EP3649214B1 - Complexes de terbium et de dysprosium avec antenne optimisée, utiles comme marqueurs luminescents - Google Patents

Complexes de terbium et de dysprosium avec antenne optimisée, utiles comme marqueurs luminescents Download PDF

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EP3649214B1
EP3649214B1 EP18742729.9A EP18742729A EP3649214B1 EP 3649214 B1 EP3649214 B1 EP 3649214B1 EP 18742729 A EP18742729 A EP 18742729A EP 3649214 B1 EP3649214 B1 EP 3649214B1
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EP
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group
groups
formula
lanthanide
complexes
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EP3649214A1 (fr
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Amandine ROUX
Anh-Thy BUI
Olivier Maury
Chantal Andraud
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/003—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table without C-Metal linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D255/00—Heterocyclic compounds containing rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D249/00 - C07D253/00
    • C07D255/02—Heterocyclic compounds containing rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D249/00 - C07D253/00 not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
    • C09K11/06—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/18—Metal complexes
    • C09K2211/182—Metal complexes of the rare earth metals, i.e. Sc, Y or lanthanide

Definitions

  • the invention relates to the technical field of lanthanide complexes.
  • the invention relates to lanthanide complexes comprising a chelating agent, formed of a macrocycle or of a ligand, and complexing a lanthanide ion, corresponding chelating agents, as well as a method of detecting a biomolecule with using said lanthanide complex.
  • luminescent lanthanide complexes exhibit remarkable spectroscopic properties (fine emission bands characteristic of a given metal and with a long lifespan), and are, therefore, compounds with very high potential for applications in biological imaging ( SV Eliseeva, J.-CG Bünzli, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189 ). These luminescent compounds can be used alone for applications in imaging by mono- or two-photon fluorescence microscopy, or in conjunction with an appropriate fluorophore to carry out FRET (Förster / Fluorescence Resonant Energy Transfer) experiments. In the latter case, the lanthanide complexes are generally in the form of a complex conjugated to a biomolecule.
  • luminescent lanthanide compounds have already been described in the literature, and some are even marketed by Cisbio Bioassays, PerkinElmer or Invitrogen.
  • functionalized lanthanide complexes have been developed in order to optimize their spectroscopic properties, shift their absorption towards the visible, optimize their two-photon absorption, and improve their solubility in aqueous medium.
  • WO 2005/058877 describes lanthanide complexes based on 1,4,7-triazacyclononane (TACN) rings of which three nitrogen atoms are substituted by chromophores consisting of a pyridine derivative optionally substituted by a reactive group, in order to facilitate conjugation with biomolecules.
  • the aim is to provide highly fluorescent, stable and easily graftable complexes to a biomolecule.
  • This document describes in particular a TACN type terbium complex, the three nitrogen atoms of which are substituted by a 2-carboxylate-4- (2,4,6-trimethoxyphenyl) -pyridine group (compound 22), but does not indicate the gloss measured for this compound.
  • TACN 1,4,7-triazacyclononane
  • the structure of the complexes according to the invention makes possible chemical variations making it possible to advantageously obtain good solubility and good stability in a biological medium, and allowing easy grafting on a biomolecule.
  • Brightness is defined as the product of absorption at the wavelength of interest and emission quantum efficiency, and corresponds to the amount of light actually available for the imaging and / or FRET experiment. Optimal brightness makes it possible to optimize the signal / noise ratio, and therefore to increase the sensitivity of the detection and / or to reduce the quantity of chromophore used.
  • the complexes of the invention are luminescent.
  • Luminescence corresponds to an emission of light following an input of energy, in particular a contribution of light.
  • This energy supply causes atoms or molecules to pass into an "excited" state, which is at an energy higher than that which they possess in their normal state called “fundamental”. It is when they return to their ground state that they can emit light.
  • the lanthanide complexes are sensitized by the antenna effect and the nature of the organic antenna controls the absorption of light and makes it possible to optimize the luminescence of the lanthanide ( SV Eliseeva, J.-C. Bünzli, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189 ).
  • the complexes according to the invention have the advantage of having a high gloss, in particular due to a very high quantum yield, in particular in a hydrophilic medium and in particular in an aqueous medium.
  • the inventors believe that the improvement in the quantum efficiency, and the optimization of the brightness, of the complexes of the invention is due to the combination of the electronic and steric effects of the antennas (ie of the groups ( B )) .
  • the presence of a single electron donor group significantly improves the quantum efficiency.
  • the inventors have observed a drastic drop in quantum efficiency when several electron donor groups are present, compared to a single complex comprising only one electron donor group.
  • the complexes according to the invention can be provided with a reactive group, so as to be optionally conjugated by a covalent bond to a molecule of interest, such as a biomolecule.
  • the complexes according to the invention can also be provided with one or more water-solubilizing groups, which then makes it possible to improve their solubility in hydrophilic medium, and in particular in aqueous medium.
  • alkyl is understood to mean a saturated hydrocarbon chain, which may be linear or branched.
  • alkyl groups comprising from 1 to 6 carbon atoms, mention may be made of methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, tert-butyl, sec-butyl groups, n-pentyl, iso-pentyl, tert-pentyl, neo-pentyl, sec-pentyl, and n-hexyl.
  • the lanthanide Ln is terbium.
  • Terbium complexes are indeed very bright.
  • the lanthanide complexes of the invention comprise a reactive group, denoted by -X, -X1 or -X2, allowing its covalent coupling to a biomolecule.
  • a reactive group denoted by -X, -X1 or -X2
  • reactive group is meant a group comprising a function which allows covalent grafting on a function capable of reacting and present on a biomolecule (amine, alcohol, thiol, carboxylic acid, unsaturation, etc.).
  • a biomolecule amine, alcohol, thiol, carboxylic acid, unsaturation, etc.
  • the various functions allowing such a bio-conjugation are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Bioconjugate Techniques, GT Hermanson, 1996, 137-166 .
  • biomolecule is understood to mean molecules of biological interest which it may be advantageous to mark with a luminescent complex.
  • biomolecules mention may be made of proteins, peptides, antibodies, antigens, DNA strands, biotin and streptavidin.
  • the proteins are the biomolecules which will most often be linked to the complexes of the invention.
  • the reactive group can be chosen from -COOH, -NH 2 , an acrylamide, an activated amine, an activated ester, an aldehyde, an alkyl halide, an anhydride, an aniline, an azide , an aziridine, a carboxylic acid, a diazoalkane, a haloacetamide, a halotriazine, a hydrazine, an imido ester, an isocyanate, an isothiocyanate, a maleimide, a sulfonyl halide, a thiol, a ketone, an acid halide, a hydroxysuccinimidyl ester, a succinimidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester, an azidonitrophenyl, an azidophenyl, a 3- (2-pyridyl dithio) -propionamide
  • the complexes according to the invention comprise at least one and at most 15 water-solubilizing groups, denoted -Y , and advantageously at least 2, and preferably from 2 to 9 water-solubilizing groups, in particular from 2 to 5, and preferably 2 or 3.
  • water-solubilizing group is understood to mean a group which comprises a function which makes it possible to improve the solubility in a hydrophilic medium.
  • sulfobetaine is intended to mean a betaine group comprising an —SO 3 - function as a function carrying the negative charge.
  • a betaine group is defined as a zwitterionic group in which the atom carrying the positive charge does not carry a hydrogen atom and is not adjacent to the atom carrying the negative charge.
  • the term “sulfobetaine” is understood to mean, for example, zwitterionic groups combining an ammonium cation, or aromatic iminium, generally pyridinium, imidazollium, and an anionic group of sulfonate type.
  • the cation and the anion are spaced apart by at least one CH 2 chain, and preferably by a bivalent alkyl chain (also called alkylene) comprising from 1 to 4, or even from 1 to 6, carbon atoms.
  • a bivalent alkyl chain also called alkylene
  • R represents an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, and preferably a methyl or ethyl, and q which is equal to 1, 2, 3, 4, 5 or 6, and preferably which is equal to 1 or 2.
  • the group -N (CH 3 ) 2 + - (CH 2 ) 3 -SO 3 - is preferred.
  • the complexes according to the invention comprise one or more water-solubilizing groups
  • these can be on any substituent of the phenyl group of the group of structure ( B ), ie on -R1 , -R2, -R3, -R4 and / or -R5 , or more precisely on -R6 , -R7 , -R8 , -R9 , -R10 and / or -R'10 .
  • the water-solubilizing groups are in the ortho and / or para position relative to the pyridinyl group of the group of structure ( B ), ie on -R6 , -R7 , -R8 , -R10 and / or -R'10 , and preferably in para.
  • -A- represents -CH 2 -
  • / or -Z- represents -C-
  • / or -R4 represents hydrogen
  • / or -R5 represents hydrogen in -Chrom1 , -Chrom2 and -Chrom3 .
  • -R4 and -R5 represent hydrogens in -Chrom1 , -Chrom2 and -Chrom3 .
  • -Chrom1 , -Chrom2 and -Chrom3 are identical in the complexes ( I ). These complexes will be named ( la ). These complexes ( Ia ) then have the advantage of being easier to synthesize.
  • -R1 represents an electron- donor group -E1 as defined for the groups of formula ( B ), in particular chosen from the groups -O R10 and -NH (CO) R10 , - R10 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • -R1 represents a group - O R10 , and in particular -OMe or -OPEG, in the complexes ( Ia ).
  • -R2 in the complexes ( Ia ), is a -R7 group as defined for the groups of formula ( B ).
  • -R2 in the complexes ( Ia ), -R2 represents -Me.
  • -R3 is advantageously a hydrogen or a group -R8 as defined for the groups of formula ( B ), preferably -Me.
  • -R3 is hydrogen in complexes ( Ia ).
  • the complexes of formula ( I ), -Chrom1 , -Chrom2 and -Chrom3 are identical and such that -R1 represents a group -E1 , in particular chosen from the groups - O R10 and -NH (CO) R10 , -R2 is a group -R7 , and in particular -Me, and -R3 is a hydrogen or a group -R8 , preferably -Me , -E1 , -R7 , -R8 and -R10 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • the complexes of formula (I) , -Chrom1 , -Chrom2 and -Chrom3 are identical and such that -R1 represents a group - O R10, -R2 is a group -R7 , and in particular -Me, and -R3 is hydrogen, -R7 and -R10 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • -Chrom1 and -Chrom2 are the same and -Chrom3 is different from -Chrom1 and -Chrom2 .
  • These complexes will be named (Ib) .
  • -R1 1 represents a group -O R10 1 , preferably -OMe or -OPEG, or a group -NH (CO) R10 1 , -R10 1 being as defined for -R10 in the group of formula ( B ).
  • -R1 1 represents a group -O R10 1 , preferably -OMe or -OPEG, -R10 1 being as defined for -R10 in the group of formula ( B ).
  • -R1 2 advantageously represents a group -NH (CO) R10 2 , or, preferably -O R10 2 , with R10 2 which is an -O (C1-C6) alkyl group substituted with a group -X1 .
  • -R2 1 and -R2 2 which are identical or different, advantageously represent a group -R7 as defined for the groups of formula ( B ).
  • -R2 1 and -R2 2 are identical and represent, preferably, -Me.
  • -R3 1 and -R3 2 which are identical or different, represent a hydrogen or a group -R8 as defined for the groups of formula ( B ).
  • R3 1 and -R3 2 are identical and represent -Me or, preferably, a hydrogen.
  • -R1 1 represents a group -O R10 1 , preferably -OMe or -OPEG
  • -R1 2 represents -O R10 2 , preferably a group - O ( C1-C6) alkyl substituted with one -X1 group, -R10 -R10 1 and 2 being as defined for in -R10 groups of formula (B).
  • -R2 -R2 1 and 2 are identical and represent a group -R7, and R3 1 and R3 2 are identical and represent hydrogen or a group such -R8 that -Me, the groups -R7 and -R8 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • -R2 1 and -R2 2 are identical and represent a group -R7 as defined for the groups of formula ( B ), and preferably -Me, and -R3 1 and -R3 2 are identical and represent hydrogen.
  • -R1 1 represent a group -O R10 1 , preferably -OMe or -OPEG
  • -R1 2 represents a group -O R10 2 , preferably a group -O (C1-C6) alkyl substituted by a group -X1, -R2 -R2 1 and 2 are identical and represent a group -R7, preferably -Me and R3 1 and R3 2 are identical and represent hydrogen, -R1 1, 2 -R1, -R2 1, 2 -R2, R3 1, R3 2 -R10 and 1 respectively defined as for -R1, - R1, -R2, -R2, R3, -R3 and -R10 for groups of formula ( B ).
  • one of -R2 and -R3 represents hydrogen groups.
  • one of -R2 or -R3 groups 1 1 represents advantageously a hydrogen.
  • one of the groups --R2 2 or R3 2 advantageously represents hydrogen.
  • -Chrom1 , -Chrom2 and -Chrom3 are identical or different, and chosen independently of one another from the groups of the following formula ( B4 ): with -R7 and -E1 as defined for the groups of formula ( B ), -R7 preferably representing -Me , and -E1 preferably representing a group - O R10 or -NH (CO) R10 optionally substituted by a group - Y or a group -X1 , R10 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • the lanthanide complexes are of formula ( Ib ' ): with A as defined for the complexes ( I ), -R7 1 and -R7 2 as defined for -R7 for the groups of formula ( B ), -R10 1 representing a (C1-C6) alkyl group substituted by a group -X1 -R10 and 2 representing a (C1-C6) alkyl substituted by a group -Y.
  • the lanthanide ( I ) complexes are chosen from the following complexes:
  • a particularly preferred lanthanide complex is the complex ( Ia.2 ).
  • -R4 and / or -R5 represents hydrogen in -Chrom4- , -Chrom5- and -Chrom6- .
  • -R4 and -R5 represent hydrogens in -Chrom4- , -Chrom5- and - Chrom6- .
  • -Chrom4- , -Chrom5- and -Chrom6- are identical. These complexes will be named ( IIa ) .
  • -R1 advantageously represents an electron- donor group -E1 as defined for the groups of formula ( B ), in particular chosen from the groups - O R10 and -NH (CO) R10 , -R10 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • -R1 represents an -OR10 group, and in particular -OMe or -OPEG in the complexes ( IIa ) .
  • -R2 is advantageously a -R7 group as defined for the groups of formula ( B ).
  • -R2 represents -Me in the complexes ( IIa ).
  • -R3 is advantageously a hydrogen or a group -R8 as defined for the groups of formula ( B ), preferably -Me.
  • -R3 is hydrogen in complexes ( IIa ).
  • -R1 3 and -R1 5 when they are present, are -O (C1-C6) alkyl or -NH (CO) (C1-C6) alkyl groups optionally substituted with a -Y group.
  • -R1 -O (C1-C6) alkyl optionally substituted by a group -Y, especially -OMe or -OPEG.
  • -R1 4 and -R1 6 when they are present, represent an -O (C1-C6) alkyl or NH (CO) (C1-C6) alkyl group substituted with a group -X1 .
  • -R1 -R1 4 and 6 are -O (C1-C6) alkyl optionally substituted by a group -X1.
  • R2 3 , -R2 4 , -R2 5 and -R2 6 when they are present, can be the same or different, and represent a group -R7 as defined for the groups of formula ( B ).
  • R2 3 , -R2 4 , -R2 5 and -R2 6 when they are present, are identical and preferably represent -Me.
  • R2 3 , -R2 4 , -R2 5 , and -R2 6 when they are present, can be identical or different and represent a hydrogen or a group -R8 as defined for the groups of formula ( B ), preferably -Me.
  • R2 3 , -R2 4 , -R2 5 , -R2 6 when they are present, are identical and preferably represent hydrogen.
  • R3 3 , -R3 4 , -R3 5 and -R3 6 when they are present, can be identical or different and represent a hydrogen or a group -R8 as defined for the groups of formula ( B ), preferably -Me.
  • R3 3 , -R3 4 , -R3 5 and -R3 6 when they are present, are identical and represent hydrogen.
  • -R3 3 , -R3 4 , -R3 5 and -R3 6 when they are present, are identical and advantageously represent hydrogens
  • -R2 3 , -R2 4 , -R2 5 and -R2 6 when they are present, are identical and each represent a group -R7 , as defined for the groups of formula ( B ), preferably -Me.
  • Chrom4-, -Chrom5- and -Chrom6- are identical or different, and chosen independently of each other from the groups of the following formula ( B14 ): with -R7 and -E1 as defined for the groups of formula ( B ), and -R7 preferably representing -Me and -E1 preferably representing a group - O R10 or -NCO (N R10 ) optionally substituted by a group - Y or a group -X1 , R10 being as defined for the groups of formula ( B ).
  • a subject of the invention is also the chelating agents corresponding to the lanthanide compounds defined in the context of the invention, regardless of their variant embodiment described.
  • the invention also relates to such chelating macrocycles in their protected form according to formula ( III ) and to such chelating ligands in their protected form according to formula ( IV ).
  • the invention also relates to the chelating agents of formula ( III ): with -Chrom1 ', -Chrom2' , and -Chrom3 ' , identical or different, and chosen independently of one another from the groups of formula ( B5 ): with R1 , R2 , R3 , R4 and R5 as defined for the lanthanide complexes ( I ), and -R13 a group protecting the acid functions (ie -Z (O) OH), such as an alkyl, and in particular an methyl, or in the form of a salt.
  • R1 , R2 , R3 , R4 and R5 as defined for the lanthanide complexes ( I ), and -R13 a group protecting the acid functions (ie -Z (O) OH), such as an alkyl, and in particular an methyl, or in the form of a salt.
  • a subject of the invention is also the chelating agents of formula ( IV ): with -Chrom4- , -Chrom5- and -Chrom6- as defined for the lanthanide complexes of formula ( II ), and -R13 a protecting group for the acid functions, such as an alkyl, and in particular a methyl, or under the form of a salt.
  • the complexation reactions are, in general, carried out with a salt of the desired lanthanide, in particular a chloride, a nitrate or a triflate, in a dissociating solvent, in particular an alcohol such as methanol, THF or acetonitrile, or else in a mixture of solvents, generally in the presence of a carbonate, at a temperature between 25 and 80 ° C., for a period varying from 30 minutes to a few hours.
  • a salt of the desired lanthanide in particular a chloride, a nitrate or a triflate
  • a dissociating solvent in particular an alcohol such as methanol, THF or acetonitrile
  • a mixture of solvents generally in the presence of a carbonate
  • Compounds ( III ) and ( IV ) are relatively easy and conventional to access, and can be obtained at a reasonable preparation cost.
  • the reagents are in fact commercially available or easily accessible.
  • the functional groups optionally present in the compounds of formulas ( III ) and ( IV ), and in the reaction intermediates, can be protected during the syntheses, either in permanent form or in temporary form, by protective groups which ensure unambiguous synthesis. expected compounds.
  • the protection and deprotection reactions are carried out according to techniques well known to those skilled in the art.
  • temporary protective group is meant protective groups such as those described in Protective Groups in Organic Synthesis, Greene TW and Wuts PGM, ed. John Wiley & Sons, 2006 , and in Protecting Groups, Kocienski PJ 1994, Georg Thieme Verlag .
  • the chelating agent of formula ( III ) can be obtained by alkylation of a ring of TACN.3HCl type with an intermediate of formula ( B6 ): with -A-, -R1, -R2, -R3, -R4, -R5 and -R13 as defined for chelating agents (III) and -LG representing a leaving group.
  • leaving group is meant a group capable of detaching from the rest of the molecule under the reaction conditions, so that another reagent reacts with the rest of the molecule to form a new bond with the carbon atom bearing initially the leaving group.
  • the nature of the leaving group is not limited, and any leaving group known to those skilled in the art may be suitable.
  • sulfonates such as mesylate or tosylate.
  • Intermediate ( B6 ) can be prepared, according to techniques well known to those skilled in the art, from the following intermediate ( B7 ): with -R1, -R2, -R3, -R4, -R5, - R13 and -Z- as defined for intermediate (B6).
  • Intermediate ( B7 ) can be synthesized from reagent ( B9 ), by formation of a boronic acid ( B8 ), followed by a Suzuki reaction with a dialkyl-4-halo-2,6-pyridinedicarboxylate: with -R1, -R2, -R3, -R4 and -R5 as defined for intermediate (B7) and Hal representing a halogen, such as -Br, -Cl or -I.
  • the chelating agent of formula ( III ) can be prepared by alkylation of the intermediate ( III ' ) with the intermediate of formula ( B6 " ), with -R1" , -R2 ", -R3 ", R4", -R5 "-R13” Z "-LG” as defined respectively for -R1, -R2, -R3, -R4, -R5, -R13, -Z and for -LG the chelating agent of formula ( III ):
  • Intermediate ( III ' ) can be prepared by alkylation of a TACN.3HCl type ring with the intermediate of formula ( B6' ), with -R1 ' , -R2' , -R3 ' , -R4', - R5 '-R13', Z 'and -LG' respectively defined as for -R1, -R2, -R3, -R4, -R5, -R13, -Z -LG and for the chelating agent (III) :
  • one of the three amine functions of the TACN.3HCl type cycle is protected, via a group protecting the amine functions, prior to the step of alkylation with the intermediate of formula ( B6 ′ ); a subsequent deprotection step making it possible to generate the intermediate ( III ' )
  • DCM dichloromethane
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Ms mesyl
  • n.d . not determined
  • PBS phosphate buffered saline
  • PEG polyethylene glycol
  • PFA paraformaldehyde
  • quant. quantitative
  • TACN Triazacyclononane
  • THF Tetrahydrofuran
  • Ts tosyle
  • the NMR spectra ( 1 H, 13 C) were recorded on a Bruker Avance apparatus at a frequency of 300 MHz or 500.10 MHz, and 75 MHz or 125.75 MHz, for 1 H and 13 C respectively.
  • the chemical shifts ( ⁇ ) are expressed in parts per million (ppm) relative to the trimethylsilane used as an internal reference and using the solvents indicated.
  • Coupling constants (J) are expressed in Hz and the following notations are used: s (singlet), br (broad), d (doublet), t (triplet), dd (doublet of doublet), m (multiplet).
  • the high-resolution mass spectra were recorded at the Lyon Joint Mass Spectrometry Center (liable Claude Bernard Lyon, Lyon, France) on a MicroTOFQII device equipped with a positive ESI source.
  • the purifications were carried out by chromatographic column on silica gel (silica gel 0.035-0.070 mm, 60A).
  • the solvents used for the reactions were purchased from Aldrich or Acros Organics as dry or extra dry solvents and stored on a 3 ⁇ molecular sieve and the reagents used were purchased from Aldrich, Acros Organics or Alfa Aesar.
  • UV / Vis absorption spectra were recorded on a JASCO V670 spectrometer; the emission spectra on a JOBIN-YVON fluorolog 3 spectrofluorimeter.
  • the retention times were carried out on an Agilent Technologies 1260 device equipped with an aWaters XBridge RP-C18 column (3.5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 100 mm).
  • the chromatographic system used is ammonium formate 0.25M-MeCN (v / v) as eluents: isocratic 15% MeCN (2 min), linear gradient 15 to 100% MeCN (16 min), isocratic 100% MeCN (4 min) , at a flow rate of 1mL.min -1 , UV detection at 210 and 252 nm.
  • the cell imaging tests were carried out using a solution concentrated as a complex in DMSO in order to obtain a final complex concentration of the order of 1.10 -5 M in the cell medium (PBS) with ⁇ 1% DMSO.
  • PBS cell medium
  • the T24 cells are previously fixed to the PFA.
  • the two-photon absorption spectra were carried out with a confocal laser scanning microscope LSM710 NLO (Cari Zeiss).
  • the compounds of (4-bromo-3-methylanisole), first (1-bromo-3,5-dimethoxybenzene) and second (2,4-dimethoxyphenylboronic acid) are commercially available.
  • Compounds 1b and 1d are prepared from the corresponding phenol, while compound 1c is prepared from the corresponding aniline.
  • the boronic acids 2a-2d are then obtained according to a procedure well known to those skilled in the art.
  • Compounds 3a-e are obtained by a Suzuki coupling reaction with dimethyl-4-iododipicolinate. Then, a reduction reaction followed by mesylation makes it possible to isolate the compounds 5a-e.
  • acetic anhydride (305 ⁇ L, 3.22 mmol) is added to a solution of 4-bromo-3-methylaniline (500 mg, 2.69 mmol) in CH 2 Cl 2 sec under Argon.
  • the mixture is stirred at room temperature under Argon until the reaction is complete (monitoring TLC, petroleum ether / ethyl acetate, 80/20). After 4 h, the mixture is washed with H 2 O (3x). The organic phase is dried over Na 2 SO 4 , filtered through cotton wool and evaporated to obtain a white solid (506 mg, 82%).
  • Compound 2a was prepared according to the protocol described in " Substitute Effects on Oxidation-Induced Formation of Quinone Methidesfrom Arylboronic Ester Precursors ", Sheng Cao, Robin Christiansen, and Xiaohua Peng, Chem. Eur. J., 2013, 19, 9050 - 9058 .
  • Potassium acetate (515 mg, 5.25 mmol) is dried under vacuum / Argon for 1 hour then bis (pinacolato) diboron (668 mg, 2.63 mmol), dry DMSO (6 mL) and 1c (400 mg, 1.75 mmol) are added. Argon bubbling in the mixture is carried out for 20 min then PdCl 2 (dppf) 2 .CH 2 Cl 2 (100 mg, 0.12 mmol) is added and the schlenck is closed. The solution is heated to 90 ° C. under Argon and with stirring for 19 h. After returning to ambient temperature, the mixture is filtered through a P3 frit and rinsed with Et 2 O. A serial extraction is then carried out with H 2 O / Et 2 O.
  • the dry potassium acetate (830 mg, 8.46 mmol) is dissolved in dry DMSO (10 mL) under Argon then bis (dipicolinato) diboron (1.07 g, 4.23 mmol) and 1d (979 mg, 2.82 mmol) are added. .
  • the solution is placed under argon bubbling for 20 minutes then PdCl 2 (dppf) 2 .CH 2 Cl 2 (161 mg, 0.20 mmol) is added.
  • the reaction mixture is heated to 90 ° C. under Argon and with stirring for 40 h.
  • a serial H 2 O / Et 2 O extraction is then carried out.
  • the organic phases are combined, washed with sat NaCl, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated in vacuo.
  • dimethyl-4-iododipicolinate 200 mg, 0.623 mmol
  • 2,4-dimethoxyphenylboronic acid 125 mg, 0.685 mmol
  • dry DMF 7 mL
  • potassium fluoride 119 mg, 2.056 mmol
  • Pd (dba) 3 tBu 3 PH.BF 4 36 mg, 0.062 mmol
  • the reaction medium is left stirring at 80 ° C. under Argon for 19 h.
  • the mixture is then diluted in an AcOEt / Et 2 O mixture and then extracted with H 2 O then sat NaCl.
  • the organic phase is then dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under vacuum.
  • the brown solid obtained is finally purified on a chromatographic column (SiO 2 , AcOEt / PE, 20/80 to 60/40, solid deposit) in order to obtain the pure product in the form of a beige solid (131 mg, 63%) .
  • 3b (320 mg, 0.72 mmol) is dissolved in a CH 2 Cl 2 / MeOH mixture (2.5 mL / 4.5 mL). After placing the medium at 0 ° C., NaBH 4 (30 mg, 0.79 mmol) is added and after 30 minutes, the solution is brought to room temperature with stirring for 3 h. The reaction is quenched by adding a 1M HCl solution. Then a CH 2 Cl 2 / H 2 O extraction is carried out. The organic phase is washed with sat NaCl, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated.
  • the triazacyclononan (27 mg, 0.115 mmol) and the sodium carbonate (122 mg, 1.15 mmol) are dissolved in dry acetonitrile (7 mL). After 10 minutes at room temperature, 5a (130 mg, 0.356 mmol) is added and the reaction mixture is heated at 60 ° C. with stirring for 24 h then at room temperature for 24 h. The mixture is then filtered through a P3 frit, rinsed with dry CH 3 CN and the mother liquors are evaporated. The crude product is purified on a chromatographic column (Al 2 O 3 , CH 2 Cl 2 / MeOH, 99/1 to 98/2) in order to obtain the pure product in the form of a pale yellow solid (81 mg, 75% ).
  • the triazacyclononan (93 mg, 0.39 mmol) and the sodium carbonate (414 mg, 3.91 mmol) are dissolved in dry acetonitrile (24 mL) under Argon. After 10 minutes at ambient temperature, 5b (289 mg, 1.21 mmol) is added and the reaction mixture is heated at 60 ° C. with stirring for 24 h then at ambient temperature for 24 h. The mixture is then filtered through a P3 frit, rinsed with dry CH 3 CN and the mother liquors are evaporated. The crude product is purified on a chromatographic column (Al 2 O 3 , CH 2 Cl 2 / MeOH, 99/1 to 95/5) in order to obtain the pure product in the form of a yellow oil (176 mg, 34%) .
  • the triazacyclononan (21.5 mg, 0.09 mmol) and the sodium carbonate (95 mg, 0.90 mmol) are dissolved in dry acetonitrile (5 mL). After 5 minutes at room temperature, 5d (143 mg, 0.28 mmol) is added, argon bubbling is carried out for 5 minutes and the reaction mixture is heated at 60 ° C. with stirring for 4 days. The mixture is then filtered through a P3 frit, rinsed with dry CH 3 CN and the mother liquors are evaporated. The crude product is purified on a chromatographic column (Al 2 O 3 , CH 2 Cl 2 / MeOH, 100% to 97/3) in order to obtain the pure product in the form of a white powder (82 mg, 66%).
  • the triazacyclononan (15 mg, 0.064 mmol) and the sodium carbonate (68 mg, 0.64 mmol) are dissolved in dry acetonitrile (4 mL). After 10 minutes at room temperature, 5th (76 mg, 0.198 mmol) is added and the reaction mixture is heated at 60 ° C with stirring for 24 h then at room temperature for 5 days. The mixture is then filtered through a P3 frit, rinsed with dry CH 3 CN and the mother liquors are evaporated. The crude product is purified on a chromatographic column (Al 2 O 3 , CH 2 Cl 2 / MeOH, 100% to 97/3) in order to obtain the pure product in the form of a white powder (41 mg, 65%).
  • Ligand 6a (70 mg, 0.075 mmol) is dissolved in THF (10 mL) then 1M NaOH (5 mL) is added and the solution is stirred at room temperature for 1 hour 30 minutes. The pH is then adjusted to pH 4 with 1M HCl (5 mL) and the mixture is concentrated in vacuo. The medium is diluted with MeOH then the pH is adjusted to pH 8-9 using a solution of Na 2 CO 3 sat . Finally, TbCl 3 .6H 2 O (84 mg, 0.224 mmol) is added and the reaction mixture is stirred at room temperature for 72 h.
  • Ligand 6b (50 mg, 0.038 mmol) is dissolved in MeOH (5 mL) then 1M NaOH (2 mL) is added and the solution is left under stirring at room temperature for 1 hour. The pH is then adjusted to pH 3 ⁇ 4 with 1M HCl, then to pH ⁇ 7 with Na 2 CO 3sat . TbCl 3 .6H 2 O (21 mg, 0.056 mmol) is added and the solution is left at room temperature overnight. After concentration under reduced pressure, the mixture is purified by extractions / washing with DCM / H 2 O, and the organic phase evaporated to give the product in the form of a pale yellow solid (55 mg, quant.).
  • the 6th ligand (31 mg, 0.032 mmol) is dissolved in MeOH (5 mL) then 1M NaOH (2 mL) is added and the solution is stirred at room temperature for 2 h.
  • the pH is then adjusted to pH 3-4 with 1M HCl (2 mL) then to pH 7 using a solution of Na 2 CO 3 sat .
  • TbCl 3 .6H 2 O (18 mg, 0.047 mmol) is finally added and the reaction mixture is stirred at room temperature for 14 h.
  • the medium is concentrated under reduced pressure then the complex is precipitated with addition of H 2 O (2 x) and centrifuged.
  • Example 2 Dysprosium complex Ia.5 and Ia.6
  • Ligand 6b (50 mg, 0.038 mmol) is dissolved in MeOH (5 mL) then 1M NaOH (2 mL) is added and the solution is left under stirring at room temperature for 1 hour. The pH is then adjusted to pH 3 ⁇ 4 with 1M HCl, then to pH ⁇ 7 with Na 2 CO 3sat .
  • Dy (NO 3 ) 3 .5H 2 O (20 mg, 0.056 mmol) is added and the solution is left at room temperature overnight. After concentration under reduced pressure, the mixture is purified by extractions / washing with DCM / H 2 O, and the organic phase evaporated to give the product in the form of a pale yellow solid (50 mg, 92%).
  • HRMS (ESI) calculated for C 69 H 87 DyN 6 Na 2 O 18 748.7577. Exp 748.7576 [M + 2Na] 2+ .
  • complexes have very high quantum yields, and much higher than that of complex 9 outside the invention, which has no substituent other than hydrogens in alpha of the pyridine-phenyl bond (positions R2 and R3).
  • the strong limitation, or even the elimination, of the internal rotation around the pyridine-phenyl bond thus makes it possible to significantly improve the quantum yield.
  • the brightness of the complexes according to the invention is then greater than that of complex 9.
  • Ia.4 exhibits a brightness at 330 nm lower than that of its counterpart Ia.2.
  • the figure 1 shows the absorption and emission spectrum of complex Ia.4 in water at room temperature.
  • Table 1 ⁇ /b> -Photophysical properties of the complexes ⁇ b> Ia.1-Ia.6, 8 ⁇ /b> and ⁇ b> 9 ⁇ /b> measured in methanol complex ⁇ max (nm) ⁇ (L.mol -1 . cm -1 ) ⁇ (%) T (ms) B at ⁇ max (L.mol -1 .
  • the Dysprosium Ia.5 and Ia.6 complexes also exhibit remarkable photophysical properties, in methanol and in water. These complexes are among the brightest complexes reported in the literature.
  • the figure 2 shows the absorption and emission spectrum of complex Ia.6 in a methanol / ethanol mixture at room temperature.
  • the Ia.2 complex has shown significant interest in one- or two-photon fluorescence microscopy imaging.
  • the emission spectra confirm the presence of Ia.2 inside the cell and not in the buffer.
  • the internalization of the Ia.5 complex in the cell is confirmed by the emission spectra.

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Description

  • L'invention concerne le domaine technique des complexes de lanthanide. En particulier, l'invention concerne des complexes de lanthanide comportant un agent chélatant, formé d'un macrocycle ou d'un ligand, et complexant un ion lanthanide, des agents chélatants correspondants, ainsi qu'un procédé de détection d'une biomolécule à l'aide dudit complexe de lanthanide.
  • Certains complexes de lanthanide luminescents présentent des propriétés spectroscopiques remarquables (bandes d'émission fines caractéristiques d'un métal donné et à longue durée de vie), et sont, de ce fait, des composés à très fort potentiel pour des applications en imagerie biologique (S.V. Eliseeva, J.-C. G. Bünzli, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189). Ces composés luminescents peuvent être utilisés seuls pour des applications en imagerie par microscopie de fluorescence mono- ou biphotonique, ou bien en conjonction avec un fluorophore approprié pour réaliser des expériences de FRET (Förster/Fluorescence Resonant Energy Transfer). Dans ce dernier cas, les complexes de lanthanide sont généralement sous la forme d'un complexe conjugué à une biomolécule. Ces deux techniques peuvent éventuellement être résolues en temps grâce à la durée de vie longue des lanthanides, ce qui constitue un avantage important pour améliorer la détection, en s'affranchissant de signaux de fluorescence parasites à durée de vie courte (C. P. Montgomery B. S. Murray, E. J. New, R. Pal, D. Parker, Acc. Chem. Res. 2009, 42, 925 ; E. G. Moore, A. P. S. Samuel, K. N. Raymond, Acc. Chem. Res. 2009, 42, 542).
  • De tels composés de lanthanide luminescents ont déjà été décrits dans la littérature, et certains sont même commercialisés par Cisbio Bioassays, PerkinElmer ou Invitrogen. Ces dernières années, des complexes de lanthanide fonctionnalisés ont été développés, afin d'optimiser leurs propriétés spectroscopiques, de déplacer leur absorption vers le visible, optimiser leur absorption biphotonique, et améliorer leur solubilité en milieu aqueux.
  • En particulier, le document WO 2005/058877 décrit des complexes de lanthanide basés sur des cycles 1,4,7-triazacyclononane (TACN) dont trois atomes d'azote sont substitués par des chromophores constitués d'un dérivé de pyridine éventuellement substitué par un groupe réactif, afin de faciliter la conjugaison avec des biomolécules. L'objectif est de fournir des complexes fortement fluorescents, stables et facilement greffables à une biomolécule. Ce document décrit notamment un complexe de terbium de type TACN dont les trois atomes d'azote sont substitués par un groupe 2-carboxylate-4-(2,4,6-triméthoxyphényle)-pyridine (composé 22), mais n'indique pas la brillance mesurée pour ce composé.
  • Par ailleurs, certains des inventeurs ont précédemment décrit des complexes de terbium basés sur des cycles 1,4,7-triazacyclononane (TACN) dont trois atomes d'azote sont substitués par des chromophores constitués d'un dérivé de pyridine (V. Placide, A. T. Bui, A. Grichine, A. Duperray, D. Pitrat, C. Andraud, O. Maury, Dalton Trans. 2015, 44, 4918). Ce document décrit en particulier un complexe de terbium de type TACN dont les trois atomes d'azote sont substitués par un groupe 2-carboxylate-4-(4-méthoxyphényle)-pyridine, qui a une absorption intense, mais un rendement quantique et une brillance faibles.
  • Il subsiste donc un besoin de complexes de lanthanide présentant une bonne brillance, et en particulier lorsqu'ils sont excités dans la gamme spectrale d'intérêt de 330 nm à 350 nm, et plus particulièrement aux alentours de 337 nm (longueur d'onde correspondant aux sources laser souvent utilisées dans les dosages biologiques). La structure des complexes selon l'invention rend possible des variations chimiques permettant d'obtenir avantageusement une bonne solubilité et une bonne stabilité en milieu biologique, et permettant un greffage aisé sur une biomolécule.
  • La brillance est définie comme le produit de l'absorption à la longueur d'onde d'intérêt et du rendement quantique d'émission, et correspond à la quantité de lumière effectivement disponible pour l'expérience d'imagerie et/ou de FRET. Une brillance optimale permet d'optimiser le rapport signal/bruit, et donc d'augmenter la sensibilité de la détection et/ou de réduire la quantité de chromophore utilisé.
  • Les Demandeurs proposent de nouveaux complexes de lanthanide comportant un agent chélatant, formé d'un macrocycle ou d'un ligand, complexant un ion lanthanide Ln3+ choisi parmi le terbium et le dysprosium, l'agent chélatant comprenant au moins un groupe de structure (B) suivante :
    Figure imgb0001
     dans laquelle :
    • -R1 représente un hydrogène, un groupe -R6, ou un groupe électrodonneur -E1,
    • -R2 représente un hydrogène, un groupe -R7, ou un groupe électrodonneur -E2,
    • -R3 représente un hydrogène, un groupe -R8, ou un groupe électrodonneur -E3,
    • -R4 et -R5, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un hydrogène ou un groupe -R9 ou -OR9,
    • -E1, -E2 et -E3 sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes -OR10, -SR10, -NH(CO)R10, -NH(CO)NR10R'10, -NH(CS)NR10R'10 et -NH(CS)NHR10,
    • -R6, -R7, -R8, -R9, -R10 et R'10 identiques ou différents, représentent indépendamment les uns des autres un groupe (C1-C6) alkyle, éventuellement substitué par un groupe -X1 ou un groupe -Y,
    • -X1 est un groupe réactif permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule,
    • -Y est un groupe hydrosolubilisant choisi parmi les groupes -SO3 -, -COO-, sulfobétaïne et -O-[(CH2)2-O]m-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10,
    • étant entendu que :
      • ∘ au moins l'un des substituants -R2 et -R3 n'est pas un hydrogène,
      • ∘ un seul des groupes -R1, -R2 et -R3 représente un groupe électrodonneur,
      • ∘ ledit agent chélatant comprend au plus un groupe réactif.
  • Les complexes de l'invention sont luminescents. La luminescence correspond à une émission de lumière consécutive à un apport d'énergie, en particulier un apport de lumière. Cet apport en énergie fait passer des atomes ou molécules dans un état « excité » se situant à une énergie supérieure à celle qu'ils possèdent dans leur état normal dit « fondamental ». C'est lors du retour à leur état fondamental qu'ils peuvent émettre de la lumière. De manière générale, les complexes de lanthanide sont sensibilisés par effet d'antenne et la nature de l'antenne organique contrôle l'absorption de la lumière et permet d'optimiser la luminescence du lanthanide (S. V. Eliseeva, J.-C. Bünzli, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 189).
  • Les complexes selon l'invention ont l'avantage d'avoir une brillance élevée, notamment due à un rendement quantique très élevé, en particulier en milieu hydrophile et notamment en milieu aqueux. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que l'amélioration du rendement quantique, et l'optimisation de la brillance, des complexes de l'invention est due à la combinaison des effets électroniques et stériques des antennes (i.e. des groupes (B)). La présence d'un seul groupe électrodonneur permet d'améliorer significativement le rendement quantique. Ainsi, de manière surprenante, notamment par rapport au document WO-2005/058877 , les inventeurs ont observé une chute drastique du rendement quantique lorsque plusieurs groupes électrodonneurs sont présents, comparé à un même complexe ne comportant qu'un seul groupe électrodonneur. De plus, il apparait que l'introduction de groupements en position R2 et/ou R3 permet vraisemblablement d'éviter la rotation interne de l'antenne autour de la liaison pyridine-phényle qui contribue à augmenter les désexcitations non radiatives et conduit à une diminution du rendement quantique. Ainsi, l'encombrement stérique des groupes -R2 et/ou - R3, qui ne sont pas tous les deux des hydrogènes dans les complexes de l'invention, bloquerait cette rotation et serait donc important pour la brillance finale du complexe.
  • Par ailleurs, les complexes selon l'invention peuvent être pourvus d'un groupe réactif, pour être éventuellement conjugués par une liaison covalente à une molécule d'intérêt, telle qu'une biomolécule. Les complexes selon l'invention peuvent également être pourvus d'un ou plusieurs groupes hydrosolubilisants, ce qui permet alors d'améliorer leur solubilité en milieu hydrophile, et en particulier en milieu aqueux.
  • Dans le cadre de l'invention, on entend par « alkyle » une chaîne hydrocarbonée saturée, qui peut être linéaire ou ramifiée. A titre d'exemples de groupes alkyles comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso-butyle, tert-butyle, sec-butyle, n-pentyle, iso-pentyle, tert-pentyle, neo-pentyle, sec-pentyle, et n-hexyle.
  • De manière préférée dans le cadre de l'invention, le lanthanide Ln est le terbium. Les complexes de terbium sont en effet très lumineux.
  • Avantageusement, les complexes de lanthanide selon l'invention comprennent un groupe réactif, noté -X, -X1 ou -X2, permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule. D'après la définition même de l'agent chélatant formant le complexe, un seul groupe réactif peut être présent.
  • Par « groupe réactif », on entend un groupe comprenant une fonction qui permet un greffage covalent sur une fonction susceptible de réagir et présente sur une biomolécule (amine, alcool, thiol, acide carboxylique, insaturation...). Les différentes fonctions permettant une telle bio-conjugaison sont bien connues de l'homme de l'art et sont décrites, par exemple, dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, 1996, 137-166.
  • Par « biomolécule », on entend les molécules d'intérêt biologique qu'il peut être avantageux de marquer grâce à un complexe luminescent. A titre d'exemple de biomolécules, on peut citer les protéines, les peptides, les anticorps, les antigènes, les brins d'ADN, la biotine et la streptavidine. Les protéines sont les biomolécules qui seront le plus souvent liées aux complexes de l'invention.
  • Dans le cadre de l'invention, le groupe réactif peut être choisi parmi -COOH, -NH2, un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldhéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule :
    Figure imgb0002
    Figure imgb0003
    Figure imgb0004
    Figure imgb0005
    Figure imgb0006
     dans lesquels w est un entier appartenant à la gamme allant de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène ; les groupes réactifs choisis parmi -COOH, -NH2, les esters de succinimidyle, les haloacétamides, les azides, les hydrazines, les isocyanates et les maléimides étant préférés.
  • De préférence, les complexes selon l'invention comprennent au moins un et au maximum 15 groupes hydrosolubilisants, notés -Y, et avantageusement au moins 2, et de préférence de 2 à 9 groupes hydrosolubilisants, en particulier de 2 à 5, et de préférence 2 ou 3.
  • Par « groupe hydrosolubilisant », on entend un groupe qui comprend une fonction qui permet d'améliorer la solubilité en milieu hydrophile.
  • Dans le cadre de l'invention, le ou les groupes hydrosolubilisants -Y peuvent être choisis parmi les groupes -SO3 -, -COO-, sulfobétaïne et -O-[(CH2)2-O]m-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10, de préférence m=3. Selon un mode de réalisation préféré, le ou les groupes hydrosolubilisants sont choisis parmi les groupes -O-[(CH2)2-O]m-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10, de préférence m=3.
  • Par « sulfobétaïne », on entend un groupement bétaïne comportant une fonction -SO3 - en tant que fonction porteuse de la charge négative. Un groupe bétaïne est défini comme un groupement zwittérionique dans lequel l'atome portant la charge positive ne porte pas d'atome d'hydrogène et n'est pas adjacent à l'atome porteur de la charge négative. Dans le cadre de l'invention, on entend par sulfobétaïne, par exemple, les groupements zwittérioniques associant un cation ammonium, ou iminium aromatique, généralement pyridinium, imidazollium, et un groupement anionique de type sulfonate. Le cation et l'anion sont espacés par au moins un chainon CH2, et de préférence par une chaine alkyle bivalente (également nommé alkylène) comprenant de 1 à 4, voire de 1 à 6, atomes de carbone. A titre d'exemple de groupe sulfobétaïne, on peut citer les groupes de formule :
    Figure imgb0007
     avec R qui représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, et de préférence un méthyle ou éthyle, et q qui est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, et de préférence qui est égal à 1 ou 2. Le groupe -N(CH3)2 +-(CH2)3-SO3 - est préféré.
  • Lorsque les complexes selon l'invention comprennent un ou plusieurs groupes hydrosolubilisants, ceux-ci peuvent être sur n'importe quel substituant du groupe phényle du groupe de structure (B), i.e. sur -R1, -R2, -R3, -R4 et/ou -R5, ou plus précisément sur -R6, -R7, -R8, -R9, -R10 et/ou -R'10. De manière préférée, les groupes hydrosolubilisants sont en position ortho et/ou para par rapport au groupement pyridinyle du groupe de structure (B), i.e. sur -R6, -R7, -R8, -R10 et/ou -R'10, et de préférence en para.
  • Selon un premier mode de réalisation, les complexes de lanthanide selon l'invention sont choisis parmi les complexes de lanthanide de formule (I) :
    Figure imgb0008
     dans lesquels :
    • Ln est un lanthanide choisi parmi Tb et Dy,
    • -A- représente -CH2- ou -CH(LA-X2)-,
    • -LA- est une liaison covalente, ou un groupe (C1-C20) alkylène, linéaire ou ramifié, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons, et éventuellement substitué par un à trois groupes -SO3H, ou -LA- est un groupe (C5-C8) cycloalkylène ou un groupe (C6-C14) arylène,
    • -X2 est un groupe réactif permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule,
    • -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques ou différents et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B1) :
      Figure imgb0009
    • -R1, -R2, -R3, -R4, et -R5 sont tels que définis pour le groupe de formule (B),
    • -Z- représente -C- ou -P(RZ)-, et
    • -RZ représente un groupe phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, iso-butyle ou tert-butyle, et de préférence un groupe phényle ou méthyle,
    • étant entendu que si -A- est -CH(LA-X2)-, alors aucun des groupes -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 de formule (B1) ne comprend de groupe -X1.
  • De préférence, dans les complexes de formule (I), -A- représente -CH2-, et/ou -Z- représente -C-, et/ou -R4 représente un hydrogène, et/ou -R5 représente un hydrogène dans -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3.
  • De préférence, dans les complexes de formule (I), -R4 et -R5 représentent des hydrogènes dans -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3.
  • Selon un mode de réalisation préféré, les complexes de lanthanide (I) sont tels que -A-représente -CH2-, -Z- représente -C- et -R4 = -R5 = H dans -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3.
  • Selon un mode de réalisation, -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques dans les complexes (I). Ces complexes seront nommés (la). Ces complexes (la) présentent alors l'avantage d'être plus faciles à synthétiser.
  • Selon un mode de réalisation, dans les complexes (Ia), -R1 représente un groupe électrodonneur -E1 tel que défini pour les groupes de formule (B), notamment choisi parmi les groupes -OR10 et -NH(CO)R10, -R10 étant tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence, -R1 représente un groupe -OR10, et en particulier -OMe ou -OPEG, dans les complexes (Ia).
  • Selon un mode de réalisation, dans les complexes (Ia), -R2 est un groupe -R7 tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence, dans les complexes (Ia), -R2 représente -Me.
  • Selon un mode de réalisation, dans les complexes (Ia), -R3 est avantageusement un hydrogène ou un groupe -R8 tel que défini pour les groupes de formule (B), préférentiellement -Me. De préférence, -R3 est un hydrogène dans les complexes (Ia).
  • Selon un mode de réalisation particulier des complexes de formule (I), -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques et tels que -R1 représente un groupe -E1, notamment choisi parmi les groupes -OR10 et -NH(CO)R10, -R2 est un groupe -R7, et en particulier -Me, et -R3 est un hydrogène ou un groupe -R8, de préférence -Me, -E1, -R7, -R8 et -R10 étant tels que définis pour les groupes de formule (B).
  • Selon un mode de réalisation particulier des complexes de formule (I), -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques et tels que -R1 représente un groupe -OR10, -R2 est un groupe -R7, et en particulier -Me, et -R3 est un hydrogène, -R7 et -R10 étant tels que définis pour les groupes de formule (B).
  • Selon un autre mode de réalisation, -Chrom1 et -Chrom2 sont identiques et -Chrom3 est différent de -Chrom1 et de -Chrom2. Ces complexes seront nommés (Ib).
  • Selon un mode particulier de réalisation, les complexes de lanthanide (Ib) sont tels que :
    • -A- représente -CH2-,
    • -Chrom1 et -Chrom2 sont identiques et sont de structure (B2) :
      Figure imgb0010
       avec -R11 , -R21 , -R31 , -R41 , -R51 et -Z1- tels que définis respectivement pour R1, -R2, -R3, -R4, -R5 et -Z- dans les groupes de formule (B), étant entendu que Chrom1 et -Chrom2 ne comprennent pas de groupe réactif, et
    • -Chrom3 est différent de -Chrom1 et de -Chrom2 et est de structure (B3) :
      Figure imgb0011
       avec -R12 , -R22 , -R32 , -R42 , -R52 et -Z2- tels que définis respectivement pour R1, -R2, -R3, -R4, -R5 et -Z- dans les groupes de formule (B), étant entendu que -Chrom3 comprend un groupe réactif.
  • Selon un mode de réalisation, dans les complexes (Ib), -R11 représente un groupe -OR101 , de préférence -OMe ou -OPEG, ou un groupe -NH(CO)R101 , -R101 étant tel que défini pour -R10 dans le groupe de formule (B). De préférence, dans les complexes (Ib), -R11 représente un groupe -OR101 , de préférence -OMe ou -OPEG, -R101 étant tel que défini pour -R10 dans le groupe de formule (B).
  • Dans les complexes (Ib), -R12 représente avantageusement un groupe -NH(CO)R102 , ou, de préférence -OR102 , avec R102 qui est un groupe -O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1.
  • Dans les complexes (Ib), -R21 et -R22 , identiques ou différents, représentent avantageusement un groupe -R7 tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence, dans les complexes (Ib), -R21 et -R22 sont identiques et représentent, préférentiellement, -Me.
  • Dans les complexes (Ib), -R31 et -R32 , identiques ou différents, représentent un hydrogène ou un groupe -R8 tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence, dans les complexes (Ib), R31 et -R32 sont identiques et représentent -Me ou, préférentiellement, un hydrogène.
  • Selon un mode de réalisation particulier, dans les complexes (Ib), -R11 représente un groupe -OR101 , de préférence -OMe ou -OPEG, et -R12 représente -OR102 , de préférence un groupe - O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1, -R101 et -R102 étant tel que défini pour -R10 dans les groupes de formule (B).
  • Selon un mode de réalisation particulier, dans les complexes (Ib), -R21 et -R22 sont identiques et représentent un groupe -R7, et -R31 et -R32 sont identiques et représentent un hydrogène ou un groupe -R8 tel que -Me, les groupes -R7 et -R8 étant tels que définis pour les groupes de formule (B).
  • Selon un mode de réalisation particulier, dans les complexes (Ib), -R21 et -R22 sont identiques et représentent un groupe -R7 tel que défini pour les groupes de formule (B), et préférentiellement -Me, et -R31 et -R32 sont identiques et représentent un hydrogène.
  • Selon un mode de réalisation particulier des complexes de formule (Ib), -R11 représentent un groupe -OR101 , de préférence -OMe ou -OPEG, -R12 représente un groupe -OR102 , de préférence un groupe -O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1, -R21 et -R22 sont identiques et représentent un groupe -R7, de préférence -Me et -R31 et -R32 sont identiques et représentent un hydrogène, -R11 , -R12 , -R21 , -R22 , R31 , -R32 et -R101 tels que définis respectivement pour -R1, - R1, -R2, -R2, R3, -R3 et -R10 pour les groupes de formule (B).
  • Avantageusement, dans les groupes de formule (B), un des groupes -R2 ou -R3 représente un hydrogène. De même, dans les groupes de formule (B1), un des groupes -R21 ou -R31 représente avantageusement un hydrogène. De même, dans les groupes de formule (B2), un des groupes - R22 ou R32 représente avantageusement un hydrogène.
  • En particulier, -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques ou différents, et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B4) suivante :
    Figure imgb0012
     avec -R7 et -E1 tels que définis pour les groupes de formule (B), -R7 représentant de préférence -Me, et -E1 représentant de préférence un groupe -OR10 ou -NH(CO)R10 éventuellement substitué par un groupe -Y ou un groupe -X1, R10 étant tel que défini pour les groupes de formule (B).
  • Selon un mode de réalisation particulier, les complexes de lanthanide (I) selon l'invention sont tels que :
    • -R11 est un groupe -O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -Y,
    • -R12 est un groupe -O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1,
    • -R21 et -R22 , identiques ou différents, représentent un groupe -R7 tel que défini pour les groupes de structure (B), et sont de préférence identiques et représentent, préférentiellement, un groupe (C1-C6) alkyle, notamment -Me, et
    • -R31 , -R32 , -R41 , -R42 , -R51 et -R52 sont des hydrogènes.
  • Selon ce mode particulier de réalisation, les complexes de lanthanide sont de formule (Ib') :
    Figure imgb0013
     avec A tel que défini pour les complexes (I), -R7 1 et -R72 tels que définis pour -R7 pour les groupes de formule (B), -R101 représentant un groupe (C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1 et -R102 représentant un groupe (C1-C6) alkyle substitué par un groupe -Y.
  • Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les complexes de lanthanide (I) sont choisis parmi les complexes suivants :
    Figure imgb0014
    Figure imgb0015
    Figure imgb0016
    Figure imgb0017
    Figure imgb0018
    Figure imgb0019
  • Un complexe de lanthanide particulièrement préféré est le complexe (Ia.2).
  • Selon un second mode de réalisation, les complexes de lanthanide selon l'invention sont choisis parmi les complexes de lanthanide de formule (II) :
    Figure imgb0020
     dans lesquels :
    • Ln est un lanthanide choisi parmi Tb et Dy,
    • -R11 et -R12, identiques ou différents, sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi -X1, -Y, un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6) alkyle,
      -Chrom4-, -Chrom5-, et -Chrom6-, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe de formule (B), tel que défini dans le cadre de l'invention.
  • De préférence, -R4 et/ou -R5 représente un hydrogène dans -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6-. De préférence, -R4 et -R5 représentent des hydrogènes dans -Chrom4-, -Chrom5- et - Chrom6-.
  • Selon un mode de réalisation, -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques. Ces complexes seront nommés (IIa).
  • Dans les complexes (IIa), -R1 représente avantageusement un groupe électrodonneur -E1 tel que défini pour les groupes de formule (B), notamment choisi parmi les groupes -OR10 et -NH(CO)R10, -R10 étant tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence, -R1 représente un groupe -OR10, et en particulier -OMe ou -OPEG dans les complexes (IIa).
  • Dans les complexes (IIa), -R2 est avantageusement un groupe -R7 tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence, -R2 représente -Me dans les complexes (IIa).
  • Dans les complexes (IIa), -R3 est avantageusement un hydrogène ou un groupe -R8 tel que défini pour les groupes de formule (B), préférentiellement -Me. De préférence, -R3 est un hydrogène dans les complexes (IIa).
  • Selon un autre mode de réalisation, les complexes de lanthanide (II), nommés (IIb), sont tels que :
    • -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques et sont de structure (B10) :
      Figure imgb0021
       avec -R13 , -R23 , -R33 , -R43 , et -R53 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, et -R5 dans les groupes de structure (B), étant entendu que -Chrom5- et -Chrom6- ne comprennent pas de groupe réactif, et
    • -Chrom4- est différent de -Chrom5- et de -Chrom6- et est de structure (B11) :
      Figure imgb0022
       avec -R14 , -R24 , -R34 , -R44 et -R54 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans les groupes de structure (B), étant entendu que -Chrom4-comprend un groupe réactif -X1 permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule.
  • Selon un autre mode de réalisation, les complexes de lanthanide (II), nommés (IIc) sont tels que :
    • -Chrom4- et -Chrom6- sont identiques et sont de structure (B12) :
      Figure imgb0023
       avec -R15 , -R25 , -R35 , -R45 et -R55 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans les groupes de formule (B), étant entendu que -Chrom4- et -Chrom6- ne comprennent pas de groupe réactif, et
    • -Chrom5- est différent de -Chrom4- et de -Chrom6- et est de structure (B13) :
      Figure imgb0024
       avec -R16, -R26, -R36, -R46 et -R56 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans les groupes de formule (B), étant entendu que -Chrom5- comprend un groupe réactif -X1 permettant son couplage par liason covalente à une biomolécule.
  • Avantageusement, dans les complexes (IIb) et (IIc), -R13 et -R15 , lorsqu'ils sont présents, sont des groupes -O(C1-C6) alkyle ou -NH(CO)(C1-C6) alkyle éventuellement substitué par un groupe -Y. De préférence dans les complexes (IIb) et (IIc), -R13 et -R15 sont des groupes -O(C1-C6) alkyle éventuellement substitué par un groupe -Y, et en particulier -OMe ou -OPEG.
  • Avantageusement dans les complexes (IIb) et (IIc), -R14 et -R16 , lorsqu'ils sont présents, représentent un groupe -O(C1-C6) alkyle ou NH(CO)(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1. De préférence dans les complexes (IIb) et (IIc), -R14 et -R16 sont des groupes -O(C1-C6) alkyle éventuellement substitué par un groupe -X1.
  • Dans les complexes (IIb) et (IIc), R23 , -R24 , -R25 et -R26, lorsqu'ils sont présents, peuvent être identiques ou différents, et représenter un groupe -R7 tel que défini pour les groupes de formule (B). De préférence dans les complexes (IIb) et (IIc), R23 , -R24 , -R25 et -R26 , lorsqu'ils sont présents, sont identiques et représentent, préférentiellement -Me.
  • Dans les complexes (IIb) et (IIc), R23 , -R24 , -R25, et -R26 , lorsqu'ils sont présents, peuvent être identiques ou différents et représenter un hydrogène ou un groupe -R8 tel que défini pour les groupes de formule (B), préférentiellement -Me. De préférence, R23 , -R24 , -R25 , -R26 , lorsqu'ils sont présents, sont identiques et représentent, préférentiellement un hydrogène.
  • Dans les complexes (IIb) et (IIc), R33 , -R34 , -R35 et -R36 , lorsqu'ils sont présents, peuvent être identiques ou différents et représenter un hydrogène ou un groupe -R8 tel que défini pour les groupes de formule (B), préférentiellement -Me. De préférence, R33 , -R34 , -R35 et -R36, lorsqu'ils sont présents, sont identiques et représentent un hydrogène.
  • De préférence dans les complexes (IIb) et (IIc), -R33 , -R34 , -R35 et -R36, lorsqu'ils sont présents, sont identiques et représentent avantageusement des hydrogènes, et -R23 , -R24 , -R25 et - R26 , lorsqu'ils sont présents, sont identiques et représentent chacun un groupe -R7, tel que défini pour les groupes de formule (B), de préférence -Me.
  • En particulier, Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques ou différents, et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B14) suivante :
    Figure imgb0025
     avec -R7 et -E1 tels que définis pour les groupes de formule (B), et -R7 représentant de préférence -Me et -E1 représentant de préférence un groupe -OR10 ou -NCO(NR10) éventuellement substitué par un groupe -Y ou un groupe -X1, R10 étant tel que défini pour les groupes de formule (B).
  • Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les complexes de lanthanide (IIb) sont tels que :
    • -R13 est un groupe -O(C1-C6) alkyle éventuellement substitué par un groupe -Y,
    • -R14 est un groupe -O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1,
    • -R23 et -R24 sont identiques ou différents, de préférence identiques, et représentent un groupe -R7, et en particulier un groupe (C1-C6) alkyle, et
    • -R33 , R34 , -R43 , -R44 , -R53 et -R54 sont des hydrogènes.
  • Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les complexes de lanthanide (IIc) sont tels que :
    • -R15 est un groupe -O(C1-C6) alkyle éventuellement substitué par un groupe -Y,
    • -R16 est un groupe -O(C1-C6) alkyle substitué par un groupe -X1,
    • -R25 et -R26 sont identiques ou différents, de préférence identiques, et représentent un groupe -R7, et en particulier un groupe (C1-C6) alkyle, et
    • -R35 , R36, -R45, -R46, -R55 et -R56 sont des hydrogènes.
  • L'invention a également pour objet les agents chélatants correspondant aux composés de lanthanide définis dans le cadre de l'invention, et ce quelle que soit leur variante de réalisation décrite. L'invention concerne aussi de tels macrocycles chélatants sous leur forme protégée selon la formule (III) et à de tels ligands chélatants sous leur forme protégée selon la formule (IV).
  • L'invention concerne également les agents chélatants de formule (III) :
    Figure imgb0026
     avec -Chrom1', -Chrom2', et -Chrom3', identiques ou différents, et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B5) :
    Figure imgb0027
     avec R1, R2, R3, R4 et R5 tels que définis pour les complexes de lanthanide (I), et -R13 un groupe protecteur des fonctions acide (i.e. -Z(O)OH), tel qu'un alkyle, et notamment un méthyle, ou sous la forme d'un sel.
  • L'invention a aussi pour objet les agents chélatants de formule (IV) :
    Figure imgb0028
     avec -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- tels que définis pour les complexes de lanthanide de formule (II), et -R13 un groupe protecteur des fonctions acide, tel qu'un alkyle, et notamment un méthyle, ou sous la forme d'un sel.
  • La préparation des complexes (I) et (II) selon l'invention met en œuvre des techniques et des réactions classiques connues de l'homme de l'art. Ils peuvent, notamment, être obtenus selon des procédés analogues à ceux décrits dans les exemples.
  • Les réactions de complexation sont, en général, menées avec un sel du lanthanide souhaité, notamment un chlorure, un nitrate ou un triflate, dans un solvant dissociant, notamment un alcool tel que le méthanol, le THF ou l'acétonitrile, ou encore dans un mélange de solvants, en présence généralement d'un carbonate, à une température comprise entre 25 et 80 °C, pendant une durée variant de 30 minutes à quelques heures.
  • Les composés (III) et (IV) sont d'accès relativement aisé et classique, et peuvent être obtenus à un coût de préparation raisonnable. Les réactifs sont en effet disponibles dans le commerce ou facilement accessibles.
  • Les groupes fonctionnels éventuellement présents dans les composés de formule (III) et (IV), et dans les intermédiaires réactionnels, peuvent être protégés au cours des synthèses, soit sous forme permanente soit sous forme temporaire, par des groupes protecteurs qui assurent une synthèse univoque des composés attendus. Les réactions de protection et de déprotection sont effectuées selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Par groupe protecteur temporaire, on entend les groupes protecteurs tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. et Wuts P. G. M., ed. John Wiley & Sons, 2006 , et dans Protecting Groups, Kocienski P. J. 1994, Georg Thieme Verlag.
  • Selon la formule (I) est décrite la famille de complexes de lanthanide issus de la coordination d'un ligand macrocyclique de formule (III) après déprotection et libération des fonctions acide - Z(O)OH (acide dialkyle ou diaryle phosphinique lorsque -Z- = -P(Rz)- ou acide carboxylique lorsque -Z- = -C-).
  • Selon un premier mode de réalisation, -Chrom1', -Chrom2', et -Chrom3' sont identiques. Selon ce mode de réalisation, l'agent chélatant de formule (III) peut être obtenu par alkylation d'un cycle de type TACN.3HCl avec un intermédiaire de formule (B6) :
    Figure imgb0029
     avec -A-, -R1, -R2, -R3, -R4,-R5 et -R13 tels que définis pour les agents chélatants (III), et -LG représentant un groupe partant.
  • Par « groupe partant », on entend un groupe apte à se détacher du reste de la molécule dans les conditions réactionnelles, de sorte qu'un autre réactif réagisse avec le reste de la molécule pour former une nouvelle liaison avec l'atome de carbone portant initialement le groupe partant. La nature du groupe partant n'est pas limitée, et tout groupe partant connu de l'homme du métier peut convenir. A titre d'exemples, on peut citer les sulfonates, comme le mésylate ou le tosylate.
  • L'intermédiaire (B6) peut être préparé, selon des techniques bien connues de l'homme du métier, à partir de l'intermédiaire (B7) suivant :
    Figure imgb0030
     avec -R1, -R2, -R3, -R4, -R5, -R13 et -Z- tels que définis pour l'intermédiaire (B6).
  • L'intermédiaire (B7) peut être synthétisé à partir du réactif (B9), par formation d'un acide boronique (B8), suivie d'une réaction de Suzuki avec un dialkyl-4-halogéno-2,6-pyridinedicarboxylate :
    Figure imgb0031
     avec -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 tels que définis pour l'intermédiaire (B7) et -hal représentant un halogène, comme -Br, -Cl ou -I.
  • Selon un second mode de réalisation, -Chrom1' et -Chrom2' sont identiques, et -Chrom3' est différent de -Chrom1' et -Chrom2'. Selon ce mode de réalisation, l'agent chélatant de formule (III) peut être préparé par alkylation de l'intermédiaire (III') avec l'intermédiaire de formule (B6"), avec -R1", -R2", -R3", -R4", -R5", -R13", -Z" et -LG" tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, -R5, -R13, -Z et -LG pour l'agent chélatant de formule (III) :
    Figure imgb0032
  • L'intermédiaire (III') peut être préparé par alkylation d'un cycle de type TACN.3HCl avec l'intermédiaire de formule (B6'), avec -R1', -R2', -R3', -R4', -R5', -R13', -Z' et -LG' tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, -R5, -R13, -Z et -LG pour l'agent chélatant (III) :
    Figure imgb0033
  • Avantageusement, une des trois fonctions amine du cycle de type TACN.3HCl est protégée, via un groupe protecteur des fonctions amine, préalablement à l'étape d'alkylation avec l'intermédiaire de formule (B6') ; une étape de déprotection subséquente permettant de générer l'intermédiaire (III')
  • Les intermédiaires (B6') et (B6") peuvent être obtenus de manière analogue à l'intermédiaire (B6).
  • Selon la formule (II) est décrite la famille de complexes de lanthanide issus de la coordination d'un ligand chélatant de formule (IV) après déprotection et libération des fonctions acide carboxylique. Pour la synthèse de ces composés, on pourra notamment se référer aux demandes WO 2013/026790 et WO 2013/092992 de Takalo .
  • L'invention concerne enfin un procédé de détection d'une biomolécule comprenant la détection de la luminescence d'un conjugué de ladite biomolécule avec un complexe luminescent tel que défini dans le cadre de l'invention, comprenant un groupe réactif, et obtenu par couplage de ladite biomolécule avec ledit complexe luminescent sur son groupe réactif.
    • La figure 1 présente le spectre d'absorption et d'émission du complexe Ia.4 dans l'eau à température ambiante.
    • La figure 2 présente le spectre d'émission du complexe Ia.6 dans un mélange méthanol/éthanol 4 :1 à température ambiante.
    • La figure 3 représente des images de cellules fixées au PFA et marquées par le complexe Ia.2 (excitation biphotonique λex = 720 nm), obtenues avec l'émission dans le visible du complexe Ia.2 (image de gauche) ou obtenue en lumière transmise DIC (image de droite).
    • La figure 4 représente des images de cellules fixées au PFA et marquées par le complexe Ia.5 (excitation biphotonique λex = 720 nm), obtenues avec l'émission dans le visible du complexe Ia.5 (images a et c) ou obtenue en lumière transmise DIC (images b et d).
  • Les exemples ci-dessous permettent d'illustrer l'invention, mais n'ont aucun caractère limitatif.
    • Exemples
  • Les abréviations ci-dessous sont utilisées dans les exemples qui vont suivre : DCM : dichlorométhane ; DMF : diméthylformamide ;DMSO : diméthylsulfoxide ; Ms : mésyle ; n.d. : non déterminé ; PBS : phosphate buffered saline ; PEG : polyéthylène glycol ; PFA : paraformaldéhyde ; quant. : quantitatif ; TACN : Triazacyclononane ; THF : Tétrahydrofurane ; Ts : tosyle
    • Informations Générales :
  • Les spectres RMN (1H, 13C) ont été enregistrés sur un appareil Bruker Avance à une fréquence de 300 MHz ou 500,10 MHz, et 75 MHz ou 125,75 MHz, pour 1H et 13C respectivement. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en partie par million (ppm) par rapport au triméthylsilane utilisé comme référence interne et en utilisant les solvants indiqués. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hz et les notations suivantes sont utilisées : s (singulet), br (broad), d (doublet), t (triplet), dd (doublet de doublet), m (multiplet). Les spectres de masse haute résolution ont été enregistrés au centre commun de spectrométrie de masse de Lyon (Université Claude Bernard Lyon, Lyon, France) sur un appareil MicroTOFQII équipé avec une source ESI positive. Les chromatographies sur couche mince ont été réalisées sur des plaques de gel de silice sur feuilles d'aluminium (silica gel, Fluka) et révélées à l'aide d'une lampe UV (λ = 254 ou 365 nm) ou bien par coloration. Les purifications ont été réalisées par colonne chromatographique sur gel de silice (silica gel 0,035-0,070 mm, 60A). Les solvants utilisés pour les réactions ont été achetés chez Aldrich ou Acros Organics en tant que solvants secs ou extra sec et stockés sur tamis moléculaire 3Å et les réactifs utilisés ont été achetés chez Aldrich, Acros Organics ou Alfa Aesar. Les spectres d'absorption UV/Vis ont été enregistrés sur un spectromètre JASCO V670 ; les spectres d'émission sur un spectrofluorimètre JOBIN-YVON fluorolog 3. Les temps de rétention ont été réalisés sur un appareil Agilent Technologies 1260 équipé d'une colonne aWaters XBridge RP-C18 (3.5 µm, 4.6 × 100 mm). Le système chromatographique utilisé est formiate d'ammonium 0.25M-MeCN (v/v) comme éluants : isocratique 15% MeCN (2 min), gradient linéaire 15 à 100% MeCN (16 min), isocratique 100% MeCN (4 min), à un débit de 1mL.min-1, détection UV à 210 et 252 nm. Les tests d'imagerie cellulaire ont été réalisés à partir d'une solution concentrée en complexe dans le DMSO afin d'obtenir une concentration finale en complexe de l'ordre de 1.10-5 M dans le milieu cellulaire (PBS) avec < 1% DMSO. Les cellules T24 sont préalablement fixées au PFA. Les spectres d'absorption biphotonique ont été réalisés avec un microscope confocal à balayage laser LSM710 NLO (Cari Zeiss).
    • A. PREPARATION DES COMPLEXES Exemple 1 : Complexes d'Europium Ia-Ie
  • Figure imgb0034
    Figure imgb0035
  • Les composés la (4-bromo-3-méthylanisole), 1e (1-bromo-3,5-diméthoxybenzène) et 2e (acide 2,4-dimethoxyphenylboronique) sont disponibles commercialement. Les composés 1b et 1d sont préparés à partir du phénol correspondant, tandis que le composé 1c est préparé à partir de l'aniline correspondante. Les acides boroniques 2a-2d sont ensuite obtenus selon une procédure bien connue de l'homme du métier. Les composés 3a-e sont obtenus par une réaction de couplage de Suzuki avec du diméthyl-4-iododipicolinate. Puis, une réaction de réduction puis de mésylation permet d'isoler les composés 5a-e.
    Figure imgb0036
    Figure imgb0037
  • Une réaction d'alkylation du TACN.3HCl par les dérivés mésylates 5a-e, dans des conditions classiques d'alkylation, suivie d'une étape de déprotection des fonctions acide carboxylique, permettent d'obtenir les complexes de lanthanide Ia-Ie.
    • Composé 1b
  • Figure imgb0038
  • Le 4-bromo-3-methylphenol (1.0 g, 5.3 mmol) et K2CO3 (3,7 g, 27 mmol) sont séchés sous vide puis solubilisés dans la DMF sèche (20 mL). Après 30 minutes, le triethylene glycol methyl ether tosylate (2.55 g, 8 mmol) est ajouté dans le schlenck. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à 80°C pendant 5 jours. La solution est ensuite filtrée sur fritté P3, rincée avec CH2Cl2 et concentrée sous vide. Le milieu est dilué dans AcOEt/Et2O et lavée avec H2O et NaClsat. La phase organique est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 90/10 à 80/20) pour donner le produit pur sous forme d'huile incolore (1.62 g, 91%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 80/20) = 0.53 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.38 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H6), 6.81 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H3), 6.62 (dd, 1H, J3 = 8.7 Hz, J4= 2.9 Hz, H5), 4.08 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H8), 3.83 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H9), 3.75-3.53 (m, 8H, H10/H11/H12/H13), 3.38 (s, 3H, H14), 2.35 (s, 3H, H7) ; 13C NMR (100 MHz, CDCl3, δ): 158.2 (C4), 138.9 (C2), 132.9 (C6), 117.4 (C3), 115.8 (C1), 113.8 (C5), 72.1 (C13), 71.0 (C10), 70.8 (C11), 70.8 (C12), 69.8 (C9), 67.8 (C8), 59.2 (C14), 23.3 (C7) ; HRMS (ESI) calculée pour C14H21BrNaO4 355.0515. Exp 355.0520 [M+Na]+.
    • Composé 1c
  • Figure imgb0039
  • Dans un ballon, l'anhydride acétique (305 µL, 3.22 mmol) est ajouté à une solution de 4-bromo-3-methylaniline (500 mg, 2.69 mmol) dans CH2Cl2 sec sous Argon. Le mélange est agité à température ambiante sous Argon jusqu'à la réaction complète (suivi CCM, éther de pétrole/acétate d'éthyle, 80/20). Après 4h, le mélange est lavé avec H2O (3x). La phase organique est séchée sur Na2SO4, filtrée sur coton et évaporée pour obtenir un solide blanc (506 mg, 82%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 80/20) = 0.46 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.45-7.42 (m, 2H, H6/H3), 7.19 (dd, 1H, J3= 8.6 Hz, J4= 2.4 Hz, H5), 2.36 (s, 3H, H7), 2.16 (s, 3H, H9) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 169.0 (C8), 138.5 (C4), 137.2 (C1), 132.6 (C3), 122.4 (C6), 119.6 (C2), 119.2 (C5), 24.5 (C9), 23.1 (C7) ; HRMS (ESI) calculée pour C9H11BrNO 228.0024. Exp 228.0019 [M+H]+.
    • Composé 1d
  • Figure imgb0040
  • Le 4-bromo-3,5-dimethylphenol (1.30 g, 6.46 mmol) et K2CO3 (4.46 g, 9.68 mmol) sont séchés sous vide puis solubilisés dans la DMF sèche (12 mL). Un bullage d'Argon est effectué pendant 10 minutes et le triethylene glycol methyl ether tosylate (3.08 g, 9.68 mmol) est ajouté dans le schlenck. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à 80°C pendant 3 jours. Une extraction CH2Cl2/H2O est ensuite effectuée, puis la phase organique est séchée avec NaClsat et Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 100/0 à 80/20) pour donner une huile du produit pur (1.5 g, 67%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 95/5) = 0.38 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 6.66 (s, 2H, H3), 4.07 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H8), 3.82 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H9), 3.74-3.52 (m, 8H, H10/H11/H12/H13), 3.37 (s, 3H, H14), 2.36 (s, 6H, H7) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 157.4 (C4), 139.2 (C1), 118.5 (C2/6), 114.7 (C3/5), 72.1 (C13), 71.0 (C10), 70.8 (C11), 70.7 (C12), 69.8 (C9), 67.7 (C8), 59.2 (C14), 24.1 (C7) ; HRMS (ESI) calculée pour C15H23BrNaO4 369.0672. Exp 369.0664 [M+Na]+.
    • Composé 2a
  • Le composé 2a a été préparé selon le protocole décrit dans " Substituent Effects on Oxidation-Induced Formation of Quinone Methidesfrom Arylboronic Ester Precursors ", Sheng Cao, Robin Christiansen, and Xiaohua Peng, Chem. Eur. J., 2013, 19, 9050 - 9058.
    • Composé 2b
  • Figure imgb0041
  • L'acétate de potassium sec (442 mg, 8.46 mmol) est solubilisé dans le DMSO sec (15 mL) sous Argon puis le bis(dipicolinato)diboron (572 mg, 2.25 mmol) et 1b (500 mg, 1.50 mmol) sont ajoutés. La solution est placée sous bullage d'Argon pendant 20 minutes puis PdCl2(dppf)2 (77 mg, 0.11 mmol) est ajouté. Le mélange réactionnel est mis à chauffer à 90°C sous Argon et sous agitation pendant 16h. Une extraction en série H2O/Et2O est ensuite effectuée. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec NaClsat, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 90/10 à 80/20) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'huile jaune (516 mg, 90%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 80/20) = 0.57 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 7.69 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H6), 6.72-6.69 (m, 2H, H3/H5), 4.13 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H8), 3.85 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H9), 3.75-3.53 (m, 8H, H10/H11/H12/H13), 3.38 (s, 3H, H14), 2.50 (s, 3H, H7), 1.32 (s, 12H, H16) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 161.1 (C4), 147.3 (C2), 138.0 (C6), 120.6 (C1), 116.4 (C3), 110.9 (C5), 83.3 (C15), 72.1 (C13), 71.0 (C10), 70.8 (C11), 70.8 (C12), 69.9 (C9), 67.2 (C8), 59.2 (C14), 25.1 (C16), 22.6 (C7) ; HRMS (ESI) calculée pour C20H33BNaO6 403.2262. Exp 403.2255 [M+Na]+.
    • Composé 2c
  • Figure imgb0042
  • L'acétate de potassium (515 mg, 5.25 mmol) est mis à séché sous vide/Argon pendant 1h puis le bis(pinacolato)diboron (668 mg, 2.63 mmol), le DMSO sec (6 mL) et 1c (400 mg, 1.75 mmol) sont ajoutés. Un bullage d'Argon dans le mélange est effectué pendant 20 min puis PdCl2(dppf)2.CH2Cl2 (100 mg, 0.12 mmol) est ajouté et le schlenck est fermé. La solution est mise à chauffer à 90°C sous Argon et sous agitation pendant 19h. Après retour à température ambiante, le mélange est filtré sur fritté P3 et rincé avec Et2O. On procède ensuite à une extraction en série avec H2O/Et2O. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na2SO4, filtrées sur coton et évaporées. L'évaporation lente du CH2Cl2 donne lieu à la formation de cristaux qui sont lavés plusieurs fois au CH2Cl2 et séchés sous vide. La RMN 1H montre l'obtention du produit attendu pur (240 mg, 50%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 80/20) = 0.61 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.72 (d, 1H J= 8 Hz, H5), 7.33 (s, 1H, H3), 7.30 (d, 1H, J= 8 Hz, H6), 7.18 (s, 1H, NH), 2.51 (s, 3H, H7), 2.16 (s, 3H, H9), 1.33 (s, 12H, H11) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 168.7 (C8), 146.4 (C2), 140.3 (C4), 137.1 (C6), 120.6 (C3), 115.9 (C5), 83.4 (C10), 25.1 (C9), 25.0 (C11), 22.4 (C7) ; HRMS (ESI) calculée pour C15H23BNO3 276.1768. Exp 276.1762 [M+H]+.
    • Composé 2d
  • Figure imgb0043
  • L'acétate de potassium sec (830 mg, 8.46 mmol) est solubilisé dans le DMSO sec (10 mL) sous Argon puis le bis(dipicolinato)diboron (1.07 g, 4.23 mmol) et 1d (979 mg, 2.82 mmol) sont ajoutés. La solution est placée sous bullage d'Argon pendant 20 minutes puis PdCl2(dppf)2.CH2Cl2 (161 mg, 0.20 mmol) est ajouté. Le mélange réactionnel est mis à chauffer à 90°C sous Argon et sous agitation pendant 40h. Une extraction en série H2O/Et2O est ensuite effectuée. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec NaClsat, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 95/5 à 80/20) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'huile (748 mg, 68%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 80/20) = 0.43 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 6.51 (s, 2H, H3), 4.09 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H8), 3.82 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H9), 3.74-3.53 (m, 8H, H10/H11/12/H13), 3.37 (s, 3H, H14), 2.37 (s, 6H, H7), 1.36 (s, 12H, H16) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 159.7 (C4), 144.5 (C2/6), 113.2 (C3/5), 83.5 (C15), 72.1 (C13), 70.9 (C10), 70.8 (C11), 70.7 (C12), 69.9 (C9), 67.1 (C8), 59.1 (C14), 25.0 (C16), 22.7 (C7) ; HRMS (ESI) calculée pour C21H35BNaO6 417.2423. Exp 417.2417 [M+Na]+.
    • Composé 3a
  • Figure imgb0044
  • Dans un schlenck, le diméthyl-4-iododipicolinate (300 mg, 0.934 mmol) et l'acide 2-méthyl,4-méthoxyphenylboronic (186 mg, 1.121 mmol) sont solubilisés dans la DMF sèche (15 mL) sous Argon. Après 30 minutes de bullage d'Argon dans le milieu, le fluorure de césium (355 mg, 2.335 mmol) et Pd(PPh3)4 (cat.) sont ajoutés. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation à 90°C sous Argon pendant 17h. Le mélange est ensuite dilué dans CH2Cl2 puis extrait avec H2O. La phase chlorée est évaporée et la phase aqueuse est extraite de nouveau avec AcOEt. La phase organique est lavée avec NaClsat., séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide. Le produit brut obtenu est purifié sur 2 colonnes chromatographiques (SiO2, CH2Cl2/acétone, 90/10 puis SiO2, CH2Cl2/AcOEt 98/2 à 95/5) afin d'obtenir le produit pur (159 mg, 54%). Rf (SiO2, CH2Cl2/acétone, 80/20) = 0.82 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.28 (s, 2H, H3/5), 7.24-7.20 (m, 1H, H12), 6.87-6.85 (m, 2H, H11/H9), 4.04 (s, 6H, H16), 3.86 (s, 3H, H14), 2.32 (s, 3H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 165.5 (C15), 160.5 (C10), 152.6 (C4), 148.4 (C2/6), 137.0 (C8), 131.0 (C12), 128.8 (C7), 121.7 (C3/5), 116.6 (C9), 112.1 (C11), 55.5 (C14), 53.4 (C16), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée C17H17NNaO5 338.0999. Exp 338.0990 [M+Na]+.
    • Composé 3b
  • Figure imgb0045
  • Le dimethyl 4-iodo-2,6-pyridinedicarboxylate sec (344 mg, 1.07 mmol) est solubilisé dans la DMF sèche (12 mL) et 2b (448 mg, 1.18 mmol) est ajouté sous Argon. La solution est placée sous bullage d'Argon pendant 30 minutes puis le fluorure de potassium (205 mg, 3.53 mmol) et Pd(dba)3tBu3PH.BF4 (43 mg, 0.08 mmol) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est placé à 80°C sous agitation et sous Argon pendant 40h. Une extraction en série AcOEt/H2O est ensuite effectuée. Les phases organiques sont lavées avec NaClsat, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/acétone, 95/5 à 90/10) pour obtenir le produit pur sous forme de solide blanc (343 mg, 72%). Rf (SiO2, CH2Cl2/acétone, 90/10) = 0.45 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 8.26 (s, 2H, H3/5), 7.19 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H12), 6.87 (d, 1H, J = 2.3 Hz, H9), 6.86 (dd, 1H, J3 = 8.3 Hz, J4= 2.3 Hz, H11), 4.17 (t, 2H, J = 4.7 Hz, H14), 4.03 (s, 6H, H22), 3.86 (t, 2H, J = 4.7 Hz, H15), 3.76-3.54 (m, 8H, H16/H17/H18/H19), 3.38 (s, 3H, H20), 2.30 (s, 3H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 165.5 (C21), 159.7 (C10), 152.6 (C4), 148.3 (C2/6), 136.9 (C8), 130.9 (C12), 130.1 (C7), 128.7 (C3/5), 117.3 (C9), 112.7 (C11), 72.1 (C19), 71.0 (C16), 70.9 (C17), 70.8 (C18), 69.8 (C15), 67.7 (C14), 59.2 (C20), 53.4 (C22), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C23H30NO8 448.1966. Exp 448.1959 [M+H]+.
    • Composé 3c
  • Figure imgb0046
  • 2c (200 mg, 0.73 mmol) et le dimethyl 4-iodo-2,6-pyridinedicarboxylate (212 mg, 0.66 mmol) sont préalablement séchés sous vide/Argon puis la DMF sèche (15 mL) est ajoutée. La solution est dégazée pendant 20 min sous Argon et le fluorure de potassium (126 mg, 2.18 mmol) et Pd(dba)3tBu3PH.BF4 (27 mg, 0.05 mmol) sont ajoutés. Le mélange est placé à 80°C sous Argon pendant 3 jours. Après retour à température ambiante, du CH2Cl2 est ajouté et la phase organique est lavée avec H2O (3x) et NaCl saturé (1x). La phase organique est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide. Après évaporation lente d'un mélange DCM/MeOH, des cristaux sont obtenus et rincés avec un minimum de CH2Cl2 afin d'obtenir le produit pur (107 mg, 47%). Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.55 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.25 (s, 2H, H3/5), 7.96 (s, 1H, NH), 7.55 (s, 1H, H9), 7.48 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H11), 7.19 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H12), 4.00 (s, 6H, H17), 2.26 (s, 3H, H13), 2.19 (s, 3H, H15) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 168.9 (C14), 165.3 (C16), 152.3 (C4), 148.3 (C2/6), 139.2 (C10), 136.2 (C8), 133.0 (C7), 130.2 (C12), 128.6 (C3/5), 121.9 (C9), 117.8 (C11), 53.3 (C17), 24.7 (C15), 20.6 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C18H19N2O5 343.1288. Exp 343.1289 [M+H]+.
    • Composé 3d
  • Figure imgb0047
  • Le dimethyl 4-iodo-2,6-pyridinedicarboxylate sec (144 mg, 0.45 mmol) est solubilisé dans la DMF sèche (5 mL) et 2d (195 mg, 0.50 mmol) est ajouté sous Argon. La solution est placée sous bullage d'Argon pendant 20 minutes puis le fluorure de césium (171 mg, 0.11 mmol) et Pd(PPh3)4 (52 mg, 0.05 mmol) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est placé à 80°C sous agitation et sous Argon pendant 5 jours. Une extraction en série AcOEt/H2O est ensuite effectuée. Les phases organiques sont lavées avec NaClsat, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/acétone, 100% à 80/20) pour obtenir le produit pur sous forme d'huile (85 mg, 39%). Rf (SiO2, CH2Cl2/acétone, 95/5) = 0.41 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.08 (s, 2H, H3/5), 6.66 (s, 2H, H8), 4.11 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H14), 3.99 (s, 6H, H22), 3.83 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H15), 3.72-3.50 (m, 8H, H16/H17/H18/H19), 3.34 (s, 3H, H20), 1.94 (s, 6H, H13) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 165.2 (C21), 158.7 (C10), 152.5 (C4), 148.7 (C2/6), 136.5 (C8/12), 130.0 (C7), 129.6 (C3/5), 114.0 (C9/11), 72.0 (C19), 70.9 (C16), 70.7 (C17), 70.6 (C18), 69.7 (C15), 67.4 (C14), 59.0 (C20), 53.2 (C22), 21.0 (C13).
    • Composé 3e
  • Figure imgb0048
  • Dans un schlenck, le diméthyl-4-iododipicolinate (200 mg, 0.623 mmol) et l'acide 2,4-diméthoxyphenylboronic (125 mg, 0.685 mmol) sont solubilisés dans la DMF sèche (7 mL) sous Argon. Après 30 minutes de bullage d'Argon dans le milieu, le fluorure de potassium (119 mg, 2.056 mmol) et Pd(dba)3tBu3PH.BF4 (36 mg, 0.062 mmol) sont ajoutés. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation à 80°C sous Argon pendant 19h. Le mélange est ensuite dilué dans un mélange AcOEt/Et2O puis extrait avec H2O puis NaClsat. La phase organique est ensuite séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée sous vide. Le solide brun obtenu est finalement purifié sur colonne chromatographique (SiO2, AcOEt/EP, 20/80 à 60/40, dépôt solide) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'une solide beige (131 mg, 63%). Rf (SiO2, EP/AcOEt, 60/40) = 0.73 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.50 (s, 2H, H3/5), 7.40 (d, 1H, J = 8.5 Hz, H12), 6.63 (dd, 1H, J3 = 8.4 Hz, J4= 2.4 Hz, H11), 6.58 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H9), 4.04 (s, 6H, H16), 3.88 (s, 3H, H13), 3.87 (s, 3H, H14) ; 13C NMR (100 MHz, CDCl3, δ): 165.8 (C15), 162.5 (C10), 158.2 (C8), 149.2(C4), 148.1(C2/6), 131.6(C12), 128.4(C3/5), 118.6(C7), 105.5(C9), 99.2(C11), 55.8(C13), 55.7(C14), 53.4 (C16) ; HRMS (ESI) calculée pour C17H17NNaO6 354.0948. Exp 354.0937 [M+Na]+.
    • Composé 4a
  • Figure imgb0049
  • 3a (180 mg, 0.571 mmol) est solubilisé dans un mélange CH2Cl2/MeOH (2/3 mL) puis refroidi à 0°C. NaBH4 (42 mg, 1.1 mmol) est ensuite ajouté et après 30 minutes, le milieu réactionnel est placé à température ambiante pendant 4h. La réaction est ensuite quenchée avec une solution HCl 1M. La phase organique est lavée avec H2O (2x) puis NaClsat, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/acétone 80/20 à 65/35) afin d'obtenir le produit pur sous forme de cristaux jaune pâle (136 mg, 83%). Rf (SiO2, CH2Cl2/acétone, 80/20) = 0.25 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 8.01 (s, 1H, H3), 7.46 (s, 1H, H5), 7.17 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H12), 6.85-6-81 (m, 2H, H11/H9), 4.89 (d, 2H, J = 4.6 Hz, H17), 4.01 (s, 3H, H16), 3.85 (s, 3H, H14), 3.31 (t, 1H, J = 4.6 Hz, OH), 2.29 (s, 3H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 165.9 (C15), 160.1 (C6, C10), 151.8 (C4), 147.1 (C2), 136.9 130.9 (C7), 130.8 (C12), 125.0 (C3), 124.6 (C5), 116.5 (C9), 111.9 (C11), 64.9 (C17), 55.5 (C14), 53.1 (C16), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C16H18NO4 288.1230. Exp 288.1220 [M+H]+. Calc pour C16H17NNaO4 310.1050. Exp 310.1038 [M+Na]+.
    • Composé 4b
  • Figure imgb0050
  • 3b (320 mg, 0.72 mmol) est solubilisé dans un mélange CH2Cl2/MeOH (2.5 mL/4.5 mL). Après avoir placé le milieu à 0°C, NaBH4 (30 mg, 0.79 mmol) est ajouté et après 30 minutes, la solution est mise à température ambiante sous agitation pendant 3h. La réaction est quenchée par ajout d'une solution HCl 1M. Puis une extraction CH2Cl2/H2O est effectuée. La phase organique est lavée avec NaClsat, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Une purification sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 98/2 à 97/3) est effectuée afin d'obtenir le produit pur sous forme d'huile incolore (270 mg, 90%). Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 97/3) = 0.22 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 7.99 (d, 1H, J = 0.9 Hz, H3), 7.47 (s, 1H, H5), 7.15 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H12), 6.85 (d, 1H, J = 2.3 Hz, H9), 6.83 (dd, 1H, J3= 8.4 Hz, J4= 2.3 Hz, H11), 4.89 (d, 2H, J = 3.9 Hz, H23), 4.16 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H14), 3.99 (s, 3H, H22), 3.87 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H15), 3.72-3.54 (m, 8H, H16/H17/H18/H19), 3.51 (m, 1H, OH), 3.37 (s, 3H, H20), 2.27 (s, 3H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 165.9 (C21), 160.3 (C6), 159.3 (C10), 151.8 (C4), 147.1 (C2), 136.8 (C8), 131.0 (C7), 130.8 (C12), 125.0 (C3), 124.6 (C5), 117.2 (C9), 112.5 (C11), 72.1 (C19), 71.0 (C16), 70.9 (C17), 70.8 (C18), 69.9 (C15), 67.6 (C14), 64.9 (C23), 59.2 (C20), 53.1 (C22), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C22H30NO7 420.2017. Exp 420.2015 [M+H]+.
    • Composé 4c
  • Figure imgb0051
  • 3c est solubilisé dans un mélange CH2Cl2/MeOH et NaBH4 est ajouté à 0°C. Après 5 minutes, la solution est laissée à température ambiante et la monoréduction est suivie par CCM (SiO2, DCM/MeOH, 95/5). Au bout de 2h30, la réaction est quenchée par HCl 1M. La phase organique est ensuite lavée avec H2O et NaClsat, puis séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (SiO2, DCM/MeOH, 95/5) et une poudre blanche est obtenue (56 mg, 58%). Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.30 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.98 (s, 1H, H3), 7.48 (m, 2H, H4/H9/NH), 7.42 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H11), 7.17 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H12), 4.90 (s, 2H, H18), 4.00 (s, 6H, H17), 3.57 (s, 1H, OH), 2.26 (s, 3H, H13), 2.20 (s, 3H, H15); 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 168.7 (C14), 165.8 (C16), 160.4 (C6), 151.4 (C4), 147.1 (C2), 138.6 (C10), 136.2 (C8), 134.2 (C7), 130.2 (C12), 124.7 (C3), 124.4 (C5), 121.9 (C9), 117.7 (C11), 64.9 (C18), 53.1 (C17), 24.8 (C15), 20.6 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C17H19N2O4 315.1339. Exp 315.1342 [M+H]+.
    • Composé 4d
  • Figure imgb0052
  • 3d (136 mg, 0.29 mmol) est solubilisé dans un mélange CH2Cl2/MeOH (50/50, 4 mL). Après avoir placé le milieu à 0°C, NaBH4 (42 mg, 1.11 mmol) est ajouté (coloration marron de la solution) et après 20 minutes, la solution est mise à température ambiante sous agitation pendant 6h. La réaction est quenchée par ajout d'une solution HCl 1M (4 mL). Puis une extraction CH2Cl2/H2O est effectuée. La phase organique est lavée avec NaClsat, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Une purification sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 70/30 à 50/50 puis 10% MeOH) est effectuée afin d'obtenir le produit pur (123 mg, 98%). Rf (SiO2, CH2Cl2/AcOEt, 80/20) = 0.32 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.08 (s, 1H, H3), 7.79 (s, 1H, H5), 6.63 (s, 2H, H9), 4.87 (s, 2H, H23), 4.09 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H14), 3.93 (s, 3H, H22), 3.81 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H15), 3.72-3.49 (m, 8H, H16/H17/H18/H19), 3.33 (s, 3H, H20), 1.93 (s, 6H, H13) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 165.6 (C21), 161.0 (C6), 158.2 (C10), 151.4 (C4), 147.1 (C2), 136.4 (C8/12), 130.9 (C7), 125.2 (C3/5), 113.6 (C9/11), 71.8 (C19), 70.7 (C16), 70.5 (C17), 70.4 (C18), 69.6 (C15), 67.2 (C14), 64.6 (C23), 58.9 (C20), 52.7 (C22), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C23H32NO7434.2173. Exp 434.2158 [M+H]+.
    • Composé 4e
  • Figure imgb0053
  • 3e (120 mg, 0.36 mmol) est solubilisé dans un mélange CH2Cl2/MeOH (2/3 mL) puis refroidi à 0°C. NaBH4 (15 mg, 0.40 mmol) est ensuite ajouté et après 15 minutes, le milieu réactionnel est placé à température ambiante pendant 4h. La réaction est ensuite quenchée avec une solution HCl 1M. La phase organique est lavée avec H2O (2x) puis NaClsat, séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit brut est ensuite purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/acétone 80/20) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'un solide beige (53 mg, 56%). Rf (SiO2, CH2Cl2/acétone, 80/20) = 0.17 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.21 (s, 1H, H3), 7.67 (s, 1H, H5), 7.33 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H12), 6.60 (dd, 1H, J3= 8.3 Hz, J4= 2.4 Hz, H11), 6.57 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H9), 4.87 (d, 2H, J = 4.5 Hz, H17), 4.00 (s, 3H, H16), 3.87 (s, 3H, H13), 3.84 (s, 3H, H14), 3.42 (br, 1H, OH).
    • Composé 5a
  • Figure imgb0054
  • 4a (126 mg, 0.439 mmol) est solubilisé dans CH2Cl2 sec (4 mL) et la triéthylamine (180 µL, 1.317 mmol) est ajoutée. Après avoir placé le milieu à 0°C, le chlorure de mésyle (50 µL, 0.702 mmol) est ajouté et après 5 minutes, le mélange réactionnel est placé à température ambiante pendant 30 minutes. La phase organique est lavée avec H2O, puis séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée pour donner une huile jaune utilisée sans purification supplémentaire pour l'étape suivante (137 mg, 85%). Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.83 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.08 (s, 1H, H3), 7.62 (s, 1H, H5), 7.18 (m, 1H, H12), 6.86-6.82 (m, 2H, H11/H9), 5.47 (s, 2H, H17), 4.02 (s, 3H, H16), 3.85 (s, 3H, H14), 3.16 (s, 3H, H18), 2.30 (s, 3H, H13).
    • Composé 5b
  • Figure imgb0055
  • 4b (282 mg, 0.67 mmol) est solubilisé dans CH2Cl2 (8 mL) puis la triéthylamine (280 µL, 2.02 mmol) est ajoutée. Le milieu est placé à 0°C puis le chlorure de mésyle (80 µL, 1.08 mmol) est ajouté. Après 5 minutes, le mélange réactionnel est placé à température ambiante pendant 30 minutes. La phase organique est lavée avec H2O puis les phases aqueuses sont réextraites par CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 98/2 à 96/4) afin d'obtenir le composé pur sous la forme d'une huile jaune pâle (304 mg, 91%). Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.49 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 8.08 (d, 1H, J = 1.5 Hz, H3), 7.62 (d, 1H, J = 1.5 Hz, H5), 7.16 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H12), 6.86 (d, 1H, J = 2.6 Hz, H9), 6.84 (dd, 1H, J3= 8.3 Hz, J4= 2.6 Hz, H11), 5.46 (s, 2H, H23), 4.17 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H14), 4.01 (s, 3H, H22), 3.88 (t, 2H, J= 4.7 Hz, H15), 3.76-3.55 (m, 8H, H16/H17/H18/H19), 3.38 (s, 3H, H20), 3.16 (s, 3H, H24), 2.28 (s, 3H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 165.6 (C21), 159.5 (C10), 154.4 (C6), 152.4 (C4), 147.8 (C2), 136.9 (C8), 130.8 (C12), 130.5 (C7), 125.90 (C3), 125.88 (C5), 117.3 (C9), 112.6 (C11), 72.1 (C19), 71.2 (C23), 70.9 (C16), 70.8 (C17), 70.1 (C18), 69.9 (C15), 67.8 (C14), 59.2 (C20), 53.3 (C22), 38.3 (C24), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C23H32NO9S 498.1792. Exp 498.1779 [M+H]+.
    • Composé 5c
  • Figure imgb0056
  • 4c (56 mg, 0.18 mmol) est solubilisé dans CH2Cl2 (4 mL) puis la triéthylamine 75 µL, 0.53 mmol) est ajoutée. Le mélange est placé à 0°C et le chlorure de mésyle (21 µL, 0.27 mmol) est ajouté. Après 5 minutes, la réaction est placée à température ambiante sous agitation pendant 40 minutes. Un lavage de la phase organique avec H2O est ensuite effectué et les phases aqueuses sont réextraites avec CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. La RMN 1H montre l'obtention du produit pur de manière quantitative (70 mg) et celui-ci est utilisé sans purification supplémentaire pour l'étape suivante. Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.64 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.04 (s, 1H, H3), 7.89 (s, 1H, NH), 7.59 (s, 1H, H45), 7.51 (s, 1H, H9), 7.46 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H11), 7.16 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H12), 5.43 (s, 2H, H18), 3.99 (s, 6H, H17), 3.14 (s, 3H, H19), 2.25 (s, 3H, H13), 2.19 (s, 3H, H15).
    • Composé 5d
  • Figure imgb0057
  • 4d (123 mg, 0.28 mmol) est solubilisé dans CH2Cl2 (5 mL) puis la triéthylamine (192 µL, 1.38 mmol) est ajoutée. Le milieu est placé à 0°C puis le chlorure de mésyle (53 µL, 0.68 mmol) est ajouté. Après 5 minutes, le mélange réactionnel est placé à température ambiante pendant 30 minutes. La phase organique est lavée avec H2O puis les phases aqueuses sont réextraites par CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous vide. Le produit obtenu est utilisé sans purification supplémentaire pour l'étape suivante. Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.76 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.90 (s, 1H, H3), 7.45 (s, 1H, H5), 6.66 (s, 2H, H9), 5.44 (s, 2H, H23), 4.12 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H14), 3.97 (s, 3H, H22), 3.83 (t, 2H, J= 4.6 Hz, H15), 3.74-3.51 (m, 8H, H16/H17/H18/H19), 3.35 (s, 3H, H20), 3.13 (s, 3H, H24), 1.95 (s, 6H, H13) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 165.3 (C21), 158.6 (C10), 154.7 (C6), 152.3 (C4), 148.0 (C2), 136.5 (C8/12), 130.4 (C7), 126.6/126.5 (C3/C5), 113.9 (C9/11), 71.9 (C19), 70.9 (C16), 70.7 (C17), 70.6 (C18), 69.7 (C15), 67.4 (C14), 59.0 (C20), 53.1 (C22), 38.1 (C23), 31.6 (C24), 21.0 (C13).
    • Composé 5e
  • Figure imgb0058
  • 4e (60 mg, 0.198 mmol) est solubilisé dans CH2Cl2 (3 mL) et la triéthylamine (83 µL, 0.593 mmol) )est ajoutée. Après avoir placé le milieu à 0°C, le chlorure de mésyle (24 µL, 0.317 mmol) est ajouté et après 5 minutes, le mélange réactionnel est placé à température ambiante pendant 30 minutes. La phase organique est lavée avec H2O, puis séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée pour donner une huile jaune utilisée sans purification supplémentaire pour l'étape suivante (76 mg, quant.). Rf (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.76 ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.29 (s, 1H, H3), 7.86 (s, 1H, H5), 7.35 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H12), 6.61 (dd, 1H, J3= 8.4 Hz, J4= 2.3 Hz, H11), 6.57 (d, 1H, J = 2.3 Hz, H9), 5.46 (s, 2H, H17), 4.02 (s, 3H, H16), 3.87 (s, 3H, H13), 3.85 (s, 3H, H14), 3.14 (s, 3H, H18).
    • Composé 6a
  • Figure imgb0059
  • Le triazacyclononane (27 mg, 0.115 mmol) et le carbonate de sodium (122 mg, 1.15 mmol) sont solubilisés dans l'acétonitrile sec (7 mL). Après 10 minutes à température ambiante, 5a (130 mg, 0.356 mmol) est ajouté et le mélange réactionnel est chauffé à 60°C sous agitation pendant 24h puis à température ambiante pendant 24h. Le mélange est ensuite filtré sur fritté P3, rincé avec CH3CN sec et les eaux mères sont évaporées. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 99/1 à 98/2) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'un solide jaune pâle (81 mg, 75%). Rf (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.58 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 7.94 (s, 3H, H3), 7.68 (s, 3H, H5), 7.09 (d, 3H, J = 8.2 Hz, H12), 6.79-6.75 (m, 6H, H9/H11), 3.98 (s, 9H, H16), 3.97 (s, 6H, H17), 3.83 (s, 9H, H14), 2.92 (s, 12H, H18), 2.23 (s, 9H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 166.2 (C15), 161.1 (C6), 159.9 (C10), 151.2 (C4), 147.3 (C2), 136.7 (C8), 131.1 (C7), 130.8 (C12), 127.0 (C5), 124.7 (C3), 116.3 (C9), 111.8 (C11), 64.8 (C17), 56.0 (C18), 55.4 (C14), 53.1 (C16), 20.9 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C54H62N6O9 469.2284. Exp 469.2273 [M+2H]++.
    • Composé 6b
  • Figure imgb0060
  • Le triazacyclononane (93 mg, 0.39 mmol) et le carbonate de sodium (414 mg, 3.91 mmol) sont solubilisés dans l'acétonitrile sec (24 mL) sous Argon. Après 10 minutes à température ambiante, 5b (289 mg, 1.21 mmol) est ajouté et le mélange réactionnel est chauffé à 60°C sous agitation pendant 24h puis à température ambiante pendant 24h. Le mélange est ensuite filtré sur fritté P3, rincé avec CH3CN sec et les eaux mères sont évaporées. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 99/1 à 95/5) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'une huile jaune (176 mg, 34%). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 7.92 (d, 3H, J = 1.1 Hz, H3), 7.67 (s, 3H, H5), 7.07 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H12), 6.81 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H9), 6.77 (dd, 1H, J3= 8.4 Hz, J4= 2.4 Hz, H11), 4.14 (t, 6H, J= 4.6 Hz, H14), 3.96 (br s, 15H, H23/ H22), 3.86 (t, 6H, J= 4.6 Hz, H15), 3.74-3.53 (m, 24H, H16/H17/H18/H19), 3.37 (s, 9H, H20), 2.91 (br s, 12H, H24), 2.21 (s, 9H, H13) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 166.2 (C21), 161.0 (C6), 159.2 (C10), 151.1 (C4), 147.3 (C2), 136.7 (C8), 131.3 (C7), 130.7 (C12), 127.0 (C5), 124.7 (C3), 117.0 (C9), 113.8 (C11), 72.1 (C19), 71.0 (C16), 70.8 (C17), 70.7 (C18), 69.8 (C15), 67.6 (C14), 64.7 (C23), 59.2 (C20), 55.9 (C24), 53.0 (C22), 20.8 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C72H98N6O18 667.3463 Exp 667.34558 [M+2H]2+.
    • Composé 6c
  • Figure imgb0061
  • 5c sec (70 mg, 0.18 mmol) est solubilisé dans l'acétonitrile sec (3 mL) et Na2CO3 (67 mg, 0.63 mmol) est ajouté ainsi que le triazacyclononane (13.6 mg, 0.06 mmol). Après bullage d'Argon dans le milieu pendant 5 min, la mélange réactionnel est mis à chauffer à 60°C pendant 5 jours. Le mélange est ensuite filtré sur fritté P3, rincé avec CH3CN sec et les eaux mères sont évaporées. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 96/4) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'une poudre blanche (47 mg, 81%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 8.94 (s, 3H, NH), 7.88 (s, 3H, H3), 7.54-7.45 (m, 9H, H5/H9/H11), 7.07 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H12), 3.98 (m, 15H, H18/ H17), 2.87 (s, 12H, H19), 2.25 (s, 9H, H13), 2.09 (s, 9H, H15) ; 13C NMR (75 MHz, MeOD, δ): 171.8 (C14), 166.9 (C16), 162.4 (C6), 152.8 (C4), 148.3 (C2), 140.7 (C10), 136.9 (C8), 134.9 (C7), 131.0 (C12), 128.6 (C3), 124.4 (C5), 123.0 (C9), 118.9 (C11), 65.0 (C18), 57.0 (C19), 53.3 (C17), 24.05 (C15), 20.9 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C57H64N9O9 1018.4822. Exp 1018.4782 [M+H]+ ; tR= 8.33 min (méthode HPLC-MM-ACN, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Composé 6d
  • Figure imgb0062
  • Le triazacyclononane (21.5 mg, 0.09 mmol) et le carbonate de sodium (95 mg, 0.90 mmol) sont solubilisés dans l'acétonitrile sec (5 mL). Après 5 minutes à température ambiante, 5d (143 mg, 0.28 mmol) est ajouté, un bullage d'Argon est effectué pendant 5 minutes et le mélange réactionnel est chauffé à 60°C sous agitation pendant 4 jours. Le mélange est ensuite filtré sur fritté P3, rincé avec CH3CN sec et les eaux mères sont évaporées. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 100% à 97/3) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'une poudre blanche (82 mg, 66%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.77 (s, 3H, H3), 7.47 (s, 3H, H5), 6.64 (s, 6H, H9), 4.12 (t, 6H, J= 4.7 Hz, H14), 3.94 (s, 9H, H22), 3.91 (s, 6H, H23), 3.84 (t, 6H, J= 4.7 Hz, H15), 3.74-3.52 (m, 24H, H16/H17/H18/H19), 3.35 (s, 9H, H20), 2.82 (s, 12H, H24), 1.91 (s, 18H, H13) ; 13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ): 166.0 (C21), 161.4 (C6), 158.3 (C10), 151.0 (C4), 147.5 (C2), 136.5 (C8/12), 131.3 (C7), 127.8 (C5), 125.3 (C3), 113.8 (C9/11), 72.0 (C19), 70.9 (C16), 70.7 (C17), 70.6 (C18), 69.8 (C15), 67.4 (C14), 64.6 (C23), 59.1 (C20), 55.6 (C24), 52.9 (C22), 21.0 (C13) ; HRMS (ESI) calculée pour C75H104N6O18 688.3698. Exp 688.3686 [M+2H]2+ ; tR= 13.09 min (méthode HPLC-MM-ACN, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Composé 6e
  • Figure imgb0063
  • Le triazacyclononane (15 mg, 0.064 mmol) et le carbonate de sodium (68 mg, 0.64 mmol) sont solubilisés dans l'acétonitrile sec (4 mL). Après 10 minutes à température ambiante, 5e (76 mg, 0.198 mmol) est ajouté et le mélange réactionnel est chauffé à 60°C sous agitation pendant 24h puis à température ambiante pendant 5 jours. Le mélange est ensuite filtré sur fritté P3, rincé avec CH3CN sec et les eaux mères sont évaporées. Le produit brut est purifié sur colonne chromatographique (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 100% à 97/3) afin d'obtenir le produit pur sous forme d'une poudre blanche (41 mg, 65%). Rf (Al2O3, CH2Cl2/MeOH, 95/5) = 0.54 ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ): 8.15 (s, 3H, H3), 7.92 (s, 3H, H5), 7.25 (d, 3H, J = 8.0 Hz, H12), 6.54-6.49 (m, 6H, H9/H11), 3.99 (s, 6H, H17), 3.97 (s, 9H, H16), 3.84 (s, 9H, H13), 3.75 (s, 9H, H14), 2.99 (s, 12H, H18) ; 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ): 166.5 (C15), 161.9 (C10), 160.9 (C6), 158.0 (C8), 147.8 (C4), 147.2 (C2), 131.4 (C12), 126.6 (C5), 124.4 (C3), 119.9 (C7), 105.3 (C9), 99.2 (C11), 65.0 (C17), 56.2 (C18), 55.7 (C13), 55.6 (C14), 53.0 (C16).
    • Composé 7c
  • Figure imgb0064
  • 6c (47 mg, 0.05 mmol) est dissout dans le THF (3 mL) puis NaOH 1M (3 mL) est ajouté jusqu'à pH >12. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24h. Un suivi LC-MS permet d'observer la déprotection complète des esters méthyliques. Le produit est utilisé pour la complexation sans purification supplémentaire. HRMS (ESI) calculée pour C54H58N9O9 976.4352. Exp 976.4306 [M+H]+ ; tR = 6.24 min (méthode HPLC-MM-ACN, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Composé 7d
  • Figure imgb0065
  • 6d (38.7 mg, 0.028 mmol) est dissout dans le tetrahydrofurane (3 mL) et NaOH 1M (3 mL) est ajouté jusqu'à pH 14. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 6h30. Le suivi par spectrométrie de masse montre la disparition du produit de départ. Le mélange est utilisé pour l'étape de complexation sans purification supplémentaire. HRMS (ESI) calculée pour C75H98N6O18 667.3463. Exp 667.3461 [M+2H]2+ ; tR= 9.57 min (méthode HPLC-ESI-ACN, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Complexe Ia.1
  • Figure imgb0066
  • Le ligand 6a (70 mg, 0.075 mmol) est dissout dans THF (10 mL) puis NaOH 1M (5 mL) est ajouté et la solution est agitée à température ambiante pendant 1h30. Le pH est ensuite ajusté à pH 4 avec HCl 1M (5 mL) et le mélange est concentré sous vide. Le milieu est dilué avec MeOH puis le pH est ajusté à pH 8-9 à l'aide d'une solution de Na2CO3sat. Enfin, TbCl3.6H2O (84 mg, 0.224 mmol) est ajouté et le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 72h. Le milieu est concentré sous pression réduite puis le complexe est précipité avec ajout d'H2O (2 x) et centrifugé pour obtenir un solide blanc correspondant au complexe de terbium(III) (79 mg, quant.). HRMS (ESI) calculée pour C51H53N6O9Tb 526.1558. Exp 526.1557 [M+2H]++. Calc pour C51H52N6O9Tb 1051.3044. Exp 1051.3011 [M+H]+.
    • Complexe Ia.2
  • Figure imgb0067
  • Le ligand 6b (50 mg, 0.038 mmol) est solubilisé dans MeOH (5 mL) puis NaOH 1M (2 mL) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 1h. Puis le pH est ajusté à pH 3∼4 avec HCl 1M, puis à pH ∼7 avec Na2CO3sat. TbCl3.6H2O (21 mg, 0.056 mmol) est ajouté et la solution est laissée à température ambiante pendant une nuit. Après concentration sous pression réduite, le mélange est purifié par extractions/lavages avec DCM/H2O, et la phase organique évaporée pour donner le produit sous forme d'un solide jaune pâle (55 mg, quant.). HRMS (ESI) calculée pour C69H87N6Na2O18Tb 746.2557. Exp 746.2565 [M+2Na]2+ ; tR = 9.65 min (méthode HPLC-MM, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Complexe Ia.3
  • Figure imgb0068
  • Le pH de la solution de 7c est ajusté à pH 6 par ajout d'une solution de HCl 1M puis TbCl3.6H2O est ajouté à température ambiante. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 48h puis le THF est évaporé sous pression réduite. Le précipité formé est centrifugé dans H2O (3x) afin d'éliminer l'excès de sels présents puis le solide blanc est séché sous vide (43 mg, 83%). HRMS (ESI) calculée pour C54H55N9O9Tb 1132.3371. Exp 1132.3323 [M+H]+, C54H54N9O9TbNa 1154.3190, Exp 1154.3133 [M+Na]+; tR = 6.67 min (méthode HPLC-MM-ACN, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Complexe Ia.4
  • Figure imgb0069
  • Le pH de la solution 7d est ajusté à pH 6 avec HCl 1M puis TbCl3.6H2O (12 mg, 0.031 mmol) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 6 jours. Le THF est ensuite évaporé et une extraction CH2Cl2/H2O est effectuée. Les phases organiques sont rassemblées et évaporées pour obtenir le complexe de terbium(III) pur (38 mg, 90%). HRMS (ESI) calculée pour C72H95N6O18Tb 745.2973. Exp 745.2966 [M+2H]2+, C72H94N6O18TbNa 756.2882. Exp 756.2882 [M+H+Na]2+ ; tR = 9.64 min (méthode HPLC-ESI-ACN-365, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • Complexe 8 (hors invention)
  • Figure imgb0070
  • Le ligand 6e (31 mg, 0.032 mmol) est dissout dans MeOH (5 mL) puis NaOH 1M (2 mL) est ajouté et la solution est agitée à température ambiante pendant 2h. Le pH est ensuite ajusté à pH 3-4 avec HCl 1M (2 mL) puis à pH 7 à l'aide d'une solution de Na2CO3sat. TbCl3.6H2O (18 mg, 0.047 mmol) est enfin ajouté et le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 14h. Le milieu est concentré sous pression réduite puis le complexe est précipité avec ajout d'H2O (2 x) et centrifugé. Puis le solide obtenu est de nouveau précipité dans Et2O et centrifugé pour obtenir un nouveau précipité blanc correspondant au complexe de terbium(III) (30 mg, 85%). MS Calc pour C51H53N6O12Tb 550.1488. Exp 550.1482 [M+2H]2+; calc pour C51H52N6NaO12Tb 561.1392. Exp 561.1405 [M+H+Na]2+; calc pour C51H51N6Na2O12Tb 572.1301. Exp 572.1323 [M+2Na]2+.
    • Exemple 2 : Complexe de Dysprosium Ia.5 et Ia.6 Complexe Ia.5
  • Figure imgb0071
  • Le ligand 6b (50 mg, 0.038 mmol) est solubilisé dans MeOH (5 mL) puis NaOH 1M (2 mL) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 1h. Puis le pH est ajusté à pH 3∼4 avec HCl 1M, puis à pH ∼7 avec Na2CO3sat. Dy(NO3)3.5H2O (20 mg, 0.056 mmol) est ajouté et la solution est laissée à température ambiante pendant une nuit. Après concentration sous pression réduite, le mélange est purifié par extractions/lavages avec DCM/H2O, et la phase organique évaporée pour donner le produit sous forme d'un solide jaune pâle (50 mg, 92%). HRMS (ESI) calculée pour C69H87DyN6Na2O18 748.7577. Exp 748.7576 [M+2Na]2+.
    • Complexe Ia.6
  • Figure imgb0072
  • 6d (9 mg, 0.007 mmol) est dissout dans le tetrahydrofurane (2 mL) et NaOH 1M (2 mL) est ajouté jusqu'à pH 14. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 24h. Le pH de la solution est ensuite ajusté à pH 6 avec HCl 1M puis DyCl3.6H2O (3.2 mg, 0.008 mmol) est ajouté et la solution est laissée sous agitation à température ambiante pendant 3 jours. Le THF est ensuite évaporé et une extraction CH2Cl2/H2O est effectuée. Les phases organiques sont rassemblées et évaporées pour obtenir le complexe de dysprosium(III) pur (8 mg, 77%). HRMS (ESI) calculée pour C72H93N6O18DyNa2 769.7811. Exp 769.7818 [M+2Na]2+, C72H93N6O18DyNa3 520.8505. Exp 520.8521 [M+3Na]3+ ; tR = 9.57 min (méthode HPLC-ESI-ACN-365, H2O/CH3CN 85/15 à 0/100 en 16 min).
    • B. EVALUATION DES COMPLEXES Exemple 3 : propriétés spectroscopiques
  • Les propriétés des complexes Ia.1-Ia.6 et 8 ont été évaluées dans le méthanol (Tableau 1) et dans l'eau (Tableau 2). Ces propriétés ont été comparées à celles du complexe 9, décrit dans le document, Dalton Trans. 2015, 44, 4918, et de structure suivante :
    Figure imgb0073
  • Les mesures photophysiques des complexes montrent que les complexes de terbium Ia.1-Id.4 selon l'invention ont une absorption intense dans le méthanol (Tableau 1).
  • De plus, ces complexes possèdent des rendements quantiques très importants, et bien supérieurs à celui du complexe 9 hors invention, qui ne possède pas de substituant autre que des hydrogènes en alpha de la liaison pyridine-phényle (positions R2 et R3). La forte limitation, voire la suppression, de la rotation interne autour de la liaison pyridine-phényle permet ainsi d'améliorer significativement le rendement quantique. La brillance des complexes selon l'invention est alors supérieure à celle du complexe 9.
  • Différents groupes électrodonneurs ont été testés : méthoxy, PEG ou amide. De moins bons résultats ont été observés avec un groupe amide (complexe Ia.3), en raison d'un moins bon rendement quantique, mais demeurent tout de même satisfaisants en termes de brillance.
  • En revanche, la présence d'un second groupe électrodonneur de type méthoxy sur le groupe phényle (complexe 8) provoque une chute du rendement quantique, comparé à un groupe méthyle (complexe Ia.1).
  • L'introduction d'un second groupement méthyle a un effet majeur sur le coefficient d'extinction molaire avec une baisse de plus de 50 %. Ainsi, en dépit d'un rendement quantique excellent, Ia.4 présente une brillance à 330 nm inférieure à celle de son homologue Ia.2.
  • Les propriétés spectroscopiques des complexes Ia.2 et Ia.4 sont conservées dans l'eau (Tableau 2).
  • La brillance du complexe Ia.2 est très élevée, et comparable à celle du complexe TbLumi-4, issus des travaux du groupe de K. Raymond (J. Xu et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 19900-19910), qui figure parmi les meilleurs complexes actuellement sur le marché (Φ = 59%, ε de l'ordre de 25000 L.mol-1. cm-1 et une brillance aux alentours des 15000 L.mol-1. cm-1).
  • La figure 1 présente le spectre d'absorption et d'émission du complexe Ia.4 dans l'eau à température ambiante. Tableau 1-propriétés photophysiques des complexes Ia.1-Ia.6, 8 et 9 mesurées dans le méthanol
    complexe λ max (nm) ε (L.mol-1. cm-1) Φ (%) T (ms) B à λ max (L.mol-1. cm-1) B à 330 nm (L.mol-1.cm- 1)
    Ia.1 306 21000 74 1.33 15500 n.d.
    Ia.2 305 34800 74 1.32 26000 10000
    Ia.3 305 34800 35 0.79 12000 5600
    Ia.4 274 19000 65 1.59 12000 3400
    302 13000 8500
    8 (hors invention) 325 51000 13 0.22 6600 6500
    Ia.5 306 n.d. 2.8 0.021 n.d. n.d.
    Ia.6 301 n.d. 2.6 0.020 n.d. n.d.
    9 (hors invention) 308 33000 12 n.d. 3900 n.d.
    Tableau 2 - propriétés photophysiques des complexes Ia.2 et Ia.4-Ia.6 mesurées dans l'eau
    complexe λ max (nm) ε (L.mol-1. cm-1) Φ (%) T (ms) B à λ max (L.mol-1. cm-1) B à 330 nm (L.mol-1.cm-1)
    Ia.2 302 30400 74 1.36 23000 8900
    Ia.4 275 21000 66 1.46 14000 2500
    300 11800 7800
    Ia.5 302 n.d. 1.8 0.017 n.d. n.d.
    Ia.6 300 n.d. 2.5 0.028 n.d. n.d.
  • Les complexes de Dysprosium Ia.5 et Ia.6 présentent également des propriétés photophysiques remarquables, dans le méthanol et dans l'eau. Ces complexes sont parmi les complexes les plus brillants rapportés dans la littérature.
  • La figure 2 présente le spectre d'absorption et d'émission du complexe Ia.6 dans un mélange méthanol/éthanol à température ambiante.
    • Exemple 4 : imagerie cellulaire
  • Le complexe Ia.2 a montré un intérêt important en imagerie par microscopie de fluorescence à un ou deux photons. La figure 3 représente des images de cellules fixées au PFA et marquées par le complexe Ia.2 (concentration = 10-5 mol.L-1, excitation biphotonique, λex = 720 nm), qui montre bien son internalisation dans la cellule. Les spectres d'émission confirment la présence de Ia.2 à l'intérieur de la cellule et non dans le tampon.
    La figure 4 représente des images de cellules T24 fixées au PFA et marquées par le complexe Ia.5 (concentration = 10-5 mol.L-1, excitation biphotonique, λex = 720 nm). De même que pour le complexe Ia.2, l'internalisation du complexe Ia.5 dans la cellule est confirmée par les spectres d'émission.

Claims (15)

  1. Complexe de lanthanide comportant un agent chélatant, formé d'un macrocycle ou d'un ligand, complexant un ion lanthanide Ln3+, caractérisé en ce que le lanthanide est choisi parmi le terbium et le dysprosium et en ce que l'agent chélatant comprend au moins un groupe (B) de structure suivante :
    Figure imgb0074
     dans laquelle :
    - -R1 représente un hydrogène, un groupe -R6, ou un groupe électrodonneur -E1,
    - -R2 représente un hydrogène, un groupe -R7, ou un groupe électrodonneur -E2,
    - -R3 représente un hydrogène, un groupe -R8, ou un groupe électrodonneur -E3,
    - -R4 et -R5, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un hydrogène ou un groupe -R9 ou -OR9,
    - -E1, -E2 et -E3 sont choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes -OR10, -SR10, -NH(CO)R10, -NH(CO)NR10R'10, -NH(CS)NR10 R'10 et -NH(CS)NHR10,
    - -R6, -R7, -R8, -R9, -R10 et R'10 identiques ou différents, représentent indépendamment les uns des autres un groupe (C1-C6) alkyle, éventuellement substitué par un groupe -X1 ou un groupe -Y,
    - -X1 est un groupe réactif permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule,
    - -Y est un groupe hydrosolubilisant, choisi parmi les groupes -SO3 -, -COO-, sulfobétaïne et -O-[(CH2)2-O]m-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10,
    - étant entendu que :
    ∘ au moins l'un des substituants -R2 et -R3 n'est pas un hydrogène,
    ∘ un seul des groupes -R1, -R2 et -R3 représente un groupe électrodonneur,
    ∘ ledit agent chélatant comprend au plus un groupe réactif.
  2. Complexe de lanthanide selon la revendication 1 choisi parmi les complexes de lanthanide de formule (I) :
    Figure imgb0075
     dans lesquels :
    - Ln est un lanthanide choisi parmi Tb et Dy,
    - -A- représente -CH2- ou -CH(LA-X2)-,
    - -LA- est une liaison covalente, ou un groupe (C1-C20) alkylène, linéaire ou ramifié, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons, et éventuellement substitué par un à trois groupes -SO3H, ou -LA- est un groupe (C5-C8) cycloalkylène ou un groupe (C6-C14) arylène,
    - -X2 est un groupe réactif permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule,
    - -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques ou différents et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B1) :
    Figure imgb0076
    - -R1, -R2, -R3, -R4, et -R5 sont tels que définis à la revendication 1,
    - -Z- représente -C- ou -P(RZ )-, et
    - -RZ représente un groupe phényle, benzyle, méthyle, éthyle, propyle, n-butyle, sec-butyle, iso-butyle ou tert-butyle, et de préférence un groupe phényle ou méthyle,
    - étant entendu que si -A- est -CH(LA-X2)-, alors aucun des groupes -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 de formule (B1) ne comprend de groupe -X1.
  3. Complexe de lanthanide selon la revendication 2, caractérisé en ce que -A- représente -CH2- et -Z- représente -C-.
  4. Complexe de lanthanide selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que :
    - -Chrom1, -Chrom2 et -Chrom3 sont identiques,
    - -R1 représentant un groupe électrodonneur -E1 tel que défini à la revendication 1,
    - -R2 étant un groupe -R7 tel que défini à la revendication 1, et
    - -R3 étant un groupe -R8 tel que défini à la revendication 1.
  5. Complexe de lanthanide selon la revendication 2 ou 3 dans lesquels :
    - -A- représente -CH2-,
    - -Chrom1 et -Chrom2 sont identiques et sont de structure (B2) :
    Figure imgb0077
     avec -R11, -R21, -R31, -R41, -R51 et -Z1- tels que définis respectivement pour R1, -R2, -R3, -R4, -R5 et -Z- dans l'une des revendications 1 à 3, étant entendu que Chrom1 et -Chrom2 ne comprennent pas de groupe réactif, et
    - -Chrom3 est différent de -Chrom1 et de -Chrom2 et est de structure (B3) :
    Figure imgb0078
    - avec -R12, -R22, -R32, -R42, -R52 et -Z2- tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, -R5 et -Z- dans l'une des revendications 1 à 3, étant entendu que-Chrom3 comprend un groupe réactif.
  6. Complexe de lanthanide selon la revendication 1 choisi parmi les complexes de lanthanides de formule (II) :
    Figure imgb0079
     dans lesquels :
    - Ln est un lanthanide choisi parmi Tb et Dy,
    - -R11 et -R12, identiques ou différents, sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi -X1, -Y, un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6) alkyle,
    - -Chrom4-, -Chrom5-, et -Chrom6-, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe de formule (B), tel que défini à la revendication 1.
  7. Complexe de lanthanide selon la revendication 6, caractérisé en ce que :
    - -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques,
    - -R1 représentant un groupe électrodonneur -E1 tel que défini à la revendication 1,
    - -R2 étant un groupe -R7 tel que défini à la revendication 1, et
    - -R3 étant un groupe -R8 tel que défini à la revendication 1.
  8. Complexe de lanthanide selon la revendication 6, caractérisé en ce que :
    • soit :
    - -Chrom5- et -Chrom6- sont identiques et sont de structure (B10) :
    Figure imgb0080
     avec -R13, -R23, -R33, -R43, et -R53 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4, et -R5 dans la revendication 1, étant entendu que -Chrom5- et -Chrom6-ne comprennent pas de groupe réactif,
    - -Chrom4- est différent de -Chrom5- et de -Chrom6- et est de structure (B11) :
    Figure imgb0081
     avec -R14, -R24, -R34, -R44 et -R54 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans la revendications 6, étant entendu que -Chrom4- comprend un groupe réactif -X1 permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule,
    • soit :
    - -Chrom4- et -Chrom6- sont identiques et sont de structure (B12) :
    Figure imgb0082
     avec -R15, -R25, -R35, -R45 et -R55 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans la revendication 1, étant entendu que -Chrom4- et -Chrom6-ne comprennent pas de groupe réactif, et
    - -Chrom5- est différent de -Chrom4- et de -Chrom6- et est de structure (B13) :
    Figure imgb0083
     avec -R16, -R26, -R36, -R46 et -R56 tels que définis respectivement pour -R1, -R2, -R3, -R4 et -R5 dans la revendication 1, étant entendu que -Chrom5- comprend un groupe réactif -X1 permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule.
  9. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que -R4 et -R5 représentent des hydrogènes.
  10. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les groupements réactifs -X1 et -X2 sont indépendamment choisis parmi - COOH, -NH2, un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule :
    Figure imgb0084
    Figure imgb0085
    Figure imgb0086
    Figure imgb0087
    Figure imgb0088
     dans lesquels w est un entier appartenant à la gamme allant de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
  11. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend un seul groupe réactif permettant son couplage par liaison covalente à une biomolécule, ledit groupe réactif étant, de préférence, choisie parmi - COOH, -NH2, un acrylamide, une amine activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, une hydrazine, un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et les groupes de formule :
    Figure imgb0089
    Figure imgb0090
    Figure imgb0091
    Figure imgb0092
    Figure imgb0093
     dans lesquels w est un entier appartenant à la gamme allant de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène ;
    les groupes réactifs choisis parmi -COOH, -NH2, les esters de succinimidyle, les haloacétamides, les azides, les hydrazines, les isocyanates et les maléimides étant préférées.
  12. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le groupe Y est choisi parmi -SO3 -, -COO-, les groupes sulfobétaine et -O-[(CH2)2-O]m-CH3, m étant un nombre entier allant de 1 à 10, de préférence m=3.
  13. Complexe de lanthanide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que Ln est du terbium.
  14. Agent chélatant de formule (III) ou de formule (IV) :
    Figure imgb0094
    - avec -Chrom1', -Chrom2', et -Chrom3', identiques ou différents, et choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes de formule (B5) :
    Figure imgb0095
    - avec R1, R2, R3, R4 et R5 tels que définis à la revendication 1,
    - avec -Chrom4-, -Chrom5- et -Chrom6- tels que définis à l'une quelconque des revendications 6 à 8,
    - et -R13 un groupe protecteur des fonctions acide, ou sous la forme d'un sel.
  15. Procédé de détection d'une biomolécule comprenant la détection de la luminescence d'un conjugué de ladite biomolécule avec un complexe luminescent selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant un groupe réactif, et obtenu par couplage de ladite biomolécule avec ledit complexe luminescent sur son groupe réactif.
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