EP3338090A1 - Méthode individuelle prédictive des effets génotoxiques d'agents chimiques ou biochimiques, cassant l'adn - Google Patents

Méthode individuelle prédictive des effets génotoxiques d'agents chimiques ou biochimiques, cassant l'adn

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EP3338090A1
EP3338090A1 EP16763915.2A EP16763915A EP3338090A1 EP 3338090 A1 EP3338090 A1 EP 3338090A1 EP 16763915 A EP16763915 A EP 16763915A EP 3338090 A1 EP3338090 A1 EP 3338090A1
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EP
European Patent Office
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chemical
cells
biochemical
concentration
cell sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16763915.2A
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German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas FORAY
Mélanie FERLAZZO
Laurène SONZOGNI
Larry BODGI
Sandrine PEREIRA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Léon Bérard
Université Claude Bernard Lyon 1
Neolys Diagnostics SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Léon Bérard
Université Claude Bernard Lyon 1
Neolys Diagnostics SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Centre Léon Bérard, Université Claude Bernard Lyon 1, Neolys Diagnostics SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/709—Toxin induced

Definitions

  • the invention relates to the field of toxicology and more particularly to the field of genotoxicological laboratory methods.
  • the invention more particularly relates to a new predictive method of cellular toxicity after exposure to chemical agents that directly or indirectly break DNA (in particular certain metals, pesticides and certain active principles for chemotherapy) and which is based on the determination and cross-referencing of several parameters and cellular and enzymatic criteria.
  • DLBs double-strand breaks
  • Toxicity and cancer can be the consequences of various external agents such as physical agents (X-rays, particles, UV, heat), chemical agents (alkylating agents, certain active ingredients used in chemotherapy, certain metals), biological agents (such as some viruses or bacteria).
  • external agents such as physical agents (X-rays, particles, UV, heat), chemical agents (alkylating agents, certain active ingredients used in chemotherapy, certain metals), biological agents (such as some viruses or bacteria).
  • ionizing radiation is the external agent for which biological effects are best documented (Thomas et al., "Impact of dose-rate on the low-dose hyper-radiosensitivity and induced radioresistance response", International Journal of Radiation Biology, 89 (10) p813-822 (2013), Colin C.
  • ionizing radiation can break certain types of chemical bonds by generating free radicals (in particular by peroxidation) and other reactive species that cause DNA damage. Damage to DNA by endogenous or exogenous aggressions (such as ionizing radiation and free radicals) can lead to different types of DNA damage depending in particular on the deposited energy: base damage, single-strand breaks and double-strand breaks (DSBs).
  • Unrepaired CBD is associated with cell death, toxicity and more specifically radiosensitivity (in the case of exposure to ionizing radiation).
  • Badly repaired CBD is associated with genomic instability, mutagenicity, and susceptibility to cancer.
  • the body has specific repair systems for each type of DNA damage.
  • mammals have two primary modes of repair: suture repair (ligation of strands) and recombinant repair (insertion of a homologous or non-homologous strand).
  • suture repair ligation of strands
  • recombinant repair insertion of a homologous or non-homologous strand.
  • radiosensitivity is also true for susceptibility to cancer, and more particularly to radiation-induced cancer.
  • any excess of biological dose increases both the toxic risk and the carcinogenic risk. It would therefore be useful to have a predictive test method for determining the risk and excess of biological dose due to exposure to genotoxic DNA-breaking agents.
  • H2AX or pH2AX is used as a marker for the detection and repair of DNA damage, especially when using brittle agents.
  • the patent application WO 2014/152873 describes a method for quantifying the genotoxicity of active ingredients used in chemotherapy by quantifying the expression of histone H2AX.
  • Patent Application WO 2005/113821 describes the use of the pH2AX marker as a means of detecting double-strand breaks in DNA in methods for identifying the least toxic tobacco products. In these methods, the tobacco smoke is contacted with the cells for a predetermined time (15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes or one hour). The presence or absence of pH2AX foci is verified by immunofluorescence. However, this method concerns a cocktail of chemicals whose brittle agent is not exactly identified.
  • Patent application WO2005 / 1 13 821 (Vector Tobacco / New York Medical University) describes the use of the pH2AX marker to detect double-strand breaks in DNA and evaluate the toxicity of tobacco.
  • Another method that uses the H2AX expression level to detect double-stranded DNA breaks and evaluate the effectiveness of an anti-cancer agent is described in WO2014 / 152,873 (Pioma).
  • the present invention aims at providing a novel predictive method of the risk of toxicity related to exposure to DNA-breaking chemical agents.
  • the inventors have found, and the method according to the invention part of this observation, that the double-strand breaks (DSB) of the DNA are the most predictive damage of genotoxicity when they are not repaired on the one hand, and genomic instability when they are poorly repaired on the other hand.
  • CBD are supported by the majority mode of suture repair, and / or by the minority method of faulty repair called MRE1 1-dependent recombination. The balance between these two modes of repair is controlled by the ATM protein and constitutes the individual factor.
  • the pH2AX marker indicates a CBD site recognized by the suture repair mode.
  • the marker MRE1 1 indicates a CBD site that was supported by the MRE1 1 -dependent fault repair.
  • the pATM marker provides information on activation of the suture pathway by phosphorylation of H2AX and inhibition of the MRE1 1-dependent pathway.
  • the inventors have also observed a transfer of the cytoplasmic forms of the ATM protein into the cell nucleus following an oxidative-type stress, and in particular following a stress inducing CBD and producing an oxidation in the cytoplasm.
  • DNA repair after exposure to genotoxic stress, DNA repair must be taken into account, whose kinetics depend on the nature of the stress but also potentially on the nature of the impacted tissue. It is also known that the efficiency and speed of DNA repair varies from one individual to another, and that there are also particular genetic conditions that lead to exceptional sensitivity.
  • the problem is solved by a method based on:
  • the so-called reference control cells are cells considered as being resistant to the brittle stress considered, preferably they are chemical-induced and radiation-induced stress-resistant cells (eg Group I individual cells).
  • Commercial cells usually employed as controls can be used in genotoxicity studies such as, in particular, BR3 cell lines (Killalea et al., "Factors in post-dialysis CAPD fluid affecting 3H cholesterol and human skin fibroblasts", Biochemical Society Transactions p123S (1997), 149BR and MRC9 (Watanabe et al., “Comparison of lung cancer cells with gene expression expression using quantitative real-time PCR", Cancer Cell International 10 (2) p1-12 (2010)).
  • Other cells such as HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, and MRC5 can be used as reference control cells.
  • a first object of the invention is therefore a method for predicting the sensitivity of an individual to stress breaking DNA from a cellular sample derived from cells
  • a cell sample is prepared by dispersion and / or amplification of so-called reference cells (group I of sensitivity); applying several concentrations within a wide concentration range of said brittle agent (said concentration range, for example, from nM to mM) for a predetermined time (preferably 24 hours) on this cell sample; pH2AX immunofluorescence is carried out with DAPI counterstaining which also allows micronucleus analysis for all the applied concentrations on the same cell sample.
  • C ref is the concentration which gives:
  • a cell sample is prepared by dispersing and / or amplifying cells taken from the individual.
  • the reference concentration C ref defined above is applied to this cell sample for a predetermined duration (preferably 24 hours).
  • the pH2AX immunofluorescence assay is then determined with counterstaining with
  • Another subject of the invention is a method for evaluating the sensitivity of a tissue taken from an individual with the toxic effect breaking the DNA of at least one chemical or biochemical agent, or a combination of chemical and / or biochemical agents, comprising the following steps:
  • a working concentration is set for said at least one chemical or biochemical agent, or for chemical and / or biochemical agents included in said combination of chemical and / or biochemical agents;
  • step (c) dispersing and / or amplifying said cells to obtain a cell sample;
  • said cell sample is brought into contact with said at least one chemical or biochemical agent (or said combination of chemical and / or biochemical agents) in its working concentration defined in step (a), for a predetermined duration ;
  • step (e) The number of double-strand breaks in the DNA, and / or a biomarker representing this number, and / or the number of micronuclei are detected, knowing that steps (b), (c), (d) and ( e) must be executed one after the other, and that step (a) must be performed prior to step (e).
  • Said chemical agent may be, by way of example, a metal or non-metallic anion, a non-metallic cation, an organic anion, an organic cation, a zwitterionic compound, a neutral or neutral inorganic compound, a neutral or neutral organic compound an organometallic, an insoluble compound; said chemical agent may be present for example in dissolved form in a liquid medium (aqueous or non-aqueous), in the form of particles, in the form of nanoparticles, fixed on a cellular membrane, in gaseous form.
  • Said biochemical agent may be, for example, a peptide (recombinant or not), an antibody, an antigen, a virus (deactivated or not), a fragment of virus, a cellular fragment.
  • the method according to the invention further comprises a step (f) in which a diagnostic score is determined which represents said sensitivity of said tissue to the toxic effect breaking the DNA of said chemical or biochemical agent or said combination of chemical agents. and / or biochemical, using said number of double-strand breaks of the DNA (and / or the number of micronuclei) and said working concentration.
  • the detection of double-strand breaks in step (e) is advantageously using a technique selected from the group formed by immunofluorescence, cytogenetic examination, pulsed field electrophoresis.
  • At least one biomarker selected from the group consisting of: pH2AX, 53BP1, Phospho-DNAPK, MDC1 is detected in step (e).
  • the pH2AX biomarker is detected, and preferably the number and the size of the nuclear foci of said biomarker.
  • a counterstain is performed which locates the cell nuclei to quantify micronucleus (MN).
  • the working concentration is advantageously a reference concentration C ref previously determined.
  • the number of double-strand breaks in the DNA is determined by pH2AX immunofluorescence. and, after counterstaining with the DAPI, the number of micronuclei (MN) is detected, and then on said cell sample N pH 2Ax (24h, C ref ) and ⁇ ⁇ ⁇ (24 ⁇ , C ref ) are determined; if for the cell sample N pH 2Ax (24h, C ref ) ⁇ 2, or if ⁇ ⁇ ⁇ (24 ⁇ , C ref ) ⁇ 2%, then we conclude that the genotoxic risk is low and / or called "Group I "; if the cell sample to N P H2AX (24, C r e f)> 8, or ⁇ ⁇ ⁇ (24 ⁇ , C ref)> 10%, then it is concluded that the genotoxic risk is very high and / or said " Group III "; for all other cases
  • the working concentration is advantageously a reference concentration C ref previously determined. This determination is advantageously done by a process in which:
  • concentrations of the at least one chemical or biochemical agent to be tested said concentrations being chosen within a concentration range of said chemical or biochemical agent (said concentration range ranging for example from nM to mM) for a predetermined time (preferably 24h), knowing that each on a fraction of this cell sample;
  • the so-called reference cells are chosen from cell lines HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, and MRC5, BR3, 149BR and MRC9 and more particularly from cell lines 1 BR3, 149BR and MRC9.
  • t4 is a fixed value which represents the time for which the rate of DNA breaks reaches its residual value, and which must be at least 12 hours, and preferably between 12h and 48h, and which is even more preferentially about 24 hours. hours;
  • the mean number of micronuclei observed at times t per 100 cells [in%] is also determined on said cell sample (this average number being called N M N (t)), the times t being at least t0. (Not exposed to an absorbed biological dose D) and t4 after exposure with absorbed biological dose D.
  • FIG. 1 (A), (B) and (C) show the evolution of the number of pH2AX foci 24 h after contacting the cell sample with glyphosate (CAS No. 1071 -83-6) at a concentration given as a function of this concentration of glyphosate for fibroblast lines 1 BR3 ( Figure 1 (A)), 149BR ( Figure 1 (B)) and 04PSL ( Figure 1 (C)).
  • glyphosate CAS No. 1071 -83-6
  • FIG. 2 (A), (B) and (C) show the evolution of the number of pH2AX foci 24 h after contacting the cell sample with 5FU at a given concentration as a function of this 5FU concentration for fibroblast lines MRC9 ( Figure 2 (A)), 03HLS ( Figure 2 (B)) and GM02718 ( Figure 2 (C)).
  • the operator takes the patient a sample of tissue for the preparation of the cell sample.
  • tissue sample Preferably he biopsy samples a skin sample; this sampling can be advantageously done according to a method known as the "dermatological punch".
  • the tissue sample is placed in DMEM medium + 20% (sterile fetal calf serum).
  • the tissue sample is transferred without delay to a specialized laboratory, knowing that the sample should not remain more than 38 hours at room temperature.
  • the next step is the isolation and / or amplification of the sampled tissue.
  • the tissue sample (typically the biopsy) is established as an amplifiable cell line without a viral or chemical transformation agent following an ancillary procedure and well known to culture laboratories, such as the publication of EIkind et al. "The radiobiology of cultured mammalian cells ", Gordon and Breach (1967).
  • a cell sample is prepared: The cells are seeded on glass slides in petri dishes. Some of these lamellae are contaminated with metals or pesticides or any other chemical or biochemical agent that is brittle for DNA at different concentrations. Another part is not contaminated; it represents the spontaneous state. During contamination, the cells remain in the culture incubator at 37 ° C.
  • HEPES buffer solution 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid
  • the coverslips are then washed in phosphate buffered saline (known as PBS) before immunological staining. Incubation was carried out for 40 min at 37 ° C in PBS supplemented with 2% bovine serum albumin (known as BSA or fraction V, provided for example by Sigma Aldrich) and was followed by washing. to the PBS.
  • BSA or fraction V bovine serum albumin
  • the primary anti-pH2AX antibodies are used at a concentration of 1: 800.
  • Incubations with FITC anti-mouse or anti-rabbit TRITC secondary antibodies (1: 100, provided for example by Sigma Aldrich) are performed at 37 ° C in 2% BSA for 20 minutes.
  • the results are acquired from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model, for example).
  • the reading can be direct (typically by counting the foci on at least 50 cells in G 0 / Gi for each point) or by dedicated image analysis software, or on an automated microscope; of preferably the software or automated microscope methods are calibrated with manual determinations.
  • the invention is based inter alia on the use of data acquired for one of the two pH2AX markers on non-contaminated cells (spontaneous state) and contaminated.
  • the method is based on the study of the labeling by this marker for a given duration of contamination: the samples are marked after a determined lapse of time from the cessation of the contamination, and their immunofluorescence is studied.
  • pH2AX refers to the forms phosphorylated in serine 439 of the histone H2AX X variant which marks, according to the findings of the applicant, the number of double-strand breaks in the DNA (CBD) which are recognized by the majority repair mode and faithful, the suture.
  • the pH2AX marker is essentially nuclear in the form of only nuclear foci, and only the number and size of these nuclear foci will be analyzed.
  • DAPI a DNA marker known to those skilled in the art
  • the method according to the invention shows that the tissue sensitivity to a given metal varies depending on the tissue of interest. For example, astrocytes contaminated with 100 ⁇ l of aluminum have fewer breaks (HA cells, 2 foci of H2AX) compared to endothelial cells for the same concentration (HMEC cells, 3.7 foci of H2AX) (see Table 1).
  • HMEC cells endothelial cells for the same concentration
  • HMEC cells 3.7 foci of H2AX
  • the inventors have shown that there is a correspondence between the proposed single scale of toxicity and certain clinical signs described for example in the case of lead (lead poisoning) or in the case of cadmium (disease of Itai-ltai) (see table 3).
  • the method according to the invention also makes it possible to show that cells contaminated with copper have, for the highest concentration tested (1 mM), a number of breaks in the DNA visualized by H2AX foci ranging from 2 to 21 foci according to the cell type tested (see Tables 1 and 2).
  • the process according to the invention is so sensitive that it makes it possible to characterize the impact on a tissue of chemical agents that break DNA in very low concentrations, which are of the order of magnitude of the regulatory limit values.
  • these limit values are, for example, of the order of 2 mM (2 mg / L) for copper, 200 ⁇ M for aluminum, 5 ⁇ M for cadmium, 10 ⁇ M for Pb.
  • GROUP sensitivity groups
  • the cells were stored in the culture incubator at 37 ° C. 24h after contact with glyphosate at a given concentration as shown in Table 1, the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker was acquired. Acquisition of the results was performed from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model). The reading was carried out directly by counting the foci obtained with the pH2AX marker on at least 50 cells in G 0 / Gi for each point and by dedicated image analysis software (imageJ).
  • imageJ dedicated image analysis software
  • the reference concentration was determined for the 1 BR3 and 149BR skin control cell samples (see Table 1).
  • FIG. 1 represents the evolution of the number of acquired pH2AX foci per cell, 24 hours after the contacting of the control cells 1 BR3 (see FIG. 1 (A)) and 149 BR (FIG. glyphosate depending on the concentration of glyphosate used.
  • a cell sample of skin of a patient was taken by biopsy via the method of "dermatological punch" known to those skilled in the art.
  • the cell sample was then placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum.
  • the cell sample was then transferred without delay to a specialized laboratory so that the sample did not stay for more than 38 hours at room temperature.
  • the cell sample resulting from the biopsy was established in the form of a cell line amplified by 04PSL according to a procedure well known to the culture laboratories and to those skilled in the art: by using in particular the tryptic dispersion, the cells are again diluted in renewed medium and so on until the desired number of cells is obtained. After obtaining a sufficient number of cells (generally after one to three weeks), the first experiments were carried out using the method according to the invention.
  • the cells of the 04PSL line were seeded on glass slides in petri dishes. Part of these coverslips were then brought into contact with glyphosate at a concentration of 100 ⁇ . As a verification, another part of these lamellae was brought into contact with glyphosate at a given concentration (see Table 1, Figure 1 (C)).
  • the cells were stored in the culture incubator at 37 ° C. 24h after contact with glyphosate at a given concentration as shown in Table 1, the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker was acquired. The results were acquired from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model). The reading was carried out directly by counting the foci obtained with the pH2AX marker on at least 50 cells in G 0 / Gi for each point and by dedicated image analysis software (imageJ).
  • imageJ dedicated image analysis software
  • the number of pH2AX foci obtained for the 04PSL cell line is approximately 7; this figure validates the equation 2 ⁇ N pH 2Ax (24h) ⁇ 8. Therefore, for the 04PSL cell line, the genotoxic risk related to glyphosate is of "group II" or said intermediate.
  • the 04PSL line is chemosensitive.
  • the cells were stored in the culture incubator at 37 ° C. 24h after contacting with 5FU at a given concentration as shown in Table 2, the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker was acquired. The acquisition of the results was made from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model). The reading was carried out directly by counting the foci obtained with the pH2AX marker on at least 50 cells. for each point and by dedicated image analysis software (imageJ). In order to obtain results of sufficient statistical reliability to serve as a basis for a diagnosis, 3 sets of independent experiments were carried out.
  • FIG. 2 shows the evolution of the number of pH2AX foci acquired per cell, 24 hours after the contacting of the MRC9 control cells (see FIG. 2 (A)) with 5FU as a function of the concentration of 5FU employed.
  • the GM02718 cell line was amplified following the recommendations of the supplier (Coriell Institute) until the desired number of cells was obtained.
  • a cell sample of skin of a patient was taken by biopsy via the method of "dermatological punch" known to those skilled in the art.
  • the cell sample was then placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum.
  • the cell sample was then transferred without delay to a specialized laboratory so that the sample did not stay for more than 38 hours at room temperature.
  • the cell sample from the biopsy was established in the form of an amplifiable cell line 03HLS following a procedure well known to the culture laboratories and to those skilled in the art: by using in particular the tryptic dispersion, the cells are again diluted in renewed medium and so on until the desired number of cells is obtained. After obtaining a sufficient number of cells for these two lines, (generally after one to three weeks), the first experiments were carried out using the method according to the invention.
  • the cells of the line GM02718, respectively 03HLS were seeded on glass slides in Petri dishes. Part of these strips was then brought into contact with 5FU at a concentration of 30 ⁇ . As a verification, another part of these lamellae was brought into contact with 5FU at a given concentration (see Table 2, see Figure 2 (B) for the cell line GM02718, respectively Figure 2 (C) for the cell line 03HLS).
  • the cells were stored in the culture incubator at 37 ° C. 24h after contacting with 5FU at a given concentration as shown in Table 2, the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker was acquired. The results were acquired from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model). The reading was carried out directly by counting the foci obtained with the pH2AX marker on at least 50 cells. for each point and by dedicated image analysis software (imageJ).
  • the number of pH2AX foci obtained for the cell line GM02718, respectively 03HLS is approximately 2.38 respectively 2.59 foci; this figure validates the equation 2 ⁇ N pH 2Ax (24h) ⁇ 8. Therefore, for the cell line GM02718, respectively 03HLS, the genotoxic risk related to 5FU is "group II" or said intermediate. GM02718 and 03HLS are chemosensitive.
  • Table 3 Detection of the number of pH2AX foci and the number of micronuclei 24 hours after the contacting of 04PSL, 01 PAU, 08HNG, 1 BR3 cells with a pesticide-type brittle agent (Glyphosate, Permethrin, Thiobendazole, PCP, Atrazine) in depending on the concentration of pesticide used
  • a pesticide-type brittle agent Glyphosate, Permethrin, Thiobendazole, PCP, Atrazine
  • Table 4 Detection of the number of pH2AX foci and the number of micronuclei 24 hours after contacting the control cell lines of the nervous system Ha (astrocytic cells), Hah (astrocytic hippocampal cells) and Hasp (astrocytic spinal cord cells) with a compound metal (AICI 3 , Cu, CuCl 2 , CuSO 4 , Pb (NO 3 ) 2 , CdCl 2 , Cd-acetate or Cd-acetate-citrate) as a function of the concentration of said metal compound employed
  • GROUP I absence of clinical signs
  • GROUP I I presence of clinical signs
  • GROUP I I lethal effect

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Abstract

Procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes : (a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques; (b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu; (c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée; (e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e).

Description

Méthode individuelle prédictive des effets génotoxiques d'agents chimiques ou biochimiques, cassant l'ADN
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne le domaine de la toxicologie et plus particulièrement le domaine des méthodes génotoxicologiques de laboratoire. L'invention concerne plus particulièrement une nouvelle méthode prédictive de la toxicité cellulaire après exposition à des agents chimiques cassants directement ou indirectement l'ADN (notamment certains métaux, les pesticides et certains principes actifs pour chimiothérapie) et qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques.
Etat de la technique
Des données de littérature de plus en plus nombreuses montrent que les cassures double-brin (CDB) sont les dommages de l'ADN les mieux corrélés à la létalité cellulaire et à la toxicité - si elles ne sont pas réparées - et à l'instabilité génomique et au risque de cancer - si elles sont mal réparées (Jeggo et Lobrich, « DNA double-strand breaks: their cellular and clinical impact ? », Oncogene 26(56) p.7717-7719 (2007) ; Joubert et al., « Radiation biology: major advances and perspectives for radiotherapy », Cancer Radiotherapy 15(5) p.348-354 (201 1 ). A l'origine établie pour les CDB radio-induites, une telle conclusion semble être valable pour tous les agents cassants de l'ADN. Dès lors, une évaluation du risque toxique et cancérogène basée sur la quantification des CDB et des fonctionnalités de leur voie de réparation apparaît comme prometteuse. Pourtant, la détermination des CDB et les modèles de réparation et signalisation qui les régissent sont encore loin de faire l'unanimité parmi les radiobiologistes et les génotoxicologistes. A l'inverse, certains travaux ont montré une corrélation quantitative entre le nombre de CDB non réparées et la radiosensibilité cellulaire des cellules humaines en utilisant la technique de l'immunofluorescence, et ont proposé un modèle moléculaire en opposition avec les paradigmes actuels (Joubert et al., « DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response : at least two différent assays to predict intrinsic radiosensitivity ? », Int.J. Radiation Biology 84(2), p.1 -19 (2008); Joubert, et al. (article précité de 201 1 )). Plus récemment, ce même groupe de chercheurs a montré des réponses spécifiques de certains tissus humains à des métaux (notamment Pb, Cd, Al) (Viau et al., « Cadmium inhibits non-homologous end-joining and over- activâtes the MRE11 -dépendent repair pathway », Mutation Research 654 p.13-21 (2008) ; Gastaldo et al., « Lead contamination results in late and slowly repairable DNA double-strand breaks and impacts upon the ATM-dependent signaling pathways », Toxicology Letters 173, p.201 -214 (2007) ; Gastaldo et al., « Induction and repair rate of DNA damage: A unified mode! for describing effects of externat and internai irradiation and contamination with heavy metals », J Theoretical Biology 251 p.68-81 (2008)).
Toxicité et cancer peuvent être les conséquences de différents agents externes tels que les agents physiques (rayons X, particules, UV, chaleur), les agents chimiques (agents alkylants, certains principes actifs utilisés en chimiothérapie, certains métaux), les agents biologiques (comme certains virus ou bactéries). Parmi ces facteurs de stress génotoxique les radiations ionisantes sont l'agent externe pour lequel les effets biologiques sont les mieux documentés (Thomas et al., « Impact of dose-rate on the low- dose hyper-radiosensitivity and induced radioresistance response », International Journal of Radiation Biology, 89(10) p813-822 (2013) ; Colin C. et al., « MRE11 and H2AX biomarkers in the response to low-dose exposure : balance between individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability », International journal of low radiation, 8(2) p96-106 (201 1 )) ; Joubert A. et al., « Irradiation in présence of iodinated contrast agent results in radiosensitization of endothelial cells : conséquences for computed tomography therapy », International Journal of Radiation : Oncology Biology Physics, 62(5) p1486-1496 (2005). Toutefois, comme pour tous les autres facteurs de stress, l'histoire de l'estimation du risque toxique et cancérogène a montré que des modèles moléculaires et cellulaires de la réponse au stress doivent être validés et des paramètres clairement identifiés. Il apparaît également clair que le facteur individuel constitue un facteur majeur à prendre en compte mais pose à nouveau la pertinence des modèles considérés (Dorr and Hendry « Consequential late effects in normal tissues » Radiother Oncol. 61 (3):223-31 (2001 ) ; Granzotto A et al, "Individual susceptibility to radiosensitivity and to genomic instability: its impact on low-dose phenomena" Health Phys. 100(3):282 (201 1 )). Ainsi, un diagnostic fiable du risque lié à tout stress génotoxique nécessite donc de solides pré-données obtenues sur un nombre suffisant d'individus, de modèles cellulaires, avec des paramètres justifiés.
La littérature actuelle montre un nombre croissant d'études concernant les effets génotoxiques de certains métaux et métalloïdes (comme Al, Cd, U, As, Se et Sb) et de leurs formes nanoparticulaires associées (Polya et Charlet, « Increasing arsenic risk ? », Nature Geoscience 2, p.383-384 (2009); Akhter et al., « Cancer targeted metallic nanoparticle : targeting overview, récent advancement and toxicity concern », Curr. Pharm. Des. 17(18),p.1834-1850 (201 1 ); Almeida et al., « In vivo biodistribution of nanoparticles », Nanomedicine (Lond) 6(5), p.815-835 (201 1 ); Pereira et al., "Genotoxicity of uranium contamination in embryonic zebrafish cells", Aquatic Toxicology 109, p.1 1 -16 (2012) ; Pereira et al., "Comparative genotoxicity of aluminium and cadmium in embryonic zebrafish cells", Mutation Research 750, p.19-26 (2013)), notamment concernant l'exposition par l'eau et générée par l'industrie des semi-conducteurs, ainsi que des pesticides (Garaj-Vrhovac et Zeljezic, « Evaluation of DNA damage in workers occupationally exposed to pesticides using single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay. Pesticide genotoxicity revealed by cornet assay », Mutation Research 469(2), p.279-285 (2000); Garaj-Vrhovac et al., « Efficacity of HUMN criteria for scoring the micronucleus assay in human lymphocytes exposed to a low concentration of p,p'-DDT », Braz J Med Biol Res 41 (6), p.473-376 (2008); Guilherme et al., « Différentiel genotoxicity of Roundup ® formulation and its constituents in blood cells of fish (Anguilla anguilla) : considérations on chemical interactions and DNA damaging mechanisms », Ecotoxicology 21 (5), p1381 - 90. (2012)). Or, ces deux types d'agents représentent clairement des enjeux sociétaux majeurs au vu du développement de l'industrie, de la pollution atmosphérique et du besoin d'augmentation des rendements agricoles. De fait, ils se trouvent également aux centres des préoccupations de santé et dans le cadre environnemental et dans le cadre du travail. La communauté scientifique suspecte que la toxicité de certains composants nanoparticulaires oxydés pourrait engendrer génotoxicité et carcinogénèse : la recherche sur les effets biologiques spécifiques des nanoparticules s'inscrit donc naturellement dans la programmation de recherches sur les conséquences humaines et environnementales d'une telle technologie.
On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celle des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité (dans le cas d'une exposition aux radiations ionisantes). Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). On sait également que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« Inhérent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621 - 629 (1981 ) ; « Intrincsic radiosensitivity of human cell Unes is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 1 1 , p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu.
Ce qui est vrai pour la radiosensibilité l'est également pour la prédisposition au cancer, et plus particulièrement au cancer radioinduit. Ainsi, tout excès de dose biologique augmente à la fois le risque toxique et le risque carcinogène. Il serait donc utile de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer le risque et l'excès de dose biologique dû à l'exposition à des agents génotoxiques cassant l'ADN.
Dans le cadre de leur publications (Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response ; At least two différent assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiât. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 (2008)), une classification de la radiosensiblité humaine en 3 groupes a été proposée : Groupe I : radiorésistance et faible risque de cancer, Groupe II radiosensibilité modérée et haut risque de cancer ; Groupe III, hyper-radiosensibilité et haut risque de cancer. Cette classification est basée sur des critères moléculaires ; elle permet de décrire tous les cas de radiosensibilité humaine. Une telle classification qui prend en compte le facteur individuel n'existe pas pour le stress génotoxique engendré par des agents chimiques tels que les métaux et les pesticides.
Un certain nombre de documents décrivent les conditions dans lesquelles H2AX ou pH2AX est utilisée comme marqueur de la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN notamment lors de l'utilisation d'agents cassants. La demande de brevet WO 2014/152873 décrit une méthode de quantification de la génotoxicité de principes actifs utilisés en chimiothérapie par la quantification de l'expression de l'histone H2AX. La demande de brevet WO 2005/1 13821 décrit l'utilisation du marqueur pH2AX comme moyen de détection de cassures double brin de l'ADN dans des méthodes pour identifier les produits du tabac les moins toxiques. Dans ces méthodes, la fumée de tabac est mise au contact des cellules pendant une durée prédéterminée (15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes ou une heure). La présence ou absence de foci pH2AX est vérifiée par immunofluorescence. Cependant cette méthode concerne un cocktail de produits chimiques dont on n'identifie pas l'agent cassant de manière exact.
La demande de brevet WO2005/1 13 821 (Vector Tobacco / New York Médical University) décrit l'utilisation du marqueur pH2AX pour détecter des cassures double-brin d'ADN et évaluer la toxicité du tabac. Une autre méthode qui utilise le niveau d'expression H2AX pour détecter des cassures double-brin d'ADN et évaluer l'efficacité d'un agent anticancer est décrite dans WO2014/152 873 (Pioma).
Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate qu'il n'existe pas de méthode de quantification de l'excès de dose biologique et du risque lié à l'exposition aux agents chimiques cassant l'ADN. Pour ces agents, le problème de fournir une méthode prédictive de la génotoxicologie individuelle reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive du risque de toxicité lié à l'exposition aux agents chimiques cassant l'ADN.
Objets de l'invention
Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages les plus prédictifs de la génotoxicité quand ils sont non-réparés d'une part, et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Dans le cadre de la présente invention les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit de recombinaison MRE1 1 - dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM et constitue le facteur individuel. Le marqueur pH2AX indique un site de CDB reconnu par le mode de réparation par suture. Le marqueur MRE1 1 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE1 1 -dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie MRE1 1 -dépendante. Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress induisant des CDB et produisant une oxydation dans le cytoplasme.
Les inventeurs ont montré que ces modèles sont valables pour un grand nombre d'agents chimiques et biochimiques cassant l'ADN comme les métaux, les pesticides, les nanoparticules et certaines drogues chimiothérapeutiques.
Pour constater l'endommagement d'un ADN par une agression exogène génotoxique, il faut tenir compte :
d'une part, de l'état spontané de l'ADN,
d'autre part, de son état stress-induit.
Par ailleurs, après l'exposition à un stress génotoxique, il faut tenir compte de la réparation de l'ADN, dont la cinétique dépend de la nature du stress mais aussi potentiellement de la nature du tissu impacté. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une sensibilité exceptionnelle.
Enfin, afin de mieux appréhender les différences inter-individuelles, il faut construire un système basé sur une dose biologique ou une concentration de référence pour mieux quantifier les phénomènes à partir d'une même base.
Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur :
(i) La préparation d'un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules non transformées, prélevées sur un individu, par exemple de cellules issues de biopsies de peau de l'individu concerné mais aussi de cellules témoins dites de référence considérées comme résistantes au stress cassant considéré (ex : cellules d'individu Groupe I) ;
La détermination d'une concentration de référence après exposition de l'échantillon cellulaire issu des cellules de référence (Groupe I) au stress donné. A noter que cette étape peut avoir été déjà effectuée et être contenue dans une base de données du laboratoire inventeur ;
(iii) La définition d'un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines quiescentes ; (iv) Des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB sur les cellules de l'individu considéré à la concentration de référence définie plus haut.
Les cellules témoins dites de référence sont des cellules considérées comme résistantes au stress cassant considéré, de préférence ce sont des cellules résistantes au stress induit par des agents chimiques et au rayonnement (ex : cellules d'individu Groupe I). On peut utiliser des cellules commerciales habituellement employées comme témoins dans des études de génotoxicité telles que, notamment, les lignées cellulaires 1 BR3 (Killalea et al., « Factors in post dialysis CAPD fluid affecting 3H cholestérol eïïlux from human skin fibroblasts », Biochemical Society Transactions 25 p123S (1997)), 149BR et MRC9 (Watanabe et al., « Comparison of lung cancer cell Unes representing four histopathological subtypes with gene expression profiling using quantitative real-time PCR », Cancer Cell International 10(2) p1 -12 (2010)). D'autres cellules telles que HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, et MRC5 peuvent être employées comme cellules témoins dites de référence.
Un premier objet de l'invention est donc un procédé pour prédire la sensibilité d'un individu envers un stress cassant l'ADN à partir d'un échantillon cellulaire issu de cellules
(de préférence de cellules de peau) prélevé sur l'individu et de la définition d'une concentration de référence à laquelle les expériences sont réalisées.
dans lequel procédé :
(Etape dite de définition des références)
(i) si la concentration de référence n'a pas été déjà déterminée pour l'agent chimique ou biochimique à étudier, on prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (groupe I de sensibilité) ; on applique plusieurs concentrations à l'intérieur d'une large gamme de concentration dudit agent cassant (ladite gamme de concentration allant par exemple du nM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h) sur cet échantillon cellulaire ; on procède à une immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI qui permet également sur le même échantillon cellulaire l'analyse de micronoyaux pour toutes les concentrations appliquées.
(ii) Soit le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NPH2Ax(t, C)), soit le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(Î, C)), soit l'écart-type σ correspondant à l'erreur commises sur ces mesures respectives qui doivent être effectuées sur au moins 50 noyaux une fois (écart-type gaussien) ou 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne).
La concentration de référence dite Cref est la concentration qui donne :
NPH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 2 σ = 2 % ; (Etape dite d'estimation du risque)
(iv) On prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules prélevées sur l'individu considéré. On applique à cet échantillon cellulaire la concentration de référence Cref définie plus haut pendant une durée prédéterminée (de préférence 24 h). On procède ensuite à une détermination de l'immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au
DAPI.
(v) On détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref) et ΝΜΝ(24ΙΙ,
(vi) Si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref) < 2 ou bien ΝΜΝ(24ΙΙ, Cref)≤ 2 % , alors le risque génotoxique est considéré comme faible et dit « de Groupe I »
(vii) Si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, CreT) >8 ou bien ΝΜΝ(24ΙΙ, CreT) > 10%, alors le risque génotoxique est considéré comme très élevé et dit « de Groupe III »
(viii) Pour tous les autres cas, le risque génotoxique est considéré comme intermédiaire et dit « de Groupe II ».
Un autre objet de l'invention est un procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes :
(a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques ;
(b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu ;
(c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée ;
(e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e).
Ledit agent chimique peut être, à titre d'exemple, un anion métallique ou non métallique, un cation non-métallique, un anion organique, un cation organique, un composé zwitterionique, un composé inorganique neutre ou non, un composé organique neutre ou non, un organo-métallique, un composé insoluble ; ledit agent chimique peut être présent par exemple sous forme dissout dans un milieu liquide (aqueux ou non-aqueux), sous forme de particules, sous forme de nanoparticules, fixé sur un membrane cellulaire, sous forme gazeuse. Ledit agent biochimique peut être, à titre d'exemple, un peptide (recombinant ou non), un anticorps, un antigène, un virus (désactivé ou non), un fragment de virus, un fragment cellulaire.
Avantageusement le procédé selon l'invention comprend en plus une étape (f) dans laquelle on détermine un score diagnostique qui représente ladite sensibilité dudit tissu à l'effet toxique cassant l'ADN dudit agent chimique ou biochimique ou de ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, en utilisant ledit nombre de cassures double brin de l'ADN (et/ou le nombre de micronoyaux) et ladite concentration de travail.
Selon l'invention, la détection des cassures double brin à l'étape (e) se fait avantageusement en utilisant une technique sélectionnée dans le groupe formé par l'immunofluorescence, l'examen cytogénétique, l'électrophorèse en champ puisé.
Dans un mode de réalisation on détecte à l'étape (e) au moins un biomarqueur sélectionné dans le groupe formé par : pH2AX, 53BP1 , Phospho-DNAPK, MDC1. De manière avantageuse on détecte le biomarqueur pH2AX, et de préférence le nombre et la taille des foci nucléaires dudit biomarqueur. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré on procède à une contre-coloration apte à localiser les noyaux cellulaires pour quantifier les micronoyaux (MN).
A l'étape (e) du procédé selon l'invention la concentration de travail est avantageusement une concentration de référence Cref préalablement déterminée. Dans un mode de réalisation on détermine par immunofluorescence pH2AX le nombre de cassures double brin de l'ADN, et on détecte, après contre-coloration au DAPI, le nombre de micronoyaux (MN), et on détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref) et ΝΜΝ(24ΙΙ , Cref) ; si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref)≤ 2, ou bien si ΝΜΝ(24ΙΙ , Cref)≤ 2 %, alors on conclut que le risque génotoxique est faible et/ou dit « de Groupe I » ; si pour l'échantillon cellulaire NPH2Ax(24h, Cref) >8, ou bien ΝΜΝ(24ΙΙ, Cref) > 10%, alors on conclut que le risque génotoxique est très élevé et/ou dit « de Groupe III » ; pour tous les autres cas, on conclut que le risque génotoxique est intermédiaire et/ou dit « de Groupe II ».
A l'étape (e) du procédé selon l'invention la concentration de travail est avantageusement une concentration de référence Cref préalablement déterminée. Cette détermination se fait avantageusement par un procédé dans lequel :
(i) on prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (Groupe I de sensibilité) et on le subdivise en plusieurs fractions ;
(ii) on applique plusieurs concentrations de l'au moins un agent chimique ou biochimique à tester, lesdites concentrations étant choisies à l'intérieur d'une gamme de concentration dudit agent chimique ou biochimique (ladite gamme de concentration allant par exemple du nM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h), sachant que chacune sur une fraction de cet échantillon cellulaire ;
(iii) on détermine pour chacune des fractions de l'échantillon cellulaire le nombre de foci au pH2AX par cellule et/ou le nombre de micronoyaux par cellule ;
(iv) On détermine :
o le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NpH2Ax(t, C)), (cette détermination se faisant de préférence par immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI),
o le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(t, C)),
o l'écart-type σ sur ces mesures respectives, sachant que ces mesures sont effectuées de préférence sur au moins 50 noyaux une fois (écart- type gaussien) ou sur 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne),
o la concentration de référence dite Cref en tant que la concentration qui donne : NpH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 2o = 2 %. Avantageusement, les cellules dites de référence sont choisies parmi les lignées cellulaires HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, et MRC5, 1 BR3, 149BR et MRC9 et plus particulièrement parmi les lignées cellulaires 1 BR3, 149BR et MRC9. Dans un mode de réalisation du procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissue prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques :
(i) on isole et/ou amplifie des cellules issues dudit tissue prélevé, ces cellules amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ;
(ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t) lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état non exposé à ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) et au moins un temps d'observation t4 après la mise en contact dudit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail pendant une durée prédéterminée (cette mise en contact étant appelée ici « exposition génotoxique »);
(iii) on détermine le groupe de sensibilité de l'échantillon à l'exposition génotoxique, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t) ; t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;
Dans un mode de réalisation on détermine en plus sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé NMN(t)), les temps t étant au moins tO (non exposé à une dose biologique absorbée D) et t4 après exposition avec une dose biologique absorbée D. Dans cadre de la présente invention, le critère de Groupe peut être défini selon des critères cliniques : Groupe I = absence de signes cliniques ; Groupe II = présence de signes cliniques ; Groupe III = effet létal. Description des figures
La figure 1 (A), (B) et (C) montre l'évolution du nombre de foci pH2AX 24 h après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec du glyphosate (CAS n° 1071 -83-6) à une concentration donnée en fonction de cette concentration en glyphosate pour les lignées fibroblastiques 1 BR3 (figure 1 (A)), 149BR (figure 1 (B)) et 04PSL (figure 1 (C)).
La figure 2 (A), (B) et (C) montre l'évolution du nombre de foci pH2AX 24 h après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec du 5FU à une concentration donnée en fonction de cette concentration en 5FU pour les lignées fibroblastiques MRC9 (figure 2 (A)), 03HLS (figure 2 (B)) et GM02718 (figure 2 (C)).
Description détaillée
Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain.
1 . Préparation de l'essai Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que lesdits opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire.
Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon de tissu servant à la préparation de l'échantillon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique ». L'échantillon de tissu est placé dans du milieu DMEM+20% (sérum de veau fétal stérile). L'échantillon de tissu est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante.
L'étape suivante représente l'isolation et /ou l'amplification du tissu prélevé.
Dans un mode de réalisation, dès réception, l'échantillon de tissu (typiquement la biopsie) est établi sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture, comme le souligne la publication d'EIkind et al. « The radiobiology of cultured mammalian cells », Gordon and Breach (1967). Dès que le nombre de cellules est suffisant (typiquement après 1 à 3 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. On prépare un échantillon cellulaire : Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles sont contaminées avec des métaux ou des pesticides ou tout autre agent chimique ou biochimique cassants pour l'ADN à différentes concentrations. Une autre partie n'est pas contaminée; elle représente l'état spontané. Pendant la contamination, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C.
Pour les cellules contaminées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état après un temps d'incubation avec l'agent chimique ou biochimique cassant l'ADN. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX. Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (Bodgi et al, « A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical définition of individual radiosensitivity », J Theor Biol. 21 p 333:135-45.2013) :
les cellules sont fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule i-Oct-C6H4- (OCH2CI-l2)xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par exemple par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture sont lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par exemple par Sigma Aldrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX sont utilisés à une concentration de 1 :800. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souris ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par exemple par Sigma Aldrich) sont effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du Vectashield™ contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase Gi (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles).
L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en G0/Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles.
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 séries d'expériences (exposition) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée.
2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques
2.1 Généralités et marqueurs utilisés
L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour un des deux marqueurs pH2AX sur des cellules non-contaminées (état spontané) et contaminées. La méthode est basée sur l'étude du marquage par ce marqueur pour une durée de contamination donnée : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à compter de l'arrêt de la contamination, et on étudie leur immunofluorescence.
Les moyennes obtenues pour chaque point et chaque dose avec chaque marqueur sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »). pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double- brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire, et seuls le nombre et la taille de ces foci nucléaires seront analysés.
La contre-coloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire pour quantifier les micronoyaux, qui sont des marqueurs cellulaires complémentaires aux données sur les foci.
2.2 Paramètres biologiques et cliniques
On définit et détermine comme indiqué : - NPH2Ax(t), les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX aux temps d'observations tO (non contaminé) et t4 sachant que la détermination du paramètre NpH2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention,
- le nombre de micronoyaux observés spontanément (à t = tO, i.e. sans contamination) ou à t = t4 après contamination pour 100 cellules (en %).
Le procédé selon l'invention montre que la sensibilité tissulaire à un métal donné varie en fonction du tissu d'intérêt. Par exemple des astrocytes contaminés avec 100 μΜ d'aluminium présentent moins de cassures (cellules HA, 2 foci de H2AX) comparés à des cellules endothéliales pour la même concentration (cellules HMEC, 3,7 foci de H2AX) (cf tableau 1 ). De plus, pour certains métaux, les inventeurs ont montré qu'il existait une correspondance entre l'échelle unique de toxicité proposée et certains signes cliniques décrits par exemple dans le cas du plomb (saturnisme) ou dans le cas du cadmium (maladie d'Itai-ltai) (cf tableau 3).
Le procédé selon l'invention permet de montrer également que des cellules contaminées avec du cuivre présentaient pour la plus forte concentration testée (1 mM) un nombre de cassures de l'ADN visualisées par des foci de H2AX allant de 2 à 21 foci selon le type cellulaire testé (cf. tableaux 1 et 2).
On note que le procédé selon l'invention est tellement sensible qu'il permet de caractériser l'impact sur un tissu d'agents chimiques cassant l'ADN dans des concentrations très faibles, qui sont de l'ordre de grandeur des valeurs limites réglementaires pour certains agents chimiques dans l'eau potable ; ces valeurs limites sont par exemple de l'ordre de 2 mM (2 mg/L) pour le cuivre, 200 μΜ pour l'aluminium, 5 μΜ pour le cadmium, 10 μΜ pour le Pb.
2.3 Evaluation prédictive
Elle vise la prédiction de paramètres cliniques à partir des données biologiques mesurées.
Un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; celui-ci concerne le critère suivant :
(i) La classification du patient dans un Groupe I, Il ou III (critère appelé GROUPE) :
La définition des groupes de sensibilité (GROUPE) aide le médecin à déterminer à partir des scores selon l'invention et du tableau clinique du patient des analogies avec des syndromes génétiques connus. Ces groupes ont été définis initialement dans la publication de Joubert et al. (Int. J. Radiât. Biol. 84(2), p. 107-125 (2008), citée ci-dessus.
Selon la présente invention, on considère que : Si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref) <= 2 ou bien ΝΜΝ(24ΙΙ, Cref) <= 0,5%, de préférence ΝΜΝ(24ΙΙ, Cref) <= 1 % et encore plus préférentiellement ΝΜΝ(24ΙΙ, Cref) <= 2%, alors le risque génotoxique est considéré comme faible et dit « de Groupe I »
Si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref) >8 ou bien ΝΜΝ(24ΙΙ, Cref) > 10%, alors le risque génotoxique est considéré comme très élevé et dit « de Groupe III »
Pour tous les autres cas, le risque génotoxique est considéré comme intermédiaire et dit « de Groupe II ». Exemples
Exemple 1
1 . Détermination, sur des lignées fibroblastiques témoins, de la concentration de référence du glyphosate (agent chimique)
Des fibroblastes témoins commerciaux 1 BR3 et 149BR ont été amplifiés suivant les préconisations du fournisseur (SIGMA-ALDRICH) jusqu'à obtention du nombre de cellules témoins souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec le milieu à tester comprenant du glyphosate (CAS n° 1071 -83-6) à une concentration donnée comme présentée dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1
Détection du nombre de foci pH2AX 24h après la mise en contact des cellules fibroblastiques témoins 1 BR3, 149 BR et des cellules 04PSL avec du glyphosate en fonction de la concentration en glyphosate employée
5
Après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 1 , le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition 10 des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en G0/Gi pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base 15 d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 1 .
Ainsi, pour les échantillons cellulaires témoins de peau 1 BR3 et 149BR (cf. tableau 1 ), la 20 concentration de référence a été déterminée. Cette concentration de référence a été définie comme étant la concentration qui donne : NpH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 où σ correspond à l'écart-type des mesures du nombre de foci pH2AX acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée, ces mesures étant réalisées sur 3 expériences indépendantes de 50 cellules (écart-type 25 de la moyenne). La figure 1 représente l'évolution du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, 24h après la mise en contact des cellules témoins 1 BR3 (cf. figure 1 (A)) et 149 BR (cf. figure 1 (B)) avec du glyphosate en fonction de la concentration en glyphosate employée. La concentration Cref définie par NpH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 pour les 2 lignées cellulaires témoins 149BR et 1 BR3 est de 100 μΜ.
2. Préparation de l'essai (lignée cellulaire 04PSL)
Un échantillon cellulaire de peau d'un patient a été prélevé par biopsie via la méthode de « punch dermatologique » connue de l'homme du métier. L'échantillon cellulaire a ensuite été placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon cellulaire a ensuite été transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, afin que l'échantillon ne reste pas plus de 38 h à la température ambiante.
Dès réception, l'échantillon cellulaire issu de la biopsie a été établi sous la forme d'une lignée cellulaire 04PSL amplifiable suivant une procédure bien connue des laboratoires de culture et de l'homme du métier : en utilisant notamment la dispersion trypsique les cellules sont à nouveau diluée dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules de la lignée 04PSL ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec du glyphosate à une concentration de 100 μΜ. A titre de vérification, une autre partie de ces lamelles a été mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée (cf. tableau 1 , figure 1 (C)).
Après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du glyphosate à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 1 , le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en G0/Gi pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 1 et sur la figure 1 (C). 3. Détermination du risque génotoxique de la lignée cellulaire 04PSL
A une concentration de glyphosate de 100 μΜ, le nombre de foci pH2AX obtenu pour la lignée cellulaire 04PSL est environ de 7 ; ce chiffre valide l'équation 2 < NpH2Ax(24h) < 8. Par conséquent, pour la lignée cellulaire 04PSL, le risque génotoxique lié au glyphosate est de « groupe II » ou dit intermédiaire. La lignée 04PSL est chimiosensible.
Exemple 2
1 . Détermination, sur des lignées fibroblastiques témoins, de la concentration de référence de la drogue chimiothérapeutique 5FU (agent chimique) Des fibroblastes témoins commerciaux MRC9 ont été amplifiés selon les préconisations du fournisseur (SIGMA-ALDRICH) jusqu'à obtention du nombre de cellules témoins souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec le milieu à tester comprenant du 5FU à une concentration donnée comme présentée dans le tableau 2 ci- après.
Tableau 2
Détection du nombre de foci pH2AX 24h après la mise en contact des cellules fibroblastiques témoins MRC9 et des cellules GM02718 et 03HLS avec du 5FU en fonction de la concentration en 5FU employée
Après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 2, le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ). Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du 5FU à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 2. Ainsi, pour les échantillons cellulaires témoins MRC9 (cf. tableau 2, figure 2 (A)), la concentration de référence a été déterminée. Cette concentration de référence a été définie comme étant la concentration qui donne : NpH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 où σ correspond à l'écart-type des mesures du nombre de foci pH2AX acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du glyphosate à une concentration donnée, ces mesures étant réalisées sur 3 expériences indépendantes de 50 cellules (écart-type de la moyenne).
La figure 2 représente l'évolution du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, 24h après la mise en contact des cellules témoins MRC9 (cf. figure 2 (A)) avec du 5FU en fonction de la concentration en 5FU employée. La concentration Cref définie par NpH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 pour la lignée cellulaire témoin MRC9 est de 30 μΜ.
2. Préparation de l'essai (lignées cellulaires GM02718 et 03HLS)
La lignée cellulaire GM02718 a été amplifiée suivant les préconisations du fournisseur (Coriell Institute) jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité.
Pour la lignée 03 HLS, un échantillon cellulaire de peau d'un patient a été prélevé par biopsie via la méthode de « punch dermatologique » connue de l'homme du métier. L'échantillon cellulaire a ensuite été placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon cellulaire a ensuite été transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, afin que l'échantillon ne reste pas plus de 38 h à la température ambiante.
Dès réception, l'échantillon cellulaire issu de la biopsie a été établi sous la forme d'une lignée cellulaire 03HLS amplifiable suivant une procédure bien connue des laboratoires de culture et de l'homme du métier : en utilisant notamment la dispersion trypsique les cellules sont à nouveau diluée dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant pour ces deux lignées, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules de la lignée GM02718, respectivement 03HLS ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec du 5FU à une concentration de 30 μΜ. A titre de vérification, une autre partie de ces lamelles a été mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée (cf. tableau 2, cf. figure 2 (B) pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement figure 2 (C) pour la lignée cellulaire 03HLS).
Après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. 24h après la mise en contact avec du 5FU à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 2, le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX a été acquis. L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis 24h après la mise en contact des cellules témoins avec du 5FU à une concentration donnée a été calculé et présenté dans le tableau 2 et sur la figure 2 (B) pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement figure 2 (C) pour la lignée cellulaire 03HLS.
3. Détermination du risque génotoxique de la lignée cellulaire GM02718,
respectivement 03HLS
A une concentration de 5FU de 30 μΜ, le nombre de foci pH2AX obtenu pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement 03HLS est environ de 2,38 respectivement 2,59 foci ; ce chiffre valide l'équation 2 < NpH2Ax(24h) < 8. Par conséquent, pour la lignée cellulaire GM02718, respectivement 03HLS, le risque génotoxique lié au 5FU est de « groupe II » ou dit intermédiaire. Les lignées GM02718 et 03HLS sont chimiosensibles.
Autres exemples
Les tableaux qui suivent résument les résultats de nombreuses expériences qui ont été exécutées tel que décrit dans la partie « Description détaillée » ci-dessus. Dans les tableaux 3 et 4, « pH2AX » correspond au nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX, 24 heures après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec l'agent chimique à la concentration C (NpH2Ax(24h, C)), et où "Micronoyaux » correspond au nombre moyen de micronoyaux observés pour 100 cellules 24h après la mise en contact de l'échantillon cellulaire avec l'agent chimique à la concentration C (ΝΜΝ(24ΙΙ, C)).
Tableau 3 : Détection du nombre de foci pH2AX et du nombre de micronoyaux 24h après la mise en contact de cellules 04PSL, 01 PAU, 08HNG, 1 BR3 avec un agent cassant de type pesticide (Glyphosate, Permethrine, Thiobendazole, PCP, Atrazine) en fonction de la concentration en pesticide employée
Concentration [μΜ]
Lignée Agent Cassant Marqueurs 0 0,01 0,1 0,3 1 10 20 30
1 BR3 micronoyaux 1 5 6 13,5 15 40
Atrazine
pH2AX 1 1 ,3 1 ,8 3,1 3,5 Tableau 4 : Détection du nombre de foci pH2AX et du nombre de micronoyaux 24h après la mise en contact des lignées cellulaires témoins du système nerveux Ha (cellules astrocytaires), Hah (cellules astrocytaires hippocampiques) et Hasp (cellules astrocytaires moelle épinière ) avec un composé métallique (AICI3, Cu, CuCI2, CuS04, Pb(N03)2, CdCI2, 5 Cd-acétate ou du Cd-acetate-citrate) en fonction de la concentration dudit composé métallique employée
Les données expérimentales présentées dans le tableau 4 ci-dessus ont été utilisées pour déterminer la concentration de référence Cref notamment pour du Pb(N03)2 (Cref < 1 μΜ) et du CdCI2 (Cref = 10 μΜ). Ces données ont été corrélées aux signes cliniques observés et présentés dans le tableau 5 ci-après, notamment pour du Pb(N03)2 et du CdCI2.
Tableau 5: Exemples numériques de correspondance entre l'échelle unique de toxicité
'invention et les signes cliniques correspondants
Où le critère GROUPE est défini comme suivant : GROUPE I = absence de signes cliniques GROUPE I I = présence de signes cliniques GROUPE I I I = effet létal

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé d'évaluation de la sensibilité d'un tissu prélevé sur un individu à l'effet toxique cassant l'ADN d'au moins un agent chimique ou biochimique, ou d'une combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, comprenant les étapes suivantes : (a) On fixe une concentration de travail pour ledit au moins un agent chimique ou biochimique, ou pour des agents chimiques et/ou biochimiques compris dans ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques ;
(b) On prélève des cellules d'un tissu à évaluer d'un individu ;
(c) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ; (d) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail définie à l'étape (a), pendant une durée prédéterminée ;
(e) On détecte le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux, sachant que les étapes (b), (c), (d) et (e) doivent être exécutées l'une après l'autre, et que l'étape (a) doit être exécutée préalablement à l'étape (e).
2. Procédé selon la revendication 1 , comprenant en plus une étape (f) dans laquelle on détermine un score diagnostique qui représente ladite sensibilité dudit tissu à l'effet toxique cassant l'ADN dudit agent chimique ou biochimique ou de ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques, en utilisant ledit nombre de cassures double brin de l'ADN (et/ou le nombre de micronoyaux) et ladite concentration de travail.
3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel à l'étape (e) on détecte les cassures double brin en utilisant une technique sélectionnée dans le groupe formé par l'immunofluorescence, l'examen cytogénétique, l'électrophorèse en champ puisé.
4. Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel à l'étape (e) on détecte au moins un biomarqueur sélectionné dans le groupe formé par : pH2AX, 53BP1 , Phospho- DNAPK, MDC1 .
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel on détecte le biomarqueur pH2AX, et de préférence le nombre et la taille des foci nucléaires dudit biomarqueur.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel on procède à une contre- coloration apte à localiser les noyaux cellulaires pour quantifier les micronoyaux (MN).
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel : A l'étape (e) la concentration de travail est une concentration de référence Cref préalablement déterminée,
On détermine par immunofluorescence pH2AX le nombre de cassures double brin de l'ADN, et on détecte, après contre-coloration au DAPI, le nombre de micronoyaux (MN),
On détermine alors sur ledit échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, Cref) et ΝΜΝ(24ΙΙ, C ref),
o et si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, CreT)≤ 2,
ou bien si NMN(24h, Cref) < 2 %,
alors on conclut que le risque génotoxique est faible et/ou dit « de Groupe I »,
o si pour l'échantillon cellulaire NpH2Ax(24h, CreT) >8,
ou bien NMN(24h, Cref) > 10% ,
alors on conclut que le risque génotoxique est très élevé et/ou dit « de Groupe III »,
o pour tous les autres cas, on conclut que le risque génotoxique est intermédiaire et/ou dit « de Groupe II ».
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ladite concentration de travail est une concentration de référence CreT déterminée par un procédé dans lequel :
(i) On prépare un échantillon cellulaire par dispersion et/ou amplification de cellules dites de référence (Groupe I de sensibilité) et on le subdivise en plusieurs fractions ;
(ii) On applique plusieurs concentrations de l'au moins un agent chimique ou biochimique à tester, lesdites concentrations étant choisies à l'intérieur d'une gamme de concentration dudit agent chimique ou biochimique (ladite gamme de concentration allant par exemple du nM au mM) pendant une durée prédéterminée (de préférence 24h), sachant que chacune sur une fraction de cet échantillon cellulaire ;
(iii) On détermine pour chacune des fractions de l'échantillon cellulaire le nombre de foci au pH2AX par cellule et/ou le nombre de micronoyaux par cellule ;
(iv) On détermine :
o le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NpH2Ax(t, C)), (cette détermination se faisant de préférence par immunofluorescence pH2AX avec contre-coloration au DAPI),
o le nombre moyen de micronoyaux pour 100 cellules aux temps d'observation t et à la concentration C (ce nombre moyen étant appelé NMN(t, C)),
o l'écart-type σ sur ces mesures respectives, sachant que ces mesures sont effectuées de préférence sur au moins 50 noyaux une fois (écart- type gaussien) ou sur 3 expériences indépendantes de 50 noyaux (écart-type de la moyenne),
o la concentration de référence dite Cref en tant que la concentration qui donne : NpH2Ax(24h, Cref) + 2o = 2 ou bien NMN(24h, Cref) + 2o = 2 %.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel ledit au moins un agent chimique ou biochimique est choisi parmi un anion métallique ou non métallique, un cation non-métallique, un anion organique, un cation organique, un composé zwitterionique, un composé inorganique neutre ou non, un composé organique neutre ou non, un organo-métallique, un composé insoluble.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ledit au moins un agent chimique ou biochimique est sous forme dissoute dans un milieu liquide (aqueux ou non-aqueux), sous forme de particules, sous forme de nanoparticules, fixé sur une membrane cellulaire, sous forme gazeuse.
1 1. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel ledit au moins un agent biochimique est choisi parmi un peptide (recombinant ou non), un anticorps, un antigène, un virus (désactivé ou non), un fragment de virus, un fragment cellulaire.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , dans lequel :
(i) on isole et/ou amplifie des cellules issues dudit tissue prélevé, ces cellules amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ;
on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t) lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état non exposé à ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) et au moins un temps d'observation t4 après la mise en contact dudit échantillon cellulaire avec ledit au moins un agent chimique ou biochimique (ou ladite combinaison d'agents chimiques et/ou biochimiques) dans sa concentration de travail pendant une durée prédéterminée (cette mise en contact étant appelée ici « exposition génotoxique »);
(iii) on détermine le groupe de sensibilité de l'échantillon à l'exposition génotoxique, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t).
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel on détermine en plus sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé NMN(t)), de préférence au moins au temps tO et au temps t4.
14. Procédé selon les revendications 13 ou 14, dans lequel t4 est une valeur fixe au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, dans lequel les cellules dites de référence sont choisies parmi les lignées cellulaires HF19, IMR90, 48BR, 70BR, 142BR, 155BR, et MRC5, 1 BR3, 149BR et MRC9 et plus particulièrement parmi les lignées cellulaires 1 BR3, 149BR et MRC9.
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