EP3491143A1 - Substrat spécifique d'une isoenzyme de l'aldh - Google Patents

Substrat spécifique d'une isoenzyme de l'aldh

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Publication number
EP3491143A1
EP3491143A1 EP17749666.8A EP17749666A EP3491143A1 EP 3491143 A1 EP3491143 A1 EP 3491143A1 EP 17749666 A EP17749666 A EP 17749666A EP 3491143 A1 EP3491143 A1 EP 3491143A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
aldh
specific substrate
substrate according
isoenzyme
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP17749666.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Ismail Ceylan
Guillaume Martin
Gérard Quash
Milleidys PEREZ-ALEA
Guy Fournet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Advanced BioDesign SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Advanced BioDesign SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1, Advanced BioDesign SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3491143A1 publication Critical patent/EP3491143A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/007—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isoenzyme profiles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/20—Coumarin derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/40—Triphenylmethane dye chromogens, e.g. fluorescein derivatives

Definitions

  • the present invention relates to a substrate specific for an isozyme I ALDH, a composition comprising at least one such substrate, a diagnostic marker comprising such a substrate, and their associated uses and methods.
  • ALDHs Aldehydes dehydrogenases
  • ALDHs are a group of enzymes that catalyze the oxidation (dehydrogenation) of aldehydes.
  • nineteen genes encoding ALDHs have been identified in the human genome. These genes participate in a wide variety of biological processes, including the detoxification of aldehydes generated exogenously and endogenously.
  • the ALDHs are found in all subcellular regions including in the cytosol, in the mitochondria, in the endoplasmic reticulum and the core, many of them ending up in more than one compartment. Most ALDHs have a broad tissue distribution and display distinct substrate specificity.
  • ALDHs Generally considered to be detoxifying enzymes, ALDHs have been shown to protect against aldehyde-induced cytotoxicity. ALDHs also have a central role in physiological functions and processes, such as embryogenesis and development.
  • the ALDH1 isoenzyme would play a central role in embryogenesis and development mediated by retinoic acid signaling. It would also be involved in the detoxification of methional while the ALDH3 be involved in the 4-hydroxynonal, these two compounds being apoptogenic endogenous aldehydes. ALDH1 and ALDH3 are also thought to be related to cellular defense mechanisms against UV radiation inducing damage in ocular tissue.
  • the ALDH2 isozyme is itself a mitochondrial isozyme primarily related to the detoxifying acetaldehyde in the second step in the metabolism of alcohol.
  • ALDHs were studied for their potential use as a universal marker of normal and cancer stem cells, since some of the ALH isoenzymes would have been identified as key elements of these cells. For example, ALDH 1 has been shown to be elevated in hematopoietic stem cells and could be used to isolate them.
  • ALDEFLUOR TM assay (Stemcell Technologies Inc.). This ALDEFLUOR TM test uses a fluorescent substrate that can be metabolized by many isoenzymes of ALDH.
  • the substrate of ALDH BODIPY-aminacétaldéhyde (BAAA) is converted to BODIPY aminoacetate in the presence of ALDH, and the latter accumulates in the cells and enhances their fluorescence by issuing a green color.
  • BAAA BODIPY-aminacétaldéhyde
  • the ALDEFLUOR TM does not differentiate the various isoenzymes of ALDH.
  • the subject of the present invention is therefore a substrate specific for an isoenzyme of ALDH comprising a compound:
  • R-COO-A (I) resulting from the esterification of a fluorescent tracer A-OH with an acylating agent derived from the corresponding acid RCOOH, wherein R is selected so as to form the retinoate, propionate, octanoate, benzoate, 4-aminobutyrate, the hexanoate, 4-diethylaminobenzoate or 4-hydroxy-2-nonenoate; or
  • a substrate specific for an isoenzyme of ALDH comprising a compound:
  • R and R ' are chosen so as to form the retinoate, propionate, octanoate, benzoate, 4-aminobutyrate, hexanoate, 4-diethylaminobenzoate or 4-hydroxy-2-nonenoate; and
  • A-OH is a fluorescent tracer.
  • A is thus the esterified form of A-OH which is a fluorescent tracer, when the latter is free.
  • the present invention also concerns the use of a specific substrate in an invention to quantify isozyme of ALDH in a cell population.
  • the present invention also relates to the use of a specific substrate of the invention to distinguish healthy stem cells from cancer stem cells.
  • the present invention also relates to the use of a specific substrate according to the invention to characterize the different stages of cancer or the various stages of differentiation of stem cells.
  • the present invention also relates to a composition comprising at least one specific substrate according to the invention.
  • the present invention also relates to a diagnostic marker comprising a specific substrate according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a marker according to the invention for the diagnosis of a disease involving dysregulation of a isozyme of ALDH.
  • the marker is used to determine if a subject is likely to respond to a therapy that inhibits the activity of an isoenzyme of ALDH and / or directed against cancer stem cells.
  • the present invention also relates to a method for distinguishing cells expressing at least one isoenzyme of ALDH in a cell population, said method comprising:
  • the present invention also relates to a kit for quantifying an isozyme of ALDH comprising at least one specific substrate according to the invention.
  • the invention relates to a specific substrate of an isozyme of ALDH comprising a compound:
  • R-COO-A (I) resulting from the esterification of a fluorescent tracer A-OH with an acylating agent derived from the corresponding acid RCOOH, wherein R is selected so as to form the retinoate, propionate, octanoate, benzoate, 4-aminobutyrate, the hexanoate, 4-diethylaminobenzoate or 4-hydroxy-2-nonenoate; or
  • R and R ' identical or different, are chosen so as to form the retinoate, propionate, octanoate, benzoate, 4-aminobutyrate, hexanoate, 4-diethylaminobenzoate or 4-hydroxy-2- nonenoate.
  • the compound of formula (II) may also be described as having the formula: R-COO-A-OOC-R ', wherein the fluorescent tracer is of formula HO-A-OH and is fluorescein.
  • specific substrate of an isoenzyme of ALDH means a chemical molecule that will specifically interact with a particular isoenzyme of ALDH as ALDH1 I or I ALDH3 for example, to produce a chemical reaction which, in the scope of the present invention, will free a fluorescent molecule (a-OH) allowing to identify with certainty said particular isozyme of ALDH.
  • the specific substrate is cleaved by an isozyme of ALDH that allow the release of the fluorescent tracer A-OH.
  • the specific substrate according to the invention results from the esterification of the fluorescent tracer A-OH with an acylating agent derived from the corresponding acid RCOOH or R'COOH.
  • the corresponding ester is propionate
  • the corresponding ester hexanoate when R and / or R 'whose acid RCOOH and / or R'COOH is a retinoic acid
  • the corresponding ester is the retinoate when R and / or R 'whose acid RCOOH and / or R'COOH is a benzoic acid
  • the corresponding ester is benzoate when R and R' of which the acid RCOOH and / or R 'is a COOH 4-diethyl-aminobenzoic acid
  • the corresponding ester is diethyl-4-aminobenzoate, when R and R 'of which the acid RCOOH and / or R'COOH is 4-hydroxy-2-
  • the corresponding ester is octanoate, when R and / or R' is ethyl, the corresponding ester is the propionate, and when R / or R 'is phenyl, the corresponding ester is benzoate, when R and / or R' is 3-aminopropyl, the corresponding ester is 4-aminobutyrate, etc.
  • A is defined such that the hydroxylated form of A which is A-OH), is a fluorescent tracer.
  • the latter forms an ester with specific substrates by formulas (I) R-COO-A and (II) R-COO-A-OOC-R 'which after cleavage of the ester function leads to the release of the acid RCOOH and / or R'COOH and said fluorescent tracer A-OH.
  • Table 1 gives the structure of the substituents R and R ' according to the invention, linked to the fluorescent tracer. The table also shows the specificity of each vis-à-vis substrate isoenzymes of ALDH.
  • fluorescent tracer is meant a chemical compound that can be identified by fluorescence.
  • a fluorescent tracer of the invention is a fluorochrome or a fluorophore, ie a chemical substance capable of emitting fluorescence light after excitation.
  • the fluorophore is released under the action of an isozyme of ALDH.
  • the fluorophores are well known to those skilled in the art (see eg Manafi (2000) Int J Food Microbiol. 60:. 205-218).
  • A-OH is chosen from 7-hydroxycoumarin, a fluorophore of the tokyo green family, in particular 2-methyl-4-methoxy-Tokyo Green, resorufin and fluorescein. .
  • These tracers are known to the art and are either commercially available or can be synthesized by methods well known to the skilled person.
  • 2-methyl-4-methoxy-Tokyo Green is also named 6-Hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-xanthen-3-one, 2-Me-4-OMe TokyoGreen or 2-Me-4- OMe TG.
  • the following molecules the retinoate resorufin, resorufin propionate, octanoate resorufin, benzoate resorufin, 4-aminobutyrate resorufin, the hexanoate resorufin, 4-diéthylaminobenzoate resorufin or 4-hydroxy-2-nonenoate resorufin, the retinoate 7-hydroxycoumarin propionate, 7-hydroxycoumarin, octanoate 7-hydroxycoumarin benzoate, 7-hydroxycoumarin, the 4- aminobutyrate 7-hydroxycoumarin, the hexanoate 7-hydroxycoumarin, 4-diéthylaminobenzoate of 7-hydroxycoumarin or 4-hydroxy-2-nonenoate 7- hydroxycoumarin, the retinoate 2-methyl-4-methoxy-Tokyo Green, propionate 2-
  • ALDH aldehyde dehydrogenases
  • ALDHs In humans, 19 ALDHs have been identified, including as many genes. They are divided into subgroups: ALDHI comprising ALDH1 A1, ALDH1 A2, ALDH1 A3, ALDH1 B1, ALDH1 L1 and ALDH1 L2, ALDH2, I ALDH3 comprising ALDH3A1, ALDH3A2, ALDH3B1 and ALDH3B2, I ALDH4, ALDHS, I ALDH6, TALDH7 the ALDH8, I ALDH9 the ALDHI 6, and ALDH18.
  • ALDHI comprising ALDH1 A1, ALDH1 A2, ALDH1 A3, ALDH1 B1, ALDH1 L1 and ALDH1 L2, ALDH2, I ALDH3 comprising ALDH3A1, ALDH3A2, ALDH3B1 and ALDH3B2, I ALDH4, ALDHS, I ALDH6, TALDH7 the ALDH8, I ALDH9 the ALDHI 6, and ALDH18.
  • a specific substrate of the invention is a substrate specific for the ALDHI or of ALDH3.
  • R and R 'identical or different are chosen so as to form the retinoate, hexanoate or propionate.
  • a specific substrate according to the invention is selected from retinoate resorufin, the hexanoate resorufin, resorufin propionate, retinoate 7-hydroxycoumarin, the hexanoate 7- hydroxycoumarin propionate, 7-hydroxycoumarin, the retinoate 2-methyl-4- methoxy-Tokyo Green, hexanoate, 2-methyl-4-methoxy-Tokyo Green, propionate 2-methyl- 4-methoxy-Tokyo Green, fluorescein di-retinoate, fluorescein dipropionate, fluorescein di-hexanoate.
  • isozyme of ALDH is ALDH3 I
  • R and R 'identical or different are chosen so as to obtain octanoate, 4-hydroxy-2-nonenoate, the 4-diethylaminobenzoate or benzoate.
  • a specific substrate according to the invention is selected from octanoate resorufin, 4-hydroxy-2-nonenoate resorufin, benzoate resorufin, 4- diéthylaminobenzoate resorufin octanoate 7-hydroxycoumarin, 4-hydroxy-2-nonenoate 7-hydroxycoumarin benzoate, 7-hydroxycoumarin, 4-diéthylaminobenzoate of 7-hydroxycoumarin, octanoate 2-methyl-4- methoxy-Tokyo Green, 2-methyl-4-methoxy-Tokyo Green 4-hydroxy-2-nonenoate, 2-methyl-4-methoxy-Tokyo Green benzoate, 2-methyl-4-methoxy hexanoate -Tokyo Green, fluorescein di-octanoate, fluorescein di-4-hydroxy-2-nonenoate, fluorescein di-benzo
  • R and R 'identical or different are chosen so as to obtain 4-aminobutyrate.
  • a specific substrate of the invention is selected from 4-aminobutyrate resorufin, 4-aminobutyrate 7-hydroxycoumarin, 4-aminobutyrate, 2-methyl- 4-methoxy-Tokyo Green, fluorescein di-4-aminobutyrate.
  • the present invention also relates to a composition comprising at least one specific substrate according to the invention.
  • composition according to the invention thus comprises 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 or more specific substrates according to the invention.
  • the composition makes it possible to directly detect and identify several isozymes of ALDH.
  • the composition comprises a substrate specific for the ADLHI and a specific substrate of the ALDH3 or a specific substrate of the ALDHI and I ALDH9, or ALDH3 and ALDH 9 or the ALDHI to TALDH3 and ALDH9.
  • composition according to the invention may for example comprise one or more of the following specific substrates: the retinoate resorufin, resorufin propionate, octanoate resorufin, benzoate resorufin, 4-aminobutyrate resorufin, the hexanoate resorufin or 4-hydroxy-2-nonenoate resorufin, 4- diéthylaminobenzoate resorufin, the retinoate 7-hydroxycoumarin propionate, 7-hydroxycoumarin, octanoate 7-hydroxycoumarin, 7-hydroxycoumarin benzoate, 7-hydroxycoumarin 4-aminobutyrate, 7-hydroxycoumarin hexanoate or 7-hydroxycoumarine 4-hydroxy-2-nonenoate, 7-hydroxycoumarine 4-diethylaminobenzoate, 2-methyl-4-methoxy retinoate Tokyo Green, propionate 2-methyl-4-methoxy
  • the specific substrate according to the invention is characterized in that isozyme of ALDH is detected in a cell population.
  • cell population is meant a set of cells of the same origin or of different origin and whose characteristics (genetic sequences, levels of expression, state of differentiation) are identical or different.
  • the cell population comprises at least 2 cells, for example 10, 100, 1000 or 1 000 cells.
  • the specific substrate is detected in vitro or ex vivo by the use of the fluorescence technique plate of flow cytometry technique and / or immunofluorescence.
  • the specific substrates according to the invention are useful for identifying the different isoenzymes of ALDH. They allow in particular to identify cells expressing different ALDH isoenzymes (eg, certain types of stem cells) and distinguish in a mixed population of those who do not isoenzyme expression of ALDH or not the same isozyme of ALDH.
  • the substrates of the invention can also be used to distinguish cells that express isozyme of ALDH to a high degree of the cells that express it to a lesser degree.
  • the present invention relates to the use of at least one specific substrate according to the invention to quantify at least one isoenzyme of ALDH in a cell population.
  • the present invention also relates to the use of at least one specific substrate according to the invention to isolate and / or select a portion of a cell population of overexpressing an isoenzyme ALDH.
  • the present invention also relates to the use of at least one specific substrate according to the invention to sort all or part of a cell population according to their expression of at least one isoenzyme of ALDH.
  • At least one isoenzyme of ALDH means 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 17, 18 or 19 isoenzymes of ALDH.
  • the 19 isoenzymes have been described previously.
  • At least one specific substrate according to the invention has the same meaning as previously described.
  • the present invention also relates to a method for quantifying at least one isoenzyme of ALDH in a cell population, comprising the use of at least one specific substrate according to the invention.
  • Quantification can be performed using a plate fluorescence technique.
  • the identification and / or quantification of the various isozymes of ALDH thus enables to distinguish and / or identify different cell types.
  • the present invention also relates to the use of at least one specific substrate of the invention to distinguish healthy stem cells from cancer stem cells.
  • It also relates to a method for distinguishing healthy stem cells from cancer stem cells comprising the use of at least one specific substrate of the invention.
  • Said method and said use also make it possible to isolate these cells, including for example a step of isolation of cells exhibiting fluorescence.
  • cancer stem cells are meant, for example, stem cells of cancer of the bladder, breast, cervix, colon, head and neck, liver, lung, pancreas, prostate, ovarian, leukemia.
  • the specific substrate according to the invention is used to distinguish the stem cells of solid cancers and / or hematologic malignancies.
  • solid cancer is meant, for example, breast, lung or prostate cancer.
  • hematological malignancies means leukemia, lymphomas or myeloma.
  • the stem cells of interest are cancerous or healthy hematopoietic cells.
  • the identification and / or quantification of different isoenzymes of ALDH also allows to characterize different stages of a disease or differentiation of cells.
  • the present invention also relates to the use of at least one specific substrate according to the invention to characterize the different stages of cancer or the various stages of differentiation of stem cells.
  • It also relates to a method for characterizing the various stages of cancer or the various stages of stem cell differentiation comprising the use of at least one specific substrate according to the invention.
  • differentiated steps of stem cells are meant the steps which are well known to those skilled in the art, in particular the following steps: undifferentiated cells, poorly differentiated cells, moderately differentiated cells and well differentiated cells.
  • different stages of cancer refers to the steps that are well known to those skilled in the art, in particular the following steps: undifferentiated tumor or cancer, tumor or cancer poorly differentiated, moderately differentiated tumor or cancer, or tumor well differentiated cancer.
  • Specific substrates according to the invention allowing the identification and / or quantification of the various isozymes of ALDH, are useful as a diagnostic marker.
  • the present invention therefore also relates to a diagnostic marker comprising a specific substrate according to the invention.
  • diagnosis marker is meant the meaning commonly attributed to these terms by a person skilled in the art, that is to say a characteristic element making it possible to confirm or invalidate a diagnosis.
  • the diagnostic marker according to the invention is a specific substrate according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a marker according to the invention for the diagnosis of a disease involving deregulation of an isoenzyme of ALDH. It also relates to a method for diagnosing a disease involving dysregulation of an isoenzyme of ALDH comprising the use of a marker according to the invention.
  • a disease involving deregulation of an isoenzyme of ALDH is a disease involving said isoenzyme will be overexpressed or under expressed in the subject patient relative to the so-called normal expression, that is to say the expression observed in a holy subject.
  • overexpressed or “overexpression” means a level of expression in the patient about higher than the healthy subject.
  • under expressed means a level of expression in the subject sick less than that of healthy subjects.
  • Such a disease can be selected from cancers, disorders of sperm motility, ischemia, head trauma or pancreatitis.
  • cancer is meant for example leukemia, breast cancer or lung cancer.
  • “Sperm motility disorders” means disorders affecting the rate at which sperm can move and pass through the woman's cervix, uterus and fallopian tubes.
  • the present invention also relates to the use of a marker according to the invention for determining whether a subject is likely to respond to therapy inhibiting the activity of an isoenzyme of ALDH and / or directed against cancer stem cells.
  • It also relates to a method for determining whether a subject is likely to respond to therapy inhibiting the activity of an isoenzyme of ALDH and / or directed against cancer stem cells comprising the use of a marker according to the invention .
  • subject in the context of the present invention, a warm-blooded animal such as a mammal, animal or human, particularly a human being.
  • the subject may be a healthy subject or a subject who is suffering from, or has the potential to be afflicted with, one or more diseases and / or conditions described within the scope of the present invention.
  • therapy inhibit the activity of an isozyme of ALDH refers to a therapy that directly or indirectly target would be an isozyme of ALDH as such I'ALDHI, ALDH3, I ALDH9 or more isoenzymes ALDH.
  • therapy directed against cancer stem cells refers to a therapy which would target cancer stem cells, one of the features is the high level of ALDH.
  • the present invention also relates to a method for distinguishing cells expressing at least one isoenzyme from ALDH in a cell population, said method comprising:
  • bringing into contact is meant in particular the incubation with at least one specific substrate according to the invention for a defined time ranging from a few minutes, for example 30 minutes to several hours, for example 4 hours or more, with the cell population.
  • a “cell population” is as defined above.
  • “At least one isozyme of ALDH” and “at least one specific substrate of the invention” are as defined above.
  • the fluorescence measurement can be performed by any method known to the skilled person.
  • an increased fluorescence with respect to the fluorescence of the cell population before said population is brought into contact with the specific substrate it is meant a florescence of the studied cell population that is greater than the fluorescence of this same cell population before that population. it has been brought into contact with the specific substrate according to the invention.
  • said method may also include an additional step d) comprising distinguishing between cells expressing the at least two isoenzymes of the ALDH.
  • This distinction can be achieved for example by observing different fluorescent colors depending on the detected isoenzyme.
  • the method comprises bringing the cell population into contact with resorufin retinoate and 7-hydroxycoumarin octanoate
  • the cells with increased red fluorescence will be identified as expressing ALDH1
  • cells with increased blue fluorescence will be identified as expressing ALDH3.
  • the present invention also relates to a kit for the uses mentioned in the context of the present invention, particularly for quantifying an isozyme of ALDH, particularly in a cell population, comprising at least one specific substrate according to the invention.
  • the kit may be a kit for diagnosing a disease involving dysregulation of an isozyme of ALDH, wherein said disease is selected for example from: cancers, disorders of sperm motility ischemia, head trauma or pancreatitis; for determining whether a subject is likely to respond to therapy inhibit the activity of an isoenzyme of ALDH and / or directed against cancer stem cells; to distinguish healthy stem cells from cancer stem cells, for example to distinguish between stem cells from solid cancers and / or hematological malignancies; or to characterize the different stages of cancer or the different stages of stem cell differentiation.
  • a disease involving dysregulation of an isozyme of ALDH wherein said disease is selected for example from: cancers, disorders of sperm motility ischemia, head trauma or pancreatitis; for determining whether a subject is likely to respond to therapy inhibit the activity of an isoenzyme of ALDH and / or directed against cancer stem cells; to distinguish healthy stem cells from cancer stem cells, for example to distinguish between stem cells from solid cancer
  • kits of the invention may for example further comprise instructions for use of said kit for determining the amount of isoenzyme ALDH, particularly in a cell population, for the diagnosis of a disease involving deregulation an ALDH isoenzyme, for determining whether a subject is likely to respond to therapy inhibit the activity of an isoenzyme of ALDH and / or directed against cancer stem cells, to distinguish healthy stem cells cancer stem cells, or to characterize the different stages of cancer or the various stages of differentiation of stem cells.
  • kits may be provided in the form of a solid (for example freeze-dried) or in liquid form.
  • Kits of the present invention may optionally include different containers (eg, ampule, test tube, vial or bottle) for each compound. Each compound will usually be aliquoted in its container or provided in a concentrated form. Other suitable containers for carrying out certain steps of the methods described in the context of the present invention may also be provided.
  • containers eg, ampule, test tube, vial or bottle
  • Figure 1 Plot of ichaelis- enten to determine the K m and V max of resorufine propionate on ALDH1A1, ALDH2 and ALDH3A1.
  • Figure 2 Assay of ALDH activity 1 by resorufin propionate after treatment with interfering RNA ALDH1A1.
  • Figure 3 Assay of ALDH1 activity by resorufin propionate after treatment with inhibitors of ALDH 1 and 3.
  • Figure 4 Activity ALDH1 detected by flow cytometry via resorufin propionate.
  • Figure 5 Determination of activity by the ALDH1 retinoate resorufin and fluorescein di-retinoate and ALDH3 by benzoate resorufin and fluorescein di- benzoate after treatment with retinoic acid.
  • Figure 6 Assay of ALDH1 activity by resorufin retinoate and fluorescein di-retinoate and ALDH3 by resorufin benzoate and fluorescein dibenzoate after Disulfiram (DSF) treatment.
  • the spray gas flow was at 0.4 bar and the capillary voltage at 3500v.
  • the solutions were perfused at 10 ⁇ l / min in a solvent mixture (methanol / dichloromethane / water 45/40/15) with 1% formic acid.
  • the mass range of the assay was 50-1000m-z and the calibration was performed with sodium formate.
  • the compounds were prepared from resorufin (sodium salt) (Sigma) with the corresponding acid chloride (2 equivalents) in dichloromethane (0.05M) in the presence of DI PEA (diisopropylethylamine, 2 equivalents) .
  • the compound was prepared in the same manner as the previous ester using commercial retinoic acid (yield. 40%).
  • the crude (orange-red solid) obtained was washed with MeOH and purified by chromatography on silica gel (MeOH / DCM: 1/99). Further washing with EtOH followed by MeOH gave 100 mg (40%) of pure product.
  • 2-Me-4-MeO tokyo-green (CAS No. 643755-84-4: 6-hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-Xanthen-3-one) was synthesized in two steps: a bis-silylation of 3.6- commercial dihydroxyxanth-9-one produced according to the procedure described in the article "J. Biol. ChemVol. 264, No. 14. Issue of May 15, PP. 8171-8178, 1989 "led to the 3,6-bis (tbutyldiméthylsilyloxy) xanthone.
  • a second step carried out according to the procedure described in the article Chem. Eur. J. 2014, 20, 447. 455 "consisting of a treatment using magnesium from 2-Bromo-3-methoxytoluene followed by acid hydrolysis gave 2-Me-4-MeO tokyo green.
  • the compound was prepared from 2.1 equivalents of retinoic acid, 2.1 equivalents of EDCI, 0.1 equivalent of 4-DMAP. Scale: 0.5 mmol, purification by chromatography on silica gel (PE / EtOAc: 80/20). Yellow solid, 45% yield. Mp 145-150 ° C (dec);
  • esters were prepared in the same manner as previously from 7-hydroxycoumarin and acid chloride in the presence of DIPEA.
  • NCI-H522 and A 549 lung cancer cells as well as leukemia lines were used.
  • the cells were obtained from American Type Culture Collection (ATCC), the European Collection of Cell Cultures (ECACC) and Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultruren (DSMZ).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • ECACC European Collection of Cell Cultures
  • DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultruren
  • a range of resorufine propionate was made: 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80 and 70 ⁇ and 0 ⁇ .
  • 50 ⁇ solution of recombinant enzyme at 2.5 mU / well ALDH1 A1 (R & D Sytems, 5869-DH), ALDH2 (Abeam, ab87415) and ALDH3A1 (R & D Sytems, 6705-DH) was added. The incubation was carried out for 30 minutes at + 37 ° C.
  • the HL-60 cells were inoculated at a concentration of 50,000 cells / well in RPMI-1640 medium without phenol red supplemented with L-Glutamine, Penicillin, Streptomycin and 10% Fetal Calf Serum ( SVF) supplemented with dimethyl ampalthiolester (DIMATE) a specific inhibitor ALDH1 and 3, morpholino ampal thiolester (MATE) a specific inhibitor of ALDH3, at concentrations of 8 ⁇ respectively.
  • DIMATE dimethyl ampalthiolester
  • MATE morpholino ampal thiolester
  • the substrates of the different ALDHs respectively resorufine propionate for ALDH1 and resorufin 4-diethylaminobenzoate for ALDH 3 were added at a final concentration of 10 ⁇ and then incubated for one hour at +37 ° C.
  • DSF Disulfiram
  • the substrates of different ALDHs the retinoate respectively resorufin and fluorescein di- retinoate for I ALDH1 and benzoate and fluorescein di-benzoate fluorescein for ALDH 3 were added at a final concentration of 5 ⁇ then incubated for 30 minutes at +37 C.
  • the HL-60 cells were inoculated at a concentration of 50,000 cells / well in RPMI-1640 medium without phenol red supplemented with L-Glutamine, Penicillin, Streptomycin and 10% Fetal Calf Serum ( SVF) supplemented with retinoic acid, known to be an inhibitor of ALDH activity at concentrations of 1 ⁇ and 10 ⁇ . The cells were then incubated for 72 hours.
  • the substrates of different ALDHs the retinoate resorufin respectively and di-réetinoate fluorescein for I ALDH 1 and benzote fluorescein and di-benzote fluorescein for ALDH 3 were added at a final concentration of 5 ⁇ then incubated for 30 minutes at +37 ° C.
  • the NCI-H522 cells were seeded at a concentration of 250,000 cells / plates, corresponding to a confluence of 40-50%, in RPMI-1640 medium supplemented with L-Glutamine, Penicillin, Streptomycin and 10% Fetal Calf Serum (FCS) on the night at + 37 C. The next day, the medium was replaced with the same medium without FBS.
  • the transfection solution was then prepared by diluting 100 nM in 500 ⁇ l of culture medium without FCS, to which 500 ⁇ l of culture medium without FCS supplemented with 3 ⁇ l of lipofectamine 2000 (Invitrogen) was added. The solution was then incubated for 30 minutes at room temperature and then drops added to the cell solution.
  • the mixture was incubated at +37 C in a 5% CO 2 incubator for 8 hours. After incubation, the medium was changed by medium supplemented with FCS and the cells were left in culture for 48 hours. The inhibition of the protein was validated by Western Blot. The specific activity of ALDH1A1 was then assayed by fluorescence.
  • the cells were inoculated at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate in 100 ⁇ l in RPMI-1640 medium without phenol red supplemented with L-Glutamine, Penicillin, Streptomycin and 10% Fetal Calf Serum (FBS). supplemented with 10 ⁇ resorufine propionate.
  • the NCI-H522 cells were added at a cell concentration of 50,000 cells / well and then incubated in RPMI-1640 medium supplemented with L-Glutamine, Penicillin, Streptomycin and 10% Fetal Calf Serum overnight at + 37C with 5% CO2. The next day, the culture medium was changed with either DIMATE (5 ⁇ ) or the treatment vehicle and incubated for 6 hours. The cells were incubated for 30 minutes with culture medium supplemented with 10 ⁇ l of resorufin propionate, were then washed with cold PBS and then fixed with paraformaldehyde for 15 minutes at 37 ° C.
  • the cells were permeabilized and saturated with a PBS solution. ; 3% Bovine albumin; 0.3% Triton for 1 hour.
  • the incubation was carried out with anti-ALDM antibody A1 (R & D System, MAB5869) 1 hour at 37 C, then with an anti-mouse antibody coupled to fluorescein for 1 hour at room temperature in the dark, with PBS washes between the two steps. 3 PBS washes were performed and microscopy glasses were mounted with support of antifading supplemented with DAPI. The cells were then observed under a microscope.
  • 500,000 cells were incubated with RPMI-1640 medium supplemented with L-Glutamine, Penicillin, Streptomycin and 10% Fetal Calf Serum overnight at + 37C with 5% C02 atmosphere. .
  • the cells were taken up in medium supplemented with 15 ⁇ l of dimethyl ampalthiolester (DIMATE) a specific inhibitor of ALDH1 and 3, then incubated for 5 hours at 37 C, 5% CO2. After trypsination, the cells were taken up in supplemented RPMI medium and centrifuged at 800g for 5 minutes.
  • DIMATE dimethyl ampalthiolester
  • the cell pellet was then taken up in fresh supplemented medium containing 10 ⁇ l of resorufin propionate and then incubated for 1 hour in a tube of polycarbonate at 37 ° C., 5% CO 2. After incubation, the cells were then centrifuged and then washed in cold PBSxl and finally taken up in 200 ml of cold PBSxl. The solution was then analyzed by flow cytometry (Ex 590nm / Em 560 nm or red laser).
  • Figure 1 shows the data obtained to determine the K m and Vmax of resorufine propionate.
  • FIG. 4 illustrates ALDH1 activity detected by flow cytometry via resorufin propionate.
  • the untreated condition demonstrates the presence of living positive ALDH1 cells (Calcein-AM).
  • Bone marrow (Mo) and blood (Sg) were obtained from 33 patients with their enlightened chords. The evaluations were performed on whole blood after lysis of red blood cells or bone marrow.
  • the isolation of the blast cells was performed by a Navios flow cytometer (Beckman Coulter®) according to the phenotype of the latter indicated in Table 5 (CD34 +, CD1 17+ or CD45 weak).
  • ALDH1 and ALDH3 activity was evaluated by incubating reagents: resorufin retinoate or resorufine octanoate at 5 pmol.L “1 and fluorescein di-retinoate or fluorescein dioctanoate at 0.8 pmol.L " 1 in blood after total lysis of the erythrocytes or in the extract bone marrow for 30 minutes at 37 C. the observed fluorescence is analyzed by cytometry to give a median fluorescence intensity value (MFI) corresponding to the relative activity of each isoform of ALDH blast cells.
  • MFI median fluorescence intensity value
  • Table 4 Patient parameters included in the study of the different activities of Aldehydes Dehydrogenases.
  • AML Acute Leukemia Myeloide
  • AREB Refractory Anemia with Excess Blasts
  • Sg blood
  • Mo bone marrow
  • I FM value of the Median Fluorescence Intensity.

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Abstract

La présente invention concerne un substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH, une composition comprenant au moins un tel substrat, un marqueur diagnostique comprenant un tel substrat, ainsi que leurs utilisations et méthodes associées.

Description

Substrat spécifique d'une isoenzyme de i'ALDH
La présente invention concerne un substrat spécifique d'une isoenzyme de I'ALDH, une composition comprenant au moins un tel substrat, un marqueur diagnostique comprenant un tel substrat, ainsi que leurs utilisations et méthodes associées.
Les aldéhydes déshydrogénases (ALDHs) sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'oxydation (déshydrogénation) des aldéhydes. A ce jour, dix-neuf gènes codant pour les ALDHs ont été identifiés dans le génome humain. Ces gènes participent à une grande variété de processus biologiques, y compris la détoxification des aldéhydes générés par voie exogène et endogène. Les ALDHs se retrouvent dans toutes les régions subcellulaires y compris dans le cytosol, dans les mitochondries, dans le réticulum endoplasmique et le noyau, plusieurs d'entre elles se retrouvant dans plus d'un compartiment. La plupart des ALDHs ont une large distribution tissulaire et affichent une spécificité de substrat distinct.
Généralement considérées comme des enzymes de détoxification, il a été montré que les ALDHs ont une action de protection contre la cytotoxicité induite par les aldéhydes. Les ALDHs auraient par ailleurs un rôle central dans les fonctions et les processus physiologiques, tels que l'embryogenèse et le développement.
En particulier, l'isoenzyme ALDH1 jouerait un rôle central dans l'embryogenèse et le développement par la médiation de la signalisation de l'acide rétinoïque. Elle serait également impliquée dans la détoxification du méthional alors que l'ALDH3 serait impliquée dans celle du 4-hydroxynonal, ces deux composés étant des aldéhydes apoptogéniques endogènes. Les ALDH1 et ALDH3 seraient également liées aux mécanismes de défense cellulaire contre les rayonnements UV induisant des dommages dans le tissu oculaire. L'isoenzyme ALDH2 est quant à elle une isoenzyme mitochondriale principalement liée à la détoxification de l'acétaldéhyde dans la deuxième étape du métabolisme de l'alcool.
Il y a plus de 20 ans, les ALDHs ont été étudiées pour leur utilisation potentielle en tant que marqueur universel des cellules souches normales et cancéreuses, étant donné que certaines isoenzymes des ALDHs auraient été identifiées comme des éléments clés de ces cellules. Par exemple, il a été montré que I'ALDH 1 était élevée dans les cellules souches hématopoïétiques et pouvait être utilisée pour les isoler.
Une méthode commune utilisée pour identifier et isoler les cellules souches grâce à leur haute activité ALDH est l'utilisation du test ALDEFLUOR™ (Stemcell Technologies Inc.). Ce test ALDEFLUOR™ utilise un substrat fluorescent pouvant être métabolisé par de nombreuses isoenzymes de l'ALDH.
Dans ce test, le substrat de l'ALDH : BODIPY-aminacétaldéhyde (BAAA) est convertit en BODIPY-aminoacétate en présence d'ALDH, et celui-ci s'accumule dans les cellules et accroît leur fluorescence par l'émission d'une couleur verte.
Cependant, l'ALDEFLUOR™ ne permet pas de différencier les différentes isoenzymes de l'ALDH.
Malgré des recherches actives, le rôle des différentes isoenzymes de l'ALDH dans différents domaines tels que les cellules souches ou la cancérologie restent énigmatiques. Comprendre le métabolisme des différentes isoenzymes dans le contrôle du phénotype cellulaire et pendant le développement, l'homéostasie tissulaire ou la réparation, ainsi que dans la cancérogenèse pourrait pourtant ouvrir des perspectives importantes en biologie tissulaire.
Il existe donc un besoin d'identifier de nouveaux substrats qui seraient spécifiques des différentes isoenzymes de l'ALDH.
C'est dans ce contexte que les inventeurs de la présente invention ont découvert un outil permettant d'identifier les différentes isoenzymes de l'ALDH, en développant de nouveaux substrats spécifiques de celles-ci.
La présente invention a donc pour objet un substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant un composé :
(a) de formule (I): R-COO-A (I) résultant de l'estérification d'un traceur fluorescent A-OH par un agent acylant dérivé de l'acide correspondant RCOOH, dans lequel R est choisi de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; ou
(b) de formule (II) :
former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4- aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2- nonenoate.
Est ainsi décrit un substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant un composé :
(a) de formule (I): R-COO-A (I); ou
(b) de formule (II) :
(II)
dans lequel :
R et R', identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; et A-OH est un traceur fluorescent.
A est ainsi la forme estérifié de A-OH qui est un traceur fluorescent, lorsque ce dernier est libre.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat spécifique selon invention pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat spécifique selon l'invention pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat spécifique selon l'invention pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches.
La présente invention concerne également une composition comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention.
La présente invention concerne également un marqueur diagnostique comprenant un substrat spécifique selon l'invention.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un marqueur selon l'invention pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH. En particulier, le marqueur est utilisé pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses.
La présente invention concerne également une méthode pour distinguer des cellules exprimant au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, ladite méthode comprenant :
(a) la mise en contact de la population cellulaire avec au moins un substrat spécifique selon l'invention,
(b) la mesure de la fluorescence de la population cellulaire ; et
(c) l'identification des cellules présentant une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec au moins un substrat spécifique selon l'invention.
La présente invention concerne également un kit pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention.
Tel qu'indiqué précédemment, l'invention concerne un substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant un composé :
(a) de formule (I): R-COO-A (I) résultant de l'estérification d'un traceur fluorescent A-OH par un agent acylant dérivé de l'acide correspondant RCOOH, dans lequel R est choisi de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; ou
(b) de formule (II) :
dans lequel R et R', identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4- aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2- nonenoate. Le composé de formule (II) peut également être décrit comme étant de formule : R-COO- A-OOC-R', dans laquelle le traceur fluorescent est de formule HO-A-OH et est la fluorescéine. Par « substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH », on entend une molécule chimique qui va interagir spécifiquement avec une isoenzyme particulière de l'ALDH telle que I ALDH1 ou I ALDH3 par exemple, pour produire une réaction chimique qui, dans le cadre de la présente invention, va permettre de libérer une molécule fluorescente (A-OH) permettant ainsi d'identifier de façon certaine ladite isoenzyme particulière de l'ALDH. Ainsi, dans le contexte de l'invention, le substrat spécifique sera clivé par une isoenzyme de l'ALDH qui permettra la libération du traceur fluorescent A-OH.
Le substrat spécifique selon l'invention résulte de l'estérification du traceur fluorescent A-OH par un agent acylant dérivé de l'acide correspondant RCOOH ou R'COOH.
Par exemple, dans le cas où R et/ou R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est un acide propionique, l'ester correspondant est le propionate, dans le cas où R et/ou R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est un acide hexanoique, l'ester correspondant un hexanoate, lorsque R et/ou R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est un acide rétinoïque, l'ester correspondant est le retinoate, lorsque R et/ou R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est un acide benzoïque, l'ester correspondant est le benzoate, lorsque R et R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est un acide 4-diethyl-aminobenzoique, l'ester correspondant est le 4-diethyl-aminobenzoate, lorsque R et R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est un acide 4-hydroxy-2-nonenoique, l'ester correspondant est le 4-hydroxy-2- nonenoate, lorsque R et/ou R' dont l'acide RCOOH et/ou R'COOH est le acide 4- aminobutanoique, l'ester correspondant est le 4-aminobutyrate.
Parallèlement, par exemple, dans le cas où R et/ou R' est un heptyle, l'ester correspondant est l'octanoate, lorsque R et/ou R' est un éthyle, l'ester correspondant est le propionate, lorsque R et/ou R' est un phényle, l'ester correspondant est le benzoate, lorsque R et/ou R' est un 3-aminopropyle, l'ester correspondant est le 4-aminobutyrate, etc.
« A » est défini tel que la forme hydroxylée de A qui est A-OH), est un traceur fluorescent. Ce dernier forme un ester avec les substrats spécifiques faisant les formules (I) R-COO-A et (II) R-COO-A-OOC-R' qui après clivage de la fonction ester conduit à la libération de l'acide RCOOH et/ou R'COOH et dudit traceur fluorescent A-OH. Le tableau 1 ci-dessous donne la structure des substituants R et R' selon l'invention, liés au traceur fluorescent. Le tableau indique également la spécificité de chaque substrat vis-à-vis des isoenzymes de l'ALDH.
Tableau 1
Par « traceur fluorescent » on entend un composé chimique identifiable par fluorescence. En particulier, un traceur fluorescent selon l'invention est un fluorochrome ou un fluorophore c'est à dire une substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation.
Dans le cadre de la présente invention, le fluorophore sera libéré sous l'action d'une isoenzyme de l'ALDH.
Les fluorophores sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple Manafi (2000) Int. J. Food Microbiol. 60:205-218).
Différents traceurs fluorescents selon l'invention figurent dans le tableau 2 ci- dessous.
Tableau 2
En particulier, dans le cadre de la présente invention, A-OH est choisi parmi la 7- hydroxycoumarine, un fluorophore de la famille des tokyo green, en particulier le 2- méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, la résorufine et la fluorescéine. Ces traceurs sont tous connus de l'homme du métier et sont soit disponibles commercialement, soit peuvent être synthétisés par des méthodes bien connues de l'homme du métier.
En particulier, le 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green est aussi nommé 6-Hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl)-3H-xanthen-3-one, 2-Me-4-OMe TokyoGreen ou 2-Me-4- OMe TG.
Ainsi, on peut citer à titre de substrat spécifique selon la présente invention les molécules suivantes : le rétinoate de résorufine, le propionate de résorufine, l'octanoate de résorufine, le benzoate de résorufine, le 4-aminobutyrate de résorufine, l'hexanoate de résorufine, le 4-diéthylaminobenzoate de résorufine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de résorufine, le rétinoate de 7-hydroxycoumarine, le propionate de 7-hydroxycoumarine, l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, le benzoate de 7-hydroxycoumarine, le 4- aminobutyrate de 7-hydroxycoumarine, l'hexanoate de 7-hydroxycoumarine, le 4- diéthylaminobenzoate de 7-hydroxycoumarine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 7- hydroxycoumarine, le rétinoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le propionate de 2- méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, l'octanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le benzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4-aminobutyrate de 2-méthyl-4- méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, 4- diéthylaminobenzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-rétinoate de fluorescéine, le di-propionate de fluorescéine, le di-octanoate de fluorescéine, le di-benzoate de fluorescéine, le di-4- aminobutyrate de fluorescéine, le di-hexanoate de fluorescéine, le di-4- diéthylaminobenzoate de fluorescéine ou le di-4-hydroxy-2-nonenoate de fluorescéine.
Comme indiqué précédemment « ALDH » est utilisé pour « aldéhydes déshydrogénases » et représente un groupe d'enzymes de type déshydrogénases qui existe sous des formes constitutives et inductibles.
Chez l'être humain, 19 ALDHs ont été identifiées, dont autant de gènes. Ils sont répartis en sous-groupes : l'ALDHI regroupant ALDH1 A1 , ALDH1 A2, ALDH1 A3, ALDH1 B1 , ALDH1 L1 et ALDH1 L2, l'ALDH2, I ALDH3 regroupant ALDH3A1 , ALDH3A2, ALDH3B1 et ALDH3B2, I ALDH4, l'ALDHS, I ALDH6, TALDH7, l'ALDH8, I ALDH9, l'ALDHI 6, et l'ALDH18.
En particulier, un substrat spécifique selon l'invention est un substrat spécifique de l'ALDHI ou de l'ALDH3. Selon un mode de réalisation de la présente invention, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est l'ALDHI , R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, l'hexanoate ou le propionate.
En particulier, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est l'ALDHI , un substrat spécifique selon l'invention est choisi parmi le rétinoate de résorufine, l'hexanoate de résorufine, le propionate de résorufine, le rétinoate de 7-hydroxycoumarine, l'hexanoate de 7- hydroxycoumarine, le propionate de 7-hydroxycoumarine, le rétinoate de 2-méthyl-4- méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le propionate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-rétinoate de fluorescéine, le di-propionate de fluorescéine, le di-hexanoate de fluorescéine.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est I ALDH3, R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à obtenir l'octanoate, le 4-hydroxy-2-nonenoate, le 4-diéthylaminobenzoate ou le benzoate.
En particulier, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est I ALDH3, un substrat spécifique selon l'invention est choisi parmi l'octanoate de résorufine, le 4-hydroxy-2-nonenoate de résorufine, le benzoate de résorufine, le 4-diéthylaminobenzoate de résorufine l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, le 4-hydroxy-2-nonenoate de 7-hydroxycoumarine, le benzoate de 7-hydroxycoumarine, le 4-diéthylaminobenzoate de 7-hydroxycoumarine, l'octanoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4-hydroxy-2-nonenoate de 2-méthyl-4-méthoxy- Tokyo Green, le benzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl- 4-méthoxy-Tokyo Green , le di-octanoate de fluorescéine, le di-4-hydroxy-2-nonenoate de fluorescéine, le di-benzoate de fluorescéine le di-4-diéthylaminobenzoate de fluorescéine.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est l'ALDH9, R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à obtenir le 4-aminobutyrate.
En particulier, lorsque l'isoenzyme de l'ALDH est I ALDH9, un substrat spécifique selon l'invention est choisi parmi le 4-aminobutyrate de résorufine, le 4-aminobutyrate de 7-hydroxycoumarine, le 4-aminobutyrate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-4- aminobutyrate de fluorescéine.
Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également une composition comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention.
La composition selon l'invention comprend ainsi 1. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 ou plus de substrats spécifiques selon l'invention.
Ladite composition permet ainsi de détecter et d'identifier directement plusieurs isoenzymes de l'ALDH. Par exemple, la composition comprend un substrat spécifique de l'ADLHI et un substrat spécifique de l'ALDH3 ou un substrat spécifique de l'ALDHI et de I ALDH9, ou de l'ALDH3 et de l'ALDH 9 ou de l'ALDHI , de TALDH3 et de l'ALDH9.
Ainsi la composition selon l'invention peut par exemple comprendre un ou plusieurs des substrats spécifiques suivants : le rétinoate de résorufine, le propionate de résorufine, l'octanoate de résorufine, le benzoate de résorufine, le 4-aminobutyrate de résorufine, l'hexanoate de résorufine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de résorufine, le 4- diéthylaminobenzoate de résorufine, le rétinoate de 7-hydroxycoumarine, le propionate de 7-hydroxycoumarine, l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, le benzoate de 7- hydroxycoumarine, le 4-aminobutyrate de 7-hydroxycoumarine, l'hexanoate de 7- hydroxycoumarine ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 7-hydroxycoumarine, le 4- diéthylaminobenzoate de 7-hydroxycoumarine, le rétinoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le propionate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, l'octanoate de 2-méthyl-4- méthoxy-Tokyo Green, le benzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4- aminobutyrate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, l'hexanoate de 2-méthyl-4-méthoxy- Tokyo Green ou le 4-hydroxy-2-nonenoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le 4- diéthylaminobenzoate de 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, le di-rétinoate de fluorescéine, le di-propionate de fluorescéine, le di-octanoate de fluorescéine, le di- benzoate de fluorescéine, le di-4-aminobutyrate de fluorescéine, le di-hexanoate de fluorescéine ou le di-4-hydroxy-2-nonenoate de fluorescéine, le di-4- diéthylaminobenzoate de fluorescéine.
En particulier, le substrat spécifique selon l'invention est caractérisé en ce que l'isoenzyme de l'ALDH est détecté dans une population cellulaire.
Par « population cellulaire », on entend un ensemble de cellules de même origine ou d'origine différente et dont les caractéristiques (séquences génétiques, niveaux d'expression, état de différentiation) sont identiques ou différentes. En particulier la population cellulaire comprend au moins 2 cellules, par exemple 10, 100, 1000 ou 1000000 cellules.
Ainsi, selon un mode de réalisation de la présente invention, le substrat spécifique est détecté in vitro ou ex vivo par l'utilisation de la technique de fluorescence en plaque, de la technique de cytométrie en flux et/ou d'immunofluorescence.
Les substrats spécifiques selon l'invention sont utiles pour identifier les différentes isoenzymes de l'ALDH. Ils permettent notamment d'identifier des cellules exprimant les différentes isoenzymes de l'ALDH (par exemple, certains types de cellules souches) et de les distinguer dans une population mixte de celles qui n'expriment pas d'isoenzyme de l'ALDH ou pas la même isoenzyme de l'ALDH. Les substrats selon l'invention peuvent également permettre de distinguer des cellules qui expriment une isoenzyme de l'ALDH à un degré élevé des cellules qui l'expriment à un degré moindre.
Ainsi la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour quantifier au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire.
Ainsi la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour isoler et/ou sélectionner une partie d'une population cellulaire surexprimant une isoenzyme de l'ALDH.
Ainsi la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour trier toute ou une partie d'une population cellulaire en fonction de son expression d'au moins une isoenzyme de l'ALDH.
Par « au moins une » isoenzyme de l'ALDH, on entend 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 17, 18 ou 19 isoenzymes de l'ALDH. Les 19 isoenzymes ont été décrites précédemment.
« Au moins un » substrat spécifique selon l'invention a la même signification que précédemment décrit.
La présente invention concerne également une méthode pour quantifier au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, comprenant l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention.
La quantification peut être réalisée en utilisant une technique de fluorescence par plaque. L'identification et/ou la quantification des différentes isoenzymes de l'ALDH permet ainsi de distinguer et/ou d'identifier différents types cellulaires.
Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses.
Elle concerne également une méthode pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses comprenant l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention.
Ladite méthode et ladite utilisation permettent également d'isoler ces cellules, en incluant par exemple une étape d'isolement des cellules présentant une fluorescence.
Par « cellules souches cancéreuses », on entend par exemple des cellules souches de cancer de la vessie, du sein, du col de l'utérus, du côlon, de la tête et du cou, du foie, du poumon, du pancréas, de la prostate, de l'ovaire, de leucémie.
En particulier, le substrat spécifique selon l'invention est utilisé pour distinguer les cellules souches de cancers solides et/ou les tumeurs malignes hématologiques. Par « cancer solide », on entend par exemple le cancer du sein, du poumon ou de la prostate.
Par « tumeurs malignes hématologiques », on entend par exemple la leucémie, les lymphomes ou le myélome.
En particulier, les cellules souches d'intérêt sont les cellules hématopoïétiques cancéreuses ou saines. L'identification et/ou la quantification des différentes isoenzymes de l'ALDH permet également de caractériser différentes étapes d'une maladie ou de la différentiation des cellules.
Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches.
Elle concerne également une méthode pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches comprenant l'utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'invention.
Par « différentes étapes de la différenciation des cellules souches », on entend les étapes qui sont bien connues de l'homme du métier, en particulier les étapes suivantes : cellules indifférenciées, cellules peu différenciées, cellules modérément différenciées et cellules bien différenciées.
Par « différentes étapes d'un cancer », on entend les étapes qui sont bien connues de l'homme du métier, en particulier les étapes suivantes : tumeur ou cancer indifférencié, tumeur ou cancer peu différencié, tumeur ou cancer modérément différencié, tumeur ou cancer bien différencié.
Les substrats spécifiques selon l'invention, en permettant l'identification et/ou la quantification des différentes isoenzymes de l'ALDH, sont utiles en tant que marqueur diagnostique.
La présente invention concerne donc également un marqueur diagnostique comprenant un substrat spécifique selon l'invention.
Par « marqueur diagnostique », on entend le sens couramment attribué à ces termes par un homme du métier c'est-à-dire un élément caractéristique permettant de confirmer ou d'infirmer un diagnostic.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le marqueur diagnostique selon l'invention est un substrat spécifique selon l'invention.
Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'un marqueur selon l'invention pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH. Elle concerne également une méthode pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant l'utilisation d'un marqueur selon l'invention.
Une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH est une maladie impliquant que ladite isoenzyme va être surexprimée ou sous exprimée chez le sujet malade par rapport à l'expression dite normale, c'est-à-dire l'expression observée chez un sujet saint.
Par « surexprimée » ou « surexpression », on entend un taux d'expression chez le sujet malade supérieur à celui du sujet sain.
Par « sous exprimée » ou « sous expression », on entend un taux d'expression chez le sujet malade inférieur à celui du sujet sain.
Une telle maladie peut être choisie parmi les cancers, les troubles de la motilité du sperme, les ischémies, les traumatismes crâniens ou les pancréatites.
Par « cancer », on entend par exemple la leucémie, le cancer du sein ou le cancer du poumon.
Par « troubles de la motilité du sperme », on entend les troubles influant sur la vitesse à laquelle le sperme peut se déplacer et passer à travers le col de l'utérus, l'utérus et les trompes de Fallope de la femme.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un marqueur selon l'invention pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses.
Elle concerne également une méthode pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses comprenant l'utilisation d'un marqueur selon l'invention.
Par « sujet », on entend dans le cadre la présente invention, un animal à sang chaud tel qu'un mammifère, animal ou humain, en particulier un être humain. Le sujet peut être un sujet sain ou un sujet qui est atteint de, ou qui a le potentiel d'être atteint d'une ou plusieurs maladies et/ou affections décrites dans le cadre de la présente invention.
Par « thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH », on entend une thérapie dont la cible directe ou indirecte serait une isoenzyme de l'ALDH tel que par exemple I'ALDHI , ALDH3, I ALDH9 ou plusieurs isoenzymes de l'ALDH. Par « thérapie dirigée contre les cellules souches cancéreuses », on entend une thérapie dont la cible serait les cellules souches cancéreuses dont une des caractéristiques est le niveau élevé d'ALDH.
Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également une méthode pour distinguer des cellules exprimant au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, ladite méthode comprenant :
(a) la mise en contact de la population cellulaire avec au moins un substrat spécifique selon l'invention,
(b) la mesure de la fluorescence de la population cellulaire; et
(c) l'identification des cellules présentant une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec ledit au moins substrat spécifique.
Par « mise en contact », on entend en particulier l'incubation avec au moins un substrat spécifique selon l'invention pendant un temps défini allant de quelques minutes, par exemple 30 minutes à plusieurs heures, par exemple 4 heures ou plus, avec la population cellulaire.
Une « population cellulaire » est telle que définie précédemment. « Au moins une isoenzyme de l'ALDH » et « au moins un substrat spécifique selon l'invention » sont tels que définis précédemment.
La mesure de la fluorescence peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple l'utilisation du fluorimètre, du cytomètre en flux ou par microscopie à fluorescence.
Par « une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec le substrat spécifique », on entend une florescence de la population cellulaire étudiée supérieure à la fluorescence de cette même population cellulaire avant que celle-ci ait été mise en contact avec le substrat spécifique selon l'invention.
Si au moins deux substrats spécifiques d'au moins deux isoenzymes de l'ALDH différentes sont mis en contact avec la population cellulaire, ladite méthode peut également comprendre une étape additionnelle d) comprenant la distinction entre les cellules exprimant les au moins deux isoenzymes de l'ALDH.
Cette distinction peut par exemple être réalisée en observant des couleurs de fluorescence différentes en fonction de l'isoenzyme détectée.
A titre d'exemple, si la méthode comprend la mise en contact de la population cellulaire avec du rétinoate de résorufine et de l'octanoate de 7-hydroxycoumarine, les cellules présentant une fluorescence accrue de couleur rouge seront identifiées comme exprimant I ALDH1 alors que les cellules présentant une fluorescence accrue de couleur bleue seront identifiées comme exprimant l'ALDH3.
Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également un kit pour les différentes utilisations mentionnées dans le cadre de la présente invention, en particulier pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH, plus particulièrement dans une population cellulaire, comprenant au moins un substrat spécifique selon l'invention.
Le kit peut être également un kit pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH, ladite maladie étant choisie par exemple parmi : les cancers, les troubles de la motilité du sperme les ischémies, les traumatismes crâniens ou les pancréatites; pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses ; pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses, par exemple pour distinguer les cellules souches de cancers solides et/ou de tumeurs malignes hématologiques ; ou pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches.
Les kits selon l'invention peuvent par exemple comprendre en outre des instructions pour l'utilisation dudit kit pour déterminer la quantité d'une isoenzyme de l'ALDH, en particulier dans une population cellulaire, pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH, pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses, pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses, ou pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches.
Les différents composés inclus dans un kit selon l'invention peuvent être fournis sous forme d'un solide (par exemple lyophilisée) ou sous forme liquide.
Les kits de la présente invention peuvent éventuellement comprendre des récipients différents (par exemple, une ampoule, un tube à essai, un flacon ou une bouteille) pour chaque composé. Chaque composé sera généralement aliquoté dans son conteneur ou fourni sous une forme concentrée. D'autres récipients appropriés pour la réalisation de certaines étapes des méthodes décrites dans le cadre de la présente invention peuvent également être fournis.
La présente invention sera illustrée plus en détails par les figures et exemples suivants. Figures
Figure 1 : Tracé de ichaelis- enten pour déterminer le Km et la Vmax du propionate de résorufine sur les ALDH1A1 , ALDH2 etALDH3A1.
Figure 2 : Dosage de l'activité ALDH 1 par le propionate de résorufine après un traitement à l'ARN interférant ALDH1A1.
Figure 3 : Dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine après traitement aux inhibiteurs d'ALDH 1 et 3.
Figure 4 : Activité ALDH1 détecté par cytométrie en flux via le propionate de résorufine. Figure 5 : Dosage de l'activité ALDH1 par le rétinoate de résorufine et le di-rétinoate de fluorescéine et ALDH3 par le benzoate de résorufine et le di- benzoate de fluorescéine après un traitement à l'acide rétinoïque.
Figure 6 : Dosage de l'activité ALDH1 par le rétinoate de résorufine et le di-rétinoate de fluorescéine et ALDH3 par le benzoate de résorufine et le di- benzoate de fluorescéine après un traitement au Disulfiram (DSF).
Exemples
1. Préparation des substrats spécifigues selon l'invention
Conditions opératoires
Les réactifs et solvants commerciaux (Fisher, Sigma, Fluorochem etc ...) ont été utilisés sans purification excepté le dichlorométhane distillé sous atmosphère inerte sur CaH2. Les réactions ont été suivies par chromatographie sur couche mince sur des feuilles d'aluminium recouvertes de gel de silice Macherey-Nagel ALUGRAM SIL G/UV254 (épaisseur 0,2 mm), l'observation des plaques ayant été réalisée sous lampe ultraviolet à 254 et 312 nm.
Les chromatographies sur colonne ont été réalisées sur gel de silice Macherey-Nagel 60M (40-63 μηι) sous pression d'air.
Les points de fusion ont été mesurés avec un appareil Tottoli Buchi SMP-20 et n'ont pas été corrigés.
Les spectres RMN 1H ont été enregistrés avec des appareils Brucker ALS300 ou DRX300 à 300 MHz. Les spectres RMN 13C ont été obtenus sur des appareils Brucker DRX300 à
75 MHz. Les déplacements chimiques δ sont exprimés en partie par million (ppm), le pic résiduel du solvant ayant été pris comme référence interne. Les constantes de couplage J sont exprimées en Hz. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode positif sur un spectromètre de masse à temps de vol hybride (MicroTOFQ-ll, Bruker Daltonics, Bremen) avec une source electrospray (ESI).
Le flux de gaz de pulvérisation était à 0.4 bar et la tension capillaire à 3500v. Les solutions ont été perfusées à 10 μΙ/min dans un mélange de solvants (méthanol/ dichlorométhane/eau 45/40/15) avec de l'acide formique à 1 %. La plage de masse de l'analyse était 50-1000m-z et l'étalonnage a été effectué avec du formate de sodium.
Exemples de structure des substrats spécifiques selon l'invention
Tableau 3
Propionate de résorufine
Hexanoate de résorufine
Octanoate de résorufine
Benzoate de résorufine
4-diéthylaminobenzoate de résorufine
Rétinoate de résorufine
Hexanoate de 2-méthyl- 4-méthoxy-Tokyo Green
Octanoate de 2-méthyl-4- méthoxy-Tokyo Green Octanoate de 4- hydroxycoumarine
Di-hexanoate de fluorescéine
Di-octanoate de fluorescéine
Di-rétinoate de fluorescéine
Esters de résorufine
Propionate et benzoate de résorufine
Les composés ont été préparés à partir de la résorufine (sel de sodium) (Sigma) à l'aide du chlorure d'acide (2 équivalents) correspondant dans le dichlorométhane (0.05M) en présence de DI PEA (diisopropyléthylamine, 2 équivalents).
Pour le proprionate, à une suspension de sel de sodium de résorufine (235.2 mg, 1 .0 mmol) dans 20 mL de DCM anhydre ont été ajoutés la DI PEA (2 équivalents) à température ambiante puis le chlorure de propionyle (2 équivalents) goutte à goutte à O C. Après 5 minutes à O C le milieu réactionnel a été porté à température ambiante et agité la nuit. 30 mL d'eau ont ensuite été ajoutés et une extraction par 3x30mL de DCM a été réalisée. Les phases organiques réunies ont été lavées par 30 mL d'une solution saturée de NaHC03 puis 30 mL d'une solution saturée de NaCI . Après séchage sur Na2S04, filtration et évaporation du solvant, le résidu a été repris par EtOH. Une sonication a été réalisée et le solide obtenu a été filtré sur fritté et lavé par EtOH (2 fois). Après séchage sous vide 218 mg (81 %) d'un solide orange ont été obtenus.
Mp 176-177 C (EtOH) (Guilbault et al Analytical Chem 1965, 37, 120-123: 177 C); 1H MN (300 MHz, DMSO) δ 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 7.40 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 7.25 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1 H), 6.84 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1 H), 6.31 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 2.66 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1 .15 (t, J = 7.5 Hz, 3H) ; ESI-MS m/z 270.1 [M+H]+Poids : 269.2 g.mol"1
Formule :Ci5H N04
Pour le benzoate, le mode opératoire est identique à celui du propionate. Le chlorure de benzoyie a été utilisé (échelle: 1.0 mmol). Le solide isolé (166 mg) a été purifié par chromatographie sur gel de silice (MeOH/DCM : 1/99) pour donner 156 mg (49%) de benzoate pur.
Mp >210 C (Guilbault et al Analytical Chem 1965, 37, 120-123: 203 C); 'HRMN (300 MHz, DMSO) δ 8.21 - 8.14 (m, 2H), 7.95 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.84 - 7.75 (m, 1 H), 7.62 (ddd, J = 1 1.7, 10.5, 8.1 Hz, 4H), 7.44 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1 H), 6.86 (dd, J = 9.8, 2.1 Hz, 1 H). 6.33 (d, J = 2.1 Hz, 1 H) ; ESI-MS m/z 318.1 [M+H]+.
Poids : 317.3 g. mol"1
Formule :C19HiiN04
Hexanoate et octanoate de résorufine
Les composés ont été préparés et isolés de la même manière que pour les deux esters précédents à l'aide des chlorures d'acide correspondants. Les rendements respectifs obtenus sont de 65% et 81 %.
Pour l'hexanoate, le mode opératoire est identique à celui du propionate. Du chlorure d'hexanoyle (échelle: 1 .0 mmol) a été utilisé. Le composé obtenu a été isolé par précipitation dans l'EtOH, suivi de 2 lavages à l'EtOH, rendement 65%.
Mp 130-132 C ; 1HRMN (300 MHz, DMSO) δ 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 7.39 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 7.24 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1 H), 6.84 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1 H), 6.30 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 2.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1 .75 - 1 .57 (m, 2H), 1.43 - 1.25 (m, 4H), 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 3H) ; ESI-MS m/z312.1 [M+H]+.
Poids : 31 1.3 g. mol"1
Formule :C18H17N04
Pour l'octanoate, le mode opératoire est identique à celui du propionate. Du chlorure d'octanoyle (échelle : 1 .0 mmol) a été utilisé. Le composé obtenu a été isolé par précipitation dans l'EtOH, suivi de 2 lavages à l'EtOH, rendement 81 %.
Mp 127-129 C ; 'HRMN (300 MHz, DMSO) δ 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.57 (d, J =
9.8 Hz, 1 H), 7.39 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.23 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1 H), 6.84 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1 H), 6.30 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 2.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1 .72 - 1 .57 (m. 2H), 1.44 - 1.19 (m, 8H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ; ESI-MS m/z 340.2 [M+H]+.
Poids : 339.4 g. mol"1
Formule :C2oH2i 04
4-diéthylamino benzoate de résorufine
Le sel de sodium de résorufine (235.2 mg, 1.0 mmol), l'acide 4- diéthylaminobenzoïque (1.1 équivalent), l'EDCI (1 .1 équivalent) et le 4-DMAP (0.1 équivalent) ont été placés sous argon. 25 ml de DCM ont été ajoutés et le milieu réactionnel a été agité la nuit à température ambiante. Le solvant a été évaporé et le résidu purifié par chromatographie sur gel de silice (MeOH/DCM=1/99 à 2.5/87.5) pour donner 207 mg (53%) de produit présentant une très légère impureté (UV visible) qu'une deuxième colonne (MeOH/DCM=1/99) permet d'éliminer. Mp 206-208 C ; HRMN (300 MHz, DMSO) δ 7.92 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.59 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 7.49 (s, 1 H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 6.85 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 6.79 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.32 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 3.46 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.14 (t. J = 7.0 Hz, 6H) ; ESI-MS m/z 389.1 [M+H]+.
Poids : 388.4 g. mol"1
Formule :C23H2oN204
(All)trans rétinoate de résorufine
Le composé a été préparé de la même manière que l'ester précédent à l'aide de l'acide rétinoïque commercial (rdt. 40%). Le brut (solide rouge orangé) obtenu a été lavé au MeOH et purifié par chromatograp ie sur gel de silice (MeOH/DCM : 1/99). Un lavage supplémentaire à l'EtOH puis au MeOH a donné 100 mg (40%) de produit pur. Mp 150- 160 (décomposition) ; 'H MN(300 MHz, CDCI3) δ 7.82 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 7.46 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 7.25 - 7.10 (m, 3H), 6.89 (dd, J = 9.8, 2.0 Hz, 1 H), 6.46 - 6.31 (m, 3H), 6.26 - 6.14 (m, 2H), 6.00 (s, 1 H), 2.45 (d, J = 0.9 Hz, 3H), 2.10-2.00 (m, 5H), 1.75 (d, J = 0.6 Hz, 3H), 1.70 - 1.58 (m, 2H), 1 .54 - 1.46 (m, 2H), 1.06 (s, 6H) ; ESI-MS m/z 496.2 [M+H+].
Poids : 495.6 g. mol"1
Formule :C32H33 04
Esters de tokvo-qreen
Le 2-Me-4-MeO tokyo-green (CAS n° 643755-84-4 : 6-hydroxy-9-(4-methoxy-2- methylphenyl)-3H-Xanthen-3-one) a été synthétisé en deux étapes : une bis-silylation de la 3.6- dihydroxyxanth-9-one commerciale réalisée selon le mode opératoire décrit dans l'article « J. Biol. ChemVol. 264, No. 14. Issue of May 15, PP. 8171-8178, 1989" a conduit à la 3.6-bis(tbutyldiméthylsilyloxy)xanthone. Une deuxième étape réalisée selon le mode opératoire décrit dans l'article « Chem. Eur. J. 2014, 20, 447— 455 » consistant en un traitement à l'aide du magnésien issu du 2-Bromo-3-meéhoxytoluene suivi d'une hydrolyse acide a donné le 2-Me-4-MeO tokyo green.
Hexanoate et octanoate de 2-Me-4-MeO tokyo-green
Les composés ont été préparés de manière classique à l'aide des chlorures d'acides correspondants. Pour l'hexanoate, à partir de 0.15 mmol de 2-Me-4-MeO -TG, une purification par chromatographie sur gel de silice (MeOH/DCM : de 1/99 à 10/90), a été réalisée, rendement : 40% (résine non cristallisée).
'HRMN (300 MHz, MeOD) et 7.45 (d. J = 2.0 Hz, 1 H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.16 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.1 1 (dd, J = 8.8, 2.1 Hz, 1 H), 7.04 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 6.99 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1 H), 6.61 (dd, J = 9.7, 1.9 Hz, 1 H), 6.44 (d, J = 1.9 Hz, 1 H), 3.89 (s, 3H), 2.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.04 (s, 3H), 1 .81— 1 .67 (m, 2H), 1 .47— 1.33 (m, 4H), 1.00— 0.89 (m, 3H).
13CRMN(101 MHz, CDCI3) et 186.23, 171.64, 160.63, 158.85, 154.54, 153.29, 148.87, 138.07, 131 .00, 130.88, 130.58, 129.38, 124.29, 120.84, 1 18.85, 1 18.56, 1 16.24, 1 1 1 .80, 1 10.38, 106.18, 77.16, 55.51 , 34.47, 31.32, 24.60, 22.42, 20.19, 14.05.
ESI-MS: [M+H]+ : 431.1
Poids :430.5 g. mol"1
Formule :C2 H260S
Pour l'octanoate, à partir de 0.19 mmol de TG, une purification par chromatographie sur gel de silice (MeOH/DCM : de 1/99 à 10/90), a été réalisée, rendement : 20% (résine non cristallisée)
1H RMN (300 MHz, MeOD) et 7.46 (s, 1 H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.17 (d, 1 = 8.9 Hz, 2H), 7.12 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1 H), 7.05 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.00 (cid, 1 = 8.4, 2.2 Hz, 1 H), 6.62 (dd, J = 9.7, 1.5 Hz, 1 H), 6.45 (s, 1 H), 3.90 (s, 3H), 2.64 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.05 (s, 3H), 1.81— 1.67 (m, 2H), 1.49— 1.26 (m, 9H), 0.96— 0.87 (m.3H).
13CRMN(101 MHz, CDCI3) et 186.20, 171.66, 160.61 , 158.78, 154.49, 130.92, 130.59, 129.34, 124.33, 120.89, 1 18.86, 106.23, 77.16, 55.51 , 34.51 , 31.76, 29.14, 29.02, 24.92, 22.73, 20.19, 14.21.
ESI-MS : [M+H]+ : 459.2
Poids :485 g. mol"1
Formule :C29H3o05
Diesters de fluorescéine
La préparation identique est à celle décrite précédemment en utilisant 3.0 eq. des chlorures d'acides correspondants et 3eq. de base. L'hexanoate et l'octanoate ont déjà été décrits [litt. Ge, Feng-Yan; Dyes and Pigments 2007, 72(3), 322-326].
Di-hexanoate de fluorescéine :
[7364-90-1 ] Echelle 0.8 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ EtOAc : 90/10). Solide blanc, rdt : 98%. Mp 103-105 C (lavages pentane) (litt. 100°C, Ge, Feng-Yan; Dyes and Pigments 2007, 72(3), 322-326) ;
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.09 - 8.03 (m, 1 H), 7.83 (td, J = 7.4, 1.4 Hz, 1 H), 7.77 (td, J = 7.4, 1.2 Hz, 1 H), 7.44 - 7.38 (m, 1 H), 7.28 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 6.94 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.71 - 1.58 (m, 4H), 1 .40 - 1.25 (m, 8H), 0.95 - 0.81 (m, 6H) ;
ESI-MS : [M+H]+ : 529.2
Poids :528.9 g. mol"1
Formule :C32H320/
Di-octanoate de fluorescéine :
[19722-86-2] Echelle 0.8 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ EtOAc : 90/10 à 80/20). Solide blanc, rdt : 92%. Mp 50-52 C () (litt. 49 C, Ge, Feng- Yan; Dyes and Pigments 2007, 72(3), 322-326).
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.09 - 8.04 (m, 1 H), 7.83 (td, J = 7.4, 1.3 Hz, 1 H), 7.77 (td, J = 7.3, 1.0 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.27 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.94 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.70 - 1.57 (m, 4H), 1.41 - 1.20 (m, 16H), 0.92 - 0.81 (m, 6H) ;
ESI-MS : [M+H]+ : 585.3.
Poids : 584.7 g. mol"1
Di-rétinoate de fluorescéine :
Le composé a été préparé à partir de 2.1 équivalents d'acide rétinoique, 2.1 équivalents D'EDCI, 0.1 équivalent de 4-DMAP. Echelle : 0.5 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ EtOAc : 80/20). Solide jaune, rdt 45%. Mp 145- 150 C (dec) ;
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.07 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.89 - 7.73 (m, 2H), 7.42 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.31 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 7.20 (dd, J = 15.0, 1 1 .5 Hz, 2H), 6.98 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 6.39 - 6.15 (m, 6H), 6.1 1 (s, 2H), 2.38 (s, 6H), 2.07 - 1 .95 (m, 10H), 1 .70 (s, 6H), 1.63 - 1 .51 (m, 4H), 1.50 - 1.40 (m, 4H), 1.03 (s, 12H).
ESI-MS : [M+HJ+ : 897.3
Poids : 879.1 g. mol"1
Formule :C6oH6407
Esters de 7-hvdroxvcoumarine
Ces esters ont été préparés de la même manière que précédemment à partir de la 7-hydroxycoumarine et du chlorure d'acide en présence de DIPEA.
Octanoate de 7-hvdroxvcoumarine :
Echelle 2 mmol, purification par chromatographie sur gel de silice (PE/ EtOAc : 70/30) rdt : 92%. Mp 58-59 C ;
H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.08 (d, J = 9.3 Hz, 1 H), 7.77 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.26 (d. J = 2.2 Hz, 1 H), 7.15 (dd. J = 8.4. 2.2 Hz, 1 H), 6.48 (d, J - 9.6 Hz, 1 H), 2.61 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65 (s, 2H), 1.42 - 1.21 (m, 8H), 0.93 - 0.81 (m, 3H) ;
ESI-MS : [M+HJ+ : 289.1
Poids : 288.3 g. mol"1
Formule :C17H2o04
2. Activité des substrats spécifiques selon l'invention
Matériel et méthodes
Lignées Cellulaires
Des cellules de cancers de poumons NCI-H522 et A 549 ainsi que des lignées de leucémies ont été utilisées. Les cellules ont été obtenues de chez American Type Culture Collection (ATCC), the European Collection of Cell Cultures (ECACC) et Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultruren (DSMZ).
Détermination du Km et de la Vmax du propionate de résorufine avec les différentes isoenzymes ALDH1A 1. ALDH2 et ALDH3A 1 purifiées.
Dans 50pL de tampon phosphate 0.1 M pH6,00 ; 0.2 M KCI ; 2mM NADP+ ; 2 mM EDTA, une gamme de propionate de résorufine a été faite : 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80 et 70 μΜ et 0 μΜ. 50 μί de solution d'enzyme recombinante à 2.5 mU/puits ALDH1 A1 (R&D Sytems, 5869-DH), ALDH2 (abcam, ab87415) et ALDH3A1 (R&D Sytems, 6705-DH)a été ajoutée. L'incubation a été réalisée 30 minutes à +37 C puis la lecture en fluorescence a été faite (Em : 590 nm, Ex : 530 nm). Les données ont ensuite été converti en résorufine relarguée (nM.min"1.pg"1) puis le Km et le Vmax ont été calculés via l'équation de Michaelis-Menten en utilisant GraphPad Prism 5.0.
Traitement des cellules par des inhibiteurs spécifique de IADLH1 et 3
Dans une plaque 96 puits, les cellules HL-60 ont été ensemencées à une concentration de 50 000 cellules/puits dans un milieu RPMI-1640 sans rouge phénol supplémenté en L- Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Fœtal (SVF) complété avec du dimethyl ampalthiolester (DIMATE) un inhibiteur spécifique ALDH1 et 3, morpholino ampal thiolester (MATE) un inhibiteur spécifique de l'ALDH3, à des concentrations respectivement de 8 μΜ. Après incubation de 6 heures, les substrats des différentes ALDHs respectivement le propionate de résorufine pour I ALDH1 et le 4- diethylaminobenzoate de résorufine pour l'ALDH 3 ont été ajoutés à une concentration finale de 10 μΜ puis incubés durant une heure à +37 C. La plaque a ensuite été lue en utilisant un lecteur de plaque fluorescent Appliskan (ex= 560 nm, Em=600). Les données ont été exprimées en unité de fluorescence relative produites par un nombre égale de cellules.
Traitement des cellules par le Disulfiram (DSF) Dans une plaque 96 puits, les cellules HL-60 ont été ensemencées à une concentration de 50 000 cellules/puits dans un milieu PMI-1640 sans rouge phénol supplémenté en L- Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau F tal (SVF) complété avec du disulfiram (DSF), un inhibiteur de l'activité ALDH, aux concentrations 250nM et 1000n . Les cellules ont ensuite été incubées pendant 1 heure. Après incubation, les substrats des différentes ALDHs respectivement le rétinoate de résorufine et le di- rétinoate de fluorescéine pour I ALDH1 et le benzoate de fluorescéine et le di-benzoate de fluorescéine pour l'ALDH 3 ont été ajoutés à une concentration finale de 5 μΜ puis incubés durant 30 minutes à +37 C. La plaque a ensuite été lue en utilisant un lecteur de plaque fluorescent SpectraMax®, Molecular Devices (Ex= 560 nm, Em=600 nm pour la résorufine et ex=485 nm, em=535nm pour la fluorescéine). Les données ont été exprimées en unité de fluorescence relative.
Traitement des cellules avec de l'acide rétinoïque
Dans une plaque 96 puits, les cellules HL-60 ont été ensemencées à une concentration de 50 000 cellules/puits dans un milieu RPMI-1640 sans rouge phénol supplémenté en L- Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Fœtal (SVF) complété avec de l'acide rétinoïque, connu pour être un inhibiteur de l'activité ALDH aux concentrations 1 μΜ et 10μΜ. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 72 heures. Après incubation, les substrats des différentes ALDHs respectivement le rétinoate de résorufine et le di-réetinoate de fluorescéine pour I ALDH 1 et le benzote de fluorescéine et le di-benzote de fluorescéine pour l'ALDH 3 ont été ajoutés à une concentration finale de 5 μΜ puis incubés durant 30 minutes à +37 C. La plaque a ensuite été lue en utilisant un lecteur de plaque fluorescent SpectraMax®, Molecular Devices (Ex= 560 nm, Em=600 nm pour la résorufine et Ex=485 nm, Em=535nm pour la fluorescéine). Les données ont été exprimées en unité de fluorescence relative.
Traitement des cellules avec des ARN interférant ALDH1A 1
Dans une boîte de Pétri 60mm, les cellules NCI-H522 ont été ensemencées à une concentration de 250 000 cellules/plaques, correspondant à une confluence de 40-50%, dans un milieu RPMI-1640 supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Fœtal (SVF) sur la nuit à+37 C. Le lendemain, le milieu a été remplacé par le même milieu sans SVF. La solution de transfection a ensuite été préparée en diluant 100nM dans 500μί de milieu de culture sans SVF, à laquelle on a ajouté 500μί de milieu de culture sans SVF complété avec 3 μί de lipofectamine 2000 (Invitrogen). La solution a ensuite été incubée 30 minutes à température ambiante, puis ajoutée gouttes à gouttes dans la solution cellulaire. Le mélange a été incubé à +37 C dans un incubateur à C02 5% pendant 8 heures. Après l'incubation, le milieu a été changé par du milieu supplémenté en SVF puis les cellules ont été laissées en culture pendant 48 heures. L'inhibition de la protéine a été validée par Western Blot. L'activité spécifique de l'ALDH1A1 a ensuite été dosée par fluorescence.
Dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine
Les cellules ont été ensemencées à une concentration de 1X104 cellules/puits dans une plaque 96 puits dans 100pL dans un milieu RPMI-1640 sans rouge phénol supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Fœtal (SVF) complété avec du propionate de résorufine 10 μΜ. Les cellules ont ensuite été incubées 1 heure puis la plaque a été lue en utilisant un lecteur de plaque fluorescent Appliskan (ex= 560 nm, Em=600). Les données ont été exprimées en unité de fluorescence relative produites par un nombre égale de cellules.
Double localisation du propionate de résorufine et de l'ALDHIA 1 par microscopie fluorescente
Dans une plaque 24 puits avec des verres de microscopie préalablement lavées à l'éthanol puis placées dans les puits, les cellules NCI-H522 ont été ajoutées à une concentration cellulaire de 50 000 cellules/puits puis incubé dans un milieu RPMI-1640 supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Fœtal sur la nuit à+37 C avec une atmosphère 5% C02. Le lendemain, le milieu de culture a été changé avec soit du DIMATE (5μΜ) ou bien le véhicule de traitement puis incubé 6 heures. Les cellules ont été incubées 30 minutes avec du milieu de culture supplémenté avec 10μΜ de propionate de résorufine, ont ensuite été lavées avec du PBS à froid puis fixées au paraformaldehyde 15 minutes à 37 C. Les cellules ont été perméabilisées et saturées avec une solution PBS ; 3% Albumine de Bovin ; 0.3% de Triton pendant 1 heure. L'incubation a été réalisée avec l'anticorps anti-ALDM A1 (R&D System, MAB5869) 1 heure à +37 C, puis avec un anticorps anti-souris couplé à la fluorescéine pendant 1 heure à température ambiante à l'obscurité, avec lavages au PBS entre les deux étapes. 3 lavages au PBS ont été effectués puis les verres de microscopie ont été montés avec un support d'antidécoloration complété avec du DAPI. Les cellules ont ensuite été observées au microscope.
Identification des cellules ALDH1 positive par cytomérie en flux
Dans une boîte de Pétri 60mm, 500 000 cellules ont été incubées avec un un milieu RPMI-1640 supplémenté en L-Glutamine, Pénicilline, Streptomycine et 10% de Sérum de Veau Fœtal sur la nuit à+37 C avec une atmosphère 5% C02. Pour le contrôle négatif, les cellules ont été reprises dans du milieu supplémenté avec 15μΜ du dimethyl ampalthiolester (DIMATE) un inhibiteur spécifique des ALDH1 et 3, puis incubées 5 heures à 37 C, 5% C02. Après trypsination, les cellules ont été reprises dans du milieu RPMI supplémenté et centrifugé à 800g 5 minutes. Le culot cellulaire a ensuite été repris dans du milieu supplémenté frais contenant 10 μΜ de propionate de résorufine, puis est incubé pendant 1 heure dans un tube de polycarbonate à 37 C, 5% C02. Après incubation, les cellules ont ensuite été centrifugées puis lavées dans du PBSxl froid et enfin repris dans 200mL de PBSxl froid. La solution a ensuite été analysée via cytométrie en flux (Ex 590nm / Em 560 nm ou laser rouge).
Résultats
Les résultats sont présentés dans les figures 1 à 5.
En particulier, la figure 1 représente les données obtenues pour déterminer le Km et la Vmax du propionate de résorufine.
Les résultats figurent également dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 4
Les résultats du dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine après un traitement à l'ARN interférant ALDH1A1 sont illustrés par le figure 2 qui montre qu'une inhibition complète de I ALDH1A1 est observé à 100nM de siRNA qui induit une diminution significative (P<0.05) du signal du propionate de résorufine.
Les résultats du dosage de l'activité ALDH1 par le propionate de résorufine après traitement aux inhibiteurs d'ALDH 1 et 3 sont illustrés en figure 3 et montre une inhibition significative de la fluorescence (P<0.001 ) après traitement au DIMATE (inhibiteur de l'ALDH 1 et 3) au contraire du MATE qui est un inhibiteur spécifique de TALDH3.
De plus, la conversion du propionate de résorufine en résorufine, molécule qui fluoresce dans le rouge, a été détectée par microscopie fluorescente. La réaction est inhibée par le DIMATE, inhibiteur de l'ALDH 1 , montrant la spécificité du substrat (résultats non illustrés).
De plus, le signal fluorescent du propionate de résorufine peut-être colocalisé avec l'ALDH 1A1 suggérant une activité spécifique avec l'enzyme (résultats non illustrés). La figure 4 illustre l'activité ALDH1 détectée par cytométrie en flux via le propionate de résorufine. La condition non-traitée démontre la présence de cellules ALDH1 positive vivante (Calcein-AM).
En présence d'un inhibiteur d'ALDHI , le DIMATE, une inhibition des cellules ALDH1 positive est observée pour les cellules vivantes ainsi qu'une baisse de la viabilité, due au traitement.
Les résultats du dosage de l'activité ALDH1 par le rétinoate de résorufine et le di-rétinoate de fluorescéine et de l'activité ALDH3 par le benzoate de résorufine et le di-benzoate de fluorescéine après un traitement à l'acide rétinoïque sont illustrés par la figure 5 qui montre qu'une inhibition significative (P<0.001 ) ou (P<0.01 ) de niveau d'activité de l'ALDHI pour le rétinoate de résorufine et le di-rétinoate de fluorescéine et de l'ALDH3 pour le benzoate de résorufine et le di-benzoate de fluorescéine.
En présence de DSF aux deux concentrations 250nM et 1000nM, une inhibition significative (P<0.001 ) de l'activité ALDH1 pour le rétinoate de résorufine et le di-rétinoate de fluorescéine et ALDH3 pour le benzoate de résorufine et le di-benzoate de fluorescéine, sont illustrés par la figure 6.
3. Application de l'utilisation des substrats
Matériels et Méthodes
Patients
La moelle osseuse (Mo) et le sang (Sg) ont été obtenus de 33 patients avec leurs accords éclairés. Les évaluations ont été réalisées sur sang total après lyse des globules rouges ou sur moelle osseuse.
Isolement des cellules Mastiques et évaluation de l'activité ALDH1 et ALDH3
L'isolement des cellules blastiques a été réalisée par un cytomètre en flux Navios (Beckman Coulter®) en fonction du phénotype de ces derniers indiqué sur le tableau 5 (CD34+, CD1 17+ ou bien CD45 faible).
L'activité ALDH1 et ALDH3 a été évaluée en incubant les réactifs : rétinoate de résorufine ou octanoate de résorufine à 5 pmol.L"1 et di-rétinoate de fluorescéine ou di-octanoate de fluorescéine à 0.8 pmol.L"1 dans le sang total après lyse des globules rouges ou dans l'extrait de moelle osseuse pendant 30 minutes à 37 C. La fluorescence observée est analysée par cytométrie permettant de donner une valeur de l'intensité de fluorescence médiane (IFM) correspondant à l'activité relative de chaque isoforme d'ALDH des cellules blastiques.
Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 : Paramètres de patients inclus dans l'étude des différentes activités des Aldéhydes Déhydrogénases. LAM, Leucémie Aigue Myeloide ; AREB, Anémie Réfractaire avec Excès Blastes ; Sg, sang ; Mo, Moelle osseuse ; I FM, valeur de l'Intensité de Fluorescence Médiane.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Substrat spécifique d'une isoenzyme de l'ALDH comprenant un composé :
(a) de formule (I): R-COO-A (I) résultant de l'estérification d'un traceur fluorescent A-OH par un agent acylant dérivé de l'acide correspondant
RCOOH, dans lequel R est choisi de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate; ou
(b) de formule (II) :
(II)
dans lequel :
R et R', identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, le propionate, l'octanoate, le benzoate, le 4-aminobutyrate, l'hexanoate, le 4- diethylaminobenzoate ou le 4-hydroxy-2-nonenoate.
2. Substrat spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce que A-OH est choisi parmi la 7-hydroxycoumarine, un fluorophore de la famille des tokyo green, en particulier le 2-méthyl-4-méthoxy-Tokyo Green, la résorufine et la fluorescéine.
3. Substrat spécifique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'isoenzyme de l'ALDH est I'ALDHI et en ce que R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à former le rétinoate, l'hexanoate ou le propianoate.
4. Substrat spécifique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'isoenzyme de l'ALDH est I ALDH3 et en ce que R et R' identiques ou différents sont choisis de manière à former l'octanoate, le 4-hydroxy-2- nonenoate, le 4-diethylaminobenzoate ou le benzoate.
5. Substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'isoenzyme de l'ADLH est détecté dans une population cellulaire.
6. Composition comprenant au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7. Marqueur diagnostique comprenant un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour quantifier au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire.
9. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour trier toute ou une partie d'une population cellulaire en fonction de son expression d'au moins une isoenzyme de l'ALDH.
10. Utilisation d'un marqueur selon la revendication 7 pour le diagnostic d'une maladie impliquant une dérégulation d'une isoenzyme de l'ALDH.
1 1. Utilisation selon la revendication 10, dans laquelle ladite maladie est choisie parmi : les cancers, les troubles de la motilité du sperme, les ischémies, les traumatismes crâniens ou les pancréatites.
12. Utilisation d'un marqueur selon la revendication 7 pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre à une thérapie inhibant l'activité d'une isoenzyme de l'ALDH et/ou dirigée contre les cellules souches cancéreuses.
13. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour distinguer des cellules souches saines de cellules souches cancéreuses.
14. Utilisation selon la revendication 13 pour distinguer les cellules souches de cancers solides et/ou de tumeurs malignes hématologiques.
15. Utilisation d'au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour caractériser les différentes étapes d'un cancer ou les différentes étapes de la différentiation de cellules souches.
16. Méthode pour distinguer des cellules exprimant au moins une isoenzyme de l'ALDH dans une population cellulaire, ladite méthode comprenant:
(a) la mise en contact de la population cellulaire avec au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,
(b) la mesure de la fluorescence de la population cellulaire; et
(c) l'identification des cellules présentant une fluorescence accrue par rapport à la fluorescence de la population cellulaire avant que ladite population soit mise en contact avec au ledit moins un substrat spécifique.
17. Kit pour quantifier une isoenzyme de l'ALDH comprenant au moins un substrat spécifique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
EP17749666.8A 2016-07-28 2017-07-27 Substrat spécifique d'une isoenzyme de l'aldh Pending EP3491143A1 (fr)

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