EP3595723A1 - Verfahren zur bestrahlung von säugetierzellen mit elektronenstrahlen und/oder röntgenstrahlen - Google Patents

Verfahren zur bestrahlung von säugetierzellen mit elektronenstrahlen und/oder röntgenstrahlen

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Publication number
EP3595723A1
EP3595723A1 EP18715500.7A EP18715500A EP3595723A1 EP 3595723 A1 EP3595723 A1 EP 3595723A1 EP 18715500 A EP18715500 A EP 18715500A EP 3595723 A1 EP3595723 A1 EP 3595723A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
cells
mammalian cells
population
irradiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18715500.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank-Holm Rögner
Sebastian Ulbert
Jana Burkhardt
Javier PORTILLO
Jessy Schönfelder
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP3595723A1 publication Critical patent/EP3595723A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/10—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light

Definitions

  • the present invention relates to a method for irradiating a population of mammalian cells comprising at least one target mammalian cell with electron beams and / or X-rays, characterized in that: (i) a composition comprising a population of mammalian cells is irradiated with electron beams and / or X-rays in vitro wherein the population of mammalian cells contains at least one target mammalian cell, and wherein the dose rate is in the range of 5 Gy / sec to 10 7 Gy / sec, and (ii) optionally isolates or enriches vital target mammalian cells from the population of mammalian cells , as well as funds obtainable therefrom, as well as uses thereof.
  • Cellular therapeutics can be used to treat a variety of conditions.
  • the current state of research and clinical use of cellular therapeutics in the treatment of cancer is particularly promising (Melief et al 201 1).
  • donor cells which must be obtained sufficiently in sufficient quantity and clinical requirements.
  • autologous preparations in turn, in particular in pretreated cancer patients in their potential effectiveness sometimes severely limited.
  • cell lines derived, for example, primary tumors or, for example, were immortalized by means of viral treatment can potentially be produced in any desired amount and are thus also suitable as on-the-shelf products
  • Cell lines that correspond to the nature of natural killer cells (NK cells) are already used in hospitals for the treatment of tumors (Carotta 2016; Suck et al., 2016).
  • Leukemia cells which were taken from patients in the 1990s and cultured permanently (Klingemann et al., 1996; Yagita et al., 2000). Both cell lines have a profile corresponding to NK cells, can be stimulated by, for example, interleukin (IL) -2, and have excellent cytotoxic properties against various tumor entities.
  • IL interleukin
  • gamma irradiation is also known for its negative influence on the functional effectiveness, for example the anti-tumor cytotoxic activity of NK cells (FIG
  • All these cellular products are usually irradiated ex vivo, ie before use on the patient and outside the body with gamma radiation of a high, finally lethal dose, usually at about 10 to 50 Gy, typically 30 Gy.
  • gamma-irradiated NK-92 cells lose at least 50% of their cytotoxic potential (Tarn et al., 1999).
  • NK cell lines are produced, which, however, appear even more radiosensitively than unchanged NK cells.
  • the loss of function is attributable, on the one hand, to frequently long irradiation times, which are necessary to achieve higher doses, but also the accumulation of gamma-radiation-associated effects, such as, for example, unwanted oxidation of effector molecules.
  • the present invention therefore in one embodiment relates to a method for irradiating a population of mammalian cells comprising at least one target mammalian cell with electron beams and / or X-rays, characterized in that:
  • composition comprising a population of mammalian cells in vitro with electron beams and / or X-rays, the population of mammalian cells containing at least one target mammalian cell, and wherein the dose rate is in the range of 5 Gy / sec to 10 7 Gy / sec lies, and
  • the present invention relates to a process for the preparation of an agent comprising at least one treated vital target mammalian cell suitable for administration to a subject and / or for the preparation of treated target mammalian vital cells for the production of a cellular mammalian cell Suitable for administration to an individual, characterized in that:
  • composition comprising a population of mammalian cells in vitro with electron beams and / or X-rays, the population of mammalian cells containing at least one target mammalian cell, and wherein the dose rate is in the range of 5 Gy / sec to 10 7 Gy / sec lies, and
  • the ability to proliferate the target mammalian cell can be reduced, for example completely inhibited, while the cells at the same time are vital: the irradiated cell population surprisingly shows a higher proportion of vital cells in the irradiated cell population over a longer period after irradiation compared to conventionally irradiated with X-ray or gamma radiation cells irradiated at low dose rate, each with the same radiation dose ,
  • the cells may have a higher desired biological activity, for example cytotoxicity, compared to conventionally irradiated cells.
  • the Examples and accompanying Figures 2 to 12 demonstrate that the high dose rate electron beam irradiation of the present invention, in terms of cell vitality as well as the desired cytotoxicity biological activity, provides conventional gamma or x-ray radiation at a low dose rate each same dose, is superior.
  • a low dose rate is used; i.e. a certain dose is applied over a longer period of time.
  • mammalian cells are irradiated.
  • the mammalian cells may be cells of any mammal, such as humans, pigs, cows, horses, dogs, cats, sheep, monkeys, rats, mice, rabbits, guinea pigs or rabbits.
  • the mammal is a monkey or human, most preferably a human.
  • the mammalian cells may be cells taken directly from the mammal, primary cells, cultured mammalian cells, or genetically modified mammalian cells, such as cell lines from mammalian cells.
  • a preferred embodiment of such cell lines are immortalized cell lines, such as the immortalized cancer cell lines used in the examples.
  • the mammalian cells may be cells from different locations of a mammal, and may include, for example, blood cells, PBMC cells, plasma cells, tumor cells, cells of healthy or diseased tissue, cells of organs such as liver cells, kidney cells, spleen cells, pancreatic cells, hematopoietic stem cells, cells Body fluids such as urine, saliva or cerebrospinal fluid and / or cells intended for transplantation.
  • Stem cells are preferably not human embryonic stem cells and / or the population of mammalian cells preferably does not contain human embryonic stem cells.
  • the methods irradiate a population of mammalian cells.
  • a population of mammalian cells comprising at least 2 cells, preferably at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8 or 10 9 Cells, for example 10 2 to 10 9 cells, 10 3 to 10 8 cells, 10 4 to 10 8 cells or 10 5 to 10 7 or 10 8 to 10 9 cells.
  • the population of mammalian cells contains at least one target mammalian cell.
  • a target mammalian cell is a mammalian cell whose ability to proliferate by irradiation is to be reduced while maintaining the vitality of the target mammalian cell in period 1 d to 7 d after irradiation, and preferably the biological activity of the target mammalian cell in period 1 d to 7 d after irradiation is to be obtained.
  • the vitality of the target mammalian cell 3 d after irradiation remains at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or 80% of a plurality of irradiated target mammalian cells, and / or is the biological activity of the target mammalian cell 3 d after irradiation at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the biological activity of the same mammalian cells which have not been irradiated , under otherwise identical conditions.
  • the population of mammalian cells consists of target mammalian cells, or that the population of mammalian cells contains at least one target mammalian cell and one or more other mammalian cells.
  • the population of mammalian cells may consist of target mammalian cells.
  • the population of mammalian cells in this embodiment contains no or substantially no other mammalian cells.
  • a population of mammalian cells containing one or more other mammalian cells in addition to the target mammalian cell (s) may be, for example, a graft comprising various cell types, such as a hematopoietic stem cell transplant, or a co-culture of 2, 3 or more different cell types from mammalian cells ,
  • feeder cells may be included in a co-culture comprising the feeder cells and the target mammalian cells, such as tumor cells.
  • a method of the invention is characterized in that the population of mammalian cells consists of target mammalian cells or consists essentially of target mammalian cells.
  • a method according to the invention is therefore characterized in that the population of mammalian cells contains at least one target mammalian cell and one or more other mammalian cells.
  • a method according to the invention is characterized in that the population of mammalian cells comprises a mixture of at least 2 different primary mammalian cells, in particular wherein the population of mammalian cells is a cellular transplant or a mixture of immune cells or a body fluid.
  • Primary mammalian cells are mammalian cells taken from a mammal that have retained their phenotypic properties. Immortalized cells are not primary mammalian cells.
  • a mixture of immune cells may be, for example, a composition containing one or more of the following cells: T cells, in particular Treg cells, CD4 + cells or CD8 + T cells, NK cells, B cells or DC cells cells.
  • a body fluid may be, for example, blood, blood plasma, whole blood, urine, storage or cerebrospinal fluid.
  • a cellular graft may be a hematopoietic stem cell graft.
  • a cellular graft may, for example, be allogeneic or autologous.
  • a method according to the invention is characterized in that the population of mammalian cells comprises one or more cell lines or consists of one or more cell lines.
  • a method according to the invention is characterized in that the target mammalian cell is a proliferating, hyperproliferative or immortalized target mammalian cell, in particular wherein the target mammalian cell is a cancer cell, cancer cell line and / or immune cell, in particular wherein the cell line is a natural Killer cell (NK cell) line, T cell line, or genetically engineered cell line, and / or the immune cells are natural killer (NK) cells, T cells, or genetically engineered immune cells.
  • NK cell natural Killer cell
  • T cell line T cell line
  • the immune cells are natural killer (NK) cells, T cells, or genetically engineered immune cells.
  • Irradiated mammalian cell lines such as the NK cell line used in the examples, can then be used in cancer therapy because the harmful unrestrained proliferation is reduced by the irradiation while maintaining the vitality for a longer period of time after the irradiation.
  • the method can be applied to target mammalian cells for so-called "feeder" cells.
  • “Feeder” cells are cell lines used to grow the actual therapeutic cell products, for example, in the production of primary NK cell products. According to the invention, it is also possible to irradiate tumor cells which are used ex vivo after the treatment in the context of the production of so-called cell vaccines based on dendritic cells (DCs).
  • DCs dendritic cells
  • mesenchymal stromal cells can also be irradiated as target mammalian cells.
  • mesenchymal stromal cells can be used in the context of a cellular immunosuppressive therapy after irradiation according to the invention, which prevents undirected proliferation and immunotoxic expansion in vivo.
  • the ability to proliferate the one or more other mammalian cells in the population can also be altered, in particular diminished, and the vitality 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d after irradiation for at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or 80% of these mammalian cells are preferably retained.
  • the ability to proliferate the one or more other mammalian cells is reduced while maintaining the vitality 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d after irradiation for at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or 80% of the cells is retained, but this is not mandatory.
  • Such differences can result from different sensitivities of different cells to the radiation.
  • the method is for the preparation of an agent comprising at least one treated target vital mammalian cell suitable for administration to a subject and / or for producing treated target mammalian vital cells for use in the manufacture of a cellular agent Administration to an individual.
  • immortalized cell lines can be irradiated according to the invention.
  • a composition comprising vital cells of the cell line irradiated according to the invention can be administered as an agent to an individual for tumor therapy.
  • An agent comprising cells of the cell line which have been irradiated according to the invention and which are reduced in their ability to proliferate, preferably reduced by 100% in their ability to proliferate, is suitable for administration to an individual.
  • an agent is not suitable for administration to an individual if the administration results in the death of the individual or leads to the disease of the individual, without a predominant therapeutic effect.
  • An agent is suitable for administration to an individual, especially a human, if it is suitable for therapeutic, preventive, diagnostic or cosmetic administration to an individual.
  • feeder cells can be irradiated according to the invention.
  • a composition comprising vital feeder cells irradiated according to the invention can be used to produce a cellular agent for administration to an individual.
  • the cellular agent in this embodiment may be a population of cells of a cell line.
  • the feeder cells may serve for the growth of cellular agents, for example, in the production of primary NK cell products.
  • the NK-cell products are suitable and intended for administration to an individual in this embodiment.
  • a cellular agent is a composition comprising at least one vital cell, preferably a pharmaceutical or cosmetic composition comprising at least one vital cell, more preferably a pharmaceutical composition comprising at least one vital cell.
  • a cellular agent for administration to an individual is preferably sterile and / or does not contain pyrogens.
  • An individual is a mammal, preferably a human. - -
  • step (ii) of the methods of the invention optionally, vital target mammalian cells are isolated or enriched from the population of mammalian cells.
  • vital target mammalian cells are isolated or enriched from the population of mammalian cells.
  • the methods of the invention are performed in vitro using suitable electron beam and / or X-ray generating devices. Such devices are known in the art.
  • the method according to the invention is carried out using a device for generating electron beams, which operates continuously or rapidly pulsed.
  • the method according to the invention is carried out using a device for generating electron beams, which supplies electrons according to the cold cathode or hot cathode principle.
  • the method according to the invention is carried out using a device for generating electron beams, which is designed as an axial radiator (scanner) or linear broadband radiator.
  • the composition is statically taken up in the device or transported continuously through the electron beam or X-ray beam.
  • the method according to the invention is preferably carried out using a device for generating x-rays, which provides the high dose rates according to the invention by means of a special target arrangement and a high-frequency electron beam with high frequency deflection.
  • a device for generating x-rays which provides the high dose rates according to the invention by means of a special target arrangement and a high-frequency electron beam with high frequency deflection.
  • Such devices for generating and high-frequency deflection of the electron beam are known in the art.
  • the methods of the invention are performed at a dose rate in the range of 5 Gy / sec to 10 7 Gy / sec. It has surprisingly been found that at this high dose rate the damage, especially secondary damage, to the cells is minimized.
  • the method of the present invention provides irradiated target mammalian cells which are vital for a longer time compared to conventionally irradiated mammalian cells, while at the same time reducing the ability to proliferate target mammalian cells (see Figures 2 to 12).
  • the target mammalian cells irradiated by the method according to the invention preferably have a higher biological activity over a longer period of time after the irradiation compared to conventionally irradiated mammalian cells.
  • the biological activity is preferably cytotoxicity to tumor cells. NK cells were successfully irradiated with the method of the invention as shown in the Examples and Figures 2 to 12.
  • the dose rate (dose / time) can be suitably adapted by the skilled person. It is generally to be considered that - with respect to a particular desired applied dose - a high beam current requires little irradiation time and little beam current requires a long exposure time.
  • the dose rate will be adjusted by the skilled person, taking into account e.g. with a continuous transport of the composition of the flow rate of the medium, and the radiator-type dependent jet current range. Due to the high dose rate, a high applied dose in the composition can be achieved even with a short irradiation time.
  • irradiation is carried out with (i) electron beams, (ii) electron beams and x-rays, or (iii) x-rays, at a dose rate in the range of 5 Gy / sec to 10 7 Gy / sec in accordance with the invention.
  • the method is performed with X-rays at a dose rate in the range of 5 Gy / sec to 10 7 Gy / sec in accordance with the invention.
  • electron beams are irradiated with dose rates according to the invention or with electron beams and X-rays at dose rates according to the invention, in particular preferably with electron beams with inventive - -
  • Dose rate irradiated It should be noted that when irradiated with electron beams at the impact of the rays and X-rays. Therefore, when irradiated with electron beams, X-rays are also irradiated. However, the dose rate of the X-rays will be significantly lower in the case of irradiation with electron beams according to the invention; about in the per thousand range.
  • a mammalian cell is "vital" in the sense of the present cells when the cell can be determined to be vital in a cell vitality determination method described in the prior art Such methods are well known in the art and include diffusion-based methods and methods In a preferred embodiment, a perforated cell membrane diffusion-based method is used to determine vitality.
  • Diffusion-based perforated cell membrane techniques are well known in the art and include perforating dyes such as trypan blue, brilliant blue FCF, crystal violet and DNA -intercalating fluorescent dyes 4 ', 6-diamidin-2-phenylindole (DAPI), ethidium bromide or propidium iodide.
  • perforating dyes such as trypan blue, brilliant blue FCF, crystal violet and DNA -intercalating fluorescent dyes 4 ', 6-diamidin-2-phenylindole (DAPI), ethidium bromide or propidium iodide.
  • DAPI 6-diamidin-2-phenylindole
  • ethidium bromide or propidium iodide ethidium bromide or propidium iodide.
  • these perforation dyes can penetrate through perforated cell membranes into vitally restricted cells, whereas live cells are hardly stained
  • vital cells after staining can be done microscopically, by trypan blue
  • the presence of a vital cell after irradiation is preferably within 1 d - - determined to 7 d after irradiation, in particular 2 d or 3 d to 7 d determined after irradiation.
  • the vitality 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d can be determined after the irradiation.
  • 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d after irradiation are at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 % or 80% of the irradiated target mammalian cells are vital, more preferably 3 d after irradiation, at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or 80% of the irradiated target mammalian cells are vital.
  • a method according to the invention is characterized in that the population of mammalian cells or the target mammalian cells after irradiation is / are suitable for administration to an individual and / or is suitable for producing a cellular agent for administration to an individual. are.
  • a method according to the invention is characterized in that the population of mammalian cells or the target mammalian cells is / are suitable for therapeutic, preventive or cosmetic administration to an individual and / or for the preparation of a cellular therapeutic, preventive or cosmetic agent suitable for administration to an individual.
  • the target mammalian cells are reduced in their ability to proliferate and the vitality 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d after irradiation for at least 10%, 20%, 30%, 40% , 50%, 60%, 70% or 80% of the target mammalian cells.
  • the cells are suitable and contemplated for therapeutic, preventive and / or cosmetic administration to an individual.
  • the cells are suitable for therapeutic and / or preventive administration to an individual for use in the prevention or treatment of cancer or a hyperproliferative disease.
  • the cells are suitable for therapeutic administration to an individual for use in the prevention or treatment of a disease requiring transplantation, such as leukemia in the case of hematopoietic stem cell preparations.
  • the cells are suitable for therapeutic and / or preventive administration to an individual for use in the prevention or treatment of, for example, a hyperproliferative disorder, cancer, immune disease or chronic degenerative disease, depending on the immune cells.
  • the population of mammalian cells or the target mammalian cells is suitable for administration to an individual for the therapy and / or prevention of a hyperproliferative disease, immune disease or chronic degenerative disease, and / or is the agent comprising at least one treated vital target Mammalian cell, a graft, in particular a hematopoietic stem cell transplant, a vaccine, a cytotoxic agent or an apheresis product.
  • a method according to the invention is characterized in that the dose is in the range from 0.1 Gy to 1 kGy, preferably in the range from 1 Gy to 100 Gy.
  • a method according to the invention is characterized in that the dose is in the range of 0.5 Gy to 800 Gy, preferably in the range of 1 Gy to 5 Gy, 10 Gy, 20 Gy, 30 Gy, 40 Gy, 50 Gy, 60 Gy , 70 Gy, 80 Gy, 90 Gy, 100 Gy, 200 Gy, 300 Gy, 400 Gy, 500 Gy, 600 Gy, 700 Gy, 800 Gy, 900 Gy or 1 kGy.
  • the dose is in the range of 1 Gy to 5 Gy, 1 Gy to 10 Gy, 1 Gy to 20 Gy, 1 Gy to 30 Gy, 1 Gy to 40 Gy, 1 Gy to 50 Gy, 1 Gy to 60 Gy, 1 Gy to 70 Gy, 1 Gy to 80 Gy, 1 Gy to 90 Gy, 1 Gy to 100 Gy or 1 Gy to 200 Gy.
  • the dose is in the range of 5 Gy to 10 Gy, 5 Gy to 20 Gy, 5 Gy to 30 Gy, 5 Gy to 40 Gy, 5 Gy to 50 Gy, 5 Gy to 60 Gy, 5 Gy to 70 Gy, 5 Gy to 80 Gy, 5 Gy to 90 Gy, 5 Gy to 100 Gy or 5 Gy to 200 Gy.
  • the dose is in the range of 10 Gy to 20 Gy, 10 Gy to 30 Gy, 10 Gy to 40 Gy, 10 Gy to 50 Gy, 10 Gy to 60 - -
  • the dose may be in the range of 10 Gy to 30 Gy.
  • a method according to the invention is characterized in that the dose rate is in the range from 10 Gy / sec to 10 4 Gy / sec, in particular between 50 Gy / sec to 10 3 Gy / sec, for example between 10 Gy / sec to 10 3 Gy / sec or 50 Gy / sec to 10 3 Gy / sec.
  • a method according to the invention is therefore characterized in that the irradiation time is in the range of between 0.1 msec and 10 sec, more preferably wherein the irradiation time is in the range of between 10 msec and 8 sec. More preferably, the irradiation time is in the range of between 0.1 msec and 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 sec, or between 0.5 msec and 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 sec.
  • a method according to the invention is characterized in that the composition comprising a population of mammalian cells is present as a thin layer during the irradiation in step (i).
  • a composition is present as a thin layer if the composition is thin with respect to the penetration depth of the radiation during the irradiation, in particular wherein the path length of the beam path through the composition during the irradiation is less than 5 cm.
  • composition as a thin layer allows for substantially homogeneous irradiation of the mammalian cells in the composition.
  • the composition as a thin layer may, for example, be on a solid support during irradiation, present as a thin liquid jet, or present as an aerosol, such as aerosol particles.
  • the composition is on a solid support upon irradiation.
  • the solid support preferably comprises a planar or substantially planar surface on which the composition is applied.
  • the solid support may be, for example, a planar or substantially planar surface, or may include cavities containing a planar or substantially planar surface.
  • the solid support may be flexible, for example a foil, or may not be flexible, for example a plate or array.
  • the solid carrier can be any carrier that is compatible and substantially non-toxic to the desired population of mammalian cells and target mammalian cells, and is preferably substantially radiation tolerant.
  • a carrier is compatible with the radiation if, during the irradiation, no migration of harmful radiolysis products from the irradiated carrier into the composition takes place.
  • plastic films such as polypropylene, PE or PVC films
  • plastic plates and arrays such as culture plates with one or more wells, or plastic trays, such as Petri dishes
  • plastic trays such as Petri dishes
  • the composition is irradiated on a solid support so that the rays strike the composition first and then the solid support.
  • the size and shape of the area of the irradiated composition is not particularly limited.
  • the area of the irradiated composition should be designed so that irradiation of the entire composition is made possible homogeneously. This can be done by irradiating the stationary held composition, or by continuously passing the composition through the beam path.
  • the surface area of the composition in step (i) may be between 1 mm 2 to 100 cm 2 .
  • the composition may comprise a cover during irradiation or may not comprise a cover.
  • a cover may be, for example, a lid, or a foil.
  • the composition may be in a bag. If a cover is used, the cover is preferably radiolucent and radiation-resistant. - -
  • the thin layer is preferably formed such that the thickness of the layer in the preferred direction of propagation of the beam path corresponds to the diameter of one or a few mammalian cell (s), for example the diameter of one or 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100 or 1000 mammalian cell (s).
  • a composition is to be irradiated as a thin layer on a solid support, as in the examples, the rays preferably impinge on the layer perpendicularly or substantially perpendicularly.
  • the thin liquid jet is preferably irradiated laterally, substantially perpendicular to the liquid jet.
  • the thin layer has a thickness of between 0.5 ⁇ and 3 cm.
  • the thin layer therefore preferably has a thickness of between 1 ⁇ m and 1 or 2 cm, 1 ⁇ m and 100 ⁇ m or 1 ⁇ m and 50 ⁇ m.
  • the composition comprising a population of mammalian cells prior to irradiation may be any composition containing mammalian cells comprising at least one living or vital target mammalian cell.
  • the composition may be frozen, lyophilized, gel, sol or liquid.
  • the composition is preferably a gel, in particular a hydrogel, or liquid.
  • the composition comprising a population of mammalian cells is frozen upon irradiation in step (i), a gel, a sol or liquid, preferably a gel or liquid.
  • the mammalian cells may be in suspension, and / or adhered to a solid support.
  • the composition preferably comprises water, more preferably an aqueous solution, wherein the aqueous solution particularly preferably contains one or more buffer substances and / or medium.
  • the aqueous buffered solution may be, for example, PBS.
  • the pH of such a solution is preferably in the range of pH 5.5 to 8.5, more preferably in the range of pH 6.5 to 8.0.
  • the composition may further contain hydrogel-forming substances, or may be frozen or liquid.
  • a method according to the invention is therefore characterized in that the composition comprising a population of mammalian cells is present as a cell suspension during the irradiation in step (i) (a), or
  • (b) is present as an adherent cell layer on a solid support.
  • the adherent cell layer may preferably have one or more, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 50 cell layers.
  • the population of mammalian cells upon irradiation in step (i) contains substantially no tissues, more preferably no contiguous tissue, such as liver pieces. An even distribution of the cells is helpful for homogeneous irradiation.
  • the electron beams may preferably be accelerated at energies in the range of 80 keV and 10 MeV.
  • a method according to the invention is characterized in that electron beams are irradiated and the electron beams are accelerated with an acceleration energy of between 80 keV and 10 MeV, in particular with an acceleration energy of between 80 keV and 300 keV.
  • the electron beams can be accelerated with an acceleration energy of between 80 keV and 1 MeV, 80 keV and 250 keV, 300 keV, 400 keV, 500 KeV, 600 KeV or 700 keV.
  • a method according to the invention is characterized in that X-rays are irradiated and the X-radiation has an energy of between 5 keV and 600 keV, preferably between 5 keV and 300 keV, 400 keV or 500 keV, more preferably between 10 and 200 keV.
  • the electron beams and / or X-rays are applied substantially under atmospheric pressure atmosphere, wherein the normal pressure atmosphere is preferably present as a gas mixture of the earth's atmosphere.
  • the temperature of the composition before irradiation is between -200 ° C and 38 ° C, preferably between -130 ° C, -80 ° C, -10 ° C or 0 ° C and 37, 7 ° C, more preferably between 10 ° C and 37.5 ° C, even more preferably between 15 ° C and 37.5 ° C.
  • the composition may also have a temperature of less than 1 ° C after irradiation, or the temperature of the composition after irradiation may be 1 ° C or more.
  • the temperature of the composition after irradiation is between -200 ° C and 38 ° C, preferably between -130 ° C, -80 ° C, -10 ° C or 0 ° C and 37, 7 ° C, more preferably between 10 ° C and 37.5 ° C, even more preferably between 15 ° C and 37.5 ° C.
  • the density of the composition is between 0.9 and 2 g / cm 3 , preferably between 1, 0 and 1, 8 g / cm 3 .
  • the vitality The cells are maintained 3 d after irradiation for at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% or 80% of the cells of the population. It is known to the person skilled in the art that different cells can have a different radiation sensitivity and therefore the values for different cells can vary.
  • the composition comprising a population of mammalian cells after irradiation comprises at least one targeting mammalian vital cell, and the target mammalian cell (s) of the composition have a reduced ability to proliferate after irradiation.
  • the ability to proliferate may be reduced by at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 95%.
  • the ability to proliferate after irradiation is reduced by 100%.
  • these cells can no longer multiply.
  • a 100% reduction in proliferation ability may be required in hyperproliferating cells, for example, tumor cells to be delivered or immortalized cell lines, as these cells are not suitable for a remaining ability to proliferate for administration to an individual.
  • the ability to proliferate can be determined by determining the number of cells under conditions that allow their growth in vitro. Such conditions are usually between 10 ° C to 38 ° C, in the presence of a suitable culture medium. The number of cells is determined at least two different times. Methods for determining the number of cells are well known to those skilled in the art and include, for example, methods for determining the proliferation or vitality of cells. The determination of vitality can be carried out as described above. Methods for determining proliferation are also well known to those skilled in the art and include, for example, the vitality tests mentioned above, as well as the chromium release assay or the lymphocyte transformation assay (LTT).
  • the reduction in the ability to proliferate after irradiation is understood as a reduction in the ability to proliferate compared to the same mammalian cells that have not been irradiated under otherwise similar conditions. - -
  • the irradiated, vital mammalian target cells have a desired biological activity, in particular 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d after irradiation.
  • This desired biological activity depends on the nature of the target mammalian cell.
  • the cell may have a therapeutically, preventively or cosmetically effective activity.
  • the biological activity may be cytotoxicity, immunogenicity, immunosuppression and mediation of immune tolerance.
  • the biological activity is preferably cytotoxicity to tumor cells. NK cells were successfully irradiated with the method of the invention as shown in the Examples and Figures 2 to 12.
  • the desired biological activity 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d or 7 d after irradiation is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the biological activity of the same mammalian cells which have not been irradiated under otherwise identical conditions. More preferably, the desired biological activity is 3 d after irradiation of at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the biological activity of the same mammalian cells which have not been irradiated , under otherwise identical conditions.
  • Methods for determining the desired biological activity are well known to those skilled in the art. For example, in vitro and / or in vivo assays for the determination of cytotoxicity, immunogenicity, immunosuppression or mediation of immune tolerance are well known.
  • a method according to the invention is characterized in that
  • composition comprising a population of mammalian cells after irradiation comprises at least one targeting mammalian vital cell
  • target mammalian cell (s) is a hyperproliferative or immortalized cell, and the ability to proliferate after irradiation is reduced by 100%
  • the target mammalian cell (s) of the composition after irradiation have a biological activity, in particular therapeutic, preventive or cosmetically active activity, preferably wherein the biological activity - - is selected from the group consisting of cytotoxicity, immunogenicity, immunosuppression and mediation of immune tolerance.
  • the present invention relates to a process for the preparation of an agent comprising at least one treated vital target mammalian cell suitable for administration to an individual, characterized in that:
  • composition comprising a population of mammalian cells, wherein the population of mammalian cells comprises at least one target mammalian cell is provided,
  • composition comprising a population of mammalian cells optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or
  • Adjuvants are added, and / or
  • steps (a1) to (a3) are carried out in any order.
  • an otherwise ready-to-use composition such as a vaccine, a cytotoxic product or apheresis product, which already contains suitable adjuvants and / or adjuvants and / or one or more other therapeutic, preventative or cosmetically active Contains funds.
  • irradiation of the population may be carried out in accordance with the invention and then optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or adjuvants may be added to the composition, and / or one or more other therapeutically, preventively or cosmetically active agents may be added to the composition ,
  • the composition in step (i) is a liquid suspension, a gel or adherent cells on a solid support, or a frozen composition containing water, for example a suspension of the mammalian cells in an aqueous solution the aqueous solution especially - - Preferably one or more buffer substances and / or medium contains.
  • the aqueous buffered solution may be, for example, PBS.
  • the pH of such a solution is preferably in the range of pH 5.5 to 8.5, more preferably in the range of pH 6.5 to 8.0.
  • composition in step (i) may contain one or more further pharmaceutically acceptable carriers and / or adjuvants, or these may be added if desired after step (i) and optionally step (ii). Furthermore, the composition in step (i) may be added with one or more further therapeutically, preventively or cosmetically active agents or, if desired, may be added after step (i) and optionally step (ii).
  • the composition in step (i) contains pharmaceutically acceptable carriers and / or adjuvants.
  • adjuvants may be included as adjuvants.
  • Adjuvants are well known to those skilled in the art. Suitable adjuvants are those sufficient to enhance an immune response to an immunogen.
  • Suitable adjuvants for antibody-based vaccines include, for example, aluminum salts such as aluminum phosphate or aluminum hydroxide, squalene mixtures (SAF-1), muramyl peptide, saponin derivatives, mycobacterium cell wall preparations, monophosphoryl lipid A, mycolic acid derivatives, block copolymer nonionic surfactants, Quil A, cholera toxin B subunit, polyphosphazene and derivatives and immunostimulating complexes (ISCOMs) such as those described in Takahashi et al. (1990) Nature 344: 873-875.
  • a suitable adjuvant for Th-1-based cytotoxic vaccines is, for example, poly I: C.
  • Suitable carriers and excipients are, for example, water or an aqueous solution suitable for administration, which particularly preferably contains one or more buffer substances. Suitable carriers and excipients may be selected depending on the route of administration, dose, dosage form, storage and active agent (s).
  • the excipients include excipients, for example microcrystalline cellulose, lactose, mannitol, solvents, for example polyethylene glycols, emulsifiers and dispersing or wetting agents, for example sodium dodecyl sulfate, polyoxysorbitanoleate, binders, for example polyvinylpyrrolidone, synthetic and natural polymers, for example albumin, stabilizers, for example - -
  • Antioxidants such as ascorbic acid, dyes, for example, inorganic pigments such as iron oxides, and flavor and / or odoriferous.
  • the dose and route of administration will also depend on the type of cellular agent to be administered. For example, systemic, such as intravenous or intraperitoneal administration, enteral or parenteral administration, or local administration such as intratumoral or subcutaneous administration may be considered. Further, depending on the type of cellular agent to be administered, for example, between 10 4 to 10 9 cells per administration may be administered to an individual.
  • the present invention relates to an agent comprising at least one treated vital target mammalian cell suitable for administration to an individual and / or treated targeting vital mammalian cell suitable for the manufacture of a cellular agent for administration to an individual is producible according to any method of the invention carried out above.
  • the agent and / or treated target mammalian vital cell treated according to the invention is characterized by having one or more features disclosed in the method of the invention, preferably wherein the agent is for use in the treatment or prevention of a disease.
  • the present invention relates to the use of a device for generating electron beams and / or X-rays, - -
  • the present invention relates to the use of electron beams and / or X-rays,
  • a use according to the invention is therefore characterized in that it has one or more features which are / are disclosed for the method according to the invention.
  • FIG. 1 Loss of anti-tumor cytotoxicity conventionally (gamma, 10 Gy) of irradiated NK cell lines according to Tarn et al. (1999) and Suck et al. (2006).
  • K562 lymphoma tumor cell line as cytotoxic target A): NK-92 NK cell line B): KHYG-1 NK cell line
  • Bars Control, right bars: 3 days after irradiation with 10 kGy.
  • Electron beam and restriction of proliferation and preservation of vitality of irradiated cells The control was treated the same except for a fake irradiation.
  • minimal dose 3
  • NK-92 cells treated with 5x minimal dose 3.
  • NK-92 cells treated with 10x minimal dose 4.
  • NK-92 cells treated with 100x minimal dose The electron irradiation of a thin liquid film of a cell suspension leads to a restriction of the proliferative activity of the cellular component with largely preserved vitality.
  • NK-92 cells treated conventionally (10 Gy gamma); 2. NK-92 cells translL2-1 conventionally treated; 3. NK - -
  • KHYG-1 cells translL2-1 conventionally treated; 4. NK-92 cells treated with minimal dose electron beams.
  • B Bars from left: 1. KHYG-1 cells treated conventionally (10 Gy gamma); 2. KHYG-1 cells treated with minimal dose electron beams.
  • Figure 5 Proliferation of NK92 after conventional irradiation or minimally metered electron beam irradiation.
  • the NK92 NK cell line was irradiated with conventional x-irradiation (cans: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) ("x-ray") or minimally dosed electron beam irradiation ("ebeam”).
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • FIG. 6 Vitality of NK92 after conventional irradiation or minimally metered electron beam irradiation.
  • the NK cell line NK92 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • Cells were seeded at a density of one million cells / ml in NK cell medium in a 6-well flat-bottomed plate.
  • FIG. 7 Cytotoxic capacity of NK92 after conventional irradiation and minimally metered electron beam irradiation. Effector cells to target cells 5: 1.
  • the NK cell line NK92 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. (calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy) and the specific lysis was detected over four days (24, 48, 72 and 96 hours).
  • NK92 was co-cultured for two hours with the target cell line K562 in an E: T ratio of 5: 1 in NK cell medium.
  • the data of the conventional irradiation were calculated from a duplicate experiment and were expressed as mean ⁇ SD.
  • the data for the minimal dose electron beam irradiation were calculated from three independent experiments with triplicates and were presented as the mean ⁇ SD. Compared to conventional irradiation data, statistical significance was achieved at p-values ⁇ 0.05 ( * ) and calculated using the unpaired two-tailed t-test.
  • E T: Effector cells to target cells.
  • FIG. 8 Cytotoxic capacity of NK92 after conventional irradiation and minimally metered electron beam irradiation. Effector cells to target cells 1: 1.
  • the NK cell line NK92 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • the specific lysis was detected over four days (24, 48, 72 and 96 hours).
  • NK92 was incubated for two hours with the target cell line K562 in an E: T - -
  • FIG. 9 Proliferation of KHYG1 after conventional irradiation or minimally metered electron beam irradiation.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with conventional X-ray irradiation (X-ray irradiation (cans: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) Apparatus: SARRP, Xstrahl Limited, UK) ("x-ray”) or minimally metered electron beam irradiation ( ebeam)
  • FIG. 10 Vitality of KHYG1 after conventional irradiation or minimally metered electron beam irradiation.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (X-ray irradiation (dose: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation Electron irradiation was performed under the following conditions: dose rate : about 300 Gy / sec calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy The cells were in a density of one million cells / ml - - Sown in NK Zellmediunn in a 6-well (wells) plate with flat bottom.
  • FIG. 11 Cytotoxic property of KHYG1 after conventional irradiation and minimally metered electron beam irradiation. Effector cells to target cells 5: 1.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (X-ray irradiation (dose: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose ebeam irradiation 300 Gy / sec calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy
  • the specific lysis was detected over four days (24, 48, 72 and 96 hours) for the europium cytotoxicity assay KHYG1 was co-cultured with the target cell line K562 for two hours in an E: T ratio of 5: 1 in NK cell medium
  • the data from the conventional irradiation were calculated from a duplicate experiment and were presented as the mean ⁇ SD data of the minimal dose electron beam irradiation were calculated from three independent experiments with triplicates and were presented as
  • FIG. 12 Cytotoxic capacity of KHYG1 after conventional irradiation and minimally metered electron beam irradiation. Effector cells to target cells 1: 1.
  • the NK cell line KHYG1 was probed with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation - - irradiated.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • the specific lysis was detected over four days (24, 48, 72 and 96 hours).
  • KHYG1 was cocultivated with the target cell line K562 for two hours in an E: T ratio of 1: 1 in NK cell medium.
  • the data of the conventional irradiation were calculated from a duplicate experiment and were expressed as mean ⁇ SD.
  • the data for the minimal dose electron beam irradiation were calculated from three independent experiments with triplicates and were presented as the mean ⁇ SD.
  • a statistical significance was achieved at p-values ⁇ 0.05 ( * ) and calculated with the unpaired two-sided t-test.
  • E T: Effector cells to target cells.
  • the cell number was kept for cultivation or expansion between 0.2-1 x 10 6 cells / ml medium.
  • 70 ⁇ l of a 1 ⁇ 10 7 cell / ml cell suspension were irradiated.
  • the cell count and vitality were determined by trypan blue counting before irradiation.
  • 10 ⁇ l of the cell suspension in medium were mixed with 10 ⁇ l of a 0.5% trypan blue solution (0.5 g trypan blue [Thomas Geyer, Renningen] in 100 ml DPBS buffer [Fisher Scientific, Schrete]).
  • the mixture is incubated for about 2 minutes at 37 ° C and by means of a Neubauer counting chamber [Dr. Ilona Schubert Laboratory Trade, Leipzig].
  • 10 ⁇ of the mixture are placed under a cover glass on the chamber so that it fills with the colored mixture.
  • a cell culture transmitted light microscope (Axio, Zeiss, Jena) using 10er lens, the evaluation. Vital cells are morphologically round and colorless, while dead cells are also round and purple discolored.
  • the cell count is the mean of the number of cells in the four large squares multiplied by the dilution factor (here: 0.5), the volume of the original cell suspension, and the counting chamber-specific factor 10 4 .
  • the cells were adjusted to the desired cell density and harvested by centrifugation at 300 xg [Fisher Scientific, Schong] or pelleted and taken up in 70 ⁇ DPBS each.
  • the cells were irradiated with a minimum dose in the range of about 20 ⁇ 10 Gy (hereinafter referred to as "minimum dose") and at 5, 10, 50 and 100 times this minimum dose of about 20 Gy and 2000 Gy (calculated) irradiated.
  • minimum dose a minimum dose in the range of about 20 ⁇ 10 Gy (hereinafter referred to as "minimum dose") and at 5, 10, 50 and 100 times this minimum dose of about 20 Gy and 2000 Gy (calculated) irradiated.
  • the irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: approx. 300 Gy / sec (calculated).
  • Irradiation time between 0.066 and 6.6 sec.
  • the cells were dissolved under the OPP film with about 100 ⁇ M of a trypsin / 0.5% EDTA solution [Fisher Scientific, Schrö], washed with DPBS and vitality determined via trypan blue cell counting. Thereafter, the cells were added with medium and transferred to a new well (well) for further cultivation and according to the cultivation conditions - -
  • NK92 NK cell line was irradiated with conventional x-irradiation (cans: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) ("x-ray") or minimally dosed electron beam irradiation ("ebeam").
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • NK92 The vitality of NK92 was determined after conventional low dose rate irradiation or minimal dose high dose rate electron beam irradiation.
  • the NK cell line NK92 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • NK92 cytotoxic ability of NK92 was determined after conventional low dose rate irradiation with minimal dose electron beam irradiation at high dose rate, with a ratio of effector to target cells of 5: 1.
  • the NK cell line NK92 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • NK92 was cocultured for two hours with the target cell line K562 in an E: T ratio of 5: 1 in NK cell medium.
  • the data of the conventional irradiation were calculated from a duplicate experiment and were expressed as mean ⁇ SD.
  • the data for the minimal dose electron beam irradiation were calculated from three independent experiments with triplicates and were presented as the mean ⁇ SD.
  • Statistical significance was achieved at p-values ⁇ 0.05 ( * ) compared to the data from conventional irradiation and calculated using the unpaired two-tailed t-test.
  • E T: Effector cells to target cells.
  • NK92 cytotoxic capacity of NK92 was determined after conventional low dose rate irradiation and minimized dose electron beam irradiation at high dose rate, with a ratio of effector to target cells of 1: 1.
  • the NK cell line NK92 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec (calculated). Irradiation time: between 0.033 and 6.6 sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • NK92 was cocultured for two hours with the target cell line K562 in an E: T ratio of 1: 1 in NK cell medium.
  • the data of the conventional irradiation were calculated from a duplicate experiment and were expressed as mean ⁇ SD.
  • the data of the minimal dose electron beam irradiation were calculated from three independent ones - -
  • the proliferation of KHYG1 was determined after conventional low dose rate irradiation or minimal dose high dose rate electron beam irradiation.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with conventional x-irradiation (cans: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) ("x-ray") or minimally dosed electron beam irradiation ("ebeam”).
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy. Cells were seeded immediately after irradiation at a density of one million cells / ml in NK cell medium in a 6-well flat-bottomed plate.
  • the cells were counted by trypan blue staining. Proliferation was observed over four days (24, 48, 72 and 96 hours). The count after 24 hours of irradiation served as the reference value.
  • the data of the conventional irradiation were calculated from an experiment with triplicates and were shown as mean ⁇ SEM.
  • the vitality of KHYG1 was determined after conventional low dose rate irradiation or minimal dose high dose rate electron beam irradiation.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy. Cells were seeded at a density of one million cells / ml in NK cell medium in a 6-well flat-bottomed plate.
  • cytotoxic capacity of KHYG1 was determined after conventional low dose rate irradiation with minimal dose electron beam irradiation at high dose rate, with a 5: 1 effector cell to target cell ratio.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec.
  • the cytotoxic capacity of KHYG1 was determined after conventional low dose rate irradiation with minimal dose electron beam irradiation at high dose rate, with a ratio of effector to target cells of 1: 1.
  • the NK cell line KHYG1 was irradiated with (a) conventional X-ray irradiation (doses: 10, 20 and 40 Gy, instrument: SARRP, Xstrahl Limited, UK) or (b) minimum dose electron beam irradiation.
  • the electron irradiation was carried out under the following conditions: Dose rate: about 300 Gy / sec. Calculated doses: 0, 10, 20 and 40 Gy.
  • the specific lysis was detected over four days (24, 48, 72 and 96 hours).
  • KHYG1 was co-cultivated with the target cell line K562 for two hours in an E: T ratio of 1: 1 in NK cell medium.
  • the data of the conventional irradiation were calculated from a duplicate experiment and were expressed as mean ⁇ SD.
  • the data for the minimal dose electron beam irradiation were calculated from three independent experiments with triplicates and were presented as the mean ⁇ SD. - -
  • FIGS. 5 to 12 show that the high dose rate electron beam irradiation of the present invention has the cell vitality as well as the desired cytotoxicity biological activity of conventional X-ray irradiation of 10 Gy, 20 Gy or 40 Gy and a low dose rate , is superior at each same dose.
  • Irradiation preserves immunosuppressive potential and inhibits clonogenic capacity of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.
  • Cancer research 69 (9), p. 4010-4017.
  • DOI 10.1 158 / 0008-5472.CAN-08-3712. Klingemann, H.
  • NK-92 Off-the-shelf therapeutic for adoptive natural killer cell-based cancer immunotherapy.
  • KHYG-1 A novel natural killer cell line (KHYG-1) from a patient with aggressive natural killer cell leukemia carrying a p53 point mutation.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, dadurch gekennzeichnet, dass: (i) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt, und (ii) optional vitale Ziel-Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert werden, sowie dadurch erhältliche Mittel, sowie Verwendungen davon.

Description

Verfahren zur Bestrahlung von Säugetierzellen mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, dadurch gekennzeichnet, dass: (i) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt, und (ii) optional vitale Ziel-Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert werden, sowie dadurch erhältliche Mittel, sowie Verwendungen davon. Zelltherapeutika können zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden. Besonders vielversprechend ist derzeit der Forschungsstand und klinische Einsatz von zellulären Therapeutika im Bereich der Behandlung von Krebserkrankungen (Melief et al. 201 1 ). Jedoch ergab sich in der Vergangenheit eine Reihe von Problemen beim Einsatz dieser Therapeutika-Gruppe. Zum einen ist man bei der Gewinnung von therapeutischen Zellen häufig auf Spenderzellen angewiesen, die in ausreichender Menge und klinischen Ansprüchen genügend gewonnen werden müssen. Patienten-eigene, sogenannte autologe Präparate, wiederum sind insbesondere bei vorbehandelten Krebspatienten in ihrer potentiellen Effektivität mitunter stark eingeschränkt.
Eine Alternative bietet sich in der Verwendung von Zelllinien an, welche beispielsweise primären Tumoren entstammen oder bspw. mittels viraler Behandlung immortalisiert wurden. Derartige Zelllinien sind potentiell in jeder gewünschten Menge produzierbar und eignen sich hierdurch auch als „on the shelf" Produkt. Insbesondere Zelllinien, die dem Charakter von Natürlichen Killerzellen entsprechen (NK Zellen) werden bereits in der Klinik zur Behandlung von Tumoren eingesetzt (Carotta 2016; Suck et al. 2016).
Von besonderem Interesse ist die therapeutische Verwendung der Zelllinien NK- 92 und KHYG-1 . Es handelt sich hierbei originär um Lymphom- bzw. - -
Leukämiezellen, welche in den 90er Jahren Patienten entnommen und dauerhaft kultiviert werden konnten (Klingemann et al. 1996; Yagita et al. 2000). Beide Zelllinien verfügen über ein Profil entsprechend NK-Zellen, lassen sich beispielsweise durch das Interleukin (IL)-2 stimulieren und besitzen hervorragende zytotoxische Eigenschaften gegenüber verschiedenen Tumorentitäten.
Die Anwendung solcher und anderer zellulärer Produkte am Patienten unterliegt weiterhin strengen Sicherheitsauflagen. Da es sich im Prinzip um Krebszellen handelt, müssen diese vor Verabreichung in ihrem Wachstum eingeschränkt werden. Eine ungehinderte Proliferation geht im Übrigen auch bei der Anwendung anderer zellulärer Therapeutika mit mitunter schweren Nebenwirkungen wie dem erwähnten onkogenen Potential, aber auch immuntoxischen Effekten einher. Diese Nebenwirkungen gilt es strengstens zu vermeiden. Aktuell werden daher eine große Reihe von zelltherapeutischen Produkten, insbesondere solche die ihren Ursprung in Krebszelllinien haben, mittels Gamma- Bestrahlung inaktiviert (Tarn et al. 1999).
Diese Art der Bestrahlung führt zur kompletten Inhibierung des Zellwachstums, und letztendlich auch nach einer gewissen Zeit, in der Regel wenigen Tagen, zum Tod der derart behandelten Zellen. Insbesondere die Gamma-Bestrahlung ist darüber hinaus auch für ihren negativen Einfluss auf die funktionelle Effektivität, beispielsweise die anti-Tumor zytotoxische Aktivität von NK-Zellen, bekannt (Figur
1 )-
Aktuelle Beispiele zellulärer therapeutischer Produkte, welche vor Applikation mittels Gamma-Bestrahlung inaktiviert werden, sind beispielsweise folgende:
(a) Bestrahlung von NK-Zelllinien vor Einsatz in der Krebstherapie (Klingemann et al. 1996)
(b) Bestrahlung von sogenannten „Feeder" -Zellen, also Zelllinien, die der Anzucht der eigentlich therapeutischen Zellprodukte dienen, beispielsweise bei der Herstellung primärer NK-Zell-Produkte (Fujisaki et al. 2009)
(c) Bestrahlung von Tumorzellen ex vivo im Rahmen der Produktion von sogenannten Zellvakzinen basierend auf dendritischen Zellen (DCs) (Vandenberk et al. 2016) - -
(d) Bestrahlung von anderen Zell Produkten, beispielsweise mesenchymalen Stromazellen, zur Verhinderung einer ungerichteten Proliferation oder immuntoxischen Expansion im Rahmen einer zellulären immunsuppressiven Therapie (de Andrade, Ana Valeria Gouveia et al. 2014).
Alle diese zellulären Produkte werden üblicherweise ex vivo, also vor Einsatz am Patienten und außerhalb des Körpers mit Gamma-Strahlung einer hohen, letztendlich letalen Dosis, zumeist mit ungefähr 10 bis 50 Gy, typischerweise mit 30 Gy, bestrahlt.
Ein äußerst relevantes Problem, dass sich aus diesem methodischen Vorgehen des Standes der Technik ergibt, ist ein begleitender erheblicher Funktionsverlust der zellulären Therapeutika auf Grund dieser unumgänglichen Bestrahlung.
Beispielsweise verlieren derart Gamma-bestrahlte NK-92 Zellen mindestens 50% ihres zytotoxischen Potentials (Tarn et al. 1999).
Mittlerweile werden auch genetisch veränderte und für die Tumortherapie optimierte NK-Zelllinien hergestellt, welche jedoch noch strahlensensibler erscheinen als unveränderte NK-Zellen.
Der Funktionsverlust ist dabei zum einen auf häufig lange Bestrahlungszeiten zurückzuführen, die nötig sind um höhere Dosen zu erreichen, aber auch die Akkumulation von Gamma-Bestrahlungs-assoziierten Effekten, wie beispielsweise ungewollte Oxidation von Effektormolekülen.
Zusätzlich stellt auch die technische Realisierung einer Gamma-Bestrahlung von Zellprodukten mitunter ein Problem dar, da es strikter Abschirmungs- und Sicherheitsmaßnahmen bedarf und die Zerfallsstrahlung generell technisch schwieriger zu steuern ist (WO 2015/01 1265 A1 ).
Die Nutzung von Elektronenstrahl-Geräten zur Sterilisation von Festkörpern und Flüssigkeiten wurde im Stand der Technik beschrieben. Der Einsatz von Elektronenstrahlen wurde darüber hinaus im Zusammenhang mit der Herstellung von Vakzinen auf Basis bestrahlter viraler Partikel offenbart (US 8,173,139 B1 ; WO 2015/01 1265A1 ). Es besteht daher ein Bedürfnis nach regulatorisch sicheren und einfach handhabbaren Verfahren zur Herstellung von zellulären Mitteln, die zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, oder zur Herstellung von zellulären Mitteln, die ihrerseits zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, wobei die Verfahren die Vitalität und biologische Aktivität von bestrahlten Zellen, insbesondere für einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung, wie für 1 d bis 7 d nach Bestrahlung, für einen möglichst großen Anteil der bestrahlten Zellen erhalten. Die Probleme des Standes der Technik werden durch die erfindungsgemäßen Verfahren überwunden:
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, dadurch gekennzeichnet, dass:
(i) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt, und
(ii) optional vitale Ziel-Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel-Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, dass:
(i) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt, und
(ii) optional vitale Ziel-Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert werden. - -
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass durch die Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen mit einer hohen erfindungsgemäßen Dosisrate die Fähigkeit zur Proliferation der Ziel- Säugetierzelle vermindert, beispielsweise vollständig inhibiert werden kann, während die Zellen gleichzeitig vital sind: die bestrahlte Zellpopulation weist überraschenderweise gegenüber konventionell mit Röntgen- oder Gammastrahlung bestrahlten Zellen, die mit niedriger Dosisrate bestrahlt wurden, über einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung einen höheren Anteil vitaler Zellen in der bestrahlten Zell-Population auf, bei jeweils gleicher Strahlendosis. Insbesondere können die Zellen nach erfindungsgemäßer Bestrahlung eine höhere gewünschte biologische Aktivität aufweisen, beispielsweise Zytotoxizität, verglichen mit konventionell bestrahlten Zellen. So wird durch die Beispiele und die zugehörigen Figuren 2 bis 12 belegt, dass die erfindungsgemäße Bestrahlung mit Elektronenstrahlen mit hoher Dosisrate hinsichtlich der Vitalität der Zellen als auch der gewünschten biologische Aktivität der Zytotoxizität einer konventionellen Bestrahlung mit Gamma- oder Röntgenstrahlen bei einer niedrigen Dosisrate, bei jeweils gleicher Dosis, überlegen ist.
Bei konventionellen, im Stand der Technik bekannten Bestrahlungsverfahren mit gamma-Strahlen bzw. Röntgenstrahlen wird eine niedrige Dosisrate eingesetzt; d.h. eine bestimmte Dosis wird über einen längeren Zeitraum hinweg appliziert. Ein weiterer Vorteil der Elektronenstrahl-Bestrahlung als auch der Röntgen- Bestrahlung insbesondere im Vergleich zu Gamma-Bestrahlung liegt in dem Potential einer Patienten-nahen („bed-side") Anwendung und/oder „high throughpuf'-Anwendung: da eine vergleichsweise geringe Abschirmung erforderlich ist, ist es möglich, die erfindungsgemäßen Bestrahlungsverfahren dezentral in einer üblichen Radiologie-Einheit eines Krankenhauses durchzuführen. Dies ermöglicht das Einsparen von Wegen und Zeit.
Hinzu kommt die Vermeidung von langzeitbegleitenden oxidativen Effekten der Gamma-Bestrahlung durch die ionisierte Atmosphäre, welche sich ebenfalls negativ auf die Funktionalität der bestrahlten biologischen, insbesondere zellulären, Komponenten auswirken kann. Bei kurzem Dosisstoß in Elektronenstrahl-Anlagen oder Röntgenstrahl-Anlagen, jeweils mit den erfindungsgemäßen hohen Dosisraten im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek, - - werden solche Nebenwirkungen durch die kurze Behandlungszeit, beispielsweise im Millisekunden-Bereich, jedoch ausgeschlossen.
Somit hat die Verwendung von Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen Vorteile bei der präziseren Steuerbarkeit der gewünschten hohen Dosisrate sowie des verminderten Sicherheitsrisikos für den Betreiber und die Umwelt solch eines Gerätes im Vergleich zu Gamma-Strahlern, welche auf dem Zerfall radioaktiver Nuklide basieren. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden Säugetierzellen bestrahlt. Die Säugetierzellen können Zellen beliebiger Säugetiere sein, wie beispielsweise Menschen, Schweine, Kühe, Pferde, Hunde, Katzen, Schafe, Affen, Ratten, Mäuse, Kaninchen, Meerschweinchen oder Hasen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Säugetier ein Affe oder Mensch, am meisten bevorzugt ein Mensch. Die Säugetierzellen können direkt aus dem Säuger entnommene Zellen, primäre Zellen, kultivierte Säugetierzellen, oder genetisch veränderte Säugetierzellen sein, wie beispielsweise Zelllinien von Säugetierzellen. Eine bevorzugte Ausführungsform solcher Zelllinien sind immortalisierte Zelllinien, wie die in den Beispielen verwendeten immortalisierten Krebszelllinien.
Die Säugetierzellen können Zellen von unterschiedlichen Orten eines Säugetiers sein, und können beispielsweise Blutzellen, PBMC-Zellen, Plasmazellen, Tumorzellen, Zellen von gesundem oder erkranktem Gewebe, Zellen von Organen, wie beispielsweise Leberzellen, Nierenzellen, Milzzellen, Bauchspeicheldrüsenzellen, hämatopoetische Stammzellen, Zellen aus Körperflüssigkeiten wie Urin, Speichel oder Liquor und/oder Zellen, die für eine Transplantation vorgesehen sind, sein.
Stammzellen sind bevorzugt keine humanen embryonalen Stammzellen und/oder die Population von Säugetierzellen enthält bevorzugt keine humanen embryonalen Stammzellen.
Bei den Verfahren wird eine Population von Säugetierzellen bestrahlt. Eine Population von Säugetierzellen umfasst mindestens 2 Zellen, bevorzugt mindestens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 oder 109 Zellen, beispielsweise 102 bis 109 Zellen, 103 bis 108 Zellen, 104 bis 108 Zellen oder 105 bis 107 oder l O8 bis 109 Zellen. Die Population von Säugetierzellen enthält mindestens eine Ziel-Säugetierzelle. Eine Ziel-Säugetierzelle ist eine Säugetierzelle deren Fähigkeit zur Proliferation durch die Bestrahlung vermindert werden soll, während die Vitalität der Ziel- Säugetierzelle im Zeitraum 1 d bis 7 d nach Bestrahlung erhalten werden soll, und vorzugsweise die biologische Aktivität der Ziel-Säugetierzelle im Zeitraum 1 d bis 7 d nach Bestrahlung erhalten werden soll. Bevorzugt bleibt die Vitalität der Ziel- Säugetierzelle 3 d nach Bestrahlung für mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % einer Mehrzahl von bestrahlten Ziel-Säugetierzellen erhalten, und/oder beträgt die biologische Aktivität der Ziel-Säugetierzelle 3 d nach Bestrahlung mindestens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der biologischen Aktivität von gleichen Säugetierzellen, die keiner Bestrahlung unterworfen wurden, unter ansonsten gleichen Bedingungen. Dabei ist es möglich, dass die Population von Säugetierzellen aus Ziel-Säugetierzellen besteht, oder dass die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält und eine oder mehrere andere Säugetierzellen.
So ist es beispielsweise möglich, eine kultivierte immortalisierte Säugetierzelllinie oder Tumorzellen als Ziel-Säugetierzellen zu bestrahlen. In dieser Ausführungsform kann die Population von Säugetierzellen aus Ziel- Säugetierzellen bestehen. Die Population von Säugetierzellen enthält in dieser Ausführungsform keine oder im Wesentlichen keine anderen Säugetierzellen.
Eine Population von Säugetierzellen, die neben der/den Zielsäugetierzelle(n) eine oder mehrere andere Säugetierzellen enthält kann beispielsweise ein Transplantat umfassend verschiedene Zelltypen, wie ein hämatopoetisches Stammzelltransplantat, sein, oder eine Ko-Kultur von 2, 3 oder mehr verschiedenen Zelltypen von Säugetierzellen. Beispielsweise können Feeder- Zellen in einer Ko-Kultur umfassend die Feeder-Zellen und die Ziel- Säugetierzellen, wie Tumorzellen, enthalten sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren daher dadurch gekennzeichnet, dass die Population von Säugetierzellen aus Ziel- Säugetierzellen besteht oder im Wesentlichen aus Ziel-Säugetierzellen besteht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren daher dadurch gekennzeichnet, dass die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle und eine oder mehrere andere Säugetierzellen enthält. - -
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Population von Säugetierzellen eine Mischung von mindestens 2 unterschiedlichen primären Säugetierzellen umfasst, insbesondere wobei die Population von Säugetierzellen ein zelluläres Transplantat oder eine Mischung von Immunzellen oder eine Körperflüssigkeit ist.
Primäre Säugetierzellen sind Säugetierzellen, die einem Säugetier entnommen wurden und die ihre phänotypischen Eigenschaften beibehalten haben. Immortalisierte Zellen sind keine primäre Säugetierzellen.
Eine Mischung von Immunzellen kann beispielsweise eine Zusammensetzung sein, die ein oder mehrere der folgenden Zellen enthält: T-Zellen, insbesondere Treg-Zellen, CD4+-Zellen oder CD8+-T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen oder DC-Zellen.
Eine Körperflüssigkeit kann beispielsweise Blut, Blutplasma, Vollblut, Urin, Speicher oder Liquor sein.
Ein zelluläres Transplantat kann beispielsweise ein hämatopoetisches Stammzelltransplantat sein. Ein zelluläres Transplantat kann weiterhin beispielsweise allogen oder autolog sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Population von Säugetierzellen eine oder mehrere Zelllinien umfasst oder aus einer oder mehreren Zelllinien besteht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel-Säugetierzelle eine proliferierende, hyperproliferative oder immortalisierte Ziel-Säugetierzelle ist, insbesondere wobei die Ziel-Säugetierzelle eine Krebszelle, Krebszelllinie und/oder Immunzelle ist, insbesondere wobei die Zelllinie eine natürliche Killerzell- (NK-Zell-)linie, T-Zelllinie, oder gentechnisch veränderte Zelllinie ist, und/oder die Immunzellen natürliche Killerzellen (NK-Zellen), T-Zellen oder gentechnisch veränderte Immunzellen sind.
Bei diesen Zellen ist es insbesondere erforderlich, die Fähigkeit zur Proliferation zu vermindern, wenn möglich um 100% zu vermindern, um eine ungerichtete Proliferation und/oder immuntoxische Effekte in vivo zu vermeiden. Gleichzeitig ist - - es wichtig, die Vitalität für einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung zu erhalten, damit die Zellen den gewünschten therapeutischen, präventiven oder kosmetischen Effekt bewirken können. Bestrahlte Säugetierzelllinien, wie die in den Beispielen eingesetzte NK-Zelllinie, können anschließend in der Krebstherapie eingesetzt werden, da die schädliche ungehemmte Proliferation durch die Bestrahlung vermindert ist, während die Vitalität für einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung erhalten wurde. In gleicher Weise kann das Verfahren für sogenannte„Feeder" -Zellen als Ziel- Säugetierzellen angewandt werden. „Feeder" -Zellen sind Zelllinien, die der Anzucht der eigentlich therapeutischen Zellprodukte dienen, beispielsweise bei der Herstellung primärer NK-Zell-Produkte. Erfindungsgemäß können auch Tumorzellen bestrahlt werden, die nach der Behandlung ex vivo im Rahmen der Produktion von sogenannten Zellvakzinen basierend auf dendritischen Zellen (DCs) verwendet werden.
Es können jedoch auch andere zelluläre Mittel, wie beispielsweise mesenchymale Stromazellen als Ziel-Säugetierzellen bestrahlt werden. Solche mesenchymalen Stromazellen können nach der erfindungsgemäßen Bestrahlung, die eine ungerichtete Proliferation und immuntoxische Expansion in vivo verhindert, im Rahmen einer zellulären immunsuppressiven Therapie eingesetzt werden. Wenn neben der/den Zielsäugetierzelle(n) eine oder mehrere andere Säugetierzellen in der Population vorhanden sind, kann auch die Fähigkeit zur Proliferation der einen oder mehreren anderen Säugetierzellen in der Population durch die Bestrahlung verändert, insbesondere vermindert werden und die Vitalität 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung für mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % dieser Säugetierzellen vorzugsweise erhalten bleiben. Vorzugsweise wird die Fähigkeit zur Proliferation der einen oder mehreren anderen Säugetierzellen vermindert, während die Vitalität 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung für mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der Zellen erhalten bleibt, dies ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Solche Unterschiede können sich durch unterschiedliche Empfindlichkeiten verschiedener Zellen gegenüber der Strahlung ergeben. - -
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung eines Mittels umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel- Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel-Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist.
Beispielsweise können immortalisierte Zelllinien erfindungsgemäß bestrahlt werden. Eine Zusammensetzung umfassend erfindungsgemäß bestrahlte, vitale Zellen der Zelllinie können als Mittel an ein Individuum zur Tumortherapie verabreicht werden. Ein Mittel umfassend erfindungsgemäß bestrahlte, vitale Zellen der Zelllinie, die in ihrer Fähigkeit zur Proliferation vermindert sind, bevorzugt um 100% in ihrer Fähigkeit zur Proliferation vermindert sind, ist zur Verabreichung an ein Individuum geeignet. Dagegen ist ein Mittel nicht zur Verabreichung an ein Individuum geeignet, wenn die Verabreichung zum Tod des Individuums führt oder zur Erkrankung des Individuums führt, ohne einen überwiegenden therapeutischen Effekt. Ein Mittel ist zur Verabreichung an ein Individuum, insbesondere einen Menschen geeignet, wenn es zur therapeutischen, präventiven, diagnostischen oder kosmetischen Verabreichung an ein Individuum geeignet ist.
Beispielsweise können Feeder-Zellen erfindungsgemäß bestrahlt werden. Eine Zusammensetzung umfassend erfindungsgemäß bestrahlte, vitale Feeder-Zellen können zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum eingesetzt werden. Das zelluläre Mittel kann in dieser Ausführungsform eine Population von Zellen einer Zelllinie sein. Die Feeder-Zellen können für die Anzucht der zellulären Mittel dienen, beispielsweise bei der Herstellung primärer NK-Zell-Produkte. Die NK-Zell-Produkte sind in dieser Ausführungsform zur Verabreichung an ein Individuum geeignet und vorgesehen. Ein zelluläres Mittel ist eine Zusammensetzung umfassend mindestens eine vitale Zelle, bevorzugt eine pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung umfassend mindestens eine vitale Zelle, stärker bevorzugt eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens eine vitale Zelle. Ein zelluläres Mittel zur Verabreichung an ein Individuum ist bevorzugt steril und/oder enthält keine Pyrogene.
Ein Individuum ist ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch. - -
In Schritt (ii) der erfindungsgemäßen Verfahren werden optional vitale Ziel- Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert. So ist es beispielsweise möglich, falls erforderlich, Ziel-Säugetierzellen nach der Bestrahlung in Schritt (i), beispielsweise durch immunologische Verfahren, wie Apherese, oder Zentrifugation, Filtrieren oder Waschen, vor der Verabreichung an ein Individuum zu isolieren oder anzureichern. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden in vitro unter Einsatz geeigneter Vorrichtungen zur Erzeugung von Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen durchgeführt. Solche Vorrichtungen sind im Stand der Technik bekannt.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung zur Erzeugung von Elektronenstrahlen durchgeführt, die kontinuierlich oder schnell gepulst arbeitet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung zur Erzeugung von Elektronenstrahlen durchgeführt, die nach dem Kalt- oder Glühkathodenprinzip Elektronen liefert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung zur Erzeugung von Elektronenstrahlen durchgeführt, die als Axialstrahler (Scanner) oder Linear- Breitbandstrahler ausgeführt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zusammensetzung, statisch in die Vorrichtung aufgenommen, oder kontinuierlich durch den Elektronenstrahl oder Röntgenstrahl transportiert.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung zur Erzeugung von Röntgenstrahlen durchgeführt, die durch eine spezielle Targetanordnung und einen hochfrequent abgelenkten Elektronenstrahl mit hoher Leistungsdichte die erfindungsgemäß hohen Dosisraten zur Verfügung stellt. Solche Vorrichtungen zur Erzeugung und hochfrequenten Ablenkung des Elektronenstrahls sind im Stand der Technik bekannt. - -
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden bei einer Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek durchgeführt. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass bei dieser hohen Dosisrate die Schäden, insbesondere Sekundärschäden, an den Zellen minimiert werden. Somit werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestrahlte Ziel-Säugetierzellen erhalten, die im Vergleich zu konventionell bestrahlten Säugetierzellen längere Zeit vital sind, während gleichzeitig die Fähigkeit zur Proliferation von Ziel-Säugetierzellen vermindert werden kann (siehe Figuren 2 bis 12). Zudem weisen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestrahlten Ziel-Säugetierzellen vorzugsweise eine höhere biologische Aktivität über einen längeren Zeitraum nach der Bestrahlung auf im Vergleich zu konventionell bestrahlten Säugetierzellen. Im Falle von NK- Zellen ist die biologische Aktivität vorzugsweise Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen. NK-Zellen wurden erfolgreich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestrahlt, wie in den Beispielen sowie Figuren 2 bis 12 gezeigt.
Die Dosisrate (Dosis/Zeit) kann vom Fachmann geeignet angepasst werden. Dabei ist generell zu berücksichtigen, dass - in Bezug auf eine bestimmte gewünschte, applizierte Dosis - ein hoher Strahlstrom wenig Bestrahlungszeit erfordert, und wenig Strahlstrom eine lange Bestrahlungszeit erfordert. Die Dosisrate wird vom Fachmann angepasst unter Berücksichtigung z.B. bei einem kontinuierlichen Transport der Zusammensetzung der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums, sowie des vom Strahlertyp abhängigen Strahlstrom-Bereichs. Durch die hohe Dosisrate kann auch bei kurzer Bestrahlungszeit eine hohe applizierte Dosis in der Zusammensetzung erreicht werden.
Gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bestrahlung (i) mit Elektronenstrahlen, (ii) mit Elektronenstrahlen und Röntgenstrahlen, oder (iii) mit Röntgenstrahlen, mit einer erfindungsgemäßen Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek, durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren mit Röntgenstrahlen mit einer erfindungsgemäßen Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek durchgeführt. In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mit Elektronenstrahlen mit erfindungsgemäßer Dosisrate oder mit Elektronenstrahlen und Röntgenstrahlen mit erfindungsgemäßen Dosisraten bestrahlt, insbesondere bevorzugt mit Elektronenstrahlen mit erfindungsgemäßer - -
Dosisrate bestrahlt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass bei einer Bestrahlung mit Elektronenstrahlen am Auftreffort der Strahlen auch Röntgenstrahlung entsteht. Daher wird bei einer Bestrahlung mit Elektronenstrahlen auch mit Röntgenstrahlen bestrahlt. Jedoch wird die Dosisrate der Röntgenstrahlen bei einer erfindungsgemäßen Bestrahlung mit Elektronenstrahlen deutlich niedriger sein; ca. im Promille-Bereich.
Soll mit Elektronenstrahlen und Röntgenstrahlen mit erfindungsgemäßen Dosisraten bestrahlt werden, so ist es möglich den erfindungsgemäßen Verfahrensschritt nacheinander durchzuführen, in beliebiger Reihenfolge mit Elektronenstrahlen und Röntgenstrahlen. In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, eine Vorrichtung zur Erzeugung von Elektronenstrahlen zu nutzen, die neben Elektronenstrahlen auch Röntgenstrahlen mit erfindungsgemäßen Dosisraten emittiert.
Eine Säugetierzelle ist„vital" im Sinne der vorliegenden Zellen, wenn die Zelle in einem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Zellvitalität als vital bestimmt werden kann. Solche Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen diffusionsbasierte Verfahren und Verfahren, die auf der Messung des elektrischen Widerstands beruhen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein diffusionsbasierten Verfahren auf perforierte Zellmembran zur Bestimmung der Vitalität verwendet. Diffusionsbasierte Verfahren auf perforierte Zellmembran sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen Perforationsfarbstoffe wie Trypanblau, Brillantblau FCF, Kristallviolett und die DNA-interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffe 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI), Ethidiumbromid oder Propidiumiodid. Diese Perforationsfarbstoffe können durch perforierte Zellmembranen in vital eingeschränkte Zellen eindringen. Lebende Zellen werden dagegen kaum gefärbt. Eine Auszählung der vitalen Zellen nach Färbung kann beispielsweise mikroskopisch, durch Trypanblau- Färbung und/oder durch Propidiumiodid-Färbung mittels Durchflusszytometrie erfolgen, und kann manuell oder kamera- und/oder computerunterstützt erfolgen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Vitalität von Säugetierzellen unter Verwendung der Trypanblau-Färbung bestimmt, wie in den Beispielen beschrieben.
Vitale Zellen, deren Fähigkeit zur Proliferation vermindert ist, insbesondere um 100% vermindert ist, werden nach einiger Zeit absterben. Daher wird die Anwesenheit einer vitalen Zelle nach Bestrahlung vorzugsweise innerhalb von 1 d - - bis 7 d nach der Bestrahlung bestimmt, insbesondere 2 d oder 3 d bis 7 d nach der Bestrahlung bestimmt. Beispielsweise kann die Vitalität 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach der Bestrahlung bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der bestrahlten Ziel-Säugetierzellen vital, stärker bevorzugt sind 3 d nach Bestrahlung mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der bestrahlten Ziel-Säugetierzellen vital.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Population von Säugetierzellen oder die Ziel-Säugetierzellen nach Bestrahlung zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind, und/oder zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Population von Säugetierzellen oder die Ziel-Säugetierzellen zur therapeutischen, präventiven oder kosmetischen Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind, und/oder zur Herstellung eines zellulären therapeutischen, präventiven oder kosmetischen Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind.
Insbesondere sind die Ziel-Säugetierzellen in ihrer Fähigkeit zur Proliferation vermindert und die Vitalität 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung für mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der Ziel- Säugetierzellen beibehalten.
Je nach Art der Population von Säugetierzellen und der Ziel-Säugetierzellen sind die Zellen zur therapeutischen, präventiven und/oder kosmetischen Verabreichung an ein Individuum geeignet und vorgesehen.
Bei Vakzinen, beispielsweise im Bereich einer hyperproliferativen Erkrankung oder Krebs, sind die Zellen zur therapeutischen und/oder präventiven Verabreichung an ein Individuum geeignet, zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von Krebs oder einer hyperproliferativen Erkrankung. - -
Bei Transplantaten, beispielsweise von hämatopoetischen Stammzellpräparaten, sind die Zellen zur therapeutischen Verabreichung an ein Individuum geeignet, zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung einer Krankheit, die einer Transplantation bedarf, wie Leukämie im Falle von hämatopoetischen Stammzellpräparaten.
Bei Immunzellen, sind die Zellen zur therapeutischen und/oder präventiven Verabreichung an ein Individuum geeignet, zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung von beispielsweise einer hyperproliferativen Erkrankung, Krebs, Immunerkrankung oder chronisch degenerativen Erkrankung, abhängig von den Immunzellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Population von Säugetierzellen oder sind die Ziel-Säugetierzellen zur Verabreichung an ein Individuum zur Therapie und/oder Prävention einer hyperproliferativen Erkrankung, Immunerkrankung oder chronisch degenerativen Erkrankung geeignet, und/oder ist das Mittel umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle ein Transplantat, insbesondere ein hämatopoetisches Stammzelltransplantat, ein Vakzin, ein zytotoxisches Mittel oder ein Aphereseprodukt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Dosis im Bereich von 0,1 Gy bis 1 kGy liegt, bevorzugt im Bereich von 1 Gy bis 100 Gy liegt.
Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Dosis im Bereich von 0,5 Gy bis 800 Gy liegt, bevorzugt im Bereich von 1 Gy bis 5 Gy, 10 Gy, 20 Gy, 30 Gy, 40 Gy, 50 Gy, 60 Gy, 70 Gy, 80 Gy, 90 Gy, 100 Gy, 200 Gy, 300 Gy, 400 Gy, 500 Gy, 600 Gy, 700 Gy, 800 Gy, 900 Gy oder 1 kGy liegt. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform liegt die Dosis im Bereich von 1 Gy bis 5 Gy, 1 Gy bis 10 Gy, 1 Gy bis 20 Gy, 1 Gy bis 30 Gy, 1 Gy bis 40 Gy, 1 Gy bis 50 Gy, 1 Gy bis 60 Gy, 1 Gy bis 70 Gy, 1 Gy bis 80 Gy, 1 Gy bis 90 Gy, 1 Gy bis 100 Gy oder 1 Gy bis 200 Gy. In einer weiteren weiter bevorzugten Ausführungsform liegt die Dosis im Bereich von 5 Gy bis 10 Gy, 5 Gy bis 20 Gy, 5 Gy bis 30 Gy, 5 Gy bis 40 Gy, 5 Gy bis 50 Gy, 5 Gy bis 60 Gy, 5 Gy bis 70 Gy, 5 Gy bis 80 Gy, 5 Gy bis 90 Gy, 5 Gy bis 100 Gy oder 5 Gy bis 200 Gy. In einer weiteren weiter bevorzugten Ausführungsform liegt die Dosis im Bereich von 10 Gy bis 20 Gy, 10 Gy bis 30 Gy, 10 Gy bis 40 Gy, 10 Gy bis 50 Gy, 10 Gy bis 60 - -
Gy, 10 Gy bis 70 Gy, 10 Gy bis 80 Gy, 10 Gy bis 90 Gy, 10 Gy bis 100 Gy oder 10 Gy bis 200 Gy. Beispielsweise kann die Dosis im Bereich von 10 Gy bis 30 Gy sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Dosisrate im Bereich von 10 Gy/sek bis 104 Gy/sek liegt, insbesondere zwischen 50 Gy/sek bis 103 Gy/sek liegt, beispielsweise zwischen 10 Gy/sek bis 103 Gy/sek oder 50 Gy/sek bis 103 Gy/sek liegt.
Wie bereits dargelegt, ist ein kurzer Dosisstoß vorteilhaft.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren daher dadurch gekennzeichnet, dass die Bestrahlungszeit im Bereich von zwischen 0,1 msek und 10 sek liegt, stärker bevorzugt wobei die Bestrahlungszeit im Bereich von zwischen 10 msek und 8 sek liegt. Stärker bevorzugt liegt die Bestrahlungszeit im Bereich von zwischen 0,1 msek und 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 sek, oder zwischen 0,5 msek und 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 sek.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) als dünne Schicht vorliegt.
Eine Zusammensetzung liegt als dünne Schicht vor, wenn die Zusammensetzung im Hinblick auf die Eindringtiefe der Strahlung bei der Bestrahlung dünn ist, insbesondere wobei die Weglänge des Strahlengangs durch die Zusammensetzung bei der Bestrahlung weniger als 5 cm beträgt.
Die Bestrahlung der Zusammensetzung als dünne Schicht ermöglicht eine im Wesentlichen homogene Bestrahlung der Säugetierzellen in der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung als dünne Schicht kann bei der Bestrahlung beispielsweise auf einem festen Träger sein, als dünner Flüssigkeitsstrahl vorliegen, oder als Aerosol, wie als aerosole Partikel, vorliegen. - -
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung bei der Bestrahlung auf einem festen Träger. Der feste Träger umfasst bevorzugt eine planare oder im Wesentlichen planare Fläche auf der die Zusammensetzung aufgebracht ist. Der feste Träger kann beispielsweise eine planare oder im Wesentlichen planare Fläche sein, oder Kavitäten umfassen, die eine planare oder im Wesentlichen planare Fläche enthalten. Der feste Träger kann flexibel sein, beispielsweise eine Folie, oder nicht flexibel sein, beispielsweise eine Platte oder Array. Der feste Träger kann jeglicher Träger sein, der gegenüber der gewünschten Population von Säugetierzellen und Ziel-Säugetierzellen verträglich und im Wesentlichen nicht toxisch ist und vorzugsweise im Wesentlichen strahlenverträglich ist. Ein Träger ist strahlenverträglich wenn bei der Bestrahlung keine Migration von schädlichen Radiolyseprodukten aus dem bestrahlten Träger in die Zusammensetzung erfolgt. Beispielsweise kommen Kunststofffolien, wie Polypropylen-, PE- oder PVC-Folien, Kunststoffplatten und -arrays, wie beispielsweise Kulturplatten mit einer oder mehreren Vertiefungen (wells), oder Kunststoffschalen, wie Petrischalen, in Betracht. In einer bevorzugten Form wird die Zusammensetzung auf einem festen Träger so bestrahlt, dass die Strahlen zunächst auf die Zusammensetzung und anschließend auf den festen Träger treffen.
Die Größe und Form der Fläche der bestrahlten Zusammensetzung ist nicht besonders beschränkt. Vorzugsweise sollte die Fläche der bestrahlten Zusammensetzung so ausgebildet sein, dass eine Bestrahlung der gesamten Zusammensetzung homogen ermöglicht wird. Dies kann durch Bestrahlen der stationär gehaltenen Zusammensetzung erfolgen, oder durch kontinuierliches Durchführen der Zusammensetzung durch den Strahlengang. Beispielsweise kann die Oberfläche der Zusammensetzung in Schritt (i) zwischen 1 mm2 bis 100 cm2 sein.
Die Zusammensetzung kann bei der Bestrahlung eine Abdeckung umfassen oder keine Abdeckung umfassen. Eine Abdeckung kann beispielsweise ein Deckel sein, oder eine Folie. Beispielsweise kann die Zusammensetzung in einem Beutel sein. Wird eine Abdeckung verwendet, so ist die Abdeckung vorzugsweise strahlendurchlässig und strahlenbeständig. - -
Um eine im Wesentlichen gleichmäßige Bestrahlung zu erreichen, ist die dünne Schicht vorzugsweise so ausgebildet, dass die Dicke der Schicht in der Vorzugsrichtung der Ausbreitung des Strahlengangs dem Durchmesser von einer oder wenigen Säugetierzelle(n) entspricht, beispielsweise dem Durchmesser von einer oder 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100 oder 1000 Säugetierzelle(n). Soll eine Zusammensetzung als dünne Schicht auf einem festen Träger bestrahlt werden, wie in den Beispielen, so treffen die Strahlen vorzugsweise senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht auf die Schicht auf. In der Ausführungsform eines dünnen Flüssigkeitsstrahls wird der dünne Flüssigkeitsstrahl vorzugsweise seitlich, im Wesentlichen senkrecht zum Flüssigkeitsstrahl, bestrahlt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die dünne Schicht daher eine Dicke von zwischen 0,5 μιτι und 3 cm auf. Bevorzugt weist die dünne Schicht daher eine Dicke von zwischen 1 μιτι und 1 oder 2 cm, 1 μιτι und 100 μιτι oder 1 μιτι und 50 μιτι auf.
Die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen vor der Bestrahlung kann eine beliebige Zusammensetzung sein, die Säugetierzellen umfassend mindestens eine lebende oder vitale Ziel-Säugetierzelle enthält. Beispielsweise kann die Zusammensetzung gefroren, gefriergetrocknet, ein Gel, ein Sol oder flüssig sein. Bevorzugt ist die Zusammensetzung ein Gel, insbesondere ein Hydrogel, oder flüssig.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) gefroren, ein Gel, ein Sol oder flüssig, bevorzugt ein Gel oder flüssig. Im Falle einer flüssigen Zusammensetzung können die Säugetierzellen als Suspension vorliegen, und/oder adhärent auf einem festen Träger sein. Die Zusammensetzung umfasst bevorzugt Wasser, stärker bevorzugt eine wässrige Lösung, wobei die wässrige Lösung besonders bevorzugt eine oder mehrere Puffersubstanzen und/oder Medium enthält. Die wässrige gepufferte Lösung kann beispielsweise PBS sein. Der pH einer solchen Lösung ist bevorzugt im Bereich von pH 5,5 bis 8,5, stärker bevorzugt im Bereich von pH 6,5 bis 8,0. Die Zusammensetzung kann weiterhin Hydrogel-bildende Substanzen enthalten, oder kann gefroren oder flüssig sein. - -
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren daher dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) (a) als Zellsuspension vorliegt, oder
(b) als adhärente Zellschicht auf einem festen Träger vorliegt.
Die adhärente Zellschicht kann vorzugsweise eine oder mehrere, beispielsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 50 Zellschichten aufweisen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) im Wesentlichen keine Gewebe, stärker bevorzugt kein zusammenhängendes Gewebe, wie beispielsweise Leberstücke. Eine gleichmäßige Verteilung der Zellen ist für eine homogene Bestrahlung hilfreich.
Die Elektronenstrahlen können vorzugsweise mit Energien im Bereich von 80 keV und 10 MeV beschleunigt sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass mit Elektronenstrahlen bestrahlt wird und die Elektronenstrahlen mit einer Beschleunigungsenergie von zwischen 80 keV und 10 MeV beschleunigt werden, insbesondere mit einer Beschleunigungsenergie von zwischen 80 keV und 300 keV beschleunigt werden. Beispielsweise können die Elektronenstrahlen mit einer Beschleunigungsenergie von zwischen 80 keV und 1 MeV, 80 keV und 250 keV, 300 keV, 400 keV, 500 KeV, 600 KeV oder 700 keV beschleunigt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass mit Röntgenstrahlen bestrahlt wird und die Röntgenstrahlung eine Energie von zwischen 5 keV und 600 keV, bevorzugt zwischen 5 keV und 300 keV, 400 keV oder 500 keV, stärker bevorzugt zwischen 10 und 200 keV aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen im Wesentlichen unter Normaldruckatmosphäre appliziert, wobei die Normaldruckatmosphäre bevorzugt als Gasgemisch der Erdatmosphäre vorliegt. - -
Bei der Bestrahlung kann eine Temperaturerhöhung stattfinden. Zur Vermeidung von Denatunerungsprozessen ist es daher von Vorteil, wenn die Temperatur nur gering oder nicht ansteigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Temperatur der Zusammensetzung vor der Bestrahlung zwischen -200°C und 38°C, vorzugsweise zwischen -130°C, -80°C, -10°C oder 0°C und 37,7°C, stärker bevorzugt zwischen 10°C und 37,5°C, noch stärker bevorzugt zwischen 15°C und 37,5°C.
Es ist in einer anderen Ausführungsform möglich, die Bestrahlung bei Temperaturen der Zusammensetzung vor der Bestrahlung von weniger als 1 °C durchzuführen, beispielsweise von gefrorenen Zusammensetzungen. In diesem Fall kann die Zusammensetzung nach Bestrahlung ebenfalls eine Temperatur von weniger als 1 °C aufweisen, oder die Temperatur der Zusammensetzung nach Bestrahlung kann 1 °C oder mehr betragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Temperaturerhöhung der Zusammensetzung nach der Bestrahlung im Vergleich zu vor der Bestrahlung zwischen 0 K und 5 K, vorzugsweise zwischen 0 K und 1 K.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Temperatur der Zusammensetzung nach der Bestrahlung zwischen -200°C und 38°C, vorzugsweise zwischen -130°C, -80°C, -10°C oder 0°C und 37,7°C, stärker bevorzugt zwischen 10°C und 37,5°C, noch stärker bevorzugt zwischen 15°C und 37,5°C. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Dichte der Zusammensetzung zwischen 0,9 und 2 g/cm3, bevorzugt zwischen 1 ,0 und 1 ,8 g/cm3.
Durch die erfindungsgemäße Bestrahlung von Säugetierzellen wird die Vitalität der Zellen 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung für mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der Zellen der Population aufrechterhalten, d.h. weitgehend aufrechterhalten, während die Fähigkeit zur Proliferation vermindert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vitalität - - der Zellen 3 d nach Bestrahlung für mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der Zellen der Population aufrechterhalten. Dem Fachmann ist bekannt, dass unterschiedliche Zellen eine unterschiedliche Strahlensensitivitat aufweisen können und daher die Werte für unterschiedliche Zellen variieren können.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen nach der Bestrahlung mindestens eine vitale Ziel-Säugetierzelle, und die Ziel-Säugetierzelle(n) der Zusammensetzung weisen nach der Bestrahlung eine verminderte Fähigkeit zur Proliferation auf. Bevorzugt kann die Fähigkeit zur Proliferation um mindestens 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90% oder 95% vermindert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Fähigkeit zur Proliferation nach der Bestrahlung um 100 % vermindert. In dieser Ausführungsform können sich diese Zellen nicht mehr vermehren. Eine Verminderung der Fähigkeit zur Proliferation um 100 % kann bei hyperproliferierenden Zellen, beispielsweise bei zu verabreichenden Tumorzellen oder immortalisierten Zelllinien erforderlich sein, da diese Zellen bei einer verbleibenden Fähigkeit zur Proliferation zur Verabreichung an ein Individuum nicht geeignet sind.
Die Fähigkeit zur Proliferation kann durch Bestimmung der Anzahl von Zellen unter Bedingungen, bestimmt werden, die deren Wachstum in vitro erlauben. Solche Bedingungen sind üblicherweise bei zwischen 10°C bis 38°C, in Anwesenheit eines geeigneten Kulturmediums. Dabei wird die Anzahl der Zellen zu mindestens zwei verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl Zellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen beispielsweise Verfahren zur Bestimmung der Proliferation oder Vitalität von Zellen. Die Bestimmung der Vitalität kann wie oben beschrieben durchgeführt werden. Verfahren zur Bestimmung der Proliferation sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt und umfassen beispielsweise die oben genannten Vitalitätstests, sowie den Chromium-Release-Assay oder den Lymphozytentransformationstest (LTT). Die Verminderung der Fähigkeit zur Proliferation nach Bestrahlung versteht sich als Verminderung der Fähigkeit zur Proliferation im Vergleich zu gleichen Säugetierzellen, die keiner Bestrahlung unterworfen wurden, unter ansonsten gleichen Bedingungen. - -
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die bestrahlten, vitalen Ziel- Säugetierzellen eine gewünschte biologische Aktivität auf, insbesondere 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung. Diese gewünschte biologische Aktivität hängt von der Art der Ziel-Säugetierzelle ab. Beispielsweise kann die Zelle eine therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Aktivität aufweisen. Bevorzugt kann die biologische Aktivität Zytotoxizität, Immunogenität, Immunsuppression und Vermittlung von Immuntoleranz sein. Im Falle von NK- Zellen ist die biologische Aktivität vorzugsweise Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen. NK-Zellen wurden erfolgreich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestrahlt, wie in den Beispielen sowie Figuren 2 bis 12 gezeigt. Bevorzugt ist die gewünschte biologische Aktivität 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d oder 7 d nach Bestrahlung mindestens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der biologischen Aktivität von gleichen Säugetierzellen, die keiner Bestrahlung unterworfen wurden, unter ansonsten gleichen Bedingungen. Stärker bevorzugt ist die gewünschte biologische Aktivität 3 d nach Bestrahlung mindestens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der biologischen Aktivität von gleichen Säugetierzellen, die keiner Bestrahlung unterworfen wurden, unter ansonsten gleichen Bedingungen. Verfahren zur Bestimmung der gewünschten biologischen Aktivität sind dem Fachmann gut gekannt. Beispielsweise sind in vitro und/oder in vivo Tests zur Bestimmung der Zytotoxizität, Immunogenität, Immunsuppression oder Vermittlung von Immuntoleranz gut bekannt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass
(a) die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen nach der Bestrahlung mindestens eine vitale Ziel-Säugetierzelle umfasst, und
(b) die Ziel-Säugetierzelle(n) der Zusammensetzung nach der Bestrahlung eine verminderte Fähigkeit zur Proliferation aufweisen,
insbesondere wobei die Ziel-Säugetierzelle(n) eine hyperproliferative oder immortalisierte Zelle ist, und die Fähigkeit zur Proliferation nach der Bestrahlung um 100 % verringert ist,
und, optional,
(c) die Ziel-Säugetierzelle(n) der Zusammensetzung nach der Bestrahlung eine biologische Aktivität, insbesondere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Aktivität aufweisen, bevorzugt wobei die biologische Aktivität - - ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zytotoxizität, Immunogenität, Immunsuppression und Vermittlung von Immuntoleranz.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels, umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel- Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass:
(aO) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel- Säugetierzelle enthält, bereitgestellt wird,
(a1 ) das ein erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt wird,
(a2) der Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen optional ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger- und/oder
Hilfsstoffe zugegeben werden, und/oder
(a3) der Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen optional ein oder mehrere weitere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Mittel zugegeben werden, wobei die Schritte (a1 ) bis (a3) in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
Es ist daher möglich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine ansonsten fertige Zusammensetzung zur Verabreichung, wie beispielsweise ein Vakzin, ein zytotoxisches Produkt oder Aphereseprodukt, zu bestrahlen, die bereits geeignete Hilfsstoffe und/oder Adjuvantien und/oder ein oder mehrere weitere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Mittel enthält.
In einer anderen Ausführungsform kann die Bestrahlung der Population erfindungsgemäß durchgeführt werden und anschließend der Zusammensetzung optional ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger- und/oder Hilfsstoffe zugegeben werden, und/oder der Zusammensetzung optional ein oder mehrere weitere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Mittel zugegeben werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Zusammensetzung in Schritt (i) eine flüssige Suspension, ein Gel, oder adhärente Zellen auf einem festen Träger, oder eine gefrorene Zusammensetzung enthaltend Wasser, beispielsweise eine Suspension der Säugetierzellen in einer wässrigen Lösung, wobei die wässrige Lösung besonders - - bevorzugt eine oder mehrere Puffersubstanzen und/oder Medium enthält. Die wässrige gepufferte Lösung kann beispielsweise PBS sein. Der pH einer solchen Lösung ist bevorzugt im Bereich von pH 5,5 bis 8,5, stärker bevorzugt im Bereich von pH 6,5 bis 8,0. Weiterhin kann die Zusammensetzung in Schritt (i) ein oder mehrere weitere pharmazeutisch annehmbare Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten, oder diese können falls gewünscht nach Schritt (i) und optional Schritt (ii) zugegeben werden. Weiterhin kann die Zusammensetzung in Schritt (i) ein oder mehrere weitere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Mittel zugegeben werden, oder diese können falls gewünscht nach Schritt (i) und optional Schritt (ii) zugegeben werden.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält daher die Zusammensetzung in Schritt (i) pharmazeutisch annehmbare Trägerund/oder Hilfsstoffe.
Im Falle von Vakzinen können Adjuvantien als Hilfsstoffe enthalten sein. Adjuvantien sind dem Fachmann gut bekannt. Geeignete Adjuvantien sind solche, die ausreichend sind um eine Immunantwort auf ein Immunogen zu verstärken. Geeignete Adjuvantien für Antikörper-basierte Vakzine sind beispielsweise Aluminiumsalze wie Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid, Squalenmischungen (SAF-1 ), Muramyl-Peptid, Saponin-Derivate, Mycobacterium Zellwand-Zubereitungen, Monophosphoryl-Lipid A, Mykolsäure Derivate, nichtionische Block-Copolymer grenzflächenaktive Substanzen, Quil A, Cholera- Toxin B Untereinheit, Polyphosphazen und Derivate und immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) wie solche die in Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875 beschrieben sind. Ein geeignetes Adjuvans für Th-1 -basierte, zytotoxische Vakzine ist beispielsweise poly l:C.
Geeignete Träger- und Hilfsstoffe sind beispielsweise Wasser oder eine zur Verabreichung geeignete wässrige Lösung, die besonders bevorzugt eine oder mehrere Puffersubstanzen enthält. Geeignete Träger- und Hilfsstoffe können abhängig von der Art der Verabreichung, der Dosis, der Darreichungsform, Lagerung und der/des aktiven Wirkstoffs(e) ausgewählt werden. Zu den Hilfsstoffen zählen Trägerstoffe, beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol, Lösungsmittel, beispielsweise Polyethylenglykole, Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel, beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat, Bindemittel, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, synthetische und natürliche Polymere, beispielsweise Albumin, Stabilisatoren, beispielsweise - -
Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure, Farbstoffe, beispielsweise anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide, und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien. Die Dosis und der Verabreichungsweg hängen ebenfalls von der Art des zu verabreichenden zellulären Mittels ab. So kommt beispielsweise die systemische, wie intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung, enterale oder parenterale Verabreichung, oder lokale Verabreichung, wie intratumorale oder subkutane Verabreichung in Betracht. Weiterhin können abhängig von der Art des zu verabreichenden zellulären Mittels beispielweise zwischen 104 bis 109 Zellen pro Verabreichung an ein Individuum verabreicht werden.
Es kann gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Verabreichungsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Verabreichung größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Mittel, umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder behandelte vitale Ziel- Säugetierzelle, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, herstellbar nach einem beliebigen oben ausgeführten erfindungsgemäßen Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Mittel und/oder die erfindungsgemäße behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle dadurch gekennzeichnet, dass es/sie ein oder mehrere Merkmale aufweist, das/die für das erfindungsgemäße Verfahren offenbart ist/sind, bevorzugt wobei das Mittel zur Anwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ist. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Vorrichtung zur Erzeugung von Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, - -
(i) zur Herstellung eines Mittels umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel-Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, und/oder
(ii) zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen,
(i) zur Herstellung eines Mittels umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel-Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, und/oder
(ii) zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt.
Für die Verwendungen der vorliegenden Erfindung sind die gleichen Ausführungsformen anwendbar, die auch für die erfindungsgemäßen Verfahren offenbart sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Verwendung daher dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere Merkmale aufweist, das/die für das erfindungsgemäße Verfahren offenbart ist/sind.
Figuren - -
Figur 1 : Verlust an anti-Tumor Zytotoxizität konventionell (Gamma, 10 Gy) bestrahlter NK-Zelllinien nach Tarn et al. (1999) und Suck et al. (2006). „Kont." = Kontrolle. NK-92 und KHYG-1 = NK Zelllinien. K562 = Lymphom-Tumorzelllinie als zytotoxisches Ziel. A): NK-92-NK-Zelllinie; B): KHYG-1 NK-Zelllinie. Jeweils linker Balken: Kontrolle; jeweils rechter Balken: 3 Tage nach Bestrahlung mit 10 kGy.
Figur 2: Bestrahlung von NK-92 Zellen mit unterschiedlichen Dosen durch einen
Elektronenstrahler und Einschränkung der Proliferation und Erhalt der Vitalität bestrahlter Zellen. Die Kontrolle wurde bis auf eine fingierte Bestrahlung gleichartig behandelt. Jeweils Balken von links: 1 . NK-92 Zellen unbehandelt; 2. NK-92 Zellen mit einer Dosis von 20 ± 10 Gy (im Folgenden als„Minimaldosis" bezeichnet) behandelt; 3. NK-92 Zellen mit 5x Minimaldosis behandelt; 4. NK-92 Zellen mit 10x Minimaldosis behandelt; 5. NK-92 Zellen mit 50x Minimaldosis behandelt; 6. NK-92 Zellen mit 100x Minimaldosis behandelt. Die Elektronenbestrahlung eines dünnen Flüssigkeitsfilms einer Zellsuspension führt zu einer Einschränkung der Proliferationsaktivität der zellulären Komponente bei weitestgehend erhaltener Vitalität.
Figur 3: Bestrahlung von KHYG-1 NK-Zellen durch einen Elektronenstrahler und
Einschränkung der Proliferation und Erhalt der Vitalität bestrahlter Zellen. Die Kontrolle wurde bis auf eine fingierte Bestrahlung gleichartig behandelt. Jeweils Balken von links: 1 . KHYG-1 Zellen unbehandelt; 2. KHYG-1 Zellen mit Minimaldosis behandelt; 3. KHYG-1 Zellen mit 5x Minimaldosis behandelt; 4. KHYG-1 Zellen mit 10x Minimaldosis behandelt; 5. KHYG-1 Zellen mit 50x Minimaldosis behandelt; 6. KHYG- 1 Zellen mit 100x Minimaldosis behandelt. Die Elektronenbestrahlung eines dünnen Flüssigkeitsfilms einer Zellsuspension führt zu einer Einschränkung der Proliferationsaktivität der zellulären Komponente bei weitestgehend erhaltener Vitalität.
Figur 4: Vergleich der Vitalitäten publizierter konventionell bestrahlter
(Gammabestrahlung, 10 Gy, modifiziert nach Tarn et al. 1999 für NK-92 und Suck et al. 2006 für KHYG-1 ) und minimal Proliferationshemmend mit Elektronenstrahl bestrahlter NK-92- oder KHYG-1 NK-Zelllinien. A: Jeweils Balken von links: 1 . NK-92 Zellen konventionell behandelt (10 Gy gamma); 2. NK-92 Zellen translL2-1 konventionell behandelt; 3. NK- - -
92 Zellen translL2-1 konventionell behandelt; 4. NK-92 Zellen mit Minimaldosis Elektronenstrahlen behandelt. B: Jeweils Balken von links: 1 . KHYG-1 Zellen konventionell behandelt (10 Gy gamma); 2. KHYG-1 Zellen mit Minimaldosis Elektronenstrahlen behandelt.
Figur 5 Proliferation von NK92 nach konventioneller Bestrahlung oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Die NK Zelllinie NK92 wurde mit konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) („x-ray") oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung („ebeam") bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden direkt nach der Bestrahlung in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellen wurden mittels Trypanblau- Färbung gezählt. Die Proliferation wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Zählung nach 24 Stunden Bestrahlung diente als Referenzwert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n=3.
Figur 6: Vitalität von NK92 nach konventioneller Bestrahlung oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Die NK Zelllinie NK92 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellvitalität wurde mittels BD Accuri™ C6 gemessen. Die Vitalität wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal - - dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt, n=3. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet.
Figur 7: Zytotoxisches Vermögen von NK92 nach konventioneller Bestrahlung und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Effektorzellen zu Zielzellen 5:1 . Die NK Zelllinie NK92 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. (kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy) und die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts- Assay wurde NK92 für zwei Stunden mit der Zielzelllinie K562 in einem E:T Verhältnis von 5:1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p- Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet. Abkürzung: E:T : Effektorzellen zu Zielzellen.
Figur 8: Zytotoxisches Vermögen von NK92 nach konventioneller Bestrahlung und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Effektorzellen zu Zielzellen 1 :1 . Die NK Zelllinie NK92 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts-Assay wurde NK92 für zwei Stunden mit der Zielzelllinie K562 in einem E:T - -
Verhältnis von 1 :1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p- Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet. Abkürzung: E:T : Effektorzellen zu Zielzellen.
Figur 9: Proliferation von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit konventioneller Röntgenbestrahlung (Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) („x-ray") oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung (ebeam) bestrahlt. Die
Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden direkt nach der Bestrahlung in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellen wurden mittels Trypanblau-Färbung gezählt. Die Proliferation wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Zählung nach 24 Stunden Bestrahlung diente als Referenzwert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n=3.
Figur 10: Vitalität von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden in einer Dichte von einer Million Zellen/ml - - in NK Zellmediunn in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellvitalität wurde mittels BD Accuri™ C6 gemessen. Die Vitalität wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt, n=3. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p- Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet.
Figur 1 1 : Zytotoxisches Vermögen von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Effektorzellen zu Zielzellen 5:1 . Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung („ebeam") bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts-Assay wurde KHYG1 mit der Zielzelllinie K562 für zwei Stunden in einem E:T Verhältnis von 5:1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p- Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet. Abkürzung: E:T : Effektorzellen zu Zielzellen.
Figur 12: Zytotoxisches Vermögen von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung. Effektorzellen zu Zielzellen 1 :1 . Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung - - bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts- Assay wurde KHYG1 mit der Zielzelllinie K562 für zwei Stunden in einem E:T Verhältnis von 1 :1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t- Test berechnet. Abkürzung: E:T : Effektorzellen zu Zielzellen.
Beispiele Methoden Die suspensorischen Zelllinien NK-92 (natural killer lymphoma, DSMZ #: ACC 488) und KHYG-1 (natural killer leukemia, DSMZ#: ACC 725; bezogen über die DSMZ, Braunschweig, Deutschland) wurden bei 37°C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchte expandiert in Kulturmedium (RPMI 1640 [Life technologies, Karlsruhe] mit 20% FKS [Fisher Scientific, Schwerte], 2 mM Glutamin [Fisher Scientific, Schwerte], 100mM HEPES [Fisher Scientific, Schwerte], 1 % MEM Aminosäuren [Fisher Scientific, Schwerte], 100 U/ml Penicillin-Streptomycin [Life Technologies, Karlsruhe], 100 U/ml IL-2 [ReproTech, Hamburg, #200-02]). Die Zellzahl wurde zur Kultivierung bzw. Expansion zwischen 0.2-1 x 106 Zellen / ml Medium gehalten. Es wurden je Versuch 70 μΙ einer 1 x 107 Zellen/ml Zellsuspension bestrahlt. Hierfür wurde die Zellzahl und Vitalität mittels Trypanblau-Zählung vor Bestrahlung ermittelt. Im Detail wurden 10 μΙ der Zellsuspension in Medium (siehe oben) mit 10 μΙ einer 0,5 %igen Trypanblau-Lösung (0.5 g Trypanblau [Thomas Geyer, Renningen] in 100 ml DPBS Puffer [Fisher Scientific, Schwerte]) versetzt. Die Mischung wird für ca. 2 Minuten bei 37°C inkubiert und mittels einer Neubauerzählkammer [Dr. Ilona Schubert Laborfachhandel, Leipzig] ausgezählt. - -
Dabei werden 10 μΙ der Mischung unter ein Deckglas auf die Kammer gegeben, so dass diese sich mit der gefärbten Mischung füllt. Unter einem Zellkultur- Durchlichtmikroskop (Axio, Zeiss, Jena) erfolgt mittels 10er Objektiv die Auswertung. Dabei sind vitale Zellen morphologisch rund und farblos, während tote Zellen ebenfalls rund und violett verfärbt sind. Die Zellzahl ergibt sich aus dem Mittelwert der Zellzahl in den vier großen Quadraten multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor (hier: 0,5), mit dem Volumen der ursprünglichen Zellsuspension, sowie dem Zählkammer-spezifischen Faktor 104. Vor Durchführung des Experimentes wurden die Zellen auf die gewünschte Zelldichte eingestellt und durch Zentrifugation bei 300 x g [Fisher Scientific, Schwerte] geerntet bzw. pelletiert und in je 70 μΙ DPBS aufgenommen. Unmittelbar vor Bestrahlung wurden 70 μΙ der Zellsuspension mit 1 x 107 Zellen in die Mitte einer Petrischale [Corning® Primaria™ Easy-Grip dish, Corning B.V. Life Sciences, Amsterdam, The Netherlands] pipettiert und mit einer OPP-Folie (orientierte Polypropylen Folie) mit einem Durchmesser von 3 cm überschichtet, um vor Bestrahlung einen konfluenten Zell-Monolayer (Monoschicht) zu induzieren. Es wurden biologische Duplikate bestrahlt. Die Petrischale wurde ohne Deckel auf einen Probenhalter gelegt und mit einer Folie abgedeckt, um einen gewissen Grad an Sterilität zu gewährleisten. Die Zellen wurden mit einer minimalen Dosis im Bereich von ca. 20 ± 10 Gy (im Folgenden als „Minimaldosis" bezeichnet) und mit dem 5-, 10-, 50- und 100- fachen dieser Minimaldosis bestrahlt. Somit wurden mit Dosen im Bereich von ca. 20 Gy und 2000 Gy (berechnet) bestrahlt.
Die Bestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet).
Bestrahlungszeit: zwischen 0,066 und 6,6 sek.
Unmittelbar nach Bestrahlung wurden die Zellen unter der OPP-Folie mit ca. 100 μΙ einer Trypsin / 0,5%igen EDTA Lösung [Fisher Scientific, Schwerte] gelöst, mit DPBS gewaschen und die Vitalität via Trypanblau Zellzählung bestimmt. Danach wurden die Zellen mit Medium versetzt und zur Weiterkultivierung in ein neues Well (Vertiefung) überführt und entsprechend den Kultivierungsbedingungen - -
(siehe oben) behandelt. In Zeitabständen von 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 144 h wurden Vitalität und Zellzahl bestimmt.
Für den Versuch der Figur 5 wurde die Proliferation von NK92 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt. Die NK Zelllinie NK92 wurde mit konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) („x-ray") oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung („ebeam") bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden direkt nach der Bestrahlung in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellen wurden mittels Trypanblau-Färbung gezählt. Die Proliferation wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Zählung nach 24 Stunden Bestrahlung diente als Referenzwert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n=3.
Für den Versuch der Figur 6 wurde die Vitalität von NK92 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt. Die NK Zelllinie NK92 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellvitalität wurde mittels BD Accuri™ C6 gemessen. Die Vitalität wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt, n=3. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung - - wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet.
Für den Versuch der Figur 7 wurde das zytotoxische Vermögen von NK92 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt, bei einem Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen von 5:1 . Die NK Zelllinie NK92 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts-Assay wurde NK92 für zwei Stunden mit der Zielzelllinie K562 in einem E:T Verhältnis von 5:1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet. Abkürzung: E:T : Effektorzellen zu Zielzellen.
Für den Versuch der Figur 8 wurde das zytotoxische Vermögen von NK92 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt, bei einem Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen von 1 :1 . Die NK Zelllinie NK92 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek (berechnet). Bestrahlungszeit: zwischen 0,033 und 6,6 sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts-Assay wurde NK92 für zwei Stunden mit der Zielzelllinie K562 in einem E:T Verhältnis von 1 :1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen - -
Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet.
Für den Versuch der Figur 9 wurde die Proliferation von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt. Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) („x-ray") oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung („ebeam") bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden direkt nach der Bestrahlung in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellen wurden mittels Trypanblau-Färbung gezählt. Die Proliferation wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Zählung nach 24 Stunden Bestrahlung diente als Referenzwert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n=3.
Für den Versuch der Figur 10 wurde die Vitalität von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate oder minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt. Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die Zellen wurden in einer Dichte von einer Million Zellen/ml in NK Zellmedium in einer 6-Well (Vertiefungen)-Platte mit Flachboden ausgesät. Die Zellvitalität wurde mittels BD Accuri™ C6 gemessen. Die Vitalität wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) beobachtet. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt, n=3. Verglichen mit den - -
Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p- Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet. Für den Versuch der Figur 1 1 wurde das zytotoxische Vermögen von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt, bei einem Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen von 5:1 . Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lysis wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts-Assay wurde KHYG1 mit der Zielzelllinie K562 für zwei Stunden in einem E:T Verhältnis von 5:1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet.
Für den Versuch der Figur 12 wurde das zytotoxische Vermögen von KHYG1 nach konventioneller Bestrahlung mit niedriger Dosisrate und minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung mit hoher Dosisrate bestimmt, bei einem Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen von 1 :1 . Die NK Zelllinie KHYG1 wurde mit (a) konventioneller Röntgenbestrahlung (Dosen: 10, 20 und 40 Gy; Gerät: SARRP, Xstrahl Limited, UK) oder (b) minimal dosierter Elektronenstrahlbestrahlung bestrahlt. Die Elektronenbestrahlung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Dosisrate: ca. 300 Gy/sek. Kalkulierte Dosen: 0, 10, 20 und 40 Gy. Die spezifische Lyse wurde über vier Tage (24, 48, 72 und 96 Stunden) detektiert. Für den Europium Zytotoxizitäts-Assay wurde KHYG1 mit der Zielzelllinie K562 für zwei Stunden in einem E:T Verhältnis von 1 :1 in NK Zellmedium kokultiviert. Die Daten der konventionellen Bestrahlung berechneten sich aus einem Experiment mit Duplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Daten der minimal dosierten Elektronenstrahlbestrahlung berechneten sich aus drei unabhängigen Experimenten mit Triplikaten und wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. - -
Verglichen mit den Daten der konventionellen Bestrahlung wurde eine statistische Signifikanz bei p-Werten < 0.05 (*) erreicht und mit dem ungepaarten zweiseitigem t-Test berechnet. Bei konventionellen, im Stand der Technik bekannten Bestrahlungsverfahren mit gamma-Strahlen bzw. Röntgenstrahlen wird eine niedrige Dosisrate eingesetzt; d.h. eine bestimmte Dosis wird über einen längeren Zeitraum hinweg appliziert.
Ergebnis
In den Versuchen konnte ein dünner Flüssigkeitsfilm einer Zellsuspension erzeugt werden, der einer Bestrahlung mit Elektronenstrahlen mit hoher Dosisrate unterworfen wurde. Überraschenderweise konnte eine Einschränkung der Proliferationsaktivität der jeweiligen zellulären Komponente bei weitestgehend erhaltener Vitalität nachgewiesen werden (Figuren 2 und 3).
Auch aus Figur 4 zeigt sich, dass die Bestrahlung mit Elektronenstrahlen bei hoher Dosisrate hinsichtlich der Vitalität der Zellen nach Bestrahlung gegenüber publizierten Vitalitäten konventionell bestrahlter Zellen (Gammabestrahlung, 10 Gy, modifiziert nach Tarn et al. 1999 für NK-92 und Suck et al. 2006 für KHYG-1 ), die mit einer niedrigen Dosisrate bestrahlt wurden, bei jeweils gleicher Dosis überlegen ist.
Zudem wird durch die Figuren 5 bis 12 belegt, dass die erfindungsgemäße Bestrahlung mit Elektronenstrahlen mit hoher Dosisrate hinsichtlich der Vitalität der Zellen als auch der gewünschten biologische Aktivität der Zytotoxizität einer konventionellen Bestrahlung mit Röntgenbestrahlung mit 10 Gy, 20 Gy oder 40 Gy und einer niedrigen Dosisrate, bei jeweils gleicher Dosis überlegen ist.
Referenzen
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Claims

Ansprüche
Verfahren zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, dadurch gekennzeichnet, dass:
(i) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt, und
(ii) optional vitale Ziel-Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert werden.
Verfahren zur Herstellung eines Mittels umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel-Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind,
dadurch gekennzeichnet, dass:
(i) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt, und
(ii) optional vitale Ziel-Säugetierzellen aus der Population von Säugetierzellen isoliert oder angereichert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei
(i) die Population von Säugetierzellen aus Ziel-Säugetierzellen besteht oder im Wesentlichen aus Ziel-Säugetierzellen besteht, oder
(ii) die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle und eine oder mehrere andere Säugetierzellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei
(a) die Population von Säugetierzellen eine Mischung von mindestens 2 unterschiedlichen primären Säugetierzellen umfasst, insbesondere wobei die Population von Säugetierzellen ein zelluläres Transplantat oder eine Mischung von Immunzellen oder eine Körperflüssigkeit ist, und/oder
(c) die Population von Säugetierzellen eine oder mehrere Zelllinien umfasst oder aus einer oder mehreren Zelllinien besteht, und/oder
(b) die Ziel-Säugetierzelle eine proliferierende, hyperproliferative oder immortalisierte Ziel-Säugetierzelle ist, insbesondere wobei die Ziel- Säugetierzelle eine Krebszelle, Krebszelllinie und/oder Immunzelle ist, insbesondere wobei die Zelllinie eine natürliche Killerzell- (NK-Zell-) linie, T- Zelllinie, oder gentechnisch veränderte Zelllinie ist, und/oder die Immunzellen natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), T-Zellen oder gentechnisch veränderte Immunzellen sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Population von Säugetierzellen oder die Ziel-Säugetierzellen nach Bestrahlung zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind, und/oder zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Population von Säugetierzellen oder die Ziel-Säugetierzellen zur therapeutischen, präventiven oder kosmetischen Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind, und/oder zur Herstellung eines zellulären therapeutischen, präventiven oder kosmetischen Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist/sind, insbesondere wobei die Population von Säugetierzellen oder die Ziel-Säugetierzellen zur Verabreichung an ein Individuum zur Therapie und/oder Prävention einer hyperproliferativen Erkrankung, Immunerkrankung oder chronische degenerative Erkrankung geeignet ist/sind, und/oder das Mittel umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle ein Transplantat, insbesondere ein hämatopoetisches Stammzelltransplantat, eine Vakzine, ein zytotoxisches Mittel oder ein Aphereseprodukt ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei
(a) die Dosis im Bereich von 0,1 Gy bis 1 kGy liegt, bevorzugt im Bereich von 1 Gy bis 100 Gy liegt, und/oder
(b) die Dosisrate im Bereich von 10 Gy/sek bis 103 Gy/sek liegt, und/oder (c) die Bestrahlungszeit im Bereich von zwischen 0,1 msek und 10 sek liegt, bevorzugt wobei die Bestrahlungszeit im Bereich von zwischen 10 msek und 8 sek liegt. 8. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) als dünne Schicht vorliegt. 9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die dünne Schicht eine Dicke von zwischen 0,5 μιτι und 3 cm aufweist.
10. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) gefroren, ein Gel, ein
Sol oder flüssig ist, bevorzugt ein Gel oder flüssig ist.
1 1 . Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i)
(a) als Zellsuspension vorliegt, oder
(b) als adhärente Zellschicht auf einem festen Träger vorliegt,
(c) auf einem festen Träger ist, als dünner Flüssigkeitsstrahl vorliegt oder als Aerosol vorliegt,
insbesondere wobei die Population von Säugetierzellen bei der Bestrahlung in Schritt (i) im Wesentlichen keine Gewebe enthält.
12. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 1 1 , wobei mit Elektronenstrahlen bestrahlt wird und die Elektronenstrahlen mit einer Beschleunigungsenergie von zwischen 80 keV und 10 MeV beschleunigt werden, insbesondere mit einer Beschleunigungsenergie von zwischen 80 keV und 300 keV beschleunigt werden.
13. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, wobei
(a) die Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen nach der Bestrahlung mindestens eine vitale Ziel-Säugetierzelle umfasst, und (b) die Ziel-Säugetierzelle(n) der Zusammensetzung nach der Bestrahlung eine verminderte Fähigkeit zur Proliferation aufweisen,
insbesondere wobei die Ziel-Säugetierzelle(n) eine hyperproliferative oder immortalisierte Zelle ist, und die Fähigkeit zur Proliferation nach der Bestrahlung um 100 % verringert ist,
und, optional,
(c) die Ziel-Säugetierzelle(n) der Zusammensetzung nach der Bestrahlung eine biologische Aktivität, insbesondere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Aktivität aufweisen, bevorzugt wobei die biologische Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zytotoxizität, Immunogenität, Immunsuppression und Vermittlung von Immuntoleranz.
14. Verfahren zur Herstellung eines Mittels, umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass:
(aO) eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, bereitgestellt wird,
(a1 ) das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 durchgeführt wird,
(a2) der Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen optional ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Trägerund/oder Hilfsstoffe zugegeben werden, und/oder
(a3) der Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen optional ein oder mehrere weitere therapeutisch, präventiv oder kosmetisch wirksame Mittel zugegeben werden, wobei die Schritte (a1 ) bis (a3) in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
15. Mittel, umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, herstellbar nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14.
16. Mittel und/oder behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle nach Anspruch 15, mit den Merkmalen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14, bevorzugt wobei das Mittel zur Anwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ist.
17. Verwendung einer Vorrichtung zur Erzeugung von Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen,
(i) zur Herstellung eines Mittels unnfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel- Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, und/oder
(ii) zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt.
18. Verwendung von Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen,
(i) zur Herstellung eines Mittels umfassend mindestens eine behandelte vitale Ziel-Säugetierzelle, das zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist, und/oder zur Herstellung von behandelten vitalen Ziel- Säugetierzellen, die zur Herstellung eines zellulären Mittels zur Verabreichung an ein Individuum geeignet sind, und/oder
(ii) zur Bestrahlung einer Population von Säugetierzellen umfassend mindestens eine Ziel-Säugetierzelle mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung umfassend eine Population von Säugetierzellen in vitro mit Elektronenstrahlen und/oder Röntgenstrahlen, bestrahlt wird, wobei die Population von Säugetierzellen mindestens eine Ziel-Säugetierzelle enthält, und wobei die Dosisrate im Bereich von 5 Gy/sek bis 107 Gy/sek liegt.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, mit den Merkmalen des Verfahrens nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14.
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