EP3137617A1 - Method for transforming levoglucosenone into 4-hydroxymethyl butyrolactone or 4-hydroxymethyl butenolide - Google Patents

Method for transforming levoglucosenone into 4-hydroxymethyl butyrolactone or 4-hydroxymethyl butenolide

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Publication number
EP3137617A1
EP3137617A1 EP15720056.9A EP15720056A EP3137617A1 EP 3137617 A1 EP3137617 A1 EP 3137617A1 EP 15720056 A EP15720056 A EP 15720056A EP 3137617 A1 EP3137617 A1 EP 3137617A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
levoglucosenone
dihydrolévoglucosénone
oxidation
lipase
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15720056.9A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Florent ALLAIS
Amandine FLOURAT
Aurélien PERU
Andreia TEIXEIRA
Fanny BRUNISSEN
Henry Eric SPINNLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP3137617A1 publication Critical patent/EP3137617A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C

Definitions

  • the present invention relates to a process for converting levoglucosenone to 4-hydroxymethylbutyrolactone or 4-hydroxymethylbutenolide.
  • Levoglucosenone is commonly used as a starting material for the synthesis of various chemical compounds of interest, in particular 4-hydroxymethylbutenolide, of formula (IIa), and of 4-hydroxymethylbutyrolactone, of formula (Mb):
  • levoglucosenone is converted in a conventional manner in two successive steps, the first of these steps consisting of a Baeyer-Villiger type oxidation reaction, to form a formate intermediate, followed by a hydrolysis step. acid to form 4-hydroxymethylbutenolide.
  • levoglucosenone is first subjected to a catalytic hydrogenation step, so as to form dihydrolivoglucosénone which is then subjected to the transformation steps described above with reference to levoglucosenone.
  • the present invention therefore aims to remedy the disadvantages of the methods proposed by the prior art for the conversion of levoglucosenone to 4-hydroxymethylbutyrolactone or 4-hydroxymethylbutenolide, in particular to those described above, by proposing such a process which makes it possible to obtain high levels of conversion of levoglucosenone, in a short time, not exceeding a few hours, and using reagents devoid of toxicity and respectful of the environment.
  • a further object of the invention is that this method is economical to implement.
  • this method comprises the following successive steps. a) Where appropriate, to obtain a compound of general formula (II) in which R represents -CH 2 -CH 2 -, it is firstly carried out a step of hydrogenation of levoglucosenone (la), so as to form dihydrolivoglucosénone of formula (Ib):
  • This step can be carried out by any conventional method in itself, in particular by catalytic hydrogenation in the presence of palladium on carbon.
  • the reaction medium obtained at the end of this step b) comprises a mixture of the target compound (IIa) or (Mb) with the corresponding formate (Nia) or (IIIb).
  • This step can be carried out by any conventional method in itself, for example using hydrochloric acid, especially in solution in methanol, acetic acid, sulfuric acid, an Amberlyst® type resin. or any acidic zeolite.
  • the hydrolysis step may otherwise be made in basic conditions, according to any conventional method in itself for the skilled person.
  • d) Where appropriate, to obtain a compound of general formula (II) in which R represents -CH 2 -CH 2 -, that is to say to obtain 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb), if a step a) has not been carried out, hydrogenation of the compound (IIa) obtained in step c).
  • This hydrogenation reaction may be carried out by any method known to those skilled in the art, in particular by catalytic hydrogenation, for example according to the methods indicated above.
  • step b) of oxidation of levoglucosenone, or dihydrolivoglucosénone is carried out by contacting a solution of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone in a solvent, with a lipase in the presence of an agent oxidant and an acyl donor compound.
  • the oxidation reaction is thus advantageously catalyzed enzymatically.
  • the resulting benefits are numerous, both from an economic and an ecological point of view.
  • the lipase exhibits no or very little toxicity, in particular in comparison with the metal catalysts and peracids used by the prior art.
  • the method according to the present invention is thus more advantageous than the processes proposed by the prior art, while having the advantage of a significant environmental gain. It has also been found by the present inventors, here again quite unexpectedly, that at the end of this stage b) of oxidation, the lipase has a significant residual activity, allowing it to be reused for catalyzing at least one, and even more, subsequent oxidation reactions according to the present invention. This result is all the more unexpected since the oxidation reaction of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone generates, as a byproduct of the reaction, formic acid, which is known to have a negative impact on the reaction. lipase activity.
  • the present invention advantageously provides, in preferred embodiments, that the process comprises a step of isolating the lipase from the reaction medium after this step b) oxidation, prior to the implementation of step c) hydrolysis, in particular acid hydrolysis.
  • the choice of the various preferential characteristics of the invention in particular the values of the different operational parameters of the levoglucosenone or dihydrolivoglucosenone oxidation step b), which are indicated below, is carried out according to the invention.
  • invention so as to obtain the highest conversion rates of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone possible, with a reduced reaction time, and while maintaining the enzyme strong residual activity at the end of the reaction, so as to be able to reuse it for subsequent reactions, and thereby limit the cost of implementing the process.
  • the lipase can be of any type. Preferentially, lipase B of Candida antarctica, known under the abbreviation CaL-B, is used. Other lipases, such as Candida rugosa or Rhizomucor miehei for example, can also be used.
  • the lipase may be used in free form in the reaction medium, that is to say in a form in which it is not immobilized on any solid support. The use of lipases in free form makes it possible in particular to obtain good yields of the oxidation reaction, in short times, especially a few hours, while having the advantage of a low cost of preparation.
  • the lipase is used in immobilized form on a solid support, so that it can easily be isolated from the reaction medium at the end of the oxidation step b).
  • a CaL-B lipase immobilized on a polymethylmethacrylate support such as the lipase marketed by Novozymes under the name Novozym® 435 designation.
  • the duration of step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone is between two and four hours, and preferably between about two and three hours. As previously stated, such a short reaction time allows for high conversion rates of levoglucosenone and dihydrolevoglucosenone.
  • the solvent used in the oxidation stage b), for the dissolution of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone can be of any type compatible with the action of the lipase. It may for example be an organic solvent, an organic solvent / water mixture, an ionic liquid, a eutectic solvent, or a mixture of such solvents, or even supercritical CO 2 .
  • This solvent may for example be chosen from toluene, dichloromethane, hexane, etc., or a mixture thereof.
  • the acyl donor compound may be of any conventional type in itself. It may in particular be constituted by a long-chain acid, such as a C2 to C30 linear chain saturated fatty acid, for example caprylic acid or capric acid.
  • the acyl donor compound and the solvent are constituted by the same product.
  • the solvent used for the dissolution of the levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone substrate is thus an organic solvent, preferably ethyl acetate, which at the same time ensures the function of acyl donor.
  • Other solvents, such as butyl acetate or ethyl propionate may otherwise be used, alone or in admixture with one another or with ethyl acetate.
  • ethyl acetate offers the advantage of being biobased, and of not having any toxicity for living organisms and for the environment.
  • the oxidizing agent used in step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolivoglucosénone is preferably chosen from hydrogen peroxide and carbamide peroxide, otherwise known as hydrogen peroxide - urea, in solution in water.
  • Such oxidizing agents have in particular a good stability, so that the risks associated with their industrial implementation are reduced.
  • the oxidizing agent is oxygen peroxide alone, that is to say not associated with urea, which makes it possible to obtain particularly high conversion rates.
  • the concentration of the oxidizing agent is at least equal to 1 molar equivalent relative to levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone. This concentration is preferably between 1 and 2 molar equivalents relative to levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone. Such a concentration range advantageously allows to obtain a high reaction yield, without causing denaturation of the lipase, which remains reusable for subsequent reactions.
  • the concentration of oxidizing agent is approximately equal to 1.2 molar equivalents relative to levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone.
  • the temperature of step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolivoglucosénone is preferably between 30 and 60 ° C, in order to ensure optimal functioning of the lipase. Preferably, this temperature is about 40 ° C. Such a temperature makes it possible in particular to obtain rapid kinetics of the oxidation reaction, while limiting the energy expenditure, and therefore the cost, associated with the implementation of the process according to the invention.
  • the concentration of levoglucosénone or dihydroglucosénone in the organic solvent is in addition preferably between 0.5 and 1 mol / L. Concentrations within such a range of values advantageously make it possible to obtain optimal yields of the oxidation reaction.
  • the co-products of the oxidation reaction namely acetic acid and formic acid, are eliminated as they are formed by in situ neutralization or extraction of the product. reaction medium.
  • step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolivoglucosénone is carried out in the presence, in the reaction medium, of at least one buffer substance, preferably of pKa between 5 and 9.6, or a mixture of such buffer substances.
  • a buffer substance advantageously neutralizes the co-products of the oxidation reaction that are acetic acid and formic acid, thereby preventing the deleterious effect that these acids could have on the lipase. It also maintains in the reaction medium an optimal pH for the operation of the latter.
  • the buffer substance may be a liquid buffer substance, such as a phosphate buffer, conventional in itself.
  • the buffer substance may be a solid buffer substance, preferably of pKa between 5 and 9.6, and preferably between 7.2 and 9.6.
  • solid buffer substance is meant a mixture of the two acid and basic forms of the buffer.
  • Such a solid form of the buffer substance has several advantages. It allows easy separation of the buffer substance and the reaction medium. In addition, and quite unexpectedly, the implementation of a solid buffer substance during the oxidation step has the effect of significantly increasing the speed of the oxidation reaction, compared with buffer-free conditions, and even, to a lesser extent, liquid buffer substances. Thus, the solid buffer substances make it possible to reach, within two hours of reaction, conversion close to 90%.
  • any type of solid buffer substance can be used in the context of the invention.
  • the solid buffer substance is chosen for its behavior in the reaction medium, in particular to ensure that it does not form a gel in this medium, so that, on the one hand, it does not interfere with the catalytic action of the reaction medium. lipase, and secondly, it is easily separable from the reaction medium at the end of the oxidation reaction.
  • a TAPS buffer substance N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -3-aminopropane sulfonic acid
  • a CAPSO buffer substance cyclohexylamino-3-hydroxy-2-propanesulphonic acid
  • the concentration of the solid buffer substance in the reaction medium is preferably between 20 and 100 mg / mL, ie between 10 and 50 mg / mL of each of the acid and basic forms of the buffer.
  • the amount of lipase used is between 56 and 1134 lipase units per millimole of levoglucosenone or of dihydrolivoglucosénone.
  • such a small amount of enzyme makes it possible to obtain high levels of conversion of levoglucosenone or dihydrolivoglucosenone in reduced reaction times.
  • the amount of lipase used is preferably between 227 and 1134 lipase units per millimole of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone.
  • the amount of lipase used is preferably between 56 and 227 lipase units per millimole of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone.
  • concentration ranges advantageously make it possible to obtain, at a temperature of 40 ° C., conversion rates of levoglucosenone or dihydrolivoglucosénone which are greater than 70%, in about two hours or about four hours respectively in the presence or absence of a solid buffer substance.
  • steps b) of oxidation and c) hydrolysis, in particular of acid hydrolysis, of the process according to the invention can be carried out in a single reactor, without isolation of the intermediate products.
  • These successive steps may otherwise be separated by an intermediate step of separating the lipase, and optionally the solid buffer substance, from the reaction medium, optionally followed by a step of concentration of this reaction medium prior to the implementation of step c) of hydrolysis, in particular of acid hydrolysis, of the mixture comprising the compound of formula (II) and the corresponding formate, to obtain 4-hydroxymethylbutenolide of formula (IIa) or 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb ).
  • FIGS. 1a, 1b and 1c show HPLC chromatograms obtained for samples taken from the reaction medium during the implementation of a step according to the invention for the oxidation of levoglucosenone (LGO) to 4-hydroxymethylbutenolide (HBO) and in the corresponding formate (FHBO), the samples being taken from the reaction medium after respectively 0 h, 1 h and 2 h of reaction;
  • LGO levoglucosenone
  • HBO 4-hydroxymethylbutenolide
  • FHBO corresponding formate
  • FIG. 2 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO), during the implementation of an oxidation step according to the invention, under the following different conditions : no solid buffer at 40 ° C, no solid buffer at 60 ° C, CAPSO solid buffer at 40 ° C, MOPS solid buffer at 40 ° C, TAPS solid buffer at 40 ° C;
  • FIG. 3 shows a graph illustrating the conversion rate of levoglucosenone (LGO), during the implementation of successive cycles of oxidation reactions according to the invention using the same lipase, for amounts of lipase in the initial reaction medium of 10% or 20% w / w (13 or 227 units / mmol) relative to the LGO, in the presence of a solid buffer;
  • FIG. 4 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) on the one hand, and cyclohexanone (CH) on the other hand, during the implementation of an oxidation step according to the invention;
  • FIG. 5 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) during the implementation of an oxidation step according to the invention, with as agent oxidizing hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide - urea (UHP);
  • FIG. 6 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) during the implementation of an oxidation step according to the invention, with as lipase a Candida Antarctica type B lipase immobilized on a solid support (S), or Candida Antarctica type B lipase in free form, with (LTpn) or without (L) liquid buffer in the reaction medium;
  • LGO levoglucosenone
  • FIG. 7 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) during the implementation of an oxidation step according to the invention, with as lipase.
  • 4-hydroxymethylbutenolide, of formula (IIa) is prepared from levoglucosenone (LGO) according to the particular embodiment of the process according to the present invention hereinafter referred to as "one-pot”.
  • a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide H 2 O 2 (2.57 mmol, 0.26 ml, 1.2 eq with respect to LGO) is added in a single portion to a suspension.
  • LGO 270 mg, 2.14 mmol
  • CaL-B lipase Novozym® 435, 75 mg, 315 U / mmol LGO
  • ethyl acetate 3 mL
  • 1 g of Novozym® 435 corresponds to 9000 units of CaL-B lipase (activity measured after the enzyme has remained in ethyl acetate).
  • the reaction mixture is stirred at 40 ° C for 4 h and then evaporated to dryness.
  • the latter is separated from the reaction medium prior to the dry evaporation step of the medium.
  • the acid hydrolysis is then carried out as described above. Pure 4-hydroxymethylbutenolide is also obtained with the same yield of 72%.
  • the acid hydrolysis step is carried out directly on the reaction medium obtained at the outcome of the oxidation step, without it being previously carried out dry evaporation step. Whether the lipase has been removed from the reaction medium by filtration or not, in such variants of the invention, the yield of the reaction is similar to that obtained for the embodiment described above in detail, that is, about 72%.
  • 4-hydroxymethylbutyrolactone, of formula (Mb) is prepared from levoglucosenone (LGO) according to one or other of the variants of the process according to the present invention below. 2.1 / way 1
  • Pd / C (10% w / w, 500 mg) is added to a solution of (-) - levoglucosenone LGO (5 g, 39.7 mmol) in ethyl acetate (50 mL) at room temperature .
  • the stirred suspension is degassed 3 times under vacuum / nitrogen.
  • the suspension is then hydrogenated with a hydrogen atmosphere at room temperature until the total consumption of the starting material is approximately 4 hours.
  • the crude mixture is filtered through a pad of celite and the filtrate is concentrated to dryness with silica gel.
  • the crude product is purified by chromatography on silica gel (elution with 10 to 60% ethyl acetate in cyclohexane), to obtain dihydrolivoglucosenone of formula (Ib) (2H-LGO) pure (colorless oil, 4%). , 4g, 87%).
  • a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide H 2 0 2 (9.3 mmol, 0.97 mL, 1.2 eq with respect to 2H-LGO) is added in a single portion to a suspension of 2H-LGO (1 g, 7.8 mmol) under stirring additionally containing lipase (Novozym® 435, 100 mg, 340 U / mmol 2H-LGO) in ethyl acetate (10 mL) at room temperature.
  • the reaction mixture is stirred at 40 ° C for 4 h and then evaporated to dryness.
  • the 4-hydroxymethylbutenolide (IIa) obtained in Example 1 is subjected to catalytic hydrogenation, as follows.
  • Pd / C (10% w / w, 250 mg) is added to a solution of 4-hydroxymethylbutenolide (1.4 g, 12.3 mmol) in ethyl acetate (15 mL) at room temperature.
  • the stirred suspension is degassed 3 times under vacuum / nitrogen.
  • the suspension is then hydrogenated with a hydrogen atmosphere at ambient temperature for 4 hours.
  • the crude mixture is filtered through a pad of celite and the filtrate is concentrated to dryness with silica gel.
  • the crude product is purified by chromatography on silica gel (elution with a gradient ranging from 75 to 100% of ethyl acetate in cyclohexane), to obtain 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb) pure (1, 19 g, 82%).
  • reaction medium A sample of 0 0 ⁇ l of reaction medium is diluted in 1.5 ml of acetonitrile. The mixture is filtered on a 0.2 ⁇ PTFE filter and then injected into the HPLC chromatograph.
  • the analyzes are carried out on a Thermo Scientific® Syncronis® aQ column (250 * 4.6 mm, 5 ⁇ ) under the following conditions: injection volume 10; oven temperature 30 ° C; elution method: isocratic 85/15 water / acetonitrile 0 to 5 min, 5 to 10 min 85/15 to 90/10 water / acetonitrile gradient, 10 to 15 min isocratic 90/10 water / acetonitrile, 15 to 20 min gradient from 90/10 to 85/15 water / acetonitrile; spectrum recording at 220 nm.
  • the area under the peak attributed to LGO is measured, and plotted on a standard curve made by HPLC analysis of solutions of known LGO concentrations.
  • the conversion rate of the LGO is deduced from the mass value thus determined, as compared to the initial mass of LGO.
  • Reactions are also carried out with the following different solid buffer substances, added in the reaction medium at the beginning of the reaction, at a concentration of 20 mg / ml for each of the acidic and basic forms: MOPS (pKa 7.2), TAPS (pKa 8.4) or CAPSO (pKa 9.6), of commercial origin.
  • MOPS pKa 7.2
  • TAPS pKa 8.4
  • CAPSO pKa 9.6
  • the LGO conversion level is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating protocol of Example 3, from the measurement of the area under the HPLC peak attributed to the LGO (retention time 8.40 min).
  • a process is carried out by way of comparative example under the same reaction conditions, but with addition in the medium.
  • a liquid buffer more precisely a phosphate buffer solution of pKa 7.2, at the rate of 1 ml of buffer solution per 4 ml of ethyl acetate.
  • a lipase conversion rate of 43% is obtained.
  • LGO oxidation reactions are performed in accordance with the invention with the following operational parameters.
  • the initial concentration of LGO in ethyl acetate is 0.75 mol / L.
  • the reaction is conducted at 40 ° C.
  • the amount of CaL-B lipase is 226.8 units per mmol of LGO.
  • the oxidizing agents used are hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide-urea (H 2 O 2 -urea) in a concentration of 1.2 eq. molar to LGO. Different reaction times are tested: 4 h, 6 h, 8 h, 16 h, 24 h.
  • the lipase is isolated from the reaction medium by filtration, washed with ethyl acetate, with water and then with hexane, dried for 1 h at 40 ° C. and then overnight at room temperature. in a desiccator under reduced pressure, and finally subjected to the following test.
  • the residual activity of the lipase is measured by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), determining the conversion rate of lauric acid to propyl laurate.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • composition substrate solution is prepared: 74.65% (w / w) lauric acid, 22.37% (w / w) 1-propanol, 2.98% (w / w) ) of water.
  • the mixture is liquefied at 60 ° C. 14 mg of lipase are introduced into a flask, placed at 60 ° C. 5 g (6 ml) of the substrate solution are added to the flask.
  • GC vial containing at least 500 ⁇ . liquid; injection of 1 ⁇ , in 40: 1 split mode; injector temperature 280 ° C; carrier gas: H 2 , 1, 2 mL / min constant flow; oven temperature: 60 ° C for 1 min then temperature gradient from 20 ° C / min to 325 ° C and held at 325 ° C for 5 min; temperature of the transfer line: 280 ° C.
  • MS solvent delay 1 min; temperature of the source: 230 ° C; quad temperature: 150 ° C; sweep range 30 to 350 amu.
  • a standard mass range is made for each sample pass (from 0.1 g / L to 2.8 g / L or from 0.2 mg / g to 4.5 mg / g). The mass of lauric acid remaining in each sample is deduced by comparison with the standard range.
  • Mf represents the final number of mmoles of lauric acid
  • W represents the amount of lipase (g)
  • t represents the reaction time (min)
  • a PLU unit is defined as the amount of enzyme which, under standard conditions of 60 ° C and 15 min of reaction, forms 1 ⁇ of propyl laurate per minute.
  • Mf is calculated from the corresponding peak area in GC-MS and using a calibration curve.
  • a first LGO oxidation reaction according to the invention is carried out under the following conditions.
  • the concentration of LGO in ethyl acetate is 0.67 mol / L.
  • To this solution are added: 13 or 227 units of Cal-B lipase per mmol of LGO (respectively 10% or 20% by weight of lipase relative to the weight of LGO), 1, 2 eq. hydrogen peroxide (50% in water), and 20 mg / mL of each of the acidic and basic forms of HEPES solid buffer (pKa 7.5).
  • the reaction is conducted with stirring at 40 ° C for 2 hours.
  • 10 of reaction medium are removed and analyzed by HPLC, according to the protocol described in Example 2 above.
  • the lipase and the solid buffer are then separated from the reaction medium by filtration and washed with ethyl acetate.
  • Stage b) of the process according to the invention, of oxidation of levoglucosenone (LGO), is carried out as described in Example 1, by varying various operating parameters as indicated in Table 3 below. .
  • the conversion rate of the LGO is determined, as indicated in Example 4 above; the residual activity of the lipase, as shown in Example 5 above.
  • the results obtained are summarized in Table 3 below.
  • the lipase CaL-B (Novozym®435, 1 U / mmol of substrate) is added, followed by 1, 2 eq. of 50% hydrogen peroxide in water.
  • the reaction medium is stirred at 40 ° C.
  • the conversion rate of each substrate is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating procedure of Example 3 above, from the measurement of the area under the HPLC peak assigned to the substrate.
  • Step b / oxidation of levoglucosenone is carried out as described in Example 1 above, with the operating parameters indicated below, with as oxidizing agent hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide - urea (UHP).
  • oxidizing agent hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide - urea (UHP).
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • UHP hydrogen peroxide - urea
  • Step b / oxidation of levoglucosenone (LGO) is carried out on the one hand by means of the enzyme CaL-B immobilized on a solid support (Novozym®435), and on the other hand by means of the lipase B Candida antarctica in free form CaL-B L, as marketed under the name Lipozyme® by Novozymes.
  • the lipase (1 U / mmol of substrate) is added, followed by the oxidizing agent (50% hydrogen peroxide in the water) (1, 2 eq for lipase immobilized on solid support, and 1 eq for lipase in free form).
  • the reaction medium is stirred at 40 ° C.
  • Step b / oxidation of levoglucosenone (LGO) is carried out on the one hand by means of the enzyme CaL-B immobilized on a solid support (Novozym®435), and on the other hand by means of the lipase B Candida antarctica in free form CaL-B L, as marketed under the name Lipozyme® by Novozymes.
  • lipase (1 U / mmol of LGO for free form lipase, and 1 U / mmol of LGO for lipase is added. on solid support), then the oxidizing agent (50% hydrogen peroxide in water) (1.2 eq for immobilized lipase solid support, and 1 eq for lipase in free form).
  • a phosphate buffer of pKa 7 (KH 2 PO 4 / NaOH) is also introduced into the reaction medium.
  • the following solid buffer substances are used, at a concentration of 20 mg / mL for each of the acidic and basic forms: MOPS (pKa 7.2), TAPS (pKa 8.4) or CAPSO (pKa 9.6), of commercial origin.
  • MOPS pKa 7.2
  • TAPS pKa 8.4
  • CAPSO pKa 9.6
  • the reaction medium is stirred at 40 ° C.
  • the conversion rate is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating procedure of Example 3 below. before, from the measurement of the area under the HPLC peak attributed to the LGO.
  • 4-hydroxymethylbutenolide, of formula (IIa) is prepared from levoglucosenone (LGO) according to the particular embodiment of the process according to the present invention hereinafter.
  • the lipases tested are as follows: Lipozyme® Candida antarctica type B Cal-B L; Lipase AY “Amano” 30SD-K Candida rugosa; Lipase MER "Amano”.
  • the operating protocol is as follows.
  • lipase either Lipozyme® Candida antarctica type B Cal-B L (0.1 to 0.3 ml or 1 15 U at 350 U, activity 5000 LU / g), or Lipase AY “Amano" 30SD-K Candida rugosa (13 mg, that is 1 U U activity 30000 U / g), or Lipase MER "Amano” (53 mg or 1 15 U activity 7500 LU / g),
  • reaction mixture is stirred magnetically or at the incubator (Thermo MAXQ 150 RPM) at 40 ° C for 24 h.
  • reaction medium is then subjected to an acid hydrolysis step as described in Example 1 above.
  • 4-hydroxymethylbutenolide is obtained with a yield of between 60 and 80%.

Abstract

The invention relates to a method for transforming levoglucosenone into 4-hydroxymethyl butyrolactone or 4-hydroxymethyl butenolide, comprising a step involving the oxidation of the levoglucosenone, or dihydrolevoglucosenone obtained by hydrogenation of levoglucosenone, by bringing a solution of levoglucosenone or dihydrolevoglucosenone in a solvent into contact with a lipase in the presence of an oxidizing agent and an acyl donor compound. The oxidation step is followed by a step involving the hydrolysis of the reaction mixture obtained, and, if necessary, a step involving the hydrogenation of the compound obtained at the end of the hydrolysis step.

Description

PROCÉDÉ DE TRANSFORMATION DE LÉVOGLUCOSÉNONE EN PROCESS FOR TRANSFORMING LEVOGLUCOSENONE INTO
4-HYDROXYMÉTHYLBUTYROLACTONE OU 4-HYDROXYMÉTHYLBUTÉNOLIDE 4-HYDROXYMETHYLBUTYROLACTONE OR 4-HYDROXYMETHYLBUTENOLIDE
La présente invention concerne un procédé de transformation de la lévoglucosénone en 4-hydroxyméthylbutyrolactone ou en 4- hydroxyméthylbuténolide. The present invention relates to a process for converting levoglucosenone to 4-hydroxymethylbutyrolactone or 4-hydroxymethylbutenolide.
Afin de résoudre le problème de dépendance vis-à-vis des énergies fossiles, il a été développé dans les dernières décennies des procédés de production de composés chimiques d'intérêt à partir de biomasse. En particulier, la biomasse lignocellulosique est devenue l'une des sources vertes de composés carbonés. La lévoglucosénone, de formule (la) : In order to solve the problem of dependence on fossil fuels, it has been developed in recent decades processes for the production of chemical compounds of interest from biomass. In particular, lignocellulosic biomass has become one of the green sources of carbon compounds. Levoglucosenone, of formula (Ia):
est l'un des produits les plus intéressants pouvant ainsi être obtenus à partir de biomasse, notamment par une technologie de flash pyrolyse de cellulose.  is one of the most interesting products that can be obtained from biomass, in particular by a cellulose pyrolysis flash technology.
La lévoglucosénone est couramment employée en tant que produit de départ pour la synthèse de divers composés chimiques d'intérêt, en particulier de 4-hydroxyméthylbuténolide, de formule (lia), et de 4- hydroxyméthylbutyrolactone, de formule (Mb) : Levoglucosenone is commonly used as a starting material for the synthesis of various chemical compounds of interest, in particular 4-hydroxymethylbutenolide, of formula (IIa), and of 4-hydroxymethylbutyrolactone, of formula (Mb):
Ces composés présentent un intérêt particulier car ils constituent des intermédiaires chimiques asymétriques (chiraux) à forte valeur ajoutée qui sont fréquemment mis en œuvre dans l'industrie agroalimentaire, pour la production de fragrances et d'arômes, ou encore dans l'industrie pharmaceutique, pour la production de principes actifs de médicaments, tirant profit de leur noyau lactonique et de leur centre chiral. These compounds are of particular interest because they constitute asymmetric (chiral) chemical intermediates with high added value that are frequently used in the food industry, for the production of fragrances and flavors, or in the pharmaceutical industry. for the production of active drug ingredients, taking advantage of their core lactonic and their chiral center.
La transformation de lévoglucosénone en 4-hydroxyméthylbuténolide s'effectue de manière classique en deux étapes successives, la première de ces étapes consistant en une réaction d'oxydation du type Baeyer-Villiger, pour former un intermédiaire formiate, suivie par une étape d'hydrolyse acide pour former le 4-hydroxyméthylbuténolide. Pour obtenir la 4- hydroxyméthylbutyrolactone, la lévoglucosénone est au préalable soumise à une étape d'hydrogénation catalytique, de sorte à former de la dihydrolévoglucosénone qui est ensuite soumise aux étapes de transformation décrites ci-avant en référence à la lévoglucosénone. The conversion of levoglucosenone to 4-hydroxymethylbutenolide is carried out in a conventional manner in two successive steps, the first of these steps consisting of a Baeyer-Villiger type oxidation reaction, to form a formate intermediate, followed by a hydrolysis step. acid to form 4-hydroxymethylbutenolide. To obtain 4-hydroxymethylbutyrolactone, levoglucosenone is first subjected to a catalytic hydrogenation step, so as to form dihydrolévoglucosénone which is then subjected to the transformation steps described above with reference to levoglucosenone.
Il a été proposé par l'art antérieur plusieurs procédés pour réaliser la réaction d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone. It has been proposed by the prior art several methods for carrying out the oxidation reaction of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone.
A titre d'exemples, on peut citer le document US 4,994,585, qui décrit l'oxydation de lévoglucosénone par un peracide, tel que l'acide m- chloroperbenzoïque ou l'acide peracétique, dans un solvant organique ; ou le document US 5,1 12,994, qui décrit un procédé de synthèse de 4- hydroxyméthylbutyrolactone à partir de dihydrolévoglucosénone, selon lequel la réaction d'oxydation est également réalisée par un peracide dans un solvant organique. Afin d'obtenir un rendement élevé, ces réactions doivent toutefois être conduites pendant une longue durée, de un à deux jours. By way of example, mention may be made of US Pat. No. 4,994,585, which describes the oxidation of levoglucosenone by a peracid, such as m-chloroperbenzoic acid or peracetic acid, in an organic solvent; or US 5,1 12,994, which describes a process for synthesizing 4-hydroxymethylbutyrolactone from dihydrolévoglucosénone, wherein the oxidation reaction is also carried out with a peracid in an organic solvent. In order to obtain a high yield, however, these reactions must be carried out for a long time, from one to two days.
Il a autrement été proposé dans la publication de Paris et al., dans Green Chemistry, 2013, 15, 2101 -2109, de réaliser la réaction d'oxydation de la lévoglucosénone par des catalyseurs métalliques tels que les zéolites d'aluminium ou d'étain, en présence d'un agent oxydant. De tels procédés peuvent cependant également être longs à mettre en œuvre, pour certains des catalyseurs proposés, pour obtenir un taux de conversion de la lévoglucosénone qui s'avère satisfaisant. Les zéolites d'aluminium permettent d'obtenir des taux de conversion élevés en quatre heures. Cependant, ce temps ne prend pas en compte le temps nécessaire à la préparation du catalyseur. Ce dernier s'avère en outre potentiellement toxique. Il a par ailleurs été proposé par l'art antérieur, dans un objectif de meilleur respect de l'environnement par mise en œuvre de substances moins toxiques, de réaliser l'oxydation de cétones cycliques par réaction de type Baeyer-Villiger au moyen, en tant que catalyseur, d'une lipase immobilisée sur un support particulier en silice poreuse greffée. Un tel procédé est notamment décrit dans la publication de Drozdz et al., dans Applied Catalysis A: General, 2013, 467, 1 63-170. Comme décrit dans ce document, ce procédé s'avère satisfaisant, en termes de taux de conversion de la cétone cyclique et de temps de réaction, pour les cétones à forte tension de cycle, telles que la cyclobutanone ou la cyclopentanone, mais uniquement pour les cétones cycliques de ce type. Au contraire, pour les cétones cycliques à faible tension de cycle, telles que la cyclohexanone ou la cycloheptanone, une telle réaction d'oxydation s'avère peu performante, car permettant d'obtenir de faibles taux de conversion, et/ou en des temps très longs. Une telle différence de réactivité en fonction de la tension de cycle, liée notamment au nombre de chaînons du cycle, est bien connue de l'homme du métier, dont les connaissances générales en la matière sont notamment illustrées par le document de Wiberg, dans Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1986, 25, 312-322. It has otherwise been proposed in the publication of Paris et al., In Green Chemistry, 2013, 15, 2101-2109, to carry out the oxidation reaction of levoglucosenone by metal catalysts such as aluminum or aluminum zeolites. tin, in the presence of an oxidizing agent. However, such methods can also be slow to implement, for some of the proposed catalysts, to obtain a conversion rate of levoglucosenone which proves satisfactory. Aluminum zeolites make it possible to obtain high conversion rates in four hours. However, this time does not take into account the time required for the preparation of the catalyst. The latter is also potentially toxic. It has also been proposed by the prior art, with a view to improving environmental protection by using less toxic substances, to carry out the oxidation of cyclic ketones by means of a Baeyer-Villiger reaction by means of as a catalyst, a lipase immobilized on a particular support grafted porous silica. Such a method is in particular described in the publication by Drozdz et al., In Applied Catalysis A: General, 2013, 467, 1 63-170. As described in this document, this process proves satisfactory, in terms of cyclic ketone conversion rate and reaction time, for ketones with high ring voltage, such as cyclobutanone or cyclopentanone, but only for cyclic ketones of this type. On the other hand, for cyclic ketones with a low ring voltage, such as cyclohexanone or cycloheptanone, such an oxidation reaction proves to be inefficient because it makes it possible to obtain low conversion rates, and / or in times very long. Such a difference in reactivity as a function of the cycle voltage, linked in particular to the number of ring members of the cycle, is well known to a person skilled in the art, whose general knowledge in the field is particularly illustrated by the Wiberg document, in Angew. . Chem. Int. Ed. Engl., 1986, 25, 312-322.
La lévoglucosénone et la dihydrolévoglucosénone présentant toutes deux une faible tension de cycle, comparable à celles de la cyclohexanone ou de la cycloheptanone, de tels résultats détournent par conséquent l'homme du métier de mettre en œuvre, pour réaliser l'oxydation de ces composés en des temps et avec des rendements acceptables, le procédé décrit dans ce document, et l'incitent au contraire à rechercher des solutions alternatives. Or, il a constaté par les présents inventeurs, de manière tout à fait inattendue, que l'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone par catalyse enzymatique, au moyen d'une lipase en présence d'un agent oxydant et d'un composé donneur d'acyle, permet d'obtenir des taux de conversion particulièrement élevés en des temps de réaction particulièrement courts, pour former, après une étape ultérieure d'hydrolyse, la 4-hydroxyméthylbutyrolactone ou le 4-hydroxyméthylbuténolide. La présente invention vise donc à remédier aux inconvénients des procédés proposés par l'art antérieur pour la transformation de lévoglucosénone en 4-hydroxyméthylbutyrolactone ou en 4- hydroxyméthylbuténolide, notamment à ceux exposés ci-avant, en proposant un tel procédé qui permette d'obtenir des taux élevés de conversion de la lévoglucosénone, en un temps réduit, ne dépassant pas quelques heures, et en mettant en œuvre des réactifs dénués de toxicité et respectueux de l'environnement. Levoglucosenone and dihydrolévoglucosenone both having a low cycle voltage, comparable to those of cyclohexanone or cycloheptanone, such results therefore divert the skilled person to implement, to achieve the oxidation of these compounds in time and with acceptable yields, the method described in this document, and instead encourage it to seek alternative solutions. However, it has found by the present inventors, quite unexpectedly, that the oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosenone by enzymatic catalysis, by means of a lipase in the presence of an oxidizing agent and a compound Acyl donor allows to obtain particularly high conversion rates in particularly short reaction times, to form, after a subsequent hydrolysis step, 4-hydroxymethylbutyrolactone or 4-hydroxymethylbutenolide. The present invention therefore aims to remedy the disadvantages of the methods proposed by the prior art for the conversion of levoglucosenone to 4-hydroxymethylbutyrolactone or 4-hydroxymethylbutenolide, in particular to those described above, by proposing such a process which makes it possible to obtain high levels of conversion of levoglucosenone, in a short time, not exceeding a few hours, and using reagents devoid of toxicity and respectful of the environment.
Un objectif supplémentaire de l'invention est que ce procédé soit économique à mettre en œuvre. A further object of the invention is that this method is economical to implement.
Ainsi, il est proposé selon la présente invention un procédé de transformation de la lévoglucosénone (dite LGO) en un composé de formule générale (II) : Thus, it is proposed according to the present invention a process for converting levoglucosenone (so-called LGO) into a compound of general formula (II):
dans laquelle R représente -CH=CH- ou -CH2-CH2-. wherein R is -CH = CH- or -CH 2 -CH 2 -.
Plus particulièrement, lorsque R représente -CH=CH-, le composé de formule (II) est le 4-hydroxyméthylbuténolide (dit HBO), de formule (lia) : More particularly, when R represents -CH = CH-, the compound of formula (II) is 4-hydroxymethylbutenolide (called HBO), of formula (IIa):
Lorsque R représente -CH2-CH2-, le composé de formule (II) est la 4- hydroxyméthylbutyrolactone (dite HLO), de formule (Mb) : When R represents -CH 2 -CH 2 -, the compound of formula (II) is 4-hydroxymethylbutyrolactone (called HLO), of formula (Mb):
Selon l'invention, ce procédé comprend les étapes successives suivantes. a) Le cas échéant, pour obtenir un composé de formule générale (II) dans laquelle R représente -CH2-CH2-, il est tout d'abord réalisé une étape d'hydrogénation de la lévoglucosénone (la), de sorte à former de la dihydrolévoglucosénone de formule (Ib) : According to the invention, this method comprises the following successive steps. a) Where appropriate, to obtain a compound of general formula (II) in which R represents -CH 2 -CH 2 -, it is firstly carried out a step of hydrogenation of levoglucosenone (la), so as to form dihydrolévoglucosénone of formula (Ib):
Cette étape peut être réalisée par toute méthode classique en elle- même, en particulier par hydrogénation catalytique en présence de palladium sur charbon. b) Oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone obtenue à l'étape a), selon la réaction de Baeyer-Villiger, selon l'un des schémas réactionnels suivants, en fonction du produit de départ :  This step can be carried out by any conventional method in itself, in particular by catalytic hydrogenation in the presence of palladium on carbon. b) Oxidation of the levoglucosenone or dihydrolévoglucosenone obtained in step a), according to the Baeyer-Villiger reaction, according to one of the following reaction schemes, depending on the starting product:
ou or
Le milieu réactionnel obtenu à l'issue de cette étape b) comporte un mélange du composé cible (lia) ou (Mb) avec le formiate correspondant (Nia) ou (lllb). c) Hydrolyse, notamment hydrolyse acide, du mélange réactionnel obtenu à l'étape b), afin de transformer le formiate (Nia) ou (lllb) contenu dans ce mélange en le composé cible (lia) ou (Mb) correspondant. The reaction medium obtained at the end of this step b) comprises a mixture of the target compound (IIa) or (Mb) with the corresponding formate (Nia) or (IIIb). c) Hydrolysis, in particular acid hydrolysis, of the reaction mixture obtained in step b), in order to transform the formate (Nia) or (IIIb) contained in this mixture into the corresponding target compound (IIa) or (Mb).
Cette étape peut être réalisée par toute méthode classique en elle- même, par exemple mettant en œuvre de l'acide chlorhydrique, notamment en solution dans le méthanol, de l'acide acétique, de l'acide sulfurique, une résine de type Amberlyst® ou encore tout zéolite acide. L'étape d'hydrolyse peut autrement être mise en conditions basiques, selon toute méthode classique en elle-même pour l'homme du métier. d) Le cas échéant, pour obtenir un composé de formule générale (II) dans laquelle R représente -CH2-CH2-, c'est-à-dire pour obtenir la 4- hydroxyméthylbutyrolactone de formule (Mb), si une étape a) n'a pas été réalisée, hydrogénation du composé (lia) obtenu à l'étape c). This step can be carried out by any conventional method in itself, for example using hydrochloric acid, especially in solution in methanol, acetic acid, sulfuric acid, an Amberlyst® type resin. or any acidic zeolite. The hydrolysis step may otherwise be made in basic conditions, according to any conventional method in itself for the skilled person. d) Where appropriate, to obtain a compound of general formula (II) in which R represents -CH 2 -CH 2 -, that is to say to obtain 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb), if a step a) has not been carried out, hydrogenation of the compound (IIa) obtained in step c).
Cette réaction d'hydrogénation peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier, notamment par hydrogénation catalytique, par exemple selon les méthodes indiquées ci-avant. This hydrogenation reaction may be carried out by any method known to those skilled in the art, in particular by catalytic hydrogenation, for example according to the methods indicated above.
Selon la présente invention, l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone, ou de la dihydrolévoglucosénone, est réalisée par mise en contact d'une solution de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone dans un solvant, avec une lipase en présence d'un agent oxydant et d'un composé donneur d'acyle. According to the present invention, step b) of oxidation of levoglucosenone, or dihydrolévoglucosénone, is carried out by contacting a solution of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone in a solvent, with a lipase in the presence of an agent oxidant and an acyl donor compound.
La réaction d'oxydation est ainsi avantageusement catalysée par voie enzymatique. Les avantages en découlant sont multiples, tant du point de vue économique que du point de vue écologique. La lipase ne présente notamment pas ou très peu de toxicité, en particulier en comparaison avec les catalyseurs métalliques et les peracides mis en œuvre par l'art antérieur. The oxidation reaction is thus advantageously catalyzed enzymatically. The resulting benefits are numerous, both from an economic and an ecological point of view. In particular, the lipase exhibits no or very little toxicity, in particular in comparison with the metal catalysts and peracids used by the prior art.
En outre, il a été découvert par les présents inventeurs que, de manière tout à fait surprenante, la mise en œuvre d'une lipase pour catalyser l'étape d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone permet d'obtenir des taux élevés de conversion de ces substrats en un temps réduit, de manière notamment bien plus performante que lorsque cette même étape est mise en œuvre pour la cyclohexanone, dont les caractéristiques de tension de cycle sont pourtant similaires. Des taux de conversion de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone supérieurs à 70 % peuvent ainsi être atteints en un temps inférieur ou égal à 4 heures, et même, selon certaines conditions, aussi court qu'environ deux heures, des taux de conversions d'environ 90 % étant alors atteints en 3 heures environ. Du point de vue de la cinétique réactionnelle, le procédé selon la présente invention s'avère ainsi plus avantageux que les procédés proposés par l'art antérieur, tout en présentant l'avantage d'un gain environnemental important. II a de plus été constaté par les présents inventeurs, là encore de manière tout à fait inattendue, qu'à l'issue de cette étape b) d'oxydation, la lipase présente une activité résiduelle importante, lui permettant d'être réutilisée pour la catalyse d'au moins une, et même plusieurs, réactions d'oxydation ultérieures conformes à la présente invention. Ce résultat s'avère d'autant plus inattendu que la réaction d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone génère, en tant que coproduit de la réaction, de l'acide formique, qui est connu pour présenter un impact négatif sur l'activité des lipases. In addition, it has been discovered by the present inventors that, quite surprisingly, the use of a lipase to catalyze the oxidation step of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone makes it possible to obtain high levels. conversion of these substrates in a reduced time, particularly much more efficiently than when this same Step is implemented for cyclohexanone, whose cycle voltage characteristics are similar. Conversion rates of levoglucosenone or dihydrolévoglucosenone greater than 70% can thus be achieved in less than or equal to 4 hours, and even under certain conditions, as short as about two hours, conversion rates of about 90% then being reached in about 3 hours. From the point of view of the reaction kinetics, the method according to the present invention is thus more advantageous than the processes proposed by the prior art, while having the advantage of a significant environmental gain. It has also been found by the present inventors, here again quite unexpectedly, that at the end of this stage b) of oxidation, the lipase has a significant residual activity, allowing it to be reused for catalyzing at least one, and even more, subsequent oxidation reactions according to the present invention. This result is all the more unexpected since the oxidation reaction of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone generates, as a byproduct of the reaction, formic acid, which is known to have a negative impact on the reaction. lipase activity.
Ainsi, afin de tirer profit de cette activité résiduelle importante de la lipase à l'issue de l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la présente invention prévoit avantageusement, dans des modes de mise en œuvre préférés, que le procédé comporte une étape d'isolation de la lipase du milieu réactionnel après cette étape b) d'oxydation, préalablement à la mise en œuvre de l'étape c) d'hydrolyse, notamment d'hydrolyse acide. Thus, in order to take advantage of this important residual activity of the lipase at the end of step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone, the present invention advantageously provides, in preferred embodiments, that the process comprises a step of isolating the lipase from the reaction medium after this step b) oxidation, prior to the implementation of step c) hydrolysis, in particular acid hydrolysis.
Un avantage supplémentaire du procédé selon l'invention, lorsque l'étape b) d'oxydation est mise en œuvre à partir de dihydrolévoglucosénone, de formule (Ib) ci-avant, est la remarquable et étonnante régiosélectivité de la réaction, qui conduit, avec des rendements importants et comparables à ceux obtenus à partir de la lévoglucosénone, à la formation de 4- hydroxyméthylbutyrolactone de formule (Mb) et du formiate (lllb) correspondant. Selon des modes de mise en œuvre particuliers, l'invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en œuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. An additional advantage of the process according to the invention, when the oxidation step b) is carried out starting from dihydrolévoglucosénone, of formula (Ib) above, is the remarkable and surprising regioselectivity of the reaction, which leads, with high yields comparable to those obtained from levoglucosenone, the formation of 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb) and the corresponding formate (IIIb). According to particular embodiments, the invention also satisfies the following characteristics, implemented separately or in each of their technically operating combinations.
Ces caractéristiques visent notamment à atteindre les objectifs que s'est fixés la présente invention de réduire le coût associé à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, ainsi qu'à en limiter l'impact environnemental. These features are aimed in particular at achieving the objectives that the present invention has set itself to reduce the cost associated with the implementation of the method according to the invention, as well as to limit the environmental impact thereof.
En particulier, le choix des différentes caractéristiques préférentielles de l'invention, notamment des valeurs des différents paramètres opérationnels de l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, qui sont indiquées ci-après, est réalisé selon l'invention de sorte à obtenir les taux de conversion de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone les plus élevés possible, avec un temps de réaction réduit, et tout en conservant à l'enzyme une forte activité résiduelle à l'issue de la réaction, de sorte à être en mesure de la réutiliser pour des réactions ultérieures, et à limiter de ce fait le coût de mise en œuvre du procédé. In particular, the choice of the various preferential characteristics of the invention, in particular the values of the different operational parameters of the levoglucosenone or dihydrolévoglucosenone oxidation step b), which are indicated below, is carried out according to the invention. invention so as to obtain the highest conversion rates of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone possible, with a reduced reaction time, and while maintaining the enzyme strong residual activity at the end of the reaction, so as to be able to reuse it for subsequent reactions, and thereby limit the cost of implementing the process.
La lipase peut être de tout type. Préférentiellement, il est mis en œuvre la lipase B de Candida antarctica, connue sous l'abréviation CaL-B. D'autres lipases, telles que Candida rugosa ou Rhizomucor miehei par exemple, peuvent également être utilisées. La lipase peut être utilisée sous forme libre dans le milieu réactionnel, c'est-à-dire sous une forme dans laquelle elle n'est pas immobilisée sur un quelconque support solide. La mise en œuvre de lipases sous forme libre permet notamment d'obtenir de bons rendements de la réaction d'oxydation, en des temps courts, notamment de quelques heures, tout en présentant l'avantage d'un faible coût de préparation. The lipase can be of any type. Preferentially, lipase B of Candida antarctica, known under the abbreviation CaL-B, is used. Other lipases, such as Candida rugosa or Rhizomucor miehei for example, can also be used. The lipase may be used in free form in the reaction medium, that is to say in a form in which it is not immobilized on any solid support. The use of lipases in free form makes it possible in particular to obtain good yields of the oxidation reaction, in short times, especially a few hours, while having the advantage of a low cost of preparation.
Dans des variantes de l'invention, la lipase est utilisée sous forme immobilisée sur un support solide, si bien qu'elle peut facilement être isolée du milieu réactionnel à l'issue de l'étape b) d'oxydation. Par exemple, il peut être utilisé une lipase CaL-B immobilisée sur un support de polyméthylméthacrylate, telle que la lipase commercialisée par la société Novozymes sous la dénomination Novozym® 435. In variants of the invention, the lipase is used in immobilized form on a solid support, so that it can easily be isolated from the reaction medium at the end of the oxidation step b). For example, it may be used a CaL-B lipase immobilized on a polymethylmethacrylate support, such as the lipase marketed by Novozymes under the name Novozym® 435 designation.
Dans des modes de mise en œuvre particulièrement avantageux de l'invention, la durée de l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est comprise entre deux et quatre heures, et de préférence entre environ deux et trois heures. Comme il a été dit précédemment, une durée de réaction aussi courte permet d'obtenir des taux de conversion élevés de la lévoglucosénone et de la dihydrolévoglucosénone. In particularly advantageous embodiments of the invention, the duration of step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone is between two and four hours, and preferably between about two and three hours. As previously stated, such a short reaction time allows for high conversion rates of levoglucosenone and dihydrolevoglucosenone.
Le solvant mis en œuvre dans l'étape b) d'oxydation, pour la mise en solution de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, peut être de tout type compatible avec l'action de la lipase. Il peut par exemple s'agir d'un solvant organique, d'un mélange solvant organique / eau, d'un liquide ionique, d'un solvant eutectique, ou d'un mélange de tels solvants, voire même de C02 supercritique. The solvent used in the oxidation stage b), for the dissolution of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, can be of any type compatible with the action of the lipase. It may for example be an organic solvent, an organic solvent / water mixture, an ionic liquid, a eutectic solvent, or a mixture of such solvents, or even supercritical CO 2 .
Ce solvant peut par exemple être choisi parmi le toluène, le dichlorométhane, l'hexane, etc., ou un de leurs mélanges. This solvent may for example be chosen from toluene, dichloromethane, hexane, etc., or a mixture thereof.
Le composé donneur d'acyle peut être de tout type classique en lui- même. Il peut notamment être constitué par un acide à chaîne longue, tel qu'un acide gras saturé à chaîne linéaire en C2 à C30, par exemple l'acide caprylique ou l'acide caprique. Dans des modes de mise en œuvres préférés de l'invention, dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, le composé donneur d'acyle et le solvant sont constitués par un même produit. Préférentiellement, le solvant utilisé pour la mise en solution du substrat lévoglucosénone ou dihydrolévoglucosénone est ainsi un solvant organique, de préférence l'acétate d'éthyle, qui assure en même temps la fonction de donneur d'acyle. D'autres solvants, tels que l'acétate de butyle ou le propionate d'éthyle, peuvent autrement être utilisés, seuls ou en mélange entre eux ou avec l'acétate d'éthyle. The acyl donor compound may be of any conventional type in itself. It may in particular be constituted by a long-chain acid, such as a C2 to C30 linear chain saturated fatty acid, for example caprylic acid or capric acid. In preferred embodiments of the invention, in step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the acyl donor compound and the solvent are constituted by the same product. Preferably, the solvent used for the dissolution of the levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone substrate is thus an organic solvent, preferably ethyl acetate, which at the same time ensures the function of acyl donor. Other solvents, such as butyl acetate or ethyl propionate, may otherwise be used, alone or in admixture with one another or with ethyl acetate.
L'acétate d'éthyle offre notamment l'avantage d'être biosourcé, et de ne pas présenter de toxicité pour les organismes vivants et pour l'environnement. In particular, ethyl acetate offers the advantage of being biobased, and of not having any toxicity for living organisms and for the environment.
L'agent oxydant mis en œuvre dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est préférentiellement choisi parmi le peroxyde d'hydrogène et le peroxyde de carbamide, autrement connu sous le nom peroxyde d'hydrogène - urée, en solution dans l'eau. De tels agents oxydants présentent notamment une bonne stabilité, si bien que les risques associés à leur mise en œuvre industrielle sont réduits. Préférentiellement, l'agent oxydant est le peroxyde d'oxygène seul, c'est-à-dire non associé à l'urée, qui permet d'obtenir des taux de conversion particulièrement élevés. The oxidizing agent used in step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone is preferably chosen from hydrogen peroxide and carbamide peroxide, otherwise known as hydrogen peroxide - urea, in solution in water. Such oxidizing agents have in particular a good stability, so that the risks associated with their industrial implementation are reduced. Preferentially, the oxidizing agent is oxygen peroxide alone, that is to say not associated with urea, which makes it possible to obtain particularly high conversion rates.
Dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la concentration en l'agent oxydant est au moins égale à 1 équivalent molaire par rapport à la lévoglucosénone ou la dihydrolévoglucosénone. Cette concentration est de préférence comprise entre 1 et 2 équivalents molaires par rapport à la lévoglucosénone ou la dihydrolévoglucosénone. Une telle plage de concentration permet avantageusement d'obtenir un rendement de réaction élevé, sans provoquer de dénaturation de la lipase, qui reste de ce fait réutilisable pour des réactions ultérieures. Préférentiellement, la concentration d'agent oxydant est environ égale à 1 ,2 équivalent molaire par rapport à la lévoglucosénone ou la dihydrolévoglucosénone. In step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the concentration of the oxidizing agent is at least equal to 1 molar equivalent relative to levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone. This concentration is preferably between 1 and 2 molar equivalents relative to levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone. Such a concentration range advantageously allows to obtain a high reaction yield, without causing denaturation of the lipase, which remains reusable for subsequent reactions. Preferentially, the concentration of oxidizing agent is approximately equal to 1.2 molar equivalents relative to levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone.
La température de l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est de préférence comprise entre 30 et 60 °C, afin d'assurer un fonctionnement optimal de la lipase. Préférentiellement, cette température est d'environ 40 °C. Une telle température permet notamment d'obtenir une cinétique rapide de la réaction d'oxydation, tout en limitant la dépense énergétique, et donc le coût, associés à la mise en œuvre du procédé selon l'invention. The temperature of step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone is preferably between 30 and 60 ° C, in order to ensure optimal functioning of the lipase. Preferably, this temperature is about 40 ° C. Such a temperature makes it possible in particular to obtain rapid kinetics of the oxidation reaction, while limiting the energy expenditure, and therefore the cost, associated with the implementation of the process according to the invention.
Pour l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la concentration en lévoglucosénone ou en dihydrolévoglucosénone dans le solvant organique est en outre de préférence comprise entre 0,5 et 1 mol/L. Des concentrations comprises dans une telle plage de valeurs permettent avantageusement d'obtenir des rendements optimaux de la réaction d'oxydation. For step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone, the concentration of levoglucosénone or dihydrolévoglucosénone in the organic solvent is in addition preferably between 0.5 and 1 mol / L. Concentrations within such a range of values advantageously make it possible to obtain optimal yields of the oxidation reaction.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, les coproduits de la réaction d'oxydation que sont l'acide acétique et l'acide formique sont éliminés au fur et à mesure de leur formation, par neutralisation in situ ou extraction du milieu réactionnel. In particular embodiments of the invention, the co-products of the oxidation reaction, namely acetic acid and formic acid, are eliminated as they are formed by in situ neutralization or extraction of the product. reaction medium.
Dans des modes de mise en œuvre particulièrement avantageux de l'invention, l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est réalisée en présence, dans le milieu réactionnel, d'au moins une substance tampon, de préférence de pKa compris entre 5 et 9,6, ou d'un mélange de telles substances tampon. Une telle substance tampon neutralise avantageusement les coproduits de la réaction d'oxydation que sont l'acide acétique et l'acide formique, prévenant de ce fait l'effet néfaste que ces acides pourraient avoir sur la lipase. Elle maintient en outre dans le milieu réactionnel un pH optimal pour le fonctionnement de cette dernière. In particularly advantageous embodiments of the invention, step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone is carried out in the presence, in the reaction medium, of at least one buffer substance, preferably of pKa between 5 and 9.6, or a mixture of such buffer substances. Such a buffer substance advantageously neutralizes the co-products of the oxidation reaction that are acetic acid and formic acid, thereby preventing the deleterious effect that these acids could have on the lipase. It also maintains in the reaction medium an optimal pH for the operation of the latter.
La substance tampon peut être une substance tampon liquide, tel qu'un tampon phosphate, classique en elle-même. The buffer substance may be a liquid buffer substance, such as a phosphate buffer, conventional in itself.
Autrement, la substance tampon peut être une substance tampon solide, de préférence de pKa compris entre 5 et 9,6, et préférentiellement compris entre 7,2 et 9,6. On entend, par substance tampon solide, un mélange des deux formes acide et basique du tampon. Otherwise, the buffer substance may be a solid buffer substance, preferably of pKa between 5 and 9.6, and preferably between 7.2 and 9.6. By solid buffer substance is meant a mixture of the two acid and basic forms of the buffer.
Une telle forme solide de la substance tampon présente plusieurs avantages. Elle permet une séparation facile de la substance tampon et du milieu réactionnel. En outre, et de manière tout à fait inattendue, la mise en œuvre d'une substance tampon solide lors de l'étape d'oxydation a pour effet d'augmenter de manière significative la vitesse de la réaction d'oxydation, par rapport aux conditions d'absence de tampon, et même, dans une moindre mesure, aux substances tampons liquides. Ainsi, les substances tampon solides permettent d'atteindre, en deux heures de réaction, des taux de conversion proches de 90 %. Such a solid form of the buffer substance has several advantages. It allows easy separation of the buffer substance and the reaction medium. In addition, and quite unexpectedly, the implementation of a solid buffer substance during the oxidation step has the effect of significantly increasing the speed of the oxidation reaction, compared with buffer-free conditions, and even, to a lesser extent, liquid buffer substances. Thus, the solid buffer substances make it possible to reach, within two hours of reaction, conversion close to 90%.
Tout type de substance tampon solide, de pKa adéquat, peut être mis en œuvre dans le cadre de l'invention. Préférentiellement, la substance tampon solide est choisie pour son comportement dans le milieu réactionnel, pour assurer notamment qu'elle ne forme pas un gel dans ce milieu, de sorte à ce que d'une part, elle ne gêne pas l'action catalytique de la lipase, et, d'autre part, elle soit facilement séparable du milieu réactionnel à l'issue de la réaction d'oxydation. A titre d'exemples, on peut utiliser une substance tampon TAPS (acide N-[tris(hydroxyméthyl)méthyle]-3-aminopropane sulfonique), ou une substance tampon CAPSO (acide cyclohexylamino-3-hydroxy-2- propanesulfonique-1 ), de tels exemples n'étant en aucun cas limitatifs de l'invention. Any type of solid buffer substance, of adequate pKa, can be used in the context of the invention. Preferably, the solid buffer substance is chosen for its behavior in the reaction medium, in particular to ensure that it does not form a gel in this medium, so that, on the one hand, it does not interfere with the catalytic action of the reaction medium. lipase, and secondly, it is easily separable from the reaction medium at the end of the oxidation reaction. By way of examples, a TAPS buffer substance (N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -3-aminopropane sulfonic acid) or a CAPSO buffer substance (cyclohexylamino-3-hydroxy-2-propanesulphonic acid) can be used. such examples are in no way limiting of the invention.
La concentration de la substance tampon solide dans le milieu réactionnel est de préférence comprise entre 20 et 100 mg/mL, soit entre 10 et 50 mg/mL de chacune des formes acide et basique du tampon. The concentration of the solid buffer substance in the reaction medium is preferably between 20 and 100 mg / mL, ie between 10 and 50 mg / mL of each of the acid and basic forms of the buffer.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, pour l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la quantité de lipase utilisée est comprise entre 56 et 1 134 unités de lipase par millimole de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone. De manière surprenante, une aussi faible quantité d'enzyme permet d'obtenir des taux élevés de conversion de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone dans des temps de réaction réduits. In particular embodiments of the invention, for step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the amount of lipase used is between 56 and 1134 lipase units per millimole of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone. Surprisingly, such a small amount of enzyme makes it possible to obtain high levels of conversion of levoglucosenone or dihydrolévoglucosenone in reduced reaction times.
Plus particulièrement, lorsque le milieu réactionnel est dépourvu de substance tampon solide, la quantité de lipase utilisée est de préférence comprise entre 227 et 1 134 unités de lipase par millimole de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone. Lorsque le milieu réactionnel contient une substance tampon solide, la quantité de lipase utilisée est de préférence comprise entre 56 et 227 unités de lipase par millimole de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone. De telles plages de concentration permettent avantageusement d'obtenir, à une température de 40 °C, des taux de conversion de la lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone qui sont supérieurs à 70 %, en environ deux heures ou environ quatre heures respectivement en présence ou en l'absence de substance tampon solide. More particularly, when the reaction medium is devoid of solid buffer substance, the amount of lipase used is preferably between 227 and 1134 lipase units per millimole of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone. When the reaction medium contains a solid buffer substance, the amount of lipase used is preferably between 56 and 227 lipase units per millimole of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone. Such concentration ranges advantageously make it possible to obtain, at a temperature of 40 ° C., conversion rates of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone which are greater than 70%, in about two hours or about four hours respectively in the presence or absence of a solid buffer substance.
Les étapes b) d'oxydation et c) d'hydrolyse, notamment d'hydrolyse acide, du procédé selon l'invention peuvent être réalisées dans un réacteur unique, sans isolement des produits intermédiaires. Ces étapes successives peuvent autrement être séparées par une étape intermédiaire de séparation de la lipase, et le cas échéant de la substance tampon solide, du milieu réactionnel, optionnellement suivie d'une étape de concentration de ce milieu réactionnel préalablement à la mise en œuvre de l'étape c) d'hydrolyse, notamment d'hydrolyse acide, du mélange comprenant le composé de formule (II) et le formiate correspondant, pour obtenir le 4-hydroxyméthylbuténolide de formule (lia) ou la 4-hydroxyméthylbutyrolactone de formule (Mb). The steps b) of oxidation and c) hydrolysis, in particular of acid hydrolysis, of the process according to the invention can be carried out in a single reactor, without isolation of the intermediate products. These successive steps may otherwise be separated by an intermediate step of separating the lipase, and optionally the solid buffer substance, from the reaction medium, optionally followed by a step of concentration of this reaction medium prior to the implementation of step c) of hydrolysis, in particular of acid hydrolysis, of the mixture comprising the compound of formula (II) and the corresponding formate, to obtain 4-hydroxymethylbutenolide of formula (IIa) or 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb ).
Les caractéristiques et avantages du procédé selon l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci- après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 a à 7, dans lesquelles : The features and advantages of the method according to the invention will appear more clearly in the light of the following examples of implementation, provided for illustrative purposes only and in no way limitative of the invention, with the support of FIGS. 1 to 7, in which :
- les figures 1 a, 1 b et 1 c représentent des chromatogrammes HPLC obtenus pour des échantillons prélevés du milieu réactionnel lors de la mise en œuvre d'une étape conforme à l'invention d'oxydation de lévoglucosénone (LGO) en 4-hydroxyméthylbuténolide (HBO) et en le formiate correspondant (FHBO), les échantillons étant prélevés du milieu réactionnel après respectivement 0 h, 1 h et 2 h de réaction ; FIGS. 1a, 1b and 1c show HPLC chromatograms obtained for samples taken from the reaction medium during the implementation of a step according to the invention for the oxidation of levoglucosenone (LGO) to 4-hydroxymethylbutenolide (HBO) and in the corresponding formate (FHBO), the samples being taken from the reaction medium after respectively 0 h, 1 h and 2 h of reaction;
- la figure 2 montre un graphe illustrant l'évolution au cours du temps du taux de conversion de la lévoglucosénone (LGO), lors de la mise en œuvre d'une étape d'oxydation conforme à l'invention, dans les différentes conditions suivantes : absence de substance tampon solide à 40 °C, absence de substance tampon solide à 60 °C, tampon solide CAPSO à 40 °C, tampon solide MOPS à 40 °C, tampon solide TAPS à 40 °C ; FIG. 2 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO), during the implementation of an oxidation step according to the invention, under the following different conditions : no solid buffer at 40 ° C, no solid buffer at 60 ° C, CAPSO solid buffer at 40 ° C, MOPS solid buffer at 40 ° C, TAPS solid buffer at 40 ° C;
- la figure 3 montre un graphe illustrant le taux de conversion de la lévoglucosénone (LGO), lors de la mise en œuvre de cycles successifs de réactions d'oxydation conformes à l'invention au moyen de la même lipase, pour des quantités de lipase dans le milieu réactionnel initial de 10 % ou 20 % p/p (1 13 ou 227 unités/mmol) par rapport à la LGO, en présence d'un tampon solide ; - la figure 4 montre un graphe illustrant l'évolution au cours du temps du taux de conversion de la lévoglucosénone (LGO) d'une part, et de la cyclohexanone (CH) d'autre part, lors de la mise en œuvre d'une étape d'oxydation conforme à l'invention ; FIG. 3 shows a graph illustrating the conversion rate of levoglucosenone (LGO), during the implementation of successive cycles of oxidation reactions according to the invention using the same lipase, for amounts of lipase in the initial reaction medium of 10% or 20% w / w (13 or 227 units / mmol) relative to the LGO, in the presence of a solid buffer; FIG. 4 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) on the one hand, and cyclohexanone (CH) on the other hand, during the implementation of an oxidation step according to the invention;
- la figure 5 montre un graphe illustrant l'évolution au cours du temps du taux de conversion de la lévoglucosénone (LGO) lors de la mise en œuvre d'une étape d'oxydation conforme à l'invention, avec en tant qu'agent oxydant le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou le peroxyde d'hydrogène - urée (UHP) ; FIG. 5 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) during the implementation of an oxidation step according to the invention, with as agent oxidizing hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide - urea (UHP);
- la figure 6 montre un graphe illustrant l'évolution au cours du temps du taux de conversion de la lévoglucosénone (LGO) lors de la mise en œuvre d'une étape d'oxydation conforme à l'invention, avec en tant que lipase une lipase de type B de Candida Antarctica immobilisée sur support solide (S), ou une lipase de type B de Candida Antarctica sous forme libre, avec (LTpn) ou sans (L) tampon liquide dans le milieu réactionnel ; FIG. 6 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) during the implementation of an oxidation step according to the invention, with as lipase a Candida Antarctica type B lipase immobilized on a solid support (S), or Candida Antarctica type B lipase in free form, with (LTpn) or without (L) liquid buffer in the reaction medium;
- et la figure 7 montre un graphe illustrant l'évolution au cours du temps du taux de conversion de la lévoglucosénone (LGO) lors de la mise en œuvre d'une étape d'oxydation conforme à l'invention, avec en tant que lipase une lipase de type B de Candida Antarctica immobilisée sur support solide (S), en présence d'un tampon solide CAPSO, MOPS ou TAPS ; ou une lipase de type B de Candida Antarctica sous forme libre avec présence d'un tampon liquide dans le milieu réactionnel (LTpn). and FIG. 7 shows a graph illustrating the evolution over time of the conversion rate of levoglucosenone (LGO) during the implementation of an oxidation step according to the invention, with as lipase. a Candida Antarctica type B lipase immobilized on a solid support (S), in the presence of a CAPSO, MOPS or TAPS solid buffer; or Candida Antarctica type B lipase in free form with the presence of a liquid buffer in the reaction medium (LTpn).
EXEMPLE 1 - Synthèse de 4-hydroxyméthylbuténolide EXAMPLE 1 Synthesis of 4-hydroxymethylbutenolide
Du 4-hydroxyméthylbuténolide, de formule (lia), est préparé à partir de lévoglucosénone (LGO) selon le mode de mise en œuvre particulier du procédé selon la présente invention ci-après, dit en « one-pot ». Oxydation 4-hydroxymethylbutenolide, of formula (IIa), is prepared from levoglucosenone (LGO) according to the particular embodiment of the process according to the present invention hereinafter referred to as "one-pot". Oxidation
Dans un réacteur, une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène H2O2 à 30 % (2,57 mmol, 0,26 ml_, 1 ,2 éq. par rapport à la LGO) est ajoutée en une unique portion à une suspension de LGO (270 mg, 2,14 mmol) et de lipase CaL-B (Novozym® 435, 75 mg, 315 U/mmol LGO) dans l'acétate d'éthyle (3 mL) sous agitation à température ambiante, dans un incubateur à agitation planaire. Pour cet exemple comme pour tous les exemples décrits ci-après, 1 g de Novozym® 435 correspond à 9000 unités de lipase CaL-B (activité mesurée après séjour de l'enzyme dans l'acétate d'éthyle). Le mélange réactionnel est agité à 40 °C pendant 4 h puis évaporé à sec. In a reactor, a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide H 2 O 2 (2.57 mmol, 0.26 ml, 1.2 eq with respect to LGO) is added in a single portion to a suspension. of LGO (270 mg, 2.14 mmol) and CaL-B lipase (Novozym® 435, 75 mg, 315 U / mmol LGO) in ethyl acetate (3 mL) with stirring at room temperature, in a planar agitation incubator. For this example, as for all the examples described below, 1 g of Novozym® 435 corresponds to 9000 units of CaL-B lipase (activity measured after the enzyme has remained in ethyl acetate). The reaction mixture is stirred at 40 ° C for 4 h and then evaporated to dryness.
Hydrolyse acide Acid hydrolysis
De l'acide chlorhydrique concentré (5 mmol, 0,4 mL) est ajouté à une solution de ce mélange brut dans le méthanol (5 mL), à température ambiante. Le mélange réactionnel est chauffé sous agitation pendant 8 à 1 6 heures, de sorte à convertir le formiate (Nia) en l'alcool (Ha) correspondant. Le mélange réactionnel est évaporé à sec avec un gel de silice. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (élution avec 75 à 100% d'acétate d'éthyle dans du cyclohexane) pour obtenir du 4-hydroxyméthylbuténolide (lia) pur (175 mg, 72 %). 1 H RMN (CDCIs) : δ 7,53 (dd, J = 1 ,5 et 5,7 Hz, 1 H), 6,2 (dd, J = 1 ,5 et 5,7 Hz, 1 H), 5,17 (m, 1 H), 4,0 (d, J = 3,6 et 12,0 Hz, 1 H), 3,80 (dd, J = 3,6 et 12,0 Hz, 1 H) Concentrated hydrochloric acid (5 mmol, 0.4 mL) is added to a solution of this crude mixture in methanol (5 mL) at room temperature. The reaction mixture is heated with stirring for 8 to 16 hours so as to convert the formate (Nia) to the corresponding alcohol (IIa). The reaction mixture is evaporated to dryness with silica gel. The crude product is purified by chromatography on silica gel (elution with 75 to 100% ethyl acetate in cyclohexane) to obtain pure 4-hydroxymethylbutenolide (IIa) (175 mg, 72%). 1 H NMR (CDCl3): δ 7.53 (dd, J = 1.5 and 5.7 Hz, 1H), 6.2 (dd, J = 1.5 and 5.7 Hz, 1H), 5.17 (m, 1H), 4.0 (d, J = 3.6 and 12.0 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 3.6 and 12.0 Hz, 1H) )
13C RMN (CDCI3) : δ 173,5 (s), 154,0 (d), 122,8 (d), 84,3 (d), 62,2 (t) 13 C NMR (CDCI 3 ): δ 173.5 (s), 154.0 (d), 122.8 (d), 84.3 (d), 62.2 (t)
En variante, à l'issue de l'étape de traitement de la LGO avec la lipase, cette dernière est séparée du milieu réactionnel préalablement à l'étape d'évaporation à sec du milieu. L'hydrolyse acide est ensuite réalisée comme décrit ci-avant. On obtient également du 4-hydroxyméthylbuténolide pur, avec un même rendement de 72 %. Alternatively, at the end of the step of treating the LGO with the lipase, the latter is separated from the reaction medium prior to the dry evaporation step of the medium. The acid hydrolysis is then carried out as described above. Pure 4-hydroxymethylbutenolide is also obtained with the same yield of 72%.
Dans d'autres variantes du procédé selon l'invention, l'étape d'hydrolyse acide est réalisée directement sur le milieu réactionnel obtenu à l'issue de l'étape d'oxydation, sans qu'il soit réalisé au préalable d'étape d'évaporation à sec. Que la lipase ait été éliminée du milieu réactionnel par filtration ou non, dans de telles variantes de l'invention, le rendement de la réaction est similaire à celui obtenu pour le mode de mise en œuvre décrit ci- avant de manière détaillée, c'est-à-dire d'environ 72 %. In other variants of the process according to the invention, the acid hydrolysis step is carried out directly on the reaction medium obtained at the outcome of the oxidation step, without it being previously carried out dry evaporation step. Whether the lipase has been removed from the reaction medium by filtration or not, in such variants of the invention, the yield of the reaction is similar to that obtained for the embodiment described above in detail, that is, about 72%.
EXEMPLE 2 - Synthèse de 4-hydroxyméthylbutyrolactone EXAMPLE 2 Synthesis of 4-hydroxymethylbutyrolactone
De la 4-hydroxyméthylbutyrolactone, de formule (Mb), est préparée à partir de lévoglucosénone (LGO) selon l'une ou l'autre des variantes du procédé conforme à la présente invention ci-après. 2.1 / Voie 1 4-hydroxymethylbutyrolactone, of formula (Mb), is prepared from levoglucosenone (LGO) according to one or other of the variants of the process according to the present invention below. 2.1 / way 1
Hydrogénation catalvtique Catalan Hydrogenation
Du Pd/C (10 % p/p, 500 mg) est ajouté à une solution de (-)- lévoglucosénone LGO (5 g, 39,7 mmol) dans de l'acétate d'éthyle (50 mL) à température ambiante. La suspension sous agitation est dégazée 3 fois sous vide/azote. La suspension est ensuite hydrogénée par une atmosphère d'hydrogène à température ambiante jusqu'à consommation totale du produit de départ, soit environ 4 h. Le mélange brut est filtré sur un tampon de célite et le filtrat est concentré à sec avec un gel de silice. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (élution avec 10 à 60% d'acétate d'éthyle dans le cyclohexane), pour obtenir de la dihydrolévoglucosénone de formule (Ib) (2H-LGO) pure (huile incolore, 4,4 g, 87 %). Pd / C (10% w / w, 500 mg) is added to a solution of (-) - levoglucosenone LGO (5 g, 39.7 mmol) in ethyl acetate (50 mL) at room temperature . The stirred suspension is degassed 3 times under vacuum / nitrogen. The suspension is then hydrogenated with a hydrogen atmosphere at room temperature until the total consumption of the starting material is approximately 4 hours. The crude mixture is filtered through a pad of celite and the filtrate is concentrated to dryness with silica gel. The crude product is purified by chromatography on silica gel (elution with 10 to 60% ethyl acetate in cyclohexane), to obtain dihydrolévoglucosenone of formula (Ib) (2H-LGO) pure (colorless oil, 4%). , 4g, 87%).
1 H RMN (CDCI3) : δ 5,10 (s, 1 H), 4,70 (m, 1 H), 4,09 (dd, J = 0,8 et 7,5 Hz, 1 H), 3,98 (ddd, J = 1 ,4, 5,0 et 7,0 Hz, 1 H), 2,66 (m, 1 H), 2,45-2,22 (m, 2 H), 2,10-1 ,97 (m, 1 H) 13C RMN (CDCI3) : δ 200,2 (s), 101 ,5 (d), 73,1 (d), 67,5 (t), 31 ,1 (t), 29,9 (t) Oxydation 1 H NMR (CDCl 3): δ 5.10 (s, 1H), 4.70 (m, 1H), 4.09 (dd, J = 0.8 and 7.5 Hz, 1H), 3.98 (ddd, J = 1.4, 5.0 and 7.0 Hz, 1H), 2.66 (m, 1H), 2.45-2.22 (m, 2H), 2 , 10-1, 97 (m, 1H) 13 C NMR (CDCl 3 ): δ 200.2 (s), 101.5 (d), 73.1 (d), 67.5 (t), 31 , 1 (t), 29.9 (t) Oxidation
Dans un réacteur, une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène H202 à 30 % (9,3 mmol, 0,97 mL, 1 ,2 éq. par rapport à la 2H-LGO) est ajoutée en une unique portion à une suspension de 2H-LGO (1 g, 7,8 mmol) sous agitation contenant en outre de la lipase (Novozym® 435, 100 mg, 340 U/mmol 2H-LGO) dans l'acétate d'éthyle (10 mL) à température ambiante. Le mélange réactionnel est agité à 40 °C pendant 4 h puis évaporé à sec. In a reactor, a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide H 2 0 2 (9.3 mmol, 0.97 mL, 1.2 eq with respect to 2H-LGO) is added in a single portion to a suspension of 2H-LGO (1 g, 7.8 mmol) under stirring additionally containing lipase (Novozym® 435, 100 mg, 340 U / mmol 2H-LGO) in ethyl acetate (10 mL) at room temperature. The reaction mixture is stirred at 40 ° C for 4 h and then evaporated to dryness.
Hydrolyse acide De l'acide chlorhydrique concentré (12 mmol, 1 mL) est ajouté à une solution de ce mélange brut dans le méthanol (10 mL), à température ambiante. Le mélange réactionnel est chauffé sous agitation pendant 8 à 1 6 heures, de sorte à convertir le formiate (lllb) en l'alcool (Mb) correspondant. Le mélange réactionnel brut est évaporé à sec avec un gel de silice. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (élution avec 75 à 100 % d'acétate d'éthyle dans le cyclohexane) pour obtenir de la 4- hydroxyméthylbutyrolactone (Mb) pure (750 mg, 83 %). Acid Hydrolysis Concentrated hydrochloric acid (12 mmol, 1 mL) is added to a solution of this crude mixture in methanol (10 mL) at room temperature. The reaction mixture is heated with stirring for 8 to 16 hours so as to convert the formate (IIIb) to the corresponding alcohol (Mb). The crude reaction mixture is evaporated to dryness with silica gel. The crude product is purified by chromatography on silica gel (elution with 75 to 100% ethyl acetate in cyclohexane) to obtain pure 4-hydroxymethylbutyrolactone (Mb) (750 mg, 83%).
1 H RMN (CDCIs) : 5 4,64 (m, 1 H), 3,92 (dd, J = 2,7 et 12,6 Hz, 1 H), 3,66 (dd, J = 4,5 et 12,6 Hz, 1 H), 2,72-2,49 (m, 3 H (2 H + OH)), 2,35-2,09 (m, 2 H) 13C RMN (CDCI3) : δ 177,7 (s), 80,8 (d), 64,1 (t), 28,7 (t), 23,1 (t) 1 H NMR (CDCl3): δ 4.64 (m, 1H), 3.92 (dd, J = 2.7 and 12.6 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 4.5 and 12.6 Hz, 1H), 2.72-2.49 (m, 3H (2H + OH)), 2.35-2.09 (m, 2H) 13 C NMR (CDCl 3 ) : δ 177.7 (s), 80.8 (d), 64.1 (t), 28.7 (t), 23.1 (t)
2.2/ Voie 2 2.2 / Track 2
Le 4-hydroxyméthylbuténolide (lia) obtenu à l'Exemple 1 est soumis à hydrogénation catalytique, de la manière suivante. The 4-hydroxymethylbutenolide (IIa) obtained in Example 1 is subjected to catalytic hydrogenation, as follows.
Du Pd/C (10 % p/p, 250 mg) est ajouté à une solution de 4- hydroxyméthylbuténolide (1 ,4 g, 12,3 mmol) dans de l'acétate d'éthyle (15 mL) à température ambiante. La suspension sous agitation est dégazée 3 fois sous vide/azote. La suspension est ensuite hydrogénée par une atmosphère d'hydrogène à température ambiante pendant 4 heures. Le mélange brut est filtré sur un tampon de célite et le filtrat est concentré à sec avec un gel de silice. Le produit brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (élution avec un gradient allant de 75 à 100% d'acétate d'éthyle dans le cyclohexane), pour obtenir de la 4-hydroxyméthylbutyrolactone de formule (Mb) pure (1 ,19 g, 82 %). Pd / C (10% w / w, 250 mg) is added to a solution of 4-hydroxymethylbutenolide (1.4 g, 12.3 mmol) in ethyl acetate (15 mL) at room temperature. The stirred suspension is degassed 3 times under vacuum / nitrogen. The suspension is then hydrogenated with a hydrogen atmosphere at ambient temperature for 4 hours. The crude mixture is filtered through a pad of celite and the filtrate is concentrated to dryness with silica gel. The crude product is purified by chromatography on silica gel (elution with a gradient ranging from 75 to 100% of ethyl acetate in cyclohexane), to obtain 4-hydroxymethylbutyrolactone of formula (Mb) pure (1, 19 g, 82%).
1 H RMN (CDCI3) : 5 4,64 (m, 1 H), 3,92 (dd, J = 2,7 et 12,6 Hz, 1 H), 3,66 (dd, J = 4,5 et 12,6 Hz, 1 H), 2,72-2,49 (m, 3 H), 2,35-2,09 (m, 2 H) 1 H NMR (CDCl 3): 5 4.64 (m, 1H), 3.92 (dd, J = 2.7 and 12.6 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 4.5 and 12.6 Hz, 1H), 2.72-2.49 (m, 3H), 2.35-2.09 (m, 2H)
13C RMN (CDCIs) : δ 177,7 (s), 80,8 (d), 64,1 (t), 28,7 (t), 23,1 (t) 13 C NMR (CDCl3): δ 177.7 (s), 80.8 (d), 64.1 (t), 28.7 (t), 23.1 (t)
L'une comme l'autre des voies de synthèse 1 et 2 ci-dessus permettent d'obtenir, de manière régiosélective et avec des rendements élevés, la 4-hydroxyméthylbutyrolactone (Mb), dont la structure est confirmée par RMN du proton et du carbone. Both of the synthesis routes 1 and 2 above make it possible to obtain, in a regioselective manner and with high yields, 4-hydroxymethylbutyrolactone (Mb), the structure of which is confirmed by proton NMR and carbon.
EXEMPLE 3 - Suivi cinétique de la réaction d'oxydation par HPLC EXAMPLE 3 Kinetic Monitoring of the Oxidation Reaction by HPLC
Protocole HPLC HPLC protocol
Un échantillon de ^ 0 μL de milieu réactionnel est dilué dans 1 ,5 mL d'acétonitrile. Le mélange est filtré sur un filtre PTFE 0,2 μηι, puis injecté dans le chromatographe HPLC. A sample of 0 0 μl of reaction medium is diluted in 1.5 ml of acetonitrile. The mixture is filtered on a 0.2 μηι PTFE filter and then injected into the HPLC chromatograph.
Les analyses sont réalisées sur une colonne Thermo Scientific® Syncronis® aQ (250*4,6 mm, 5 μηπ) dans les conditions suivantes : volume d'injection 10 ; température du four 30 °C ; méthode d'élution : isocratique 85/15 eau/acétonitrile de 0 à 5 min, de 5 à 10 min gradient de 85/15 à 90/10 eau/acétonitrile, de 10 à 15 min isocratique 90/10 eau/acétonitrile, de 15 à 20 min gradient de 90/10 à 85/15 eau/acétonitrile ; enregistrement du spectre à 220 nm. The analyzes are carried out on a Thermo Scientific® Syncronis® aQ column (250 * 4.6 mm, 5 μηπ) under the following conditions: injection volume 10; oven temperature 30 ° C; elution method: isocratic 85/15 water / acetonitrile 0 to 5 min, 5 to 10 min 85/15 to 90/10 water / acetonitrile gradient, 10 to 15 min isocratic 90/10 water / acetonitrile, 15 to 20 min gradient from 90/10 to 85/15 water / acetonitrile; spectrum recording at 220 nm.
Suivi cinétique La cinétique de la réaction d'oxydation, réalisée conformément à l'invention, de la lévoglucosénone (LGO) en 4-hydroxyméthylbuténolide (lia) (HBO) est suivie par HPLC. Kinetic monitoring The kinetics of the oxidation reaction, carried out according to the invention, of levoglucosenone (LGO) to 4-hydroxymethylbutenolide (IIa) (HBO) is monitored by HPLC.
499 mg de LGO (3,96 mmol) sont dissous dans 5,3 mL d'acétate d'éthyle (concentration en LGO : 0,75 mol/l). Sont ajoutés à cette solution du tampon solide TAPS (150 mg) et du TAPS sel de sodium (149 mg), puis 77 mg de lipase CaL-B (Novozym® 435, 15 % en masse, 170 U/mmol LGO) et enfin 0,33 mL de peroxyde d'hydrogène à 50% dans l'eau (1 ,2 éq./LGO). Le milieu est agité à 40 °C. 499 mg of LGO (3.96 mmol) are dissolved in 5.3 ml of ethyl acetate (concentration of LGO: 0.75 mol / l). TAPS solid buffer (150 mg) and sodium salt TAPS (149 mg) are added to this solution, followed by 77 mg of CaL-B lipase (Novozym® 435, 15% by weight, 170 U / mmol LGO) and finally 0.33 mL of 50% hydrogen peroxide in water (1.2 eq / LGO). The medium is stirred at 40 ° C.
Des échantillons de ~\ 0 μί. sont prélevés dans le milieu réactionnel à différents intervalles de temps, et analysés par HPLC selon le protocole décrit ci-avant. Les chromatogrammes HPLC obtenus aux temps de réaction T = 0 h, T = 1 h et T = 2 h sont montrés respectivement sur les figures 1 a, 1 b et 1 c. Samples of ~ \ 0 μί. are taken from the reaction medium at different time intervals, and analyzed by HPLC according to the protocol described above. The HPLC chromatograms obtained at the reaction times T = 0 h, T = 1 h and T = 2 h are shown respectively in FIGS. 1 a, 1 b and 1 c.
Les pics correspondant aux différents composés sont attribués par comparaison avec des chromatogrammes HPLC obtenus à partir des produits purs, disponibles dans le commerce ou synthétisés par d'autres voies et purifiés en interne, suivant les temps de rétention : The peaks corresponding to the different compounds are attributed by comparison with HPLC chromatograms obtained from pure products, commercially available or synthesized by other routes and purified internally, according to the retention times:
LGO : 8,40 min LGO: 8.40 min
HBO et formiate FHBO correspondant : 3,73 et 3,87 min HBO and corresponding FHBO formate: 3.73 and 3.87 min
Afin de déterminer le taux de conversion de la LGO à chaque temps, l'aire sous le pic attribué à LGO est mesurée, et reportée sur une courbe étalon réalisée par analyse HPLC de solutions de concentrations en LGO connues. Le taux de conversion de la LGO est déduit de la valeur en masse ainsi déterminée, par comparaison avec la masse initiale de LGO. In order to determine the conversion rate of the LGO at each time, the area under the peak attributed to LGO is measured, and plotted on a standard curve made by HPLC analysis of solutions of known LGO concentrations. The conversion rate of the LGO is deduced from the mass value thus determined, as compared to the initial mass of LGO.
On obtient les résultats montrés dans le tableau 1 ci-après. The results shown in Table 1 below are obtained.
Tableau 1 - Taux de conversion de la LGO après différents temps de réaction, par analyse HPLC  Table 1 - Conversion Rates of LGO after Different Reaction Times by HPLC Analysis
EXEMPLE 4 - Etude de la présence d'une substance tampon sur le taux de conversion Des réactions d'oxydation de la lévoglucosénone (LGO), pour obtenir un mélange de 4-hydroxyméthylbuténolide (lia) (HBO) et du formiate (Nia) correspondant, sont réalisées conformément à la présente invention avec les conditions suivantes. EXAMPLE 4 Study of the Presence of a Buffering Substance on the Conversion Ratio Levuvucensenone (LGO) oxidation reactions, to obtain a mixture of 4-hydroxymethylbutenolide (IIa) (HBO) and the corresponding formate (Nia) , are made in accordance with the present invention with the following conditions.
Dans une solution de LGO à 0,75 mol/L dans l'acétate d'éthyle, sont ajoutés la lipase CaL-B (Novozym® 435, 50 mg/mmol de LGO, 450 U/mmol LGO), puis 1 ,2 éq. de peroxyde d'hydrogène à 50 % dans l'eau. Le milieu réactionnel est agité à 40 °C ou à 60 °C pendant 24 h. In a solution of LGO at 0.75 mol / l in ethyl acetate, the CaL-B lipase (Novozym® 435, 50 mg / mmol of LGO, 450 U / mmol LGO) is added, followed by 1, 2 eq. of 50% hydrogen peroxide in water. The environment The reaction mixture is stirred at 40 ° C. or 60 ° C. for 24 hours.
Des réactions sont également mises en œuvre avec les différentes substances tampon solides suivantes, ajoutées dans le milieu réactionnel au début de la réaction, à une concentration de 20 mg/mL pour chacune des formes acide et basique : MOPS (pKa 7,2), TAPS (pKa 8,4) ou CAPSO (pKa 9,6), d'origine commerciale. Reactions are also carried out with the following different solid buffer substances, added in the reaction medium at the beginning of the reaction, at a concentration of 20 mg / ml for each of the acidic and basic forms: MOPS (pKa 7.2), TAPS (pKa 8.4) or CAPSO (pKa 9.6), of commercial origin.
Pour chacune des substances tampon solides, ainsi que pour un milieu réactionnel sans substance tampon, à 40 °C et à 60 °C, le taux de conversion de la LGO est suivi au cours du temps et évalué par HPLC, selon le protocole opératoire de l'Exemple 3, à partir de la mesure de l'aire sous le pic HPLC attribué à la LGO (temps de rétention 8,40 min). For each of the solid buffer substances, as well as for a reaction medium without buffer substance, at 40 ° C. and 60 ° C., the LGO conversion level is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating protocol of Example 3, from the measurement of the area under the HPLC peak attributed to the LGO (retention time 8.40 min).
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 2. On y observe que des taux de conversion de la LGO supérieurs à 70 % sont obtenus, pour la réaction sans substance tampon, en moins de 4 heures à 40 °C et en moins de 2 heures à 60 °C, et, pour toutes les substances tampon solides testées, en moins de 2 heures à 40 °C. Les tampons solides CAPSO et TAPS permettent même d'obtenir, en 2 h de réaction, des taux de conversion sensiblement égaux à 90%. La performance légèrement moins bonne du tampon MOPS pourrait être attribuée au fait que cette substance forme un gel dans le milieu réactionnel, pouvant entraver l'action de la lipase. The results obtained are shown in FIG. 2. It is observed that LGO conversion rates of greater than 70% are obtained for the reaction without a buffer substance in less than 4 hours at 40 ° C. and in less than 2 hours. at 60 ° C, and for all the solid buffer substances tested, in less than 2 hours at 40 ° C. The CAPSO and TAPS solid buffers even make it possible to obtain, in 2 hours of reaction, conversion rates substantially equal to 90%. The slightly poorer performance of the MOPS buffer could be attributed to the fact that this substance forms a gel in the reaction medium, which can hinder the action of the lipase.
Afin de comparer l'effet sur la réaction d'oxydation de la LGO d'une substance tampon solide conforme à l'invention, il est réalisé à titre d'exemple comparatif un procédé dans les mêmes conditions réactionnelles, mais avec ajout dans le milieu réactionnel, au début de la réaction, d'un tampon liquide, plus précisément d'une solution tampon phosphate de pKa 7,2, à raison de 1 mL de solution tampon pour 4 mL d'acétate d'éthyle. Après 24 heures de réaction, on obtient un taux de conversion de la lipase de 43 %. In order to compare the effect on the LGO oxidation reaction of a solid buffer substance according to the invention, a process is carried out by way of comparative example under the same reaction conditions, but with addition in the medium. at the beginning of the reaction, a liquid buffer, more precisely a phosphate buffer solution of pKa 7.2, at the rate of 1 ml of buffer solution per 4 ml of ethyl acetate. After 24 hours of reaction, a lipase conversion rate of 43% is obtained.
Ce résultat démontre clairement l'efficacité importante et surprenante des substances tampon solides dans le cadre de la mise en œuvre du procédé selon la présente invention. EXEMPLE 5 - Mesure de l'activité résiduelle de la lipase à l'issue de la réaction d'oxydation This result clearly demonstrates the significant and surprising effectiveness of the solid buffer substances in the context of the implementation of the method according to the present invention. EXAMPLE 5 Measurement of the Residual Activity of the Lipase at the End of the Oxidation Reaction
5.1 / Mesure par transformation d'acide laurique 5.1 / Measurement by transformation of lauric acid
Des réactions d'oxydation de la LGO sont réalisées conformément à l'invention, avec les paramètres opérationnels suivants. La concentration initiale en LGO dans l'acétate d'éthyle est égale à 0,75 mol/L. La réaction est conduite à 40 °C. La quantité de lipase CaL-B est de 226,8 unités par mmol de LGO. Les agents oxydants utilisés sont le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou le peroxyde d'hydrogène-urée (H2O2-urée), dans une concentration de 1 ,2 éq. molaires par rapport au LGO. Différentes durées de réaction sont testées : 4 h, 6 h, 8 h, 16 h, 24 h. LGO oxidation reactions are performed in accordance with the invention with the following operational parameters. The initial concentration of LGO in ethyl acetate is 0.75 mol / L. The reaction is conducted at 40 ° C. The amount of CaL-B lipase is 226.8 units per mmol of LGO. The oxidizing agents used are hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide-urea (H 2 O 2 -urea) in a concentration of 1.2 eq. molar to LGO. Different reaction times are tested: 4 h, 6 h, 8 h, 16 h, 24 h.
A l'issue de la réaction, la lipase est isolée du milieu réactionnel par filtration, lavée à l'acétate d'éthyle, à l'eau puis à l'hexane, séchée 1 h à 40 °C puis une nuit à température ambiante dans un dessiccateur sous pression réduite, et enfin soumise au test suivant. At the end of the reaction, the lipase is isolated from the reaction medium by filtration, washed with ethyl acetate, with water and then with hexane, dried for 1 h at 40 ° C. and then overnight at room temperature. in a desiccator under reduced pressure, and finally subjected to the following test.
L'activité résiduelle de la lipase est mesurée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), en déterminant le taux de conversion de l'acide laurique en laurate de propyle. The residual activity of the lipase is measured by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), determining the conversion rate of lauric acid to propyl laurate.
A cet effet, il est préparé une solution de substrat de composition : 74,65 % (p/p) d'acide laurique, 22,37 % (p/p) de 1 -propanol, 2,98 % (p/p) d'eau. Le mélange est liquéfié à 60 °C. 14 mg de lipase sont introduits dans un flacon, placé à 60 °C. 5 g (6 mL) de la solution de substrat sont ajoutés dans le flacon. For this purpose, a composition substrate solution is prepared: 74.65% (w / w) lauric acid, 22.37% (w / w) 1-propanol, 2.98% (w / w) ) of water. The mixture is liquefied at 60 ° C. 14 mg of lipase are introduced into a flask, placed at 60 ° C. 5 g (6 ml) of the substrate solution are added to the flask.
Après 15 min de réaction, 4 échantillons de 2 μί. chacun sont prélevés et placés dans des flacons pour chromatographie en phase gazeuse (GC) de poids connu. 1 mL d'hexane est ajouté dans chaque flacon, puis la quantité d'acide laurique convertie par la lipase est évaluée par GC-MS comme suit. After 15 minutes of reaction, 4 samples of 2 μί. each are removed and placed in vials for gas chromatography (GC) known weight. 1 mL of hexane is added to each vial, then the amount of lauric acid converted by the lipase is evaluated by GC-MS as follows.
GC : flacon contenant au moins 500 μί. de liquide ; injection de 1 μί, en mode split 40:1 ; température de l'injecteur 280 °C ; gaz vecteur : H2, 1 ,2 mL/min à flux constant ; température du four : 60 °C pendant 1 min puis gradient de température de 20 °C/min jusqu'à 325 °C et maintien à 325 °C pendant 5 min ; température de la ligne de transfert : 280 °C. GC: vial containing at least 500 μί. liquid; injection of 1 μί, in 40: 1 split mode; injector temperature 280 ° C; carrier gas: H 2 , 1, 2 mL / min constant flow; oven temperature: 60 ° C for 1 min then temperature gradient from 20 ° C / min to 325 ° C and held at 325 ° C for 5 min; temperature of the transfer line: 280 ° C.
MS : retard solvant 1 min ; température de la source : 230 °C ; température quad : 1 50 °C ; plage de balayage 30 à 350 amu. Une gamme de masse étalon est réalisée pour chaque passage d'échantillon (de 0,1 g/L à 2,8 g/L ou de 0,2 mg/g à 4,5 mg/g). La masse d'acide laurique restant dans chaque échantillon est déduite par comparaison avec la gamme étalon. MS: solvent delay 1 min; temperature of the source: 230 ° C; quad temperature: 150 ° C; sweep range 30 to 350 amu. A standard mass range is made for each sample pass (from 0.1 g / L to 2.8 g / L or from 0.2 mg / g to 4.5 mg / g). The mass of lauric acid remaining in each sample is deduced by comparison with the standard range.
L'activité de l'enzyme, exprimée en PLU/g, est déterminée par l'équation : The activity of the enzyme, expressed in PLU / g, is determined by the equation:
Activité = [(Mi-Mf) / (W x t)] x 1 000 où M, représente le nombre initial de mmoles d'acide laurique Activity = [(Mi-Mf) / (W x t)] x 1000 where M, is the initial number of moles of lauric acid
Mf représente le nombre final de mmoles d'acide laurique Mf represents the final number of mmoles of lauric acid
W représente la quantité de lipase (g) t représente le temps de réaction (min) W represents the amount of lipase (g) t represents the reaction time (min)
Une unité PLU est définie comme la quantité d'enzyme qui, dans des conditions standards de 60 °C et 1 5 min de réaction, forme 1 μηποΙ de laurate de propyle par minute. A PLU unit is defined as the amount of enzyme which, under standard conditions of 60 ° C and 15 min of reaction, forms 1 μηποΙ of propyl laurate per minute.
Mf est calculée à partir de l'aires du pic correspondant en GC-MS et à l'aide d'une courbe d'étalonnage. Mf is calculated from the corresponding peak area in GC-MS and using a calibration curve.
Dans la mesure où il se produit une perte d'activité de la lipase à son entrée en contact avec l'acétate d'éthyle (AcOEt), et où cette perte d'activité ne se prolonge pas dans le temps, une activité résiduelle de 1 00 % est définie pour une suspension de la lipase dans l'acétate d'éthyle. Les résultats obtenus, pour les différentes conditions de la réaction d'oxydation de la LGO conformes à l'invention, sont montrés dans le tableau 2 ci-après. Conditions Activité (PLU/g) Activité résiduelle (%)Insofar as there is a loss of lipase activity when it comes into contact with ethyl acetate (EtOAc), and where this loss of activity does not extend over time, a residual activity of 100% is defined for a suspension of lipase in ethyl acetate. The results obtained for the various conditions of the LGO oxidation reaction in accordance with the invention are shown in Table 2 below. Activity conditions (PLU / g) Residual activity (%)
CaL-B d'origine (sortie du pot) 16763 -Original CaL-B (out of the pot) 16763 -
CaL-B d'origine dans AcOEt 9593 100,0 CaL-B of origin in AcOEt 9593 100.0
(H202), 4 h de réaction 81 16 84,6 (H 2 0 2 ), 4 h reaction 81 16 84.6
(H202), 6 h de réaction 7532 78,6 (H 2 0 2 ), 6 h reaction 7532 78.6
(H202), 8 h de réaction 7132 74,4 (H 2 O 2 ), 8 h reaction 7132 74.4
(H202), 16 h de réaction 3594 37,5 (H 2 0 2 ), 16 h reaction 3594 37.5
(H202-urée), 6 h de réaction 7947 82,9 (H 2 O 2 -urea), 6 h reaction 7947 82.9
(H202-urée), 24 h de réaction 5069 52,9 (H 2 O 2 -urea), 24 h reaction 5069 52.9
Tableau 2 - Activité résiduelle de la lipase après mise en œuvre d'une réaction d'oxydation de LGO conforme à l'invention  Table 2 - Residual activity of the lipase after implementation of an LGO oxidation reaction according to the invention
On observe que l'activité résiduelle de la lipase reste importante même après de longs temps de réaction. Après 6 h de réaction avec la LGO, cette activité résiduelle est supérieure à 78 % quel que soit l'agent oxydant utilisé. It is observed that the residual activity of the lipase remains significant even after long reaction times. After 6 hours of reaction with LGO, this residual activity is greater than 78% regardless of the oxidizing agent used.
5.2/ Réutilisation de la lipase dans un procédé conforme à l'invention 5.2 / Reuse of lipase in a process according to the invention
Une première réaction d'oxydation de la LGO conforme à l'invention est réalisée dans les conditions suivantes. La concentration de LGO dans l'acétate d'éthyle est égale à 0,67 mol/L. A cette solution sont ajoutées : 1 13 ou 227 unités de lipase Cal-B par mmole de LGO (soit respectivement 10 % ou 20 % en poids de lipase par rapport au poids de LGO), 1 ,2 éq. de peroxyde d'hydrogène (50 % dans l'eau), et 20 mg/mL de chacune des formes acide et basique du tampon solide HEPES (pKa 7,5). La réaction est conduite sous agitation à 40 °C pendant 2 heures. A l'issue de la réaction, 10 de milieu réactionnel sont prélevés et analysés par HPLC, selon le protocole décrit dans l'Exemple 2 ci-avant. A first LGO oxidation reaction according to the invention is carried out under the following conditions. The concentration of LGO in ethyl acetate is 0.67 mol / L. To this solution are added: 13 or 227 units of Cal-B lipase per mmol of LGO (respectively 10% or 20% by weight of lipase relative to the weight of LGO), 1, 2 eq. hydrogen peroxide (50% in water), and 20 mg / mL of each of the acidic and basic forms of HEPES solid buffer (pKa 7.5). The reaction is conducted with stirring at 40 ° C for 2 hours. At the end of the reaction, 10 of reaction medium are removed and analyzed by HPLC, according to the protocol described in Example 2 above.
La lipase et la substance tampon solide sont ensuite séparées du milieu réactionnel par filtration, et lavées à l'acétate d'éthyle. The lipase and the solid buffer are then separated from the reaction medium by filtration and washed with ethyl acetate.
Elles sont ensuite réutilisées pour un deuxième cycle de réaction, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-avant, puis dans un troisième, et enfin un quatrième cycle de réaction. A l'issue de chaque cycle, le taux de conversion de la LGO est déterminé par analyse HPLC. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 3. On observe sur cette figure qu'il est possible de réaliser avec la même lipase un second cycle de réaction d'oxydation de la LGO sans perte de rendement. Un troisième cycle, et même un quatrième cycle sont également possibles, avec toutefois des rendements plus faibles. They are then reused for a second reaction cycle, under the same conditions as those described above, then in a third, and finally a fourth reaction cycle. At the end of each cycle, the conversion rate of the LGO is determined by HPLC analysis. The results obtained are shown in Figure 3. It is observed in this figure that it is possible to achieve with the same lipase a second LGO oxidation reaction cycle without loss of yield. A third cycle and even a fourth cycle are also possible, but with lower yields.
EXEMPLE 6 - Variation des conditions opératoires d'oxydation de la lévoglucosénone EXAMPLE 6 Variation of the operating conditions of oxidation of levoglucosenone
L'étape b) du procédé conforme à l'invention, d'oxydation de la lévoglucosénone (LGO), est mise en œuvre comme décrit dans l'Exemple 1 , en faisant varier différents paramètres opératoires comme indiqué dans le tableau 3 ci-après. A l'issue de 2 h de réaction à 40 °C, sont déterminés : le taux de conversion de la LGO, comme indiqué dans l'Exemple 4 ci-avant ; l'activité résiduelle de la lipase, comme indiqué dans l'Exemple 5 ci-avant. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 3 ci-après. Stage b) of the process according to the invention, of oxidation of levoglucosenone (LGO), is carried out as described in Example 1, by varying various operating parameters as indicated in Table 3 below. . After 2 hours of reaction at 40 ° C., the conversion rate of the LGO is determined, as indicated in Example 4 above; the residual activity of the lipase, as shown in Example 5 above. The results obtained are summarized in Table 3 below.
Tableau 3 - Taux de conversion de la LGO et activité résiduelle de la lipase à l'issue de réactions d'oxydation de la LGO selon différents modes de mise en œuvre du procédé selon l'invention  TABLE 3 Conversion Rates of LGO and Residual Activity of Lipase After LGO Oxidation Reactions According to Different Modes of Implementation of the Process According to the Invention
Ces résultats montrent clairement qu'à l'issue de 2 h de réaction, on obtient pour tous les modes de mise en œuvre du procédé selon la présente invention des taux de conversion de la lévoglucosénone supérieurs à 80 %, et pouvant même atteindre près de 94 %. A l'issue de la réaction, la lipase présente en outre une activité résiduelle d'au moins 44 %, et jusqu'à 85 % selon les conditions, si bien qu'elle peut être réutilisée efficacement pour la mise en œuvre de réactions d'oxydation supplémentaires. These results clearly show that after 2 hours of reaction, obtains for all modes of implementation of the method according to the present invention levoglucosenone conversion rates greater than 80%, and may even reach nearly 94%. At the end of the reaction, the lipase also has a residual activity of at least 44%, and up to 85% depending on the conditions, so that it can be reused effectively for the implementation of reaction reactions. additional oxidation.
EXEMPLE 7 - Exemple comparatif - oxydation de la lévoglucosénone et de la cyclohexanone EXAMPLE 7 Comparative Example - Oxidation of Levoglucosenone and Cyclohexanone
L'oxydation de la lévoglucosénone (LGO) ou de la cyclohexanone est mise en œuvre comme décrit dans l'Exemple 1 ci-avant, avec les paramètres opératoires indiqués ci-après. The oxidation of levoglucosenone (LGO) or cyclohexanone is carried out as described in Example 1 above, with the operating parameters indicated below.
Dans une solution de substrat (cyclohexanone ou LGO) à 0,75 mol/L dans l'acétate d'éthyle, sont ajoutés la lipase CaL-B (Novozym®435, 1 15 U/mmol de substrat), puis 1 ,2 éq. de peroxyde d'hydrogène à 50 % dans l'eau. Le milieu réactionnel est agité à 40 °C. In a solution of substrate (cyclohexanone or LGO) at 0.75 mol / l in ethyl acetate, the lipase CaL-B (Novozym®435, 1 U / mmol of substrate) is added, followed by 1, 2 eq. of 50% hydrogen peroxide in water. The reaction medium is stirred at 40 ° C.
Le taux de conversion de chaque substrat est suivi au cours du temps et évalué par HPLC, selon le protocole opératoire de l'Exemple 3 ci-avant, à partir de la mesure de l'aire sous le pic HPLC attribué au substrat. The conversion rate of each substrate is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating procedure of Example 3 above, from the measurement of the area under the HPLC peak assigned to the substrate.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 4. On y observe que les taux de conversion atteints pour la lévoglucosénone sont largement supérieurs à ceux atteints pour la cyclohexanone, et ce dès de courts temps de réaction, et malgré le fait que les tensions de cycle de ces molécules soient comparables. Ce résultat démontre clairement l'efficacité importante et surprenante du procédé selon la présente invention pour l'oxydation de la lévoglucosénone. The results obtained are shown in FIG. 4. It can be seen that the conversion rates achieved for levoglucosenone are much higher than those reached for cyclohexanone, and this from short reaction times, and despite the fact that the cycle voltages of these molecules are comparable. This result clearly demonstrates the significant and surprising effectiveness of the method according to the present invention for the oxidation of levoglucosenone.
EXEMPLE 8 - Variation du composé oxydant EXAMPLE 8 Variation of Oxidant Compound
L'étape b/ d'oxydation de la lévoglucosénone (LGO) est mise en œuvre comme décrit dans l'Exemple 1 ci-avant, avec les paramètres opératoires indiqués ci-après, avec en tant qu'agent oxydant du peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou du peroxyde d'hydrogène - urée (UHP). Dans une solution de LGO à 0,75 mol/L dans l'acétate d'éthyle, sont ajoutés la lipase CaL-B (Novozym®435, 1 15 U/mmol de substrat), puis 1 ,2 éq. d'agent oxydant (peroxyde d'hydrogène à 50 % dans l'eau ou UHP). Le milieu réactionnel est agité à 40 °C. Pour chaque expérience le taux de conversion est suivi au cours du temps et évalué par HPLC, selon le protocole opératoire de l'Exemple 3 ci- avant, à partir de la mesure de l'aire sous le pic HPLC attribué à la LGO. Step b / oxidation of levoglucosenone (LGO) is carried out as described in Example 1 above, with the operating parameters indicated below, with as oxidizing agent hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or hydrogen peroxide - urea (UHP). In a solution of LGO at 0.75 mol / L in ethyl acetate, the CaL-B lipase (Novozym®435, 1 U / mmol of substrate) is added, followed by 1.2 eq. oxidizing agent (50% hydrogen peroxide in water or UHP). The reaction medium is stirred at 40 ° C. For each experiment the conversion rate is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating procedure of Example 3 above, from the measurement of the area under the HPLC peak assigned to the LGO.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 5. On y observe que des taux de conversion élevés sont atteints pour les deux agents oxydants, le peroxyde d'hydrogène s'avérant cependant bien plus performant que le peroxyde d'hydrogène - urée. The results obtained are shown in FIG. 5. It is observed that high conversion rates are achieved for the two oxidizing agents, hydrogen peroxide being however much more efficient than hydrogen peroxide-urea.
EXEMPLE 9 - Mise en œuvre de lipase sous forme libre EXAMPLE 9 - Implementation of lipase in free form
9.1 / Expérience 1 9.1 / Experience 1
L'étape b/ d'oxydation de la lévoglucosénone (LGO) est mise en œuvre d'une part au moyen de l'enzyme CaL-B immobilisée sur support solide (Novozym®435), et d'autre part au moyen de la lipase B de Candida antarctica sous forme libre CaL-B L, telle que commercialisée sous le nom Lipozyme® par la société Novozymes. Step b / oxidation of levoglucosenone (LGO) is carried out on the one hand by means of the enzyme CaL-B immobilized on a solid support (Novozym®435), and on the other hand by means of the lipase B Candida antarctica in free form CaL-B L, as marketed under the name Lipozyme® by Novozymes.
Dans une solution de LGO à 0,75 mol/L dans l'acétate d'éthyle, sont ajoutés la lipase (1 15 U/mmol de substrat), puis l'agent oxydant (peroxyde d'hydrogène à 50 % dans l'eau) (1 ,2 éq. pour la lipase immobilisée sur support solide, et 1 éq. pour la lipase sous forme libre). Le milieu réactionnel est agité à 40 °C. In a solution of LGO at 0.75 mol / L in ethyl acetate, the lipase (1 U / mmol of substrate) is added, followed by the oxidizing agent (50% hydrogen peroxide in the water) (1, 2 eq for lipase immobilized on solid support, and 1 eq for lipase in free form). The reaction medium is stirred at 40 ° C.
Une expérience est également réalisée, pour la lipase sous forme libre, en incluant dans le milieu réactionnel un tampon phosphate de pKa = 7 (KH2PO4/NaOH). An experiment is also carried out for the lipase in free form, including in the reaction medium a phosphate buffer of pKa = 7 (KH 2 PO 4 / NaOH).
Pour chaque expérience le taux de conversion est suivi au cours du temps et évalué par HPLC, selon le protocole opératoire de l'Exemple 3 ci- avant, à partir de la mesure de l'aire sous le pic HPLC attribué à la LGO. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 6. On y observe que des taux de conversion élevés sont atteints pour l'ensemble des conditions testées, alors même que la charge en lipase dans le milieu réactionnel est relativement faible (1 15 PLU/mmol substrat). Lorsque la lipase est mise en œuvre sous forme libre, en présence de solution tampon liquide, on obtient des taux de conversion particulièrement élevés en des temps courts, comparables à ceux obtenus pour la lipase immobilisée sur support solide. For each experiment the conversion rate is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating procedure of Example 3 above, from the measurement of the area under the HPLC peak assigned to the LGO. The results obtained are shown in FIG. 6. It is observed that high conversion levels are achieved for all the conditions tested, even though the lipase load in the reaction medium is relatively low (1 PLU / mmol substrate ). When the lipase is used in free form, in the presence of liquid buffer solution, particularly high conversion rates are obtained in short times, comparable to those obtained for the lipase immobilized on a solid support.
9.2/ Expérience 2 9.2 / Experience 2
L'étape b/ d'oxydation de la lévoglucosénone (LGO) est mise en œuvre d'une part au moyen de l'enzyme CaL-B immobilisée sur support solide (Novozym®435), et d'autre part au moyen de la lipase B de Candida antarctica sous forme libre CaL-B L, telle que commercialisée sous le nom Lipozyme® par la société Novozymes. Step b / oxidation of levoglucosenone (LGO) is carried out on the one hand by means of the enzyme CaL-B immobilized on a solid support (Novozym®435), and on the other hand by means of the lipase B Candida antarctica in free form CaL-B L, as marketed under the name Lipozyme® by Novozymes.
Dans une solution de LGO à 0,75 mol/L dans l'acétate d'éthyle, sont ajoutés la lipase (1 15 U/mmol de LGO pour la lipase sous forme libre, et 1 15 U/mmol de LGO pour la lipase sur support solide), puis l'agent oxydant (peroxyde d'hydrogène à 50 % dans l'eau) (1 ,2 éq. pour la lipase immobilisée sur support solide, et 1 éq. pour la lipase sous forme libre). In a solution of LGO at 0.75 mol / L in ethyl acetate, lipase (1 U / mmol of LGO for free form lipase, and 1 U / mmol of LGO for lipase is added. on solid support), then the oxidizing agent (50% hydrogen peroxide in water) (1.2 eq for immobilized lipase solid support, and 1 eq for lipase in free form).
Pour la lipase sous forme libre il est également introduit dans le milieu réactionnel un tampon phosphate de pKa = 7 (KH2PO4/NaOH). For the lipase in free form, a phosphate buffer of pKa = 7 (KH 2 PO 4 / NaOH) is also introduced into the reaction medium.
Pour la lipase sur support solide, les différentes substances tampons solides suivantes sont mis en œuvre, à une concentration de 20 mg/mL pour chacune des formes acide et basique : MOPS (pKa 7,2), TAPS (pKa 8,4) ou CAPSO (pKa 9,6), d'origine commerciale. Dans tous les cas, les tampons sont ajoutés dans le milieu réactionnel au début de la réaction. For the solid support lipase, the following solid buffer substances are used, at a concentration of 20 mg / mL for each of the acidic and basic forms: MOPS (pKa 7.2), TAPS (pKa 8.4) or CAPSO (pKa 9.6), of commercial origin. In all cases, the buffers are added to the reaction medium at the beginning of the reaction.
Le milieu réactionnel est agité à 40 °C. The reaction medium is stirred at 40 ° C.
Pour chaque expérience le taux de conversion est suivi au cours du temps et évalué par HPLC, selon le protocole opératoire de l'Exemple 3 ci- avant, à partir de la mesure de l'aire sous le pic HPLC attribué à la LGO. For each experiment, the conversion rate is monitored over time and evaluated by HPLC, according to the operating procedure of Example 3 below. before, from the measurement of the area under the HPLC peak attributed to the LGO.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 7. On y observe que des taux de conversion élevés sont atteints pour l'ensemble des conditions testées, alors même que la charge en lipase dans le milieu réactionnel est relativement faible. Lorsque la lipase est mise en œuvre sous forme libre, en présence de solution tampon liquide, on obtient des taux de conversion tout à fait intéressants (70 % de conversion) en des temps courts (4 heures seulement), avec en outre l'avantage d'un coût des réactifs limité. The results obtained are shown in FIG. 7. It is observed that high conversion rates are achieved for all the conditions tested, even though the lipase load in the reaction medium is relatively low. When the lipase is used in free form, in the presence of liquid buffer solution, conversion rates of quite high interest (70% conversion) are obtained in short times (only 4 hours), with the advantage that a limited reagent cost.
EXEMPLE 10 - Synthèse de 4-hydroxyméthylbuténolide à partir de lévoglucosénone au moyen de lipases sous forme libre EXAMPLE 10 Synthesis of 4-hydroxymethylbutenolide from levoglucosenone by means of lipases in free form
Du 4-hydroxyméthylbuténolide, de formule (lia), est préparé à partir de lévoglucosénone (LGO) selon le mode de mise en œuvre particulier du procédé selon la présente invention ci-après. 4-hydroxymethylbutenolide, of formula (IIa), is prepared from levoglucosenone (LGO) according to the particular embodiment of the process according to the present invention hereinafter.
Les lipases testées sont les suivantes : Lipozyme® Candida antarctica type B Cal-B L ; Lipase AY "Amano" 30SD-K Candida rugosa ; Lipase MER "Amano". The lipases tested are as follows: Lipozyme® Candida antarctica type B Cal-B L; Lipase AY "Amano" 30SD-K Candida rugosa; Lipase MER "Amano".
Le protocole opératoire est le suivant. The operating protocol is as follows.
Dans un erlenmeyer bafflé de 50 mL ou un ballon de 250 mL, sont introduits successivement : - la lévoglucosénone (LGO, 504 mg, 4 mmol), In a 50-ml baffled Erlenmeyer flask or a 250-mL flask, are introduced successively: levoglucosenone (LGO, 504 mg, 4 mmol),
- l'acétate d'éthyle (5,3 mL), ethyl acetate (5.3 mL),
- la lipase : soit Lipozyme® Candida antarctica type B Cal-B L (0,1 à 0,3 mL soit 1 15 U à 350 U, activité 5000 LU/g), soit Lipase AY "Amano" 30SD- K Candida rugosa (13 mg soit 1 15 U activité 30000 U/g), soit Lipase MER "Amano" (53 mg soit 1 15 U activité 7500 LU/g), lipase: either Lipozyme® Candida antarctica type B Cal-B L (0.1 to 0.3 ml or 1 15 U at 350 U, activity 5000 LU / g), or Lipase AY "Amano" 30SD-K Candida rugosa (13 mg, that is 1 U U activity 30000 U / g), or Lipase MER "Amano" (53 mg or 1 15 U activity 7500 LU / g),
- l'eau oxygénée à 50 % dans l'eau (1 éq., 0,27 mL), - 50% oxygenated water in water (1 eq., 0.27 ml),
- avec/ou sans tampon dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4/NaOH) pH 7 (0,25 mL). Le mélange réactionnel est agité magnétiquement ou à l'incubateur (Thermo MAXQ 150 RPM) à 40 °C pendant 24 h. with or without potassium dihydrogenphosphate buffer (KH 2 PO 4 / NaOH) pH 7 (0.25 mL). The reaction mixture is stirred magnetically or at the incubator (Thermo MAXQ 150 RPM) at 40 ° C for 24 h.
Le milieu réactionnel est ensuite soumis à une étape d'hydrolyse acide comme décrit dans l'Exemple 1 ci-avant. Pour chacune des enzymes et conditions testées, on obtient du 4- hydroxyméthylbuténolide avec un rendement compris entre 60 et 80 %. The reaction medium is then subjected to an acid hydrolysis step as described in Example 1 above. For each of the enzymes and conditions tested, 4-hydroxymethylbutenolide is obtained with a yield of between 60 and 80%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de transformation de la lévoglucosénone en un composé ule générale (II) : 1. Process for converting levoglucosenone into a general ule compound (II):
dans laquelle R représente -CH=CH- ou -CH2-CH2-, comprenant les étapes successives suivantes : a) le cas échéant, pour obtenir un composé de formule générale (II) dans laquelle R représente -CH2-CH2-, hydrogénation de la lévoglucosénone pour former de la dihydrolévoglucosénone, b) oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone obtenue à l'étape a), c) hydrolyse du mélange réactionnel obtenu à l'étape b), d) le cas échéant, pour obtenir un composé de formule générale (II) dans laquelle R représente -CH2-CH2-, si une étape a) n'a pas été réalisée, hydrogénation du composé obtenu à l'étape c), ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est réalisée par mise en contact d'une solution de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone dans un solvant, avec une lipase en présence d'un agent oxydant et d'un composé donneur d'acyle. in which R represents -CH = CH- or -CH 2 -CH 2 -, comprising the following successive steps: a) if necessary, to obtain a compound of general formula (II) in which R represents -CH 2 -CH 2 -, hydrogenation of levoglucosenone to form dihydrolévoglucosénone, b) oxidation of levoglucosénone or dihydrolévoglucosénone obtained in step a), c) hydrolysis of the reaction mixture obtained in step b), d) if necessary, to obtain a compound of general formula (II) in which R represents -CH 2 -CH 2 -, if a step a) has not been carried out, hydrogenation of the compound obtained in step c), said process being characterized in that step b) of oxidation of levoglucosenone or of dihydrolévoglucosénone is carried out by contacting a solution of levoglucosénone or dihydrolévoglucosénone in a solvent, with a lipase in the presence of an oxidizing agent and a acyl donor compound.
2. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel pour l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la quantité de lipase mise en œuvre est comprise entre 56 et 1 134 unités de lipase par millimole de lévoglucosénone ou de dihydrolévoglucosénone. 2. Method according to claim 1, wherein for step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the amount of lipase used is between 56 and 1134 units of lipase per millimole of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, selon lequel la lipase est la lipase B de Candida antarctica. 3. Method according to any one of claims 1 to 2, wherein the lipase is lipase B of Candida antarctica.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel la durée de l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est comprise entre deux et quatre heures, de préférence entre deux et trois heures. 4. Process according to any one of claims 1 to 3, wherein the duration of step b) of oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone is between two and four hours, preferably between two and three hours.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, le composé donneur d'acyle et le solvant sont constitués par un même produit, de préférence l'acétate d'éthyle. 5. Method according to any one of claims 1 to 4, wherein in step b) of oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the acyl donor compound and the solvent are constituted by the same product, of preferably ethyl acetate.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, selon lequel dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, l'agent oxydant est choisi parmi le peroxyde d'hydrogène et le peroxyde de carbamide, en solution dans l'eau. 6. Process according to any one of claims 1 to 5, wherein in step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the oxidizing agent is selected from hydrogen peroxide and carbamide peroxide. , in solution in water.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, selon lequel dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la concentration d'agent oxydant est au moins égale à 1 équivalent molaire par rapport à la lévoglucosénone ou la dihydrolévoglucosénone, de préférence comprise entre 1 et 2 équivalents molaires par rapport à la lévoglucosénone ou la dihydrolévoglucosénone. 7. Method according to any one of claims 1 to 6, wherein in step b) of oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the concentration of oxidizing agent is at least equal to 1 molar equivalent relative to levoglucosenone or dihydrolévoglucosenone, preferably between 1 and 2 molar equivalents relative to levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone est réalisée à une température comprise entre 30 et 60 °C, et préférentiellement égale à 40 °C. 8. Process according to any one of claims 1 to 7, wherein the step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone is carried out at a temperature between 30 and 60 ° C, and preferably equal to 40 ° vs.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, selon lequel dans l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, la concentration en lévoglucosénone ou en dihydrolévoglucosénone dans le solvant est comprise entre 0,5 et 1 mol/L. 9. Process according to any one of claims 1 to 8, wherein in step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, the concentration of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone in the solvent is between 0.5 and 1 mol / L.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, selon lequel l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, est réalisée en présence dans le milieu réactionnel d'au moins une substance tampon solide. 10. Process according to any one of claims 1 to 9, wherein the step b) of oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, is carried out in the presence in the reaction medium of at least one solid buffer substance.
11. Procédé selon la revendication 10, selon lequel la concentration de la substance tampon solide dans le milieu réactionnel est comprise entre 20 et 100 mg/mL. 11. The method of claim 10, wherein the concentration of the solid buffer substance in the reaction medium is between 20 and 100 mg / mL.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , selon lequel la lipase est isolée du milieu réactionnel après l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, préalablement à la mise en œuvre de l'étape c) d'hydrolyse. 12. Method according to any one of claims 1 to 1 1, wherein the lipase is isolated from the reaction medium after step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, prior to the implementation of the step c) hydrolysis.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, selon lequel l'étape b) d'oxydation de la lévoglucosénone ou de la dihydrolévoglucosénone, est réalisée en présence dans le milieu réactionnel d'au moins une substance tampon liquide. 13. A method according to any one of claims 1 to 12, wherein the step b) oxidation of levoglucosenone or dihydrolévoglucosénone, is carried out in the presence in the reaction medium of at least one liquid buffer substance.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, selon lequel la lipase est immobilisée sur un support solide. 14. A method according to any one of claims 1 to 13, wherein the lipase is immobilized on a solid support.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, selon lequel la lipase est sous forme libre dans le milieu réactionnel. 15. Method according to any one of claims 1 to 13, wherein the lipase is in free form in the reaction medium.
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