EP3559015A1 - Peptides therapeutiques - Google Patents

Peptides therapeutiques

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Publication number
EP3559015A1
EP3559015A1 EP17837968.1A EP17837968A EP3559015A1 EP 3559015 A1 EP3559015 A1 EP 3559015A1 EP 17837968 A EP17837968 A EP 17837968A EP 3559015 A1 EP3559015 A1 EP 3559015A1
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EP
European Patent Office
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mipep
mir
fragment
seq
peptide
Prior art date
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Pending
Application number
EP17837968.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Philippe COMBIER
Anne PREL
Frédéric DESCHASEAUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Etablissement Francais du Sang
Universite de Toulouse
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Etablissement Francais du Sang
Universite Toulouse III Paul Sabatier
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Filing date
Publication date
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • MicroRNAs are small non-coding RNAs, about 21 nucleotides after processing, which control the expression of target genes at the post-transcriptional level, by degrading the target mRNA or by inhibiting its translation, in organisms eukaryotes.
  • the miRs can in particular regulate the expression of specific genes involved in certain pathologies in humans and animals. It is now recognized that miRs play an important role in many pathologies, and these are therefore attractive targets for the development of new drugs.
  • the regulation of the expression of miRs is very little known, but it is known in particular that it involves, like most coding genes, an RNA polymerase II: this enzyme produces a primary transcript, called “pri "miR”, which is then matured with a protein complex containing especially Dicer type enzymes.
  • This maturation leads firstly to the formation of a miR precursor called “pre-miR", having a secondary stem-loop structure containing the miR and its complementary miR * sequence.
  • the precursor is then matured resulting in the formation of a shorter double-stranded RNA containing miR and miR *.
  • the miR is then supported by the RISC complex which cleaves the mRNA of the target gene or inhibits its translation.
  • the first approach is to mimic the effect of miR using synthetic RN duplexes designed to mimic the miR of interest.
  • One strand is identical to the miR of interest, while the other strand can be modified to facilitate cellular uptake of the molecule.
  • the allowed modifications are chemically limited.
  • this approach allows for the replacement of the amounts of miRs lost during a pathology, it is difficult to target the RNA molecules to specific tissues, and the tissues that do not normally express the miR of interest. can also capture the synthetic RNA duplex and lead to undesirable side effects.
  • the second approach is to use antisense oligonucleotides.
  • antisense oligonucleotides have a sequence complementary to all or part of that target miR and will reduce the endogenous amount of miRs.
  • their manipulation is made difficult and expensive.
  • ORFs small open reading frames
  • micropeptides or "miPEPs", microKNA encoded PEPtides
  • miPEPs micropeptides
  • microKNA encoded PEPtides capable of modulating the accumulation of miRs in cells
  • Another aspect of the invention relates to these micropeptides for their use as medicaments, and for the treatment of specific pathologies.
  • Another aspect of the invention relates to a method of identifying micropeptides for modulating the accumulation of miRs involved in pathologies.
  • a subject of the invention is a pharmaceutical composition comprising:
  • miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, and
  • microRNA non-coding microRNA
  • miR miRNA receptor
  • microRNAs function to regulate certain genes via post-transcriptional mechanisms, for example via the RISC complex.
  • the primary transcript of the microRNA or "pri-miR” corresponds to the RNA molecule directly obtained from the transcription of the DNA molecule. Generally, this primary transcript undergoes one or more post-transcriptional modifications, which result, for example, in a particular structure of the RNA or a cleavage of certain parts of RNA, and which lead to the precursor form of the microRNA or "pre-miR", then to the mature form of the microRNA or "miR".
  • micropeptides and “miPEPs” (microRNA encoded PEPtides) are equivalent and may be used interchangeably. They define a peptide which is encoded by an open reading frame present on the primary transcript of a microRNA, and which is capable of modulating the accumulation of said microRNA. Micropeptides within the meaning of the present invention should not be understood as necessarily being small peptides, since "micro” does not correspond to the size of the peptide.
  • a miPEP can also be assimilated to a transcription modulator, and in particular a transcriptional activator.
  • a transcription modulator may act at the transcriptional level to modulate the accumulation of pri-miR, pre-miR and miR.
  • the same micropeptide can be encoded by several nucleotide sequences. Such nucleotide sequences, different from one another at least one nucleotide but coding the same peptide, are called "degenerate sequences".
  • open reading frame or "ORF” are equivalent and can be used interchangeably. They correspond to a nucleotide sequence in a DNA or RNA molecule that can potentially encode a peptide or a protein: said open reading frame starts with a start codon (the start codon generally coding for a methionine), followed by a codon series (each codon encoding an amino acid), and ends with a stop codon (the stop codon is not translated).
  • the ORFs may be specifically called "miORFs" when these are present on the primary microRNA transcripts.
  • the miORFs may be contained in the 5 'or 3' portion of said primary microAR transcript, preferably in the 5 'portion.
  • the 5 'or 3' portions of the primary microRNA transcript correspond to the terminal portions of the RNA molecule that are cleaved during microRNA processing.
  • the miORFs as defined in the invention in particular can range in size from 12 to 1503 nucleotides and encode peptides of 3 to 500 amino acids.
  • miORFs encode miPEPs with a size of:
  • the miPEPs may especially have a size of 100 to 500 amino acids, 101 to 500 amino acids, 200 to 500 amino acids, 300 to 500 amino acids, or 400 to 500 amino acids.
  • a "miPEP fragment” corresponds to an N-terminal part, a C-terminal part or an internal part of the sequence of a miPEP.
  • a "miPEP fragment” corresponds to a part of a miPEP containing the first N-terminal amino acid, to a part of the miPEP containing the last C-terminal amino acid or to a part containing neither the first N-terminal amino acid or the last C-terminal amino acid.
  • a miPEP fragment has a size of 2 to 20 amino acids, preferably 5 to 10 amino acids.
  • a miPEP fragment has a size of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids .
  • a miPEP fragment has a size of 10 amino acids and corresponds to the N-terminal portion of a miPEP.
  • miPEP // a fragment of miPEP may be referred to as "miPEP //".
  • accumulation is meant the production of a molecule, such as a microRNA or a micropeptide, in the cell.
  • microRNA or a micropeptide can be determined using assay methods known to those skilled in the art, such as for example by RT-qPCR or by the quantification of the fluorescence due to the fusion of a peptide or protein to a fluorescent marker.
  • the "modulation" of the accumulation of a molecule in a cell corresponds to a modification of the quantity of this molecule present in the cell.
  • the effect of a miPEP can be observed via the modulation of the accumulation of miR, but also through the modulation of the accumulation of pri-miR or the corresponding pre-miR.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein the modulation of the accumulation of said microRNA is a decrease or increase in the accumulation of said microRNA, in particular an increase.
  • a “decrease in accumulation” corresponds to a decrease in the amount of said molecule in the cell relative to a control cell. Conversely, an “increase in accumulation” corresponds to an increase in the amount of said molecule in the cell relative to a control cell.
  • a miPEP is capable of modulating the accumulation of pri-miR, pre-miR and miR. Therefore, if a primary transcript contains more than one miRs, a same miPEP encoded by said primary transcript is capable of modulating the accumulation of at least one of the miRs present on the primary transcript.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising:
  • miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, which miR regulates expression of at least one gene involved in a pathology,
  • said pharmaceutical composition comprises at least one miPEP but may also comprise a mixture of several miPEPs.
  • said pharmaceutical composition may for example comprise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 miPEPs.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of:
  • miPEP 145-2 (MVGLNPPLWQETGEYT, SEQ ID NO: 11,745)
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 751 (MVGLNPPLWQ). In a particular embodiment, the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751 (MVGLNPPLWQ).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11,752 (MSLCLSPSLT).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11,752 (MSLCLSPSLT).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of miPEP 15a- 16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753 (MFKHRFF YMH).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 15a-16-1 consisting of SEQ ID NO: 11 753 (MFKHRFF YMH).
  • the pharmaceutical compositions comprising miPEPs are in the form of a unit dose comprising from 10 " M to 10 " 10 M of miPEP.
  • compositions according to the invention can be administered in one or more times.
  • the pharmaceutical compositions are suitable for oral, ocular, nasal, parenteral (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular), rectal, vaginal, topical or auricular administration.
  • the miPEP can be vectorized or encapsulated.
  • the miPEP, or the fragment of said miPEP may be fused or linked to one or more molecules facilitating the entry of the miPEP, or miPEP fragment, into the cell.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, in which the miPEP, or the fragment of said miPEP, is fused to a peptide facilitating the entry into the cell of the miPEP, or fragment of miPEP.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein the miPEP, or the fragment of said miPEP, is fused with the TAT peptide (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11,754).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, in which the miPEP, or the fragment of said miPEP, is fused to N-ter or C-ter with the TAT peptide (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11,754).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, wherein said miPEP fragment is chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 755 (MVGLNPPLWQ-YGRKKRRQRRR), miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRKKRRQRRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11757 (MFKHRFFYMH-YGRKXRRQRRR).
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, in which the miPEP, or the fragment of said miPEP, is fused with penetratin to a polyhistidine peptide (in particular a peptide of at least 6 residues). histidine) or to a polyarginine peptide (in particular a 9-residue arginine peptide).
  • a polyhistidine peptide in particular a peptide of at least 6 residues). histidine
  • a polyarginine peptide in particular a 9-residue arginine peptide
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above, in which the miPEP, or the fragment of said miPEP, is linked to one or more palmitic acid molecules.
  • the amount of miPEP present in the composition or used for the treatment of a pathology may vary depending on whether or not the miPEP is modified with a molecule facilitating cell penetration.
  • the subject of the invention is a miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, for use as a medicine.
  • the invention relates to a miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, which miR regulates the expression of at least one gene involved in a pathology, for its use as a drug.
  • a gene is involved in a pathology if the expression of said gene varies significantly between a patient suffering from said pathology and a healthy individual.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being identified, or as identified, by the implementation of a method identification of a miPEP modulating the accumulation of a miR involved in a pathology, comprising:
  • a modulation of the accumulation of said miR in the presence of said peptide with respect to the accumulation of said miR in the absence of said peptide indicates the existence of a miPEP, the latter being coded by said open frame reading and being able to modulate the accumulation of said miR involved in a pathology.
  • a miR is involved in a pathology if said miR is capable of regulating the expression of a gene involved in said pathology and / or of reducing the symptoms of said pathology.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR chosen from those presented in Tables 2, 3, 4, 5 and 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR chosen from group consisting of:
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR chosen from group consisting of: hsa-mir-125a, hsa-mir-15a-16-l and hsa-mirl45.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q ranging from 1 to 5,875.
  • the invention relates to a miPEP for its use as defined above, said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11 745), the miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-1 (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a miPEP fragment for its use as defined above, said miPEP fragment being miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being a fragment of the 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being miPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being a fragment of miPEP 15a- 16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being miPEP // 15a-16-l consisting of SEQ ID NO: 11 753 .
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, the miPEP, or the fragment of said miPEP, being fused to the TAT peptide.
  • the invention relates to a miPEP fragment for its use as defined above, said miPEP fragment being chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 755 (MVGLNPPLWQ-YGRKKRRQRRR),
  • miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRKKR QR R), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,757 (MFKHRFFYMH-YGRKKRRQRRR).
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, the miPEP, or the fragment of said miPEP, being fused to penetratin, to a polyhistidine peptide (in particular a peptide of at least 6 histidine residues) or a polyarginine peptide (in particular a 9-residue arginine peptide).
  • a polyhistidine peptide in particular a peptide of at least 6 histidine residues
  • a polyarginine peptide in particular a 9-residue arginine peptide
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, the miPEP, or the fragment of said miPEP, being linked to one or more palmitic acid molecules.
  • Another aspect of the invention relates to a miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a cell eukaryote, for its use in the treatment of a pathology chosen from: cancer, bacterial infections, mycoses, cardiovascular diseases, hereditary congenital diseases, skin diseases, eye diseases, diseases of the digestive system , diseases of the endocrine system, diseases of the nervous system, diseases related to viruses, diseases related to nutrition and metabolism, lymphatic diseases and hemopathies, neonatal and hereditary diseases, respiratory diseases, urogenital diseases in human, urogenital diseases in women, disorders of the immune system, musculoskeletal disorders, diseases or trauma of bone tissue or cartilaginous tissue.
  • a pathology chosen from: cancer, bacterial infections, mycoses, cardiovascular diseases, hereditary congenital diseases, skin diseases, eye diseases, diseases of
  • the subject of the invention is a miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, for use in the treatment of disease or trauma to bone tissue or cartilage tissue.
  • bone tissue disease refers to any disease reducing bone capital, such as osteoporosis.
  • bone tissue trauma refers to a break in continuity or fracture of a bone.
  • the invention relates to a miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, for its use as defined above, which miR regulates the expression of at least one gene involved in said pathology.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being identified, or as identified, by the implementation of a method identification of a miPEP modulating the accumulation of a miR involved in a pathology, comprising:
  • modulating the accumulation of said miR in the presence of said peptide with respect to the accumulation of said miR in the absence of said peptide indicates the existence of a miPEP, which is encoded by said open reading frame and being able to modulate the accumulation of said miR involved in a pathology.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q ranging from 1 to 5,875.
  • the invention relates to a miPEP for its use as defined above, said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11 745), miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-1 (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 751 .
  • the invention relates to a miPEP fragment for its use as defined above, said miPEP fragment being miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being a fragment of 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being the miPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11,752.
  • the invention relates to a miPEP fragment for its use as defined above, said miPEP fragment being a fragment of miPEP 15a- 16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to a miPEP fragment, for its use as defined above, said miPEP fragment being miPEP // 15a-16-1 consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, the miPEP, or the fragment of said miPEP, being fused to the TAT peptide.
  • the invention relates to a miPEP fragment for its use as defined above, said miPEP fragment being chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 755 (MVGLNPPLWQ-YGRKKPvRQRRR),
  • miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRKKRRQRRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,757 (MFKHRFFYMH-YGRKK RQRRR).
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, the miPEP, or the fragment of said miPEP, being fused to penetratin, to a polyhistidine peptide (in particular a peptide of at least 6 histidine residues) or a polyarginine peptide (in particular a 9-residue arginine peptide).
  • a polyhistidine peptide in particular a peptide of at least 6 histidine residues
  • a polyarginine peptide in particular a 9-residue arginine peptide
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, the miPEP, or the fragment of said miPEP, being linked to one or more palmitic acid molecules.
  • Tables 2 to 6 present the different miRs and the pathologies in which they are involved.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a cancer, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of the invention. a miR selected from the cancer-related miRs in Table 2, particularly among the cancer-related miRs in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a bacterial infection or mycosis, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from the miRs related to bacterial infections and mycoses in Table 2, in particular among miRs related to bacterial infections and mycoses in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a cardiovascular disease, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from the miRs related to cardiovascular diseases in Table 2, particularly among miRs related to cardiovascular diseases in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a hereditary congenital disease, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the transcript. of a miR selected from miRs related to hereditary congenital diseases in Table 2, in particular among miRs related to hereditary congenital diseases in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP for its use as defined above, said pathology being a disease of the skin, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from miRs related to skin diseases in Table 2, particularly among miRs related to skin diseases in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being an eye disease, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the transcript of a miR selected from the miRs related to eye diseases in Table 2, particularly among miRs related to eye diseases in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disease of the digestive system, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the invention.
  • primary transcript of a miR selected from the miRs related to diseases of the digestive system in Table 3, in particular among miRs related to diseases of the digestive system in Table 5.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disease of the endocrine system, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the invention.
  • primary transcript of a miR selected from miRs related to endocrine diseases in Table 3, in particular among miRs related to endocrine diseases in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disease of the nervous system, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the invention.
  • Primary transcript of a miR selected from miRs related to nervous system diseases in Table 3, particularly among miRs related to nervous system diseases in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disease linked to a virus, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from miRs related to virus-related diseases in Table 3, particularly among the miRs related to virus-related diseases in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disease related to nutrition and metabolism, said miPEP being encoded by a sequence nucleotide contained in the primary transcript of a miR selected from miRs related to nutrition and metabolism disorders in Table 3, in particular among miRs related to disorders of nutrtion and metabolism in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a lymphatic disease or a hematopathy, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from MIRS related 'to lymphatic diseases or malignancies in table 3, especially among MIRS related to lymphatic diseases or malignancies in table 6.
  • the The invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a neonatal and hereditary disease, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from miRs related to neonatal and hereditary diseases in Table 4, especially among miRs related to neonatal and hereditary diseases Hereditary in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a respiratory disease, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from the miRs related to respiratory diseases in Table 4, particularly among miRs related to respiratory diseases in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a urogenital disease in humans, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from the miRs related to urogenital diseases in humans in Table 4, in particular among the miRs related to urogenital diseases in humans in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a urogenital disease in women, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from the miRs related to urogenital diseases in women in Table 4, in particular among miRs related to urogenital diseases in women in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disorder of the immune system, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the invention.
  • primary transcript of a miR selected from miRs related to disorders of the immune system in Table 4, in particular among the miRs related to disorders of the immune system in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP , or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a musculoskeletal disorder, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR selected from the miRs linked to disorders musculoskeletal in Table 4, particularly among miRs related to musculoskeletal disorders in Table 6.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disorder of metabolism, said miR being chosen from hsa-miR-103- 1, hsa-miR-103-2 and hsa-mir-107, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NO: 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 2547, 2549, 2551, 2553, 3921, 3923, 3925 and 3927.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being an infection with the hepatitis C virus, said miR being the hsa- miR-122, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NO: 97, 99, 101, 103, 2561, 2563, 2565 and 2567.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a disease inflammatory, said miR being hsa-miR-155, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOS: 4433, 4435, 4437, 4439, 4441, 4443, 4445, 4447, 8377, 8379, 8381 and 8383.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a fibrosis, said miR being hsa-miR-21, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOs: 497, 499, 501, 503, 2793, 2795, 2797, 2799, 3425, 3427, 3429, 3431, 4937, 4939, 4941, 4943, 8545, 8547, 8549, 8551, 10801 , 10803, 10805 and 10807.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being atherosclerosis said miR being hsa-miR-33, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOS: 5609, 5611, 5613, 5615, 8673, 8675, 8677 and 8679.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a cardiovascular disease, said miR being selected from hsa-miR-15a and the has-miR-15b, said miPEP being preferably chosen from SEQ ID NO: 4449, 4451, 4453, 4455, 4457, 4459, 4461, 4463, 4465, 4467, 4469 and 4471.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a myeloproliferative disease, said miR being hsa-miR-451, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOS: 1017, 1019, 1021, 1023, 3609, 3611, 3613, 3615, 6113, 6115, 6117 and 6119.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being linked to neoangiogenesis, said miR being chosen from hsa-mir-92a.
  • miPEP being preferably selected from SEQ ID NOS: 1777, 1779, 1781, 1783, 1785, 1787, 1789, 1791, 8033, 8035, 8037, 8039, 8041, 8043, 8045, 8047, 8049, 8051, 8053, 8055, 9225, 9227, 9229, 9231, 9233, 9235, 9237, 9239, 9241, 9243, 9245, 9247, 10345, 10347, 10349, 10351, 10353, 10355, 10357, 10359, 10361, 10363, 10365, 10367, 11489, 11491, 11493, 11495, 11497, 11499, 11501, 11503, 11505, 11507, 11509 and 11511.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a cardiac disorder, said miR being chosen from among the hsa-mir-208 and the hsa-mir-208b, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOs: 4889, 4891, 4893, 4895, 4897, 4899, 4901, 4903, 4905, 4907, 4909, 4911, 4913, 4915, 4917 and 4919 .
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a pulmonary fibrosis, said miR being hsa-mir-208, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOS: 4889, 4891, 4893, 4895, 4897, 4899, 4901, 4903, 4905, 4905, 4907, 4909, 4911, 4913, 4915, 4917 and 4919.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a cancer, said miR being hsa-let-7, said miPEP being preferably chosen from SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 28, from 1225 to 1260, from 1561 to 1576, from 1865 to 1916, from 4065 to 4100, from 4645 to 4668, from 5197 to 5228.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a cardiovascular disease, in particular the ischemia-reperfusion syndrome, said miR being hsa- miR-7, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOs: 3089, 3091, 3093, 3095, 3689, 3691, 3693, 3695, 7881, 7883, 7885, 7887, 7889, 7891, 7893, 7895, 7897, 7899, 7901, 7903, 9209, 9211, 9213, 9215, 11473, 11475, 11477 and 11479.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being an infection with the hepatitis C virus, said miR being the hsa- mir-181c, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NOs: 321, 323, 325, 327, 2657, 2659, 2661, 2663, 4537, 4539, 4541, 4543, 8409, 8411, 8413, 8415, 9497 , 9499, 9501 and 9503.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, for its use as defined above, said pathology being a pulmonary fibrosis, said miR being hsa-miR-29, said miPEP being preferably selected from SEQ ID NO: 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 2905, 2907, 2909, 2911, 2913, 2915, 2917, 2919, 3529, 3531, 3533, 3535, 3537, 3539, 3541, 3543, 5281, 5283, 5285, 5287, 5289, 5291, 5293, 5295, 5297, 5299, 5301, 5303, 5305, 5307, 5309, 5311, 11657, 11659, 11661, 11663, 11665, 11667, 11669 and 11671.
  • the invention relates to a miPEP for its use in the treatment of a disease or trauma of bone tissue or cartilage tissue, said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11,745), miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-.l (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to a miPEP fragment for use in treating a disease or trauma to bone tissue or cartilage tissue, said miPEP fragment being a 145-2 miPEP fragment. preferably consisting of SEQ ID NO: 11,751.
  • the invention relates to a miPEP fragment for use in treating a disease or trauma to bone tissue or cartilage tissue, wherein said miPEP fragment is miPEP. 2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a miPEP fragment for its use in the treatment of a disease or trauma of bone tissue or cartilage tissue, said miPEP fragment being a fragment of 125a-l miPEP preferably consisting of SEQ ID NO: 11,752.
  • the invention relates to a miPEP fragment for use in treating a disease or trauma to bone tissue or cartilage tissue, said miPEP fragment being miPEP // 125a-1. consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to a miPEP fragment for use in the treatment of disease or trauma to bone tissue or tissue. cartilaginous, said miPEP fragment being a fragment of miPEP a-16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to a miPEP fragment for use in treating a disease or trauma to bone tissue or cartilage tissue, said miPEP fragment being miPEP // 15a-16 consisting of SEQ ID NO: 11,754.
  • the invention relates to a miPEP fragment for use in the treatment of a disease or trauma of bone tissue or cartilage tissue, said miPEP fragment being selected from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 755 (MVGLNPPLWQ-YGRKKRRQRRR),
  • miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRKKRRQRRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,757 (MFKHRFFYMH-YGRKKRRQRRR).
  • Another aspect of the invention relates to a method for identifying a miPEP, or a fragment of said miPEP, modulating the accumulation of a miR involved in a pathology, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the sequence of the primary transcript of said miR,
  • modulation of the accumulation of said miR in the presence of said peptide with respect to the accumulation of said miR in the absence of said peptide indicates the existence of a miPEP, which is encoded by said open reading frame and capable of modulate the accumulation of said miR involved in a pathology.
  • Another aspect of the invention also relates to a miPEP of 101 to 500 amino acids, or a fragment of said miPEP, encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a microRNA, said miPEP being able to modulate the accumulation of said micro RNA in a eukaryotic cell.
  • a miPEP may have a size of 200 to 500 amino acids, 300 to 500 amino acids or 400 to 500 amino acids,
  • a miPEP may have a size of 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,
  • the invention relates to a miPEP selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875, or a fragment of said miPEP.
  • the invention relates to a miPEP selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11,745), miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-1 (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a fragment of 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 752. In a particular embodiment, the invention relates to the MEPPE 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11,752.
  • the invention relates to a fragment of miPEP 15a-16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11753.
  • the invention relates to a fragment of miPEP // 15a-16-1 consisting of SEQ ID NO: 11,753.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP vectorized or encapsulated.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, fused to a peptide facilitating entry into the miPEP cell, or the miPEP fragment.
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, fused with the TAT peptide (YGRKKRRQPvRJR., SEQ ID NO: 11,754).
  • the invention relates to a miPEP fragment, said miPEP fragment being chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 755 (MVGLNPPLWQ-YGRKK RQRRR),
  • miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRKKRRQRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,757 (MFKHRFFYMH-YGRKKRRQRRR).
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, as defined above, fused to penetratin, to a polyhistidine peptide (in particular a peptide of at least 6 histidine residues) or to a polyarginine peptide (in particular a 9-residue arginine peptide).
  • the invention relates to a miPEP, or a fragment of said miPEP, as defined above, linked to one or more palmitic acid molecules.
  • the invention in another aspect, relates to a composition comprising a miPEP or a fragment of said miPEP.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11 745), miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-1 (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP fragment is a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of miPEP 15a- 16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 15a-16-1 consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • said miPEP fragment being chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 755 (MVGLNPPLWQ-YGRKKRRQRRR),
  • miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRK RQRRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,757 (MFKHRFFYMH-YGRKKRRQRRR).
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said composition additionally contains growth factors and / or cell differentiation factors.
  • the invention relates to a composition as defined above, wherein said composition additionally contains BMP4. In a particular embodiment, the invention relates to a composition as defined above, wherein said composition additionally contains cell culture medium. In another aspect, the invention relates to the use in vitro or ex vivo of a miPEP of 3 to 500 amino acids encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being able to modulate the accumulation of said miR in a eukaryotic cell, to promote cell differentiation of cells.
  • the invention relates to the in vitro or ex vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to promote cell differentiation of mesenchymal stem cells (also called bone marrow stromal cells). mesenchymal stromal cells).
  • the invention relates to the in vitro or ex vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to promote cell differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein the cells are cultured in the presence of said miPEP, or a fragment of said miPEP.
  • the invention relates to the use as defined above, in which the cells are cultured in the presence of said miPEP, or a fragment of said miPEP, and in the presence of growth factors and / or cell differentiation factors.
  • the invention relates to the use as defined above, in which the cells are cultured in the presence of said miPEP, or a fragment of said miPEP, and in the presence of BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4 ).
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875.
  • said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11 745), miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-1 (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11,751.
  • said miPEP fragment is miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of miPEP 15a-16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 15a-16-l consisting of SEQ ID NO: 11 753. In a Particular embodiment, the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,755 (MVGLNPPLWQ-YGRKKRRQR R), miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT YGRKKRRQRRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,757 (MFKHRFFYMH YGRKKRRQRRR).
  • the invention relates to the in vitro or ex vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to induce or promote bone formation.
  • the invention relates to the in vitro or ex vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to form a mineralized bone matrix.
  • the invention relates to the use in vitro or ex vivo of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to promote bone formation with the aid of a bone biomaterial.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein mesenchymal stem cells are cultured in the presence of said miPEP, or a fragment of said miPEP.
  • the invention relates to the use as defined above, in which the mesenchymal stem cells are cultured in the presence of said miPEP, or of a fragment of said miPEP, and in the presence of growth factors and / or cell differentiation factors.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein the mesenchymal stem cells are cultured in the presence of said miPEP, or a fragment of said miPEP, and in the presence of BMP4.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP is selected from the group of miPEPs consisting of: miPEP 145-2 (SEQ ID NO: 11,745), miPEP 125a-1 (SEQ ID NO: 11,747) and miPEP 15a-16-1 (SEQ ID NO: 11,749).
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is a 145-2 miPEP fragment, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11 751.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of 125a-1 miPEP, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 752.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11 752. In a particular embodiment the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is a fragment of miPEP 15a- 16-1, preferably consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is miPEP // 15a-16-1 consisting of SEQ ID NO: 11 753.
  • the invention relates to the use as defined above, wherein said miPEP fragment is chosen from:
  • miPEP // 145-2-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,755 (MVGLNPPLWQ-YGRK R QRRR),
  • miPEP // 125a-1-TAT consisting of SEQ ID NO: 11,756 (MSLCLSPSLT-YGRKK RQPvRR), and
  • miPEP // 15a-16-l-TAT consisting of SEQ ID NO: 11 757 (MFKHRPFYMH- YGRKKRRQRRR).
  • the invention relates to the in vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to induce or promote bone formation.
  • the invention relates to the in vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to form a mineralized bone matrix.
  • the invention relates to the in vivo use of a miPEP, or a fragment of said miPEP, to promote bone formation with the aid of a bone biomaterial.
  • nucleic acid encoding a miPEP as defined above, or a fragment of said miPEP.
  • the invention relates to a nucleic acid as defined above, said nucleic acid being selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2q, q varying from 1 to 5,875.
  • the invention relates to an antibody specifically recognizing a miPEP selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q ranging from 1 to 5,875, or a fragment of said miPEP.
  • Such an antibody can be obtained from a method known to those skilled in the art, such as for example by injecting said miPEP with a non-human animal to trigger an immunization reaction and the production of antibodies by said animal.
  • the invention relates to an antibody specifically recognizing a miPEP, or fragment thereof, for use as a medicament.
  • the invention relates to an antibody specifically recognizing a miPEP selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875, or a fragment of said miPEP, for use as a medicament .
  • the invention relates to the use of an antibody specifically recognizing a miPEP, or a fragment of said miPEP, for immunostaining said miPEP or a fragment of said miPEP.
  • the invention relates to the use of an antibody as defined above, wherein said antibody specifically recognizes a miPEP selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875, or a fragment of said miPEP.
  • a miPEP selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 1 to 5,875, or a fragment of said miPEP.
  • the subject of the invention is a miPEP of 3 to 500 amino acids, encoded by a nucleotide sequence contained in the primary transcript of a miR, or a fragment of said miPEP, said miPEP being capable of modulating accumulation. said miR in a eukaryotic cell,
  • a miR being selected from the group consisting of: let-7b, let-7g, miR-15a, miR16-1, miR106a , miRlOa, miRlOb, miR1246, miR125a-l, miR132, miR134, miR142, miR145, miR145-2, miR146a, miR150, miR155, miR181c, miR182, miR183, miR184, miR18b, miR192, miR195, miR200a, miR202, miR203, miR205 , miR206, miR20b, miR21, miR210, miR27a, miR29a, miR29c, miR30b, miR345, miR377, miR409, miR495, miR520h, miR542, miR572, miR648, miR96 and miR99b;
  • miR15a preferably from the group consisting of: miR15a, miR16-l, miR125a-1 and
  • the subject of the invention is a miPEP as described above having in particular a size of from 3 to 50 amino acids, from 50 to 100 amino acids, from 100 to 500 amino acids, from 101 to 500 acids. amino, 200 to 500 amino acids, 300 to 500 amino acids, 400 to 500 amino acids, 100 to 200 amino acids, 200 to 300 amino acids or 300 to 400 amino acids.
  • the subject of the invention is a miPEP, or fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being identified, or as identified, by the implementation of a method identification of a miPEP modulating the accumulation of a miR involved in a musculoskeletal disorder, or a disease or trauma bone tissue or cartilage tissue, comprising:
  • the subject of the invention is a miPEP, or fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP being chosen from the group of miPEPs consisting of: SEQ ID NO: 2q-1,
  • the subject of the invention is a miPEP, or fragment of said miPEP for its use as defined above for its use in the treatment of one or more musculoskeletal disorders, or diseases or traumas of the patient.
  • bone tissue or cartilaginous tissue selected from the group consisting of:
  • osteoarthritis deforming osteochondritis of the hip, osteochondritis dissecans, osteo
  • the invention miPEP, or fragment of said miPEP for its use as defined above, said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of: SEQ ID NO: 2q-1,
  • 2061 to 2064 from 2073 to 2076, from 2117 to 2120, from 2129 to 2140, from 2185 to 2188, from 2217 to 2244, from 2269 to 2288, from 2317 to 2320, from 2337 to 2340, from 2361 to 2364, from 2413 to 2416, from 2425 to 2432, from 2437 to 2444, from 2465 to 2476, from 2609 to 2612, from 2641 to 2644, from 2653 to 2656, from 2689 to 2692, from 2825 to 2828, from 2949 to 2952, 2977 to 2980, from 3141 to 3144, from 3317 to 3320, from 3373 to 3376, from 3517 to 3520, from 3861 to 3868, from 4041 to 4044, from 4061 to
  • 4064 to 4096 from 4113 to 4116, from 4121 to 4128, from 4157 to 4164, from 4189 to 4192, from 4205 to 4208, from 4225 to 4228, from 4242 to 4245, from 4269 to 4276, from 4309 to to 4312, from 4341 to 4344, from 4421 to 4424, from 4637 to 4640, from 4661 to 4664, from 4677 to 4680, from 4685 to 4692, from 4705 to 4708, from 4749 to 4752, from 4757 to 4764, from 4777 at 4780, from 4793 to 4796, from 4813 to 4816, from 4825 to 4828, from 4833 to 4840, from 4898 to 4901, from 4985 to 4988, from 5157 to 5160,
  • the subject of the invention is a miPEP fragment for its use as defined above, said miPEP fragment being chosen from:
  • miPEP // 145-2 consisting of SEQ ID NO: 11,751,
  • MiPEP // 125a-1 consisting of SEQ ID NO: 11,752,
  • miPEP // 15a-16-l consisting of SEQ ID NO: 11,753.
  • the invention relates to a miPEP, or fragment of said miPEP, for its use as defined above, said miPEP, or the fragment of said miPEP, being fused or bound to one or more molecules facilitating the entry of the miPEP or the miPEP fragment into the cell,
  • said miPEP or the fragment of said miPEP, preferably being fused to N-ter or C-ter with the TAT peptide (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11,754).
  • the invention relates to a miPEP chosen from the group of miPEPs consisting of: SEQ ID NO: 2q-1, q varying from 45 to 48, from 89 to 92, from 101 to 104, from 121 to 124 , from 133 to 140, from 153 to 156, from 161 to 164, from 169 to 192, from 221 to 224, from 233 to 256, from 301 to 304, from 317 to 320, from 329 to 332, from 337 to 340 , from 381 to 384, from 445 to 448, from
  • said miPEP, or the fragment of said miPEP being in particular fused with the TAT peptide (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11,754), fused to penetratin, fused to a polyhistidine peptide, fused to a polyarginine peptide, or linked to one or more palmitic acid molecules.
  • TAT peptide YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11,754
  • the subject of the invention is a nucleic acid encoding one of the miPEPs chosen from the group of miPEPs consisting of SEQ ID NO: 2q, q varying from 45 to 48, from 89 to 92, from 101 to 104, from 121 to 124, from 133 to 140, from 153 to 156, from 161 to 164, from 169 to 192, from 221 to 224, from 233 to 256, from 301 to 304, from 317 to 320, from 329 to 332, from 337 to 340, from 5 381 to 384, from 445 to 448, from 469 to 472, from 533 to 536, from 693 to 696, from 789 to 792, from 909 to 916, from 977 to 980, from 1021 to at 1024, from 1237 to 1240, from 1277 to 1280, from 1329 to 1332, from 1337 to 1344, from 1350 to 1353, from 1361 to 1364, from 1374 to
  • the invention also relates to a method for identifying a miPEP modulating the accumulation of a miR involved in a musculoskeletal disorder, or a disease or trauma of bone tissue or cartilage tissue, said miPEP being encoded by a nucleotide sequence contained in the sequence of the primary transcript of said miR, comprising:
  • modulating the accumulation of said miR in the presence of said peptide with respect to the accumulation of said miR in the absence of said peptide indicates the existence of a miPEP, which is encoded by said open reading frame and being capable of modulating the accumulation of said miR involved in a musculoskeletal disorder, or a disease or trauma of bone tissue or cartilage tissue.
  • the subject of the invention is also the use in vitro, in vivo or ex vivo of a miPEP or fragment of said miPEP,
  • said miPEP being selected from the group of miPEPs consisting of: SEQ ID NO: 2q-1, q variant
  • the invention relates to the use of a miPEP or fragment of said miPEP as defined above, in combination with one or more additives,
  • said additives being selected from the group consisting of: cytokines such as bone morphogenetic protein (BMP) and / or dexamethasone.
  • cytokines such as bone morphogenetic protein (BMP) and / or dexamethasone.
  • the invention relates to a use of a miPEP or fragment of said miPEP as defined above, in association with a biomaterial,
  • biomaterial selected from the following table:
  • hydroxyapatite [HA] coral Goniopora, - titanium fiber sheets (Ti), ⁇ -tricalcium phosphate [ ⁇ ⁇ ] coral hydroxyapatite, - titanium wire,
  • the invention relates to the use of a miPEP or fragment of said miPEP as defined above, in combination with one or more additives, said additives being chosen from the group consisting of: cytokines as well as bone morphogenetic protein (BMP) and / or dexamethasone;
  • BMP bone morphogenetic protein
  • biomaterial selected from the group shown in Table 1 (see 41-43).
  • the invention relates to the use of a miPEP fragment of sequence SEQ ID NO: 11 752 for promoting the osteogenesis of mesenchymal stem cells in association with a biomaterial, said biomaterial being ⁇ ' ⁇ / ⁇ -TCP in a ratio of 20/80.
  • Another aspect of the invention is that it relates to osteo-induced cells with one or more miPEP or fragment of said miPEP as defined above, said cells being in particular mesenchymal stem cells.
  • Another aspect of the invention is that it relates to cells comprising a nucleic acid encoding one or more of the miPEPs as defined above, the expression of said nucleic acid being inducible or not, said cells being in particular mesenchymal stem cells.
  • the invention relates to a composite biomaterial comprising osteoinduced cells as defined above or cells as defined above,
  • additives being chosen from the group consisting of: cytokines such as bone morphogenetic proteins (BMP) and / or dexamethasone,
  • the subject of the invention is a composite biomaterial comprising mesenchymal stem cells osteo-induced by a miPEP fragment of sequence SEQ ID NO: 11 752, said biomaterial being ⁇ / ⁇ -TCP in a ratio of 20 / 80.
  • MiRs involved in diseases of the digestive system diseases of the endocrine system, diseases of the nervous system, diseases related to viruses, diseases related to nutrition and metabolism and lymphatic diseases and hemopathies
  • Table 5 The top 10 miRs involved in cancers, bacterial and fungal infections, immune system disorders, cardiovascular diseases, hereditary congenital diseases, skin diseases, musculoskeletal disorders, eye diseases and diseases of the digestive system.
  • Table 6 The top 10 miRs involved in diseases of the endocrine system, diseases of the nervous system, diseases related to viruses, diseases related to nutrition and metabolism, lymphatic diseases and hemopathies, neonatal and hereditary diseases, respiratory diseases, urogenital diseases in men, urogenital diseases in women.
  • FIG. 1 List indicating the corresponding miPEPs and miORPs, as well as the associated miRs.
  • FIG. 2 Expression of the iBSP gene in mesenchymal stem cells cultured in DIF + BMP4 medium in the presence of the miPEP // 125a-1.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 125a-1, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the iBSP gene. Analyzes and statistics were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** pO.001).
  • Figure 3 Expression of the PTHR1 gene in mesenchymal stem cells cultured in DIF + BMP4 medium in the presence of miPEP // 125a-1.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 125a-1, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the ordinate axis indicates the relative expression of the PTHR1 gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05; ** pO.01 and *** pO.001).
  • FIG. 4 Expression of the STMN2 gene in mesenchymal stem cells cultured in DIF + BMP4 medium in the presence of the miPEP // 125a-1.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 125a-1, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the STMN2 gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** pO.001).
  • Figure 5 Expression of the OSTERIX gene in mesenchymal stem cells cultured in DIF + BMP4 medium in the presence of the miPEP // 125a-1.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 125a-1, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the OSTERIX gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05; ** pO.01 and *** p ⁇ 0.001).
  • Figure 6 Expression of the Oak STMN2 in mesenchymal stem cells cultured in the medium PIF + BMP4 in the presence of the miPEP // 145-2.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 145-2, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the STMN2 gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** pO.001).
  • Figure 7 Expression of the STMN2 Oak in mesenchymal stem cells cultured in the medium PIF A BMP4 in the presence of the miPEP // 125a-1.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 125a-1, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the STMN2 gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** pO.001).
  • Ferrure 8 Expression of OSTERJX Reed in mesenchymal stem cells cultured in PIF A BMP4 medium in the presence of miPEP // 125a-1.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 125a-1, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the ordinate axis indicates the relative expression of the OSTERIX gene.
  • the statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** pO.001).
  • FIG. 9 Expression of the STMN2 gene in mesenchymal stem cells cultured in PIF A BMP4 medium in the presence of the miPEP // 145-2.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 145-2, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the STMN2 gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** pO.001).
  • FIG. 10 Expression of the OSTERIX gene in mesenchymal stem cells in the medium PIF A BMP4 in the presence of the miPEP // 145-2.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 145-2, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the OSTERIX gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05; ** pO.01 and *** p ⁇ 0.001).
  • Figure 11 Expression of Oak STMN2 in mesenchymal stem cells cultured in PROLIF medium in the presence of miPEP // 145-2.
  • the mesenchymal stem cells were treated for 4 days with 100 ⁇ l of miPEP // 145-2, with 100 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 125a) or untreated (NT).
  • the y-axis indicates the relative expression of the STMN2 gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05; ** pO.01 and *** p ⁇ 0.001).
  • FIG. 12 Entry of miPEP // 15a-16-FAM in mesenchymal stem cells.
  • the undifferentiated mesenchymal stem cells were treated for 6 hours with miPEP // 15a-16-l-1-FAM at 5 ⁇ (A), 10 ⁇ (B), 50 ⁇ (C) or 100 ⁇ (D).
  • FIG. 13 Entry of miPEP // 15a-16-FAM into mesenchymal stem cells. Undifferentiated mesenchymal stem cells were treated with 100 ⁇ l of miPEP // 15a-16-ll-FAM for 2 hours (A), 4 hours (B), 6 hours (C), 8 hours (D) and 24 hours. (E).
  • FIG. 14 Entry of miPEP // 15a-16-FAM-TAT into mesenchymal stem cells.
  • Undifferentiated mesenchymal stem cells were treated for 6 hours with miPEP // 15a-16-ll-FAM-TAT at 5 ⁇ (A), 10 ⁇ (B), 20 ⁇ (C), 50 ⁇ (D). or 100 ⁇ (E).
  • FIG. 15 Entry of miPEP // 15a-16-FAM-TAT into mesenchymal stem cells.
  • Undifferentiated mesenchymal stem cells were treated for 2 hours with 10 ⁇ M miPEP // 1 5 -16-1-FAM-TAT.
  • Figure 16 Accumulation of the precursor miR16-1 in the presence of miPEP // 15a-16-l-TAT.
  • the mesenchymal stem cells were treated with 10 ⁇ l of miPEP // 15a-16-1-TAT, treated with 10 ⁇ l of control peptide (ScmiPEP // 21-1) or untreated (NT) for 3 hours.
  • the amount of miR16-1 precursor in the cells was measured by quantitative RT-PCR. The measurement of the amount of miR16-1 precursor has been normalized with respect to PPIA household gene.
  • Statistical analyzes were performed with the Mann-Withney test (p-value: * p ⁇ 0.05, ** pO.Ol and *** pO.001).
  • Figure 17 Evaluation of the effects of miPEP125a-1 on bone formation in vivo.
  • mice were also given regular injections (once a week) of either miPEP // 125a-1 (D) or scramble miPEP (F) during the study. After 4 weeks, the mice are euthanized and the grafts were then isolated, fixed, included in methacrylate, cut and then treated for histology. The sections were scanned (NDPview) and the bone formation (dark gray) is evaluated (A to F) and is also quantified (G) through the use of the Fiji image analysis software and the total area of Neoformed bone is referred to the total area of the cut.
  • D miPEP // 125a-1
  • F scramble miPEP
  • EXAMPLE 1 miPEP 125a-1 and miPEP 145-2
  • a transcriptomic analysis carried out by the inventors has revealed that the miR 125a-1 and miR 145-2 are overexpressed during the differentiation of the cells into osteoblasts (unpublished results).
  • the 125a-1 and 145-2 miPEPs sequences were identified from the 125a-1 and 145-2 miRs primary transcripts.
  • miPEP 125a-1 and miPEP 145-2 were analyzed by measuring the expression of iBSP genes, PTHR1, STMN2 and OSTERIX which correspond to markers of osteoblast osteogenesis and differentiation (Chiellini et al., Biochem Biophys Res Commun, 374 (1): 64-8, 2008; Cordonnier et al., Tissue Eng, 17 ( 3): 249-259, 2011).
  • DIF + BMP4 medium aMEM + 2% FCS + b-Glycerophosphate + Ascorbic acid + BMP4
  • DIF ⁇ 4 medium aMEM + 2% FCS + b-Glycerophosphate + ascorbic acid
  • PROLIF medium aMEM + 10% FCS
  • iBSP mesenchymal stem cells cultured in the presence or absence of a miPEP *.
  • the miPEP // 125a-1 increases the expression of the WSP, PTHR1, STMN2 and OSTERIX genes (FIGS. 2, 3, 4 and 5).
  • the miPEP // 145-2 increases the expression of the STMN2 gene (FIG. 6).
  • the miPEP // 125a-1 increases the expression of the STMN2 and OSTERIX genes (FIGS. 7 and 8).
  • the miPEP // 145-2 increases the expression of STMN2 and OSTERIX genes (FIGS. 9 and 10).
  • FBS Fetal bovine serum
  • miPEP // 125a-1 (MSLCLSPSLT, SEQ ID NO: 11752),
  • miPEP // 145-2 (MVGLNPPLWQ, SEQ ID NO: 1,1751),
  • ScmiPEP / 125a "scramble" control peptide (IQVGHEDETD, SEQ ID NO: 1,1758).
  • PROLIF Proliferation medium
  • DIF + BMP4 Differentiation medium + BMP4
  • the miPEP // 125a-1 was synthesized by Smartbioscience and dissolved in water + 0.1% ammonium.
  • the mesenchymal stem cells were seeded in 12-well plates at 70,000 cells / well in 1 ml of PROLIF medium. The cells were then incubated for 72 h at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO 2 . d. Cell treatment with miPEPs
  • the cells were pre-treated with 100 ⁇ l of miPEP or "scramble" peptide diluted in PROLIF medium, and then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • cells treated with PROLIF +/- water or water + 0.1% ammonium medium were used as a negative control.
  • the cells were treated every 24 h with 100 ⁇ l of diluted miPEP either in DIF + BMP4 medium, or in DIF ⁇ 4 medium, or in PROLIF medium. Cells untreated or treated with water or water + 0.1% ammonium were used as controls. The cells are incubated at 37 ° C.
  • RNAs were extracted according to the supplier's recommendations with the miRNeasy microkit kit (Qiagen). f. Reverse transcription reaction
  • RNAs were reverse transcribed with the High Capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystem). 600ng of RNA were added to 2 ⁇ 1 of RT buffer (10X), 2 ⁇ 1 of Random primer (10X), 0.8 ⁇ 1 of dNTPs (25X), 0.5 ⁇ 1 of RNAse OUT (401 ⁇ / ⁇ 1) and ⁇ of multiscribe reverse transcriptase (501 ⁇ / ⁇ 1) in a total volume of 20 ⁇ 1.
  • the reverse transcription reaction was carried out at 25 ° C for 10 min and then 42 ° C for 2 h. The activity of the enzyme was stopped by incubating the mixture at 85 ° C for 5 min.
  • the expression of osteoblastic transcription factors SPSP, PTHR1, STMN2 and OSTERJX was evaluated by quantitative RT-PCR with the SsoFast EvagGreen kit.
  • 3 ⁇ l of reverse transcriptase diluted 1/8 were added to IX of SsoFast EvaGreen, 10 ⁇ of each primer and water without RNase in a final volume of ⁇ .
  • the reaction was subjected to the following temperatures: 3 min pre-amplification at 95 ° C, 40 cycles at 10 ° to 95 ° C and 30 ° at 60 ° C in a thermal cycler (CFX96 Real-time PCR detection system, Biorad) .
  • PPIA was used as a reference gene to normalize quantitative RT-PCR. For all PCR reactions, two replicates were used for each biological sample.
  • miPEPs mesenchymal stem cells
  • FBS Fetal bovine serum
  • miPEP // 15a-16-1 (MFKHRFFYMH, SEQ ID NO: 11,753),
  • miPEP // 15a-16-l-TAT (MFKHRFFYMH-YGRKK RQR, SEQ ID NO: 11,757).
  • Undifferentiated MSCs are incubated in ⁇ MEM + 10% FBS + 1% P / S medium in the presence of fluorescein labeled miPEP (FAM). After incubation for 2 h, the wells are washed 3 times with PBS and then the cells are fixed for 5 min with 3.8% formaldehyde). The nuclei are marked with the Draq5 diluted 1/1000. The cells are then observed under a confocal microscope in fluorescence.
  • FAM fluorescein labeled miPEP
  • a transcriptomic analysis performed by the inventors has revealed that the miR 15a and miR 16-1 are overexpressed during the differentiation of the cells into osteoblasts (unpublished results).
  • the sequence of miPEP 15a-16-1 was identified from the primary transcript 15a-16-1.
  • MSCs from three different patients were treated with 10 ⁇ l of miPEP // 15a-16-1 fused to TAT peptide (miPEP // 15a-16-1-TAT) for 3h, then the amount of miR16-1 was measured by RT-qPCR. 3.1 - Results
  • FBS Fetal bovine serum
  • miPEP // 15a-16-1-TAT (MFKHRFFYMH-YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO: 11,757).
  • Peptides were synthesized by Smartbioscience and dissolved at 2mM in water. b. Seeding of the cells
  • the CSMs were seeded in wells of 12-well plates at 72900 cells per well under 1 ml of PROLIF medium. The cells were then incubated for 72 h at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO 2 . vs. Cell treatment with miPEPs
  • the cells were treated with 10 ⁇ l of miPEP // 15a-16-l-TAT or ⁇ of ScmiPEP21 diluted in PROLIF medium and then incubated at 37 ° C. for 1 h, 2 h, 3 h, 4 h and 6h.
  • cells treated with PROLIF +/- water medium were used as a negative control.
  • the miRNAs were extracted according to the supplier's recommendations with the miRNeasy microkit kit (Qiagen). e. Reverse transcription reaction
  • RNAs were reverse transcribed with the High Capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystem). 400ng of RNA were added to 2 ⁇ 1 of RT buffer (10X), 2 ⁇ 1 of Random primer (10X), 0.8 ⁇ 1 of dNTPs (25X), 0.5 ⁇ 1 of RNAse OUT (40 ⁇ / ⁇ 1) and ⁇ ⁇ of multiscribe reverse transcriptase ( 50 ⁇ / ⁇ l) in a total volume of 20 ⁇ l. The transcription reaction is carried out at 25 ° C for 10 min and then 42 ° C for 2h. The activity of the enzyme is stopped by incubating the mixture at 85 ° C for 5 min. f. Quantification of precursor miRNAs by quantitative RT-PCR
  • the amount of precursor miRNA in cells treated or not treated with miPEP was evaluated by quantitative RT-PCR with the SsoFast EvagGreen kit.
  • 3 ⁇ of reverse transcriptase diluted 1/5 are added to IX of SsoFast EvaGreen, ⁇ of each primer and RNase free water in a final volume of 10 ⁇ .
  • the reaction is subjected to the following temperatures: 3 min pre-amplification at 95 ° C, 40 cycles at 10 ° to 95 ° C and 30 ° at 60 ° C in a thermal cycler (CFX96 Real-time PCR detection System, Biorad).
  • PPIA is used as a reference gene to normalize quantitative RT-PCR.
  • the production of polyclonal antibodies specifically recognizing miPEP 125a, miPEP145 and miPEP15a-16-1 is made in mice or rabbits. The animals are treated by repeated injections of miPEP triggering the production of anti-miPEP antibodies.
  • Mesenchymal stem cells from 6 different donors are cultured for 7 days either in proliferation medium (aMEM + 10% FCS) or in differentiation medium (aMEM + 2% FCS + b-Glycerophosphate + Ascorbic acid + BMP4).
  • the presence of miPEP is then looked for in the cells by immunolabelings with the polyclonal antibodies anti-miPEP125a, anti-miPEP145 and anti-miPEP 15a- 16-1.
  • the cells are incubated for 1H to 12H with the primary antibodies. They are then washed 3 times with 0.1% BSA PBS and then treated by adding anti-species secondary antibodies (anti-mouse or anti-rabbit) conjugated to a fluorescent probe. The reading is done under an epifluorescence microscope.
  • EXAMPLE 5 In Vivo Bone Formation by Subcutaneous Implantation in Nude Mice
  • the cultured cells are osteoinduced using miPEPs and then suspended for 1 to 2 hours in the culture medium also containing biomaterial granules in the ratio of 2 ⁇ 10 6 cells / 50 mg of biomaterial.
  • This biomaterial is biphasic inorganic calcium phosphate (BCP) composed of hydroxyapatite (HA) and beta-tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) in a ratio of 20/80, ranging in size from 0.5 to 1 mm (sold by Biomatlante, Vigneux de Bretagne, France).
  • BCP biphasic inorganic calcium phosphate
  • HA hydroxyapatite
  • ⁇ -TCP beta-tricalcium phosphate
  • the porosity of this biomaterial was 75 +/- 5% of pores of which 70% from 0 to ⁇ , 20% from 10 to ⁇ and 10% from 100 to 300 ⁇ .
  • the biomaterial is sterilized by autoclaving.
  • mice Female Nude mice (RjOrl: NMRI-Foxnnul / Foxnlnu) (Laboratoires Janvier, Saint-Berthevin, France) are generally anesthetized by inhalation of isoflurane.
  • the biomaterial alone is implanted as a negative control.
  • Two implants are placed in the back of the mice subcutaneously on each side of the spine (a mouse may contain different types of implants). After 8 weeks, the treated animals are sacrificed. The implants are then removed and fixed in a buffered 4% formalin solution.
  • NIH 3T3 cells (mouse fibroblast cell line) are cultured on DMEM medium, supplemented with 1-Glutamine (4 mM), Sodium Pyruvate (1 mM) and a 10% BCS BCS solution.
  • the cells are transfected with Dharmafect I according to the reseller's recommendations and then with increasing amounts of a miPEP encoded by the primary miR-29 transcript.
  • the cells are collected 48 hours after transfection and Collai expression is measured by qPCR.
  • LetR-7 miR is known to act as a tumor suppressor gene in a variety of human tissues, particularly in the lung, by downregulating the post-transcriptional expression of multiple oncogenes, including RAS, MYC and HMGA2, as well as other genes for cell cycle progression.
  • Increasing amounts of let-7 miR in overexpressing KRAS mutant cells showed a dose-dependent reduction in kras expression (Esquela-Kerscher et al., The let-7 microRNA cancer, Cell Cycle (2008), 7 (6), 759-764).
  • A549 cells (KRAS overexpressing mutant cell line) were cultured on DMEM medium (90%) supplemented with fetal calf serum (10%) and 1x penicillin / streptomycin solution, then transfected with increasing amount of miPEP. encoded by the primary transcript of miR let-7. The next day, the cells are rinsed and incubated for 48 hours with a conventional culture medium. The proliferation tests are carried out with the AlamarBlue kit according to the distributor's recommendations.
  • EXAMPLE 8 Ischemia - Reperfusion
  • MiR-7 is implicated in the deleterious effects of ischemia-reperfusion syndrome (I / R) and is overexpressed in simulated I / R cardiomyocites.
  • miR-7 has been shown to protect myocardial cells against apoptosis by reducing the expression of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).
  • PARP poly (ADP-ribose) polymerase
  • An increase in miR-7 induces a dose-dependent reduction in PARP expression (Li et al, MicroRNA-7a / b Protects against Cardiac Myocyte Injury in Ischemia Reperfusion by Targeting Poly (ADP-Ribose) Polymerase, PLoS One (2014) 9 (3); e90096).
  • H9c2 cells (rat ventricular cell line) are cultured at 37 ° C under 5% CO2 on DMEM medium (90%) supplemented with fetal calf serum (10%) and 100 ⁇ g / ml penicillin / streptomycin solution. .
  • the cells are subjected to a simulated I / R episode: the medium is replaced by glucose- and serum-deficient DMEM, and the cells are placed in a hypoxic chamber at 37 ° C. for 10 h and then reoxygenated for 2 h on DMEM medium containing 10% fetal calf serum. Quantification of PARP expression is conducted in Western Blot with anti-PARP antibodies.
  • EXAMPLE 9 Infection with the Hepatitis C Virus CHCV
  • HOXA1 Homeobox A1
  • HOXA1 Homeobox A1
  • a miR-181c analogue inhibits HOXA1 and other cascading agents, including STAT3 and STAT5, involved in the regulation of cell growth.
  • the analog also suppresses HCV replication (Mukherjee et al., Transcriptional Suppression of miR-181c by Hepatitis C Virus Enhances Homeobox Al Expression, J. Virol. (2014), 88 (14); 7929-7940.).
  • the human hepatoma cells (Huh7.5) are maintained on DMEM medium (90%) supplemented with fetal calf serum (10%) and antibiotics (100 U penicillin G / ml and 100 ⁇ g streptomycin / ml).
  • HCV genotype 2a (clone JFH1) is grown in Huh7.5 cells. The supernatant is filtered on a cellulose acetate membrane. For infection, Huh7.5 cells are incubated with the viral solution for 72h.
  • the cells reflecting the presence of HCV genotype 2a are cultured on DMEM medium (90%) supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin / streptomycin solution 1%. All cells are maintained at 37 ° C under 5% CO 2 and transfected with increasing doses of a miPEP encoded by the primary miR-181c transcript.
  • the quantification of HOXAl is carried out by Western Blot using dedicated antibodies.
  • mice All experiments on animals were done in accordance with EU Directive 2010/63 and after validation of protocols by the Animal Ethics Committee (Toulouse, N: 86/809 EEC). A total of 6-8 mice were used per group.
  • biomaterials were biphasic inorganic calcium phosphate (BCP), composed of hydroxyapatite (HA) and beta-tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) in a ratio of 20/80, ranging in size from 0.5 to 1 mm (sold by Biomatlante, Vigneux de Bretagne, France).
  • BCP biphasic inorganic calcium phosphate
  • HA hydroxyapatite
  • ⁇ -TCP beta-tricalcium phosphate
  • the biomaterial alone has been implanted as a negative control.
  • Female Nude mice (RjOrl: NMRI-Foxnnul / Foxnlnu), from the approved supplier Janvier (Laboratoires Janvier, Saint-Berthevin, France) were generally anesthetized by inhalation of isoflurane. Two implants (cells + biomaterials) were placed in the back of the mice subcutaneously on each side of the spine. After 4 weeks, the treated animals were sacrificed. The implants were then removed and fixed in a 4% buffered formalin solution.
  • mice will also receive regular injections (once a week) in the course of the study either of the miPEP // 125a-1 (SEQ ID NO: 11,752) or the control miPEP (scramble ScmiPEP // 125a, SEQ ID NO: 11,758).
  • the photos were obtained by a scan of each cut (NanoZoomer, Hamamatsu, Photonics, Hamamatsu City, Shizuoka, Japan) and observed virtually (NDP view, Hamamatsu).
  • the histomorphometry of the images was done using the ImageJ software and the neoformed bone percentage was calculated by explant area. 3 to 4 sections per explant were analyzed and quantified. 10.2 - Materials
  • BCP Biphasic inorganic calcium phosphate
  • HA hydroxyapatite
  • ⁇ -TCP beta-tricalcium phosphate
  • NDPview (NDP view, Hamamatsu).
  • FIG. 17 show that there is no bone formation in the biomaterial control alone (FIG. 17A). In contrast, the addition of CSM to the biomaterial generated bone formation in all cases (Fig 17B-F). However, qualitatively it appears that this bone formation is greater when the MSCs have been pre-treated with miPEP125a-1 (Fig 17C-D) than with the screamed miPEP (Fig 17E-F).

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Abstract

La présente invention concerne des peptides thérapeutiques.

Description

PEPTIDES THERAPEUTIQUES
La présente invention concerne des peptides thérapeutiques. Les micro ARNs (miRs) sont des petits ARNs non codants, d'environ 21 nucléotides après maturation, qui contrôlent l'expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel, en dégradant l'ARNm cible ou en inhibant sa traduction, chez les organismes eucaryotes.
Les miRs peuvent notamment réguler l'expression de gènes spécifiques impliqués dans certaines pathologies chez l'humain et les animaux. Il est d'ailleurs désormais admis que les miRs jouent un rôle important dans de nombreuses pathologies, et ces derniers constituent, par conséquent, des cibles intéressantes pour le développement de nouveaux médicaments. La régulation de l'expression des miRs est très peu connue, mais on sait notamment que celle-ci fait intervenir, à l'instar de la plupart des gènes codants, une ARN polymerase II : cette enzyme produit un transcrit primaire, appelé « pri-miR », qui est ensuite maturé par un complexe protéique contenant notamment les enzymes type Dicer. Cette maturation conduit tout d'abord à la formation' d'un précurseur de miR appelé « pre-miR », ayant une structure secondaire en forme tige-boucle contenant le miR et sa séquence miR * complémentaire. Puis le précurseur est maturé, ce qui conduit à la formation d'un ARN double brin plus court contenant le miR et le miR*. Le miR est ensuite pris en charge par le complexe RISC qui clive l'ARNm du gène cible ou bien inhibe sa traduction.
A l'heure actuelle, il existe principalement deux types d'approches thérapeutiques permettant de réguler l'expression des miRs in vivo.
La première approche consiste à mimer l'effet du miR en utilisant des duplex d RN synthétiques conçus pour imiter le miR d'intérêt. L'un des brins est identique au miR d'intérêt, tandis que l'autre brin peut être modifié pour faciliter l'absorption cellulaire de la molécule. Cependant, étant donné que l'un des brins doit fonctionner comme un miR et être reconnu comme tel par la cellule, les modifications autorisées sont chimiquement limitées. De plus, bien que cette approche permette de remplacer les quantités de miRs perdues lors d'une pathologie, il est difficile de cibler les molécules d'ARN vers des tissus spécifiques, et les tissus qui n'expriment normalement pas le miR d'intérêt peuvent aussi capter le duplex d'ARN synthétique et conduire à des effets secondaires indésirables.
La seconde approche consiste à recourir à des oligonucléotides antisens. De tels oligonucléotides antisens possèdent une séquence complémentaire de tout ou partie de celle du miR cible et vont réduire la quantité endogène de miRs. Cependant, en raison de la faible stabilité in vivo de ce type de molécules, leur manipulation est rendue délicate et coûteuse.
Il est donc nécessaire de fournir un moyen permettant de réguler plus simplement, et de 5 manière spécifique, les miRs impliqués dans certaines pathologies.
Récemment, il a également été découvert de petits cadres ouverts de lecture (ORFs) dans de longs ARNs non codants intergéniques (lincRNAs) dont la fonction putative, si elle existe, n'est pas connue (Ingolia et al, Cell, 147(4):789~802, 2011 ; Guttman & Rinn, Nature, 10 482(7385):339-46, 2012). Toutefois, aucun exemple n'a encore été rapporté concernant l'existence d'ORFs codant des peptides au sein des miRs. Jusqu'à présent, les miRs, et par extension leur transcrit primaire, ont toujours été considérés, de par leur mode d'action particulier, comme des ARNs régulateurs non codants ne produisant aucun peptide.
15 Or, les Inventeurs ont récemment mis en évidence l'existence de micropeptides (ou « miPEPs », microKNA encoded PEPtides) capables de moduler l'accumulation des miRs dans les cellules (Lauressergues et al, Nature, 520(7545): 90-3, 2015 ; demande internationale WO 2015/063431). 0 L'un des aspects de l'invention est donc de proposer des compositions contenant des micropeptides capables de moduler l'accumulation des miRs impliqués dans certaines pathologies.
Un autre aspect de l'invention concerne ces micropeptides pour leur utilisation en tant que médicaments, et pour le traitement de pathologies spécifiques.
5 Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'identification de micropeptides permettant de moduler l'accumulation des miRs impliqués dans des pathologies.
D'autres aspects de l'invention concernent également des micropeptides en tant que tels et les acides nucléiques codant ces derniers. 0 Dans un aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant :
- un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, et
- un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans l'invention, les termes « microARN », « micro ARN non codant » et « miR » sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent des petites molécules d'APvN d'environ 21 nucléotides, qui ne sont pas traduites et ne conduisent pas à un peptide ou une protéine.
Cependant, sous cette forme mature, les microARNs assurent une fonction de régulation de certains gènes via des mécanismes post-transcriptionnels, comme par exemple par l'intermédiaire du complexe RISC.
Le transcrit primaire du microARN ou « pri-miR » correspond lui à la molécule d'ARN directement obtenue à partir de la transcription de la molécule d'ADN. Généralement, ce transcrit primaire subit une ou plusieurs modifications post-transcriptionnelles, qui entraînent par exemple une structure particulière de l'ARN ou un clivage de certaines parties de TARN, et qui conduisent à la forme précurseur du microARN ou « pre-miR », puis à la forme mature du microARN ou « miR ».
Les termes « micropeptides » et « miPEPs » (microRNA encoded PEPtides) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent un peptide qui est codé par un cadre ouvert de lecture présent sur le transcrit primaire d'un microARN, et qui est capable de moduler l'accumulation dudit microARN. Les micropeptides au sens de la présente invention ne doivent être entendus comme étant nécessairement des peptides de petite taille, dans la mesure où « micro » ne correspond pas à la taille du peptide.
Selon l'invention, un miPEP peut être également assimilé à un modulateur de transcription, et notamment un activateur transcriptionnel. Un tel modulateur de transcription peut agir au niveau de la transcription pour moduler l'accumulation du pri-miR, du pre-miR et du miR. Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, un même micropeptide peut être codé par plusieurs séquences nucléotidiques. De telles séquences nucléotidiques, différentes entre elles d'au moins un nucléotide mais codant un même peptide, sont appelées « séquences dégénérées ».
Les termes « cadre ouvert de lecture » ou « ORF » (ppen reading framé) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides dans une molécule d'ADN ou d'ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine: ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon start (le codon start codant généralement une méthionine), suivi d'une série de codons (chaque codon codant un acide aminé), et se termine par un codon stop (le codon stop n'étant pas traduit).
Dans l'invention, les ORFs peuvent être dénommés de manière spécifique « miORFs » lorsque ceux-ci sont présents sur les transcrits primaires de microARN. Les miORFs peuvent être contenus dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire du microAR , de préférence dans la partie 5'.
Les parties 5' ou 3' du transcrit primaire du microARN correspondent aux parties terminales de la molécule de ARN qui sont clivées au cours de la maturation du microARN.
5 Les miORFs tels que définis dans l'invention en particulier peuvent avoir une taille de 12 à 1503 nucléotides et coder des peptides de 3 à 500 acides aminés.
En particulier, les miORFs codent des miPEPs ayant une taille de :
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 10 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,
104, 105 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 113 114, 115 116, 117, 118; 119, 120, 121, 122, 123, 124 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 132 133, 134 135, 136, 137: 138, 139, 140, 141, 142, 143 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 151 152, 153 154, 155, 156; 157, 158, 159, 160,
15 161, 162 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 170 171, 172 173, 174, 175: 176, 177, 178, 179, 180, 181 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188 189 190, 191 192, 193, 194: 195, 196, 197, 198, 199, 200 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207: 208 209, 210 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 227 228, 229 230, 231, 232: 233, 234, 235, 236, 237, 238 239, 240, 241, 242, 243, 244,·245: 246 247, 248 249, 250, 25L 252, 253, 254, 255,
20 256, 257 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264; 265 266, 267 268, 269, 270: 271, 272, 273, 274, 275, 276 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283 284 285, 286 287, 288, 289: 290, 291, 292, 293, 294, 295 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 303 304, 305 306, 307, 308: 309, 310, 311, 312, 313, 314 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321 322 323, 324 325, 326, 327: 328, 329, 330, 331, 332, 333 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340 341 342, 343 344, 345, 346: 347, 348, 349, 350,
25 351, 352 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359 360 361, 362 363, 364, 365; 366, 367, 368, 369, 370, 371 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378 379 380, 381 382, 383, 384: 385, 386, 387, 388,
. 389, 390 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397 398 399, 400 401, 402, 403: 404, 405, 406, 407, 408, 409 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416 417 418, 419 420, 421, 422: 423, 424, 425, 426, 427, 428 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435 436 437, 438 439, 440, 441: 442, 443, 444, 445,
30 446, 447 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454 455 456, 457 458, 459, 460: 461, 462, 463, 464, 465, 466 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473 474 475, 476 477, 478, 479: 480, 481, 482, 483, 484, 485 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500 acides aminés. Les miPEPs peuvent notamment avoir une taille de 100 à 500 acides aminés, de 101 à 500 acides aminés, 200 à 500 acides aminés, de 300 à 500 acides aminés, ou de 400 à 500 acides aminés.
Selon l'invention, un « fragment de miPEP » correspond à une partie N-terminale, à une partie C-terminale ou à une partie interne de la séquence d'un miPEP.
En d'autres termes, un « fragment de miPEP » correspond à une partie d'un miPEP contenant le premier acide aminé N-terminal, à une partie du miPEP contenant le dernier acide aminé C- terminal ou à une partie ne contenant ni le premier acide aminé N-terminal ni le dernier acide aminé C-terminal.
En particulier, un fragment de miPEP a une taille de 2 à 20 acides aminés, de préférence de 5 à 10 acides aminés.
En particulier, un fragment de miPEP a une taille de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés.
De préférence, un fragment de miPEP a une taille de 10 acides aminés et correspond à la partie N-terminale d'un miPEP.
Dans la présente invention, un fragment de miPEP peut être désigné par le terme « miPEP// ». Dans l'invention, par « accumulation », on entend la production d'une molécule, telle qu'un microARN ou un micropeptide, dans la cellule.
L'accumulation d'un microARN ou d'un micropeptide peut être déterminée à l'aide des méthodes de dosage connues de l'homme du métier, comme par exemple par RT-qPCR ou par la quantification de la fluorescence dûe à la fusion d'un peptide ou d'une protéine à un marqueur fluorescent.
Ainsi, la « modulation » de l'accumulation d'une molécule dans une cellule correspond à une modification de la quantité de cette molécule présente dans la cellule.
Par ailleurs, l'effet d'un miPEP peut être observé via la modulation de l'accumulation du miR, mais également à travers la modulation de l'accumulation du pri-miR ou du pre-miR correspondant.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci- dessus, dans laquelle la modulation de l'accumulation dudit microARN est une diminution ou une augmentation de l'accumulation dudit microARN, en particulier une augmentation.
Une « diminution de l'accumulation » correspond à une baisse de la quantité de ladite molécule dans la cellule par rapport à une cellule témoin. A l'inverse, une « augmentation de l 'accumulation » correspond à une hausse de la quantité de ladite molécule dans la cellule par rapport à une cellule témoin.
Selon l'invention, un miPEP est capable de moduler l'accumulation du pri-miR, du pre-miR et du miR. Par conséquent, si un transcrit primaire contient plusieurs miRs, un même miPEP codé par ledit transcrit primaire est capable de moduler l'accumulation d'au moins un des miRs présents sur le transcrit primaire.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant :
- un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans une pathologie,
- un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon l'invention, ladite composition pharmaceutique comprend au moins un miPEP mais peut également comprendre un mélange de plusieurs miPEPs. De manière non limitative, ladite composition pharmaceutique peut par exemple comprendre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 miPEPs.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en :
- le miPEP 145-2 (MVGLNPPLWQETGEYT, SEQ ID NO : 11 745),
- le miPEP 125a-l (MSLCLSPSLTPTPGSTGPPHTMLPVSRSLRPFNL, SEQ ID NO : 11 747), et - le miPEP 15a- 16-1 (MFKHRPFYMHSFFPERKYFLYSLGANVCLKKIKPWSKV AAHNGLWILKRCRPYCAASKIQGSDLLKKIYFFLFIALMIAMSAVP, SEQ ID NO : 11 749). Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751 (MVGLNPPLWQ). Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751 (MVGLNPPLWQ).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 125a-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752 (MSLCLSPSLT).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752 (MSLCLSPSLT).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 15a- 16-1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753 (MFKHRFF YMH) .
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753 (MFKHRFF YMH) .
La liste de l'ensemble des miPEPs, et des miORFs correspondants, est présentée dans la Figure 1 et est intégrée dans la présente demande. Dans un mode de réalisation particulier, les compositions pharmaceutiques comprenant les miPEPs sont sous forme d'une dose unitaire comprenant de 10" M à 10"10M de miPEP.
Dans un mode particulier, les compositions selon l'invention peuvent être administrées en une ou plusieurs fois.
Dans un mode de réalisation particulier, les compositions pharmaceutiques sont adaptées à une administration par voie orale, oculaire, nasale, parentérale (intraveineuse, intraartérielle, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire), rectale, vaginale, topique ou auriculaire.
Dans un mode de réalisation particulier, le miPEP peut être vectorisé ou encapsulé.
Dans l'invention, le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, peut être fusionné ou lié à une ou plusieurs molécules facilitant l'entrée du miPEP, ou du fragment de miPEP, dans la cellule.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, est fusionné à un peptide facilitant l'entrée dans la cellule du miPEP, ou du fragment de miPEP.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, est fusionné avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO : 11 754). Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, est fusionné en N-ter ou en C-ter avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO : 11 754). Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKKRRQRRR), le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRKKRRQRRR), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRFFYMH- YGRKXRRQRRR).
Dans un . mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, est fusionné à la pénétratine, à un peptide polyhistidine (notamment un peptide d'au moins 6 résidus histidine) ou à un peptide polyarginine (notamment un peptide de 9 résidus arginine).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, dans laquelle le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, est lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique.
La quantité de miPEP présent dans la composition ou utilisée pour le traitement d'une pathologie peut varier selon que le miPEP est ou non modifié avec une molécule facilitant la pénétration cellulaire. Dans un autre aspect, l'invention a pour objet un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour son utilisation comme médicament. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans une pathologie, pour son utilisation comme médicament.
Dans l'invention, un gène est impliqué dans une pathologie si l'expression dudit gène varie de manière significative entre un patient souffrant de ladite pathologie et un individu sain. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant identifié, ou tel qu'identifié, par la mise en œuvre d'un procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans une pathologie, comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis
- b) une étape de comparaison entre :
• l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et
• l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide, dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans une pathologie.
Dans l'invention, un miR est impliqué dans une pathologie si ledit miR est capable de réguler l'expression d'un gène impliqué dans ladite pathologie et/ou de réduire les symptômes de ladite pathologie.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi ceux présentés dans les tableaux 2, 3, 4, 5 et 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi le groupe consistant en :
le hsa-mir- 103-1, le hsa-mir-103-2, le hsa-mir-107, le hsa-mir-122, le hsa-mir-155, le hsa- mir-21, le hsa-mir-33, le hsa-mir-15a, le hsa-miR-15b, le hsa-mir-451, le hsa-mir-92a-l, le hsa-mir-92a-2, le hsa-mir-92b, le hsa-mir-208, le hsa-mir-208b, le hsa-mir-29a, le hsa-mir- 29b-l, le hsa-mir-29b-2, le hsa-mir-29c,le hsa-mir-143,le hsa-mir-145,le hsa-mir-206,le hsa- mir-378, le hsa-mir-34a, le hsa-mir-34b, le hsa-mir-34c, le hsa-let-7, le sa-mir-16-1, le hsa- mir-16-2 et le hsa-mir-125a. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi le groupe consistant en : le hsa-mir-125a, le hsa-mir-15a-16-l et le hsa-mirl45. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a-l (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a- 16-1 (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 125a- 1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 15a- 16-1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné au peptide TAT.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKKRRQRRR),
le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRKKR QR R), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRFFYMH- YGRKKRRQRRR).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné à la pénétratine, à un peptide polyhistidine (notamment un peptide d'au moins 6 résidus histidine) ou à un peptide polyarginine (notamment un peptide de 9 résidus arginine).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique.
Un autre aspect de l'invention a pour objet un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie choisie parmi : le cancer, les infections bactériennes, les mycoses, les maladies cardiovasculaires, les maladies congénitales héréditaires, les maladies de la peau, les maladies des yeux, les maladies du système digestif, les maladies du système endocrinien, les maladies du système nerveux, les maladies liées à des virus, les maladies liées à la nutrition et au métabolisme, les maladies lymphatiques et hémopathies, les maladies néonatales et héréditaires, les maladies respiratoires, les maladies urogénitales chez l'homme, les maladies urogénitales chez la femme, les troubles du système immunitaire, les troubles musculo-squelettiques, les maladies ou les traumatismes du tissu osseux ou du tissu cartilagineux.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux.
Dans l'invention, le terme « maladie du tissu osseux » désigne toute maladie réduisant le capital osseux, telle que l'ostéoporose. Dans l'invention, le terme « traumatisme du tissu osseux » désigne une rupture de continuité ou une fracture d'un os.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans ladite pathologie.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant identifié, ou tel qu'identifié, par la mise en œuvre d'un procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans une pathologie, comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis - b) une étape de comparaison entre :
• l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR, en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la
5 cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et
• l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par 10 rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, ' celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans une pathologie.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit 15 miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : 20 le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a-l (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a-16-l (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 25 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 125a-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 15a- 16-1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné au peptide TAT.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKKPvRQRRR),
le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRKKRRQRRR), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRFFYMH- YGRKK RQRRR) .
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus,le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné à la pénétratine, à un peptide polyhistidine (notamment un peptide d'au moins 6 résidus histidine) ou à un peptide polyarginine (notamment un peptide de 9 résidus arginine).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus,le miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique. Les tableaux 2 à 6 présentent les différents miRs et les pathologies dans lesquelles ils sont impliqués.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant un cancer, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés au cancer dans le tableau 2, en particulier parmi les miRs liés au cancer dans le tableau 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une infection bactérienne ou une mycose, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux infections bactériennes et aux mycoses dans le tableau 2, en particulier parmi les miRs liés aux infections bactériennes et aux mycoses dans le tableau 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie cardiovasculaire, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies cardiovasculaires dans le tableau 2, en particulier parmi les miRs liés aux maladies cardiovasculaires dans le tableau 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie congénitale héréditaire, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies congénitales héréditaires dans le tableau 2, en particulier parmi les miRs liés aux maladies congénitales héréditaires dans le tableau 5. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie de la peau, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies de la peau dans le tableau 2, en particulier parmi les miRs liés aux maladies de la peau dans le tableau 5. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie des yeux, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies des yeux dans le tableau 2, en particulier parmi les miRs liés aux maladies des yeux dans le tableau 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie du système digestif, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies du système digestif dans le tableau 3, en particulier parmi les miRs liés aux maladies du système digestif dans le tableau 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que défïme ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie du système endocrinien, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies du système endocrinien dans le tableau 3, en particulier parmi les miRs liés aux maladies du système endocrinien dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie du système nerveux, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies du système nerveux dans le tableau 3, en particulier parmi les miRs liés aux maladies du système nerveux dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie liée à un virus, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies liées à des virus dans le tableau 3, en particulier parmi les miRs liés aux maladies liées à des virus dans le tableau 6. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie liée à la nutrition et au métabolisme, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux troubles de la nutrition et du métabolisme dans le tableau 3, en particulier parmi les miRs liés aux troubles de la nutrtion et du métabolisme dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie lymphatique ou une hémopathie, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés' aux maladies lymphatiques ou aux hémopathies dans le tableau 3, en particulier parmi les miRs liés aux maladies lymphatiques ou aux hémopathies dans le tableau 6. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie néonatale et héréditaire, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies néonatales et héréditaires dans le tableau 4, en particulier parmi les miRs liés aux maladies néonatales et héréditaires dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie respiratoire, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies respiratoires dans le tableau 4, en particulier parmi les miRs liés aux maladies respiratoires dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie urogénitale chez l'homme, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies urogénitales chez l'homme dans le tableau 4, en particulier parmi les miRs liés aux maladies urogénitales chez l'homme dans le tableau 6. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie urogénitale chez la femme, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux maladies urogénitales chez la femme dans le tableau 4, en particulier parmi les miRs liés aux maladies urogénitales chez la femme dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant un trouble du système immunitaire, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux troubles du système immunitaire dans le tableau 4, en particulier parmi les miRs liés aux troubles du système immunitaire dans le tableau 6. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant un trouble musculo-squelettique, ledit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR choisi parmi les miRs liés aux troubles musculo-squelettiques dans le tableau 4, en particulier parmi les miRs liés aux troubles musculo-squelettiques dans le tableau 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant un trouble du métabolisme, ledit miR étant choisi parmi le hsa-miR- 103-1, le hsa-miR- 103-2 et le hsa-mir- 107, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 2547, 2549, 2551, 2553, 3921, 3923, 3925 et 3927.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une infection par le virus de l'hépatite C, ledit miR étant le hsa-miR-122, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 97, 99, 101, 103, 2561, 2563, 2565 et 2567.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie inflammatoire, ledit miR étant le hsa-miR-155, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 4433, 4435, 4437, 4439, 4441, 4443, 4445, 4447, 8377, 8379, 8381 et 8383.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit 5 miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une fibrose, ledit miR étant le hsa-miR-21, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 497, 499, 501, 503, 2793, 2795, 2797, 2799, 3425, 3427, 3429, 3431, 4937, 4939, 4941, 4943, 8545, 8547, 8549, 8551, 10801, 10803, 10805 et 10807.
10 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une athérosclérose ledit miR étant le hsa-miR-33, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 5609, 5611, 5613, 5615, 8673, 8675, 8677 et 8679.
15 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie cardiovasculaire, ledit miR étant choisi parmi le hsa-miR-15a et le has-miR-15b, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 4449, 4451, 4453, 4455, 4457, 4459, 4461, 4463, 4465, 4467, 4469 et 4471.
20
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie myéloproliférative, ledit miR étant le hsa-miR-451, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 1017, 1019, 1021, 1023, 3609, 3611, 3613, 3615, 6113, 6115, 6117 et 25 6119.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant liée à la néoangiogénèse, ledit miR étant choisi parmi le hsa-mir-92a-l, le hsa-mir-92a-2, et le hsa- 30 mir-92b, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 1777, 1779, 1781, 1783, 1785, 1787, 1789, 1791, 8033, 8035, 8037, 8039, 8041, 8043, 8045, 8047, 8049, 8051, 8053, 8055, 9225, 9227, 9229, 9231, 9233, 9235, 9237, 9239, 9241, 9243, 9245, 9247, 10345, 10347, 10349, 10351, 10353, 10355, 10357, 10359, 10361, 10363, 10365, 10367, 11489, 11491, 11493, 11495, 11497, 11499, 11501, 11503, 11505, 11507, 11509 et 11511. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant un trouble cardiaque, ledit miR étant choisi parmi le hsa-mir-208 et le hsa-mir-208b, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 4889, 4891, 4893, 4895, 4897, 4899, 4901, 4903, 5 4905, 4907, 4909, 4911, 4913, 4915, 4917 et 4919.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une fibrose pulmonaire, ledit miR étant le hsa-mir-208, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les 10 SEQ ID NO : 4889, 4891, 4893, 4895, 4897, 4899, 4901, 4903, 4905, 4905, 4907, 4909, 4911, 4913, 4915, 4917 et 4919.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant un cancer, ledit 15 miR étant le hsa-let-7, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 28, de 1225 à 1260, de 1561 à 1576, de 1865 à 1916, de 4065 à 4100, de 4645 à 4668, de 5197 à 5228.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit 20 miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une maladie cardiovasculaire, en particulier le syndrome d'ischémie-reperfusion, ledit miR étant le hsa- miR-7, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 3089, 3091, 3093, 3095, 3689, 3691, 3693, 3695, 7881, 7883, 7885, 7887, 7889, 7891, 7893, 7895, 7897, 7899, 7901, 7903, 9209, 9211, 9213, 9215, 11473, 11475, 11477 et 11479.
25
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une infection par le virus de l'hépatite C, ledit miR étant le hsa-mir-181c, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 321, 323, 325, 327, 2657, 2659, 2661, 2663, 4537, 4539, 4541, 30 4543, 8409, 8411, 8413, 8415, 9497, 9499, 9501 et 9503.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite pathologie étant une fibrose pulmonaire, ledit miR étant le hsa-miR-29, ledit miPEP étant de préférence choisi parmi les SEQ ID NO : 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 2905, 2907, 2909, 2911, 2913, 2915, 2917, 2919, 3529, 3531, 3533, 3535, 3537, 3539, 3541, 3543, 5281, 5283, 5285, 5287, 5289, 5291, 5293, 5295, 5297, 5299, 5301, 5303, 5305, 5307, 5309, 5311, 11657, 11659, 11661, 11663, 11665, 11667, 11669 et 11671.
5
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a-l (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a-16-.l 10 (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 145-2, consistant de 15 préférence en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//l 45-2 consistant en SEQ ID NO : 11 20 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 125a-l, consistant de 25 préférence en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 30 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant un fragment du miPEP 15 a- 16-1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 754.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP pour son utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKKRRQRRR),
le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRKKRRQRRR), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRFFYMH- YGRKKRRQRRR) .
Un autre aspect de l'invention a pour objet un procédé d'identification d'un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans une pathologie, le dit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire dudit miR,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis
- b) une étape de comparaison entre :
• l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR, en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et
• l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide, dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans une pathologie.
5
Un autre aspect de l'invention concerne également un miPEP de 101 à 500 acides aminés, ou un fragment dudit miPEP, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit micro ARN dans une cellule eucaryote.
10
En particulier, un miPEP peut avoir une taille de 200 à 500 acides aminés, de 300 à 500 acides aminés ou de 400 à 500 acides aminés,
En particulier, un miPEP peut avoir une taille de 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,
15 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204,
20 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299,
25 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394,
30 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500 acides aminés.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875, ou un fragment dudit miPEP.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a- 1 (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a-16-l (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment du miPEP 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment du miPEP 125a-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment du miPEP 15a-16- 1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment du miPEP//15a-16- 1 consistant en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, vectorisé ou encapsulé.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, fusionné à un peptide facilitant l'entrée dans la cellule du miPEP, ou du fragment de miPEP. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, fusionné avec le peptide TAT (YGRKKRRQPvRJR., SEQ ID NO : 11 754).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un fragment de miPEP, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKK RQRRR),
le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRKKRRQRR ), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRFFYMH- YGRKKRRQRRR) .
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, tel que défini ci-dessus, fusionné à la pénétratine, à un peptide polyhistidine (notamment un peptide d'au moins 6 résidus histidine) ou à un peptide polyarginine (notamment un peptide de 9 résidus arginine).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, tel que défini ci-dessus, lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant un miPEP ou un fragment dudit miPEP.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a-l (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a-16-l (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 125a-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 15a- 16-1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKKRRQRRR),
le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRK RQRRR), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRFFYMH- YGRKKRRQRRR).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition contient en plus des facteurs de croissance et/ou des facteurs de différenciation cellulaire.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition contient en plus du BMP4. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition contient en plus du milieu de culture cellulaire. Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP de 3 à 500 acides aminés codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote, pour favoriser la différenciation cellulaire des cellules. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour favoriser la différenciation cellulaire des cellules souches mésenchymateuses (également appelées cellules stromales de moelle osseuse ou cellules stromales mésenchymateuses).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour favoriser la différenciation cellulaire des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle les cellules sont cultivées en présence dudit miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle les cellules sont cultivées en présence dudit miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, et en présence de facteurs de croissance et/ou des facteurs de différenciation cellulaire.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle les cellules sont cultivées en présence dudit miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, et en présence de BMP4 {Bone Morphogenetic Protein 4).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a-l (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a-16-l (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 125a-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 15a-16-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRKKRRQR R), le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ NO : 11 756 (MSLCLSPSLT YGRKKRRQRRR), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ NO : 11 757 (MFKHRFFYMH YGRKKRRQRRR) .
Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour induire ou favoriser la formation osseuse.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour former une matrice osseuse minéralisée.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour favoriser la formation osseuse avec l'aide d'un biomatériau osseux.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle des cellules souches mésenchymateuses sont cultivées en présence dudit miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle les cellules souches mésenchymateuses sont cultivées en présence dudit miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, et en présence de facteurs de croissance et/ou des facteurs de différenciation cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle les cellules souches mésenchymateuses sont cultivées en présence dudit miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, et en présence de BMP4.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : le miPEP 145-2 (SEQ ID NO : 11 745), le miPEP 125a- 1 (SEQ ID NO : 11 747) et le miPEP 15a- 16-1 (SEQ ID NO : 11 749).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 145-2, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 125a-l, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 752.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est un fragment du miPEP 15a- 16-1, consistant de préférence en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci- dessus, dans laquelle ledit fragment de miPEP est choisi parmi :
le miPEP//145-2-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 755 (MVGLNPPLWQ- YGRK R QRRR),
le miPEP//125a-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 756 (MSLCLSPSLT- YGRKK RQPvRR), et
le miPEP//15a-16-l-TAT consistant en SEQ ID NO : 11 757 (MFKHRPFYMH- YGRKKRRQRRR) .
Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation in vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour induire ou favoriser la formation osseuse.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation in vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour former une matrice osseuse minéralisée.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation in vivo d'un miPEP, ou d'un fragment dudit miPEP, pour favoriser la formation osseuse avec l'aide d'un biomatériau osseux.
Un autre aspect de l'invention a pour objet un acide nucléique codant un miPEP tel que défini ci-dessus, ou un fragment dudit miPEP. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un acide nucléique tel que défini ci-dessus, ledit acide nucléique étant choisi parmi le groupe consistant en SEQ ID NO : 2q, q variant de 1 à 5 875.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP choisi parmi le groupe consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875, ou un fragment dudit miPEP.
Un tel anticorps peut être obtenu à partir d'un procédé connu de l'homme du métier, comme par exemple en injectant ledit miPEP à un animal non humain pour déclencher une réaction d'immunisation et la production d'anticorps par ledit animal.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation comme médicament. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP choisi parmi le groupe consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875, ou un fragment dudit miPEP, pour son utilisation comme médicament. Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP, ou un fragment dudit miPEP, pour l'immunomarquage dudit miPEP ou d'un fragment dudit miPEP. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit anticorps reconnaît spécifiquement un miPEP choisi parmi le groupe consistant en SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 1 à 5 875, ou un fragment dudit miPEP. Selon un mode particulier, l'invention a pour objet un miPEP de 3 à 500 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote,
pour son utilisation comme médicament dans le traitement de troubles
musculo-squelettique, ou de maladie ou de traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit transcrit primaire d'un miR étant choisi parmi le groupe consistant en : let-7b, let-7g, miR- 15a, miR16-l, miR106a, miRlOa, miRlOb, miR1246, miR125a-l, miR132, miR134, miR142, miR145, miR145-2, miR146a, miR150, miR155, miR181c, miR182, miR183, miR184, miR18b, miR192, miR195, miR200a, miR202, miR203, miR205, miR206, miR20b, miR21, miR210, miR27a, miR29a, miR29c, miR30b, miR345, miR377, miR409, miR495, miR520h, miR542, miR572, miR648, miR96 et miR99b ;
de préférence parmi le groupe consistant en : miR15a, miR16-l, miR125a-l et
miR145-2. Selon un autre mode particulier, l'invention a pour objet un miPEP tel que décrit ci-dessus ayant notamment une taille de 3 à 50 acides aminés, de 50 à 100 acides aminés, de 100 à 500 acides aminés, de 101 à 500 acides aminés, 200 à 500 acides aminés, de 300 à 500 acides aminés, de 400 à 500 acides aminés, de 100 à 200 acides aminés, de 200 à 300 acides aminés ou de 300 à 400 acides aminés.
Selon un autre mode particulier, l'invention a pour objet un miPEP, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant identifié, ou tel qu'identifié, par la mise en œuvre d'un procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, comprenant :
a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis
b) une étape de comparaison entre :
i. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et
ii. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux. Selon un autre mode particulier, l'invention a pour objet un miPEP, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q- 1 ,
q variant
de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 5 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 10 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745,
SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749.
15 Selon un autre mode particulier, l'invention a pour objet un miPEP, ou fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus pour son utilisation dans le traitement d'un ou plusieurs troubles musculo-squelettique, ou maladies ou traumatismes du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, choisies parmi le groupe comprenant :
l'arthrite, la craniosynostosis, la dysplasia fibreuse, l'exostoses héréditaires multiples, les 0 fentes palatines, la fibrodysplasia ossificans progressiva, le fibrome non-ossifiant, la fracture osseuse, l'hyperostosis, l'hyperostosis cortical infantile, l'hyperostosis porotique, l'hyperparathyroidisme, l'hypophosphatasia, la maladie de Kienbôck, la maladie de Kôhler- Mouchet, la maladie de Paget, la maladie de Panner, la maladie de Scheuermann, la maladie d'Osgood-Schlatter ou ostéochondrose tibiale, la melorheostosis, le myelome multiple, 5 l'ostéite, l'osteitis condensas, l'osteitis fibrosa cystica ou osteitis fibrosa ou la maladie de Von Recklinghausen, l'ostéoarthrite, l'ostéochondrite déformante de la hanche, l'ostéochondrite disséquante, l'osteochondroma, l'ostéogénèse imparfaite ou maladie des os de verre, l'ostéolyse, l'osteomalacia, l'osteomyelitis, l'ostéopenie, l'ostéopétrose, l'ostéophyte, l'ostéoporose, l'osteosclerosis, la pseudarthrose, la pseudarthrose (ou non consolidation ou 30 consolidation retardée), la pycnodysostosis, le syndrome Coffin-Lowry, le syndrome Hajdu- Cheney, le syndrome Klippel-Feil, les tumeur à cellules géantes et la tumeur osseuse.
Selon un autre mode particulier, l'invention miPEP, ou fragment dudit miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l,
q variant de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 5 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de
10 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à
15 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de
20 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745,
25 SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749.
Selon un autre mode particulier, l'invention a pour objet un fragment de miPEP pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751,
30 le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752, et
le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753.
Selon un autre mode particulier, l'invention concerne un miPEP, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné ou lié à une ou plusieurs molécules facilitant l'entrée du miPEP ou du fragment de miPEP dans la cellule,
ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant de préférence fusionné en N-ter ou en C-ter avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO : 11 754).
5
Selon un autre mode particulier, l'invention concerne un miPEP choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de
10 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à
15 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de
20 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à
25 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745,
30 SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749,
ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant notamment fusionné avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO : 11 754), fusionné à la pénétratine, fusionné à un peptide polyhistidine, fusionné à un peptide polyarginine, ou lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique. Selon un autre mode particulier, l'invention a pour objet un acide nucléique codant l'un des miPEP choisis parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q, q variant de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 5 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de
10 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à
15 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de
20 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ; de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 746, SEQ ID NO : 11
25 748 et SEQ ID NO : 11 750.
Par ailleurs, l'invention concerne également un procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, le dit miPEP étant codé 30 par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, comprenant :
a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis
b) une étape de comparaison entre : i. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant 5 présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et
ii. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide,
10 dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatismes du tissu osseux ou du tissu cartilagineux.
15
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation in vitro, in vivo ou ex vivo d'un miPEP ou fragment dudit miPEP,
ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l, q variant
20 de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à
25 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de
30 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745,
SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749,
pour favoriser l'ostéogénèse des cellules, en particulier les cellules souches mésenchymateuses.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un miPEP ou fragment dudit miPEP telle que définie ci-dessus, en association avec un ou des additifs,
lesdits additifs étant choisis parmi le groupe consistant en : les cytokines comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et/ou le dexaméthasone.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne une utilisation d'un miPEP ou fragment dudit miPEP telle que définie ci-dessus, en association avec un biomatériau,
ledit biomatériau étant choisi parmi le tableau suivant :
a) les polymères naturels b) les polymères synthétiques c) verres bioactifs
- gélatine/chitooligosaccharide, poly(lactide-co-glycolide) [PLGA] , - 45S5 Bioglass (marque déposée par
- collagène, poly(s-caprolactone) [PCL] ou l'Université de Floride),
- chitosan, poly(hydroxymethylglycolide-co-8- - CaMgSi206,
- chitosan/collagène beta-glycérop osphate caprolactone) [pHMGCL], - 45 S5 bioactive glass® (marque déposée par (β-GP), PLGA-poly(oxyde d'éthylène) (PEO) l'Université de Floride),
- fibroïnes de soie, [= PLGA-PEO], - 45 S bioactive glass®,
- alginate/ciment à base de phosphate de poly(L-lactide-co-s-caprolactone)/poly(L- - bioactive glass® (BG20),
calcium (CPC) [= alginate/CPC] lactide-co-1 ,5-dioxepan-2-one) [poly(LLA- - bioglass®, ou
- alginate, co-CL)/poly(LLA-co-DXO)], - bioactive glass® (13-93)
- acide hyaluronique, poly[(ethylglycinato)(p-methylphenoxy)
- RAD16-I BD™ (PuraMatrix™ , marque phosphazene]/PLGA [= PPHOS/PLGA],
déposée par 3-D Matrix, Ltd.), ou PCL/poly(diisopropyl fumarate) (PDIPF) [=
- chitosan/peptide 'Arginine-Glycine-Acide PCL/PDIPF],
aspartique' (RGD) poly(ester amide)-g-TA [PEA-g-TA],
[= chitosan/peptide RGD] PLGA-poly(éthylène glycol-acide
aspartique (PEG-ASP)
[= PLGA-(PEG-ASP)],
poly(ethylene oxide
terephthalate)/poly(butylene terephthalate)
[PEOT/PBT], ou
poly (hydroxyethyl methacrylate)
[poly-HEMA]
d) phosphates de calcium le corail les métaux
CPC, Porites sp. , - NiTi/Ti,
hydroxyapatite [HA] corail Goniopora, - feuilles de fibres de titane (Ti), β-tricalcium phosphate [βΊ Ρ] corail hydroxyapatite, - fil de titane,
HA/ PTCP, coralline en forme de condyle, - Ti,
calcium Aluminate/mélatonine, ou Porites lutea, - Ti02,
CPC Bioglass® Porites acropora, ou - alliage de TieT-^Sn,
matrices de corail naturel - alliage Magnésium W4 (MgY4),
- alliage Fer-manganèse
g) les composites polymère/céramique h) les composites métal/céramique
Nano-apatite/PCL, polyNaSS/Ti,
PLGA-PCL-Phosphate de calcium acide polylactique sous forme
[= PLGA-PCL-CP], cristaline/PLGA/Ti [= PLLA/PLGA/Ti],
PEOT/PBT-CP, polyNaSS/Ti,
Collagène-CPC, acide NaSS/méthacrylique,
PCL-TCP, alliage MA/Ti6Al4V,
Chitosan-CPC, polyNaSS/Ti,
Phosphate de magnésium-PCL, Si02/CaO/Na20/MgO/B203,
PLGA-PTCP, Niobium/fluorapatite,
Tableau 1. Liste des biomatériaux possibles pour mettre en œuvre l'invention.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un miPEP ou fragment dudit miPEP telle que définie ci-dessus, en association avec un ou des additifs, lesdits additifs étant choisis parmi le groupe consistant en : les cytokines comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et/ou le dexaméthasone ;
et en association avec un biomatériau, ledit biomatériau étant choisi parmi le groupe présenté dans le tabelau 1 (cf. 41-43).
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un fragment de miPEP de séquence SEQ ID NO : 11 752 pour favoriser l'ostéogénèse des cellules souches mésenchymateuses en association avec un biomatériau, ledit biomatériau étant Ι'ΗΑ/β-TCP dans un ratio de 20/80.
Un autre des aspects de l'invention est qu'elle a pour objet des cellules ostéo-induites par un ou plusieurs miPEP ou fragment desdits miPEP telle que défini précédemment, lesdites cellules étant en particulier des cellules souches mésenchymateuses.
Un autre des aspects de l'invention est qu'elle a pour objet des cellules comprenant un acide nucléique codant l'un ou plusieurs des miPEP telle que défini précédement, l'expression dudit acide nucléique étant inductible ou non, lesdites cellules étant en particulier des cellules souches mésenchymateuses.
Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un biomatériau composite comprenant des cellules ostéo-induites telles que définies précédemment ou des cellules telles que définies précédemment,
en association ou non avec un ou des additifs, lesdits additifs étant choisis parmi le groupe consistant en : les cytokines comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et/ou le dexaméthasone,
ledit biomatériau étant choisi parmi le groupe présenté dans le tabelau 1 (cf. 41-43). Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet un biomatériau composite comprenant des cellules souches mésenchymateuses ostéo-induites par un fragment de miPEP de séquence SEQ ID NO : 11 752, ledit biomatériau étant ΓΗΑ/β-TCP dans un ratio de 20/80.
Tableau 2. MiRs impliqués dans le cancer, les infections bactériennes ou mycoses, les maladies cardiovasculaires, les maladies congénitales héréditaires, les maladies de la peau et les maladies des yeux
Tableau 3. MiRs impliqués dans les maladies du système digestif, les maladies du système endocrinien, les maladies du système nerveux, les maladies liées à des virus, les maladies liées à la nutrition et au métabolisme et les maladies lymphatiques et hémopathies
Tableau 4. MiRs impliqués dans les maladies néonatales et héréditaires, les maladies respiratoires, les maladies urogénitales chez l'homme, les maladies urogénitales chez la femme, les troubles du système immunitaire et les troubles musculo-squelettiques
Tableau 5. Les 10 principaux miRs impliqués dans les cancers, les infections bactériennes et mycoses, les troubles du système immunitaire, les maladies cardiovasculaires, les maladies congénitales héréditaires, les maladies de la peau, les troubles musculo-squelettiques, les maladies des yeux et les maladies du système digestif.
Tableau 6. Les 10 principaux miRs impliqués dans les maladies du système endocrinien, les maladies du système nerveux, les maladies liées à des virus, les maladies liées à la nutrition et au métabolisme, les maladies lymphatiques et hémopathies, les maladies néonatales et héréditaires, les maladies respiratoires, les maladies urogénitales chez l'homme, les maladies urogénitales chez la femme.
Les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en limiter sa portée. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : Liste indiquant les miPEPs et les miORFs correspondants, ainsi que les miRs associés- Figure 2 : Expression du gène iBSP chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu DIF + BMP4 en présence du miPEP//125a-l.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//125a-l, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène iBSP. Les analyses, statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** p<0.01 et *** pO.001). Figure 3 : Expression du gène PTHR1 chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu DIF + BMP4 en présence du miPEP//125a-l .
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//125a-l, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène PTHR1. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** pO.01 et *** pO.001).
Figure 4 : Expression du gène STMN2 chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu DIF + BMP4 en présence du miPEP//125a-l.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//125a-l, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène STMN2. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** p<0.01 et *** pO.001).
Figure 5 : Expression du gène OSTERIX chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu DIF + BMP4 en présence du miPEP//125a-l.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//125a-l, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène OSTERIX. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** pO.01 et *** p<0.001). Figure 6 : Expression du Rêne STMN2 chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu PIF + BMP4 en présence du miPEP//145-2.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//145-2, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène STMN2. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** p<0.01 et *** pO.001).
Figure 7 : Expression du Rêne STMN2 chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu PIF A BMP4 en présence du miPEP//125a-l .
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//125a-l, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène STMN2. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** p<0.01 et *** pO.001). FÏRure 8 : Expression du Rêne OSTERJX chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu PIF A BMP4 en présence du miPEP//125a-l.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//125a-l, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène OSTERIX, Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** p<0.01 et *** pO.001).
Figure 9 : Expression du gène STMN2 chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu PIF A BMP4 en présence du miPEP//145-2.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//145-2, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène STMN2. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** p<0.01 et *** pO.001).
Figure 10 : Expression du gène OSTERIX chez les cellules souches mésenchymateuses dans le milieu PIF A BMP4 en présence du miPEP//145-2.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//145-2, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène OSTERIX. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** pO.01 et *** p<0.001). Figure 11 : Expression du Rêne STMN2 chez les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le milieu PROLIF en présence du miPEP//145-2.
Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées pendant 4 jours avec 100 μΜ de miPEP//145-2, avec 100 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//125a) ou non traitées (NT). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du gène STMN2. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** pO.01 et *** p<0.001).
Figure 12 : Entrée du miPEP//15a-16-FAM dans des cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses non différenciées ont été traitées pendant 6 heures avec le miPEP//15a-16-l-l-FAM à 5 μΜ (A), 10 μΜ (B), 50 μΜ (C) ou 100 μΜ (D).
Figure 13 : Entrée du miPEP//15a-16-FAM dans des cellules souches mésenchymateuses. Les cellules souches mésenchymateuses non différenciées ont été traitées avec 100 μΜ de miPEP//15a-16-l-l-FAM pendant 2 heures (A), 4 heures (B), 6 heures (C), 8 heures (D) et 24 heures (E).
Figure 14 : Entrée du miPEP//15a-16-FAM-TAT dans des cellules souches mésenchymateuses.
Les cellules souches mésenchymateuses non différenciées ont été traitées pendant 6 heures avec le miPEP//15a-16-l-l-FAM-TAT à 5 μΜ (A), 10 μΜ (B), 20 μΜ (C), 50 μΜ (D) ou 100 μΜ (E).
Figure 15 : Entrée du miPEP//15a-16-FAM-TAT dans des cellules souches mésenchymateuses.
Les cellules souches mésenchymateuses non différenciées ont été traitées pendant 2 heures avec le miPEP//l 5a- 16- 1 - 1 -FAM-TAT à 10 μΜ.
Figure 16 : Accumulation du miR16-l précurseur en présence du miPEP//15a-16-l-TAT. Les cellules souches mésenchymateuses ont été traitées avec 10 μΜ de miPEP//15a-16-l- TAT, traitées avec 10 μΜ de peptide contrôle (ScmiPEP//21-l) ou non traitées (NT) pendant 3 heures. La quantité de miR16-l précurseur dans les cellules a été mesurée par RT-PCR quantitative. La mesure de la quantité de miR16-l précurseur a été normalisée par rapport au gène de ménage PPIA. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test Mann-Withney (p-value : * p<0.05 ; ** pO.Ol et *** pO.001).
Figure 17 : Evaluation des effets du miPEP125a-l sur la formation osseuse in vivo.
Les souris Nude ont été greffées avec
A. le biomatériel seul,
B. les cellules souches mésenchymateuses mélangées au biomatériel (granules de PTCP
[20/80]),
C. & D. les cellules souches mésenchymateuses pré-traitées 4 jours avec le miPEP//125a-l mélangées au biomatériel (granules de pTCP [20/80]),
E. & F. les cellules souches mésenchymateuses pré-traitées 4 jours avec le miPEP conrôle (scramble) mélangées au biomatériel (granules de βΊ Ρ [20/80]).
Pour les conditions D. et F. les souris ont également reçu des injections régulières (1 fois par semaine) soit du miPEP//125a-l (D) soit du miPEP scramble (F) au cours de l'étude. Après 4 semaines, les souris sont euthanasiées et les greffons ont alors été isolés, fixés, inclus en méthacrylate, coupés puis traités pour de l'histologie. Les coupes ont été scannées (NDPview) et la formation osseuse (gris foncé) est évaluée (A à F) et est également quantifiée (G) grâce à l'utilisation du logiciel d'analyse d'image Fiji et la surface totale d'os néoformé est rapportée à la surface totale de la coupe.
S' agissant des photographies microscopiques 17A à 17F, l'échelle est indiquée sur la figure. Pour ce qui est de la figure 17G, l'axe des ordonnées indique le pourcentage de formation osseuse et les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t-test apparié (p-value : * p<0.05 ; ** pO.01 et *** pO.001). EXEMPLES
EXEMPLE 1 : miPEP 125a-l et miPEP 145-2
Une analyse transcriptomique réalisée par les Inventeurs a révélé que les miR 125a-l et miR 145-2 sont surexprimés lors de la différenciation des cellules en ostéoblastes (résultats non publiés).
Les séquences des miPEPs 125a-l et 145-2 ont été identifiées à partir des transcrits primaires des miRs 125a-l et 145-2.
Les effets respectifs du miPEP 125a-l et du miPEP 145-2 sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses ont été analysés en mesurant l'expression des gènes iBSP, PTHR1, STMN2 et OSTERIX qui correspondent à des marqueurs de l'ostéogénèse et de la différenciation en ostéoblastes (Chiellini et al, Biochem Biophys Res Commun, 374(l):64-8, 2008 ; Cordonnier et al, Tissue Eng, 17(3): 249-259, 2011).
Les expériences ont été réalisées avec deux fragments de 10 acides aminés correspondant respectivement à la partie N-terminale du miPEP 125a-l (= fragment miPEP//125a-l) et à la partie N-terminale du miPEP 145-2 (= fragment miPEP//145-2).
Les cellules souches mésenschymateuses issues de 4 donneurs différents ont été mises en culture pendant 24H dans du milieu PROLIF (aMEM+10%SVF) avec ou sans miPEP// puis pendant 3 jours dans du milieu DIF + BMP4 (aMEM + 2% SVF + b-Glycérophosphate + Acide ascorbique + BMP4), du milieu DIF ΔΒΜΡ4 (aMEM + 2% SVF + b- Glycérophosphate + Acide ascorbique) ou du milieu PROLIF (aMEM + 10% SVF), avec ou sans miPEP//.
L'expression des gènes iBSP, PTHR1, STMN2 et OSTERIX a ensuite été mesurée dans les cellules souches mésenchymateuses cultivées en présence ou non d'un miPEP*.
1.1 - Résultats
Dans le milieu DIF + BMP4
Le miPEP//125a-l augmente l'expression des gènes WSP, PTHR1, STMN2 et OSTERIX (Figures 2, 3, 4 et 5).
Le miPEP//145-2 augmente l'expression du gène STMN2 (Figure 6).
Dans le milieu DIF ΔΒΜΡ4
Le miPEP//125a-l augmente l'expression des gènes STMN2 et OSTERIX (Figures 7 et 8). Le miPEP//145-2 augmente l'expression des gènes STMN2 et OSTERIX (Figures 9 et 10).
Dans le milieu PROLIF
Le miPEP//145-2 augmente l'expression du gène STMN2 (Figure 11).
Les résultats ci-dessus montrent que le miPEP//125a-l et le miPEP//145-2 augmentent l'expression de gènes marqueurs des ostéoblastes, ce qui indique que ces miPEPs favorisent la différenciation ostéoblastique des cellules souches mésenchymateuses. 1.2 - Matériels
- ΜΕΜα GIBCO (référence 22561-021) => "αΜΕΜ",
- Fetal bovine sérum (FBS),
- Pénicilline/streptomycine GIBCO (référence 15140-122) => "P/S ",
- Dulbecco's PBS GIBCO (référence 14190-169) = "PBS",
- Plaque 12 puits,
- pglycérophosphate SIGMA (référence G9422)
- Acide ascorbique SIGMA (référence A8960)
- BMP4 PEPROTECH (référence 120-05ET) = "BMP4",
- miPEP//125a-l (MSLCLSPSLT, SEQ ID NO : 1 1 752),
- miPEP//145-2 (MVGLNPPLWQ, SEQ ID NO : 1 1 751),
- Peptide contrôle "scramble" ScmiPEP//125a (IQVGHEDETD, SEQ ID NO : 1 1 758).
1.3 - Méthodes
a. Composition des milieux de culture
- Milieu de prolifération (PROLIF) : aMEM + 10% FBS + 1% P/S
- Milieu de différenciation + BMP4 (DIF + BMP4) : aMEM + 2% FBS + 1% P/S + glycérophosphate (l OmM) + Acide ascorbique (50 μΜ) + BMP4 (50ng/ml)
- Milieu de différenciation sans BMP4 (DIF ΔΒΜΡ4) : aMEM + 2% FBS + 1% P/S + glycérophosphate (lOmM) + Acide ascorbique (50 μΜ) b. Resuspension des micropeptides
Le miPEP//145-2 a été synthétisé par Smartbioscience et dissout à 2mM dans de l'eau. Le miPEP//125a-l a été synthétisé par Smartbioscience et dissout dans de l'eau + 0.1 % d'ammonium.
f c. Ensemencement des cellules
Les cellules souches mésenchymateuses ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à raison de 70 000 cellules / puits sous 1ml de milieu de PROLIF. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 72h à 37°C en atmosphère humide avec 5% de C02. d. Traitement des cellules avec les miPEPs
Après 72h d'incubation, les cellules ont été pré-traitées avec 100 μΜ de miPEP ou de peptide "scramble" dilués dans du milieu de PROLIF, puis incubées à 37°C pendant 24h. En parallèle, des cellules traitées avec du milieu de PROLIF +/- eau ou eau + 0.1% d'ammonium ont été 5 utilisées comme témoin négatif.
Pendant 3 jours, les cellules ont été traitées toutes les 24h avec 100 μΜ de miPEP dilués soit dans du milieu DIF+BMP4, soit dans du milieu DIF ΔΒΜΡ4, soit dans du milieu PROLIF. Des cellules non traitées ou traitées avec de l'eau ou de l'eau + 0.1% d'ammonium ont été utilisées comme témoins. Les cellules sont incubées à 37°C.
10 A l'issue des 3 jours de traitement, les surnageants de culture ont été enlevés, les tapis cellulaires ont été lavés 1 fois avec du PBS, puis les plaques ont été congelées à -80°C jusqu'à l'extraction des ARNs totaux. e. Extraction des ARN totaux
15 Les ARNs totaux ont été extraits selon les recommandations du fournisseur avec le kit miRNeasy microkit (Qiagen). f. Réaction de reverse transcription
Les ARNs ont été reverse transcrits avec le kit High Capacity cDNA reverse transcription 20 (Applied Biosystem). 600ng d'ARN ont été ajoutés à 2μ1 de tampon RT (10X), 2μ1 de Random primer (10X), 0.8μ1 de dNTPs (25X), 0.5μ1 de RNAse OUT (401Γ/μ1) et Ιμΐ de multiscribe reverse transcriptase (501Ι/μ1) dans un volume total de 20μ1. La réaction de transcription inverse a été effectuée à 25°C pendant 10 min, puis 42°C pendant 2h. L'activité de l'enzyme a été stoppée par l'incubation du mélange à 85°C pendant 5 min.
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g. Evaluation de l'expression génique par RT-PCR quantitative
L'expression des facteurs de transcription ostéoblastiques ŒSP, PTHR1, STMN2 et OSTERJX a été évaluée par RT-PCR quantitative avec le kit SsoFast EvagGreen. Pour la réaction de RT- PCR, 3 μΐ de reverse transcriptase dilués au 1/8 ont été ajoutés à IX de SsoFast EvaGreen, 30 10μΜ de chaque amorce et de l'eau sans RNase dans un volume final de ΙΟμΙ. La réaction a été soumise aux températures suivantes : 3 min de pré-amplification à 95°C, 40 cycles de 10" à 95°C et 30" à 60°C dans un thermocycleur (CFX96 Real-time PCR détection system, Biorad). PPIA a été utilisé comme gène de référence pour normaliser la RT-PCR quantitative. Pour l'ensemble des réactions PCR, deux réplicats ont été utilisés pour chaque échantillon biologique.
Tableau 7. Séquences des amorces.
EXEMPLE 2 : Pénétration cellulaire des miPEPs
L'entrée des miPEPs dans les cellules souches mésenchymateuses (CSM) a été analysée par microscopie à fluorescence en utilisant le miPEP//15a-16-l marqué à la fluoresceine (FAM), fusionné ou non à un peptide favorisant la pénétration cellulaire (peptide TAT).
2.1 - Résultats
Dans une première expérience, les CSM non différenciées ont été incubées pendant 7h avec 5μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ ou 100 μΜ de miPEP//15a-16-l-FAM (Figure 12).
Dans une seconde expérience, les CSM non différenciées ont été incubées avec 100 μΜ de miPEP//15a-16-l-FAM pendant 2h, 4h, 6h, 8h ou 24h (Figure 13).
Dans une troisième expérience, les CSM non différenciées ont été incubées pendant 7h avec 5μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 50 μΜ ou 100 μΜ de miPEP//15a-16-l-FAM-TAT (Figures 14).
Dans une quatrième expérience, les CSM non différenciées ont été incubées pendant 2h, avec 10 μΜ de miPEP//15a-16-l-FAM-TAT (Figure 15).
Les résultats ci-dessus indiquent d'une part, que le miPEP//15a-16-l-FAM pénètre de manière homogène les CSM quand les CSMs son traitées avec au moins 50μΜ de miPEP, et d'autre part, que le miPEP est capté dans le noyau des CSM.
La fluorescence la plus forte est observée de 4H à 8H après le traitement avec le miPEP. Ces résultats indiquent également que l'ajout du peptide TAT sur le miPEP favorise la pénétration cellulaire d'un facteur 10 par rapport à la pénétration cellulaire du miPEP sans le peptide TAT. 2.2 - Matériel
- MEMcc GIBCO (référence 22561-021) => " MEM",
- Fetal bovine sérum (FBS),
- Pénicilline/streptomycine GIBCO (référence 15140-122) => "P/S",
- Dulbecco's PBS GIBCO (référence 14190-169) => "PBS",
- Lame IBIDI 8 puits (^ slide 8 well IBIDi ; Biovalley),
- DRAQ5 (5mM) Biostatus,
- Formaldéhyde solution 37% ,
- miPEP//15a-16-l (MFKHRFFYMH, SEQ ID NO : 11 753),
- miPEP//15a-16-l-TAT (MFKHRFFYMH- YGRKK RQR , SEQ ID NO : 11 757).
2.3 - Méthodes
Les CSM non différenciées sont incubées dans du milieu aMEM+10% FBS+1% P/S en présence du miPEP marqué à fluoresceine (FAM). Après 2H àlOH d'incubation, les puits sont lavés 3 fois avec du PBS puis les cellules sont fixées pendant 5 min avec formarndéhyde à 3,8%). Les noyaux sont marqués avec le Draq5 dilué au 1/1000. Les cellules sont ensuite observées au microscope confocal en fluorescence.
EXEMPLE 3 : miPEP 15a- 16-1
Une analyse transcriptomique réalisée par les Inventeurs a révélé que les miR 15a et miR 16-1 sont surexprimés lors de la différenciation des cellules en ostéoblastes (résultats non publiés). La séquence du miPEP 15a-16-l a été identifiée à partir du transcrit primaire 15a-16-l.
L'effet du miPEP 15a-16-l sur l'accumulation du miR16-l a été analysé dans les cellules souches mésenchymateuses (CSM). Les expériences ont été réalisées avec un fragment de 10 acides aminés correspondant respectivement à la partie N-terminale du miPEP 15a- 16-1 (= fragment miPEP//15a-16-l).
Les CSM issues de trois patients différents ont été traitées avec 10 μΜ de miPEP//15a-16-l fusionné au peptide TAT (miPEP//15a-16-l-TAT) pendant 3h, puis la quantité de miR16-l a été mesurée par RT-qPCR. 3.1 - Résultats
Le traitement avec le miPEP//15a-16-l-TAT entraîne une augmentation de la quantité de miR 16-1 (Figure 16). 3.2 - Matériels
- MEMa GIBCO (référence 22561-021) = "aMEM",
- Fetal bovine sérum (FBS),
- Pénicilline/streptomycine GIBCO (référence 15140-122) => "P/S",
- Dulbecco's PBS GIBCO (référence 14190-169) => "PBS",
- miPEP//15a-16-l-TAT (MFKHRFFYMH-YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO : 11 757).
- ScmiPEP//21 (RPHLRMELPV)
3.3 - Méthodes a. Resuspension des micropeptides
Les peptides ont été synthétisés par Smartbioscience et dissouts à 2mM dans de l'eau. b. Ensemencement des cellules
Les CSMs ont été ensemencées dans des puits de plaques 12 puits à raison de 72900 cellules par puits sous 1ml de milieu de PROLIF. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 72h à 37°C en atmosphère humide avec 5% de C02. c. Traitement des cellules avec les miPEPs
Après 24h d'incubation, les cellules ont été traitées avec 10 μΜ de miPEP//15a-16-l-TAT ou ΙΟΟμΜ de ScmiPEP21 dilués dans du milieu de PROLIF puis incubées à 37°C pendant lh, 2h, 3h, 4h et 6h. En parallèle, des cellules traitées avec du milieu de PROLIF +/- eau ont été utilisées comme témoin négatif.
Après lh à 6h de traitement, les surnageants de culture ont été enlevés puis les tapis cellulaires ont été lavés 2 fois avec du BPS, puis les plaques ont été congelées à -80°C jusqu'à l'extraction des miRNA. d. Extraction des AR totaux
Les miRNA ont été extraits selon les recommandations du fournisseur avec le kit miRNeasy microkit (Qiagen). e. Réaction de reverse transcription
Les ARNs ont été reverse transcrits avec le kit High Capacity cDNA reverse transcription (Applied Biosystem). 400ng d'ARN ont été ajoutés à 2μ1 de tampon RT (10X), 2μ1 de Random primer (10X), 0.8μ1 de dNTPs (25X), 0.5μ1 de RNAse OUT (40υ/μ1) et Ι μΐ de multiscribe reverse transcriptase (50υ/μ1) dans un volume total de 20μ1. La réaction de transcription s'effectue à 25°C pendant 10 min puis 42°C pendant 2h. L'activité de l'enzyme est stoppée par l'incubation du mélange à 85°C pendant 5 min. f. Quantification des miRNA précurseurs par RT-PCR quantitative
La quantité de miRNA précurseur dans les cellules traitées ou non avec les miPEP a été évaluée par RT-PCR quantitative avec le kit SsoFast EvagGreen. Pour réaliser la réaction de RT-PCR, 3 μΐ de reverse transcriptase dilués au 1/5 sont ajoutés à IX de SsoFast EvaGreen, ΙΟμΜ de chaque amorce et de l'eau RNase free dans un volume final de 10 μΐ. La réaction est soumise aux températures suivantes : 3 min de pre-amplification à 95°C, 40 cycles de 10" à 95°C et 30" à 60°C dans un thermocycleur (CFX96 Real-time PCR détection System, Biorad). PPIA est utilisé comme gène de référence pour normaliser la RT-PCR quantitative.
Pour l'ensemble desréactions PCR, chaque échantillon biologique a deux réplicats techniques.
Tableau 8. Séquences des amorces. EXEMPLE 4 : Immunomarquage des miPEPs
La production d'anticorps polyclonaux reconnaissant spécifiquement les miPEP 125a, miPEP145 et miPEP15a-16-l est faite chez la souris ou le lapin. Les animaux sont traités par injections répétées de miPEP déclenchant la production d'anticorps anti miPEP.
Des cellules souches mésenchymateuses issues de 6 donneurs différents sont mises en culture pendant 7 jours soit dans du milieu de prolifération (aMEM+10%SVF), soit dans du milieu de différenciation (aMEM + 2% SVF + b-Glycérophosphate + Acide ascorbique + BMP4). La présence de miPEP est ensuite recherchée dans les cellules par des immunomarquages avec les anticorps polyclonaux anti-miPEP125a, anti-miPEP145 et anti-miPEP 15a- 16-1. Les cellules sont incubées de 1H à 12H avec lesanticorps primaires. Elles sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS 0.1% BSA puis traitées par ajout d'anticorps secondaires anti-espèce (antisouris ou anti-lapin) conjugués à une sonde fluorescente. La lecture est faite sous microscope à épifluorescence. EXEMPLE 5 : Formation de tissu osseux in vivo par implantation en sous cutané chez la souris Nude
Tous les expériences sont faites sur les animaux en accord avec la directive 2010/63/UE et après validation des protocoles par le comité éthique animal (Toulouse). Un total de 6 à 8 souris est utilisé par groupe. Les cellules cultivées sont ostéo-induites à l'aide des miPEPs, puis mises en suspension pendant 1 à 2h dans le milieu de culture contenant également des granules de biomatériau selon le rapport de 2x106 cellules / 50mg de biomatériau. Ce biomatériau est du phosphate de calcium inorganique biphasique (BCP) composé d'hydroxyapatite (HA) et de beta-tricalcique phosphate (β-TCP) dans un ratio de 20/80, de taille compris entre 0,5 à 1 mm (vendu par Biomatlante, Vigneux de Bretagne, France). La porosité de ce biomatériau (%vol) était de 75 +/- 5% de pores dont 70% de 0 à ΙΟμιη, 20% de 10 à ΙΟΟμη et 10% de 100 à 300μηι. Le biomatériau est stérilisé à l'autoclave.
Les souris Nude femelles (RjOrl : NMRI-Foxnnul/Foxnlnu) (Laboratoires Janvier, Saint- Berthevin, France) sont anesthésiées de façon générale par inhalation d'isoflurane. Le biomatériau seul est implanté comme contrôle négatif. Deux implants (cellules + biomatériaux) sont placés dans le dos des souris en sous-cutané de chaque côté de la colonne vertébrale (une souris peut contenir différents types d'implants). Après 8 semaines, les animaux traités sont sacrifiés. Les implants sont ensuite prélevés et fixés dans une solution de formol 4% tamponnée. EXEMPLE 6 : Fibrose pulmonaire
Le miR-29 en tant que cible thérapeutique
Le bénéfice thérapeutique de l'augmentation du niveau de mir-29 a été démontré pour des fibroses au niveau du cœur, du rein, du foie, du poumon et dans un contexte de sclérose systémique. La capacité d'un analogue de miR-29b à cibler directement l'expression de Collagenlal {Collai), dont la dérégulation est impliquée dans le mécanisme de fibrose, a été démontrée. Ainsi, une quantité croissante de cet analogue entraine une baisse dose- dépendante de l'expression de Collai dans un modèle cellulaire (Montgomery et al., MicroRNA mimicry blocks pulmonary fibrosis, EMBO Mol. Med. (2014), 6(10); 1347- 1356).
Mise en évidence de l'effet thérapeutique d'un miPEP codé par le transcript primaire du mir29
Des cellules NIH 3T3 (lignée cellulaire de fibroblaste de souris) sont cultivées sur milieu DMEM, complémenté avec de la 1-Glutamine (4 mM), du Pyruvate de Sodium (1 mM) et une solution de BCS à 10% BCS. Les cellules sont transfectées avec du Dharmafect I selon les recommandations du revendeur, puis par des quantités croissantes d'un miPEP codé par le transcrit primaire du miR-29. Les cellules sont collectées 48h après la transfection et l'expression de Collai est mesurée par qPCR.
EXEMPLE 7 : Cancer du poumon (Non-Small Cell Lung Cancer)
Le miR let-7 en tant que cible thérapeutique
Le miR let-7 est connu pour agir comme un gène suppresseur de tumeurs dans une variété de tissus humains, particulièrement au niveau du poumon, en régulant négativement l'expression post-transcriptionnelle de multiples oncogènes, dont RAS, MYC et HMGA2, ainsi que d'autres gènes de progression du cycle cellulaire. Des quantités croissantes de miR let-7 dans des cellules mutées sur-exprimant KRAS ont montré une réduction dose-dépendante de l'expression de kras (Esquela-Kerscher et al., The let-7 microRNA reduces tumor growth in mouse models of lung cancer, Cell Cycle (2008), 7(6), 759-764). Mise en évidence de l'effet thérapeutique d'un miPEP codé par le transcript primaire du miR let-7
Des cellules A549 (lignée de cellules mutées sur-exprimant KRAS) sont cultivées sur milieu DMEM (90%) complémenté avec du sérum de veau fœtal (10%) et une solution de pénicilline/streptomycine lx, puis transfectée avec une quantité croissante de miPEP codé par le transcript primaire du miR let-7. Le lendemain, les cellules sont rincées et incubées 48h avec un média de culture classique. Les tests de prolifération sont réalisés avec le kit AlamarBlue selon les recommendations du distributeur. EXEMPLE 8 : Ischémie - Reperfusion
Le miR-7 comme cible thérapeutique
Le miR-7 est impliqué dans les effets délétères liés au syndrome d'ischémie-reperfusion (I/R) et est surexprimé dans les cardiomyocites soumis à une I/R simulée. Par ailleurs, il a été démontré que miR-7 protégeait les cellules myocardiques contre l'apoptose en réduisant l'expression de la polymérase poly(ADP-ribose) (PARP). Une augmentation de miR-7 induit une réduction dose-dépendante de l'expression de PARP (Li et al, MicroRNA-7a/b Protects against Cardiac Myocyte Injury in Ischemia Reperfusion by Targeting Poly(ADP-Ribose) Polymérase, PLoS One (2014), 9(3); e90096).
Mise en évidence de l'effet thérapeutique d'un miPEP codé par le transcript primaire du miR- 7
Des cellules H9c2 (lignée cellulaire ventriculaire de rat) sont cultivées à 37°C sous 5% de C02 sur milieu DMEM (90%) complémenté en sérum de veau fœtal (10%) et 100μg/mL d'une solution de pénicilline/streptomycine. Quarante-huit heures après la transfection d'un miPEP codé par le transcript primaire du miR-7, les cellules sont soumises à un épisode d'I/R simulé : le milieu est remplacé par du DMEM déficient en glucose et en sérum, et les cellules sont placées dans une chambre hypoxique à 37°C pendant lOh, puis réoxygénée pendant 2h sur milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal. La quantification de l'expression de PARP est menée en Western Blot avec des anticorps anti-PARP. EXEMPLE 9 : Infection par le virus de l'hépatite C CHCV
Le miR-181c comme cible thérapeutique
L'expression d'Homeobox Al (HOXAl) est accrue dans les hépatocytes infectés par HCV. L'expression exogène d'un analogue de miR-181c inhibe HOXAl et d'autres acteurs en cascade dont STAT3 et STAT5, impliqués dans la régulation de la croissance cellulaire. L'analogue supprime également la réplication de HCV (Mukherjee et al., Transcriptional Suppression of miR-181c by Hepatitis C Virus Enhances Homeobox Al Expression, J. Virol. (2014), 88(14); 7929-7940.).
Mise en évidence de l'effet thérapeutique d'un miPEP codé par le transcript primaire du miR- 181c
Les cellules d'hépatomes humains (Huh7.5) sont maintenues sur milieu DMEM (90%) complémenté en sérum de veau foetal (10%) et en antibiotiques (100 U de pénicilline G/ml et 100 μg de streptomycine/ml). HCV génotype 2a (clone JFHl) est cultivé dans des cellules Huh7.5. Le supernageant est filtré sur membrane d'acétate de cellulose. Pour l'infection, des cellules Huh7.5 sont incubées avec la solution virale pendant 72h. Les cellules reflétant la présence de HCV génotype 2a sont cultivées sur milieu DMEM (90%) complémenté avec du sérum de veau fœtal (10%) et une solution de pénicilline/streptomycine 1%. Toutes les cellules sont maintenues à 37°C sous 5% de C02 et transfectées avec des doses croissantes d'un miPEP codé par le transcript primaire du miR-181c. La quantification de HOXAl est réalisée par Western Blot à l'aide d'anticorps dédiés.
EXEMPLE 10 : Evaluation des effets du miPEP125a sur la formation osseuse in vivo par implantation en sous cutané chez la souris Nude
10.1 - Méthodes
Toutes les expériences faites sur les animaux l'ont été en accord avec la directive 2010/63 UE et après validation des protocoles par le comité éthique animal (Toulouse, N : 86/809 EEC). Un total de 6 à 8 souris a été utilisé par groupe. Les cellules cultivées ostéo-induites ou non selon les méthodes décrites par ailleurs (cf. exemple 1), ont ensuite été mises en suspension pendant 1 à 2h dans le milieu de culture contenant également des granules de biomatériaux selon le rapport de 2x106 cellules / 50 mg de biomatériel. Ces biomatériaux ont été du phosphate de calcium inorganique biphasique (BCP), composé d'hydroxyapatite (HA) et de beta-tricalcique phosphate (β-TCP) dans un ratio de 20/80, de taille compris entre 0,5 à 1 mm (vendu par Biomatlante, Vigneux de Bretagne, France). La porosité de ces biomatériaux (%vol) était de 75 +- 5% de pores dont 70% (0 à ΙΟμιη), 20% (10 à ΙΟΟμιη) et de 10% (100 à 300μιη). Ils ont été stérilisés à l'autoclave.
Le biomatériel seul a été implanté comme control négatif. Des souris Nude femmelles (RjOrl : NMRI-Foxnnul/Foxnlnu), provenant du fournisseur agréé Janvier (Laboratoires Janvier, Saint-Berthevin, France) ont été anesthésiées de façon générale par inhalation d'isoflurane. Deux implants (cellules + biomatériaux) ont été placés dans le dos des souris en sous-cutané de chaque côté de la colonne vertébrale. Après 4 semaines, les animaux traités ont été sacrifiés. Les implants ont ensuite été prélevés et fixés dans une solution de formol 4% tamponée. Certains groupes de souris recevront également des injections régulières (1 fois par semaine) au cours de l'étude soit du miPEP//125a-l (SEQ ID NO : 11 752) soit du miPEP contrôle (scramble ScmiPEP//125a, SEQ ID NO : 11 758).
Ces implants ont ensuite été décalcifiés dans une solution de 4,13% EDTA/0.2% PFA dans du PBS pendant 96 heures à 50 °C en utilisant un micro-onde automatique pour déminéralisation (KOS Histostation, Milestone Med. Corp. USA). Les échantillons ont été déshydratés dans des bains d'éthanol puis de butanol dans un appareil de déshydratation automatique (MicromMicrotech, Lyon, France). Les échantillons ont été ensuite plongés dans la paraphine (Histowax, Histolab, Gottenburg, Suède). Des coupes fines (3mm d'épaisseur) ont été réalisées grâce à un microtome (Leica RM2255, Leica Biosystems, Nanterre, France). Les coupes ont été colorées par la technique du trichrome Masson colorant ainsi le collagène en vert clair. Les photos ont été obtenues par un scanne de chaque coupe (NanoZoomer, Hamamatsu, Photonics, Hamamatsu City, Shizuoka, Japon) et observées virtuellement (NDP view, Hamamatsu). L'histomorphometrie des images a été faite en utilisant le logiciel ImageJ et le pourcentage d'os néoformé a été calculé par aire d'expiant. 3 à 4 sections par explants ont été analysées et quantifiés. 10.2 - Matériels
- Souris Nude femmelles (RjOrl : NMRI-Foxnnul/Foxnlnu), provenant du fournisseur agréé Janvier (Laboratoires Janvier, Saint-Berthevin, France),
- Biomatériaux : Phosphate de calcium inorganique biphasique (BCP), composéd'hydroxyapatite (HA) et de beta-tricalcique phosphate (β-TCP) dans un ratio de 20/80, de taille compris entre 0,5 à 1 mm (vendu par Biomatlante, Vigneux de Bretagne, France),
- Tubes Eppendorf 1.5 mL,
- Table d'anesthésie à l'Isoflurane,
- Seringues 19 G,
- Un micro-onde automatique pour déminéralisation (KOS Histostation, Milestone Med.
Corp. USA),
- Solution de déminéralisation de 4, 13% EDTA/0.2% PFA dans du PBS,
- Ethanol, Butanol,
- Appareil de déshydratation automatique (MicromMicrotech, Lyon, France),
- Microtome (Leica RM2255, Leica Biosystems, Nanterre, France),
- Paraphine (Histowax, Histolab, Gottenburg, Suède),
- NanoZoomer (Flamamatsu, Photonics, Hamamatsu City, Shizuoka, Japon),
- Logiciel NDPview (NDP view, Hamamatsu).
10.3 - Résultats
Les images de la figure 17 montrent qu'il n'y a pas de formation osseuse dans le contrôle biomatériel seul (Fig 17 A). Par contre, l'ajout de CSM au biomatériel a généré de la formation osseuse dans tous les cas (Fig 17B-F). Toutefois, de façon qualitative il apparaît que cette formation osseuse est plus importante lorsque les CSM ont été pré-traitées avec le miPEP125a-l (Fig 17C-D) qu'avec le miPEP scr amble (Fig 17E-F).
La quantification d'os néoformé confirme cette appréciation (Fig 17G). En effet, il y a significativement plus de formation osseuse lorsque les CSM ont été pré-traitées par le miPEP//125a en culture (C) que dans le contrôle associé (E : CSM prétraitées par le miPEP scramble ; p = 0.0499). Cette quantification montre également que l'injection du miPEP//125a-l in vivo (D) est sans conséquence, voire diminue (de manière non significatice) l'effet d'induction comparé à son contrôle (C : CSM uniquement pré-traitées). Par contre, il ressort clairement que la formation osseuse des CSM pré-traitées in vitro uniquement (C) ou pré-traitées in vitro puis traitées in vivo (D) est significativement plus importante que les CSM non-traitées (B) (p=0.0241 et p=0.0203 respectivement).
Le traitement des CSM humaines par le miPEP//125a-l a donc augmenté leur capacité à former de l'os in vivo quand elles sont préalablement traitées in vitro.
La liste des séquences de la présente invention est identique à celle du document de priorité, lequel correspond à la demande française n°FRl 6/63245 déposée le 22 décembre 2016.

Claims

REVENDICATIONS miPEP de 3 à 500 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un miR, ou un fragment dudit miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote,
pour son utilisation comme médicament dans le traitement de troubles musculo-squelettique, ou de maladie ou de traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, ledit transcrit primaire d'un miR étant choisi parmi le groupe consistant en :
let-7b, let-7g, miR- 15a, miR16-l, miR106a, miRlOa, miRlOb, miR1246, miR125a-l, miR132, miR134, miR142, miR145, miR145-2, miR146a, miR150, miR155, miR181c, miR182, miR183, miR184, miR18b, miR192, miR195, miR200a, miR202, miR203, miR205, miR206, miR20b, miR21, miR210, miR27a, miR29a, miR29c, miR30b, miR345, miR377, miR409, miR495, miR520h, miR542, miR572, miR648, miR96 et miR99b ;
de préférence parmi le groupe consistant en : miR15a, miR16-l, miR125a-l et miR145-2.
miPEP selon la revendication 1, de 3 à 50 acides aminés, de 50 à 100 acides aminés, de 100 à 500 acides aminés, de 101 à 500 acides aminés, 200 à 500 acides aminés, de 300 à 500 acides aminés, de 400 à 500 acides aminés, de 100 à 200 acides aminés, de 200 à 300 acides aminés ou de 300 à 400 acides aminés.
miPEP, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, ledit miPEP étant identifié, ou tel qu'identifié, par la mise en œuvre d'un procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, comprenant :
a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis
b) une étape de comparaison entre : i. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et ii. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux.
miPEP, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l, q variant
de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745, SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749.
miPEP, ou fragment dudit miPEP pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour son utilisation dans le traitement d'un ou plusieurs troubles musculo-squelettique, ou maladies ou traumatismes du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, choisies parmi le groupe comprenant :
l'arthrite, la craniosynostosis, la dysplasia fibreuse, l'exostoses héréditaires multiples, les fentes palatines, la fibrodysplasia ossificans progressiva, le fibrome non-ossifiant, la fracture osseuse, l'hyperostosis, Phyperostosis cortical infantile, l'hyperostosis porotique, l'hype arathyroidisme, l'hypophosphatasia, la maladie de Kienbôck, la maladie de Kôhler-Mouchet, la maladie de Paget, la maladie de Panner, la maladie de Scheuermann, la maladie d'Osgood-Schlatter ou ostéochondrose tibiale, la melorheostosis, le myelome multiple, l'ostéite, l'osteitis condensas, l'osteitis fibrosa cystica ou osteitis fibrosa ou la maladie de Von Recklinghausen, l'ostéoarthrite, l'ostéochondrite déformante de la hanche, l'ostéochondrite disséquante, l'osteochondroma, l'ostéogénèse imparfaite ou maladie des os de verre, l'ostéolyse, l'osteomalacia, l'osteomyelitis, l'ostéopenie, l'ostéopétrose, l'ostéophyte, l'ostéoporose, l'osteosclerosis, la pseudarthrose, la pseudarthrose (ou non consolidation ou consolidation retardée), la pycnodysostosis, le syndrome Coffin-Lowry, le syndrome Hajdu-Cheney, le syndrome Klippel-Feil, les tumeur à cellules géantes et la tumeur osseuse. miPEP, ou fragment dudit miPEP pour son utilisation selon la revendication 5, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à . 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745, SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749.
Fragment de miPEP pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ledit fragment de miPEP étant choisi parmi :
le miPEP//145-2 consistant en SEQ ID NO : 11 751,
le miPEP//125a-l consistant en SEQ ID NO : 11 752, et
le miPEP//15a-16-l consistant en SEQ ID NO : 11 753. miPEP, ou fragment dudit miPEP, pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant fusionné ou lié à une ou plusieurs molécules facilitant l'entrée du miPEP ou du fragment de miPEP dans la cellule,
ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant de préférence fusionné en N-ter ou en C-ter avec le peptide TAT (YGRKKR QR R, SEQ ID NO : 11 754).
miPEP choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745, SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749, ledit miPEP, ou le fragment dudit miPEP, étant notamment fusionné avec le peptide TAT (YGRKKRRQRRR, SEQ ID NO : 11 754), fusionné à la pénétratine, fusionné à un peptide polyhistidine, fusionné à un peptide polyarginine, ou lié à une ou plusieurs molécules d'acide palmitique.
Acide nucléique codant l'un des miPEP choisis parmi le groupe de miPEPs consistant en SEQ ID NO : 2q, q variant de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 746, SEQ ID NO : 11 748 et SEQ ID NO : 11 750. Procédé d'identification d'un miPEP modulant l'accumulation d'un miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatisme du tissu osseux ou du tissu cartilagineux, le dit miPEP étant codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, comprenant :
a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 1 503 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit miR, puis
b) une étape de comparaison entre :
i. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit miR, et ii. l'accumulation dudit miR dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit miR,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit miR en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit miR en absence dudit peptide indique l'existence d'un miPEP, celui-ci étant codé par ledit cadre ouvert de lecture et étant capable de moduler l'accumulation dudit miR impliqué dans un trouble musculo-squelettique, ou une maladie ou un traumatism.es du tissu osseux ou du tissu cartilagineux.
Utilisation in vitro ou ex vivo d'un miPEP ou fragment dudit miPEP,
ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de miPEPs consistant en : SEQ ID NO : 2q-l, q variant
de 45 à 48, de 89 à 92, de 101 à 104, de 121 à 124, de 133 à 140, de 153 à 156, de 161 à 164, de 169 à 192, de 221 à 224, de 233 à 256, de 301 à 304, de 317 à 320, de 329 à 332, de 337 à 340, de 381 à 384, de 445 à 448, de 469 à 472, de 533 à 536, de 693 à 696, de 789 à 792, de 909 à 916, de 977 à 980, de 1021 à 1024, de 1237 à 1240, de 1277 à 1280, de 1329 à 1332, de 1337 à 1344, de 1350 à 1353, de 1361 à 1364, de 1374 à 1377, de 1385 à 1388, de 1393 à 1404, de 1445 à 1448, de 1453 à 1456, de 1469 à 1472, de 1533 à 1536, de 1549 à 1552, de 1557 à 1560, de 1581 à 1584, de 1645 à 1652, de 1677 à 1680, de 1705 à 1716, de 1769 à 1772, de 1877 à 1880, de 1909 à 1912, de 1953 à 1956, de 1965 à 1972, de 2061 à 2064, de 2073 à 2076, de 2117 à 2120, de 2129 à 2140, de 2185 à 2188, de 2217 à 2244, de 2269 à 2288, de 2317 à 2320, de 2337 à 2340, de 2361 à 2364, de 2413 à 2416, de 2425 à 2432, de 2437 à 2444, de 2465 à 2476, de 2609 à 2612, de 2641 à 2644, de 2653à 2656, de 2689 à 2692, de 2825 à 2828, de 2949 à 2952, de 2977 à 2980, de 3141 à 3144, de 3317 à 3320, de 3373 à 3376, de 3517 à 3520, de 3861 à 3868, de 4041 à 4044, de 4061 à 4064, de 4093 à 4096, de 4113 à 4116, de 4121 à 4128, de 4157 à 4164, de 4189 à 4192, de 4205 à 4208, de 4225 à 4228, de 4242 à 4245, de 4269 à 4276, de 4309 à 4312, de 4341 à 4344, de 4421 à 4424, de 4637 à 4640, de 4661 à 4664, de 4677 à 4680, de 4685 à 4692, de 4705 à 4708, de 4749 à 4752, de 4757 à 4764, de 4777 à 4780, de 4793 à 4796, de 4813 à 4816, de 4825 à 4828, de 4833 à 4840, de 4898 à 4901, de 4985 à 4988, de 5157 à 5160, de 5189 à 5196, de 5221 à 5224, de 5241 à 5244, de 5249 à 5300, de 5341 à 5344, de 5357 à 5360, de 5381 à 5384, de 5397 à 5408, de 5437 à 5440, de 5473 à 5476, de 5563 à 5570, de 5717 à 5720, de 5765 à 5768, de 5793 à 5800, de 5809 à 5812, de 5826 à 5829, de 5833 à 5836 et de 5869 à 5875 ;
de préférence choisi parmi le groupe consistant en : SEQ ID NO : 11 745, SEQ ID NO : 11 747 et SEQ ID NO : 11 749,
pour favoriser l'ostéogénèse des cellules, en particulier les cellules souches mésenchymateuses .
Utilisation d'un miPEP ou fragment dudit miPEP selon la revendication 12, en association avec un ou des additifs,
lesdits additifs étant choisis parmi le groupe consistant en : les cytokines comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et/ou le dexaméthasone.
Utilisation d'un miPEP ou fragment dudit miPEP selon la revendication 12, en association avec un biomatériau,
ledit biomatériau étant choisi parmi le groupe consistant en :
a) les polymères naturels tels que la gélatine/chitooligosaccharide, le collagène, le chitosan, le chitosan/collagène/ -GP, les fibromes de soie, l'alginate/CPC, l'alginate, l'acide hyaluronique, le RAD16-I BD™ ou le chitosan/peptide RGD ; ou b) les polymères synthétiques tels que le PLGA, le PCL ou pHMGCL, le PLGA-PEO, le poly(LLA-co-CL)/poly(LLA-co-DXO), le PPHOS/PLGA, le PCL/PDIPF, le PEA-g-TA, le PLGA-(PEG-ASP), le ΡΕΟΊ7ΡΒΤ, ou le poly-HEMA ; ou
c) les verres bioactifs tels que le 45S5 Bioglass®, le CaMgSi206, le 45S5 bioactive glass®, le 45 S bioactive glass®, le bioactive glass® (BG20), le bioglass® ou le bioactive glass® (13-93) ; ou
d) les phosphates de calcium tels que le CPC, le HA, le βΤΟΡ, le HA/ TCP, le calcium Aluminate/mélatonine ou le CPC/Bioglass® ; ou
e) le corail tels que les Porites sp. , le corail Goniopora, le corail hydroxyapatite, la coralline en forme de condyle, le Porites lutea, le Porites acropora ou les matrices de corail naturel ; ou
f) les métaux tels que le NiTi/Ti, les feuilles de fibres de titane (Ti), le fil de titane, le Ti, le Ti02, l'alliage de Ti6Ta4Sn, l'alliage Magnésium W4 (MgY4) ou l'alliage Fer-manganèse ; ou
g) les composites polymère/céramique tels que le Nano-apatite PCL, le PLGA-PCL-CP, le PEOT PBT-CP, le Collagène-CPC, le PCL-TCP, le Chitosan-CPC, le Phosphate de magnésium-PCL, le PLGA- TCP, le PCLF-PVA-HA, le Chitosan/poly(DL, lactide-co-glycolide), le PLGA-nHA ou le P3HB-HA ; ou
h) les composites métal/céramique tels que le polyNaSS/Ti, le PLLA/PLGA/Ti, le polyNaSS/Ti, l'acide NaSS/méthacrylique, l'alliage MA /Ti6Al4V, le polyNaSS/Ti, le Si02/CaO/Na20/MgO/B203, le Niobium/fluorapatite, le Ti-HA, le Ti02, le Zr02-CP/PCL, le K/Sr-CPP, le Zr02/HA, le Co-MBG, le Cu-MBG, le β-TCP/Mg ou le Sr/CPP.
Utilisation d'un miPEP ou fragment dudit miPEP selon la revendication 12, en association avec un ou des additifs, lesdits additifs étant choisis parmi le groupe consistant en : les cytokines comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et/ou le dexaméthasone ;
et en association avec un biomatériau, ledit biomatériau étant choisi parmi le groupe défini dans la revendication 14.
5
16. Utilisation d'un fragment de miPEP de séquence SEQ ID NO : 11 752 pour favoriser l'ostéogénèse des cellules souches mésenchymateuses en association avec un biomatériau, ledit biomatériau étant ΗΑ/β-TCP dans un ratio de 20/80.
10 17. Cellules ostéo-induites par un ou plusieurs miPEP ou fragment desdits miPEP selon la revendication 9, lesdites cellules étant en particulier des cellules souches mésenchymateuses.
18. Cellules comprenant un acide nucléique codant l'un ou plusieurs des miPEP selon la 15 revendication 10, l'expression dudit acide nucléique étant inductible ou non, lesdites cellules étant en particulier des cellules souches mésenchymateuses.
19. Biomatériau composite comprenant des cellules ostéo-induites selon la revendication 17 ou des cellules selon la revendication 18,
20 en association ou non avec un ou des additifs, lesdits additifs étant choisis parmi le groupe consistant en : les cytokines comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et/ou le dexaméthasone,
ledit biomatériau étant choisi parmi le groupe défini dans la revendication 14.
25 20. Biomatériau composite comprenant des cellules souches mésenchymateuses ostéo- induites par un fragment de miPEP de séquence SEQ ID NO : 11 752, ledit biomatériau étant Ι'ΗΑ/β-TCP dans un ratio de 20/80.
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