EP3405565A1 - Souche bacterienne genetiquement modifiee produisant de la kurstakine dans le milieu de culture - Google Patents

Souche bacterienne genetiquement modifiee produisant de la kurstakine dans le milieu de culture

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Publication number
EP3405565A1
EP3405565A1 EP17701673.0A EP17701673A EP3405565A1 EP 3405565 A1 EP3405565 A1 EP 3405565A1 EP 17701673 A EP17701673 A EP 17701673A EP 3405565 A1 EP3405565 A1 EP 3405565A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
kurstakin
medium
production
kurstakine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17701673.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Lereclus
Philippe Jacques
Michel Gohar
Marlène CHOLLET
Thibault CARADEC
Sébastien GÉLIS-JEANVOINE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Original Assignee
Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Lille 1 Sciences et Technologies, Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech filed Critical Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Publication of EP3405565A1 publication Critical patent/EP3405565A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified bacterial strain, in particular a strain of Bacillus thuringiensis, as well as the use of such a strain to produce kurstakin.
  • the invention also relates to a process for producing kurstakine in a liquid medium and the use of kurstakine as antifungal agent and biosurfactant.
  • Bacillus thuringiensis is a ubiquitous bacterium that is found in virtually all soils, aquatic environments, air and plant foliage. Also called Thuringian bacillus, this bacterium was discovered at the beginning of the 20th century and used as a microbiological or insecticidal control agent since the 50s. It is used in agriculture, market gardening, forest protection, but also in fight vector control for the control of insects carrying diseases such as malaria.
  • Bacillus thuringiensis lies in its ability to synthesize protein crystals that are toxic to certain insects. These crystals are mainly composed of toxic proteins called delta-endotoxins or Cry toxins. Once ingested by insects (usually during larval stages), the crystals encounter a medium in the midgut of insects capable of dissolving their constituents, thanks to the alkaline or acidic pH, and the presence of proteases, and the release of toxic proteins. These proteins interact with the intestinal wall of the insect and destroy the cells that compose it by forming pores in the digestive wall.
  • Bacillus thuringiensis, or Bt is the most widely used insecticide in the world in organic farming: it accounts for nearly 95% of bioinsecticides.
  • Kurstakin is a lipopeptide produced in small amounts by some strains of the Bacillus cereus group, including several strains of the species Bacillus thuringiensis, in which this molecule was first isolated in 2000 (Hathout et al.). Kurstakin is produced non-ribosomally by a non-Ribosomal Peptide Synthase (NRPS), a multi-enzyme complex operating in a modular fashion. The enzymes of this complex are expressed from an operon (called krs operon) comprising the genes krsE, krsA, krsB, krsC and krsD (from the 5 'end to the 3' end of the operon). Kurstakine comes in different isoforms.
  • krs operon comprising the genes krsE, krsA, krsB, krsC and krsD (from the 5 'end to the 3' end of the oper
  • Kurtakin exhibits anti-fungal activity against the strain Stachybotris charatum, originally described by Hathout et al. (2000).
  • the inventors have now highlighted the anti-fungal effect of kurstakin against two other phytopathogenic strains: Galactomyces geotrichum and Botrytis cinerea.
  • the inventors genetically modified strains of Badllus thuringiensis so as to increase their kurstakin production capacity. Using these improved strains, they developed a process for producing and purifying kurstakin in a liquid medium.
  • the present invention firstly relates to a genetically modified bacterial strain not expressing Cry toxin.
  • the bacterial strains that can be modified according to the present invention are all bacterial strains that express kurstakine, naturally or not.
  • a bacterial strain that can be genetically modified according to the invention is therefore first of all a strain carrying the operon necessary for the synthesis of kurstakine.
  • Bacillus cereus group all strains belonging to the Bacillus cereus group are likely to express kurstakin.
  • a bacterial strain that can be modified according to the invention may also be a strain which does not naturally express kurstakin but which has been genetically modified by the input of the genes of the krs operon so that it expresses kurstakin.
  • Such a strain may for example be a strain of Bacillus subtills.
  • a bacterial strain according to the invention is therefore defined as a strain expressing kurstakine and not expressing Cry toxin.
  • bacterial strain not expressing Cry toxin is meant a bacterial strain which is not capable of producing Cry toxin because at least one of the genes responsible for the expression of these proteins is inactivated or absent (by mutation, deletion or insertion at the level of the gene itself or its promoter).
  • Cry genes responsible for the production of Cry toxins are naturally carried by plasmids, it is possible to eliminate these plasmids to suppress the production of toxin.
  • a non-toxin-expressing strain may also be a strain that has retained the plasmid carrying the cry genes but in which the plasmid does not allow the expression of Cry toxins. it is understood that a strain not expressing Cry toxin may be any bacterial strain in which the krs operon is absent, in particular absent naturally.
  • a bacterial strain according to the invention is a strain expressing kurstakine, not expressing toxin and in which a stabilizing sequence of CARNm has been introduced upstream of the krsE gene of the krs operon.
  • this mRNA stabilizing sequence corresponds to STAB-SD of sequence SEQ ID NO. 1.
  • a strain according to the invention corresponds to a genetically modified Bt strain not expressing Cry toxin and comprising an STAB-SD ARMm stabilizer upstream of the krs operon.
  • a strain according to the invention is a Bt strain that does not express Cry toxin and is incapable of sporulating.
  • a strain according to the invention is a Bt strain that does not express Cry toxin following the loss of the plasmid carrying the genes responsible for the production of said toxin and wherein the spoOA gene is inactivated.
  • strain Bt 407 CrybspoOA An example of such a strain is strain Bt 407 CrybspoOA.
  • a strain according to the invention is a Bt strain overexpressing the KrsE protein.
  • a strain according to the invention does not express Cry toxin and overexpress KrsE.
  • a strain according to the invention further comprises a deletion of the spoOA gene, an STAB-SD ARMm stabilizer upstream of the krs operon, and the replacement of the endogenous Coperon krs promoter by the cry3A promoter "Pcry3a" and the introduction of a terminator sequence "termcrylAc" downstream of the krsD gene.
  • a strain thus modified can further overexpress the Sfp and KrsD proteins.
  • KrsE, Sfp and KrsD proteins can be obtained by introducing the coding sequence of these proteins into the bacterium, for example by introducing a plasmid carrying an expression cassette for these proteins.
  • This plasmid may allow the insertion of said cassette into the genome of the bacterium or persist in the episomal state.
  • the second subject of the present invention is the use of a bacterial strain genetically modified for the production of kurstakine, in particular a strain of Badllus thurlngiensls, said bacterial strain not expressing Cry toxin.
  • the protein sequence of the kurstakine thus produced corresponds to the following sequence:
  • the inventors have shown that the strains Bt 407 Cry 'and Bt HD-73 Cry- (not expressing Cry toxin) have an interesting property since their kurstakin production capacity is increased by a factor of 3 to a factor of 5 according to strains, relative to the corresponding strains naturally expressing Cry toxins (see Example 1.4).
  • the strains Bt 407 Cry 'and Bt HD-73 Cry- not expressing Cry toxin
  • the present invention is divided into different embodiments corresponding to the use of the various strains previously described as objects of the invention.
  • a strain has been modified by the introduction of Pcry3A promoter and mRNA stabilizer STAB-SD upstream of the operon krs of Bt strain HD-73 Cry ", and introduction of the termcrylAc sequence downstream of the krsD gene
  • the stabilizer STAB-SD allows an increase of approximately 2096 kurstakin production.This effect is even amplified when the spoOA gene is deleted in this strain (cf Example 1.6)
  • preference is given to the use of Bt Cry ' strains comprising an mRNA stabilizer and, preferably, Bt Cry ' strains comprising an mRNA stabilizer and a deionization of the mRNA. spoOA gene.
  • the termcrylAc sequence can be used to increase the expression of a gene and the associated protein, in particular by stabilizing the corresponding PARNm.
  • a strain according to the invention is a strain expressing kurstakine, not expressing Cry toxin and having a termcrylAc sequence located downstream of the krsD gene. This advantageous combination is in addition to the other genetic modifications previously described.
  • the inventors have also shown that the overexpression of the KrsE protein is of interest for the production of kurstakine in a liquid medium. They thus helped elucidate the role of this protein by highlighting the effect of KrsE on the release of kurstakin in the culture supernatant. Using an inducible expression system, they highlighted a kurstakin production increased by a factor of 20 when KrsE is overexpressed (see Example 1.7).
  • the overexpression of KrsE protein can also be controlled by a constitutive promoter such as the promoter of the aphA3 gene (Trieu-Cuot P, Courvalin P., 1983. Gene 23: 331-341, Dubois, T et al., 2012. PLoS Pathog.8: el002629), by a promoter preferentially activated during the stationary phase, such as the promoter of the nprR gene (Perchât, S., Dubois, T. et al., 2011 .. Mol.
  • a constitutive promoter such as the promoter of the aphA3 gene (Trieu-Cuot P, Courvalin P., 1983. Gene 23: 331-341, Dubois, T et al., 2012.
  • PLoS Pathog.8: el002629 a promoter preferentially activated during the stationary phase, such as the promoter of the nprR gene (Perchât,
  • Mcrobiol 82: 619-633 or an inducible promoter such as the xylose-inducible promoter (Slamti, L. and Lereclus, D., 2002. EMBO J. 21: 4550-4559).
  • the invention consists in using a bacterial strain, preferably a Bt strain, not expressing toxin, comprising an mRNA stabilizer and overexpressing the krsE gene.
  • Such a strain is for example Bt HD-73 Cry
  • This strain may further comprise a termcrylAc sequence as in the strain Bt HD73
  • sfp and krsD genes that encode respectively for phosphopantheinyltransferase and thioesterase.
  • the Sfp protein sequence corresponds to SEQ ID NO. 5.
  • the invention consists in using a strain Bt that does not express any toxin, comprising a stabilizer of the mRNA of the krs operon and the overexpression of the krsE gene and further comprising inactivation of the spoOA gene.
  • the Bt strain also comprises a P1 promoter in place of the endogenous promoter of the krs operon and a termcrylAc terminator sequence downstream of the krs operon, and overexpresses the sfp and krsD genes.
  • a strain of interest is a strain HD1 having lost the plasmids carrying the cry genes and comprising the genetic construct capable of inducing the strongest expression of kurstakine in the culture medium.
  • a third object of the invention consists in a process for the production of kurstakine consisting in cultivating a bacterial strain genetically modified according to the invention, in a liquid medium and in recovering the kurstakine produced in the supernatant.
  • the bacterial strain according to the invention is cultured in a liquid culture medium and the kurstakine is harvested in the culture medium.
  • This liquid medium can be optimized in order to further increase the concentration of the protein in the supernatant, in particular by reducing its degradation over time. It can be in particular the AK medium as described by Hathout et al. (2000).
  • the culture time is adapted according to the kinetics of production specific to each strain, which is within the reach of the skilled person.
  • the method of producing kurstakin in a liquid medium is to cultivate a bacterial strain overexpressing KrsE. Indeed, the inventors have demonstrated that the overexpression of KrsE is critical to promote effective excretion of KrsE in the culture medium.
  • a strain expressing KrsE will preferably be chosen for production of kurstakine in a liquid medium.
  • the process for producing kurstakin further comprises a continuous extraction step by mlcroffltration.
  • this extraction step is followed by the transfer of the kurstakine thus obtained in a medium whose pH is less than 4, preferably less than or equal to 2.
  • a method makes it possible to preserve the activity of kurstakine over time. It is for example possible to preserve the activity of the Hpopeptide for several days at 37 ° C. in a medium at pH 2, whereas the activity is lost if the lipopeptide was kept in a medium whose pH is greater than or equal to 4.
  • This method in a liquid medium has the advantage of not requiring extraction of the lipopeptide from the bacterial cells.
  • the lipopeptide is simply collected in the culture supernatant and then purified by two membrane ultrafiltration steps, the first without solvent and the second in the presence of a solvent (for example ethanol, methanol, etc.).
  • a solvent for example ethanol, methanol, etc.
  • This process is the first commercial production process for kurstaklne.
  • a fourth object of the present invention is the use of kurstaklne as an anti-fungal agent against the Galactomyces geotrichum and Botrytis dnerea strains.
  • a fifth object of the present invention is the use of kurstakin as a biosurfactant to improve the dispersion of Bacillus thuringiensis strains used as a biopesticide.
  • Bt bacteria expressing Cry toxin is the world's most widely used biopesticide in agriculture.
  • israeltakine in particular recombinant kurstakine as produced according to the invention, as a biosurfactant.
  • Figure 1 Map of the constructs used for the preparation of overproducing kurstakin strains. 1A: insertion upstream of krsA, and termcrylAc downstream of
  • FIG. 2 MALDI-TOF mass spectrometry analysis of kurstakin production by different colonies of B. thuringiensis.
  • 2A Analysis of kurstakin production by a colony of B. thuringiensis HD-73 cultured on LB agar medium for 24 hours at 30 ° C. A colony was taken up in 20 ⁇ l of HCCA matrix, the mixture then being briefly centrifuged. The analysis is carried out on the supernatant containing the molecules recovered from the surface of the cells The table recalls the m / z values of the H *, Na * and K * adducts of the different forms observed 2B: Analysis of kurstakin production by a colony of B.
  • 3B Comparison of the HPLC chromatogram profile obtained in this study for the production of kurstakin by B. thuringiensis strain HD-1 on AK agar medium (A) with the analysis carried out during the discovery of kurstakin B (Hathout et al. al., 2000).
  • Figure 4 MALOI-TOF mass spectrometry analysis of kurstakin production. Peak analysis at retention times between 9 and 14 minutes during HPLC analysis of kurstakin extract produced by B. thuringiensis HD-73 on AK agar medium.
  • Figure 5 Production rate of kurstakin. Analysis performed on middle AK agar after 1 night at 37 "C and 3 days at room temperature by the strains of Baa 'Hus thuringiensis HD-1, HD-73 and Bt407.
  • Figure 6 Bt strain the Growth of HD-73 experience. performed in liquid medium LB and AK at 30 ° C, 160 rpm.
  • Figure 7 Measurement of kurstakin concentration. Analysis of the culture supernatant of strain Bt HD-73 cultivated in LB and AK medium at 24 and 72H.
  • Figure 8 Growth curve of the strain Badllus thuringiensis HD-73. Experiment made in 3L fermenter in LB medium.
  • Figure 11 Quantitative analysis of kurstatin production by HPLC chromatography Chromatogram of the extract made from the cell pellet of Bacillus thuringiensis HD-73 after 9H fermentor culture in LB medium at 30oC.
  • Figure 12 MALDI-TOF mass spectrometry analysis of kurstakin production.
  • Figure 14 MALDI-TOF mass spectrometry analysis of kurstakin production.
  • 15A Analysis carried out on a colony of the strain Bt407Cry + grown on LB agar medium for 24 hours at 37 ° C.
  • 15B Analysis performed on a colony of the Bt407Crys strain cultured on LB agar medium for 24 hours at 37 ° C.
  • Figure 16 Effect of plasmid loss carrying cry genes in Bt strain HD-73 on kurstakin production.
  • the HPLC assay was performed from cell extracts of cells grown on AK agar medium for 1 night at 37 ° C. and 3 days at room temperature and purified on SPE C8.
  • Figure 17 Production rate of kurstakine after insertion of an mRNA stabilizer upstream of the krs locus.
  • AK agar medium After 1 night at 37 ° C and 3 days at room temperature in Bt HD-73 Cry- and Bt HD-73 Cry-STAB-SD strains.
  • Figure 18 Effect of overexpression of the krsE gene on the growth curve of strain 0. thuringiensis HD73.
  • Figure 19 Determination of kurstakin in culture supernatants of the Bt strain overexpressing the KrsE protein. In this experiment, B.thuringiensis HD73 krs
  • FIG. 20 Antifungal activity test of purified extracts of kurstakin.20A: Antifungal effect against the strain Rhizoctonia solani. 20B: Antifungal effect against the strain Fusarium oxysporum. The amounts indicated correspond to the amount of lipopeptide present on the disc.
  • the negative control is composed of 3096 acetonitrite.
  • Figure 21 Test of antifungal activity of purified extracts of kurstakine.21A: Antifungal effect against the strain Galactomyces geotrichum after 3 days (A) and 5 days of incubation (B); 21B: Antifungal effect against the Botrytis cinerea strain after 5 days (A) and 7 days of incubation (B). The amounts indicated correspond to the amount of lipopeptide present on the disc.
  • the negative control is composed of 30% acetonitrile.
  • Bacillus thuringiensis (Bt) used in this study were provided by the MICALIS team at INRA Jouy-en-Josas. These are, on the one hand, wild strains isolated from the environment, and, on the other hand, genetically modified strains for studying the effect of various factors on kurstakin production by Bt.
  • Table 1 List of Bacillus thuringiensls strains used in the study of kurstakin production mechanism
  • the strains are cultured in 5 ml of liquid LB culture medium at 37 ° C., shaken on a rotary shaker at 160 rpm until an ODex of 1 is obtained.
  • the culture is then distributed in cryotubes of 1 mL in the following proportions: 0.3 mL of glycerol per 0.7 mL of culture.
  • the cryotubes thus obtained are directly put in the freezer at -80 ° C for the long-term storage of bacterial strains. 2.
  • the Luria Bertani culture medium is a complex medium conventionally used for culturing bacterial strains, it is composed of tryptone, 10 g / L; yeast extract, 5 g / L; NaCl, 10 g / L.
  • the components are solubilized in 800 mL of deionized water, the pH is then adjusted to 7.0 and the volume is supplemented to 1 L.
  • This medium can be solidified (LGg medium) by the addition of agar (15 g / ml). L).
  • the medium is sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes.
  • Medium 863 is a medium used for culturing yeast strains used for molecular biology manipulations.
  • the composition of the 863 medium is as follows: glucose, 10 g / L; yeast extract 10 g / L; casein peptone, 10 g / L.
  • Geostatic medium 868 can be prepared by adding Pagar (15 g / L). The medium is sterilized by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes.
  • AK agar medium # 2 (Beckton, Dickinson, USA) is a ready-to-use medium used for the sporulation of Bacillus strains.
  • the approximate composition indicated by the supplier is as follows: gelatin peptone, 6 g / L; casein peptone, 4 g / L; yeast extract, 3g / L; beef extract, 1.5 g / L; glucose, 1 g / L; agar, 15 g / L; Manganese sulphate II, 0.3 g / L
  • the medium is prepared by solubilizing 30.8 g of medium in 1 L of deionized water, and is sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes.
  • the liquid medium AK is identical to the medium AK agar described above with the difference that it does not contain agar.
  • PDA medium Panato Dextrose Agar, Bfokar Diagnostics
  • the composition of the medium is as follows: potato extract, 4 g / L; glucose, 20 g / L; agar, 15 g / L
  • the medium is prepared by solubilizing 39 g of medium in 1 L of demineralised water and is sterilized by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes. 3. Construction of overproducing strains of kurstakfne
  • overproducing kurstakin strains are as follows: deletion of the spoOA gene, insertion of a strong promoter (Agaisse H. and Lereclus D. 1994, J Bacterioi 176: 4734-4741) and a stabilizer of STAB-SD mRNA (Agaisse H.
  • the strains 407, HD1 and HD73 are natural strains.
  • strain HD73 Cry The deletion of spoOA in strain HD73 Cry is carried out by insertion into this gene of a kanamycin resistance cassette, according to the method previously published (Yang H., et al., 2012, Appl Environ Microbiol 78: 6466-6474). .
  • the strain obtained is named HD73 Cry ' AspoOA.
  • allelic exchange using a genetic construct carried by the suicide vector pMAD. and STAB-SD are located in contiguity on the same DNA sequence, amplified by PCR from plasmid pHT7830 (Agaisse H. and Lereclus D., 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107) using primers stabSD-fwd and stabSD-rev (Table 2). These primers introduce the XmaI and EcoRI sites at the 5 'and 3' ends of this 577 bp sequence.
  • the regions upstream and downstream of the krsE promoter are amplified by PCR from the chromosomal DNA of the HD73 strain using the primers (krs-up-fWd, krs-up-rev) for the upstream region. (960pb), and (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) for the downstream region (084bp). Restriction sites (NcoI, XmaI) are introduced at 5 'and 3' in the upstream region, and (EcoRI, BamHI) at 5 'and 3' in the downstream region.
  • the upstream, Pcry3A-stabSD and downstream fragments are digested and ligated at XmaI and EcoRI.
  • This construct is amplified by PCR and treated with T4 poK / nucleotide kinase (phosphorylation of the 5 'and 3' ends of the fragment in blunt ends).
  • the phosphorylated fragment is inserted into the plasmid pMAD at the SmaI site, after dephosphorylation by the alkaline phosphatase of the ends of the open plasmid, to obtain the plasmid
  • the insertion of termcrylAc downstream of krsD is carried out by allelic exchange using a construct carried by the suicide vector pMAD
  • the nucleotide sequence of the terminator 'termcrylAc' of the crylAc gene (SEQ 10 NO 3) is amplified by PCR from pHN73 of plasmid pHT73 (Liu G., et al., 2013, Genome Announc 1: e0008013), using the termcry-fwd and termcry-rev primers (Table 2) These primers introduce the XbaI sites and Pstl at the 5 'and 3' ends of this 222bp sequence
  • the sequences of the krsD gene on the one hand, and the region located downstream of this gene on the other hand are amplified by PCR from the chromosomal DNA strain HD73 using primers (krs-up-fwd, krs-up-rev) for the upstream region (936pb),
  • TermcrylAc and downstream are digested and then ligated to XbaI and PstI.
  • This construct is amplified by PCR, digested with BamHI and NcoI and ligated to the plasmid pMAO opened with the same enzymes.
  • the plasmid pMAD-termcrylAc is transferred into the HD73 cry ' AspoOA krsA :: Pcry3A-stabSD strain by electroporation. The strain having the integrated plasmid is then cultured successively at 30 ° and 37 "to select a double homologous recombination (D. Lereclus et al, 1992, Bio / Technology. 10: 418-421).
  • the clones having integrated chromosomally This construct is selected by colony PCR and the correct insertion of termcrylAc is verified by sequencing.
  • the strain obtained is HD73 Cry ' AspoOA krsA :: Pcry3A-stabSD krsD :: termcrylAc.
  • the overexpression of the krsE, sfp and krsD genes is obtained by cloning these genes behind the Pxyl inducible promoter, in the high copy number plasmids pHT1618 (Lereclus D. and Arantes 0. 1992, Mol Microbiol 6: 35-46) ( Figure 1B) and pHT315pxyl (Slamti L and Lereclus D., 2002, EMBO J 21: 4550-4559) ( Figure 1C).
  • the sequence of the krsE gene is amplified by PCR from the chromosomal DNA of strain HD73, using primers krsE-fwd and krsE-rev (Table 2).
  • sfp and krsD genes For the overexpression of the krsE, sfp and krsD genes, the following clonings were performed: The sequence of the krsE gene preceded by its promoter is amplified by PCR from the chromosomal DNA of strain HD73, using the primers pkrsE-fwd and pkrsE-rev (Table 2). These primers introduce the BamHI and XbaI sites at the 5 'and 3' ends of this 1800 bp sequence. The sequence of sfp and krsD genes, organized as an operon, is amplified by PCR using primers sfpkrsD-fwd and sfpkrsD-rev.
  • the amplified sequence 1500pb in size, has the XbaI and HindIII restriction sites at its 5 'and 3' ends.
  • the two amplified sequences are digested with the enzymes BamHI, XbaI and HindIII and are then ligated into the plasmid pHT315pxyl opened with BamHI and HindIII.
  • the plasmid is selected for E. coli for resistance to erythromycin, verified by sequencing and transferred by electroporation
  • Strains of B. thuringiensis were cultured on solid media (AK agar or LBg) for the production of kurstakines according to the protocol described by Hathout et al. Overnight preculture was performed in liquid LB medium at 30 ° C, shaken at 160 rpm. The boxes of agar medium are then inoculated by flooding, and the surplus of preculture is removed. The boxes are incubated overnight at 37oC and 3 days at room temperature on bench. Collection of the culture on a plate is carried out after 24, 48, 72 and 120 hours of culture for the determination of the lipopeptides.
  • the bacterial carpet having developed on the plates of agar medium is recovered by means of a rake, and taken up in a 1M KCl / 0.5M NaCl solution.
  • the solution is homogenized by vortex, then centrifuged at 10,000 g for 10 minutes.
  • the pellet is then washed 3 times with an equivalent volume of distilled water.
  • the extraction is carried out on these pellets by adding solvent ACN / H 2 0 90/10 (V / V), followed by homogenization by vortexing.
  • the suspension is then centrifuged at 3000 g for 10 minutes to separate the supernatant, containing the components recovered from the surface of the spores, and the cell pellet.
  • the supernatant is then directly processed by solid phase extraction (SPE) for the extraction of kurstakines.
  • SPE solid phase extraction
  • an awakening culture is performed in 10 mL of LB medium in a test tube from a cryotube of the strain stored at -80 ° C.
  • the liquid cultures of Bt are made from cryotubes prepared previously.
  • Preculture is carried out in 100 ml of liquid culture medium corresponding to the medium used for the culture, namely LB or AK medium.
  • the growth of the preculture is carried out under the same conditions of temperature and agitation as the culture for which it was prepared. When the pre-culture reaches one it is used to seed the crop for
  • israeltakines Purification of kurstakines is performed by SPE on C8 columns fitted to a vacuum extractor Alltech Vacuum 12-port Manifold, using a Savant Gel Pump GP100 pump.
  • SPE C8 columns (Bond-Elut ir C8 100mol) are first washed and conditioned by passing 20mL of ACN / 0.1% TFA, then 20mL of the sample to be analyzed (5mL).
  • a cell extract or culture supernatant is then deposited on the column and fully passed through the column.
  • a first wash is carried out with 10 ml of H 2 O / 0.1% TFA in order to remove the hydrophilic salts and impurities contained in the sample.
  • a second wash is performed by the passage of lipopeptides are eluted
  • the development of the kurstakine purification by HPLC was carried out in order to allow the purification of the lipopeptide from large volumes of Bacillus thuringiensis cell extracts that can not be carried out using low volume SPE columns.
  • the purification was carried out by means of a glass column 15 cm high for 2 cm diameter filled with BONDESIL-C8 phase 40 ⁇ (Agitate Technologies).
  • the solvents are for the acetonitrile route A supplemented with 0.1% TFA (v / v) and for the ultrapure water route B containing 0.1% TFA (v / v).
  • a volume of 5 to 10 ml of concentrated kurstakine extract is injected into the column.
  • the kurstakines are separated using a 4-phase program based on the HPLC program: 25 minutes at 100% water for the elution of hydrophilic contaminants, 20 minutes at 30% acetonitrile for elution of a portion of the contaminants having an affinity with this solvent, 20 minutes of solvent passage at 70% acetonitrile for the elution of kurstakines, and finally 20 minutes at 100% acetonitrile for cleaning the column.
  • Kurstakin is harvested by means of an automatic collector during the 70% acetonitrile elution phase.
  • the analysis is carried out using a Kinetex C8 (ref) column on a Waters apparatus (Online Degaser, 717 Autosampler, 660S Controller, 626 Pump, 2996 PhotoDiodeArray, Waters Corporation, Milford, MA, U.S.A.).
  • the kurstakines are separated by a linear gradient of acetonitrile supplemented with 0.1% of TFA (solvent A) by 30 to 70% over 25 minutes.
  • the HPLC column is then washed for 5 minutes with 100% solvent A and then 5 minutes of rebalancing at 30% of the solvent A for the passage of the next sample.
  • the lipopeptides are detected by reading the absorbance of the amide bonds at 214 nm.
  • the retention time of the peaks obtained and their second derivatives are analyzed using the software EMPOWER 2 Software.
  • the quantification of kurstakine is carried out by comparison with the peak area obtained for a surfactin standard at 1 g / L analyzed under the same conditions.
  • Standardization of lipopeptide assays is performed by relating the amounts of lipopeptides measured to the biological dry mass from which kurstakin was extracted.
  • the cells are recovered after extraction with SPE by resuspending in 5 ml of deionized water and the suspension obtained is deposited in an aluminum dish weighed beforehand and dried in an oven. at 95 ° C for 48 hours for complete removal of water from the sample. After evaporation, the cup is weighed again to determine the dry mass of the sample. 4.5.
  • the search for the different peptides synthesized by S. thuringiensis is carried out by mass spectrometry from bacterial colonies developed on AK agar or LB medium. agar for 24 and 48h. A colony is suspended in 25 ⁇ l of HCCA matrix ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid). The suspension is homogenized by vortexing for 10 seconds, centrifuged rapidly (short spin) at 5000 rpm for 5 seconds and the supernatant is plated for analysis. The acquisition of the mass spectra is carried out using a MALDI-TOF-TOF UltraFlex II instrument (Bruker Daltonics, Bremen, Germany), equipped with a Smartbeam laser, in positive reflectron mode. A thousand MALDI-MS spectra were acquired at each position in a field of 500 to 2000 Da using a laser frequency of 20 Hz.
  • the analysis of culture supernatants and liquid samples is carried out by mixing 10 ⁇ l of sample with 10 ⁇ l of HCCA matrix. In order to identify the desired molecules, the peaks corresponding to the H *, Na * and K * adducts of these are sought.
  • the antifungal activity of Bacillus thuringiensis extracts enriched in kurstakine is evaluated by means of a growth inhibition test of various strains of molds and yeasts on a solid-state can.
  • the various molds to be tested are first cultured by depositing on a PDA agar medium a square of agar colonized by these strains (a strain / petri dish). After inoculation, the different dishes are incubated at 25 ° C. until complete colonization of the dishes.
  • One agar plate of each of these strains is used to colonize the boxes used for the antifungal test. It is made of Petri dishes containing exactly 20ml of PDA. Squares of colonized agar are cut from the previous cultures and placed upside down in the center of the boxes.
  • the incubation is carried out at 25 ° C. until a culture disk 1 cm in diameter is obtained.
  • Disks impregnated with purified kurstakin extracts corresponding to 25, 50 and 100 ⁇ g of lipopeptides are then deposited at 1 cm from the edge of the dish.
  • a negative control is carried out by depositing a disk impregnated with the solvent in which the extracts of kurstakine (ACN / H 2 O 30/70 (v / v)) were taken up.
  • the dishes are incubated at 25 ° C. until the can is completely invaded by the mold strain tested.
  • the antifungal effect of kurstakin is observed by inhibiting the growth of each strain around the lipopeptide-impregnated disks.
  • the different peaks detected correspond to the adducts H *, Na * and K * of the kurstakine bearing a fatty acid with 11, 12, 13 and 14 carbons, indicating the production of these 4 forms of lipopeptide by the strain B. thuringiensis HD-73 .
  • B. thuringiensis strain Bt407 has a peak profile close to that of B. thuringiensis strain HD-73.
  • the adducts H *, Na * and K * of the C13 form are in the majority, and the peaks of the adducts of the C12 and C14 forms are only slightly visible.
  • only the adduct H * of the form Cil can be detected.
  • the intensity of the peaks observed being less than that obtained with B. thuringiensis HD-73, the signal peaks corresponding to other adducts is probably not enough to clear the background.
  • israeltaklne synthetase genes and kurstakin production have been observed in different strains, the identification of the strain with the best rate of lipopeptide production is necessary for the selection of a strain of blotechnofogic interest.
  • kurstakin production rates of various wild strains of B. thuringiensis were evaluated by performing the HPLC assay of extracts prepared from solid cultures AK agar according to the modified protocol ofHathout et al. . described in the Materials and Methods section. Strains are cultured on AK agar medium overnight at 37oC and 3 days at room temperature.
  • the samples are analyzed by HPLC allowing the separation of the different forms of kurstakine by a column grafted with C8 phase during a solvent gradient of 30 to 70% of acetonitrile .
  • the separation of the molecules is followed by the measurement of the absorbance at 214 nm.
  • An example of a chromatogram obtained is shown in FIG. 3A.
  • HPLC analysis identifies 4 peaks at retention times 9.97, 11.65, 11.97 and 13.12 minutes.
  • the first three peaks have intensities of the same order of magnitude.
  • the peak at 13.12 minutes has a relatively higher intensity.
  • the MALDI-TOF mass spectrometry analysis of the peaks collected during the HPLC analysis makes it possible to identify the various H ⁇ Nav and K + adducts the Cil to C14 forms of kurstakine, thus confirming that the peaks detected by HPLC correspond to the different forms of lipopeptide.
  • B. thuringiensis strain HD-73 produces about 6 ⁇ g of kurstakin per mg of dry matter.
  • B. thuringiensis strain HD-1 produces between 15 and 20 ⁇ g / mg dry matter.
  • the strain B. thuringiensis Bt407 produces lug / mg of dry matter.
  • B. thuringiensis strain HD-1 has the highest kurstakin production rate among the strains tested, followed by B. thuringiensis HD-73 and B. thuringiensis Bt407. Nevertheless, at the beginning of the work carried out within the framework of this study, only the genomes of B. thuringiensis strains HD-73 and Bt407 had been sequenced and published. The strain HD-73 having the best rate of production of lipopeptide between these two strains, it was mainly used for the study of factors potentially limiting the production of kurstakine.
  • strain BT HD-73 is cultured in LB medium and liquid AK for 72 hours at 30 ° C. with shaking at 160 rpm.
  • the growth monitoring is carried out by measuring the absorbance at 600 nm (FIG. 6), and kurstakin production is carried out on each sample according to the protocol described in the Materials and Methods section.
  • strain Bt HD-73 The growth of strain Bt HD-73 is similar in the two liquid culture media tested.
  • the strain is in an exponential growth phase for about 3 hours, then is in a slowdown phase of 3 to 24 hours of culture, at which point it enters the stationary phase.
  • kurstakin production in AK medium reaches 5 mg / L in the culture supernatant. After 72 h of culture, 3.7 mg / L are measured. In LB medium, 1 mg / L is measured after 24 h, but kurstakine is no longer detectable after 72 h.
  • the culture in liquid medium AK thus allows the production of an amount of kurstakine greater than that of a culture in liquid medium LB.
  • Bacillus thuringiensis presents in fermentor an exponential growth phase of 3 hours, and a slowdown phase of 2 hours.
  • the mass spectrometric analysis makes it possible to observe the presence of kurstakine adducts of C13 form.
  • strain HD-73 was cultured in AK agar medium and LB agar for 5 days.
  • the extraction, purification and quantification of kurstakine were carried out according to the protocol described in the Materials and Methods section (FIG. 13).
  • the production of kurstakine is about 1 mg / mg of dry matter after 9 hours of culture, and reaches a maximum after 24 hours of culture, with 2 ⁇ g / mg of dry matter.
  • the amount of kurstakin then decreases to 0.5 ⁇ g / mg of dry matter after 96h, then settles at 2 ⁇ g / mg dry matter after 120h. Nevertheless, the measurement inaccuracies related to the small quantities of detected molecule do not make it possible to establish a significant difference in measurements between the different culture times for this medium.
  • israeltakine has been, since the discovery of this molecule, associated with the sporulation phenomenon of ⁇ . thuringiensis. This is due in particular to the physiological state of the cells used during the discovery of the lipopeptide.
  • the lipopeptide production capacity of the Bt ACHbspoOA strain was studied. This strain whose SpoOA gene, coding for an activator of genes linked to sporulation, has been interrupted is therefore incapable of sporulating or even of engaging in the sporulation process (Lereclus, et al., 199S. Bio / Technology, 13: 67-71).
  • a first step the analysis of the products of the different strains was carried out by MALDI-TOF mass spectrometry from colonies grown on LB agar medium for 24 hours at 30 ° C. (FIG. 15A).
  • the wild-type Bt 407 strain has peaks of kurtakin adducts at C11, C12, C13 and C14.
  • the assay was performed under the same conditions for strain Bt407 Cry- in which the plasmid carrying the cry genes was deleted ( Figure 15B).
  • the kurstakines of Cil to C14 form are found on the cells of the strain Bt407 Cry-.
  • the wild-type Bt407 and Bt 407 Cry- strains therefore produce the same forms of kurstakin, indicating that the deletion of the plasmid carrying the genes responsible for the production of toxins does not lead to a qualitative change in the forms of kursakin produced.
  • Bt HD-73 has a kurstakin production level of about 6 ⁇ g / mg dry matter, and after the loss of the plasmid, the strain produces about 18 ⁇ g / mg dry matter, while the Bt 407 strain plasmid allows the increase in production of 1 to 5 ⁇ g / mg dry matter.
  • the removal of the plasmid thus has a positive effect on kurstakin production from a quantitative point of view, with an increase in lipopeptide production rate brought to the dry matter by a factor of 3 to 5 depending on the strain.
  • the stability of the messenger RNAs from the production genes is essential for the production of the synthetase responsible for kurstakin production.
  • a problem of mRNA stability would result in a very weak synthesis of the enzyme complex producing the lipopeptide.
  • the importance of the mRNA stability of the krsEABC genes was therefore evaluated here by the determination of kurstakin by the Bt HD-73 Cry-STAB-SD and Bt HD-73 CryospoOA STAB-SD strains in which STAB-SD sequence was integrated upstream of the krsE gene.
  • This Shine-Dalgarno-like sequence upstream of the cry3A toxin gene was identified in B. thuringlensis as acting as an mRNA stabilizer.
  • the minimal STAB-SD sequence for stabilizing downstream mRNA corresponds to SEQ ID NO. 1.
  • This sequence can be placed between any promoter and the sequence of the gene of interest. Inserting this sequence upstream of krsE could therefore increase the stability of kurstakine mRNA. synthetase.
  • the various modified strains were cultured on AK agar medium and used for the preparation of cell extracts according to the method described in the Materials and Methods section. The production results of these strains and the corresponding parent strains are shown in FIG. 17. Bt HD-73 Cry-strain produces 18.2 ⁇ g of kurstakin per mg of dry matter. The introduction of the STAB-SD stabilizer into the strain results in an increase in production to 21.7 ⁇ g / mg, an increase of about 20%.
  • This strain in which the kurstakine synthetase promoter is inducible by the addition of xylose, was cultured in liquid LB medium, in the absence or in the presence of 20 mM xylose (LBxyl), allowing induction of the transcription of the krsE gene.
  • the liquid cultures were carried out in 100 ml of 500 ml Erlenmeyer flask or LBxyl medium at 30 ° C. for 24 hours. A 5 mL sample was taken every hour for the first 8 hours of culture. A 5 mL sample was also taken after 24, 28 and 32 hours of culture. For each sample, the pellet and supernatant were separated by centrifugation at 5000g for 5 minutes, and the extraction, purification and analysis of kurstakin production was performed as described in the Materials and Methods section.
  • the growth curves of strain H073 :: STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE grown in LB medium in the absence or in the presence of 20mM xylose are shown in FIG. 18.
  • the strain Bt HD73 krs :: STAB- SD pHT1618T-pxylOkrsE has an exponential growth phase of about 3 hours. The strain then enters the slowdown until the beginning of the spring phase, at about 10 hours of cultivation, reaching a maximum of 6.0 after 32 hours of culture.
  • the strain In LBxyl medium, the strain has the same growth profile at the exponential phase. Nevertheless, where the strain has a simple slowdown phase in LB medium, the growth in the presence of xylose sees the culture fall from 6 hours of
  • the monitoring of the concentration of kurstakin present in the culture supernatant of the strain under the different conditions is presented in FIG. 19.
  • the kurstakin concentration in the culture supernatant is relatively low or impossible to evaluate by HPLC. , being below the detection threshold of the device despite the concentration step performed on SPE column.
  • the maximum measured concentration is obtained after 24 hours of culture, with 1.02 mg / L of kurstakine in the culture supernatant.
  • the concentrations measured in the first hours of culture are of the order of 4.6 and 5.4 mg / L for the first and second hours of culture respectively. The concentration then decreases gradually until the 7th hour of culture, with a concentration of 0.1 mg / L of lipopeptide. At 8 hours of culture, the measured concentration increases to 1.3 mg / L. hours of culture, the concentration measured in the culture supernatant of the strain grown in LBxyl is 18.46 mg / L. These results show an increase in the production of kurstatin in the supernatant by about a factor of 18, at 24 hours. in culture medium LB.
  • This experiment shows the positive effect of the overexpression of the krsE gene on the production of kurstatin in the supernatant under culture conditions in a liquid medium.
  • Bocillus lipopeptides have a wide variety of industrially valued activities (antibacterial, antifungal, surfactant ). To date, only one antifungal activity has been demonstrated in kurstakine, against the single strain Stachybrotris chartarum. The purpose of this part is to evaluate the biological activities of kurstakine, especially as antifungal and antibacterial.
  • israeltakin purified extracts are grown in PDA medium from the center of the petri dish, and the endoculum is surrounded by discs respectively containing 25, 50 and 100 ⁇ g of kurstakin.
  • Antifungal activity is evaluated by inhibiting the growth of the molds tested around the discs containing the lipopeptide.
  • the Rhizoctonia solanii strain was able to grow on the whole surface of PDA agar medium, also covering the disks imbibed with lipopeptide extract (FIG. 20A). Kurstakin therefore has no antagonistic effect on the growth of the strain.
  • the strain Calactomyces geotrichum did not colonize the entire surface of the petri dish. Three days after the deposition of the mold, its growth reached the control disc and began to cover it. In contrast, a halo of growth inhibition is visible around all discs containing kurstakin. After 5 days of culture, the strain completely covered the control disk, but did not cover the disks containing the lipopeptide extract. In addition, growth inhibition is visible on the opposite side of the discs ( Figure 21A). Kurstakine therefore has antifungal effect on the Galactomyces geotrichum strain.
  • Kurstakin is also active against the Botrytis cinerea strain. Indeed, after 5 days of culture, a halo of inhibition is visible around the discs containing kurstakine. After 7 days of culture, the strain completely covered the control disk, while a growth inhibition halo of about 1.5 cm in diameter is visible around the lipopeptide-containing disks at all concentrations. tested ( Figure 21B).

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Abstract

La présente invention concerne une souche bactérienne génétiquement modifiée, en particulier une souche de Bacillus thuringiensis, exprimant la kurstakine et n'exprimant pas de toxine Cry, un procédé de production de kurstakine en milieu liquide et l'utilisation de la kurstakine en tant qu'agent antifongique et biosurfactant.

Description

SOUCHE BACTERIENNE GENETIQUEMENT MODIFIEE PRODUISANT DE LA KURSTAKINE DANS LE
MILIEU DE CULTURE
La présente invention a pour objet une souche bactérienne génétiquement modifiée, en particulier une souche de Bacillus thuringiensis, ainsi que l'utilisation d'une telle souche pour produire de la kurstakine. L'invention a également pour objet un procédé de production de kurstakine en milieu liquide et l'utilisation de la kurstakine en tant qu'agent antifongique et biosurfactant.
Bacillus thuringiensis est une bactérie ubiquitaire que l'on le retrouve dans pratiquement tous les sols, les milieux aquatiques, l'air et le feuillage des végétaux. Aussi appelé bacille de Thuringe, cette bactérie a été découverte au tout début du XXe siècle et utilisée comme agent de lutte microbiologique ou insecticide depuis les années 50. Elle est utilisée en agriculture, en culture maraîchère, en protection des forêts, mais aussi en lutte antivectorielle pour le contrôle d'insectes porteurs de maladies comme le paludisme.
La particularité de Bacillus thuringiensis tient à sa capacité à synthétiser des cristaux protéiques toxiques pour certains insectes. Ces cristaux sont majoritairement composés de protéines toxiques appelées delta-endotoxines ou toxines Cry. Une fois ingérés par les insectes (généralement lors des stades larvaires), les cristaux rencontrent, dans l'intestin moyen des insectes, un milieu capable d'assurer la dissolution de leurs constituants, grâce au pH alcalin ou acide, et à la présence de protéases, et la libération des protéines toxiques. Ces protéines interagissent avec la paroi intestinale de l'insecte et détruisent les cellules qui la composent en formant des pores dans la paroi digestive. Aujourd'hui, Bacillus thuringiensis, ou Bt, est l'insecticide le plus utilisé au monde en agriculture biologique : il représente à lui seul près de 95% des bioinsecticides.
La kurstakine est un lipopeptide produit en faible quantité par certaines souches du groupe Bacillus cereus, notamment plusieurs souches de l'espèce Bacillus thuringiensis, chez laquelle cette molécule a été isolée pour la première fois en 2000 (Hathout et al.). La kurstakine est produite de façon non-ribosomique par une Non Ribosomal Peptide Synthase (NRPS), complexe multi-enzymatique fonctionnant de façon modulaire. Les enzymes de ce complexe sont exprimées à partir d'un opéron (appelé opéron krs) comprenant les gènes krsE, krsA, krsB, krsC et krsD (de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' de l'opéron). La kurstakine se présente sous différents isoformes.
La kurtakine présente une activité anti-fongique contre la souche Stachybotris charatum, initialement décrite par Hathout et al. (2000). Les inventeurs ont maintenant mis en évidence l'effet anti-fongique de la kurstakine contre deux autre souches phytopathogènes : Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea.
Il serait de plus intéressant d'utiliser la kurstakine en tant que biosurfactant.
M n'existe actuellement aucun procédé permettant une production à grande échelle de kurstakine, notamment en milieu liquide. En effet, deux verrous technologiques limitent actuellement la possibilité de produire et extraire ce lipopeptide à l'échelle industrielle : le faible niveau d'expression des gènes de l'opéron kurstakine et la faible production de lipopeptides qui en découle.
En vue d'une utilisation de ce lipopeptide dans le domaine phytosanitaire, les inventeurs ont modifié génétiquement des souches de Badllus thuringiensis de sorte à augmenter leur capacité de production de kurstakine. En utilisant ces souches améliorées, ils ont mis au point un procédé de production et de purification de kurstakine en milieu liquide.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente Invention a pour premier objet une souche bactérienne génétiquement modifiée n'exprimant pas de toxine Cry.
Les souches bactériennes qui peuvent être modifiées conformément à la présente invention sont toutes les souches bactériennes qui expriment la kurstakine, de façon naturelle ou non.
Une souche bactérienne pouvant être génétiquement modifiée selon l'invention est donc tout d'abord une souche portant l'opéron krs nécessaire à la synthèse de la kurstakine.
D'une façon générale, toutes les souches appartenant au groupe Bacillus cereus sont susceptibles d'exprimer la kurstakine. Parmi les souches utilisables à cette fin, on peut citer les souches de Bacillus thurengiensis (Bt) ou de Bacillus cereus qui expriment naturellement l'opéron krs, et en particulier les souches Bt HD-1, Bt HD-73, Bt 407, Bt serovar chiniensis, BT IS5056, Bt HD789, Bt YBT 1518, etc..
Une souche bactérienne pouvant être modifiée selon l'invention peut aussi être une souche n'exprimant pas naturellement la kurstakine mais qui a été préalablement modifiée génétiquement par apport des gènes de l'opéron krs, de sorte à ce qu'elle exprime la kurstakine. Une telle souche peut par exemple être une souche de Bacillus subtills. Une souche bactérienne selon l'invention se définit donc comme une souche exprimant la kurstakine et n'exprimant pas de toxine Cry.
Par « souche bactérienne n'exprimant pas de toxine Cry », on entend une souche bactérienne qui n'est pas capable de produire de toxine Cry du fait qu'au moins un des gènes responsables de l'expression de ces protéines, est inactivé ou absent (par mutation, délétion ou insertion au niveau du gène lui-même ou de son promoteur). Les gènes cry responsables de la production des toxines Cry étant naturellement portés par des plasmides, il est possible d'éliminer ces plasmides pour supprimer la production de toxine. Une telle perte de plasmide a été réafisée et a permis l'obtention des souches Bt 407 Cry', Bt HD73 Cry', et Bt 407 Cry' àspoOA décrites par Yang et al., (2012), Lereclus et al., (1989) et Lereclus et al., (1995). Une souche n'exprimant pas de toxine peut également être une souche qui a conservé le plasmide porteur des gènes cry mais dans laqueHe ce plasmide ne permet pas l'expression de toxines Cry. il est entendu qu'une souche n'exprimant pas de toxine Cry peut être toute souche bactérienne chez laquelle l'opéron krs est absent, en particulier absent naturellement. Dans un mode de réalisation particulier, une souche bactérienne selon l'invention est une souche exprimant la kurstakine, n'exprimant pas de toxine et dans laquelle une séquence stabilisatrice de CARNm a été introduite en amont du gène krsE de l'opéron krs.
Oans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, cette séquence stabilisatrice de l'ARNm correspond à STAB-SD de séquence SEQ ID NO. 1. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une souche selon l'invention correspond à une souche Bt génétiquement modifiée n'exprimant pas de toxine Cry et comprenant un stabilisateur d'ARMm STAB-SD en amont de l'opéron krs.
De plus, afin d'augmenter le niveau d'expression de la kurstakine, le promoteur endogène de l'opéron krs peut être remplacé par le promoteur cry3A « Pcry3a » et une séquence terminatrice « termcrylAc » peut être introduite en aval du gène krsD. La séquence de Pcry3A correspond à la SEQ ID NO. 2 et la séquence terminatrice termcrylAc correspond à la séquence SEQ ID NO. 3. Le choix de ces séquences ne doit toutefois pas être considéré comme limitant du fait qu'il est à la portée de l'homme du métier de substituer ces séquences par des séquences aux fonctions équivalentes. Dans un autre mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention est une souche Bt n'exprimant pas de toxine Cry et incapable de sporuter. Afin de supprimer l'activité de sporulation d'une souche Bt, il est possible d'inactiver tout gène essentiel à la sporulation comme les gènes impliqués dans l'expression des facteurs sigma de sporulation SigE, SigH et SigK, et en particulier de supprimer l'expression de la protéine SpoOA, par exemple en délétant le gène spoOA Dans un mode particulier de mise en oeuvre, une souche selon l'invention est une souche Bt n'exprimant pas de toxine Cry suite à la perte du plasmide porteur des gènes responsable de la production de ladite toxine et dans laquelle le gène spoOA est inactivé.
Un exemple d'une telle souche est la souche Bt 407 Cry- bspoOA.
Dans un autre mode de réalisation, une souche selon l'invention est une souche Bt surexprlmant la protéine KrsE.
Les inventeurs ont en effet démontré que la surexpression de KrsE permet une excrétion du tipopeptide dans le milieu de culture. Ce résultat est très intéressant du fait qu'il permet une production en milieu liquide, élément nécessaire au développement d'un procédé de production à grande échelle. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention n'exprime pas de toxine Cry et surexprime KrsE. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, une souche selon l'invention comprend en outre une délétion du gène spoOA, un stabilisateur d'ARMm STAB-SD en amont de l'opéron krs, le remplacement du promoteur endogène de Copéron krs par le promoteur cry3A « Pcry3a » et l'introduction d'une séquence terminatrice « termcrylAc » en aval du gène krsD.
Une souche ainsi modifiée peut en outre surexprimer les protéines Sfp et KrsD.
La surexpression des protéines KrsE, Sfp et KrsD peut être obtenue par introduction de la séquence codante de ces protéines dans la bactérie, par exemple en introduisant un plasmide porteur d'une cassette d'expression pour ces protéines. Ce plasmide peut permettre l'insertion de ladite cassette dans le génome de la bactérie ou persister à l'état épisomal.
La présente invention a pour second objet l'utilisation d'une souche bactérienne génétiquement modifiée pour la production de kurstakine, notamment une souche de Badllus thurlngiensls, ladite souche bactérienne n'exprimant pas de toxine Cry.
La séquence protéique de la kurstakine ainsi produite correspond à la séquence suivante : Les inventeurs ont montré que les souches Bt 407 Cry' et Bt HD-73 Cry- (n'exprimant pas de toxine Cry) présentent une propriété intéressante puisque leur capacité de production de kurstakine est augmentée d'un facteur 3 à un facteur 5 selon les souches, par rapport aux souches correspondantes exprimant naturellement les toxines Cry (Cf Exemple 1.4). Toutefois, pour pouvoir utiliser ces souches pour la production de kurstakine à grande échelle, il était nécessaire d'améliorer encore leur capacité de production.
La présente invention se décline en différents modes de réalisation correspondant à l'utilisation des différentes souches décrites précédemment en tant qu'objets de l'invention.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, une souche a été modifiée par l'introduction du promoteur Pcry3A et du stabilisateur d'ARNm STAB-SD en amont de l'opéron krs de la souche Bt HD-73 Cry", et l'introduction de la séquence termcrylAc en aval du gène krsD. Dans ce contexte, le stabilisateur STAB-SD permet une augmentation d'environ 2096 de la production de kurstakine. Cet effet est même amplifié lorsque que le gène spoOA est délété chez cette souche (Cf Exemple 1.6). Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, on privilégie l'utilisation des souches Bt Cry' comportant un stabilisateur d'ARNm et, de manière préférée, les souches Bt Cry' comportant un stabilisateur d'ARNm et une déiétion du gène spoOA.
Les inventeurs ont également montré pour la première fois que l'introduction de la séquence termcrylAc permet à elle seule une augmentation de la production (Cf Exemple 1.8). Ainsi, dans un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, la séquence termcrylAc peut être utilisée pour augmenter l'expression d'un gène et de la protéine associée, en particulier en stabilisant PARNm correspondant.
Dans un mode de réalisation préféré, une souche selon l'invention est une souche exprimant la kurstakine, n'exprimant pas de toxine Cry et comportant une séquence termcrylAc située en aval du gène krsD. Cette combinaison avantageuse s'ajoute aux autres modifications génétiques précédemment décrites.
Les inventeurs ont également montré que la surexpression de la protéine KrsE présente un intérêt pour la production de kurstakine en milieu liquide. Ils ont ainsi participé à élucider le rôle de cette protéine en mettant en évidence l'effet de KrsE sur la libération de la kurstakine dans le surnageant de culture. A l'aide d'un système d'expression inductible, ils ont mis en évidence une augmentation de la production de kurstakine proche d'un facteur 20 lorsque KrsE est surexprimée (Cf Exemple 1.7).
Dans le cadre de la présente invention, la surexpression de protéine KrsE peut également être contrôlée par un promoteur constitutif tel que le promoteur du gène aphA3 (Trieu-Cuot P, Courvalin P., 1983. Gene 23:331-341 ; Dubois, T., et al., 2012. PLoS Pathog. 8: el002629), par un promoteur préférentiellement activé pendant la phase stationnaire comme le promoteur du gène nprR (Perchât, S., Dubois, T. et al., 2011.. Mol. Mlcrobiol. 82: 619-633} ou encore un promoteur inductible comme le promoteur inductible par le xylose (Slamti, L. and Lereclus, D., 2002. EMBO J. 21: 4550-4559).
En particulier, il est préconisé pour obtenir une souche exprimant fortement la kurstakine en interne et capable de l'excréter dans le surnageant de culture d'introduire une séquence termCrylAc en plus de la surxpression de KrsE.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention consiste à utiliser une souche bactérienne, de préférence une souche Bt, n'exprimant pas de toxine, comportant un stabilisateur d'ARNm et surexprimant le gène krsE.
Une telle souche est par exemple Bt HD-73 Cry
Cette souche peut en outre comporter une séquence termcrylAc comme dans la souche Bt HD73
Afin d'améliorer encore le transport de la kurstakine vers le surnageant de culture, deux autres éléments pouvant être impliqués dans la maturation de la kurstakine peuvent être surexprimés concomitamment à la surexpression du gène krsE : il s'agit des gènes sfp et krsD qui codent respectivement pour une phosphopantéthéinyltransférase et une thioestérase.
La séquence de protéine Sfp correspond à la SEQ ID NO. 5.
La séquence de la protéine KrsD correspond à la SEQ ID NO. 6. Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention consiste à utiliser une souche Bt n'exprimant pas de toxine, comprenant un stabilisateur de l'ARNm de l'opéron krs et la surexpression du gène krsE et comportant en outre une inactivation du gène spoOA. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la souche Bt comprend également un promoteur P^ à la place du promoteur endogène de l'opéron krs et une séquence terminatrice termcrylAc en aval de l'opéron krs, et surexprime les gènes sfp et krsD. En vue de l'industrialisation du procédé, et selon un mode de réalisation préféré de l'invention, une souche d'intérêt est une souche HD1 ayant perdu les plasmides porteurs des gènes cry et comprenant la construction génétique capable d'Induire la plus forte expression de kurstakine dans le milieu de culture. Un troisième objet de l'Invention consiste en un procédé de production de kurstakine consistant à cultiver une souche bactérienne génétiquement modifiée conformément à l'invention, en milieu liquide et à récupérer la kurstakine produite dans le surnageant
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la souche bactérienne selon l'invention est cultivée dans un milieu de culture liquide et la kurstakine est récoltée dans le milieu de culture. Ce milieu liquide peut être optimisé afin d'augmenter encore la concentration de la protéine dans le surnageant, notamment en diminuant sa dégradation au cours du temps. Il peut s'agir en particulier du milieu AK tel que décrit par Hathout et al. (2000). Le temps de culture est adapté en fonction de la cinétique de production propre à chaque souche, ce qui est à la portée de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de production de kurstakine en milieu liquide consiste à cultiver une souche bactérienne surexprimant KrsE. En effet, les inventeurs ont démontré que la surexpression de KrsE est déterminante pour promouvoir une excrétion efficace de KrsE dans le milieu de culture.
Ainsi parmi les souches génétiquement modifiées selon l'invention, on choisira de préférence une souche exprimant KrsE pour une production de kurstakine en milieu liquide.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de production de kurstakine comprend en outre une étape d'extraction en continu par mlcroffltration. Dans un mode de réalisation préféré, cette étape d'extraction est suivie du transfert de la kurstakine ainsi obtenue dans un milieu dont le pH est inférieur à 4, de préférence Inférieur ou égal à 2. Un tel procédé permet de préserver l'activité de la kurstakine au cours du temps. Il est par exemple possible de conserver l'activité du Hpopeptide pendant plusieurs jours à 37ºC dans un milieu à pH 2, alors que l'activité est perdue si le lipopeptide était conservé dans un milieu dont le pH est supérieur ou égal à 4.
Ce procédé en milieu liquide a l'avantage de ne pas nécessiter d'extraction du lipopeptide à partir des cellules bactériennes. Le lipopeptide est simplement récolté dans le surnageant de culture, puis purifié par deux étapes d'ultrafiltration membranaire, la première sans solvant et la deuxième en présence d'un solvant (par exemple éthanol, méthanol...). L'utilisation d'un procédé de production en milieu liquide permet une montée en échelle afin d'augmenter les quantités de molécules produites en vue de l'industrialisation du procédé.
Ce procédé constitue le premier procédé de production de kurstaklne à visée commerciale.
Un quatrième objet de la présente invention consiste en l'utilisation de la kurstaklne en tant qu'agent anti-fongique à rencontre des souches Galactomyces geotrichum et Botrytis dnerea.
En effet, les inventeurs ont testé f effet anti-fongique de la kurstakine sur différentes souches de champignons. Ils ont ainsi confirmé les propriétés antifongiques de ce lipopeptide sur Stachybotris charatum et démontré son effet sur deux autres souches phytopathogènes : Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea. Un cinquième objet de la présente invention consiste en l'utilisation de la kurstakine en tant que biosurfactant pour améliorer la dispersion de souches de Baclttus thuringiensis utilisées comme biopesticide.
Les bactéries Bt exprimant la toxine Cry (Cry+) constituent le biopesticide de loin le plus utilisé au monde en agriculture. Afin de faciliter la dispersion et augmenter la persistance de ces souches dans la rhizosphère ou la phyilosphère, il est proposé d'utiliser la kurstakine, notamment la kurstakine recombinante telle que produite selon l'invention, en tant que biosurfactant.
Les modes de réalisation décrits dans cette demande et les exemples qui suivent ne sont donnés qu'à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Carte des constructions utilisées pour la préparation des souches surproductrices de kurstakine. 1A : insertion de en amont de krsA, et de termcrylAc en aval de
krsD. 1B : carte du plasmide carte du plasmlde
krsD
Figure 2 : Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine par différentes colonies de B. thuringiensis. 2A Analyse de la production de kurstakine par une colonie de B. thuringiensis HD-73 cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 30"C. Une colonie a été reprise dans 20 μL de matrice HCCA, le mélange ayant été ensuite brièvement centrifugé. L'analyse est réalisée sur le surnageant contenant les molécules récupérées de la surface des cellules. Le tableau rappelle les valeurs m/z des adduits H*, Na* et K* des différentes formes observées. 2B : Analyse de la production de kurstakine par une colonie de B. thuringiensis Bt407 cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 30ºC. Une colonie a été reprise dans 20μί de matrice HCCA, le mélange ayant été ensuite brièvement centrifugé. L'analyse est réalisée sur le surnageant contenant les molécules récupérées de la surface des cellules. Le tableau rappelle les valeurs m/z des adduits H*, Na*et K* des différentes formes observées. Figure 3 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC. 3A :
Chromatogramme HPLC de 20μί d'un extrait liquide enrichi en kurstakine produite par Bt HD-73 en milieu AK agar après 1 nuit à 37"C et 3 jours à température ambiante selon le protocole décrit par Hathout et al (2000). La kurstakine présente 4 pics à 9,97, 11,65, 11,97 et 13,12 minutes d'analyse. La séparation est effectuée sur une colonne Kinetex C8, avec un gradient de concentration en acétonitrile de 30 à 7096 de 0 à 25 minutes. 3B : Comparaison du profil de chromatogramme HPLC obtenu lors de cette étude pour la production de kurstakine par la souche B. thuringiensis HD-1 sur milieu AK agar(A) avec l'analyse réalisée lors de la découverte de la kurstakine B (Hathout et al., 2000).
Figure 4 : Analyse par spectrométrie de masse MALOI-TOF de la production de kurstakine. Analyse des pics aux temps de rétention compris entre 9 et 14minutes lors de l'analyse HPLC de l'extrait de kurstakine produit par B. thuringiensis HD-73 sur milieu AK agar.
Figure 5 : Taux de production de kurstakine. Analyse réalisée sur milieu AK agar après 1 nuit à 37"C et 3 jours à température ambiante par les souches de Baa'Hus thuringiensis HD-1, HD-73 et Bt407. Figure 6 : Croissance de la souche Bt HD-73. Expérience réalisée en milieu liquide LB et AK à 30°C, 160 rpm.
Figure 7 : Mesure de la concentration en kurstakine. Analyse du surnageant de culture de la souche Bt HD-73 cultivée en milieu LB et AK à 24 et 72H.
Figure 8 : Courbe de croissance de la souche Badllus thuringiensis HD-73. Expérience réalisée en fermenteur de 3L en milieu LB.
Figure 9 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC
Chromatogramme de l'extrait réalisé à partir du culot cellulaire de Bacillus thuringiensis HD-73 après 8H de culture en fermenteur en milieu LB à 30ºC. Figure 10 : Analyse par spectrométrie de masse MALOI-TOF de la production de kurstakine.
Analyse du composé récolté après séparation par HPLC provenant de l'extrait cellulaire réalisé sur un culot de B. thuringiensis HD-73 après 8H de culture en milieu LB à 30ºC
Figure 11 : Analyse quantitative de production de kurstatine par chromatographie HPLC Chromatogramme de l'extrait réalisé à partir du culot cellulaire de Bacillus thuringiensis HD-73 après 9H de culture en férmenteur en milieu LB à 30ºC.
Figure 12 : Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine.
Analyse des composés récoltés après séparation par HPLC provenant de l'extrait cellulaire réalisé sur un culot de 0. thuringiensis HD-73 après 9H de culture en milieu LB à 30*C. Figure 13 : Cinétique de production de kurstakine. Analyse réalisée en milieu AK agar et LB gélosé (LBg) par la souche Bacillus thuringiensis HD-73.
Figure 14 : Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine.
Analyse d'une colonie de la souche Bt407AspoOA cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37ºC. Figure 15 : Spectre de masse MALDI-TOF de la production de kurstakine chez des souches Bt407.
15A : Analyse réalisée sur une colonie de la souche Bt407Cry+ cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37ºC. 15B : Analyse réalisée sur une colonie de la souche Bt407Cry- cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37"C.
Figure 16 : Effet de la perte du plasmide portant les gènes cry chez la souche Bt HD-73 sur la production de kurstakine. Le dosage HPLC a été réalisé à partir d'extraits cellulaires de cellules cultivées sur milieu AK agar pendant 1 nuit à 37'C et 3 jours à température ambiante et purifiée surSPE C8.
Figure 17 : Taux de production de kurstakine après insertion d'un stabilisateur de l'ARNm en amont du locus krs. Expérience réalisée sur milieu AK agar après 1 nuit à 37"C et 3 jours à température ambiante chez les souches Bt HD-73 Cry- et Bt HD-73 Cry-STAB-SD.
Figure 18 : Effet de la surexpression du gène krsE sur la courbe de croissance de la souche 0. thuringiensis HD73. Expérience réalisée avec la souche Bt HD73 krs STAB-SD pHT1618T- en milieu LB liquide avec ou sans addition de xylose à 20 mM. Figure 19 : Dosage de kurstakine dans les surnageants de culture de la souche Bt surexprimant la protéine KrsE. Dans cette expérience, B.thuringiensis HD73 krs
est cultivée en milieu LB et LBxyl. La concentration du lipopeptide, évaluée par dosage HPLC, est exprimée en mg/L Figure 20 : Test d'activité antifongique d'extraits purifiés de kurstakine.20A : Effet antifongique contre la souche Rhizoctonia solani. 20B: Effet antifongique contre la souche Fusarium oxysporum. Les quantités indiquées correspondent à la quantité de lipopeptide présente sur le disque. Le témoin négatif est composé d'acétonitrite à 3096.
Figure 21 : Test d'activité antifongique d'extraits purifiés de kurstakine.21A : Effet antifongique contre la souche Galactomyces geotrichum après 3 jours (A) et 5 jours d'incubation (B) ; 21B : Effet antifongique contre la souche Botrytis cinerea après 5 jours (A) et 7 jours d'incubation (B). Les quantités indiquées correspondent à la quantité de lipopeptide présente sur le disque. Le témoin négatif est composé d'acétonitrite à 30%.
MATERIELS ET METHODES
1. Souches microbiennes utilisées
1.1 Description des souches
Les souches de Bacillus thuringiensis (Bt) utilisées lors de cette étude ont été fournies par l'équipe MICALIS de l'INRA de Jouy-en-Josas. Ce sont, d'une part des souches sauvages isolées de l'environnement, et, d'autre part, des souches modifiées génétiquement pour l'étude de l'effet de différents facteurs sur la production de kurstakine par Bt.
Tableau 1 : Liste des souches de Bacillus thuringiensls utilisées dans le cadre de l'étude du mécanisme de production de la kurstakine
Les souches sont mises en culture dans 5 mL de milieu de culture LB liquide à 37'C, agitées sur un agitateur rotatif à 160 rpm jusqu'à l'obtention d'une DOexmm de 1. La culture est alors répartie dans des cryotubes de 1 mL selon les proportions suivantes : 0,3 mL de glycérol pour 0,7 mL de culture. Les cryotubes ainsi obtenus sont directement mis au congélateur à -80"C pour le stockage de longue durée des souches bactériennes. 2. Milieux de culture
2.1. Milieu LB
Le milieu de culture Luria Bertani (LB) est un milieu complexe classiquement utilisé pour la mise en culture des souches bactériennes, il est composé de tryptone, 10 g/L ; extrait de levure, 5 g/L ; NaCI, 10 g/L. Les composants sont solubilisés dans 800 mL d'eau déminéralisée, le pH est ensuite ajusté à 7,0 et le volume est complété à 1 L. Ce milieu peut être solidifié (milieu LGg) par l'addition d'agar (15 g /L). Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121ºC pendant 15 minutes.
2.2. Milieu 863
Le milieu 863 est un milieu utilisé pour la mise en culture des souches de levures utilisées pour les manipulations de biologie moléculaire. La composition du milieu 863 est la suivante : glucose, 10 g/L ; extrait de levure 10 g/L ; peptone de caséine, 10 g/L. Le milieu géiosé 868 peut être préparé en ajoutant de Pagar (15 g/L). Le milieu est stérilisé par autoclavage à 121'C pendant 15 minutes.
2.3. Milieu AK agar #2
Le milieu AK agar #2 (Beckton, Dickinson, Etats-Unis) est un milieu acheté prêt à l'emploi utilisé pour la sporulation des souches de Bacillus. La composition approximative indiquée par le fournisseur est la suivante : peptone de gélatine, 6 g/L ; peptone de caséine, 4 g/L ; extrait de levure, 3g/L ; extrait de bœuf, 1,5 g/L ; glucose, 1 g/L ; agar, 15 g/L ; sulfate de manganèse II, 0,3 g/L Le milieu est préparé en solubilisant 30,8 g de milieu dans 1 L d'eau déminéralisée, et est stérilisé par autoclavage à 121'C pendant 15 minutes. 2.4. Milieu AK liquide
Le milieu AK liquide est identique au milieu AK agar décrit ci-dessus à la différence qu'il ne contient pas d'agar.
2.5. Milieu PDA
Le milieu PDA (Potato Dextrose Agar, Bfokar Diagnostics) est le milieu utilisé pour la mise en culture des souches de moisissures et pour les tests d'activité antifongique. La composition du milieu est la suivante : extrait de pommes de terre, 4 g/L ; glucose, 20 g/L ; agar, 15 g/L Le milieu est préparé en solubilisant 39 g de milieu dans 1 L d'eau déminéralisée et est stérilisé par autoclavage à 121"C pendant 15 minutes. 3. Construction des souches surproductrices de kurstakfne
Les différentes étapes pour la construction de souches surproductrices de kurstakine sont les suivantes : délétion du gène spoOA, insertion d'un promoteur fort (Agaisse H. and Lereclus D. 1994, J Bacterioi 176: 4734-4741) et d'un stabilisateur de l'ARNm STAB-SD (Agaisse H. and Lereclus D. 1996, Molecular Microbiology 20: 633-643) en amont du locus krsEABC, insertion d'un terminateur fort (termcrylAc) stabilisant l'ARNm en aval de ce locus, transformation de ta souche par un plasmide permettant la surexpression du gène krsE codant pour le transporteur de la kurstakine KrsE, et des gènes sfp et krsD, dont les produits permettent le recyclage du complexe enzymatique impliqué dans la synthèse du lipopeptide. Les souches 407, HD1 et HD73 sont des souches naturelles. Les souches 407 Cry', HD73 Cry" et 407 Cry" àspoOA ont été obtenues et publiées précédemment (Du C, Nickerson K.W. 1996, Appl Environ Microbiol 62: 3722-3726 ; Lereclus D. et ai, 1989, FEMS Microbiol Lett 60: 211-217 ; Lereclus D. et ai, 1995, Bio/Technology (N Y) 13: 69-71).
3.1 Délétion de spoOA
La délétion de spoOA dans la souche HD73 Cry est réalisée par insertion dans ce gène d'une cassette de résistance à la kanamycine, selon la méthode publiée précédemment (Yang H., et al. 2012, Appl Environ Microbiol 78: 6466-6474). La souche obtenue est nommée HD73 Cry' AspoOA.
3.2. Insertion de et de STAB-SD
L'insertion de et de STAB-SD (SEQ ID NO. 2) en amont de krsEABC (Figure 1) est réalisée par
échange allélique en utilisant une construction génétique portée par le vecteur suicide pMAD. et STAB-SD sont situés en contiguïté sur une même séquence d'ADN, amplifiée par PCR à partir du plasmide pHT7830 (Agaisse H. and Lereclus D., 1994, Molecular Microbiology 13: 97- 107) en utilisant les amorces stabSD-fwd et stabSD-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xmal et EcoRI aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 577pb. Les régions situées en amont et en aval du promoteur de krsE sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73 à l'aide des amorces (krs-up-fWd, krs-up-rev) pour la région amont (960pb), et (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) pour la région aval (084pb). Les sites de restriction (Ncol, Xmal) sont introduits en 5' et 3' dans la région amont, et (EcoRI, BamHI) en 5' et 3' dans la région aval. Les fragments amont, Pcry3A-stabSD et aval sont digérés et ligaturés au niveau de Xmal et EcoRI. Cette construction est amplifiée par PCR et traitée par la T4 poK/nucléotide kinase (phosphorylation des extrémités 5* et 3' du fragment en blunt ends). Le fragment phosphorylé est inséré dans le plasmide pMAD au niveau du site Smal, après déphosphorylation par la phosphatase alcaline des extrémités du plasmide ouvert, pour obtenir le plasmide
STAB-SD. Ce plasmide est transféré dans les souches HD73 cry" et HD73 cry" AspoOA par électroporation. La souche ayant intégré le plasmide est ensuite cultivée successivement à 30" et 37" pour sélectionner une double recombinaison homologue (Lereclus 0. et al., 1992, Bio/Technology, 10: 418-421). Les clones ayant intégré au niveau chromosomique cette construction sont sélectionnés par PCR sur colonie et l'insertion correcte de est vérifiée par séquençage. Les souches obtenues sont la HD73 et la HD73
3.3. Insertion de termcrylAc
L'insertion de termcrylAc en aval de krsD (Figure 1} est réalisée par échange allélique en utilisant une construction portée par le vecteur suicide pMAD. La séquence nucléotidique du terminateur 'termcrylAc' du gène crylAc (SEQ 10 NO. 3) est amplifiée par PCR à partir de f'AON du plasmide pHT73 (Liu G., et al. 2013, Génome Announc 1: e0008013), en utilisant les amorces termcry-fwd et termcry-rev (Tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xbal et Pstl aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 222pb. Les séquences du gène krsD d'une part, et de la région située en aval de ce gène d'autre part, sont amplifiées par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73 à l'aide des amorces (krs-up-fwd, krs-up-rev) pour la région amont (936pb), et (krs-dn-fwd, krs-dn-rev) pour la région aval (I035pb). Les sites de restriction (BamHi, Xbal) sont introduits en 5' et 3' dans la région amont, et (Pstl, Ncoi) en 5' et 3' dans la région aval. Les fragments amont, termcrylAc et aval sont digérés puis ligaturés au niveau de Xbal et Pstl. Cette construction est amplifiée par PCR, digérée par BamHI et Ncol et ligaturé au plasmide pMAO ouvert par les mêmes enzymes. Le plasmide pMAD-termcrylAc, est transféré dans la souche HD73 cry' AspoOA krsA::Pcry3A-stabSD par électroporation. La souche ayant intégré le plasmide est ensuite cultivée successivement à 30* et 37" pour sélectionner une double recombinaison homologue (Lereclus D. et al., 1992, Bio/Technology, 10: 418-421). Les clones ayant intégré au niveau chromosomique cette construction sont sélectionnés par PCR sur colonie et l'insertion correcte de termcrylAc est vérifiée par séquençage. La souche obtenue est la HD73 Cry' AspoOA krsA::Pcry3A-stabSD krsD::termcrylAc.
3.4. Surexpression des gènes krsE, sfp et krsD
La surexpression des gènes krsE, sfp et krsD est obtenue par clonage de ces gènes derrière le promoteur inductible Pxyl, dans les plasmides à haut nombre de copies pHT1618 (Lereclus D. and Arantes 0. 1992, Mol Microbiol 6: 35-46) (figure 1B) et pHT315pxyl (Slamti L and Lereclus D., 2002, EMBO J 21: 4550-4559) (figure 1C). La séquence du gène krsE est amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de la souche HD73, en utilisant les amorces krsE-fwd et krsE-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites Xbal et Kpnl aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 1250pb. La séquence est ensuite digérée par ces enzymes puis ligaturée dans le plasmide pHT1618T ouvert par les mêmes enzymes. Le plasmide est
sélectionné chez E. coli pour sa résistance à l'érythromycine, vérifié par séquençage puis transféré par électroporation dans la souche HD73 Cry" AspoOA La souche obtenue est la HD73 Cry" spoOA pHT1618Tpxylξrsf.
Pour la surexpression des gènes krsE, sfp et krsD, les clonages suivants ont été réalisés : La séquence du gène krsE précédé de son promoteur est amplifiée par PCR à partir de l'ADN chromosomique de fa souche HD73, en utilisant les amorces pkrsE-fwd et pkrsE-rev (tableau 2). Ces amorces introduisent les sites BamHI et Xbal aux extrémités 5' et 3' de cette séquence de 1800pb. La séquence des gènes sfp et krsD, organisés en opéron, est amplifiée par PCR à l'aide des amorces sfpkrsD-fwd et sfpkrsD-rev. La séquence amplifiée, de taille 1500pb, possède les sites de restriction Xbal et Hindlll à ses extrémités 5' et 3'. Les deux séquences amplifiées sont digérées par les enzymes BamHI, Xbal et Hindlll puis sont ligaturées dans le plasmide pHT315pxyl ouvert par BamHI et Hindlll. Le plasmide est sélectionné chez E. coli pour sa résistance à l'érythromycine, vérifié par séquençage puis transféré par électroporation
4. Production de kurstakine
4.1. Production en milieu solide
Les souches de B. thuringiensis ont été cultivées sur milieux solides (AK agar ou LBg) pour la production de kurstakines selon le protocole décrit par Hathout et al. Une pré-culture d'une nuit a été réalisée dans du milieu LB liquide à 30°C, agitée à 160 rpm. Les boites de milieu gélosé sont alors ensemencées par inondation, et le surplus de pré-culture est éliminé. Les boites sont mises à incuber une nuit à 37ºC et 3 jours à température ambiante sur paillasse. Le prélèvement de la culture sur boite est réalisé après 24, 48, 72 et 120 heures de culture pour le dosage des lipopeptides. Le tapis bactérien s' étant développé sur les boites de milieu gélosé est récupéré au moyen d'un râteau, et repris dans une solution à 1 M KCI/0,5 M NaCI. La solution est homogénéisée au vortex, puis centrifugée à 10000 g pendant 10 minutes. Le culot est ensuite lavé 3 fois par un volume équivalent d'eau distillée. L'extraction est réalisée sur ces culots par ajout de solvant ACN/H20 90/10 (V/V), suivi d'une homogénéisation au vortex. La suspension est ensuite centrifugée à 3 000 g pendant 10 minutes, afin de séparer le surnageant, contenant les composants récupérés de la surface des spores, et le culot cellulaire. Le surnageant est ensuite directement traité par extraction en phase solide (SPE) pour l'extraction des kurstakines.
4.2. Production en milieu liquide
Pour les cultures bactériennes, une culture de réveil est réalisée dans 10 mL de milieu LB dans un tube à essai à partir d'un cryotube de la souche conservée à -80°C. Les cultures liquides de Bt sont réalisées à partir des cryotubes préparés précédemment. Une préculture est réalisée dans 100 mL de milieu de culture liquide correspondant au milieu utilisé pour la culture, à savoir milieu LB ou AK. La croissance de la pré-culture est réalisée dans les mêmes conditions de température et d'agitation que la culture pour laquelle celle-ci a été préparée. Lorsque la pré-culture atteint une elle est utilisée pour ensemencer la culture pour
atteindre une initiale égale à 0,2.
4.3. Purification
La purification des kurstakines est effectuée par SPE sur colonnes C8 adaptées sur un extracteur sous vide Alltech Vacuum 12-port Manifold, au moyen d'une pompe Savant Gel Pump GP100. Les colonnes SPE C8 (Bond-Elut ir C8 lOOOMg) sont tout d'abord lavées et conditionnées par le passage de 20 mL d'ACN /0,1% TFA, puis 20 mL L'échantillon à analyser (5 mL
d'extrait cellulaire ou de surnageant de culture) est alors déposé sur la colonne et entièrement passé à travers la colonne. Un premier lavage est effectué avec 10 mL d'H20/0,l%TFA afin d'éliminer les sels et impuretés hydrophiles contenus dans l'échantillon. Un deuxième lavage est effectué par le passage de Les lipopeptides sont élués
par le passage de d'échantillon ainsi collectés
sont séchés au moyen d'un concentrateur rotatif sous vide. Les culots sont repris dans 300 uL afin d'être analysés en HPLC.
La mise au point de la purification de kurstakine par HPLC a été réalisée afin de permettre la purification du lipopeptide à partir de volumes importants d'extraits cellulaires de Bacillus thuringiensis ne pouvant être réalisée par colonnes SPE de faible volume. La purification a été réalisée au moyen d'une colonne en verre de 15 cm de hauteur pour 2 cm de diamètre remplie au moyen de phase BONDESIL-C8, 40μιη (Agitent Technologies). Les solvants sont pour la voie A de l'acétonitrile additionné de TFA à 0,1% (v/v) et pour la voie B de l'eau ultrapure contenant 0,1% de TFA (v/v). Un volume de 5 à 10 ml d'extrait de kurstakine concentré est injecté dans la colonne. La séparation des kurstakines est réalisée au moyen d'un programme en 4 phases basé sur le programme utilisé en HPLC : 25 minutes à 100% d'eau pour l'élution des contaminants hydrophiles, 20 minutes à 30% d'acétonitrile pour l'élution d'une partie des contaminants présentant une affinité avec ce solvant, 20 minutes de passage de solvant à 70% d'acétonitrile pour l'élution des kurstakines, et enfin 20 minutes à 100% d'acétonitrile pour le nettoyage de la colonne. La récolte de la kurstakine est réalisée au moyen d'un collecteur automatique pendant la phase d'élution à 70% d'acétonitrile.
4.4. Détection et quantification
L'analyse est réalisée au moyen d'une colonne Kinetex C8 (ref) sur un appareillage Waters (Online Degaser, 717 Autosampler, 660S Controller, 626 Pump, 2996 PhotoDiodeArray, Waters Corporation, Milford, MA, U.S.A.). La séparation des kurstakines est effectuée par un gradient linéaire d'acétonitrile additionné de 0,1% de TFA (solvant A) de 30 à 70% sur 25 minutes. La colonne HPLC subit ensuite un lavage pendant 5 minutes avec 100% de solvant A, puis 5 minutes de rééquilibrage à 30% du solvant A pour le passage de l'échantillon suivant. La détection des lipopeptides est effectuée par lecture de l'absorbance des liaisons amides à 214 nm. Le temps de rétention des pics obtenus et leurs dérivées secondes sont analysés au moyen du logiciel EMPOWER 2 Software. La quantification de la kurstakine est réalisée par comparaison avec l'aire de pics obtenus pour un standard de surfactine à 1 g/L analysé dans les mêmes conditions.
La standardisation des dosages de lipopeptides est réalisée en rapportant les quantités de lipopeptides mesurées à la masse sèche biologique à partir de laquelle la kurstakine a été extraite. Dans le cadre des analyses de production en milieu solide, les cellules sont récupérées après l'extraction sur SPE par reprise dans 5 mL d'eau déminéralisée et la suspension obtenue est déposée dans une coupelle en aluminium préalablement pesée et mise à sécher dans une étuve à 95*C pendant 48 h pour l'élimination totale de l'eau de l'échantillon. Après évaporation, la coupelle est à nouveau pesée pour déterminer la masse sèche de l'échantillon. 4.5. Spectrométrie de masse
La recherche des différents peptides synthétisés par S. thuringiensis est réalisée par spectrométrie de masse à partir de colonies bactériennes développées sur AK agar ou milieu LB gélosé pendant 24 et 48h. Une colonie est mise en suspension dans 25 μί de matrice HCCA (Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique). La suspension est homogénéisée au vortex pendant 10 secondes, centrifugée rapidement (short spin) à 5000 rpm pendant 5 secondes et le surnageant est déposé sur plaque pour analyse. L'acquisition des spectres de masse est réalisée au moyen d'un instrument MALDI-TOF-TOF UltraFlex II (Bruker Daltonics, Brème, Allemagne), équipé avec un laser Smartbeam, en mode réflectron positif. Un millier de spectres MALDI-MS ont été acquis à chaque position dans un champ de 500 à 2000 Da en utilisant une fréquence de laser de 20 Hz.
L'analyse des surnageants de culture et d'échantillons liquides est réalisée en mélangeant 10 μί d'échantillon avec 10 μί de matrice HCCA. Afin d'identifier les molécules recherchées, les pics correspondants aux adduits H*, Na* et K* de celles-ci sont recherchés.
5. Tests d'activité biologique
5.1. Souches de champignons
Afin d'évaluer le potentiel antifongique de la kurstakine, 4 souches de moisissures phytopathogènes ont été utilisées dans le cadre de tests d'activité. Ces souches ont été fournies par Monica Hôfte (Laboratoire de phytopathologie, Département de protection des cultures de l'Université de Gand, Belgique).
5.2. Test d'activité antifongique
L'activité antifongique des extraits de Bacillus thuringiensis enrichis en kurstakine est évaluée au moyen d'un test d'inhibition de croissance de différentes souches de moisissures et de levures sur boite en milieu solide. Les différentes moisissures à tester sont d'abord cultivées en déposant sur un milieu PDA gélosé un carré de gélose colonisée par ces souches (une souche /boîte de Pétri). Après inoculation, les différentes boîtes sont mises à incuber à 25'C jusqu'à la colonisation complète des boites. Un carré de gélose de chacune de ces souches sert à coloniser les boîtes utilisées pour le test antifongique. Celui-ci est réalisé en boites de Pétri contenant précisément 20ml de PDA. Des carrés de gélose colonisée sont découpés à partir des cultures précédentes et déposés à l'envers au centre des boites. L'incubation s'effectue à 25'C jusqu'à l'obtention d'un disque de culture d'I cm de diamètre. Des disques imprégnés d'extraits purifiés de kurstakines correspondant à 25, 50 et lOOug de lipopeptides sont alors déposés à 1cm du bord de la boite. Un témoin négatif est réalisé en déposant un disque imprégné du solvant dans lequel ont été repris les extraits de kurstakine (ACN/H2O 30/70 (v/v)). Les boites sont incubées à 25*C jusqu'à l'envahissement total de la boite par la souche de moisissure testée. L'effet antifongique de la kurstakine est observé par l'inhibition de la croissance de chaque souche autour des disques imprégnés en lipopeptide.
RESULTATS
1. Analyse de la production de kurstakine
1.1. Détection de la kurstakine produite par Bt HD-73 et Bt407
Afin de confirmer le potentiel de production de kurstakine par les souches Bt HD-73 et Bt407, une analyse en spectrométrie de masse des cellules est réalisée pour détecter le lipopeptide. En effet, la présence de gènes de synthétase ne signifie pas pour autant que la production du peptide ou lipopeptide associé sera effective. Ainsi, plusieurs souches de B. thuringiensis chez lesquelles les gènes de la kurstakine synthétase avaient été détectés ne présentent pas de production du lipopeptide lors d'une analyse par spectrométrie de masse. (Abderrahmani et al., 2011).
La production de kurstakine par la souche B. thuringiensis HD-73 a été analysée par spectrométrie de masse MALDI-TOF sur colonies cultivées sur milieu LB pendant 24 heures (Figure 2A).
Les différents pics détectés correspondent aux adduits H*, Na* et K* de la kurstakine portant un acide gras à 11, 12, 13 et 14 carbones, indiquant la production de ces 4 formes de lipopeptide par la souche B. thuringiensis HD-73.
L'intensité relative des groupes de pics semblent indiquer la production d'une forte majorité de kurstakine C13.
De la même manière, une analyse des formes de kurstakines produites par la souche B. thuringiensis Bt407 est réalisée par spectrométrie de masse dans les mêmes conditions (Figure 2B). La souche B. thuringiensîs Bt407 présente un profil de pics proche de celui de la souche B. thuringiensîs HD-73. Les addults H*, Na* et K* de la forme C13 sont majoritaires, et les pics des adduits des formes C12 et C14 ne sont que peu visibles. En revanche, seul l'adduit H* de la forme Cil peut être détecté. L'intensité des pics observés étant moins forte que celle obtenue avec ia souche B. thuringiensîs HD-73, le signal des pics correspondant aux autres adduits n'est sans doute pas suffisant pour se dégager du bruit de fond.
Ces expériences montrent que les deux souches analysées produisent un mélange similaire des formes Cil à C14 de la kurstaklne.
1.2. Analyse quantitative de la production de kurstaklne par différentes souches de B. thuringiensîs
Les gènes de la kurstaklne synthétase et la production de kurstakine ayant été observés chez différentes souches, l'identification de la souche présentant le meilleur taux de production en lipopeptide est nécessaire pour la sélection d'une souche d'intérêt blotechnofogique. Afin de déterminer ce potentiel, les taux de production de kurstakine de différentes souches sauvages de B. thuringiensîs et ont été évalués en réalisant le dosage HPLC d'extraits préparés à partir de cultures réalisées en milieu solide AK agar selon le protocole modifié cfHathout et al. décrit dans la section Matériels et Méthodes. Les souches sont cultivées sur le milieu AK agar une nuit à 37ºC et 3 jours à température ambiante. Après extraction et purification des lipopeptides sur colonne SPE C8, les échantillons sont analysés par HPLC permettant la séparation des différentes formes de ia kurstakine par une colonne greffée par de la phase C8 lors d'un gradient de solvant de 30 à 70% d'acétonitriie. La séparation des molécules est suivie par la mesure de rabsorbance à 214 nm. Un exemple de chromatogramme obtenu est présenté à la figure 3A.
L'analyse HPLC permet d'identifier 4 pics aux temps de rétentions 9,97, 11,65, 11,97 et 13,12 minutes. Les trois premiers pics présentent des intensités du même ordre de grandeur. Le pic à 13,12 minutes présente une intensité relativement plus importante.
Cette analyse est comparée avec les données de la littérature. La première analyse d'extraits de spores de Bt par HPLC a été réalisée en 2000 par Hathout et al. Elle a démontré que dans les conditions utilisées, la kurstakine est détectée par HPLC sous la forme de 4 pics entre 9 et 14 minutes d'élution (Figure 3B). La comparaison des résultats obtenus avec le premier chromatogramme de séparation des différentes formes de kurstakine avec les résultats obtenus lors de cette étude permet d'observer la présence du même massif de 4 pics entre 9 et 14 minutes d'élution.
De plus, une confirmation de la nature des pics observés est réalisée en récoltant le produit de l'élution à (a sortie du système HPLC entre 9 et 14 minutes. Après concentration de l'extrait par évaporation du solvant, le produit séché est repris dans un volume de 20 uJ de matrice HCCA pour une analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 4).
L'analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF des pics récoltés lors de l'analyse HPLC permet d'identifier les différents adduits H\ Nav et K+ les formes Cil à C14 de la kurstakine, confirmant ainsi que les pics détectés par HPLC correspondent aux différentes formes du lipopeptide.
L'utilisation de la technique HPLC permettant de détecter les différentes formes de kurstakines, le dosage de la production des lipopeptides par les souches B. thuringiensis HD-1, HD-73 et Bt407 a été réalisé selon le même protocole (Figure 5). Aucun standard de kurstakine n'étant disponible à ce jour, un standard de surfactine, possédant le même nombre de liaisons peptidiques que la kurstakine, a été utilisé pour réaliser cette quantification.
La souche B. thuringiensis HD-73 produit environ 6 ug de kurstakine par mg de matière sèche. A titre de comparaison la souche B. thuringiensis HD-1 produit entre 15 et 20 ug/mg de matière sèche. La souche B. thuringiensis Bt407 produit quant à elle lug/mg de matière sèche.
A la vue de ces résultats la souche B. thuringiensis HD-1 présente le taux de production de kurstakine le plus élevé parmi les souches testées, suivi de B. thuringiensis HD-73 et B. thuringiensis Bt407. Néanmoins, lors du début des travaux réalisés dans le cadre de cette étude, seuls les génomes des souches B. thuringiensis HD-73 et Bt407 avaient été séquencés et publiés. La souche HD-73 possédant le meilleur taux de production du lipopeptide entre ces deux souches, elle a été majoritairement utilisée pour l'étude des facteurs limitant potentiellement la production de kurstakine.
Plusieurs mutants réalisés à partir de la souche B. thuringiensis 407 étant également disponibles au début de cette étude, ceux-ci ont été également utilisés pour l'analyse de l'impact de certains de ces facteurs. 1.3. Cinétique de production de la kurstakine
Lors de la découverte de la kurstakine en 2000, ce lipopeptide avait été identifié à partir de spores de B. thuringiensis, obtenues après 4 jours de culture sur milieu de culture AK agar#2, milieu spécifiquement dédié à la production de spores bactériennes (Hathout et al., 2000). L'influence du milieu de culture sur la production de kurstakine a donc été étudiée dans le cadre de production en milieu liquide et en milieu solide.
- Production en milieu liquide
Dans le cadre de l'étude de la production en milieu liquide, la souche BT HD-73 est cultivée en milieu LB et AK liquide pendant 72 heures à 30ºC sous une agitation à 160 rpm. Le suivi de croissance est réalisé par mesure de l'absorbance à 600nm (Figure 6), et la production de kurstakine est réalisée sur chaque échantillon selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes.
La croissance de la souche Bt HD-73 est similaire dans les deux milieux de culture liquides testés. La souche est en phase exponentielle de croissance pendant environ 3 heures, puis est en phase de ralentissement de 3 à 24 heures de culture, moment à laquelle elle entre en phase stationnaire.
La cinétique de production en milieu liquide ne permet pas de quantifier de kurstakine par HPLC, aussi bien au niveau des culots cellulaires qu'au niveau des surnageants de cultures pendant les 8 premières heures de culture. En revanche, une quantification de kurstakine a pu être réalisée de façon plus tardive dans les surnageants de culture après 24h et 48h de culture (Figure 7).
Après 24 h de culture, la production de kurstakine en milieu AK atteint 5 mg/L dans le surnageant de culture. Après 72 h de culture, 3,7 mg/L sont mesurés. En milieu LB, 1 mg/L est mesuré après 24 h, mais la kurstakine n'est plus détectable après 72 h.
La culture en milieu liquide AK permet donc la production d'une quantité de kurstakine supérieure à celle d'une culture en milieu liquide LB.
Quel que soit le milieu de culture utilisé, la production de kurstakine semble suivre le même comportement, avec une impossibilité de détecter la molécule dans le surnageant pendant les premières heures de culture, une production détectable de quelques milligrammes par litre après 24h de culture, puis une diminution de la quantité de lipopeptides mesurée dans le surnageant après 72h. Dans le cadre des travaux réalisés, une première étude de fa production de kurstakine par B. thuringiensis en fermenteur a été menée. La souche B. thuringiensis HD-73 a été cultivée dans 3L de milieu LB pendant 24H en batch. La croissance de la culture a été suivie par mesure de l'absorbance à 600nm (Figure 8). Toutes les heures, un prélèvement de 20mL a été effectué, et le culot et le surnageant ont été analysés séparément après leur séparation par centrifugation.
Bacillus thuringiensis présente en fermenteur une phase de croissance exponentielle de 3 heures, et une phase de ralentissement de 2h.
Le prélèvement réalisé 8h après le début de la culture permet d'identifier par HPLC un pic correspondant à la kurstakine, avec un temps de rétention de 13 minutes environ, et un profil d'absorbance en UV similaire à celui observé lors des quantifications du lipopeptide réalisées précédemment (voir paragraphe 1.2.2) (Figure 9).
Afin de confirmer la nature des peptides élués lors de cette chromatographie, une récolte du pic a été effectuée, et l'échantillon a été concentré par réduction du volume à ΙΟμί final par séchage, puis additionné de ΙΟμί de matrice HCCA pour analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 10).
L'analyse par spectrométrie de masse permet d'observer la présence d'adduits de kurstakine de forme C13.
Après lh de culture supplémentaire, le profil HPLC observé est légèrement différent Deux pics sont observés en HPLC, à respectivement 12,6 et 13,6 minutes. Le profil de l'absorbance en UV est différent de celui du pic observé après 8h de culture (Figure 11).
Une collecte a été réalisée à l'issue de la séparation par HPLC de 12 à 14 minutes d'élution afin d'identifier les composés détectés. Le volume de l'échantillon prélevé est réduit à un volume de ΙΟμί final par séchage, et est mélangé à ΙΟμΙ de matrice HCCA pour l'analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 12). Après analyse par spectrométrie de masse, la présence de pics de rapport m/z 924,71, 946,71 et 962,70 peuvent être observés. Ces pics correspondent aux adduits H+, Na+ et K+ de la kurstakine C13 sous sa forme linéaire, indiquant la linéarisation partielle de la quantité de lipopeptide produit par B. thuringiensis HD-73 entre 8 et 9h de culture. - Production en milieu solide
Pour l'étude de la cinétique de production de kurstaklne en milieu solide, la souche HD-73 a été cultivée en milieu AK agar et LB gélosé pendant 5 jours. L'extraction, la purification et la quantification de kurstakine ont été réalisées selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes (Figure 13).
En milieu de culture solide la production de kurstakine présente également de grande variation en fonction de l'âge de la culture. Ainsi, après 9h de culture, la production de kurstakine atteint 5 μβ/mg de matière sèche en milieu AK agar. Après 24h et 32h de culture, le niveau de production mesuré est de 2 pg/mg de matière sèche environ. Enfin, le niveau de production à 96h et 120h est d'environ 8 ug/mg de matière sèche. Le maximum de production observé est donc atteint après 4 à 5 jours de cultures, soit le temps recommandé par le protocole décrit par Hathout et al.
En milieu LB, la production de kurstakine est d'environ 1 Mg/mg de matière sèche après 9h de culture, et atteint un maximum après 24h de culture, avec 2 ug/mg de matière sèche. La quantité de kurstakine diminue ensuite jusqu'à 0,5 ug/mg de matière sèche après 96h, puis s'établit à 2 ug/mg de matière sèche après 120h. Néanmoins, les imprécisions de mesures liées aux faibles quantités de molécule détectée ne permettent pas d'établir de différence significative des mesures entre les différents temps de culture pour ce milieu.
Ces résultats montrent que la quantité de kurstakine produite est supérieure lorsque les souches Bacillus thurungiensis sont cultivées dans un milieu optimisé AK par rapport à une culture en milieu classique LB également en condition de culture en milieu solide.
1.4. Etude de la relation entre la sporulation de Bt et la production de kurstakine
La production de kurstakine a été, depuis la découverte de cette molécule, associée au phénomène de sporulation de β. thuringiensis. Cela est notamment dû à l'état physiologique des cellules utilisées lors de la découverte du lipopeptide. Afin d'en savoir plus sur la relation entre la production de kurstakine et la sporulation des cellules, la capacité de production du lipopeptide par la souche Bt ACHbspoOA a été étudiée. Cette souche dont le gène spoOA, codant pour un activateur des gènes liés à la sporulation, a été Interrompu est donc incapable de sporuler ou même de s'engager dans le processus de sporulation (Lereclus, et al., }., 199S. Nature Bio/Technology, 13: 67-71). Pour cela, une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a été réalisée sur une colonie cultivée sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 37*C (Figure 14). L'analyse par spectrométrie de masse F permet d'identifier les adduits H* Na* et K* de
la kurstakine C12 et C13. Les pics correspondants aux formes Cil et C14 ne sont pas détectés. Il est néanmoins difficile de déterminer s'il s'agit d'une réelle absence de production de ces deux formes, ou de l'effet de la limite de détection par l'appareil. Les résultats démontrent que la souche A produit de la kurstakine malgré la délétion
de l'activateur transcriptionnel principal de la sporulation chez S. thuringiensis. Cela indique que la sporulation des cellules de Bt n'est pas nécessaire à la production de kurstakine.
1.5. Effet de l'inactivatîon de la production de toxines de B. thuringiensis sur la production de kurstakine
La production de toxines protéiques sous forme de cristaux est l'une des particularités métaboliques les plus importantes de 8. thuringiensis. Il a été décidé de tester si la suppression de cette activité de synthèse pouvait donc avoir un effet bénéfique sur la production de kurstakine.
L'effet de l'élimination du plasmide portant les gènes permettant la production de cristaux protéiques toxiques par les souches de Bt a donc été étudié au moyen de deux souches modifiées : Bt 407 Cry- et Bt HD-73 Cry-.
- Analyse qualitative
Dans un premier temps, l'analyse des produits des différentes souches a été réalisée par spectrométrie de masse MALDI-TOF à partir de colonies cultivées sur milieu LB gélosé pendant 24 heures à 30*C (Figure 15A). La souche Bt 407 sauvage présente les pics des adduits des kurstakines en Cil, C12, C13 et C14. L'analyse a été réalisée dans les mêmes conditions pour la souche Bt407 Cry- chez laquelle le plasmide portant les gènes cry a été supprimé (Figure 15B).
Les kurstakines de forme Cil à C14 sont retrouvées sur les cellules de la souche Bt407 Cry-.
Les souches Bt407 sauvage et Bt 407 Cry- produisent donc les mêmes formes de kurstakine, indiquant que la suppression du plasmide portant les gènes responsables de la production de toxines n'entraine pas de modification qualitative des formes de kursakine produites.
Afin de confirmer ce résultat, les produits de la souche sauvage B. thuringiensis HD-73 et de la souche modifiée B. thuringiensis HD-73 Cry- chez laquelle le plasmide portant les gènes de production de toxine a été supprimé ont été analysés dans les même conditions. La perte du plasmide portant les gènes permettant la production de cristaux protéiques toxiques n'a pas d'effet majeur sur la variété de kurstakine produite par les souches de Bt, les mêmes formes de la molécule étant retrouvées dans la souche sauvage et la souche curée du plasmide.
- Analyse quantitative L'effet de l'élimination du plasmide portant les gènes de production de toxines sur la production de kurstakine par B. thuringlensis a également été analysé quantitativement par un dosage de la production du lipopeptide par HPLC. Ce dosage a été réalisé à partir d'extrait cellulaires réalisés selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes après culture des souches sur milieu AK agar pendant 1 nuit à 37"C puis 3 jours à température ambiante (Figure 16). La souche sauvage Bt HD-73 présente un niveau de production de kurstakine d'environ 6 ug/mg de matière sèche. Après la perte du plasmide, la souche produit environ 18 ug/mg de matière sèche. Pour la souche Bt 407, la perte du plasmide permet l'augmentation de la production de 1 à 5 ug/mg de matière sèche.
L'élimination du plasmide a ainsi un effet positif sur la production de kurstakine d'un point de vue quantitatif, avec une augmentation du taux de production de lipopeptide ramené à la matière sèche d'un facteur 3 à 5 en fonction de la souche.
Dans la perspective de produire la kurstakine à l'échelle industrielle, la meilleure construction sera introduite dans une souche HD1 ayant perdu les plasmides porteurs des gènes cry.
1.6. Effet de l'augmentation de la stabilité de l'ARNm de la kurstakine synthétase sur la production de kurstakine
La stabilité des ARN messagers issus des gènes de production est essentielle à la production de la synthétase responsable de la production de la kurstakine. Un problème de stabilité des ARNm entraînerait une synthèse très faible du complexe enzymatique produisant le lipopeptide. L'importance de la stabilité de l'ARNm des gènes krsEABC a donc été évaluée ici par le dosage de la kurstakine par les souches Bt HD-73 Cry- STAB-SD et Bt HD-73 Cry- spoOA STAB-SD chez lesquelles la séquence STAB-SD a été intégrée en amont du gène krsE. Cette séquence de type Shine-Dalgarno présente en amont du gène de toxine cry3A a été identifiée chez B. thuringlensis comme agissant en tant que stabilisateur d'ARNm. La séquence STAB-SD minimale permettant de stabiliser l'ARNm situé en aval correspond à la SEQ ID NO. 1. Cette séquence peut être placée entre n'importe quel promoteur et la séquence du gène d'intérêt. L'Insertion de cette séquence en amont de krsE pouvait donc permettre d'augmenter la stabilité de l'ARNm de la kurstakine synthétase. Les différentes souches modifiées ont été cultivées sur milieu AK agar et utilisées pour la préparation d'extraits cellulaires selon la méthode décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Les résultats de production de ces souches et des souches mère correspondantes sont présentés dans la Figure 17. La souche Bt HD-73 Cry- produit 18,2 pg de kurstakine par mg de matière sèche. L'introduction du stabilisateur STAB-SD chez la souche entraîne une augmentation de ia production à 21,7 ug/mg, soit une augmentation d'environ 2096.
L'effet de l'introduction du stabilisateur d'ARNm en amont du locus krs chez S. thuringiensis entraine donc une augmentation de la production chez la souche H073 Cry-. En revanche, cet effet semble proportionnellement plus important chez ta souche HD73 AspoOA.
1.7. Rôle du gène krsE dans le transport de la kurstakine
Le rôle du produit du gène krsE, dont l'analyse bioinformatique démontre une proximité avec la famille des protéines de transport de type Major Facilitator Superfamily (MFS-1), est à ce jour inconnu. Néanmoins, la prédiction de son activité suggère l'implication de la protéine KrsE dans le transport de la kurstakine. Afin de déterminer le rôle joué par cette protéine dans la synthèse de la kurstakine, l'effet de la surexpression du gène krsE sur la production de kurstakine a été étudié lors d'une culture en milieu liquide. Une souche HD73 krs :: STAB-SD pHT1618T-pxylQkrsE a été utilisée pour l'évaluation de l'effet de la surexpression du gène krsE sur la production et le transport de kurstakine. Cette souche, chez laquelle le promoteur de la kurstakine synthétase est inductible par l'addition de xylose, a été cultivée en milieu LB liquide, en absence ou en présence de xylose à 20 mM (LBxyl), permettant l'induction de la transcription du gène krsE.
Les cultures liquides ont été réalisées dans 100 mL de milieu LB ou LBxyl en erlenmeyer de 500 mL, à 30ºC pendant 24 heures. Un prélèvement de 5 mL a été effectué toutes les heures pendant les 8 premières heures de culture. Un prélèvement de 5 mL a également été effectué après 24, 28 et 32 heures de culture. Pour chaque prélèvement, le culot et le surnageant ont été séparés par centrifugation à 5000g pendant 5 minutes, et l'extraction, la purification et l'analyse de la production de kurstakine ont été réalisés comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Les courbes de croissance de la souche H073 krs :: STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE cultivée en milieu LB en absence ou en présence de xylose à 20mM sont présentés dans la Figure 18. En milieu LB, la souche Bt HD73 krs :: STAB-SD pHT1618T-pxylOkrsE présente une phase exponentielle de croissance d'environ 3 heures. La souche entre ensuite en phase de ralentissement, jusqu'au début de la phase statlonnaire, à environ 10 heures de culture, atteignant une maximale de 6,0 après 32 heures de culture.
En milieu LBxyl, la souche présente le même profil de croissance au niveau de la phase exponentielle. Néanmoins, là où la souche présente une simple phase de ralentissement en milieu LB, la croissance en présence de xylose voit la de la culture chuter à partir de 6 heures de
cultures, et ce jusqu'à 10 heures, passant de 2,9 à 1,8. A 24 heures de culture, la souche cultivée en présence de xylose présente une plus faible qu'en milieu LB.
La suivi de la concentration de kurstakine présente dans le surnageant de culture de la souche dans les différentes conditions est présentée dans la Figure 19. En milieu LB, la concentration en kurstakine dans le surnageant de culture est relativement faible, voire impossible à évaluer par HPLC, étant inférieure au seuil de détection de l'appareil malgré l'étape de concentration réalisée sur colonne SPE. La concentration maximale mesurée est obtenue après 24 heures de cultures, avec 1,02 mg/L de kurstakine dans le surnageant de culture.
En milieu LBxyl, les concentrations mesurées dès les premières heures de cultures sont de l'ordre de 4,6 et 5,4 mg/L pour la première et la deuxième heure de culture respectivement. La concentration diminue ensuite progressivement jusqu'à la 7*"* heure de culture, avec une concentration de 0,1 mg/L de lipopeptide. A 8 heures de culture, la concentration mesurée augmente à 1,3 mg/L. Après 24 heures de culture, la concentration mesurée dans le surnageant de culture de la souche cultivée en LBxyl est de 18,46 mg/L. Ces résultats montrent une augmentation de la production de kurstatine dans le surnageant d'environ un facteur 18, à 24 heures de culture en milieu LB.
Cette expérience montre l'effet positif de la surexpression du gène krsE sur la production de kurstatine dans le surnageant en condition de culture en milieu liquide.
1.8. Effet de l'introduction d'une séquence terminatrice termcrylAc en aval du gène krsD
La séquence termcrylAc a été introduite dans différentes souches Bt selon l'invention afin d'étudier l'effet propre à cette séquence sur la production de kurstakine dans le milieu de culture. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4. Tableau 4 : Production de kurstaklne en milieu AK après 24h de culture
Ces expériences permettent une comparaison relative de la production de kurstakine dans le milieu de culture. Elles mettent en évidence le fait que les souches qui produisent le plus de kurstakine comportent la séquence termcrylAc (a. et b.). Ce résultat est surprenant du fait que ces souches sont meilleures productrices que la souche qui surexprime KrsE (e.) alors même que les inventeurs ont montré par ailleurs que la surexpression de KrsE est déterminante pour une bonne excrétion du lipopeptide dans le surnageant. Ces données mettent donc en évidence que l'introduction de la séquence termcrylAc est une modification génétique particulièrement intéressante pour augmenter la production protéique.
2. Tests d'activités biologiques de la kurstakine
Les lipopeptides de Bocillus possèdent une variété importante d'activités industriellement valorisâmes (antibactérienne, antifongique, surfactant...). A ce jour, une seule activité antifongique a été démontrée chez la kurstakine, contre la seule souche Stachybrotris chartarum. Le but de cette partie est d'évaluer les activités biologiques de la kurstakine, notamment en tant qu'antifongique et antibactérien.
2.1. Test d'activité antifongique
Afin de déterminer le potentiel d'utilisation de la kurstakine en phytoprotection, des tests d'activité antifongique sont réalisés à partir d'extraits purifiés en kurstakine. Chaque souche de moisissure sur laquelle l'effet de la kurstakine est testé est cultivée en milieu PDA à partir du centre de la boite de Pétri, et finoculum est entouré de disques contenant respectivement 25, 50 et lOOug de kurstakine. L'activité antifongique est évaluée par l'inhibition de la croissance des moisissures testées autour des disques contenant le lipopeptide. La souche Rhizoctonia solanii a pu se développer sur toute la surface de milieu gélosé PDA, en recouvrant également les disques imbibés d'extrait de lipopeptide (Figure 20A). La kurstakine n'a donc aucun effet antagoniste sur la croissance de la souche.
Comme pour Rhizoctonia solanii, la souche Fusarium oxysporum a pu croître sur toute la surface de la boite de Pétri et a recouvert les disques d'extrait de kurstakine (Figure 20B). Celle-ci n'a donc pas d'effet antagoniste contre F. oxysporum aux concentrations testées.
La souche Calactomyces geotrichum n'a pas colonisé toute la surface de la boite de Pétri. Trois jours après le dépôt de la moisissure, sa croissance a atteint le disque témoin et a commencé à le recouvrir. En revanche, un halo d'inhibition de croissance est visible autour de tous les disques contenant de la kurstakine. Après 5 jours de culture, la souche a totalement recouvert le disque témoin, mais n'a pas recouvert les disques contenant l'extrait de lipopeptide. De plus, une inhibition de croissance est visible du côté des disques opposés au centre (Figure 21 A). La kurstakine possède donc un effet antifongique sur la souche Galactomyces geotrichum.
La kurstakine est aussi active contre la souche Botrytis cinerea. En effet, après 5 jours de culture, un halo d'inhibition est visible autour des disques contenant de la kurstakine. Après 7 jours de culture, la souche a totalement recouvert le disque témoin, tandis qu'un halo d'inhibition de croissance d'un diamètre d'environ 1,5cm est visible autour des disques contenant du lipopeptide, et ce à toutes les concentrations testées (Figure 21B).

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche bactérienne génétiquement modifiée exprimant la kurstakine caractérisée en ce qu'elle n'exprime pas de toxine Cry et qu'elle comprend un stabilisateur d'ARMm STAB-SD introduit en amont du gène krsE.
2. Souche selon la revendication 1 dans laquelle le promoteur endogène de l'opéron kurstatine est remplacé par le promoteur du gène cry3A et une séquence terminatrice termcrylAc est introduite en aval du gène krsD.
3. Souche selon l'une des revendications 1 ou 2 dans laquelle le gène spoOA est inactivé.
4. Souche selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le gène krsE est surexprimé.
5. Souche selon la revendication 4 dans laquelle les gènes sfp et krsD sont surexprimés.
6. Souche selon l'une des revendications précédentes correspondant à une souche Bacillus thuringiensis.
7. Souche selon la revendication 6, choisie parmi Bt HD-1, Bt HD-73 et Bt 407.
8. Utilisation d'une souche telle que définie à l'une des revendications 1 à 7 pour la production de kurstakine.
9. Procédé de production de kurstakine caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche bactérienne génétiquement modifiée telle que définie à l'une des revendications 4 à 7 en milieu liquide et à récupérer la kurstakine dans le surnageant.
10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel ladite souche est cultivée dans un milieu AK.
11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10 comprenant en outre une étape d'extraction en continu par microfiltration.
12. Procédé selon la revendication 11 dans lequel la kurstakine ainsi obtenue est conservée dans un milieu dont le pH est inférieur à 4, de préférence inférieur ou égal à 2.
13. Utilisation de la kurstakine en tant qu'agent antifongique à fencontre des souches Galactomyces geotrichum et Botrytis cinerea.
14. Utilisation de la kurstakine en tant que biosurfactant pour améliorer la dispersion de souches de Bacillus thuringiensis utilisées comme biopesticide.
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