EP3027061A1 - Souche de lactobacillus rhamnosus régulatrice du métabolisme lipidique - Google Patents

Souche de lactobacillus rhamnosus régulatrice du métabolisme lipidique

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EP3027061A1
EP3027061A1 EP14722774.8A EP14722774A EP3027061A1 EP 3027061 A1 EP3027061 A1 EP 3027061A1 EP 14722774 A EP14722774 A EP 14722774A EP 3027061 A1 EP3027061 A1 EP 3027061A1
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EP
European Patent Office
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lactobacillus rhamnosus
strain
rhamnosus strain
angptl4
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14722774.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Elsa JACOUTON
Hervé BLOTTIÈRE
Tamara Smokvina
Joel DORÉ
Johan Van Hylckama Vlieg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gervais Danone SA, Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Gervais Danone SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
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    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
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    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus
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    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics

Definitions

  • the invention relates to the use of probiotics to regulate lipid metabolism.
  • BMI body mass index
  • Obesity is an important factor in the development of diseases such as hypertension, type II diabetes, cardiovascular disease, liver disease and certain cancers, and is rapidly becoming a major public health problem.
  • the number of obese people in the world has more than doubled since 1980. In 2008, more than 1.4 billion adults were overweight, and among these, more than 200 million men and almost 300 million women were obese.
  • ANGPTL4 protein angiopoietin like 4
  • FIAF fasting induced adipose factor
  • PGAR PPAR- ⁇ induced angiopoietin-related protein
  • HFARP hepatic fibrinogen / angiopoietin reiated protein
  • ANGPTL4 is a target gene for PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors) nuclear receptors, including PPAR- ⁇ in TA and colon, and PPAR-cc in the liver and small intestine.
  • PPARs peroxisome proliferator-activated receptors
  • ANGPTL4 inhibits the activity of lipoprotein lipase (LPL) by promoting the dissociation of active LPL dimers into inactive monomers (SUKONINA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 103, 17450-5, 2006), which leads to the mobilization of triglycerides as a source of energy in favor of the peripheral organs, and the limitation of the excessive storage of fats in organs such as in adipose tissue, the heart and macrophages.
  • LPL lipoprotein lipase
  • ANGPTL4 improved glucose tolerance in obese mice with type II diabetes (XU et al., Proc Natl Acad Sci USA, 102, 6086-91, 2005) but also induced in this model animal hyperlipidemia in the short term. In humans, an inverse correlation between plasma ANGPTL4 levels, adiposity, or increased blood glucose has been reported (ROBCIUC et al., J Lipid Res, 51, 824-31, 2010; ROBCIUC et al. , J Lipid Res, 52, 1575-82, 201 1).
  • ANGTPL4 protein anorexigenic effect (KIM et al., Diabetes, 59, 2772-80, 2010) or a decrease in inflammation caused by saturated dietary lipids (LICHTENSTEIN and al., Cell Metab, 12, 580-92, 2010).
  • ANGPTL4 has been shown to play an important role in controlling the expression of ANGPTL4 in the small intestine.
  • the level of ANGPTL4 expression in the small intestine is higher in axenic mice than in conventional mice, and colonization of axenic mice reduces its level of expression (BACKHED et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101, 15718-23, 2004).
  • LPL Lipoprotein Lipase
  • Lactobacillus paracasei F19 induces the intestinal expression of ANGPTL4 (PPARs dependent) resulting in vivo by a decrease in fat mass (ARONSSON et al., PLoS One, 5, 2010).
  • ANGPTL4 PPARs dependent
  • a commensal bacterium, Clostridium tyrobutyricum induces strong expression of ANGPTL4 during colonization of axenic mice (KORECKA, et al., Am J. Physiology Gastrointest Liver Physiol, in press, 2013).
  • the present invention relates to the use of the strain Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 or a composition containing said strain, for preventing or reducing excessive accumulation of fat in adipocytes and metabolic consequences and / inflammatory conditions, such as insulin resistance in a subject or chronic inflammation.
  • said subject is a mammal, which may be an animal or a human.
  • the present invention includes the CNCM 1-4317 strain of
  • Lactobacillus rhamnosus or a composition containing said strain for use as a medicament in the treatment, prevention, or mitigation of a condition due to excessive accumulation of body fat and / or insulin resistance.
  • pathologies resulting from excessive body fat accumulation are overweight, obesity and related disorders, such as metabolic syndrome, type II diabetes, non-alcoholic fatty liver, hypertension, high blood pressure, chronic inflammation, etc.
  • the present invention also encompasses the non-therapeutic use of the CNCM 1-4317 strain to prevent or reduce excessive body fat accumulation in a subject for cosmetic purposes.
  • Lactobacillus rhamnosus strain CNCM 1-4317 can be used in the form of whole bacteria which can be alive, or non-living, for example heat-inactivated.
  • she can be used in the form of a bacterial lysate, or in the form of bacterial fractions; the bacterial fractions suitable for this use are in particular supernatants of cultures of the CNCM 1-4317 strain.
  • compositions used in the present invention may be in any form suitable for administration, particularly oral administration. This includes, for example, semi-solid, liquid and powder formulations.
  • the composition may typically comprise from 10 5 to 10 13 colony forming units (cfu), in particular at least 10 6 cfu, preferably at least 10 7 cfu, preferably at least 10 8 cfu. cfu, and most most preferably at least 10 9 cFU per gram dry weight of the composition.
  • cfu colony forming units
  • this generally corresponds to from 10 4 to 10 12 cfu, preferably at least 10 5 cfu, more preferably at least 10 6 cfu, advantageously at least 10 7 cfu, and quite exactly preferred at least 10 9 cfu / ml.
  • compositions for use in the present invention are nutritional compositions, including food products and especially dairy products. These nutritional compositions also include dietary supplements and functional foods.
  • a "dietary supplement” means a product made from compounds commonly used in food, but which is in the form of tablets, powder, capsules, potion or any other form not usually associated with food, and which has beneficial effects for health.
  • a “functional food” is a food that, in addition to its nutritional properties, also has beneficial effects on health.
  • dietary supplements and functional foods can have a physiological effect - protective or curative - against a disease, for example against a chronic disease.
  • compositions suitable for use in the present invention are pharmaceutical or cosmetic compositions.
  • compositions of the invention may also comprise, besides the CNCM 1-4317 strain, one or more other strain (s) of lactic acid bacteria, probiotic or otherwise, for example one or more bacterial strain (s). selected from the genera Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, and Bifidobacteria.
  • this (these) other strain (s) may include one or more strain (s) of Streptococcus thermophilus, and / or one or more strain (s) of Lactobacillus bulgaricus.
  • ANGPTL4 The effect of several bacterial strains belonging to the L.paracasei and L.rhamnosus species on the expression of the ANGPTL4 gene was measured in cancerous HT29 cancer cells, and compared with that of rosiglitazone (PPAR ⁇ receptor agonist, known to increase very strongly the expression of ANGPTL4).
  • the HT29 cells were cultured in DMEM medium (Lonza®) supplemented with 20% fetal calf serum (FCS) (Lonza®), 2mM glutamine (Sigma®), IX non-essential amino acids (NAA) ( Invitrogen®) and 50U / ml penicillin streptomycin (Lonza®) mixture in an environment containing 10% CO 2 at 37 ° C.
  • the cells were detached with trypsin-versene EDTA (Lonza®) and plated in a 6-well plate. 625,000 cells were deposited per well and cultured for 48 hours in DMEM medium without antibiotic.
  • the medium was changed before contacting cells for 6h with bacterial suspensions, DMEM (negative control) or rosiglitazone (positive control).
  • DMEM negative control
  • rosiglitazone positive control
  • the cell cultures were then rinsed with PB S (Lonza®) before extracting RNA.
  • Rosiglitazone (Cayman chemical®) was prepared in DMSO and diluted in cell culture medium. This preparation was brought into contact with the cells at a final concentration of 10 ⁇ .
  • the bacterial suspensions were then added to the cells at 20% of the final volume.
  • RNA samples were extracted with the kit "RNeasy mini kit” (Qiagen®) according to the supplier's instructions.
  • the RNA was assayed with nanodrop and an agarose gel was made to determine the quality of the RNAs.
  • the cDNA synthesis was performed from the final RNA using the High Capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems®) and the T100 Thermal Cycler device (Biorad®) according to supplier's instructions.
  • the cDNAs obtained were assayed with nanodrop and preparations at 10 ng / ⁇ l were made in water nuclease free (Ambion®) for RTqPCR.
  • RTqPCRs were performed using the "Taqman® gene expression master” reagents (Applied Biosystems®) with the device (ABI PRISM 7000 - Applied Biosystems®) according to the supplier's instructions.
  • mice C57BL / 6 germ-free mice aged 7 to 11 weeks were maintained under standard diet (R 03-40, SAFE).
  • RNAlater stabilizing reagent
  • Tissue RNA was extracted using the RNeasy kit mini-kit (Qiagen) and ⁇ cDNA synthesized from 1 ⁇ g RNA using the High Capacity Kit cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) .
  • the cDNAs were diluted to 203 ⁇ 4 / ⁇ 1 and the RTqPCRs performed with a final volume of 25 ⁇ 1 using Taqman probes (Life Technologies) and the ABI Prism 7700 thermocycler (Applied Biosystem) according to the supplier's recommendations.
  • the results were normalized using 2 control genes (GAPDH and ⁇ -actin).

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Abstract

L'invention est relative à l'utilisation d'une souche de Lactobacillus rhamnosus pour prévenir ou traiter des pathologies associées à une accumulation excessive de graisse corporelle. Cette souche est de préférence administrée par voie orale, notamment sous forme dans un aliment ou un complément alimentaire.

Description

SOUCHE DE LA CTOBA CILL US RHAMNOSUS RÉGULATRICE DU
MÉTABOLISME LIPIDIQUE.
L'invention est relative à l'utilisation de probiotiques pour réguler le métabolisme lipidique.
Le métabolisme des lipides joue un rôle important dans l'homéostasie énergétique. L'énergie provenant de la nourriture est emmagasinée dans les adipocytes sous forme de réserves lipidiques qui sont utilisées quand cela est nécessaire pour satisfaire les besoins énergétiques du corps. Un apport calorique excédant les dépenses caloriques induit l'accumulation de graisse corporelle, conduisant au surpoids et à plus long terme à l'obésité. Le surpoids est défini par un indice de masse corporelle (IMC) supérieur ou égal à 25, et l'obésité par un IMC supérieur ou égal à 30.
L'obésité constitue un facteur important dans l'apparition de maladies telles que l'hypertension, le diabète de type II, les maladies cardio-vasculaires, les maladies du foie et certains cancers, et devient rapidement un problème majeur de santé publique. Le nombre de personnes obèses dans le monde a plus que doublé depuis 1980. En 2008, plus de 1 ,4 milliards d'adultes étaient en surpoids, et parmi ceux-ci, plus de 200 millions d'hommes et presque 300 millions de femmes étaient obèses.
Il est généralement reconnu que parmi les causes principales de la fréquence actuelle de l'obésité et des désordres métaboliques qui lui sont associés figurent une activité physique réduite et une alimentation riche en graisses et en sucre.
Toutefois, les différences interindividuelles observées au niveau de la propension à l'accumulation de graisse et la prise de poids sont également corrélées avec d'autres facteurs, tels que le fond génétique, les conditions sanitaires, les traitements médicaux, l'âge ou le manque de sommeil.
Parmi les nombreux gènes impliqués dans l'obésité figure celui codant pour la protéine ANGPTL4 (angiopoietin like 4), également appelée FIAF (fasting induced adipose factor), PGAR (PPAR-γ induced angiopoietin-related protein), ou HFARP (hepatic fibrinogen/angiopoietin reiated protein). Cette protéine a été initialement découverte en 2000 (YOON et al, Mol Cell Biol, 20, 5343-9, 2000; KERSTEN et al, J Biol Chem, 275, 28488-93, 2000; KIM et al., Biochem J, 346 Pt 3, 603-10, 2000). Elle est bien conservée chez les mammifères, avec 77% d'homologie de séquences entre l'homme (hANGPTL4) et la souris (mANGPTL4) (KIM et al, Biochem J, 346 Pt 3, 603-10, 2000). Elle est majoritairement exprimée dans le foie, le tissu adipeux (TA) et l'intestin, et son expression est accrue par le jeûne et l'exercice physique. ANGPTL4 est un gène cible des récepteurs nucléaires PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors), notamment PPAR-γ dans le TA et le colon, et PPAR-cc dans le foie et l'intestin grêle. Parmi les effets physiologiques attribués à ANGPTL4 figure notamment son rôle dans le métabolisme des lipides et du glucose. En particulier, ANGPTL4 inhibe l'activité de la lipoprotéine lipase (LPL) en favorisant la dissociation des dimères actifs de LPL en monomères inactifs (SUKONINA et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 17450-5, 2006), ce qui conduit à la mobilisation des triglycérides comme source d'énergie en faveur des organes périphériques, et à la limitation du stockage excessif des graisses dans des organes tels que dans le tissu adipeux, le cœur et les macrophages.
Il a également été observé qu'ANGPTL4 améliorait la tolérance au glucose chez des souris obèses présentant un diabète de type II (XU et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 6086-91, 2005) mais induisait par ailleurs dans ce modèle animal une hyperlipidémie à court terme. Chez l'homme, une corrélation inverse entre les niveaux d'ANGPTL4 plasmatique, l'adiposité, ou l'augmentation du glucose sanguin a été rapportée (ROBCIUC et al, J Lipid Res, 51, 824-31 , 2010 ; ROBCIUC et al, J Lipid Res, 52, 1575-82, 201 1).
D'autres effets ont été attribuées à la protéine ANGTPL4, tels qu'un effet anorexigène (KIM et al., Diabètes, 59, 2772-80, 2010) ou une diminution de l'inflammation causée par les lipides alimentaires saturés (LICHTENSTEIN et al., Cell Metab, 12, 580-92, 2010).
Il a été observé qu'il existait une forte variation interindividuelle du taux d'ANGPTL4 plasmatique (ROBCIUC et al, J Lipid Res, 51, 824-31, 2010), mais que le fond génétique ne jouait qu'un rôle mineur dans cette variabilité (ROBCIUC et al., J Lipid Res, 52, 1575-82, 201 1).
Par ailleurs, il a été montré que le microbiote intestinal jouait un rôle important dans le contrôle de l'expression d'ANGPTL4 dans l'intestin grêle. Le niveau d'expression d'ANGPTL4 dans l'intestin grêle est plus élevé chez les souris axéniques que chez des souris conventionnelles, et la colonisation des souris axéniques réduit son niveau d'expression (BACKHED et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 15718-23, 2004). Ces modulations d'expression d'ANGPTL4 sont corrélées aux niveaux d'activité de la Lipoprotéine Lipase (LPL) dans le tissu adipeux et le cœur, et par conséquent au stockage des graisses dans le tissu adipeux. Plus récemment, il a été observé que des bactéries commensales ou probiotiques pouvaient moduler l'expression d'ANGPTL4. Ainsi, Lactobacillus paracasei F19 induit l'expression intestinale d'ANGPTL4 (PPARs dépendante) se traduisant in vivo par une diminution de la masse graisseuse (ARONSSON et al., PLoS One, 5, 2010). De la même façon, une bactérie commensale, Clostridium tyrobutyricum, induit une forte expression d'ANGPTL4 lors de la colonisation de souris axéniques (KORECKA, et al, Am J.Physiology Gastrointest Liver Physiol, sous presse, 2013). Les mécanismes intervenant dans cette régulation bactérienne sont à l'heure actuelle mal élucidés : elle peut dans certains cas être directe ; dans d'autres cas elle peut être médiée par des facteurs sécrétés ou des métabolites tel que les acides gras à chaîne courte (AGCCs), ou le peroxyde d'hydrogène (H202) (KOREC A, et al, Am J.Physiology Gastro, sous presse, 2013 ; GROOTAERT et al, Environ Microbiol, 13, 1778-89, 201 1).
De manière plus générale, le rôle du microbiote intestinal dans l'obésité fait l'objet d'un intérêt croissant, et il a été suggéré que sa manipulation à l'aide de prébiotiques, probiotiques, ou symbiotiques, pourrait aider à réduire l'obésité et les troubles métaboliques associés (MALLAPPA et al, Indian J Endocrinol Metab, 16, 20-7, 2012; DELZENNE et al., Nat Rev Endocrinol, 7, 639-46, 201 1).
Il a été rapporté que certaines souches de probiotiques permettaient de réduire l'accumulation de graisse, et/ou les troubles métaboliques liés à l'obésité. Les effets de ces différents probiotiques apparaissent toutefois spécifiques de la souche concernée, et médiés par des mécanismes qui diffèrent d'une souche à l'autre.
Dans ce contexte, les Inventeurs ont testé différentes souches de lactobacilles pour déterminer leurs effets sur l'expression de la protéine ANGPTL4, et ont identifié parmi celles-ci une souche de Lactobacillus rhamnosus capable d'augmenter significativement cette expression. Il s'agit de la souche de Lactobacillus rhamnosus déposée selon le traité de Budapest le 19 Mai 2010 sous le numéro 1-4317 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 Rue du Docteur Roux, Paris). Cette souche est également décrite dans la Demande PCT WO 2011/148219.
En conséquence, la présente invention a pour objet l'utilisation de la souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 ou d'une composition contenant ladite souche, pour prévenir ou réduire l'accumulation excessive de graisse dans les adipocytes et les conséquences métaboliques et/ou inflammatoires en découlant, telles que la résistance à l'insuline chez un sujet ou l'inflammation chronique. De préférence, ledit sujet est un mammifère, qui peut être un animal ou un humain.
En particulier, la présente invention englobe la souche CNCM 1-4317 de
Lactobacillus rhamnosus ou une composition contenant ladite souche, pour l'utilisation comme médicament dans le traitement, la prévention, ou l'atténuation d'une pathologie due à une accumulation excessive de graisse corporelle et/ou à la résistance à l'insuline.
Des exemples de pathologies résultant de l'accumulation excessive de graisse corporelle sont le surpoids, l'obésité et les troubles qui y sont liés, comme le syndrome métabolique, le diabète de type II, la stéatose hépatique non alcoolique, l'hypertension, l'inflammation chronique, etc.
La présente invention englobe également l'utilisation non-thérapeutique de la souche CNCM 1-4317 pour prévenir ou réduire l'accumulation excessive de graisse corporelle chez un sujet dans un but esthétique.
Pour la mise en œuvre de la présente invention, la souche CNCM 1-4317 de Lactobacillus rhamnosus peut être utilisée sous forme de bactéries entières qui peuvent être vivantes, ou non-vivantes, par exemple inactivées par la chaleur. Alternativement, elle peut être utilisée sous la forme d'un lysat bactérien, ou sous forme de fractions bactériennes; les fractions bactériennes convenant à cette utilisation sont notamment des surnageants de cultures de la souche CNCM 1-4317.
Les compositions utilisées dans la présente invention peuvent être sous toute forme appropriée pour l'administration, en particulier l'administration orale. Cela inclut, par exemple, les formulations semi-solides, liquides et poudres.
Lorsque les bactéries se présentent sous forme de bactéries vivantes, la composition peut comprendre typiquement de 105 à 1013 unités formant colonies (ufc), en particulier au moins 106 ufc, de préférence au moins 107 ufc, avantageusement au moins 108 ufc, et de manière tout à fait préférée au moins 109 ufc par gramme de poids sec de la composition. Dans le cas d'une composition liquide, ceci correspond généralement à de 104 à 1012 ufc, de préférence au moins 105 ufc, plus préférablement au moins 106 UFC, avantageusement au moins 107 ufc, et de manière tout à fait préférée au moins 109 ufc/ml.
Les compositions préférées pour une utilisation dans la présente invention sont des compositions nutritionnelles, y compris les produits alimentaires et en particulier des produits laitiers. Ces compositions nutritionnelles comprennent également des compléments alimentaires et des aliments fonctionnels. Un «complément alimentaire» désigne un produit fabriqué à partir de composés habituellement utilisés dans les denrées alimentaires, mais qui est sous la forme de comprimés, de poudre, de capsules, potion ou toute autre forme non associée habituellement avec des aliments, et qui a des effets bénéfiques pour la santé. Un «aliment fonctionnel» est un aliment qui, outre ses propriétés nutritionnelles, a aussi des effets bénéfiques pour la santé. En particulier, les compléments alimentaires et les aliments fonctionnels peuvent avoir un effet physiologique - de protection ou curatif - contre une maladie, par exemple contre une maladie chronique.
D'autres exemples de compositions appropriées pour une utilisation dans la présente invention sont des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques.
Les compositions de l'invention peuvent également comprendre, outre la souche CNCM 1-4317, une ou plusieurs autre(s) souche(s) de bactéries lactiques, probiotiques ou non, par exemple une ou plusieurs souche(s) bactérienne(s) choisie(s) parmi les genres Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, et les bifidobactéries. En particulier, cette (ces) autre(s) souche(s) peu(ven)t inclure une ou plusieurs souche(s) de Streptococcus thermophilus, et/ou une ou plusieurs souche(s) de Lactobacillus bulgaricus.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'effet de la souche CNCM 1-4317 sur l'expression de la protéine ANGPTL4. EXEMPLE 1 : INDUCTION DE L'EXPRESSION DU GÈNE ANGPTL4 PAR DES BACTÉRIES LACTIQUES DANS DES CELLULES ÉPITHÉLIALES INTESTINALES.
L'effet de plusieurs souches bactériennes appartenant aux espèces L.paracasei et L.rhamnosus sur l'expression du gène ANGPTL4 a été mesuré dans des cellules coliques cancéreuses HT29, et comparé avec celui de la rosiglitazone (agoniste du récepteur PPARy, connu pour augmenter très fortement l'expression d'ANGPTL4).
Cultures cellulaires
Les cellules HT29 ont été cultivées dans du milieu DMEM (Lonza®) supplémenté avec 20% de sérum de veau fœtal (SVF) (Lonza®), 2mM de glutamine (Sigma®), IX d'acides aminés non essentiels (AANE) (Invitrogen®) et 50U/ml d'un mélange pénicilline streptomycine (Lonza®) dans un environnement contenant 10% de C02 à 37°C.
Les cellules ont été décollées à la trypsine-versene EDTA (Lonza®) et déposées en plaque 6 puits. 625,000 cellules ont été déposées par puits et cultivées pendant 48h dans du milieu DMEM sans antibiotique.
Le milieu a été changé avant de mettre les cellules en contact pendant 6h avec les suspensions bactériennes, du milieu DMEM (contrôle négatif) ou de la rosiglitazone (contrôle positif). Les cultures cellulaires ont alors été rincées au PB S (Lonza®) avant d'en extraire TARN.
La rosiglitazone (Cayman chemical®) a été préparée dans du DMSO et diluée dans le milieu de culture cellulaire. Cette préparation à été mise en contact avec les cellules à une concentration finale de 10μΜ.
Cultures bactériennes
Une pré-culture des souches de Lactobacillus paracasei et rhamnosus a été réalisée dans du MRS (Man, Rogosa and Sharpe médium - Oxoid® CM0359) pendant une nuit. Les bactéries ont ensuite été ensemencées à 0,2% du volume final et cultivées pendant 6h.
1 ml de chaque bactérie a été centrifugé à 6000 g pendant 10 minutes et lavés au PBS. Les culots bactériens ont été repris dans le milieu cellulaire DMEM sans antibiotique à une D06oo (densité optique) finale de 0,1 ce qui correspond à environ 2 à 7 x 107 CFU/ml.
Les suspensions bactériennes ont alors été ajoutées aux cellules à 20% du volume final.
Extraction ARNs et synthèse d'ADNc
L'extraction des ARNs cellulaires a été réalisée avec le kit « RNeasy mini kit » (Qiagen®) selon les instructions du fournisseur. L'ARN a été dosé au nanodrop et un gel d'agarose a été réalisé pour déterminer la qualité des ARNs. La synthèse des ADNc a été effectuée à partir d' ^g final d'ARN à l'aide du kit « High capacity cDNA reverse transcription » (Applied Biosystems®) et l'appareil « T100 Thermal Cycler » (Biorad®) selon les instructions du fournisseur.
Les ADNc obtenus ont été dosés au nanodrop et des préparations à 1 OOng/μΙ ont été réalisées dans de l'eau nuclease free (Ambion®) pour la RTqPCR.
RT-qPCR
Les RTqPCRs ont été réalisées à l'aide des réactifs « Taqman® gene expression master » (Applied Biosystems®) avec l'appareil (ABI PRISM 7000 - Applied Biosystems®) selon les instructions du fournisseur.
Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Graph Pad Prism 5
(version 8.0).
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
Légende de la Fi ure 1 : en abscisse, souches testées ; en ordonnée, expression d'ANGPTL4, normalisée par rapport au gène contrôle b-actine. p<0.001 indique un écart significatif (test ANOVA) par rapport au contrôle négatif DMEM.
Ces résultats montrent que la souche CNCM 1-4317 est capable d'induire une augmentation significative d'environ 8 fois de l'expression du gène ANGPTL4.
EXEMPLE 2 : ÉTUDE DE L'EXPRESSION DU GENE ANGPTL4 DANS L'INTESTIN GRELE DISTAL DE SOURIS AXÉNIQUES AYANT INGÉRÉ LA BACTÉRIE CNCM 1-4317.
Matériel et méthode:
Des souris C57BL/6 germ-free (GF) âgées de 7 à 1 1 semaines ont été maintenues sous régime standard (R 03-40, SAFE). Les souris ont été colonisées par un gavage de 10E9 CFU/ml bactéries (cultures fraîches suspendues dans du PBS). Elles ont été isolées dans 3 incubateurs distincts selon le gavage reçu (N-7 souris gavées par Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317, N=6 souris gavées par CNCM 1-2493 et N=5 souris gavées par PBS). Après 2 semaines de stabilisation, les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale. La colonisation a été confirmée par dénombrement dans les fèces et galerie API 50CH (Biomérieux®). Les tissus (intestin grêle, colon) ont été prélevés et stockés dans du RNAlater (réactif de stabilisation) à -80°C. L'ARN des tissus a été extrait à l'aide du kit RNeasy mini- kit (Qiagen) et Γ ADNc synthétisé à partir d' 1 μg d'ARN à l'aide du kit High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Les ADNcs ont été dilués à 20¾/μ1 et les RTqPCRs réalisées avec un volume final de 25μ1 à l'aide de sondes Taqman (Life technologies) et de l'appareil thermocycleur ABI Prism 7700 (Applied Biosystem) selon les recommandations du fournisseur. Les résultats ont été normalisés à l'aide de 2 gènes contrôles (GAPDH et β-actine).
Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
Légende de la Figure 2 : en abscisse, souches testées ; en ordonnée, expression d'ANGPTL4, normalisée par rapport aux gènes contrôles b-actine et GAPDH.
L'analyse de l'expression du gène ANGPTL4 dans un modèle murin a mis en évidence une tendance de la bactérie CNCM 1-4317 à induire cette expression au niveau de l'intestin grêle distal.

Claims

REVENDICATIONS
1) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie résultant d'une accumulation excessive de graisse corporelle et/ou à la résistance à l'insuline.
2) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi le surpoids, l'obésité, et les maladies en résultant.
3) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé pour l'administration par voie orale.
4) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite souche est contenue dans une composition administrable par voie orale.
5) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite composition est un aliment ou un complément alimentaire.
6) Souche de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4317 pour l'utilisation comme médicament selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite composition est un produit laitier.
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