EP3017056A2 - Endoglucanase-induced production of cellulose oligomers - Google Patents

Endoglucanase-induced production of cellulose oligomers

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EP3017056A2
EP3017056A2 EP14733666.3A EP14733666A EP3017056A2 EP 3017056 A2 EP3017056 A2 EP 3017056A2 EP 14733666 A EP14733666 A EP 14733666A EP 3017056 A2 EP3017056 A2 EP 3017056A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cellulose
hydrolysis
endoglucanase
chain length
endoglucanases
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14733666.3A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Mari GRANSTRÖM
Alois Kindler
Antje Spiess
Stefanie KLUGE
Benjamin BONHAGE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP14733666.3A priority Critical patent/EP3017056A2/en
Publication of EP3017056A2 publication Critical patent/EP3017056A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
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    • A23K20/10—Organic substances
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
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    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of cellulose oligomers (cellooligomers) using endoglucanases and to the use of the oligomers thus produced in various technical fields.
  • Cellulose is the most common polymer on earth [Pinkert, Marshet al. Chemical Reviews, 109 (12): 6712-6728, 2009] and occurs in the form of lignocellulose in plant cell walls [Teeri, T.T., Trends in Biotechnology, 15 (5): 160-167, 1997].
  • the primary and secondary plant cell wall consists of 10 to 90% lignocellulose fibers [Weiler, E.W., General and Molecular Botany, Vol. 1. Thieme, Stuttgart, 2008].
  • Cellulose forms cellulosic fibrils in plant cell walls together with lignin and hemicellulose.
  • Within a cellulose fibril is a crystalline core, which consists of 30 to 100 parallel to each other arranged cellulose molecules.
  • Cellulose serves as a structural component of the plant cell wall and is responsible for stability and tensile strength, but also for flexibility. Unlike sugar and starch, cellulose is not a food that is relevant to human nutrition and is therefore ethically acceptable as a renewable raw material for materials and energy production.
  • a novel and surprisingly advantageous process procedure for the preparation of insoluble cellooligomers by means of endoglucanases is provided.
  • the process of the invention exhibits particular advantages in terms of producing oligomers of defined chain length and narrow chain length distribution of the insoluble cellooligomers, low production of soluble sugars, and achieving a cellooligomer chain length near the aqueous solubility limit.
  • cellulose is a water-insoluble, partially crystalline biopolymer and is poorly enzymatically hydrolyzed in aqueous media [Dadi et al., Biotechnology and Bioengineering, 95 (5): 904-10, 2006], in particular, a suitable pretreatment, e.g. by ionic liquids.
  • a suitable pretreatment e.g. by ionic liquids.
  • purified endoglucanases in particular from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, are used for the hydrolysis of the cellulose.
  • Figures 1 a to 1 e show the time course of DP W and DP n for the enzymatic hydrolysis of Avicel by means of endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum and e) 7. emersonii.
  • Figures 2a to 2e show the time course of the DP W and DP n for the enzymatic hydrolysis of alpha-cellulose by means of endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum and e) 7. emersonii.
  • FIGS. 3 a to 3 e show the time course of the degrees of polymerization DP W and DP n for the enzymatic hydrolysis of sigmacell by means of endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum and e). 7 emersonii.
  • Figures 4a to 4c show the time course of the degree of polymerization DP W and DP n for the two-stage enzymatic hydrolysis of Avicel by endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, and c) 7. maritima, after intermediate treatment with ionic Liquid (IL Restart).
  • Figures 5a to 5c show the time course of the degree of polymerization DP W and DP n for the two-stage enzymatic hydrolysis of alpha-cellulose by endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, and c) 7. maritima, after intermediate treatment with ionic liquid (IL restart).
  • IL restart ionic liquid
  • the "DP N value” refers to the amount-related degree of polymerization or number average chain length of an oligomer or polymer.
  • the "DP W value” denotes the mass-based degree of polymerization or the chain length of an oligomer or polymer.
  • the "DP N value” and the “DP W value” are determined experimentally, in particular using gel permeation chromatography (GPC) under the standard conditions (mobile phase, operating temperature, flow rate, column material) described in more detail in the experimental section
  • chain length distribution and the “molecular weight distribution” is meant the frequency distribution of the chain length or the molecular weight, which was determined by GPC.
  • the number-average molar mass M N and the mass-average molar mass M w can be used for the quantitative description of the width of the chain length or molar mass distribution.
  • the polydispersity is defined as the ratio of M w to M N and is greater than or equal to 1. The smaller the polydispersity, the narrower is the molecular weight distribution.
  • Cellulose is to be understood broadly in the context of the invention in the environment of lignin-poor and essentially hemicellulose-free cellulose materials, from pulp to pure alpha-cellulose they do not substantially adversely affect the enzymatic reaction, the celluloses may have completely inkristallin or completely crystalline, or an average degree of crystallinity (Crl%) according to the known methods of determination (for example, X-ray diffraction) the.. "DP N - value" employed cellulose z can. B. in the range of about 30 to 150 are.
  • the "DP W value” can be, for example, in the range from 120 to 500.
  • a “celloologomer” is an oligomer having a DP N value in the range from 10 to 70 and composed of several glucose units linked to ⁇ -1,4-glycosidically.
  • Endoglucanases are enzymes that cleave randomly within a cellulose molecule. They attack in the amorphous regions of cellulose. Due to the arbitrary chain cleavage two mostly different lengths of cellulose chains are formed. This leads to rapid reduction of DP W and increase in reducing ends [Lynd, LR et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66 (3): 506-577, 2002].
  • One unit of endoglucanase activity is defined as the amount of enzyme required to produce one mole of glucose equivalents of reducing sugars per minute of carboxymethylcellulose at 40 ° C and a pH of 4.5 and 6, respectively.
  • Beta-glucosidase (EC 3.2.1 .21, or beta-1, 6-glucosidase) is a glucosidase enzyme that acts on ⁇ 1 -> 4 bonds between two glucose or substituted glucose molecules. It is an exocellulase with specificity for a variety of beta-D-glucosidic substrates. It catalyzes the hydrolysis of non-reducing terminal residues in beta-D-glucosides to release glucose.
  • Bacillus amyloliquefaciens is a Gram-positive rod-shaped bacterium discovered by J. Fukomoto in 1943 [Fukomoto, J., J. Agric. Chem. SOC. Jpn., 19; 487-503; 1943]. It was not characterized until 1987 by a group of scientists and declared as a species of its own [Priest et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 37 (1): 69-71, 1987].
  • B. amyloliquefaciens was isolated from the soil and has a size of 0.7 ⁇ to 0.9 ⁇ times 1, 8 ⁇ to 3.0 ⁇ on. The peritrich flagellated cells are mobile and form chains. The optimum temperature is between 30 ° C to 40 ° C.
  • B. amyloliquefaciens has the number 23350 in the American Type Culture Collection.
  • Aspergillus niger is a filamentous fungus that grows aerobically [Schuster et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 59 (4-5): 426-435, 2002]. In nature, A. niger occurs in soil, waste, compost and rotten plant material. A. niger grows at temperatures of 6 ° C to 47 ° C and in a pH range of 1.4 to 9.8 [Reiss, J., Schimmelpilze lifestyle, benefits, harm, fight. Springer, 1986]. It produces black, shaded conidiospores that spread across the air. Indus- trially, A.
  • Thermotoga maritima is a rod-shaped gram negative strictly anaerobic bacterium with a free outer cell membrane.
  • T. maritima was discovered in 1986 by R. Huber in a volcano off Italy. The growth optimum of this bacterium is at 80 ° C. Below 55 ° C no growth occurs.
  • T. maritima is 1 .5 ⁇ to 1 1 ⁇ long and 0.6 ⁇ wide. It is subpolar monotrich flagellated and thus freely mobile [Huber et al.
  • T. maritima grows on simple and complex carbohydrates such as glucose, sucrose, starch, cellulose and xylan [Nelson, KE et al., Nature, 399 (6734): 323-329, 1999].
  • Talaromyces emersonii belongs to the family of Trichocomaceae, which belongs to the Ascomycota Division and was discovered by Stolk in 1965 [Stolk, A. C, et al., Journal of Microbiology and Serology, 31 (3): 262, 1965].
  • the current name is Rasam- sonia emersonii [Houbraken, Spierenburg, Frisvad. Antonie van Leeuwenhoek, 101 (2): 403-21, 2012].
  • Trichoderma longibrachiatum belongs to the family Hypocreaceae. This belongs to the department of Ascomycota. T. longibrachiatum was discovered by Rifai in 1969 [Rifai, M.A., Mycological Pat. 1 16, Washington Mycological Institute, 1969].
  • Reaction medium with at least one endoglucanase (EC3.2.1 .4), in particular a microbial EG, such as from bacteria or fungi, hydrolytically cleaves and b) the reaction product comprising one or more cellooligomers, ie a cellooligomer fraction, isolated from the reaction medium.
  • EC endoglucanase
  • the formed cellooligomer (the cellooligomers formed) have a number average chain length or a number average degree of polymerization; DP N in the range of 10 to 100.
  • the cellooligomer formed (the cellooligomers formed) has a DP N value in the range of 15 to 50, such as 20 to 45, 25 to 40, or 30 to 35.
  • the chain length distribution of cellooligomers prepared according to the invention can be determined, e.g. but not limited to, in the range of 5 to 500, 10 to 4000 15 to 300 20 to 2000 or 25 to 150 are.
  • the EG is a naturally or recombinantly produced, possibly genetically modified enzyme from microorganisms of the genus Bacillus, Aspergillus or Thermotoga, in particular the species Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus niger or Thermotoga maritima, or a combination of at least two of these natural or recombinant enzymes.
  • Method according to one of the preceding embodiments wherein at least one EG is used in a concentration of about 0.01 to 100, such as 1 to 50, 1, 5 to 30 or 2 to 10, U / ml reaction mixture.
  • Method according to one of the preceding embodiments wherein cellulose is used in a concentration in the range of 0.1 to 5 or 1 to 4 or 2 to 3% (w / v) based on the total volume of the reaction mixture.
  • a1 is subjected to a pretreatment step by which the crystallinity of the cellulose is reduced
  • the ionic liquid is selected from salts which are liquid below a temperature of 100 ° C, in particular 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate (EMIM Ac) and 3-methyl-N-butylpyridinium chloride ([C4mpy] CI).
  • EMIM Ac 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate
  • [C4mpy] CI 3-methyl-N-butylpyridinium chloride
  • step a1) cellulose is initially introduced in the ionic liquid, optionally under the action of temperature, e.g. 20 to 80, 25 to 60 or 30 to 50 ° C dissolves and then precipitated by addition of water, an organic solvent or a mixture thereof, the precipitate separates off if necessary washes and optionally removed liquid.
  • temperature e.g. 20 to 80, 25 to 60 or 30 to 50 ° C dissolves and then precipitated by addition of water, an organic solvent or a mixture thereof, the precipitate separates off if necessary washes and optionally removed liquid.
  • step a1) the acid treatment is carried out with concentrated phosphoric acid.
  • step a1) the mechanical treatment takes place by means of a ball mill, for example with 1 mm glass balls, and / or a power consumption in the range of about 200 to 600 or 300 to 500 or about 400 W. 14.
  • Method according to one of the preceding embodiments wherein the treatment steps, in particular the steps a1) and a2), are repeated one or more times before the reaction product is isolated. 15. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the reaction is also carried out in the presence of a beta-glucosidase.
  • the present invention is not limited to the specifically disclosed or used enzymes having endoglucanase activity, but rather extends to functional equivalents thereof.
  • amino acid sequences of the invention used in the literature are given below: Thermotoga maritima: (SEQ ID NO: 1)
  • Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 3):
  • “functional equivalents” is understood to mean enzymes which, in the test used for endoglucanase activity, have an activity which is at least 1%, for example at least 10% or 20%, such as at least 50% or 75% or 90% higher or lower activity
  • functional equivalents are preferably stable between pH 2 to 1 and advantageously have a pH optimum in the range of pH 3 to 10, and a temperature optimum in the range of 25 ° C to 95 ° Coder 20 ° C to 70 ° C, such as about 45 to 60 ° C or about 50 to 55 ° C.
  • Endoglucanase activity can be detected by several known tests. Without being limited to this, let a test be performed using a reference substrate, such as a reference substrate. As carboxymethylcellulose, under standardized conditions at 40 ° C and a pH of 4.5 and 6, respectively.
  • “functional equivalents” are understood to mean, in particular, “mutants” which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities.
  • “Functional equivalents” thus include the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions, and / or inversions, which changes can occur in any sequence position as long as they result in a mutant having the property profile of the invention Equivalence is also given in particular if the reactivity patterns between the mutant and the unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, identical substrates are reacted at different speeds. the. Examples of suitable amino acid substitutions are summarized in the following table:
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, as well as salts with organic bases such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like, acid addition salts such as salts with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids such as acetic acid and oxalic acid also the subject of the invention.
  • inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts
  • organic bases such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like
  • acid addition salts such as salts with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids such as acetic acid and
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reacting with acyl groups.
  • “functional equivalents” also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, regions of homologous sequence regions can be determined by sequence comparison and, based on the specific requirements of the invention, equivalent enzymes can be determined.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably single domains or sequence motifs, of the polypeptides of the invention having, for example, the desired biological function.
  • Fusion equivalents are also fusion proteins which contain one of the abovementioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further functionally different heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without substantial functional impairment of the fusion protein portions
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides, histidine anchors or enzymes.
  • Homologs to the concretely disclosed proteins according to the invention include homologs with at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98 or 99%, homology (or identity) to one of the specifically disclosed amino acid sequences calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448.
  • a percentage homology or identity of an invented The homologous polypeptide according to the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of the amino acid sequences specifically described herein. The percent identity values can also be determined using BLAST alignments, blastp algorithm (protein-protein BLAST), or by applying the Clustal settings below.
  • “functional equivalents” include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • Homologs of the proteins or polypeptides of the invention may be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation, extension or shortening of the protein.
  • Homologs of the proteins of the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants.
  • a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477).
  • Several techniques for screening gene products of combinatorial libraries made by point mutations or truncation and for screening cDNA libraries for gene products having a selected property are known in the art.
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the person skilled in the art can introduce completely random or even more targeted mutations into genes or non-coding nucleic acid regions (which are important, for example, for the regulation of expression) and then generate gene banks.
  • the molecular biological methods required for this purpose are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.
  • DNA shuffling in which a pool of closely related genes is formed and digested, and the fragments are used as templates for a polymerase chain reaction in which repeated strand separation and recapture ultimately generate full-length mosaic genes (Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad. USA 91: 10747).
  • first gene libraries of the respective proteins are generated, using, for example, the abovementioned methods
  • the gene banks are expressed in a suitable manner, for example by bacteria or by phage display systems.
  • the respective genes of host organisms expressing functional mutants with properties which largely correspond to the desired properties can be subjected to another round of mutation.
  • the steps of the mutation and the selection or screening can be repeated iteratively until the functional mutants present have the desired properties to a sufficient extent.
  • a limited number of mutations such as 1 to 5 mutations, can be carried out step by step and evaluated and selected for their influence on the relevant enzyme property.
  • the selected mutant can then be subjected in the same way to a further mutation step. This significantly reduces the number of single mutants to be studied.
  • appropriate expression constructs can be used in particular.
  • the invention also relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for an enzyme according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • an "expression unit” is understood as meaning a nucleic acid with expression activity which comprises a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulation of expression, ie transcription and translation, of said nucleic acid or gene
  • a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulation of expression, ie transcription and translation, of said nucleic acid or gene
  • regulatory elements e.g. Enhancers
  • an expression cassette or “expression construct” is understood according to the invention to mean an expression unit which is functionally linked to the nucleic acid to be expressed or to the gene to be expressed.
  • an expression cassette comprises not only nucleic acid sequences that regulate transcription and translation, but also the nucleic acid sequences that are to be expressed as a protein as a result of transcription and translation.
  • expression in the context of the invention describe the production or increase of the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by introducing a gene into an organism replace existing gene with another gene, increase the copy number of the gene (s), use a strong promoter, or use a gene encoding a corresponding enzyme with a high activity and, if desired, combine these measures 5'-upstream of the respective coding sequence, a promoter and 3'-downstream, a terminator sequence and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • promoter a "nucleic acid with promoter activity” or a " Promotorsequ enz” is understood according to the invention as a nucleic acid which regulates the transcription of this nucleic acid in functional linkage with a nucleic acid to be transcribed.
  • a “functional” or “operative” linkage in this context means, for example, the sequential arrangement of one of the nucleic acids with promoter activity and a nucleic acid sequence to be transcribed and, if appropriate, further regulatory elements, for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and, for example a terminator, such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence.
  • further regulatory elements for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and, for example a terminator, such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence.
  • Genetic control sequences such as enhancer sequences, may also exert their function on the target sequence from more distant locations or even from other DNA molecules.
  • nucleic acid sequence to be transcribed is positioned behind (ie at the 3 'end) of the promoter sequence, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the transgenic nucleic acid sequence to be expressed may be less than 200 base pairs, or less than 100 base pairs or less than 50 base pairs.
  • examples of other regulatory elements include targeting sequences, enhancers, polyadenylation signals, selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • Nucleic acid constructs according to the invention comprise, in particular, those in which the coding sequence with one or more regulatory signals is advantageously used for the control, e.g. Increased, the gene expression was operatively or functionally linked.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically altered so that natural regulation is eliminated and expression of genes increased.
  • the nucleic acid construct can also be simpler, ie no additional regulatory signals have been inserted before the coding sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the already mentioned “enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids of the invention may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers, such as antibiotic resistance or auxotrophic complementing genes, optionally for selection on the construct.
  • suitable regulatory sequences are promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq " T7-, T5-, T3-, gal-, trc, ara, rhaP (rhaP B AD) SP6, lambda P R - or contained in the lambda P L promoter, which are advantageously in gram- find negative bacteria application.
  • Further advantageous regulatory sequences are included, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. It is also possible to use artificial promoters for regulation.
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which allows for optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • Vectors other than plasmids and phages are also all other vectors known to those skilled in the art, ie viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention. Suitable plasmids are described, for example, in E.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ).
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced in the form of a linear DNA into the microorganisms and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or of the nucleic acid according to the invention.
  • the "codon usage" can be easily determined by computer evaluations of other known genes of the organism concerned.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors” (Pouweis P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the endoglucanases which can be used according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, more preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium or Rhodococcus used , Very particularly preferred is the genus and species Escherichia coli. Further beneficial bacteria are also found in the group of alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria
  • the host organism or the host organisms according to the invention preferably contain at least one of the endoclucanase-encoding nucleic acid sequences, nucleic acid constructs or vectors which encode an enzyme having an endoglucanase activity as defined above.
  • Microorganisms are generally contained in a liquid medium which contains a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins. at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted under oxygen fumigation.
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is regulated during the cultivation or not.
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • a microorganism producing this enzyme is cultured, optionally the expression of the enzyme is induced and this is isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or batchwise in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • batch cultivation is in the textbook by Chmiel (Bioreatechnik 1st Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook of Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) Find.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good sources of carbon are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds, such as molasses, or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats such.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soybean protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • sulfur source inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic see sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine. Growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis.
  • Information about the media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practice”. Growth Approaches can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or in batches as desired.
  • the temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • foam anti-foaming agents such as. As fatty acid polyglycol, are used.
  • suitable selective substances such as e.g. As antibiotics, are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. B. ambient air, registered in the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C and.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broth is then further processed.
  • the biomass can be wholly or partly by separation methods, such. Centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods are removed from the fermentation broth or left completely in it.
  • the cells may be disrupted and the product digested by known protein isolation techniques obtained from the lysate.
  • the cells may be disrupted by high frequency ultrasound, by high pressure such as in a French pressure cell, by osmolysis, by detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the listed procedures.
  • Purification of the polypeptides may be accomplished by known chromatographic techniques such as molecular sieve chromatography (gel filtration) such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional techniques such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, T.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • anchors such as anchors.
  • hexa-histidine anchors which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press ).
  • anchors may be used to attach the proteins to a solid support, e.g. a polymer matrix, which may for example be filled in a chromatography column, or used on a microtiter plate or on another carrier.
  • these anchors can also be used to detect the proteins.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme markers which upon reaction with a substrate form a detectable reaction product, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to identify the proteins for the derivation of the proteins.
  • the endoglucanase can be used freely or immobilized.
  • An immobilized enzyme is an enzyme which is fixed to an inert carrier. Suitable support materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. The disclosure of these documents is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • Suitable support materials include, for example, clays, clay minerals such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silica, alumina, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powders, anion exchange materials, synthetic polymers such as polystyrene, acrylic resins, phenolformaldehyde resins, polyurethanes and polyolefins such as polyethylene and polypropylene.
  • the support materials are usually used to prepare the supported enzymes in a finely divided, particulate form, with porous forms being preferred.
  • the particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (grading curve).
  • Carrier materials are, for example, calcium alginate and carrageenan.
  • Enzymes as well as cells can also be cross-linked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs). Corresponding and further immobilization processes are described, for example, in J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalyst in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim described.
  • the preparation of the celloologomers is carried out by single or multiple enzymatic hydrolysis by means of endoglucanases optionally combined with a treatment of the cellulose by ionic liquids and / or mechanical treatment.
  • the optimal sequence can be determined by the skilled person by simple preliminary tests. a) Treatment of cellulose with ionic liquids
  • the cellulose is suspended, for example, in cold EMIM Ac.
  • 0.02 g of cellulose per ml of EMIM Ac are heated until the liquid becomes clear.
  • the cellulose is precipitated with water.
  • the precipitated cellulose is passed through a vacuum filtered from the ionic liquid and the water used for precipitation.
  • the cellulose is washed with water.
  • Freshly pretreated cellulose is used for enzymatic hydrolysis.
  • a suitable buffer acetate, phosphate or Tris buffer, 0.01 to 0.25 M, pH 4 to 7
  • a suitable buffer e.g. 0.1 M Na acetate buffer pH 4.5 and 0.1 M Na-K phosphate buffer pH 6.
  • the buffer concentration and the pH value can be optimally adjusted by a few preliminary experiments.
  • the cellulases are dissolved in buffer in the desired concentration.
  • the weighed cellulose is added to the cellulase solution and mixed for a few seconds in advance. Unless otherwise stated, about 10 mg (dry weight) of cellulose are used in 2 ml Eppendorf tubes with 1 ml cellulase solution for hydrolysis, which are incubated in a thermomixer at 40 ° C. and 800 min -1 for the desired time. To stop the reaction, the samples are centrifuged for 3 min at 14000 min -1 in a bench top centrifuge. A corresponding implementation in larger batches is also possible after some routine preliminary tests.
  • Areas of application - are e.g. in the field of fiber reinforcement or the modification of surface-active substances or formulations (defoamers, rheology-modifying agents, etc.).
  • cellulose substrates with different property profiles were used according to the invention.
  • the cellulose substrates differ in terms of their degree of polymerization or their chain length distribution and their degree of crystallinity and the available surface. Table 1 shows an overview of the substrates used.
  • the degree of polymerization and the chain length distribution of a cellulose substrate are determined by GPC.
  • the samples were derivatized according to previous methods and then measured by GPC [Rinaldiet al. Angewandte Chemie International Edition, 47 (42): 8047-8050, 2008, Rinaldi et al., Chemsuschem, 3 (2): 266-276, 2010].
  • the samples analyzed according to the invention have to be analyzed for GPC by an alternative GPC method [Engel et al. 2012, Biotechnology for Biofuels 5:77] are no longer derivatized.
  • Table 1 shows the determined degree of polymerization of the substrates with the GPC measuring system used according to the invention. enzymes:
  • the cellulose is suspended in cold EMIM Ac. For this, 0.75 g of cellulose per 50 mL of EMIM Ac are heated to 80 ° C for at least 40 minutes until the liquid becomes clear. The cellulose is then precipitated with 400 ml of water. The precipitated cellulose is separated from the ionic liquid and the water used for precipitation by means of a vacuum filtration in which a 0.2 .mu. ⁇ pore size cellulose acetate filter is used. Subsequently, the cellulose is washed 3 times with 500 ml of water. 2. Mechanical pretreatment of the cellulose
  • cellulose 10% (w) of cellulose is dissolved in dist. Water suspended.
  • the ball mill (Beadbeater, Biospec Products) is prepared according to instructions with 1 mm glass beads, filled with the cellulosic suspension and ground for 3 min. Thereafter, the ball mill must cool for 3 minutes until the cellulose can be ground again. This process is performed on ice five times. Subsequently, the cellulose with dist. Wash water out of the glass balls until the wash water clears. The washed suspension is collected and then alternates 3 min at 4000 min -1 (Rotina 35R) centrifuge. The water is decanted from the pretreated cellulose and the cellulase used for the enzymatic hydrolysis.
  • the endoglucanases from A. niger, T. longibrachiatum and T. emersonii, and A. niger ⁇ -glucosidase are dissolved in the desired concentration in Na acetate buffer.
  • the endoglucanases from T. maritima and B. amyloliquefaciens are dissolved in the desired concentration in Na-K phosphate buffer.
  • the weighed cellulose is added to the cellulase solution and vortexed for a few seconds. Unless otherwise stated, 10 mg (dry weight) of cellulose in 2 ml Eppendorf tubes with 1 ml cellulase solution are used for the hydrolysis, which are incubated in a thermomixer at 40 ° C.
  • the samples are centrifuged for 3 min at 14000 min -1 in a bench top centrifuge, the supernatant removed and transferred to another Eppendorf reaction vessel. The pellet and the supernatant are frozen at -80 ° C and can be analyzed later.
  • the determined cellulose loss is used to calculate the amount of cellulose after hydrolysis (dry weight).
  • the pellet obtained after the hydrolysis is dissolved in EMIM Ac at 80 ° C for 2 h.
  • the amount of EMIM Ac required depends on the amount and moisture content of the cellulose because the water present in the cellulose samples decreases the cellulose solubility of EMIM Ac.
  • the cellulose is precipitated from EMIM Ac by addition of water.
  • the cellulose is washed three times with water. To separate the liquid, the cellulose is centrifuged for 3 min at 4000 min -1 (Rotina 35R) and the liquid is then decanted off. Weighing determines the wet weight of the cellulose samples.
  • the determined wet weight of the samples and the calculated dry weights after hydrolysis are used to determine the swelling factor of the samples.
  • the cellulose purified by cellulase using this method is then used for a second hydrolysis.
  • the previously determined swelling factor is used.
  • GPC 0 Organic gel permeation chromatography determines the chain length distribution of cellulose samples.
  • the cellulose samples obtained from the hydrolysis are lyophilized and the lyophilizate is subsequently dissolved at 80 ° C. in DMF / 19% (v / v) EMIM Ac.
  • the dissolved cellulose is filtered through a 0.1 ⁇ PT-FE filter and transferred to HPLC glassware.
  • a GPC 0 system was used with the devices listed above (Table 3) under the following conditions.
  • aqueous gel permeation chromatography (GPC W )
  • the composition of the sugar present in the aqueous supernatant of the hydrolysis is determined.
  • the supernatants obtained from the hydrolysis are sterile-filtered (0.2 ⁇ ) and transferred into HPLC glass vessels.
  • a GPC system with the components according to Table 4 under the following conditions
  • glucose and cellooligomers (cellobiose [C2] to cellohexaose [C6]) from Megazyme (Ireland) are used.
  • the retention time is 27 to 31, 5 min.
  • Dry Mass Determination In order to subsequently determine the exact amount of cellulose used for the hydrolysis, a dry mass determination of the pretreated cellulose is carried out. For this Eppendorf reaction vessels are labeled and dried at 80 ° C for 3 d. After listing the weight, the Eppendorf reaction tube is filled with a certain amount of wet cellulose and the weight noted. Then the filled Eppendorf reaction vessel is dried at 80 ° C. After drying the Eppendorf reaction vessel is weighed again. From the curb weight, the wet weight and the dry weight, the swelling factor will be determined. Since freshly pretreated cellulose is used for all tests, the determined swelling factor merely serves to retrospectively check the values calculated for the hydrolysis tests.
  • the cellulose loss determination can be used to determine how much of the cellulose is broken down into soluble sugars and cellooligomers. To determine the cellulose loss, 30 mg dry mass of cellulose are hydrolyzed by the method described above.
  • the cellulose is not separated from the buffer by centrifugation.
  • the weight of a cellulose acetate filter having a pore size of 0.2 ⁇ m is recorded and the hydrolysed cellulose suspension is filtered off via the filter.
  • the filter with the hydrolyzed cellulose is washed three times with 10 ml. Washed water and dried at 80 ° C for 3 d. After drying, weigh the cellulose acetate filter with the dried cellulose and record the weight. From the difference in weight between the cellulose used for the hydrolysis and the weight after the drying of the cellulose, the cellulose loss can be determined.
  • High performance liquid chromatography can be used to determine the concentration of glucose and cellobiose present in the aqueous supernatant of the hydrolysis reaction.
  • HPLC High-performance liquid chromatography
  • the supernatants obtained from the hydrolysis are sterile filtered and transferred into HPLC glass vessels.
  • an HPLC (Table 5) under the following conditions
  • the 4-hydroxybenzoic acid hydrazide test can be used to determine the molar concentration of the reducing sugar present in the aqueous supernatant of the hydrolysis reaction.
  • the reducing soluble sugars react with the PAH BAH reagent to form a yellow dye that can be measured photometrically at 410 nm.
  • glucose calibration series are made with the buffers used at a concentration range of 0.025 g to 0.5 g / L.
  • For the PAH BAH test two reagents have to be prepared (A and B) whose recipes are listed in the following table. Before carrying out the PAHBAH test, the reagents A and B (ratio 1:10) are used to prepare the working reagent.
  • Trisodium citrate 12.45 g
  • Reagent B calcium chloride 1, 1 g
  • SDS gel electrophoresis sodium dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS gel electrophoresis) using an SDS gel system manufactured by Life Technologies (California, USA) was used.
  • Example 1 GPC Q of the cellulosic substrates Avicel, ⁇ -cellulose and Sigmacell To GPCo of the three enzymatically unhydrolyzed cellulose substrates Avicel, o cellulose and Sigmacell samples of these three substrates were incubated for 1 d at 40 ° C in buffer. Subsequently, they were prepared for the GPCo analogously to the samples of the hydrolysis and analyzed in the GPCo.
  • the chain length distribution determination for Avicel gave the same result for the acetate and phosphate buffers.
  • the chain length distribution of the ⁇ -cellulose and Sigmacell samples incubated in phosphate buffer show a proportional shift of the curve towards longer chains. The cause of this observation is unclear.
  • the samples incubated in acetate buffer are not shifted to longer chain lengths as compared to samples not incubated in buffer.
  • for the preparation of the chain length distribution of o cellulose and Sigmacell without enzymatic degradation substrate samples are used as a reference, which were previously incubated in acetate buffer and then lyophilized.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the sample without endoglucanase is between 10 and 1000 glucose units, with a maximum at 250. After hydrolysis with the A. niger endoglucanase for 5 min, a shift of the upper end of the chain length distribution by 700 glucose units towards shorter chain lengths is observed. The chain length distribution after this reaction time is between 10 and 300 glucose units. The maximum of the distribution is 90 glucose units. In the Time span between 5 min and 24 h shifts the upper end of the chain length distribution by 100 glucose units towards shorter chain lengths. After 24 h, the curve is between 10 and 200 glucose units and has a maximum at 70 glucose units.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the sample without endoglucanase is between 10 and 700 glucose units, with a maximum at 250. Also in the hydrolysis of Avicel by B. amyloliquefaciens endoglucanase, a shift of the upper end of the chain length distribution to shorter chains can be observed after 20 min , The chain length distribution of the 2 h sample is shifted by 150 glucose units towards shorter chain lengths after 20 min. The curves of the samples between 2 h and 24 h are congruent. The substrate is therefore not further degraded. After hydrolysis for 24 h, a chain length distribution is achieved which is between 10 and 200 glucose units and has a maximum at about 65 glucose units
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the GPCo measurement of the sample without endoglucanase has a chain length distribution of 10 to 700 glucose units.
  • the 5 min sample has a chain length distribution between 15 and 300 glucose units.
  • the chain length distribution after this reaction time is between 15 and 300 glucose units, with a maximum at 90 glucose units.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the upper end of the chain length distribution after hydrolysis for 5 minutes is between 300 and 400 glucose units. This is the case with T. longibrachiatum endoglucanase only after 20 min.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the sample without endoglucanase is between 10 and 700 glucose units, with a maximum at 250 glucose units.
  • the upper end of the chain length distribution shifts to shorter chain lengths during the first 4 h of hydrolysis. After 4 h, the curve of the chain length distribution lies between 15 and 200 glucose units, with a maximum at 70 glucose units.
  • the test results are shown graphically in the attached Figures 1 a to e.
  • the initial value of the DP W of the sample, before addition of cellulase (0 h sample), is between 160 and 220 with an average value of 190.
  • the DP W drops by 37% to 53% during the first 5 min and thus lies between 90 and 120. After 24 h, it decreases the DP W in the hydrolysis experiments with the endoglucanases from A niger, T. maritima and T. longibrachiatum by another 10% to 21% to 50% to 37% of the initial value.
  • the DP W of the hydrolysis with B. amyloliquefaciens endoglucanase is 40% of the initial value after 20 minutes. After 24 h of hydrolysis, the DP W is lowered by a further 5% to 35% of the initial value.
  • the DP W of hydrolysis of the endoglucanase from T. emersonii is lowered after 20 minutes of hydrolysis of 52% of the initial value. After 2 h of hydrolysis, the DP W with a value of 70 is 36% of the initial value. Thereafter, the DP W increases from 120 h to 24 h by the end of the reaction time. Also on hydrolysis of Sigmacell with the T. emersonii endoglucanase, both the DP W and the DP N increase after 3 h of hydrolysis. Therefore, it can not be assumed that the observed increase is measurement error. A possible cause would be an increased reduction of short chains, whereby the already existing longer chains, in the ratio more significant.
  • the DP W is reduced most in the first 5 min trial period compared to the rest of the trial period relative to baseline. In the first 1 to 2 h, the DP W drops to approx. 50%. Compared to the other endoglucanases, the lowest DP W of 65 can be achieved using B. amyloliquefaciens endoglucanase.
  • the polydispersity decreases with decreasing DP W.
  • polydispersity decreases with decreasing DP W.
  • Example 4 Mass balance of the hydrolysis of Avicel
  • soluble cellooligomers and glucose also accumulate in the hydrolysis of cellulose.
  • This example is devoted to the quantification and evaluation of the loss of cellulose employed by production of soluble cellooligomers and glucose.
  • the dissolved cellooligomers and glucose were quantified by HPLC and PAHBAH assay.
  • HPLC analysis the glucose and cellobiose concentration certainly. The concentration of these two dissolved sugars increases with time for all endoglucanases used
  • T. emersonii endoglucanase produces the most unknown soluble cellooligomers with 11% unknown soluble cellooligomers.
  • B. amyloliquefaciens endoglucanase produces 6.1% of unknown soluble cellooligomers.
  • T. longibrachiatum endoglucanase is used, 2% of unknown soluble cellooligomers are formed.
  • T. maritima and A. niger endoglucanases at 0.5% and 0% results in a very small or immeasurable amount of unknown soluble cellooligomers. Since the endoglucanases from T. emersonii and B.
  • amyloliquefaciens produce the most soluble cellooligomers compared to the other endoglucanases, these two endoglucanases could be used to produce soluble cellooligomers.
  • the endoglucanase from T. emersonii produces mainly glucose, cellobiose (51%) and soluble cellooligomers (11%).
  • the endoglucanases from B. amyloliquefaciens with 75%, A. niger with 81% and T. maritima with 96.6% insoluble cellulose after hydrolysis the best cellulosic yields are achieved compared to the other endoglucanases.
  • the endoglucanases from B. amyloliquefaciens and A. niger are of particular interest if the insoluble cellulose is relatively short-chain cellooligomers.
  • Example 5 Enzymatic hydrolysis of ⁇ -cellulose by means of endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum and T. emersonii
  • composition of the hydrolysis batch :
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the hydrolysis of ⁇ -cellulose was determined by means of B. amyloliquefaciens endoglucanase. After hydrolysis for 5 minutes with A. niger endoglucanase, only a flattening of the slope between 10 and 30 glucose units of the chain length distribution can be seen instead of the shoulder. After 20 min reaction time, this flattening is no longer visible, but instead a nearly Gaussian chain length distribution is observed. At the end of the experiment, the distribution of the chain lengths is between 10 and 400 glucose units with a maximum at 80 glucose units. By the enzymatic hydrolysis a reduction of the maximum by 80% and the upper end by 75% is achieved.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the hydrolysis of ⁇ -cellulose was determined by T. maritima endoglucanase.
  • the GPC 0 analyzed 5 min sample of the hydrolysis of ⁇ -cellulose by T. maritima endoglucanase shows a chain length distribution between 10 and 1800 glucose units. Compared to the sample Without enzyme, cellooligomers are present in the range 10 to 20 glucose units. The maximum after 5 minutes has shifted from 450 to 350. A shoulder is no longer pronounced, but a slight flattening of the slope at about 120 glucose units visible.
  • the slope of the chain length distribution is in the range between 10 and 30 glucose units compared to the slope in the range of 30 glucose units to the maximum, flatter.
  • the upper end of the chain length distribution and the maxima of the curves shift towards shorter chain lengths during hydrolysis. After 19 h reaction time, the curve is between 10 and 600 and the maximum at 150 glucose units. Thus, the maximum of the chain length distribution is reduced by 65% and the upper end of the chain length distribution by 65%.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the hydrolysis of ⁇ -cellulose was determined by T. longibrachiatum endoglucanase.
  • the upper end of the chain length distribution of the hydrolysis of ⁇ -cellulose by T. longibrachiatum endoglucanase shifts to shorter chain lengths after hydrolysis for 5 minutes.
  • the chain length distribution after this reaction time is between 10 and 1500 glucose units.
  • the maximum has shifted from 450 to 200 glucose units.
  • the shoulder has also shifted to shorter chain lengths and is about 25 glucose units.
  • the upper end of the chain length distribution shifts ever further towards shorter chain lengths.
  • the maxima of the curves also shift towards shorter chains.
  • the chain length distribution becomes narrower in the course of the experiment, the height of the maxima increases in the course of the experiment.
  • the chain length distribution is between 10 and 400 and the maximum at 75 glucose units.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the hydrolysis of ⁇ -cellulose by T. emersonii endoglucanase was determined by GPCo.
  • the chain length distribution of the sample without enzyme is between 20 and 1800 glucose units, with a maximum at 450 glucose units. Between 90 and 200 glucose units, the chain length distribution has a shallower area (shoulder).
  • the upper end of the chain length distribution of the hydrolysis of ⁇ -cellulose by T. emersonii endoglucanase shifts to shorter chain lengths after hydrolysis for 5 minutes.
  • the chain length distribution is after this reaction time between 10 and 1500 glucose units.
  • the maximum has shifted from 450 to 280 glucose units.
  • the shoulder has also shifted towards shorter chain lengths and is about 30 glucose units.
  • Example 6 Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolysed alpha cellulose For the determination of the DP of enzymatically hydrolysed alpha-cellulose (from Example 5), GPC analyzes were carried out.
  • the DP W of the A. niger samples drops to 180. This results in a reduction of the DP W of at least 50%.
  • the DP W continues to decrease and, after 19 h, has a value of 1 to about 25% of the initial value. This shows that the reduction of the DP W slows down over time.
  • the DP N drops from 240 to 140 after a reaction time of 5 min. Until the end of the test after 19 h, the DP N drops to 50.
  • the DP W of the B. amyloliquefaciens sample drops to 140 within 5 min.
  • the DP N is 70 after this reaction time. After 19 h, the DP W is 90 and the DP N is 50.
  • the DP is located W of the sample using T. emersonii endoglucanase at 150.
  • T. longibrachiatum endoglucanase a DP W of 170 to 40 minutes is achieved.
  • values in this range are already reached after 5 min. Accordingly, the reduction of DP W using the endoglucanases from T. emersonii and T. longibrachiatum proceeds more slowly than when using the endoglucans from A. niger and B. amyloliquefaciens.
  • T. emersonii and T. longibrachiatum proceeds more slowly than when using the endoglucans from A. niger and B. amyloliquefaciens.
  • a DP W of 90 and a DP N of 50 are achieved.
  • a DP W of 90 and a DP N of 40 are achieved after hydrolysis for 19 h.
  • the DP W and DP N increase after approx. 1 h of hydrolysis with the T. emersonii endoglucanase.
  • the increase in DP is not observed when using ⁇ -cellulose.
  • T. maritima and A. niger endoglucanases 87.1% and 94.5% insoluble cellulose were measured after hydrolysis.
  • these two enzymes are of particular interest when the insoluble cellulose is short-chain cellooligomers.
  • the DP W from 150 to 19 h by T. maritima endoglucanase is approximately 50 units above the DP W of the other endoglucanases after the same hydrolysis time.
  • DP W is not reduced to the same extent as using the other endoglucanases.
  • a DP W T. emersonii and T. lon gibrachiatum is using the endoglucanase from A. niger achieved in the same range as when using the endoglucanases from B. amyloliquefaciens.
  • the reduction of DP W in the same proportion and the low production of glucose and soluble cellooligomers compared to the other endoglucanases makes A. niger endoglucanase the favored endoglucanase for the enzymatic hydrolysis of ⁇ -cellulose.
  • the endoglucanases from B. amyloliquefaciens and T. maritima produce little or no soluble cellooligomers at 0.7% and 0%, respectively.
  • the A. niger and T. longibrachiatum endoglucanases produce 2.7% and 3.1% unknown cellooligomers, respectively.
  • T. emersonii endoglucanase produces the most unknown soluble cellooligomers (27.4%).
  • the endoglucanase from T. emersonii is probably suitable for the production of soluble cellooligomers, which are larger than cellobiose.
  • Example 8 Enzymatic hydrolysis of Sigmacell using endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum and T. emersonii With the aid of GPCo, the chain length distribution of the hydrolysis samples of o cellulose and of sigmacell was determined.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of Sigmacell without enzymatic degradation is in the range between 10 and 1000 glucose units, with a maximum at 300-400 glucose units and has a smaller slope in the range between 10 and 50 glucose units in the range between 50 glucose units and the maximum.
  • the flattening after 5 minutes of hydrolysis with A. niger endoglucanase is between 10 and 20 glucose units.
  • the chain length distribution is between 10 and 500 glucose units, with a maximum at 100 glucose units.
  • the upper end of the chain length distribution is between 10 and 350 glucose units and is thus shifted by 150 glucose units towards shorter chain lengths in comparison to the chain length distribution of the 5 min sample.
  • the 6 h hydrolysis sample shows no flattening in the left part of the curve.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the 5 min sample of the hydrolysis of Sigmacell by means of B. amyloliquefaciens endoglucanase is between 10 and 400 glucose units. After this reaction time, no flattening between 15 and 50 glucose units can be seen. Until the end of the experiment after 20 h, the upper end of the shifts Chain length distribution continuously on to shorter chains. The distribution is after this reaction time between 10 and 300 glucose units. The maximum also shifts towards shorter chain lengths and is at 65 glucose units. T. maritima
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution is in the same range as untreated Sigmacell.
  • the maximum of the chain length distribution is shifted by 100 glucose units to shorter chain lengths and an increase of short cellulose chains in the range of 10 to 200 glucose units can be seen.
  • the chain length distribution shifts further towards shorter chain lengths and then lies between 10 and 400 glucose units.
  • a slower degradation of sigmacell is observed in comparison to Sigmacell hydrolysis experiments using A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases.
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution is between 15 and 800 glucose units.
  • the flattening at the front of the chain length distribution is still visible between 15 and 60 glucose units at this point, but in a shorter range than untreated Sigmacell.
  • the curve is between 10 and 300 glucose units with a maximum at 80 glucose units
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distribution of the 20 h sample shows an unexpected course compared to the other hydrolysis samples.
  • the chain length distribution ranges from 10 to 300 glucose units, with a maximum at 70 glucose units. Thereafter, an increase in the longer chains can be observed, with the range of the chain length distribution narrowing more and more.
  • the maximum of the curve also shifts towards longer chain lengths.
  • the chain length distribution is after 6 h hydrolysis between 10 and 250 glucose units, with a maximum at 100 glucose units.
  • the DP W drops to 130.
  • the DP N drops from 1 10 to 60. This reduces both the DP W and the DP N by at least 55%.
  • a DP W of 100 and a DP N of 40 are reached. The hydrolysis slows down thus. With a DP W of 120, the DP W of the 1 h and 3 h samples increases slightly.
  • the DP N shows an analogue course.
  • the DP W of 100 and DP N of 50 after 6 h reaction time support the assumption that the increase in DP W and DP N after 1 h and 3 h hydrolysis time is probably also due to measurement disturbances.
  • the DPw is at 150 using the T. emersonii endoglucanase. After 1 h reaction time decreases the DP W is still at 75. The DP N is at 40 at this point. After 3 h of hydrolysis, an increase in the DP W is observed. Also, upon hydrolysis of ⁇ -cellulose with T. emersonii endoglucanase, both DP W and DP N increase after 2 h of hydrolysis. A possible cause would be an increased dismantling of short chains, as a result of which the longer chains that already exist fall more in proportion.
  • a DP W of 200 is reached after a reaction time of 5 min. After 1 h of reaction time, the DP W further drops to 130. The DP N is at this point at 65. After 1 h, the cellulose is further degraded using T. longibrachiatum endoglucanase and after completion of the experiment a DP W of 80 and reached a DP N of 50.
  • the hydrolysis of Sigmacell by T. maritima endoglucanase is slower than sigmacell hydrolyses using A. niger, B. amyloliquefaciens, T. emersonii and T. longibrachiatum endoglucanases.
  • the DP W can be reduced to less than half of the initial value.
  • the endoglucanases used differ in their reaction rate and in DP W , which is reached at the end of the experiment.
  • the lowest DP values can be achieved using B. amyloliquefaciens and T. longibrachiatum endoglucanase.
  • B. amyloliquefaciens endoglucanase stagnation of DP W at 80 is observed. It is therefore achieved a mining stop.
  • the DP W decreases until the end of the experiment. It is thus achieved no loss of construction. Because of the faster reaction rate of the A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases compared to the other endoglucanases, these endoglucanases are of particular interest for further experimental investigations.
  • the polydispersity of DP W and DP N was also calculated for Sigmacell and can be seen in the following table.
  • the DP and polydispersity results of enzymatic hydrolysis using A. niger and T. emersonii endogiucanases do not correlate. In these endoglucanases, however, no DP results after 1 d were used due to measurement errors in the hydrolysis samples of the A. niger endogiucanase and an unusual DP increase in the hydrolysis samples of T. emersonii endogiucanase.
  • the DP W and the polydispersity of the other endoglucanases with a hydrolysis time of 1 d correlate, as already observed with Avicel and ⁇ -cellulose.
  • Example 11a Hydrolysis of Avicel to IL Restart:
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distributions resulting from the second hydrolysis differ depending on the endoglucanase used.
  • the endoglucanase from A. niger and B. amyloliquefaciens is used, an increase in cellooligomers with a size of 18 glucose units can be seen after performing an IL restart.
  • the hydrolysis by A. niger endoglucanase gives a further maximum at 18 glucose units after carrying out an IL restart.
  • T. maritima endoglucanase an increase in cellooligomers of 15 glucose units is observed after performing an IL restart.
  • Example 11b Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolyzed Avicel after IL restart
  • the DP W of the samples is between 55 and 65, except for the Restart experiments.
  • a DP W of 35 is achieved
  • the DP W of the 1 d and 2 d samples is 80.
  • the IL restarts method results in a DP W of 55. With this method, the DP W can be reduced by at least 30% reduced to the simple hydrolysis.
  • Example 11c Hydrolysis of ⁇ -cellulose after IL restart
  • composition of the hydrolysis batch :
  • the chain length distributions of the hydrolysis experiments of ⁇ -cellulose with the enzymes used essentially give an analogous picture of Avicel hydrolysis. Only the IL restart experiments lead to significantly reduced molecular weights.
  • A. niger endoglucanase is used, an increase in cellooligomers with a size of 18 glucose units can be seen after performing an IL restart.
  • the chain length distribution shifts to shorter chains after carrying out an IL restart and is between 10 and 200 glucose units.
  • B. amyloliquefaciens endoglucanase is used for the hydrolysis of ⁇ -cellulose, the maximum of the chain length distribution shifts by 30 glucose units to shorter chain lengths after carrying out an IL restart. After carrying out an IL restart using the T. maritima endoglucanase, no shift of the upper end of the chain length distribution or of the maximum of the chain length distribution towards shorter chain lengths can be observed.
  • Example 11 d Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolysed alpha-cellulose after IL restart To determine the DP of enzymatically hydrolysed alpha-cellulose (from Example 11c), GPC analyzes were carried out.
  • the DP W can be reduced by 36% compared with the simple hydrolysis after 2 days.
  • a DP W of 120 is achieved after 1 d of hydrolysis of DP W of 140 and after 2 d of hydrolysis.
  • ⁇ -cellulose By the end of the experiment, the DP W decreases in the case of simple hydrolysis; it is thus achieved no loss of construction.
  • ⁇ -cellulose With the IL Restart method ⁇ -cellulose can be produced with a DP W of 55.
  • the ⁇ -glucosidase used in the examples represents an optional further embodiment of the invention. In the context of investigations according to the invention it has been possible to show that their use is not absolutely necessary. It is known that ⁇ -glucosidase can prevent possible product inhibition of the endoglucanases by the presence of cellulose degradation products (in particular cellobiose). The actual need to use this enzyme, however, can be determined by a few routine preliminary experiments.

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Abstract

The invention relates to a method for the production of cellulose oligomers (cellooligomers) using endoglucanases and to the use of the thus produced oligomers in different technical fields.

Description

Endoglucanase-induzierte Herstellung von Celluloseoligomeren  Endoglucanase-induced production of cellulose oligomers
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Celluloseoligomeren (Cellooligomeren) unter Verwendung von Endoglucanasen und die Verwendung der so herge- stellten Oligomeren auf verschiedenen technischen Gebieten. The invention relates to a process for the preparation of cellulose oligomers (cellooligomers) using endoglucanases and to the use of the oligomers thus produced in various technical fields.
Hintergrund der Erfindung Background of the invention
Cellulose ist das häufigste Polymer der Erde [Pinkert, Marshet al. Chemical Reviews, 109(12):6712-6728, 2009] und kommt in Form von Lignocellulose in pflanzlichen Zellwänden vor [Teeri, T. T., Trends in Biotechnology, 15(5):160-167, 1997]. Die primäre und sekun- däre pflanzliche Zellwand besteht zu 10 bis 90 % aus Lignocellulosefasern [Weiler, E. W., Allgemeine und molekulare Botanik, Vol. 1. Thieme, Stuttgart, 2008]. Cellulose bildet in pflanzlichen Zellwänden zusammen mit Lignin und Hemicellulose Cellulosefibrillen. Innerhalb einer Cellulosefibrille befindet sich ein kristalliner Kern, welcher aus 30 bis 100 parallel zueinander angeordneten Cellulosemolekülen besteht. Cellulose dient als Strukturbaustein der pflanzlichen Zellwand und ist für die Stabilität und Zugfestigkeit verantwortlich, aber auch für Flexibilität. Anders als Zucker und Stärke ist Cellulose kein für die menschliche Ernährung relevantes Nahrungsmittel und ist demnach als nachwachsender Rohstoff für Materialien und Energiegewinnung ethisch vertretbar. Cellulose is the most common polymer on earth [Pinkert, Marshet al. Chemical Reviews, 109 (12): 6712-6728, 2009] and occurs in the form of lignocellulose in plant cell walls [Teeri, T.T., Trends in Biotechnology, 15 (5): 160-167, 1997]. The primary and secondary plant cell wall consists of 10 to 90% lignocellulose fibers [Weiler, E.W., General and Molecular Botany, Vol. 1. Thieme, Stuttgart, 2008]. Cellulose forms cellulosic fibrils in plant cell walls together with lignin and hemicellulose. Within a cellulose fibril is a crystalline core, which consists of 30 to 100 parallel to each other arranged cellulose molecules. Cellulose serves as a structural component of the plant cell wall and is responsible for stability and tensile strength, but also for flexibility. Unlike sugar and starch, cellulose is not a food that is relevant to human nutrition and is therefore ethically acceptable as a renewable raw material for materials and energy production.
Über die Produktion von Cellooligomeren und deren möglichen Einsatz ist wenig be- kannt. Denkbar wäre der Zusatz zu Lebens- und Waschmitteln. Aufgrund der hohen Anzahl an Hydroxylgruppen in den Cellooligomeren können diese an mehreren Stellen derivatisiert werden, wodurch ihre Eigenschaften gezielt modifiziert werden können. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien zur mehrstufigen Umwandlung von Cellulose in Biokraftstoffe veröffentlicht [Hahn-Haegerdal et al. Trends in Biotechnology, 24(12):549-556, 2006, J0rgensen et al. 2007, Waltz 2008], da die Suche nach erneuerbaren Energien die Forschung in diesem Bereich vorantreibt. Little is known about the production of cellooligomers and their possible use. Conceivable would be the addition to food and detergents. Due to the high number of hydroxyl groups in the cellooligomers they can be derivatized at several points, whereby their properties can be selectively modified. Numerous studies on the multistage conversion of cellulose into biofuels have been published in recent years [Hahn-Haegerdal et al. Trends in Biotechnology, 24 (12): 549-556, 2006, Jörgensen et al. 2007, Waltz 2008], as the search for renewable energy drives research in this area.
2008 wurde über den Einsatz von festen Katalysatoren in ionischen Flüssigkeiten zur Hydrolyse von Cellulose berichtet [Rinaldiet al., Angewandte Chemie-International Edi- tion, 47(42):8047-8050, 2008]. Während der Depolymerisierung der Cellulose werden jedoch Glucoseabbauprodukte, wie Hydroxymethylfurfural, Ameisensäure und andere Produkte gebildet [Rinaldi et al.Chemsuschem, 3(2): 266-276, 2010], die die Verwendung der Cellooligomere beeinträchtigen könnten. Die gute Löslichkeit von Zuckern in ionischen Flüssigkeiten macht die Extraktion der Zucker und das Recyceln der ioni- sehen Flüssigkeit schwierig [Rinaldi etal., Angewandte Chemie-International Edition, 47(42):8047-8050, 2008]. Bricht man die Reaktion vorzeitig ab, können nach 1 .5 h Reaktionszeit Cellooligomere mit einem DP von ungefähr 30 und einer Ausbeute von 90 % hergestellt werden [Rinaldi et al., Angewandte Chemie-International Edition, 47(42):8047-8050, 2008]. In 2008, the use of solid catalysts in ionic liquids for the hydrolysis of cellulose was reported [Rinald et al., Angewandte Chemie International Edition, 47 (42): 8047-8050, 2008]. During the depolymerization of the cellulose however, glucose degradation products such as hydroxymethylfurfural, formic acid and other products have been formed [Rinaldi et al. Chemsuschem, 3 (2): 266-276, 2010], which could affect the use of cellooligomers. The good solubility of sugars in ionic liquids makes the extraction of sugars and the recycling of the ionic liquid difficult [Rinaldi et al., Angewandte Chemie-International Edition, 47 (42): 8047-8050, 2008]. If the reaction is prematurely terminated, cellooligomers having a DP of about 30 and a yield of 90% can be prepared after a reaction time of 1.5 h [Rinaldi et al., Angewandte Chemie-International Edition, 47 (42): 8047-8050, 2008].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dessen Hilfe Cellooligomere bereitgestellt werden können, welches aber nicht die Nachteile bekannter Herstellungsverfahren aufweist. Kurzfassung der Erfindung It is therefore an object of the present invention to provide a process by means of which cellooligomers can be provided, but which does not have the disadvantages of known preparation processes. Summary of the invention
Erfindungsgemäß wird eine neuartige und überraschend vorteilhafte Prozessführung zur Herstellung von unlöslichen Cellooligomeren mittels Endoglucanasen bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Prozess zeigt insbesondere Vorteile hinsichtlich Herstellung von Oligomeren definierter Kettenlänge und enger Kettenlängenverteilung der unlöslichen Cellooligomere, geringer Produktion von löslichen Zuckern und der Erzielung einer Cellooligomerkettenlänge nahe der wässrigen Löslichkeitsgrenze. According to the invention, a novel and surprisingly advantageous process procedure for the preparation of insoluble cellooligomers by means of endoglucanases is provided. The process of the invention exhibits particular advantages in terms of producing oligomers of defined chain length and narrow chain length distribution of the insoluble cellooligomers, low production of soluble sugars, and achieving a cellooligomer chain length near the aqueous solubility limit.
Da Cellulose ein wasserunlösliches teilkristallines Biopolymer und aufgrund dessen schlecht in wässrigen Medien enzymatisch hydrolysierbar ist [Dadi et al., Biotechnology and Bioengineering, 95(5):904-10, 2006], kann zusätzlich insbesondere eine geeignete Vorbehandlung, z.B. mittels ionischer Flüssigkeiten, durchgeführt werden. Für die Hydrolyse der Cellulose kommen insbesondere kommerziell erhältliche, gereinigte Endoglucanasen, wie insbesondere aus A. niger, B. amyloliquefaciens , T. maritima , zum Einsatz. In addition, since cellulose is a water-insoluble, partially crystalline biopolymer and is poorly enzymatically hydrolyzed in aqueous media [Dadi et al., Biotechnology and Bioengineering, 95 (5): 904-10, 2006], in particular, a suitable pretreatment, e.g. by ionic liquids. Commercially available, purified endoglucanases, in particular from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, are used for the hydrolysis of the cellulose.
Figurenbeschreibung Die Figuren 1 a bis 1 e zeigen die den zeitlichen Verlauf der DPW und DPn für die enzymatische Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanasen aus a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum und e)7. emersonii. Die Figuren 2a bis 2e zeigen die den zeitlichen Verlauf der DPW und DPn für die enzymatische Hydrolyse von alpha-Cellulose mittels Endoglucanasen aus a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum und e)7. emersonii. figure description Figures 1 a to 1 e show the time course of DP W and DP n for the enzymatic hydrolysis of Avicel by means of endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum and e) 7. emersonii. Figures 2a to 2e show the time course of the DP W and DP n for the enzymatic hydrolysis of alpha-cellulose by means of endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum and e) 7. emersonii.
Die Figuren 3a bis 3e zeigen die den zeitlichen Verlauf der Polymerisationsgrads DPW und DPn für die enzymatische Hydrolyse von Sigmacell mittels Endoglucanasen aus a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum und e)7. emersonii. FIGS. 3 a to 3 e show the time course of the degrees of polymerization DP W and DP n for the enzymatic hydrolysis of sigmacell by means of endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, c) 7. maritima, d) 7. longibrachiatum and e). 7 emersonii.
Die Figuren 4a bis 4c zeigen die den zeitlichen Verlauf der Polymerisationsgrads DPW und DPn für die zweistufige enzymatische Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanasen aus a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, und c) 7. maritima, nach Zwischenbehandlung mit ionischer Flüssigkeit (IL Restart). Figures 4a to 4c show the time course of the degree of polymerization DP W and DP n for the two-stage enzymatic hydrolysis of Avicel by endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, and c) 7. maritima, after intermediate treatment with ionic Liquid (IL Restart).
Die Figuren 5a bis 5c zeigen die den zeitlichen Verlauf der Polymerisationsgrads DPW und DPn für die zweistufige enzymatische Hydrolyse von alpha-Cellulose mittels Endoglucanasen aus a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, und c) 7. maritima, nach Zwischenbehandlung mit ionischer Flüssigkeit (IL Restart). Figures 5a to 5c show the time course of the degree of polymerization DP W and DP n for the two-stage enzymatic hydrolysis of alpha-cellulose by endoglucanases from a) A. niger, b) B. amyloliquefaciens, and c) 7. maritima, after intermediate treatment with ionic liquid (IL restart).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Detailed description of the invention
1. Allgemeine Definitionen 1. General definitions
Der„DPN - Wert" bezeichnet den mengenbezogenen Polymerisationsgrad oder zahlenmittlere Kettenlänge eines Oligomers oder Polymers. The "DP N value" refers to the amount-related degree of polymerization or number average chain length of an oligomer or polymer.
Der „DPW -Wert" bezeichnet den massenbezogenen Polymerisationsgrad oder die Kettenlänge eines Oligomers oder Polymers. Der„DPN - Wert" sowie der„DPW -Wert" wird erfindungsgemäß insbesondere unter Anwendung der Gelpermeationschromatographie (GPC) unter den im experimentellen Teil näher beschriebenen Standardbedingungen (Laufmittel, Betriebstemperatur, Flussrate, Säulenmaterial) experimentell bestimmt The "DP W value" denotes the mass-based degree of polymerization or the chain length of an oligomer or polymer. According to the invention, the "DP N value" and the "DP W value" are determined experimentally, in particular using gel permeation chromatography (GPC) under the standard conditions (mobile phase, operating temperature, flow rate, column material) described in more detail in the experimental section
Unter„Kettenlängenverteilung" und der„Molmassenverteilung" versteht man die Häufigkeitsverteilung der Kettenlänge bzw. der Molmasse, die mittels GPC ermittelt wurde. Die zahlenmittlere Molmasse MN und die massenmittlere Molmasse Mw können zur quantitativen Beschreibung der Breite der Kettenlängen- oder Molmassenverteilung herangezogen werden. By "chain length distribution" and the "molecular weight distribution" is meant the frequency distribution of the chain length or the molecular weight, which was determined by GPC. The number-average molar mass M N and the mass-average molar mass M w can be used for the quantitative description of the width of the chain length or molar mass distribution.
Die Polydispersität ist definieret als das Verhältnis von Mw zu MN und ist größer oder gleich 1 . Je kleiner die Polydispersität, desto enger ist die Molmassenverteilung. „Cellulose" ist im Kontext der Erfindung breit zu verstehen im Umfeld der Lignin-armen und im Wesentlichen hemicellulosefreien Cellulose-Materialien, angefangen von Pulp bis hin zu reiner alpha-Cellulose. Es können sowohl Reinprodukte also auch Cellulose- haltige Stoffgemische eingesetzt werden, sofern diese die enzymatische Umsetzung nicht wesentlich negativ beeinflussen. Die Cellulosen können völlig inkristallin oder völlig kristallin oder einen mittleren Kristallinitätsgrad (Crl%)gemäß der bekannten Bestimmungsmethoden (z.B. Röntgenbeugung) aufweisen. Der„DPN - Wert" eingesetzter Cellulose kann z. B. im Bereich von etwa 30 bis 150 liegen. Der„DPW -Wert" kann z.B. im Bereich von 120 bis 500 liegen Ein „Cellooliogomer" ist eine aus mehreren ß-1 ,4-Glycosidisch verknüpften Glu- coseeinheiten aufgebautes Oligomer mit einem DPN-Wert im Bereich von 10 bis 70. The polydispersity is defined as the ratio of M w to M N and is greater than or equal to 1. The smaller the polydispersity, the narrower is the molecular weight distribution. "Cellulose" is to be understood broadly in the context of the invention in the environment of lignin-poor and essentially hemicellulose-free cellulose materials, from pulp to pure alpha-cellulose they do not substantially adversely affect the enzymatic reaction, the celluloses may have completely inkristallin or completely crystalline, or an average degree of crystallinity (Crl%) according to the known methods of determination (for example, X-ray diffraction) the.. "DP N - value" employed cellulose z can. B. in the range of about 30 to 150 are. The "DP W value" can be, for example, in the range from 120 to 500. A "celloologomer" is an oligomer having a DP N value in the range from 10 to 70 and composed of several glucose units linked to β-1,4-glycosidically.
Endoglucanasen (E.C.3.2.1.4) sind Enzyme, die willkürlich innerhalb eines Cellulose- moleküls spalten. Sie greifen in den amorphen Regionen der Cellulose an. Durch die willkürliche Kettenspaltung entstehen zwei meist unterschiedlich lange Celluloseketten. Dies führt zur schnellen Reduzierung des DPW und zum Anstieg der reduzierenden Enden [Lynd, L.R. et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66(3):506-577, 2002]. Ein Unit der Endoglucanaseaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die benötigt wird um ein mmol Glucoseäquivalente reduzierende Zucker pro Minute aus Carboxymethyl- cellulose bei 40 °C und einem pH von 4,5 bzw. 6 zu erzeugen. Beta-Glucosidase (E.C. 3.2.1 .21 , oder beta-1 ,6-Glucosidase) ist ein Glucosidase- Enzym, das auf ß1 -> 4 Bindungen zwischen zwei Glucose oder substituierten Glucose- Molekülen wirkt. Es ist eine Exocellulase mit Spezifität für eine Vielzahl von beta-D- glykosidischen Substraten. Es katalysiert die Hydrolyse von nicht-reduzierenden terminalen Resten in beta-D-Glucosiden unter Freisetzung von Glucose. Endoglucanases (EC3.2.1.4) are enzymes that cleave randomly within a cellulose molecule. They attack in the amorphous regions of cellulose. Due to the arbitrary chain cleavage two mostly different lengths of cellulose chains are formed. This leads to rapid reduction of DP W and increase in reducing ends [Lynd, LR et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66 (3): 506-577, 2002]. One unit of endoglucanase activity is defined as the amount of enzyme required to produce one mole of glucose equivalents of reducing sugars per minute of carboxymethylcellulose at 40 ° C and a pH of 4.5 and 6, respectively. Beta-glucosidase (EC 3.2.1 .21, or beta-1, 6-glucosidase) is a glucosidase enzyme that acts on β1 -> 4 bonds between two glucose or substituted glucose molecules. It is an exocellulase with specificity for a variety of beta-D-glucosidic substrates. It catalyzes the hydrolysis of non-reducing terminal residues in beta-D-glucosides to release glucose.
Bacillus amyloliquefaciens ist ein gram-positives stäbchenförmiges Bakterium, das 1943 von J. Fukomoto entdeckt wurde [Fukomoto, J., J. Agric. Chem. SOC. Jpn., 19;487-503; 1943]. Erst 1987 wurde es von einer Gruppe von Wissenschaftlern charakterisiert und als eigene Spezies deklariert [Priest et al. International Journal of Sys- tematic Bacteriology, 37(1 ):69-71 , 1987]. B. amyloliquefaciens wurde aus der Erde isoliert und weist eine Größe von 0,7 μηη bis 0,9 μηη mal 1 ,8 μηη bis 3,0 μηη auf. Die peritrich begeißelten Zellen sind beweglich und bilden Ketten. Die optimale Temperatur liegt zwischen 30 °C bis 40 °C. Unter 15 °C findet kein Wachstum statt [Priest , et al., International Journal of Systematic Bacteriology, 37(1 ):69-71 , 1987]. Die aus B. amy- loliquefaciens hergestellten Amylasen, sind Enzyme, welche zur Stärkehydrolyse industriell eingesetzt werden. In der American Type Culture Collection besitzt B. amyloliquefaciens die Nummer 23350. Bacillus amyloliquefaciens is a Gram-positive rod-shaped bacterium discovered by J. Fukomoto in 1943 [Fukomoto, J., J. Agric. Chem. SOC. Jpn., 19; 487-503; 1943]. It was not characterized until 1987 by a group of scientists and declared as a species of its own [Priest et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 37 (1): 69-71, 1987]. B. amyloliquefaciens was isolated from the soil and has a size of 0.7 μηη to 0.9 μηη times 1, 8 μηη to 3.0 μηη on. The peritrich flagellated cells are mobile and form chains. The optimum temperature is between 30 ° C to 40 ° C. There is no growth below 15 ° C [Priest, et al., International Journal of Systematic Bacteriology, 37 (1): 69-71, 1987]. The amylases prepared from B. amyloliquefaciens are enzymes which are industrially used for starch hydrolysis. B. amyloliquefaciens has the number 23350 in the American Type Culture Collection.
Aspergillus niger ist ein filamentöser Pilz, welcher aerob wächst [Schuster et al. Ap- plied Microbiology and Biotechnology, 59(4-5):426-435, 2002]. In der Natur kommt A. niger in Erde, Abfall, Kompost und verrottetem Pflanzenmaterial vor. A. niger wächst bei Temperaturen von 6 °C bis 47 °C und in einem pH Bereich von 1 ,4 bis 9,8 [Reiss, J., Schimmelpilze Lebensweise, Nutzen, Schaden, Bekaempfung. Springer, 1986]. Er produziert schwarze, schattierte Konidiosporen, die sich über die Luft verteilen. Indust- riell wird A. niger vor allem für die Produktion von Zitronen- und Gluconsäure eingesetzt [Roukas, T., Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 25 (6):298-304, 2000]. Thermotoga maritima ist ein stabförmiges gram- negatives strikt anaerobes Bakterium mit einer freien äußeren Zellmembran. T. maritima wurde 1986 von R. Huber in einem Vulkan vor Italien entdeckt. Das Wachstumsoptimum dieses Bakteriums ist bei 80 °C. Unter 55 °C tritt kein Wachstum auf. T. maritima ist 1 .5 μηη bis1 1 μηη lang und 0.6 μηη breit. Es ist subpolar monotrich begeißelt und somit frei beweglich [Huber et al.Archives of Microbiology, 144(4):324-333, 1986]. T. maritima wächst auf einfachen und komplexen Kohlenhydraten, wie Glucose, Sucrose, Stärke, Cellulose und Xylan [Nelson, K. E. et al., Nature, 399(6734):323-329, 1999]. Talaromyces emersonii gehört zu der Familie der Trichocomaceae, welche zur Abteilung der Ascomycota gehört und 1965 von Stolk entdeckt wurde [Stolk, A. C , et al., Journal of Microbiology and Serology, 31 (3):262, 1965]. Der aktuelle Name ist Rasam- sonia emersonii [Houbraken, Spierenburg, Frisvad. Antonie van Leeuwenhoek, 101 (2):403-21 , 2012]. Aspergillus niger is a filamentous fungus that grows aerobically [Schuster et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 59 (4-5): 426-435, 2002]. In nature, A. niger occurs in soil, waste, compost and rotten plant material. A. niger grows at temperatures of 6 ° C to 47 ° C and in a pH range of 1.4 to 9.8 [Reiss, J., Schimmelpilze lifestyle, benefits, harm, fight. Springer, 1986]. It produces black, shaded conidiospores that spread across the air. Indus- trially, A. niger is mainly used for the production of citric and gluconic acid [Roukas, T., Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 25 (6): 298-304, 2000]. Thermotoga maritima is a rod-shaped gram negative strictly anaerobic bacterium with a free outer cell membrane. T. maritima was discovered in 1986 by R. Huber in a volcano off Italy. The growth optimum of this bacterium is at 80 ° C. Below 55 ° C no growth occurs. T. maritima is 1 .5 μηη to 1 1 μηη long and 0.6 μηη wide. It is subpolar monotrich flagellated and thus freely mobile [Huber et al. Archives of Microbiology, 144 (4): 324-333, 1986]. T. maritima grows on simple and complex carbohydrates such as glucose, sucrose, starch, cellulose and xylan [Nelson, KE et al., Nature, 399 (6734): 323-329, 1999]. Talaromyces emersonii belongs to the family of Trichocomaceae, which belongs to the Ascomycota Division and was discovered by Stolk in 1965 [Stolk, A. C, et al., Journal of Microbiology and Serology, 31 (3): 262, 1965]. The current name is Rasam- sonia emersonii [Houbraken, Spierenburg, Frisvad. Antonie van Leeuwenhoek, 101 (2): 403-21, 2012].
Trichoderma longibrachiatum gehört zu der Familie der Hypocreaceae. Diese gehört zur Abteilung der Ascomycota. T. longibrachiatum wurde 1969 von Rifai entdeckt [Rifai, M. A., Mycological Paters No. 1 16, Commonwealth Mycological Institute, 1969]. Die Art war schon Bestandteil vieler Studien [Bissett, J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 62(5):924-931 , 1984; J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 69(1 1 ):2357-2372, 1991 ; J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 69(1 1 ):2373-2417, 1991 ; J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 69(1 1 ):2418-2420, 1991 ]. 2. Besondere Ausführungsformen der Erfindung: Trichoderma longibrachiatum belongs to the family Hypocreaceae. This belongs to the department of Ascomycota. T. longibrachiatum was discovered by Rifai in 1969 [Rifai, M.A., Mycological Pat. 1 16, Commonwealth Mycological Institute, 1969]. The species has already been included in many studies [Bissett, J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 62 (5): 924-931, 1984; J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 69 (11): 2357-2372, 1991; J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 69 (11): 2373-2417, 1991; J., Canadian Journal of Botany - Revue Canadienne de Botanique, 69 (1 1): 2418-2420, 1991]. 2. Particular embodiments of the invention:
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere folgende Ausführungsformen: The present invention particularly relates to the following embodiments:
1 . Verfahren zur Herstellung von Cellooligomeren, wobei man 1 . Process for the preparation of cellooligomers, wherein
a) Cellulose oder ein Cellulose-haltiges Ausgangsmaterial in einem wässrigen a) cellulose or a cellulose-containing starting material in an aqueous
Reaktionsmedium mit wenigstens einer Endoglucanase (EG) (E.C.3.2.1 .4), insbesondere eine mikrobielle EG, wie z.B. aus Bakterien oder Pilzen, hydrolytisch spaltet und b) das Reaktionsprodukt, umfassend ein oder mehrere Cellooligomere, d.h. eine Cellooligomerfraktion, aus dem Reaktionsmedium isoliert. Reaction medium with at least one endoglucanase (EC) (EC3.2.1 .4), in particular a microbial EG, such as from bacteria or fungi, hydrolytically cleaves and b) the reaction product comprising one or more cellooligomers, ie a cellooligomer fraction, isolated from the reaction medium.
Verfahren nach Ausführungsform 1 , wobei das gebildete Cellooligomer (die ge bildeten Cellooligomere) eine zahlenmittlere Kettenlänge oder einen zahlenmittle ren Polymerisationsgrad; DPN im Bereich von 10 bis 100, aufweist (aufweisen). The method of embodiment 1, wherein the formed cellooligomer (the cellooligomers formed) have a number average chain length or a number average degree of polymerization; DP N in the range of 10 to 100.
Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei das gebildete Cellooligomer (die gebildeten Cellooligomere) einen DPN-Wert im Bereich von 15 bis 50, wie z.B. 20 bis 45, 25 bis 40, oder 30 bis 35 aufweist (aufweisen). A method according to any one of the preceding embodiments, wherein the cellooligomer formed (the cellooligomers formed) has a DP N value in the range of 15 to 50, such as 20 to 45, 25 to 40, or 30 to 35.
Die Kettenlängenverteilung erfindungsgemäß hergestellter Cellooligomere kann, z.B. ohne darauf beschränkt zu sein, im Bereich von 5 bis 500, 10 bis 4000 15 bis 300 20 bis 2000 oder 25 bis 150 liegen. The chain length distribution of cellooligomers prepared according to the invention can be determined, e.g. but not limited to, in the range of 5 to 500, 10 to 4000 15 to 300 20 to 2000 or 25 to 150 are.
Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die EG ein natürliches oder rekombinant hergestelltes, ggf. genetisch verändertes Enzym aus Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Aspergillus oder Thermotoga, insbesondere der Species Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus niger oder Thermotoga maritima, oder eine Kombination aus wenigstens zwei dieser natürlichen oder rekombinanten Enzyme ist. Method according to one of the preceding embodiments, wherein the EG is a naturally or recombinantly produced, possibly genetically modified enzyme from microorganisms of the genus Bacillus, Aspergillus or Thermotoga, in particular the species Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus niger or Thermotoga maritima, or a combination of at least two of these natural or recombinant enzymes.
Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man die enzymatische Hydrolyse in einem wässrigen Medium bei einem pH im Bereich von etwa 3 bis 8, insbesondere 4 bis 7 oder 5 bis 6 und/oder bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 90, insbesondere 30 bis 80 oder 40 bis 70 °C und/ oder über eine Dauer von 0,1 bis 100 Stunden, insbesondere 1 bis 72 oder 1 bis 48 Stunden, durchführt. Method according to one of the preceding embodiments, wherein the enzymatic hydrolysis in an aqueous medium at a pH in the range of about 3 to 8, in particular 4 to 7 or 5 to 6 and / or at a temperature in the range of 20 to 90, in particular 30 to 80 or 40 to 70 ° C and / or over a period of 0.1 to 100 hours, in particular 1 to 72 or 1 to 48 hours.
Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man wenigstens eine EG in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 100, wie z.B. 1 bis 50 , 1 ,5 bis 30 oder 2 bis 10, U/ml Reaktionsansatz einsetzt. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man Cellulose in eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 5 oder 1 bis 4 oder 2 bis 3% (w/v) bezogen auf das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes einsetzt. Method according to one of the preceding embodiments, wherein at least one EG is used in a concentration of about 0.01 to 100, such as 1 to 50, 1, 5 to 30 or 2 to 10, U / ml reaction mixture. Method according to one of the preceding embodiments, wherein cellulose is used in a concentration in the range of 0.1 to 5 or 1 to 4 or 2 to 3% (w / v) based on the total volume of the reaction mixture.
Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man die Cellulose Method according to one of the preceding embodiments, wherein the cellulose
a1 ) einem Vorbehandlungsschritt unterzieht, durch welchen die Kristallinität der Cellulose verringert wird, und man a1) is subjected to a pretreatment step by which the crystallinity of the cellulose is reduced, and
a2) die Cellulose aus Schhrittl a) enzymatisch mittels der EG hydrolysiert. a2) the cellulose from Schhrittl a) enzymatically hydrolyzed by means of the EC.
Verfahren nach Ausführungsform 8, wobei die Kristallinität der Cellulose durch Behandlung in Schritt a1 ) mittels ionischer Flüssigkeit, Säure und/oder durch mechanischen Energieeintrag verringert wird. Process according to embodiment 8, wherein the crystallinity of the cellulose is reduced by treatment in step a1) by means of ionic liquid, acid and / or by mechanical energy input.
Verfahren nach Ausführungsform 9, wobei die ionische Flüssigkeit ausgewählt ist unter Salzen, die unterhalb einer Temperatur von 100°C flüssig sind, wie insbesondere 1 -Ethyl-3-methylimidazoliumacetat (EMIM Ac) und 3-Methyl-N- butylpyridiniumchlorid ([C4mpy]CI). Process according to embodiment 9, wherein the ionic liquid is selected from salts which are liquid below a temperature of 100 ° C, in particular 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate (EMIM Ac) and 3-methyl-N-butylpyridinium chloride ([C4mpy] CI).
Verfahren nach Ausführungsform 10, wobei man in Schritt a1 ) Cellulose in der ionischen Flüssigkeit vorlegt, ggf. unter Temperatureinwirkung, wie z.B. 20 bis 80, 25 bis 60 oder 30 bis 50 °C löst und anschließend durch Zugabe von Wasser, einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon ausfällt , den Niederschlag abtrennt ggf. wäscht und ggf. Flüssigkeit entfernt. Process according to embodiment 10, wherein in step a1) cellulose is initially introduced in the ionic liquid, optionally under the action of temperature, e.g. 20 to 80, 25 to 60 or 30 to 50 ° C dissolves and then precipitated by addition of water, an organic solvent or a mixture thereof, the precipitate separates off if necessary washes and optionally removed liquid.
Verfahren nach Ausführungsform 9, wobei in Schritt a1 ) die Säurebehandlung mit konzentrierter Phosphorsäure erfolgt. Process according to embodiment 9, wherein in step a1) the acid treatment is carried out with concentrated phosphoric acid.
Verfahren nach Ausführungsform 9, wobei in Schritt a1 ) die mechanische Behandlung mittels einer Kugelmühle z.B. mit 1 mm Glaskugeln, und/ der einer Leistungsaufnahme im Bereich von etwa 200 bis 600 oder 300 bis 500 oder etwa 400 W erfolgt. 14. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man die Behandlungsschritte, insbesondere die Schritte a1 ) und a2) ein- oder mehrfach wiederholt, bevor man das Reaktionsprodukt isoliert. 15. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Umsetzung außerdem in Gegenwart einer beta-Glucosidase durchgeführt wird. Method according to embodiment 9, wherein in step a1) the mechanical treatment takes place by means of a ball mill, for example with 1 mm glass balls, and / or a power consumption in the range of about 200 to 600 or 300 to 500 or about 400 W. 14. Method according to one of the preceding embodiments, wherein the treatment steps, in particular the steps a1) and a2), are repeated one or more times before the reaction product is isolated. 15. The method according to any one of the preceding embodiments, wherein the reaction is also carried out in the presence of a beta-glucosidase.
16. Verwendung eines Cellooligomers, hergestellt mittels eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ausführungsformen, als Zusatz zu Nahrungs- und Fut- termittel, kosmetischen oder pharmazeutischen Mitteln, als Waschmittelzusatz als Rheologiemodifizierer und als Ausgangsprodukt für organische Synthesen, 16. Use of a cellooligomer prepared by a process according to one of the preceding embodiments, as an additive to foodstuffs and feedstuffs, cosmetic or pharmaceutical agents, as detergent additive as rheology modifier and as starting material for organic syntheses,
3. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung 3.1 Enzyme - Verwendbare Endoglucanasen 3. Further Embodiments of the Invention 3.1 Enzymes - Usable Endoglucanases
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die konkret offenbarten bzw. verwendeten Proteine bzw. Enzyme mit Endoglucanase-Aktivität beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon. The present invention is not limited to the specifically disclosed or used enzymes having endoglucanase activity, but rather extends to functional equivalents thereof.
Nicht-Iimitierende Beispiele für literaturbekannte Aminosäuresequenzen erfindungsgemäß verwendeter Enzyme sind im Folgenden angegeben: Thermotoga maritima: (SEQ ID NO:1 ) Non-limiting examples of amino acid sequences of the invention used in the literature are given below: Thermotoga maritima: (SEQ ID NO: 1)
Nelson K.E. et al., "Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima." Nature 399:323-329(1999)  Nelson K.E. et al., "Evidence for lateral gene transfer between archaea and bacteria from the genome sequence of Thermotoga maritima." Nature 399: 323-329 (1999)
Uniprot: Q9X274  Uniprot: Q9X274
10 20 30 40 50 60  10 20 30 40 50 60
MNN I PRWRG FNLLEAFSIK STGNFKEEDF LWMAQWDFNF VRIPMCHLLW SDRGNPFIIR  MNN I PRWRG FNLLEAFSIK STGNFKEEDF LWMAQWDFNF VRIPMCHLLW SDRGNPFIIR
70 80 90 100 110 120  70 80 90 100 110 120
EDFFEKIDRV IFWGEKYGIH ICISLHRAPG YSVNKEVEEK TNLWKDETAQ EAFIHHWSFI  EDFFEKIDRV IFWGEKYGIH ICISLHRAPG YSVNKEVEEK TNLWKDETAQ EAFIHHWSFI
130 140 150 160 170 180  130 140 150 160 170 180
ARRYKGISST HLSFNLINEP PFPDPQIMSV EDHNSLIKRT ITEIRKIDPE RLI I IDGLGY  ARRYKGISST HLSFNLINEP PFPDPQIMSV EDHNSLIKRT ITEIRKIDPE RLI I IDGLGY
1 90 200 210 220 230 240 GNIPVDDLTI ENTVQSCRGY IPFSVTHYKA EWVDSKDFPV PEWPNGWHFG EYWNREKLLE1 90 200 210 220 230 240 GNIPVDDLTI ENTVQSCRGY IPFSVTHYKA EWVDSKDFPV PEWPNGWHFG EYWNREKLLE
250 260 270 280 2 90 300250 260 270 280 2 90 300
HYLTWIKLRQ KGIEVFCGEM GAYNKTPHDV VLKWLEDLLE IFKTLNIGFA LWNFRGPFGI HYLTWIKLRQ KGIEVFCGEM GAYNKTPHDV VLKWLEDLLE IFKTLNIGFA LWNFRGPFGI
310 320  310 320
LDSERKDVEY EEWYGHKLDR KMLELLRKY  LDSERKDVEY EEWYGHKLDR KMLELLRKY
Aspergillus niger: (SEQ ID NO:2) Aspergillus niger: (SEQ ID NO: 2)
van Peij N.N., et al., "The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger." Appl. Environ. Microbiol. van Peij N.N., et al., "The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger." Appl. Environ. Microbiol.
64:3615-3619(1998) 64: 3615-3619 (1998)
Uniprot: 074705  Uniprot: 074705
10 20 30 40 50 60  10 20 30 40 50 60
MKLPVSLAML AATAMGQTMC SQYDSASSPP YSVNQNLWGE YQGTGSQCVY VDKLSSSGAS  MKLPVSLAML AATAMGQTMC SQYDSASSPP YSVNQNLWGE YQGTGSQCVY VDKLSSSGAS
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WHTEWTWSGG EGTVKSYSNS GVTFNKKLVS DVSSIPTSVE WKQDNTNVNA DVAYDLFTAA  WHTEWTWSGG EGTVKSYSNS GVTFNKKLVS DVSSIPTSVE WKQDNTNVNA DVAYDLFTAA
130 140 150 160 170 180  130 140 150 160 170 180
NVDHATSSGD YELMIWLARY GNIQPIGKQI ATATVGGKSW EVWYGSTTQA GAEQRTYSFV  NVDHATSSGD YELMIWLARY GNIQPIGKQI ATATVGGKSW EVWYGSTTQA GAEQRTYSFV
1 90 200 210 220 230  1 90 200 210 220 230
SESPINSYSG DINAFFSYLT QNQGFPASSQ YLINLQFGTE AFTGGPATFT VDNWTASVN  SESPINSYSG DINAFFSYLT QNQGFPASSQ YLINLQFGTE AFTGGPATFT VDNWTASVN
Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO:3): Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 3):
Zhang G., et al., "Complete Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208, a Strain for Industrial Production of Guanosine and Ribavirin." J. Bacteriol. 193:3142- 3143(201 1 ) Zhang G., et al., "Complete Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208, a Strain for Industrial Production of Guanosine and Ribavirin." J. Bacteriol. 193: 3142- 3143 (201 1)
Uniprot: F4E3N1  Uniprot: F4E3N1
10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60
MKHTMELIKK LVSIPSPTGN TYEVIAYTES LLKDWGVSSY RNRKGGLFVT IPGRDDKKHR MKHTMELIKK LVSIPSPTGN TYEVIAYTES LLKDWGVSSY RNRKGGLFVT IPGRDDKKHR
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LLTAHVDTLG AMVKEIKADG RLKIDLIGGF RYNSIEGEYC EIQTSSGKTY TGTILMHQTS LLTAHVDTLG AMVKEIKADG RLKIDLIGGF RYNSIEGEYC EIQTSSGKTY TGTILMHQTS
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VHVYKDAGKA ERNQENMEVR LDEHVRTKEE TSDLGIRVGD FISFDPRVQI TPSGFIKSRH VHVYKDAGKA ERNQENMEVR LDEHVRTKEE TSDLGIRVGD FISFDPRVQI TPSGFIKSRH
1 90 200 210 220 230 240 1 90 200 210 220 230 240
LDDKASVALL LDLIRRITEE KIDLPYTTHF LISNNEEIGY GGNSNIPPET VEYLAVDMGA LDDKASVALL LDLIRRITEE KIDLPYTTHF LISNNEEIGY GGNSNIPPET VEYLAVDMGA
250 260 270 280 2 90 300 250 260 270 280 2 90 300
IGDGQSTDEY TVSICVKDAS GPYHYQLRKH LAGLAERYGI DYQLDIYPYY GSDASAAIRS IGDGQSTDEY TVSICVKDAS GPYHYQLRKH LAGLAERYGI DYQLDIYPYY GSDASAAIRS
310 320 330 340 GHDIVHGLIG PGIDASHAFE RTHELSLLNT AKLLHRYVLS PMA 310 320 330 340 GHDIVHGLIG PGIDASHAFE RTHELSLLNT AKLLHRYVLS PMA
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der erfindungsgemäß konkret verwendeten , oder hierin beschriebenen Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Endoglucanase-Aktivität, besitzen. "Functional equivalents" or analogs of the enzymes specifically used in this invention or described herein are within the scope of the present invention various polypeptides which also possess the desired biological activity, such as endoglucanase activity.
So versteht man beispielsweise unter„funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die im verwendeten Test auf Endoglucanase Aktivität eine um mindestens 1 % , wie z.B. mindestens 10% oder 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder nied- rigere Aktivität eines Enzyms, umfassend eine hierin definierte Aminosäuresequenz aufweisen. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 2 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 3 bis 10, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 25°C bis 95°Coder 20°C bis 70°C, wie z.B. etwa 45 bis 60°C oder etwa 50 bis 55°C. Thus, for example, "functional equivalents" is understood to mean enzymes which, in the test used for endoglucanase activity, have an activity which is at least 1%, for example at least 10% or 20%, such as at least 50% or 75% or 90% higher or lower activity In addition, functional equivalents are preferably stable between pH 2 to 1 and advantageously have a pH optimum in the range of pH 3 to 10, and a temperature optimum in the range of 25 ° C to 95 ° Coder 20 ° C to 70 ° C, such as about 45 to 60 ° C or about 50 to 55 ° C.
Die Endoglucanase-Aktivität kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. Carboxymethylcellulose, unter standardisierten Bedingungen bei 40 °C und einem pH von 4,5 bzw. 6, zu nennen. Endoglucanase activity can be detected by several known tests. Without being limited to this, let a test be performed using a reference substrate, such as a reference substrate. As carboxymethylcellulose, under standardized conditions at 40 ° C and a pH of 4.5 and 6, respectively.
Unter„funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch „Mutanten", welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwi- sehen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt wer- den. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zu- sammengefasst: According to the invention, "functional equivalents" are understood to mean, in particular, "mutants" which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities. "Functional equivalents" thus include the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions, and / or inversions, which changes can occur in any sequence position as long as they result in a mutant having the property profile of the invention Equivalence is also given in particular if the reactivity patterns between the mutant and the unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, identical substrates are reacted at different speeds. the. Examples of suitable amino acid substitutions are summarized in the following table:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution Original rest Examples of substitution
Ala Ser  Ala Ser
Arg Lys  Arg Lys
Asn Gin; His  Asn Gin; His
Asp Glu  Asp Glu
Cys Ser  Cys Ser
Gin Asn  Gin Asn
Glu Asp  Glu Asp
Gly Pro  Gly Pro
His Asn ; Gin  His Asn; gin
lle Leu; Val  all leuu; Val
Leu lle; Val  Hell! Val
Lys Arg ; Gin ; Glu  Lys Arg; Gin; Glu
Met Leu ; lle  Met Leu; lle
Phe Met ; Leu ; Tyr Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr Ser Thr
Thr Ser  Thr Ser
Trp Tyr  Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe  Tyr Trp; Phe
Val lle; Leu  Val lle; Leu
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch„Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie„funktionale Derivate" und„Salze" der Polypeptide. "Functional equivalents" in the above sense are also "precursors" of the described polypeptides as well as "functional derivatives" and "salts" of the polypeptides.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität. "Precursors" are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
Unter dem Ausdruck„Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. „Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen. Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, as well as salts with organic bases such as amines such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like, acid addition salts such as salts with mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids such as acetic acid and oxalic acid also the subject of the invention. "Functional derivatives" of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reacting with acyl groups.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermit- teln. Of course, "functional equivalents" also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, regions of homologous sequence regions can be determined by sequence comparison and, based on the specific requirements of the invention, equivalent enzymes can be determined.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen. "Functional equivalents" also include fragments, preferably single domains or sequence motifs, of the polypeptides of the invention having, for example, the desired biological function.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funk- tionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker oder Enzyme. "Functional equivalents" are also fusion proteins which contain one of the abovementioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further functionally different heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without substantial functional impairment of the fusion protein portions Nonlimiting examples of such heterologous sequences are, for example, signal peptides, histidine anchors or enzymes.
Erfindungsgemäß mit umfasste„funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konk- ret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homologie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfin- dungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen. Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algorithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden. Homologs to the concretely disclosed proteins according to the invention include homologs with at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98 or 99%, homology (or identity) to one of the specifically disclosed amino acid sequences calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448. A percentage homology or identity of an invented The homologous polypeptide according to the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of the amino acid sequences specifically described herein. The percent identity values can also be determined using BLAST alignments, blastp algorithm (protein-protein BLAST), or by applying the Clustal settings below.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße„funktio- nale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen. In the case of a possible protein glycosylation, "functional equivalents" according to the invention include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Muta- genese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins. Homologs of the proteins or polypeptides of the invention may be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation, extension or shortening of the protein.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispiels- weise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degene- rierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477). Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1 -7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ). Homologs of the proteins of the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants. For example, a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides. There are a variety of methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector. The use of a degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences. Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477). Several techniques for screening gene products of combinatorial libraries made by point mutations or truncation and for screening cDNA libraries for gene products having a selected property are known in the art. These techniques can be adapted to the rapid screening of gene libraries generated by combinatorial mutagenesis of homologs of the invention. The most commonly used techniques for screening large libraries that are subject to high throughput analysis include cloning the library into replicable expression vectors, transforming the appropriate cells with the resulting vector library, and expressing the combinatorial genes under conditions that demonstrate the desired activity isolation of the vector encoding the gene whose product was detected is facilitated. Recursive ensemble mutagenesis (REM), a technique that increases the frequency of functional mutants in the banks, can be used in combination with the screening assays to identify homologs (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 781 1 -7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering 6 (3): 327-331).
Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten der hierin beispielhaft verwendeten Endoglucanasen bekannt. Moreover, those skilled in the art are aware of methods for generating functional mutants of the endoglucanases exemplified herein.
Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 . Depending on the technique used, the person skilled in the art can introduce completely random or even more targeted mutations into genes or non-coding nucleic acid regions (which are important, for example, for the regulation of expression) and then generate gene banks. The molecular biological methods required for this purpose are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.
Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der durch diese codierten Proteine sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise - die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis pro- tocols. Humana Press, New Jersey), Methods for the modification of genes and thus for the modification of the proteins coded by these have long been familiar to the person skilled in the art, for example - the site-specific mutagenesis, in which one or more nucleotides of a gene are exchanged selectively (Trower MK (ed.) 1996; in vitro mutagenesis pro- tocols, Humana Press, New Jersey),
- die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler- Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Fei- genbutz M, Valcärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ), - the saturation mutagenesis, in which a codon for any amino acid can be exchanged or added at any position of a gene (cone Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22: 1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22: 541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3: 1),
- die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleo- tidsequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert - the error-prone polymerase chain reaction (error-prone PCR), in which nucleotide sequences are mutated by defective DNA polymerases (Eckert
KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739); KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18: 3739);
- die SeSaM-Methode (Sequence Saturation Method), bei der bevorzugte Austausche durch die Polymerase verhindert werden. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279  - the SeSaM method (Sequence Saturation Method), which prevents preferential exchanges by the polymerase. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279
- das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidse- quenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random muta- genesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro muta- genesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder Passing genes in mutator strains in which, for example, due to defective DNA repair mechanisms, an increased mutation rate of nucleotide sequences occurs (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using E. coli mutator strain In: Trower MK (Eds.) In Vitro Mutagenesis Protocols, Humana Press, New Jersey), or
- das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747). DNA shuffling, in which a pool of closely related genes is formed and digested, and the fragments are used as templates for a polymerase chain reaction in which repeated strand separation and recapture ultimately generate full-length mosaic genes (Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad. USA 91: 10747).
Unter Anwendung der sogenannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing in- dustrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwendung kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, bei- spielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display-Systeme. Using directed evolution (described, inter alia, in Reetz MT and Jaeger KE (1999), Topics Curr Chem 200: 31, Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing Industrial Enzymes by Direc- tive Evolution, in: Demain AL, Davies JE (eds.) Manual of indus- trial microbiology and biotechnology), the expert can also generate functional mutants in a targeted manner and also on a large scale In a first step, first gene libraries of the respective proteins are generated, using, for example, the abovementioned methods The gene banks are expressed in a suitable manner, for example by bacteria or by phage display systems.
Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese iterative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen , wie z.B. 1 bis 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern. Zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäß brauchbarer Endoglucanasen sind insbesondere entsprechende Expressionskonstrukte einsetzbar. The respective genes of host organisms expressing functional mutants with properties which largely correspond to the desired properties can be subjected to another round of mutation. The steps of the mutation and the selection or screening can be repeated iteratively until the functional mutants present have the desired properties to a sufficient extent. By means of this iterative procedure, a limited number of mutations, such as 1 to 5 mutations, can be carried out step by step and evaluated and selected for their influence on the relevant enzyme property. The selected mutant can then be subjected in the same way to a further mutation step. This significantly reduces the number of single mutants to be studied. For the recombinant production of endoglucanases useful according to the invention, appropriate expression constructs can be used in particular.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsge- mäßes Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. The invention also relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for an enzyme according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
Unter einer„Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierin definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer „regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein. According to the invention, an "expression unit" is understood as meaning a nucleic acid with expression activity which comprises a promoter as defined herein and, after functional linkage with a nucleic acid or a gene to be expressed, regulation of expression, ie transcription and translation, of said nucleic acid or gene In this context, therefore, one speaks of a "regulatory nucleic acid sequence". In addition to the promoter, other regulatory elements, e.g. Enhancers, be included.
Unter einer„Expressionskassette" oder„Expressionskonstrukt" wird erfindungsgemäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit umfasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen. Die Begriffe "Expression" oder„Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einem„Promotor", einer„Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer„Promotorsequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert. Unter einer„funktionellen" oder„operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Termina- tor, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevor- zugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein. Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete re- gulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). An "expression cassette" or "expression construct" is understood according to the invention to mean an expression unit which is functionally linked to the nucleic acid to be expressed or to the gene to be expressed. Thus, unlike an expression unit, an expression cassette comprises not only nucleic acid sequences that regulate transcription and translation, but also the nucleic acid sequences that are to be expressed as a protein as a result of transcription and translation. The terms "expression" or "overexpression" in the context of the invention describe the production or increase of the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by introducing a gene into an organism replace existing gene with another gene, increase the copy number of the gene (s), use a strong promoter, or use a gene encoding a corresponding enzyme with a high activity and, if desired, combine these measures 5'-upstream of the respective coding sequence, a promoter and 3'-downstream, a terminator sequence and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.under a "promoter", a "nucleic acid with promoter activity" or a " Promotorsequ enz "is understood according to the invention as a nucleic acid which regulates the transcription of this nucleic acid in functional linkage with a nucleic acid to be transcribed. A "functional" or "operative" linkage in this context means, for example, the sequential arrangement of one of the nucleic acids with promoter activity and a nucleic acid sequence to be transcribed and, if appropriate, further regulatory elements, for example nucleic acid sequences which ensure the transcription of nucleic acids, and, for example a terminator, such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transcription of the nucleic acid sequence. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as enhancer sequences, may also exert their function on the target sequence from more distant locations or even from other DNA molecules. Preference is given to arrangements in which the nucleic acid sequence to be transcribed is positioned behind (ie at the 3 'end) of the promoter sequence, so that both sequences are covalently linked to one another. The distance between the promoter sequence and the transgenic nucleic acid sequence to be expressed may be less than 200 base pairs, or less than 100 base pairs or less than 50 base pairs. In addition to promoters and terminators, examples of other regulatory elements include targeting sequences, enhancers, polyadenylation signals, selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere solche, in denen die kodierende Sequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafter- weise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden. Nucleic acid constructs according to the invention comprise, in particular, those in which the coding sequence with one or more regulatory signals is advantageously used for the control, e.g. Increased, the gene expression was operatively or functionally linked.
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. In addition to these regulatory sequences, the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically altered so that natural regulation is eliminated and expression of genes increased. However, the nucleic acid construct can also be simpler, ie no additional regulatory signals have been inserted before the coding sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein. A preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the already mentioned "enhancer" sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators. The nucleic acids of the invention may be contained in one or more copies in the construct. The construct may also contain further markers, such as antibiotic resistance or auxotrophic complementing genes, optionally for selection on the construct.
Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet- , trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq" T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram- negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefeoder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden. Examples of suitable regulatory sequences are promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq " T7-, T5-, T3-, gal-, trc, ara, rhaP (rhaP B AD) SP6, lambda P R - or contained in the lambda P L promoter, which are advantageously in gram- find negative bacteria application. Further advantageous regulatory sequences are included, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. It is also possible to use artificial promoters for regulation.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pl N-l 111 3-B 1 , Agt1 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB1 10, pC194 oder pBD214, in Corynebac- terium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 . Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden. The nucleic acid construct, for expression in a host organism, is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which allows for optimal expression of the genes in the host. Vectors other than plasmids and phages are also all other vectors known to those skilled in the art, ie viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention. Suitable plasmids are described, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pl NI 11 1 3 -B 1, Agt1 1 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB1 10, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, pIL1 or pBB1 16, in yeasts 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLYe23 or in plants pLGV23, pGHIac + , pBIN19, pAK2004 or pDH51. The plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ).
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts- Organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen. Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Codonnutzung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln. In a further embodiment of the vector, the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced in the form of a linear DNA into the microorganisms and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination. This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or of the nucleic acid according to the invention. For optimal expression of heterologous genes in organisms, it is advantageous to modify the nucleic acid sequences according to the specific "codon usage" used in the organism. The "codon usage" can be easily determined by computer evaluations of other known genes of the organism concerned.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal. For this purpose, common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pou- weis P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. The recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host. Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouweis P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendbaren Endogluca- nasen eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Proto- plastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben. With the aid of the vectors according to the invention, recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the endoglucanases which can be used according to the invention. Advantageously, the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed. In this case, it is preferred to use familiar cloning and transfection methods known to the person skilled in the art, for example co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, in order to express the stated nucleic acids in the respective expression system. Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, beson- ders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden In principle, all prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention. Advantageously, microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms. Advantageously, gram-positive or gram-negative bacteria, preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, more preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium or Rhodococcus used , Very particularly preferred is the genus and species Escherichia coli. Further beneficial bacteria are also found in the group of alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der für eine Endoclucanase kodierenden Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit En- doglucanase-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren. The host organism or the host organisms according to the invention preferably contain at least one of the endoclucanase-encoding nucleic acid sequences, nucleic acid constructs or vectors which encode an enzyme having an endoglucanase activity as defined above.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stick- stoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann„batch"-weise,„semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäß einsetzbarer Endoglucanasen oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wird ein dieses Enzym produzierender Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression des Enzyms induziert und dieses aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. The organisms used in the method according to the invention are grown or grown, depending on the host organism, in a manner known to those skilled in the art. Microorganisms are generally contained in a liquid medium which contains a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins. at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted under oxygen fumigation. In this case, the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is regulated during the cultivation or not. The cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously. For the recombinant production of endoglucanases or functional, biologically active fragments thereof which can be used according to the invention, a microorganism producing this enzyme is cultured, optionally the expression of the enzyme is induced and this is isolated from the culture. The polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1 . Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden. Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten. Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente. The microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or batchwise in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process). A summary of known cultivation methods is in the textbook by Chmiel (Bioprozesstechnik 1st Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook of Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) Find. The culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981). These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cel- lulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides. Very good sources of carbon are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose. Sugar can also be added to the media via complex compounds, such as molasses, or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources. Other possible sources of carbon are oils and fats such. B. soybean oil. Sunflower oil. Peanut oil and coconut fat, fatty acids such. As palmitic acid, stearic acid or linoleic acid, alcohols such. As glycerol, methanol or ethanol and organic acids such. As acetic acid or lactic acid. Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds. Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soybean protein, yeast extract, meat extract and others. The nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organi- sehe Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden. As sulfur source inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic see sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Py- ridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Prac- tical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen. Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution. Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid. The fermentation media used according to the invention usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine. Growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like. In addition, suitable precursors can be added to the culture medium. The exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information about the media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practice". Growth Approaches can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder char- genweise hinzugegeben werden. All media components are sterilized either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration. The components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or in batches as desired.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabi- lität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Pro- duktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. The temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment. The pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0. The pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid. To control the development of foam anti-foaming agents, such as. As fatty acid polyglycol, are used. In order to maintain the stability of plasmids, suitable selective substances, such as e.g. As antibiotics, are added. In order to maintain aerobic conditions, oxygen or oxygen-containing gas mixtures, such. B. ambient air, registered in the culture. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C and. The culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentri- fugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. The fermentation broth is then further processed. Depending on the requirement, the biomass can be wholly or partly by separation methods, such. Centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods are removed from the fermentation broth or left completely in it.
Man kann die Zellen auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufschließen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden. Also, if the polypeptides are not secreted into the culture medium, the cells may be disrupted and the product digested by known protein isolation techniques obtained from the lysate. Optionally, the cells may be disrupted by high frequency ultrasound, by high pressure such as in a French pressure cell, by osmolysis, by detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the listed procedures.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben. Purification of the polypeptides may be accomplished by known chromatographic techniques such as molecular sieve chromatography (gel filtration) such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional techniques such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, T.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind bei- spielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. It may be advantageous to use for isolation of the recombinant protein vector systems or oligonucleotides which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus encode altered polypeptides or fusion proteins, e.g. serve a simpler cleaning. Such suitable modifications are, for example, so-called "tags", such as anchors. the modification or epitopes known as hexa-histidine anchors, which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press ). These anchors may be used to attach the proteins to a solid support, e.g. a polymer matrix, which may for example be filled in a chromatography column, or used on a microtiter plate or on another carrier.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarb- Stoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden. Die Endoglucanase kann frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A- 1 149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustau- schermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformalde- hydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Endoglucana- se als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobilisierte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin„Immobilization of Enzymes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Cataly- sis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben. At the same time, these anchors can also be used to detect the proteins. In addition, conventional markers, such as fluorescent dyes, enzyme markers which upon reaction with a substrate form a detectable reaction product, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to identify the proteins for the derivation of the proteins. The endoglucanase can be used freely or immobilized. An immobilized enzyme is an enzyme which is fixed to an inert carrier. Suitable support materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. The disclosure of these documents is hereby incorporated by reference in its entirety. Suitable support materials include, for example, clays, clay minerals such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silica, alumina, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powders, anion exchange materials, synthetic polymers such as polystyrene, acrylic resins, phenolformaldehyde resins, polyurethanes and polyolefins such as polyethylene and polypropylene. The support materials are usually used to prepare the supported enzymes in a finely divided, particulate form, with porous forms being preferred. The particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (grading curve). Similarly, when using endoglucanase as a whole-cell catalyst, a free or immobilized form can be selected. Carrier materials are, for example, calcium alginate and carrageenan. Enzymes as well as cells can also be cross-linked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs). Corresponding and further immobilization processes are described, for example, in J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalyst in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim described.
3.2 Cellooligomerherstellung 3.2 Cellooligomer Production
Die Herstellung der Cellooliogomere erfolgt durch ein- oder mehrfache enzymatische Hydrolyse mittels Endoglucanasen ggf kombiniert mit einer Behandlung der Cellulose durch ionische Flüssigkeiten und /oder mechanische Behandlung. Die optimale Reihenfolge kann vom Fachmann durch einfache Vorversuche bestimmt werden. a) Behandlung der Cellulose mit ionischen Flüssigkeiten The preparation of the celloologomers is carried out by single or multiple enzymatic hydrolysis by means of endoglucanases optionally combined with a treatment of the cellulose by ionic liquids and / or mechanical treatment. The optimal sequence can be determined by the skilled person by simple preliminary tests. a) Treatment of cellulose with ionic liquids
Die Cellulose wird hierzu z.B. in kaltem EMIM Ac suspendiert. Dazu werden z.B. 0,02 g Cellulose pro ml_ EMIM Ac aufgeheizt, bis die Flüssigkeit klar wird. Anschließend wird die Cellulose mit Wasser gefällt. Die ausgefällte Cellulose wird über eine Vakuum- filtrierung von der ionischen Flüssigkeit und dem zum Fällen eingesetzten Wasser getrennt. Anschließend wird die Cellulose mit Wasser gewaschen. b) Mechanische Behandlung der Cellulose For this purpose, the cellulose is suspended, for example, in cold EMIM Ac. For example, 0.02 g of cellulose per ml of EMIM Ac are heated until the liquid becomes clear. Subsequently, the cellulose is precipitated with water. The precipitated cellulose is passed through a vacuum filtered from the ionic liquid and the water used for precipitation. Subsequently, the cellulose is washed with water. b) Mechanical treatment of the cellulose
10 % ( w/w ) Cellulose wird in dest. Wasser suspendiert. Eine Kugelmühle (z.B. Bead- beater, Biospec Products) wird nach Anleitung mit 1 mm Glaskugeln vorbereitet, mit der Cellulosesuspension befüllt und gemahlen. Nach Abkühlen wird die Cellulose erneut gemahlen. Dieser Vorgang wird auf Eis mehrmals wiederholt. Anschließend wird die Cellulose mit dest. Wasser aus den Glaskugeln herausgewaschen, bis das Waschwasser klar wird. Die ausgewaschene Suspension wird aufgefangen und daraufhin zentrifugiert. Das Wasser wird von der vorbehandelten Cellulose abdekantiert und die Cellulose für die enzymatische Hydrolyse eingesetzt. c) Enzymatische Hydrolyse der Cellulose 10% (w / w) cellulose is dissolved in dist. Water suspended. A ball mill (e.g., Beadbeater, Biospec Products) is prepared according to instructions with 1mm glass beads, filled with the cellulosic suspension, and ground. After cooling, the cellulose is ground again. This process is repeated several times on ice. Subsequently, the cellulose with dist. Wash water out of the glass balls until the wash water clears. The washed out suspension is collected and then centrifuged. The water is decanted from the pretreated cellulose and the cellulose used for the enzymatic hydrolysis. c) Enzymatic hydrolysis of the cellulose
Für die enzymatische Hydrolyse wird frisch vorbehandelte Cellulose eingesetzt.. Für die Hydrolyse wird ein geeigneter Puffer (Acetat-, Phosphat- oder Tris-Puffer, 0,01 bis 0,25 M, pH 4 bis 7 ) vorbereitet, z.B. 0,1 M Na-Acetatpuffer pH 4,5 und 0,1 M Na-K- Phosphatpuffer pH 6. Die Pufferkonzentration und der pH-Wert können durch wenige Vorversuche optimal eingestellt werden. Freshly pretreated cellulose is used for enzymatic hydrolysis. For the hydrolysis, a suitable buffer (acetate, phosphate or Tris buffer, 0.01 to 0.25 M, pH 4 to 7) is prepared, e.g. 0.1 M Na acetate buffer pH 4.5 and 0.1 M Na-K phosphate buffer pH 6. The buffer concentration and the pH value can be optimally adjusted by a few preliminary experiments.
Die Cellulasen werden in der gewünschten Konzentration in Puffer gelöst. Der abgewogenen Cellulose wird die Cellulaselösung zugefügt und für einige Sekunden im Vor- texer gemischt. Falls nicht anders angegeben werden etwa 10 mg (Trockengewicht) Cellulose in 2 ml_ Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit 1 ml_ Cellulaselösung für die Hydrolyse verwendet, welche in einem Thermomixer bei 40 °C und 800 min-1 für die gewünschte Zeit inkubiert werden. Zum Abbruch der Reaktion werden die Proben 3 min bei 14000 min-1 in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Eine entsprechende Durchfüh- rung in größeren Ansätzen ist ebenfalls nach einigen routinemäßigen Vorversuchen möglich. c) Weitere enzymatische Hydrolyse Um unvollständig hydrolysierte Cellulose weiter abzubauen, kann bereits hydrolysierte Cellulose nochmals mit ionischer Flüssigkeit behandelt und die behandelte Cellulose erneut einer enzymatischen Hydrolyse unterzogen werden. Diese wird wie oben beschrieben nach Vorbehandlung mit ionischer Flüssigkeit, ebenfalls wie oben beschrie- ben, durchgeführt. The cellulases are dissolved in buffer in the desired concentration. The weighed cellulose is added to the cellulase solution and mixed for a few seconds in advance. Unless otherwise stated, about 10 mg (dry weight) of cellulose are used in 2 ml Eppendorf tubes with 1 ml cellulase solution for hydrolysis, which are incubated in a thermomixer at 40 ° C. and 800 min -1 for the desired time. To stop the reaction, the samples are centrifuged for 3 min at 14000 min -1 in a bench top centrifuge. A corresponding implementation in larger batches is also possible after some routine preliminary tests. c) Further enzymatic hydrolysis In order to further reduce incompletely hydrolyzed cellulose, already hydrolyzed cellulose can be treated again with ionic liquid and the treated cellulose can again be subjected to enzymatic hydrolysis. This is carried out as described above after pretreatment with ionic liquid, likewise as described above.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf folgende spezielle Ausführungsformen im Experimentgellen Teil näher erläutert. 3.3 Anwendungen The invention will now be explained in more detail with reference to the following specific embodiments in Experimental part. 3.3 Applications
Anwendungsgebiete - ohne diese durch diese Aufzählung einschränken zu wollen, liegen z.B. im Bereich der Faserverstärkung oder der Modifikation von grenzflächenaktiven Substanzen bzw. Rezepturen (Entschäumer, Rheologie-modifizierende Agenzien etc.). Areas of application - without wishing to be limited by this list, are e.g. in the field of fiber reinforcement or the modification of surface-active substances or formulations (defoamers, rheology-modifying agents, etc.).
Experimenteller Teil  Experimental part
I. Materialien Cellulosen: I. Materials Celluloses:
Erfindungsgemäß wurden verschiedene Cellulosesubstrate mit unterschiedlichem Eigenschaftsprofil verwendet. Die Cellulosesubstrate unterscheiden sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades beziehungsweise ihrer Kettenlängenverteilung sowie ihres Kristallinitätsgrades und der verfügbaren Oberfläche. In Tabelle 1 ist eine Übersicht der verwendeten Substrate dargestellt. Different cellulose substrates with different property profiles were used according to the invention. The cellulose substrates differ in terms of their degree of polymerization or their chain length distribution and their degree of crystallinity and the available surface. Table 1 shows an overview of the substrates used.
Tabelle 1 .: Die verwendeten Cellulosesubstrate und deren Eigenschaften Table 1: The cellulose substrates used and their properties
und DPN wurde mit der hierin beschriebenen GPCW ermittelt. and DPN was determined with the GPC W described herein.
Der Polymerisationsgrad und die Kettenlangenverteilung eines Cellulosesubstrates werden mittels GPC bestimmt. Für diese Messung wurden die Proben nach bisherigen Methoden derivatisiert und anschließend mittels GPC vermessen [Rinaldiet al. Angewandte Chemie-International Edition, 47(42):8047-8050, 2008, Rinaldi et al.,Chemsuschem, 3(2):266-276, 2010]. Die erfindungsgemäß analysierten Proben müssen für die Messung per GPC aufgrund einer alternativen GPC-Methode [Engel et al. 2012, Biotechnology for Biofuels 5:77] nicht mehr derivatisiert werden. In Tabelle 1 ist der ermittelte Polymerisationsgrad der Substrate mit dem erfindungsgemäß verwendeten GPC Messsystem aufgeführt. Enzyme: The degree of polymerization and the chain length distribution of a cellulose substrate are determined by GPC. For this measurement, the samples were derivatized according to previous methods and then measured by GPC [Rinaldiet al. Angewandte Chemie International Edition, 47 (42): 8047-8050, 2008, Rinaldi et al., Chemsuschem, 3 (2): 266-276, 2010]. The samples analyzed according to the invention have to be analyzed for GPC by an alternative GPC method [Engel et al. 2012, Biotechnology for Biofuels 5:77] are no longer derivatized. Table 1 shows the determined degree of polymerization of the substrates with the GPC measuring system used according to the invention. enzymes:
Tabelle 2.: Übersicht über die verwendeten Cellulasen von Megazyme Inc. Table 2: Overview of the cellulases used by Megazyme Inc.
II. Apparaturen Tabelle 3.: Geräte der organischen GPC II. Apparatus Table 3 .: Devices of the organic GPC
Tabelle 5.: HPLC Geräte Table 5 .: HPLC devices
Gerätetyp Hersteller Modell Device Type Manufacturer Model
Detektor Shodex RI-71 UVD340S (210, 220,  Shodex RI-71 UVD340S detector (210, 220,
230 und 300)  230 and 300)
Säulenofen Dionex STH 585  Column oven Dionex STH 585
Autosampier Gilson 232XL  Autosampler Gilson 232XL
Pumpe Dionex P580 HPLC Säule CS-Chromatographie SerOrganic Acid-Resin 250 x vice 8mm inkl. VorsäulePump Dionex P580 HPLC column CS chromatography SerOrganic Acid-Resin 250 x vice 8mm incl. Precolumn
Software Dionex Chromeleon Analysesoftware Software Dionex Chromeleon analysis software
III. Methoden 1. Vorbehandlung der Cellulose mit ionischen Flüssigkeiten III. Methods 1. Pre-treatment of cellulose with ionic liquids
Die Cellulose wird in kaltem EMIM Ac suspendiert. Dazu werden 0,75 g Cellulose pro 50 mL EMIM Ac für mindestens 40 min auf 80 °C aufgeheizt, bis die Flüssigkeit klar wird. Anschließend wird die Cellulose mit 400 mL Wasser gefällt. Die ausgefällte Cellu- lose wird über eine Vakuumfiltrierung, bei der ein Celluloseacetatfilter mit 0.2 μηη Porengröße eingesetzt wird, von der ionischen Flüssigkeit und dem zum Fällen eingesetzten Wasser getrennt. Anschließend wird die Cellulose 3-mal mit 500 mL Wasser gewaschen. 2. Mechanische Vorbehandlung der Cellulose The cellulose is suspended in cold EMIM Ac. For this, 0.75 g of cellulose per 50 mL of EMIM Ac are heated to 80 ° C for at least 40 minutes until the liquid becomes clear. The cellulose is then precipitated with 400 ml of water. The precipitated cellulose is separated from the ionic liquid and the water used for precipitation by means of a vacuum filtration in which a 0.2 .mu.η pore size cellulose acetate filter is used. Subsequently, the cellulose is washed 3 times with 500 ml of water. 2. Mechanical pretreatment of the cellulose
10 % ( w ) Cellulose wird in dest. Wasser suspendiert. Die Kugelmühle (Beadbeater, Biospec Products) wird nach Anleitung mit 1 mm Glaskugeln vorbereitet, mit der Cellu- losesuspension befüllt und 3 min gemahlen. Danach muss die Kugelmühle 3 min ab- kühlen, bis die Cellulose erneut gemahlen werden kann. Dieser Vorgang wird auf Eis fünfmal durchgeführt. Anschließend wird die Cellulose mit dest. Wasser aus den Glaskugeln herausgewaschen, bis das Waschwasser klar wird. Die ausgewaschene Suspension wird aufgefangen und daraufhin 3 min bei 4000 min-1 (Rotina 35R) zentrifu- giert. Das Wasser wird von der vorbehandelten Cellulose abdekantiert und die Cellulo- se für die enzymatische Hydrolyse eingesetzt. 10% (w) of cellulose is dissolved in dist. Water suspended. The ball mill (Beadbeater, Biospec Products) is prepared according to instructions with 1 mm glass beads, filled with the cellulosic suspension and ground for 3 min. Thereafter, the ball mill must cool for 3 minutes until the cellulose can be ground again. This process is performed on ice five times. Subsequently, the cellulose with dist. Wash water out of the glass balls until the wash water clears. The washed suspension is collected and then alternates 3 min at 4000 min -1 (Rotina 35R) centrifuge. The water is decanted from the pretreated cellulose and the cellulase used for the enzymatic hydrolysis.
3. Enzymatische Hydrolyse der Cellulose 3. Enzymatic hydrolysis of the cellulose
Für die enzymatische Hydrolyse wird frisch vorbehandelte Cellulose eingesetzt. Da die Cellulose nach der Vorbehandlung nicht getrocknet wird, muss das Nassgewicht in Trockengewicht umgerechnet werden. Hierzu ist es nicht möglich, durch Trocknung eines Teils der vorbehandelten Cellulose vorab das Trockengewicht zu bestimmen, da dies mehrere Tage in Anspruch nimmt. Zur Berechnung des Quellfaktors wird daher von 5 % Celluloseverlust durch die Vorbehandlung ausgegangen. Das Nassgewicht der vorbehandelten Cellulose wird ermittelt und durch 95% des für die Vorbehandlung eingesetzten Gewichtes geteilt. Der ermittelte Quellfaktor dient im Folgenden zur Berechnung der benötigten Menge an vorbehandelter feuchter Cellulose. Da das Nassgewicht nach der Vorbehandlung variieren kann, muss dieser Faktor nach jeder Vorbehandlung neu bestimmt werden. Für die Hydrolyse wird 0,1 M Na-Acetatpuffer pH 4,5 und 0,1 M Na-K- Phosphatpuffer pH 6 vorbereitet. For the enzymatic hydrolysis fresh pretreated cellulose is used. Since the cellulose is not dried after the pretreatment, the wet weight must be converted to dry weight. For this it is not possible by drying To determine a part of the pretreated cellulose in advance the dry weight, as this takes several days to complete. For the calculation of the swelling factor, therefore, 5% cellulose loss is assumed by the pretreatment. The wet weight of the pretreated cellulose is determined and divided by 95% of the weight used for the pretreatment. The determined swelling factor is used in the following to calculate the required amount of pretreated moist cellulose. Since the wet weight may vary after pretreatment, this factor must be re-determined after each pretreatment. For the hydrolysis, 0.1 M Na acetate buffer pH 4.5 and 0.1 M Na-K phosphate buffer pH 6 are prepared.
Die Endoglucanasen aus A. niger, T. longibrachiatum und T. emersonii, sowie die ß- Glucosidase aus A. niger werden in der gewünschten Konzentration in Na- Acetat- puffer gelöst. Die Endoglucanasen aus T. maritima und B. amyloliquefaciens werden in der gewünschten Konzentration in Na-K-Phosphatpuffer gelöst. Der abgewogenen Cellulose wird die Cellulaselösung zugefügt und für einige Sekunden im Vortexer gemischt. Falls nicht anders angegeben werden 10 mg (Trockengewicht) Cellulose in 2 ml_ Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit 1 ml_ Cellulaselösung für die Hydrolyse verwendet, welche in einem Thermomixer bei 40 °C und 800 min-1 für die gewünschte Zeit inkubiert werden. Zum Abbruch der Reaktion werden die Proben 3 min bei 14000 min-1 in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand abgenommen und in ein weiteres Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Das Pellet sowie der Überstand werden bei -80 °C eingefroren und können später analysiert werden. The endoglucanases from A. niger, T. longibrachiatum and T. emersonii, and A. niger β-glucosidase are dissolved in the desired concentration in Na acetate buffer. The endoglucanases from T. maritima and B. amyloliquefaciens are dissolved in the desired concentration in Na-K phosphate buffer. The weighed cellulose is added to the cellulase solution and vortexed for a few seconds. Unless otherwise stated, 10 mg (dry weight) of cellulose in 2 ml Eppendorf tubes with 1 ml cellulase solution are used for the hydrolysis, which are incubated in a thermomixer at 40 ° C. and 800 min -1 for the desired time. To stop the reaction, the samples are centrifuged for 3 min at 14000 min -1 in a bench top centrifuge, the supernatant removed and transferred to another Eppendorf reaction vessel. The pellet and the supernatant are frozen at -80 ° C and can be analyzed later.
4. Zweite enzymatische Hydrolyse nach erneuter Vorbehandlung mit ionischer Flüssigkeit (IL-Restart) 4. Second enzymatic hydrolysis after renewed pretreatment with ionic liquid (IL restart)
Um unvollständige Cellulosehydrolyse aufgrund von strukturellen Eigenschaften oder Veränderungen der Cellulose, wie z.B. Kristallinität oder Rekristallinität zu untersuchen, wird bereits hydrolysierte Cellulose nochmals mit ionischer Flüssigkeit behandelt und die behandelte Cellulose erneut einer enzymatischen Hydrolyse unterzogen. Der IL-Restart wird nach der Hydrolyse von mit ionischen Flüssigkeiten vorbehandelter Cellulose durchgeführt. Für beide Hydrolyseschritte kommen 10 U/mL Endoglucanase und 3 U/mL ß-Glucosidase in den entsprechenden Puffern zum Einsatz. Da frisch hydrolysierte Cellulose für den IL-Restart eingesetzt wird, wird der Celluloseverlust nach der Hydrolyse berechnet. Hierzu muss zuvor der Celluloseverlust nach der Hydrolyse der fünf eingesetzten Endoglucanasen bestimmt werden (siehe unten). Der ermittelte Celluloseverlust wird verwendet, um zu berechnen, wie groß die Menge an Cellulose nach der Hydrolyse ist (Trockengewicht). Das nach der Hydrolyse erhaltene Pellet wird in EMIM Ac bei 80 °C 2 h aufgelöst. Die benötigte Menge an EMIM Ac hängt von der Menge und dem Feuchtigkeitsgehalt der Cellulose ab, weil das in den Celluloseproben vorhandene Wasser das Celluloselösungsvermögen von EMIM Ac herabsetzt. Anschließend wird die Cellulose aus EMIM Ac durch Zugabe von Wasser gefällt. Die Cellulose wird dreimal mit Wasser gewaschen. Zum Abtrennen der Flüssigkeit wird die Cellulose 3 min bei 4000 min-1 (Rotina 35R) zentrifugiert und die Flüssigkeit anschließend abdekantiert. Durch Wiegen wird das Nassgewicht der Celluloseproben bestimmt. Das ermittelte Nassgewicht der Proben und die berechneten Trockengewichte nach der Hydrolyse werden verwendet, um den Quellfaktor der Proben zu bestimmen. Die mit diesem Verfahren von der Cellulase gereinigte Cellulose wird anschließend für eine zweite Hydrolyse eingesetzt Zur Bestimmung der Nassgewichte der Cellulose wird der zuvor bestimmte Quellfaktor verwendet. In order to investigate incomplete cellulose hydrolysis due to structural properties or changes in the cellulose, such as crystallinity or recrystallinity, already hydrolyzed cellulose is again treated with ionic liquid and the treated cellulose is again subjected to enzymatic hydrolysis. The IL restart is carried out after the hydrolysis of cellulose pretreated with ionic liquids. For both hydrolysis steps, 10 U / mL endoglucanase and 3 U / mL β-glucosidase are used in the respective buffers. Since freshly hydrolyzed cellulose is used for the IL restart, the cellulose loss after hydrolysis is calculated. For this, the loss of cellulose after the hydrolysis of the five endoglucanases used has to be determined beforehand (see below). The determined cellulose loss is used to calculate the amount of cellulose after hydrolysis (dry weight). The pellet obtained after the hydrolysis is dissolved in EMIM Ac at 80 ° C for 2 h. The amount of EMIM Ac required depends on the amount and moisture content of the cellulose because the water present in the cellulose samples decreases the cellulose solubility of EMIM Ac. Subsequently, the cellulose is precipitated from EMIM Ac by addition of water. The cellulose is washed three times with water. To separate the liquid, the cellulose is centrifuged for 3 min at 4000 min -1 (Rotina 35R) and the liquid is then decanted off. Weighing determines the wet weight of the cellulose samples. The determined wet weight of the samples and the calculated dry weights after hydrolysis are used to determine the swelling factor of the samples. The cellulose purified by cellulase using this method is then used for a second hydrolysis. To determine the wet weights of the cellulose, the previously determined swelling factor is used.
IV. Analysemethoden IV. Methods of analysis
1. Organische Gelpermeationschromatographie 1. Organic gel permeation chromatography
Mit der organischen Gelpermeationschromatographie (GPC0) wird die Kettenlängen- verteilung von Celluloseproben bestimmt. Für die GPC0 werden die aus der Hydrolyse erlangten Celluloseproben lyophilisiert und das Lyophilisat anschließend bei 80 °C in DMF/19 % (v/v) EMIM Ac gelöst. Die gelöste Cellulose wird durch einen 0,1 μηη PT- FE Filter filtriert und in HPLC Glasgefäße überführt. Zur Analyse wurde eine GPC0 Anlage mit den oben aufgeführten Geräten (Tab. 3) unter folgenden Bedingungen verwendet. Organic gel permeation chromatography (GPC 0 ) determines the chain length distribution of cellulose samples. For the GPC 0 , the cellulose samples obtained from the hydrolysis are lyophilized and the lyophilizate is subsequently dissolved at 80 ° C. in DMF / 19% (v / v) EMIM Ac. The dissolved cellulose is filtered through a 0.1 μηη PT-FE filter and transferred to HPLC glassware. For analysis, a GPC 0 system was used with the devices listed above (Table 3) under the following conditions.
Betriebsparameter Konfiguration Operating parameter configuration
Laufmittel DMF/10 % EMIM Ac (v/v)  Eluent DMF / 10% EMIM Ac (v / v)
Betriebstemperatur 50 °C  Operating temperature 50 ° C
Fluss 0,5 mL/min Die Detektion der Konzentration erfolgt über einen Rl- Detektor. Die Bestimmung der molaren Masse der Celluloseketten erfolgt über einen Streulichtdetektor. Die Nach- weisgrenze von Cellooligomeren liegt bei einem Polymerisationsgrad von ca. 10. Sowohl der DPW als auch der DPN wird mit Hilfe der ASTRA Software ermittelt. Flow 0.5 mL / min The detection of the concentration takes place via a RI detector. The determination of the molar mass of the cellulose chains takes place via a scattered-light detector. The detection limit of cellooligomers lies at a degree of polymerization of approx. 10. Both the DP W and the DP N are determined using the ASTRA software.
2. Wässrige Gelpermeationschromatographie 2. Aqueous gel permeation chromatography
Mit der wässrigen Gelpermeationschromatographie (GPCW) wird die Zusammensetzung der im wässrigen Überstand der Hydrolyse befindliche Zucker bestimmt werden. Für die wässrige GPC werden die aus der Hydrolyse erlangten Überstände sterilfiltriert (0,2 μηη) und in HPLC Glasgefäße überführt. Zur Analyse wird eine GPC Anlage mit den Komponenten nach Tabelle 4 unter folgenden Bedingungen With the aqueous gel permeation chromatography (GPC W ), the composition of the sugar present in the aqueous supernatant of the hydrolysis is determined. For the aqueous GPC, the supernatants obtained from the hydrolysis are sterile-filtered (0.2 μηη) and transferred into HPLC glass vessels. For analysis, a GPC system with the components according to Table 4 under the following conditions
verwendet. Zur Kalibrierung werden Glucose und Cellooligomere (Cellobiose [C2] bis Cellohexaose [C6]) der Firma Megazyme (Irland) eingesetzt. Die Retentionszeit liegt bei 27 bis 31 ,5 min. Die Detektion der Analyten erfolgt über einen Rl- Detektor. used. For calibration, glucose and cellooligomers (cellobiose [C2] to cellohexaose [C6]) from Megazyme (Ireland) are used. The retention time is 27 to 31, 5 min. The detection of the analytes via a Rl detector.
3. Trockenmassebestimmung Um die genaue Menge der zur Hydrolyse eingesetzten Cellulose nachträglich zu bestimmen, wird eine Trockenmassebestimmung der vorbehandelten Cellulose durchgeführt. Hierfür werden Eppendorfreaktionsgefäße beschriftet und bei 80 °C für 3 d getrocknet. Nach der Notierung des Gewichtes wird das Eppendorfreaktionsgefäß mit einer bestimmten Menge nasser Cellulose befüllt und das Gewicht notiert. Daraufhin wird das befüllte Eppendorfreaktionsgefäß bei 80 °C getrocknet. Nach dem Trocknen wird das Eppendorfreaktionsgefäß erneut gewogen. Aus dem Leergewicht, dem Nassgewicht und dem Trockengewicht wird der Quellfaktor bestimmt werden. Da für alle Versuche frisch vorbehandelte Cellulose verwendet wird, dient der ermittelte Quellfaktor lediglich der nachträglichen Überprüfung der für die Hydrolyseversuche berechne- ten Werte. 3. Dry Mass Determination In order to subsequently determine the exact amount of cellulose used for the hydrolysis, a dry mass determination of the pretreated cellulose is carried out. For this Eppendorf reaction vessels are labeled and dried at 80 ° C for 3 d. After listing the weight, the Eppendorf reaction tube is filled with a certain amount of wet cellulose and the weight noted. Then the filled Eppendorf reaction vessel is dried at 80 ° C. After drying the Eppendorf reaction vessel is weighed again. From the curb weight, the wet weight and the dry weight, the swelling factor will be determined. Since freshly pretreated cellulose is used for all tests, the determined swelling factor merely serves to retrospectively check the values calculated for the hydrolysis tests.
Quellfaktor = Nassgewicht / Trockengewicht Swelling factor = wet weight / dry weight
4. Celluloseverlustbestimmung 4. Cellulose loss determination
Mit der Celluloseverlustbestimmung kann ermittelt werden, wieviel der Cellulose in lösliche Zucker und Cellooligomere abgebaut wird. Zur Celluloseverlustbestimmung werden 30 mg Trockenmasse Cellulose nach der oben beschriebenen Methode hydroly- siert. The cellulose loss determination can be used to determine how much of the cellulose is broken down into soluble sugars and cellooligomers. To determine the cellulose loss, 30 mg dry mass of cellulose are hydrolyzed by the method described above.
Die Cellulose wird jedoch nicht per Zentrifugation vom Puffer getrennt. Das Gewicht eines Celluloseacetatfilters mit einer Porengröße von 0.2 μηη wird notiert und die hyd- rolysierte Cellulosesuspension über den Filter abfiltriert. Der Filter mit der hydrolysier- ten Cellulose wird dreimal mit 10 ml_ dest. Wasser gewaschen und bei 80 °C für 3 d getrocknet. Nach dem Trocknen wird der Celluloseacetatfilter mit der getrockneten Cellulose gewogen und das Gewicht notiert. Aus der Gewichtsdifferenz zwischen der zur Hydrolyse eingesetzten Cellulose und dem Gewicht nach dem Trocknen der Cellulose kann der Celluloseverlust bestimmt werden. However, the cellulose is not separated from the buffer by centrifugation. The weight of a cellulose acetate filter having a pore size of 0.2 μm is recorded and the hydrolysed cellulose suspension is filtered off via the filter. The filter with the hydrolyzed cellulose is washed three times with 10 ml. Washed water and dried at 80 ° C for 3 d. After drying, weigh the cellulose acetate filter with the dried cellulose and record the weight. From the difference in weight between the cellulose used for the hydrolysis and the weight after the drying of the cellulose, the cellulose loss can be determined.
Da eventuell an der Cellulose adsorbierte Cellulase durch diese Methode nicht entfernt wird, wird tendenziell ein zu hohes Gewicht bestimmt. Bei unhydrolysierter Cellulose macht die potenziell anhaftende Cellulase zwischen 0,8 % und 2,3 % aus. Durch Produktion von Glucose und löslichen Cellooligomeren nimmt der Anteil der Cellulasen während der Hydrolyse im Verhältnis zur unlöslichen Cellulose zu. Bei einer Reduktion der Cellulose um 70 % liegt der Anteil der potenziell anhaftenden Cellulase bei maxi- mal 7,6 %. Dadurch ist der reale Verlust an Cellulose durch Bildung von löslichen Zuckern und Cellooligomeren geringfügig höher, als der mit dieser Methode ermittelt wird. Since cellulase adsorbed on the cellulose is not removed by this method, too high a weight tends to be determined. For unhydrolyzed cellulose, the potentially adherent cellulase accounts for between 0.8% and 2.3%. By producing glucose and soluble cellooligomers, the proportion of cellulases during hydrolysis increases relative to insoluble cellulose. When the cellulose is reduced by 70%, the proportion of cellulase potentially adhering is maximally 7.6%. As a result, the real loss of cellulose through the formation of soluble sugars and cellooligomers is slightly higher than that determined by this method.
5. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann die Konzentration der im wässrigen Überstand des Hydrolyseansatzes befindlichen Glucose und Cellobiose bestimmt werden. Für die HPLC werden die aus der Hydrolyse erlangten Überstände sterilfiltriert und in HPLC Glasgefäße überführt. Zur Analyse wird eine HPLC (Tabelle 5) unter folgenden Bedingungen 5. High performance liquid chromatography High-performance liquid chromatography (HPLC) can be used to determine the concentration of glucose and cellobiose present in the aqueous supernatant of the hydrolysis reaction. For HPLC, the supernatants obtained from the hydrolysis are sterile filtered and transferred into HPLC glass vessels. For analysis, an HPLC (Table 5) under the following conditions
verwendet. used.
6. 4-Hydroxybenzoesäurehyd razi d -Test 6. 4-hydroxybenzoic acid razi d test
Mit dem 4-Hydroxybenzoesäurehydrazid-Test (PAHBAH-Test) kann die molare Konzentration der im wässrigen Überstand des Hydrolyseansatzes befindlichen reduzie- renden Zucker bestimmt werden. Die reduzierenden löslichen Zucker reagieren mit dem PAH BAH Reagenz zu einem gelben Farbstoff, der bei 410 nm photometrisch gemessen werden kann. Zur Kalibrierung werden Glucosekalibrierreihen mit den verwendeten Puffern mit einem Konzentrationsbereich von 0,025 g bis 0,5 g/L angefertigt. Für den PAH BAH-Test müssen zwei Reagenzien hergestellt werden (A und B), deren Rezepte in folgender Tabelle aufgeführten sind. Vor Durchführung des PAHBAH-Test wird aus den Reagenzien A und B (Verhältnis 1 :10) das Arbeitsreagenz hergestellt. Dieses ist nur wenige Stunden haltbar und sollte deshalb unmittelbar vor Durchführung des PAH BAH-Test hergestellt werden. Die zu testenden Proben und die Kalibrierlö- sungen werden im Verhältnis 1 :3 und 1 :5 mit dem Arbeitsreagenz gemischt und für 15 min bei 100 °C inkubiert. Nachdem die Proben und Standardlösungen auf Raumtemperatur abgekühlt sind, werden sie im Photometer bei 410 nm vermessen. Mit Hilfe der durch linare Regression ermittelten Kalibriergerade kann die Menge an löslichen reduzierenden Zuckern und Cellooligomeren in mol/mL bestimmt werden. Reagenz Substanz Masse/Volumen The 4-hydroxybenzoic acid hydrazide test (PAHBAH test) can be used to determine the molar concentration of the reducing sugar present in the aqueous supernatant of the hydrolysis reaction. The reducing soluble sugars react with the PAH BAH reagent to form a yellow dye that can be measured photometrically at 410 nm. For calibration, glucose calibration series are made with the buffers used at a concentration range of 0.025 g to 0.5 g / L. For the PAH BAH test two reagents have to be prepared (A and B) whose recipes are listed in the following table. Before carrying out the PAHBAH test, the reagents A and B (ratio 1:10) are used to prepare the working reagent. This is only stable for a few hours and should therefore be produced immediately before the PAH BAH test. The samples to be tested and the calibration solutions are mixed in a ratio of 1: 3 and 1: 5 with the working reagent and incubated for 15 min at 100 ° C. After the samples and standard solutions have cooled to room temperature, they are measured in the photometer at 410 nm. The amount of soluble reducing sugars and cellooligomers in mol / mL can be determined by means of the linear regression calibration line. Reagent substance mass / volume
p-Hydroxybenzoesäurehydrazid 5 g  p-hydroxybenzoic acid hydrazide 5 g
Wasser 30 mL  Water 30 mL
Reagenz A HCl (conc.) 5 mL  Reagent A HCl (conc.) 5 mL
Wasser auf 100 mL auffüllen Make up to 100 mL water
Trinatriumcitrat 12,45 g Trisodium citrate 12.45 g
Wasser 500 mL  Water 500 mL
Reagenz B Calciumchlorid 1 ,1 g  Reagent B calcium chloride 1, 1 g
Natriumhydroxid 20 g  Sodium hydroxide 20 g
Wasser auf 1 L auffüllen  Fill water to 1 liter
7. Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese Zur Überprüfung der Reinheit der verwendeten Enzyme wurde eine Natriumdodecylsul- fat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Gelelektrophorese) mit einem von der Firma Life Technologies (Kalifornien, USA) hergestellten SDS-Gelsystem verwendet. 7. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis To check the purity of the enzymes used, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS gel electrophoresis) using an SDS gel system manufactured by Life Technologies (California, USA) was used.
Umsetzungsbeispiele Examples of implementation
Um Cellooligomere mit einer Größe nahe der wässrigen Löslichkeit herzustellen, wurden zunächst Versuche mit den drei Cellulosesubstraten Avicel, α-Cellulose und Sig- macell, sowie fünf Endoglucanasen und zwei ß-Glucosidasen durchgeführt. Vor Beginn der Experimente wurden die eingesetzten Enzyme auf Reinheit und die eingesetzten Cellulosen auf Größenverteilung nach Quellung im jeweiligen Reaktionspuffer untersucht. Für alle enzymatischen Hydrolysen wurde, falls nicht anders angegeben, zunächst eine IL Vorbehandlung und anschließend eine enzymatische Hydrolyse durchgeführt. Die drei Cellulosen wurden zunächst für 2 h mit allen Endoglucanasen hydro- lysiert. Anschließend wurden in den folgenden Versuchen die Reaktionen der drei En- doglucanasen mit der geringsten Produktion an Glucose und löslichen Cellooligome- ren untersucht. In order to prepare cellooligomers with a size close to the aqueous solubility, first experiments were carried out with the three cellulose substrates Avicel, α-cellulose and sigma-cell, as well as five endoglucanases and two β-glucosidases. Before starting the experiments, the enzymes used were examined for purity and the celluloses used for size distribution after swelling in the respective reaction buffer. For all enzymatic hydrolyses, unless stated otherwise, first an IL pretreatment and then an enzymatic hydrolysis were carried out. The three celluloses were first hydrolyzed for 2 h with all endoglucanases. Subsequently, the reactions of the three endoglucanases with the lowest production of glucose and soluble cellooligomers were investigated in the following experiments.
Beispiel 1 : GPCQ der Cellulosesubstrate Avicel, α-Cellulose und Sigmacell Zur GPCo der drei enzymatisch nicht-hydrolysierten Cellulosesubstrate Avicel, o Cellulose und Sigmacell wurden Proben dieser drei Substrate 1 d bei 40 °C in Puffer inkubiert. Anschließend wurden diese analog zu den Proben der Hydrolyse für die GPCo vorbereitet und in der GPCo analysiert. Example 1: GPC Q of the cellulosic substrates Avicel, α-cellulose and Sigmacell To GPCo of the three enzymatically unhydrolyzed cellulose substrates Avicel, o cellulose and Sigmacell samples of these three substrates were incubated for 1 d at 40 ° C in buffer. Subsequently, they were prepared for the GPCo analogously to the samples of the hydrolysis and analyzed in the GPCo.
Die Bestimmung der Kettenlangenverteilung lieferte bei Avicel für den Acetat- und Phosphatpuffer das gleiche Ergebnis. Die Kettenlangenverteilung der α-Cellulose und Sigmacellproben, welche in Phosphatpuffer inkubiert wurden, zeigen eine proportionale Verschiebung der Kurve hin zu längeren Ketten. Die Ursache dieser Beobachtung ist unklar. Die Proben, die in Acetatpuffer inkubiert wurden, sind im Vergleich zu Proben, die nicht in Puffer inkubiert wurden, nicht hin zu längeren Kettenlängen verschoben. Im Folgenden werden für die Darstellung der Kettenlängenverteilung von o Cellulose und Sigmacell ohne enzymatischen Abbau Substratproben als Referenz verwendet, die zuvor in Acetatpuffer inkubiert und anschließend lyophilisiert wurden. The chain length distribution determination for Avicel gave the same result for the acetate and phosphate buffers. The chain length distribution of the α-cellulose and Sigmacell samples incubated in phosphate buffer show a proportional shift of the curve towards longer chains. The cause of this observation is unclear. The samples incubated in acetate buffer are not shifted to longer chain lengths as compared to samples not incubated in buffer. In the following, for the preparation of the chain length distribution of o cellulose and Sigmacell without enzymatic degradation substrate samples are used as a reference, which were previously incubated in acetate buffer and then lyophilized.
Beispiel 2 : Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanasen aus A. niger, B. amy- loliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum und T. emersonii Example 2 Hydrolysis of Avicel by Endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum and T. emersonii
Mittels GPCo wurde die Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanasen aus A. niger, B. amyloliquefaciens und T. maritima, analysiert. By GPCo, the hydrolysis of Avicel was analyzed by A. niger endoglucanases, B. amyloliquefaciens and T. maritima.
A. niger A. niger
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/m L Avicel, 10 mg / m L Avicel,
10 U/mL Endoglucanase aus A. niger, 10 U / mL endoglucanase from A. niger,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Ergebnis: Die Kettenlängenverteilung der Probe ohne Endoglucanase liegt zwischen 10 und 1000 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 250. Nach 5 min Hydrolyse mit der Endoglucanase aus A. niger ist eine Verschiebung des oberen Endes der Kettenlängenverteilung um 700 Glucoseeinheiten hin zu kürzeren Kettenlängen zu beobachten. Die Kettenlängenverteilung liegt nach dieser Reaktionszeit zwischen 10 und 300 Glucoseeinheiten. Das Maximum der Verteilung liegt bei 90 Glucoseeinheiten. In der Zeitspanne zwischen 5 min und 24 h verschiebt sich das obere Ende der Kettenlän- genverteilung um 100 Glucoseeinheiten hin zu kürzeren Kettenlängen. Nach 24 h liegt die Kurve zwischen 10 und 200 Glucoseeinheiten und weist ein Maximum bei 70 Glucoseeinheiten auf. Result: The chain length distribution of the sample without endoglucanase is between 10 and 1000 glucose units, with a maximum at 250. After hydrolysis with the A. niger endoglucanase for 5 min, a shift of the upper end of the chain length distribution by 700 glucose units towards shorter chain lengths is observed. The chain length distribution after this reaction time is between 10 and 300 glucose units. The maximum of the distribution is 90 glucose units. In the Time span between 5 min and 24 h shifts the upper end of the chain length distribution by 100 glucose units towards shorter chain lengths. After 24 h, the curve is between 10 and 200 glucose units and has a maximum at 70 glucose units.
B. amyloliquefaciens B. amyloliquefaciens
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Avicel, 10 mg / mL Avicel,
10 U/mL Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens  10 U / ml endoglucanase from B. amyloliquefaciens
3 U/mL ß-Glucosidase aus Agrobacterium sp., 3 U / mL β-glucosidase from Agrobacterium sp.,
40 °C, 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 40 ° C, 0.1 M phosphate buffer pH 6
Ergebnis: Die Kettenlängenverteilung der Probe ohne Endoglucanase liegt zwischen 10 und 700 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 250. Auch bei der Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens ist nach 20 min eine Verschiebung des oberen Endes der Kettenlängenverteilung hin zu kürzeren Ketten zu beobachten. Die Kettenlängenverteilung der 2 h Probe ist im Vergleich zu der nach 20 min um 150 Glucoseeinheiten hin zu kürzeren Kettenlängen verschoben. Die Kurven der Proben zwischen 2 h und 24 h sind deckungsgleich. Das Substrat wird demnach nicht weiter abgebaut. Nach 24 h Hydrolyse wird eine Kettenlängenverteilung erreicht, welche zwischen 10 und 200 Glucoseeinheiten liegt und bei ca. 65 Glucoseeinheiten ein Maximum aufweist Result: The chain length distribution of the sample without endoglucanase is between 10 and 700 glucose units, with a maximum at 250. Also in the hydrolysis of Avicel by B. amyloliquefaciens endoglucanase, a shift of the upper end of the chain length distribution to shorter chains can be observed after 20 min , The chain length distribution of the 2 h sample is shifted by 150 glucose units towards shorter chain lengths after 20 min. The curves of the samples between 2 h and 24 h are congruent. The substrate is therefore not further degraded. After hydrolysis for 24 h, a chain length distribution is achieved which is between 10 and 200 glucose units and has a maximum at about 65 glucose units
T. maritima T. maritima
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Avicel, 10 mg / mL Avicel,
10 U/mL Endoglucanase aus T. maritima,  10 U / ml T. maritima endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus Agrobacterium sp., 3 U / mL β-glucosidase from Agrobacterium sp.,
40 °C, 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 40 ° C, 0.1 M phosphate buffer pH 6
Die GPCo Messung der Probe ohne Endoglucanase weist eine Kettenlängenverteilung von 10 bis 700 Glucoseeinheiten auf. Während der ersten 5 min Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanase aus T. maritima ist eine Verschiebung des oberen Endes der Kettenverteilung hin zu kürzeren Ketten zu beobachten. Dies geschieht analog zu den Hydrolysen von Avicel mit den Endoglucanasen aus A. niger und B. amyloliquefaciens. Die 5 min Probe weist eine Kettenlängenverteilung zwischen 15 und 300 Glucoseeinheiten auf. Bis zum Ende des Versuches nach 24 h verschiebt sich das obere Ende der Kettenlängenverteilung weiter hin zu kürzeren Kettenlängen. Die Kettenlängenverteilung liegt nach dieser Reaktionszeit zwischen 15 und 300 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 90 Glucoseeinheiten. The GPCo measurement of the sample without endoglucanase has a chain length distribution of 10 to 700 glucose units. During the first 5 minutes of hydrolysis of Avicel by T. maritima endoglucanase, there is a shift in the upper end of the Chain distribution towards shorter chains to watch. This is analogous to the hydrolyses of Avicel with the endoglucanases from A. niger and B. amyloliquefaciens. The 5 min sample has a chain length distribution between 15 and 300 glucose units. By the end of the experiment after 24 h, the upper end of the chain length distribution shifts further towards shorter chain lengths. The chain length distribution after this reaction time is between 15 and 300 glucose units, with a maximum at 90 glucose units.
T. longibrachiatum T. longibrachiatum
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Avicel, 10 mg / mL Avicel,
10 U/mL Endoglucanase aus T. longibrachiatum,  10 U / mL T. longibrachiatum endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0, 1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0, 1 M acetate buffer pH 4.5
Im Vergleich zu den bereits genannten Hydrolysen von Avicel mit den Endoglucanasen aus A. niger, B. amyloliquefaciens und T. maritima verläuft die Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanase aus T. longibrachiatum langsamer. Compared to the previously mentioned hydrolysis of Avicel with the endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens and T. maritima, the hydrolysis of Avicel is slower by T. longibrachiatum endoglucanase.
Bei den genannten Endoglucanasen liegt das obere Ende der Kettenlängenverteilung nach 5 min Hydrolyse zwischen 300 und 400 Glucoseeinheiten. Dies ist bei der Endoglucanase aus T. longibrachiatum erst nach 20 min der Fall. Die Kettenlängenverteilung ist nach 24 h mit 10 bis 200 Glucoseeinheiten und einem Maximum bei 60 Glu- coseinheiten jedoch vergleichbar mit den entsprechenden Kettenlängenverteilung der Endoglucanasen aus A. niger , B. amyloliquefaciens und T. maritima . In the case of the abovementioned endoglucanases, the upper end of the chain length distribution after hydrolysis for 5 minutes is between 300 and 400 glucose units. This is the case with T. longibrachiatum endoglucanase only after 20 min. The chain length distribution after 24 h with 10 to 200 glucose units and a maximum at 60 glucose units, however, is comparable to the corresponding chain length distribution of the endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens and T. maritima.
T. emersonii T. emersonii
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Avicel, 10 mg / mL Avicel,
10 U/mL Endoglucanase aus T. ermersonii,  10 U / mL T. ermersonii endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A. niger, 3 U / mL β-glucosidase from A. niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 Die Kettenlängenverteilung der Probe ohne Endoglucanase liegt zwischen 10 und 700 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 250 Glucoseeinheiten. Bei der Hydrolyse von Avicel mittels Endoglucanase aus T. emersonii verschiebt sich das obere Ende der Kettenlängenverteilung während der ersten 4 h der Hydrolyse hin zu kürzeren Kettenlängen. Nach 4 h liegt die Kurve der Kettenlängenverteilung zwischen 15 und 200 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 70 Glucoseeinheiten. 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5 The chain length distribution of the sample without endoglucanase is between 10 and 700 glucose units, with a maximum at 250 glucose units. In the hydrolysis of Avicel by T. emersonii endoglucanase, the upper end of the chain length distribution shifts to shorter chain lengths during the first 4 h of hydrolysis. After 4 h, the curve of the chain length distribution lies between 15 and 200 glucose units, with a maximum at 70 glucose units.
Zusammenfassung: Summary:
Unter Verwendung der fünf verwendeten Endoglucanasen kann nach 24 h der Hydrolyse eine Verschiebung des oberen Endes der Kettenlängenverteilung hin zu kürzeren Kettenlängen erreicht werden. Der ursprüngliche Verlauf der Kettenlängenverteilung verschmälert sich mit zunehmender Hydrolyse. Das untere Ende der Kettenlängenver- teilung befindet sich dabei bei allen Endoglucanasen im Bereich zwischen 7 und 15 Glucoseeinheiten. Somit kann für alle Endoglucanasen eine endo-Aktivität nachgewiesen werden. Using the five endoglucanases used, after 24 h of hydrolysis, a shift in the upper end of the chain length distribution toward shorter chain lengths can be achieved. The original course of the chain length distribution narrows with increasing hydrolysis. The lower end of the chain length distribution is in all endoglucanases in the range between 7 and 15 glucose units. Thus, an endo activity can be detected for all endoglucanases.
Beispiel 3: Bestimmung des Polymerisationsgrads DP von enzymatisch hydrolysiertem Avicel Example 3 Determination of the Degree of Polymerization DP of Enzymatically Hydrolyzed Avicel
Zur Bestimmung des DP von enzymatisch hydrolysiertem Avicel (aus Beispiel 2) wurden GPC Analysen durchgeführt. To determine the DP of enzymatically hydrolysed Avicel (from Example 2) GPC analyzes were performed.
Probenzusammensetzung GPCo: Sample composition GPCo:
2 mg/mL Cellulose-Lyophilisat in DMF/19 % EMIM Ac (v/v)  2 mg / mL cellulose lyophilisate in DMF / 19% EMIM Ac (v / v)
Laufmittel: DMF/10 % EMIM Ac (v/v), 50 °C Eluent: DMF / 10% EMIM Ac (v / v), 50 ° C
Die Versuchsergebnisse sind in den beiliegenden Figuren 1 a bisl e graphisch dargestellt. Der Ausgangswert des DPW der Probe, vor Cellulase-Zugabe (0 h Probe), liegt zwischen 160 und 220 mit einem Mittelwert von 190. The test results are shown graphically in the attached Figures 1 a to e. The initial value of the DP W of the sample, before addition of cellulase (0 h sample), is between 160 and 220 with an average value of 190.
Alle im Folgenden gemachten Prozentangaben beziehen sich auf den DPW - Ausgangsmittelwert von 190. All percentages given below refer to the DP W initial mean value of 190.
Bei den Hydrolyseversuchen mit Endoglucanasen aus A. niger , T. maritima, T. emer- sonii und T. longibrachiatum sinkt der DPW während der ersten 5 min um 37 % bis 53 % und liegt somit zwischen 90 und 120. Nach 24 h sinkt der DPW bei den Hydroly- seversuchen mit den Endoglucanasen aus A niger, T. maritima und T. longibrachiatum um weitere 10 % bis 21 % auf 50 % bis 37 % des Ausgangswertes. In the hydrolysis experiments with endoglucanases from A. niger, T. maritima, T. emer- sonii and T. longibrachiatum, the DP W drops by 37% to 53% during the first 5 min and thus lies between 90 and 120. After 24 h, it decreases the DP W in the hydrolysis experiments with the endoglucanases from A niger, T. maritima and T. longibrachiatum by another 10% to 21% to 50% to 37% of the initial value.
Der DPW der Hydrolyse mit der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens liegt nach 20 min bei 40 % des Ausgangswertes. Nach 24 h Hydrolyse wird der DPW um weitere 5 % auf 35 % des Ausgangswertes gesenkt. The DP W of the hydrolysis with B. amyloliquefaciens endoglucanase is 40% of the initial value after 20 minutes. After 24 h of hydrolysis, the DP W is lowered by a further 5% to 35% of the initial value.
Der DPW der Hydrolyse der Endoglucanase aus T. emersonii wird nach 20 min Hydrolyse um 52 % des Ausgangswertes gesenkt. Nach 2 h Hydrolyse liegt der DPW mit einem Wert von 70 bei 36 % des Ausgangswertes. Danach steigt der DPW bis zum Ende der Reaktionszeit von 24 h auf 120. Auch bei Hydrolyse von Sigmacell mit der En- doglucanase aus T. emersonii steigt sowohl der DPW als auch der DPN nach 3 h Hydrolyse an. Deshalb kann nicht davon ausgegangen werden, dass es sich bei dem beobachteten Anstieg um Messfehler handelt. Eine mögliche Ursache wäre ein vermehrter Abbau von kurzen Ketten, wodurch die schon vorhandenen längeren Ketten, im Verhältnis stärker ins Gewicht fallen. The DP W of hydrolysis of the endoglucanase from T. emersonii is lowered after 20 minutes of hydrolysis of 52% of the initial value. After 2 h of hydrolysis, the DP W with a value of 70 is 36% of the initial value. Thereafter, the DP W increases from 120 h to 24 h by the end of the reaction time. Also on hydrolysis of Sigmacell with the T. emersonii endoglucanase, both the DP W and the DP N increase after 3 h of hydrolysis. Therefore, it can not be assumed that the observed increase is measurement error. A possible cause would be an increased reduction of short chains, whereby the already existing longer chains, in the ratio more significant.
Bei Verwendung der Endoglucansen aus B. amyloliquefaciens und T. maritima kann nach 2 h Hydrolyse kein weiterer Abbau von Avicel beobachtet. Bei den Hydrolyseversuchen mit den Endoglucanasen aus A. niger und T. emersonii ist bis zum Versuchsende eine weitere Reduktion des DPW zu beobachten. When using the endoglucans from B. amyloliquefaciens and T. maritima, no further degradation of Avicel is observed after 2 h of hydrolysis. In the hydrolysis experiments with the endoglucanases from A. niger and T. emersonii, a further reduction of the DP W can be observed until the end of the experiment.
Bei Verwendung aller Endoglucanasen wird der DPW während den ersten 5 min Versuchsdauer im Vergleich zum übrigen Versuchszeitraum im Verhältnis zum Ausgangswert am stärksten reduziert. In den ersten 1 bis 2 h sinkt der DPW auf ca. 50 %. Im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen kann der geringste DPW mit einem Wert von 65 bei Verwendung der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens erzielt werden. When all endoglucanases are used, the DP W is reduced most in the first 5 min trial period compared to the rest of the trial period relative to baseline. In the first 1 to 2 h, the DP W drops to approx. 50%. Compared to the other endoglucanases, the lowest DP W of 65 can be achieved using B. amyloliquefaciens endoglucanase.
Aus dem DPW und DPN wurde die in folgender Tabelle aufgelistete Polydispersität be- rechnet From the DP W and DP N , the polydispersity listed in the following table was calculated
Polymerisations- Polygr d disper¬Polymerization Polygr d disper¬
Endoglucanase DPN sität Endoglucanase DP N sity
A niger 75 \_ 40 1 ,8 A niger 75 \ _ 40 1, 8
B. Bmylöiique- 65 40 ^ 1 ,6  B. Bmylöiique- 65 40 ^ 1, 6
faciens  faciens
T. maritima 95 45 2,1  T. maritima 95 45 2.1
T. bngibm- 65 \^ 40 \ i  T. bngibm- 65 \ ^ 40 \ i
chiatum  chiatum
T. emermnii 75 < > 40 1 ,9 T. emermnii 75 <> 40 1, 9
(2 h)  (2 hours)
DPW , DPN und Polydispersitäts- (PD) Bestimmung mittels GPCo (Software: ASTRA) Pfeile zeigen den jeweiligen Trend DP W , DP N and polydispersity (PD) determination using GPCo (Software: ASTRA) arrows show the respective trend
Die Polydispersität sinkt mit sinkendem DPW. Demnach besteht eine Korrelation zwischen Polydispersität und dem Abbaugrad der Cellulose. The polydispersity decreases with decreasing DP W. Thus, there is a correlation between polydispersity and the degree of degradation of the cellulose.
Beispiel 4: Massenbilanz der Hydrolyse von Avicel Neben den gewünschten unlöslichen Cellooligomeren fallen bei der Hydrolyse von Cellulose auch lösliche Cellooligomere und Glucose an. Dieses Beispiel widmet sich der Quantifizierung und Bewertung des Verlustes der eingesetzten Cellulose durch Produktion von löslichen Cellooligomeren und Glucose. Die gelösten Cellooligomere und Glucose wurden mit Hilfe einer HPLC und dem PAHBAH Test quantifiziert. Für diese Untersuchungen wurde der wässrige Überstand der Avicel-Hydrolyseproben verwendet. Mittels HPLC Analyse wurde die Glucose- und Cellobiosekonzentration bestimmt. Die Konzentration dieser beiden gelösten Zucker steigt bei allen verwendeten Endoglucanasen mit der Zeit an Example 4: Mass balance of the hydrolysis of Avicel In addition to the desired insoluble cellooligomers, soluble cellooligomers and glucose also accumulate in the hydrolysis of cellulose. This example is devoted to the quantification and evaluation of the loss of cellulose employed by production of soluble cellooligomers and glucose. The dissolved cellooligomers and glucose were quantified by HPLC and PAHBAH assay. For these studies, the aqueous supernatant of the Avicel hydrolysis samples was used. By HPLC analysis, the glucose and cellobiose concentration certainly. The concentration of these two dissolved sugars increases with time for all endoglucanases used
Die Massenverteilung von Avicel nach der enzymatischen Hydrolyse ist in folgender Tabelle zusammengefasst: The mass distribution of Avicel after enzymatic hydrolysis is summarized in the following table:
unlöslich löslich insoluble soluble
Endoglucanase Cellulose reduGiucose unbekannte Massen¬ Endoglucanase cellulose reduGiucose unknown Massen¬
< f%] zierende und lösliche Celbilanz <f%] ornamental and soluble cel balance
Zucker > Cetlobiose looligomere [%]  Sugar> Cetlobiose looligomers [%]
[%} [%] (Gfc3- Gfce) [%] [%] (Gfc 3 - Gfc e )
> [%]  > [%]
A. niger 81 ,0 10,4 10,9 0 (-0,5) 91 ,4 A. niger 81, 0 10.4 10.9 0 (-0.5) 91, 4
B. amyloliquefaci75,0 31 ,7 25,8 6,1 106,7 ens B. amyloliquefaci75.0 31, 7 25.8 6.1 106.7 ens
T. maritima 96,6 7,1 6,7 0,4 103,7 T. maritima 96.6 7.1 6.7 0.4 103.7
T. longibrachiatum 56,0 34,8 32,8 90,8T. longibrachiatum 56.0 34.8 32.8 90.8
T. emersonii 29,0 61 ,8 50,8 11,0 100,8 unlösliche Cellooligomere gemessen mittels Celluloseverlustbestimmung nach 24 h; reduzierende Zucker gemessen mittels PAHBAH-Test nach 24 h: T. emersonii 29,0 61, 8 50,8 11,0 100,8 insoluble cellooligomers measured by determination of cellulose loss after 24 h; reducing sugars measured by PAHBAH test after 24 h:
Giucose und Cellobiose gemessen mittels HPLC nach 24 h; Giucose and cellobiose measured by HPLC after 24 h;
unbekannte lösliche Cellooligomere (Differenz zwischen PAHBAH Test und HPLC Analyse) nach 24 h; unknown soluble cellooligomers (difference between PAHBAH test and HPLC analysis) after 24 h;
Prozentangabe bezogen auf die gebildete Giucose und Cellobiose bei vollständigem Umsatz der eingesetzten Cellulose  Percentage based on the formed glucose and cellobiose with complete conversion of the cellulose used
Die Endoglucanase aus T. emersonii produziert mit 1 1 % unbekannten löslichen Cellooligomeren am meisten unbekannte lösliche Cellooligomere. Die Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens produziert 6,1 % unbekannte lösliche Cellooligomere. Bei Ver- wendung der Endoglucanase aus T. longibrachiatum entstehen 2 % unbekannte lösliche Cellooligomere. Die Verwendung der Endoglucanasen aus T. maritima und A. niger führt mit 0,5 % und 0 % zu einer sehr geringen bzw. nicht messbaren Menge an unbekannten löslichen Cellooligomeren. Da bei den Endoglucanasen aus T. emersonii und B. amyloliquefaciens im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen die meisten löslichen Cellooligomere produziert werden, könnten diese beiden Endoglucanasen zur Produktion von löslichen Cellooligomeren verwendet werden. Mit 29 % Cellulose nach der Hydrolyse, entstehen bei Verwendung der Endoglucanase aus T. emersonii hauptsächlich Glucose, Cellobiose (51 %) und lösliche Cellooligo- mere (1 1 %). Bei Verwendung der Endoglucanasen aus B. amyloliquefaciens mit 75 %, A. niger mit 81 % und T. maritima mit 96,6 % unlöslicher Cellulose nach Hydrolyse, werden im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen die besten Celluloseausbeuten erreicht. Für einen industriellen Prozess mit dem Ziel der Produktion von unlöslichen Cellooligomeren sind die Endoglucanasen aus B. amyloliquefaciens und A. niger deshalb besonders interessant, wenn es sich bei der unlöslichen Cellulose um relativ kurz- kettige Cellooligomere handelt. T. emersonii endoglucanase produces the most unknown soluble cellooligomers with 11% unknown soluble cellooligomers. B. amyloliquefaciens endoglucanase produces 6.1% of unknown soluble cellooligomers. When T. longibrachiatum endoglucanase is used, 2% of unknown soluble cellooligomers are formed. The use of T. maritima and A. niger endoglucanases at 0.5% and 0% results in a very small or immeasurable amount of unknown soluble cellooligomers. Since the endoglucanases from T. emersonii and B. amyloliquefaciens produce the most soluble cellooligomers compared to the other endoglucanases, these two endoglucanases could be used to produce soluble cellooligomers. With 29% cellulose after the hydrolysis, the endoglucanase from T. emersonii produces mainly glucose, cellobiose (51%) and soluble cellooligomers (11%). When using the endoglucanases from B. amyloliquefaciens with 75%, A. niger with 81% and T. maritima with 96.6% insoluble cellulose after hydrolysis, the best cellulosic yields are achieved compared to the other endoglucanases. For an industrial process with the aim of producing insoluble cellooligomers, the endoglucanases from B. amyloliquefaciens and A. niger are of particular interest if the insoluble cellulose is relatively short-chain cellooligomers.
Beispiel 5: Enzymatische Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanasen aus A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum und T. emersonii Example 5 Enzymatic hydrolysis of α-cellulose by means of endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum and T. emersonii
Mit Hilfe der GPC0 wurde die Kettenlangenverteilung der Hydrolyseproben von o Cellulose ermittelt. With the aid of GPC 0 , the chain length distribution of the hydrolysis samples of o cellulose was determined.
A. niger A. niger
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL alpha-Cellulose, 10 mg / mL alpha-cellulose,
10 U/mL Endoglucanase aus A. niger, 10 U / mL endoglucanase from A. niger,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 α-Cellulose, die nicht mit Enzym behandelt wurde, zeigt folgenden charakteristischen Verlauf: Die Konzentration der Celluloseketten steigt im Bereich 20 bis 90 Glucoseein- heiten. Die Steigung wird im Bereich 90 bis 200 Glucoseeinheiten geringer und nimmt im Bereich 200 bis 450 Glucoseeinheiten wieder zu. 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5 α-cellulose, which was not treated with enzyme, shows the following characteristic course: The concentration of cellulose chains increases in the range 20 to 90 glucose units. The slope decreases in the range of 90 to 200 glucose units and increases again in the range of 200 to 450 glucose units.
Nach 5 min Hydrolyse mit der Endoglucanase aus A. niger ist die Schulter nicht mehr sichtbar. Das obere Ende der Kettenlangenverteilung ist im Vergleich zum Verlauf der nicht hydrolysierten Probe hin zu kürzeren Kettenlängen verschoben. Das Maximum der Verteilung ist ebenfalls hin zu kürzeren Ketten verschoben. Die Verteilung liegt zwischen 10 und 800 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum von 120. Bis 19 h ver- schmälert sich die Kettenlängenverteilung immer weiter. Die Kurve liegt nun im Bereich zwischen 10 und 450 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 75. Somit wird eine Reduktion des Maximums um 80 % und des oberen Ende der Kettenlängenverteilung um 75 % erreicht. After hydrolysis for 5 minutes with A. niger endoglucanase, the shoulder is no longer visible. The upper end of the chain length distribution is shifted toward shorter chain lengths compared to the course of the unhydrolyzed sample. The maximum of the distribution is also shifted towards shorter chains. The distribution is between 10 and 800 glucose units, with a maximum of 120. Until 19 h the chain length distribution decreases further and further. The curve is now in the range between 10 and 450 glucose units, with a maximum at 75. Thus, a reduction of the maximum by 80% and the upper end of the chain length distribution by 75% is achieved.
B. amyloliquefaciens B. amyloliquefaciens
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL alpha-Cellulose, 10 mg / mL alpha-cellulose,
10 U/mL Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens, 10 U / ml endoglucanase from B. amyloliquefaciens,
3 U/mL ß-Glucosidase aus Agrobacterium sp., 3 U / mL β-glucosidase from Agrobacterium sp.,
40 °C, 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 40 ° C, 0.1 M phosphate buffer pH 6
Mit der GPC0 wurde die Kettenlängenverteilung der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens ermittelt. Nach 5 min Hydrolyse mit der Endoglucanase aus A. niger ist statt der Schulter nur noch eine Abflachung der Steigung zwischen 10 und 30 Glucoseeinheiten der Kettenlängenverteilung zu erkennen. Nach 20 min Reaktionszeit ist diese Abflachung nicht mehr zu erkennen, stattdessen ist eine nahezu gaußförmige Kettenlängenverteilung zu beobachten. Am Ende des Versuches liegt die Verteilung der Kettenlängen zwischen 10 und 400 Glucoseeinheiten mit einem Maximum bei 80 Glucoseeinheiten. Durch die enzymatische Hydrolyse wird eine Reduktion des Maximums um 80 % und des oberen Ende um 75 % erreicht. With GPC 0 , the chain length distribution of the hydrolysis of α-cellulose was determined by means of B. amyloliquefaciens endoglucanase. After hydrolysis for 5 minutes with A. niger endoglucanase, only a flattening of the slope between 10 and 30 glucose units of the chain length distribution can be seen instead of the shoulder. After 20 min reaction time, this flattening is no longer visible, but instead a nearly Gaussian chain length distribution is observed. At the end of the experiment, the distribution of the chain lengths is between 10 and 400 glucose units with a maximum at 80 glucose units. By the enzymatic hydrolysis a reduction of the maximum by 80% and the upper end by 75% is achieved.
T. maritima T. maritima
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL alpha-Cellulose, 10 mg / mL alpha-cellulose,
10 U/mL Endoglucanase aus T. maritima, 10 U / ml T. maritima endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Mit der GPC0 wurde die Kettenlängenverteilung der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus T. maritima bestimmt. Die mittels GPC0 analysierte 5 min-Probe der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus T. maritima zeigt eine Kettenlängenverteilung zwischen 10 und 1800 Glucoseeinheiten. Im Vergleich zur Probe ohne Enzym sind im Bereich 10 bis 20 Glucoseeinheiten Cellooligomere vorhanden. Das Maximum nach 5 min hat sich von 450 auf 350 verschoben. Eine Schulter ist nicht mehr ausgeprägt, jedoch eine leichte Abflachung der Steigung bei ca. 120 Glucoseeinheiten erkennbar. Die Steigung der Kettenlangenverteilung ist im Bereich zwischen 10 und 30 Glucoseeinheiten im Vergleich zur Steigung im Bereich 30 Glucoseeinheiten bis zum Maximum, flacher. Das obere Ende der Kettenlangenverteilung sowie die Maxima der Kurven verschieben sich während der Hydrolyse hin zu kürzeren Kettenlängen. Nach 19 h Reaktionszeit liegt die Kurve zwischen 10 und 600 und das Maximum bei 150 Glucoseeinheiten. Somit wird das Maximum der Kettenlängenverteilung um 65 % und das oberen Ende der Kettenlängenverteilung um 65 % reduziert. With GPC 0 , the chain length distribution of the hydrolysis of α-cellulose was determined by T. maritima endoglucanase. The GPC 0 analyzed 5 min sample of the hydrolysis of α-cellulose by T. maritima endoglucanase shows a chain length distribution between 10 and 1800 glucose units. Compared to the sample Without enzyme, cellooligomers are present in the range 10 to 20 glucose units. The maximum after 5 minutes has shifted from 450 to 350. A shoulder is no longer pronounced, but a slight flattening of the slope at about 120 glucose units visible. The slope of the chain length distribution is in the range between 10 and 30 glucose units compared to the slope in the range of 30 glucose units to the maximum, flatter. The upper end of the chain length distribution and the maxima of the curves shift towards shorter chain lengths during hydrolysis. After 19 h reaction time, the curve is between 10 and 600 and the maximum at 150 glucose units. Thus, the maximum of the chain length distribution is reduced by 65% and the upper end of the chain length distribution by 65%.
T. longibrachiatum T. longibrachiatum
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL alpha-Cellulose, 10 mg / mL alpha-cellulose,
10 U/mL Endoglucanase aus T. longibrachiatum, 10 U / mL T. longibrachiatum endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Mit der GPCo wurde die Kettenlängenverteilung der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus T. longibrachiatum ermittelt. Das obere Ende der Kettenlängenverteilung der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus T. longibrachiatum verschiebt sich nach 5 min Hydrolyse hin zu kürzeren Kettenlängen. Die Kettenlängenverteilung liegt nach dieser Reaktionszeit zwischen 10 und 1500 Glucoseeinheiten. Im Vergleich zur Probe ohne Enzym hat sich das Maximum von 450 auf 200 Glucoseein- heiten verschoben. Die Schulter hat sich ebenfalls hin zu kürzeren Kettenlängen verschoben und liegt bei ungefähr 25 Glucoseeinheiten. Während 19 h Reaktionszeit verschiebt sich das obere Ende der Kettenlängenverteilung immer weiter hin zu kürzeren Kettenlängen. Die Maxima der Kurven verschieben sich ebenfalls hin zu kürzeren Ketten. Da die Kettenlängenverteilung im Laufe des Versuchs enger wird, nimmt die Höhe der Maxima im Laufe des Versuchs zu. Nach 19 h liegt die Kettenlängenverteilung zwischen 10 und 400 und das Maximum bei 75 Glucoseeinheiten. With the GPCo, the chain length distribution of the hydrolysis of α-cellulose was determined by T. longibrachiatum endoglucanase. The upper end of the chain length distribution of the hydrolysis of α-cellulose by T. longibrachiatum endoglucanase shifts to shorter chain lengths after hydrolysis for 5 minutes. The chain length distribution after this reaction time is between 10 and 1500 glucose units. Compared to the sample without enzyme, the maximum has shifted from 450 to 200 glucose units. The shoulder has also shifted to shorter chain lengths and is about 25 glucose units. During a 19 h reaction time, the upper end of the chain length distribution shifts ever further towards shorter chain lengths. The maxima of the curves also shift towards shorter chains. As the chain length distribution becomes narrower in the course of the experiment, the height of the maxima increases in the course of the experiment. After 19 h, the chain length distribution is between 10 and 400 and the maximum at 75 glucose units.
Das Maximum reduziert sich innerhalb der Hydrolysezeit von 19 h um 80 % und das obere Ende der Kettenlängenverteilung um 75 %. T. emersonii The maximum is reduced by 80% within the hydrolysis time of 19 h and the upper end of the chain length distribution by 75%. T. emersonii
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL alpha-Cellulose, 10 mg / mL alpha-cellulose,
10 U/mL Endoglucanase aus T. emersonii, 10 U / mL endoglucanase from T. emersonii,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Die Kettenlangenverteilung der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus T. emersonii wurde mit der GPCo bestimmt. Die Kettenlangenverteilung der Probe ohne Enzym liegt zwischen 20 und 1800 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 450 Glucoseeinheiten. Zwischen 90 und 200 Glucoseeinheiten weist die Kettenlangenverteilung einen flacheren Bereich auf (Schulter). Das obere Ende der Kettenlangenverteilung der Hydrolyse von α-Cellulose mittels Endoglucanase aus T. emersonii ver- schiebt sich nach 5 min Hydrolyse hin zu kürzeren Kettenlängen. Die Kettenlangenverteilung liegt nach dieser Reaktionszeit zwischen 10 und 1500 Glucoseeinheiten. Im Vergleich zur Probe ohne Enzym hat sich das Maximum von 450 auf 280 Glucoseeinheiten verschoben. Die Schulter hat sich ebenfalls hin zu kürzeren Kettenlängen verschoben und liegt bei ungefähr 30 Glucoseeinheiten. Während 19 h Reaktionszeit ver- schiebt sich das obere Ende der Kettenlängenverteilung immer weiter hin zu kürzeren Kettenlängen. Die Maxima der Kurven verschieben sich ebenfalls hin zu kürzeren Ketten. Da die Kettenlängenverteilung im Laufe des Versuchs enger wird, nimmt die Höhe der Maxima im Laufe des Versuchs zu. Nach 19 h liegt die Kettenlängenverteilung zwischen 10 und 300 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 70. Durch die en- zymatische Hydrolyse wird eine Reduktion des Maximums um 85 % und des oberen Ende der Kettenlängenverteilung um 80 % erreicht. The chain length distribution of the hydrolysis of α-cellulose by T. emersonii endoglucanase was determined by GPCo. The chain length distribution of the sample without enzyme is between 20 and 1800 glucose units, with a maximum at 450 glucose units. Between 90 and 200 glucose units, the chain length distribution has a shallower area (shoulder). The upper end of the chain length distribution of the hydrolysis of α-cellulose by T. emersonii endoglucanase shifts to shorter chain lengths after hydrolysis for 5 minutes. The chain length distribution is after this reaction time between 10 and 1500 glucose units. Compared to the sample without enzyme, the maximum has shifted from 450 to 280 glucose units. The shoulder has also shifted towards shorter chain lengths and is about 30 glucose units. During a reaction time of 19 h, the upper end of the chain length distribution shifts ever further towards shorter chain lengths. The maxima of the curves also shift towards shorter chains. As the chain length distribution becomes narrower in the course of the experiment, the height of the maxima increases in the course of the experiment. After 19 h, the chain length distribution is between 10 and 300 glucose units, with a maximum at 70. Enzyme hydrolysis achieves a reduction of the maximum by 85% and the upper end of the chain length distribution by 80%.
Zusammenfassung: Beim Vergleich der vorgestellten Endoglucanasen zeigen die Endoglucanasen aus A. niger und B. amyloliquefaciens den schnellsten Abbau der Cellulose. Die Endoglucanasen aus T. longibrachiatum und T. emersonii bauen α-Cellulose langsamer ab. Die Kettenlängenverteilungen nach 19 h liegen allerdings im selben Bereich. Bei Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima wird α-Cellulose im Vergleich zur Hydrolyse mittels Endoglucanasen aus A. niger und B. amyloliquefaciens ebenfalls langsamer abgebaut. Nach einer Reaktionszeit von 19 h ist α-Cellulose jedoch nicht so weit abgebaut wie unter Verwendung der anderen Endoglucanasen. Besonders bei den langsameren Endoglucanasen ist zu beobachten, dass sich zunächst das Maximum hin zu kürzeren Ketten verschiebt und Cellooligomere mit einer Kettenlänge von 10 bis 30 Glucoseeinheiten gebildet werden. Mit fortschreitender Reaktionszeit verschieben sich die Kettenlängenverteilung und deren Maxima immer weiter hin zu kürzeren Kettenlängen. Die Kettenlängenverteilung wird dadurch gestaucht und die Höhe des Maximums erhöht sich. Summary: Comparing the endoglucanases presented, the A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases show the fastest degradation of the cellulose. T. longibrachiatum and T. emersonii endoglucanases degrade α-cellulose more slowly. The chain length distributions after 19 h, however, are in the same range. When T. maritima endoglucanase is used, α-cellulose is compared to the hydrolysis also degraded more slowly by means of endoglucanases from A. niger and B. amyloliquefaciens. However, after a reaction time of 19 hours α-cellulose is not degraded as much as using the other endoglucanases. Especially with the slower endoglucanases, it can be observed that first the maximum shifts to shorter chains and cellooligomers with a chain length of 10 to 30 glucose units are formed. As the reaction time progresses, the chain length distribution and its maxima shift ever further towards shorter chain lengths. The chain length distribution is thereby compressed and the height of the maximum increases.
Beispiel 6: Bestimmung des Polymerisationsgrads DP von enzymatisch hydrolysierter alpha Cellulose Zur Bestimmung des DP von enzymatisch hydrolysierter alpha-Cellulose (aus Beispiel 5) wurden GPC Analysen durchgeführt. Example 6 Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolysed alpha cellulose For the determination of the DP of enzymatically hydrolysed alpha-cellulose (from Example 5), GPC analyzes were carried out.
Probenzusammensetzung GPCo: Sample composition GPCo:
2 mg/mL Cellulose-Lyophilisat in DMF/19 % EMIM Ac (v/v)  2 mg / mL cellulose lyophilisate in DMF / 19% EMIM Ac (v / v)
Laufmittel: DMF/10 % EMIM Ac (v/v), 50 °C Eluent: DMF / 10% EMIM Ac (v / v), 50 ° C
Die Versuchsergebnisse sind in den Figuren 2a bis 2e dargestellt. The test results are shown in FIGS. 2a to 2e.
Bei den 0 h Proben wurde keine Enzymlösung zugegeben und das Celluloselyophilisat mittels GPCo analysiert. Als Referenz wurde eine α-Cellulose-Probe verwendet, wel- che zuvor in Acetatpuffer inkubiert wurde und anschließend lyophilisiert wurde. Der DPW der unhydrolysierten α-Celluloseproben liegt bei 550. Der DPN liegt bei 230. For the 0 h samples, no enzyme solution was added and the cellulose lyophilizate was analyzed by GPCo. As a reference, an α-cellulose sample was used, which was previously incubated in acetate buffer and then lyophilized. The DP W of the unhydrolysed α-cellulose samples is 550. The DP N is 230.
Nach 5 min Hydrolyse sinkt der DPW der Proben von A. niger auf 180. Damit wird eine Reduktion des DPW um mindestens 50 % erreicht. Der DPW sinkt kontinuierlich weiter und liegt nach 19 h mit einem Wert von 1 10 bei ca. 25 % des Ausgangswertes. Dies zeigt, dass sich die Reduktion des DPW mit der Zeit verlangsamt. Der DPN fällt nach einer Reaktionszeit von 5 min von ursprünglich 240 auf 140. Bis zur Beendigung des Versuches nach 19 h sinkt der DPN auf 50. Der DPW der Probe aus B. amyloliquefaciens sinkt innerhalb von 5 min auf 140. Der DPN liegt nach dieser Reaktionszeit bei 70. Nach 19 h liegt der DPW bei 90 und der DPN bei 50. Nach 20 min Hydrolyse liegt der DPW der Probe unter Verwendung der Endoglucanase aus T. emersonii bei 150. Bei Verwendung der Endoglucanase aus T. longibrachiatum wird ein DPW von 170 nach 40 min erreicht. Unter Verwendung der Endoglucanasen aus A niger und B. amyloliquefaciens werden Werte in diesem Bereich bereits nach 5 min erreicht. Demnach verläuft die Reduktion des DPW bei Verwendung der En- doglucanasen aus T. emersonii und T. longibrachiatum langsamer als bei Verwendung der Endoglucansen aus A. niger und B. amyloliquefaciens. Nach 19 h Hydrolyse mit der Endoglucanase aus T. emersonii wird ein DPW von 90 und ein DPN von 50 erreicht. Bei Verwendung der Endoglucanase aus T. longibrachiatum wird nach 19 h Hydrolyse ein DPW von 90 und ein DPN von 40 erreicht. Bei den Hydrolysen von Avicel und Sig- macell steigt der DPW und DPN nach ca. 1 h Hydrolyse mit der Endoglucanase aus T. emersonii an. Der Anstieg des DP ist bei Verwendung von α-Cellulose nicht zu beobachten. Der Anstieg des DP bei Verwendung von Avicel und Sigmacell bei einem DPW von ca. 70 ein, dieser DPW wird bei Verwendung von α-Cellulose nicht erreicht. Möglich wäre demnach ein Anstieg, der abhängig von DPW ist. Auch bei Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima ist ein Abbau von α-Cellulose zu beobachten. Allerdings liegt der DPW nach 19 h Hydrolyse mit einem Wert von 150 höher als bei Verwendung der anderen Endoglucanasen. Mit einem DPN Wert von 65 nach 19 h Hydrolyse liegt der DPN im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen ebenfalls höher. Die niedrigsten DPW beim Vergleich der Hydrolyse von α-Cellulose mit den fünf verwendeten Endoglucanasen werden bei Verwendung der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens, T. longibrachiatum und T. emersonii mit einer Reaktionszeit von 19 h erreicht. Diese liegen zwischen 90 und 93. Bei allen Endoglucanasen ist bis zum Versuchende eine Reduktion des DPW zu beobachten. Wie auch für Avicel wurde die Polydispersität aus dem DPW und DPN berechnet (vgl. folgende Tabelle) Polymerisations- Poly- gr d disper-After 5 minutes of hydrolysis, the DP W of the A. niger samples drops to 180. This results in a reduction of the DP W of at least 50%. The DP W continues to decrease and, after 19 h, has a value of 1 to about 25% of the initial value. This shows that the reduction of the DP W slows down over time. The DP N drops from 240 to 140 after a reaction time of 5 min. Until the end of the test after 19 h, the DP N drops to 50. The DP W of the B. amyloliquefaciens sample drops to 140 within 5 min. The DP N is 70 after this reaction time. After 19 h, the DP W is 90 and the DP N is 50. After 20 min of hydrolysis, the DP is located W of the sample using T. emersonii endoglucanase at 150. Using T. longibrachiatum endoglucanase, a DP W of 170 to 40 minutes is achieved. Using the endoglucanases from A. niger and B. amyloliquefaciens, values in this range are already reached after 5 min. Accordingly, the reduction of DP W using the endoglucanases from T. emersonii and T. longibrachiatum proceeds more slowly than when using the endoglucans from A. niger and B. amyloliquefaciens. After 19 h hydrolysis with T. emersonii endoglucanase, a DP W of 90 and a DP N of 50 are achieved. When T. longibrachiatum endoglucanase is used, a DP W of 90 and a DP N of 40 are achieved after hydrolysis for 19 h. In the hydrolyses of Avicel and Sig- macell, the DP W and DP N increase after approx. 1 h of hydrolysis with the T. emersonii endoglucanase. The increase in DP is not observed when using α-cellulose. The increase in DP when using Avicel and Sigmacell at a DP W of about 70, this DP W is not achieved when using α-cellulose. Therefore, an increase that is dependent on DP W would be possible. Even when using the endoglucanase from T. maritima degradation of α-cellulose is observed. However, after 19 hours of hydrolysis, the DP W is 150 times higher than when using the other endoglucanases. With a DP N value of 65 after 19 h of hydrolysis, the DP N is also higher in comparison to the other endoglucanases. The lowest DP W in comparing the hydrolysis of α-cellulose with the five endoglucanases used is achieved using the B. amyloliquefaciens, T. longibrachiatum and T. emersonii endoglucanase with a 19 h reaction time. These are between 90 and 93. In all endoglucanases, a reduction of the DP W is observed up to the end of the experiment. As for Avicel, the polydispersity was calculated from the DP W and DP N (see the following table) Polymerization polygraphic disperse
Endoglucanase DPW DPN sität Endoglucanase DP W DP N sity
A. niger 110 50 2,2  A. niger 110 50 2.2
ß. Bmytolique- 90 X 50 1  ß. Bmytolique- 90 X 50 1
faciens  faciens
T. maritima 155 X 65 X 2,3  T. maritima 155 X 65 X 2.3
T. tongibm- 95 \ 45 X 2,1  T. tongibm- 95 \ 45 X 2.1
chiatum  chiatum
T. emersonii 90 50 X 1 ,8  T. emersonii 90 50 X 1, 8
DPW , DPN und CLD Bestimmung mittels GPCo (Software: ASTRA) Pfeile zeigen den jeweilige Trend DP W , DP N and CLD determination by GPCo (Software: ASTRA) Arrows show the respective trend
Auch bei Verwendung von α-Cellulose besteht eine Korrelation zwischen DPW und Po- lydispersität. Even when using α-cellulose, there is a correlation between DP W and polydispersity.
Beispiel 7: Massenbilanz der Hydrolyse von alpha-Cellulose Example 7: Mass balance of the hydrolysis of alpha-cellulose
Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefasst: unlöslich löslich The results are summarized in the following table: insoluble soluble
Endoglucanase Cellulose reduGlucose unbekannte Massen¬ Endoglucanase cellulose reduGlucose unknown Massen¬
< £%] zierende und lösliche Cel- bilanz <£%] ornamental and soluble cell balance
Zucker > Celiobiose looligomere [%]  Sugar> Celiobiose looligomers [%]
[%] [%] (G/c3- G/c6) [%] [%] (G / c 3 - G / c 6 )
> [%]  > [%]
A. niger 94,5 9,5 8,8 2,7 104,0 A. niger 94.5 9.5 8.8 2.7 104.0
B. amyloliquefaci- 64,5 14,2 14,9 0,7 79,4 ens B. amyloliquefaci- 64.5 14.2 14.9 0.7 79.4 ens
T, mariti a' 87,1 4,8 5,0 0 {-0,2) 91 ,9 T, mariti a '87,1 4,8 5,0 0 {-0,2) 91, 9
T. longibrachiatum 64,5 19,9 16.8 3,1 84,4T. longibrachiatum 64.5 19.9 16.8 3.1 84.4
T. emersonii 45,7 46,8 19.4 27,4 92,5 unlösliche Cellooligomere gemessen mittels Celluloseverlustbestimmung nach 19 h reduzierende Zucker gemessen mittels PAHBAH-Test nach 19 h T. emersonii 45.7 46.8 19.4 27.4 92.5 insoluble cellooligomers measured by means of cellulose loss determination after 19 h reducing sugars measured by means of PAHBAH test after 19 h
Glucose und Cellobiose gemessen mittels HPLC nach 19 h Glucose and cellobiose measured by HPLC after 19 h
unbekannte lösliche Cellooligomere (Differenz zwischen PAHBAH Test und HPLC Analyse) nach 19 h unknown soluble cellooligomers (difference between PAHBAH test and HPLC analysis) after 19 h
Prozentangabe bezogen auf die gebildete Glucose und Cellobiose bei vollständigem Umsatz der eingesetzten Cellulose  Percentage based on the glucose and cellobiose formed with complete conversion of the cellulose used
Unter Verwendung der Endoglucanasen aus T. maritima und A. niger wurden 87,1 % und 94,5 % unlösliche Cellulose nach der Hydrolyse gemessen. Damit sind diese beiden Enzyme aufgrund des geringen Verlustes an α-Cellulose für einen industriellen Prozess, bei dem lösliche Cellooligomere und Glucose nicht das Ziel der Produktion sind, besonders interessant, wenn es sich bei der unlöslichen Cellulose um kurzkettige Cellooligomere handelt. Der DPW von 150 nach 19 h mittels Endoglucanase aus T. maritima liegt ca. 50 Einheiten über dem DPW der anderen Endoglucanasen nach derselben Hydrolysezeit. Somit werden mit dieser Endoglucanase zwar wenige Nebenprodukte gebildet, jedoch wird der DPW nicht im gleichen Maße reduziert wie unter Verwendung der anderen Endoglucanasen. Mit einem DPW von 1 10 wird bei Verwendung der Endoglucanase aus A. niger ein DPW im gleichen Bereich erreicht, wie bei Verwendung der Endoglucanasen aus B. amyloliquefaciens, T. emersonii und T. lon- gibrachiatum. Die Reduktion des DPW im gleichen Verhältnis und die geringe Produktion von Glucose und löslichen Cellooligomeren im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen macht die Endoglucanase aus A. niger zur favorisierten Endoglucanase zur enzymatischen Hydrolyse von a-Cellulose. Using the T. maritima and A. niger endoglucanases, 87.1% and 94.5% insoluble cellulose were measured after hydrolysis. Thus, due to the low loss of α-cellulose for an industrial process in which soluble cellooligomers and glucose are not the target of production, these two enzymes are of particular interest when the insoluble cellulose is short-chain cellooligomers. The DP W from 150 to 19 h by T. maritima endoglucanase is approximately 50 units above the DP W of the other endoglucanases after the same hydrolysis time. Thus, although few by-products are formed with this endoglucanase, DP W is not reduced to the same extent as using the other endoglucanases. With a DP of 1 W 10, a DP W T. emersonii and T. lon gibrachiatum is using the endoglucanase from A. niger achieved in the same range as when using the endoglucanases from B. amyloliquefaciens. The reduction of DP W in the same proportion and the low production of glucose and soluble cellooligomers compared to the other endoglucanases makes A. niger endoglucanase the favored endoglucanase for the enzymatic hydrolysis of α-cellulose.
Die Endoglucanasen aus B. amyloliquefaciens und T. maritima produzieren mit 0,7 % und 0 % kaum bzw. keine löslichen Cellooligomere. Die Endoglucanasen aus A. niger und T. longibrachiatum produzieren 2,7 % beziehungsweise 3,1 % unbekannte Cellooligomere. Im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen produziert die Endogluca- nase aus T. emersonii mit 27,4 % am meisten unbekannte lösliche Cellooligomere. Damit ist die Endoglucanase aus T. emersonii wohl zur Produktion von löslichen Cellooligomeren geeignet, die größer sind als Cellobiose. The endoglucanases from B. amyloliquefaciens and T. maritima produce little or no soluble cellooligomers at 0.7% and 0%, respectively. The A. niger and T. longibrachiatum endoglucanases produce 2.7% and 3.1% unknown cellooligomers, respectively. Compared to the other endoglucanases, T. emersonii endoglucanase produces the most unknown soluble cellooligomers (27.4%). Thus, the endoglucanase from T. emersonii is probably suitable for the production of soluble cellooligomers, which are larger than cellobiose.
Beispiel 8: Enzymatische Hydrolyse von Sigmacell mittels Endoglucanasen aus A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum und T. emersonii Mit Hilfe der GPCo wurde die Kettenlangenverteilung der Hydrolyseproben von o Cellulose und von Sigmacell ermittelt. Example 8 Enzymatic hydrolysis of Sigmacell using endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens, T. maritima, T. longibrachiatum and T. emersonii With the aid of GPCo, the chain length distribution of the hydrolysis samples of o cellulose and of sigmacell was determined.
A. niger A. niger
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Sigmacell, 10 mg / mL Sigmacell,
10 U/mL Endoglucanase aus A. niger, 10 U / mL endoglucanase from A. niger,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Die Kettenlangenverteilung von Sigmacell ohne enzymatischen Abbau liegt im Bereich zwischen 10 und 1000 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 300 - 400 Glucoseeinheiten und weist im Bereich zwischen 10 und 50 Glucoseeinheiten eine geringere Steigung auf als im Bereich zwischen 50 Glucoseeinheiten und dem Maximum. Die Abflachung liegt nach 5 min Hydrolyse mit der Endoglucanase aus A. niger zwischen 10 bis 20 Glucoseeinheiten. Die Kettenlangenverteilung liegt zwischen 10 und 500 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 100 Glucoseeinheiten. Nach 6 h Hydrolyse liegt das obere Ende der Kettenlangenverteilung zwischen 10 und 350 Glucoseeinheiten und ist somit im Vergleich zu der Kettenlangenverteilung der 5 min Pro- be um 150 Glucoseeinheiten hin zu kürzeren Kettenlängen verschoben. Bei der 6 h Hydrolyseprobe ist keine Abflachung im linken Bereich der Kurve zu erkennen. The chain length distribution of Sigmacell without enzymatic degradation is in the range between 10 and 1000 glucose units, with a maximum at 300-400 glucose units and has a smaller slope in the range between 10 and 50 glucose units in the range between 50 glucose units and the maximum. The flattening after 5 minutes of hydrolysis with A. niger endoglucanase is between 10 and 20 glucose units. The chain length distribution is between 10 and 500 glucose units, with a maximum at 100 glucose units. After 6 h hydrolysis, the upper end of the chain length distribution is between 10 and 350 glucose units and is thus shifted by 150 glucose units towards shorter chain lengths in comparison to the chain length distribution of the 5 min sample. The 6 h hydrolysis sample shows no flattening in the left part of the curve.
B. amyloliquefaciens B. amyloliquefaciens
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Sigmacell, 10 mg / mL Sigmacell,
10 U/mL Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens,  10 U / ml endoglucanase from B. amyloliquefaciens,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A. niger, 3 U / mL β-glucosidase from A. niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Die Kettenlangenverteilung der 5 min Probe der Hydrolyse von Sigmacell mittels Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens liegt zwischen 10 und 400 Glucoseeinheiten. Nach dieser Reaktionszeit ist keine Abflachung zwischen 15 und 50 Glucoseeinheiten zu erkennen. Bis zum Ende des Versuches nach 20 h verschiebt sich das obere Ende der Kettenlangenverteilung kontinuierlich weiter hin zu kürzeren Ketten. Die Verteilung liegt nach dieser Reaktionszeit zwischen 10 und 300 Glucoseeinheiten. Das Maximum verschiebt sich ebenfalls hin zu kürzeren Kettenlängen und liegt bei 65 Glucoseeinheiten. T. maritima The chain length distribution of the 5 min sample of the hydrolysis of Sigmacell by means of B. amyloliquefaciens endoglucanase is between 10 and 400 glucose units. After this reaction time, no flattening between 15 and 50 glucose units can be seen. Until the end of the experiment after 20 h, the upper end of the shifts Chain length distribution continuously on to shorter chains. The distribution is after this reaction time between 10 and 300 glucose units. The maximum also shifts towards shorter chain lengths and is at 65 glucose units. T. maritima
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Sigmacell, 10 mg / mL Sigmacell,
10 U/mL Endoglucanase aus T. maritima, 10 U / ml T. maritima endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger, 3 U / mL β-glucosidase from A niger,
40 °C, 0, 1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0, 1 M acetate buffer pH 4.5
Nach 5 min Hydrolyse mit der Endoglucanase aus T. maritima liegt die Kettenlangenverteilung im gleichen Bereich wie unbehandeltes Sigmacell. Das Maximum der Kettenlangenverteilung ist um 100 Glucoseeinheiten hin zu kürzeren Kettenlängen ver- schoben und eine Zunahme von kurzen Celluloseketten im Bereich 10 bis 200 Glucoseeinheiten ist zu erkennen. Bis zum Versuchsende mit einer Reaktionszeit von 20 h verschiebt sich die Kettenlängenverteilung weiter hin zu kürzeren Kettenlängen und liegt dann zwischen 10 und 400 Glucoseeinheiten. Unter Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima ist im Vergleich zu den Hydrolyseversuchen von Sigmacell mit- tels Endoglucanasen aus A. niger und B. amyloliquefaciens ein langsamerer Abbau von Sigmacell zu beobachten. After hydrolysis for 5 min with the T. maritima endoglucanase, the chain length distribution is in the same range as untreated Sigmacell. The maximum of the chain length distribution is shifted by 100 glucose units to shorter chain lengths and an increase of short cellulose chains in the range of 10 to 200 glucose units can be seen. Until the end of the experiment with a reaction time of 20 h, the chain length distribution shifts further towards shorter chain lengths and then lies between 10 and 400 glucose units. Using the T. maritima endoglucanase, a slower degradation of sigmacell is observed in comparison to Sigmacell hydrolysis experiments using A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases.
T. longibrachiatum T. longibrachiatum
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Sigmacell, 10 mg / mL Sigmacell,
10 U/mL Endoglucanase aus T. longibrachiatum,  10 U / mL T. longibrachiatum endoglucanase,
3 U/mL ß-Glucosidase aus Agrobacterium sp., 3 U / mL β-glucosidase from Agrobacterium sp.,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 Nach 5 min Hydrolyse von Sigmacell mittels Endoglucanase aus T. longibrachiatum liegt die Kettenlängenverteilung zwischen 15 und 800 Glucoseeinheiten. Die Abflachung im vorderen Bereich der Kettenlängenverteilung ist zu diesem Zeitpunkt zwischen 15 und 60 Glucoseeinheiten noch sichtbar, aber in einem kürzeren Bereich als bei unbehandeltem Sigmacell. Das obere Ende der Kettenlängenverteilung und das Maximum der Kettenlangenverteilung verschieben sich im Laufe des Versuches weiter hin zu kürzeren Ketten und die Abflachung nimmt im Laufe des Versuches weiter ab, bis diese nicht mehr zu erkennen ist. Nach 20 h liegt die Kurve zwischen 10 und 300 Glucoseeinheiten mit einem Maximum bei 80 Glucoseeinheiten 40 ° C., 0.1 M acetate buffer pH 4.5 After 5 minutes hydrolysis of Sigmacell by T. longibrachiatum endoglucanase, the chain length distribution is between 15 and 800 glucose units. The flattening at the front of the chain length distribution is still visible between 15 and 60 glucose units at this point, but in a shorter range than untreated Sigmacell. The upper end of the chain length distribution and the In the course of the experiment, the maximum of the chain length distribution shifts further towards shorter chains, and the flattening continues to decrease in the course of the experiment until it is no longer recognizable. After 20 h, the curve is between 10 and 300 glucose units with a maximum at 80 glucose units
T. emersonii T. emersonii
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes:  Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Sigmacell, 10 mg / mL Sigmacell,
10 U/mL Endoglucanase aus T. emersonii,  10 U / mL endoglucanase from T. emersonii,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A. niger, 3 U / mL β-glucosidase from A. niger,
40 °C, 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Die Kettenlangenverteilung der 20 h Probe zeigt im Vergleich zu den anderen Hydrolyseproben einen unerwarteten Verlauf. Nach 1 h Hydrolyse von Sigmacell mittels En- doglucanase aus T. emersonii liegt die Kettenlangenverteilung im Bereich 10 bis 300 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 70 Glucoseeinheiten. Danach ist eine Zunahme der längeren Ketten zu beobachten, wobei der Bereich der Kettenlangenverteilung sich immer weiter verschmälert. Durch die Verschiebung der Kettenlängenvertei- lung hin zu längeren Kettenlängen, verschiebt sich das Maximum der Kurve ebenfalls hin zu längeren Kettenlängen. Die Kettenlängenverteilung liegt nach 6 h Hydrolyse zwischen 10 und 250 Glucoseeinheiten, mit einem Maximum bei 100 Glucoseeinheiten. The chain length distribution of the 20 h sample shows an unexpected course compared to the other hydrolysis samples. After 1 h of hydrolysis of Sigmacell by means of T. emersonii endoglucanase, the chain length distribution ranges from 10 to 300 glucose units, with a maximum at 70 glucose units. Thereafter, an increase in the longer chains can be observed, with the range of the chain length distribution narrowing more and more. By shifting the chain length distribution towards longer chain lengths, the maximum of the curve also shifts towards longer chain lengths. The chain length distribution is after 6 h hydrolysis between 10 and 250 glucose units, with a maximum at 100 glucose units.
Zusammenfassung: Summary:
Beim Vergleich des Abbaus von Sigmacell mittels der fünf eingesetzten Endoglucana- sen wird ein schneller Abbau mittels Endoglucanase aus A. niger und B. amyloliquefa- ciens erreicht. Die Endoglucanasen aus T. maritima und T. longibrachiatum sind im Abbau langsamer. Bei Verwendung der Endoglucanasen aus A. niger, B. amylolique- faciens, T. maritima und T. longibrachiatum liegt das obere Ende der Kettenlängenverteilung nach 19 h Hydrolyse von Sigmacell bei 300 bis 400 Glucoseeinheiten. Unter Verwendung der Endoglucanase aus T. emersonii, ist nach 1 h Hydrolyse eine Zunahme von längeren Ketten zu beobachten. Bei Verwendung von Avicel und der Endoglucanase aus T. emersonii wurde nach 2 h Hydrolyse ebenfalls eine Zunahme von längeren Celluloseketten beobachtet, weshalb nicht davon auszugehen ist, dass es sich bei dieser Beobachtung um Messfehler handelt. Die Ursache dieser Beobachtung ist unklar. Möglich wäre ein vermehrter Abbau von kurzen Ketten, wodurch die schon vorhandenen längeren Ketten im Verhältnis stärker ins Gewicht fallen Comparing the degradation of Sigmacell with the five endoglucanases used, rapid degradation by A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases is achieved. The T. maritima and T. longibrachiatum endoglucanases are slower in degradation. When the endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefiens, T. maritima and T. longibrachiatum are used, the upper end of the chain length distribution after 19 h hydrolysis of Sigmacell is from 300 to 400 glucose units. Using T. emersonii endoglucanase, an increase in longer chains is observed after 1 h of hydrolysis. When Avicel and T. emersonii endoglucanase were used, hydrolysis was also increased after 2 h observed longer cellulose chains, which is why it can not be assumed that this observation is measurement errors. The cause of this observation is unclear. It would be possible an increased degradation of short chains, whereby the already existing longer chains fall in proportion more significant
Beispiel 9; Bestimmung des Polymerisationsgrads DP von enzymatisch hydrolysiertem Sigmacell Example 9; Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolysed Sigmacell
Zur Bestimmung des DP von enzymatisch hydrolysiertem Sigmacell (aus Beispiel 8) wurden GPC Analysen durchgeführt. To determine the DP of enzymatically hydrolysed Sigmacell (from Example 8) GPC analyzes were performed.
Probenzusammensetzung GPCo: Sample composition GPCo:
2 mg/mL Cellulose-Lyophilisat in DMF/19 % EMIM Ac (v/v)  2 mg / mL cellulose lyophilisate in DMF / 19% EMIM Ac (v / v)
Laufmittel: DMF/10 % EMIM Ac (v/v), 50 °C Die Versuchsergebnisse sind in den Figuren 3a bis 3e dargestellt. Eluent: DMF / 10% EMIM Ac (v / v), 50 ° C. The experimental results are shown in FIGS. 3a to 3e.
Nach 5 min Hydrolyse mittels Endoglucanase aus A. niger fällt der DPW auf 130. Der DPN fällt von 1 10 auf 60. Damit wird sowohl der DPW als auch der DPN um mindestens 55 % gesenkt. Nach 20 min Hydrolyse wird ein DPW von 100 und ein DPN von 40 er- reicht. Die Hydrolyse verlangsamt sich somit. Mit einem DPW von 120 steigt der DPW der 1 h und 3 h Proben leicht. Der DPN zeigt einen analogen Verlauf. Der DPW von 100 und DPN von 50 nach 6 h Reaktionszeit untermauern die Annahme, dass der Anstieg des DPW und DPN nach 1 h und 3 h Hydrolysezeit wahrscheinlich ebenfalls durch Messstörungen begründet ist. After hydrolysis for 5 minutes using A. niger endoglucanase, the DP W drops to 130. The DP N drops from 1 10 to 60. This reduces both the DP W and the DP N by at least 55%. After 20 minutes of hydrolysis, a DP W of 100 and a DP N of 40 are reached. The hydrolysis slows down thus. With a DP W of 120, the DP W of the 1 h and 3 h samples increases slightly. The DP N shows an analogue course. The DP W of 100 and DP N of 50 after 6 h reaction time support the assumption that the increase in DP W and DP N after 1 h and 3 h hydrolysis time is probably also due to measurement disturbances.
Bei Verwendung der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens kann der DPW nach 5 min Hydrolyse auf 50 % des Ausgangswertes gesenkt werden. Bis zum Ende des Versuches fällt der DPW weiter auf 80 und stagniert dann. Ein analoger Verlauf ist bei dem DPN zu beobachten. Dieser halbiert sich ebenfalls nach 5 min Hydrolyse und stagniert dann nach 40 min bei einem DPN von 50. Es wird ein Abbaustopp erreicht. Die Hydrolyse von Sigmacell mittels Endoglucanase aus T. emersonii und T. longibra- chiatum verläuft langsamer als die Hydrolyse durch die Endoglucanasen aus A. niger und B. amyloliquefaciens. Nach einer Reaktionszeit von 5 min liegt der DPw bei Verwendung der Endoglucanase aus T. emersonii bei 150. Nach 1 h Reaktionszeit sinkt der DPW weiter auf 75. Der DPN liegt zu diesem Zeitpunkt bei 40. Nach 3 h Hydrolyse ist ein Anstieg des DPW zu beobachten. Auch bei Hydrolyse von α-Cellulose mit der Endoglucanase aus T. emersonii, steigt sowohl der DPW als auch der DPN nach 2 h Hydrolyse an. Eine mögliche Ursache wäre ein vermehrter Abbau kurzer Ketten, wodurch die schon vorhandenen längeren Ketten im Verhältnis stärker ins Gewicht fallen. When using the endoglucanase from B. amyloliquefaciens of DP W can be reduced to 50% of the initial value after hydrolysis min. 5 By the end of the experiment, the DP W falls further to 80 and then stagnates. An analogous course can be observed with the DP N. This is also halved after 5 min of hydrolysis and then stagnates after 40 min at a DP N of 50. It is achieved a degradation stop. The hydrolysis of Sigmacell by T. emersonii and T. longibrachiatum endoglucanase proceeds more slowly than hydrolysis by the A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases. After a reaction time of 5 min, the DPw is at 150 using the T. emersonii endoglucanase. After 1 h reaction time decreases the DP W is still at 75. The DP N is at 40 at this point. After 3 h of hydrolysis, an increase in the DP W is observed. Also, upon hydrolysis of α-cellulose with T. emersonii endoglucanase, both DP W and DP N increase after 2 h of hydrolysis. A possible cause would be an increased dismantling of short chains, as a result of which the longer chains that already exist fall more in proportion.
Bei Verwendung der Endoglucanase aus T. longibrachiatum wird nach einer Reaktionszeit von 5 min ein DPW von 200 erreicht. Nach 1 h Reaktionszeit sinkt der DPW weiter auf 130. Der DPN liegt zu diesem Zeitpunkt bei 65. Nach 1 h wird die Cellulose bei Verwendung der Endoglucanase aus T. longibrachiatum weiter abgebaut und nach Beendigung des Versuches wird ein DPW von 80 und ein DPN von 50 erreicht. When T. longibrachiatum endoglucanase is used, a DP W of 200 is reached after a reaction time of 5 min. After 1 h of reaction time, the DP W further drops to 130. The DP N is at this point at 65. After 1 h, the cellulose is further degraded using T. longibrachiatum endoglucanase and after completion of the experiment a DP W of 80 and reached a DP N of 50.
Die Hydrolyse von Sigmacell mittels der Endoglucanase aus T. maritima verläuft lang- samer als die Hydrolysen von Sigmacell mittels Endoglucanasen aus A. niger, B. amyloliquefaciens, T. emersonii und T. longibrachiatum. Nach 20 h Reaktionszeit ist der DPW mit 100 und der DPN mit 45 im selben Bereich wie bei Verwendung der Endoglucanase aus A. niger nach 6 h Reaktionszeit. Nach 20 h Hydrolyse mittels der vorgestellten Endoglucanasen kann der DPW auf weniger als die Hälfte des Ausgangswertes gesenkt werden. Dabei unterscheiden sich die verwendeten Endoglucanasen in ihrer Reaktionsrate und im DPW, der am Ende des Versuches erreicht wird. Die niedrigsten DP-Werte können unter Verwendung der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens und T. longibrachiatum erreicht werden. Bei der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens ist eine Stagnation des DPW bei 80 zu beobachten. Es wird demnach ein Abbaustopp erreicht. Bei den Endoglucanasen aus A. niger, T. maritima und T. emersonii nimmt der DPW bis zum Versuchsende ab. Es wird somit kein Abbaustopp erreicht. Aufgrund der im Vergleich zu den anderen Endoglucanasen schnelleren Reaktionsgeschwindigkeit der Endoglucanasen aus A. niger und B. amyloliquefaciens sind diese Endoglucanasen für weitere experimentelle Untersuchungen besonders interessant. Wie auch bei Avicel und α-Cellulose wurde für Sigmacell ebenfalls die Polydispersitat aus dem DPW und DPN berechnet und sind folgender Tabelle zu entnehmen.. The hydrolysis of Sigmacell by T. maritima endoglucanase is slower than sigmacell hydrolyses using A. niger, B. amyloliquefaciens, T. emersonii and T. longibrachiatum endoglucanases. After 20 h of reaction time, the DP W with 100 and the DP N with 45 in the same range as when using the A. niger endoglucanase after 6 h reaction time. After 20 h of hydrolysis by means of the endoglucanases presented, the DP W can be reduced to less than half of the initial value. The endoglucanases used differ in their reaction rate and in DP W , which is reached at the end of the experiment. The lowest DP values can be achieved using B. amyloliquefaciens and T. longibrachiatum endoglucanase. In B. amyloliquefaciens endoglucanase stagnation of DP W at 80 is observed. It is therefore achieved a mining stop. In the case of the endoglucanases from A. niger, T. maritima and T. emersonii, the DP W decreases until the end of the experiment. It is thus achieved no loss of construction. Because of the faster reaction rate of the A. niger and B. amyloliquefaciens endoglucanases compared to the other endoglucanases, these endoglucanases are of particular interest for further experimental investigations. As with Avicel and α-cellulose, the polydispersity of DP W and DP N was also calculated for Sigmacell and can be seen in the following table.
PolymerisationsPolygrad disper¬Polymerization Polygrad disper¬
Endogiucanase DPN sitat Endogiucanase DP N sitat
A niger (6 h) 100 V  A niger (6 h) 100 V
B. amytofiq - O 45 ^  B. amytofiq - O 45 ^
feciens  feciens
T. maritima 100 V 45 2,2  T. maritima 100V 45 2.2
T. fongibra- 85 X 45 V 1 ,9  T. fongibra- 85 X 45 V 1, 9
chtaium  chtaium
T. emersonii 80 X 40 \ 2  T. emersonii 80 X 40 \ 2
{1 h) DPW , DPN und CLD Bestimmung mittels GPC0 (Software: ASTRA) Pfeile zeigen den jeweiligen Trend {1 h) DP W , DP N and CLD Determination by GPC 0 (Software: ASTRA) Arrows show the respective trend
Die DP- und Polydispersitätsergebnisse der enzymatischen Hydrolyse mittels Endogiucanase aus A. niger und T. emersonii korrelieren nicht miteinander. Bei diesen En- doglucanasen wurden jedoch aufgrund von Messfehlern bei den Hydrolyseproben der Endogiucanase aus A. niger und einem ungewöhnlichen DP Anstieg der Hydrolyseproben der Endogiucanase aus T. emersonii keine DP Ergebnisse nach 1 d verwendet. Der DPW und die Polydispersitat der anderen Endoglucanasen mit einer Hydrolysezeit von 1 d korrelieren, wie auch schon bei Avicel und α-Cellulose beobachtet, mit- einander. The DP and polydispersity results of enzymatic hydrolysis using A. niger and T. emersonii endogiucanases do not correlate. In these endoglucanases, however, no DP results after 1 d were used due to measurement errors in the hydrolysis samples of the A. niger endogiucanase and an unusual DP increase in the hydrolysis samples of T. emersonii endogiucanase. The DP W and the polydispersity of the other endoglucanases with a hydrolysis time of 1 d correlate, as already observed with Avicel and α-cellulose.
Beispiel 10: Massenbilanz der Hydrolyse von Sigmacell Example 10: Mass balance of the hydrolysis of Sigmacell
Die Messergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefasst: 1 unlöslich löslich The measurement results are summarized in the following table: 1 insoluble soluble
Endoglucanase Cellulose reduGiucose unbekannte Massen¬ Endoglucanase cellulose reduGiucose unknown Massen¬
< [%] zierende und lösliche Celbilanz <[%] ornamental and soluble celloscale
Zucker > Cetlobiose looligomere [%]  Sugar> Cetlobiose looligomers [%]
[%] [%] (G/c3- G/c6) [%] [%] (G / c 3 - G / c 6 )
> [%]  > [%]
A. niger 87,9 12,5 9,0 3 ,.5 100,4 A. niger 87.9 12.5 9.0 3, .5 100.4
B. amyioliquefaci- 78 20,5 18,9 1,7 98 ens B. amyioliquefaci- 78 20.5 18.9 1.7 98 ens
T. maritima 100 9,1 6,9 ? 9 109,1 T. maritima 100 9.1 6,9? 9 109.1
T. longibrachiatum 58,2 48,6 23.2 106,8T. longibrachiatum 58.2 48.6 23.2 106.8
T. emersonii 5 jQ 46,2 33., 5 12,7 103,2 unlösliche Cellooligomere gemessen mittels Celluloseverlustbestimmung nach 20 h reduzierende Zucker gemessen mittels PAHBAH-Test nach 20 h T. emersonii 5 j Q 46.2 33., 5 12.7 103.2 insoluble cellooligomers measured by determination of cellulose loss after 20 h reducing sugars measured by PAHBAH test after 20 h
Giucose und Cellobiose gemessen mitttels HPLC nach 20 h Giucose and cellobiose measured by HPLC after 20 h
unbekannte lösliche Cellooligomere (Differenz zwischen PAHBAH Test und HPLC Analyse) nach 20 h unknown soluble cellooligomers (difference between PAHBAH test and HPLC analysis) after 20 h
Prozentangabe bezogen auf die gebildete Giucose und Cellobiose bei vollständigem Umsatz der eingesetzten Cellulose Unter Verwendung der Endoglucanasen aus A niger wurden 87,9 % unlösliche Cellulose nach der Hydrolyse gemessen. Bei Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima wurden 100 % unlösliche Cellulose gemessen. Damit sind diese beiden Enzyme aufgrund des geringen Verlustes an Sigmacell für einen industriellen Prozess, bei dem lösliche Cellooligomere und Giucose nicht das Ziel der Produktion sind, besonders interessant.  Percentage based on the formed glucose and cellobiose with complete conversion of the cellulose used. Using the endoglucanases from A niger, 87.9% of insoluble cellulose were measured after the hydrolysis. Using T. maritima endoglucanase, 100% insoluble cellulose was measured. Thus, these two enzymes are particularly interesting because of the low loss of Sigmacell for an industrial process in which soluble cellooligomers and glucose are not the target of production.
Mittels PAHBAH Test wurde bei der Hydrolyse von Sigmacell mittels Endoglucanase aus T. maritima ein Anteil von 9,1 % an reduzierenden Zuckern bestimmt. Der Anteil von 100 % unlöslicher Cel- lulose ist demnach zu hoch, da mindestens 9,1 % der ein- gesetzten Cellulose in Giucose und lösliche Cellooligomere umgesetzt wurden. Bei Verwendung der Endoglucanasen aus B. amyloliquefaciens , T. maritima und A. niger werden unter 4 % unbekannte lösliche Cellooligomere produziert. Unter Verwendung der Endoglucanasen aus T. emersonii und T. longibrachiatum werden 12,7 % bzw. 25,4 % unbekannte lösliche Cellooligomere produziert. Damit sind diese Endoglucana- sen zur Produktion von löslichen Cellooligomeren geeignet. Beispiel 11. Zweite enzymatische Hydrolyse der Cellulosen nach erneuter Vorbehandlung mit ionischer Flüssigkeit: (IL Restart) Mittels IL-Restart wird die bereits 2 Tage per enzymatischer Hydrolyse abgebaute Cel- lulose nochmals in Ionischer Flüssigkeit aufgelöst und anschließend gefällt. Durch die erneute Vorbehandlung wird die Cellulose nochmals aufgeschlossen. Ein substratbedingter Abbaustopp kann mit Hilfe dieser Methode untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind im Folgenden beschrieben. By means of the PAHBAH test, a proportion of 9.1% of reducing sugars was determined in the hydrolysis of Sigmacell using T. maritima endoglucanase. The proportion of 100% insoluble cellulose is therefore too high, since at least 9.1% of the cellulose used was converted into glucose and soluble cellooligomers. When using the endoglucanases from B. amyloliquefaciens, T. maritima and A. niger, below 4% unknown soluble cellooligomers are produced. Using T. emersonii and T. longibrachiatum endoglucanases, 12.7% and 25.4%, respectively, of unknown soluble cellooligomers are produced. Thus, these endoglucanases are suitable for the production of soluble cellooligomers. EXAMPLE II Second Enzymatic Hydrolysis of the Celluloses After Renewed Pretreatment with Ionic Liquid: (IL Restart) Using IL restarts, the cellulose, which has already been degraded by enzymatic hydrolysis for 2 days, is redissolved in ionic liquid and then precipitated. By re-pretreatment, the cellulose is digested again. A substrate-related degradation stop can be investigated using this method. The results of these investigations are described below.
Für diese Versuche wurden die Endoglucanasen aus A. niger, B. amyloliquefaciens und T. maritima verwendet, da sie aufgrund der geringen Gelöstzuckerproduktion für die Herstellung von Cellooligomeren besonders interessant sind. Diese Untersuchungen wurden mit dem kurzkettigen Substrat Avicel und dem langkettigen Substrat o Cellulose durchgeführt, um eine Kettenlängenabhängigkeit zu untersuchen. The endoglucanases from A. niger, B. amyloliquefaciens and T. maritima were used for these experiments since they are of particular interest for the preparation of cellooligomers because of their low sugar production. These studies were performed with the short chain substrate Avicel and the long chain substrate o cellulose to study chain length dependence.
Beispiel 11a: Hydrolyse von Avicel nach IL Restart: Example 11a: Hydrolysis of Avicel to IL Restart:
Zur Analyse der weiterführenden Hydrolyseversuche von Avicel wurden die Proben mittels GPCo analysiert. To analyze the further hydrolysis experiments of Avicel, the samples were analyzed by GPCo.
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL Avicel, 10 mg / mL Avicel,
10 U/mL Endoglucanase aus A. niger, B. amyloliquefaciens bzw. T. maritima,  10 U / ml endoglucanase from A. niger, B. amyloliquefaciens or T. maritima,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A. niger bzw. Agrobacterium sp., 3 U / mL β-glucosidase from A. niger or Agrobacterium sp.,
40 °C, 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 bzw 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5  40 ° C, 0.1 M phosphate buffer pH 6 or 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Bei den Kettenlangenverteilungen der Proben, bei denen ein IL-Restart durchgeführt wurde, ist eine Verschiebung des oberen Endes der Kettenlängenverteilung, im Ver- gleich zur einfachen Hydrolyse hin zu kürzeren Ketten zu beobachten. Die bei der zweiten Hydrolyse entstehenden Kettenlangenverteilungen unterscheiden sich je nach eingesetzter Endoglucanase. Bei Verwendung der Endoglucanase aus A. niger und B. amyloliquefaciens ist nach Durchführung eines IL-Restarts eine Zunahme von Cellooligomeren mit einer Größe von 18 Glucoseeinheiten zu erkennen. Durch die Zunahme von Cellooligomeren mit einer Größe von 18 Glucoseeinheiten liegt bei der Hydrolyse mittels Endoglucanase aus A. niger nach Durchführung eines IL-Restarts ein weiteres Maximum bei 18 Glucoseeinheiten vor. Unter Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima ist nach Durchführung eines IL-Restarts eine Zunahme von Cellooligomeren mit einer Größe von 15 Glucoseeinheiten zu beobachten. In the chain length distributions of the samples in which an IL restart was performed, a shift of the upper end of the chain length distribution is observed in comparison to the simple hydrolysis towards shorter chains. The chain length distributions resulting from the second hydrolysis differ depending on the endoglucanase used. When the endoglucanase from A. niger and B. amyloliquefaciens is used, an increase in cellooligomers with a size of 18 glucose units can be seen after performing an IL restart. By the increase of cellooligomers with a size of 18 glucose units, the hydrolysis by A. niger endoglucanase gives a further maximum at 18 glucose units after carrying out an IL restart. Using the T. maritima endoglucanase, an increase in cellooligomers of 15 glucose units is observed after performing an IL restart.
Beispiel 11 b: Bestimmung des Polymerisationsgrads DP von enzymatisch hydro- lysiertem Avicel nach IL Restart Example 11b: Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolyzed Avicel after IL restart
Zur Bestimmung des DP von enzymatisch hydrolysiertem Avicel (aus Beispiel 1 1 a) wurden GPC Analysen durchgeführt. To determine the DP of enzymatically hydrolysed Avicel (from Example 11a), GPC analyzes were carried out.
Probenzusammensetzung GPCo: Sample composition GPCo:
2 mg/mL Cellulose-Lyophilisat in DMF/19 % EMIM Ac (v/v) 2 mg / mL cellulose lyophilisate in DMF / 19% EMIM Ac (v / v)
Laufmittel: DMF/10 % EMIM Ac (v/v), 50 °C Eluent: DMF / 10% EMIM Ac (v / v), 50 ° C
Die Versuchsergebnisse sind in den Figuren 4a bis 4c dargestellt. Nach 21 h Hydrolyse mittels Endoglucanase aus A niger wird ein DPW von 85 erzielt. Die Analyse der Probe, die 45 h inkubiert wurde, zeigt, dass die Cellulose nicht weiter abgebaut wird. Der DPW steigt sogar auf 95. Die Reaktionszeit von 1 d reicht demnach bei Verwendung dieser Endoglucanase und Avicel aus. Durch die Behandlung mittels IL-Restart kann der der DPW auf die Hälfte des Wertes nach einmaliger Hydrolyse gesenkt werden. Die Methode des IL-Restarts ist demnach eine geeignete Methode, um Cellulose mit einem DPW von 40 herzustellen. The test results are shown in FIGS. 4a to 4c. After 21 h of hydrolysis by means of endoglucanase from A niger, a DP W of 85 is achieved. The analysis of the sample, which was incubated for 45 h, shows that the cellulose is not further degraded. The DP W even increases to 95. The reaction time of 1 d is therefore sufficient when using this endoglucanase and Avicel. Through the treatment by IL-restart of the DP W can be reduced to half of the value after a single hydrolysis. The method of IL restarts is therefore a suitable method to produce cellulose with a DP W of 40.
Bei Verwendung der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens liegt der DPW der Pro- ben bis auf die der Restart-Versuche zwischen 55 und 65. Bei Verwendung der Methode IL-Restart wird ein DPW von 35 erreicht Bei Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima liegt der DPW der 1 d- und 2 d- Proben bei 80. Die Methode des IL-Restarts führt zu einem DPW von 55. Mit dieser Methode kann der DPW um mindestens 30 % gegenüber dem der einfachen Hydrolyse reduziert werden. When B. amyloliquefaciens endoglucanase is used, the DP W of the samples is between 55 and 65, except for the Restart experiments. Using the IL Restart method, a DP W of 35 is achieved When using the T. maritima endoglucanase, the DP W of the 1 d and 2 d samples is 80. The IL restarts method results in a DP W of 55. With this method, the DP W can be reduced by at least 30% reduced to the simple hydrolysis.
Beispiel 11 c: Hydrolyse von α-Cellulose nach IL Restart Example 11c: Hydrolysis of α-cellulose after IL restart
Zur Analyse der weiterführenden Hydrolyseversuche von alpha-Cellulose wurden die Proben mittels GPC analysiert. To analyze the further hydrolysis experiments of alpha-cellulose, the samples were analyzed by GPC.
Zusammensetzung des Hydrolyseansatzes: Composition of the hydrolysis batch:
10 mg/mL alpha-Cellulose, 10 mg / mL alpha-cellulose,
10 U/mL Endoglucanase aus A. niger, B. amyloliquefaciens bzw. T. maritima,  10 U / ml endoglucanase from A. niger, B. amyloliquefaciens or T. maritima,
3 U/mL ß-Glucosidase aus A niger bzw. Agrobacterium sp., 3 U / mL β-glucosidase from Aiger or Agrobacterium sp.,
40 °C, 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 bzw 0,1 M Acetatpuffer pH 4,5 40 ° C, 0.1 M phosphate buffer pH 6 or 0.1 M acetate buffer pH 4.5
Aus den Kettenlängenverteilungen der Hydrolyseversuche von α-Cellulose mit den eingesetzten Enzymen ergibt sich im Wesentlichen ein analoges Bild zur Avicel- Hydrolyse. Lediglich die IL-Restart-Experimente führen zu signifikant reduzierten Mole- kulargewichten. Bei Verwendung der Endoglucanase aus A. niger ist nach Durchführung eines IL-Restarts eine Zunahme von Cellooligomeren mit einer Größe von 18 Glucoseeinheiten zu erkennen. Die Kettenlängenverteilung verschiebt sich nach Durchführung eines IL-Restarts hin zu kürzeren Ketten und liegt zwischen 10 und 200 Glucoseeinheiten. Bei Verwendung der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens zur Hydrolyse von α-Cellulose verschiebt sich das Maximum der Kettenlängenverteilung nach Durchführung eines IL- Restarts um 30 Glucoseeinheiten hin zu kürzeren Kettenlängen. Nach Durchführung eines IL-Restarts unter Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima ist keine Verschiebung des oberen Endes der Kettenlängenverteilung oder des Maximums der Kettenlängenverteilung hin zu kürzeren Kettenlängen zu be- obachten. The chain length distributions of the hydrolysis experiments of α-cellulose with the enzymes used essentially give an analogous picture of Avicel hydrolysis. Only the IL restart experiments lead to significantly reduced molecular weights. When A. niger endoglucanase is used, an increase in cellooligomers with a size of 18 glucose units can be seen after performing an IL restart. The chain length distribution shifts to shorter chains after carrying out an IL restart and is between 10 and 200 glucose units. When B. amyloliquefaciens endoglucanase is used for the hydrolysis of α-cellulose, the maximum of the chain length distribution shifts by 30 glucose units to shorter chain lengths after carrying out an IL restart. After carrying out an IL restart using the T. maritima endoglucanase, no shift of the upper end of the chain length distribution or of the maximum of the chain length distribution towards shorter chain lengths can be observed.
Beispiel 11 d: Bestimmung des Polymerisationsgrads DP von enzymatisch hydro- lysierter alpha-Cellulose nach IL Restart Zur Bestimmung des DP von enzymatisch hydrolysierter alpha-Cellulose (aus Beispiel 1 1 c) wurden GPC Analysen durchgeführt. Example 11 d: Determination of the degree of polymerization DP of enzymatically hydrolysed alpha-cellulose after IL restart To determine the DP of enzymatically hydrolysed alpha-cellulose (from Example 11c), GPC analyzes were carried out.
Probenzusammensetzung GPC0: Sample composition GPC 0 :
2 mg/mL Cellulose-Lyophilisat in DMF/19 % EMIM Ac (v/v) 2 mg / mL cellulose lyophilisate in DMF / 19% EMIM Ac (v / v)
Laufmittel: DMF/10 % EMIM Ac (v/v), 50 °C Eluent: DMF / 10% EMIM Ac (v / v), 50 ° C
Die Versuchsergebnisse sind in den Figuren 5a bis c dargestellt. Bei den Endoglucanasen aus A. niger und T. maritima kann durch Verlängerung der Reaktionszeit auf 2 d eine Reduktion des DPW erreicht werden. Dies ist bei der En- doglucanase aus B. amyloliquefaciens unklar, da die Probe mit 1 d Hydrolyse aufgrund von Problemen beim Lyophilisieren verworfen wurde. Für die Endoglucanase aus A. niger wird bei Verwendung des IL-Restarts der DPW um 40% gegenüber der einfachen Hydrolyse nach 2 d gesenkt. The test results are shown in FIGS. 5a to c. In the case of the endoglucanases from A. niger and T. maritima, a reduction of the DP W can be achieved by extending the reaction time to 2 d. This is unclear in the B. amyloliquefaciens endoglucanase, since the sample was discarded with 1 d of hydrolysis due to problems with lyophilization. For A. niger endoglucanase, using the IL restarts, the DP W is reduced by 40% over simple hydrolysis after 2 days.
Bei Verwendung der Methode des IL-Restarts mit der Endoglucanase aus B. amyloliquefaciens kann der DPW um 36 % gegenüber der einfachen Hydrolyse nach 2 d ge- senkt werden. When using the IL restarts method with the B. amyloliquefaciens endoglucanase, the DP W can be reduced by 36% compared with the simple hydrolysis after 2 days.
Unter Verwendung der Endoglucanase aus T. maritima wird nach 1 d Hydrolyse ein- DPW von 140 und nach 2 d Hydrolyse ein DPW von 120 erreicht. Durch die Durchführung eines IL-Restarts kann im Vergleich zur einfachen Hydrolyse kein weiterer Abbau erreicht werden. Using T. maritima endoglucanase, a DP W of 120 is achieved after 1 d of hydrolysis of DP W of 140 and after 2 d of hydrolysis. By performing an IL restart, no further degradation can be achieved compared to simple hydrolysis.
Bis zum Versuchsende von 2 d nimmt der DPW bei der einfachen Hydrolyse ab; es wird somit kein Abbaustopp erreicht. Mit der Methode des IL-Restarts kann α-Cellulose mit einem DPW von 55 hergestellt werden. Die in den Beispielen verwendete ß-Glucosidase stellt eine optionale weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Im Rahmen erfindungsgemäßer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass deren Verwendung nicht zwingend notwendig ist. Es ist bekannt, dass ß-Glucosidase eine eventuelle Produktinhibierung der Endogluca- nasen durch die Gegenwart von Cellulose-Abbauprodukten (insbesondere Cellobiose) verhindern kann. Die tatsächliche Notwendigkeit zur Verwendung dieses Enzyms kann aber durch wenige routinemäßige Vorversuche bestimmt werden. By the end of the experiment, the DP W decreases in the case of simple hydrolysis; it is thus achieved no loss of construction. With the IL Restart method α-cellulose can be produced with a DP W of 55. The β-glucosidase used in the examples represents an optional further embodiment of the invention. In the context of investigations according to the invention it has been possible to show that their use is not absolutely necessary. It is known that β-glucosidase can prevent possible product inhibition of the endoglucanases by the presence of cellulose degradation products (in particular cellobiose). The actual need to use this enzyme, however, can be determined by a few routine preliminary experiments.
Auf die Offenbarung der hierin genannten Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen. The disclosure of the references cited herein is incorporated by reference.

Claims

Patentansprüche claims
Verfahren zur Herstellung von Cellooligomeren, wobei man Process for the preparation of cellooligomers, wherein
a) Cellulose (Cellulose-haltiges Ausgangsmaterial) in einem wässrigen Reaktionsmedium mit wenigstens einer Endoglucanase (EG) (E.C.3.2.1.4) hydrolytisch spaltet und a) hydrolytically cleaves cellulose (cellulose-containing starting material) in an aqueous reaction medium with at least one endoglucanase (EC) (E.C.3.2.1.4) and
b) das Reaktionsprodukt, umfassend ein oder mehrere Cellooligomere (eine Cellooligomerfraktion) aus dem Reaktionsmedium isoliert. b) the reaction product comprising one or more cellooligomers (a cellooligomer fraction) isolated from the reaction medium.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das(die) gebildete(n) Cellooligomer(e) eine zahlenmittlere Kettenlänge (einen zahlenmittleren Polymerisationsgrad; DPN) im Bereich von 10 bis 100 aufweist (aufweisen). The process of claim 1 wherein the cellooligomer (s) formed have a number average chain length (number average degree of polymerization; DP N ) in the range of 10 to 100.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das(die) gebildetein) Cellooligomer€ einen DPN-Wert im Bereich von 15 bis 50 aufweist (aufweisen). A method according to any one of the preceding claims wherein the cellooligomer (s) formed have a DP N value in the range of 15 to 50.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die EG ein natürliches oder rekombinant hergestelltes, ggf. genetisch verändertes Enzym aus Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Aspergillus oder Thermotoga, insbesondere der Species Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus niger oder Thermotoga maritima, oder eine Kombination aus wenigstens zwei dieser natürlichen oder rekom- binanten Enzyme ist. Method according to one of the preceding claims, wherein the EC is a naturally or recombinantly produced, possibly genetically modified enzyme from microorganisms of the genus Bacillus, Aspergillus or Thermotoga, in particular the species Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus niger or Thermotoga maritima, or a combination of at least two of these natural or recombinant enzymes.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man die enzymati- sche Hydrolyse in einem wässrigen Medium bei einem pH im Bereich von etwa 3 bis 8, insbesondere 4 bis 7 und/oder bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 90 °C, insbesondere 30 bis 80 °C und/ oder über eine Dauer von 0,1 bis 100Method according to one of the preceding claims, wherein the enzymatic hydrolysis in an aqueous medium at a pH in the range of about 3 to 8, in particular 4 to 7 and / or at a temperature in the range of 20 to 90 ° C, in particular 30 to 80 ° C and / or over a period of 0.1 to 100
Stunden, insbesondere 1 bis 48 Stunden, durchführt. Hours, in particular 1 to 48 hours.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man wenigstens eine EG in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 100, wie z. B. 1 bis 50 oder 2 bis 10 U/ml Reaktionsansatz einsetzt. Method according to one of the preceding claims, wherein at least one EG in a concentration of about 0.01 to 100, such as. B. 1 to 50 or 2 to 10 U / ml reaction mixture begins.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man Cellulose in eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 5 % (w/v) bezogen auf das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes einsetzt. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man die Cellulose a1 ) einem Vorbehandlungsschritt unterzieht, durch welchen die Kristallinität der Cellulose verringert wird, und man A process according to any one of the preceding claims, wherein cellulose is used in a concentration ranging from 0.1 to 5% (w / v) based on the total volume of the reaction mixture. A process according to any one of the preceding claims wherein the cellulose a1) is subjected to a pretreatment step whereby the crystallinity of the cellulose is reduced, and
a2) die Cellulose aus Schritt a1 ) enzymatisch mittels der EG hydrolysiert.  a2) the cellulose from step a1) is hydrolyzed enzymatically by means of the EG.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Kristallinität der Cellulose durch Behandlung in Schritt a1 ) mittels ionischer Flüssigkeit, Säure und/oder durch mechanischen Energieeintrag verringert wird. 9. The method of claim 8, wherein the crystallinity of the cellulose is reduced by treatment in step a1) by means of ionic liquid, acid and / or by mechanical energy input.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die ionische Flüssigkeit ausgewählt ist unter Salzen, die unterhalb einer Temperatur von 100°C flüssig sind, wie insbesondere 1 -Ethyl-3-methylimidazoliumacetat (EMIM Ac) und 3-Methyl-N- butylpyridiniumchlorid ([C4mpy]CI). 10. The method of claim 9, wherein the ionic liquid is selected from salts which are liquid below a temperature of 100 ° C, in particular 1-ethyl-3-methylimidazoliumacetat (EMIM Ac) and 3-methyl-N-butylpyridinium chloride ( C4mpy] CI).
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, wobei man in Schritt a1 ) Cellulose in der ionischen Flüssigkeit vorlegt, ggf. unter Temperatureinwirkung löst und anschließend durch Zugabe von Wasser, einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon ausfällt, den Niederschlag abtrennt ggf. wäscht und ggf. Flüssigkeit entfernt. 1 1. A process according to claim 10, wherein in step a1) cellulose is initially introduced into the ionic liquid, optionally dissolved under the action of temperature and then precipitated by addition of water, an organic solvent or a mixture thereof, the precipitate is separated off if necessary and if appropriate liquid is removed ,
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt a1 ) die Säurebehandlung mit konzentrierter Phosphorsäure erfolgt. 12. The method of claim 9, wherein in step a1) the acid treatment is carried out with concentrated phosphoric acid.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt a1 ) die mechanische Behandlung mittels einer Kugelmühle erfolgt. A method according to claim 9, wherein in step a1) the mechanical treatment takes place by means of a ball mill.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man die Behandlungsschritte, insbesondere die Schritte a1 ) und a2) ein- oder mehrfach wiederholt, bevor man das Reaktionsprodukt isoliert. Process according to one of the preceding claims, wherein the treatment steps, in particular the steps a1) and a2), are repeated one or more times before the reaction product is isolated.
Verwendung eines Cellooligomers, hergestellt mittels eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, als Zusatz zu Nahrungs- und Futtermittel, kosmetischen oder pharmazeutischen Mitteln, als Waschmittelzusatz als Rheolo- giemodifizierer und als Ausgangsprodukt für organische Synthesen. Use of a cellooligomer prepared by a process according to any one of the preceding claims as an additive to food and feed, cosmetic or pharmaceutical agents, as detergent additive as rheology modifier and as starting material for organic syntheses.
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