EP3259343A1 - Biosenseur bactérien de la dégradation du bois - Google Patents

Biosenseur bactérien de la dégradation du bois

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EP3259343A1
EP3259343A1 EP16705449.3A EP16705449A EP3259343A1 EP 3259343 A1 EP3259343 A1 EP 3259343A1 EP 16705449 A EP16705449 A EP 16705449A EP 3259343 A1 EP3259343 A1 EP 3259343A1
Authority
EP
European Patent Office
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wood
bacteria
reporter gene
nucleic acid
cebr
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16705449.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Cyril BONTEMPS
Pierre Leblond
Maxime TOUSSAINT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Lorraine
Original Assignee
Universite de Lorraine
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Lorraine filed Critical Universite de Lorraine
Publication of EP3259343A1 publication Critical patent/EP3259343A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/46—Wood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi

Definitions

  • the present invention relates to a bacterial biosensor of wood degradation.
  • the bio-degradation of wood is a major phenomenon of forest ecosystems because it allows the recycling of organic matter and the proper functioning of the forest. This degradation is largely due to microorganisms and is usually initiated by lignolytic fungi. However, this primodegradation quickly allows the installation of more or less complex bacterial communities that take advantage of lignocellulosic compounds become accessible following this fungal attack. At the economic level, the exploitation of the degradation capacities of these microbial consortia is currently of obvious interest for green chemistry and environmental biotechnologies, notably with the degradation of the recalcitrant lignocellulosic elements of the biomass.
  • biodegradation of wood is a considerable economic problem when it concerns wood used or conserved as building materials, such as wood used for frames, partitions or furniture. Due to biodegradation during storage, approximately 13 to 30% of the logs become unfit for marketing after 6 months of storage. The cost of this biodegradation is therefore considerable.
  • the attack by fungi is found by tests described in the European standard EN113 / A1 (August / 2004) entitled "Wood preservatives - Test method to determine the protective efficacy vis-à-vis the mushrooms basidiomycetes lignivores Determination of the efficacy threshold ".
  • the fungal attack is revealed by the mass difference between samples of wood to be analyzed and a non-degraded sample of wood as a control.
  • wood samples are treated with different levels of wood preservatives and exposed to fungi belonging to different genera. After 16 weeks of exposure, these samples are washed, dried and weighed. The difference in mass loss between a treated and an untreated sample allows to conclude on the quality of the protection of the material.
  • the length of time for this test is very long for industries that need to know quickly if the wood has been biodegraded or if a protective measure has worked.
  • the present invention aims to develop a tool and methodology to diagnose quickly, specifically and with high sensitivity fungal attack of wood.
  • the invention relates to the use of certain microorganisms of the soil, more particularly the saprophytic bacteria of the genus Streptomyces, which are incapable of initiating the degradation of wood, but which, on the other hand, are quick to recognize and use certain specific compounds released by all.
  • types of wood in the early stages of fungal attack such as cellulose derivatives, hemicelluloses, lignins, cello-oligosaccharides, cellobioses.
  • Streptomyces bacteria can colonize decomposing wood and have enzymes to degrade and metabolize complex sugars released during fungal attack.
  • silico studies also revealed that a large part of the genes encoding these cellulolytic enzymes were under the control of a regulatory system called "CebR", consisting of a CebR protein and a region of 10 to 20 nucleotides, named “CebR”. -box ", located in the promoter regions of these genes.
  • CebR protein is a highly conserved protein in bacteria of the genus Streptomyces. Proteins with very similar amino acid sequences and function also exist in other genera of bacteria, such as Thermobifida fusca (Spiridonov et al., 1999, J. Biol Chem., 274: 13127-13132), Actinosynnema mirum (Anderson et al., 2012, PLoS ONE 7 (6): e39331), Jonesia denitrificans (Anderson et al., 2012), Cellulomonas flavigena (Anderson et al., 2012), or Streptosporangium roseum (Anderson et al. 2012).
  • CebR protein is a major regulator of cellulose catabolism / cellooligosaccharides in Streptomyces. It can repress the transcription of its targeted genes, grouped in the ceb operon, by focusing on the "CebR-box" region, located in the promoter regions of these genes.
  • the "CebR-box” region is also a highly conserved region within Streptomyces bacteria. DNA regions having a nucleic sequence and a similar function are also present in other kinds of bacteria, such as Thermobifida fusca (Spiridonov et al., 1999), Actinosynnema mirum (Anderson et al., 2012), Jonesia denitrificans (Anderson et al., 2012), Cellulomonas flavigena (Anderson et al., 2012), or Streptosporangium roseum (Anderson et al., 2012).
  • Wood degradation compounds such as cello-oligosaccharides, especially cellobiose, can also bind to the CebR protein and thereby prevent CebR from binding to the CebRbox region. Consequently, by binding to the CebR protein, these compounds can remove the transcriptional repression of this protein from the genes under the control of the "CebR-box" region and result in the expression of these cellulolytic enzymes.
  • the invention is based on the use of genetically modified Streptomyces bacteria, into which a DNA combination of the "CebR box” region with a reporter gene is introduced.
  • the CebR protein using the "CebRbox” region effectively controls the expression of an exogenous gene, such as an exogenous reporter gene.
  • the invention relates to genetically modified bacteria of the genus Streptomyces, stably comprising an expression vector comprising:
  • nucleic acid of 10 to 20 nucleotides being capable of preventing transcription of the reporter gene, when the CebR protein is attached to said nucleic acid.
  • expression vector is meant a circular or linear double-stranded DNA molecule comprising the elements necessary for the replication of said molecule and the expression of the genes carried by this vector in a bacterium of the genus Streptomyces.
  • Said elements are for example an origin of replication, a promoter, a ribosomal binding site, a translation initiation codon, a stop codon of the translation, a transcription terminator.
  • Said expression vector may further comprise an enhancer, a selection marker, and at least one restriction site.
  • Each of these elements may be selected from those conventionally used in an expression vector for Streptomyces.
  • the aforementioned expression vector may be integrated, for example by site-specific recombination, into the chromosome of bacteria, or independent of the latter.
  • said expression vector When said expression vector is integrated by site-specific recombination into the bacterial genome, said vector may comprise two recombination sites, such as "att" sites.
  • stably vector integrated in a bacterium a vector that is replicated within said bacterium and can transmit a copy to descendants of said bacterium.
  • Said vector can be introduced into a bacterium of the genus Streptomyces by conventional methods, such as transformation, for example by thermal shock, or intergeneric conjugation.
  • Genetically modified bacterium means a bacterium whose genetic heritage has been modified by genetic engineering with respect to that of the same bacterium found in nature.
  • the invention relates to genetically modified bacteria of the genus Streptomyces, stably comprising an expression vector comprising:
  • constitutive promoter is meant a promoter that is active in all circumstances in Streptomyces and is not itself subject to a regulatory system.
  • constitutive promoters may be selected from the constitutive promoters conventionally used in Streptomyces, such as the permE * promoter (Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics: John Innes Foundation) or galP2 (Fornwald et al., Proc Natl. Acad Sci USA 1987, 84 (8): 2130-2134).
  • the promoter used in this vector for the implementation of the invention is the permE * promoter, which is a strong promoter in Streptomyces.
  • the nucleic sequence of a "CebRbox" region of 10 to 20 nucleotides can be determined by an in silico study of the genomes of the bacteria, in particular those of the genus Streptomyces, in comparison with a sequence SEQ ID NO: 1, which is the consensus sequence of the "CebR-box" region of Streptomyces griseus.
  • the search for sequence homology can be carried out, for example using the PREDETECTOR software (Hiard et al., Biochem Biophys Res Commun., 2007, 357 (4): 861-4).
  • the aforementioned nucleic acid "CebR-box” may be placed upstream of the promoter or between the promoter and the reporter gene.
  • said nucleic acid of 10 to 20 nucleotides is represented by the sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence having at least 85%, in particular 90%, more particularly 95%, identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • said nucleic acid of 10 to 20 nucleotides is a nucleic acid of a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2-10.
  • said nucleic acid "CebR-Box” is a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the reporter gene in such an expression vector is a gene which can be selected or detected by biochemical, biological or physical methods, in particular a gene encoding or to activate an indicator molecule.
  • Said reporter gene may be a gene encoding an enzyme that degrades a colored substrate or results in the production of a colored compound, in particular xylE of Pseudomonas putida, redD of Streptomyces coelicolor, melC of Streptomyces glaucescens.
  • the reporter gene may also be a gene encoding a fluorescent or chemiluminescent protein selected from the group consisting of GFP, eGFP, RFP, luxA, luxB, or a gene for resistance to at least one antibiotic.
  • a fluorescent or chemiluminescent protein selected from the group consisting of GFP, eGFP, RFP, luxA, luxB, or a gene for resistance to at least one antibiotic.
  • an antibiotic resistance gene may be the nptII gene which confers on bacteria resistance to kanamycin, neomycin or the ampR gene which confers on bacteria an ampicillin resistance.
  • a particular embodiment of the invention relates to genetically modified bacteria of the genus Streptomyces, comprising an expression vector comprising:
  • the xylE gene encodes catechol dioxygenase, an enzyme that converts catechol, a colorless substrate, into a dark yellow product (2-hydroxymuconic semialdehyde).
  • the expression of the xylE gene in the bacterium is under the control of the "CebR-box" region and cello-oligosaccharide compounds via the CebR protein.
  • the expression of the xylE gene is repressed by the CebR protein by binding to the "CebR-box” region. This repression is lifted by cello-oligosaccharide compounds, which can be released during the fungal degradation of wood.
  • a more particular embodiment of the invention relates to genetically modified bacteria of the genus Streptomyces, comprising an expression vector comprising:
  • the genetically modified bacteria of the invention belong to the species Streptomyces ambofaciens or Streptomyces coelicolor.
  • the invention relates more particularly to a strain of Streptomyces spp. genetically modified, said strain being registered under number CNCM 1-4930 on December 17, 2014 and comprising an expression vector obtained from the vector pIB139 in which are inserted the nucleic acid "CebR-box" of sequence SEQ ID NO: 2 and the xylE reporter gene of Pseudomonas putida.
  • the present invention also relates to an expression vector to be introduced stably into bacteria of the genus Streptomyces or any other bacterium having recombination sites, allowing specific insertion.
  • Said vector comprises:
  • nucleic acid of 10 to 20 nucleotides being capable of preventing transcription of the reporter gene, when said CebR protein is attached to said nucleic acid.
  • Said vector also comprises all the elements necessary for the replication of said molecule and the expression of the genes carried by this vector in a bacterium in which it must be introduced.
  • this vector is a vector to be integrated in a bacterial genome, it also includes specific recombination sites, such as "att" sites.
  • said vector comprises:
  • said vector comprises: (i) a nucleic acid whose sequence is chosen from the sequences SEQ ID NO: 2-10,
  • Another objective of the invention is to provide a bacterial biosensor for the bio-degradation of wood.
  • a biosensor of the invention is capable of to indicate the presence or absence of these residues in 24 hours.
  • a biosensor according to the present invention makes it possible to indicate the biodegradation of the wood, in particular due to an attack of at least one lignivorous fungus, by the detection of the presence of the degradation compounds, in particular cello-oligosaccharides, released by this fungal attack. .
  • lignivorous fungus is understood to mean a fungus that feeds on organic carbonaceous and nitrogenous material from the wood and therefore causes degradation of the wood.
  • wood-eating fungi can be grouped into three main groups: brown rot fungi, white rot fungi, and soft rot fungi.
  • Serpula poria, Coniophora tenuna, Antrodia vaillantii, or Lenzites betulinus may be mentioned as brown rot fungi; the Phanerochaete, Donkiopera expansa, Heterobasidion annosum, Coriolus versicolor, Fomes fomentarius, Asterostroma cervicolor and Trametes versicolor as white rot fungi; Chaetomium, Phialophora and Humicola as soft rot fungi.
  • biosensor The concept of biosensor is defined, according to IUPAC criteria (Nagel et al., Pure & Appl Chem, Vol 64, No. 1, pp. 143-168, 1992.), as a "small device”. and compact that uses specific reactions induced by enzymes, immunosystems, tissues, organelles or whole cells in response to the detection of compounds.
  • the biosensor of the present invention comprises a strain of genetically modified bacteria as described above and detects the presence of the compounds released by a fungal attack using the expression of the reporter gene, which is under the control of the control system. "CebR" regulation.
  • a biosensor of the invention may in particular indicate the bio-degradation of wood by the detection of cello-oligosaccharides released by fungal attack.
  • a biosensor of the present invention may further comprise accessory elements, for example elements allowing the bacteria to remain alive, such as a culture medium, a physical support, or a substrate that collaborates with the protein expressed by the gene. rapporteur to indicate the presence of compounds from wood degradation.
  • accessory elements for example elements allowing the bacteria to remain alive, such as a culture medium, a physical support, or a substrate that collaborates with the protein expressed by the gene. rapporteur to indicate the presence of compounds from wood degradation.
  • a particular embodiment of the invention relates to a bacterial biosensor for the bio-degradation of wood constituted by a strain of genetically modified bacteria according to the invention.
  • a more particular embodiment of the invention relates to a wood biodegradation biosensor comprising or consisting of a strain of Streptomyces spp. genetically modified under number CNCM 1-4930.
  • the subject of the present invention is also the use of a biosensor as described above for detecting the bio-degradation of wood due to a fungal attack, in particular due to an attack of at least one lignivorous fungus.
  • the expression of the reporter gene signifies the presence of the compounds, in particular cells. oligosaccharides, released by wood degradation and therefore indicates the bio-degradation of wood.
  • biosensor of the invention makes it possible to rapidly detect the bio-degradation of the wood, because in the presence of the compounds that lift the transcriptional repression of the reporter gene, the expression of this gene becomes visible only after 24 hours of culture of the bacteria. .
  • the biosensor of the invention is capable of detecting the bio-degradation of different wood species, by different decaying agents, or after different degradation times.
  • a biosensor of the invention as described above can be used to detect the biodegradation of previously treated wood against rotting.
  • Such treatment may be any anti-decay treatment conventionally used for the storage and preservation of wood.
  • These methods include chemical treatment methods, such as impregnation of wood with chemicals, including products comprising arsenic, zinc or copper, modification of the wood structure by chemical treatment. , or methods by physical treatment, such as autoclaving.
  • a biosensor of the invention as described above can be used to indicate the effectiveness of anti-decay treatment of wood.
  • the invention more particularly relates to genetically modified bacteria of the genus Streptomyces as described above and which are resistant to arsenic, zinc or copper, and their use for detecting the biodegradation of wood previously treated with products comprising arsenic, zinc or copper.
  • the above-mentioned bacteria are obtained by transformation of a strain naturally resistant to arsenic, zinc or copper with a vector according to the present invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for detecting the bio-degradation of wood.
  • the method comprises the following steps:
  • said bacteria are incubated according to the conventional culture conditions.
  • FIGS. 1A and 1B illustrate the control mechanism of the CebR system under natural conditions.
  • Figures 1C and 1D show the mechanism of action of a biosensor of the invention.
  • FIG. 1A In the absence of wood degradation compounds, the CebR protein binds to the "CebR box" region located in the promoter region of the genes it regulates and inactivates its expression.
  • Figure 1B Compounds of wood degradation, when present, compete with the "CebR box" for the binding of CebR protein, thus lifting the repression of the regulated genes and leading to its expression.
  • Figure 1C The binding of CebR on the "CebR box” region prevents the constitutive expression of the reporter gene and the activation of the indicator molecule.
  • Figure 1D In the presence of wood degradation compounds, the removal of the inhibition of transcription of the reporter gene activates the indicator molecule and thus reveals the presence of these compounds.
  • FIGS. 3A and 3B illustrate the color change, in the absence or in the presence of cellobiose, of a bacterial strain of the invention as a biosensor for the bio-degradation of wood.
  • Figure 3A The bacteria of the invention were streaked and incubated on rich medium with mannitol as the only carbon source.
  • Figure 3B The bacteria of the invention were streaked on the same medium, but supplemented with cellobiose (5g / L) signal molecule of wood degradation. After 2 days of growth, the dishes were sprayed with catechol (developer). After 30 minutes, the strain biosensor in the presence of cellobiose transformed the catechol into a yellow compound, appreciable to the naked eye and significantly higher than the low background observed in the absence of cellobiose.
  • Figure 4A It illustrates the result of the susceptibility test of a bacterial strain of the invention as a biosensor for the bio-degradation of wood.
  • the bacterial strain of the invention was incubated from 18 to 20 H in a liquid medium (modified HT medium) supplemented with 15 ⁇ 10 3 , 300, 15 or 1.5 ⁇ l of cellobiose and compared with the same strain incubated in a medium containing no no cellobiose.
  • the ordinate axis represents the oxidation of the cathecol by the product of the reporter gene (xylE), followed by spectrometry at 375 nm and relative to the amount of total proteins in order to standardize the experiments (ordinate axis).
  • Figure 4B It illustrates the result of the test for detection of fungal attack of wood by a bacterial strain of the invention as a biosensor.
  • the bacterial strain was incubated in a liquid medium (modified HT medium) supplemented with either a non-degraded spruce leachate (control) or with a spruce leachate which had been in the process of being degraded for 7 weeks by Poria placenta.
  • the ordinate axis represents the oxidation of the cathecol by the reporter gene product (xylE), followed by spectrometry at 375 nm.
  • the experiments with the leachates of wood were carried out three times. The significance of the results was assessed using a t-student test (p> 0.05).
  • the binding region of the CebR protein was identified, isolated and cloned between a strong promoter (permE *), a translation site (RBS) and a reporter gene (xylE).
  • the xylE gene is amplified from the primers Biosens_F (SEQ ID NO: 11) and Biosens_R (SEQ ID NO: 12), the Biosens_F primer containing the sequences of the "CebR box" region, as well as the initiation site of translation (RBS, Ribosome binding site). This construction was obtained by PCR and then cloned into the vector pIB139 (FIG 2).
  • the vector is then transferred to a Streptomyces strain by intergeneric conjugation and stably integrated with the genome of the recipient bacterium.
  • Streptomyces are grown in SFM (Soy flour medium) for genetic engineering experiments.
  • This culture medium contains 8 g of soy flour, 8 g of bacto agar and 8 g of mannitol for a volume of 400 ml.
  • the medium used for the tests of Streptomyces in solid culture medium (Petri dish) or in liquid medium is the medium HT (Hickey-Tresner medium) modified, which contains 1 g of yeast extract, 1 g of extract of beef, 5 g mannitol, 2 g bacto-tryptone and 0.02 g COC for a volume of IL.
  • This medium is adjusted to pH 7.3.
  • this medium is a solid medium, it also contains 20 g of bacto agar.
  • a quantification protocol for the color indicator has been developed using liquid cultures.
  • Cell suspensions obtained after 18-22 hours of growth in the presence or absence of inducing compounds were lysed by sonication.
  • the cell lysate is then contacted with a reaction buffer containing catechol, the substrate of the xylE gene.
  • the intensity of the reaction was then measured by an optical density measurement at 375 nm and weighted between the different experiments by the amount of protein present in the cell lysate (Bradford test).
  • This protocol has been optimized in particular microplate, allowing the treatment of a large number of samples at a time. Reaction time kinetics make it possible to determine that the detection reaction is stable and measurable over time over nearly an hour.
  • the detection of fungal attack of wood is carried out in a context similar to that used in standard EN113 / A1 (March / 2004).
  • the tests were carried out for the CNCM 1-4930 strain used as a biosensor in the presence of degraded wood leachates.
  • the leachates were recovered by vacuum infiltration of acetate buffer of spruce specimens attacked by the lignivorous fungus Poria Placenta for seven weeks.
  • the reporter gene activity in the presence of degraded wood leachates is twice as high as the background noise observed with non-degraded wood leachate ( Figure 4B).

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Abstract

L'invention concerne des bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, ainsi que l'utilisation de ces bactéries comme biosenseur pour détecter la bio-dégradation du bois due à une attaque fongique.

Description

Biosenseur bactérien de la dégradation du bois
La présente invention concerne un biosenseur bactérien de la dégradation du bois.
La bio-dégradation du bois est un phénomène primordial des écosystèmes forestiers car il permet le recyclage de la matière organique et le bon fonctionnement de la forêt. Cette dégradation est en très grande partie due à des microorganismes et est généralement initiée par des champignons lignolytiques. Toutefois, cette primodégradation permet rapidement l'installation de communautés bactériennes plus ou moins complexes qui tirent profit des composés lignocellulosiques devenus accessibles suite à cette attaque fongique. Au niveau économique, l'exploitation des capacités de dégradation de ces consortia microbiens représente actuellement un intérêt évident pour la chimie verte et les biotechnologies de l'environnement, avec notamment la dégradation des éléments lignocellulosiques récalcitrants de la biomasse. En revanche, la biodégradation du bois constitue un problème économique considérable quand elle concerne le bois utilisé ou conservé en tant que matériaux de construction, tel que le bois utilisé pour les charpentes, les cloisons ou les mobiliers. A cause de la biodégradation lors de son stockage, environ 13 à 30% des grumes deviennent ainsi impropres à la commercialisation après 6 mois de stockage. Le coût de cette biodégradation est donc considérable.
Actuellement, l'attaque par les champignons est constatée par des tests décrits dans la norme européenne EN113/A1 (Août/2004) intitulée «Produits de préservation du bois - Méthode d'essai pour déterminer l'efficacité protectrice vis-à-vis des champignons basidiomycétes lignivores Détermination du seuil d'efficacité ». Selon ces tests normatifs, l'attaque fongique est révélée par la différence de masse entre des échantillons de bois à analyser et un échantillon de bois non dégradé en tant que contrôle. Par exemple, pour déterminer l'efficacité d'une méthode ou d'un produit de protection du bois, des échantillons de bois sont traités par différentes concentrations d'agents protecteurs du bois et exposés à des champignons appartenant à des genres différents. Après 16 semaines d'exposition, ces échantillons sont lavés, séchés puis pesés. La différence de perte de masse entre un échantillon traité et un échantillon non-traité permet de conclure sur la qualité de la protection du matériau.
La durée du temps de ce test est très longue pour les industries qui ont besoin de savoir rapidement si le bois a subi une bio-dégradation ou si une mesure de protection a fonctionné.
Il existe par conséquent un besoin de développer des outils permettant de détecter rapidement l'attaque biologique du bois et d'évaluer rapidement l'efficacité d'un traitement de protection du bois.
La présente invention a pour objectif de développer un outil et une méthodologie permettant de diagnostiquer rapidement, spécifiquement et avec une haute sensibilité l'attaque fongique du bois.
L'invention concerne l'utilisation de certains microorganismes du sol, plus particulièrement les bactéries saprophytes du genre Streptomyces, qui sont incapables d'initier la dégradation du bois, mais qui en revanche sont prompts à reconnaître et à utiliser certains composés spécifiques libérés par tous les types de bois lors des premières étapes de l'attaque fongique, tels que les dérivés de cellulose, hémicelluloses, lignines, cello-oligosaccharides, cellobioses.
Les bactéries du genre Streptomyces peuvent coloniser le bois en décomposition et possèdent des enzymes leur permettant de dégrader et de métaboliser les sucres complexes libérés lors de l'attaque fongique. Les études in silico ont également révélé qu'une grande partie des gènes codant ces enzymes cellulolytiques étaient sous la dépendance d'un système de régulation désigné « CebR », constitué par une protéine CebR et une région de 10 à 20 nucléotides, nommée « CebR-box », située dans les régions promotrices de ces gènes.
La protéine CebR est une protéine très conservée au sein des bactéries du genre Streptomyces. Des protéines ayant des séquences d'acides aminés et une fonction très similaires existent aussi chez d'autres genres de bactéries, tels que Thermobifida fusca (Spiridonov et al., 1999, J. Biol. Chem. , 274: 13127-13132), Actinosynnema mirum (Anderson et al ., 2012, PLoS ONE 7(6) :e39331), Jonesia denitrificans (Anderson et al., 2012), Cellulomonas flavigena (Anderson et al., 2012), ou Streptosporangium roseum (Anderson et al. 2012). La protéine CebR est un régulateur majeur du catabolisme de cellulose/cellooligosaccharides chez Streptomyces. Elle peut réprimer la transcription de ses gènes ciblés, regroupés dans l'opéron ceb, en se fixant sur la région « CebR-box », située dans les régions promotrices de ces gènes.
La région « CebR-box » est également une région très conservée au sein des bactéries du genre Streptomyces. Des régions d'ADN ayant une séquence nucléique et une fonction similaire sont également présentes chez d'autre genre de bactéries, telles que Thermobifida fusca (Spiridonov et al., 1999), Actinosynnema mirum (Anderson et al., 2012), Jonesia denitrificans (Anderson et al., 2012), Cellulomonas flavigena (Anderson et al., 2012), ou Streptosporangium roseum (Anderson et al., 2012).
Les composés de la dégradation du bois, tels que les cello- oligosaccharides, notamment la cellobiose, peuvent également se lier à la protéine CebR et ainsi empêcher ce dernier de se fixer sur la région « CebR- box ». En conséquence, en se liant à la protéine CebR, ces composés peuvent lever la répression transcriptionnelle de cette protéine vis-à-vis des gènes sous le contrôle de la région « CebR-box » et aboutir à l'expression de ces enzymes cellulolytiques.
L'invention repose sur l'utilisation des bactéries du genre Streptomyces génétiquement modifiées, dans lesquelles est introduite une combinaison d'ADN de la région « CebR-box » avec un gène rapporteur. La protéine CebR à l'aide de la région « CebR-box » permet effectivement de contrôler également l'expression d'un gène exogène, tel qu'un gène rapporteur exogène.
L'invention porte sur des bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant stablement un vecteur d'expression comprenant :
(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de fixer la protéine CebR, et
(ii) un gène rapporteur,
ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides étant capable d'empêcher la transcription du gène rapporteur, lorsque la protéine CebR est fixée sur ledit acide nucléique.
En l'absence de composés cello-oligosaccharides, l'expression d'un gène rapporteur dans ces bactéries est réprimée par la protéine CebR qui se fixe sur la région « CebR-box ». Au contact des composés cello-oligosaccharides, qui peuvent être les produits libérés lors d'une attaque fongique de la dégradation du bois, cette répression est levée et le gène rapporteur est exprimé pour donner un signal détectable.
On entend par vecteur d'expression, une molécule d'ADN à double-brins circulaire ou linéaire, comportant les éléments nécessaires pour la réplication de ladite molécule et l'expression des gènes portés par ce vecteur dans une bactérie du genre Streptomyces.
Ces éléments sont par exemple une origine de réplication, un promoteur, un site de fixation ribosomique, un codon d'initiation de la traduction, un codon-stop de la traduction, un terminateur de transcription. Ledit vecteur d'expression peut comporter en outre un enhancer, un marqueur de sélection, et au moins un site de restriction.
Chacun de ces éléments peut être choisi parmi ceux utilisés conventionnellement dans un vecteur d'expression pour les Streptomyces.
Le susdit vecteur d'expression peut être soit intégré, par exemple par recombinaison site-spécifique, dans le chromosome de bactérie, soit indépendant de ce dernier.
Lorsque ledit vecteur d'expression est intégré par recombinaison site- spécifique dans le génome de bactérie, ledit vecteur peut comporter deux sites de recombinaison, tels que les sites « att ».
On entend par vecteur « stablement » intégré dans une bactérie, un vecteur qui est répliqué au sein de ladite bactérie et peut transmettre une copie aux générations descendantes de ladite bactérie.
Ledit vecteur peut être introduit dans une bactérie du genre Streptomyces par les méthodes conventionnelles, telles que la transformation, par exemple par choc thermique, ou la conjugaison intergénérique.
On entend par « bactérie génétiquement modifiée », une bactérie dont le patrimoine génétique a été modifié par génie génétique par rapport à celui de la même bactérie présente dans la nature.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention porte sur des bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant stablement un vecteur d'expression comprenant :
(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de fixer la protéine CebR, (ii) un gène rapporteur, et
(iii) un promoteur constitutif.
On entend par « promoteur constitutif », un promoteur qui est actif dans toutes les circonstances chez les Streptomyces et n'est pas, lui-même soumis, à un système de régulation.
Ces promoteurs constitutifs peuvent être choisis parmi les promoteurs constitutifs utilisés conventionnellement chez les Streptomyces, tels que le promoteur permE*( Kieser et al., 2000, Practical Streptomyces Genetics : John Innés Foundation) ou galP2 (Fornwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987; 84(8) : 2130-2134).
Dans un mode de réalisation plus particulier, le promoteur utilisé dans ce vecteur pour la mise en œuvre de l'invention est le promoteur permE*, qui est un promoteur fort chez les Streptomyces.
La séquence nucléique d'une région « CebR-box » de 10 à 20 nucléotides peut être déterminée par une étude in silico des génomes des bactéries, notamment ceux du genre Streptomyces, en comparaison avec une séquence SEQ ID NO : 1, qui est la séquence consensus de la région « CebR-box » de Streptomyces griseus. La recherche d'homologie de séquences peut être effectuée, par exemple à l'aide du logiciel PREDETECTOR (Hiard et al., Biochem Biophys Res Commun. , 2007, 357(4) : 861-4).
Le susdit acide nucléique « CebR-box » peut être placé en amont du promoteur ou entre le promoteur et le gène rapporteur.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides est représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, plus particulièrement 95%, d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides est un acide nucléique d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2- 10.
De préférence, ledit acide nucléique « CebR-Box » est un acide nucléique de séquence SEQ ID NO: 2.
Conformément à l'invention, le gène rapporteur dans un tel vecteur d'expression est un gène sélectionnable ou détectable par des méthodes biochimiques, biologiques ou physiques, notamment un gène codant ou permettant d'activer une molécule indicatrice. Ledit gène rapporteur peut être un gène codant une enzyme dégradant un substrat coloré ou aboutissant à la production d'un composé coloré, notamment xylE de Pseudomonas putida, redD de Streptomyces coelicolor, melC de Streptomyces glaucescens.
Ledit gène rapporteur peut être aussi un gène codant une protéine fluorescente ou chimioluminescente choisie dans le groupe comprenant GFP, eGFP, RFP, luxA, luxB, ou un gène de résistance à au moins un antibiotique. A titre d'exemple, un tel gène de résistance aux antibiotiques peut être le gène nptll qui confère aux bactéries une résistance à la kanamycine, néomycine ou le gène ampR qui confère aux bactéries une résistance à l'ampicilline.
Les séquences nucléiques de ces susdits gènes rapporteurs sont déjà décrites dans l'art antérieur et disponibles dans les bases des données spécifiques, telles que la base des données « Genbank » ou « EMBL ».
Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne les bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant un vecteur d'expression comprenant :
(i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10, et
(ii) le gène rapporteur xylE.
Le gène xylE code la dioxygénase de catéchol, une enzyme qui convertit le catéchol, substrat incolore, en un produit de couleur jaune foncé (2- hydroxymuconic semialdehyde). Dans ce mode de réalisation de l'invention, l'expression du gène xylE dans la bactérie est sous le contrôle de la région « CebR-box » et des composés cello-oligosaccharides par l'intermédiaire de la protéine CebR. En l'absence de ces composés, l'expression du gène xylE est réprimée par la protéine CebR en se fixant sur la région « CebR-box ». Cette répression est levée par les composés cello-oligosaccharides, qui peuvent être libérés lors de la dégradation fongique du bois.
Un mode de réalisation plus particulier de l'invention concerne les bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces, comportant un vecteur d'expression comprenant :
(i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10,
(ii) le gène rapporteur xylE, et (iii) le promoteur pErmE*.
Dans un autre mode de réalisation particulier, les bactéries génétiquement modifiées de l'invention appartiennent à l'espèce Streptomyces ambofaciens ou Streptomyces coelicolor.
L'invention concerne plus particulièrement une souche de Streptomyces spp. génétiquement modifiée, ladite souche étant enregistrée sous le numéro CNCM 1-4930 le 17 décembre 2014 et comportant un vecteur d'expression obtenu à partir du vecteur pIB139 dans lequel sont insérés l'acide nucléique « CebR-box » de séquence SEQ ID NO : 2 et le gène rapporteur xylE de Pseudomonas putida.
La présente invention concerne également un vecteur d'expression destiné à être introduit stablement dans les bactéries du genre Streptomyces ou toute autre bactérie comportant des sites de recombinaison, permettant une insertion spécifique.
Ledit vecteur comprend :
(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de se fixer à la protéine CebR,
(ii) un gène rapporteur, et
(iii) un promoteur,
ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides étant capable d'empêcher la transcription du gène rapporteur, lorsque ladite protéine CebR est fixée au dit acide nucléique.
Ledit vecteur comprend également tous les éléments nécessaires pour la réplication de ladite molécule et l'expression des gènes portés par ce vecteur dans une bactérie dans laquelle il doit être introduit.
Lorsque ce vecteur est un vecteur à intégrer dans un génome bactérien, il comprend également les sites de recombinaison spécifique, tels que les sites « att ».
Dans un mode de réalisation particulier, ledit vecteur comprend :
(i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences
SEQ ID NO : 2-10,
(ii) le gène rapporteur xylE, et
(iii) un promoteur.
Dans un mode réalisation plus particulier, ledit vecteur comprend : (i) un acide nucléique dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10,
(ii) le gène rapporteur xylE, et
(iii) le promoteur pErmE*.
Un autre objectif de l'invention est de mettre à disposition un biosenseur bactérien de la bio-dégradation du bois.
Contrairement à la méthode classique décrite dans la norme européenne EN113/A1 (Août/2004), qui nécessite au moins 16 semaines d'expérience pour indiquer la présence ou pas de la bio-dégradation du bois, un biosenseur de l'invention est capable d'indiquer la présence ou pas de ces résidus en 24 heures.
Un biosenseur selon la présente invention permet d'indiquer la biodégradation du bois, notamment due à une attaque d'au moins un champignon lignivore, par la détection de la présence des composés de dégradation, notamment les cello-oligosaccarides, libérés par cette attaque fongique.
On entend par « champignon lignivore » un champignon qui se nourrit de matière organique carbonée et azotée en provenance du bois et cause par conséquent la dégradation du bois.
Selon leurs modes d'attaque, les champignons lignivores peuvent être regroupés en trois groupes principaux : les champignons à pourritures brunes, les champignons à pourritures blanches, et les champignons à pourritures molles.
A titre d'exemple, nous pouvons citer Serpula poria, Coniophora puteana, Antrodia vaillantii, ou Lenzites betulinus comme les champignons à pourritures brunes ; les Phanerochaete, Donkiopera expansa, Heterobasidion annosum, Coriolus versicolor, Fomes fomentarius, Asterostroma cervicolor et Trametes versicolor comme les champignons à pourritures blanches ; les Chaetomium, les Phialophora et les Humicola comme les champignons à pourritures molles.
La notion de biosenseur est définie, selon les critères de l'IUPAC (Nagel et al., Pure & Appl. Chem. , Vol. 64, No. 1, pp. 143-168, 1992.), comme un « dispositif petit et compact qui utilise des réactions spécifiques induites par des enzymes, des immunosystèmes, des tissus, des organelles ou des cellules entières en réponse à la détection des composés ». Le biosenseur de la présente invention comprend une souche de bactéries génétiquement modifiées telles que décrites ci-dessus et détecte la présence des composés libérés par une attaque fongique à l'aide de l'expression du gène rapporteur, qui est sous le contrôle du système de régulation « CebR ».
Un biosenseur de l'invention peut notamment indiquer la bio-dégradation du bois par la détection des cello-oligosaccarides libérés par attaque fongique.
Un biosenseur de la présente invention peut comprendre en outre des éléments accessoires, par exemple des éléments permettant le maintien en vie des bactéries, tels qu'un milieu de culture, un support physique, ou un substrat qui collabore avec la protéine exprimée par le gène rapporteur pour indiquer la présence des composés issus de la dégradation du bois.
Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne un biosenseur bactérien de la bio-dégradation du bois constitué par une souche des bactéries génétiquement modifiées conformes à l'invention.
Un mode plus particulier de l'invention concerne un biosenseur de biodégradation du bois comprenant ou constitué par une souche de Streptomyces spp. génétiquement modifiée enregistrée sous le numéro CNCM 1-4930.
Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un biosenseur tel que décrit ci-dessus pour détecter la bio-dégradation du bois due à une attaque fongique, notamment due à une attaque d'au moins un champignon lignivore.
L'expression du gène rapporteur, visualisée par un changement de couleur ou tout autre signal détectable de manière optique (à l'œil ou par lecture spectrophotométrique dans le visible) et supérieur au témoin négatif, signifie la présence des composés, notamment des cello-oligosaccarides, libérés par la dégradation du bois et indique par conséquent la bio-dégradation du bois.
L'utilisation d'un biosenseur de l'invention permet de détecter rapidement la bio-dégradation du bois, car en présence des composés levant la répression transcriptionnelle du gène rapporteur, l'expression de ce gène devient visualisable seulement après 24H de culture des bactéries.
Le biosenseur de l'invention est apte à la détection de la bio-dégradation de différentes essences de bois, par différents agents de pourriture, ou après différents temps de dégradation. Dans un mode réalisation plus particulier, un biosenseur de l'invention tel que décrit ci-dessus peut être utilisé pour détecter la bio-dégradation du bois préalablement traité contre le pourrissement.
Un tel traitement peut être n'importe quel traitement anti-pourrissement conventionnellement utilisé pour le stockage et la conservation du bois. Parmi ces méthodes, on peut citer des méthodes par traitement chimique, telles que l'imprégnation du bois par des produits chimiques, notamment des produits comprenant de l'arsenic, du zinc ou du cuivre, la modification de la structure du bois par traitement chimique, ou des méthodes par traitement physique, tel que l'autoclavage.
Dans un mode de réalisation de l'invention, un biosenseur de l'invention tel que décrit ci-dessus peut être utilisé pour indiquer l'efficacité d'un traitement anti-pourrissement du bois.
L'invention concerne plus particulièrement les bactéries génétiquement modifiées du genre Streptomyces telles que décrites précédemment et qui sont résistantes à l'arsenic, au zinc ou au cuivre, et leur utilisation pour détecter la bio-dégradation du bois préalablement traité par des produits comprenant de l'arsenic, du zinc ou du cuivre.
Les susdites bactéries sont obtenues par transformation d'une souche naturellement résistante à l'arsenic, au zinc ou au cuivre avec un vecteur conforme à la présente invention.
Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé de détection de la bio-dégradation du bois.
Ledit procédé comprend les étapes suivantes :
- récupérer les lixiviats d'un bois dont la dégradation éventuelle est à détecter,
- incuber les bactéries génétiquement modifiées conformes à l'invention dans un milieu contenant les lixiviats récupérés et
- révéler chez lesdites bactéries éventuellement lysées, l'expression du gène rapporteur contenu dans lesdites bactéries.
Dans ce procédé, lesdites bactéries sont incubées selon les conditions classiques de culture.
Lorsque les bactéries sont lysées pour révéler l'expression du gène rapporteur, la lyse des bactéries a lieu au moins après 24 H de culture. L'invention est illustrée ci-après plus en détail par les figures et les exemples.
Les figures 1A et 1B illustrent le mécanisme de régulation du système CebR en conditions naturelles. Les figures 1C et 1 D montrent le mécanisme d'action d'un biosenseur de l'invention.
Figure 1A : En l'absence de composés de dégradation du bois, la protéine CebR se fixe sur la région « CebR box » située dans la région promotrice des gènes qu'elle régule et en inactive l'expression.
Figure 1B : Des composés de la dégradation du bois, lorsqu'ils sont présents, sont en compétition avec la région « CebR box » pour la fixation de la protéine CebR, levant ainsi la répression des gènes régulés et conduisant à son expression.
Figure 1C : La fixation de CebR sur la région « CebR box » empêche l'expression constitutive du gène rapporteur et l'activation de la molécule indicatrice.
Figure 1D : En présence de composés de dégradation du bois, la levée de l'inhibition de la transcription du gène rapporteur permet d'activer la molécule indicatrice et révèle, par conséquent, la présence de ces composés.
Figure 2 : Schéma de développement du vecteur intégratif contenant la construction « CebR box-ι- gène rapporteur ».
Les figures 3A et 3B illustrent le changement de couleur, en l'absence ou en présence de la cellobiose, d'une souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur de la bio-dégradation du bois.
Figure 3A : Les bactéries de l'invention ont été striées et incubées sur un milieu riche avec du mannitol comme seule source de carbone.
Figure 3B : Les bactéries de l'invention ont été striées sur le même milieu, mais supplémenté avec de la cellobiose (5g/L), molécule signal de la dégradation du bois. Après 2 jours de croissance, les boîtes ont été vaporisées avec du catéchol (révélateur). Après 30 minutes, la souche biosenseur en présence de cellobiose a transformé le catéchol en un composé jaune, appréciable à l'œil nu et nettement supérieur au faible bruit de fond observé en l'absence de cellobiose. Figure 4A : elle illustre le résultat du test de sensibilité d'une souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur de la bio-dégradation du bois. La souche bactérienne de l'invention a été incubée de 18 à 20 H en milieu liquide (milieu HT modifié) complémenté avec 15xl03, 300, 15 ou 1,5 μΜ de cellobiose et comparée avec la même souche incubée dans un milieu ne contenant pas de cellobiose. L'axe des ordonnées représente l'oxydation du cathécol par le produit du gène rapporteur (xylE), suivie par spectrométrie à 375nm et rapportée à la quantité de protéines totales afin de standardiser les expériences (axe des ordonnées). Après 10 minutes de réaction, une activité du gène rapporteur significativement supérieure est observable pour des concentrations en cellobiose de 15xl03, 300 et 15 μΜ, traduisant une détection de la cellobiose par ladite souche bactérienne en tant que biosenseur. Les expériences de sensibilité ont été répétées deux fois. La significativité des résultats a été évaluée à l'aide d'un test de t-student (p>0,05).
Figure 4B : elle illustre le résultat du test de détection de l'attaque fongique du bois par une souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur. La souche bactérienne a été incubée en milieu liquide (milieu HT modifié) supplémenté avec soit un lixiviat d'épicéa non dégradé (contrôle), soit avec un lixiviat d'épicéa en cours de dégradation depuis 7 semaines par Poria placenta. L'axe des ordonnées représente l'oxydation du cathécol par le produit du gène rapporteur (xylE), suivie par spectrométrie à 375nm. Les expériences avec les lixiviats de bois ont été réalisées trois fois. La significativité des résultats a été évaluée à l'aide d'un test de t-student (p>0,05).
Exemples
1. Matériels et méthodes
1.1. Construction du vecteur d'expression
La région de fixation de la protéine CebR a été identifiée, isolée et clonée entre un promoteur fort (permE*), un site de traduction (RBS) et un gène rapporteur (xylE). Le gène xylE est amplifié à partir des amorces Biosens_F (SEQ ID NO : 11) et Biosens_R (SEQ ID NO : 12), l'amorce Biosens_F contenant les séquences de la région « CebR box », ainsi que le site d'initiation de la traduction (RBS, Ribosome binding site). Cette construction a été obtenue par PCR puis clonage dans le vecteur pIB139 (Fig . 2).
1.2. Obtention de la souche CNCM 1-4930
La préparation de cellules E.coli électrocompétentes et l'électroporation (transformation par choc électrique) du vecteur dans lesdites cellules sont réalisées selon le protocole de Sambrook & Russell (2001, Molecular cloning: a laboratory manual. 1 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Ledit vecteur est ensuite transféré dans une souche de Streptomyces par conjugaison intergénérique et intégrée de façon stable au génome de la bactérie réceptrice.
1.3 Culture de bactéries
Les Streptomyces sont cultivés dans le milieu SFM (Soy flour médium) pour les expériences de génie génétique.
Ce milieu de culture contient 8g de farine de soja, 8g de bacto agar et 8g de mannitol pour un volume de 400 ml.
Le milieu utilisé pour les tests des Streptomyces en milieu de culture solide (boite de Pétri) ou en milieu liquide est le milieu HT (Hickey-Tresner médium) modifié, qui contient 1 g d'extrait de levure, 1 g d'extrait de bœuf, 5 g de mannitol, 2 g de bacto-tryptone et 0,02g de COC pour un volume de IL. Ce milieu est ajusté à pH 7,3. Lorsque ce milieu est un milieu solide, il contient en outre 20 g de bacto agar.
2. Validation des constructions biosenseurs de l'invention
2.1. Tests sur boîte
Des tests de détection visuelle par strie des souches sur milieu gélosé supplémenté ou non avec de la cellobiose (5g/l) ou de l'Avicel® (5g/l) comme molécules potentiellement inductrices ont été réalisés. La cellobiose est un dimère de glucose constituant de base de la cellulose et présent dans les zones de dégradation du bois. L'Avicel® est une forme cristalline de cellulose. Des contrôles ont été réalisés en parallèle en striant les souches biosenseurs ou sauvages sur des milieux contenant ou non des composés inducteurs. Après 2 jours de croissance à 30°C, les boites ont été vaporisées avec le cathécol à 0,5M en tant que révélateur. La dégradation de ce substrat par le gène rapporteur xylE contenu dans le biosenseur conduit à une coloration jaune des colonies et/ou du milieu si le gène est exprimé (Fig . 3A, 3B). Cette coloration peut être observée visuellement. Les stries réalisées avec les souches sauvages sont restés incolores, indiquant l'absence d'activité catéchol dioxygénase endogène chez les Streptomyces. Les contrôles biosenseurs non induits ont parfois présenté un faible bruit de fond, suggérant une légère fuite de la construction. Toutefois l'intensité du signal était suffisamment faible pour ne pas générer de faux positifs dans l'interprétation des résultats. En présence d'Avicel®, les souches biosenseurs n'ont pas donné de signal significatif, indiquant que la cellulose cristalline est peu ou pas inductrice du biosenseur. Ce résultat suggère que le bois natif non attaqué ne serait pas susceptible d'induire de faux positifs. Les souches biosenseurs ont en revanche présenté une coloration jaune importante et significative sur milieu cellobiose (Fig . 3B), indiquant une reconnaissance de ce composé par le biosenseur.
2.2. Tests en culture liquide
Afin de s'affranchir du caractère potentiellement subjectif de l'estimation visuelle de la coloration du milieu par le biosenseur dans les tests sur boites, un protocole de quantification de l'indicateur coloré a été mis au point en utilisant des cultures liquides. Les suspensions cellulaires obtenues après 18- 22 heures de croissance en présence ou non de composés inducteurs ont été lysées par sonication. Le lysat cellulaire est ensuite mis en contact avec un tampon de réaction contenant du catéchol, le substrat du gène xylE. L'intensité de la réaction a ensuite été mesurée par une mesure de densité optique à 375 nm et pondérée entre les différentes expériences par la quantité de protéine présente dans le lysat cellulaire (test de Bradford). Ce protocole a notamment été optimisé en microplaque, permettant le traitement d'un grand nombre d'échantillons à la fois. Des cinétiques de temps de réaction permettent de déterminer que la réaction de détection est stable et mesurable dans le temps sur près d'une heure.
2.3. Test de spécificité Des tests de spécificité ont été réalisés en culture liquide en faisant croître les souches bactériennes en tant que biosenseurs et les souches sauvages en présence ou non de lixiviats d'épicéa non attaqué par des champignons. Aucun bruit de fond n'a été détecté avec les souches sauvages suite à l'ajout de catéchol dans les lysats cellulaires, confirmant l'absence d'activité catéchol dioxygénase endogène dans ces souches. Un léger bruit de fond a été mesuré avec les souches biosenseurs en l'absence ou en présence de lixiviat de bois non dégradé. Ce résultat suggère une fuite constitutive de notre construction non inhérente à la présence de bois sain,
Cette fuite est en revanche suffisamment faible et constante pour ne pas gêner l'interprétation des résultats réalisés par la suite avec des lixiviats de bois dégradé et ne génère donc pas de faux positifs.
2.4. Détection de l'attaque fongique du bois
La détection de l'attaque fongique du bois est effectuée dans un contexte similaire à celui utilisé dans la norme EN113/A1 (août/2004). Les tests ont été réalisés pour la souche CNCM 1-4930 utilisée en tant que biosenseur en présence de lixiviats de bois dégradé. Les lixiviats ont été récupérés par infiltration sous vide de tampon acétate d'éprouvettes d'épicéa attaqué par le champignon lignivore Poria Placenta pendant sept semaines. L'activité du gène rapporteur en présence de lixiviats de bois dégradé est deux fois supérieure au bruit de fond observé avec un lixiviat de bois non dégradé (fig 4B). Ces résultats permettent de détecter sans ambiguïté et de façon reproductible la dégradation du bois par rapport au bois sain et démontrent la validité de la souche bactérienne de l'invention en tant que biosenseur dans ce contexte.
Imprimé (original sous forme électronique)
(Cette feuille ne fait pas partie de la demande internationale ni ne compte comme une feuille de celle-ci)
du mandataire WOBI15UHPFOB
1 Les indications ci-dessous ont trait
au micro-organisme ou autre matériel
biologique visé dans la description :
1-1 page 9
1-2 ligne 17
1-3 Identification du dépôt
1 -3-1 Nom de l'institution de dépôt CNCM Collection nationale de cultures de microorganismes (CNCM)
1 -3-2 Adresse de l'institution de dépôt Institut Pasteur, 28, Rue du Docteur
Roux, 75724 Paris Cédex 15, France
1 -3-3 Date du dépôt 17 décembre 2014 (17.12.2014)
1 -3-4 Numéro d'ordre CNCM 1-4930
1-5 Etats désignés pour lesquels les
indications sont données De toutes les désignations
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Claims

REVENDICATIONS
1. Bactérie génétiquement modifiée du genre Streptomyces, comportant stablement un vecteur d'expression comprenant :
(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de fixer la protéine CebR, et
(ii) un gène rapporteur,
ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides étant capable d'empêcher la transcription du gène rapporteur, lorsque la protéine CebR est fixée audit acide nucléique.
2. Bactérie génétiquement modifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce que le susdit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides est représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, plus particulièrement 95%, d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, en particulier une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2-10.
3. Bactérie génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le gène rapporteur est un gène sélectionnable ou détectable par des méthodes biochimiques, biologiques ou physiques, ledit gène étant notamment un gène rapporteur choisi parmi xylE, luxA, luxB, redD, melC, un gène codant une protéine fluorescente choisie dans le groupe comprenant GFP, eGFP, RFP, ou un gène de résistance à au moins un antibiotique.
4. Bactérie génétiquement modifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite bactérie est une souche de Streptomyces spp. enregistrée sous le numéro CNCM 1-4930.
5. Vecteur d'expression destiné à être introduit stablement dans les bactéries du genre Streptomyces ou toute autre bactérie comportant des sites de recombinaison, permettant une insertion spécifique, ledit vecteur comprenant :
(i) un acide nucléique de 10 à 20 nucléotides capable de se fixer à la protéine CebR, et
(ii) un gène rapporteur,
(iii) un promoteur, ledit acide nucléique de 10 à 20 nucléotides étant capable d'empêcher la transcription du gène rapporteur, lorsque ladite protéine CebR est fixée à ledit acide nucléique.
6. Biosenseur bactérien de la bio-dégradation du bois, caractérisé en ce que ledit biosenseur comprend ou est constitué par une souche des bactéries génétiquement modifiées selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7. Utilisation d'un biosenseur selon la revendication 6 pour indiquer l'efficacité d'un traitement anti-pourrissement du bois.
8. Utilisation d'un biosenseur selon la revendication 6 pour détecter la biodégradation du bois due à une attaque fongique, notamment due à une attaque d'au moins un champignon lignivore.
9. Utilisation d'un biosenseur selon la revendication 8 pour détecter la biodégradation du bois préalablement traité contre le pourrissement par imprégnation de produits chimiques, par modification chimique de la structure du bois ou par des méthodes physiques.
10. Procédé de détection de la bio-dégradation du bois, comprenant les étapes suivantes :
- récupérer les lixiviats d'un bois dont la dégradation éventuelle est à détecter,
- incuber les bactéries génétiquement modifiées selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans un milieu contenant les lixiviats récupérés,
-révéler chez lesdites bactéries éventuellement lysées, l'expression du gène rapporteur contenu dans lesdites bactéries.
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