EP3638771A1 - Milieu et procédé de culture et isolement sélectif de la bactérieenterococcus hirae - Google Patents

Milieu et procédé de culture et isolement sélectif de la bactérieenterococcus hirae

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Publication number
EP3638771A1
EP3638771A1 EP18731157.6A EP18731157A EP3638771A1 EP 3638771 A1 EP3638771 A1 EP 3638771A1 EP 18731157 A EP18731157 A EP 18731157A EP 3638771 A1 EP3638771 A1 EP 3638771A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
culture medium
enterococcus
hirae
bacteria
medium according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18731157.6A
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German (de)
English (en)
Inventor
Didier Raoult
Saber KHELAIFIA
Marion Bonnet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
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Filing date
Publication date
Application filed by Aix Marseille Universite, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM, Fondation Mediterranee Infection filed Critical Aix Marseille Universite
Publication of EP3638771A1 publication Critical patent/EP3638771A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a novel medium and method of culture and selective isolation of the commensal bacterium Enterococcus hirae in a biological sample, including stool.
  • Bacteria of the genus Enterococcus are Gram-positive cocci, found as diplococci. They are commensal germs of the digestive tract, most often responsible for endocarditis and urinary infections [1].
  • the genus Enterococcus is classified in the field of Bacteria, the phylum Firmicutes, the class Baciili, the order Lactobaciliales, the family Enterococcaceae and finally the branch Clostridium. At present, there are 58 different species of enterococci [1].
  • enterococci faecalis which account for 75 to 85% of enterococci and Enterococcus faecium clinical strains, which account for 10 to 20% of clinical strains of enterococci, while other species of clinical strains of Enterococcus genus accounting for about 5%, namely Enterococcus hirae, £ casseliflavus, £ ga / iinarum and E raffinosus [14],
  • Enterococcus hirae is a zoonotic pathogen found in mammals and birds that has rarely been isolated from infection in humans [2].
  • the objective of the present invention is to select specifically hirae, among other bacteria of the genus Enterococcus, Indeed, this bacterium hirae plays an important role in immunity, especially in the treatment of breast cancer [5]. It has been shown that the presence of h hirae in women with breast cancer favors the response to chemotherapy treatment. E hirae is an oncomicrobiotic, it promotes the anti-cancer therapeutic effect of cyclophosphamide (CTX). Indeed, it activates anti-tumor immunity via the induction of Th17 cells and by increasing the ratio of cytotoxic cells to regulatory T cells [5].
  • CX cyclophosphamide
  • the purpose of the present invention is to select hirae from biological samples, in particular stool of patients, in order to highlight the presence or absence of this bacterium in the microbiota of these patients and thus to predict their possible response to treatment. therapy with cyclophosphamide [5].
  • the present invention firstly consisted in specifically selecting bacteria of the genus Enterococcus and more particularly faecalis, faecium and hirae on a culture medium and then differentiating hirae from other enterococci by a staining technique.
  • the culture medium for Enterococcus consists of a basic culture medium, known for the selective culture of enterococci, including in particular different inhibitors of Gram-negative bacteria and most Gram-positive bacteria, other as enterococci.
  • a commonly used medium for the detection of enterococci is the bile-esculin medium which comprises:
  • - esculin and ammoniacal iron citrate (a compound that allows the black shift of the culture medium when esculin is hydrolyzed). Enterococci develop by hydrolyzing esculin so that the enterococci grow by turning the medium to black: the blackening of the medium translating the hydrolysis by ammoniac iron citrate from esculin to esculetin that binds with iron.
  • a solid culture medium specific for enterococci called m-Enterococcus agar medium [3] preferably comprises in the following amounts and weight proportions for IL:
  • Sodium azide has an inhibitory action on gram-negative bacteria and on all streptococci except those in group D.
  • Cycloheximide has an anti-fungal action.
  • Nalidixic acid is a quinolone antibiotic used for its action on Gram-negative bacteria.
  • Sodium chloride inhibits Gram-positive bacteria other than Enterococcus, particularly the subgenus Streptococcus D can be inhibited by the salinity of a culture medium. Thus Enterococci can be grown selectively on a hypersaline medium.
  • Pancreatic extract of gelatin and yeast extract provide the necessary nutrients.
  • the present invention provides a culture medium specific for the cultivation and selective isolation of Enterococcus hirae bacteria consisting of nutrients other than sugars of a basic culture medium for culturing enterococci. lacking escuiine, comprising inhibitors of gram-negative bacteria and gram-positive bacteria other than enterococci and preferably at least one antifungal compound characterized in that it comprises:
  • a colored indicator which changes color at a pH below the pH of said specific culture medium corresponding to the acidification of said specific culture medium resulting from the consumption of mannitol.
  • escuiine in the basal medium is avoided because it blackens all enterococci as indicated above.
  • advantage is taken of the fact that hirae does not consume mannitol whereas mannitol is consumed by causing a drop in the pH or acidification of said specific culture medium, by all the main other Enterococcus bacteria likely to be present in clinical specimens from human patients, including stools, namely, faecalis, E faecium, casseliflavus, ga / iinarum and E raffinosus [l ⁇ .
  • said medium according to the invention is in solid form comprising a gelling agent preferably at a concentration of at least 1%, more preferably at a concentration of 1.5%.
  • the medium according to the invention thus has the ability to isolate Enterococcus hirae culture starting from a microbial flora stool sample composed of about 10 10 bacteria / g of saddle comprising in practice about 400 different species.
  • This medium exerts a selection action on the rest of the flora, thanks to the presence of inhibitory agents, which makes it possible to select among the 400 species, only 3 species Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium which are differentiated by the combination of their mannitol fermentation properties generating a Ph corresponding to that of a colored indicator bromcresol purple. Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium together account for 95% of the enterococci that can be found in clinical specimens of human stool.
  • Enterococcus hirae Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium, Gram-positive, other than enterococci, is used in a concentration of at least 20 g / L and not more than 60 g / L, which does not affect the growth of Enterococcus hirae at these concentrations.
  • Bromcresol purple was chosen as a color indicator not in relation to mannitol per se, but because of its color change range with respect to the pH corresponding to that resulting from the consumption of mannitol by the species involved in the medium of the invention.
  • the medium according to the invention comprises an inhibitor of Gram-positive enterococcal bacteria other than Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium, in particular inhibitor of Enterococcus durans, clindamycin, preferably at a concentration of at least 8 mg / l.
  • This antibiotic eliminates this bacterium Enterococcus durans in which as Enterococcus hirae does not ferment mannitol and appears with rare occurrences in the stool samples.
  • the pH of said specific culture medium according to the invention is 7.3 +/- 0.2 and the colored indicator is bromcresol purple.
  • This colored indicator turns to a pH of 5.2-6.8, a pH in this range of 5.2-6.8 corresponding to the acidification of a culture medium of PH 7.3 +/- 0, 2; inoculated with at least one isolated colony of Enterococcus bacteria other than Enterococcus hirae.
  • the specific culture medium according to the invention comprises at least 10 g / l of mannitol.
  • said specific culture medium according to the invention comprises nutrients other than mannitol in a concentration of not more than 20 g / l, preferably at least at least 10 g / l.
  • This relatively high concentration of mannitol relative to other nutrients allows favoring the priority consumption of said sugar by Enterococcus other than hirae on the one hand offers enough nutrient for the growth of hirae.
  • said specific culture medium according to the invention comprises as a color indicator bromcresol purple at a concentration of at least 25 mg / L.
  • said specific culture medium according to the invention comprises, as color indicator, bromcresol purple at a concentration of at least 50 mg / L.
  • said nutrients are sources of energy and a source of carbon, nitrogen or phopsphore.
  • said specific culture medium according to the invention comprises as nutrients other than sugars of a basic culture medium for the culture of enterococci: vitamins, metallic mineral salts, especially metals such as Cu, Zn , Co, Ni, Bi, Ti, and nitrogen compounds. More particularly, said specific culture medium according to the invention comprises as a source of vitamins, essential salts and nitrogen compounds:
  • Peptone provides amino acids and peptides as a source of energy and carbon other than sugars.
  • said specific culture medium according to the invention comprises:
  • said specific culture medium according to the invention comprises a gelling agent preferably chosen from agar and agar, preferably in a weight proportion of 0.5 to 5%, more preferably 1 to 2%.
  • said specific culture medium according to the invention comprises:
  • said specific culture medium according to the invention comprises the following components, preferably in the following amounts and weight proportions for IL:
  • the present invention also provides a method of culture and selective isolation of a bacterium Enterococcus hirae characterized in that a biological sample is cultured containing or likely to contain a bacterium Enterococcus hirae and / or Enterococcus bacteria other than Enterococcus hirae, at a temperature of 37 ° C for a time sufficient to reveal a coloration of Enterococcus bacteria other than Enterococcus hirae by said dye in a said solid specific culture medium according to the invention.
  • said specific culture medium according to the invention makes it possible to select a Enterococcus hirae bacterium in a tested sample. comprising other bacteria selected from: faecalis, faedum, casseliflavus, gailinarum and E. coli. raff formulationosus.
  • the method according to the invention comprises the following steps in which:
  • a dilution is preferably carried out at least 3 successive dilutions at
  • a sample diluted stool preferably 100 microliters of diluted stool, is inoculated on said solid specific culture medium, and c) after 72 hours of incubation, preferably at least 5 days of incubation, at 37 ° C.
  • a said Enterococcus hirae bacterium is detected if a colony of undecolored bacteria is identified with respect to said bromcresol purple dye, and d) preferably, it is confirmed that said undecolored bacterium colony is of the species Enterococcus hirae by a MALDI-TOF type mass spectrometry identification technique.
  • step a) a series of several dilutions is carried out at 1/10 of the starting sample, preferably at least 5 (ie a dilution of 10 ⁇ s ) from a stool sample, in particular taken at 0.1 mg / ml of PBS buffer, and in step b) a sample of each of the dilutions is inoculated on the said solid specific culture medium according to the invention.
  • a sample of 100 microliters of diluted stool is seeded on said solid specific culture medium.
  • pre-incubation at 37 ° C., preferably at least 24 hours, of said stool samples in a liquid-specific culture medium of the same composition as said before (before step a)) is carried out beforehand (before step a)).
  • a so-called pre-incubation is carried out with a said sample of 0.10 to 0.50 g / ml of stool in a buffer solution solution, preferably 0.15 g / l in PBS, in 10 to 100 ml of said culture culture medium.
  • specific liquid preferably 40 ml respectively
  • This pre-incubation makes it possible to increase the selective power of the culture medium according to the invention against E.durans, E. faecalis and faecium as reported in Example B below and thus to be able to observe a greater number of hirae colonies if necessary from the 3rd dilution to 1/10 (ie a dilution of 10 "3 ) of the pre-incubated sample.
  • enterococci are resistant to high saline concentrations [1], in order to eliminate some of the Gram-positive bacteria other than enterococci and Gram-negative bacteria, which are resistant to the above-mentioned inhibitors, different concentrations of gram-positive bacteria have been tested. (sodium chloride) to find the most suitable to add to the formulation of the present invention. Four concentrations were tested (60 g / L, 65 g / L, 70 g / L and 75 g / L). The results showed that the 3 strains of enterococci - hirae, faecium and faecalis - tested on these media grew at each of the concentrations tested. However, after reading the agar at 24 hours, it was observed that the higher the salt concentrations, the smaller the colonies of the resulting hirae bacteria.
  • the concentration of sodium chloride retained for a selective medium according to the present invention is not less than 20g / L but not more than 60 g / L
  • enterococci most represented in biological samples, especially stools, are faecalis and faecium [2, 6, 7].
  • enterococcal species are subdominant, no inhibitors of other enterococci have been added to the formulation of the present invention.
  • some enterococci - Enterococcus casseliflavus, Enterococcus gallinarum and Enterococcus raffinosus - are present in an amount comparable to Enterococcus hirae [8] in the seiles.
  • the present invention makes it possible to differentiate them from nterococcus hirae, as demonstrated below.
  • the main object of the present invention is to isolate oil from faecium and faecalis. Since the latter two bacterial species are resistant to a large number of inhibitors which are resistant to Hirae, it has not been possible to eliminate them from the samples. The inventors then sought to differentiate them according to their metabolic profile. For this, the inventors have sought sugars consumed either exclusively by £ hirae, or exclusively by £ faecium and E faecalis. After studying the data from the literature, three sugars were selected: melibiose, raffinose and mannitol. In fact, the melibiose is consumed by the hirae and in a variable manner by faecium.
  • variable it is meant that the consumption of this sugar by faecium is strain-dependent.
  • raffinose and mannitol they are consumed exclusively by faecalis and faecium and not by hirae (see Table 1) [9, 10, 11].
  • the inventors have added in the middle of the present invention a colored indicator whose color will vary depending on the pH of the medium. Indeed, during the consumption of sugar by the bacteria, there is an acidification of the medium, resulting in a turn of the colored indicator.
  • the inventors have tested several of which the following three; phenol red, bromcresol green and bromcresol purple. Based on the concentrations in media already containing one of these colored indicators, the inventors have initially chosen to test a concentration of 25 mg / L [12] for each of the chosen indicators. 1) Tests of different colored indicators
  • the phenol red is red; it turns yellow when the pH is in the indicator's turning zone, which is between 6.6 and 8.
  • the medium has a pH between 7.3 ⁇ 0.2, the indicator has started to turn yellow as soon as autoclaving, not allowing its use in a medium according to the present invention.
  • Bromcresol green has a blue color; it turns yellow when the pH is in the turn zone of the indicator, which is between 3.8 and 5.4.
  • This colored indicator requires too much acidification of the medium to be able to visualize a true color change. The inventors have thus observed a shift towards green rather than yellow. The contrast between the faecalis and E faecium colonies and the culture medium was therefore not important enough to differentiate them.
  • Bromcresol purple is purple in color; it turns yellow when the pH is in the turn zone of the indicator, which is between 5.2 and 6.8.
  • the advantage of this colored indicator is that it does not require a strong lowering of the pH to reveal yellow colonies with a yellow halo underneath.
  • this turning zone is ideal since the pH of the present invention is 7.3 ⁇ 0.2.
  • the inventors have therefore chosen this last colored indicator for the formulation of the present invention. Wanting to further improve the contrast, the inventors increased the concentration of bromcresol purple to 50 mg / L
  • mannitol For this sugar, the inventors have found that there was a change of color of the medium and colonies for faecalis and faecium, but not for those of hirae which remained colorless. The inventors have therefore chosen mannitol as sugar for the formulation of the said invention, at a concentration of 10 g / L, a concentration frequently found in culture media [12].
  • Table 1 Consumption of sugars by the 3 enterococci studied
  • enterococci Enterococcus casseiiflavus, enterococcus gallinarum and Enterococcus raffmosus - are present in an amount comparable to the equivalent of 1 hirae. Since bacteria belonging to the genus Enterococcus are generally sensitive and resistant to the same inhibitors, the inventors have sought the consumption of sugars for these different enterococci. It turned out that they all consumed mannitol (see Table 2). It is therefore possible to distinguish between hirae and enterococci.
  • Said culture medium also comprises a source of vitamins, essential salts and compounds nitrogenized by the presence of beef extract [13] at a concentration of 1 g / L and the proteose-peptone added to 10 g /
  • the invention provides amino acids and peptides (energy source and carbon). No other nutrient has been provided to the present invention because it is the objective that the faecal / isetrifium preferably uses sugar, mannitol, as a source of nutrition to allow their growth. These sources, however, can not be suppressed since hirae, not using selected sugar as a source of energy, needs nutrients to grow.
  • Said culture medium is a solid culture medium containing a gelling agent preferably chosen from agar and agar, preferably in a weight proportion of 0.5 to 5%, more preferably 1 to 2%.
  • a culture medium for the selection of Enterococcus hirae according to the invention comprises the following components, preferably in the following amounts and weight proportions for IL of water.
  • Bromocresol purple 0.05 g (0.005%)
  • a sample containing Enterococcus hirae bacteria is cultured at a temperature of 37 ° C. for 72 hours in said medium. selection culture of Enterococcus hirae.
  • the bacterium of the species Enterococcus hirae is identified by the presence of a MALDI-TOF mass spectrometry technique [15].
  • a culture medium of the Enterococcus hirae according to the invention makes it possible to select E hirae after 72 hours.
  • Example 1 a colony of a strain of Enterococcus hirae, of a strain of Enterococcus faecalis and of a strain of Enterococcus faecium, were mixed in one milliliter of PBS (Phosphate Buffered Saline),
  • a saddle is artificially enriched in hirae
  • a colony of a strain of Enterococcus hirae was mixed in one milliliter of PBS with the equivalent of a blue oesse (10 microliters) of saddle, that is about 0.15 g
  • a blue oesse (10 microliters) of saddle that is about 0.15 g
  • Example 3 the equivalent of a blue oesse (10 microliters) of clinical stool, namely about 0.15 g which is known rich in hirae was mixed in one milliliter of PBS.
  • the inventors have prepared six eppendorf tubes (Sigma-Aldrich), which were filled with 900 microliters of PBS and, from the mother tube, containing the colonies and optionally stool samples, 100 microliters were removed and mixed with the 2 nd tube containing 900 microliters of PBS, and cascade dilutions were made to obtain six dilutions of 10 "1 to 10 " 6 ,
  • Example B By testing a larger number of samples, ie more than
  • Example A With 100 clinical stools from the bacteriology diagnostic laboratory, it was found that the medium of Example A above, selected in rare occurrences (4 out of 100 samples tested) Enterococcus durans together with Enterococcus hirae, both not not fermenting mannitol and appearing transparent despite the colored indicator BCP unlike the only two other species present faecium faecalis and faecalis.
  • an antibiotic which inhibits the growth of Edurans, namely clindamycin, an antibiotic of the lincosamide family.
  • Edurans namely clindamycin
  • This antibiotic has a primarily bacteriostatic action against gram-positive aerobic bacteria including Enterococcus durans but with the exception of the three species of faecium, faecalis and E. hirae and against a wide spectrum of anaerobic bacteria.
  • This antibiotic was added in the medium at the concentration of 8 mg / L.
  • nalidixic acid was reduced from 250 mg / L to not more than 100 mg / L due to its dilution in water above 100mg / L and colistin was added at a concentration of 25mg / L to compensate, which is a polypeptide antibiotic of the family of polymyxins that has an action on Gram-negative bacteria.
  • a selective medium B comprising bacterial inhibitors, such as 60 g / l NaCl, cycloheximide 0.05 g / L, sodium azide 0.15 g / L, nalidixic acid at 0.1 g / L, colistin at 0.025 g / L and clindamycin at 0.008 g / L
  • bacterial inhibitors such as 60 g / l NaCl, cycloheximide 0.05 g / L, sodium azide 0.15 g / L, nalidixic acid at 0.1 g / L, colistin at 0.025 g / L and clindamycin at 0.008 g / L
  • Bromocresol purple 0.05 g (0.005%)
  • the inventors seeded 100 stools taken at random, from the laboratory of diagnosis (bacteriology) of the IHU Mediterranean infection. For this, the equivalent of a blue oesse (10 microliters) of clinical stool, namely about 0.15 g was mixed in ImL of PBS. The inventors have decided to seed the dilution 10 "3 on their medium, so as to observe a large number of colonies on the medium, in case of growth. bacterial.
  • the inventors prepared three eppendorf tubes (Sigma-Aldrich), which were filled with 900 microliters of PBS, and from the mother tube, containing the stool samples in 1 mL, 100 microliters were collected and mixed with the 2 nd tube containing 900 microliters of PBS, and cascading dilutions were performed to obtain three dilutions of 10 -1 to 10 "3.
  • Seeding of 50 ⁇ l was then performed on a solid culture medium according to Example B above, of the 10 -3 dilution, and the results are observed after the agar plates have been incubated in an incubator at 37.degree. ° C for 72 hours, and preferably up to five days.
  • the inventors retested the 4 stools where durans had been highlighted. For each of these stools, no colony of durans was identified by MALDI TOF SP mass spectrometry.
  • the inventors carried out a pre-incubation of the samples for 24 hours, in anaerobic blood culture bottles emptied and in which they added the hirae culture medium. , in its liquid form, quoted below, at a rate of 40 mL per bottle.
  • Liquid culture medium hirae Liquid culture medium hirae
  • the agar was removed so as to obtain a liquid medium, and the colored indicator, bromcresol purple, was also removed from this liquid medium formulation as it was of no use in the preparation of the liquid medium. incubation.
  • a pre-incubation of these samples is also carried out for 24 hours.
  • the equivalent of a blue oesle (10 microliters) of clinical stool, containing E.hira, namely about 0.15 g was mixed in ImL PBS, and all was injected into the hemoculture bottle. containing 40 mL of liquid hirae medium.
  • the inventors incubated the bottle at 37 ° C. for 24 hours. They then realized dilutions as described above and seeded 3rd dilution (10 "3) on the solid hirae middle.
  • E.hirae After 72 hours of incubation, preferably 5 days higher growth of E.hirae could to be observed without pre-incubation, the The inventors could observe less than 10 colonies of E. hirae and after pre-incubation this growth was of the order of 200-300 colonies at the same dilution.

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Abstract

La présente invention concerne un milieu de culture spécifique pour la culture et l'isolement sélectif d'une bactérie Enteroœccus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend : - comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.

Description

MILIEU ET PROCEDE DE CULTURE ET ISOLEMENT SELECTIF DE LA BACTERIE
ENTEROCOCCUS HIRAE
La présente invention concerne un nouveau milieu et procédé de culture et d'isolement sélectif de la bactérie commensale Enterococcus hirae au sein d'un échantillon biologique, notamment de selles.
Les bactéries du genre Enterococcus sont des cocci à Gram positif, retrouvés sous forme de diplocoques. Ce sont des germes commensaux du tube digestif, le plus souvent responsables d'endocardites et d'infections urinaîres [1]. Le genre Enterococcus est rangé dans le domaine des Bacteria, le phylum des Firmicutes, la classe des Baciili, l'ordre des Lactobaciliales, la famille des Enterococcaceae et enfin la branche des Clostridium. A l'heure actuelle, il existe 58 espèces d'entérocoques différentes [l].
Les entérocoques les plus souvent retrouvés dans les échantillons cliniques sont Enterococcus faecalis qui représentent qui représentent 75 à 85 % des souches cliniques d'entérocoques et Enterococcus faecium qui représentent 10 à 20 % des souches cliniques d'entérocoques, les autres espèces des souches cliniques du genre Enterococcus représentant environ 5 % à savoir Enterococcus hirae, £ casseliflavus, £ ga/iinarum et E raffinosus [l4],
Enterococcus hirae est un pathogène zoonotique, retrouvé chez les mammifères et les oiseaux, qui a rarement été isolé à partir d'une infection chez l'homme [2].
Actuellement, différents milieux de culture solides sont utilisés pour sélectionner les bactéries du genre Enterococcus, tel que le milieu BEA (Bile Esculine Azide) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) [3], qui permet l'isolement sélectif des bactéries du genre Streptococcus appartenant au groupe D et les bactéries du genre Enterococcus. Il existe également les milieux mEI Agar (Difco, BD, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis), Chromocuit® enterococci (Merck, Darmstadt, Allemagne), et m- Enterococcus agar (Sigma-Aldrich), qui permettent d'isoler les entérocoques [4]. L'objectif de la présente invention est de sélectionner spécifiquement £ hirae, parmi les autres bactéries du genre Enterococcus, En effet, cette bactérie £ hirae joue un rôle important dans l'immunité, notamment dans le traitement du cancer du sein [5]. Il a été démontré que la présence d'£ hirae chez les femmes atteintes d'un cancer du sein favorisait la réponse au traitement par chimiothérapie. E hirae est un « oncomicrobiotique », elle favorise l'effet thérapeutique anti-cancéreux du cyclophosphamide (CTX). En effet, elle active l'immunité anti-tumorale via l'induction de cellules Thl7 et en augmentant le ratio des cellules cytotoxiques sur les cellules T régulatrices [5].
Le but de la présente invention est de sélectionner £ hirae à partir de prélèvements biologiques, en particulier de selles de patients, afin de mettre en évidence la présence ou non de cette bactérie dans le microbiote de ces patients et ainsi prédire leur possible réponse au traitement thérapeutique par cyclophosphamide [5].
La présente invention a consisté tout d'abord à sélectionner spécifiquement les bactéries du genre Enterococcus et plus particulièrement £ faecaiis, £ faecium et £ hirae sur un milieu de culture puis différencier £ hirae des autres entérocoques par une technique de coloration.
On comprend que le milieu de culture pour Enterococcus selon l'invention est constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture sélective des entérocoques, comprenant notamment différents inhibiteurs des bactéries Gram négatif et de la plupart des bactéries Gram positif, autres que les entérocoques.
Un milieu couramment utilisé pour la mise en évidence des entérocoques est le milieu bile-esculine qui comprend :
- 10 % de bile de bœuf (les entérocoques tolèrent jusqu'à 40 % de bile contrairement à de nombreux autres germes) ;
- de l'azoture de sodium (un antiseptique élimine toutes les bactéries. Gram négatifs) ;
- de l'esculine et du citrate de fer ammoniacal (un composé qui permet le virage vers le noir du milieu de culture lorsque l'esculine est hydrolysée). Les entérocoques se développent en hydrolysant l'esculine de sorte que les entérocoques poussent en faisant virer le milieu au noir : ie noircissement du milieu traduisant l'hydrolyse par le citrate de fer ammoniacal de l'esculine en esculétine qui se lie avec le fer.
Un milieu de culture solide spécifique des entérocoques, dénommé milieu m- Enterococcus agar [3] comprend de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour IL:
- Extrait pancréatique de gélatine: 10 g (1%)
- Extrait de levure : 30 g (3%)
- Chlorure de sodium : 15 g (1,5%)
- Esculine : 1 g (0,1%)
- Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
- Cycioheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%)
- Agar : 15 g (1,5%)
L'azoture de sodium présente une action inhibitrice sur les bactéries Gram négatif et sur tous les streptocoques sauf ceux du groupe D.
Le cycioheximide présente une son action antifongique.
L'acide nalidixique est un antibiotique de la classe des quinolones, utilisé pour son action sur les bactéries Gram négatif.
Le chlorure de sodium permet d'inhiber les bactéries gram positifs autres qu' Enterococcus, en particulier le sous-genre Streptococcus D peut être inhibé par la salinité d'un milieu de culture. Ainsi Les Enterococcus peuvent être cultivées sélectivement sur un milieu hypersalé.
L'extrait pancréatique de gélatine et l'extrait de levure apportent les nutriments nécessaires.
La présente invention fournit un milieu de culture spécifique pour la culture et l'isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'escuiine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et
- comme seul sucre du mannitol, et
- comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
On évite en particulier la mise en œuvre d'escuiine dans le milieu de base car celle-ci colore en noir tous les entérocoques comme indiqué ci-dessus.
Selon la présente invention on tire parti du fait que £ hirae ne consomme pas de mannitol alors que le mannitol est consommé en provoquant une baisse du pH ou acidification dudit milieu de culture spécifique, par toutes les principales autres bactéries Enterococcus susceptibles d'être présentes dans des échantillons cliniques de patients humains, notamment de selles, à savoir £ faecalis, E faecium, £ casseliflavus, £ ga/iinarum et E raffinosus [l \.
Plus particulièrement, le dit milieu selon l'invention est sous forme solide comprenant un agent gélifiant de préférence à une concentration au moins 1%, de préférence encore de i'agar à la concentration de 1,5%. Le milieu selon l'invention présente ainsi la capacité d'isoler par culture Enterococcus hirae en partant d'une flore microbienne d'échantillon de selles composée d'environ 1010 bactéries /g de selle comprenant en pratique environ 400 espèces différentes. Ce milieu exerce avant tout une action de sélection sur le reste de la flore et cela grâce entre autres à la présence d'agents inhibiteurs ce qui permet de sélectionner parmi les 400 espèces, 3 espèces seulement Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium lesquelles sont différentiées par la combinaison de leur propriétés de fermentation du mannitol générant un Ph correspondant à celui d'un indicateur coloré le bromocrésol pourpre. Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium représentent à eux deux 95% des bactéries enterocoques pouvant être trouvées dans des échantillons cliniques de selles humains. Pour sélectionner ces 3 espèces seulement Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, on met en œuvre notamment Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, qui n'affecte pas la croissance dEnterococcus hirae à ces concentrations.
Le pourpre de bromocrésol, a été choisi comme indicateur coloré non pas par rapport au mannitol en tant que tel mais de par sa fourchette de virage de couleur vis-à-vis du pH correspondant en l'espèce à celle résultant la consommation du mannitol par les espèces en cause dans le milieu de l'invention.
De préférence, le milieu selon l'invention comprend un inhibiteur de bactéries Gram positif entérocoques autres quEnterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, la Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8mg/L. Cet antibiotique permet d'éliminer cette bactérie Enterococcus durans laquelle comme Enterococcus hirae ne fermente pas le mannitol et apparaît présentant de rares occurrences dans les échantillons de selles.
Plus particulièrement, le pH dudit milieu de culture spécifique selon l'invention est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol.
Cet indicateur coloré vire à un pH de 5,2-6,8, un pH dans cette fourchette de 5,2-6,8 correspondant à l'acidification d'un milieu de culture de PH 7,3 +/- 0,2; ensemencé par au moins une colonie isolée de bactérie Enterococcus autre que Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, le milieu de culture spécifique selon l'invention comprend au moins 10 g/L de mannitol.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins lOg/L. Cette concentration relativement élevée en mannitol par rapport aux autres nutriments permet de favoriser la consommation prioritaire dudit sucre par les Enterococcus autres que £ hirae d'une part offre suffisamment de nutriment pour la croissance de £ hirae.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50mg/L
De façon connue, lesdits nutriments sont des sources d'énergie et source de carbone, azote ou phopsphore.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques : des vitamines, des sels minéraux métalliques, notamment de métaux tels que Cu, Zn, Co, Ni, Bi, Ti, et des composés azotés. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de b uf, et
- la protéose-peptone.
La peptone permet d'apporter des acides aminés et des peptîdes comme source d'énergie et de carbone autre que sucres.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend :
- un extrait de viande de bœuf à la concentration de 1 g/L, et
- la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend:
- comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif:
- l'azoture de sodium, et
~ l'acide nalîdixîque à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et
- la Colistine, et
- comme antifongique : la Cycloheximide.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour IL:
- Protéose-peptone : 10 g (1%)
- Extrait de viande de b uf : 1 g (0,1%)
- Chlorure de sodium : 60 g (6%)
- Mannitol 10 g (1%)
- Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
- Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%)
- Colistine 0,025 g (0,0025%)
- Clindamycine 0,008 g (0,0008 %)
- Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%)
- Agar : 15 g (1,5%)
La présente invention fournit également un procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37°C durant un temps suffisant pour faire apparaître une coloration de bactéries Enterococcus autres qu' Enterococcus hirae par ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention permet de sélectionner une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé comprenant d'autres bactéries choisies parmi £ faecalis, £ faedum, £ casseliflavus, £ gailinarum etE. raffînosus.
Plus particulièrement encore, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes dans lesquelles:
a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au
1/10 (soit au dilution à 10"3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à 0,50 g/mL dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et b) un échantillon de selle diluée, de préférence de 100 microlitres de selle diluée, est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide, et c) au bout de 72 heures d'incubation, de préférence au moins 5 jours d'incubation, à 37°C, on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
L'identification û' Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a été décrite [15],
Selon la présente invention, on a découvert qu'au bout d'au moins 72h, de préférence 5 jours d'incubation sur les géloses, on peut voir apparaître avec un milieu selon l'invention une coloration pour toutes les souches d'enterocoques sauf pour Enterococcus hirae , y compris un jaunissement des colonies d'E.faeciu .
Plus particulièrement à l'étape a) on effectue une série de plusieurs dilutions au 1/10 du prélèvement de départ, de préférence au moins 5 (soit une dilution de 10~s ) à partir d'un échantillon de selle, notamment prélevé à l'aide d'une oëse, à raison de 0,15 g/mL de tampon PBS, et à l'étape b) un échantillon de chacune des dilutions est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention, de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide. De préférence, on réalise au préalable (avant l'étape a)) une pré incubation à 37°C, de préférence d'au moins 24 h, du dit échantillons de selles dans un milieu de culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture spécifique solide mais sans agar et de préférence sans colorant.
Plus particulièrement, on réalise une dite pré incubation avec un dit échantillon de 0.10 à 0,50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de préférence 0.15 g/L dans du PBS, dans 10 à 100 mL dudit milieu de culture culture spécifique liquide, de préférence respectivement 40 mL
Cette pré-incubation permet d'augmenter le pouvoir sélectif du milieu de culture selon l'invention contre E.durans , E.faecalis et £ faecium comme rapporté dans l'exemple B ci-après et ainsi de pouvoir observer un plus grand nombre de colonies d'£ hirae le cas échéant dès la 3ième dilution au 1/10 (soit une dilution de 10"3) de l'échantillon pré-incubé.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée de l'invention et des exemples iîlustratifs ci- après.
Exemple A :
Du fait que les entérocoques sont résistants aux fortes concentrations salines [1], afin d'éliminer une partie des bactéries Gram positif autres qu'entérocoques et les bactéries Gram négatif, résistantes aux inhibiteurs cités précédemment, il a été testé différentes concentrations de se! (chlorure de sodium) pour trouver la plus adéquate à ajouter à la formulation de la présente invention. Quatre concentrations ont été expérimentées (60 g/L, 65 g/L, 70 g/L et 75 g/L). Les résultats ont montrés que les 3 souches d'entérocoques - £ hirae, £ faecium et £ faecalis - testées sur ces milieux ont eu une croissance pour chacune des concentrations testées. Cependant, après lecture des géloses à 24 heures, il a été observé que plus les concentrations en sel étaient augmentées, plus les colonies des bactéries £ hirae obtenues étaient de petite taille.
Pour permettre une visibilité suffisante des colonies, la concentration en chlorure de sodium retenue pour un milieu sélectif selon la présente invention est d'au moins 20g/L mais pas plus de 60 g/L
Les entérocoques les plus représentés dans les prélèvements biologiques, en particulier les selles, sont £ faecalis et £ faecium [2, 6, 7]. Les autres espèces d'entérocoques étant sous-dominantes, aucun inhibiteur des autres entérocoques n'a été ajouté à la formulation de la présente invention. Cependant, certains entérocoques - Enterococcus casseliflavus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus - sont présents en quantité comparable à Enterococcus hirae [8] dans les seiles. La présente invention permet toutefois de les différencier d' nterococcus hirae, comme démontré ci-après.
Le principal objectif de la présente invention est d'isoler £ hirae parmi £ faecium et £ faecalis. Ces deux dernières espèces bactériennes étant résistantes à un grand nombre d'inhibiteurs auxquels £ hirae résiste, il n'a pas été possible de les éliminer des prélèvements. Les inventeurs ont alors cherché à les différencier en fonction de leur profil métabolique. Pour cela, les inventeurs ont recherché des sucres consommés soit exclusivement par £ hirae, soit exclusivement par £ faecium et E faecalis. Après étude des données de la littérature, trois sucres ont été retenus : le mélibiose, le raffinose et le mannitol. En effet, le mélibiose est consommépar £ hirae et de façon variable par £ faecium. On entend par variable le fait que la consommation de ce sucre par £ faecium est souche-dépendante. Quant au raffinose et au mannitol, ils sont exclusivement consommés par £ faecalis et £ faecium et non pas par £ hirae (cf tableau 1) [9, 10, 11].
Pour mettre en évidence la consommation du sucre par les bactéries, les inventeurs ont ajouté au milieu de la présente invention un indicateur coloré dont la couleur va varier en fonction du pH du milieu. En effet, lors de la consommation du sucre par la bactérie, il y a une acidification du milieu, ce qui entraîne un virage de l'indicateur coloré. Pour déterminer l'indicateur coloré le plus approprié, les inventeurs en ont testé plusieurs dont les trois suivants ; le rouge phénol, le vert de bromocrésol et le pourpre de bromocrésol. En se basant sur les concentrations dans des milieux contenant déjà un de ces indicateurs colorés, les inventeurs ont choisi, dans un premier temps, de tester une concentration de 25 mg/L [12] pour chacun des indicateurs choisis. 1) Tests des différents indicateurs colorés
Le rouge phénol est de couleur rouge ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 6.6 et 8. Le milieu ayant un pH compris entre 7.3±0.2, l'indicateur a commencé a viré vers le jaune dès l'autoclavage, ne permettant pas son utilisation dans un milieu selon la présente invention.
Le vert de bromocrésol a une couleur bleue ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 3.8 et 5.4. Cet indicateur coloré nécessite une acidification du milieu trop importante pour pouvoir visualiser un véritable changement de couleur. Les inventeurs ont ainsi observé un virage davantage vers le vert que vers le jaune. Le contraste entre les colonies de £ faecalis et E faecium et le milieu de culture n'a donc pas été assez important pour les différencier.
Le pourpre de bromocrésol est de couleur violet ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 5.2 et 6.8. L'avantage de cet indicateur coloré est qu'il ne nécessite pas un fort abaissement du pH pour laisser apparaître des colonies jaunes avec un halo jaune dessous. De plus, cette zone de virage est idéale puisque le pH de la présente invention est de 7.3±0.2. Les inventeurs ont donc choisi ce dernier indicateur coloré pour la formulation de la présente invention. Voulant améliorer davantage le contraste, les inventeurs ont augmenté la concentration du pourpre de bromocrésol jusqu'à 50 mg/L
2) Détermination du sucre
Une fois l'indicateur coloré choisi, les inventeurs ont pu déterminer quel sucre était le plus adapté à la présente invention.
Le mélibiose a donné des résultats variables, du fait de la consommation variable de ce sucre par £ faecium. Ce sucre ne peut donc pas être utilisé pour isoler les £ hirae.
Concernant le raffinose, le test n'a pas été concluant car aucun changement de couleur des colonies de £ faecalis t £ faecium n'a pu être observé.
Enfin, le dernier sucre testé a été le mannitol. Pour ce sucre, les inventeurs ont constaté qu'il y avait bien un changement de couleur du milieu et des colonies pour £ faecalis et £ faecium, mais pas pour celles d'£ hirae qui sont restées incolores. Les inventeurs ont donc choisi le mannitol comme sucre pour la formulation de la dite invention, à une concentration de 10 g/L, concentration fréquemment retrouvée dans les milieux de culture [12].
Mélibiose Raffinose Mannitol
Enterococcus hirae + + -
Enterococcus faecalis - - +
Enterococcus faecium V -
+
Tableau 1 : Consommation des sucres par les 3 entérocoques étudiés De plus, il a été montré dans la littérature que certaines souches d'entérocoques - Enterococcus casseiiflavus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffmosus - sont présentes en quantité comparable à £ hirae. Etant donné que les bactéries appartenant au genre Enterococcus sont dans l'ensemble sensibles et résistantes aux mêmes inhibiteurs, les inventeurs ont recherché la consommation des sucres pour ces différents entérocoques. Il s'est avéré qu'ils consommaient tous le mannitol (cf tableau 2). Il est donc possible de distinguer £ hirae parmi ces entérocoques.
Mannitol
Enterococcus hirae Enterococcus casseiiflavus + Enterococcus gaiiinarum + Enterococcus raffmosus + Tableau 2 : Consommation du mannitol par les espèces d'entérocoques présents en quantité comparable à £ hirae dans les selles.
Ledit milieu de culture comprend également une source de vitamines, de sels essentiels et de composés azotés par la présence d'extrait de viande de b uf [13] à la concentration de 1 g/L et la protéose-peptone ajoutée à 10 g/L à ladite invention qui permet d'apporter des acides aminés et des peptides (source d'énergie et de carbone). Aucun autre élément nutritif n'a été apporté à la présente invention car l'objectif est que £ faeca/iset £ faecium se servent en priorité du sucre, le mannitol, comme source de nutrition pour permettre leur croissance. Ces sources ne peuvent cependant pas être supprimées puisque £ hirae, n'utilisant pas le sucre sélectionné comme source d'énergie, a besoin de nutriments pour croître.
Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%. Un milieu de culture permettant la sélection des Enterococcus hirae selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour IL d'eau.
Milieu A :
Protéose-peptone : 10 g (1%)
Extrait de viande de bœuf : 1 g (0,1%)
Chlorure de sodium : 60 g (6%)
Mannitol 10 g (1%)
Azide de sodium : 0,15 g (0,015%)
Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
Acide nalidixîque : 0,25 g (0,025%)
Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%)
Agar ; 15 g (1,5%)
Tous les composés de ce milieu sont référencés chez Sigma-AIdrich.
Plus particulièrement, on cultive un échantillon contenant une bactérie Enterococcus hirae à une température de 37 °C durant 72 heures dans ledit milieu de culture de sélection û'Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, on réalise les étapes suivantes :
- on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant contenir Enterococcus hirae. Dans un premier temps, on effectue une série de six dilutions au dixième à partir d'une solution mère du prélèvement de départ. Cent microlitres de chacune des dilutions sont ensemencés sur une gélose, correspondant à la présente invention, et
- au bout de 72 heures d'incubation à 37°C, on identifie que la bactérie détectée non colorée est une bactérie de l'espèce Enterococcus hirae par une technique de spectrométrie de masse, de type MALDI-TOF [15]. Un milieu de culture Û'Enterococcus hirae selon l'invention permet de sélectionner E hirae au bout de 72 heures.
Aux exemples 1 à 3 ci-après, on fournit des résultats de l'ensemencement d'une série de six dilutions de divers échantillons contenant trois enterocoques - E hirae, E faecalis et E faecium - sur un milieu de culture solide selon la présente invention, au bout de 72 heures d'incubation à 37 °C.
Mode opératoire :
Dans les 3 exemples, on réalise une série de six dilutions de 10 1 à 10/6 d'un échantillon de départ comme suit :
- à l'exemple 1, une colonie d'une souche û'Enterococcus hirae, d'une souche dEnterococcus faecalis et d'une souche û'Enterococcus faecium, ont été mélangées dans un millilitre de PBS (Phosphate Buffered Saline),
- à l'exemple 2, une selle est artificiellement enrichie en £ hirae, une colonie d'une souche û'Enterococcus hirae a été mélangée dans un millilitre de PBS avec l'équivalent d'une oëse bleue (10 microlitres) de selle, à savoir environ 0,15 g, et
- à l'exemple 3, l'équivalent d'une oëse bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g que l'on sait riche en £ hirae a été mélangé dans un millilitre de PBS. Pour réaliser ces dilution, les inventeurs ont préparé six tubes eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS et, à partir du tube mère, contenant les colonies et le cas échéant les échantillons de selles, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2eme tube contenant les 900 microlitres de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir six dilutions de 10"1 à 10"6,
Puis, on réalise l'ensemencement de 100 pL sur un milieu de culture solide selon l'exemple A ci-dessus, de la série des six dilutions et on observe le résultat après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 °C pendant 72 heures.
Pour les 3 exemples, on observe l'apparition de colonies jaunes pour £ faecium et £ faecalis et de colonies transparentes pour £ hirae. Les colonies isolées sont les plus visibles sur les dilutions 10"5 et 10"6. Les autres dilutions sont trop concentrées en bactéries pour que l'on puisse observer des colonies isolées et ainsi bien distinguer Enterococcus hirae des autres entérocoques pour l'analyse de la richesse en Enterococcus hirae ' de la selle testée. Exemple B : En testant un plus grand nombre d'échantillons, à savoir plus de
100 selles cliniques, provenant du laboratoire diagnostic de bactériologie, il est apparu que le milieu de l'exemple A ci-dessus, sélectionnait dans de rares occurrences (4 échantillons sur 100 testés) la bactérie Enterococcus durans conjointement avec Enterococcus hirae, toutes deux ne fermentant pas le mannitol et apparaissant transparente en dépit de l'indicateur coloré BCP contrairement aux deux seules autres espèce présentes £ faecium et £ faecalis.
Pour pallier cela, et être davantage encore sélectif vis-à-vis dEnterococcus hirae, on a trouvé un antibiotique qui inhibe la croissance û'Edurans à savoir la clindamycine, un antibiotique de la famille des lincosamides. Cet antibiotique possède une action principalement bactérîostatique à encontre des bactéries aérobies Gram positif y compris Enterococcus durans mais excepté les 3 espèces £ faecium, £ faecalis et E. hirae et à encontre d'un large spectre de bactéries anaérobies. Cet antibiotique a été rajouté dans le milieu à la concentration de 8 mg/L.
Par ailleurs, on a diminué la concentration de l'acide nalidixique de 250 mg/L à pas plus de 100 mg/L du fait de sa mauvaise dilution dans l'eau au-dessus de 100mg/L et a été ajouté la colistine à une concentration 25 mg/L pour compenser, qui est un antibiotique poiypeptidique de la famille des polymyxines qui a une action sur les bactéries Gram négatif.
Grâce à ce milieu B, on a pu sélectionner spécifiquement les souches suivantes : Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium.
Pour cela, on a mis en œuvre un milieu sélectif B comprenant des inhibiteurs bactériens, tel que le NaCI à 60 g/L, le cycloheximide à 0,05 g/L, le sodium azide à 0,15 g/L, l'acide nalidixique à 0,1 g/L, la colistine à 0,025 g/L et la clindamycine à 0,008 g/L La formule du milieu B est donc :
Protéose-peptone : 10 g (1%)
Extrait de viande de bœuf : 1 g (0,1%)
Chlorure de sodium : 60 g (6%)
Mannitol 10 g (1%)
Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
Acide nalidixique ; 0,10 g (0,010%)
Colistine 0,025 g (0,0025%)
Clindamycine 0,008 g (0,0008 %)
Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%)
Agar : 15 g (1,5%)
Pour tester l'efficacité de ce milieu, les inventeurs ont ensemencé 100 selles prises au hasard, provenant du laboratoire de diagnostic (bactériologie) de l'IHU Méditerranée infection. Pour cela, l'équivalent d'une oëse bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans ImL de PBS. Les inventeurs ont décidé d'ensemencer la dilution 10"3 sur leur milieu, de façon à observer un grand nombre de colonies sur le milieu, en cas de croissance bactérienne. Pour réaliser des dilutions, les inventeurs ont préparé trois tubes eppendorf (Sigma-AIdrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS, et à partir du tube mère, contenant les échantillons de selles dans 1 mL, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2eme tube contenant les 900 microiitres de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir trois dilutions de 10_1à 10"3.
Puis, on a réalisé l'ensemencement de 50 μΐ sur un milieu de culture solide selon l'exemple -B ci-dessus, de la dilution 10"3 et on observe les résultats après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 °C pendant 72 heures, et de préférence jusqu'à cinq jours.
Sur les 100 selles ensemencées, seulement 40 ont montré une croissance bactérienne. Après identification des colonies au spectromètre de type MALDI TOF SP, les inventeurs ont observé que les seuls bactéries obtenues étaient Enterococcus hirae (2), £ faecium (16), £ faecalis (22) et £ durans
Pour éliminer E. durans, les inventeurs ont testé un antibiotique, la clindamycine. Ce choix a été basé sur une série d'antibiogrammes que les inventeurs avaient réalisés précédemment. Afin de déterminer la meilleure concentration de clindamycine à ajouter au milieu de culture, les inventeurs ont testé trois concentrations de cet antibiotique, à savoir 2 mg/L, 4 mg/L et 8 mg/L. Les inventeurs ont ensemencé des souches ô' Enterococcus hirae, £ faecium, £ faecalis et £ durans. Une croissance pour chacune de ces espèces a été observée pour les deux premières concentrations de clindamycine, 2 mg/L et 4 mg/L. En revanche, une absence de croissance pour £ durans a été mise en évidence à la concentration de 8 mg/L de clindamycine. Enterococcus hirae, £ faecium, £ faecalis ont une croissance à cette concentration de clindamycine.
Afin de confirmer ces résultats, les inventeurs ont retesté les 4 selles où £ durans avait été mise en évidence. Pour chacune de ces selles, aucune colonie de £ durans n'a été identifiée par spectrométrie de masse MALDI TOF SP. Pour augmenter le pouvoir sélectif du milieu de culture contre E.duransû s les prélèvements testés, les inventeurs ont réalisé une pré-incubation des prélèvements durant 24h, dans des bouteilles d'hémoculture anaérobie vidées et dans lesquelles ils ont ajouté le milieu de culture hirae, sous sa forme liquide, cité ci-dessous, à raison de 40 mL par bouteille. Pour cela, l'équivalent d'une oëse bleue (10 microlitres) de selle clinique, contenant E.durans, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans ImL de PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture. Les inventeurs ont incubé la bouteille à 37°C durant 24h.
Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3ème dilution (10~3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5 jours, aucune croissance de E.durans n'a pu être observée.
Milieu de culture hirae liquide ;
- Protéose-peptone : 10 g (1%)
- Extrait de viande de b uf : 1 g (0,1%)
- Chlorure de sodium : 60 g (6%)
- Mannitol 10 g (1%)
- Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
- Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
- Acide nalîdixïque : 0,10 g (0,010%)
- Colistine 0,025 g (0,0025%)
- Clindamycine 0,008 g (0,0008 %)
L'agar a été enlevé, de façon à obtenir un milieu liquide, et l'indicateur coloré, le pourpre de bromocrésol, a également été éliminé de cette formule du milieu liquide car il n'avait pas d'utilité lors de la pré-incubation.
Par ailleurs, pour favoriser la croissance û'E.hirae sur le milieu de culture hirae, notamment lorsque E aecium et Efaecalis sont également présents dans l'échantillon de selle testé, une pré-incubation de ces prélèvements est également réalisée pendant 24h. Pour cela, l'équivalent d'une oëse bleue (10 microlitres) de selle clinique, contenant E.hîrae, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans ImL de PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture contenant 40 mL du milieu hirae liquide. Les inventeurs ont incubé la bouteille à 37°C durant 24h. Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3eme dilution (10"3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5 jours, une croissance plus importante de E.hirae a pu être observée. Sans pré-incubation, les inventeurs pouvaient observer moins de 10 colonies de E.hirae et après pré- incubation, cette croissance était de l'ordre de 200-300 colonies à une même dilution.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Milieu de culture spécifique pour la culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend : - comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et
- comme seul sucre du mannitol, et
- comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
2. Milieu de culture spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un inhibiteur de bactéries Gram positif entérocoques autres quEnterococcus hirae, Enterococcus faecaïts et Enterococcus faciurn, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, ia Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8 mg/L de clindamycine.
3. Milieu de culture spécifique selon la revendication 2 caractérisé en ce que le pH dudit milieu de culture spécifique est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésoi.
4. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 g/L de mannitol.
5, Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10 g/L.
6. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocréso! à une concentration d'au moins 25 mg/L s
7. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50 mg/L,
8. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques : deso vitamines, des sels minéraux métalliques et des composés azotés.
9. Milieu de culture spécifique selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de bœuf, et
- la protéose-peptone. 5 10. Milieu de culture spécifique selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comprend :
- un extrait de viande de b uf à la concentration de 1 g/L, et
- Sa protéose-peptone à la concentration de 10 g/L.
11. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 100 caractérisé en ce qu'il comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
12. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend : 5 - comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif;
- l'azoture de sodium, et
- l'acide nalidixique à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et
- la Colistine, et - comme antifongique : la Cycloheximide.
13. Milieu de de culture spécifique selon la revendication 1 à 12 caractérisé en, ce qu'il est sous forme solide comprenant un agent gélifiant de préférence à une concentration au moins 1%, de préférence encore de l'agar à la concentration de s 1,5%.
14. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour IL:
-Protéose-peptone : 10 g (1%)
-Extrait de viande de b uf : 1 g (0,1%)
-Chlorure de sodium : 60 g (6%)
-Clindamycine ; 0.008 g (0.0008%)
-Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%)
-Cycloheximide : 0,05 g (0,005%)
-Acide nalidixique : 0,10 g (0,025%)
-Colîstine : 0.025 g (0.0025%)
-Mannito! 10 g (1%)
-Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%)
-Agar : 15 g (1,5%)
15. Procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37°C durant un temps suffisant pour faire apparaître une coloration de bactéries Enterococcus autres5 que Enterococcus hirae par ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon l'une des revendications 1 à 14,
16. Procédé de culture selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'on sélectionne une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé comprenant d'autres bactéries choisies parmi £ faecaiis, E. faecium, E.durans, £ casseiifiavus, £0 gailinarum et £ raffinosus.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16 caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes : a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au 1/10 (soit au dilution à 10"3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à s 0,50 g/mL dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et
b) un échantillon de de selle diluée est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention, de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée, et
c) au bout de 72 heures, de préférence au moins 5 jours d'incubation, à 37°C,o on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type ALDI-TOF. 5 18. Procédé de culture selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisé en ce qu'on réalise au préalable une pré incubation à 37°C, de préférence d'au moins 24 h, du dît échantillons de selles dans un milieu de culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture spécifique solide mais sans agar et de préférence sans colorant. 0 19. Procédé de culture selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'on réalise au préalable une dite pré incubation avec un dit échantillon de 0.10 à 0.50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de préférence du PBS, dans 10 à 100 mL dudit milieu de culture culture spécifique liquide.
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