ARN long non codant, un ARN tige-boucle (en anglais « Hairpin RNA »),
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue étant flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété ou celui au locus du gène mic3 délété, et
- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique
et les moyens nécessaires à la transcription du susdit ADN hétérologue.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche selon l'invention, contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés,
ledit ADN hétérologue étant flanqué :
• d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,
• d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,
et les moyens nécessaires à sa transcription, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre- recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété étant différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, autre que ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété, et
- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, et
- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ledit ADN hétérologue codant pour au moins une protéine, ladite souche mutante comporte également les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue.
Ce mode de réalisation cible l'expression protéique dudit ADN hétérologue dans une mutante telle que décrite précédemment. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche selon l'invention contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, ledit ADN hétérologue codant pour une protéine et étant flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus du gène miel délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et
d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,
et les moyens nécessaires à l'expression protéique du susdit ADN hétérologue, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre- recombinase et, les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, ledit ADN hétérologue codant pour au moins une protéine et étant flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase au locus du gène miel délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et
- d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique
et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (appelé site A) étant différent de celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différents de ceux correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A),
et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété,
et les moyens nécessaires à l'expression du susdit ADN hétérologue. lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que
ledit site A et ledit site B sont différents, et
ledit site C est identique audit site A ou B, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, dans laquelle ladite enzyme est la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, tels que
ledit site A et ledit site B sont différents, et
ledit site C est identique audit site A ou audit site B.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) correspond à un site loxN SEQ ID NO : 5 et celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B) correspond à un site loxP SEQ ID NO : 12,
et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic 1 délété, et un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) correspond à un site loxP SEQ ID NO : 12 et celui au locus du gène mic3 délété (appelé site B) correspond à un site loxN SEQ ID NO : 5, et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel et mic3 délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxP SEQ ID NO : 12, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C) correspondant à un site loxN SEQ ID NO : 5, identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, dans laquelle ladite enzyme est la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68,
tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, et
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, et
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B ; ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété.
Le gène ropl6 permet de coder la protéine Ropl6 qui est une protéine de rophtries. Cette protéine est une sérine thréonine kinase.
Ces protéines ROPs, sont sécrétées pour permettre l'invagination de la membrane plasmique de la cellule hôte et la formation de la vacuole parasitophore. Les ROPs relarguées dans le cytosol de la cellule hôte peuvent migrer à la surface de la vacuole parasitophore (ROP5, ROP18, ROP2) ou dans le noyau (ROP16, protéine phosphatase 2C ou PP2C-hn), permettant une modulation de l'expression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène roplôl est délété, et qui contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété. et dans laquelle ladite souche mutante contient également au locus du gène roplôl , en aval dudit site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété, un gène codant pour la protéine GRA15II , ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine,
Les protéines GRAs sont associées au réseau nanotubulaire membraneux et à la membrane de la vacuole parasitophore (Mercier et al, Int J Parasitol. 2005 Jul;35(8):829-49. Review. Erratum in: Int J Parasitol. 2005 Dec;35(14): 1611-2). Elles participent à l'échange de nutriments entre le parasite et les organelles (mitochondries et du réticulum endoplasmique) de la cellule hôte (Sibley, Immunol Rev. 2011 Mar;240(l):72-91).
Récemment, certaines protéines des granules denses dont GRA15, ont été identifiées comme protéines jouant un rôle dans la modulation/contrôle de la réponse immunitaire de la cellule hôte. GRA15 présente un polymorphisme selon la typologie du parasite (I, II, III...).
Dans ce mode de réalisation, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène rop 161 délété est donc flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop 161 délété.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., et dans laquelle le gène rop 161 est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop 161 délété,
ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, et ladite souche comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène rop 161 délété,
ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène rop 161 délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, au locus dudit gène rop 161 délété.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,
et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété
ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,
et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété,
et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété
lesdits sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus des gènes miel, mic3 et roplôl délété sont choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68,
tels que ces trois sites sont différents l'un de l'autre.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété, et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété et du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 délété,
et dans laquelle ladite souche mutante contient également au locus du gène roplôl , en aval dudit site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété, un gène codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété et au locus du gène mic3 délété.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,
et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété (appelé site B), et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (appelé site D) est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (appelé site A) et du site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase situé au locus du gène mic3 délété (appelé site B). tels que
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que
ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3 sont délétés, et contenant deux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, chacun des deux sites étant respectivement au locus de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
dans laquelle le gène roplôl est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété,
ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp.,
et dans laquelle le gène roplôl est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété
et ladite souche mutante comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène roplôl délété,
ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène roplôl délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, notamment dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est, la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N SEQ ID NO :5, lox P SEQ ID NO : 12 et lox 2272 SEQ ID NO :68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété et au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement : le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété
en particulier tels que
ledit site A est le site lox N,
ledit site B est le site lox P,
ledit site D est le site lox 2272.
Selon un mode de réalisation particulier la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les deux gènes mic 1 et mic 3, et le gène roplôl sont délétés,
et qui contient au locus de chacun de ces gènes délétés un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, tel que
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (appelé site A) est différent du site de recombinaison spécifique au locus du gène mic3 délété (appelé site B),
et le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (appelé site D) est différent du site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (appelé site A) et du site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase situé au locus du gène mic3 délété (appelé site B),
ladite souche contenant éventuellement un codant pour la protéine GRA15II ainsi que les moyens d'expression nécessaires à l'expression de ladite protéine,
et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène roplôl délété, différent des ADN hétéro logues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel, mic3 et roplôl délétés, de telle façon que : lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué : - d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété (site A), lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 (site B) délété, lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène roplôl délété (site D), et
- d'un second site de recombinaison spécifique (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique situé au locus du gène roplôl (site D) délété, étant entendu que ladite souche comporte les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine.
Dans ce mode de réalisation particulier, ladite souche mutante contient alors quatre sites de recombinaison spécifique de la cre-recombinase défini de la manière suivante : le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété,
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68;
ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 ; ou tels que lorsque l'ADN hétéro logue est inséré au locus du gène roplôl délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou ledit site A correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site B correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
- ledit site C correspond à un lox 2272, SEQ ID NO : 68
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, dans laquelle le gène roplôl est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété, ladite souche contenant quatre sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B), ou au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D)
le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO : 5,
ledit site C est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 , ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site D, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 ; ou tels que - ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
ledit site C est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68 , ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site D, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue telle que définies ci-dessus, dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour une protéine d'intérêt.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue cité dans l'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrit, est choisi parmi :
la séquence SEQ ID NO : 212 qui code pour la protéine SEQ ID NO :208, la séquence SEQ ID NO : 213 qui code pour la protéine SEQ ID NO :209, la séquence SEQ ID NO : 214 qui code pour la protéine SEQ ID NO :210, la séquence SEQ ID NO : 215 qui code pour la protéine SEQ ID NO :211, la séquence SEQ ID NO : 173 qui code pour la protéine SEQ ID NO : 167, ou la séquence SEQ ID NO : 168 qui code pour la protéine SEQ ID NO : 165.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue cité dans l'un quelconque des modes de réalisation précédemment décrit, est choisi parmi :
une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :208, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :209, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :210, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO :211, une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO : 167, ou une séquence codant pour la protéine SEQ ID NO : 165, selon la dégénérescence du code génétique.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue telle que définies ci-dessus, dans laquelle ladite protéine d'intérêt est un antigène hétérologue immunogène.
Par « antigène hétérologue immunogène » on entend tout peptide ou protéine provenant d'un organisme différent de ladite souche mutante et capable de provoquer une réaction immunitaire.
Un antigène peut correspondre à un épitope ou à plusieurs épitopes. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins deux protéines d'intérêt et comprend les moyens nécessaires à leurs expressions, chacune desdites au moins deux protéines d'intérêt étant traduites de manière indépendante, c'est-à-dire qu'elles sont chacune contrôlées par des éléments nécessaires à leur traduction indépendants.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins deux protéines d'intérêt et comprend les moyens nécessaires à leurs expressions, chacune desdites au moins deux protéines d'intérêt étant traduites de manière indépendante, et dans laquelle lesdites au moins deux protéines d'intérêt sont des antigènes hétérologues immunogènes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine d'intérêt et une protéine de résistance et les moyens nécessaires l'expression desdites protéines, chacune desdites protéines d'intérêt et de résistance étant traduites de manière indépendantes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine d'intérêt et une protéine de résistance et les moyens nécessaires l'expression desdites protéines, chacune desdites protéines d'intérêt et de résistance étant traduites de manière indépendantes, et dans laquelle ladite au moins une protéine d'intérêt est un antigène hétérologue immunogène.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de virus. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène du virus Inf uenza.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, comprenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène du virus Influenza choisi parmi : la protéine de SEQ ID NO : 208(fragment N-ter d'un virus influenza humain I), ou la protéine de SEQ ID NO : 209 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza du porc), ou la protéine de SEQ ID NO : 201 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza aviairel) ou la protéine de SEQ ID NO : 211 (fragment N-ter de la protéine M2 d'un virus influenza aviairell) ou la protéine de SEQ ID NO : 167, correspondant à la fusion, dans l'ordre, de deux protéines SEQ ID NO : 208, une protéine SEQ ID NO : 209, une protéine SEQ ID NO : 210 et une protéine SEQ ID NO : 211, espacée chacune par un linker pour permettre une bonne conformation de la protéine de fusion SEQ ID NO : 167, ou la protéine SEQ ID NO : 165, correspondant à la fusion, dans l'ordre, de la protéine SAG1 de T. gondii SEQ ID NO : 166, de deux protéines SEQ ID NO : 208, une protéine SEQ ID NO : 209, une protéine SEQ ID NO : 210 et une protéine SEQ ID NO : 211.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les deux protéines SEQ ID NO : 208, la protéine SEQ ID NO : 209, la protéine SEQ ID NO : 210 et la protéine SEQ ID NO : 211, peuvent être fusionnées dans l'un des ordres suivants, en veillant toujours à ce qu'elles soient espacées par un linker :
['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210\ 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209']
['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208']
['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209']
['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211']
['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID ΝΟ:210', 'SEQ ID ΝΟ:208', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO :208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO :210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO 211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO :208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211'] ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 210', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO 209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO 209', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:210'] ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:209' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211' ['SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210' ['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208'] ['SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:210']
['SEQ ID NO:208', 'SEQ ID N0:211', 'SEQ ID NO:210', 'SEQ ID NO:208', 'SEQ ID NO:209'],
la protéine issue de la fusion de ces protéines pouvant également être exprimée en fusion avec la protéine SAG1 de T. gondii SEQ ID NO : 166.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de bactérie.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment, dans laquelle ledit antigène hétérologue immunogène est un antigène hétérologue immunogène de parasite.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit ADN hétérologue code pour un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie, et est en particulier constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173, codant pour l'antigène du virus Influenza SEQ ID NO : 167.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii et dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165,
ledit ADN hétérologue étant au locus du gène miel délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox N de SEQ ID NO : 5.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12. ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165,
ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic3 délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox P de SEQ ID NO : 12. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae, ladite souche mutante étant une souche de Toxoplasma gondii, dans laquelle les gènes mic 1, le gène mic 3, et le gène roplôl sont délétés, et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5, et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12, et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété est le site lox 2272 de SEQ ID NO :68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante selon l'invention, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii choisi parmi
- une souche dans laquelle
o le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N SEQ ID NO : 5 et
o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12.
- une souche dans laquelle le gène mic 1, le gène mic 3 et le gène roplôl sont délétés, et comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène roplôl délété,
ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène roplôl délété, étant flanqué en amont par un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase,
dans laquelle
o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N SEQ ID NO : 5, et
o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12, et o ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase qui flanque en amont ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène roplôl délété, est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés, contenant trois sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété étant différent des sites de recombinaison spécifique situés aux loci des gènes miel et mic3 délétés et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène roplôl délété, ledit ADN hétérologue étant différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel, mic3 et roplôl délétés, de telle façon que :
• lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et
d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (site A),
- lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et
d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 (site B) délété, o lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène roplôl délété (site D), et
- d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène roplôl (site D) délété, ladite souche comportant les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine, ladite souche mutante contenant alors quatre sites de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase définis de la manière suivante :
le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,_ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété,
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque Γ ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68; ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum et dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12.
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165, ledit ADN hétérologue étant au locus du gène miel délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox P de SEQ ID NO : 12.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante de Sarcocystidae telle que définie précédemment dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum, dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P de SEQ ID NO : 12.
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et ladite souche comportant un ADN hétérologue SEQ ID NO : 168 permettant l'expression d'une protéine SEQ ID NO : 165,
ledit ADN hétérologue étant au locus du gène mic3 délété, et étant flanqué en amont par un premier site de recombinaison correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre- recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N de SEQ ID NO : 5 et en aval par un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase lox N de SEQ ID NO : 5.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche mutante telle que définies précédemment, ne contenant pas d'ADN hétérologue différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, pour l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue, à l'exception d'une utilisation à des fins thérapeutiques.
La présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou comme immunostimulant. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère ou des oiseaux.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un mammifère, ledit mammifère étant en particulier choisi parmi l'Homme, les ovidés, les caprins, les porcins, les bovins, les équidés, les camélidés, les canidés ou les félidés.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention de pathologies infectieuses d'origine virale, parasitaire ou bactérienne chez un oiseau, ledit oiseau étant en particulier choisi parmi les poules, dindes, pintades, canards, oies, cailles, pigeons, faisans, perdrix, les autruches, les nandous, les émeus et les kiwis élevés ou détenus en captivité en vue de leur reproduction, de la production de viande ou d'œufs de consommation ou de la fourniture de gibier de repeuplement.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil digestif, provocant des diarrhées, affectant la digestibilité alimentaire ou l'absorption intestinale. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant le système nerveux central ou périphérique et toutes les conséquences sur les autres systèmes qui y seraient associées.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil locomoteur, notamment affectant le système musculo- squelettique ou articulaire en particulier les affections d'origine infectieuse provoquant des myosites, des arthrites ou affectant le vol.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil respiratoire et notamment les fièvres catarrhales, les abcès obstructifs, les perforations et emphysème d'origine infectieux, les trachéites, les bronchites, les pneumonies, les pleurésies ou dans le cas particulier des oiseaux, d'aerosacculites.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse affectant l'appareil reproducteur, la fécondité et la fertilité, notamment, une pathologie infectieuse affectant le développement normal de l'appareil reproducteur du mâle ou de la femelle, la physiologie du cycle reproducteur chez les femelles, affectant le bon déroulement de la gestation chez les mammifères incluant le développement fœtal ou affectant la qualité des œufs, en particulier, les pathologies infectieuses induisant des métrites, des salpingites, les mammites ou le syndrome de chute de ponte.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie d'origine infectieuse affectant l'appareil cardio-circulatoire, la moelle osseuse ou le sang, en particulier dans la prévention des affections d'origine infectieuse provocant une altération de la genèse des éléments figurés du sang et les septicémies incluant les conséquences associées sur les autres organes.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention chez l'animal du portage de virus, de bactéries ou de parasites par un animal ou par un sous-produit dérivé et ayant un caractère potentiellement zoonotique, en particulier, pour une utilisation dans la prévention du portage chez l'animal de Salmonella spp., d'Escherichia spp. zoonotique, de Clostridies, de mycobactéries dont la tuberculose.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse d'origine virale causée par un virus appartenant aux groupes suivant :
• Groupe I, II de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ADN susceptible d'infecter un mammifère ou un oiseau, en particulier un virus naturel appartenant à la famille des Herpesviridae, et plus particulièrement le virus Epstein-Barr responsable de la mononucléose humaine, l'herpès virus bovin de type I responsable de la rhinotrachéite infectieuse bovine ou le virus de la maladie Marek chez la poule domestique.
• Groupe III, IV et V de la classification de Baltimore comprenant les virus dont le génome est constitué d'ARN simple brin ou double brin et qui sont susceptibles d'affecter un mammifère ou un oiseau, en particulier des virus appartenant à la famille des Orthomyxoviridae et plus particulièrement les virus Influenza humains, aviaires et porcins.
• Groupe VI de la classification de Baltimore comprenant les virus à ARN requérant une rétrotranscription en ADN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un mammifère ou un oiseau, en particulier les virus de la famille des Retroviridae, tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus de l'immunodéficience féline (FIV), le virus de l'arthrite et encéphalite caprine ou le virus de la leucose féline FELV.
• Groupe VII de la classification de Baltimore comprenant les virus à ADN requérant une rétrotranscription en ARN pour la multiplication virale et susceptibles d'infecter un mammifère ou un oiseau en particulier les virus de la famille des Hepadnaviridae, et plus particulièrement le virus de l'hépatite B humaine ou le virus de l'hépatite du canard de Pékin (DHBV).
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue SEQ ID NO : 165, pour son utilisation dans la prévention de la grippe causée par le virus Influenza.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie infectieuse d'origine bactérienne (ou causée par une toxine provenant d'une bactérie), ladite bactérie pouvant appartenir aux groupes suivant :
• Des Coques GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau. En particulier des bactéries appartenant au genre Staphylococcus, Streptococcus ou Enteroccoccus ;
• Des Coques GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Neisseria ;
• Des bacilles GRAM positif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Listeria, Erysipelothryx, Corynebacterium ou Bacillus ;
• Des bacilles GRAM négatif qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriacae. Pseudomonaceae, Vibrionaceae ou appartenant aux genres Escherichia, Brucella, Haemophilus, Pasteurella, Bordetella, Legionella, Ornithobacterium ou Salmonella ;
• Des bactéries de forme spiralées GRAM positives ou négatives qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Treponema, Leptospira ou Borrelia ;
• Des bactéries de type mycoplasme qui sont susceptibles d'affecter directement ou par l'un de ces sous-produits, un mammifère ou un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Mycoplasma et Ureaplasma ;
• Des bactéries non sus-mentionnées ayant la capacité d'envahir une cellule d'un mammifère ou d'un oiseau, en particulier des bactéries appartenant au genre Chlamydia, Rickettsia ou Micobacterium.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation dans la prévention d'une pathologie ayant pour origine une infection parasitaire, le parasite pouvant appartenir aux groupes suivant :
• Protozoaires susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des protozoaires appartenant à l'embranchement des sporozoaires, Rhizoflagellés, des ciliés ou appartenant aux genres Encephalitozoon, Enterocytozoon ou blastocystis ;
• Némathelminthes susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des Némathelminthes appartenant au genre Trichuris, Ascaris, Anisakis, Necator, Strongyloïdes, Toxocara, Ancylostoma, Trichinella, Loa, Onchocerca, Wichereria, ou Enterobius ;
• Plathelminthes susceptibles d'affecter directement un mammifère ou un oiseau, en particulier des Plathelminthes appartenant au genre Fasciola, Paragonimus, Opisthorchis, Sasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Taenia, Diphyllobothrium, Echinococcus, Multiceps, Hymenolepsis et Shistosoma ;
• Arthropodes susceptibles d'être responsable d'une affection ou de la vectorisation d'un agent infectieux vis-à-vis d'un mammifère ou d'un oiseau, en particulier des arthropodes appartenant à l'ordre des Anoploures des hétéroptères, des Shiphonaptères, des Diptères, des Brachycères ou des Acariens. Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une souche mutante contenant un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène telle que définie précédemment, pour son utilisation comme immunostimulant.
On entend par « immunostimulant », que ladite souche mutante, contenant éventuellement un ADN hétérologue codant pour un antigène hétérologue immunogène, permet de stimuler les défenses immunitaires (comme un vaccin, par exemple).
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une souche mutante telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant au moins un produit choisi parmi : un adjuvant, un stabilisant ou un conservateur, ou un mélange de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une composition pharmaceutique, formulée sous forme de dose unitaire variant de 102 à 109 tachyzoïtes d'une souche mutante telle que définie précédemment.
La présente invention concerne également une composition vaccinale comprenant une souche mutante telle que définie précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également une méthode de prévention d'une pathologie infectieuse d'origine virale, parasitaire ou bactérienne comprenant une étape d'administration à un mammifère ou à un oiseau d'une souche mutante. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel et mic3 sont délétés, à partir d'une souche sauvage, comprenant :
une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété,
une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété
les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A, et les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés et dans laquelle un gène codant pour la protéine GRA15II est intégré au locus du gène roplôl délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant :
- Une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques , suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété,
Une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi d'une étape d'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3
- une étape C comprenant ou constituée de la délétion du gène roplôl par recombinaison homologue et insertion d'une cassette comprenant une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique , et comprenant en aval de cette cassette de sélection une séquence codant pour le gène gral5II, suivi d'une étape d'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle ladite séquence codant pour le gène gral5II est alors intégrée au locus du gène roplôl délété en aval d'un seul site de recombinaison spécifique les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène roplôl étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant les cassettes de sélection insérées aux locus des gènes miel et mic3.
les étapes A, B et C pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B suivi de C, ou A suivi de C suivi de B, ou B suivi de A suivi de C, ou B suivi de C suivi de A, ou C suivi de A suivi de B, ou C suivi de B suivi de A.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel et mic3 sont délétés et dans laquelle un ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant :
- une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété,
une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3 les étapes A et B pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B ou B suivi de A,
puis une étape D comprenant ou constituée de l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue flanqué par un site de recombinaison spécifique, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété,
ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic3 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété
une fois intégré, ledit ADN hétérologue sera donc encadré par deux sites de recombinaison spécifique.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés et dans laquelle un ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et un gène codant pour la protéine GRA15II est intégré au locus du gène roplôl délété, à partir d'une souche sauvage, comprenant :
- Une étape A comprenant ou constituée de la délétion du gène mic3 par recombinaison homologue et insertion d'une première cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène mic3 délété, Une étape B comprenant ou constituée de la délétion du gène miel par recombinaison homologue et insertion d'une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique identiques, suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase,
suite à laquelle un seul des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette reste intégré au locus dudit gène miel délété les deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3
- Une étape C comprenant ou constituée de la délétion du gène roplôl par recombinaison homologue et insertion d'une cassette comprenant une cassette de sélection encadrée par deux sites de recombinaison spécifique, ces deux sites de recombinaison spécifique étant différents des deux sites de recombinaison spécifique encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène miel et de ceux encadrant la cassette de sélection insérée au locus du gène mic3, et comprenant en aval de cette cassette de sélection une séquence codant pour le gène gral5II,
suivi de l'excision de ladite cassette de sélection par la cre-recombinase, suite à laquelle ladite séquence codant pour le gène gral5II est alors intégrée au locus du gène roplôl délété en aval d'un seul site de recombinaison spécifique les étapes A, B et C pouvant être réalisée dans un ordre A suivi de B suivi de C, ou A suivi de C suivi de B, ou B suivi de A suivi de C, ou B suivi de C suivi de A, ou C suivi de A suivi de B, ou C suivi de B suivi de A, puis
une étape D comprenant ou constituée de l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue flanqué par un site de recombinaison spécifique, ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène miel délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété,
ledit ADN hétérologue est intégré au locus du gène mic3 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété, ledit ADN hétéro logue est intégré au locus du gène ropl6 délété lorsque le site de recombinaison spécifique qui le flanque correspond au site de recombinaison spécifique situé au locus du gène ropl6 délété,
une fois intégré, ledit ADN hétérologue sera donc encadré par deux sites de recombinaison spécifique.
DESCRIPTIONS DES FIGURES
Figure 1 : cette figure est une représentation schématique de recombinaison par le système Cre/loxP appliqué au gène X encadré par les sites loxP identiques
Figure 2- A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMIC3-KO- CAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10063 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmic3.
Figure 2-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pNcMICl-KO- CAT-GFP loxP. Ce plasmide de 10069 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène ncmicl.
Figure 2-C : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTSAGl- Cre Recombinase. Ce plasmide de 4 694 paires de bases comprend le gène codant pour la protéine CRE-Recombinase placé sous le contrôle du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii est insérée pour stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase.
Figure 3-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Neo ncmicl-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Neo ncmicl-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase.
Figure 3-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum, la souche Neo ncmic3 KO, la souche Neo ncmic3 KO 2G, la souche Neo ncmicl-3 KO et la souche Neo ncmicl-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 3.
Figure 3-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Neo ncmicl-3 KO 2G et confirme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxP et LoxN.
Figure 4- A : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection de la protéine MIC3 obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et souche Neo ncmicl-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC3.
Figure 4-B : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection de la protéine CATGFP obtenue respectivement avec la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum et les souches mutantes de Neospora caninum en utilisant la fluorescence intrinsèque de la protéine CATGFP. Cette figure permet de mettre en évidence la présence de la protéine CATGFP ou l'absence de la protéine CATGFP suite à l'action de la Cre Recombinase. Figure 5-A : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMIC3-KO- CAT-GFP loxP. Ce plasmide de 9 931 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxP identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmic3.
Figure 5-B : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgMICl-KO- CAT-GFP loxN. Ce plasmide de 10 285 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites loxN identiques de même orientation, ajoutés par PCR. De part et d'autre de la cassette ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgmicl.
Figure 6-A : cette figure illustre les 4 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène mic3. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmic3 KO. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase. La troisième étape permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP au locus du gène miel. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche simple mutante Toxo tgmicl-3 KO. Enfin, dans une dernière étape, le gène codant pour la protéine CAT-GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase.
Figure 6-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmicl-3 KO et la souche finale Toxo tgmicl-3 KO 2G en utilisant les jeux d'amorces des PCR du Tableau 7.
Figure 6-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G et confirme que les gènes miel et mic3 ont été supprimés et remplacés respectivement par des cicatrices LoxN et LoxP. Figure 7 : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection des protéines MIC1, MIC3 ou CAT-GFP obtenus respectivement avec la souche sauvage RH de Toxoplasma gondii, la souche Toxo tgmic3 KO, la souche Toxo tgmic3 KO 2G, la souche Toxo tgmicl-3 KO et la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre la protéine MIC1, MIC3 ou directement avec les propriétés fluorescentes intrinsèques de la protéine CAT-GFP.
Figure 8 : cette figure est une représentation schématique du plasmide pTgRopl6KO- Gral5nKI-CAT-GFP lox2272. Ce plasmide de 12721 paires de bases comprend le gène de sélection codant pour la protéine chimérique CAT-GFP placé sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii pour permettre l'expression du gène dans le parasite. Cette cassette de sélection est encadrée par deux sites lox2272 identiques de même orientation, ajoutés par PCR. En aval de cette cassette a été intégré la cassette d'expression permettant de coder la protéine Gra51HAII. Puis de part et d'autre de ces cassettes ont été insérées les régions homologues flanquant le gène tgroplô.
Figure 9-A : cette figure illustre les 2 étapes pour obtenir la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G. La première étape de recombinaison homologue permet l'intégration du gène codant pour l'enzyme CAT-GFP et le gène gral5IIHA au locus du gène ropl6. Une sélection par le chloramphénicol permet d'amplifier la souche mutante Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15n Kl. Dans une seconde étape, le gène codant pour la protéine CAT- GFP est supprimé par action de la Cre Recombinase pour obtenir la souche Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G.
Figure 9-B : cette figure représente les profils électrophorétiques des produits PCR obtenus respectivement avec les souches Toxo tgmicl-3 KO 2G, Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl 2G.
Figure 9-C : cette figure représente les résultats des séquençages obtenus sur la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n Kl 2G et confirme que les gènes ropl6 et cat-gfp ont été supprimés et remplacés par la cicatrice Lox2272 et le gène gral5HAII.
Figure 10 : cette figure illustre l'analyse par immuno fluorescence de la détection de la protéine GRA15 (via le tag HA) obtenu respectivement avec les souches Toxo tgmicl- 3 KO ropl6 KO GRA15n Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G en utilisant un anticorps spécifiquement dirigé contre le tag HA. Cette figure illustre également la suppression de la cassette CATGFP avec la disparition de la fluorescence GFP pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GRA15n KI-2G.
Figure 11-A : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes ncmic3, ncmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Neo ncmic3 KO et/ou Neo ncmic3 KO 2G et/ou Neo ncmicl-3 KO et/ou Neo ncmicl-3 KO 2G de Neospora caninum. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO : x) définies dans la présente demande.
Figure 11-B : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgmic3, tgmicl, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmic3 KO et/ou Toxo tgmic3 KO 2G et/ou Toxo tgmicl-3 KO et/ou Toxo tgmicl-3 KO 2G de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO : x) définies dans la présente demande.
Figure 11-C : cette figure illustre la position des amorces nucléiques utilisées dans la présente invention pour détecter la présence des trois gènes tgroplô, gral5ll, cat-gfp dans les souches sauvages et/ou des souches mutantes de Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl de Toxoplasma gondii. Les chiffres représentent la numérotation des séquences d'amorces (SEQ ID NO : x) définies dans la présente demande.
Figure 12 : cette figure illustre le titrage en anticorps spécifique dirigé contre Neospora caninum dans le sérum de souris vaccinées 30 jours au préalable par la souche NeoKO 2G. Le véhicule ayant été utilisé en contrôle. n=2 par groupe. ANOVA deux voies. .
Figure 13-A : cette figure illustre le suivi des scores cliniques observés pour les souris.
Figure 13-B : cette figure illustre le titrage en anticorps spécifique dirigé contre T. gondii dans le sérum de souris à J-2, J28 et J129. ANOVA une voie (**** : pO.0001, * : p<0.05). Figure 13-C : cette figure illustre le dosage d'IFNy suite à une restimulation des splénocytes avec l'extrait total de T. gondii 72h après la restimulation. ANOVA une voie (**** : p<0.0001, * : p<0.05). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
Figure 13-D : cette figure illustre le nombre de kystes cérébraux détectés chez les mères. ANOVA une voie (* : p<0.05). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
Figure 13-E : cette figure illustre la prolificité obtenue pour chaque lot.
Figure 13-F : cette figure illustre le sex-ratio obtenu pour chaque lot. ANOVA deux voies (** : p<0.01), * : p<0.05).
Figure 13-G : cette figure illustre les résultats obtenus pour la mortinalité.
Figure 13-H : cette figure illustre les résultats obtenus pour la mortalité observée par portée pour chaque lot. ANOVA une voie (**** : p<0.0001, *** : p<0.001). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
Figure 13-1 : cette figure illustre le pourcentage de survie obtenue pour les souriceaux sur 32 jours. Log-rank (Mantel-Cox) test (**** : p<0.0001). Le lot 1 correspond au groupe contrôle, le lot 2 correspond au groupe challenge 76K, le lot 3 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G et le lot 4 correspond au groupe Toxo tgmic 1-3 KO 2G + challenge 76K.
Figure 13-J : cette figure illustre le suivi des scores cliniques observés pour les souriceaux.
Figure 13-K : cette figure illustre le titrage en IgM spécifique dirigé contre T. gondii dans le sérum de souris de chaque lot. ANOVA une voie (**** : p<0.0001, ** : p<0.01). Exemple 1 : Construction de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G
L'haploïdie du génome de Neospora caninum lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.
Culture des parasites
Tous les tachyzoïtes de la souche de Neospora caninum utilisés ont été produits en fîbroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.
Construction des plasmides
• Plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP loxN
Le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Ρα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène cat-gfp SEQ ID :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxN SEQ ID NO :5 identiques de même orientation.
Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces cat-gfp LoxN For SEQ ID NO :7 et catgfp loxN rev SEQ ID NO :8 (2380pb), digérée par les enzymes de restriction Clal et Xbal (2348 pb) et clonée dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par Clal et Xbal (7715 pb).
Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMic3KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 1.
Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 1 ci-dessous. Le plasmide pNcMic3KO- CAT-GFP loxN contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par une séquence 5 'HR du gène ncmic3 SEQ ID NO : 98 et une séquence 3'HR du gène ncmic3 SEQ ID NO : 97. Tableau 1 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcMIC3-KO-CAT- GFP loxN catgfp loxN For SEQ ID NO : 7
TCCGCTCTCAGAGAATCGATGAAGCTTATAACTTCGTATAGT ATACCTTATACGAAGTTATGATATGCATGTCCGCGTTCGTGA AATCTC Clal LoxN
catgfp loxN rev SEQ ID NO :8
ATACGTAAACTTCTAGATCCATAACTTCGTATAAGGTATACT ATACGAAGTTATCCCTCGGGGGGGCAAGAATTGTGTTAACCG Xbal loxN
GTTCGA
• Plasmide pNcMIC 1 -KO-CAT-GFP lox
Le plasmide pNcMicl KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval de la séquence codant CAT-GFP, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser PARNm codant la protéine de fusion CAT/GFP. Cette cassette de sélection SEQ ID NO :6 est encadrée par deux sites loxP SEQ ID NO : 12 identiques de même orientation.
Pour obtenir ce plasmide, la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 a été amplifiée par PCR sur le plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO :9 avec les amorces CN10 SEQ ID NO : 13 et CN11 SEQ ID NO : 14 permettant l'ajout des sites loxP SEQ ID NO : 12 (2394 pb), digérée par les enzymes de restriction HindIII et BamHI (2339 pb) et clonée dans le plasmide pT230-ble SEQ ID NO : 37 digéré par HindIII et BamHI (293 lpb). Le plasmide alors obtenu est le plasmide pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 113.
La région 3 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 3 HR NCmicl F Kpnl et 3 HR NCmicl R HindIII (SEQ ID NO: 114 et SEQ ID NO: 115) permettent l'amplification de la région 3 HR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 3HR en amont de la cassette de sélection CAT-GFP dans le pT230 CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 113. Le plasmide obtenu est dénommé pNcmicl-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118.
La région 5 HR du gène ncmicl a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche NC-1 de Neospora caninum. Pour l'amplification, les amorces 5 HR NCmicl F BamHI et 5 HR NCmicl R Notl (SEQ ID NO: 116 et SEQ ID NO: 117) permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène ncmicl et la création de deux sites de restrictions qui ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR en aval de la cassette de sélection CAT-GFP dans le plasmide pNcmicl-3HR CATGFP loxP SEQ ID NO : 118 (BamHI -Notl).
Le plasmide alors obtenu est le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 11. Le plasmide pNcMiclKO-CAT-GFP loxP contient donc une cassette CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par une séquence 5'HR du gène ncmicl SEQ ID NO : 96 et une séquence 3'HR du gène ncmicl SEQ ID NO : 95.
Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : liste des amorces utilisées pour la construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP
Construction du plasmide pNcmicl KO CATGFP loxP
SEQ ID NO : 13
CN10 GCGGCCAAGCTT/ί TAA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGA Hindlll, loxP
yiGr 47OATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg
SEQ ID NO : 14
cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGA^C 4GrGGATCCyiryiyi
CN1 1 Spel, BamHI, loxP
CTTCGTA TA GCA TA CA TTA TA CGAA GTTA 7CCCTCGGGGG
GGCAAGAATT
3 HR NCmicl F SEQ ID NO: 1 14
Kpnl
Kpnl CGCGGTACCAGGCAGAAGTAAAGAAGGTTCCTC
3 HR NCmicl R SEQ ID NO: 1 15
Hindlll
Hindlll CGCAAGCTTTGATCACGCAAGAAAAGAAGC
5 HR NCmicl F SEQ ID NO: 1 16
BamHI
BamHI CGCGGATCCCATTTGTAGATACGGTTGCACAC
5 HR NCmicl R SEQ ID NO: 1 17
Notl
Notl CGCGCGGCCGCACATTCAGACGGCAGAACTCTG
• Plasmide pTSAGl- Cre Recombinase
Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage PI (Brecht et al., 1999, même référence que précédemment). Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial). qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl .
Dans le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO : 16 est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase.
L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase.
Construction de la souche Neomicl-3 KO - 2G
La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Neo ncmicl- 3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes :
1. Délétion par recombinaison homologue du gène ncmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences LoxN SEQ
ID NO : 5.
Pour obtenir cette souche, la souche sauvage NC-1 de Neospora caninum est électroporée avec le plasmide pNcMIC3-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO : 1. 20 μg de plasmide purifié puis linéarisé par Kpnl sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de ΑΤΡ (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al., Nucleic Acid Research, Jun l l ; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 μΕ, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous- clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 101. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 106 est présente dans le génome de la souche.
Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO : 6 : la souche Neo ncmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15.
L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmic3 KO - 2G.
Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 106 est présente dans le génome de la souche.
Délétion par recombinaison homologue du gène ncmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO : 12.
Pour obtenir cette souche, la souche Neo ncmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pNcMICl-KO-CAT-GFP lox P SEQ ID NO : 11 linéarisé par Kpnl, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmicl-3 KO Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18. Dans cette souche, le gène miel a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 102.
4. Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO : 6 : la souche Neo ncmicl-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15.
L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Neo ncmicl-3 KO - 2G.
Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 18.
Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 91.
Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G par PCR
Pour valider la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-A et sont détaillées dans le Tableau 3 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 3-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 4 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 3-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (ncmic3, ncmic3KO CATGFP et ncmic3KO loxN (2 G) ou ncmicl, ncmiclK ) CATGFP et ncmicl Jd loxP(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues Tableau 3 : Liste des amorces utilisées pour la validation des souches.
Tableau 4 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Neospora caninum
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces c SEQ ID NO : 22 et d SEQ ID NO : 23 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 850 paires de bases pour la souche NC-1, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène ncmic3 SEQ ID NO : 105 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmic 1-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces i SEQ ID NO : 24 et j SEQ ID NO : 25 et les amorces k SEQ ID NO : 26 et 1 SEQ ID NO : 27 (mix Ncmic3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 2960 et 3668 paires de bases pour la souche Neo ncmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp dans cette souche à la place du gène ncmic3. Cette bande n'est pas détectée dans les souches NC-1, Neo ncmic3 KO - 2G, Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmic 1- 3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 au locus ncmic 3 dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces amorces g SEQ ID NO : 32 et h SEQ ID NO :33 (cicatrice Ncmic3) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2163 paires de bases pour la souche NC-1, confirme la présence du gène ncmic3 SEQ ID NO : 105 dans cette souche. Une bande de 2575 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo ncmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène ncmic3. Enfin une bande de 276 paires de bases est mise en évidence pour les souches Neo ncmic3 KO - 2G Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO : 5 dans le génome.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces a SEQ ID NO : 20 et b SEQ ID NO :21 (mix Ncmic 1) permettent de mettre en évidence une bande à 644 paires de bases pour les souches NC-1, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène ncmic 1 SEQ ID NO : 106 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Neo ncmicl-3 KO et Neo ncmicl- 3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces m SEQ ID NO : 28 et j SEQ ID NO : 25 et les amorces k SEQ ID NO : 26 et n SEQ ID NO : 29 (mix Ncmic 1) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3359 et 3421 paires de bases pour la souche Neo ncmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche à la place du gène ncmic 1. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage NC-1 de N. caninum, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G, et Neo ncmic 1-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection at-gfp SEQ ID NO : 2 au locus ncmic 1 dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO : 30 et f SEQ ID NO : 31 (cicatrice Ncmic 1) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 2182 paires de bases pour les souches NC-1, Neo ncmic3 KO, Neo ncmic3 KO - 2G confirme la présence du gène ncmic 1 dans ces souches. Une bande de 2560 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo ncmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène ncmic 1. Enfin une bande de 261 paires de bases est mise en évidence pour la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO : 12 dans le génome. Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquencés et les séquençages ont confirmés que :
• le gène ncmic3 SEQ ID NO : 105 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO : 5 conforme à la séquence attendue (Figure 3C).
• le gène ncmic 1 SEQ ID NO : 106 a été supprimé et que la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO : 12 conforme à la séquence attendue (Figure 3C).
Validation de la souche Neo ncmicl-3 KO - 2G par immunofluorescence
Les tachyzoïtes cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBSIX, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBSIX, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBSIX pendant 5 min. Après 3 lavages au PBS IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PBS 1X/SVF 10% pendant 30 min.. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2% SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBSIX puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBSIX, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence. L'anticorps primaire Tgmic3 permet une reconnaissance de la protéine Ncmic3, il permet de détecter l'expression de la protéine NcMIC3 SEQ ID NO : 118 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb anti-MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti- lapin (Life technologies réf. A-l 1012). Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC3 (Figure 4- A).
L'anticorps primaire Tgmicl ne permet pas une reconnaissance de la protéine NcMICl SEQ ID NO : 119.
Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Neo ncmic3 KO et Neo ncmicl-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Neo ncmic3 KO - 2G et Neo ncmicl-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP SEQ ID NO :6) (Figure 4-B).
Exemple 2 : Construction de la souche Toxo tsmicl-3 KO - 2G
L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.
Culture des parasites
Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634)) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.
Construction des plasmides
• Plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP
Le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP Lox P SEQ ID NO : 34 (Figure 5A) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC3 de Toxoplasma gondii (référence ATCC : souche RH Pra310) par recombinaison homologue.
Le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant un gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour une protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3. En aval du gène cat-gfp SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 qui permettent l'ajout des sites loxP (SEQ ID NO : 12) et des sites de restrictions HindIII et Spel. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR (2389 pb) a ensuite été cloné dans le plasmide pT230TUB Ble SEQ ID NO : 37 par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction HindIII et Spel. Le plasmide obtenu est dénommé pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38.
La région 3'HR du gène tgmic3 SEQ ID NO : 39 a été obtenu par la double digestion enzymatique du plasmide pmic3KO-2 SEQ ID NO : 40 avec les enzymes de restriction Kpnl et HindIII (2145pb), puis cloné dans le plasmide pCATGFP loxP SEQ ID NO : 38 digéré par Kpnl et HindIII (5238pb). Le plasmide obtenu est dénommé p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO : 41.
La région 5'HR du gène tgmic3 SEQ ID NO : 42 a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche RH de T. gondii. Pour l'amplification, les amorces SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 permettent l'amplification de la région 5'UTR du gène tgmic3 et la création de deux sites de restrictions (2568pb / sites Spel et Xbal). Ces sites de restrictions ont été utilisés pour cloner le fragment 5HR digéré par Spel et Xbal (2548pb) dans le plasmide p3'UTRmic3-CATGFP loxP SEQ ID NO : 38 en aval de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 au niveau du site Spel du plasmide précédemment décrit (7383pb) pour obtenir le plasmide pTgMic3KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO : 34.
Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 5 ci-après.
Tableau 5 : Séquences des amorces utilisées pour la construction du plasmide pTgMIC3-KO- CAT-GFP loxP .
Construction du plasmide pTgmic3KO CAT-GFP loxP
GCGGCCAAGCTT/ί TAA CTTCGTA TAA TGTA TGCTA TA CGA
SEQ ID NO : 35 /ÎGrr/i7GATATGCATGTCCGCgttcgtgaaatctctgatcaagcgg HindIII, loxP cgacgcacgctgtcactcaacttgctGCTAGA^C 4G7OGATCC^r 4
SEQ ID NO : 36 CTTCGTA TA GCA TA CA TTA TA CGAA GTTA 7CCCTCGG Spel, BamHI, loxP
GGGATCCACTAGTTTACGTATCGCGACTAGCAGCAAG BamHI, Spel,
SEQ ID NO : 43 TTGAGTGACAGCG SnaBI, NruI
GCTGCAGTCTAGAGATATCCACGTGGAATTCCTCTTGG PstI, Xbal, EcoRV
SEQ ID NO : 44 GAAGAACAAT Pmll • Plasmide pTgMIC 1 -KO-CAT-GFP loxN
Le plasmide pTgMICl -KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 (Figure 5-B) a été construit pour supprimer le gène codant la protéine TgMIC 1 de Toxoplasma gondii par recombinaison homologue.
Le plasmide pTgMicl KO-CAT-GFP loxN SEQ ID NO : 45 contient une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 codant pour la protéine de fusion CAT-GFP permettant à la fois la résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP : Green Fluorescent Protein), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3. En aval du gène cat-gfp SEQ ID NO :2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 a été insérée.
La SEQ ID NO :6 a été amplifiée à partir du plasmide pT230 CAT-GFP SEQ ID NO : 9 en utilisant les amorces SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47 qui permettent l'ajout des sites loxN (SEQ ID NO : 5) et des sites de restrictions Clal et Xbal. La séquence nucléotidique amplifiée par PCR a ensuite été cloné dans le plasmide pNcMic3KO-DHFR SEQ ID NO : 10 digéré par Clal et Xbal (7715 pb) par digestion enzymatique avec les enzymes de restriction Clal et Xbal.
Le plasmide obtenu est dénommé pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48.
Le fragment 5HR tgmicl SEQ ID NO : 49 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 50 et SEQ ID NO : 51 (2364pb), les sites de restriction Kpnl et Clal ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction Kpnl et Clal (2337pb) et cloné dans le plasmide pNCmic3KO CATGFP LoxN SEQ ID NO : 48 (voir exemple 1 pour l'obtention du plasmide pNCmic3KO CATGFP LoxN) digéré par Kpnl et Clal (7740pb) pour remplacer le fragment 5HR ncmic3 (fragment digéré par Kpnl et Clal). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmiclK05HR-NCmic3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111.
Puis le fragment 3HR tgmicl SEQ ID NO : 52 a été amplifié par PCR avec les amorces SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 (2750pb), les sites de restriction Xbal et Notl ont été ajoutés par PCR. Le fragment amplifié est digéré par les enzymes de restriction Xbal et Notl (2720 pb) puis cloné dans le plasmide pTgmiclK05HR-NCmic3K03HR CATGFP LoxN SEQ ID NO : 111 digéré par les enzymes de restriction Xbal et Notl (7565 pb) pour remplacer le fragment 3HR ncmic3 (fragment digéré par Xbal et Notl). Le plasmide obtenu est dénommé pTgmiclKO CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 45. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6 : Amorces permettant la construction du plasmide pTgmic3KO CAT-GFP loxP
• Plasmide pTSAGl- Cre Recombinase
Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 a été construit pour exprimer de manière transitoire dans le parasite Toxoplasma gondii et ses dérivés modifiés génétiquement le gène codant la protéine Cre Recombinase dérivée du bactériophage PI (Brecht et al, 1999, même référence que précédemment).
Le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15 dérive du plasmide pUC18 (plasmide commercial) qui contient une cassette d'expression de la Cre Recombinase du bactériophage Pl . Dans le plasmide pT-SAGl-Cre-Recombinase SEQ ID NO : 15, le gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO : 16, est placé sous la dépendance du promoteur du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 17, ce qui permet l'expression de la protéine Cre Recombinase dans les parasites Toxoplasma gondii transfectés. En aval du gène codant la Cre Recombinase SEQ ID NO : 16, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO :4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine Cre Recombinase.
L'absence de cassette de sélection spécifique ne permet pas une intégration stable du matériel génétique transfecté mais seulement une expression transitoire de la Cre Recombinase.
Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G
La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmicl-3 KO - 2G, est faite en 4 étapes distinctes (Figure 6-A) : Délétion par recombinaison homologue du gène tgmic3 et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences LoxP SEQ ID NO : 12.
Pour obtenir cette souche, la souche sauvage de Toxoplasma gondii RH (référence ATCC : PRA-310) est électroporée avec le plasmide pTgMIC3-KO-CAT-GFP loxP SEQ ID NO :34. 20 μg de plasmide purifié puis linéarisé par Kpnl sont ajoutés à 107 parasites mis en suspension dans le milieu d'électroporation CYTOMIX contenant de ΓΑΤΡ (3 mM) et du Glutathion (3 mM) (Van den Hoff et al, Nucleic Acid Research, Jun 11 ; 20(11):2902), et l'électroporation a été réalisée en cuvette d'écart 4 mm, dans un volume de 800 sur un appareil BioRad (Paramètres : 2000V, 50 ohms, 25 μΡ, avec deux chocs électriques). Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après l'électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmic3 KO.
Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 103. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 108 est présente dans le génome de la souche.
Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO : 6 : la souche Toxo tgmic3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15.
L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Le protocole d'électroporation est similaire au protocole précédent. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo igmic3 KO - 2G. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Le gène miel n'étant pas délété, la séquence du gène miel SEQ ID NO : 108 est présente dans le génome de la souche. Délétion par recombinaison homologue du gène tgmicl et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6 encadrée par des séquences Lox N SEQ ID NO :5. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgMICl-KO-CAT-GFP lox N SEQ ID NO :45 linéarisé par Pcil, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO.
Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.
Dans cette souche, le gène miel a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant la cassette de sélection CATGFP est la SEQ ID NO : 104.
Suppression de la cassette de sélection SEQ ID NO :6: la souche Toxo tgmicl-3 KO obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15. L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :6. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO - 2G.
Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19. Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92.
Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G par PCR
Pour valider la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11-B et sont détaillées dans le Tableau 7 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 6-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 8 ci-dessous. Pour plus de clarté sur la figure 6-B, seules les 3 étapes de la réalisation sont représentées (tgmic3, tgmic3KO CATGFP et tgmic3KO loxP (2 G) ou tgmicl, tgmiclKO CATGFP et tgmiclKO loxN(2G)), les résultats obtenus sont conformes aux tailles attendues.
Tableau 7 : liste des amorces utilisées pour la validation des souches.
Tgmic3 5 TgMlC3 SEQ ID NO 61 : 6 TgMlC3 SEQ ID NO 62 :
(mixl) For CCTCCGATGTGACTTTTGGT Rev GATCCTCGGAGCAAGTCAAC
Validation 1 CN58 SEQ ID NO 63 : j ORF
KO 3 ATACGAAGGGATTCGACGTG CATGFP
5'Tgmic3(mi R SEQ ID NO 25 :
x2) CCGTTTGGTGGATGTCTTCT
Validation k ORF 1 HR Mic3 SEQ ID NO 64
KO CATGF SEQ ID NO 26 : 4 RL ATATGCGGATGAGTGCTCGAA
3'Tgmic3 P F GCATCGACTTCAAGGAGGAC TT
(mix3)
Cicatrice 9 Tgmic3 SEQ ID NO 65 : 1 Tgmic3 SEQ ID NO 66 :
Tgmic3 loxN F GTGTGGAGACTTTTTACTTCGT 0 loxN R CCTCCGATGTGACTTTTGGT
(mix4) GTTAC
Tgmicl 3 TgMICI SEQ ID N0 55 : 4 TgMICIR SEQ ID NO 56 :
(mix5) For ATGCGCGCTATAAAGAATCG ev AGAAACAACGCCTGGCCCAT
Validation 1 tgmicl K SEQ ID NO 57 : j ORF SEQ ID NO 25 :
KO 1 O integ GTGCGATGACGTGGCTTCTCTATC CATGFP CCGTTTGGTGGATGTCTTCT
5'Tgmicl(mi F ATGTGT R
x6)
Validation k ORF SEQ ID NO 26 : 1 tgmiclKO SEQ ID N0 58 :
KO CATGF GCATCGACTTCAAGGAGGAC 2 integ R GATTCGCTTCGTCACTTCTGGTACG
3 'Tgmicl P F GATGC
(mix7)
Cicatrice 7 Tgmicl SEQ ID N0 59 : 8 Tgmicl SEQ ID NO 60 :
Tgmicl loxN F CCCGTCTAGCAAGACCTCAA loxN R TCGGTGCTGCTCAGTAATTG
(mix8) Tableau 8 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction des souches KO de Toxoplasma gondii
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 5 SEQ ID NO :61 et 6 SEQ ID NO : 62 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 808 paires de bases pour la souche RH, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène tgmic3 dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 13 SEQ ID NO :63 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO :26 et 14 SEQ ID NO :64 (mix 2 et 3) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3253 et 3537 paires de bases pour la souche Toxo tgmic3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche à la place du gène tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches RH, Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Tgmic 3 dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 9 SEQ ID NO :65 et 10 SEQ ID NO :66 (mix 4) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 1596 paires de bases pour la souche RH, confirme la présence du gène tgmic3 SEQ ID NO : 107 dans cette souche. Une bande de 2525 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmic3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène tgmic3. Enfin une bande de 226 paires de bases est mise en évidence pour les souches Toxo tgmic3 KO - 2G, Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat- gfp SEQ ID NO :2 dans ces souches, laissant une cicatrice loxP SEQ ID NO : 12 dans le génome.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 3 SEQ ID NO :55 et 4 SEQ ID NO :56 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 608 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G, conformément aux tailles de bandes attendues et confirmant la présence du gène tgmicl SEQ ID NO :108 dans ces souches. Ces bandes ne sont pas détectées dans les souches Toxo tgmicl-3 KO et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 11 SEQ ID NO :57 et j SEQ ID NO :25, et les amorces k SEQ ID NO : 26 et 12 SEQ ID NO : 58 (mix 6 et 7) permettent de mettre en évidence respectivement une bande à 3040 et 3593 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche à la place du gène tgmic3 SEQ ID NO :107. Cette bande n'est pas détectée dans les souches sauvage RH de T. gondii (référence ATCC : PRA-310), Toxo tgmic3 KO, Toxo tgmic3 KO - 2G, et Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant l'absence du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 au locus Tgmicl dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces 7 SEQ ID NO :59 et 8 SEQ ID NO : 60 (mix 8) permettent de mettre en évidence différentes bandes conformément à la taille de bande attendue. Une bande à 4198 paires de bases pour les souches RH, Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmic3 KO - 2G confirme la présence du gène tgmicl SEQ ID NO : 108 dans ces souches. Une bande de 3129 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 à la place du gène tgmicl. Enfin une bande de 830 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO :2 dans cette souche, laissant une cicatrice loxN SEQ ID NO :5 dans le génome.
Les produits PCR « cicatrice » (mix 4 et 8) ont été séquencés et les séquençages ont confirmés que : • le gène tgmic3 SEQ ID NO :107 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT- GFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice LoxP SEQ ID NO : 12 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C).
• le gène tgmicl SEQ ID NO :108 a été supprimé et que la cassette de sélection CAT- GFP SEQ ID NO :6 a bien été supprimée par action de la CRE-Recombinase laissant une cicatrice LoxN SEQ ID NO :5 conforme à la séquence attendue (Figure 6-C).
Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G par immunofluorescence
Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PB S IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2%> SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.
L'anticorps primaire Tgmic3 utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMIC3 SEQ ID NO : 121 dans le parasite (anticorps de lapin anti-mic3 : rnAb anti- MIC3 s3) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-lapin (Life technologies réf. A-l 1012).
L'anticorps primaire Tgmicl utilisé est un anticorps qui permet de détecter l'expression de la protéine TgMICl SEQ ID NO : 122 dans le parasite (anticorps de souris anti-miel : mAb anti-MICl T104F8E12) et l'anticorps secondaire commercial utilisé est l'Alexa fluor® 594 chèvre anti-souris, Life technologies réf. A-l 1005).
Les résultats montrent qu'aucune fluorescence n'est détectable au pôle apical du parasite révélant l'absence des protéines MIC1 et MIC3 dans des tachyzoïtes Toxo tgmicl-3 KO - 2G alors qu'une fluorescence au pôle apical du parasite de la souche sauvage démontre l'expression des protéines MIC1 et MIC3 (figure 7).
Les résultats montrent que les parasites expriment une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 suite à la réalisation des délétions de gènes (Toxo tgmic3 KO et Toxo tgmicl-3 KO) alors qu'après action de la Cre recombinase, les souches Toxo tgmic3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO - 2G ne sont plus fluorescentes (suppression de de la cassette CATGFP) (Figure 7).
Exemple 3 : Construction de la souche Toxo tsmicl-3 KO wp!6 KO GralSII Kl
Matériel et méthode
L'haploïdie du génome de Toxoplasma gondii lors de la phase proliférative permet l'invalidation d'un gène en une seule recombinaison homologue.
Culture des parasites
Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fibroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.
Construction du plasmide
Le plasmide pTgRopl6KO-Gral5nKI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67 (Figure 8) contient la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comprenant le gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2, codant pour la protéine de fusion CAT-GFP conférant une résistance au chloramphénicol (CAT) et une fluorescence verte (GFP), sous le contrôle du promoteur de Γα-tubuline de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 3 pour permettre l'expression du gène dans le parasite. En aval du gène de sélection SEQ ID NO : 2, la séquence 3'UTR du gène sagl de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 4 est insérée. Cette séquence a pour objectif de stabiliser l'ARNm codant la protéine de fusion CAT-GFP.
La cassette de sélection SEQ ID NO : 6 est encadrée par deux sites Lox2272 SEQ ID NO : 68, sites de reconnaissance spécifiquement reconnus par la Cre Recombinase et qui seront utilisés ultérieurement pour supprimer la cassette de sélection CAT-GFP.
En aval du deuxième site Lox2272, une cassette d'expression du gène gral5n SEQ ID NO : 69 a été cloné. Cette cassette d'expression est constituée du promoteur de gra 15u amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49 et du gène gral5n SEQ ID NO : 70 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche ME49, incluant un tag HA en 3 ' SEQ ID NO : 72 pour faciliter la localisation et de la séquence 3'UTR du gène sagl de T. gondii SEQ ID NO :4 amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche RH. Ce plasmide permet donc la réalisation simultanée d'un mutant roplôKO lox2272 CATGFP lox2272 et l'insertion de gral5IIHA au locus ropl6.
Le plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 contient une cassette CAT- tdTomato SEQ ID NO : 125 - encadrée par une séquence 5'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 100.
Le clonage a été fait à partir du plasmide pTgROP16-KO-CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par les enzymes SphI et Agel (6073pb). Ce clonage a nécessité 4 PCR indépendantes.
La première PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pCATGFP lox P SEQ ID NO : 38, d'une cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 comportant le promoteur aTubuline, le gène de sélection cat-gfp et la région 3'UTR de sagl de T. gondii, avec ajout du site lox2272 SEQ ID NO : 68 avec les amorces tub F Agel SEQ ID NO : 74 et 3 UTR lox2272 R SEQ ID NO : 75 (2090pb).
La deuxième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID NO :76, du promoteur gral5II SEQ ID NO : 71 avec ajout en 5' du site lox2272 SEQ ID NO : 68 avec les amorces pGral5 F lox2272 SEQ ID NO : 77 et P Gral5 R SEQ ID NO : 78 (1975pb).
La troisième PCR a permis l'amplification à partir du plasmide pT230 2G gral5II SEQ ID
NO :76, du gène gral5II HA avec le 3'UTR de sagl SEQ ID NO : 79 (2092 pb) avec les amorces Gral5F SEQ ID NO 126et UTR sagl roplô R SEQ ID NO 127.
Les amorces utilisées pour la construction de ce plasmide sont répertoriées dans le tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9 : Amorces utilisées pour la construction du plasmide pT230 2G Gral5II
La dernière PCR a permis l'amplification d'une partie de 3'Ropl6 SEQ ID NO : 80 avec les amorces Ropl6F SEQ ID NO : 81 et Ropl6R SphI SEQ ID NO : 82 (570pb) sur le plasmide pTgroplô KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 comme matrice.
Les 4 fragments de PCR amplifiés ont été directement clonés dans le vecteur pTgroplô KO CAT-tdTomato SEQ ID NO : 73 digéré par Agel et SphI grâce à au kit In-Fusion® de Ozyme (In-Fusion® HD Cloning Kit - Clonetech). La technologie de clonage In-Fusion® permet le clonage en une étape sans purification ou digestion d'un ou de plusieurs produits de PCR dans un vecteur linéarisé. Des extrémités complémentaires aux extrémités des fragments adjacents sont ajoutées par PCR. La réaction se fait selon les recommandations du constructeur. Le plasmide obtenu est dénommé pTgRopl6KO-Gral5nKI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67. Le plasmide dénommé pTgRopl6KO-Gral5nKI-CAT-GFP lox2272 SEQ ID NO : 67 contient donc une cassette CAT- GFP SEQ ID NO : 6 et une cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO : 69, encadrées par une séquence 5'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 99 et une séquence 3'HR du gène tgroplô SEQ ID NO : 100.
Construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G
La construction de la souche vivante atténuée de seconde génération, dénommée Toxo tgmicl-3 KO roplô KO GralSII Kl -2G, est faite en 2 étapes distinctes :
1. Délétion par recombinaison homologue du gène roplô et son remplacement par la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO : 6 encadrée par des séquences Lox2272
SEQ ID NO : 38 et la cassette gral5IISEQ ID NO :69. Pour obtenir cette souche, la souche Toxo tgmic3 KO - 2G est électroporée avec le plasmide pTgRopl6KO-Gral5nKI-CAT-GFP lox 2272 SEQ ID NO : 67 (20 μg) linéarisé par Pcil, selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GralSII KL
Dans cette souche, le gène ropl6 a été délété et remplacé par la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 et la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène ropl6 délété contenant la cassette de sélection CATGFP et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 112. Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.
Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92. Suppression de la cassette de sélection: la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl obtenue est électroporée avec le plasmide pT-SAGl-CRE-Recombinase SEQ ID NO : 15 (Figure 2-C). L'enzyme exprimée transitoirement va permettre l'excision de la cassette de sélection CAT-GFP. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Après 2 à 7 jours de culture, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique au DNAzol des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO GralSII Kl -2G.
Dans cette souche, le gène ropl6 a été délété et remplacé par la cassette d'expression de gral5HAII SEQ ID NO :69 et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène ropl6 délété contenant la cassette un seul site lox 2272 SEQ ID NO : 68 et la cassette d'expression de gral5HAII est la SEQ ID NO : 93.
Dans cette souche, le gène mic3 a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène mic3 délété contenant un seul site lox P SEQ ID NO : 12, est la SEQ ID NO : 19.
Dans cette souche, le gène miel a été délété et la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO :6 a été excisé. Ainsi, la séquence théorique au locus du gène miel délété contenant un seul site lox N SEQ ID NO : 5, est la SEQ ID NO : 92.
Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl -2G par PCR
Pour valider la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont décrites dans la Figure 11- C et sont détaillées dans le Tableau 10 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 9-B). Leur taille attendue et leur taille observée sont également décrites dans le Tableau 11 ci-dessous.
Tableau 10 : liste des amorces utilisées pour la validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G.
Tableau 11 : Taille attendue des amplicons (en paires de base) des différentes PCR de validation de la construction de la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl 2G
Toxo tgmicl- Toxo tgmicl-3 KO Toxo tgmicl-3 KO
3 KO - rop 16 KO rop 16 KO
2G Gral5II KI Gral5II KI -2G
Tgroplô (mixl) 1682 - -
Validation KO 5 'Tgro lô - 2759 -
(mix2)
Validation KO 3' Tgro lô - 2870 2870
(mix3)
Cicatrice ro lôKO - 2550 321
gral51oxP (mix4)
Gral5I/II (mix5) 560 560 et 308 560 et 308 Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rgl SEQ ID NO : 83 et rg2 SEQ ID NO: 84 (mix 1) permettent de mettre en évidence une bande à 1682 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène tgroplô dans cette souche. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la suppression du gène dans ces souches.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg3 SEQ ID NO: 85et rg4 SEQ ID NO: 86 (mix 2) permettent de mettre en évidence une bande à 2759 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène tgroplô dans cette souche et l'insertion du gène de sélection CATGFP et gral5II à la place du gène tgroplô. Cette bande n'est pas détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G et Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II KI -2G.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg5 SEQ ID NO: 87 et rg6 SEQ ID NO: 88 (mix 3) permettent de mettre en évidence une bande à 2870 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G, conformément à la taille des bandes attendues et confirmant la suppression du gène tgroplô dans cette souche et l'insertion du gène gral5II à la place du gène tgroplô. Cette bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.
Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces rg7 SEQ ID NO: 89 et rg8 SEQ ID NO: 90 (mix 4) permettent de mettre en évidence une bande de 2550 paires de bases pour la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl confirmant la présence de la cassette de sélection CATGFP SEQ ID NO : 6 à la place du gène tgroplô. Enfin une bande de 321 paires de bases est mise en évidence pour la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G confirmant la suppression du gène de sélection cat-gfp SEQ ID NO : 2 dans cette souche, laissant une cicatrice lox2272 SEQ ID NO : 68 dans le génome. Aucune bande n'est pas détectée dans la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.
Le produit PCR « cicatrice » obtenue pour la souche Toxo tgmicl-3 KO roplô KO Gral5II Kl -2G (321 paires de bases) a été séquencé et les séquençages ont confirmés que :
• le gène tgroplô a été supprimé et que la cassette de sélection CAT-GFP SEQ ID NO :
6 a bien été supprimée par action de la Cre-Recombinase laissant une cicatrice Lox2272 SEQ ID NO : 68 conforme à la séquence attendue (Figure 9-C). Les électrophorèses des produits PCR réalisés avec les amorces SEQ ID NO: 109 et SEQ ID NO: 110 (mix 5) permettent de mettre en évidence une bande à 560 paires de bases pour les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G, conformément à la taille de bande attendue et confirmant la présence du gène tggral5 dans cette souche. Une bande supplémentaire à 308 paires de bases est détectée dans les souches Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl et Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO Gral5II Kl -2G confirmant la présence du gène gral5HAII dans ces souches.
Validation de la souche Toxo tgmicl-3 KO rop!6 KO Gral5II Kl -2G par
immunofluorescence
Les tachyzoïtes sont cultivés 24h sur lamelles en verre recouvertes d'une monocouche de cellules HFF. Les cellules infectées ont été lavés 2 fois en PBS1X, et fixés par du formaldéhyde 4% pendant 30 min. Après 3 lavages en PBS1X, les cellules HFF infectées ont été perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS1X pendant 5 min. Après 3 lavages au PB S IX, une étape de saturation est effectuée avec une solution de PB S 1X/SVF 10% pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire dilué dans 2%> SVF pendant 1 heure, lavées 3 fois au PBS1X puis incubées avec un anticorps secondaire dilué dans une solution de PBS/SVF 2% pendant 1 heure. Après 2 lavages au PBS1X, les lamelles en verre sont montés sur lame avec de l'Immu-Mount™ et observés au microscope à fluorescence.
L'anticorps primaire utilisé est l'anticorps de souris anti-HA qui permet de détecter l'expression de la protéine GRA15n-HA SEQ ID NO : 123 dans le parasite. L'anticorps secondaire est l'anticorps secondaire commercial : Alexa fluor® 594 chèvre anti lapin (Life Technologies A-l 1012). Les anticorps sont dilués au 1/1000 dans du PBS SVF 2%.
Pour la souche sauvage Toxo tgmicl-3 KO 2G, aucune fluorescence rouge n'est observée au pôle apical du parasite révélant ainsi l'absence de la protéine GRA15n-HA. Au contraire, pour la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl, une fluorescence rouge est observée démontrant la protéine GRA15n-HA. La souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl exprime une fluorescente verte reflétant l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 alors qu'après action de la Cre recombinase, la souche Toxo tgmicl-3 KO ropl6 KO gral5II Kl lox2272 n'est plus fluorescente (Figure 10). Exemple 4 : Construction de souches recombinantes exprimant la protéine M2eGPI après intégration ciblée
L'objectif de cette expérience est d'évaluer si les souches Toxo tstnicl-3 KO 2G et Neo ncmicl-3 KO 2G peuvent exprimer des antigènes hétérologues.
Culture des parasites
Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fîbroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.
Construction des plasmides
Plasmide pUC 4G2 ICrel
Le plasmide pUC 4G2 ICrel SEQ ID NO : 156 a été construit pour permettre l'intégration d'un transgène hétérologue dans les souches Toxo tgmicl-3 KO 2G, Neo ncmicl-3 KO 2G et Toxo tgmicl-3 KO roplô KO gral5II Kl.
Le plasmide est notamment composé :
1- d'une cassette de sélection dhfr*-ty-tk SEQ ID NO : 229 (Donald & Roos, Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 15;90(24): 11703-7; Scahill et al, (Mol Biochem Parasitol. 2008 Jan;157(l):73-82. Epub 2007 Oct 6.)), placée sous la dépendance du promoteur de dhfr* SEQ ID NO : 230 de T. gondii et en aval de la séquence 3'UTR du gène dhfr* SEQ ID NO : 231 de Toxoplasma gondii. Cette cassette de sélection permet de coder la protéine de fusion DHFR*TYTK SEQ ID NO : 207 et permet une sélection positive par la pyriméthamine et une sélection négative par le ganciclovir.
2- d'une cassette d'expression constitué du promoteur de I'a-Tub8 SEQ ID NO : 128 (Soldati et al, Mol Cell Biol. 1995 Jan;15(l):87-93 - fusion d'une partie du promoteur de Tgsagl et Tgtub), d'un site de clonage multiple MCS pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène tgsagl SEQ ID NO : 4 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. La cassette de sélection dhfr*-ty-tk a été réalisée à partir de 3 fragments PCR obtenus avec les amorces du tableau 20:
• L'amplification du premier fragment PCR SEQ ID NO : 129 a été effectuée sur le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 130 (Donald & Roos 1993, même référence que précédemment) avec les amorces Dhtkl SEQ ID NO : 131 et Dhtk2 SEQ ID NO : 132 (674pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de DHFR* SEQ ID NO : 133 et d'ajouter la séquence codant le TY en 3' SEQ ID NO : 134.
• La deuxième PCR a été effectuée sur une séquence synthétisée du gène codant la Thymidine Kinase de l'Human herpesvirus 1 (TK) SEQ ID NO : 135 avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 136 et Dhtk4 SEQ ID NO : 137 (1161pb) et permet l'amplification de la séquence codante de la Thymidine Kinase avec ajout de la séquence codant le TY en 5' SEQ ID NO : 138.
• L'amplification du troisième fragment de PCR a été effectuée sur pUC18DHFR* SEQ ID NO : 130 avec les amorces Dhtk5 SEQ ID NO : 139 et Dhtk6 SEQ ID NO : 140 (363pb) et permet l'amplification de la fin de la séquence codante de la Thymidine Kinase et du 3'UTR de DHFR* SEQ ID NO : 141.
Les deuxième et troisième fragments de PCR sont fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces Dhtk3 SEQ ID NO : 136 et Dhtk6 SEQ ID NO : 140 (1501pb) pour donner la séquence SEQ ID NO : 191. Enfin le premier fragment SEQ ID NO : 129 digéré par BamHI et BglII (646pb) et la fusion des deux autres PCR SEQ ID NO : 191 digéré par BamHI et Xbal (1474pb) sont clonés dans le plasmide pUC18DHFR* SEQ ID NO : 130 digéré par BglII et Xbal (5258pb). Le plasmide obtenu est appelé pUC 18DHFR*TYTK SEQ ID NO : 142.
Tableau 20 : Liste de amorces utilisées
Dhtk AF SEQ ID NO : 131 Dhtk AF SEQ ID NO : 132
1 DHFRi CTGAGAAGGGCGTGAAGA 2 DHFR GTCAAGTGGATCCTGGTTAGTA nt Bgl TC TY R TGGACCTCGACAGCCATCTCCA
F TCTGGATTCG
Dhtk TY SEQ ID NO : 136 Dhtk HSVT SEQ ID NO : 137
3 HSVT GAGGTCCATACTAACCAG 4 K stop TTAGTTAGCCTCCCCCATCTCC
K F GATCCACTTGACATGGCTT TAA C CGTACCCCTGCCATCA R
Dhtk AFHS SEQ ID NO : 139 Dhtk AF SEQ ID NO : 140
5 VTK3 GGGAGATGGGGGAGGCTA 6 3UTR TTTTTCTAGAATCCTGCAAGTG UTRD ACTAACGGAAATACAGAA DHFR CATAGAAGGAA HFRF GCTGCCCGTCTCT XbaR La cassette d'expression est composée du promoteur de Pa-Tub8 SEQ ID NO : 128 (Soldati et al, 1995, même référence que précédemment), d'un site de clonage multiple pour permettre l'intégration future de transgène hétérologue et de la séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO : 4 qui doit permettre de stabiliser l'ARNm du gène hétérologue. La partie promotrice de I'a-Tub8 SEQ ID NO : 128 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcsl SEQ ID NO : 143 et K7mcs2 SEQ ID NO : 144 (530pb) sur le pTUB8TY TAIL SEQ ID NO : 145 (Meissner et al., J Cell Sci. 2002;115:563-574). La séquence 3'UTR du gène sagl SEQ ID NO : 4 a été obtenue par PCR avec les amorces K7mcs3 SEQ ID NO : 146 et K7mcs4 SEQ ID NO : 147 (395 pb). Puis les deux fragments de PCR ont été fusionnés par PCR chevauchante avec les amorces K7mcsl SEQ ID NO : 143 et K7mcs4 SEQ ID NO : 147 (914pb) pour donner la séquence SEQ ID NO : 192. La PCR chevauchante SEQ ID NO : 192 digérée par Kpnl et Sacl (902pb) a été clonée dans le pUC18 (plasmide commercial) Kpnl Sacl (2682pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 12 ci-dessous. Le plasmide obtenu est le pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 148.
Tableau 12 : liste des amorces utilisées pour la construction de la cassette d'expression
La cassette d'expression Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 149 obtenue par digestion du pUC 18 -Tub8MCS 3UTR SEQ ID NO : 148 avec l'enzyme Xbal (890pb) a ensuite été clonée dans le plasmide pUC18 DHFR*TYTK SEQ ID NO : 142 digéré par Xbal et déphosphorylé (7378pb). Le plasmide obtenu a sa cassette d'expression Tub8MCS 3UTR transcrite en sens inverse par rapport à la cassette DHFR*TYTK. Le plasmide obtenu est nommé pUC4G2 SEQ ID NO : 150.
Le fragment de PCR SEQ ID NO : 193 amplifié avec les amorces Icrell SEQ ID NO : 151 et IcreI2 SEQ ID NO : 152 sur le pTsaglIcrel αβγ SEQ ID NO : 153 (142pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 194 amplifié avec les amorces IcreB SEQ ID NO : 154 et IcreI4 SEQ ID NO : 155 sur le pUC4G2 SEQ ID NO : 150 (153pb) permettent l'ajout de la séquence αβ Icrel SEQ ID NO : 157. Les deux fragments PCR SEQ ID NO : 193 et SEQ ID NO : 194 ont été directement clonés dans le plasmide pUC4G2 SEQ ID NO : 150 digéré par les enzymes de restriction Pml I et KasI (7990pb) avec la technique In-Fusion de Ozyme.
Puis le fragment de PCR SEQ ID NO : 195 amplifié avec les amorces IcreI5 SEQ ID NO : 159 et IcreI6 SEQ ID NO : 160 sur le pTIcrellOO SEQ ID NO : 158 (546pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 196 amplifié avec les amorces IcreI7 SEQ ID NO : 161 et IcreI8 SEQ ID NO : 162 sur le pTsaglIcrel αβγ SEQ ID NO : 153 (133pb) permettent l'ajout de la séquence Icrel βγ SEQ ID NO : 163 dans le plasmide précédemment décrit digéré par les enzymes de restriction Nsil et Avril (7734pb). Le plasmide obtenu est nommé pUc4G2 Icrel SEQ ID NO : 164. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 21 ci-dessous.
Tableau 21 : Liste de amorces utilisées
Plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164
Ce plasmide permettra la production d'une protéine de fusion sagl M2eGPI SEQ ID NO : 165, comprenant la protéine S AGI de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 166, une répétition de 5 M2e (fragment Nter de la protéineM2 du virus d'Influenza) espacée par des linkers (Lee et al, 2015, PLoS ONE 10(9): e0137822. doi: 10.1371/journal.pone.0137822) SEQ ID NO : 167 et en Cter une séquence d'ancrage en GPI de la protéine S AGI de Toxoplasma gondii SEQ ID NO : 169. L'amplification de 3 fragments PCR a été nécessaire pour cette construction. L'amplification du premier fragment de PCR SEQ ID NO : 197 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii de la séquence codante de sagl SEQ ID NO : 170 avec les amorces da SEQ ID NO : 171 et db SEQ ID NO : 172 (906pb). La deuxième PCR SEQ ID NO : 198 a été effectuée sur une séquence synthétisée comprenant une répétition de 5 M2e SEQ ID NO : 173 (Lee et al) avec les amorces de SEQ ID NO : 174 et dd SEQ ID NO : 175 (588pb). Cette séquence M2e a été optimisée pour l'expression chez Toxoplasma gondii. L'amplification du troisième fragment de PCR SEQ ID NO : 199 a été effectuée sur l'ADN génomique de Toxoplasma gondii de la séquence codante de sagl (partie ancrage GPI) SEQ ID NO : 176 avec les amorces de SEQ ID NO : 177 et df SEQ ID NO : 178 (98pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 13 ci-dessous.
Tableau 13 : liste des amorces utilisées pour la construction des plasmides pUC 4G2 Icrel M2eGPI
Les fragments de PCR ont été directement clonés dans le plasmide p4G2 ICrel SEQ ID NO : 156 digéré par les enzymes Pmel et Notl (8344pb) avec la technique In- Fusion de Ozyme.
Plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179
Le site LoxP SEQ ID NO : 12 a été introduit par PCR dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel (8901 pb). Le fragment de PCR SEQ ID NO : 200 obtenu avec les amorces aa SEQ ID NO : 180 et ab SEQ ID NO : 181 (438pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 201 obtenu avec les amorces ac SEQ ID NO : 182 et ad SEQ ID NO : 183 (534pb) ont été clonés avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 14 ci-dessous.
Tableau 14 : liste des amorces utilisées pour l'introduction du site loxP
- Plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184
Le site loxN SEQ ID NO : 5 a été introduit par PCR dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel (8901 pb ). Le fragment de PCR SEQ ID NO : 202 obtenu avec les amorces aa SEQ ID NO : 180 et bb SEQ ID NO : 181 (438pb) et le fragment de PCR SEQ ID NO : 203 obtenu avec les amorces bc SEQ ID NO : 182 et ad SEQ ID NO : 183 (534pb) ont été clonés avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide PUC 4G2 Icrel M2eGPI SEQ ID NO : 164 digéré Pcil et Pmel. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 15 ci-dessous.
Tableau 15 : liste des amorces utilisées pour l'introduction du site loxN
Construction des souches Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI intégration ciblée ou aléatoire.
Intégration ciblée au site loxP
La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après F électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP.
Intégration ciblée au site loxN
La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN. Intégration aléatoire
La souche ToxoKO miel -3 KO 2G est électroporée avec 20 μg du plasmide linéarisé purifié pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179 ou pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphénicol 20 μΜ), 24 heures après F électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont analysés pour l'expression de la protéine de fusion SAG1 M2eGPI SEQ ID NO : 165 (analyse sur la population totale).
Validation Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI intégration ciblée par PCR
Intégration ciblée au site loxP
Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré les plasmides pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré le plasmide ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 204 (1719pb).
La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmic3 loxP. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ec SEQ ID NO : 189 et eb SEQ ID NO : 188 par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 205 (2704 pb).
Tableau 16 : liste des amorces utilisées pour la validation des clones
Amorce Séquence Amorce R Séquence
F
ea seq TUB SEQ ID NO : 187 eb seq 3utr SEQ ID NO : 188
MCS F AACCCGCGCAGAAGACATCC MCS R ATGGGGCACATGCTGCACGAA
ec CN3 SEQ ID NO : 189 eb seq 3utr SEQ ID NO : 188
AGAGGTTGACACCGACAAAG MCS R ATGGGGCACATGCTGCACGAA Intégration ciblée au site loxN
Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée l'un des plasmides. Pour valider des souches ayant intégré le plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17 ci-dessous. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 (1719pb) par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 204.
La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmicl loxN. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ed SEQ ID NO : 55 et eb SEQ ID NO : 54 (2366pb) par l'obtention du fragment SEQ ID NO : 206.
Tableau 17 : liste des amorces utilisées pour la validation des clones
Analyse par cytométrie en flux.
Le niveau d'expression de M2eGPI SEQ ID NO : 165 a été analysé pour différentes populations de parasites recombinants suite à un marquage spécifique avec un anticorps anti M2 (anti-influenza A virus M2 Protein antibody ab5416 - Abcam). L'expression du transgène M2eGPI est similaire ou légèrement supérieur pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN au locus de miel ou mic3 ) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire. Ce résultat démontre que la souche Toxo tgmicl-3 KO 2G est un vecteur d'expression optimisé pour l'expression de transgène. Exemple 5 : Construction de souches recombinantes de Toxo ts iclS KO exprimant la protéine CAT-GFP après intégration ciblée ou aléatoire du transgène cat-sfp
L'objectif de cette expérience est d'étudier le niveau d'expression du gène cat-gpf après intégration aléatoire ou ciblée au niveau du site LoxP ou LoxN du transgène.
Culture des parasites
Tous les tachyzoïtes de la souche de Toxoplasma gondii utilisés ont été produits en fîbroblastes humains (HFF) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine. Ils ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G.
Construction des plasmides
Plasmide pUC 4G2 Icrel CAT-GFP LoxP SEQ ID NO : 221
Le fragment CATGFP SEQ ID NO : 222 a été amplifié par PCR avec les amorces ca SEQ ID NO :223 et cb SEQ ID NO :224 (1488 pb) sur le pCATGFP SEQ ID NO : 9. Ce fragment de PCR a été cloné avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxP SEQ ID NO : 179 a été digéré par Pmel et Notl (8372pb- remplacement de M2eGPI par CATGFP). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 18 ci-dessous.
Tableau 18 : liste des amorces utilisées pour la construction des plasmides pUC 4G2 Icrel CAT¬
GFP
Plasmide pUC 4G2 Icrel CAT-GFP LoxN SEQ ID NO : 225
Le fragment CATGFP SEQ ID NO : 222 a été amplifié par PCR avec les amorces ca SEQ ID NO :223 et cb SEQ ID NO :224 (1488 pb) sur le pCATGFP SEQ ID NO : 9. Ce fragment de PCR a été cloné avec la technique In-Fusion de Ozyme dans le plasmide pUC 4G2 Icrel M2eGPI loxN SEQ ID NO : 184 a été digéré par Pmel et Notl (8372pb- remplacement de M2eGPI par CATGFP). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 18 ci-dessus.
Construction des souches Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP intégration ciblée ou aléatoire.
Intégration ciblée au site loxP
La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO : 221 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après F électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP loxP.
Intégration ciblée au site loxN
La souche ToxoKO micl-3KO 2G est électroporée avec 20 μg des plasmides circulaires purifié pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO : 225 et pTsagl Cre recombinase SEQ ID NO : 15 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont sous-clonés en plaque 96 puits sur une monocouche de cellules HFF et les clones d'intérêt sont identifiés par PCR après avoir effectué une extraction d'ADN génomique des clones d'intérêt. La souche obtenue est dénommée Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP loxN.
Intégration aléatoire
La souche ToxoKO miel -3 KO 2G est électroporée avec 20 μg du plasmide linéarisé purifié pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO : 221 ou pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO : 225 selon le protocole précédemment décrit. Après électroporation, les tachyzoïtes sont déposés sur une monocouche de cellules HFF en culture. Pour la sélection des mutants, le milieu de culture est remplacé et supplémenté par l'agent de sélection (chloramphémcol 20 μΜ), 24 heures après Γ électroporation. 10 à 15 jours après sélection, les parasites sont analysés pour l'expression de la protéine CATGFP SEQ ID NO : 120 (analyse sur la population totale).
Validation Toxo tgmicl-3 KO -2G CATGFP intégration ciblée par PCR
Intégration ciblée au site loxP
Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré les plasmides pUC 4G2 Icrel CATGFP loxP SEQ ID NO :221, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16 précédemment cité. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré le plasmide ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :226 (1647pb).
La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus Tgmic3 loxP. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ec SEQ ID NO : 189 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :227 (2600 pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16.
Intégration ciblée au site loxN
Deux PCR sont réalisées pour valider les clones ayant intégré de manière ciblée le plasmide. Pour valider des souches ayant intégré le plasmide pUC 4G2 Icrel CATGFP loxN SEQ ID NO :225, des analyses PCR sont effectuées à partir de l'ADN génomique extrait au DNAzol à partir d'un culot parasitaire constitué de 107 parasites. Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17 précédemment cité. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ea SEQ ID NO : 187 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :226 (1647pb). Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 16.
La seconde PCR permet de valider la localisation de l'insertion du plasmide au locus TgmicI loxN. Les clones ayant intégré l'un des plasmides ont été validés par PCR avec les amorces ed SEQ ID NO : 190 et eb SEQ ID NO : 188 et l'obtention d'un fragment SEQ ID NO :228 (2294 pb) . Les amorces utilisées pour les PCR sont détaillées dans le tableau 17. Analyse par cytométrie en flux
Le niveau d'expression de CAT-GFP SEQ ID NO : 120 a été analysé dans les différentes populations de parasites recombinants (Tableau 19). L'expression du transgène CATGFP est systématiquement légèrement supérieure pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN au locus de miel ou mic3 ) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire.
Tableau 19 : Intensité moyenne géométrique de fluorescence des souches recombinantes
CATGFP.
Ce résultat démontre que la souche Toxo tgmicl-3 KO est un vecteur d'expression optimisé pour l'expression de transgène.
Exemple 6 : Etude d'efficacité de la souche Neo ncmicl-3 KO- 2G dans la prévention de la néosporose létale dans un modèle murin
Dans cette étude, la souche vivante atténuée Neo ncmicl-3 KO- 2G a été testée comme un vaccin préventif de la néosporose. L'objectif est de déterminer si la souche vaccinale Neo ncmicl-3 KO- 2G prévient ou non, la dissémination et l'infection aiguë dans un modèle murin de létale de néosporose. Matériel et méthodes
Production de parasites Neo ncmicl-3 KO- 2G et de la souche Nc-1.
Les parasites Neo ncmicl-3 KO- 2G et Ne- inutilisés pour le challenge) sont produits sur un tapis confluent de cellules VERO (ATCC CCL81) dans un milieu complet contenant du DMEM 1.5 g/L NaHC03, 12% (v/v) SVF décomplémenté, 100UI/mL Pénicilline- 100UI/mL Streptomycine.
Avant infection du tapis cellulaire, les cellules sont entretenues indépendamment des parasites. A chaque passage de cellules VERO, le tapis est lavé trois fois avec 5 mL de HBSS, décollé avec lmL de trypsine pure, re-suspendues en milieu complet, distribuées à raison de
7,5.105 cellules pour 25cm2 de surface de culture. Les cellules sont incubées à 37°C avec 5%
C02 et sont disponible pour l'amplification parasitaire trois jours plus tard.
A J-4, le tapis cellulaire est infecté avec 1.106 parasites pour 25cm2 de culture cellulaire à confluence.
Les parasites vaccinaux sont récoltés 4 jours plus tard. Brièvement, le tapis cellulaire infecté par les parasites est lavé avec du milieu complet afin d'enlever les parasites extracellulaires. Le tapis cellulaire, contenant les parasites, est scrappé et passé à travers une seringue de 27G. La préparation est centrifugée 10 min à 1500 g. Le surnageant est éliminé et le culot resuspendu dans une solution de DMEM additionnée de 0.1 M Sucrose, de 0.1 M de Tréhalose, de 2.5% d'inuline, de 0.1M de GSH, de 1% de proline et de 1% d'ectoïne. La solution est préparée extemporanément le jour de la vaccination. La concentration exacte de parasites, ainsi que la viabilité sont estimées par le comptage en cytométrie en flux des parasites ayant incorporés ou non de l'iodure de propidium (P4864-10ML, Sigma). La solution finale préparée a été diluée pour contenir 2.107 parasites par millilitre.
Design de l 'étude
Les souris ont été immunisées à J0 par voie intra-péritonéale (IP) avec une dose unique de 1.107 tachyzoïtes de la souche Neo ncmicl-3 KO-2G. Des souris contrôles ont été inoculées par le véhicule. Deux souris de chaque fond génétique ont été inoculées par groupe, soit quatre souris par groupe.
A J60, les souris immunisées ont été infectées par voie intra-péritonéale à la dose de létale de 2.107 tachyzoïtes de souche virulente Nc-1. Deux critères sont utilisés pour évaluer l'efficacité du vaccin, l'évaluation du taux de mortalité et la réponse humorale dirigée contre Neospora caninum à J30 post vaccination. Animaux
Huit souris C57BL/6 et Balb/C de statut EOPS (Exempt d'organisme pathogène spécifique) ont été inclus dans l'étude (Janvier Labs, ...). Elles ont été élevées en portoirs ventilés dans une animalerie A2, en toute conformité avec les normes éthiques et réglementaires européennes en vigueur.
Dosage IgG par ELISA
La production des IgG totales spécifiques de N. caninum, au niveau sérique a été déterminée par ELISA. L'extrait parasitaire total de la souche Nc-1 a été dilué dans du tampon carbonate/bicarbonate 0.05M pH9,6 afin d'obtenir une concentration finale de l(^g/mL. 100 par puits de ce mélange ont été déposés sur une plaque 96 puits à fond plat (Nunc MaxiSorp). Après une nuit à +4°C, les puits ont été lavés trois fois avec 300μΕ de tampon PBS, Tween 20 0,05% (v/v), puis saturés avec 200μί de PBS, Tween 20 0,05%, BSA 4% (p/v) pendant lh30 à 37°C. Après 3 lavages avec 300μΕ par puits de PBS, Tween 20 0.05%>, ΙΟΟμί par puits de sérum d'intérêt, préalablement dilué au l/50e dans du PBS, Tween 20 0,05%), ont été déposés sur la plaque et dilués en cascade par série de 2 en 2 (dépôt sur 11 puits/sérum d'intérêt). En contrôle, (i) un sérum, dilué de la même façon que précédemment et dont le titrage en IgG totales spécifiques est connu et important, servira de témoin de référence et (ii) un pool de sérum dilué au l/50e provenant des souris inoculées par les véhicules servira de témoin négatif. Enfin, ΙΟΟμί de PBS, Tween 20 0.05%> ont également été déposés dans 8 puits afin de servir de témoin « blanc ». Après lh d'incubation à 37°C et trois lavages avec 300μΕ par puits de PBS, Tween 20 0.05%>, ΙΟΟμί par puits de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562) et dilué au l/5000e dans du PBS-Tween 20 0.05%> ont été déposés. Après lh d'incubation à 37°C et trois lavages avec 300μΕ par puits de PBS, Tween 20 0.05%> suivi de trois lavages avec 300μΕ par puits de ΓΗ20 mQ, la révélation a été réalisée par ajout de ΙΟΟμί par puits d'une solution de para-nitrophénylphosphate disodique (PnPP) (Sigma) diluée à lmg/mL dans un tampon de 1M Diethanolamine-HCl pH9.8. Après 60 min d'incubation à +24°C et à l'abri de la lumière, l'absorbance a été mesurée à avec une contre- lecture à grâce à un lecteur de plaque (Infinité M200 Pro NanoQuant, Tecam). Les valeurs de D.O. ont été retranchées à la D.O. moyenne du témoin « blanc ». Les taux d'IgG totaux sériques spécifiques de Neospora caninum ont été exprimés sous forme de titres d'anticorps. Deux méthodes ont été utilisées pour le titrage. Le titre en IgG correspond à l'inverse de la plus forte dilution du sérum d'intérêt dont la D.O. est au moins 2,5 fois supérieure à celle obtenue avec le témoin négatif, ou dont la D.O. a été de 0,2.
Résultats
L'efficacité de Neo ncmicl-3 KO-2G a été estimé sur un modèle murin létale. Signe clinique
Après vaccination, les animaux vaccinés n'ont manifesté aucun signe clinique spécifique, aucune altération du poids et aucune augmentation significative de la température corporelle, suggérant une bonne tolérance des souris vis-à-vis de la souche Neo ncmicl-3 KO-2G.
Evaluation de la réponse humorale
A J30 post vaccination, des prélèvements de sang ont été effectués et le titre en anticorps IgG spécifique a été mesuré par ELISA pour estimer la qualité de la réponse immunitaire post-vaccination. Les résultats sont présentés figure 12.
Aucune des souris non vaccinées n'a montré de titre positif en anticorps. A l'inverse, toutes les souris vaccinées, quel que soit leur fond génétique ont séroconverti et ont présenté un titre en anticorps signifîcativement différent de celui des animaux non vaccinés.
Efficacité de la vaccination sur la survie des souris
L'efficacité réelle de la vaccination est évaluée par un challenge infectieux avec une souche virulente (Nc-1). A J60 post vaccination, les souris ont été inoculées avec la souche sauvage Nc-1 à une dose létale, soit à 2.107 tachyzoïtes par animal. Toutes les souris ayant reçu la solution contrôle sont mortes au cours de l'expérience, soit 100% de létalité. En revanche, 100 % des souris vaccinées ont survécu jusqu'à la fin de l'expérimentation, soixante jours plus tard. De plus, aucune de ces souris vaccinées n'a manifesté de signes cliniques significatifs, suggérant un effet protecteur complet, à la fois sur la morbidité et la mortalité.
Les résultats de cette expérimentation démontrent une réponse immunitaire claire et un effet protecteur du vaccin à base de la souche Neo ncmicl-3 KO-2G vis-à-vis d'un challenge létal avec une souche sauvage de Neospora caninum Nc-1. Exemple 7 : Etude d'efficacité de la souche Toxo tgmicl-3 KO- 2G dans la prévention de la toxoplasmose congénitale dans un modèle murin
Le but principal de cette étude est d'étudier l'efficacité de la souche vaccinale Toxo tgmicl-3 KO - 2G à l'encontre de la toxoplasmose congénitale dans un modèle murin.
Matériel et méthodes
Production de parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G
Les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G sont produites en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 12% de sérum de veau fœtal australien (SVF aust). Les tachyzoïtes ont été récoltés dans le surnageant. Les parasites ont été énumérés sur cellule de Malassez et dilués dans du milieu DMEM pour atteindre une concentration de 500 parasites par mL.
Design de l 'étude
La vaccination (100 tachyzoïtes dans un volume de 200 de DMEM) est effectuée sur les souris femelles à J0 par voie sous-cutanée à l'aide d'une aiguille de 27G.
Avant injection (J-2) et 28 jours post-injection, du sang veineux périphérique a été prélevé et laissé à température ambiante pour une durée minimum d'une heure. Le sérum a été obtenu par centrifugation à 5000 g durant 10 minutes. Les séra préparés ont été conservés à -20°C. Huit semaines après la vaccination, 23 souris séroconverties (pour T. gondii) par lot ont été mises aux maies puis ont été challengées à mi gestation per os avec 15 kystes de la souche T. gondii 76K. Les mères sont ensuite isolées, les mise-bas suivies. Les souriceaux sont suivis sur une période d'environ un mois puis euthanasiés. Un petit nombre de souriceaux seront analysés après sacrifice. Puis les mères seront sacrifiées, leur rate remise en culture afin d'étudier la réponse cellulaire.
Animaux
Le nombre de souris par lot nécessaire à l'étude est de 16 souris gestantes pour permettre une étude statistique. L'analyse de la réponse immunitaire chez 16 souris gestantes, nécessite de vacciner 50 souris par lot au total en prenant compte des paramètres suivants : le rendement de gestation et la potentielle mortalité liée à l'injection du parasite (la souris est un animal relativement sensible à une injection de Toxoplasma gondii et la vaccination permettant d'obtenir une séroconversion efficace peut générer de la mortalité). Ainsi les lots vaccinés contiennent 50 animaux au départ. Les souris des lots 1 et 2 n'étant pas vaccinées, 23 souris sont suffisantes pour ces lots. L'analyse est effectuée sur 16 souris gestantes par lot. Les souris surnuméraires sont sacrifiées.
Tableau 20 : Répartition des animaux dans les différents lots.
Au total 146 souris SWISS femelles de 8 semaines ont été inclues dans l'étude et sont reparties dans différents lots (tableau 20). Les animaux ont été hébergés et manipulés, dans le strict respect des normes éthiques en vigueur en France et des normes d'élevage imposées par la réglementation européenne. L'alimentation et l'eau de boisson ont été distribuées ad-libitum durant toute la durée de l'expérimentation.
Après une période de 7 jours d'acclimatation, les souris ont été identifiées individuellement et réparties aléatoirement en 4 groupes.
Dosage IgG et IgM par ELISA
Une plaque 96 puits a été adsorbée avec de l'extrait protéique de la souche RH de Toxoplasma gondii (10 μg/ml) dilué en tampon carbonate pH 9,6 pendant une nuit à 4 °C. Après 2 lavages en PBS IX/Tween 0,05% et un lavage en PBS IX, la plaque a été saturée avec du PBS 3% BSA pendant lh30 à température ambiante. Ensuite, pour le titrage, les dilutions sériées 2 de 2 en, en PBS + 3% BSA des sera murins à tester ont été déposées.
Après 1 h d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée 2 fois (PBS IX/Tween 0,05%>), puis l'anticorps secondaire (anti-mouse IgG couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A3562) ou anti-mouse IgM couplé à la phosphatase alcaline (Sigma A9688) est ajouté et dilué au 1/30 000 en PBS ΙΧ/Tween 0,05%, avant une nouvelle incubation à 37 °C durant lh30. Après 2 lavages en PBS lX/Tween 0,05% et un lavage en PBS IX, le pNPP (4-Nitrophenyl phosphate disodium sait hexahydrate) a été utilisé à une concentration de 1 mg/ml dilué en tampon DEA-HCL pour la révélation, et la plaque a été incubée 15 à 20 minutes à température ambiante. La réaction est stoppée avec l'ajout de solution stop 3N NaOH. L'absorbance à 405 nm a été lue via le lecteur de plaque Nanoquant Infinité M200 PRO (TECAN).
Dosage par ELISA d'IFN-γ sécrété par des splénocytes stimulés in vitro
Après chaque prélèvement, la rate a été broyée sur un tamis 100 μιη placé au-dessus d'un tube
Falcon de 50 ml avec ajout de 5 ml de milieu RPMI. Le broyât a ensuite été centrifugé 10 min à 400 g. Le culot a été repris dans 300 μΐ de RPMI, puis 1 ml de tampon de lyse a été ajouté.
Le tube a été incubé 3 min à 4 °C, et la réaction a été stoppée avec ajout de PBS 1X/SVF 2% en excès, puis les cellules ont été centrifugées 10 min à 400 g. Les culots de cellules obtenus ont ensuite été repris dans 5 ml de milieu de stimulation. Les cellules ont été dénombrées sur cellule de Malassez en présence de bleu trypan qui colore les cellules mortes.
Les cellules ont été mises en culture en plaques 96 puits à raison de 5.105 cellules/puit.
Différents stimulants ont pu être ajoutés : des extraits antigéniques de la souche RH de
Toxoplasma gondii (10 μg/ml) ou de la concanavaline A (5 μg/ml) qui servent de témoin positif. Les plaques ont été mises en culture en étuve à 37 °C, 5%> de C02 pour 72 h.
Le dosage d'IFN-γ a été réalisé sur les surnageants de culture des splénocytes en présence de ces différents stimulants. Le dosage a été effectué par un test ELISA selon le protocole du kit
« Mouse IFN-γ ELISA Ready-set-go® (Ebiosciences).
Evaluation du nombre de kystes présents dans le cerveau des souris
Le prélèvement des cerveaux des mères et des souriceaux est effectué pour déterminer la présence ou non de kystes cérébraux. Suite au sacrifice des souris, les cerveaux sont prélevés et broyés. Le nombre de kystes est alors dénombré par observation microscopique de la totalité du broyât de cerveau. Résultats
Efficacité de la vaccination sur les souris mères
Survie et signes cliniques suite à la vaccination avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G Les souris sont observées quotidiennement à partir de la vaccination (J0) et jusqu' au 33eme jour post vaccination et les signes cliniques sont notés. Un score clinique global est calculé selon le tableau 21 de score des signes. Les résultats sont présentés figure 13-A.
Tableau 21 : tableau de score des signes cliniques observés pour les souris
Les souris des lots non vaccinés n'ont pas présenté de signes cliniques alors que les souris des lots vaccinés ont présenté quelques signes cliniques modérés avec un score clinique inférieur à 2. Le pic des signes cliniques a été observé à J18. Ces signes cliniques ont été observés jusqu'à J33.
Il est possible d'observer en fonction su site de l'injection et des souches parasitaires de la mortalité chez les souris SWISS. Un taux de survie de 90% (10 souris mortes/100 souris pour les lots 3 et 4) est obtenu à J30 pour une vaccination des souris avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G. Evaluation de la réponse humorale adaptative
Le dosage des IgG sériques dirigés contre les protéines de Toxoplasma gondii permet d'observer très nettement que les sera issus des souris avant injection ne produisent pas d'anticorps spécifiques de cette souche. La vaccination avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G permet une forte production d'IgG à J28 (lot 3 et 4) et J129 (lot 3). Comme attendu, le challenge (souche 76K) des souris non vaccinées (lot 2) permet également la production d'IgG. La production d'IgG pour le lot vacciné est renforcée par le challenge (lot 4 à J129). Les résultats sont présentés figure 13-B.
Evaluation de la réponse cellulaire spécifique
Afin d'évaluer la mise en place d'une réponse immunitaire cellulaire, l'IFN-γ (cytokine indiquant la mise en place d'une réponse de type Thl) sécrété dans les surnageants de culture des splénocytes suite à divers stimuli, a été dosé 72 h après la mise en culture.
Comme attendu, la concentration d'IFN-γ est augmentée après un challenge par rapport au groupe contrôle. Pour l'ensemble des souris vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G (ayant été challengées (lot 4) ou non (lot3)), des concentrations importantes d'IFN-γ sont mesurées lorsque les cellules sont stimulées avec des extraits antigéniques de la souche RH de Toxoplasma gondii, par rapport aux souris non vaccinées. Cela suggère une mise en place d'une réponse cellulaire induite par la vaccination. Les résultats sont présentés figure 13-C.
Comptage du nombre de kystes présents dans le cerveau des souris mères
Les mères ont été sacrifiées à J129. Le nombre de kystes est obtenu par observation microscopique de la totalité du broyât de cerveau (4 cerveaux par lot). Aucun kyste n'est détecté pour le lot 1 (non vacciné, non challengé) alors qu'après challenge, une moyenne de 2250,75 kystes par cerveau est obtenue pour le lot 2 (non vacciné, challengé). Dans le lot 3 (uniquement vacciné), un nombre très faible de kystes est observé (0,75 kyste par cerveau). Dans le 4eme lot (vacciné puis challengé), on observe une forte diminution du nombre de kystes par rapport au lot non vacciné (lot 2), avec une moyenne de 52 kystes par cerveau. Les souris vaccinées avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G forment très peu de kystes cérébraux suite à un challenge avec la souche T. gondii 76K. Les résultats sont présentés figure 13-D. Efficacité de la vaccination sur les souriceaux
Efficacité sur la prolifération et le sex-ratio
Une prolifïcité similaire a été obtenue pour tous les groupes montrant que la vaccination et/ou le challenge n'a pas affecté le nombre de souriceaux par portée. En revanche, un changement du sex-ratio après une infection à T. gondii a déjà été décrit (Kankova et al, parasitology 2007). Nous observons un nombre réduit de mâles dans le groupe contrôle après challenge alors que cela n'est pas observé pour le groupe vacciné, suggérant que la vaccination prévient le changement du sex-ratio. Les résultats sont présentés figures 13-E et 13-F.
Efficacité sur la mortinatalité et la mortalité
La mortinatalité et la mortalité ont été augmentées suite au challenge en absence de vaccination (lot 2 par rapport au lot 1). Pour le lot uniquement vacciné (lot 3), la mortinatalité et la mortalité sont à un niveau très faible, proche du groupe témoin (lot 1). Le groupe vacciné et challengé (lot 4) présente une réduction significative du nombre de la mortinatalité et la mortalité par rapport au groupe non vacciné challengé (lot 2). La vaccination des mères protège donc la descendance d'une augmentation de la mortinatalité et la mortalité suite à un challenge. Les résultats sont présentés figures 13-G et 13-H.
Efficacité sur la survie des souriceaux
Les souriceaux ont été suivis sur une période de 32 jours afin d'étudier l'efficacité de la vaccination.
La survie des souriceaux diminue signifîcativement pour le lot dont les mères ont été challengées mais non vaccinées. Les autres groupes présentent un taux de survie proche de celui obtenu pour le lot contrôle (lot 1). La vaccination des mères augmente donc le taux de survie des souriceaux suite à un challenge au cours de la gestation. Les résultats sont présentés figure 13-1.
Efficacité sur les signes cliniques des souriceaux.
Les souriceaux sont observés quotidiennement pendant 30 jours et les signes cliniques sont notés. Un score clinique global est calculé selon le tableau de score des signes (voir ci-après, tableau 22). Mobilité Score 2
Normal 0
Limitée 1
Immobile 2
Isolement Score -1
Pas d'isolement 0
Isolement de la mère/ du nid/ des souriceaux 1
Croissance Score ; 1
Normal 0
Croissance ralentie 1
Tableau 22 : tableau de score des signes cliniques observés pour les souriceaux
Les souriceaux issus du groupe challengé (lot 2) présentent un score clinique plus élevé que les souriceaux du groupe témoin (lot 1). Ce score clinique est notamment dû à une croissance ralentie des souriceaux dans ce groupe. Pour les autres lots (vacciné ou vacciné puis challengé), le score clinique est similaire au groupe témoin. La vaccination des mères a permis d'éviter le retard de croissance induit par le challenge chez les souriceaux. Les résultats sont présentés figure 13-J.
Evaluation de la réponse humorale immature : IgM
Les IgM ne peuvent passer la barrière placentaire mais pourrait passer à la descendance via le lait maternel. Comme l'IgM a une demi vie de 5 jours, le dosage d'IgM à 32 jours reflète l'immunité des souriceaux développés en réponse à T. gondii (souche vaccinale ou souche de challenge) transmis par la mère. La réponse humorale développée par les souriceaux (en réponse à la vaccination ou le challenge de la mère) est donc évaluée par dosage ELISA de l'immunoglubuline IgM à 32 jours d'âge. Les résultats sont présentés figure 13-K.
Le titre en IgM est augmenté pour les souriceaux du groupe issu des souris challengées (lot 2) en comparaison avec ceux issu des souris non challengées (lot 1). Pour le groupe seulement vacciné (lot 3), le titre en IgM est proche du seuil de détection, ce qui indique une absence de transmission verticale de la souche aux souriceaux. Pour le groupe vacciné et challengé (lot 4), le titre d'IgM dosé pour les souriceaux est signifîcativement réduit en comparaison du titre obtenu pour les souriceaux issus du groupe challengé (lot 2). La vaccination des souris a ainsi permis de réduire la transmission verticale de la souche de challenge aux souriceaux. La souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a ainsi permis la mise en place chez les souris d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre le parasite T. gondii. La vaccination des souris avec la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a permis une diminution significative de la charge parasitaire cérébrale observée après un challenge avec la souche virulente 76K. De plus la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a une bonne innocuité. Enfin la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G a permis de protéger la descendance d'une toxoplasmose congénitale (après un challenge avec la souche virulente 76K à mi- gestation) avec une diminution de la mortinatalité et de la mortalité, un meilleur score clinique pour les souriceaux.
Exemple 8 : Etude d'innocuité et d'immunogénicité des souches Toxo tgmicl-3 KO- 2G exprimant l'antigène M2eGPI du virus Influenza dans un modèle murin
L'objectif de cette expérimentation est de déterminer si la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant l'antigène M2eGPI du virus Influenza permet l'obtention d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire envers le vecteur Toxoplasma gondii et contre l'antigène viral ciblé.
Matériel et méthode
Production de parasites Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant l'antigène M2eGPI du virus Influenza
Les souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant l'antigène du virus Influenza (Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN et Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI population totale-insertion aléatoire - exemple 4) sont produites en fibroblastes humains (HFF Hs27 ATCC CRL-1634) cultivés en milieu minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal (S VF), 2mM glutamine, 100 U/mL de pénicilline et lOO U/mL de streptomycine. Les tachyzoïtes ont été récoltés après lyse mécanique des cellules hôtes par 3 passages en seringue 25G. Les parasites ont été énumérés sur cellule de Malassez et dilués dans du milieu DMEM pour atteindre une concentration de 500 parasites par mL. Animaux
Au total 45 souris SWISS femelles de 6 semaines ont été inclues dans l'étude. Les animaux ont été hébergés et manipulés, dans le strict respect des normes éthiques en vigueur en France et des normes d'élevage imposées par la réglementation européenne. L'alimentation et l'eau de boisson ont été distribuées ad-libitum durant toute la durée de l'expérimentation.
Après une période de 15 jours d'acclimatation, les souris ont été identifiées individuellement et réparties aléatoirement en 5 groupes.
Lot 1 : Toxo tgmicl-3 KO - 2G (n=10)
Lot 2 : Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP (n=10)
Lot 3 : Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN (n=10)
Lot 4 : Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI population totale-insertion aléatoire (n=10)
Lot 5 : naïf (n=5)
A JO, 100 tachyzoïtes ont été injectés en intra-péritonéal dans un volume de 200 de DMEM. Les animaux ont ensuite été suivis et sacrifiés 5 semaines post-injection (J35) et les rates ont été prélevées. Avant (J-l) et 34 jours post-injection, du sang veineux périphérique a été prélevé et laissé à température ambiante pour une durée minimum de 30 minutes. Le sérum a été obtenu par centrifugation à 3 000 g durant 10 minutes. Les séra préparés ont été conservés à -20°C.
Dosage IgG par ELISA
Une plaque 96 puits a été adsorbée avec un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 μg/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion saglM2eGPÏ ou de l'extrait protéique de Toxo tgmicl-3 KO - 2G (10 μg/ml) dilué en tampon carbonate pH 9,6 pendant une nuit à 4 °C. Après lavages en PBS IX/Tween 0,05%, la plaque a été saturée avec du PBS IX/Tween 0,05% - BSA 4% pendant lh30 à 37 °C. Ensuite, pour le titrage, les dilutions sériées 2 de 2 en, en PBS IX/Tween 0,05%> des sera murins à tester ont été déposées. Après 1 h d'incubation à 37 °C, la plaque a été lavée, puis l'anticorps secondaire (IgG anti-mouse IgG couplé à la phosphatase alcaline) est ajouté et dilué au 1/30 000 en PBS IX/Tween 0,05%>, avant une nouvelle incubation à 37 °C durant lh30. Après lavages, le pNPP a été utilisé à une concentration de 1 mg/ml dilué en tampon DEA-HCL pour la révélation, et la plaque a été incubée 1 h à 37 °C. L'absorbance à 405 nm de chaque puits avec une contre lecture à 620 nm a été lue via le lecteur de plaque Nanoquant Infinité M200 PRO (TECAN). Dosage par ELISA d'IFN-γ sécrété par des splénocytes stimulés in vitro
Après chaque prélèvement, la rate a été broyée sur un tamis 100 μιη placé au-dessus d'un tube Falcon de 50 ml avec ajout de 5 ml de milieu RPMI. Le broyât a ensuite été centrifugé 10 min à 400 g. Le culot a été repris dans 300 μΐ de RPMI, puis 1 ml de tampon de lyse a été ajouté. Le tube a été incubé 3 min à 4 °C, et la réaction a été stoppée avec ajout de PBS 1X/SVF 2% en excès, puis les cellules ont été centrifugées 10 min à 400 g. Les culots de cellules obtenus ont ensuite été repris dans 5 ml de milieu de stimulation. Les cellules ont été dénombrées sur cellule de Malassez en présence de bleu trypan qui colore les cellules mortes.
Les cellules ont été mises en culture en plaques 96 puits à raison de 5.105 cellules/puit. Différents stimulants ont pu être ajoutés : des extraits antigéniques de Toxo tgmicl-3 KO - 2G (10 μg/ml), un mix de 4 peptides M2e synthétiques à 10 μg/mL (Anaspec) correspondant aux 4 M2e présents dans la construction de la protéine de fusion saglM2eGPI ou de la concanavaline A (5 μg/ml) qui sert de témoin positif. Les plaques ont été mises en culture en étuve à 37 °C, 5% de C02 pour 72 h.
Le dosage d'IFN-γ a été réalisé sur les surnageants de culture des splénocytes en présence de différents stimulants. Le dosage a été effectué par un test ELISA selon le protocole du kit « Mouse IFN-γ ELISA Ready-set-go® (Ebiosciences).
Résultats
Survie et signes cliniques
La plupart des souris présentent des signes cliniques tels que le poil ébouriffé, un gonflement de l'abdomen et une prostration à l'exception des souris n'ayant pas reçu de souches parasitaires.
Evaluation de la réponse humorale adaptative envers le vecteur Toxo tgmicl-3 KO - 2G Le dosage des IgG sériques dirigés contre les protéines de Toxo tgmicl-3 KO - 2G permet d'observer très nettement que les sera issus des souris avant injection ne produisent pas d'anticorps spécifiques de cette souche. Concernant les sera prélevés 34 jours après l'injection, une forte augmentation de l'absorbance synonyme de la séroconversion des souris suite à la vaccination par Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou une des souches dérivées est observée. Une grande majorité des souris sont séroconverties pour la toxoplasmose. Evaluation de la réponse humorale adaptative envers l'antigène M2e d'Influenza
À la suite de l'injection des souches Toxo tgmicl-3 KO - 2G exprimant M2eGPL on observe une production d'anticorps spécifique de l'antigène M2e exprimé par les souches Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN et Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI population totale-insertion aléatoire, mais pas de production d'anticorps spécifique de l'antigène M2e pour la souche Toxo tgmicl-3 KO - 2G.
L'expression du transgène M2eGPI étant similaire ou légèrement supérieur pour des clones dont le transgène est inséré de manière ciblée (localisé au niveau des cicatrices LoxP et LoxN) que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire (exemple 4), une réponse humorale adaptative envers l'antigène similaire ou légèrement supérieure est obtenue pour les souches Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxP, Toxo tgmicl-3 KO -2G M2eGPI loxN que pour des populations dont le transgène est inséré de manière aléatoire.
Evaluation de la réponse cellulaire spécifique de Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou l'antigène M2e d'Influenza
Afin d'évaluer la mise en place d'une réponse immunitaire cellulaire, l'IFN-γ (cytokine indiquant la mise en place d'une réponse de type Thl) sécrété dans les surnageants de culture des splénocytes suite à divers stimuli, a été dosé 72 h après la mise en culture.
Pour l'ensemble des souris vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI (insertion ciblée en loxP, loxN ou intégré de manière aléatoire), des concentrations importantes d'IFN-γ sont mesurées lorsque les cellules sont stimulées avec des extraits antigéniques de Toxo tgmicl-3 KO - 2G , par rapport aux souris non vaccinées.
Concernant les cellules restimulées avec M2e, aucune production d'IFN-γ n'est détectable pour l'ensemble des souris, qu'elles soient naïves, vaccinées avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G ou avec Toxo tgmicl-3 KO - 2G M2eGPI (insertion ciblée en loxP, loxN ou intégré de manière aléatoire).
Il a donc été observé la mise en place d'une réponse immunitaire humorale vis-à-vis de la construction M2eGPI et une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre le vecteur Toxo tgmicl-3 KO - 2G.

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche mutante de Sarcocystidae dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment la Cre-recombinase, lesdits sites de recombinaison spécifique étant au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique notamment de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété.
2. Souche mutante selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Neospora spp., en particulier une souche de l'espèce Neospora caninum.
3. Souche mutante selon la revendication 1, dans laquelle ladite souche mutante est une souche du genre Toxoplasma spp., en particulier une souche de l'espèce Toxoplasma gondii.
4. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les deux gènes miel et mic3 sont délétés, contenant deux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété, et ne contenant pas d'ADN hétérologue, autres que des ADN hétéro logues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase, et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés,
ledit ADN hétérologue étant flanqué :
• d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,
• d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et,
et les moyens nécessaires à sa transcription, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés, ledit ADN hétérologue codant pour une protéine et étant flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus du gène miel délété ou à celui au locus du gène mic3 délété, et
d'un second site de recombinaison spécifique identique audit premier site de recombinaison spécifique, correspondant au site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique, au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété et, et les moyens nécessaires à l'expression protéique du susdit ADN hétérologue, notamment ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique étant la Cre-recombinase et, les sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant choisis parmi : lox N de SEQ ID NO : 5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO : 68.
7. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, 5 et 6, contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété, différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique, ladite enzyme étant la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes miel et mic3 délétés et contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la
Cre-recombinase au locus du gène miel délété,
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit second ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lesdits trois sites de recombinaison spécifique A, B et C étant choisis parmi les sites suivants : lox N de SEQ ID NO :5, lox P de SEQ ID NO : 12 et lox 2272 de SEQ ID NO :68, de manière à ce que
ledit site A et ledit site B sont différents, et
ledit site C est identique audit site A ou audit site B ; en particulier tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, et
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ; ou tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO :5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12, et
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B,
ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A ;
ou tels que
- ledit site A est le site lox P SEQ ID NO : 12
- ledit site B est le site lox N SEQ ID NO :5, et
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO :5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B.
8. Souche mutante selon l'une des revendications 3 à 7, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp.,
et dans laquelle le gène roplôl est délété et contient un site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, ce susdit site étant différent dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène miel délété et dudit site de recombinaison spécifique situé au locus du gène mic3 délété
et ladite souche mutante comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène roplôl délété,
ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène roplôl délété, étant flanqué en amont par le susdit site de recombinaison spécifique de l'enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, notamment dans laquelle ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est, la Cre-recombinase, et ledit site de recombinaison spécifique d'une enzyme permettant une recombinaison spécifique au locus dudit gène roplôl délété, est un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase choisi parmi les sites suivants : lox N SEQ ID NO : 5, lox P SEQ ID NO : 12 et lox 2272 SEQ ID NO : 68, ce site de recombinaison spécifique étant différent des sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété et au locus du gène mic3 délété, ladite souche contenant trois sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement :
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la
Cre-recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène roplôl délété
en particulier tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5,
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.
9. Souche mutante selon l'une des revendications 3, 5 à 8, dans laquelle ladite souche mutante est une souche mutante de Toxoplasma spp., ladite enzyme permettant une recombinaison spécifique est la Cre-recombinase, dans laquelle le gène roplôl est délété et ladite souche contient un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus dudit gène roplôl délété,
ladite souche contenant quatre sites de recombinaison spécifique qui sont respectivement:
le site A correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété
le site B correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et
le site C correspondant audit second site de recombinaison spécifique qui flanque ledit ADN hétérologue identique audit premier site de recombinaison spécifique, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase correspondant au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) ou au susdit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) le site D correspondant au site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène roplôl délété
tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
ledit site C est le site lox N SEQ ID NO : 5, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site A, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68;
ou tels que
- ledit site A est le site lox N SEQ ID NO : 5
- ledit site B est le site lox P SEQ ID NO : 12,
ledit site C est le site lox P SEQ ID NO : 12, ledit premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase étant le site B, et
- ledit site D est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.
10. Souche mutante selon l'une des revendications 1 à 3, 5 à 9, dans laquelle ledit ADN hétérologue code pour un antigène hétérologue immunogène de virus, de parasite ou de bactérie, et est en particulier constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 173, codant pour l'antigène du virus Influenza SEQ ID NO : 167.
11. Souche mutante selon l'une des revendications 3 à 10, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Toxoplasma gondii choisi parmi
- une souche dans laquelle
o le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N SEQ ID NO : 5 et
o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12.
- une souche dans laquelle le gène mic 1, le gène mic 3 et le gène roplôl sont délétés, et comprenant un gène codant pour la protéine GRA15II, ainsi que les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine, au locus dudit gène roplôl délété, ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus dudit gène roplôl délété, étant flanqué en amont par un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase,
dans laquelle
o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox N SEQ ID NO : 5, et
o le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox P SEQ ID NO : 12, et
o ledit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase qui flanque en amont ledit gène codant pour la protéine GRA15II au locus du gène roplôl délété, est le site lox 2272 SEQ ID NO : 68.
12. Souche mutante selon l'une des revendications 2 ou 4, dans laquelle ladite souche mutante est une souche de Neospora caninum et dans laquelle le gène miel et le gène mic3 sont délétés et dans laquelle
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété est le site lox P SEQ ID NO : 12 et
le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété est le site lox N SEQ ID NO : 5.
13. Utilisation d'une souche mutante selon l'une des revendications 1 à 4 et 12, ne contenant pas d'ADN hétérologue différent des ADN hétérologues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, pour l'insertion ciblée d'un ADN hétérologue, à l'exception d'une utilisation à des fins thérapeutiques.
14. Souche mutante de Sarcocystidae selon l'une des revendications 1 à 12, pour son utilisation comme médicament, en particulier comme vaccin ou immunostimulant.
15. Souche mutante de Toxoplasma spp., dans laquelle les gènes miel, mic3 et roplôl sont délétés, contenant trois sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des susdits gènes délétés, le site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété étant différent de celui au locus du gène mic3 délété et le site de recombinaison spécifique au locus du gène roplôl délété étant différent des sites de recombinaison spécifique situés aux loci des gènes miel et mic3 délétés et ladite souche contenant un ADN hétérologue au locus du gène miel délété ou au locus du gène mic3 délété ou au locus du gène roplôl délété, ledit ADN hétérologue étant différent des ADN hétéro logues correspondant aux sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus respectif de chacun des gènes miel, mic3 et ropl 61 délétés,
de telle façon que :
• lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène miel délété (site A), et
d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène miel délété (site A),
- lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène mic3 délété (site B), et
d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène mic3 (site B) délété,
o lorsque ledit ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, il est flanqué :
- d'un premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase, au locus du gène roplôl délété (site D), et
- d'un second site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase (site C), identique au premier site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase situé au locus du gène roplôl (site D) délété, ladite souche comportant les éléments nécessaires à la transcription dudit ADN hétérologue, ou les moyens nécessaires à l'expression dudit ADN hétérologue lorsque ledit ADN hétérologue code pour au moins une protéine, ladite souche mutante contenant alors quatre sites de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase définis de la manière suivante :
le site A correspondant audit site de recombinaison spécifique de la
Cre-recombinase au locus du gène miel délété le site B correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété, et le site C correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène miel délété (site A) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène mic3 délété (site B) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété, ou correspondant à un site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus du gène roplôl délété (site D) lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété
le site D correspondant audit site de recombinaison spécifique de la Cre-recombinase au locus dudit gène roplôl délété tels que, lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène miel délété,
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68;
ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène mic3 délété,
ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site C correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12
ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68;
ou tels que lorsque l'ADN hétérologue est inséré au locus du gène roplôl délété, ledit site A correspond à un site lox N, SEQ ID NO : 5
ledit site B correspond à un site lox P, SEQ ID NO : 12 ledit site C correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68 ledit site D correspond à un site lox 2272, SEQ ID NO : 68.
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