EP3501660A1 - Method and device for the separation of substances by centrifugation - Google Patents
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- EP3501660A1 EP3501660A1 EP17208556.5A EP17208556A EP3501660A1 EP 3501660 A1 EP3501660 A1 EP 3501660A1 EP 17208556 A EP17208556 A EP 17208556A EP 3501660 A1 EP3501660 A1 EP 3501660A1
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- B04B5/04—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers
- B04B5/0407—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles
- B04B5/0414—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles comprising test tubes
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- B04B5/0421—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles comprising test tubes pivotably mounted
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Definitions
- the present invention relates to a process for the separation of substances, in particular for the separation of the constituents of suspensions, emulsions and gas mixtures, as well as suitable devices for carrying it out.
- Centrifuges are often used for substance separation, which work by exploiting the inertia.
- the operation is based on the centrifugal force, which comes about due to a uniform circular motion of the material to be centrifuged (Zentrifugiergut) and brings about the desired separation of substances.
- a similar method uses the centrifugal separator, for the application of the inventive method is equally suitable.
- Centrifuges use the mass inertia in the centrifuging compartment for separating substances. Higher density particles or media are separated from the lower density components due to their higher inertia. This process is much faster than the sedimentation by gravity or even possible at all, since opposing forces such as the adhesion, the thermal molecular motion or the viscosity are overcome.
- centrifuging conditions are used for the desired substance separation of a given substance mixture using the same centrifuge and a centrifuge container of the same specification, considerable separation errors may occur, especially in the medical-diagnostic field, since the separation of the components of different density has taken place only partially. Practical applications for this are, for example, the separation of whole blood into serum or plasma and cell components. The separated components such as plasma and serum are used, for example, in diagnostics for the determination of disease markers on. In this case, compliance with the centrifugation conditions is indispensable for the comparability of the measurement results, since even small differences can influence the measurement results of modern methods. The current development in cell-based immunotherapy against cancer has shown that centrifugation processes are also relevant in the pharmaceutical sector.
- the quality of the separation of particles in suspension by acceleration forces is mainly due to the particle size and the density differences between the substances dependent.
- accelerating forces larger volume, higher density particles are separated from lower volume and / or lower density particles during centrifugation, and the time to desired separation or sedimentation can be shortened by the application of higher acceleration forces.
- centrifugation allows the separation of cells, organelles, membranes and molecules in the biological or biotechnological field.
- a rough classification of centrifugation applications is made by the achievable acceleration forces (expressed in multiples of g, the gravitational acceleration). While up to 8,000 g are used in low-speed centrifugation, up to 22,000 g are used for high-speed centrifugation and up to 700,000 g for ultra-centrifugation.
- differential centrifugation which uses the sequential application of different centrifugation conditions to separate several substances from the same mixture.
- rate zonal centrifugations and isopycnic centrifugations are used. Both techniques use adjuvants that form gradients.
- rate zonal the density of the gradient is lower than the materials to be separated, and therefore it is necessary to stop the centrifugation at a defined time to achieve the separation of different particle sizes.
- isopycnic centrifugation the density of the gradient is certainly higher than that of the substances to be separated, so that the particles collect in a band of the gradient of the same density or the same sedimentation rate.
- centrifuges usually fixed-angle rotors, swing-bucket rotors or specialized rotor systems are used, which are referred to herein as separation devices.
- the rotors can be designed directly for receiving a mixture to be separated, or they are designed to accommodate containers such as tubes of different size and texture (polypropylene, usually up to 20,000 g (fixed angle rotor) at higher g-forces rather thermosets (e.g., polycarbonate).
- Typical centrifugation containers such as centrifuge tubes, have a volume of between 5 .mu.l and 5000 ml, wherein they are usually conical, spherical or elliptical in shape.
- the present invention is not limited to this exemplary selection of sizes and shapes, but is equally suitable for use with containers of other sizes and shapes.
- thermoplastic or thermosetting plastics by injection molding (in particular stretch blow molding or injection blow molding), wherein the temperatures can reach up to 220 ° C in the normal injection molding process.
- injection blow molding process uses lower processing temperatures in the range of approx. 100-120 ° C.
- the desired material separation with centrifuges whose rotors and / or containers, in particular tubes, are equipped with at least one RFID transponder, this transponder preferably representing a component of an RFID system which also comprises a receiver, and Accelerometer (accelerometer) includes, wherein the acceleration sensor may alternatively be provided as a component of a so-called inertial measurement unit (Engl. 'Inertial Measurement Unit', IMU).
- IMU inertial measurement unit
- RFID Radio Frequency Identification
- a known RFID system thus consists of a transponder, which is located on or in the article and contains a distinctive code, and a reader for reading this identifier.
- the transponder is arranged in the separating device of a centrifuge, in particular on the rotor and / or on the centrifuge tube and thus in the immediate vicinity of the material to be separated, wherein the arrangement of the transponder alternatively also take place in the rotor and / or in the centrifugation tube or, if necessary, in the material to be separated can.
- an RFID transponder centrifugation tube can be configured as disposable or reusable article. Since it is possible to embed RFID transponders circuit stable and heat-resistant in polymers via a special printing process, it is inventively preferred to use centrifugation tubes made of plastic, which have been prepared by the aforementioned injection molding process with storage of such heat-resistant RFID transponder made of polymers.
- the currently available RFID transponders already allow a temperature resistance at 220 ° C for the duration of one hour, which corresponds to the temperature range for injection molding in the context of the production of centrifugation plastic tubes.
- RFID transponders RFID chips
- the use and provision of separation devices such as in particular of centrifugation tubes with RFID transponders, which have been introduced into the tail (in the wall of the bottom) of the preform, so that the transponder using the injection blown in the subsequent solidification of the Förmlings in Bottom of the centrifuge tube is permanently fixed.
- the RFID transponder has additional recesses which facilitate orientation and positioning as well as spacing during the injection molding process.
- a commercial RFID transponder regardless of its nature and method of preparation prior to the separation process or centrifugation loose in the centrifuge tube, or a tube with a way to accommodate the transponder such as a slot on the bottom or the cap to use, whereby the centrifugation takes place in both cases in the presence of the RFID transponder in the centrifuge tube.
- RCF Radial Centrifugal Force
- a difference in the g-force at an assumed distance of 10 cm of the material to be separated to Zentrifugations- or rotation axis can easily come about both in a centrifuge tube and in a rotor. At a distance of 1 cm and a speed of 5000 rpm results in a RCF of 279.5 g. At 10 cm distance and 5000 rpm results in 2795 g for the RCF. While 280 g are well tolerated by cells, g-forces of over 1000 g can destroy cells and cause them to burst. It is clear that a (locally) multiple introduction of equipped with acceleration sensors RFID transponders in a tube, a rotor, or another separation device can be advantageous and is therefore preferred. This is especially true in the case of a desired differentiated separation of cells and biomolecules.
- RFID transponders 4 with integrated functionality of an acceleration sensor were purchased from ST Electronics (Geneva, Switzerland) for carrying out the teaching according to the invention. They are temperature resistant up to about 200 ° C, comprise an antenna and have a size of about 3 mm x 3 mm and a thickness of about 1 mm on (s. FIGS. 1 and 3 ). Due to their smaller size, passive RFID transponders 4 were used in the present case, with semipassive transponders also being used as an alternative.
- the passive RFID transponder 4 can be due to the small size most easily incorporated into the plastic of the centrifuge tube 1 to be produced. However, passive RFID transponders have no independent power source, which is why they receive appropriate signals before they are used via an RFID reader / transmitter station so that they can send or write data. Then an induction is triggered via the integrated antenna, whereby the RFID transponder 4 is supplied with sufficient current (about 0.35 watts). This amount of flow is sufficient to sufficiently supply the 3-way accelerometer integrated in the RFID transponder 4 for the subsequent centrifuging operation.
- an activating transmitter / receiver was mounted both on and in the vicinity of the centrifuge to be used.
- the centrifuge tubes 1 with passive RFID transponder 4 (receiving range 1-6 m) were brought into range of the transmitter for a few seconds before the respective centrifugation.
- a successful activation could be checked via the transmitter / receiver display.
- the centrifugation process was started.
- the passive RFID transponders 4 sent the data in real time to the transmitter / reader. This transmitted the data of the acceleration measurement to a database. Due to the constant activation of the transponder 4, continuous transmission of the centrifugation data was always ensured, even during longer centrifugation processes.
- PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells
- RCF radial centrifugal force or acceleration
- 50 ml cell culture tubes 1 (article No. 210261 Greiner BioOne, Frickenhausen, Germany) were prepared using 2-component adhesive 11 (Henkel, Dusseldorf, Germany) with one RFID transponder each with accelerometer 4 (accelerometer: H3LIS331DL, ST-Electronics , Geneva, passive RFID transponder Andy 100 IC, Farsens, San Sebastian, Spain) in cover 2 and bottom 3 provided and sealed accordingly. After complete drying, the tubes 1 were held for about 10 seconds via an Impinj R220 UHF RFID reader (also Farsens) to activate the passive RFID transponder 4. Subsequently, tubes 1 were loaded with 20 ml of Ficoll Paque gradient medium 5 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
- centrifugation C did not show the expected bands for mononuclear cells 8 and polymorphonuclear cells 9 and red streaks from erythrocyte sediment 10 traversed most of the sample.
- the transmission of the data took place online with the passive RFID unit.
- the evaluation of the data for centrifugation B showed a maximum centrifugation force g in the plateau of 311 g (+/- 2 g) for the introduced in the bottom 3 RFID transponder 4 (b2), while the RFID transponder 4 in the lid 2 (b1) in Plateau showed a maximum acceleration force of 136 g (+/- 2g) (see FIG. 4 ).
- centrifugation C the maximum centrifugal force registered in the plateau by the soil accelerometer (c2) was 22 g, while the measurement by the accelerometer 4 in the lid 2 (c1) gave only 10 g (see FIG. 4 ).
- the determined course of the centrifugal forces is for centrifugations B and C in FIG. 4 shown.
- the low insufficient centrifugation forces in centrifugation C can be clearly explained by the application error and the resulting low acceleration.
- the deviations in centrifugation B from the set 350 g are given by the distance of the accelerometer 4 from the maximum centrifugation radius of the device and makes even in the bottom area of the vessel more than 10% of the centrifugal force.
- Another application error which could be clearly recorded via an integrated accelerometer 4, would be the setting of a brake force on the centrifuge.
- An applied braking force is not desirable in a gradient centrifugation, as by the centrifugal forces released during deceleration Density bands of the gradient become blurred and no cell separation occurs.
- the recording by an accelerometer 4 here would indicate a much more abrupt decrease of the centrifuging force compared to an unrestrained leak in the discharge phase after the actual centrifugation (see additional curves in FIG. 4 ).
- FIG. 1 (AF) illustrates the respective positioning of a miniaturized RFID accelerometer 4 in the region of the bottom 3 of centrifugal containers 1 of different shape.
- A) Direct incorporation of the RFID accelerometer 4 without antennas in the centrifugation vessel 1 during the manufacturing process.
- B) Direct incorporation of the RFID accelerometer 4 with antennas during the manufacturing process.
- C) introducing and, if necessary, fixing an RFID accelerometer 4 in the interior of a centrifugation tube 1.
- FIG. 2 shows the recorded course of the acceleration in g over the time of the centrifugation, for example within specified parameters (A), as well as the recorded course of the acceleration in g over the time of centrifugation and subsequent termination when a fixed acceleration g ( B).
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stofftrennung wie insbesondere zur Trennung der Bestandteile von Suspensionen, Emulsionen und Gasgemischen, sowie geeignete Vorrichtungen zur Durchführung desselben.Erfindungsgemäß erfolgt das Trennverfahren durch übliche Zentrifugation unter Verwendung geeigneter Trennvorrichtungen und/oder Zentrifugationsbehältnissen in Anwesenheit von mindestens einem Beschleunigungssensor in unmittelbarer Nähe zum Zentrifugationsgut.The present invention relates to a method for separating substances, in particular for separating the components of suspensions, emulsions and gas mixtures, and suitable devices for carrying out the same. According to the invention, the separating method is carried out by conventional centrifugation using suitable separating devices and/or centrifugation containers in the presence of at least one acceleration sensor close proximity to the material to be centrifuged.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stofftrennung wie insbesondere zur Trennung der Bestandteile von Suspensionen, Emulsionen und Gasgemischen, sowie geeignete Vorrichtungen zur Durchführung desselben.The present invention relates to a process for the separation of substances, in particular for the separation of the constituents of suspensions, emulsions and gas mixtures, as well as suitable devices for carrying it out.
Zur Stofftrennung werden häufig Zentrifugen eingesetzt, die unter Ausnutzung der Massenträgheit arbeiten. Die Funktionsweise beruht auf der Zentrifugalkraft, die aufgrund einer gleichförmigen Kreisbewegung des zu zentrifugierenden Gutes (Zentrifugiergut) zustande kommt und die gewünschte Stofftrennung herbeiführt. Ein ähnliches Verfahren verwendet der Fliehkraftabscheider, für dessen Anwendung das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen geeignet ist.Centrifuges are often used for substance separation, which work by exploiting the inertia. The operation is based on the centrifugal force, which comes about due to a uniform circular motion of the material to be centrifuged (Zentrifugiergut) and brings about the desired separation of substances. A similar method uses the centrifugal separator, for the application of the inventive method is equally suitable.
Zentrifugen nutzen die Massenträgheit im Zentrifugiergutraum zur Stofftrennung. Dabei werden Partikel oder Medien mit höherer Dichte aufgrund ihrer höheren Trägheit von den Bestandteilen mit niedrigerer Dichte getrennt. Dieser Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich, da Gegenkräfte wie die Adhäsion, die thermische Molekularbewegung oder die Viskosität überwunden werden.Centrifuges use the mass inertia in the centrifuging compartment for separating substances. Higher density particles or media are separated from the lower density components due to their higher inertia. This process is much faster than the sedimentation by gravity or even possible at all, since opposing forces such as the adhesion, the thermal molecular motion or the viscosity are overcome.
Werden zur gewünschten Stofftrennung eines gegebenen Stoffgemisches unter Verwendung derselben Zentrifuge und eines Zentrifugationsbehältnisses derselben Spezifikation voneinander abweichende Zentrifugationsbedingungen angewendet, kann es insbesondere im medizinisch-diagnostischen Bereich zu erheblichen Auftrennungsfehlern kommen, da die Trennung der Bestandteile unterschiedlicher Dichte nur teilweise stattgefunden hat. Praktische Anwendungen hierfür sind zum Beispiel die Trennung von Vollblut in Serum oder Plasma und Zellbestandteile. Die getrennten Bestandteile wie Plasma und Serum werden zum Beispiel in der Diagnostik zur Bestimmung von Krankheitsmarkern weiterverwendet. Hierbei ist die Einhaltung der Zentrifugationsbedingungen für die Vergleichbarkeit der Messergebnisse unabdingbar, da schon kleine Unterschiede die Messergebnisse moderner Methoden beeinflussen können. Die aktuelle Entwicklung in der zellbasierten Immuntherapie gegen Krebs hat aufgezeigt, dass Zentrifugationsprozesse auch im pharmazeutischen Bereich relevant sind. Beispielsweise ist bei dem neu zugelassenen T-Zell basierten Medikament CTL019 (Novartis, CAR-T Technologie) für die Vorbereitung der T-Zellen eine Zentrifugation zur Aufbereitung der T-Zellen zwingend notwendig. Die Überprüfbarkeit, ob diese für die Konditionierung erforderlichen Zentrifugationsprozesse im Rahmen der zuvor erfolgten Spezifikation (Validierung) stattgefunden haben, ist exakt nur am Zentrifugationsgerät oder Zentrifugationsbehältnis und nur direkt nach dem Zentrifugationsvorgang gegeben. Dieser Umstand erfordert Vertrauen in regelmäßige Wartung, sachgemäße Nutzung und wahrheitsgemäße Herstellerangaben. Insbesondere bei dezentral stattfindenden Prozessen mit multiplen Anwendern kann es dabei zu einer Vielzahl von Fehlern oder Unregelmäßigkeiten kommen, die im Zuge vieler Zertifizierungs- und Auditierungsmaßnahmen nicht vorkommen dürfen, wie dies unter anderem unter GMP (Good Manufacturing Practice) bzw. GLP (Good Laboratory Practice) festgelegt ist.If different centrifuging conditions are used for the desired substance separation of a given substance mixture using the same centrifuge and a centrifuge container of the same specification, considerable separation errors may occur, especially in the medical-diagnostic field, since the separation of the components of different density has taken place only partially. Practical applications for this are, for example, the separation of whole blood into serum or plasma and cell components. The separated components such as plasma and serum are used, for example, in diagnostics for the determination of disease markers on. In this case, compliance with the centrifugation conditions is indispensable for the comparability of the measurement results, since even small differences can influence the measurement results of modern methods. The current development in cell-based immunotherapy against cancer has shown that centrifugation processes are also relevant in the pharmaceutical sector. For example, in the newly approved T cell-based drug CTL019 (Novartis, CAR-T technology), centrifugation to prepare the T cells is imperative for the preparation of T cells. The verifiability of whether these necessary for the conditioning centrifugation processes within the scope of the previously made specification (validation) have taken place, is given exactly only on Zentrifugationsgerät or Zentrifugationsbehältnis and only directly after the centrifugation process. This circumstance requires confidence in regular maintenance, proper use and truthful manufacturer information. Particularly in decentralized processes with multiple users, a large number of errors or irregularities may occur that may not occur in the course of many certification and auditing measures, such as GMP (Good Manufacturing Practice) or GLP (Good Laboratory Practice ).
Es besteht daher ein Bedarf an der Bereitstellung eines Verfahrens sowie dafür geeigneter Vorrichtungen, mit denen die Ergebnisse einer Stofftrennung der vorbezeichneten Art direkt vor Ort in Echtzeit erfasst und vergleichsweise einfach sowie kostengünstig überprüft werden können.There is therefore a need for the provision of a method as well as suitable devices with which the results of a separation of substances of the aforementioned type can be recorded directly in situ in real time and can be checked comparatively easily and inexpensively.
Die Aufgabe wird durch das Verfahren und durch die Trennvorrichtung der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen sowie in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung dargelegt.The object is achieved by the method and by the separating device of the independent claims. Advantageous embodiments are set forth in the subclaims and in the following detailed description.
Wie bereits erwähnt, ist die Güte der Trennung von Partikeln in Suspension durch Beschleunigungskräfte hauptsächlich von der Partikelgröße und den Dichteunterschieden zwischen den Stoffen abhängig. Durch die Anwendung von Beschleunigungskräften werden Partikel mit größerem Volumen und höherer Dichte von Partikeln mit geringerem Volumen und/oder geringerer Dichte im Verlauf der Zentrifugation getrennt, wobei die Zeit bis zur gewünschten Trennung oder Sedimentation durch die Anwendung höherer Beschleunigungskräfte verkürzt werden kann. Durch die Stokes-Gleichung kann die Sedimentationsgeschwindigkeit von Partikeln anhand von 5 Parametern sehr gut berechnet werden
Die Brown'sche Molekularbewegung wirkt der Sedimentationsgeschwindigkeit entgegen. Bei sehr kleinen Partikeln und geringen Dichteunterschieden müssen deshalb sehr hohe Beschleunigungskräfte wirken, um eine erfolgreiche Trennung der Partikel zu gewährleisten. Durch die Anwendung von Zentripetalkräften um eine fixierte Achse können diese hohen Beschleunigungskräfte erreicht werden, so dass selbst Trennungen von Molekülen, die sich nur in der Isotopenverteilung unterscheiden, möglich sind. Diese allgemein als Zentrifugation bezeichnete Technik ermöglicht im biologischen oder biotechnologischen Bereich die Trennung von Zellen, Organellen, Membranen und Molekülen. Eine grobe Klassifizierung von Zentrifugationsanwendungen erfolgt durch die erreichbaren Beschleunigungskräfte (ausgedrückt in Vielfachen von g, der Erdbeschleunigung). Während bei der sogenannten Low Speed Zentrifugation bis zu 8.000 g zur Anwendung kommen, werden bei der High Speed Zentrifugation bis zu 22.000 g und im Rahmen einer Ultrazentrifugation bis zu 700.000 g angewendet.The Brownian molecular motion counteracts the sedimentation velocity. For very small particles and small differences in density, therefore, very high acceleration forces must act to ensure successful separation of the particles. By applying centripetal forces about a fixed axis, these high acceleration forces can be achieved, so that even separations of molecules that differ only in the isotopic distribution, are possible. This technique, commonly referred to as centrifugation, allows the separation of cells, organelles, membranes and molecules in the biological or biotechnological field. A rough classification of centrifugation applications is made by the achievable acceleration forces (expressed in multiples of g, the gravitational acceleration). While up to 8,000 g are used in low-speed centrifugation, up to 22,000 g are used for high-speed centrifugation and up to 700,000 g for ultra-centrifugation.
Neben einer direkten Sedimentation wird vor allem die Low Speed Zentrifugation auch zur beschleunigten Filtration oder anderen Größenausschlussverfahren genutzt. Darüber hinaus werden bei der Festphasenextraktion von beispielsweise Nukleinsäuren mittels sogenannter 'Spin Columns' Zentrifugationsvorgänge zur Beschleunigung des Vorgangs eingesetzt (s. z.B. BioRad (http://www.bio-rad.com/de-de/product/empty-spin-columns).In addition to direct sedimentation, especially the low speed centrifugation is also used for accelerated filtration or other Size exclusion method used. In addition, in the solid phase extraction of, for example, nucleic acids by means of so-called 'spin columns' centrifugation processes are used to speed up the process (see, for example, BioRad (http://www.bio-rad.com/en-us/product/empty-spin-columns).
Eine Erweiterung der Methoden betrifft die differenzielle Zentrifugation, welche die sequenzielle Anwendung unterschiedlicher Zentrifugationsbedingungen nutzt, um mehrere Stoffe aus demselben Gemisch zu trennen. Weiterhin werden 'Rate-Zonal'-Zentrifugationen und isopyknische Zentrifugationen verwendet. Beide Techniken verwenden Hilfsstoffe, die Gradienten bilden. Bei 'Rate Zonal' ist die Dichte des Gradienten geringer als die zu trennenden Stoffe, weshalb es erforderlich ist, die Zentrifugation zu einem definierten Zeitpunkt zu stoppen, um die Trennung verschiedener Partikelgrößen zu erreichen. Bei der isopyknischen Zentrifugation ist die Dichte des Gradienten durchaus höher als diejenige der zu trennenden Stoffe, so dass sich die Partikel in einer Bande des Gradienten gleicher Dichte bzw. gleicher Sedimentationsrate sammeln.An extension of the methods involves differential centrifugation, which uses the sequential application of different centrifugation conditions to separate several substances from the same mixture. Further, rate zonal centrifugations and isopycnic centrifugations are used. Both techniques use adjuvants that form gradients. At rate zonal, the density of the gradient is lower than the materials to be separated, and therefore it is necessary to stop the centrifugation at a defined time to achieve the separation of different particle sizes. In the case of isopycnic centrifugation, the density of the gradient is certainly higher than that of the substances to be separated, so that the particles collect in a band of the gradient of the same density or the same sedimentation rate.
In Zentrifugen werden gewöhnlich Festwinkelrotoren, Ausschwingrotoren oder spezialisierte Rotorensysteme eingesetzt, die vorliegend auch als Trennvorrichtungen bezeichnet werden. Die Rotoren können direkt zur Aufnahme eines aufzutrennenden Gemisches ausgestaltet sein, oder sie sind ausgelegt zur Aufnahme von Behältnissen wie insbesondere Röhrchen unterschiedlicher Größe und Beschaffenheit (Polypropylen, meist bis 20.000 g (Festwinkelrotor), bei höheren g-Kräften eher Duroplasten (z.B. Polycarbonat).In centrifuges usually fixed-angle rotors, swing-bucket rotors or specialized rotor systems are used, which are referred to herein as separation devices. The rotors can be designed directly for receiving a mixture to be separated, or they are designed to accommodate containers such as tubes of different size and texture (polypropylene, usually up to 20,000 g (fixed angle rotor) at higher g-forces rather thermosets (e.g., polycarbonate).
Zu den bekanntesten Zentrifugenherstellern gehören Beckmann-Coulter (Sorvall und andere Marken, größter Hersteller von Ultrazentrifugen), Hettich, Thermo, Eppendorf, und NuAire.Beckmann Coulters (Sorvall and other brands, the largest manufacturer of ultracentrifuges), Hettich, Thermo, Eppendorf, and NuAire are among the best-known manufacturers of centrifuges.
Typische Zentrifugationsbehältnisse wie z.B. Zentrifugenröhrchen weisen ein Volumen zwischen 5 µl und 5000 ml auf, wobei sie zumeist konisch, kugelförmig oder elliptisch geformt sind. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese exemplarische Auswahl an Größen und Formgebungen gebunden, sondern ist gleichermaßen für die Verwendung von Behältnissen anderer Größen und Formen geeignet.Typical centrifugation containers, such as centrifuge tubes, have a volume of between 5 .mu.l and 5000 ml, wherein they are usually conical, spherical or elliptical in shape. The However, the present invention is not limited to this exemplary selection of sizes and shapes, but is equally suitable for use with containers of other sizes and shapes.
Herkömmliche Zentrifugenröhrchen werden zumeist aus thermoplastischen oder duroplastischen Kunststoffen im Spritzgussverfahren (im speziellen Streckblas- oder Spritzblasverfahren) hergestellt, wobei die Temperaturen im normalen Spritzgussverfahren bis zu 220°C erreichen können. Im Spritzblasverfahren werden niedrigere Verarbeitungstemperaturen im Bereich von ca. 100-120°C angewendet.Conventional centrifuge tubes are usually made of thermoplastic or thermosetting plastics by injection molding (in particular stretch blow molding or injection blow molding), wherein the temperatures can reach up to 220 ° C in the normal injection molding process. The injection blow molding process uses lower processing temperatures in the range of approx. 100-120 ° C.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird vorgeschlagen, die gewünschte Stofftrennung mit Zentrifugen durchzuführen, deren Rotoren und/oder Behältnisse wie insbesondere Röhrchen mit mindestens einem RFID-Transponder ausgerüstet sind, wobei dieser Transponder vorzugsweise eine Komponente eines auch einen Empfänger umfassenden RFID-Systems darstellt und einen Beschleunigungssensor (Accelerometer) umfasst, wobei der Beschleunigungssensor alternativ auch als Komponente einer sogenannten inertialen Messeinheit (engl. 'Inertial Measurement Unit', IMU) bereitgestellt sein kann.In the context of the present invention, it is proposed to carry out the desired material separation with centrifuges whose rotors and / or containers, in particular tubes, are equipped with at least one RFID transponder, this transponder preferably representing a component of an RFID system which also comprises a receiver, and Accelerometer (accelerometer) includes, wherein the acceleration sensor may alternatively be provided as a component of a so-called inertial measurement unit (Engl. 'Inertial Measurement Unit', IMU).
RFID (engl. 'radio-frequency identification') bezeichnet eine Technologie für Sender-Empfänger-Systeme zum automatischen und berührungslosen Identifizieren und Lokalisieren von Objekten mit Radiowellen. Ein bekanntes RFID-System besteht somit aus einem Transponder, der sich am oder im Gegenstand befindet und einen kennzeichnenden Code enthält, sowie einem Lesegerät zum Auslesen dieser Kennung. Erfindungsgemäß ist der Transponder in der Trennvorrichtung einer Zentrifuge wie insbesondere am Rotor und/oder am Zentrifugenröhrchen und somit in unmittelbarer Nähe zum aufzutrennenden Gut angeordnet, wobei die Anordnung des Transponders alternativ auch im Rotor und/oder im Zentrifugationsröhrchen bzw. ggfs. im aufzutrennenden Gut erfolgen kann. Obwohl erfindungsgemäß bevorzugt RFID-Systeme der vorbezeichneten Art, d.h. mit kennzeichnendem Code des Transponders und Lesegerät zum Auslesen der Kennung, eingesetzt werden, können insbesondere die mit einem RFID-Transponder versehenen Zentrifugationsröhrchen als Ein- oder Mehrwegartikel ausgestaltet sein. Da die Möglichkeit besteht, RFID-Transponder über ein spezielles Druckverfahren schaltungsstabil und hitzeresistent in Polymere einzubetten, ist es erfindungsgemäß bevorzugt, Zentrifugationsröhrchen aus Kunststoff zu verwenden, die durch vorbezeichnete Spritzgussverfahren unter Einlagerung solcher hitzeresistenter RFID-Transponder aus Polymeren hergestellt worden sind.RFID (Radio Frequency Identification) refers to a technology for transceiver systems for the automatic and contactless identification and localization of objects with radio waves. A known RFID system thus consists of a transponder, which is located on or in the article and contains a distinctive code, and a reader for reading this identifier. According to the invention, the transponder is arranged in the separating device of a centrifuge, in particular on the rotor and / or on the centrifuge tube and thus in the immediate vicinity of the material to be separated, wherein the arrangement of the transponder alternatively also take place in the rotor and / or in the centrifugation tube or, if necessary, in the material to be separated can. Although according to the invention preferred RFID systems of the Type, ie, with the code of the transponder and reader for reading the identifier, can be used, in particular provided with an RFID transponder centrifugation tube can be configured as disposable or reusable article. Since it is possible to embed RFID transponders circuit stable and heat-resistant in polymers via a special printing process, it is inventively preferred to use centrifugation tubes made of plastic, which have been prepared by the aforementioned injection molding process with storage of such heat-resistant RFID transponder made of polymers.
Die aktuell verfügbaren RFID-Transponder (RFID-Chips) ermöglichen bereits eine Temperaturbeständigkeit bei 220°C für die Zeitdauer einer Stunde, was dem Temperaturbereich für Spritzgussverfahren im Rahmen der Herstellung von Zentrifugationsröhrchen aus Kunststoff weitgehend entspricht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird daher bevorzugt die Bereitstellung sowie Verwendung von Trennvorrichtungen wie insbesondere Zentrifugationsröhrchen mit eingelagerten RFID-Transpondern vorgeschlagen, welche in die Spritzgussform oder für das Spritzblasverfahren des Röhrchens bereits in den Vorförmling eingebracht worden sind. Besonders bevorzugt ist die Verwendung sowie Bereitstellung von Trennvorrichtungen wie insbesondere von Zentrifugationsröhrchen mit RFID-Transpondern, die in das Endstück (in die Wandung des Bodens) des Vorförmlings eingebracht worden sind, so dass der Transponder unter Anwendung des Spritzblasverfahrens bei der nachfolgenden Verfestigung des Förmlings im Boden des Zentrifugenröhrchens dauerhaft fixiert angeordnet ist. Vorzugsweise weist der RFID-Transponder zusätzliche Aussparungen auf, die eine Orientierung und Positionierung sowie ein Abstandhalten während des Spritzgussverfahrens erleichtern. Alternativ und in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung und des aufzutrennenden Gutes wird bevorzugt, einen handelsüblichen RFID-Transponder unabhängig von seiner Beschaffenheit und Herstellungsweise vor dem Trennvorgang oder der Zentrifugation lose in das Zentrifugenröhrchen einzulegen, oder ein Röhrchen mit einer Möglichkeit zur Aufnahme des Transponders wie z.B. einem Schlitz am Boden oder der Verschlusskappe zu verwenden, wodurch die Zentrifugation in beiden Fällen in Anwesenheit des RFID-Transponders im Zentrifugationsröhrchen erfolgt.The currently available RFID transponders (RFID chips) already allow a temperature resistance at 220 ° C for the duration of one hour, which corresponds to the temperature range for injection molding in the context of the production of centrifugation plastic tubes. In the context of the present invention, it is therefore preferable to provide and use separation devices, in particular centrifugation tubes with embedded RFID transponders, which have already been introduced into the injection mold or for the injection blow molding process of the tube into the preform. Particularly preferred is the use and provision of separation devices such as in particular of centrifugation tubes with RFID transponders, which have been introduced into the tail (in the wall of the bottom) of the preform, so that the transponder using the injection blown in the subsequent solidification of the Förmlings in Bottom of the centrifuge tube is permanently fixed. Preferably, the RFID transponder has additional recesses which facilitate orientation and positioning as well as spacing during the injection molding process. Alternatively, and depending on the specific application and the material to be separated is preferred to insert a commercial RFID transponder regardless of its nature and method of preparation prior to the separation process or centrifugation loose in the centrifuge tube, or a tube with a way to accommodate the transponder such as a slot on the bottom or the cap to use, whereby the centrifugation takes place in both cases in the presence of the RFID transponder in the centrifuge tube.
Alternativ oder zusätzlich wird vorgeschlagen, den mit der Funktion eines Beschleunigungssensors ausgestatteten RFID-Transponder in oder an einem Rotor als Trennvorrichtung anzuordnen. Bei gewissen technischen Zentrifugationsprozessen werden keine Röhrchen benötigt, sondern es kommt direkt zur Trennung des Gutes im Rotor. Meist geht es dabei um die kontinuierliche Trennung von Suspensionen. Gerade im biologischen Bereich werden oft Zellen einer kontinuierlichen Flusszentrifugation (engl. Continuous Flow Centrifugation) unterworfen. Das erfolgt im niedertourigen Bereich bis 1000 g, wobei es jedoch aufgrund der Größe der Rotoren in Abhängigkeit von der konkreten Positionierung des aufzutrennenden Gutes innerhalb des Rotors zu erheblichen Unterschieden hinsichtlich der am Trennungsgut herrschenden g-Kraft kommen kann. Im Falle der Verwendung derartig mit RFID-Transpondern bestückter Rotoren ist es daher bevorzugt, eine mehrfache punktuelle Überwachung (erhöhte örtliche Auflösung durch gleichzeitige Verwendung mehrerer RFID-Transponder) der tatsächlich vorherrschenden Beschleunigungskräfte durchzuführen, um eine verbesserte Ausbeute und Viabilität von Zellen und Zellprodukten zu ermöglichen.Alternatively or additionally, it is proposed to arrange the equipped with the function of an acceleration sensor RFID transponder in or on a rotor as a separation device. In certain technical Zentrifugationsprozessen no tubes are needed, but it comes directly to the separation of the material in the rotor. Mostly it is about the continuous separation of suspensions. Especially in the biological field, cells are often subjected to continuous flow centrifugation. This is done in the low-speed range up to 1000 g, but due to the size of the rotors depending on the specific positioning of the material to be separated within the rotor can lead to significant differences in the g-force prevailing at the separation material. In the case of the use of rotors equipped with RFID transponders, it is therefore preferable to carry out a multiple punctual monitoring (increased spatial resolution by simultaneous use of several RFID transponders) of the actually prevailing acceleration forces in order to enable an improved yield and viability of cells and cell products ,
Im Rahmen der vorstehenden Abhandlung wird darauf hingewiesen, dass vor allem während der Beschleunigungs- und Abbremsphasen eines Trennvorganges Unterschiede hinsichtlich der wirkenden Beschleunigungskraft g auftreten (s.
Insbesondere bei Ausschwingrotoren und der Verwendung von Gradientensystemen kann es während der Zentrifugation zu erheblichen Positionsunterschieden der Partikel kommen, weshalb insbesondere bei der Aufreinigung von Zellen Unterschiede hinsichtlich Viabilität und Ausbeute beobachtet werden können. Je weiter eine Zelle von der Zentrifugationsachse entfernt ist, desto größer ist die Kraft, die auf sie wirkt und bei ihr Schaden anrichten kann. Die g-Kraft in einer Zentrifuge (auch Radial Centrifugal Force (RCF)) lässt sich über die eingestellte Drehzahl sowie über den Abstand von der Zentrifugationssäule (Drehachse) nach folgender Formel berechnen
Ein Unterschied hinsichtlich der g-Kraft bei einem angenommenen Abstand von 10 cm des aufzutrennenden Gutes zur Zentrifugations- oder Drehachse kann sowohl in einem Zentrifugenröhrchen als auch in einem Rotor leicht zustande kommen. Bei einem Abstand von 1 cm und einer Drehzahl von 5000 rpm ergibt sich eine RCF von 279,5 g. Bei 10 cm Abstand und 5000 rpm ergibt sich 2795 g für die RCF. Während 280 g für Zellen gut verträglich sind, können g-Kräfte von über 1000 g Zellen zerstören und zum Platzen bringen. Daraus wird deutlich, dass ein (örtlich) mehrfaches Einbringen von mit Beschleunigungssensoren ausgestatteten RFID-Transpondern in ein Röhrchen, einen Rotor, oder eine andere Trennvorrichtung vorteilhaft sein kann und damit bevorzugt ist. Dies gilt insbesondere im Falle einer gewünschten differenzierten Trennung von Zellen und Biomolekülen.A difference in the g-force at an assumed distance of 10 cm of the material to be separated to Zentrifugations- or rotation axis can easily come about both in a centrifuge tube and in a rotor. At a distance of 1 cm and a speed of 5000 rpm results in a RCF of 279.5 g. At 10 cm distance and 5000 rpm results in 2795 g for the RCF. While 280 g are well tolerated by cells, g-forces of over 1000 g can destroy cells and cause them to burst. It is clear that a (locally) multiple introduction of equipped with acceleration sensors RFID transponders in a tube, a rotor, or another separation device can be advantageous and is therefore preferred. This is especially true in the case of a desired differentiated separation of cells and biomolecules.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention will be explained in more detail with reference to embodiments.
Für die Ausführung der erfindungsgemäßen Lehre wurden RFID-Transponder 4 mit integrierter Funktionalität eines Beschleunigungssensors von ST Electronics (Genf, Schweiz) bezogen. Sie sind bis ca. 200°C temperaturbeständig, umfassen eine Antenne und weisen eine Größe von ca. 3 mm x 3 mm sowie eine Dicke von ca. 1 mm auf (s.
Der passive RFID-Transponder 4 lässt sich aufgrund der geringen Größe am einfachsten in den Kunststoff des herzustellenden Zentrifugenröhrchens 1 einarbeiten. Passive RFID-Transponder haben allerdings keine unabhängige Stromquelle, weshalb sie vor ihrem Einsatz über eine RFID-Reader/Senderstation entsprechende Signale erhalten, damit sie Daten senden oder schreiben können. Anschließend wird über die integrierte Antenne eine Induktion ausgelöst, wodurch der RFID Transponder 4 mit ausreichend Strom (ca. 0,35 Watt) versorgt wird. Diese Strömmenge reicht aus, um auch das in den RFID Transponder 4 integrierte 3-Wege Accelerometer für den nachfolgenden Zentrifugationsvorgang ausreichend zu versorgen.The
In mehreren Parallelversuchen wurde ein Aktivierungssender/Empfänger sowohl an, in als auch in der Nähe der zu benutzenden Zentrifuge angebracht. Die Zentrifugenröhrchen 1 mit passivem RFID-Transponder 4 (Empfangsreichweite 1-6 m) wurden vor der jeweiligen Zentrifugation für einige Sekunden in Reichweite des Senders gebracht. Eine erfolgte Aktivierung konnte über das Display des Senders/Empfängers überprüft werden. Der Zentrifugationsvorgang wurde gestartet. Die passiven RFID-Transponder 4 sendeten die Daten in Echtzeit an den Sender/Reader. Dieser übermittelte die Daten der Beschleunigungsmessung an eine Datenbank. Durch die ständige Aktivierung der Transponder 4 war eine durchgehende Übermittlung der Zentrifugationsdaten auch bei längeren Zentrifugationsprozessen stets gewährleistet.In several parallel experiments, an activating transmitter / receiver was mounted both on and in the vicinity of the centrifuge to be used. The
Im Rahmen der alternativen Verwendung von semipassiven RFID-Transpondern 4, die eine begrenzte Stromzufuhr haben, konnte auf eine Aktivierung durch eine Sender/Reader-Einheit vor der Zentrifugation verzichtet werden. Die Aktivierung erfolgte über das integrierte Accelerometer, d.h. dass Datenschreibvorgänge nur ab einer vorher festgelegten Zentrifugalkraft von 50 g ausgelöst wurden. Das Auslesen des RFID-Transponders 4 erfolgte zu einem späteren Zeitpunkt und an einem anderen Ort. Diese Anwendung hat den Vorteil, dass der Einsatzort nicht die Voraussetzung haben muss, die RFID-Transponderdaten online auszulesen. So ist ein sehr flexibler Einsatz der erfindungsgemäß mit RFID-Transpondern 4 ausgestatteten Zentrifugenröhrchen 1 möglich, selbst in weniger technologisierten Umgebungen.In the context of the alternative use of
Als praktische Anwendung der erfindungsgemäß vorgeschlagenen RFID-Accelerometer Technologie bei Zentrifugationsprozessen wird hier die Aufreinigung von PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) herangezogen, welche eine Vorstufe der für die T-Zell basierte Immuntherapie darstellt. Ein häufiger Anwendungsfehler ist die Einstellung der Drehzahl in Umdrehungen (rpm) anstatt der beabsichtigten radialen Zentrifugalkraft bzw. Beschleunigung (RCF oder g). Das kann dazu führen, dass die gewünschte Auftrennung der verschiedenen Zellpopulationen nicht wie gewünscht stattfindet. Hierzu wurde folgende Versuchsreihe durchgeführt.As a practical application of the inventively proposed RFID accelerometer technology in centrifugation processes, the purification of PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) is used here, which represents a precursor of the T cell-based immunotherapy. A common application error is the setting of the speed in revolutions (rpm) instead of the intended radial centrifugal force or acceleration (RCF or g). This can lead to the desired separation of the different cell populations not taking place as desired. For this purpose, the following series of experiments was carried out.
50 ml Zellkulturröhrchen 1 (Art.Nr. 210261 Greiner BioOne, Frickenhausen, Deutschland) wurden mit Hilfe von 2-Komponenten Kleber 11 (Henkel, Düsseldorf, Deutschland) mit je einem RFID-Transponder mit Accelerometer 4 (Accelerometer: H3LIS331DL, ST-Electronics, Genf, passiver RFID-Transponder Andy 100 IC, Farsens, San Sebastian, Spanien) in Deckel 2 und Boden 3 versehen und diese entsprechend versiegelt. Nach abgeschlossener Trocknung wurden die Röhrchen 1 für ca. 10 Sekunden über einen Impinj R220 UHF RFID Reader gehalten (ebenfalls Farsens), um die passiven RFID-Transponder 4 zu aktivieren. Anschließend wurden die Röhrchen 1 mit 20 ml Ficoll Paque Gradientenmedium 5 beladen (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Anschließend wurden vorsichtig 20 ml EDTA-Vollblut 6 aus einer Eigenblutspende in das Röhrchen 1 gegeben (s.
Die
Die
In den
- 11
- Zentrifugationsröhrchen, Zellkulturröhrchen, Röhrchen, ZentrifugationsbehältnisCentrifuge tube, cell culture tube, tube, centrifuge container
- 22
- Deckelcover
- 33
- Bodenground
- 44
- Beschleunigungssensor, RFID-Transponder mit Accelerometer, RFID-Accelerometer, Accelerometer, TransponderAccelerometer, RFID transponder with accelerometer, RFID accelerometer, accelerometer, transponder
- 55
- Gradientenmediumgradient medium
- 66
- EDTA-VollblutEDTA whole blood
- 77
- Plasmaplasma
- 88th
- Mononukleäre ZellenMononuclear cells
- 99
- Granulozyten, polymorphnukleäre ZellenGranulocytes, polymorphonuclear cells
- 1010
- Sediment aus Erythrozyten, ErythrozytensedimentSediment from erythrocytes, erythrocyte sediment
- 1111
- 2-Komponenten Kleber2-component adhesive
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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EP17208556.5A EP3501660A1 (en) | 2017-12-19 | 2017-12-19 | Method and device for the separation of substances by centrifugation |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN110479504A (en) * | 2019-07-10 | 2019-11-22 | 安徽嘉文仪器装备有限公司 | A kind of differential system and application method of centrifuge |
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-
2017
- 2017-12-19 EP EP17208556.5A patent/EP3501660A1/en not_active Withdrawn
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