EP3008194A2 - Erfahren zur herstellung von organischen verbindungen aus knallgas und co2 über acetoacetyl-coa als zwischenprodukt - Google Patents

Erfahren zur herstellung von organischen verbindungen aus knallgas und co2 über acetoacetyl-coa als zwischenprodukt

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EP3008194A2
EP3008194A2 EP14727495.5A EP14727495A EP3008194A2 EP 3008194 A2 EP3008194 A2 EP 3008194A2 EP 14727495 A EP14727495 A EP 14727495A EP 3008194 A2 EP3008194 A2 EP 3008194A2
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EP
European Patent Office
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enzyme
coa
activity
necator
proteins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14727495.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eva Maria Wittmann
Thomas Haas
Steffen Schaffer
Markus PÖTTER
Yvonne Schiemann
Nicole KIRCHNER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Priority to EP14727495.5A priority Critical patent/EP3008194A2/de
Publication of EP3008194A2 publication Critical patent/EP3008194A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01009—Acetyl-CoA C-acetyltransferase (2.3.1.9)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Definitions

  • the present invention is a process for the preparation of organic compounds comprising the process steps
  • Fuel value can be converted.
  • carbohydrates such as glucose, dextrose or glycerol, are subject to strong
  • Carbohydrates such as glucose, dextrose or glycerin, are not available in sufficient quantities as raw materials in all regions.
  • Fermentation raw materials are in competition with the use as food.
  • Biocatalysts and with H 2 and C0 2 as raw materials under energetically favorable, aerobic Conditions are not yet available today, but would make it possible, in terms of raw materials and regional highly flexible, these chemicals from low-cost raw materials or waste streams (natural gas, municipal waste, biomass, converter gas, etc.).
  • Another object of the invention is the use of the disclosed in the context of the invention oxyhydrogen bacteria for the production of organic compounds.
  • the present invention thus provides a process for the preparation of an organic compound comprising the process steps
  • explosive gas bacterium a bacterium capable of growing chemolithoautotrophically and of H 2 and C0 2 in the presence of oxygen
  • the oxyhydrogen bacteria used in the process according to the invention are preferably those which already represent oxyhydrogen bacteria as wild-type.
  • Oxy-gas bacteria preferably used according to the invention are selected from the genera Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga, Hydrogenophilus,
  • Methanobrevibacter Myobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas,
  • Rhodopseudomonas Rhodospirillum, Streptomyces, Thiocapsa, Treponema, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, cupriavidus being particularly preferred
  • Cupriavidus necator also known as Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydrogenomonas eutropha
  • Achromobacter ruhlandii Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis
  • Alcaligenes hydrogenophilus Alcaligenes latus
  • Anabena cylindrica Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus
  • Arthrobacter strain 11X Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Cupriavidus necator, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenobacter thermophilus, Hydro
  • Treponema monia, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus, Xanthobacter flavus in particular from the strains Cupriavidus necator H 16, Cupriavidus necator H1 or Cupriavidus necator Z-1.
  • the explosive gas bacterium of the method according to the invention has an increased compared to its wild type activity of an enzyme E- ⁇ .
  • wild-type of a cell is meant herein a cell whose genome is in a state as naturally evolved by evolution. The term is used for both the entire cell and for individual genes therefore in particular not such cells or genes whose gene sequences have been at least partially modified by humans by means of recombinant methods.
  • enhanced activity of an enzyme is preferably to be understood as meaning that the wild type has been genetically engineered in such a way that the corresponding increase in activity occurs to understand increased intracellular activity.
  • an increase in enzymatic activity can be achieved by increasing the copy number of the gene sequence or gene sequences which code for the enzyme, using a strong promoter, changing the codon usage of the gene, in various ways the half-life of the mRNA or of the enzyme that increases
  • Microorganisms are generated, for example, by transformation, transduction, conjugation, or a combination of these methods with a vector containing the desired gene, an allele of this gene or parts thereof, and a promoter enabling expression of the gene.
  • heterologous expression is achieved by integration of the gene or alleles into the chromosome of the cell or an extrachromosomally replicating vector.
  • the quantification of the increase in enzyme activity can be determined in a simple manner by comparing the 1- or 2-dimensional protein separations between wild-type and genetically modified cell.
  • a common method for preparing the protein gels in bacteria and for identifying the proteins is that of Hermann et al.
  • Protein concentration can also be assessed by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989) and subsequent optical evaluation with appropriate software for concentration determination (Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 1 1 1: 2630- 2647).
  • This method is also always suitable when possible products of the catalyzed by the enzyme activity to be determined reaction in the microorganism quickly
  • the enzyme E-i whose activity in the oxyhydrogen bacterium is increased compared to its wild-type, is preferably selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases from the enzyme class EC 2.3.1 .9.
  • accession numbers cited in connection with the present invention correspond to the ProteinBank database entries of NCBI dated 26.06.2012; As a rule, the version number of the entry is indicated by "number” such as "1".
  • Acetyl-CoA preferred according to the invention acetyl-CoA C-acetyltransferases are selected from the list
  • AAC26023.1, ABR35750.1 and ABR25255.1 such as
  • Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context, the reaction of two acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA and CoA is understood.
  • the explosive gas bacterium is provided in process step A) in an aqueous medium.
  • the aqueous medium used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • the medium may contain nitrogen sources, nitrogen source may be organic nitrogenous compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract,
  • Corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as
  • Ammonium nitrate, ammonia, ammonium hydroxide or ammonia water can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • the medium may contain phosphorus sources, phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts may be used as the phosphorus source.
  • the medium may also contain sources of carbon, but should be limited in so far as that the oxyhydrogen bacterium is dependent substantially on the utilization of carbon-containing gases contained in the gas containing H 2, C0 2 and 0. 2
  • the medium must continue to contain salts of metals such. As magnesium sulfate or iron sulfate, which are necessary for growth.
  • essential growth factors such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • suitable precursors may be added to the medium.
  • Feedstocks may be added to the culture as a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • Phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner.
  • Foaming can anti-foaming agents such.
  • B. fatty acid polyglycol esters are used.
  • the medium suitable selective substances such. B. antibiotics are added.
  • process step B) the aqueous medium is brought into contact with a gas containing H 2, C0 2 and 0. 2
  • Carbon source provided.
  • the oxyhydrogen bacterium synthesizes at least partially from this carbon source acetoacetyl-CoA, which is metabolized to other organic compounds.
  • process step B) of the invention is Unlike in an acetogenic process process, which takes place under strictly anaerobic conditions, process step B) of the invention
  • the partial pressure of hydrogen in the H is 2, C0 2 and 0 2 gas containing 0.1 to 100 bar, preferably from 0.2 to 10 bar, particularly preferably 0.5 to 4 bar.
  • the partial pressure of carbon dioxide in the H 2, C0 2 and 0 2 -containing gas is preferably 0.03 to 100 bar, particularly preferably 0.05 to 1 bar, in particular 0.05 to 0.3 bar
  • the partial pressure of oxygen in the H 2, C0 2 and gas containing 0 2 is preferably 0.001 to 100 bar, particularly preferably 0.04 to 1 bar, in particular 0.04 to 0.5 bar.
  • the gas in process step B) contains synthesis gas.
  • Syngas can, for. B. be provided from the by-product of the coal gasification. The oxyhydrogen bacterium thus converts a substance that is a waste product into a valuable raw material.
  • synthesis gas may be provided by the gasification of widely available, inexpensive agricultural raw materials for the process of the present invention.
  • raw materials that can be converted into synthesis gas, since almost all forms of vegetation can be used for this purpose.
  • Preferred raw materials are selected from the group comprising perennial grasses such as miscanthus,
  • Grain residues processing waste such as sawdust.
  • synthesis gas is recovered in a gasification apparatus from dried biomass, mainly by pyrolysis, partial oxidation and steam reforming, the primary products being CO, H 2 and CO 2 .
  • the carbon contained in the synthesis gas in
  • Process step B) at least 50 wt .-%, preferably at least 70 wt .-%, particularly preferably at least 90 wt .-% of the carbon of all carbon sources, the
  • Knallgasbakterium in process step B) are available, makes up, wherein the weight percent of carbon refer to the carbon atoms. The remaining
  • Carbon sources may, for example, be present in the form of carbohydrates in the aqueous medium or may also be C0 2 from a source other than synthesis gas.
  • Other C0 2 sources include exhaust gases such as flue gas, petroleum refinery emissions, gases resulting from yeast fermentation or clostridial fermentation, gasification gases, cellulosic materials or coal gasification.
  • the organic substance to be produced by the process according to the invention is preferably selected from substances comprising three or four carbon atoms, in particular butanol, butene, propene, butyric acid, acetone, 2-hydroxyisobutyric acid and 2-propanol and 2-hydroxyisobutyric acid.
  • Butanol A first embodiment of the process according to the invention is characterized in that the organic substance is butanol, preferably E-1 is selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases and preferably the oxyhydrogen bacterium an increased activity of an enzyme E 2 compared to its wild-type which is the implementation
  • the enzyme E 2 is preferably selected from 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenases from the enzyme class EC: 1.1.1 .157.
  • Preferred 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenases according to the invention are selected from the list
  • a preferred first embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , the oxyhydrogen bacterium has an increased activity of an enzyme E 3 compared to its wild-type, which is the reaction
  • the enzyme E 3 is preferably selected from 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases from the enzyme class EC: 4.2.1.55.
  • Preferred 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein is the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein under the
  • Activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 3 is generally understood in particular the conversion of 3-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA and water.
  • a further preferred first embodiment of the method according to the invention is characterized in that the oxyhydrogen gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme egg and optionally E 2 and / or E 3 increased compared to its wild-type activity an enzyme E 4 , which is the reaction
  • the enzyme E 4 is preferably selected from butyryl-CoA dehydrogenases from the
  • Enzyme class EC 1.3.99.2
  • Butyryl-CoA dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list NP_349317.1, YP_001307466.1 and CAQ53135.1
  • a further preferred first embodiment of the process according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 and / or E 4 , the oxyhydrogen bacterium has an activity of an enzyme E 5 which is increased compared to its wild-type
  • butyryl-CoA and NADH or NADPH to butyraldehyde NAD + or NADP + and HS-CoA and of butyraldehyde and NADH or NADPH to catalyze n-butanol and NAD + or NADPH +.
  • the enzyme E 5 is selected from bifunctional aldehyde / alcohol dehydrogenases from the enzyme class EC: 1 .2.1 .10 or EC: 1 .1.1.1 or from butyraldehyde dehydrogenases from the enzyme class EC: 1 .2.1.10.
  • the former enzymes catalyze both of the aforementioned reactions, while butyraldehyde dehydrogenases react only butyryl-CoA.
  • Preferred bifunctional aldehyde / alcohol dehydrogenases according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein is the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein under the
  • Butyraldehyde dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list YP_001310903.1 and CAQ57983.1
  • a further preferred first embodiment of the inventive method is characterized in that the explosive gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 and / or E 5 increased compared to its wild-type activity of an enzyme E 6 , which the implementation
  • the enzyme E 6 is selected from butanol dehydrogenases from the enzyme class EC: 1.1 .1 .-.
  • Butanol dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list
  • Polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, more preferably up to 15%, in particular up to 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of the amino acid residues relative to the aforementioned reference sequences are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof and which are still at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein with the corresponding
  • the oxyhydrogen gas bacterium has an increased activity E 6 when it has an increased activity of an enzyme E 5 , which requires only the reaction of butyryl-CoA and NADH or NADPH to butyraldehyde, NAD + or NADP + and HS-CoA catalyze and thus is preferably a butyraldehyde dehydrogenase.
  • a further preferred first embodiment of the method according to the invention is characterized in that the oxyhydrogen gas bacterium, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 , E 5 and / or E 6, has an increased activity of an enzyme E compared to its wild-type 7 selected from electron transfer flavoproteins from the
  • Enzyme class EC 2.8.3.9.
  • an enzyme E 7 which is a heterodimeric enzyme, composed of two subunits, in which the
  • alpha subunit is selected from NP_349315.1, YP_001307468.1 and CAQ53137.1 and the
  • beta subunit is selected from NP_349316.1, YP_001307467.1 and CAQ53136.1 and proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, more preferably up to 15%, in particular up to 10, 9, 8 , 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of
  • Amino acid residues with respect to the aforementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof are changed and still at least 50%, preferably 65%, more preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein having the corresponding above-mentioned reference sequence.
  • alpha and beta subunits from the same organism are combined.
  • the explosive gas bacterium used has an increased activity E 7 if an increased activity of E 4 already exists.
  • the oxyhydrogen bacterium has increased activities in the combinations
  • E1 E2E 3 egg ESE 4 , E1 E 5 E 6 , E
  • a second embodiment of the method according to the invention is characterized in that the organic substance is butene, preferably E-1 is selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases and preferably the oxyhydrogen bacterium an increased activity of an enzyme E 2 compared to its wild type.
  • the enzyme E 2 is preferably selected from 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenases from the enzyme class EC: 1.1.1 .157.
  • Preferred 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenases according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein is the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity the enzyme E 2 is generally understood in particular the reaction of acetoacetyl-CoA and NADH to 3-hydroxybutyryl-CoA and NAD +.
  • a preferred second embodiment of the erfindungewelen method is characterized in that the explosive gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 increased compared to its wild-type activity of an enzyme E 3 , which is the reaction
  • the enzyme E 3 is preferably selected from 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases from the enzyme class EC: 4.2.1.55.
  • Preferred 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the biocatalyst used
  • Cells ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 3 is generally understood in particular the reaction of 3-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA and water.
  • a further preferred second embodiment of the process according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 and / or E 3 , the oxyhydrogen gas bacterium has an increased activity of an enzyme E 4 compared to its wild-type
  • the enzyme E 4 is preferably selected from butyryl-CoA dehydrogenases from the enzyme class EC: 1.3.99.2
  • Butyryl-CoA dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list NP_349317.1, YP_001307466.1 and CAQ53135.1
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein is the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 4 is generally understood in particular the implementation of crotonyl-CoA and NADH to butyryl-CoA and NAD +.
  • a further preferred second embodiment of the process according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 and / or E 4 , the oxyhydrogen bacterium has an increased activity of an enzyme E 5 compared to its wild-type
  • the enzyme E 5 is selected from bifunctional aldehyde / alcohol dehydrogenases from the enzyme class EC: 1 .2.1 .10 or EC: 1 .1.1 .1 or from butyraldehyde dehydrogenases from the enzyme class EC: 1 .2.1.10.
  • bifunctional aldehyde / alcohol dehydrogenases are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the biocatalyst used
  • Cells ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 5 in the case of a bifunctional aldehyde / alcohol dehydrogenase, in particular the reaction of at least one of the two reactions
  • Butyraldehyde dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list YP_001310903.1 and CAQ57983.1
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein is the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 5 in the case of a butyraldehyde dehydrogenase in particular the reaction of butyryl-CoA and NADH to butyraldehyde, NAD + and HS-CoA is understood.
  • a further preferred second embodiment of the erfindungeingen method is characterized in that the explosive gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 and / or E 5 increased compared to its wild type activity of an enzyme E 6 , which the implementation
  • the enzyme E 6 is selected from butanol dehydrogenases from the enzyme class EC: 1.1 .1 .-.
  • Butanol dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list
  • Cell dry weight [U / g CDW]) is understood in comparison to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 6 in general in particular the implementation of Butyraldehyde and NAD (P) H to n-butanol and NAD (P) + is understood.
  • the oxyhydrogen gas bacterium has an increased activity E 6 when it has an increased activity of an enzyme E 5 , which requires only the reaction of butyryl-CoA and NADH or NADPH to butyraldehyde, NAD + or NADP + and HS-CoA catalyze and thus is preferably a butyraldehyde dehydrogenase.
  • a further preferred second embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 , E 5 and / or E 6 , the oxyhydrogen bacterium is enhanced compared to its wild type Activity of an enzyme E 7 selected from electron transfer flavoproteins from the enzyme class EC: 2.8.3.9.
  • an enzyme E 7 which is a heterodimeric enzyme, composed of two subunits, in which the
  • alpha subunit is selected from NP_349315.1, YP_001307468.1 and CAQ53137.1 and the
  • beta subunit is selected from NP_349316.1, YP_001307467.1 and CAQ53136.1 and proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, more preferably up to 15%, in particular up to 10, 9, 8 , 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of
  • Amino acid residues with respect to the aforementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof are changed and still at least 50%, preferably 65%, more preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein having the corresponding above-mentioned reference sequence.
  • alpha and beta subunits from the same organism are combined.
  • a further preferred second embodiment of the method according to the invention is characterized in that the oxyhydrogen gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 , E 5 , E 6 and / or E 7 increased compared to its wild type activity an enzyme E 8 , which is the reaction
  • the enzyme E 8 is preferably selected from oleate hydratases from the enzyme class
  • Preferred oleate hydratases according to the invention are selected from the list
  • AAA87627.1 and for both classes of enzymes proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, particularly preferably up to 15%, in particular up to 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 , 2, 1% of the amino acid residues with respect to the aforementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof are changed and at least 50%, preferably 65%, more preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase of the activity as a biocatalyst used cells, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cell used (units per gram cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein the activity in this In connection with the determination of the activity of the enzyme E 8 is generally understood in particular the reaction of n-butanol to 1-butene
  • the oxyhydrogen bacterium has increased activities in the combinations E-
  • E 1 E 2 E 7 6 E3E4E5E E8, E 1 E 3 E 7 6 E4E5E E8, E 1 E 3 E4E5E 7 E8, E 1 E 2 E3E4E5E 7 E8 is particularly preferred.
  • a third embodiment of the process according to the invention is characterized in that the organic substance is propene or butyric acid, preferably E-1 is selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases and preferably the oxyhydrogen bacterium increased compared to its wild-type Activity of an enzyme E 2 , which is the reaction of acetoacetyl-CoA and NADH or NADPH to 3-hydroxybutyryl-CoA and NAD + or NADP +
  • the enzyme E 2 is preferably selected from 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenases from the enzyme class EC: 1.1.1 .157.
  • Preferred 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenases according to the invention are selected from the list
  • a preferred third embodiment of the erfindunbeen method is characterized in that the explosive gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 increased compared to its wild-type activity of an enzyme E 3 , which is the reaction
  • the enzyme E 3 is preferably selected from 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases from the enzyme class EC: 4.2.1.55.
  • Preferred 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratases according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein is the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of Biocatalyst is understood without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity the enzyme E 3 is generally understood in particular the reaction of 3-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA and water.
  • a further preferred third embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 and / or E 3 , the oxyhydrogen bacterium has an increased activity of an enzyme E 4 compared to its wild-type, which is the reaction
  • the enzyme E 4 is preferably selected from butyryl-CoA dehydrogenases from the
  • Butyryl-CoA dehydrogenases preferred according to the invention are selected from the list NP_349317.1, YP_001307466.1 and CAQ53135.1
  • a further preferred third embodiment of the process according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 and / or E 4 , the oxyhydrogen bacterium has an activity of an enzyme E 9 which is increased compared to its wild type and which is the reaction
  • P in this context, stands for an inorganic phosphate.
  • the enzyme E 9 is preferably selected from phosphate butyryltransferases from the enzyme class EC: 2.3.1.19.
  • Preferred phosphate butyryltransferases according to the invention are selected from the list ABR32393.1 and ZP_05394269.1
  • a further preferred third embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 and / or E 9 , the oxyhydrogen bacterium is enhanced compared to its wild-type
  • the enzyme E 10 is preferably selected from butyrate kinases from the enzyme class EC: 2.7.2.7.
  • Butyrate kinases preferred according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues with respect to the aforementioned reference sequences are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof and which is at least 50%, preferably 65%, more preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of Have protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the cells used as a biocatalyst, ie the amount of substance converted per unit time based on the amount of cells used (units per gram cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 10 in general in particular the reaction of butyryl phosphate and ADP to butyrate and ATP is understood.
  • a further preferred third embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 2 , E 3 , E 4 , E 9 and / or E 10 , the oxyhydrogen bacterium has an increased activity of an enzyme En which is the implementation
  • the enzyme En is selected from cytochrome P450 of the CYP152 family.
  • cytochrome P450 of the CYP152 family according to the invention are selected from the list
  • the oxyhydrogen bacterium increased activity in the combinations E 1 E2E 3 E 4 E 9, E 1 E 2 E 3 E 4 E 10, egg E2EsE 4 Eii, E "
  • E 1 E 2 E 3 E 4 E 9 E 1 OE 11 E 1 E 3 E 4 E 9 E 10 E 11 is particularly preferred.
  • the combination of the enzymes E 9 E 10 also in combination with the abovementioned other enzymes as described above, which in total catalyzes the reaction of n-butyryl-CoA to butyrate, replaced by at least one enzyme in which the n-butyryl-CoA is converted to butyrate by a thioesterase or acyl-CoA synthetase or acyl-CoA acylate: CoA transferase.
  • a fourth embodiment of the process according to the invention is characterized in that the organic substance is acetone, preferably E-1 is selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases, and the oxyhydrogen bacterium an increased activity of an enzyme E 12 compared to its wild type.
  • the enzyme E 12 is selected from acetoacetyl-CoA: acetate / acyl: CoA transferases from the enzyme class EC: 3.1.2.1 1, from butyrate-acetoacetate-CoA transferases from
  • the alpha subunit is selected from NP_149326.1, YP_001310904.1 and CAQ57984.1 and the
  • beta subunit is selected from NP_149327.1, YP_001310905.1 and CAQ57985.1 and proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, more preferably up to 15%, in particular up to 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of the amino acid residues are modified with respect to the abovementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, whereby under the activity in this connection and in connection with the determination of the activity of the enzyme
  • Butyrate acetoacetate-CoA transferases preferred according to the invention are selected from ctfA and ctfB from Clostridium acetobutylicum and atoD and atoA from Escherichia coli as well as proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, particularly preferably up to 15% in particular, up to 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of the amino acid residues are altered from the abovementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof and which is at least 50%, preferably 65% %, more preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein having the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount converted per unit time based on the used cell volume (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocataly
  • Activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 12 is generally understood in particular the reaction of acetoacetyl-CoA to acetoacetate and CoA.
  • Acyl-CoA hydrolases which are preferred according to the invention are selected from
  • a preferred fourth embodiment of the method according to the invention is characterized in that the oxyhydrogen gas bacterium in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 12 a compared to its wild type increased activity of an enzyme E 13 , which is the reaction
  • the enzyme E 13 is preferably selected from acetoacetate decarboxylases from the
  • Enzyme class EC 4.1.1.4 or from acetone: C02 Ligases from the enzyme class EC 6.4.1 .6.
  • Acetoacetate decarboxylases preferred according to the invention are selected from the list NPJ 49328.1, YP_001310906.1 and CAQ57986.1
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the biocatalyst used
  • Cells ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein is understood, wherein under Activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 13 is generally understood in particular the reaction of acetoacetate to acetone and C0 2 .
  • Acetone preferred according to the invention is C02 ligases are selected from the list of oligomeric proteins with sequences.
  • C02 ligase A method for determining the activity of acetone: C02 ligase is described by Miriam K. Sluis et al in Proc. Natl. Acad Sci U S A. 1997 Aug. 5; 94 (16): 8456-8461, acetoacetate, AMP and orthophosphate being used here as substrates.
  • the oxyhydrogen bacterium has increased activities in the combinations E "
  • a fifth embodiment of the inventive method is characterized in that the organic substance is propan-2-ol, preferably E- ⁇ is selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases, and the oxyhydrogen bacterium compared one increased to its wild-type activity of an enzyme E 12 , which is the reaction
  • the enzyme E 12 is preferably selected from acetoacetyl-CoA: acetate / acyl: CoA transferases from the enzyme class EC: 3.1.2.1 1, from butyrate-acetoacetate-CoA transferases from the enzyme class EC 2.8.3.9 or from acyl-CoA-hydrolases from the enzyme class EC 3.1 .2.20.
  • Acetoacetyl-CoA preferred according to the invention: acetate / acyl: CoA transferases are selected from the list
  • the alpha subunit is selected from NP_149326.1, YP_001310904.1 and CAQ57984.1 and the
  • beta subunit is selected from NP_149327.1, YP_001310905.1 and CAQ57985.1 and proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, more preferably up to 15%, in particular up to 10, 9, 8 , 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of the amino acid residues with respect to the aforementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof are changed and still at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry matter ( cell dry weight) [U / g CDW]) in comparison to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, whereby under the activity in this Zusa mmenhang and in connection
  • Butyrate acetoacetate-CoA transferases preferred according to the invention are selected from ctfA and ctfB from Clostridium acetobutylicum and atoD and atoA from Escherichia coli as well as proteins having a polypeptide sequence in which up to 60%, preferably up to 25%, particularly preferably up to 15% in particular, up to 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% of the amino acid residues are altered from the abovementioned reference sequences by deletion, insertion, substitution or a combination thereof and which is at least 50%, preferably 65% %, more preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein having the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the cells used as biocatalyst, ie the amount converted per unit time based on the used cell volume (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocataly
  • Acyl-CoA hydrolases which are preferred according to the invention are selected from
  • a preferred fifth embodiment of the process according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and, where appropriate, E 12 , the oxyhydrogen bacterium has an increased activity of an enzyme compared to its wild-type
  • the enzyme E 13 is preferably selected from acetoacetate decarboxylases from the
  • Enzyme class EC 4.1.1 .4 or from acetone: C02 Ligases from the enzyme class EC 6.4.1 .6.
  • Acetoacetate decarboxylases preferred according to the invention are selected from the list
  • Amino acid residues are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof with respect to the abovementioned reference sequences and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein, the increase in the activity of the biocatalyst used
  • Cells ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein is understood, wherein under Activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 13 is generally understood in particular the reaction of acetoacetate to acetone and C0 2 .
  • a method for determining the activity of acetone: C02 ligase is described by Miriam K. Sluis et al in Proc Natl. Acad. See USA 1997 August 5; 94 (16): 8456-8461, acetoacetate, AMP and orthophosphate being used here as substrates.
  • a further preferred fifth embodiment of the method according to the invention is characterized in that, in addition to the increased activity of the enzyme Ei and optionally E 12 , and / or E 13, an increased activity of an enzyme E 14 , which enhances the conversion compared to its wild-type
  • the enzyme E 14 is preferably selected from propan-2-ol: NADP + oxidoreductase from the enzyme class EC: 1 .1.1.80.
  • the oxyhydrogen bacterium has increased activities in the combinations E-
  • the propan-2-ol in process step C) is isolated by distillation from the aqueous solution as an azeotrope.
  • Methods for the isolation of propan-2-ol are described, inter alia, in Lei Zhigang, Zhang Jinchang, Chen Biaohua Separation of aqueous isopropanol by reactive extractive distillation in Journal of Chemical Technology and Biotechnology Volume 77, Issue 1 1 pages 1251-1254, November 2002, Lloyd Berg et al., Separation of the propylene alcohols from water by azeotropic or extractive distillation US5085739 and Berg, Lloyd Separation of ethanol, isopropanol and water mixtures by azeotropic distillation US5762765 described.
  • a particularly preferred fifth embodiment of the method according to the invention comprises a method step D).
  • the isolated propan-2-ol in process step D) by chemical
  • a sixth embodiment of the process according to the invention is characterized in that the organic substance is 2-hydroxyisobutyric acid or a salt of 2-hydroxyisobutyric acid, preferably E-1 is selected from acetyl-CoA: acetyl-CoA C-acetyltransferases, the oxyhydrogen bacterium optionally an increased compared to its wild-type activity of an enzyme E 2 , which is the reaction
  • Enzymes E 2 preferred in this context are those given as preferred in the first embodiment.
  • the enzyme E 15 is preferably a hydroxyl isobutyryl-CoA mutase, an isobutyryl-CoA mutase (EC 5.4.99.13) or a methylmalonyl-CoA mutase (EC 5.4.99.2), in each case preferably a coenzyme B12 dependent mutase.
  • the enzyme E 15 is preferably those enzymes which are derived from the
  • the enzyme E 15 is a heterodimeric enzyme comprising sequences selected from SEQ ID NO. 78 and 80
  • Substitution or a combination thereof are modified and which still have at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90% of the activity of the protein with the corresponding above-mentioned reference sequence, wherein below 100% activity of the reference protein increases the Activity of used as a biocatalyst
  • Cells ie the amount of substance reacted per unit time based on the amount of cells used (units per gram of cell dry weight [U / g CDW]) compared to the activity of the biocatalyst without the presence of the reference protein, wherein the activity in this context and in connection with the determination of the activity of the enzyme E 15 is generally understood in particular the reaction of 3-hydroxybutyryl-coenzyme A to 2-hydroxyisobutyryl-coenzyme A.
  • the oxyhydrogen bacterium has increased activities in the combinations on.
  • the explosive gas bacterium increased compared to its wild-type amount of MeaB protein, in particular one with Seq ID no. 82, has.
  • the MeaB protein is preferably selected from Sequence ID No. 82, YP_001023545.1 ⁇ Methylibium petroleiphilum PM1), YP_001409454.1 ⁇ Xanthobacter autotrophicus Py2), YP_001045518.1 ⁇ Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029),
  • enzymes E 15 and the MeaB protein can be expressed as fusion proteins, as disclosed, for example, in PCT / EP2010 / 065151 and which are used with particular preference.
  • Figure 1 Exemplary acetone and isopropanol production C. necator H 16 pBBR- EcatoDAB
  • Figure 2 Exemplary butanol production with C. necator H 16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2
  • necator (nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB; Seq ID No. 16) to the C. necator phaA gene encoding the thiolase PhaA (SEQ ID NO: 17), including the phaA ribosome binding site, and the C.
  • acetobutylicum ctfAB operon encoding the a and ⁇ -subunit acetyl / butyryl-CoA-acetoacetate: CoA transferase CtfA (SEQ ID NO: 18) and CtfB (SEQ ID NO: 19), including the ctfA and cff ⁇ ribosome binding sites and the ctfAB terminator, where the CtfA and CtfB coding regions are in C.
  • necator codon optimized (nRBS-RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; SEQ ID NO: 20) of the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (SEQ ID NO: 1), C.
  • acetobutylicum thIA gene encoding the thiolase ThIA (SEQ ID NO: 21) and the C. acetobutylicum ctfAB operon encoding the ⁇ and ⁇ subunits of acetyl butyryl CoA acetoacetate: CoA transferase CtfA (Seq ID No. 18) and CtfB (SEQ ID NO: 19), inclusive of the native ctfA and cifss ribosome binding sites and the native cfAAss terminator, respectively, with the ThIA, CtfA and CtfB coding regions codon optimized for translation into C.
  • acetobutylicum adc gene encoding the acetoacetate decarboxylase Ade (SEQ ID NO: 24), including the ac / c terminator, where the ThIA, YbgC and Ade coding regions were codon optimized for translation into C. necator (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL-Caadc-T-Caadc; Seq ID No. 25) to the E. coli / acZ promoter (Seq ID No. 26), the Ribosome binding site of the C. necator groEL gene (Seq ID No. 1) and the C.
  • acetobutylicum adc gene coding for the acetoacetate Decarboxylase Ade (SEQ ID NO: 24), including the ac / c terminator, where the Ade coding region was codon optimized for translation into C. necator (Plac-RBS-RegroEL-Caadc-T-Caadc; Seq ID No.
  • EcatoDAB EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB, pBBR-CathlA-ctfAB and pBBR-CathlA-HiybgC-Caadc, and corresponding to Seq ID Nos. 28, 29, 30 and 31.
  • EcatoDAB caadc, pBBR-RephaA-CactfAB
  • adc refer to and correspond to Seq ID Nos. 32, 33 and 34.
  • CoA Acetoacetyl-CoA transferase AtoD (SEQ ID NO: 13), the ⁇ -subunit of acetyl-CoA: acetoacetyl-CoA transferase AtoA (SEQ ID NO: 14) and the thiolase AtoB (Seq-ID No. 15), including the atoD, atoA and aio ⁇ ribosome binding sites and the atoB terminator, whereby the regions coding for AtoD, AtoA and AtoB were codon optimized in C. necator (nRBS-EcatoD-nRBS- EcatoA-N RBS EcatoB-T
  • Subunit acetyl- / butyryl-CoA-acetoacetate CoA transferase CtfA (SEQ ID NO: 18) and CtfB (SEQ ID NO: 19), including the ctfA and ctfB ribosome binding sites and the cf ⁇ 4ß- Terminator, wherein the CtfA and CtfB coding regions were codon optimized in C. necator (nRBS-RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq ID No. 20) of the ribosome binding site of C. necator groEL gene (SEQ ID NO: 1), C.
  • acetobutylicum thIA gene encoding the thiolase ThIA (SEQ ID NO: 21) and the C. acetobutylicum ctfAB operon, encoding the a- and ⁇ -subunit acetyl / butyryl-CoA-acetoacetate: CoA transferase CtfA (SEQ ID NO: 18) and CtfB (SEQ ID NO: 19), including the native ctfA and cff ⁇ ribosome binding sites, respectively, and the native ctfAB terminator, where the regions encoding ThIA, CtfA and CtfB codon optimized for translation into C.
  • influenzae ybgC gene encoding the thioesterase YbgC (SEQ ID NO: 23) and finally the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (SEQ ID NO: 1), followed by the Cupriavidus necator JMP134 acss gene for the acetone carboxylase beta subunit AcbB (Seq ID No. 9), the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (Seq ID No. 1), followed by the Cupriavidus necator JMP134 acbA gene encoding the acetone carboxylase alpha subunit AcbA (Seq ID No. 8) and the
  • Cupriavidus necator JMP134 acbC gene encoding the acetone carboxylase gamma subunit AcbC (SEQ ID NO: 86), including the ac / c terminator, where the ThIA and YbgC coding regions were codon optimized for translation into C. necator (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL-AcbB-RBS-RegroEL-AcbA-RBS-RegroEL-AcBC-T-Caadc; Seq ID No. 7) 5. the £. coli / acZ promoter (SEQ ID NO: 26), the ribosome binding site of the C.
  • necator groEL gene (SEQ ID NO: 1) followed by the Cupriavidus necator JMP134 acbB gene encoding the acetone carboxylase beta subunit AcbB (SEQ ID NO: 9), the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (SEQ ID NO: 1), followed by
  • Subunit AcbA (SEQ ID NO: 8) and the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (SEQ ID NO: 1), followed by the Cupriavidus necator JMP134 acbC gene encoding the acetone carboxylase gamma subunit AcbC (Seq ID No. 86) incl.
  • the adc terminator (Plac RBS RegroEL AcbB RBS RegroEL AcbA RBS RegroEL AcBC T Caadc; Seq ID No. 6)
  • the resulting expression plasmids were named pBBR-EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB, pBBR-CathlA-ctfAB and pBBR-CathlA-HiybgC-ReacbBAC and correspond to Seq ID Nos. 28, 29, 30 and 5.
  • Components consist of: the C. necator phaA gene encoding the thiolase PhaA (SEQ ID NO: 17), including the phaA ribosome binding site, the C. necator phaBl gene, encoding the (R) -3-hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenase PhaB1 (Seq ID No. 35), including the pftassi ribosome binding site, the Aeromonascaviae phaJ gene, encoding the (R) -3-hydroxybutyryl-CoA deydratase PhaJ (Seq ID No. 36) , including the phaJ ribosome binding site, the ribosome binding site of the C.
  • necator groEL gene (SEQ ID NO: 1), the C. acetobutylicum adhE2 gene, encoding the bifunctional butyryl-CoA / butyraldehyde dehydrogenase adhE2 (Seq ID No. 37), and the A. caviae phaJ terminator (SEQ ID NO: 38), where the translation coding regions for PhaJ and AdhE2 were codon optimized in C. necator (nRBS-RephaA-nRBS- RephaB1-nRBS-AcphaJ-RBS-RegroEL-CaadhE2-T-AcphaJ; Seq ID No. 39) to the C.
  • necator phaA gene encoding the thiolase PhaA (SEQ ID NO: 17), incl phaA ribosome binding site, the C. necator phaBl 'gene, encoding f for the (R) -3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase PhaB1 (SEQ ID NO. 35), including the phaB 7-ribosome binding site and the Aeromonascaviae phaJ gene, encoding the (R) -3-hydroxybutyryl-CoA deydratase PhaJ (Seq ID No.
  • acetobutylicum hbd gene encoding the (S) -3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Hbd (Seq ID No. 41), the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (Seq ID No. 1) of the C. acetobutylicum adhE2 gene encoding the bifunctional butyryl-CoA / butyraldehyde dehydrogenase AdhE2 (SEQ ID NO: 37) and the C. acetobutylicum ctfAB terminator (SEQ ID NO: 42); coding for ThIA, Hbd and AdhE2 regions for translation in C. necator (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-Cahbd-RegroEL-CaadhE2-T-CactfAB; Seq ID No. 43)
  • acetobutylicum hbd gene encoding the (S) -3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Hbd (SEQ ID NO: 41) and the C. acetobutylicum cfAA ⁇ terminator (SEQ ID NO: 42), which are for ThIA and Hbd coding regions were optimized for translation into C. necator (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-Cahbd-T-CactfAB; Seq ID No. 44).
  • E. coli / acZ promoter (SEQ ID NO: 26), the C. necator etfBA bcd operon, encoding the ⁇ subunit of the electron transfer protein EtfB (Seq ID No. 45) , the a-subunit of the electron transfer protein EtfA (Seq ID No. 46) and the butyryl-CoA dehydrogenase Bcd (SEQ ID NO: 46), incl. the eifss, etfA and bcd ribosome binding sites and the C.
  • E. coli / acZ promoter (Seq ID No. 26), the C. acetobutylicum c / f gene, coding for crotonase Crt (Seq ID No. 50), incl. f-ribosome binding site, the C.
  • acetobutylicum etfBA-bcd operon encoding the ⁇ -subunit of the electron transfer protein EtfB (SEQ ID NO: 51), the ⁇ -subunit of the electron transfer protein EtfA (SEQ ID NO: 52) and the butyryl CoA dehydrogenase Bcd (SEQ ID NO: 53), including the etfB, etfA and bcd ribosome binding sites, and the C.
  • Expression vector pBBR1 MCS-2 (SEQ ID NO: 10) is cloned so that the expression of the genes is under the control of the E. coli / acZ promoter.
  • the resulting expression plasmids were named pBBR-RephaABJ-CaadhE2, pBBR-RephaABJ, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB and pBBR-CathlA-hbd-ctfAB, and correspond to Seq ID Nos. 56, 57, 58 and 59.
  • the expression cassette Plac-nRBS-ReetfB-nRBS-ReetfA-nRBS-Rebcd-nT was then transcribed via Hind ⁇ / Bam ⁇ into the vectors pBBR-RephaABJ-CaadhE2 and pBBR-RephaABJ (Seq-ID Nos. 56 and 57 ) cloned.
  • the resulting expression plasmids were named pBBR-RephaABJ-CaadhE2
  • the resulting expression plasmids were identified as pBBR-RephaABJ-CaadhE2
  • the expression cassette Plac-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd was then transcribed via Hind ⁇ / Bam ⁇ into the vectors pBBR-RephaABJ-CaadhE2 and pBBR-RephaABJ (SEQ ID Nos. 56 and 57).
  • the resulting expression plasmids were named pBBR-RephaABJ-CaadhE2
  • a synthetic expression cassette was synthesized consisting of the following components: 1 . the C. necator groEL promoter (Seq ID No. 68), the ribosome binding site of the C. necator groEL gene (Seq ID No. 1), followed by Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456 o / eT gene encoding the terminal olefin-forming fatty acid decarboxylase OleT (SEQ ID NO: 69), the ribosome binding site of the C. necator gro £ Z gene (SEQ ID NO: 1) and finally the C.
  • Cabuk-T-Captb-buk was then transfected via BamH ⁇ / Sac ⁇ into the vectors pBBR-RephaABJ
  • the resulting expression plasmids were identified as pBBR-RephaABJ
  • Embodiment 5 Construction of plasmids for the preparation of 2-propanol with Cupriavidus necator
  • Codon-optimized region for translation in C. necator PRegroESL-RBS-Cbadh-T-Rebcd; SEQ ID NO: 12).
  • the resulting expression plasmids were designated as pBBR-EcatoDAB
  • Cbadh refer to and correspond to Seq ID Nos. 83, 84 and 85.
  • Embodiment 6 Generation of vector pBBR 1 MCS-2 :: HCM-phaA and pBBR 1 MCS-2 :: meaBhcmA-hcmB-phaA
  • the vector pBBR1 MCS-2 :: HCM-phaA was generated starting from the plasmid pBBR1 MCS-2 :: HCM (generation and properties described in patent application EP12173010).
  • a synthetic expression cassette was synthesized, consisting of the following components:
  • the plasmid pBBR1 MCS-2 :: HCM was linearized with the Restricktionsendonuklease Xbal and then with the also restricted by XbaI and so prepared
  • the expression of the genes takes place after successful cloning under control of the E. coli lacZ promoter.
  • the resulting expression plasmid is designated pBBR1 MCS-2 :: HCM-phaA and corresponds to SEQ ID NO. 88th
  • the vector pBBR1 MCS-2 :: meaBhcmA-hcmB-phaA was generated starting from the plasmid pBBR1 MCS-2 :: meaBhcmA-hcmB (generation and properties described in patent application WO201 1/057871).
  • For the construction was a synthetic
  • Synthesized expression cassette consisting of the following components: 1 . the C. necator phaA gene encoding the thiolase PhaA (SEQ ID NO: 17), incl. the p /? a4 ribosome binding site; up and downstream of the sequence will be Xbal
  • the plasmid pBBR1 MCS-2 :: meaBhcmA-hcmB was linearized with the Restricktionsendonuklease Sacl and then ligated with the also restricted by Sacl and thus prepared expression cassette nRBS-RephaA. All molecular biological work is carried out in a manner known to the person skilled in the art.
  • the expression of the genes takes place after successful cloning under the control of the E. coli lacZ promoter.
  • the resulting expression plasmid is designated pBBR1 MCS-2 :: meaBhcmA-hcmB-phaA and corresponds to SEQ ID NO. 89th
  • Exemplary embodiment 7 Introduction of plasmids for the production of acetone, 2-propanol, 1-butanol, butyrate, 2-hydroxyisobutyric acid and 1-propene in Cupriavidus necator
  • the plasmids are transferred into competent E. coli S 17-1 cells, one strain , with which the conjugative transfer of plasmids and others in Cupriavidus necaior strains is possible.
  • a spotmating conjugation as described in FRIEDRICH et al., 1981, Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus J Bacteriol 147: 198-205) with the respective plasmids carrying £.
  • transconjugants which carry the respective plasmids and denote the corresponding strains as follows:
  • Exemplary embodiment 8 Quantification of acetone, 2-propanol, 1-butanol,
  • the quantification of butanol and butyrate from a fermentation broth is carried out by means of HPLC / RID and DAD.
  • Mobile phase Mobile phase A1: H 2 O (Millipore) + 5 mM aqueous H 2 S0 4
  • Measuring range For all analytes approx. 0.100 g / L - 12.0 g / L
  • Quantification standard is trimethylpropionic acid.
  • the determination of the analytes acetone, isopropanol and 1-propene in the aqueous phase is carried out by means of headspace GC / FID measurement and standard addition. The most important
  • Exemplary embodiment 9 Preparation of acetone, 2-propanol, 1-butanol, butyrate and 1-propene with recombinant Ralstonia eutropha cells
  • the medium consists of (NH 4 ) 2 HP0 4 2.0 g / l; KH 2 P0 4 2.1 g / l; MgS0 4 * 7H 2 0 0.2 g / l; FeCl 3 * 6H 2 0 6 mg / l; CaCl 2 x 2 H 2 O 10 mg; Trace element solution (Pfennig and Lippert, 1966) 0.1 ml.
  • the trace element solution consists of Titriplex III 10 g / l FeS0 x 7 H 2 0 4 g / l ZnS0 4 x 7 H 2 0 0.2 g / 1, MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 60 mg / l, H 3 B0 3 0.6 g / l, CoCl 2 ⁇ 6 H 2 O 0.4 g / l, CuCl 2 ⁇ 2 H 2 O 20 mg / l , NiCl 2 x 6 H 2 0 40 mg / l, Na 2 Mo 4 x 2 H 2 0 60 mg / l together.
  • the medium of the preculture was additionally supplemented with fructose 5 g / l, kanamycin 300 ⁇ g / ml.
  • the flasks were inoculated 1% (v / v) from a cryoculture.
  • the cultures are incubated on a shaker at 30 ° C and 150 rpm for 24 h. Thereafter, the cultures are combined and determined an OD 6 oo of about 3.5.
  • the main culture is chemolithoautotrophic in a 21 stainless steel reactor, Biostat B from Sartorius, filled with 1 -2 l medium of composition (NH 4 ) 2 HP0 2.0 g / l, KH 2 P0 2.1 g / l, MgS0 4 x 7 H 2 0 3 g / l, FeCl 3 * 6 H 2 0 6 mg / l, CaCl 2 x 2 H 2 0 10 mg, biotin 1 mg / l, thiamine HCl 1 mg / l, Ca-pantothenate 1 mg / l, nicotinic acid 20 mg / l, trace element solution 0.1 ml and polypropylene glycol (PPG 1000 diluted 1: 5 with water).
  • PPG 1000 diluted 1: 5 with water polypropylene glycol
  • the cultivation is carried out at 30 ° C, 500 - 1500 rpm, pH 7.
  • the pH is unilaterally controlled with 1 M NaOH. Fumigation is carried out with a gas mixture of H 2 90%, C0 2 6%, 0 2 4% with an overpressure of 0 - 2 bar with a gassing rate of 0.19 vvm.
  • the reactor is inoculated with 0.1% of the preculture. For this purpose, the required volume of preculture in 50 ml Falcontubes 10 min, centrifuged at 20 ° C and 4500 rpm and resuspended in 10 ml phosphate buffered saline. The washing is repeated 3 times, the last resuspension is carried out in 10 ml of main culture medium.
  • the cultivation period is 76 - 150 h.
  • 10 ml of sample are withdrawn via a septum using a syringe with a sterile cannula. Determined is OD 6 oo, BTM and the expected product according to strain according to example 7.
  • Production phase used by a plasmid-bearing Cupriavidus necator In this approach, the bacterium absorbs H 2 and C0 2 from the gaseous phase and forms 2HIB.
  • pressure-resistant glass bottles which can be hermetically sealed with a butyl rubber stopper, were used.
  • plasmid-carrying C. necator strains the strains C. necator pBBR1 MCS2 :: HCM and C necator pBBR1 MCS2 :: HCM-phaA were used.
  • Hydroxyisobutyric acid first streaked on LB-R agar plates with antibiotic and incubated for 3 days at 30 ° C.
  • the strains were cultured in 200 ml H16 mineral medium (modified according to Schlegel et al., 1961) in pressure-resistant 500 ml glass bottles.
  • the medium consisted of Na 2 HPO 4 ⁇ 12 H 2 O 9.0 g / L; KH 2 P0 4 1, 5g / l; NH 4 Cl 1, 0 g / l; MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.2 g / l; FeCl 3 * 6H 2 0 10 mg / l; CaCl 2 x 2 H 2 O 0.02 g / l; Trace element solution SL-6 (Pfennig, 1974) 1 ml / l.
  • the trace element solution was composed of ZnS0 4 x 7 H 2 0 100 mg / l, MnCl 2 x 4 H 2 0 30 mg / l, H 3 BO 3 300 mg / l, CoCI 2 x 6 H 2 0 200 mg / l, CuCl 2 ⁇ 2 H 2 O 10 mg / l, NiCl 2 ⁇ 6 H 2 O 20 mg / l, Na 2 Mo 4 ⁇ 2 H 2 O 30 mg / l together.
  • the pH of the medium was adjusted to 6.8 by addition of 1 M NaOH.
  • the flasks were inoculated with a single colony from the incubated agar plates and cultivated chemolithoautotrophically on a N 2 / H 2 / O 2 / C0 2 mixture (ratio
  • the cultures were incubated in an open water bath shaker at 28 ° C, 150 rpm and a fumigation of 1 l / h for 137 h to an OD> 1, 0. Gas was introduced into the medium through a gassing frit having a pore size of 10 ⁇ m, which was attached to a gassing tube in the middle of the reactor. The cells were then centrifuged off, washed with 10 ml of washing buffer (0.769 g / L NaOH, at least 1 h at 28 ° C. and 150 rpm with a gas containing 6% C0 2 ) and again centrifuged off.
  • washing buffer 0.69 g / L NaOH, at least 1 h at 28 ° C. and 150 rpm with a gas containing 6% C0 2
  • T (M) SP Sodium trimethylsilylpropionate
  • Production phase used by a plasmid-bearing Cupriavidus necator In this approach, the bacterium absorbs H 2 and C0 2 from the gaseous phase and forms 2HIB.
  • pressure-resistant glass bottles which can be hermetically sealed with a butyl rubber stopper, are used.
  • plasmid-carrying C. necator strains the strains C. necator pBBR1 MCS2 :: meaBhcmA-hcmB and C. necator pBBR1 MCS2 :: meaBhcmA-hcmB-phaA are used.
  • the plasmid-bearing C. necaior strains are used to study the formation of 2-
  • Hydroxyisobutyric acid first streaked on LB-R agar plates with antibiotic and incubated for 3 days at 30 ° C.
  • the strains are cultured in 200 ml H16 mineral medium (modified according to Schlegel et al., 1961) in pressure-resistant 500 ml glass bottles.
  • the medium consists of Na 2 HPO 4 x 12 H 2 0 9.0 g / l; KH 2 P0 4 1, 5g / l; NH 4 Cl 1, 0 g / l; MgS0 4 * 7H 2 0 0.2 g / l; FeCl 3 * 6H 2 0 10 mg / l;
  • the trace element solution consists of ZnS0 4 ⁇ 7 H 2 O 100 mg / l, MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O 30 mg / l, H 3 O 3 300 mg / l, CoCl 2 ⁇ 6 H 2 O 200 mg / l, CuCl 2 ⁇ 2 H 2 0 10 mg / l, NiCl 2 x 6 H 2 0 20 mg / l, Na 2 Mo 4 x 2 H 2 0 30 mg / l together.
  • the pH of the medium is adjusted to 6.8 by addition of 1 M NaOH. All media used are supplied with 300 ⁇ g ml kanamycin and 76 nM CoB 12 .
  • the flasks are inoculated with an individual colony from the agar plates incubated and the cultivation takes place chemolithoautotrophically on a N 2 / H 2/0 2 / C0 2 mixture (ratio
  • the cultures are incubated in an open water bath shaker at 28 ° C, 150 rpm and a fumigation of 1 l / h for 137 h to an OD> 1, 0.
  • the gas is introduced into the medium through a gassing frit with a pore size of 10 ⁇ m, which is attached to a gassing tube in the middle of the reactor.
  • the cells are then centrifuged off, washed with 10 ml of washing buffer (0.769 g / L NaOH, at least 1 h at 28 ° C and 150 rpm with a gas with 6% C0 2 effetgast) and again centrifuged.
  • the gas is introduced into the medium through a gassing frit with a pore size of 10 ⁇ m, which is attached to a gassing tube in the middle of the reactors.
  • a gassing frit with a pore size of 10 ⁇ m, which is attached to a gassing tube in the middle of the reactors.
  • the product concentration is determined by means of semi-quantitative 1 H NMR spectroscopy.
  • the internal quantification standard is sodium trimethylsilylpropionate (T (M) SP).
  • necator pBBR1 MCS2 meaBhcmA-hcmB up to 1 13 mg / l 2HIB, while in the strain C.
  • necator pBBR1 MCS2 meaBhcmA-hcmB-phaA form up to 156 mg / l 2HIB.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen umfassend die Verfahrensschritte: A) Bereitstellen eines Knallgasbakteriums mit einer verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E1, welches die Umsetzung 2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA zu katalysieren vermag, in einem wässrigen Medium; B) in Kontakt Bringen des wässrigen Mediums mit einem Gas enthaltend H2, CO2 und O2 in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 70 zu 10 bis 45 zu 5 bis 35 und gegebenenfalls C) Aufreinigen der organischen Verbindung.

Description

Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen aus Knallgas und C02 über Acetoacetyl-CoA als Zwischenprodukt
Gebiet der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen umfassend die Verfahrensschritte
A) Bereitstellen eines Knallgasbakteriums mit einer verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung
2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA
zu katalysieren vermag, in einem wässrigen Medium
B) in Kontakt Bringen des wässrigen Mediums mit einem Gas enthaltend
H2, C02 und 02
in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 70 zu 10 bis 45 zu 5 bis 35, und gegebenenfalls C) Aufreinigen der organischen Verbindung.
Stand der Technik Biobasierte Treibstoffe und Chemikalien werden heutzutage üblicherweise aus Kohlenhydraten, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin hergestellt. Dies hat eine Vielzahl von Nachteilen:
i) Preise für Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin, werden sich
möglicherweise analog zu fossilen Rohstoffen entwickeln, da sie in Produkte mit hohem
Brennwert umgewandelt werden können.
ii) Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin, unterliegen starken
Preisschwankungen.
iii) Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Glycerin, sind als Rohstoffe nicht in allen Regionen in ausreichender Menge verfügbar.
iv) Die Verwendung von Kohlenhydraten, wie Glucose oder Dextrose, als
Fermentationsrohstoffe steht in Konkurrenz zum Einsatz als Nahrungsmittel.
Technologien für die hochselektive Herstellung von organischen Verbindungen mittels
Biokatalysatoren und mit H2 und C02 als Rohstoffen unter energetisch günstigen, aeroben Bedingungen sind heutzutage noch nicht verfügbar, würden es jedoch ermöglichen, rohstofftechnisch und regional hochflexibel, diese Chemikalien aus kostengünstigen Rohstoffen bzw. Abfallströmen (Erdgas, kommunale Abfälle, Biomasse, Konvertergas, etc.) herzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren mindestens einen der Nachteile des Standes der Technik zu überwinden vermag.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das in Anspruch 1 sowie den davon abhängigen Ansprüchen beschriebene Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der im Rahmen der Erfindung offenbarten Knallgasbakterien zur Herstellung von organischen Verbindungen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer organischen Verbindung umfassend die Verfahrensschritte
A) Bereitstellen eines Knallgasbakteriums mit einer verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung
von 2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA
zu katalysieren vermag, in einem wässrigen Medium
B) in Kontakt Bringen des wässrigen Mediums mit einem Gas enthaltend
H2, C02 und 02
in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 70 zu 10 bis 45 zu 5 bis 35, insbesondere von 30 bis 55 zu 15 bis 40 zu 10 bis 30, und gegebenenfalls
C) Aufreinigen der organischen Verbindung.
Unter dem Begriff„Knallgasbakterium" ist ein Bakterium zu verstehen, das in der Lage ist chemolithoautotroph zu wachsen und aus H2 und C02 in Gegenwart von Sauerstoff
Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Es können erfindungsgemäß sowohl solche Bakterien eingesetzt werden, die von Natur aus Knallgasbakterien darstellen, oder aber auch Bakterien, welche durch gentechnische Modifikation zu Knallgasbakterien wurden, wie beispielsweise eine E. coli Zelle, die durch rekombinantes Einfügen der
notwendigen Enzyme in die Lage versetzt wurde, aus H2 und C02 in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Bevorzugt handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien um solche, welche bereits als Wildtyp Knallgasbakterien darstellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Knallgasbakterien sind ausgewählt aus den Gattungen Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, , Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga,, Hydrogenophilus,
Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. 01, Kyrpidia, Metallosphaera,
Methanobrevibacter, Myobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas,
Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus,
Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Thiocapsa, Treponema, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, wobei Cupriavidus besonders bevorzugt ist,
besonders aus den Spezies Cupriavidus necator (alias Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydrogenomonas eutropha), Achromobacter ruhlandii, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Anabena cylindrica, Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Arthrobacter strain 11X, Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Cupriavidus necator, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus., Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobaculum acidophilum, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga
pseudoflava, Hydrogenophaga taeniospiralis, Hydrogeneophilus thermoluteolus,
Hydrogenothermus marinus, Hydrogenovibrio marinus, Ideonella sp. 0-1, Kyrpidia tusciae, Metallosphaera sedula, Methanobrevibactercuticularis, Mycobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Oligotropha carboxidivorans, Paracoccus denitrificans, Pelomonas saccharophila, Polaromonas hydrogenivorans, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas thermophila, Rhizobium japonicum, Rhodococcus opacus, Rhodopseudomonas palustris, Seliberia carboxydohydrogena, Streptomyces thermoautotrophicus, Thiocapsa roseopersicina,
Treponema primitia, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus, Xanthobacter flavus, insbesondere aus den Stämmen Cupriavidus necator H 16, Cupriavidus necator H1 oder Cupriavidus necator Z-1 .
Das Knallgasbakterium des erfindungsgemäßen Verfahrens weist eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-ι auf.
Mit„Wildtyp" einer Zelle wird hierin eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff„Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Der Begriff„gesteigerte Aktivität eines Enzyms", wie er vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise zu verstehen, dass der Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass die entsprechende Aktivitätssteigerung eintritt. Bevorzugt ist dieser Begriff als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.
Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E-ι als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.
Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die
Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß eingesetzte, gentechnisch veränderte
Mikroorganismen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1 - und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer
Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar.
Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1 - oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001 ) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschließende optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 1 1 1 : 2630-2647) analysiert werden.
Diese Methode bietet sich auch immer dann an, wenn mögliche Produkte der durch die zu bestimmende Enzymaktivität katalysierten Reaktion im Mikroorganismus schnell
verstoffwechselt werden können oder aber die Aktivität im Wiltyp selber zu gering ist, um die zu bestimmende Enzymaktivität anhand der Produktbildung ausreichend bestimmen zu können.
Das Enzym E-i , dessen Aktivität in dem Knallgasbakterium verglichen zu seinem Wildtyp gesteigert ist, ist bevorzugt ausgewählt aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen aus der Enzymklasse EC 2.3.1 .9.
Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angeführten Accession-Nummern entsprechen den ProteinBank Datenbank-Einträgen des NCBI mit Datum vom 26.06.2012; in der Regel wird vorliegend die Versionsnummer des Eintrages durch„Ziffer" wie beispielsweise „1 ", kenntlich gemacht.
Erfindungsgemäß bevorzugte Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen sind ausgewählt aus der Liste
AAC26023.1 , ABR35750.1 und ABR25255.1 sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des
Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang die Umsetzung von zwei Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Middleton et al. The Biochemical journal (1972), 126(1 ), 27 - 34 beschrieben.
Das Knallgasbakterium wird in Verfahrensschritt A) in einem wässrigen Medium bereitgestellt. Das eingesetzte wässrige Medium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.
Das Medium kann Stickstoffquellen enthalten, als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie
Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat, Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder Ammoniakwasser verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Das Medium kann Phosphorquellen enthalten, als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogen-phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.
Das Medium kann auch Kohlenstoffquellen enthalten, jedoch sollten diese insofern limitiert sein, als dass das Knallgasbakterium im Wesentlichen auf die Verwertung der in dem H2, C02 und 02 enthaltenden Gas enthaltenen kohlenstoffhaltigen Gase angewiesen ist. Das Medium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Medium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten
Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie
Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden.
In Verfahrensschritt B) wird das wässrige Medium mit einem Gas enthaltend H2, C02 und 02 in Kontakt gebracht.
Hierdurch wird dem Knallgasbakterium das H2, C02 und 02 enthaltende Gas als
Kohlenstoffquelle bereitgestellt. Das Knallgasbakterium synthetisiert mindestens teilweise aus dieser Kohlenstoffquelle Acetoacetyl-CoA, welches zu weiteren organischen Verbindungen verstoffwechselt wird. Anders als in einem acetogenen Verfahrensprozess, der unter streng anaeroben Bedingungen stattfindet, wird Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen
Verfahrens unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Bevorzugt beträgt der Partialdruck des Wasserstoffes in dem H2, C02 und 02 enthaltenden Gas 0,1 bis 100 bar, bevorzugt 0,2 bis 10 bar, besonders bevorzugt 0,5 bis 4 bar.
Der Partialdruck des Kohlendioxids in dem H2, C02 und 02 enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,03 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,05 bis 1 bar, insbesondere 0,05 bis 0,3 bar
Der Partialdruck des Sauerstoffs in dem H2, C02 und 02 enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,001 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,04 bis 1 bar, insbesondere 0,04 bis 0,5 bar.
Als Quelle für das H2 und C02 in Verfahrensschritt B) ist insbesondere Synthesegas geeignet, welches mit Sauerstoff versetzt eingesetzt wird; daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das Gas in Verfahrensschritt B) Synthesegas enthält. Synthesegas kann z. B. aus dem Nebenprodukt der Kohlevergasung bereitgestellt werden. Das Knallgasbakterium wandelt folglich eine Substanz, die ein Abfallprodukt ist, in einen wertvollen Rohstoff um.
Alternativ kann Synthesegas durch die Vergasung von weit verfügbaren, preiswerten landwirtschaftlichen Rohstoffen für das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt werden. Es gibt zahlreiche Beispiele an Rohstoffen, die in Synthesegas umgewandelt werden können, da fast alle Vegetationsformen zu diesem Zwecke genutzt werden können. Bevorzugte Rohstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend perennierende Gräser wie Chinaschilf,
Getreiderückstände, Verarbeitungsabfälle wie Sägemehl. Im Allgemeinen wird Synthesegas in einer Vergasungsapparatur aus getrockneter Biomasse gewonnen, hauptsächlich durch Pyrolyse, partielle Oxidation und Dampfreformierung, wobei die Primärprodukte CO, H2 und C02 sind.
Normalerweise wird ein Teil des Produktgases aufbereitet, um Produkterträge zu optimieren und Teerbildung zu vermeiden. Das Cracken des unerwünschten Teers in Synthesegas und CO kann unter Einsatz von Kalk und/oder Dolomit durchgeführt werden. Diese Prozesse werden im Detail in z. B. Reed, 1981 beschrieben (Reed, T.B., 1981 , Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.). Es können auch Mischungen verschiedener Quellen zur Generierung von Synthesegas eingesetzt werden.
Insbesondere ist es bevorzugt, dass der im Synthesegas enthaltene Kohlenstoff in
Verfahrensschritt B) mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% des Kohlenstoffs aller Kohlenstoffquellen, die dem
Knallgasbakterium in Verfahrensschritt B) zur Verfügung stehen, ausmacht, wobei sich die Gewichtsprozente des Kohlestoffs auf die Kohlenstoffatome beziehen. Die restlichen
Kohlenstoffquellen können beispielsweise in Form von Kohlenhydraten im wässrigen Medium enthalten sein oder aber auch C02 aus einer anderen Quelle als Synthesegas darstellen. Weitere C02-Quellen stellen Abgase wie beispielsweise Rauchgas, Erdölraffinerieabgase, durch Hefegärung oder clostridielle Gärung entstandene Gase, Abgase aus der Vergasung zellulosehaltige Materialien oder der Kohlevergasung dar.
Diese Abgase müssen nicht notwendigerweise als Nebenerscheinungen anderer Prozesse entstanden sein, sondern können extra für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren produziert werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende organische Substanz ist bevorzugt ausgewählt aus Substanzen umfassend drei oder vier Kohlenstoffatomen, insbesondere Butanol, Buten, Propen, Buttersäure, Aceton, 2-Hydroxyisobuttersäure und 2-Propanol und 2- Hydroxyisobuttersäure.
Erste Ausführungsform; Butanol Eine erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Butanol ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl- CoA C-Acetyltransferasen und bevorzugt das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E2, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E2 ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.
Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E2 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH zu 3- Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Senior et al. Biochemical Journal (1973), 134(1 ), 225-38 beschrieben.
Eine bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E3, welches die Umsetzung
von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E3 ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.
Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen sind ausgewählt aus der Liste
NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E3 generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl- CoA und Wasser verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Boynton et al. Journal of bacteriology (1996), 178(1 1 ), 3015-24 beschrieben.
Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2 und /oder E3 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E4, welches die Umsetzung
von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E4 ist bevorzugt ausgewählt aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der
Enzymklasse EC:1.3.99.2
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste NP_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E4 generell insbesondere die Umsetzung von Crotonyl-CoA und NADH zu Butyryl- CoA und NAD+ verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in R. Graf Dissertation an der Universität Ulm 2002 und in Rhead et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA Vol. 77, No. 1 , pp. 580-583, January 1980 Medical Sciences beschrieben.
Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3 und /oder E4 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E5, welches die Umsetzung
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA oder
die Umsetzungen
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+ zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E5 ausgewählt aus bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1 .10 oder EC:1 .1.1.1 oder aus Butyraldehyd Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1.10.
Erstgenannte Enzyme katalysieren beide der vorgenannten Reaktionen, während Butyraldehyd Dehydrogenasen lediglich Butyryl-CoA umsetzen.
Erfindungsgemäß bevorzugte bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
NPJ 49199.1 , NP_563447.1 und YP_002861217.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E5 im Falle einer bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von mindestens einer der beiden Reaktionen
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und
von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+
verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der beiden Aktivitäten wird in in Yan et al. Appl. Environ.
Microbiol. 1990 56 (9), 2591 -9 beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyraldehyd Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste YP_001310903.1 und CAQ57983.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E5 im Falle einer Butyraldehyd Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH zu Butyraldehyd, NAD+ und HS-CoA verstanden wird.
Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4 und /oder E5 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E6, welches die Umsetzung
von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E6 ausgewählt aus Butanol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1 .1 .-.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butanol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
YP_001310904.1 , YP_001310904 und CAQ53139.1 sowie Proteine mit einer
Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden,
vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm
Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E6 generell insbesondere die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+ verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Duerre et al, Applied Microbiology and Biotechnology (1987), 26(3), 268-72 beschrieben.
Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Knallgasbakterium eine gesteigerte Aktivität E6 aufweist, wenn es über eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E5 verfügt, welches nur die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA zu katalysieren vermag und somit bevorzugt eine Butyraldehyd Dehydrogenase ist. Eine weitere bevorzugte erste Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4, E5 und /oder E6 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E7 ausgewählt aus Elektrontransfer-Flavoproteinen aus der
Enzymklasse EC:2.8.3.9 aufweist.
Insbesondere geeignet ist hier ein Enzym E7, welches ein heterodimeres Enzym ist, aufgebaut aus zwei Untereinheiten, bei dem die
alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349315.1 , YP_001307468.1 und CAQ53137.1 und die
beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349316.1 , YP_001307467.1 und CAQ53136.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen.
Hier ist es insbesondere bevorzugt, wenn alpha- und beta- Untereinheiten aus dem gleichen Organismus kombiniert werden.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass das eingesetzte Knallgasbakterium eine gesteigerte Aktivität E7 aufweist, wenn bereits eine gesteigerte Aktivität von E4 vorliegt.
In besonders bevorzugten ersten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen
E1 E2, E1E3, E-|E4, E1E5, E1E5, Ε-ιΕβ, E-|E7,
E1 E2E3, Ei EsE4, E1 E5E6, E-| E2E4, E1 E2E5, E1E2E6, Ei EsE4, E1 E3E5, E1 E3E6, E-|E4E5, E-|E4E6, Ei E6E7, E1E3E4E5E6E7! E1E2E4E5E6E7! E1 E2E3E5E6E7, E1E2E3E4E6E7! E1E2E3E4E5E6 und E1E2E3E4E5E6E7 auf, wobei E1E2E3E4E5E6E7, E1E3E4E5E6E7, E1E3E4E5E7, E1E2E3E4E5E7
besonders bevorzugt ist.
Zweite Ausführungsform; Buten
Eine zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Buten ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl- CoA C-Acetyltransferasen und bevorzugt das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E2, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E2 ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.
Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E2 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH zu 3- Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ verstanden wird.
Eine bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E3, welches die Umsetzung
von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E3 ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.
Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen sind ausgewählt aus der Liste
NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten
Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E3 generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl- CoA und Wasser verstanden wird.
Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2 und /oder E3 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E4, welches die Umsetzung
von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist. Das Enzym E4 ist bevorzugt ausgewählt aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.3.99.2
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste NP_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E4 generell insbesondere die Umsetzung von Crotonyl-CoA und NADH zu Butyryl- CoA und NAD+ verstanden wird.
Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3 und /oder E4 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerteAktivität eines Enzyms E5, welches die Umsetzung
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA oder
die Umsetzungen
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und
von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E5 ausgewählt aus bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1 .10 oder EC:1 .1.1 .1 oder aus Butyraldehyd Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1.10.
Erstgenannte Enzyme katalysieren beide der vorgenannten Reaktionen, während Butyraldehyd Dehydrogenasen lediglich Butyryl-CoA umsetzen. Erfindungsgemäß bevorzugte bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
NPJ 49199.1 , NP_563447.1 und YP_002861217.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten
Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E5 im Falle einer bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von mindestens einer der beiden Reaktionen
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA und
von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADPH+
verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyraldehyd Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste YP_001310903.1 und CAQ57983.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E5 im Falle einer Butyraldehyd Dehydrogenase insbesondere die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH zu Butyraldehyd, NAD+ und HS-CoA verstanden wird.
Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4 und /oder E5 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E6, welches die Umsetzung
von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E6 ausgewählt aus Butanol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1 .1 .-.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butanol Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
YP_001310904.1 , YP_001310904 und CAQ53139.1 sowie Proteine mit einer
Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm
Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E6 generell insbesondere die Umsetzung von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+ verstanden wird.
Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Knallgasbakterium eine gesteigerte Aktivität E6 aufweist, wenn es über eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E5 verfügt, welches nur die Umsetzung von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-CoA zu katalysieren vermag und somit bevorzugt eine Butyraldehyd Dehydrogenase ist. Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4, E5 und /oder E6 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E7 ausgewählt aus Elektrontransfer-Flavoproteinen aus der Enzymklasse EC:2.8.3.9 aufweist.
Insbesondere geeignet ist hier ein Enzym E7, welches ein heterodimeres Enzym ist, aufgebaut aus zwei Untereinheiten, bei dem die
alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349315.1 , YP_001307468.1 und CAQ53137.1 und die
beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349316.1 , YP_001307467.1 und CAQ53136.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen.
Hier ist es insbesondere bevorzugt, wenn alpha- und beta- Untereinheiten aus dem gleichen Organismus kombiniert werden.
Eine weitere bevorzugte zweite Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4, E5, E6 und /oder E7 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E8, welches die Umsetzung
von n-Butanol zu 1 -Buten und Wasser
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E8 ausgewählt aus Oleat Hydratasen aus der Enzymklasse
EC:4.2.1 .53, Kieviton Hydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.95 und Phaseollidin
Hydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.97.
Erfindungsgemäß bevorzugte Oleat Hydratasen sind ausgewählt aus der Liste
ACT54545, OLHYD_STRPZ und OLHYD_FLAME, bevorzugte Kieviton Hydratase ist
AAA87627.1 , sowie für beide Enzymklassen Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E8 generell insbesondere die Umsetzung von n-Butanol zu 1 -Buten und Wasser verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Cleveland et al. Physio. Plant. Pathol. 22 (1983) 129-142 beschrieben; es muss lediglich Kieviton durch Butanol als Substrat ersetzt werden.
In besonders bevorzugten zweiten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E-|E2E8, E-iEsEs, E-^Es, Ei E5Es, E-I EÖES, E1 E3E4E5E6E7E8, E1 E2E4E5E6E7E8, E1 E2E3E5E6E7E8, E1 E2E3E4E6E7E8,
E1E2E3E4E5E6E8 und E1E2E3E4E5E6E7E8 auf,
wobei E1E2E3E4E5E6E7E8, E1E3E4E5E6E7E8, E1E3E4E5E7E8, E1E2E3E4E5E7E8 besonders bevorzugt ist.
Dritte Ausführungsform; Propen und Buttersäure Eine dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Propen oder Buttersäure ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen und bevorzugt das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E2 ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.
Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste
NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E2 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA und NADH zu 3- Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ verstanden wird.
Eine bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E3, welches die Umsetzung
von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E3 ist bevorzugt ausgewählt aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.
Erfindungsgemäß bevorzugte 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen sind ausgewählt aus der Liste
NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E3 generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl- CoA und Wasser verstanden wird.
Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2 und /oder E3 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E4, welches die Umsetzung
von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E4 ist bevorzugt ausgewählt aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der
Enzymklasse EC: 1 .3.99.2
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyryl-CoA Dehydrogenasen sind ausgewählt aus der Liste NP_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E4 generell insbesondere die Umsetzung von Crotonyl-CoA und NADH zu Butyryl- CoA und NAD+ verstanden wird.
Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3 und /oder E4 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E9, welches die Umsetzung
von n-Butyryl-CoA und Pi zu Butyryl-Phosphat und HS-CoA
zu katalysieren vermag, aufweist.
P, steht in diesem Zusammenhang für ein anorganisches Phosphat. Bevorzugt ist das Enzym E9 ausgewählt aus Phosphat Butyryltransferasen aus der Enzymklasse EC:2.3.1.19.
Erfindungsgemäß bevorzugte Phosphat Butyryltransferasen sind ausgewählt aus der Liste ABR32393.1 und ZP_05394269.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E9 generell insbesondere die Umsetzung von n Butyryl-CoA und P, zu Butyryl- Phosphat und HS-CoA verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Wiesenborn et al. Applied and
Environmental Microbiology (1989), 55(2), 317-22 beschrieben.
Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4 und /oder E9 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte
Aktivität eines Enzyms E10, welches die Umsetzung
von Butyryl-Phosphat und ADP zu Butyrat und ATP
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E10 ausgewählt aus Butyratkinasen aus der Enzymklasse EC:2.7.2.7.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyratkinasen sind ausgewählt aus der Liste
ABR32394.1 und ZP_05392467.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E10 generell insbesondere die Umsetzung von Butyryl-Phosphat und ADP zu Butyrat und ATP verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Hartmanis J Biol Chem. 1987 Jan 15; 262(2):617-21 beschrieben.
Eine weitere bevorzugte dritte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E2, E3, E4, E9 und /oder E10 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms En, welches die Umsetzung
von Butyrat und H202 zu Propen und H20
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym En ausgewählt aus Cytochrom P450 der CYP152-Familie.
Erfindungsgemäß bevorzugte Cytochrom P450 der CYP152-Familie sind ausgewählt aus der Liste
HQ709266.1 , NP_388092,1 und NP_739069.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms En generell insbesondere die Umsetzung von Butyrat und H202 zu Propen und H20 verstanden wird. Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Mathew Applied and Environmental Microbiology, Mar. 201 1 , p. 1718-1727 beschrieben.
In besonders bevorzugten dritten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E1 E2E3E4E9, E1E2E3E4E10, Ei E2EsE4Eii , E"|E3E4E9EioE"ii , Ei E2E4EgEioEn , E1 E2E3E9E10E11 , E"| E2E3E4EioE"ii , Ε-| Ε2Ε3Ε4Ε9Ειι E1 E2E3E4E9E1o und E1 E2E3E4E9E1oE11 auf,
wobei E1 E2E3E4E9E1oE11 , E1E3E4E9E10E11 besonders bevorzugt ist.
In der dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kombination der Enzyme E9E10, auch in Kombination mit den oben genannten anderen Enzymen wie vorstehend beschrieben, welche in Summe die Reaktion von n-Butyryl-CoA zu Butyrat katalysiert, durch mindestens ein Enzym ersetzt werden, bei der das n-Butyryl-CoA durch eine Thioesterase oder Acyl-CoA-Synthetase oder Acyl-CoA Acylat:CoA-Transferase zu Butyrat umgewandelt wird.
Vierte Ausführungsform; Aceton
Eine vierte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Aceton ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl- CoA C-Acetyltransferasen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E12, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E12 ausgewählt aus Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen aus der Enzymklasse EC:3.1.2.1 1 , aus Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen aus der
Enzymklasse EC 2.8.3.9 oder aus Acyl-CoA-Hydrolasen aus der Enzymklasse EC 3.1 .2.20. Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen sind ausgewählt aus der Liste
aus zwei Untereinheiten aufgebaute Transferasen, bei denen
die alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149326.1 , YP_001310904.1 und CAQ57984.1 und die
beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149327.1 , YP_001310905.1 und CAQ57985.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E12 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen sind ausgewählt aus ctfA und ctfB aus Clostridium acetobutylicum und atoD und atoA aus Escherichia coli sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der
Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E12 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Acyl-CoA Hydrolasen sind ausgewählt aus
teil aus B. subtilis bzw. ybgC aus Heamophilus influenzae
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E12 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Transferaseaktivität des Enzyms E12 wird in Jeffrey et al, Applied and Environmental Microbiology, die der Hydrolaseaktivität des Enzyms E12 in Aragon et al. Journal of Biological Chemistry (1983), 258(8), 4725-33. beschrieben.
Eine bevorzugte vierte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E12 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E13, welches die Umsetzung
von Acetoacetat zu Aceton und C02
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E13 ist bevorzugt ausgewählt aus Acetoacetat Decarboxylasen aus der
Enzymklasse EC:4.1.1.4 oder aus Aceton:C02 Ligasen aus der Enzymklasse EC 6.4.1 .6. Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetat Decarboxylasen sind ausgewählt aus der Liste NPJ 49328.1 , YP_001310906.1 und CAQ57986.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten
Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E13 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetat zu Aceton und C02 verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Daniel et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, p. 3491 -3498 Vol. 56, No. 1 1 beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugte Aceton:C02 Ligasen sind ausgewählt aus der Liste der oligomeren Proteine mit Sequenzen.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität von Aceton:C02 Ligasen wird Miriam K. Sluis et al in Proc Natl Acad Sei U S A. 1997 August 5; 94(16): 8456-8461 beschrieben, wobei hier als Substrate Acetoacetat, AMP und Orthophosphat verwendet werden.
In besonders bevorzugten vierten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E"|E12, E-|E13 und EiEi2Ei3 auf,
wobei E-\ E12E13 besonders bevorzugt ist.
Fünfte Ausführungsform; Propan-2-ol; gegebenenfalls gefolgt von Dehydratisierung zu Propen Eine fünfte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Propan-2-ol ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl- CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E12, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E12 ausgewählt aus Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen aus der Enzymklasse EC:3.1.2.1 1 , aus Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen aus der Enzymklasse EC 2.8.3.9 oder aus Acyl-CoA-Hydrolasen aus der Enzymklasse EC 3.1 .2.20. Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen sind ausgewählt aus der Liste
aus zwei Untereinheiten aufgebaute Transferasen, bei denen
die alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149326.1 , YP_001310904.1 und CAQ57984.1 und die
beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149327.1 , YP_001310905.1 und CAQ57985.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E12 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen sind ausgewählt aus ctfA und ctfB aus Clostridium acetobutylicum und atoD und atoA aus Escherichia coli sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E12 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.
Erfindungsgemäß bevorzugte Acyl-CoA Hydrolasen sind ausgewählt aus
teil aus B. subtilis bzw. ybgC aus Heamophilus influenzae sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E12 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA verstanden wird.
Eine bevorzugte fünfte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E12 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerteAktivität eines Enzyms
E13, welches die Umsetzung
von Acetoacetat zu Aceton und C02
zu katalysieren vermag, aufweist.
Das Enzym E13 ist bevorzugt ausgewählt aus Acetoacetat Decarboxylasen aus der
Enzymklasse EC:4.1.1 .4 oder aus Aceton:C02 Ligasen aus der Enzymklasse EC 6.4.1 .6.
Erfindungsgemäß bevorzugte Acetoacetat Decarboxylasen sind ausgewählt aus der Liste
NPJ 49328.1 , YP_001310906.1 und CAQ57986.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten
Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E13 generell insbesondere die Umsetzung von Acetoacetat zu Aceton und C02 verstanden wird.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Daniel et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, p. 3491 -3498 Vol. 56, No. 1 1 beschrieben.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität von Aceton:C02 Ligasen wird Miriam K. Sluis et al in Proc Natl Acad Sei U S A. 1997 August 5; 94(16): 8456-8461 beschrieben, wobei hier als Substrate Acetoacetat, AMP und Orthophosphat verwendet werden. Eine weitere bevorzugte fünfte Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms E-i und gegebenenfalls E12, und /oder E13 eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E14, welches die Umsetzung
von Aceton, NADPH und H+ zu Propan-2-ol + NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Bevorzugt ist das Enzym E14 ausgewählt aus Propan-2-ol:NADP+ Oxidoreduktase aus der Enzymklasse EC:1 .1.1.80.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität von Propan-2-ol:NADP+ Oxidoreduktase wird in Antonio D. Uttaro et al in Molecular and Biochemical Parasitology 85 (1997) 213 219 beschrieben.
In besonders bevorzugten fünften Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen E-|E14, E"|E12 E14, EiEi2Ei3 E14 und EiE12E13E14 auf,
wobei EiE12E13E14 besonders bevorzugt ist.
In einer besonders bevorzugten fünften Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens wird in Verfahrensschritt C) das Propan-2-ol aus der wässrigen Lösung destillativ als Azeotrop isoliert. Methoden zur Isolierung von Propan-2-ol sind unter anderem in Lei Zhigang, Zhang Jinchang, Chen Biaohua Separation of aqueous isopropanol by reactive extractive distillation in Journal of Chemical Technology and Biotechnology Volume 77, Issue 1 1 pages 1251-1254, November 2002, Lloyd Berg et al Separation of the propyl alcohols from water by azeotropic or extractive destillation US5085739 und Berg, Lloyd Separation of ethanol, isopropanol and water mixtures by azeotropic distillation US5762765 beschrieben. Eine besonders bevorzugte fünfte Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens umfasst einen Verfahrensschritt D).
Dehydratisierung von dem in Verfahrensschritt C) isolierten Propan-2-ol zu Propen.
Bevorzugt wird das isolierte Propan-2-ol in Verfahrensschritt D) durch chemische
Dehydratisierung an einem sauren Katalysator zu Propen umgesetzt. Entsprechende Verfahren sind in Maria L. Martinez et al Synthesis, characterization and catalytic activity of AISBA-3 mesoporous catalyst having variable silicon-to-aluminum ratios Microporous and Mesoporous Materials 144 (201 1 ) 183-190 und A.S. Araujo et al Kinetic study of isopropanol dehydration over silicoaluminophosphate catalyst Reaction Kinetics and Catalysis Letters January 1999, Volume 66,lssue 1 , pp 141 -146 beschrieben.
Sechste Ausführungsform; 2-Hydroxyisobuttersäure Eine sechste Ausführungsform des erfindungemaßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz 2-Hydroxyisobuttersäure oder ein Salz der 2- Hydroxyisobuttersäure ist, bevorzugt E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C- Acetyltransferasen, das Knallgasbakterium gegebenenfalls eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E2, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist
und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E15, welches die Umsetzung
von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu katalysieren vermag, aufweist.
In diesem Zusammenhang bevorzugte Enzyme E2 sind jene, die in der ersten Ausführungsform als bevorzugte angegeben sind.
Bei dem Enzym E15 handelt es sich vorzugsweise um eine Hydroxyl-lsobutyryl-CoA Mutase, um eine Isobutyryl-CoA Mutase (EC 5.4.99.13) oder um eine Methylmalonyl-CoA Mutase (EC 5.4.99.2), jeweils bevorzugt um eine Coenzym B12-abhängige Mutase.
Bei dem Enzym E15 handelt es sich bevorzugt um solche Enzyme, die sich aus den
Mikroorganismen Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM1 , Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893,
Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der sechsten Ausführungsform stellt das Enzym E15 ein heterodimeres Enzyme dar, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus Seq-ID-Nr. 78 und 80
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der jeweiligen vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion,
Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50 %, bevorzugt 65 %, besonders bevorzugt 80 %, insbesondere mehr als 90 % der Aktivität des Proteins mit der entsprechenden, vorgenannten Bezugssequenz besitzen, wobei unter 100 % Aktivität des Bezugsprotein die Erhöhung der Aktivität der als Biokatalysator verwendeten
Zellen, also die pro Zeiteinheit umgesetzte Stoffmenge bezogen auf die eingesetzte Zellmenge (Units pro Gramm Zelltrockenmasse (cell dry weight) [U/g CDW]) im Vergleich zur Aktivität des Biokatalysators ohne Anwesenheit des Bezugsproteins verstanden wird, wobei unter der Aktivität in diesem Zusammenhang und im Zusammenhang mit der Bestimmung der Aktivität des Enzyms E15 generell insbesondere die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A verstanden wird.
In besonders bevorzugten sechsten Ausführungsformen des erfindungemäßen Verfahrens weist das Knallgasbakterium gesteigerte Aktivitäten in den Kombinationen auf.
In der sechsten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass neben dem Enzym E15 zusätzlich das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Menge eines MeaB Proteins, insbesondere eines mit Seq-ID-Nr. 82, aufweist. Bei dem MeaB Protein handelt es sich bevorzugt um solche ausgewählt aus Sequenz ID Nr. 82, YP_001023545.1 {Methylibium petroleiphilum PM1 ), YP_001409454.1 {Xanthobacter autotrophicus Py2), YP_001045518.1 {Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029),
YP_002520048.1 {Rhodobacter sphaeroides), AAL86727.1 {Methylobacterium extorquens AMI), CAX21841 .1 {Methylobacterium extorquens DM4), YP_001637793.1 {Methylobacterium extorquens PA1 ), AAT28130.1 {Aeromicrobium erythreum), CAJ91091 {Polyangium
cellulosum), AAM77046.1 {Saccharopolyspora erythraea) und NP_417393.1 {Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655)
sowie
Proteine mit einer Polypeptidsequenz bei der bis zu 60 %, bevorzugt bis zu 25 %, besonders bevorzugt bis zu 15 % insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 % der Aminosäurereste gegenüber der jeweiligen vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion,
Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Insbesondere können Enzyme E15 und das MeaB Protein als Fusionsproteine expremiert werden, wie sie beispielsweise in der PCT/EP2010/065151 offenbart sind und welche besonders bevorzugt eingesetzt werden.
Eine Methode zur Bestimmung der Aktivität wird in Murthy VV et al in Biochim Biophys Acta. 1977 Aug 1 1 ; 483(2): 487-91 beschrieben
Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:
Abbildung 1 : Exemplarische Aceton- und Isopropanol-Produktion C. necator H 16 pBBR- EcatoDAB|Caadc
Abbildung 2: Exemplarische Butanol-Produktion mit C. necator H 16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2
Beispiele: Ausführungsbeispiel 1: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit
Cupriavidus necator
Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit C. necator wurden fünf synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden Komponenten bestehen:
1 . dem E. coli atoDAB-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit der Acetyl-CoA:Acetoacetyl- CoA-Transferase AtoD (Seq-ID-Nr. 13), die α-Untereinheit der Acetyl-CoA:Acetoacetyl-CoA- Transferase AtoA (Seq-ID-Nr. 14) und die Thiolase AtoB (Seq-ID-Nr. NR. 15), incl. der atoD- , atoA- und aioß-Ribosomenbindestellen und dem aioß-Terminator, wobei die für AtoD, AtoA und AtoB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB; Seq-ID-Nr. 16) dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der phaA- Ribosomenbindestelle, und dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl-/Butyryl-CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der ctfA- bzw. cffß-Ribosomenbindestellen und dem ctfAB- Terminator, wobei die für CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C.
necator codonoptimiert wurden (nRBS-RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 20) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), dem C.
acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ) sowie dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl-/Butyryl- CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der nativen ctfA- bzw. cifß-Ribosomenbindestellen und dem nativen cfÄAß-Terminator, wobei die für ThIA, CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq- ID-Nr. 22) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.
acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der
Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom H. influenzae yögC-Gen, kodierend für die Thioesterase YbgC (Seq-ID-Nr. 23) und schließlich der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.
acetobutylicum adc-Gen, kodierend für die Acetoacetat-Decarboxylase Ade (Seq-ID-Nr. 24), incl. dem ac/c-Terminator, wobei die für ThIA, YbgC und Ade kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL- HiybgC-RBS-RegroEL-Caadc-T-Caadc; Seq-ID-Nr. 25) dem E. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL- Gens (Seq-ID-Nr. 1 ) sowie dem C. acetobutylicum adc-Gen, kodierend für die Acetoacetat- Decarboxylase Ade (Seq-ID-Nr. 24), incl. dem ac/c-Terminator, wobei der für Ade kodierende Bereich für die Translation in C. necator codonoptimiert wurde (Plac-RBS- RegroEL-Caadc-T-Caadc; Seq-ID-Nr. 27) Die Expressionskassetten nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB, nRBS- RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB, RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS- CactfB-T-CactfAB und RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL-Caadc-T- Caadc wurden dann über Kpn\/Hind\\\ in den Broad Host Range Expressionsvektor
pBBR1 MCS-2 (Seq-ID-Nr. 10) kloniert, so dass die Expression der Gene unter Kontrolle des £ coli /acZ-Promotors steht. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-
EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB, pBBR-CathlA-ctfAB und pBBR-CathlA-HiybgC-Caadc bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 28, 29, 30 und 31 .
Die Expressionskassette Plac-RBS-RegroEL-Caadc-T-Caadc wurde dann über /-//'ndlll/ßamHI in die Vektoren pBBR-EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB und pBBR-CathlA-ctfAB (Seq-ID-Nr. 28, 29 und 30) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-
EcatoDAB|Caadc, pBBR-RephaA-CactfAB|adc und pBBR-CathlA-ctfAB|adc bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 32, 33 und 34.
Ausführungsbeispiel 2: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit
Cupriavidus necator
Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Aceton mit C. necator wurden fünf synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden Komponenten bestehen: 1 . dem £. coli atoDAB-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit der Acetyl-
CoA:Acetoacetyl-CoA-Transferase AtoD (Seq-ID-Nr. 13), die α-Untereinheit der Acetyl- CoA:Acetoacetyl-CoA-Transferase AtoA (Seq-ID-Nr. 14) und die Thiolase AtoB (Seq-ID- Nr. 15), incl. der atoD-, atoA- und aioß-Ribosomenbindestellen und dem atoB- Terminator, wobei die für AtoD, AtoA und AtoB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-
EcatoB; Seq-ID-Nr. 16) dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der p/?a4-Ribosomenbindestelle, und dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl-/Butyryl-CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der ctfA- bzw. ctfB- Ribosomenbindestellen und dem cfÄ4ß-Terminator, wobei die für CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS- RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 20) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), dem C.
acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ) sowie dem C. acetobutylicum ctfAB-Operon, kodierend für die a- und ß-Untereinheit der Acetyl- /Butyryl-CoA-Acetoacetat:CoA-Transferase CtfA (Seq-ID-Nr. 18) und CtfB (Seq-ID-Nr. 19), incl. der nativen ctfA- bzw. cffß-Ribosomenbindestellen und dem nativen ctfAB- Terminator, wobei die für ThIA, CtfA und CtfB kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB- T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 22) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C. acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der
Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom H.
influenzae ybgC-Gen, kodierend für die Thioesterase YbgC (Seq-ID-Nr. 23) und schließlich der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acöß-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase beta Untereinheit AcbB (Seq-ID-Nr. 9), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acbA-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase alpha Untereinheit AcbA (Seq-ID-Nr. 8) und der
Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom
Cupriavidus necator JMP134 acbC-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase gamma Untereinheit AcbC (Seq-ID-Nr. 86) incl. dem ac/c-Terminator, wobei die für ThIA und YbgC kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL-AcbB- RBS-RegroEL- AcbA- RBS-RegroEL-AcBC-T-Caadc; Seq-ID-Nr. 7) 5. dem £. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ) gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acbB-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase beta Untereinheit AcbB (Seq-ID-Nr. 9), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom
Cupriavidus necator JMP134 acbA-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase alpha
Untereinheit AcbA (Seq-ID-Nr. 8) und der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL- Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Cupriavidus necator JMP134 acbC-Gen, kodierend für die Aceton carboxylase gamma Untereinheit AcbC (Seq-ID-Nr. 86) incl. dem adc- Terminator. (Plac-RBS- RegroEL-AcbB- RBS-RegroEL-AcbA- RBS-RegroEL-AcBC-T- Caadc; Seq-ID-Nr. 6)
Die Expressionskassetten nRBS-EcatoD-nRBS-EcatoA-nRBS-EcatoB-T-EcatoB, nRBS- RephaA-nRBS-CactfA-nRBS-CactfB-T-CactfAB, RBS-RegroEL-CathlA-nRBS-CactfA-nRBS- CactfB-T-CactfAB und RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-HiybgC-RBS-RegroEL- AcbB- RBS-RegroEL-AcbA- RBS-RegroEL-AcBC -T-Caadc wurden dann über Kpn\IHind\\\ in den Broad Host Range Expressionsvektor pBBR1 MCS-2 (Seq-ID-Nr. 10) kloniert, so dass die Expression der Gene unter Kontrolle des E. coli /acZ-Promotors steht. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-EcatoDAB, pBBR-RephaA-CactfAB, pBBR-CathlA- ctfAB und pBBR-CathlA-HiybgC-ReacbBAC bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nr.s 28, 29, 30 und 5.
Die Expressionskassette Plac- RBS-RegroEL- AcbB- RBS-RegroEL-AcbA- RBS-RegroEL- AcBC -T-Caadc wurde dann über /-//'ndlll/ßamHI in die Vektoren pBBR-EcatoDAB, pBBR- RephaA-CactfAB und p B B R-Cath I A-ctf AB (Seq-ID-Nr.s 28, 29 und 30) kloniert. Die
resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-EcatoDAB|ReacbBAC, pBBR-RephaA- CactfAB| ReacbBAC und pBB R-Cath IA-ctfAB| ReacbBAC bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 4, 3 und 2.
Ausführungsbeispiel 3: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von 1-Butanol mit Cupriavidus necator -
Es wurden sieben synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden
Komponenten bestehen: dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der phaA- Ribosomenbindestelle, dem C. necator phaBl -Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl- CoA-Dehydrogenase PhaB1 (Seq-ID-Nr. 35), incl. der pftaßi-Ribosomenbindestelle, dem Aeromonascaviae phaJ-Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Deydratase PhaJ (Seq-ID-Nr. 36), incl. der phaJ-Ribosomenbindestelle, der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), dem C. acetobutylicum adhE2-Gen, kodierend für die bifunktionale Butyryl-CoA-/Butyraldehyd-Dehydrogenase AdhE2 (Seq-ID-Nr. 37), sowie dem A. caviae phaJ-Terminator (Seq-ID-Nr. 38), wobei die für PhaJ und AdhE2 kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (nRBS-RephaA-nRBS- RephaB1-nRBS-AcphaJ-RBS-RegroEL-CaadhE2-T-AcphaJ; Seq-ID-Nr. 39) dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der phaA- Ribosomenbindestelle, dem C. necator phaBl '-Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl- CoA-Dehydrogenase PhaBl (Seq-ID-Nr. 35), incl. der phaB 7-Ribosomenbindestelle und dem Aeromonascaviae phaJ-Gen, kodierend für die (R)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Deydratase PhaJ (Seq-ID-Nr. 36), incl. der phaJ-Ribosomenbindestelle sowie dem Aeromonascaviae pftaJ-Terminator (Seq-ID-Nr. 38), wobei der für PhaJ kodierende Bereich für die Translation in C. necator codonoptimiert wurde (nRBS-RephaA-nRBS-RephaB1-nRBS-AcphaJ-T- AcphaJ; Seq-ID-Nr. 40) der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.
acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der
Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.
acetobutylicum hbd-Gen, kodierend für die (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd (Seq-ID-Nr. 41 ), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C. acetobutylicum adhE2-Gen, kodierend für die bifunktionale Butyryl-CoA- /Butyraldehyd-Dehydrogenase AdhE2 (Seq-ID-Nr. 37) und dem C. acetobutylicum ctfAB- Terminator (Seq-ID-Nr. 42), wobei die für ThIA, Hbd und AdhE2 kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL- Cahbd-RegroEL-CaadhE2-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 43)
ERICHTIGTES B ATT REGEL 91 ISA EP 4. der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Ger s (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.
acetobutylicum thIA-Gen, kodierend für die Thiolase ThIA (Seq-ID-Nr. 21 ), der
Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom C.
acetobutylicum hbd-Gen, kodierend für die (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd (Seq-ID-Nr. 41 ) und dem C. acetobutylicum cfÄAß-Terminator (Seq-ID-Nr. 42), wobei die für ThIA und Hbd kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (RBS-RegroEL-CathlA-RBS-RegroEL-Cahbd-T-CactfAB; Seq-ID-Nr. 44)
5. dem E. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), dem C. necator etfBA-bcd-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfB (Seq-ID-Nr. 45), die a-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfA (Seq-ID-Nr. 46) und die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd (Seq-ID-Nr. 46), incl. der eifß-, etfA- und bcd-Ribosomenbindestellen und dem C.
necator etfBA-bcd-T ermmator (Seq-ID-Nr. 48) (Plac-nRBS-ReetfB-nRBS-ReetfA-nRBS- Rebcd-nT; Seq-ID-Nr. 49)
6. dem E. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), dem C. acetobutylicum c/f-Gen, kodierend für die Crotonase Crt (Seq-ID-Nr. 50), incl. der c/f-Ribosomenbindestelle, dem C.
acetobutylicum etfBA-bcd-Operon, kodierend für die ß-Untereinheit des Elektron- Transferproteins EtfB (Seq-ID-Nr. 51 ), die α-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfA (Seq-ID-Nr. 52) und die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd (Seq-ID-Nr. 53), incl. der etfB-, etfA- und bcd-Ribosomenbindestellen und dem C. necator etfBA-bcd-T ermmator (Seq-ID- Nr. 48) (Plac-nRBS-Cacrt-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd; Seq-ID-Nr. 54)
7. dem £. coli /acZ-Promotor (Seq-ID-Nr. 26), dem C. acetobutylicum etfBA-bcd-Operor\,
kodierend für die ß-Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfB (Seq-ID-Nr. 51 ), die a- Untereinheit des Elektron-Transferproteins EtfA (Seq-ID-Nr. 52) und die Butyryl-CoA- Dehydrogenase Bcd (Seq-ID-Nr. 53), incl. der eifß-, etfA- und bcd-Ribosomenbindestellen und dem C. necator etfBA-bcd-T ermmator (Seq-ID-Nr. 48) (Plac-nRBS-CaetfB-nRBS- CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd; Seq-ID-Nr. 55)
Die Expressionskassetten nRBS-RephaA-nRBS-RephaB1 -nRBS-AcphaJ-RBS-RegroEL- CaadhE2-T-AcphaJ, nRBS-RephaA-nRBS-RephaB1 -nRBS-AcphaJ-T-AcphaJ, RBS-RegroEL- CathlA-RBS-RegroEL-Cahbd-RegroEL-CaadhE2-T-CactfAB und RBS-RegroEL-CathlA-RBS- RegroEL-Cahbd-T-CactfAB wurden dann über Kpn\/Hind\\\ in den Broad Host Range
Expressionsvektor pBBR1 MCS-2 (Seq-ID-Nr. 10) kloniert, so dass die Expression der Gene unter Kontrolle des E. coli /acZ-Promotors steht. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ-CaadhE2, pBBR-RephaABJ, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 56, 57, 58 und 59.
Die Expressionskassette Plac-nRBS-ReetfB-nRBS-ReetfA-nRBS-Rebcd-nT wurde dann über Hind\\\/Bam \ in die Vektoren pBBR-RephaABJ-CaadhE2 und pBBR-RephaABJ (Seq-ID-Nr.s 56 und 57) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ- CaadhE2|ReetfBA-bcd und pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 60 und 61 .
Die Expressionskassette Plac-nRBS-Cacrt-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd wurde dann über Hind\\\/Bam \ in die Vektoren pBBR-RephaABJ-CaadhE2, pBBR-RephaABJ, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB (Seq-ID-Nrs. 56, 57, 58 und 59) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ-CaadhE2|Cacrt- etfBA-Cabcd, pBBR-RephaABJ|Cacrt-etfBA-Cabcd, pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA- bcd und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 62, 63, 64 und 65.
Die Expressionskassette Plac-nRBS-CaetfB-nRBS-CaetfA-nRB-Cabcd-T-Rebcd wurde dann über Hind\\\/Bam \ in die Vektoren pBBR-RephaABJ-CaadhE2 und pBBR-RephaABJ (Seq-ID- Nrs. 56 und 57) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-RephaABJ- CaadhE2|etfBA-bcd und pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd bezeichnet und entsprechen den Seq- ID-Nrs. 66 und 67.
Ausführungsbeispiel 4: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Butyrat und 1- Propen mit Cupriavidus necator
Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von Butyrat und 1 -Propen mit C. necator wurde eine synthetische Expressionskassetten synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht: 1 . dem C. necator groEL- Promotor (Seq-ID-Nr. 68), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456 o/eT-Gen, kodierend für die terminale Olefine bildende Fettsäure-Decarboxylase OleT (Seq-ID-Nr. 69), der Ribosomenbindestelle des C. necator gro£Z--Gens (Seq-ID-Nr. 1 ) und schließlich dem C. acetobutylicum ptb-buk-Operon, kodierend für die Phosphotransbutyrylase Ptb (Seq-ID- Nr. 70) und die Butyratkinase Buk (Seq-ID-Nr. 71 ), incl. der öü/ -Ribosomenbindestelle und dem piö-öü/ -Terminator (Seq-ID-Nr. 72), wobei die für OleT, Ptb und Buk kodierenden Bereiche für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (PRegroESL-RBS- RegroEL-JeoleT-RBS-RegroEL-Captb-nRBS-Cabuk-T-Captb-buk; Seq-ID-Nr. 73)
Die Expressionskassette PRegroESL-RBS-RegroEL-JeoleT-RBS-RegroEL-Captb-nRBS-
Cabuk-T-Captb-buk wurde dann über BamH\/Sac\ in die Vektoren pBBR-RephaABJ|ReetfBA- bcd, pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd (Seq-ID-Nrs. 58, 60 und 62) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR- RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk, pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk und pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk bezeichnet und entsprechen den Seq- ID-Nrs. 74, 75 und 76.
Ausführungsbeispiel 5: Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von 2-Propanol mit Cupriavidus necator
Für die Konstruktion von Plasmiden für die Herstellung von 2-Propanol mit C. necator wurde eine synthetische Expressionskassette synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht:
1 . dem C. necator groEL- Promotor (Seq-ID-Nr. 68), der Ribosomenbindestelle des C. necator groEL-Gens (Seq-ID-Nr. 1 ), gefolgt vom Clostridium beijerinckii NRRL B593 adh-Gen, kodierend für eine primäre und sekundäre Alkohole oxidierende Alkoholdehydrogenase (Seq-ID-Nr. 1 1 ), wobei der für die primäre und sekundäre Alkohole oxidierende
Alkoholdehydrogenase kodierende Bereich für die Translation in C. necator codonoptimiert wurden (PRegroESL-RBS-Cbadh-T-Rebcd; Seq-ID-Nr. 12)
Die Expressionskassette PRegroESL-RBS-Cbadh-T-Rebcd wurde dann über Sac\/Spe\ in die Vektoren pBBR-EcatoDAB|Caadc, pBBR-RephaA-CactfAB|adc und pBBR-CathlA-ctfAB|adc (Seq-ID-Nrs. 32, 33 und 34) kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden als pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh, pBBR-RephaA-CactfAB|adc|Cbadh und pBBR-CathlA- ctfAB|adc|Cbadh bezeichnet und entsprechen den Seq-ID-Nrs. 83, 84 und 85.
A usführungsbeispiel 6: Generierung des Vektors pBBR 1 MCS-2::HCM-phaA und pBBR 1 MCS- 2::meaBhcmA-hcmB-phaA
Der Vektor pBBR1 MCS-2::HCM-phaA wurde ausgehend vom Plasmid pBBR1 MCS-2::HCM (Generierung und Eigenschaften in Patentanmeldung EP12173010 beschrieben) erzeugt. Für die Konstruktion wurde eine synthetische Expressionskassette synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht:
1 . dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der p/?a4-Ribosomenbindestelle; up- und downstream der Sequenz werden Xbal
Schnittstellen angefügt (nRBS-RephaA; Seq-ID-Nr. 87).
Das Plasmid pBBR1 MCS-2::HCM wurde mit der Restricktionsendonuklease Xbal linearisiert und anschließend mit der ebenfalls mittels Xbal restringierten und so vorbereiteten
Expressionskassette nRBS-RephaA ligiert. Alle molekularbiologischen Arbeiten erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Die Expression der Gene erfolgt nach erfolgreicher Klonierung unter Kontrolle des E. coli lacZ- Promotors. Das resultierenden Expressionsplasmid wird als pBBR1 MCS-2::HCM-phaA bezeichnet und entspricht der Seq-ID-Nr. 88.
Der Vektor pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB-phaA wurde ausgehend vom Plasmid pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB (Generierung und Eigenschaften in Patentanmeldung WO201 1/057871 beschrieben) erzeugt. Für die Konstruktion wurde eine synthetische
Expressionskassette synthetisiert, die aus folgenden Komponenten besteht: 1 . dem C. necator phaA-Gen, kodierend für die Thiolase PhaA (Seq-ID-Nr. 17), incl. der p/?a4-Ribosomenbindestelle; up- und downstream der Sequenz werden Xbal
Schnittstellen angefügt (nRBS-RephaA; Seq-ID-Nr. 87).
Das Plasmid pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB wurde mit der Restricktionsendonuklease Sacl linearisiert und anschließend mit der ebenfalls mittels Sacl restringierten und so vorbereiteten Expressionskassette nRBS-RephaA ligiert. Alle molekularbiologischen Arbeiten erfolgen in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Die Expression der Gene erfolgt nach erfolgreicher Klonierung unter Kontrolle des £ coli lacZ- Promotors. Das resultierenden Expressionsplasmid wird als pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB- phaA bezeichnet und entspricht der Seq-ID-Nr. 89.
Ausführungsbeispiel 7: Einbringen von Plasmiden für die Herstellung von, Aceton, 2-Propanol, 1-Butanol, Butyrat, 2-Hydroxyisobuttersäure und 1 -Propen in Cupriavidus necator Die Plasmide werden in kompetente £ coli S 17-1 -Zellen transferiert, einen Stamm, mit dem die konjugative Übertragung von Plasmiden u.a. in Cupriavidus necaior-Stämme möglich ist. Dazu wird eine Spotmating-Konjugation (wie bei FRIEDRICH et al.,1981 , Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus. J Bacteriol 147:198-205 beschrieben) mit den die jeweiligen Plasmide tragenden £. coli S 17-1 -Stämmen als Donoren und R. eutopha H16 (reklassifiziert als Cupriavidus necator, DSMZ 428) sowie R. eutropha PHB-4 (reklassifiziert als Cupriavidus necator, DSMZ 541 ) als Rezipienten durchgeführt.
Es werden in allen Fällen Transkonjuganten erhalten, die die jeweiligen Plasmide tragen und die entsprechenden Stämme wie folgt bezeichnet:
• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc
• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc
• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2
· C. necator H16 pBBR-RephaABJ
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd • C. necator H16 pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|crt-etfBA-bcd
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd
· C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk · C. necafor H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
• C. necator H 16 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh
• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh
• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh
• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|ReacbBAC
· C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB| ReacbBAC
• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB| ReacbBAC
• C. necator H16 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA
• C. necator PHB-4 pBBR-EcatoDAB|Caadc
· C. necator PHB-4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc
• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ
• C. necafor PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB
· C. necafor PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|crt-etfBA-bcd
· C. necafor PHB-4 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd
• C. necafor PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd c. necator PHB-■4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd
c. necator PHB- ■4 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
c. necator PHB- ■4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
c. necator PHB- ■4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk c. necator PHB- ■4 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh
c. necator PHB- ■4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh
c. necator PHB- ■4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh
c. necator PHB- -4 pBBR-EcatoDAB|ReacbBAC
c. necator PHB- -4 pBBR-RephaA-CactfAB| ReacbBAC
c. necator PHB- -4 pBBR-CathlA-ctfAB| ReacbBAC
c. necator PHB- -4 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA
c. necator PHB- -4 pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB-phaA
Ausführungsbeispiel 8: Quantifizierung von Aceton, 2-Propanol, 1 -Butanol,
2-Hydroxyisobuttersäure, Butyrat und 1 -Propen
Butyrat und Butanol
Die Quantifizierung von Butanol und Butyrat aus einer Fermentationsbrühe erfolgt mittels HPLC/RID und DAD.
Jeweils 2 mL Fermentationsprobe werden in einem 2 mL Eppendorff-Reaktionsgefaß für 5 bei 13000 rpm abzentrifugiert. Anschließend wird der Überstand über einen 0,2 μηη Spritzenvorsatzfilter steril in ein HPLC-Vial filtriert. Gegebenenfalls müssen die Proben entsprechend dem Messbereich verdünnt werden.
Die Messung erfolgt unter den folgenden Bedingungen:
HPLC Agilent 1200, Agilent Technologies, Waldbronn
Mobile Phase: Mobile Phase A1 : H20 (Millipore) + 5 mM wässerige H2S04
Gradient: Isokratisch
Säule: Supelcogel C-610H (9 μηη Partikelgröße,
L x l.D. 30 cm x 7,8 mm) Best.Nr.: 59320-U (Fa. Aldrich)
Vorsäule : Supelcogel H Guard Column (9 μηι Partikelgröße,
L x I.D. 5 cm x 4,6 mm) Best.Nr.: 59319 (Fa. Aldrich)
Säulentemperatu 80 °C
Fluss: 1 ,0 mL/min
Detektor: RID
DAD (210 nm)
Injektionsvolumen: 20 μΙ_,„Flush Sovent" Injektor Nadel: Isopropanol/Wasser (1 Laufzeit: 27 min
Messbereich: Für alle Analyten ca. 0,100 g/L - 12,0 g/L
Kalibrierung und Auswertung: Standardsubstanzen von Butanol und Butyrat (~ 20 mg je Analyt) werden zusammen in einen 10 mL Messkolben eingewogen. Der Messkolben wird mit LM (Millipore Wasser) bis zum Eichstrich aufgefüllt (Lösung S1 : Stammlösung). Aus der Stammlösung wird durch Verdünnen mit Millipore Wasser eine 5-Punkt Kalibrierung angesetzt. 1 mL S1 wird in einen 10 mL Messkolben pipettiert und mit LM bis zum Eichstrich aufgefüllt. In jeder Messreihe werden vor und nach den Proben jeweils die Kalibrierstandards in HPLC-Vials vermessen. Für die
Auswertung werden beide Kalibrierreihen gemittelt. Die Auswertung von Butyrat erfolgt über das DAD Signal bei 210 nm. Butanol wird im RID Chromatogramm ausgewertet.
2-Hydroxyisobuttersäure
Die Bestimmung erfolgt mittels quantitativer 1H-NMR-Spectroskopie. Als interner
Quantifizierungsstandard dient Trimethylpropionsäure.
Aceton, 2-Propanol und 1 -Propen
Die Bestimmung der Analyten Aceton, Isopropanol und 1 -Propen in der wässerigen Phase erfolgt mittels Headspace GC/FID Messung und Standardaddition. Die wichtigsten
chromatographischen Parameter sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst. Säule DB-Wax, 30 m x 250 μηι, Filmdicke: 0,25 μηι
GC System Agilent 7890
Gasfluss He, 0,9 mL/min
Säulenofen Equilibrierzeit: 0,5 min, Temperaturgradient: 0-4 min: 40 °C, 5 °C/min von 50 bis 130 °C, 30 °C/min von 130 bis 250 °C, 250 °C für 12 min
Detektor FID, 250 °C
Injektion Headspace, Temperatur: 90 °C, Septum Purge Flow 2 mL/min, Split 1 :2
Kalibrierung Die Kalibrierung erfolgt über Standardaddition mit den entsprechenden
Analyten (interne 1 -Punkt Kalibrierung), linearer Messbereich 1 - 100 mg/L
Ausführungsbeispiel 9: Herstellung von Aceton, 2-Propanol, 1 -Sutanol, Butyrat und 1 -Propen mit rekombinanten Ralstonia eutropha-Zellen
Die in Beispiel 7 beschriebenen plasmidtragenden C. necaior-Stämme werden zur
Untersuchungen der Bildung von Aceton, 2-Propanol, 1 -Butanol, Butyrat und 1 -Propen zur Vorkultur in 2 x 250ml Schüttelkolben mit Schikanen in 25 ml Medium nach Vollbrecht et al., 1978 kultiviert. Das Medium besteht aus (NH4)2HP04 2,0 g/l; KH2P04 2,1 g/l; MgS04 * 7 H20 0,2 g/l; FeCI3 * 6 H20 6 mg/l; CaCI2 x 2 H20 10 mg; Spurenelement-Lösung (Pfennig and Lippert, 1966) 0,1 ml. Die Spurenelementlösung setzt sich aus Titriplex III 10 g/l, FeS0 x 7 H20 4 g/l, ZnS04 x 7 H20 0,2 g/l, MnCI2 x 4 H20 60 mg/l, H3B03 0,6 g/l, CoCI2 x 6 H20 0,4 g/l, CuCI2 x 2 H20 20 mg/l, NiCI2 x 6 H20 40 mg/l, Na2Mo4 x 2 H20 60 mg/l zusammen. Das Medium der Vorkultur wurde zusätzlich mit Fructose 5 g/l, Kanamycin 300 μg/ml supplementiert. Die Kolben wurden 1 %ig (v/v) aus einer Cryokultur angeimpft. Die Kulturen werden auf einem Schüttler bei 30 °C und 150 rpm für 24h inkubiert. Danach werden die Kulturen vereinigt und eine OD6oo von ca. 3,5 bestimmt.
Die Hauptkultur erfolgt chemolithoautotroph in einem 21 Edelstahl - Reaktor, Biostat B von Sartorius, gefüllt mit 1 -2 I Medium mit der Zusammensetzung (NH4)2HP0 2,0 g/l, KH2P0 2,1 g/l, MgS04 x 7 H20 3 g/l, FeCI3 * 6 H20 6 mg/l, CaCI2 x 2 H20 10 mg, Biotin 1 mg/l, Thiamin- HCI 1 mg/l, Ca-Pantothenat 1 mg/l, Nicotinsäure 20mg/l, Spurenelement-Lösung 0,1 ml und Polypropylenglykol (PPG 1000 1 :5 mit Wasser verdünnt). Die Kultivierung erfolgt bei 30 °C, 500 - 1500 rpm, pH 7. Der pH wird einseitig mit 1 M NaOH geregelt. Die Begasung erfolgt mit einem Gasgemisch aus H2 90 %, C02 6 %, 02 4 % bei einem Überduck von 0 - 2 bar mit einer Begasungsrate von 0,19 vvm. Der Reaktor wird mit 0,1 % der Vorkultur angeimpft. Dazu wird das benötigte Volumen der Vorkultur in 50 ml Falcontubes 10 min, bei 20 °C und 4500 rpm abzentrifugiert und in 10 ml phosphatgepufferten Salzlösung resuspendiert. Das Waschen wird 3x wiederholt, das letzte Resuspendieren erfolgt in 10 ml Hauptkulturmedium. Die Kultivierungsdauer beträgt 76 - 150 h. Zur Probennahme werden über ein Septum mit einer Spritze mit steriler Kanüle jeweils 10 ml Probe entnommen. Bestimmt wird OD6oo, BTM und das je nach Stamm zu erwartende Produkt nach Beispiel 7.
Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von Aceton nachgewiesen werden:
• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc (siehe Abbildung 1 )
• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc
• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc
· C. necator PHB-4 pBBR-EcatoDAB|Caadc
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc
• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc
Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von 2-Propanol nachgewiesen werden: · C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc (siehe Abbildung 1 )
• C. necator H16 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh
• C. necator H16 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh
• C. necator H16 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh
• C. necator PHB-4 pBBR-EcatoDAB|Caadc|Cbadh
· C. necator PHB-4 pBBR-RephaA-CactfAB|adc| Cbadh
• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-ctfAB|adc| Cbadh
Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von 1 -Butanol nachgewiesen werden:
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2 (siehe producer Abbildung 2)
· C. necator H16 pBBR-RephaABJ
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd C. necator H16 pBBR-RephaABJ|ReetfBA-bcd
C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd
C. necator H16 pBBR-RephaABJ|crt-etfBA-bcd
C. necator H16 pBBR-RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd
C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd
C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd
C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ-CaadhE2
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ
c. necator PHB- -4 pBBR- ■CathlA-hbd-adhE2-ctfAB
c. necator PHB- -4 pBBR- ■CathlA-hbd-ctfAB
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ-CaadhE2|ReetfBA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ | Reetf BA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ-CaadhE2|crt-etfBA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ |crt-etf BA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ-CaadhE2|etfBA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■RephaABJ|CaetfBA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■CathlA-hbd-adhE2-ctfAB|crt-etfBA-bcd
c. necator PHB- -4 pBBR- ■CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd
Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von Butyrat nachgewiesen werden:
C. necator H16 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
Nach Kultivierung folgender Stämme kann die Bildung von 1 -Propen nachgewiesen werden: · C. necator H16 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
• C. necator H16 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
• C. necator H16 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk • C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
• C. necator PHB-4 pBBR-RephaABJ|CaetfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk
• C. necator PHB-4 pBBR-CathlA-hbd-ctfAB|crt-etfBA-bcd|JeoleT-Captb-buk Ausführungsbeispiel 9: Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure mit rekombinanten
Cupriavidus necator-Zellen
Für die Biotransformation von Knallgas zu 2-Hydroxyisobuttersäure (2HIB) wurde eine
Produktionsphase von einem plasmidtragenden Cupriavidus necator verwendet. In diesem Ansatz nimmt das Bakterium H2 und C02 aus der durchgeleiteten Gasphase auf und bildet 2HIB. Für die Kultivierung wurden druckfeste Glasflaschen, die mit einem Butylgummistopfen luftdicht verschlossen werden können, benutzt. Als plasmidtragende C. necator Stämme wurden die Stämme C. necator pBBR1 MCS2::HCM und C necator pBBR1 MCS2::HCM-phaA verwendet.
Die plasmidtragenden C. necaior-Stämme wurden zur Untersuchung der Bildung von 2-
Hydroxyisobuttersäure zunächst auf LB-R-Agarplatten mit Antibiotikum ausgestrichen und für 3 Tage bei 30°C inkubiert.
Zur Vorkultur wurden die Stämme in 200 ml H16-Mineralmedium (modifiziert nach Schlegel et al.,1961 ) in druckfesten 500 ml-Glasflaschen kultiviert. Das Medium bestand aus Na2HP04 x 12 H20 9,0 g/l; KH2P04 1 ,5g/l; NH4CI 1 ,0 g/l; MgS04 χ 7 H20 0,2 g/l; FeCI3 * 6 H20 10 mg/l; CaCI2 x 2 H20 0,02 g/l; Spurenelement-Lösung SL-6 (Pfennig, 1974) 1 ml/l.
Die Spurenelementlösung setzte sich aus ZnS04 x 7 H20 100 mg/l, MnCI2 x 4 H20 30 mg/l, H3BO3 300 mg/l, CoCI2 x 6 H20 200 mg/l, CuCI2 x 2 H20 10 mg/l, NiCI2 x 6 H20 20 mg/l, Na2Mo4 x 2 H20 30 mg/l zusammen. Der pH-Wert des Mediums wurde durch Zugabe von 1 M NaOH auf 6,8 eingestellt.
Die Flaschen wurden mit einer Einzelkolonie von den bebrüteten Agarplatten angeimpft und die Kultivierung erfolgte chemolithoautotroph auf einem N2/H2/02/C02-Gemisch (Verhältnis
80 %/10 %/4 %/6 %). Die Kulturen wurden in einem offenen Wasserbadschüttler bei 28 °C, 150 rpm und einer Begasung von 1 l/h für 137 h inkubiert bis zu einer OD >1 ,0. Der Gaseintrag ins Medium erfolgte durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte des Reaktors an einem Begasungsrohr angebracht war. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert, mit 10 ml Waschpuffer (0,769 g/L NaOH, mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C02 durchgast) gewaschen und erneut abzentrifugiert. Für die Produktionsphase wurden so viele gewaschene Zellen aus der Wachstumskultur in 200 mL Produktionspuffer (NaOH 0,769 g/l, wird mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C02 durchgast, wobei sich ein pH von etwa 7,4 einstellt) überführt, dass eine OD6oonm von 1 ,0 eingestellt wurde. Die Hauptkultur erfolgte chemolithoautotroph in druckfesten 500 ml- Glasflaschen bei 28 °C und 150 rpm in einem offenen Wasserbadschüttler mit einer Begasung von 1 l/h mit einem N2/H2/02/C02-Gemisch (Verhältnis 80 %/10 %/4 %/6 %) für 1 16 h. Der Gaseintrag ins Medium erfolgte durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte der Reaktoren an einem Begasungsrohr angebracht war. Bei Probenahme wurden jeweils 5 ml Probe entnommen zur Bestimmung von OD6oonm, pH und des
Produktspektrums. Die Bestimmung der Produktkonzentration erfolgte mittels semi-quantitativer 1 H-NMR-Spektroskopie. Als interner Quantifizierungsstandard diente
Natriumtrimethylsilylpropionat (T(M)SP).
Über die Kultivierungsdauer in der Produktionsphase bildeten sich bei dem Stamm C. necator pBBR1 MCS2::HCM bis zu 0,3 mg/l 2HIB, während sich bei dem Stamm C. necator pBBR1 MCS2::HCM-phaA bis zu 0,8 mg/l 2HIB bildeten.
Für die Biotransformation von Knallgas zu 2-Hydroxyisobuttersäure (2HIB) wird eine
Produktionsphase von einem plasmidtragenden Cupriavidus necator verwendet. In diesem Ansatz nimmt das Bakterium H2 und C02 aus der durchgeleiteten Gasphase auf und bildet 2HIB. Für die Kultivierung werden druckfeste Glasflaschen, die mit einem Butylgummistopfen luftdicht verschlossen werden können, benutzt. Als plasmidtragende C. necator Stämme werden die Stämme C. necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB und C. necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB-phaA verwendet.
Die plasmidtragenden C. necaior-Stämme werden zur Untersuchung der Bildung von 2-
Hydroxyisobuttersäure zunächst auf LB-R-Agarplatten mit Antibiotikum ausgestrichen und für 3 Tage bei 30°C inkubiert.
Zur Vorkultur werden die Stämme in 200 ml H16-Mineralmedium (modifiziert nach Schlegel et al.,1961 ) in druckfesten 500 ml-Glasflaschen kultiviert. Das Medium besteht aus Na2HP04 x 12 H20 9,0 g/l; KH2P04 1 ,5g/l; NH4CI 1 ,0 g/l; MgS04 * 7 H20 0,2 g/l; FeCI3 * 6 H20 10 mg/l;
CaCI2 x 2 H20 0,02 g/l; Spurenelement-Lösung SL-6 (Pfennig, 1974) 1 ml/l.
Die Spurenelementlösung setzt sich aus ZnS04 x 7 H20 100 mg/l, MnCI2 x 4 H20 30 mg/l, H3B03 300 mg/l, CoCI2 x 6 H20 200 mg/l, CuCI2 x 2 H20 10 mg/l, NiCI2 x 6 H20 20 mg/l, Na2Mo4 x 2 H20 30 mg/l zusammen. Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von 1 M NaOH auf 6,8 eingestellt. Allen verwendeten Medien werden 300 μg ml Kanamycin und 76 nM CoB12 zugeführt.
Die Flaschen werden mit einer Einzelkolonie von den bebrüteten Agarplatten angeimpft und die Kultivierung erfolgt chemolithoautotroph auf einem N2/H2/02/C02-Gemisch (Verhältnis
80 %/10 %/4 %/6 %). Die Kulturen werden in einem offenen Wasserbadschüttler bei 28 °C, 150 rpm und einer Begasung von 1 l/h für 137 h inkubiert bis zu einer OD >1 ,0. Der Gaseintrag ins Medium erfolgt durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte des Reaktors an einem Begasungsrohr angebracht ist. Die Zellen werden anschließend abzentrifugiert, mit 10 ml Waschpuffer (0,769 g/L NaOH, mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C02 durchgast) gewaschen und erneut abzentrifugiert.
Für die Produktionsphase werden so viele gewaschene Zellen aus der Wachstumskultur in 200 mL Produktionspuffer (NaOH 0,769 g/l, wird mind. 1 h bei 28°C und 150 rpm mit einem Gas mit 6% C02 durchgast, wobei sich ein pH von etwa 7,4 einstellt) überführt, dass eine OD6oonm von 1 ,0 eingestellt wird. Die Hauptkultur erfolgt chemolithoautotroph in druckfesten 500 ml- Glasflaschen bei 28 °C und 150 rpm in einem offenen Wasserbadschüttler mit einer Begasung von 1 l/h mit einem N2/H2/02/C02-Gemisch (Verhältnis 80%/10%/4%/6%) für 1 16 h. Der Gaseintrag ins Medium erfolgt durch eine Begasungsfritte mit einer Porengröße von 10 μηη, die in der Mitte der Reaktoren an einem Begasungsrohr angebracht ist. Bei Probenahme werden jeweils 5 ml Probe entnommen zur Bestimmung von OD6oonm, pH und des Produktspektrums. Die Bestimmung der Produktkonzentration erfolgt mittels semi-quantitativer 1 H-NMR- Spektroskopie. Als interner Quantifizierungsstandard dient Natriumtrimethylsilylpropionat (T(M)SP).
Über die Kultivierungsdauer in der Produktionsphase bilden sich bei dem Stamm C. necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB bis zu 1 13 mg/l 2HIB, während sich bei dem Stamm C.
necator pBBR1 MCS2::meaBhcmA-hcmB-phaA bis zu 156 mg/l 2HIB bilden.
Nach Kultivierung folgender Stämme konnte die Bildung von 2-Hydroxyisobuttersäure nachgewiesen werden:
• C. necator PHB-4 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA • C. necator H76 pBBR1 MCS-2::HCM-phaA
• C. necator PHB-4 pBBR1 MCS-2::meaBhcmA-hcmB-phaA
• C. necator H16 pBBR1 MCS-2:: meaBhcmA-hcmB-phaA

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Herstellung von organischen Verbindungen umfassend die
Verfahrensschritte
A) Bereitstellen eines Knallgasbakteriums mit einer verglichen zu seinem Wildtyp
gesteigerten Aktivität eines Enzyms E-i, welches die Umsetzung
2 Acetyl-CoA zu Acetoacetyl-CoA und CoA
zu katalysieren vermag, in einem wässrigen Medium
B) in Kontakt Bringen des wässrigen Mediums mit einem Gas enthaltend
H2, C02 und 02
in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 70 zu 10 bis 45 zu 5 bis 35, insbesondere von 30 bis 55 zu 15 bis 40 zu 10 bis 30, und gegebenenfalls
C) Aufreinigen der organischen Verbindung.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Knallgasbakterium ausgewählt ist aus der Liste der Gattungen
Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Aquifex,
Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga,,
Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. 01, Kyrpidia, Metallosphaera, Methanobrevibacter, Myobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Treponema, Thiocapsa, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, wobei Cupriavidus besonders bevorzugt ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E-ι ausgewählt ist aus Acetyl-CoA:Acetyl-CoA C-Acetyltransferasen aus der Enzymklasse EC 2.3.1 .9. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E-, ausgewählt ist aus AAC26023.1 , ABR35750.1 und ABR25255.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Gas in Verfahrensschritt B) Synthesegas enthält.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Synthesegas in Verfahrensschritt B) mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% aller
Kohlenstoffquellen, die dem Knallgasbakterium in Verfahrensschritt B) zur Verfügung stehen, ausmacht.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -4,
dadurch gekennzeichnet,
dass das C02 in Verfahrensschritt B) mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% aller Kohlenstoffquellen, die dem Knallgasbakterium in Verfahrensschritt B) zur Verfügung stehen, ausmacht.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Butanol, Buten, Propen oder 2-Hydroxyisobuttersäure ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E2, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA und NADH oder NADPH zu 3-Hydroxybutyryl-CoA und NAD+ oder NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E2 ausgewählt ist aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1.1 .157.
Verfahren gemäß Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E2 ausgewählt ist aus NP_349314.1 , YP_001307469.1 und CAQ53138.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Butanol, Buten, Buttersäure oder Propen ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E3, welches die Umsetzung
von 3-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA und Wasser
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E3 ausgewählt ist aus 3-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.55.
Verfahren gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E3 ausgewählt ist aus NP_349318.1 , YP_001307465.1 und CAQ53134.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die organische Substanz Butanol, Buten, Buttersäure oder Propen ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E4, welches die Umsetzung
von Crotonyl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyryl-CoA und NAD+ oder NADP+ zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E4 ausgewählt ist aus Butyryl-CoA Dehydrogenasen aus der
Enzymklasse EC:1 .3.99.2.
Verfahren gemäß Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E4 ausgewählt ist aus N P_349317.1 , YP_001307466.1 und CAQ53135.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Butanol oder Buten ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E5, welches die Umsetzung
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS-
CoA oder
die Umsetzungen
von Butyryl-CoA und NADH oder NADPH zu Butyraldehyd, NAD+ oder NADP+ und HS- CoA und
von Butyraldehyd und NADH oder NADPH zu n-Butanol und NAD+ oder NADP+ zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym E5 ausgewählt ist aus bifunktionalen Aldehyd/Alkohol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.2.1 .10 oder EC:1 .1 .1.1 oder aus Butyraldehyd
Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1 .2.1.10.
Verfahren gemäß Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E5 ausgewählt ist aus NP_149199.1 , NP_563447.1 und
YP_002861217.1 , YP_001310903.1 und CAQ57983.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Butanol oder Buten ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E6, welches die Umsetzung
von Butyraldehyd und NAD(P)H zu n-Butanol und NAD(P)+
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E6 ausgewählt ist aus Butanol Dehydrogenasen aus der Enzymklasse EC:1.1 .1 .-.
Verfahren gemäß Anspruch 21 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E6 ausgewählt ist aus YP_001310904.1 , YP_001310904 und
CAQ53139.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 20-22, dadurch gekennzeichnet,
dass das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E7 ausgewählt aus Elektrontransfer-Flavoproteinen aus der Enzymklasse EC:2.8.3.9 aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E7 ein heterodimeres Enzym, aufgebaut aus zwei Untereinheiten, ist, bei dem die
alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_349315.1 , YP_001307468.1 und CAQ53137.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind,
und die
beta-Untereinheit ausgewählt ist aus N P_349316.1 , YP_001307467.1 und CAQ53136.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind. 25. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Buten ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von n-Butanol zu 1 -Buten und Wasser
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 25,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E8 ausgewählt ist aus Oleat Hydratasen aus der Enzymklasse
EC:4.2.1 .53, Kieviton Hydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.95 und Phaseollidi Hydratasen aus der Enzymklasse EC:4.2.1.97. Verfahren gemäß Anspruch 26,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E8 ausgewählt ist aus ACT54545, OLHYD_STRPZ, OLHYD_FLAME und AAA87627.1 , sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Propen oder Buttersäure ist, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E9, welches die Umsetzung
von Butyryl-CoA und P, zu Butyryl-Phosphat und HS-CoA
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 28,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E9 ausgewählt ist aus Phosphat Butyryltransferasen aus der
Enzymklasse EC:2.3.1.19.
Verfahren gemäß Anspruch 29,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E9 ausgewählt ist aus ABR32393.1 und ZP_05394269.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -16 oder 28-30,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Propen oder Buttersäure ist, und das Knallgasbaktenum eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E10, welches die Umsetzung
von Butyryl-Phosphat und ADP zu Butyrat und ATP
zu katalysieren vermag, aufweist.
32. Verfahren gemäß Anspruch 31 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E10 ausgewählt ist aus Butyratkinasen aus der Enzymklasse EC:2.7.2.7.
Verfahren gemäß Anspruch 32,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E10 ausgewählt ist aus ABR32394.1 und ZP_05392467.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -16 oder 28-33,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz Propen ist, und das Knallgasbaktenum eine verglichen seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Butyrat und H202 zu Propen und H20
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 34,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym En ausgewählt ist aus Cytochrom P450 der CYP152-Familie.
36. Verfahren gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym En ausgewählt ist aus HQ709266.1 , NP_388092,1 und NP_739069.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz ausgewählt ist aus Aceton, 2-Propanol und Propen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines
Enzyms E12, welches die Umsetzung
von Acetoacetyl-CoA zu Acetoacetat und CoA
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 37,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E12 ausgewählt ist aus Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen aus der Enzymklasse EC:3.1.2.1 1 , aus Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen aus der Enzymklasse EC:2.8.3.9 oder aus Acyl-CoA-Hydrolasen aus der Enzymklasse
EC:3.1 .2.20.
39. Verfahren gemäß Anspruch 38,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E12 ausgewählt ist aus
den heterodimeren Acetoacetyl-CoA:Acetat/Acyl:CoA Transferasen aufgebaut aus zwei
Untereinheiten, bei denen
die alpha-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149326.1 , YP_001310904.1 und
CAQ57984.1
und die
beta-Untereinheit ausgewählt ist aus NP_149327.1 , YP_001310905.1 und
CAQ57985.1
sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind,
den Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferasen ctfA und ctfB aus Clostridium acetobutylicum und atoD und atoA aus Escherichia coli sowie Proteine mit einer
Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind, und
den Acyl-CoA Hydrolasen teil aus B. subtilis bzw. ybgC aus Heamophilus influenzae sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der
Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -7 oder 37-39,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz ausgewählt ist aus Aceton, 2-Propanol und Propen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E13, welches die Umsetzung
von Acetoacetat zu Aceton und C02
zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 40,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E13 ausgewählt ist aus Acetoacetat Decarboxylasen aus der
Enzymklasse EC:4.1 .1.4 oder aus Aceton:C02 Ligasen aus der Enzymklasse EC 6.4.1 .6.
Verfahren gemäß Anspruch 41 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E13 ausgewählt ist aus NP_149328.1 , YP_001310906.1 und
CAQ57986.1 sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -7 oder 37-42,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz ausgewählt ist aus 2-Propanol und Propen, und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E14, welches die Umsetzung
von Aceton, NADPH und H+ zu Propan-2-ol + NADP+
zu katalysieren vermag, aufweist.
44. Verfahren gemäß Anspruch 43,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E14 ausgewählt ist aus Propan-2-ol:NADP+ Oxidoreduktase aus der Enzymklasse EC:1 .1.1.80.
45. Verfahren gemäß Anspruch 44,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E14 ausgewählt ist aus P14941 .1 , P35630.1 , P75214.1 und P25984.1 , sowie Proteine mit einer Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind.
46. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 -10,
dadurch gekennzeichnet,
dass die organische Substanz 2-Hydroxyisobuttersäure ist und das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Aktivität eines Enzyms E15, welches die Umsetzung
von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu katalysieren vermag, aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 46,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E15 ausgewählt ist aus Hydroxyl-lsobutyryl-CoA Mutasen, Isobutyryl-CoA Mutasen aus der Enzymklasse EC 5.4.99.13 und Methylmalonyl-CoA Mutasen aus der Enzymklasse EC 5.4.99.2. Verfahren gemäß Anspruch 47,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E15 ausgewählt ist aus solchen, die sich aus den Mikroorganismen Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM1 , Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen.
Verfahren gemäß Anspruch 46,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Enzym E15 ein heterodimeres Enzyme darstellt, welches Sequenzen umfasst, ausgewählt aus Seq.-ID-Nr. 78 und Seq.-ID-Nr. 80 sowie Proteine mit einer
Polypeptidsequenz, bei der bis zu 60 % der Aminosäurereste gegenüber den
vorgenannten Bezugssequenzen durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine
Kombination davon verändert sind.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 46-49,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Knallgasbakterium eine verglichen zu seinem Wildtyp gesteigerten Menge MeaB Proteins, insbesondere eines mit Seq.-ID-Nr. 82, aufweist.
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