EP3487983A1 - Separation of enzymes from trichoderma reesei by filter press and tangential filtration on a ceramic membrane - Google Patents

Separation of enzymes from trichoderma reesei by filter press and tangential filtration on a ceramic membrane

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Publication number
EP3487983A1
EP3487983A1 EP17737287.7A EP17737287A EP3487983A1 EP 3487983 A1 EP3487983 A1 EP 3487983A1 EP 17737287 A EP17737287 A EP 17737287A EP 3487983 A1 EP3487983 A1 EP 3487983A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
separation
filter press
microfiltration
subjected
culture medium
Prior art date
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Pending
Application number
EP17737287.7A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Mohamed Fadhel BEN CHAABANE
Romain Rousset
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN, Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP3487983A1 publication Critical patent/EP3487983A1/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to a process for the separation of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes contained in a culture medium comprising a filamentous fungus Trichoderma reesei.
  • the invention is particularly in processes for producing sugar, biofuels, or biochemical molecules from lignocellulosic biomass.
  • This type of process comprises a step of enzymatic hydrolysis of a biomass pretreated with an enzymatic cocktail produced for example by the filamentous fungus Trichoderma reesei.
  • the present invention relates to the separation of this enzymatic cocktail and the filamentous fungus Trichoderma reesei.
  • flocculants may be added to increase the efficiency of the separation
  • Decantation and centrifugation used continuously in industrial processes are solid / liquid separation processes depending on their difference in density and subjecting the medium to centrifugal force.
  • Decanters are centrifugal machines equipped with a screw whose bowl rotates on a horizontal axis. They are mainly used to clarify (two-phase decanter) mixtures with large pellets or with a high content of suspended matter (greater than 15% and often of the order of 30%, and even up to 60%). Decantation allows reduce this content to about 5%.
  • the pellet is measured by centrifuging a sample at 4000 G for 5 minutes. It corresponds to the percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample.
  • Centrifugation is used with solutions having a pellet of less than 15% and makes it possible to lower this pellet to values of less than 2% or even 1%. Centrifugation clarifies the turbid liquid from settling.
  • Tangential filtration or ultrafiltration separation processes are implemented depending on the size of the elements to be separated. They use membranes.
  • the particles have a size ranging from 0.1 ⁇ to 10 ⁇ .
  • This process is used to separate, for example, microorganisms such as filamentous fungi.
  • organic membranes that are used.
  • Ultrafiltration is used to separate objects with diameters between 1 and 100 nm.
  • Such membranes allow small molecules (water, salts) to pass and stop high molecular weight molecules (polymers, proteins, etc.). They will be used to concentrate, for example, proteins or enzymes.
  • the factors that may have an impact on the separation performance are essentially the size of the molecules, the shape of the molecules, their charge, the nature of the membrane and the operating conditions.
  • Membranes are characterized by their physicochemical nature. In general, there are three main classes of membranes:
  • Organic membranes are made from cellulose polymer (eg cellulose acetate). They have low manufacturing costs, but can not be used to separate cellulases that may hydrolyze them
  • Organic membranes based on synthetic polymers such as nylon and polysulfone have many advantages over the previous ones and are the most used for the separation of enzymes (proteins).
  • Mineral membranes have a very good chemical, mechanical and thermal resistance but cost more than organic membranes (about 10 times more expensive). They are used in biotechnology in various processes such as the clarification of fruit juices, the debacterization of milk or the clarification of alcoholic beverages (wine, beer, cider). They find applications also in water treatment.
  • the composite membranes are composed of a polymer part deposited on another microporous part. These have been developed primarily for reverse osmosis. The prior art is very much provided in this field.
  • US-3398055 teaches the separation and purification of cellulases produced by Trichoderma reesei.
  • the mushroom is separated with a vacuum rotary filter.
  • the enzymes are separated using cotton and eluted with a basic solution.
  • the patent application US-2014/0295525 proposes a separation in 2 steps of the enzymes of the Trichoderma fungus.
  • the method describes the concentration of the enzymes in two ultrafiltration steps, the enzymes having previously undergone a solid / liquid separation step.
  • the membrane In a first step of separation by ultrafiltration, the membrane has a MWCO of 100,000 (Da) to 200,000 (Da), or about 0.01 ⁇ 0.02 ⁇ threshold cutoff.
  • the retentate goes into a second ultrafiltration step on a membrane having a MWCO of 5,000 to 50,000, and the 2 liquids containing the enzymes are mixed.
  • the invention proposes a separation process comprising
  • the invention provides a method for separating from a culture medium, an enzymatic cocktail and the fungus Trichoderma reesei, the culture medium resulting from an enzyme production by the fungus, in which method
  • said culture medium is subjected, within a time interval of less than or equal to 30 hours, preferably less than or equal to 24 hours, from the end of production, to separation on a press filter lined with a fabric having a porosity of 3-20 ⁇ , so as to obtain a filtrate having an optical density OD 600nm corrected lower than 2.5 and
  • the liquid phase obtained is subjected to a tangential microfiltration on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 0.5 and 1.4 .mu.m, so that the corrected OD 600nm does not exceed 0.1.
  • said culture medium is subjected to separation on a filter press without prior cooling.
  • the culture medium is not subjected to decantation and / or centrifugation before being separated on a filter press.
  • Filter press separation and microfiltration are carried out at 20-30 ° C, preferably 22-27 ° C.
  • the filtrate is recycled into the culture medium supplying the filter press at a rate of at most 10% by weight.
  • the dry matter content of the cake is at least 20% by weight, generally between 20 and 65% or 20-45%, often in the range of 25-35%) and 90-95% wt of filtrate.
  • the pellet (percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample, measured by centrifuging a sample at 4000 G for 5 minutes) of the filtrate from the filter press is less than 1, 5%.
  • the microfiltration of the filtrate obtained at the end of the filter press is carried out within a maximum of 30 hours, and preferably 24 hours maximum.
  • said filtrate from the filter press is subjected to microfiltration without prior cooling.
  • the tangential microfiltration is carried out on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 0.8 and 1.4 .mu.m.
  • the liquid phase obtained after microfiltration is subjected to ultrafiltration, preferably on a ceramic membrane, and even more preferably on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 5 and 15 kDa.
  • the liquid phase obtained after microfiltration is subjected to ultrafiltration within a maximum of 48 hours, preferably 24 hours maximum.
  • the separated enzymatic cocktail is contacted with pretreated lignocellulosic biomass, preferably by steam explosion, to perform enzymatic hydrolysis and to obtain sweetened juices, said sugar juices undergo ethanolic fermentation, enzymatic hydrolysis and fermentation being carried out separately or simultaneously, and the ethanol produced is separated by distillation.
  • the enzymatic cocktail is produced by Trichoderma reesei in a conventional aerated fermentation production line.
  • the enzymatic cocktail production process begins with a propagation phase, generally implemented in small reactors of increasing size, with the aim of multiplying the filamentous fungus and limiting the duration of the lag phase and the risks of contamination.
  • the culture medium is transferred to the final reactor of large volume.
  • the enzyme production process has two phases:
  • microorganisms used in the process for producing an enzymatic cocktail according to the invention are strains of fungi belonging to the species Trichoderma reesei.
  • the most effective industrial strains are the strains belonging to the species Trichoderma reesei, modified to improve the enzyme cocktail by mutation-selection methods, for example the strain IFP CL847 (French patent FR-B-2 555 803). Strains improved by genetic recombination techniques can also be used. These strains are cultured in stirred and aerated reactors under conditions compatible with their growth and the production of enzymes.
  • the carbonaceous growth substrate of said microorganism used in said growth phase a) of the process according to the invention is advantageously chosen from industrial soluble sugars, and preferably from glucose, lactose, xylose, liquid residues obtained after ethanolic fermentation.
  • said carbonaceous growth substrate is introduced into the closed reactor before sterilization or is sterilized separately and introduced into the closed reactor after sterilization of the latter.
  • Said carbonaceous growth substrate is used in said growth phase a) at an initial concentration most often between 20 and 90 g of carbon substrate per liter of reaction volume.
  • said growth phase a) is carried out over a period of between 30 and 70 hours, preferably between 30 and 40 hours.
  • said growth phase a) operates at a pH of 4.8 and at a temperature of 20-30 ° C, generally 22-27 ° C, preferably of the order of 27 ° C.
  • Said inducing carbon substrate used in said production phase b) is advantageously fed in the fed-batch phase with a limiting flux of between 30 and 80 mg per gram of cells per hour.
  • the temperature is generally the same as in step a).
  • a medium containing a solids concentration of between 10 and 45 g / L (corresponding to the dry mushroom) is generally obtained.
  • the pellet measured after centrifugation (4000G, 5 minutes) is greater than 15% and often of the order of 30%, and even up to 60%). It corresponds to the percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample.
  • the object of the invention is to separate the enzymes from the fungus and then possibly to concentrate them. Solid / liquid separation steps in which the fungus is separated from the liquid.
  • the liquid contains enzymes and residual salts.
  • an ultrafiltration (UF) on a ceramic membrane is substantially more effective than on an organic membrane.
  • the culture medium is subjected to a filter press separation which maximizes the recovery of the enzymes.
  • the liquid obtained is subjected to tangential microfiltration on a ceramic membrane and then optionally to ultrafiltration, preferably in tangential filtration.
  • Aeration and pH control are stopped.
  • a preservative is advantageously added, for example sodium benzoate.
  • Production is stopped when all the sugar in the fed-batch phase is consumed or when the basal consumption rate (which is proportional to the speed of protein production) is slowed down (speed less than 30% or more).
  • the filter press In the time before autolysis, the filter press is separated. It has been found that it is important to maintain the temperature below 40 ° C and preferably at 30 ° C. Beyond that, separation is much less effective.
  • cooling step before filter press separation there is no cooling step before filter press separation.
  • cooling is not desired; there may be a slight drop in temperature during the transfer between the unit where the production step takes place and the filter press unit; this drop can be 3 ° C or less.
  • the separation is often carried out substantially at the same temperature as that of the production phase of step a) either a temperature of 17 to 30 ° C or 20-30 ° C, generally 22-27 ° C, and most often of the order of 25 ° C. This is usually the ambient temperature.
  • the filter press is lined with canvas, and usually without a membrane tray.
  • the porosity of the fabrics is between 3 and 20 ⁇ m, preferably between 3 and 7 ⁇ m and preferably 5 ⁇ m. Generally 5 to 10% by weight of cake and 90 to 95% by weight of filtrate are obtained.
  • Press filter separation can be carried out in one or two steps.
  • Press filter separation is generally carried out in two steps: a first filtration step at a pressure P1 and a second compaction step at a pressure P2 greater than P1.
  • a first filtration step at a pressure P1
  • a second compaction step at a pressure P2 greater than P1.
  • the pressure P1 is between 1.2 and 6 bar and P2 between 5 and 10 bar.
  • the dryness of the cakes depends on the pressures applied. The goal is to recover as much of the filtrate as possible.
  • Another way which can be used alone or consecutively to the use of the recycling described above, is to let lysing the fungus that is in the cake, after a cooling step. The fungus then releases enzymes which are then recovered. This process is described in application WO-2016/016182.
  • the separation is carried out so as to obtain a liquid (or suspension) having a corrected OD 600nm (optical density) of less than 2.5 (corrected means deducing the absorbance of a 0.22 ⁇ equivalent filtrate).
  • the measurement is performed on a sample with a conventional laboratory spectrometer.
  • the pellet (4000 g / 5min) is generally less than 1, 5%.
  • This step must make it possible to eliminate all the fungi from the filtrate. It is carried out so that the corrected OD 600nm does not exceed 0.1 (after deduction of the absorbance of a 0.22 ⁇ equivalent filtrate).
  • the filtrate is subjected to microfiltration within a period of at most 30 hours, or at most 28 hours or preferably at most 24 hours. Most often, microfiltration can be done in line with the filter press.
  • the temperature preferably the temperature is not lowered (no desired cooling). This makes it possible to maintain a satisfactory product flow rate.
  • the temperature is therefore generally between 17 and 30 ° C or else 20 and 30 ° C, and generally 22-27 ° C, and most often of the order of 25 ° C. This is usually the ambient temperature.
  • the membranes to be used have a cutoff threshold of between 0.5 and 1.4 ⁇ , preferably between 0.6 and 1.4 .mu.m and preferably between 0.8 and 1.4 .mu.m.
  • the enzyme yield can be maximized by diafiltration (addition of water to the retentate followed by microfiltration.
  • Ultrafiltration with mineral or organic membranes can be maximized by diafiltration (addition of water to the retentate followed by microfiltration.
  • This step makes it possible to concentrate the enzymes produced by the fungus, in particular by Trichoderma reesei.
  • the enzymatic cocktail is a complex mixture of several enzymes ranging in size from 1 * 10 4 g / mol (10 kDa) to 10 * 10 4 g / mol (100 kDa).
  • This ultrafiltration step is carried out at a temperature generally between 20-30 ° C, and generally 22-27 ° C, and usually of the order of 25 ° C. It is always advantageous to implement it as close as possible (in time) to microfiltration. A delay of 48 hours maximum is recommended, and this delay is preferably less than or equal to 24 hours.
  • This step makes it possible to concentrate the proteins of interest up to 150 g / l +/- 10g / l.
  • the value of the volume concentration factor VCF (or FCV) to be achieved is a function of the initial protein concentration.
  • preservative can be added to the retentate at the end of this step.
  • preservative for example, the addition of sodium benzoate between 0.1 and 0.35% is recommended.
  • mineral membranes for ultrafiltration.
  • organic membranes can be used but with caution and only under the conditions recommended by the suppliers.
  • the process according to the invention is used to separate the enzymes in a production process, from lignocellulosic biomass, sugar juices, biofuels (such as ethanol) or biochemical molecules.
  • These processes include the pretreatment steps of the lignocellulosic biomass (eg by steam explosion), the pretreated biomass is subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of enzymes (secreted by Trichoderma reesei), the hydrolyzate loaded with sweetened juice is subjected to fermentation (for example alcoholic) and the desired products (eg alcohol) are separated (eg by distillation).
  • pretreatment steps of the lignocellulosic biomass eg by steam explosion
  • the pretreated biomass is subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of enzymes (secreted by Trichoderma reesei)
  • the hydrolyzate loaded with sweetened juice is subjected to fermentation (for example alcoholic) and the desired products (eg alcohol) are separated (eg by distillation).
  • a method in which the invention is particularly applicable includes pretreatment of lignocellulosic biomass by steam explosion, biomass pretreated is subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of enzymes secreted for example by Trichoderma reesei which they were separated according to the process of the invention, the hydrolyzate loaded with sugar juice is subjected to an alcoholic fermentation and the ethanol is separated by distillation. Enzymatic hydrolysis and fermentation can take place separately or simultaneously.
  • the ultrafiltration step has proved to be useless most of the time in the case of a plant that produces ethanol with an in-situ production of enzymes.
  • Example No. 1 Organic Membrane Microfiltration Tests (Comparative)
  • the culture medium to be treated resulting from the production phase has the following composition:
  • FIGS. 1 and 2 present the results of laboratory tests carried out with organic membranes having porosities ranging from 0.1 to 0.8 ⁇ : MFG1 membranes: 0.1 ⁇ (polysulphone) cutoff threshold, MFG2: 0.2 ⁇ (polysulphone), MFG8: ⁇ , ⁇ (polysulphone), MFP5: 0.5 ⁇ (fluoro).
  • VCF represents the volume concentration factor
  • Permeability is defined as the ratio between the concentration of enzymes in the permeate (which passes through the membrane) and that in the retentate (what remains).
  • the method used was to test 4 cut-off thresholds in parallel for each filtration.
  • the tool used is a filtration pilot to accommodate 4 different membranes in the same housing. It has a membrane permeate outlet and a single retentate loop. It allows to study in parallel the variations of permeate flow rates for 4 membranes and to produce samples.
  • the filtrate from the filter press has a concentration of 38.2 g / L in enzymes.
  • the final retentate was dosed at 44.3 g / L.
  • the enzyme concentrations of the 4 permeates are as follows:
  • Example 3 makes it possible to compare two sequences made either with a conventional method or with the method of the patent.
  • the culture medium to be treated resulting from the production phase has the following composition: • 39 g / L of protein
  • Example 3 a conventional sequence of a decanter, a centrifuge and MF (microfiltration) filtrations on organic membrane and UF (ultrafiltration) on an organic membrane.
  • the overall yield of this sequence is 27%. It is possible to approach a 50% yield by recycling the pellets of the decantation, centrifugation and retentate stages of the MF stage and subjecting them to a new separation cycle (centrifugation, MF, UF )
  • MF filtration is much more effective on ceramic membranes than on organic membranes.
  • yield on ceramic membrane whether MF or UF is significantly higher than that with organic membranes.
  • Example 4 Pilot test with the sequence according to the invention.
  • This test uses a culture medium produced in a 6 m3 reactor. Its characteristics are as follows:
  • the separation was carried out immediately after the production step, and without cooling the product.
  • the temperature is 27 ° C.
  • the tool used has 10 trays with an overall filtration area of 3 m 2 . This makes it possible to form, by batch, 10 mushroom cakes 30 mm thick and having a total volume before compaction of 30 liters.
  • the fabric used is a muiti filament fabric having a porosity of 5 ⁇ .
  • the separation is done in three steps:
  • the first step consists of a filtration with a pressure upstream of 5 bars with monitoring of the filtration rate over time.
  • the third step consists of a removal (recovery) of cakes that are weighed. Note that it would have been possible to wash the cake to minimize losses let the mushroom lysing but that was not done in the case of this example. It took a total of 14 filtrations / compactions to treat the total culture medium (4260 kg).
  • Figure 3 shows the evolution of the filtered quantity as a function of time and Figure 4 the evolution of the filtered quantity as a function of the feed pressure.
  • the batch duration is 25 minutes.
  • the filtration rate is high (between 500 and 700 L / m2 / h).
  • the mushroom "sticks" against the canvas and will serve as a filter media.
  • the pressure increases and the filtration rate decreases. It is generally decided to stop the filtration when the flow seems too low compared to the initial flow (for example less than 10 or 20%) and depending on the initial objective of the filtration time.
  • the average mass per batch before compaction is 263 ⁇ 30 kg.
  • the average filtration rate is 210 kg / m 2 / h.
  • the recovery yield of the proteins after the filter press step is 95.4%.
  • the filtrate from the filter press was then divided into several samples which are treated by microfiltration on inorganic membranes having porosities of 0.8 and 1.4 ⁇ .
  • the objective of the test is to compare their performance on filter filtrate containing enzymes and fungi with a target volume concentration factor of 10. Microfiltration is followed by diafiltration to minimize protein loss. (addition of water corresponding to 5 volumes of retentate).
  • the microfiltration tool has 3 membranes of 0.33m 2 of filtration area on each housing.
  • the first test made it possible to select the membrane 1 .4 ⁇ which has a filtration performance better than the 0.8 ⁇ membrane at the same transmembrane pressure. Indeed, the permeate flux stabilizes at 100 L / m 2 / h for the first and at 60 L / m 2 / h for the second up to a volume concentration factor (CVF) of 7.5. Both membranes clarified the product (no growth of fungus on permeate spread on PDA medium).
  • Figure 5 shows the evolution of protein concentrations in the retentate and permeates. It shows that the permeability of the two membranes with respect to proteins is very good. The permeability of the membranes at 1, 4 ⁇ is better and is greater than 0.9.

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Abstract

The invention relates to a method for separating, from a culture medium, an enzymatic cocktail and the fungus Trichoderma Reesei, the culture medium resulting from enzyme production by the fungus, method in which: said culture medium is subjected, in a period of no longer than 30 h from the halting of production, to a separation on a filter press lined with a fabric having a porosity of 3-20 μm, so as to obtain a filtrate having a corrected optical density OD at 600 nm of less than 2.5; and the liquid phase obtained is subjected to tangential micro-filtration on a ceramic membrane having a cut-off limit of 0.5 to 1.4 μm, so that the corrected OD at 600 nm does not exceed 0.1.

Description

SEPARATION DES ENZYMES ISSUES DE TRICHODERMA REESEI PAR FILTRE PRESSE ET FILTRATION TANGENTIELLE SUR MEMBRANE CERAMIQUE.  SEPARATION OF ENZYMES FROM TRICHODERMA REESEI BY PRESS FILTER AND TANGENTIAL FILTRATION ON CERAMIC MEMBRANE.
L'invention concerne un procédé de séparation d' enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques contenues dans un milieu de culture comprenant un champignon filamenteux Trichoderma reesei. The invention relates to a process for the separation of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes contained in a culture medium comprising a filamentous fungus Trichoderma reesei.
L'invention s'inscrit en particulier dans les procédés de production de sucre, de biocarburants, ou molécules biochimiques à partir de biomasse lignocellulosique. The invention is particularly in processes for producing sugar, biofuels, or biochemical molecules from lignocellulosic biomass.
Ce type de procédé comprend une étape d'hydrolyse enzymatique d'une biomasse prétraitée avec un cocktail enzymatique produit par exemple par le champignon filamenteux Trichoderma reesei. La présente invention porte sur la séparation de ce cocktail enzymatique et du champignon filamenteux Trichoderma reesei. This type of process comprises a step of enzymatic hydrolysis of a biomass pretreated with an enzymatic cocktail produced for example by the filamentous fungus Trichoderma reesei. The present invention relates to the separation of this enzymatic cocktail and the filamentous fungus Trichoderma reesei.
Il existe de nombreuses technologies de séparation utilisées seules ou en enchaînements. Art antérieur There are many separation technologies used alone or in chains. Prior art
Dans le cadre de la séparation des enzymes du champignon, la demande de brevet WO-2016/16182 de la demanderesse préconise l'enchaînement suivant : As part of the separation of enzymes from the fungus, the patent application WO-2016/16182 of the applicant recommends the following sequence:
- une première séparation par décantation. Dans certains cas, des floculants peuvent être ajoutés pour augmenter l'efficacité de la séparation,  a first separation by decantation. In some cases, flocculants may be added to increase the efficiency of the separation,
- une seconde séparation par centrifugation pour réduire le culot (encore appelé taux de culot),  a second separation by centrifugation to reduce the pellet (also known as the pellet rate),
- une microfiltration (filtration tangentielle) pour éliminer toute trace de microorganisme,  a microfiltration (tangential filtration) to eliminate any trace of microorganism,
- une dernière étape d'ultrafiltration pour concentrer les enzymes.  a last ultrafiltration step to concentrate the enzymes.
La décantation et la centrifugation utilisées en continu dans les procédés industriels sont des procédé de séparation solide/liquide en fonction de leur différence de densité et en soumettant le milieu à une force centrifuge. Decantation and centrifugation used continuously in industrial processes are solid / liquid separation processes depending on their difference in density and subjecting the medium to centrifugal force.
Les décanteurs sont des machines centrifuges munies d'une vis dont le bol tourne sur un axe horizontal. Ils sont utilisés principalement pour clarifier (décanteur deux phases) des mélanges avec des culots importants ou à forte teneur en matière en suspension (supérieur à 15% et souvent de l'ordre de 30%, et même jusqu'à 60 %). La décantation permet de réduire cette teneur à environ 5%. Le culot est mesuré en centrifugeant un échantillon à 4000 G pendant 5 minutes. Il correspond au pourcentage du volume occupé par le solide par rapport au volume total de l'échantillon. Decanters are centrifugal machines equipped with a screw whose bowl rotates on a horizontal axis. They are mainly used to clarify (two-phase decanter) mixtures with large pellets or with a high content of suspended matter (greater than 15% and often of the order of 30%, and even up to 60%). Decantation allows reduce this content to about 5%. The pellet is measured by centrifuging a sample at 4000 G for 5 minutes. It corresponds to the percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample.
La centrifugation est utilisée avec des solutions ayant un culot inférieur à 15% et permet de faire descendre ce culot à des valeurs inférieures à 2%, voire à 1 %. La centrifugation permet de clarifier le liquide trouble issu de la décantation. Centrifugation is used with solutions having a pellet of less than 15% and makes it possible to lower this pellet to values of less than 2% or even 1%. Centrifugation clarifies the turbid liquid from settling.
Elle est utilisée dans de nombreux domaines : traitements des eaux, agro-alimentaire, biotechnologie, industrie pharmaceutiques... It is used in many fields: water treatment, agro-food, biotechnology, pharmaceutical industry ...
Les procédés de séparation par filtration tangentielle ou ultrafiltration sont mis en œuvre en fonction de la taille des éléments à séparer. Ils utilisent des membranes. Tangential filtration or ultrafiltration separation processes are implemented depending on the size of the elements to be separated. They use membranes.
Ainsi dans le cas de la microfiltration les particules ont une taille variant de 0,1 μηι à 10μηι. Ce procédé est utilisé pour séparer par exemple, des microorganismes comme des champignons filamenteux. Pour des raisons économiques, ce sont le plus souvent des membranes organiques qui sont utilisées. L'ultrafiltration est utilisée pour séparer des objets ayant des diamètres compris entre 1 et 100 nm. De telles membranes laissent passer les petites molécules (eau, sels) et arrêtent les molécules de masse molaire élevée (polymères, protéines...). Elles vont être utilisées pour concentrer par exemple les protéines ou les enzymes. Thus in the case of microfiltration the particles have a size ranging from 0.1 μηι to 10μηι. This process is used to separate, for example, microorganisms such as filamentous fungi. For economic reasons, it is most often organic membranes that are used. Ultrafiltration is used to separate objects with diameters between 1 and 100 nm. Such membranes allow small molecules (water, salts) to pass and stop high molecular weight molecules (polymers, proteins, etc.). They will be used to concentrate, for example, proteins or enzymes.
Les facteurs qui peuvent avoir un impact sur les performances de séparation sont essentiellement la taille des molécules, la forme des molécules, leur charge, la nature de la membrane et les conditions opératoires. The factors that may have an impact on the separation performance are essentially the size of the molecules, the shape of the molecules, their charge, the nature of the membrane and the operating conditions.
Les membranes sont caractérisées par leur nature physico-chimiques. En général, on distingue trois classes principales de membranes : Membranes are characterized by their physicochemical nature. In general, there are three main classes of membranes:
- les membranes organiques (naturelles ou synthétiques),  - the organic membranes (natural or synthetic),
- les membranes minérales (inorganiques ou céramiques),  - mineral membranes (inorganic or ceramic),
- les membranes composites. Les membranes organiques sont fabriquées à base de polymère de cellulose (par exemple acétate de cellulose). Elles ont des coûts de fabrication faibles, mais ne peuvent pas être utilisées pour séparer les cellulases qui risquent de les hydrolyser - composite membranes. Organic membranes are made from cellulose polymer (eg cellulose acetate). They have low manufacturing costs, but can not be used to separate cellulases that may hydrolyze them
Les membranes organiques à base de polymères synthétiques tels que le nylon et le polysulfone présentent beaucoup d'avantages par rapport aux précédentes et sont les plus utilisées pour la séparation des enzymes (protéines).  Organic membranes based on synthetic polymers such as nylon and polysulfone have many advantages over the previous ones and are the most used for the separation of enzymes (proteins).
Les membranes minérales ont une très bonne résistance chimique, mécanique et thermique mais coûtent plus cher que les membranes organiques (environ 10 fois plus cher). Elles sont utilisées en biotechnologies dans différents procédés comme la clarification des jus de fruits, la débactérisation du lait ou la clarification des boissons alcoolisées (vin, bière, cidre). Elles trouvent des applications également dans le traitement des eaux.  Mineral membranes have a very good chemical, mechanical and thermal resistance but cost more than organic membranes (about 10 times more expensive). They are used in biotechnology in various processes such as the clarification of fruit juices, the debacterization of milk or the clarification of alcoholic beverages (wine, beer, cider). They find applications also in water treatment.
Enfin, les membranes composites sont composées d'une partie en polymère déposée sur une autre partie micro poreuse. Ces dernières ont été développées essentiellement pour l'osmose inverse. L'art antérieur est très fourni dans ce domaine. Finally, the composite membranes are composed of a polymer part deposited on another microporous part. These have been developed primarily for reverse osmosis. The prior art is very much provided in this field.
Le brevet US-3398055 enseigne la séparation et la purification de cellulases produites par Trichoderma reesei. Le champignon est séparé avec un filtre rotatif sous vide. Les enzymes sont séparées en utilisant du coton et éluées avec une solution basique. US-3398055 teaches the separation and purification of cellulases produced by Trichoderma reesei. The mushroom is separated with a vacuum rotary filter. The enzymes are separated using cotton and eluted with a basic solution.
La demande de brevet US-2014/0295525 propose une séparation en 2 étapes des enzymes du champignon Trichoderma. Le procédé décrit la concentration des enzymes en deux étapes d'ultrafiltration, les enzymes ayant subi préalablement une étape de séparation solide/liquide. Dans une première étape de séparation par ultrafiltration, la membrane présente un MWCO de 100.000 (Da) à 200.000 (Da), soit environ 0.01 μηι à 0.02 μηι de seuil de coupure. Le rétentat passe dans une seconde étape d'ultrafiltration sur une membrane présentant un MWCO de 5.000 à 50.000, et les 2 liquides contenant les enzymes sont mélangés. The patent application US-2014/0295525 proposes a separation in 2 steps of the enzymes of the Trichoderma fungus. The method describes the concentration of the enzymes in two ultrafiltration steps, the enzymes having previously undergone a solid / liquid separation step. In a first step of separation by ultrafiltration, the membrane has a MWCO of 100,000 (Da) to 200,000 (Da), or about 0.01 μηι 0.02 μηι threshold cutoff. The retentate goes into a second ultrafiltration step on a membrane having a MWCO of 5,000 to 50,000, and the 2 liquids containing the enzymes are mixed.
Le brevet indique que cette méthode permet de résoudre les problèmes d'encrassement de la membrane et d'agrégation des cellulases lors d'une étape unique d'ultrafiltration, même lorsqu'elle est précédée d'une séparation de particules solides dans un filtre céramique ou un matériau non-tissé. Dans le brevet, il est constaté une rétention des enzymes dans le rétentat bien que leur taille soit comprise entre 10 kDa et 100 Da. Ce brevet décrit donc essentiellement une optimisation de l'étape de la concentration des enzymes. The patent states that this method solves the problems of membrane fouling and cellulase aggregation in a single ultrafiltration step, even when preceded by separation of solid particles in a ceramic filter. or a nonwoven material. In the patent, there is a retention of enzymes in the retentate although their size is between 10 kDa and 100 Da. This patent therefore essentially describes an optimization of the enzyme concentration step.
Dans le cadre de la concentration du cocktail enzymatique issu du champignon Trichoderma reesei, on a pu constater de façon surprenante l'existence de ce phénomène de rétention des enzymes avec des membranes organiques qui ont une taille de Ο.δμηι, ayant donc des pores 40 à 80 fois plus gros que ceux décrits par la demande de brevet US-2014/0295525. Cela pénalisait fortement le rendement de séparation des enzymes. In the context of the concentration of the enzymatic cocktail derived from the fungus Trichoderma reesei, it has been surprisingly observed the existence of this phenomenon of retention of enzymes with organic membranes which have a size of Ο.δμηι, thus having pores 40 80 times larger than those described by patent application US-2014/0295525. This greatly penalized the enzyme separation efficiency.
L'invention propose un procédé de séparation comprenant The invention proposes a separation process comprising
- une étape de séparation du champignon Trichoderma reesei sur filtre-presse qui doit avantageusement être réalisée dans les 30 ou 24 heures qui suivent la production, a step of separation of the fungus Trichoderma reesei on filter-press which must advantageously be carried out within 30 or 24 hours following the production,
- puis une étape de microfiltration sur membrane minérale, then a microfiltration step on a mineral membrane,
- éventuellement suivie d'une étape de concentration sur membrane minérale ou organique.  - optionally followed by a concentration step on a mineral or organic membrane.
Il a été constaté que l'enchaînement d'une séparation sur filtre presse suivie d'une microfiltration sur membrane minérale, et éventuellement d'une ultrafiltration sur membrane minérale, permet d'obtenir des résultats particulièrement bons en termes de rendement et d'efficacité. It has been found that the sequencing of a press filter separation followed by a microfiltration on a mineral membrane, and possibly an ultrafiltration on a mineral membrane, makes it possible to obtain particularly good results in terms of efficiency and effectiveness. .
Résumé de l'invention Summary of the invention
Plus précisément, l'invention propose un procédé pour séparer d'un milieu de culture, un cocktail enzymatique et le champignon Trichoderma reesei, le milieu de culture résultant d'une production d'enzymes par le champignon, procédé dans lequel  More specifically, the invention provides a method for separating from a culture medium, an enzymatic cocktail and the fungus Trichoderma reesei, the culture medium resulting from an enzyme production by the fungus, in which method
- ledit milieu de culture est soumis, dans un délai inférieur ou égal à 30h, de préférence inférieur ou égal à 24 h, à partir de l'arrêt de la production, à une séparation sur filtre presse garni d'une toile ayant une porosité de 3-20μηι, de façon à obtenir un filtrat ayant une densité optique DO 600nm corrigée inférieure à 2.5 et said culture medium is subjected, within a time interval of less than or equal to 30 hours, preferably less than or equal to 24 hours, from the end of production, to separation on a press filter lined with a fabric having a porosity of 3-20μηι, so as to obtain a filtrate having an optical density OD 600nm corrected lower than 2.5 and
- la phase liquide obtenue est soumise à une microfiltration tangentielle sur membrane céramique ayant un seuil de coupure compris entre 0.5 et 1 .4μηι, de façon à ce que la DO 600nm corrigée ne dépasse pas 0.1 . Avantageusement, ledit milieu de culture est soumis à la séparation sur filtre presse sans refroidissement préalable. De préférence, le milieu de culture n'est pas soumis à une décantation et/ou une centrifugation avant d'être séparé sur filtre presse. the liquid phase obtained is subjected to a tangential microfiltration on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 0.5 and 1.4 .mu.m, so that the corrected OD 600nm does not exceed 0.1. Advantageously, said culture medium is subjected to separation on a filter press without prior cooling. Preferably, the culture medium is not subjected to decantation and / or centrifugation before being separated on a filter press.
La séparation sur filtre presse et la microfiltration sont réalisées à 20-30°C, de préférence 22-27°C. Filter press separation and microfiltration are carried out at 20-30 ° C, preferably 22-27 ° C.
Avantageusement, le filtrat est recyclé dans le milieu de culture alimentant le filtre presse à raison d'au plus 10% pds. Advantageously, the filtrate is recycled into the culture medium supplying the filter press at a rate of at most 10% by weight.
A l'issue de la séparation sur filtre presse (i.e. après compactage), on obtient généralement 5-10% pds de gâteau (la teneur du gâteau en matière sèche est d'au moins 20%pds, généralement entre 20 et 65% ou 20-45%, souvent de l'ordre de 25-35%) et 90-95% pds de filtrat. Le culot (pourcentage du volume occupé par le solide par rapport au volume total de l'échantillon, mesuré en centrifugeant un échantillon à 4000 G pendant 5 minutes) du filtrat issu du filtre presse est inférieur à 1 ,5 %. At the end of the filter press separation (ie after compaction), 5-10% by weight of cake is generally obtained (the dry matter content of the cake is at least 20% by weight, generally between 20 and 65% or 20-45%, often in the range of 25-35%) and 90-95% wt of filtrate. The pellet (percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample, measured by centrifuging a sample at 4000 G for 5 minutes) of the filtrate from the filter press is less than 1, 5%.
De façon avantageuse, la microfiltration du filtrat obtenu à l'issue du filtre presse est réalisée dans un délai de 30h maximum, et de préférence 24h maximum. Advantageously, the microfiltration of the filtrate obtained at the end of the filter press is carried out within a maximum of 30 hours, and preferably 24 hours maximum.
De préférence, ledit filtrat issu du filtre presse est soumis à la microfiltration sans refroidissement préalable.  Preferably, said filtrate from the filter press is subjected to microfiltration without prior cooling.
De préférence, la microfiltration tangentielle est réalisée sur une membrane céramique ayant un seuil de coupure compris entre 0.8 et 1 .4μηι.  Preferably, the tangential microfiltration is carried out on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 0.8 and 1.4 .mu.m.
De préférence, la phase liquide obtenue après microfiltration est soumise à une ultrafiltration, de préférence sur une membrane céramique, et de façon encore plus préférée sur membrane céramique ayant un seuil de coupure compris entre 5 et 15kDa. Preferably, the liquid phase obtained after microfiltration is subjected to ultrafiltration, preferably on a ceramic membrane, and even more preferably on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 5 and 15 kDa.
De préférence, phase liquide obtenue après microfiltration est soumise à une ultrafiltration dans un délai maximum de 48h, de préférence 24h maximum. Dans un mode de réalisation préféré, le cocktail enzymatique séparé est mis en contact avec une biomasse lignocellulosique prétraitée, de préférence par explosion à la vapeur, pour réaliser une hydrolyse enzymatique et obtenir des jus sucrés, lesdits jus sucrés subissent une fermentation éthanolique, l'hydrolyse enzymatique et la fermentation étant réalisées séparément ou simultanément, et l'éthanol produit est séparé par distillation. Description détaillée de l'invention Etape de production Preferably, the liquid phase obtained after microfiltration is subjected to ultrafiltration within a maximum of 48 hours, preferably 24 hours maximum. In a preferred embodiment, the separated enzymatic cocktail is contacted with pretreated lignocellulosic biomass, preferably by steam explosion, to perform enzymatic hydrolysis and to obtain sweetened juices, said sugar juices undergo ethanolic fermentation, enzymatic hydrolysis and fermentation being carried out separately or simultaneously, and the ethanol produced is separated by distillation. Detailed description of the invention Production step
Le cocktail enzymatique est produit par Trichoderma reesei dans une chaîne de production classique par fermentation aérée.  The enzymatic cocktail is produced by Trichoderma reesei in a conventional aerated fermentation production line.
Le procédé de production du cocktail enzymatique débute par une phase de propagation, en général mise en œuvre dans de petits réacteurs de taille croissante, dans le but est de multiplier le champignon filamenteux et de limiter la durée de la phase de latence et les risques de contamination.  The enzymatic cocktail production process begins with a propagation phase, generally implemented in small reactors of increasing size, with the aim of multiplying the filamentous fungus and limiting the duration of the lag phase and the risks of contamination.
Lorsque cette production est jugée suffisante (concentration en champignon supérieure à 10 g/L, de préférence supérieure à 15 g/L), on transfert le milieu de culture dans le réacteur final de grand volume.  When this production is deemed sufficient (mushroom concentration greater than 10 g / l, preferably greater than 15 g / l), the culture medium is transferred to the final reactor of large volume.
Le procédé de production d'enzymes comporte deux phases : The enzyme production process has two phases:
- une phase a) de croissance dudit microorganisme en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé aéré, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et 90 g/L  a growth phase a) of said microorganism in the presence of at least one carbonaceous growth substrate in an aerated closed reactor, said growth phase being carried out with a concentration of carbonaceous growth substrate of between 10 and 90 g / l;
- une phase b) de production du cocktail enzymatique dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est introduit, ledit substrat carboné inducteur étant choisi dans le groupe formé par le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique, ladite phase de production étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de production comprise entre 150 et 400 g/L.  a phase b) for producing the enzymatic cocktail in which at least one inducing carbonaceous substrate is introduced, said inducing carbon substrate being chosen from the group formed by lactose, cellobiose, sophorose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars; enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and / or a crude extract of water-soluble pentoses derived from the pretreatment of a cellulosic biomass, said production phase being carried out with a production carbon substrate concentration of between 150 and 400 g / l.
Les microorganismes mis en œuvre dans le procédé de production d'un cocktail enzymatique selon l'invention sont des souches de champignons appartenant l'espèce Trichoderma reesei. The microorganisms used in the process for producing an enzymatic cocktail according to the invention are strains of fungi belonging to the species Trichoderma reesei.
Les souches industrielles les plus performantes sont les souches appartenant à l'espèce Trichoderma reesei, modifiées pour améliorer le cocktail enzymatique par les procédés de mutation-sélection, comme par exemple la souche IFP CL847 (brevet français FR-B-2 555 803). Les souches améliorées par les techniques de recombinaison génétique peuvent être également utilisées. Ces souches sont cultivées en réacteurs agités et aérés dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes. Le substrat carboné de croissance dudit microorganisme utilisé dans ladite phase a) de croissance du procédé selon l'invention est avantageusement choisi parmi les sucres solubles industriels, et de préférence parmi le glucose, le lactose, le xylose, les résidus liquides obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de matériaux lignocellulosique et les extraits de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de substrat lignocellulosique prétraité, utilisé seul ou en mélange. The most effective industrial strains are the strains belonging to the species Trichoderma reesei, modified to improve the enzyme cocktail by mutation-selection methods, for example the strain IFP CL847 (French patent FR-B-2 555 803). Strains improved by genetic recombination techniques can also be used. These strains are cultured in stirred and aerated reactors under conditions compatible with their growth and the production of enzymes. The carbonaceous growth substrate of said microorganism used in said growth phase a) of the process according to the invention is advantageously chosen from industrial soluble sugars, and preferably from glucose, lactose, xylose, liquid residues obtained after ethanolic fermentation. monomeric sugars of enzymatic hydrolysates of lignocellulosic materials and extracts of the hemicellulosic fraction in the form of monomers from pretreated lignocellulosic substrate, used alone or as a mixture.
Selon sa nature, ledit substrat carboné de croissance est introduit dans le réacteur fermé avant stérilisation ou est stérilisé séparément et introduit dans le réacteur fermé après stérilisation de ce dernier.  According to its nature, said carbonaceous growth substrate is introduced into the closed reactor before sterilization or is sterilized separately and introduced into the closed reactor after sterilization of the latter.
Ledit substrat carboné de croissance est utilisé dans ladite phase a) de croissance à une concentration initiale comprise le plus souvent entre 20 et 90 g de substrat carboné par litre de volume réactionnel. Said carbonaceous growth substrate is used in said growth phase a) at an initial concentration most often between 20 and 90 g of carbon substrate per liter of reaction volume.
De préférence, ladite phase a) de croissance est réalisée sur une durée comprise entre 30 et 70 h, de préférence entre 30 et 40 h. Preferably, said growth phase a) is carried out over a period of between 30 and 70 hours, preferably between 30 and 40 hours.
De préférence, ladite phase a) de croissance opère à un pH de 4,8 et à une température de 20-30°C, généralement 22-27°C, de préférence de l'ordre de 27°C. Preferably, said growth phase a) operates at a pH of 4.8 and at a temperature of 20-30 ° C, generally 22-27 ° C, preferably of the order of 27 ° C.
Ledit substrat carboné inducteur utilisé dans ladite phase b) de production est avantageusement alimenté en phase fed-batch avec un flux limitant compris entre 30 et 80 mg par gramme de cellules et par heure. La température est généralement la même que dans l'étape a). Said inducing carbon substrate used in said production phase b) is advantageously fed in the fed-batch phase with a limiting flux of between 30 and 80 mg per gram of cells per hour. The temperature is generally the same as in step a).
A l'issue de l'étape de production d'enzymes, on obtient généralement un milieu contenant une concentration en matière sèche comprise entre 10 et 45 g/L (correspondant au champignon sec). Le culot mesuré après centrifugation (4000G, 5 minutes) est supérieur à 15% et souvent de l'ordre de 30%, et même jusqu'à 60 %). Il correspond au pourcentage du volume occupé par le solide par rapport au volume total de l'échantillon. At the end of the enzyme production step, a medium containing a solids concentration of between 10 and 45 g / L (corresponding to the dry mushroom) is generally obtained. The pellet measured after centrifugation (4000G, 5 minutes) is greater than 15% and often of the order of 30%, and even up to 60%). It corresponds to the percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample.
On observe que le champignon retient une partie importante de liquide. It is observed that the mushroom retains a significant portion of liquid.
Le but de l'invention est de séparer les enzymes du champignon puis éventuellement de les concentrer. Etapes de séparation solide/liquide dans laquelle le champignon est séparé du liquide. The object of the invention is to separate the enzymes from the fungus and then possibly to concentrate them. Solid / liquid separation steps in which the fungus is separated from the liquid.
Le liquide contient les enzymes et les sels résiduels. The liquid contains enzymes and residual salts.
Les essais menés par la demanderesse ont montré qu'une séparation sur filtre presse suivi d'une microfiltration (MF) sur membrane céramique donne de meilleurs résultats que les solutions de l'art antérieur que ce soit en termes de rendement ou d'efficacité.  The tests conducted by the Applicant have shown that a filter press separation followed by microfiltration (MF) ceramic membrane gives better results than the solutions of the prior art whether in terms of efficiency or effectiveness.
Par ailleurs, les essais ont également montré que pour concentrer les enzymes, une ultrafiltration (UF) sur membrane céramique est sensiblement plus efficace que sur membrane organique.  Moreover, the tests have also shown that to concentrate the enzymes, an ultrafiltration (UF) on a ceramic membrane is substantially more effective than on an organic membrane.
Selon l'invention, le milieu de culture est soumis à une séparation sur filtre presse qui permet de maximiser la récupération des enzymes. According to the invention, the culture medium is subjected to a filter press separation which maximizes the recovery of the enzymes.
Elle est très avantageusement réalisée avant que l'autolyse du champignon se développe. En effet, cette autolyse peut pénaliser fortement à l'efficacité de la séparation par filtre-presse. Dans le cas de Trichoderma reesei ce délai est inférieur ou égal à 30h, et de préférence à 28h, et de façon encore plus préférée à 24 h. A l'issue de cette séparation sur filtre presse, il est obtenu un gâteau contenant le champignon et un liquide contenant les enzymes. It is very advantageously carried out before the autolysis of the fungus develops. Indeed, this autolysis can strongly penalize the efficiency of filter press separation. In the case of Trichoderma reesei this time is less than or equal to 30h, and preferably 28h, and even more preferably 24 hours. At the end of this filter press separation, a cake containing the fungus and a liquid containing the enzymes is obtained.
Le liquide obtenu est soumis à une microfiltration tangentielle sur membrane céramique puis éventuellement à une ultrafiltration, de préférence en filtration tangentielle. The liquid obtained is subjected to tangential microfiltration on a ceramic membrane and then optionally to ultrafiltration, preferably in tangential filtration.
En effet, on a pu constater qu'une microfiltration sur membranes organiques conduisait à une rétention importante d'enzymes, ce qui nuisait au rendement de la séparation. Ce phénomène est étonnant puisque les pores sont jusqu'à 100 fois supérieurs à la taille des plus grosses enzymes produites. Nous n'avons pas pu donner d'explication à ce phénomène. In fact, it has been found that microfiltration on organic membranes leads to a significant retention of enzymes, which adversely affects the efficiency of the separation. This phenomenon is surprising since the pores are up to 100 times larger than the size of the largest enzymes produced. We could not explain this phenomenon.
Par contre, on a également constaté que ce phénomène est limité lorsqu'on utilise des membranes minérales. Ainsi le rendement de récupération des enzymes est à un niveau élevé.  On the other hand, it has also been found that this phenomenon is limited when using mineral membranes. Thus the recovery efficiency of the enzymes is at a high level.
On détaille ci-après la séparation par filtre-presse, la microfiltration et l'ultraf iltration. La séparation sur filtre presse: The separation by filter press, microfiltration and ultrafiltration is described below. Filter press separation:
Dès la fin de la production, l'aération et la régulation de pH sont arrêtées. Un conservateur est avantageusement ajouté, par exemple du benzoate de sodium. La production est arrêtée lorsque la totalité du sucre de la phase fed-batch est consommée ou lorsque la vitesse de consommation de base (qui est proportionnelle à la vitesse de production de protéines) est ralentie (vitesse inférieure à 30% ou plus). At the end of production, aeration and pH control are stopped. A preservative is advantageously added, for example sodium benzoate. Production is stopped when all the sugar in the fed-batch phase is consumed or when the basal consumption rate (which is proportional to the speed of protein production) is slowed down (speed less than 30% or more).
Dans le délai avant autolyse, on procède à la séparation sur filtre-presse. On a constaté qu'il est important de maintenir la température inférieure à 40°C et de préférence à 30°C. Au-delà, la séparation est bien moins efficace. In the time before autolysis, the filter press is separated. It has been found that it is important to maintain the temperature below 40 ° C and preferably at 30 ° C. Beyond that, separation is much less effective.
Il n'y a pas d'étape de refroidissement avant la séparation sur filtre presse. On entend par là que le refroidissement n'est pas recherché ; il se peut qu'il y ait une légère baisse de température lors du transfert entre l'unité où a lieu l'étape de production et l'unité filtre- presse ; cette baisse peut être de 3°C ou moins. Aussi, la séparation est souvent effectuée sensiblement à la même température que celle de la phase de production de l'étape a) soit une température de 17 à 30°C ou encore 20-30°C, généralement 22-27°C, et le plus souvent de l'ordre de 25°C. C'est généralement la température ambiante. There is no cooling step before filter press separation. By this is meant that cooling is not desired; there may be a slight drop in temperature during the transfer between the unit where the production step takes place and the filter press unit; this drop can be 3 ° C or less. Also, the separation is often carried out substantially at the same temperature as that of the production phase of step a) either a temperature of 17 to 30 ° C or 20-30 ° C, generally 22-27 ° C, and most often of the order of 25 ° C. This is usually the ambient temperature.
Le filtre presse est garni de toile, et généralement sans plateau à membrane. La porosité des toiles est comprise entre 3 et 20μηι, de façon préférée entre 3 et 7μηι et de préférence 5μηι. On obtient généralement de 5 à 10 % pds de gâteau et 90 à 95 % pds de filtrat. The filter press is lined with canvas, and usually without a membrane tray. The porosity of the fabrics is between 3 and 20 μm, preferably between 3 and 7 μm and preferably 5 μm. Generally 5 to 10% by weight of cake and 90 to 95% by weight of filtrate are obtained.
La séparation sur filtre presse peut être conduite en une ou 2 étapes. Press filter separation can be carried out in one or two steps.
La séparation sur filtre presse est généralement conduite en 2 étapes : une première étape de filtration à une pression P1 et une seconde étape de compactage à une pression P2 supérieure à P1 . Généralement la pression P1 est comprise entre 1 .2 et 6 bars et P2 entre 5 et 10bars. Press filter separation is generally carried out in two steps: a first filtration step at a pressure P1 and a second compaction step at a pressure P2 greater than P1. Generally the pressure P1 is between 1.2 and 6 bar and P2 between 5 and 10 bar.
Lorsque la séparation est conduite en une seule étape, il n'y a pas de compactage mais seulement une étape conduite à P1 . When the separation is conducted in a single step, there is no compaction but only a step conducted at P1.
La siccité des gâteaux dépend des pressions appliquées. L'objectif est de récupérer un maximum de filtrat le plus limpide possible. The dryness of the cakes depends on the pressures applied. The goal is to recover as much of the filtrate as possible.
Pour se faire, il est conseillé de recycler les premières fractions de filtrat (généralement plus troubles) dans le bac d'alimentation. Ce recyclage ne doit pas excéder 10 % du volume de filtrat. Dans le cas d'une bonne séparation et d'un gâteau perméable, il est recommandé de rajouter de l'eau au gâteau pour le laver et récupérer un maximum de protéines. To do so, it is advisable to recycle the first fractions of filtrate (usually more turbid) in the feed tray. This recycling must not exceed 10% of the volume of filtrate. In the case of a good separation and a permeable cake, it is recommended to add water to the cake to wash it and get a maximum of protein.
Une autre façon, qui peut être utilisée seule ou consécutivement à l'emploi du recyclage ci- dessus décrit, est de laisser se lyser le champignon qui est dans le gâteau, ce après une étape de refroidissement. Le champignon relargue alors des enzymes qui sont alors récupérées. Ce procédé est décrit dans la demande WO-2016/016182. Another way, which can be used alone or consecutively to the use of the recycling described above, is to let lysing the fungus that is in the cake, after a cooling step. The fungus then releases enzymes which are then recovered. This process is described in application WO-2016/016182.
La séparation est réalisée de façon à obtenir un liquide (ou suspension) ayant une DO (densité optique) 600nm corrigée inférieure à 2,5 (corrigée signifie déduction faite de l'absorbance d'un filtrat 0,22μηι équivalent). La mesure est réalisée sur un échantillon avec spectromètre classique de laboratoire. The separation is carried out so as to obtain a liquid (or suspension) having a corrected OD 600nm (optical density) of less than 2.5 (corrected means deducing the absorbance of a 0.22μηι equivalent filtrate). The measurement is performed on a sample with a conventional laboratory spectrometer.
Le culot (4000 g / 5min) est généralement inférieur à 1 ,5 %. The pellet (4000 g / 5min) is generally less than 1, 5%.
Microfiltration avec membranes minérales Microfiltration with mineral membranes
Cette étape doit permettre d'éliminer la totalité des champignons du filtrat. Elle est réalisée de façon à ce que la DO 600nm corrigée ne dépasse pas 0,1 (déduction faite de l'absorbance d'un filtrat 0,22μηι équivalent).  This step must make it possible to eliminate all the fungi from the filtrate. It is carried out so that the corrected OD 600nm does not exceed 0.1 (after deduction of the absorbance of a 0.22μηι equivalent filtrate).
De préférence, et de la même façon que pour la séparation par filtre-presse, le filtrat est soumis à la microfiltration dans un délai d'au plus 30h, ou d'au plus 28h ou de préférence d'au plus 24h. Le plus souvent, la microfiltration peut être réalisée en ligne avec le filtre presse. En ce qui concerne la température, de préférence la température n'est pas abaissée (pas de refroidissement recherché). Ceci permet de conserver un débit de produit satisfaisant. La température est donc généralement comprise entre 17 et 30°C ou encore 20 et 30°C, et généralement 22-27°C, et le plus souvent de l'ordre de 25°C. C'est généralement la température ambiante. Les membranes à utiliser ont un seuil de coupure compris entre 0.5 et 1 .4 μηι, de préférence compris entre 0.6 et 1 .4μηι et de préférence entre 0.8 et 1 .4μηι. Preferably, and in the same way as for the separation by filter press, the filtrate is subjected to microfiltration within a period of at most 30 hours, or at most 28 hours or preferably at most 24 hours. Most often, microfiltration can be done in line with the filter press. As regards the temperature, preferably the temperature is not lowered (no desired cooling). This makes it possible to maintain a satisfactory product flow rate. The temperature is therefore generally between 17 and 30 ° C or else 20 and 30 ° C, and generally 22-27 ° C, and most often of the order of 25 ° C. This is usually the ambient temperature. The membranes to be used have a cutoff threshold of between 0.5 and 1.4 μηι, preferably between 0.6 and 1.4 .mu.m and preferably between 0.8 and 1.4 .mu.m.
On peut maximiser le rendement en enzymes par diafiltration (ajout d'eau au rétentat puis passage en microfiltration. Ultrafiltration avec membranes minérales ou organiques The enzyme yield can be maximized by diafiltration (addition of water to the retentate followed by microfiltration. Ultrafiltration with mineral or organic membranes
Cette étape permet de concentrer les enzymes produites par le champignon, notamment par Trichoderma reesei. Le cocktail enzymatique est un mélange complexe de plusieurs enzymes dont la taille varie entre 1 * 104 g/mol (10 kDa) et 10* 104 g/mol (100 kDa). Cette étape d'ultrafiltration est réalisée à une température généralement comprise entre 20-30°C, et généralement de 22-27°C, et le plus souvent de l'ordre de 25°C. Il est toujours avantageux de la mettre en œuvre le plus près possible (dans le temps) de la microfiltration. Un délai de 48h maximum est préconisé, et ce délai est de préférence inférieur ou égal à 24h. Cette étape permet de concentrer les protéines d'intérêt jusqu'à 150 g/l +/- 10g/I. La valeur du facteur de concentration volumique VCF (ou FCV) à atteindre est fonction de la concentration protéique initiale. This step makes it possible to concentrate the enzymes produced by the fungus, in particular by Trichoderma reesei. The enzymatic cocktail is a complex mixture of several enzymes ranging in size from 1 * 10 4 g / mol (10 kDa) to 10 * 10 4 g / mol (100 kDa). This ultrafiltration step is carried out at a temperature generally between 20-30 ° C, and generally 22-27 ° C, and usually of the order of 25 ° C. It is always advantageous to implement it as close as possible (in time) to microfiltration. A delay of 48 hours maximum is recommended, and this delay is preferably less than or equal to 24 hours. This step makes it possible to concentrate the proteins of interest up to 150 g / l +/- 10g / l. The value of the volume concentration factor VCF (or FCV) to be achieved is a function of the initial protein concentration.
Une dose supplémentaire de conservateur peut être ajoutée au rétentat à la fin de cette étape. On préconisera par exemple, l'ajout de benzoate de sodium entre 0.1 et 0.35%. II est préférable d'utiliser des membranes minérales pour l'ultrafiltration. On utilisera par exemple des membranes céramiques tubulaires de seuils de coupure compris entre 5 et 15KDa et de préférence 8-12, le plus souvent de l'ordre de 10 kDa. An additional dose of preservative can be added to the retentate at the end of this step. For example, the addition of sodium benzoate between 0.1 and 0.35% is recommended. It is preferable to use mineral membranes for ultrafiltration. For example, tubular ceramic membranes with cutoff thresholds of between 5 and 15 KDa and preferably 8-12, most often of the order of 10 kDa, will be used.
Dans certains cas, des membranes organiques peuvent être utilisées mais avec précaution et uniquement dans les conditions préconisées par les fournisseurs. De façon particulièrement avantageuse, le procédé selon l'invention est utilisé pour séparer les enzymes dans un procédé de production, à partir de biomasse lignocellulosique, de jus sucrés, de biocarburants (tels que l'éthanol) ou molécules biochimiques. In some cases, organic membranes can be used but with caution and only under the conditions recommended by the suppliers. Particularly advantageously, the process according to the invention is used to separate the enzymes in a production process, from lignocellulosic biomass, sugar juices, biofuels (such as ethanol) or biochemical molecules.
Ces procédés comprennent les étapes de prétraitement de la biomasse lignocellulosique (par ex par explosion à la vapeur), la biomasse prétraitée est soumise à une hydrolyse enzymatique en présence d'enzymes (sécrétées par Trichoderma reesei), l'hydrolysat chargé en jus sucrés est soumis à une fermentation (par exemple alcoolique) et les produits recherchés (par ex l'alcool) sont séparés (par ex par distillation). These processes include the pretreatment steps of the lignocellulosic biomass (eg by steam explosion), the pretreated biomass is subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of enzymes (secreted by Trichoderma reesei), the hydrolyzate loaded with sweetened juice is subjected to fermentation (for example alcoholic) and the desired products (eg alcohol) are separated (eg by distillation).
Un procédé dans lequel l'invention s'applique particulièrement bien comprend un prétraitement de la biomasse lignocellulosique par explosion à la vapeur, la biomasse prétraitée est soumise à une hydrolyse enzymatique en présence d'enzymes sécrétées par exemple par Trichoderma reesei duquel elles ont été séparées selon le procédé de l'invention, l'hydrolysat chargé en jus sucrés est soumis à une fermentation alcoolique et l'éthanol est séparé par distillation. L'hydrolyse enzymatique et la fermentation peuvent avoir lieu séparément ou simultanément. A method in which the invention is particularly applicable includes pretreatment of lignocellulosic biomass by steam explosion, biomass pretreated is subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of enzymes secreted for example by Trichoderma reesei which they were separated according to the process of the invention, the hydrolyzate loaded with sugar juice is subjected to an alcoholic fermentation and the ethanol is separated by distillation. Enzymatic hydrolysis and fermentation can take place separately or simultaneously.
Il est à noter que l'étape d'ultrafiltration s'est avérée être inutile la plupart du temps dans le cas d'une usine qui produit de l'éthanol avec une production in-situ d'enzymes.  It should be noted that the ultrafiltration step has proved to be useless most of the time in the case of a plant that produces ethanol with an in-situ production of enzymes.
Exemples Examples
L'exemplel démontre la mauvaise perméabilité des enzymes obtenue avec une microfiltration avec membranes organiques. Ce problème est résolu à l'exemple 2 avec l'utilisation de membranes minérales. L'exemple 3 compare deux enchaînements réalisés soit avec un procédé conventionnel de séparation soit avec le procédé décrit dans le brevet. L'exemple 4 présente le bilan complet d'une séparation sur un volume important. Exemple n°1 : essais de microfiltration sur membrane organique (comparatif) The exemplel demonstrates the poor permeability of the enzymes obtained with microfiltration with organic membranes. This problem is solved in Example 2 with the use of mineral membranes. Example 3 compares two sequences made either with a conventional method of separation or with the method described in the patent. Example 4 presents the complete balance sheet of a separation on a large volume. Example No. 1: Organic Membrane Microfiltration Tests (Comparative)
Le milieu de culture à traiter issu de la phase de production possède la composition suivante :  The culture medium to be treated resulting from the production phase has the following composition:
• 40 g/L de protéines • 40 g / L of protein
• 20 g/L de biomasse (champignon T. reesei) Après avoir subi une séparation via filtre-presse, le filtrat est testé sur différentes membranes de microfiltration.  • 20 g / L of biomass (T. reesei mushroom) After being separated by filter press, the filtrate is tested on different microfiltration membranes.
Les figures 1 et 2 présentent les résultats des essais laboratoires réalisés avec des membranes organiques ayant des porosités allant de 0,1 à 0,8 μηι : membranes MFG1 : seuil de coupure de 0,1 μηι (polysulphone), MFG2: 0,2μηι (polysulphone), MFG8: Ο,δμηι (polysulphone), MFP5: 0,5μηι (fluoro). FIGS. 1 and 2 present the results of laboratory tests carried out with organic membranes having porosities ranging from 0.1 to 0.8 μηι: MFG1 membranes: 0.1 μηι (polysulphone) cutoff threshold, MFG2: 0.2μηι (polysulphone), MFG8: Ο, δμηι (polysulphone), MFP5: 0.5μηι (fluoro).
VCF représente le facteur de concentration volumique. VCF represents the volume concentration factor.
On remarque la faible perméabilité de ces membranes aux enzymes. La perméabilité est définie comme étant le rapport entre la concentration des enzymes dans le perméat (ce qui passe à travers la membrane) et celle dans le rétentat (ce qui reste). The low permeability of these membranes to enzymes is noted. Permeability is defined as the ratio between the concentration of enzymes in the permeate (which passes through the membrane) and that in the retentate (what remains).
Exemple 2 : essais de microfiltration sur membrane céramique Example 2: Microfiltration Tests on a Ceramic Membrane
Le même filtrat est utilisé avec 4 membranes avec les seuils de coupure de 0,14, 0,45, 0,8 et 1 ,4 μηι.  The same filtrate is used with 4 membranes with cut-offs of 0.14, 0.45, 0.8 and 1.4 μηι.
La méthode utilisée a été de tester 4 seuils de coupure en parallèle pour chaque filtration. L'outil utilisé est un pilote de filtration permettant d'accueillir 4 membranes différentes dans un même carter. Il possède une sortie perméat par membrane et une seule boucle de rétentat. Il permet ainsi d'étudier en parallèle les variations de débits de perméat pour 4 membranes et de produire des échantillons. The method used was to test 4 cut-off thresholds in parallel for each filtration. The tool used is a filtration pilot to accommodate 4 different membranes in the same housing. It has a membrane permeate outlet and a single retentate loop. It allows to study in parallel the variations of permeate flow rates for 4 membranes and to produce samples.
Les mesures des concentrations en enzymes font apparaître des disparités.  Measurements of enzyme concentrations reveal disparities.
Le filtrat issu du filtre-presse, a une concentration de 38.2 g/L en enzymes. Le rétentat final a été dosé à 44,3 g/L.  The filtrate from the filter press has a concentration of 38.2 g / L in enzymes. The final retentate was dosed at 44.3 g / L.
Il y a donc eu une légère concentration du rétentat ce qui suggère une rétention par une ou plusieurs membranes. Les concentrations d'enzymes des 4 perméats sont les suivantes :  There was therefore a slight concentration of the retentate which suggests retention by one or more membranes. The enzyme concentrations of the 4 permeates are as follows:
Par rapport au rétentat initial, on voit que les concentrations obtenues par filtration à 0.8 et 1 .4 μηι sont proches des concentrations de la solution initiale. En revanche, il y a clairement rétention d'enzyme pour les cartouches à 0.14 et 0.45 μηι. La concentration en protéines obtenue avec la membrane minérales ayant un seuil de coupure de 0.8 μηι est environ 4.3 fois supérieure à la concentration en protéines obtenues avec la membrane organique ayant le même seuil de coupure (exemple 2)  Compared to the initial retentate, it can be seen that the concentrations obtained by filtration at 0.8 and 1.4 μηι are close to the concentrations of the initial solution. On the other hand, there is clearly enzyme retention for the cartridges at 0.14 and 0.45 μηι. The protein concentration obtained with the mineral membrane having a cutoff of 0.8 μηι is approximately 4.3 times greater than the concentration of proteins obtained with the organic membrane having the same cut-off point (Example 2)
Exemple 3 : Example 3
L'exemple 3 permet de comparer deux enchaînements réalisés soit avec un procédé conventionnel soit avec le procédé du brevet. Le milieu de culture à traiter issu de la phase de production possède la composition suivante : • 39 g/L de protéines Example 3 makes it possible to compare two sequences made either with a conventional method or with the method of the patent. The culture medium to be treated resulting from the production phase has the following composition: • 39 g / L of protein
• 16,5 g/L de biomasse (champignon T. reesei) • 16.5 g / L of biomass (T. reesei mushroom)
Exemple 3 a : enchaînement conventionnel d'un décanteur, d'une centrifugeuse et de filtrations MF(microfiltration) sur membrane organique et UF(ultrafiltration) sur membrane organique. Example 3 a: conventional sequence of a decanter, a centrifuge and MF (microfiltration) filtrations on organic membrane and UF (ultrafiltration) on an organic membrane.
On obtient les performances suivantes : We obtain the following performances:
• Décantation : réduction du culot de 30% à 5% mais perte importante de protéines Rendement 70%  • Decantation: reduction of the pellet from 30% to 5% but high loss of protein Yield 70%
• Centrifugation : réduction du culot de 5% à 1 .5% sans perte importante. Rendement 95%  • Centrifugation: reduction of the pellet from 5% to 1 .5% without significant loss. Yield 95%
• MF organique à 0.8μηι: réduction du culot de 1 .5% à -0%. Perméabilité faible de 0.3.  • Organic MF at 0.8μηι: reduction of the pellet from 1 .5% to -0%. Low permeability of 0.3.
Rendement 50%.  Yield 50%.
• UF organique 10kDa: concentration en enzymes à 200 g/L. Rendement 80%.  • 10kDa organic UF: enzyme concentration at 200 g / L. Yield 80%.
Le rendement global de cet enchaînement est de 27%. Il est possible de s'approcher d'un rendement de 50% en recyclant les culots des étapes de décantation, de centrifugation et le rétentat de l'étape de MF et en leur faisant subir un nouveau cycle de séparation (centrifugation, MF,UF)  The overall yield of this sequence is 27%. It is possible to approach a 50% yield by recycling the pellets of the decantation, centrifugation and retentate stages of the MF stage and subjecting them to a new separation cycle (centrifugation, MF, UF )
Exemple 3b selon l'invention Example 3b according to the invention
Enchaînement d'une séparation sur filtre presse puis sur MF sur membrane céramique et UF sur membrane céramique.  Sequence of a separation on filter press then on MF on ceramic membrane and UF on ceramic membrane.
On obtient les performances suivantes :  We obtain the following performances:
• Séparation sur filtre presse : réduction du culot de 30% à 1 .5% sans perte importante Rendement 95% • Separation on filter press: reduction of the pellet from 30% to 1 .5% without significant loss Yield 95%
• MF céramique (1 ,4μηι): réduction du culot de 1 .5% à -0%. Perméabilité importante de 0.9. Rendement 90%. • MF ceramic (1, 4μηι): reduction of the pellet from 1 .5% to -0%. High permeability of 0.9. Yield 90%.
• UF céramique 10kDa: concentration en enzymes à 200 g/L. Rendement 90%. • 10kDa ceramic UF: enzyme concentration at 200 g / L. Yield 90%.
Le rendement global sans faire de recyclage de cet enchaînement est de 77%. Au vu de ces résultats, on note que l'étape UF est inutile dans le cas d'une usine qui produit de l'éthanol avec une production in-situ d'enzymes. Dès lors le un rendement est de 86%. The overall yield without recycling this sequence is 77%. In view of these results, it is noted that the UF stage is useless in the case of a plant that produces ethanol with an in-situ production of enzymes. Therefore the yield is 86%.
Par ailleurs, la filtration MF est bien plus efficace sur membrane céramique que sur membrane organique. De plus, le rendement sur membrane céramique que ce soit en MF ou UF est nettement supérieur à celui avec des membranes organiques. In addition, MF filtration is much more effective on ceramic membranes than on organic membranes. In addition, the yield on ceramic membrane whether MF or UF is significantly higher than that with organic membranes.
Exemple n°4 : Test pilote avec l'enchaînement selon l'invention. Example 4: Pilot test with the sequence according to the invention.
Ce test utilise un milieu de culture produit dans un réacteur de 6 m3. Ses caractéristiques sont les suivantes :  This test uses a culture medium produced in a 6 m3 reactor. Its characteristics are as follows:
- Masse du milieu de culture: 4260 kg  - Mass of the culture medium: 4260 kg
- Concentration en protéines : 38 g/L  - Protein concentration: 38 g / L
- Concentration en biomasse : 15 g/L  - Biomass concentration: 15 g / L
Séparation sur filtre-presse : Separation on filter press:
La séparation a été réalisée immédiatement après l'étape de production, et sans refroidir le produit. La température est de 27°C.  The separation was carried out immediately after the production step, and without cooling the product. The temperature is 27 ° C.
Dans cette étape on cherche à éliminer la majorité du champignon par séparation sur filtre presse. In this step we try to eliminate the majority of the mushroom by separation on a filter press.
L'outil utilisé comporte 10 plateaux avec une surface de filtration globale de 3 m2. Celui-ci permet de former par batch, 10 gâteaux de champignon de 30 mm d'épaisseur et ayant un volume total avant compactage de 30 litres. La toile utilisée est une toile muiti filament ayant une porosité de 5 μηι. The tool used has 10 trays with an overall filtration area of 3 m 2 . This makes it possible to form, by batch, 10 mushroom cakes 30 mm thick and having a total volume before compaction of 30 liters. The fabric used is a muiti filament fabric having a porosity of 5 μηι.
La séparation se fait en trois étapes :  The separation is done in three steps:
- La première étape consiste en une filtration avec une pression en amont de 5 bars avec suivi du débit de filtration au cours du temps.  - The first step consists of a filtration with a pressure upstream of 5 bars with monitoring of the filtration rate over time.
- Au cours de la deuxième étape, on arrête d'alimenter le filtre-presse, on compacte les gâteaux de champignon en appliquant une pression supérieure (9 bars). Cette deuxième étape presse le champignon et maximise la récupération d'enzymes.  - During the second step, we stop feeding the filter press, compact mushroom cakes by applying a higher pressure (9 bar). This second step presses the fungus and maximizes enzyme recovery.
- La troisième étape consiste en un débâtissage (récupération) des gâteaux qui sont pesés. A noter qu'il aurait été possible de faire un lavage du gâteau pour minimiser les pertes laisser le champignon se lyser mais que cela n'a pas été fait dans le cas de cet exemple. Il a fallu au total 14 filtrations/compactages pour traiter la totalité du milieu culture (4260 kg). - The third step consists of a removal (recovery) of cakes that are weighed. Note that it would have been possible to wash the cake to minimize losses let the mushroom lysing but that was not done in the case of this example. It took a total of 14 filtrations / compactions to treat the total culture medium (4260 kg).
Le tableau suivant présente le bilan masse de la séparation. The following table presents the mass balance of the separation.
La figure 3 présente l'évolution de la quantité filtrée en fonction du temps et la figure 4 l'évolution de la quantité filtrée en fonction de la pression en alimentation.  Figure 3 shows the evolution of the filtered quantity as a function of time and Figure 4 the evolution of the filtered quantity as a function of the feed pressure.
En première étape (filtration sous 5 bars), la durée du batch est de 25 minutes.  In the first step (filtration under 5 bar), the batch duration is 25 minutes.
Au cours des premières minutes, le débit de filtration est élevé (entre 500 et 700 L/m2/h). Le champignon se « colle » contre la toile et va servir de média filtrant. La pression augmente et le débit de filtration diminue. On décide en général d'arrêter la filtration lorsque le débit semble trop faible par rapport au débit initial (par exemple moins de 10 ou 20%) et en fonction de l'objectif initial du temps de filtration.  During the first few minutes, the filtration rate is high (between 500 and 700 L / m2 / h). The mushroom "sticks" against the canvas and will serve as a filter media. The pressure increases and the filtration rate decreases. It is generally decided to stop the filtration when the flow seems too low compared to the initial flow (for example less than 10 or 20%) and depending on the initial objective of the filtration time.
On remarque qu'il n'y a pas de différence importante entre les différents batch réalisés. Cela montre que l'aptitude du produit à être filtré n'a pas évolué durant l'opération (qui a duré moins de 12 heures au total). Note that there is no significant difference between the different batches made. This shows that the ability of the product to be filtered did not change during the operation (which lasted less than 12 hours in total).
La masse moyenne par batch avant compactage est de 263± 30 kg. Le débit moyen de filtration est de 210 kg/m2/h. The average mass per batch before compaction is 263 ± 30 kg. The average filtration rate is 210 kg / m 2 / h.
Il est alors procédé au compactage (9 bars) qui a duré 10 minutes en moyenne a permis de récupérer en moyenne 15 kg de liquide par batch avec un débit moyen de 30 kg/m2/h. La masse moyenne de gâteau obtenu par batch est de 15± 1 ,5 kg. Le pourcentage poids de gâteau par rapport au filtrat est en moyenne de 5,4% et sa MS (matière sèche) moyenne de 25% pds, soit une perte de protéines à cette étape de 4,05% pds si on ne procède pas au lavage du gâteau. It is then compaction (9 bars) which lasted 10 minutes on average allowed to recover an average of 15 kg of liquid batch with an average flow of 30 kg / m 2 / h. The average cake mass obtained by batch is 15 ± 1.5 kg. The weight percentage of cake relative to the filtrate is on average 5.4% and its DM (dry matter) average of 25% by weight, ie a loss of proteins at this stage of 4.05% by weight if it is not carried out. washing the cake.
Le rendement de récupération des protéines après l'étape de filtre-presse est de 95,4%. The recovery yield of the proteins after the filter press step is 95.4%.
Séparation par microfiltration sur céramique minérale : Microfiltration separation on mineral ceramic:
Le filtrat issu du filtre-presse a ensuite été divisé en plusieurs échantillons qui sont traités par microfiltration sur des membranes minérales ayant des porosités de 0,8 et 1 ,4 μηι. L'objectif de l'essai est de comparer leurs performances sur le filtrat de filtre-presse renfermant des enzymes et des champignons avec un facteur de concentration volumique visé de 10. La microfiltration est suivie d'une diafiltration permettant de minimiser les pertes en protéines (ajout d'eau correspondant à 5 volumes de rétentat).  The filtrate from the filter press was then divided into several samples which are treated by microfiltration on inorganic membranes having porosities of 0.8 and 1.4 μηι. The objective of the test is to compare their performance on filter filtrate containing enzymes and fungi with a target volume concentration factor of 10. Microfiltration is followed by diafiltration to minimize protein loss. (addition of water corresponding to 5 volumes of retentate).
L'outil de microfiltration comporte 3 membranes de 0.33m2 de surface de filtration sur chaque carter. The microfiltration tool has 3 membranes of 0.33m 2 of filtration area on each housing.
Le premier essai a permis de sélectionner la membrane 1 .4 μηι qui présente une performance de filtration meilleure que la membrane 0.8 μηι à même pression transmembranaire En effet, le flux de perméat se stabilise à 100 L/m2/h pour la première et à 60 L/m2/h pour la deuxième jusqu'à un facteur de concentration volumique (FCV) de 7.5. Les deux membranes ont permis de clarifier le produit (pas de croissance de champignon sur le perméat étalé sur milieu PDA). La figure 5 représente l'évolution des concentrations en protéines dans le rétentat et les perméats. Elle montre que la perméabilité des deux membranes vis-à-vis des protéines est très bonne. La perméabilité des membranes à 1 ,4 μιτι est meilleure et est supérieure à 0,9. On rappelle qu'elle était de 0,2-0,4 avec les membranes organiques même avec des porosités de Ο,δμηι. Le rendement de récupération des protéines après MF sur membrane minérale est de 93.3% par rapport à l'étape initiale. Les enzymes ont ensuite été concentrées par UF sur membrane minérale rendement de récupération de 92% soit un rendement global de 86%. The first test made it possible to select the membrane 1 .4 μηι which has a filtration performance better than the 0.8 μηι membrane at the same transmembrane pressure. Indeed, the permeate flux stabilizes at 100 L / m 2 / h for the first and at 60 L / m 2 / h for the second up to a volume concentration factor (CVF) of 7.5. Both membranes clarified the product (no growth of fungus on permeate spread on PDA medium). Figure 5 shows the evolution of protein concentrations in the retentate and permeates. It shows that the permeability of the two membranes with respect to proteins is very good. The permeability of the membranes at 1, 4 μιτι is better and is greater than 0.9. It is recalled that it was 0.2-0.4 with the organic membranes even with porosities of Ο, δμηι. The recovery yield of the proteins after MF on the mineral membrane is 93.3% compared to the initial stage. The enzymes were then concentrated by UF on a mineral membrane recovery yield of 92% or an overall yield of 86%.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé pour séparer d'un milieu de culture, un cocktail enzymatique et le champignon Trichoderma Reesei, le milieu de culture résultant d'une production d'enzymes par le champignon, procédé dans lequel 1 - Process for separating from a culture medium, an enzymatic cocktail and the fungus Trichoderma Reesei, the culture medium resulting from an enzyme production by the fungus, process in which
-ledit milieu de culture est soumis, dans un délai inférieur ou égal à 30h à partir de l'arrêt de la production, à une séparation sur filtre presse garni d'une toile ayant une porosité de 3- 20μηι , de façon à obtenir un filtrat ayant une densité optique DO 600nm corrigée inférieure à 2.5 et  said culture medium is subjected to separation on a press filter lined with a fabric having a porosity of 3 to 20 μm in a period of time less than or equal to 30 hours from the end of production, so as to obtain a filtrate having an optical density OD 600nm corrected lower than 2.5 and
-la phase liquide obtenue est soumise à une microfiltration tangentielle sur membrane céramique ayant un seuil de coupure compris entre 0.5 et 1 .4μηι, de façon à ce que la DO 600nm corrigée ne dépasse pas 0.1 . the liquid phase obtained is subjected to a tangential microfiltration on a ceramic membrane having a cutoff threshold of between 0.5 and 1.4 .mu.m, so that the corrected OD 600nm does not exceed 0.1.
2- Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit délai est inférieur ou égal à 24 h. 2. The method of claim 1 wherein said delay is less than or equal to 24 h.
3- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ledit milieu de culture est soumis à la séparation sur filtre presse sans refroidissement préalable. 3. Method according to one of the preceding claims wherein said culture medium is subjected to separation on a filter press without prior cooling.
4- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel à l'issue de la séparation sur filtre presse, on obtient 5-10% pds de gâteau et 90-95% pds de filtrat. 4- Method according to one of the preceding claims wherein after the separation on filter press, one obtains 5-10% by weight of cake and 90-95% by weight of filtrate.
5- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le culot (pourcentage du volume occupé par le solide par rapport au volume total de l'échantillon, mesuré en centrifugeant un échantillon à 4000 G pendant 5 minutes) du filtrat issu du filtre presse est inférieur à 1 ,5 %. 5. Method according to one of the preceding claims wherein the pellet (percentage of the volume occupied by the solid relative to the total volume of the sample, measured by centrifuging a sample at 4000 G for 5 minutes) of the filtrate from the filter press is less than 1, 5%.
6- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le filtrat est recyclé dans le milieu de culture alimentant le filtre presse à raison d'au plus 10% pds. 6. Method according to one of the preceding claims wherein the filtrate is recycled into the culture medium supplying the filter press at a rate of at most 10% by weight.
7- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la microfiltration du filtrat obtenu à l'issue du filtre presse est réalisée dans un délai de 30h maximum , et de préférence 24h maximum. 7- Method according to one of the preceding claims wherein the microfiltration of the filtrate obtained at the end of the filter press is performed within a maximum of 30h, and preferably 24 hours maximum.
8-Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ledit filtrat issu du filtre presse est soumis à la microfiltration sans refroidissement préalable. 9- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la séparation sur filtre presse et la microfiltration sont réalisées à 20-30°C, de préférence 22-27°C. 8-Process according to one of the preceding claims wherein said filtrate from the filter press is subjected to microfiltration without prior cooling. 9- Method according to one of the preceding claims wherein the filter press separation and microfiltration are carried out at 20-30 ° C, preferably 22-27 ° C.
10- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la microfiltration tangentielle est réalisée sur une membrane céramique ayant un seuil de coupure compris entre 0.8 et 1 .4μηι. 10- Method according to one of the preceding claims wherein the tangential microfiltration is performed on a ceramic membrane having a cut-off of between 0.8 and 1 .4μηι.
1 1 - Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le milieu de culture n'est pas soumis à une décantation et/ou une centrifugation avant d'être séparé sur filtre presse. 1 1 - Method according to one of the preceding claims wherein the culture medium is not subjected to decantation and / or centrifugation before being separated on a filter press.
12- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la microfiltration est réalisée sur membrane céramique. 12- Method according to one of the preceding claims wherein the microfiltration is performed on a ceramic membrane.
13- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la phase liquide obtenue après microfiltration est soumise à une ultrafiltration sur une membrane céramique ayant un seuil de coupure compris entre 5 et 15kDa. 13- Method according to one of the preceding claims wherein the liquid phase obtained after microfiltration is subjected to ultrafiltration on a ceramic membrane having a cut-off of between 5 and 15kDa.
14- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel la phase liquide obtenue après microfiltration est soumise à une ultrafiltration dans un délai maximum de 48h, de préférence 24h maximum. 14- Method according to one of the preceding claims wherein the liquid phase obtained after microfiltration is subjected to ultrafiltration within a maximum of 48h, preferably 24 hours maximum.
15- Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le cocktail enzymatique séparé est mis en contact avec une biomasse lignocellulosique prétraitée , de préférence par explosion à la vapeur, pour réaliser une hydrolyse enzymatique et obtenir des jus sucrés, lesdits jus sucrés subissent une fermentation éthanolique, l'hydrolyse enzymatique et la fermentation étant réalisées séparément ou simultanément, et l'éthanol produit est séparé par distillation. 15- Method according to one of the preceding claims wherein the separated enzymatic cocktail is contacted with a pretreated lignocellulosic biomass, preferably by steam explosion, to perform enzymatic hydrolysis and obtain sugar juices, said sugar juices undergo a ethanolic fermentation, the enzymatic hydrolysis and fermentation being carried out separately or simultaneously, and the ethanol produced is separated by distillation.
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