EP3125675A2 - Procede à ecoulement piston de production de racines de plantes - Google Patents

Procede à ecoulement piston de production de racines de plantes

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Publication number
EP3125675A2
EP3125675A2 EP15735834.2A EP15735834A EP3125675A2 EP 3125675 A2 EP3125675 A2 EP 3125675A2 EP 15735834 A EP15735834 A EP 15735834A EP 3125675 A2 EP3125675 A2 EP 3125675A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
support
roots
opening
root
culture
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15735834.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre-Antoine Mariage
Thierry MARIQUE
Mario GODOY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Green2chem SA
Original Assignee
Green2chem SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Green2chem SA filed Critical Green2chem SA
Publication of EP3125675A2 publication Critical patent/EP3125675A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G31/00—Soilless cultivation, e.g. hydroponics
    • A01G31/02—Special apparatus therefor
    • A01G31/04—Hydroponic culture on conveyors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G31/00—Soilless cultivation, e.g. hydroponics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G24/00—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor
    • A01G24/50—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor contained within a flexible envelope
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2
    • Y02P60/21—Dinitrogen oxide [N2O], e.g. using aquaponics, hydroponics or efficiency measures

Definitions

  • the field of the invention is that of processes for producing roots of plants above ground by scrolling a culture medium and devices implementing said methods. More specifically, the invention also relates to a support for producing roots of plants above ground.
  • Medicinal plants are the main source of medicines for the majority of the world's population and account for 40% of drugs marketed in Europe and the United States. At present, these compounds are extracted from wild plants or cultivated by extraction with solvents (ethanol, hexane, acetone, etc.) and are marketed in the pharmaceutical, cosmetic, nutraceutical, dye and food sectors. However, the production of these compounds from conventionally grown or wild harvested plants is not sufficient to meet the growing market demand. In addition, harvesting wild plants is in many cases a significant threat to species as well as their ecosystem, which is in contradiction with consumer demand for more sustainability.
  • solvents ethanol, hexane, acetone, etc.
  • bioactive secondary metabolites is in many cases too metabolically complex to be carried out in bacterial or yeast microorganisms that do not have adequate genetic material. Culture of unicellular plant cells in a bioreactor is rarely satisfactory. Indeed, cell lines are generally genetically unstable, fragile, demanding complex nutrients and the production of secondary metabolites under these conditions is unstable. Moreover, many bioactive molecules require, to be produced, interactions between several plant cell lines that can only be found in differentiated tissues such as plant roots.
  • Plant roots are a potential source of bioactive molecules that include a disconcerting diversity of metabolites and proteins, and therefore, are considered the site of the sole secondary metabolism of the whole plant.
  • Recent advances in in vitro root culture have resulted in the production of many secondary metabolites from either adventitious and phytohormone-derived root lines to grow, or transformed with Rhizobium Rhizogenes and able to grow in higher media.
  • the roots of plants can indeed be cultivated in vitro in a solid or liquid support without aerial organs (stems and leaves) provided they are brought into contact with a carbon source (glucose, etc.) and growth hormones specific to root multiplication. These hormones are very expensive, which prevents the development of the culture of this type of roots on an industrial scale.
  • An example of this type of liquid bioreactor root culture is given in Korean Patent WO2008100016.
  • In vitro root culture can also be carried out without hormones using roots transformed by bacteria such as Agrobacterium Rhizogenes.
  • Roots transformed in this way are particularly easy to sterilely cultivate in an artificial medium in a liquid, solid or aerial medium (with feeding of the medium in the form of fog), and have a high genetic and biochemical stability. This type of root is commonly called “hairy roots” or “hair roots”.
  • an object of the invention in at least one of its embodiments, is to provide a continuous flow piston process for producing roots of plants above ground by scrolling a culture medium.
  • Another object of the invention in at least one of its embodiments, is to provide a device implementing a continuous flow piston process for producing roots of plants above ground.
  • the invention in at least one of its embodiments, is also intended to provide an above-ground plant roots production support suitable for use in a continuous piston-flow process.
  • the invention relates to a continuous piston-flow process for producing roots of plants above ground by moving a culture support, said support serving as containment chamber.
  • such a continuous piston flow process comprises the following successive steps: ⁇ deployment of the culture support for production of plant roots, said support being provided with at least a first isolation means for compartmentalizing the support and to isolate the different compartments thus created from each other, Seeding within said support of a root inoculum through at least a first opening located, in the direction of travel of the support, downstream of said at least first isolation means,
  • Opening of at least one second isolation means making it possible to compartmentalize the support and to isolate the different compartments thus created from each other, situated, in the direction of the scrolling of the support, downstream from said at least one first opening ,
  • Root harvesting the speed of travel of said support allowing an increase in root mass by a factor of at least 4 between the inoculum seeding step and the harvest.
  • the general principle of the invention is based on the fact that a root inoculum is introduced into a culture medium by at least a first opening located between a first means and a second insulation means held in the closed position, said culture support forming a containment vessel or bioreactor. Then, the roots are fed by nebulization of a culture medium through at least a second opening located between the first means and the second insulating means, the culture support forming a containment enclosure or bioreactor being maintained preferentially under overpressure.
  • Said second isolation means being tilted in the open position in order to avoid any tearing due to excessively high pressure or when the two insulation means are kept in the closed position, said support being provided with at least one additional opening allowing avoid any excess pressure tear important such as a vent or a valve and / or allowing the evacuation of liquid.
  • the roots are fed into the support by nebulising a culture medium through the at least one second opening, thereafter stopping the supply by nebulization and the support is advanced, this succession of operation being reproduced as the progress of the support.
  • the containment vessel or bioreactor is thus closed at both ends and has one or more openings for eliminating excess air or liquid and preferably maintained at overpressure, preferably using a mist-laden air.
  • the support forming the confinement enclosure or bioreactor is set in motion by a displacement device by carrying within it the roots, preferably of the hairy or adventitious type, being grown by any techniques known to those skilled in the art. art such as a treadmill.
  • the roots develop within the support as the deployment and thus the advancement of said support.
  • the support is finally closed with a third means of isolation and the roots are harvested with the bioreactor, the latter can be used as packaging or be harvested directly.
  • the bioreactor or containment chamber is renewed as and when to replace the part that has moved and allow the introduction of a new inoculum.
  • the inventors have also determined that feeding the roots by nebulization of a culture medium makes it possible to supply nutrients to a containment vessel or bioreactor having a length of more than 10 m while maintaining a productivity greater than 500 g / m. 2 / day root dry matter, preferably greater than 1 kg / m 2 / day.
  • the invention is based on a completely new and inventive approach of seeding a support parade by an inoculum of roots, said support serving as containment chamber or bioreactor, the supply of said inoculum being carried out by nebulization of a culture medium. Because of the scrolling, the beginning of the confinement enclosure or bioreactor is renewed progressively so as to replace the part of the containment or bioreactor having moved, roots being introduced in the form of a inoculum for growing in said reactor and / or producing metabolites of interest therein.
  • the support serving as containment vessel or bioreactor is composed of a transparent envelope, and more preferably of a flexible transparent envelope consisting of polymer such as polyvinyl chloride (PVC), polyamide, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polylactic acid (PLA), poly-succinate.
  • PVC polyvinyl chloride
  • PLA polylactic acid
  • metabolites of interest is intended to denote an organic compound that is intermediate or derived from metabolism, generally in the form of small molecules or monomers.
  • continuous piston flow process is meant a process in which a bioreactor is filled at one end continuously and / or with successive charges at time intervals suitably distributed over time and drained at the other end. end continuously and / or by successive discharging at time intervals suitably distributed in time so that at a given distance from the first end of the bioreactor, the state of the roots is identical
  • silling a "support” or “support parade” is meant to indicate that the support is moving relative to where the seeding is performed.
  • deployment of the support it is meant to position the support before the place where seeding is performed. Said deployment corresponds to unfolding or unfolding of the support, preferably an unwinding of the support.
  • insulation means means a mechanical insulation means such as clip, clip.
  • inoculum is intended to denote a sample containing whole plant roots or in pieces, intended to be introduced into a medium favorable to its multiplication, in order to produce a greater amount.
  • root harvesting is meant the actual root collection or the recovery of the support comprising the roots, said support being closed at its ends by the insulation means thus forming a sealed pocket.
  • the at least first opening allowing the inoculum to be seeded with a root inoculum corresponds to the at least one second opening allowing the nebulization feed of a culture medium, thus the seeding of the medium.
  • support and the nebulized feed of a culture medium are made by the same opening.
  • said at least one first opening and at least one second opening are merged.
  • the at least first opening and / or the at least second opening are located on the upper part of the support.
  • the opening will not be encumbered by the roots and / or the liquid formed by the condensed mist.
  • a feed from above also allows a better distribution of particles of nebulized medium in the sky of the enclosure formed by the support above the growing roots, the particles undergoing the force of gravity.
  • the first isolation means of the deployment step corresponds to the second isolation means of the seeding step when the cycle of these steps is repeated.
  • the culture support is in the form of a strip comprising at least one lower sheet and at least one upper sheet interconnected by at least one securing means.
  • solidifying means any means for securing the upper and lower sheets between said means being selected from the group consisting of heat sealing, sewing, gluing, preferably the sheets are secured at their lateral ends or edges by gluing or heat-sealing to form a tube during the overpressure of the support after seeding.
  • the containment vessel or bioreactor formed by the support is physically separated from the external environment and allows root growth in a controlled and sanitized and / or sterile environment.
  • the culture support comprises at least one permeable sheet secured to at least a first lower sheet and at least a first upper sheet and situated between them, said support being provided with at least a vent, at least one drain and at least one opening for seeding and / or allowing the nebulization feed of a culture medium.
  • such a support has the advantage of allowing the roots to grow around the at least one permeable sheet by using it as a support and by avoiding settling under the effect of their own weight.
  • the roots can maintain a sufficiently low root bed density and sufficiently high root spacing that will allow the aerosol particles to penetrate and feed the heart of the root bed.
  • This type of support with at least one bonded permeable sheet is simple to manufacture, has a small steric hindrance and is therefore also simple to sterilize.
  • the method according to the invention is such that the step of deploying the culture medium corresponds to a running of said support.
  • the non-deployed support has a small steric hindrance which facilitates its storage as well as possible sterilization step for example by irradiation and / or pasteurization.
  • the process according to the invention is such that the root inoculum comprises pieces of roots having a size of at least 50 mm and at most
  • the pieces of roots have both a size compatible with rapid growth and a sufficient number per mass unit to form after their growth a homogeneous root mat inside the support.
  • the process according to the invention is such that the roots are of the hair type.
  • the roots grown in the process do not require the addition of growth hormone in the culture medium.
  • the process according to the invention is such that the aerosol particles constituting the nebulization feed have an average diameter less than or equal to 4 ⁇ and preferably less than or equal to 2 ⁇ m.
  • the aerosol particles will have a lower mass, a higher specific surface per unit mass and therefore will have less tendency to sediment within the support and therefore can be transported over greater distances.
  • their small size will allow them to penetrate deeper into the root bed and feed the roots in the center of the bed more efficiently compared to aerosol particles with an average diameter greater than 4 ⁇ .
  • Example 3 below shows that the growth of Salvia miltiorrhiza roots is directly affected by the average size of the aerosol particles.
  • the process according to the invention is such that the seeding of said support is carried out in a white chamber.
  • the various manipulations such as inoculation and the connections between the nebulization chamber and the second opening, can be performed under aseptic conditions and limit the risk of contamination of the controlled environment inside the support.
  • the method according to the invention is such that it comprises a step of stimulating root growth by illumination and / or modification of the composition of the culture medium.
  • it is possible to stimulate the production of metabolites of interest as bioactive compounds by induced light stress to increase root growth and / or production of active compounds.
  • These light stresses can be achieved either at wavelengths visible by conventional lighting or specialized horticulture, or at specific wavelengths with lighting with 380-500 nm LEDs, preferably between 400-450 nm, or again by lighting at UV wavelengths, preferably between 270-290 nm.
  • the advantage of the technology that is the subject of the invention is that the lighting can be arranged at any time during the growth of the roots. It is thus possible, for example, to stimulate the production of bioactive compounds only at an advanced stage of growth so as to prevent these bioactive compounds in excessive concentration from inhibiting root growth.
  • the method according to the invention is such that it comprises a root elicitation step by illumination and / or modification of the composition of the culture medium and / or acoustic stimulation.
  • a root elicitation step by illumination and / or modification of the composition of the culture medium and / or acoustic stimulation.
  • the method according to the invention is such that the stimulation and / or elicitation steps are performed on all or part of the support.
  • the method according to the invention is such that the cultivated root is selected from the group consisting of the root of the species Arabidopsis thaliana, Arctium majus, Armoracia rusticana, Artemisia annua, Astragalus membranaceous, Atropa belladonna, Azadirachta indica, Berberis vulgaris, Calystegia sepium, Catharanthus roseus and Trichophyllus, Cinchosa pubescens, Cistanche tubulosa, Datura stramonium, Derris trifolia, Dioscorea vollosa, Echinacea angustifolia, Pallida and purpurea, Eleutherococcus senticosus, Fallopia multiflora, Gloriosa superba, Glycyrrhiza glabra and Uralensis, Harpagophytum Procumbens, Hydrastis canadensis, Hyoscyamus mutic
  • the process according to the invention is such that the root elicitation step for producing a tanshinone-type metabolite of interest is carried out by illumination by means of illumination. wavelengths between 380 and 500 nm, said elicitation preferably being carried out on roots of salvia miltiorrhiza type.
  • the method according to the invention is such that the elicitation step and / or the step of stimulating root growth is carried out in the presence of at least one compound selected from the group of compounds consisting of sodium acetate, jasmonic acid, methyl jasmonate, yeast extract, salicylic acid, fatty acids, C12 fatty acids, ethylene, nitrous oxide and carbon dioxide.
  • Example 6 below shows the increased production of Tanshinone with an elicitation of 100 ppm of yeast extract.
  • C12 fatty acids is intended to denote a fatty acid containing 12 carbon atoms.
  • the invention also relates to a device for semi-continuous production of roots of plants above ground by scrolling a culture support, said support serving as confinement chamber or bioreactor, adapted to implement the method according to the invention, said device comprising:
  • the support being provided with insulating means to compartmentalize the support and isolate the various compartments thus created each other, at least one vent and at least a drain and at least one opening allowing the seeding and / or allowing the nebulization feed of a culture medium located between two successive isolation means.
  • the support forming the confinement enclosure or bioreactor has shrinkage of the circumference when the latter is fed to the culture medium, these shrinkage being obtained preferentially with the aid of external clamp.
  • media feed unit any system that makes it possible to limit the steric bulk of the storage of the support, such as folding-stacking, winding in a reel, preferably the feed unit. present in the form of a coil.
  • support scrolling mechanism any system for moving the support such as a treadmill, suspension on moving cables, tray equipped with rollers, preferably a treadmill on which the support is deposited.
  • nebulizing chamber is meant more particularly to designate a closed chamber within which culture medium is introduced for example by means of a peristaltic pump or any other techniques known to man of the the art and nebulized in the chamber either with a diffuser fed with pressurized medium, or with an ultrasonic nebulizer or with any other techniques known to those skilled in the art to form liquid particles of average diameter less than or equal to 50 ⁇ , preferably less than or equal to 10 ⁇ , more preferably less than or equal to 5 ⁇ , most preferably less than or equal to 4 ⁇ and most preferably less than or equal to 2 ⁇ .
  • a compressed air inlet on the fogging chamber makes it possible to carry the haze formed at a flow rate sufficient to supply, through one or more connections, the confinement enclosure or mist reactor over a distance greater than 5 m, and preferentially greater than 10 m.
  • nebulization chamber fed with a carrier gas is meant a chamber provided with a feed in culture medium in mist form, the culture medium in fogged form being either inserted into the chamber by injection nozzles, is formed within the chamber using ultrasonic nebulizer and mixed with a gas stream to carry the aerosol particles formed throughout the support.
  • connection between the nebulizing chamber and the support is meant to designate one or more pipes with or without valves and connections for supplying the flow of gas carrying the aerosol particles between the mist chamber and a nozzle. or more openings of the support.
  • the device according to the invention is such that it comprises a white room for seeding.
  • white room is meant a room or space where the concentration of microorganisms is controlled to minimize the introduction, generation, retention of these microorganisms within the support as by filtration air and / or air treatment with radiation and / or chemical and / or thermal treatment of the air.
  • the white chamber will be kept under pressure by injection of filtered air in order to keep the concentration of microorganisms at lower levels as exposed by the ISO 14644-1 Class 3 standard.
  • FIG. 1 schematically describes the successive steps of a method according to the invention
  • FIG. 2 illustrates a device able to implement a method according to the invention
  • FIG. 3 shows in graphical form a production of Salvia Milthiorriza hair roots in a bioreactor using a method according to the invention
  • FIG. 4 shows in graphical form a production of Salvia Milthiorriza hairy roots in a bioreactor as a function of the frequency of the fogger by implementing a process according to the invention
  • FIG. 5 graphically presents a production of Panax Ginseng hairy roots in a bioreactor using a method according to the invention.
  • FIG. 1 shows an embodiment of a continuous piston-flow process for producing roots of plants above ground by moving a culture support, said support acting as confinement enclosure. Said method comprises the following successive steps:
  • the method according to the invention may comprise an additional step of stimulating root growth by illumination and / or by modifying the composition of the culture medium and / or a root elicitation step by illumination and / or modification. the composition of the culture medium and / or by stimulation acoustically, said additional step being inserted between steps 4 and 5 or being confused with step 4.
  • a culture support reel for producing plant roots said support being in the form of a strip comprising two sheets joined at their ends or edges and being provided with a first means of insulation in the form of forceps or closing clip for bag,
  • the support is transported by a treadmill, the root inoculum introduced into the support develops there simultaneously with the transport of this until it is harvested at the exit.
  • the support constituting the containment enclosure or reactor is renewed progressively so as to replace the part s' moved and roots are introduced to grow and / or produce metabolites of interest.
  • the nebulization chamber consists of a closed chamber inside which culture medium is introduced for example using a peristaltic pump or any other techniques known to those skilled in the art and nebulized in the chamber is using a diffuser fed with pressurized medium, an ultrasonic nebulizer or any other technique known to those skilled in the art to form liquid particles of average diameter less than or equal to 50 ⁇ , preferably less than or equal to 10 ⁇ , more preferably less than or equal to 5 ⁇ m, most preferably less than or equal to 4 ⁇ and most preferably less than or equal to 2 ⁇ m average diameter.
  • a compressed air inlet on the fogging chamber enables the haze formed to be carried at a sufficient flow rate to supply, through one or more connections, the external mist tunnel over a distance greater than 5 m and preferably greater than 5 m. 10 m.
  • the support is preferentially transparent, and more preferentially transparent and flexible, and consists of a polymer such as polyvinyl chloride (PVC), polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polylactic acid (PLA), poly succinate consisting of a polymer such as poly-vinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, poly-lactic acid, poly-succinate.
  • PVC polyvinyl chloride
  • PLA polylactic acid
  • PDA poly succinate consisting of a polymer such as poly-vinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, poly-lactic acid, poly-succinate.
  • the support closed at both ends, has one or more openings for
  • the roots are harvested by isolating the part of the support containing them from the rest of the support and detaching this part of the support. This operation can be done by any technique known to those skilled in the art and preferably by crushing the walls of the support with 2 clamps and cutting the portion between the two clamps so as to limit the contacts between the two. inside the support and its external environment. When the support is set in motion, said support is continuously renewed and inoculated with hairy roots.
  • the roots can be illuminated at a photon intensity of 150 / ⁇ mole / sec / m 2 at wavelengths of 600 nm +/- 20 nm to stimulate their growth.
  • Panax Ginseng described in Examples 7 and 8 below or the species Arabidopsis thaliana, Arctium majus, Armoracia rusticana, Artemisia annua, Astragalus membranaceous, Atropa belladonna, Azadirachta indica, Berberis vulgaris, Calystegia sepium, Catharanthus roseus and Trichophyllus, Cinchosa pubescens, Cistanche tubulosa, Datura stramonium, Derris trifolia, Dioscorea vollosa, Echinacea angustifolia, pallida and purpurea, Eleutherococcus senticosus, Fallopia multiflora, Gloriosa superba, Glycyrrhiza glabra and uralensis, Harpagophytum procumbens, Hydrastis canadensis, Hyoscyamus muticus
  • This tunnel is composed of 15 compartments of 1 m 3 communicating with each other by narrowing of the circumference of the tunnel using external metal clamp,
  • a controlled atmosphere sterile zone at the inlet of the system for attaching the inlet and outlet connections aseptically to the opening of the bag and inoculating the bag with roots (22).
  • This sterile zone consists of a CLEAN AIR TECHNIEK W DLF 660EC laminar flow hood adapted to the walls.
  • a sterile compressed air supply that ensures positive pressure inside the plastic tunnel and provides the oxygen needed for root growth (23).
  • This sterile air supply is through a Pall Advanta 10 "filter and a CoenCo deoil air compressor (at a flow rate of 3 m 3 / h) through the nebulizer unit.
  • a nebulization culture medium feed (24) stainless steel tank equipped with a level detector and a Beijing Ultrasonic 2Mhz ultrasonic atomization unit.
  • the haze whose particles have an average size of 2 ⁇ ⁇ is transferred thanks to the flow of air over the entire length of the tunnel.
  • the nebulizer tank is fed at a rate of 81 / h by a Masterflex peristaltic pump.
  • the leaves are wounded with a sterile scalpel, then infected with Rhizobium rhizogenes strain LMG-152, which has an optical density of between 0.7 and 1.
  • the leaves are then laid for one week on the "Murashige and Skoog” (MS) medium (Sigma-Aldrich ref: M5519), in the dark and at 24 ° C.
  • the medium is composed of 4.4 g / l of MS powder, 20 g / l of sucrose, 7 g / l of agar and no phytohormones. After incubation, the leaves are transferred to a liquid "MS" medium (same composition as the solid but without agar) with 250 mg / L Ampicillin and 250mg / L Cefotaxime for 4-5 days with agitation to get rid of the bacteria.
  • MS liquid "MS" medium (same composition as the solid but without agar) with 250 mg / L Ampicillin and 250mg / L Cefotaxime for 4-5 days with agitation to get rid of the bacteria.
  • Example 2 Production of Salvia Milthiorrhiza Roots in the Misted Reactor An example of such a continuous bioreactor which meets the description of the invention is given in this example.
  • the autoclaved medium MS composed of the ingredients mentioned in the following table, is introduced into the fogger using a peristaltic pump at a flow rate of 8 l / h.
  • the compartment n is isolated from the n + 1 compartment and the upstream bag roll by 2 separation clamps. Every 24 hours, the treadmill is started, and the bag is unrolled to the exit of the barren chamber of lm. The compartment n then becomes the compartment n + 1 and the empty bag under the hood becomes the compartment n.
  • Roots cut into 50-100 mm pieces of Salvia Miltiorrhiza transformed with Agrobacterium Rhizogenes obtained in Example 1 to grow in the absence of aerial parts and growth hormones are inoculated by the upper opening of the first compartment (n) of the Waterproof and sterile PVC plastic tunnel with a spatially homogeneous distribution of 10 kg of roots per square meter.
  • This compartment is then connected to the compartment " n + 1 by removing the separation clamp while keeping the separation clamp with the bag roll upstream of the system .
  • the arrival of the air / mist mixture is then disconnected from the compartment n + 1 and reconnected to compartment n.
  • Figure 2 shows the masses of roots harvested over a month in the reactor. In total 1743 kg of fresh roots were produced by this technology in one month.
  • the root bed at the outlet of the reactor has an average thickness of 21.4 cm for a bulk density of 27%.
  • the roots are then harvested by cutting the bag and dried in a microwave drying tunnel of the brand Amisy AMSD-FN12 with a capacity of 100 kg / h up to a dry matter concentration of 85%.
  • Example 4 To determine the impact of fog particle size on nutrient supply to the roots and the transport of these nutrients along the tunnel, we modified the experiment in Example 4 by changing the frequency of day 1 the generator of 2 Mhz at 1, 6 Mhz or 1 Mhz which corresponds to an increase in the size of the fog particles from 2 ⁇ to 4 ⁇ and 10 / im.
  • Tanshinone A was analyzed according to the protocol described in Gupta et al (2011) on a Waters C18 column (5 ⁇ , 4.6 ⁇ 250 mm) with a mixture of acetonitrile: water (58:42) at 1 ml min-1 at room temperature and detection at 245 nm.
  • EXAMPLE 5 Elicitation Using a 600 nm Illumination of Salvia Mitiorrhiza's Hairy Root Growth
  • VEGELED 600 nm 9W from Colasse SA VEGELED 600 nm 9W from Colasse SA
  • These lamps are lit 16 hours a day providing a brightness of about 150 ⁇ mol / s / m2.
  • EXAMPLE 6 Chemical elicitation using yeast extract from the production of Tanshinone by Salvia Miltiorrhiza roots
  • the seeds were then soaked 1 min. in ethanol and 3 minutes in a 1 g / l HgCl 2 solution at room temperature.
  • the seeds whose surface has thus been sterilized are soaked in a sterile solution of 500 ppm Chloramphenicol, Neomycin 500 ppm and tetracycline 500 ppm for one hour before being deposited on an Agar-Mushashino gel purchased from Sigma-Aldrich in a box of Petri.
  • the roots and leaves of the plants obtained by germination of these seeds and culture for 30 days are cut into pieces of 2-3 cm and injected with a pin with a culture of 36 hours of the LMG-152 strain.
  • Rhizobium rhizogenes in a YMB medium containing 50 ppm of Kanamycin.
  • the infected plant pieces are grown on Mushashino medium for 48 hours at 28 ° C. After 48h, the infected plant pieces are subcultured into Mushashino liquid media containing 1000 ppm Cephalexin and 1000 ppm ampicillin every 4 days for 2 weeks. Then, the infected roots obtained are cultured in Mushashino liquid medium without antibiotic in the dark until hairy roots appear.
  • Example 8 Ginseng Root Cultivation We used the equipment and culture conditions of Example 4 by modifying only the culture medium (MS 1 ⁇ 2) and the type of cultivated hair roots (Panax Ginseng obtained in Example 7) and the speed of movement of the carpet (1 m every 2 days) and therefore harvest (1 bag every 2 days).

Landscapes

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  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

L'invention concerne un procédé continu à écoulement piston de production de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture, ledit support servant d'enceinte de confinement. Selon l'invention, un tel procédé comprend les étapes successives de déploiement du support de culture pour production de racines de plantes, ledit support étant muni d'au moins un premier moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi créés les uns des autres (1); d'ensemencement au sein dudit support d'un inoculum de racine au travers d'au moins une première ouverture située, dans le sens du défilement du support, en aval dudit au moins premier moyen d'isolation (2); d'ouverture d'au moins un second moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi créés les uns des autres, situé, dans le sens du défilement du support, en aval de ladite au moins une première ouverture (3); d'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture au travers d'au moins une seconde ouverture, ladite au moins une seconde ouverture étant située entre lesdits premier et second moyens d'isolation (4); d'isolation du support contenant les racines en fin de croissance par au moins un troisième moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi créés les uns des autres (5) et de récolte des racines (6).

Description

Procédé de production continu à écoulement piston de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture
1. Domaine de l'invention
Le domaine de l'invention est celui des procédés de production de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture et des dispositifs mettant en œuvre lesdits procédés. Plus précisément, l'invention concerne également un support de production de racines de plantes hors sol.
2. Solutions de l'art antérieur
Les plantes médicinales sont la source principale de médicaments pour la majorité de la population du monde et représentent 40% des médicaments commercialisés en Europe et aux Etats-Unis. A l'heure actuelle, ces composés sont extraits de plantes sauvages ou cultivées par extraction à l'aide de solvants (éthanol, hexane, acétone,...) et sont commercialisés dans les domaines pharmaceutiques, cosmétiques, neutraceutiques, colorants et alimentaires. Cependant la production de ces composés à partir de plantes cultivées de manière classique ou récoltées dans la nature n'est pas suffisante pour satisfaire la demande grandissante du marché. De plus la récolte de plantes sauvages représente dans de nombreux cas une menace importante pour les espèces ainsi que pour leur écosystème, ce qui est en contradiction avec la demande des consommateurs pour plus de durabilité.
La production de métabolites secondaires bioactifs est dans de nombreux cas trop complexe d'un point de vue métabolique pour être réalisée au sein de microorganismes bactériens ou levuriens qui ne disposent pas du matériel génétique adéquat. La culture de cellules végétales unicellulaires en bioréacteur est rarement satisfaisante. En effet, les lignées cellulaires sont généralement peu stables génétiquement, fragiles, réclamant des nutriments complexes et la production de métabolites secondaires dans ces conditions est instable. De plus de nombreuses molécules bioactives nécessitent, pour être produites, des interactions entre plusieurs lignées de cellules végétales qui ne peuvent être rencontrées que dans des tissus différenciés comme des racines de plantes.
Les racines des plantes sont une source potentielle de molécules bioactives qui comprennent une diversité déconcertante de métabolites et de protéines, et par conséquent, sont considérées comme le site du métabolisme secondaire unique de la plante entière. Les progrès récents dans la culture de racines in-vitro ont permis de produire de nombreux métabolites secondaires à partir de lignées de racines soit adventives et nécessitant des phytohormones pour croître, soit transformées à l'aide de Rhizobium Rhizogenes et pouvant croître dans des milieux plus simples. Les racines de plantes peuvent en effet être cultivées de manière in-vitro sur support solide ou liquide sans organes aériens (tiges et feuilles) à condition d'être mise en contact avec une source de carbone (glucose,...) et d'hormones de croissance spécifiques à la multiplication racinaires. Ces hormones sont très coûteuses, ce qui empêche le développement de la culture de ce type de racines à l'échelle industrielle. Un exemple de ce type de culture de racine en bioréacteur liquide est donné dans le brevet coréen WO2008100016.
La culture de racines in-vitro peut également être réalisée sans hormones en utilisant des racines transformées par des bactéries telles qu'Agrobacterium Rhizogenes.
Certaines bactéries du sol, telles qu'Agrobacterium Rhizogenes, contiennent des plasmides pouvant infecter les racines des plantes et les amener à croître anormalement. Les racines transformées de cette manière sont particulièrement faciles à cultiver de manière stérile en milieu artificiel en milieu liquide, solide ou aérien (avec alimentation du milieu sous la forme de brouillard), et ont une stabilité génétique et biochimique élevée. Ce type de racine est couramment appelé « hairy roots » ou encore « racines chevelues ».
Actuellement, la principale contrainte pour la production industrielle de racines adventives ou chevelues est le développement et la mise à l'échelle des récipients appropriés (bioréacteurs). La vitesse de croissance de la biomasse végétale est en effet inférieure à celle de levure et de bactéries. Le temps de doublement de la biomasse observé varie de 20 minutes chez E. Coli, 60 minutes chez Saccharomyces Cerevisiae, 100 minutes chez Lactobacillus Plantarum. Le temps de doublement des cellules végétales présentes dans les racines cultivées in-vitro varie quant à lui de quelques jours à plusieurs semaines en fonction des conditions de culture. Les bio-réacteurs existant ne permettent donc pas de produire de manière industrielle et économique des quantités suffisantes de biomasses et de molécules actives si ce n'est pour des applications à très hautes valeurs ajoutées.
Les bioréacteurs en milieu liquide aboutissent très rapidement à des difficultés d'oxygénation de la biomasse et peu de résultats précis de culture en continu ont été publiés jusqu'à présent.
Pour éliminer le problème de la limitation du transfert d'oxygène en milieu liquide tout en conservant un apport en nutriments suffisants, l'utilisation d'un bioréacteur brumisé tel que décrit par DiLorio et al (Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol 37, pp 457-462) est une alternative intéressante.
Les procédés par nébulisation existant, sont tous réalisés en culture batch et mettent en œuvre des bioréacteurs ou enceintes de culture complexes et coûteux de tels procédés sont divulgués dans les documents WO200174992, US2006240544, EP0234868A2, CN102783414, US2009017529, Kim et al (Plant Cell Tiss. Organ Cuit. Vol. 98, pp 25-33, 2009), Huang et al (Enzyme and Microbial Technology, Vol. 35(1), pp 22-32, 2004), Wyslouzil et al (Biotechnol. and Bioeng., Vol. 70(2), pp 143-150, 2000), Sivakumar et al (Biotechnol. Bioeng. Vol. 107(5), pp 802-813), ils permettent quelques applications dans des domaines spécifiques comme celui des cosmétiques et des pharmaceutiques.
Il existe également des bioréacteurs agités jetables à base de plastiques souples pour la production de cellules végétales tel que décrites par Ducos et Al. (Adv Biochem Eng Biotechnol. 2010;115:89-115 ; doi: 10.1007/ 10_2008_28) mais ces bioréacteurs sont en phase liquide, en batch et limité en taille à un volume de 100 1. Des exemples d'utilisation de ce type de réacteur sont donnés également par Eibl et al (Phytochem. Rev. Vol 7, pp 593- 598, 2008) et Stiles et al (Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., Vol 134, pp 91-114, 2013).
Au vu de cet état de l'art, il n'existe pas de méthodes de culture continue de racines adventices et/ou chevelues permettant une production industrielle à l'échelle de la tonne. Il existe donc un besoin pour ce type de procédé permettant de remédier aux inconvénients des procédés existant cités ci -dessus.
3. Objectifs de l'invention
L'invention a notamment pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur. Plus précisément, un objectif de l'invention, dans au moins un de ses modes de réalisation, est de fournir un procédé continu à écoulement piston de production de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture.
Un autre objectif de l'invention, dans au moins un de ses modes de réalisation, est de fournir un dispositif mettant en œuvre un procédé continu à écoulement piston de production de racines de plantes hors sol.
L'invention, dans au moins un de ses modes de réalisation, a encore pour objectif de fournir un support de production de racines de plantes hors sol apte à être utilisé dans un procédé continu à écoulement piston.
4. Exposé de l'invention Conformément à un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé continu à écoulement piston de production de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture, ledit support servant d'enceinte de confinement
Selon l'invention, un tel procédé continu à écoulement piston comprend les étapes successives suivantes : · déploiement du support de culture pour production de racines de plantes, ledit support étant muni d'au moins un premier moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres, • ensemencement au sein dudit support d'un inoculum de racines au travers d'au moins une première ouverture située, dans le sens du défilement du support, en aval dudit au moins premier moyen d'isolation,
• ouverture d'au moins un second moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres, situé, dans le sens du défilement du support, en aval de ladite au moins une première ouverture,
• alimentation par nébulisation d'un milieu de culture au travers d'au moins une seconde ouverture, ladite au moins une seconde ouverture étant située entre lesdits premier et second moyens d'isolation,
• isolation du support contenant les racines en fin de croissance par au moins un troisième moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres,
• récolte des racines la vitesse de défilement dudit support permettant une augmentation de masse de racine d'un facteur au moins égal à 4 entre l'étape d'ensemencement par l'inoculum et la récolte.
Le principe général de l'invention repose sur le fait qu'un inoculum de racines est introduit au sein d'un support de culture par au moins une première ouverture située entre un premier moyen et un second moyen d'isolation maintenus en position fermée, ledit support de culture formant une enceinte de confinement ou bioréacteur. Ensuite, l'alimentation des racines est effectuée par nébulisation d'un milieu de culture au travers d'au moins une seconde ouverture située située entre le premier moyen et le second moyen d'isolation, le support de culture formant une enceinte de confinement ou bioréacteur étant maintenu préférentiellement en surpression. Ledit second moyen d'isolation étant basculé en position ouverte afin d'éviter toute déchirure par surpression trop importante ou bien lorsque les deux moyens d'isolation sont maintenus en position fermée, ledit support étant muni d'au moins une ouverture supplémentaire permettant d'éviter toute déchirure par surpression trop importante tel qu'un évent ou une soupape et/ou permettant l'évacuation de liquide. Ainsi, lorsque l'on ouvre le second moyen d'isolation, l'alimentation des racines au sein du support est effectuée par nébulisation d'un milieu de culture au travers de la au moins une seconde ouverture, par la suite on arrête l'alimentation par nébulisation et on fait avancer le support, cette succession d'opération étant reproduite au fur et à mesure de l'avancée du support. L'enceinte de confinement ou bioréacteur est donc fermé aux 2 extrémités et dispose d'une ou plusieurs ouvertures pour éliminer l'air ou le liquide en excès et de manière préférentielle maintenue en surpression à l'aide préférentiellement d'un air chargé en brume alimenté par la chambre de nébulisation. Le support formant l'enceinte de confinement ou bioréacteur est mis en mouvement par un dispositif de déplacement en emportant en son sein les racines, de préférence de type chevelues ou adventives, en cours de croissance par toutes techniques connues de l'homme de l'art tel qu'un tapis roulant. Les racines se développent au sein du support au fur et à mesure du déploiement et donc de l'avancée dudit support. Le support est finalement refermé à l'aide d'un troisième moyen d'isolation et les racines étant récoltées avec le bioréacteur, ce dernier pouvant servir d'emballage ou bien étant récoltée directement. Le bioréacteur ou enceinte de confinement est donc renouvelé au fur et à mesure de manière à remplacer la partie s'étant déplacée et permettre l'introduction d'un nouvel inoculum. Les inventeurs ont également déterminé qu'une alimentation des racines par nébulisation d'un milieu de culture permet d'alimenter en nutriment une enceinte de confinement ou bioréacteur ayant une longueur de plus de 10 m tout en gardant une productivité supérieure à 500 g/m2/jour de matière sèche de racine, préférentiellement supérieure à 1 kg/m2/jour.
Ainsi, l'invention repose sur une approche tout à fait nouvelle et inventive d'ensemencement d'un support au défilé par un inoculum de racines, ledit support servant d'enceinte de confinement ou bioréacteur, l'alimentation dudit inoculum étant effectué par nébulisation d'un milieu de culture. Du fait du défilement, le début de l'enceinte de confinement ou bioréacteur est renouvelé au fur et à mesure de manière à remplacer la partie de l'enceinte de confinement ou bioréacteur s'étant déplacée, des racines étant introduites sous forme d'un inoculum pour croître dans ledit réacteur et/ou y produire des métabolites d'intérêt. Préférentiellement, le support servant d'enceinte de confinement ou bioréacteur est composé d'une enveloppe transparente, et de manière plus préférentielle d'une enveloppe transparente souple constitué de polymère tel que du chlorure de polyvinyle (PVC), du polyamide, du polyéthylène, du polypropylène, du polyéthylène téréphtalate, de l'acide polylactique (PLA), d'un poly-succinate.
Par les termes « métabolites d'intérêt », on entend désigner un composé organique intermédiaire ou issu du métabolisme se présentant en général sous forme de petites molécules ou de monomères.
Par les termes « procédé continu à écoulement piston», on entend désigner un procédé dans lequel un bioréacteur est rempli à une extrémité de manière continue et/ou par des charges successives à des intervalles temporels convenablement réparti dans le temps et vidangé à l'autre extrémité de manière continue et/ou par déchargement successives à des intervalles temporels convenablement réparti dans le temps de manière à ce que à une distance donnée de la première extrémité du bioréacteur, l'état des racines soit identiques Par les termes « défilement d'un support » ou « support au défilé », on entend désigner le fait que le support est en mouvement par rapport à l'endroit où l'ensemencement est effectué.
Par les termes « déploiement du support », on entend désigner la mise en position du support avant l'endroit où l'ensemencement est effectué. Ledit déploiement correspond à un dépliage ou un déroulement du support, préférentiellement un déroulement du support.
Par les termes « moyen d'isolation », on entend désigner un moyen d'isolation mécanique tel que pince, clip.
Par le terme inoculum, on entend désigner un échantillon contenant des racines de plantes entière ou en morceaux, destiné à être introduit au sein d'un milieu favorable à sa multiplication, afin d'en produire une quantité supérieure. Par les termes « récolte des racines », on entend désigner la récolte des racines proprement dite ou bien la récupération du support comprenant les racines ledit support étant fermé à ses extrémités par les moyens d'isolation formant ainsi une poche scellée.
Selon une mise en œuvre préférée, la au moins première ouverture permettant l'ensemencement du support par un inoculum de racines correspond à la au moins seconde ouverture permettant l'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture, de ce fait l'ensemencement du support et l'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture sont effectués par la même ouverture. En d'autres termes, lesdites au moins une première ouverture et au moins une seconde ouverture sont confondues. Ainsi, une telle mise en œuvre permet l'utilisation de support de structure et de fabrication simplifiée.
Selon une mise en œuvre préférée, la au moins première ouverture et/ou la au moins seconde ouverture sont situées sur la partie supérieure du support.
Ainsi, l'ouverture ne sera pas encombrée par les racines et/ou le liquide formé par la brume condensée. De plus une alimentation par le dessus permet également une meilleure répartition des particules de milieu nébulisé dans le ciel de l'enceinte formée par le support au-dessus des racines en croissance, les particules subissant la force de la gravité.
Selon une mise en œuvre préférée ou conforme à l'invention, le premier moyen d'isolation de l'étape de déploiement correspond au second moyen d'isolation de l'étape d'ensemencement lorsque le cycle de ces étapes est recommencé.
Avantageusement, le support de culture se présente sous forme d'une bande comprenant au moins une feuille inférieure et au moins une feuille supérieure reliées entre elles par au moins un moyen de solidarisation.
Par les termes « moyen de solidarisation », on entend désigner tout moyen permettant de solidariser les feuilles inférieure et supérieure entre -elles lesdits moyens étant sélectionné parmi le groupe consistant en thermosoudage, couture, collage, préférentiellement les feuilles sont solidarisées à leurs extrémités latérales ou bords par collage ou thermosoudage afin de former un tube lors de la mise en surpression du support après ensemencement.
Ainsi, l'enceinte de confinement ou bioréacteur formé par le support est séparé physiquement de l'environnement extérieur et permet la croissance des racines dans un environnement contrôlé et aseptisé et/ou stérile.
Selon une mise en œuvre préférée du mode précédent, le support de culture comprend au moins une feuille perméable solidarisée à au moins une première feuille inférieure et à au moins une première feuille supérieure et située entre ces dernières, ledit support étant muni d'au moins un évent, d'au moins un drain et d'au moins une ouverture permettant l'ensemencement et/ou permettant l'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture.
Ainsi un tel support présente l'avantage de permettre aux racines de croître autour de la au moins une feuille perméable en se servant d'elle comme support et en évitant de se tasser sous l'effet de leur propre poids. Les racines peuvent garder une densité de lit de racines suffisamment faible et un espacement racinaire suffisamment élevé qui permettront aux particules d'aérosol de pénétrer et d'alimenter le cœur du lit racinaire. Ce type de support avec au moins une feuille perméable solidarisée est simple à fabriquer, présente un encombrement stérique faible et est donc également simple à stériliser.
Selon une mise en œuvre préférée ou conforme à l'invention, le procédé selon l'invention est tel que l'étape de déploiement du support de culture correspond à un déroulement dudit support.
Ainsi, le support non-déployé possède un encombrement stérique faible ce qui facilite son stockage ainsi que d'éventuelle étape de stérilisation par exemple par irradiation et/ou par pasteurisation.
Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel que l'inoculum de racine comprend des morceaux de racines ayant une taille d'au moins 50 mm et d'au plus Ainsi, les morceaux de racines disposent à la fois d'une taille compatible avec une croissance rapide et un nombre par unité de masse suffisant que pour former après leur croissance un tapis de racines homogène à l'intérieur du support.
Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel que les racines sont de type chevelu.
Ainsi, les racines cultivées dans le procédé ne nécessitent pas d'ajout d'hormone de croissance dans le milieu de culture.
Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel que tel que les particules d'aérosol constituant l'alimentation par nébulisation ont un diamètre moyen inférieur ou égal à 4 μχη et de manière préférentielle inférieure ou égale à 2 //m.
Ainsi, les particules d'aérosol auront une masse inférieure, une surface spécifique supérieure par unité de masse et donc auront moins tendance à sédimenter au sein du support et donc pourront être transportées sur des plus grandes distances. De plus, leur petite taille leur permettra de pénétrer plus profondément au sein du lit de racines et nourriront plus efficacement les racines situés au centre du lit comparée à des particules d'aérosol de diamètre moyen supérieur à 4 μτη. L'exemple 3 ci-après montre que la croissance des racines de Salvia miltiorrhiza est directement impactée par la taille moyenne des particules d'aérosol.
Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel que l'ensemencement dudit support est réalisé dans une chambre blanche.
Ainsi, les différentes manipulations, tels que l'inoculation et les connections entre la chambre de nébulisation et la seconde ouverture, pourront être réalisées en condition aseptique et limiteront le risque de contamination de l'environnement contrôlé à l'intérieur du support. Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel qu'il comprend une étape de stimulation de la croissance des racines par illumination et/ou modification de la composition du milieu de culture. Ainsi, il est possible de stimuler la production de métabolites d'intérêt sous forme de composés bioactifs par des stress induits lumineux pour augmenter la croissance des racines et/ou leur production en composés actifs. Ces stress lumineux peuvent être réalisés soit aux longueurs d'onde visible par un éclairage classique, soit spécialisé d'horticulture, soit à des longueurs d'onde spécifique avec un éclairage avec des LED 380-500 nm, préférentiellement entre 400-450 nm, soit encore par un éclairage aux longueurs d'onde UV, préférentiellement entre 270-290 nm. L'intérêt de la technologie faisant l'objet de l'invention est que l'éclairage peut être disposé à n'importe quel moment de la croissance des racines. Il est ainsi possible par exemple de ne stimuler la production des composés bioactifs qu'à un stade avancée de la croissance de manière à éviter que ces composés bioactifs en trop grande concentration ne viennent inhiber la croissance des racines. La société demanderesse a découvert de manière surprenante que la production de tanshinone pouvait être augmentée de 200% en appliquant sur les racines chevelues de Salvia miltiorrhiza un traitement lumineux avec une longueur d'onde de 440 nm. De même et de manière préférentielle, les racines peuvent être éclairées à une intensité photonique de 150 μ mole/sec/m2 à des longueurs d'onde de 600 nm +/-20 nm pour stimuler leur croissance.
Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel qu'il comprend une étape d'élicitation des racines par illumination et/ou modification de la composition du milieu de culture et/ou stimulation acoustique. Ainsi, la combinaison de différente stimulation de croissance et/ou de production de composés actifs soit de manière simultanée, soit de manière successive, soit de manière continue, soit de manière discontinue permet d'exposer les racines aux conditions permettant la croissance optimale et la productivité et/ou concentration en composés actifs optimale.
Selon une mise en œuvre avantageuse d'au moins une des deux mises en œuvre précédentes, le procédé selon l'invention est tel que les étapes de stimulation et/ou d'élicitation sont pratiquées sur tout ou partie du support.
Ainsi, il est possible de ne stimuler la croissance et/ou éliciter la production de composés actifs que lorsque les racines sont dans leur phase de croissance le nécessitant. Il est par exemple possible de n'éliciter la production de composés bioactifs que lorsque la croissance des racines est terminée, certains de ces composés étant inhibiteurs pour la croissance à proprement dit.
Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel que la racine cultivée est sélectionnée parmi le groupe consistant en racine de l'espèce Arabidopsis thaliana, Arctium majus, Armoracia rusticana, Artemisia annua, Astragalus membranaceous, Atropa belladonna, Azadirachta indica, Berberis vulgaris, Calystegia sepium, Catharanthus roseus et trichophyllus , Cinchosa pubescens, Cistanche tubulosa, Datura stramonium, Derris trifolia, Dioscorea vollosa, Echinacea angustifolia, pallida et purpurea, Eleutherococcus senticosus, Fallopia multiflora, Gloriosa superba, Glycyrrhiza glabra et uralensis, Harpagophytum procumbens, Hydrastis canadensis, Hyoscyamus muticus, Hypericum perforatum, Ipomea aquatica, Leontopodium alpinum, Lepidium meyenii et peruvianum, Lippia dulcis, Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia, Morus alba et nigra, Ophiorrhiza pumila, Panax ginseng et quinquifolium, Perilla fruitescnens , Piper methysticium, Polygonum cuspidatum, Ptychopetalum olacoides, Pueraria lobata et phaseoloides, Rhodiola rosea, Salvia milthiorrhiza et prevalzkii, Sanguinaria canadensis, Sophora flavescens, Stizolobium hassjoo, Taxus brevifolia, Trigonella foenumgraceum, Whitania somnifera, Yucca shidigera, Wasabia japonica, préférentiellement en racine de l'espèce Salvia milthiorrhiza et Panax ginseng . Selon une mise en œuvre avantageuse des trois modes de mise en œuvre précédents, le procédé selon l'invention est tel que l'étape d'élicitation des racines pour produire un métabolite d'intérêt de type tanshinone est effectuée par illumination par un éclairage à des longueurs d'onde comprise entre 380 et 500 nm, ladite élicitation étant préférentiellement effectuée sur des racines de type salvia miltiorrhiza. Selon une mise en œuvre avantageuse, le procédé selon l'invention est tel que l'étape d'élicitation et/ou l'étape de stimulation de la croissance des racines est effectuée en présence d'au moins un composé sélectionné parmi le groupe de composés consistant en acétate de sodium, acide jasmonique, jasmonate de méthyl, extrait de levure, acide salicylique, acides gras, acides gras en C12, éthylène, oxyde nitreux et dioxyde de carbone. L'exemple 6 ci-après montre l'augmentation de production de Tanshinone avec une élicitation de 100 ppm d'extrait de levure.
Les termes « acides gras en C12 », on entend désigner un acide gras contenant 12 atomes de carbone. L'invention concerne également un dispositif de production semi-continue de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture, ledit support servant d'enceinte de confinement ou bioréacteur, apte à mettre en œuvre le procédé selon l'invention, ledit dispositif comprenant :
• une unité d'alimentation en support, · un mécanisme de défilement du support,
• une chambre de nébulisation alimentée par un gaz porteur,
• une connexion entre la chambre nébulisation et le support, le support étant muni de moyens d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres, d'au moins un évent et d'au moins un drain et d'au moins une ouverture permettant l'ensemencement et/ou permettant l'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture situés entre deux moyens d'isolation successifs. Préférentiellement, le support formant l'enceinte de confinement ou bioréacteur présente des rétrécissements de la circonférence lorsque celui-ci est alimenté en milieu de culture, ces rétrécissements étant obtenus préférentiellement à l'aide de pince externe.
Par les termes « unité d'alimentation du support », on entend désigner tout système permettant de limiter l'encombrement stérique du stockage du support, tels que le pliage- empilage, l'enroulage en bobine, préférentiellement l'unité d'alimentation se présente sous forme d'une bobine. Par les termes « mécanisme de défilement du support », on entend désigner tout système permettant de déplacer le support tel qu'un tapis roulant, suspension sur câbles en mouvement, plateau munis de rouleaux, préférentiellement un tapis roulant sur lequel le support est déposé. Par les termes « chambre de nébulisation », on entend plus particulièrement désigner une enceinte fermée à l'intérieur de laquelle du milieu de culture est introduit par exemple à l'aide d'une pompe péristaltique ou tout autres techniques connues de l'homme de l'art et nébulisé dans la chambre soit à l'aide d'un diffuseur alimenté en milieu sous pression, soit d'un nébulisateur ultrasonique ou de tout autres techniques connues de l'homme de l'art pour former des particules de liquide de diamètre moyen inférieur ou égal à 50 μτη, préférentiellement inférieure ou égal à 10 μχη, plus préférentiellement inférieure ou égal à 5 μιη, le plus préférentiellement inférieur ou égal à 4 μνη et de manière la plus préférée de diamètre moyen inférieur ou égal à 2 μτη. Une entrée d'air comprimé sur la chambre de nébulisation permet d'emporter la brume formée à un débit suffisant pour alimenter, à travers une ou plusieurs connexions, l'enceinte de confinement ou réacteur en brume sur une distance supérieure à 5 m et de manière préférentielle supérieure à 10 m.
Par les termes « chambre de nébulisation alimentée par un gaz porteur », on entend désigner une enceinte munie d'une alimentation en milieu de culture sous forme brumisée, l'alimentation en milieu de culture sous forme brumisée étant soit insérée dans la chambre par des buses d'injection, soit formée au sein de la chambre à l'aide de nébulisateur à ultrasons et mélangée à un flux de gaz permettant de porter les particules d'aérosol formées tout au long du support.
Par les termes « connexion entre la chambre nébulisation et le support », on entend désigner un ou plusieurs tuyaux munis ou non de vannes et de branchement permettant d'alimenter le flux de gaz portant les particules d'aérosol entre la chambre de brumisation et une ou plusieurs ouvertures du support.
Selon un mode de réalisation avantageux ou conforme à l'invention, le dispositif selon l'invention est tel que qu'il comprend une chambre blanche permettant l'ensemencement. Par les termes « chambre blanche », on entend désigner une pièce ou un espace où la concentration en micro-organismes est maîtrisée afin de minimiser l'introduction, la génération, la rétention de ces micro-organismes au sein du support tel que par filtration de l'air et/ou traitement de l'air à l'aide de rayonnement et/ou par traitement chimique et/ou thermique de l'air. De manière préférentielle, la chambre blanche sera maintenue en surpression par injection d'air filtré afin de maintenir la concentration en micro-organismes à des niveaux inférieurs tel qu'exposé par la norme ISO 14644-1 Classe 3.
5. Liste des figures
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention, de la présentation d'un dispositif apte à mettre en œuvre un procédé selon l'invention mais également d'exemples de productions de racines par mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. Ces exemples sont donnés à titre de simples exemples illustratifs et non limitatifs, et des dessins annexés, parmi lesquels :
• la figure 1 décrit de manière schématique les étapes successives d'un procédé selon l'invention,
• la figure 2 illustre un dispositif apte à mettre en œuvre un procédé selon l'invention,
• la figure 3 présente sous forme de graphique une production de racines chevelues de Salvia Milthiorriza en bioréacteur par mise en œuvre d'un procédé selon l'invention,
• la figure 4 présente sous forme de graphique une production de racines chevelues de Salvia Milthiorriza en bioréacteur en fonction de la fréquence du brumisateur par mise en œuvre d'un procédé selon l'invention,
• la figure 5 présente sous forme de graphique une production de racines chevelues de Panax Ginseng en bioréacteur par mise en œuvre d'un procédé selon l'invention.
6. Description d'un mode de réalisation de l'invention On présente, en relation avec la figure 1 , un mode de mise en œuvre d'un procédé continu à écoulement piston de production de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture, ledit support servant d'enceinte de confinement. Ledit procédé comprend les étapes successives suivantes :
1. déploiement du support de culture pour production de racines de plantes, ledit support étant muni d'au moins un premier moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres (1),
2. ensemencement au sein dudit support d'un inoculum de racine au travers d'au moins une première ouverture située, dans le sens du défilement du support, en aval dudit au moins premier moyen d'isolation (2),
3. ouverture d'au moins un second moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres, situé, dans le sens du défilement du support, en aval de ladite au moins une première ouverture (3),
4. alimentation par nébulisation d'un milieu de culture au travers d'au moins une seconde ouverture, ladite au moins une seconde ouverture étant située entre lesdits premier et second moyens d'isolation et mise en surpression du support (4),
5. isolation du support contenant les racines en fin de croissance par au moins un troisième moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres (5),
6. récolte des racines (6).
Avantageusement le procédé selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle de stimulation de la croissance des racines par illumination et/ou par modification de la composition du milieu de culture et/ou une étape d'élicitation des racines par illumination et/ou par modification de la composition du milieu de culture et/ou par stimulation acoustique, ladite étape additionnelle étant insérée entre les étapes 4 et 5 ou étant confondue avec l'étape 4.
Un exemple particulier de procédé selon l'invention est exposé ci-après. Ledit procédé comprend les étapes de :
1. déroulement d'une bobine de support de culture pour production de racines de plantes, ledit support se présentant sous forme de bande comprenant deux feuilles jointes à leurs extrémités ou bords et étant muni d'un premier moyen d'isolation sous forme de pince ou clip de fermeture pour sac,
2. ensemencement au sein dudit support d'un inoculum de racine au travers d'au moins une première ouverture située, dans le sens du défilement du support, en aval dudit au moins premier moyen d'isolation,
3. ouverture d'au moins un second moyen d'isolation sous forme de pince ou clip de fermeture pour sac, ledit second moyen étant situé, dans le sens du défilement du support, en aval de ladite au moins une première ouverture, ledit second moyen correspondant, par déplacement du support, au premier moyen d'isolation de l'étape 1 du cycle d'étape précédent,
4. alimentation par nébulisation d'un milieu de culture au travers d'au moins une seconde ouverture, ladite au moins une seconde ouverture étant située entre lesdits premier et second moyens d'isolation et mise en surpression du support, ledit support formant ainsi un réacteur ou enceinte de confinement sous forme d'un tunnel,
5. isolation du support contenant les racines en fin de croissance par au moins un troisième moyen d'isolation,
6. récolte des racines, durant l'ensemble du procédé, le support est transporté par un tapis roulant, l'inoculum de racines introduit au sein du support s'y développe simultanément avec le transport de celui- ci jusqu'à être récoltée en sortie. En outre le support constituant l'enceinte confinement ou réacteur est renouvelé au fur et à mesure de manière à remplacer la partie s' étant déplacée et des racines y sont introduites pour y croître et/ou produire des métabolites d'intérêts.
La chambre de nébulisation est constituée d'une enceinte fermée à l'intérieur de laquelle du milieu de culture est introduit par exemple à l'aide d'une pompe péristaltique ou tout autres techniques connues de l'homme de l'art et nébulisé dans la chambre soit à l'aide d'un diffuseur alimenté en milieu sous pression, soit d'un nébulisateur ultrasonique ou de tout autres techniques connues de l'homme de l'art pour former des particules de liquide de diamètre moyen inférieur ou égal à 50 μιη, préférentiellement inférieure ou égal à 10 μιη, plus préférentiellement inférieure ou égal à 5 //m, le plus préférentiellement inférieur ou égal à 4 μνη et de manière la plus préférée de diamètre moyen inférieur ou égal à 2 μχη. Une entrée d'air comprimé sur la chambre de nébulisation permet d'emporter la brume formée à un débit suffisant pour alimenter, à travers une ou plusieurs connexions, le tunnel externe en brume sur une distance supérieure à 5 m et de manière préférentielle supérieure à 10 m. Le support est préférentiellement transparent, et de manière plus préférentiel transparente et souple, et constitué de polymère tel que du chlorure de polyvinyle (PVC), du polyéthylène, du polypropylène, du polyéthylène téréphtalate, de l'acide polylactique (PLA), un poly- succinate constitué de polymère tel que le poly-vinyl chloride, le polyéthylène, le polypropylène, le polyéthylène téréphtalate, le poly-lactic acid, le poly-succinate. Le support fermé aux 2 extrémités, dispose d'une ou plusieurs ouvertures pour éliminer l'air ou le liquide en excès et de manière préférentielle maintenue sous surpression à l'aide préférentiellement de l'air chargé en brume alimenté par la chambre de nébulisation.
Les racines sont récoltées en isolant la partie du support les contenant du reste du support et en détachant cette partie du support. Cette opération peut se faire par toutes techniques connues de l'homme de l'art et préférentiellement en écrasant les parois du support à l'aide de 2 pinces et en coupant la partie située entre les deux pinces de manière à limiter les contacts entre l'intérieur du support et son environnement externe. Lorsque le support est mis en mouvement, ledit support est continuellement renouvelé et inoculé à l'aide de racines chevelues.
Pour augmenter la teneur en matière active des racines, il est possible d'éliciter la production de ces composés bioactifs par des stress induits lumineux soit aux longueurs d'onde visible par un éclairage classique d'horticulture, soit à des longueurs d'onde spécifique avec un éclairage avec des LED 380-500 nm et préférentiellement entre 400-450 nm, soit encore par un éclairage aux longueurs d'onde UV et préférentiellement entre 270-290 nm. Un avantage du procédé selon l'invention est que l'éclairage peut être disposé à n'importe quel moment de la croissance des racines. Il est ainsi possible par exemple de ne stimuler la production des composés bioactifs qu'à un stade avancée de la croissance de manière à éviter que ces composés bioactifs en trop grande concentration ne viennent inhiber la croissance des racines. Comme décrit dans l'exemple 4 ci-après, la société demanderesse a découvert de manière surprenante que la production de tanshinone pouvait être augmentée de 200% en appliquant sur les racines chevelues de Salvia Miltiorrhiza un traitement lumineux avec une longueur d'onde de 430 nm.
De même et de manière préférentielle, comme décrit dans l'exemple 5 ci-après, les racines peuvent être éclairées à une intensité photonique de 150 /<mole/sec/m2 à des longueurs d'onde de 600 nm +/-20 nm pour stimuler leur croissance.
Il est possible d'éliciter la croissance des racines et/ou la production de molécules bioactives en utiliser des composés chimiques à ajouter au milieu tel que sodium acétate, acide jasmonique, jasmonate de méthyl, extrait de levure, acide salicylique, acides gras, acides gras en C 12 ou de composés gazeux tels que l'éthylène, le dioxyde de carbone et/ou l'oxyde nitreux. L'exemple 6 ci-après montre l'augmentation de production de Tanshinone avec une élicitation de 100 ppm d'extrait de levure. II est également possible d'éliciter la production de composés bioactifs en exposant les racines à des ultrasons.
D'autres espèces peuvent également être produite dans le procédé décrit dans cet invention comme le Panax Ginseng décrit dans les exemples 7 et 8 ci-après ou encore les espèces suivantes : Arabidopsis thaliana, Arctium majus, Armoracia rusticana, Artemisia annua, Astragalus membranaceous, Atropa belladonna, Azadirachta indica, Berberis vulgaris, Calystegia sepium, Catharanthus roseus et trichophyllus, Cinchosa pubescens, Cistanche tubulosa, Datura stramonium, Derris trifolia, Dioscorea vollosa, Echinacea angustifolia, pallida et purpurea, Eleutherococcus senticosus, Fallopia multiflora, Gloriosa superba, Glycyrrhiza glabra et uralensis, Harpagophytum procumbens, Hydrastis canadensis, Hyoscyamus muticus, Hypericum perforatum, Ipomea aquatica, Leontopodium alpinum, Lepidium meyenii et peruvianum, Lippia dulcis, Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia, Morus alba et nigra, Ophiorrhiza pumila, Panax ginseng et quinquifolium, Perilla fruitescnens, Piper methysticium, Polygonum cuspidatum, Ptychopetalum olacoides, Pueraria lobata et phaseoloides, Rhodiola rosea, Salvia milthiorrhiza et prevalzkii, Sanguinaria canadensis, Sophora flavescens, Stizolobium hassjoo, Taxus brevifolia, Trigonella foenumgraceum, Whitania somnifera, Yucca shidigera, Wasabia japonica. .La figue 2 illustre un dispositif apte à mettre en œuvre un procédé selon l'invention. Le réacteur est constitué des parties suivantes décrites sur la Figure 2
1. un support sous forme d'un tunnel plastique souple et étanche en PVC (20) fermé au 2 extrémités et déposé sur un tapis roulant de 15 m de long pour 1 m de large (21) alimenté à partir d'un boudin de PVC enroulé et stérilisé par irradiation. Ce tunnel est composé de 15 compartiments de 1 m3 communiquant entre eux par des rétrécissements de la circonférence du tunnel à l'aide de pince externe en métal,
2. une zone stérile à atmosphère contrôlée à l'entrée du système permettant de fixer les connections d'entrée et de sortie de manière aseptique sur l'ouverture du sac et d'inoculer le sac avec des racines (22). Cette zone stérile est constitué d'une hotte à flux laminaire de marque DLF 660EC de CLEAN AIR TECHNIEK W adaptée au niveau des parois.
3. une alimentation en air comprimé stérile garantissant une pression positive à l'intérieur du tunnel plastique et d'apporter l'oxygène nécessaire à la croissance des racines (23). Cette alimentation d'air stérile se fait à travers un filtre Pall Advanta 10" et d'un compresseur à air déshuilé CoenCo (à un débit de 3 m3/h) au travers de l'unité de nébulisation.
4. d'une alimentation du milieu de culture par nébulisation (24) (cuve en inox équipée d'un détecteur de niveau et d'une unité d'atomisation à ultrason de marque Beijing Ultrasonic 2Mhz). La brume dont les particules ont une taille moyenne de 2 μπ\ est transférée grâce au flux d'air sur toute la longueur du tunnel. La cuve de nébulisation est alimentée à un débit de 81/h par une pompe péristaltique Masterflex.
5. d'une ou plusieurs purges d'air (25) équipée de filtre à Air Sartorius et précédé d'un demister de marque Sulzer pour éviter leur colmatation. 6. d'une ou plusieurs sorties permettant de drainer le liquide excédentaire.
Exemple 1 : Transformation de Salvia Milhiorriza en racines chevelues
Les feuilles d'une plante saine de 2 ans de Salvia Miltiorriza sont d'abord désinfectées avec le protocole suivant :
1. Simple rinçage à l'eau du robinet 2. Passage pendant 20 secondes dans une solution d'éthanol à 70%
3. Passage pendant 6 minutes dans une solution d'hypochlorite de calcium à 6%
4. 3 rinçages successifs à l'eau ultra pure (étape réalisée dans une hotte à flux laminaires).
Ensuite, les feuilles sont blessées à l'aide d'un scalpel stérile, puis infectées avec la souche LMG-152 de Rhizobium rhizogenes, qui a une densité optique comprise entre 0,7 et 1. Les feuilles sont ensuite mises pendant une semaine sur le milieu «Murashige et Skoog » (MS) ( Sigma-Aldrich ref : M5519), dans l'obscurité et à 24°C.
Le milieu est composé de 4,4 g/L de poudre MS, de 20 g/L de sucrose, de 7g/L d'agar et d'aucunes phytohormones. Après l'incubation, les feuilles sont transférées dans un milieu « MS » liquide (même composition que le solide mais sans agar) avec 250mg/L d'Ampicilline et 250mg/L de Cefotaxime pendant 4-5 jours et sous agitation pour se débarrasser de la bactérie.
Après les 4-5 jours, les feuilles sont remises sur un milieu « MS » solide à 24°C et les racines apparaissent après 2-3 semaines aux endroits des blessures. Une fois suffisamment développées, on récupère ces racines que l'on met dans un milieu « MS » liquide sous agitation pour favoriser la croissance. On les repique toutes les deux semaines dans ce même milieu jusqu'à atteindre une quantité de biomasse de 10 kg nécessaire pour l'inoculation du réacteur.
Exemple 2 : Production de racines de Salvia Milthiorrhiza dans le réacteur brumisé Un exemple d'un tel bioréacteur continu qui rencontre la description de l'invention est donnée dans cet exemple.
Le milieu MS autoclavé, composé des ingrédients mentionnés dans le tableau suivant, est introduit dans le brumisateur grâce à une pompe péristaltique à un débit de 8 1/h.
Ingrédients Ppm
Glucose 50000
Glycine 2
Myo-inositol 100
Nicotinic acid 0-5
Pyridoxyne HCL 0,5
Thiamine 0,1
CaCl2 332
KH2P04 170
KN03 1900
MgS04 180
NH4N03 1650
CoCl2 0,025
CuS04 0,025
Sous la hotte à flux laminaire, le compartiment n est isolé du compartiment n+1 et du rouleau de sac en amont par 2 pinces de séparation. Toutes les 24 h, le tapis roulant est mis en route, et le sac est déroulé vers la sortie de la chambre stérile de lm. Le compartiment n devient alors le compartiment n+1 et le sac vide sous la hotte devient le compartiment n. Des racines coupées en morceaux de 50-100 mm de Salvia Miltiorrhiza transformées par Agrobacterium Rhizogenes obtenue dans l'exemple 1 pour croître en absence de partie aérienne et d'hormones de croissance sont inoculées par l'ouverture supérieure du premier compartiment (n) du tunnel plastique PVC étanche et stérile selon une répartition spatialement homogène de 10 kg de racines par mètre carré. Ce compartiment est alors connecté au compartiment" n+1 en enlevant la pince de séparation tout en conservant la pince de séparation avec le rouleau de sac en amont du système. L'arrivée du mélange air/milieu brumisé est alors déconnectée du compartiment n+1 et reconnecté au compartiment n.
Après 15 jours et ensuite toutes les 24h, le compartiment n+15 est isolé du tunnel à l'aide de 2 pinces de séparation adjacente et le film plastique est découpé entre les deux pinces. Les sacs obtenus sont pesés pour en déterminer la masse racinaire en déduisant le poids du sac. La figure 2 indique les masses de racines récoltées sur un mois dans le réacteur. Au total 1743 kg de racines fraîches ont été produite par cette technologie en un mois.
Le lit racinaire en sortie du réacteur a une épaisseur moyenne de 21.4 cm pour une densité d'encombrement de 27%. Les racines sont alors récoltées en découpant le sac et séchées dans un tunnel de séchage microonde de la marque Amisy AMSD-FN12 d'une capacité de 100 kg/h jusqu'à une concentration en matière sèche de 85%. Exemple 3 : Taille des gouttes de brumes versus réacteur
Pour déterminer l'impact de la taille des particules de brouillard sur l'apport en nutriments aux racines et le transport de ces nutriments tout au long du tunnel, nous avons modifié l'expérience de l'exemple 4 en changeant au jour 1 la fréquence du générateur de 2 Mhz à 1 ,6 Mhz ou 1 Mhz ce qui correspond à une augmentation de la taille des particules de brouillard de 2μπι à 4μπι et 10/im.
Nous pouvons observer sur la figure 3 que lorsque l'on augmente la taille des particules de brouillard, le transfert de nutriment vers les racines se réduit de manière conséquente avec une diminution importante de la productivité de racines de plus de 40% pour la fréquence à l ,6Mhz et 75% pour la fréquence à 1 Mhz par rapport à une fréquence de nébulisation à 2 Mhz après 15 jours de culture.
Exemple 4: Elicitation à la lumière de la production de Tanshinone sur des racines Salvia Miltiorrhiza
Pour augmenter la teneur en matière active des racines, il est possible d'éliciter la production de ces composés bioactifs par des stress induits lumineux soit aux longueurs d'onde visible par un éclairage, soit à des longueurs d'onde spécifique avec un éclairage avec des LED.
Dans le cadre de cet exemple, nous avons modifié l'exemple 2 en ajoutant une rampe de lampes LED (VEGELED 430 nm 9W de la société Colasse SA) à un 1 m au-dessus des compartiments 1 à 10 ( 10 spots par m). Ces lampes sont allumées 10 h par jour fournissant une luminosité d'environ 150 /*mole/s/m2.
Nous avons analysé la concentration en Tanshinone A dans les racines ayant été exposée à la lumière 430 nm et non-exposée. Les résultats montrent clairement une augmentation de 250% de la concentration en Cryptanshinone et Tanshinone 2A et de 233% de Tanshinone 1. La tanshinone A a été analysée selon le protocole décrit Gupta et al (2011) sur une colonne Waters C18 (5 μηι, 4.6 x 250 mm) avec comme éluant un mélange Acetonitrile:eau (58:42) à 1 ml min-1 à température ambiante et une détection à 245 nm.
Exemple 5: Elicitation à l'aide d'un éclairage à 600 nm de la croissance des racines chevelues de Salvia Mitiorrhiza Dans le cadre de cet exemple, nous avons modifié l'exemple 2 en ajoutant une rampe de lampes LED (VEGELED 600 nm 9W de la société Colasse SA) à un 1 m au-dessus des compartiments 1 à 10 ( 10 spots par m). Ces lampes sont allumées 16 h par jour fournissant une luminosité de d'environ 150 /imole/s/m2.
Nous pouvons voir qu'après 15 jours de fonctionnement, nous observons une augmentation de 34 à 38% de la quantité de biomasse fraîche produite.
Exemple 6: Elicitation chimique à l'aide d'extrait de levure de la production de Tanshinone par des racines Salvia Miltiorrhiza
Dans le cadre de cet exemple, nous avons modifié l'exemple 2 en ajoutant une rampe de lampes LED (VEGELED 600 nm 9W de la société Colasse SA) à un 1 m au-dessus des compartiments 1 à 10 ( 10 spots par m). Ces lampes sont allumées 16 h par jour fournissant une luminosité de d'environ 150 //mole/s/m2. La tanshinone A a été analysée selon le protocole décrit Gupta et al (2011) sur une colonne Waters C18 (5 μηι, 4.6 x 250 mm) avec comme éluant un mélange Acetonitrile:eau (58:42) à 1 ml min-1 à température ambiante et une détection à 245 nm.
Exemple 7: Obtention de racines chevelues de Panax Ginseng Pour obtenir des racines chevelues de Panax Ginseng, des graines stratifiées achetées chez Graines Baumaux (France) ont été trempées dans de l'eau durant une nuit et ensuite traitée avec une solution à 1% volumique de cetrimide durant 5 minutes.
Les graines ont ensuite été trempée 1 min. dans l'éthanol et 3 minutes dans une solution de HgCl2 1 g/1 à température ambiante. Les graines dont la surface a ainsi été stérilisée sont trempées dans une solution stérile de Chloramphenicol 500 ppm, Neomycin 500 ppm et tetracycline 500 ppm durant une heure avant d'être déposée sur un gel Agar-Mushashino acheté chez Sigma-Aldrich dans une boîte de Pétri. Les racines et les feuilles des plants obtenu par germination de ces graines et culture durant 30 jours sont découpés en morceaux de 2-3 cm et injecté à l'aide d'une épingle avec une culture de 36 h de la souche LMG-152 de Rhizobium rhizogenes dans un milieu YMB contenant 50 ppm de Kanamycin. Les morceaux de plantes infectées sont cultivés sur un milieu Mushashino durant 48h à 28°C. Après 48h, les morceaux de plantes infectées sont repiqués dans des milieux liquides Mushashino contenant 1000 ppm de Cephalexin et 1000 ppm d'ampicillin tous les 4 jours durant 2 semaines. Ensuite, les racines infectées obtenues sont cultivées dans un milieu liquide Mushashino sans antibiotique à l'obscurité jusqu'à apparition des racines chevelues.
Exemple 8 : Culture de racines de Ginseng Nous avons utilisés l'équipement et les conditions de culture de l'exemple 4 en modifiant uniquement le milieu de culture (MS ½) et le type de racines chevelues cultivées (Panax Ginseng obtenu dans l'exemple 7) et la vitesse de déplacement du tapis (1 m tous les 2 jours) et donc de récolte (1 sac tous les 2 jours).
Nous observons sur le graphique suivant que le procédé décrit dans l'invention permet de produire après séchage de 5,5 à 8,8 kg de matière sèche de racines de Panax Ginseng tous les 2 jours pour une teneur en Ginsenosides assez stable de 4,7 à 5,4% massique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé continu à écoulement piston de production de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture, ledit support servant d'enceinte de confinement (20), comprenant les étapes successives suivantes :
• déploiement du support de culture pour production de racines de plantes, ledit support étant muni d'au moins un premier moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres (1),
• ensemencement au sein dudit support d'un inoculum de racine au travers d'au moins une première ouverture située, dans le sens du défilement du support, en aval dudit au moins premier moyen d'isolation (2),
• ouverture d'au moins un second moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres, situé, dans le sens du défilement du support, en aval de ladite au moins une première ouverture (3),
• alimentation par nébulisation d'un milieu de culture au travers d'au moins une seconde ouverture, ladite au moins une seconde ouverture étant située entre lesdits premier et second moyens d'isolation (4),
• isolation du support contenant les racines en fin de croissance par au moins un troisième moyen d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres (5),
• récolte des racines (6), la vitesse de défilement dudit support permettant une augmentation de masse de racine d'un facteur au moins égal à 4 entre l'étape d'ensemencement par l 'inoculum et la récolte.
2. Procédé selon la revendication 1 , tel que le support de culture (20) se présente sous forme d'une bande comprenant au moins une feuille inférieure et au moins une feuille supérieure reliées entre elles par au moins un moyen de solidarisation,
3. Procédé selon la revendication 2, tel que le support de culture (20) comprend au moins une feuille perméable solidarisée à au moins une première feuille inférieure et à au moins une première feuille supérieure et située entre ces dernières, ledit support étant muni d'au moins un évent, d'au moins un drain et d'au moins une ouverture permettant l'ensemencement et/ou permettant l'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture.
4. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel que l'étape de déploiement du support de culture (1) correspond à un déroulement dudit support,
5. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel que l'inoculum de racine comprend des morceaux de racines ayant une taille d'au moins 50 mm et d'au plus
100 mm,
6. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel que les racines sont de type chevelues,
7. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel que lesdites au moins une première ouverture et au moins une seconde ouverture sont confondues,
8. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel que les particules d'aérosol constituant l'alimentation par nébulisation ont un diamètre moyen inférieur ou égal à 4 μηϊ,
9. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel que l'ensemencement dudit support est réalisé dans une chambre blanche (23),
10. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel qu'il comprend une étape de stimulation de la croissance des racines par illumination et/ou modification de la composition du milieu de culture,
11. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, tel qu'il comprend une étape d'élicitation des racines par illumination et/ou modification de la composition du milieu de culture et/ou stimulation acoustique.
12. Procédé selon une quelconque des revendications 10 à 11 , tel que les étapes de stimulation et/ou d'élicitation sont pratiquées sur tout ou partie du support.
13. Procédé selon une quelconque racine, tel que la racine cultivée est sélectionnée parmi le groupe consistant en racine de l'espèce Arabidopsis thaliana, Arctium majus, Armoracia rusticana, Artemisia annua, Astragalus membranaceous, Atropa belladonna, Azadirachta indica, Berberis vulgaris, Calystegia sepium, Catharanthus roseus et trichophyllus, Cinchosa pubescens, Cistanche tubulosa, Datura stramonium, Derris trifolia, Dioscorea vollosa, Echinacea angustifolia, pallida et purpurea, Eleutherococcus senticosus, Fallopia multiflora, Gloriosa superba, Glycyrrhiza glabra et uralensis, Harpagophytum procumbens , Hydrastis canadensis, Hyoscyamus muticus, Hypericum perforatum, Ipomea aquatica, Leontopodium alpinum, Lepidium meyenii et peruvianum, Lippia dulcis, Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia, Morus alba et nigra, Ophiorrhiza pumila, Panax ginseng et quinquifolium, Perilla fruitescnens, Piper methysticium, Polygonum cuspidatum, Ptychopetalum olacoides, Pueraria lobata et phaseoloides, Rhodiola rosea, Salvia milthiorrhiza et prevalzkii, Sanguinaria canadensis, Sophora flavescens, Stizolobium hassjoo, Taxus brevifolia, Trigonella foenumgraceum, Whitania somnifera, Yucca shidigera, Wasabia japonica
14. Dispositif de production semi-continue de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture, ledit support servant d'enceinte de confinement (20), comprenant : · une unité d'alimentation en support,
• un mécanisme de défilement du support (21),
• une chambre de nébulisation alimentée par un gaz porteur (24),
• une connexion entre la chambre nébulisation (24) et le support (20),
• le support (20) étant muni de moyens d'isolation permettant de compartimenter le support et d'isoler les différents compartiments ainsi crées les uns des autres, d'au moins un évent et d'au moins un drain et d'au moins une ouverture permettant l'ensemencement et/ou permettant l'alimentation par nébulisation d'un milieu de culture situés entre deux moyens d'isolation successifs.
15. Dispositif de production semi-continu de racines de plantes hors sol par défilement d'un support de culture selon la revendication 14, tel qu'il comprend une chambre blanche (22) permettant l'ensemencement.
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