EP3004364A1 - Verfahren zur herstellung von cathin - Google Patents

Verfahren zur herstellung von cathin

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EP3004364A1
EP3004364A1 EP14717091.4A EP14717091A EP3004364A1 EP 3004364 A1 EP3004364 A1 EP 3004364A1 EP 14717091 A EP14717091 A EP 14717091A EP 3004364 A1 EP3004364 A1 EP 3004364A1
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EP
European Patent Office
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transaminase
formula
alcohol dehydrogenase
carried out
reaction
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14717091.4A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dörte ROTHER
Martina Pohl
Thorsten SEHL
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Publication date
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Publication of EP3004364A1 publication Critical patent/EP3004364A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of cathine.
  • Cathin ((1 p.2S) - norpseudoephedrine) belongs to the class of ephedra alkaloids and can be obtained from the leaves of the cat shrub. It is used as a cardiovascular agent because of the sympathomimetic, stimulating the autonomic nervous system, and is often used as an appetite suppressant.
  • cathin having an enantiomeric purity and diastereomeric purity of 99% or more can be produced. It can be achieved a turnover of up to 61, 4%.
  • the preparation proceeds in a two-stage process, is simple, inexpensive and requires no elaborate workup. Commercially available starting materials can be used and the two reaction steps can be carried out in a reaction vessel without isolation of the intermediate product.
  • the synthesis steps can be carried out either with preferably purified and lyophilized enzymes or with recombinant E. coli
  • Cells are carried out containing the enzymes used in the invention.
  • the process can be scaled up well and is therefore suitable for large-scale processes.
  • An S-selective enzyme in the sense of the invention means an enzyme which converts a substrate into an S-configured product.
  • Methylbenzylamine is an example of an amine donor.
  • amine donors may be used.
  • the transaminase may be from a chromobacterium, for example Chromobacterium violacaeum, preferably CV2025. Furthermore, transaminases from Alealigens denitrificans, Arthrobacter citreus, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorescens, Vibrio flurialis or Caulobacter crescentus.
  • purified and lyophilized enzymes are used. This has the advantage that products with significantly higher optical purities, ie higher enantiomeric and diastereomeric excesses, are produced with purified enzymes.
  • the enzymes are stable and can convert high substrate concentrations.
  • the reaction may be carried out in an aqueous medium in a pH range of 6 to 11, preferably pH 7.5 to 8.5.
  • buffers such as HEPES, potassium phosphate, MOPS, TEA or TRIS-HCl can be used.
  • the preferred temperature range is room temperature, the reaction can be performed well in a temperature range of 20 ° C to 30 ° C.
  • the reaction is preferably carried out at atmospheric pressure.
  • the pyridoxal-5 'phosphate concentration is between 100-200 ⁇ .
  • the process can be performed in vitro.
  • the enzymatic reaction can be done in vivo.
  • E. coli bacteria can be used as production organisms.
  • Genes coding for a transaminase can be ligated into a vector.
  • the E. coli strains are recombinant and contain plasmids carrying genes for a (S) -selective transaminase.
  • the plasmids may contain the genes for the o.
  • G. Transaminases includes.
  • plasmids it is possible to use, for example, pET29a or pKK233 basic bodies which contain the corresponding transaminase genes.
  • the production organisms secrete the desired product according to formula (2) into the aqueous solution.
  • the transaminase is deactivated after the first reaction step.
  • an acid preferably a non-oxidizing acid, for example HCl or H 2 S0 4 , can be added.
  • the inactivation can also be carried out by ultrafiltration of the enzyme.
  • a membrane with a molecular exclusion of, for example, 10 kDa (kilo daltons) can be used.
  • this reaction a reductive hydrogenation
  • alcohol dehydrogenases which convert the substrate and which are (S) -selective.
  • the alcohol dehydrogenase may be from Lactobacillus, preferably from Lactobacillus brevis (LbADH).
  • Lactobacillus brevis LbADH
  • alcohol dehydrogenases from Lactobacillus kefir, Candida magnoliae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor or Trichosporon cutaneum can be used.
  • purified and lyophilized enzymes are used. This has the advantage that products with significantly higher optical purities, ie higher enantiomeric and diastereomeric excesses, are produced with purified enzymes.
  • the enzymes are stable and can convert high substrate concentrations.
  • the reaction can be carried out in an aqueous medium in a pH range from 6.5 to 8.5, preferably pH 7.5 to 8.5.
  • Suitable buffers such as HEPES (2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid), potassium phosphate, TEA (triethanolamine), TRIS-HCl (tris (hydroxymethyl) aminomethane) or MOPS (3- (N-morpholino) -propansulphonic acid).
  • HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid
  • potassium phosphate potassium phosphate
  • TEA triethanolamine
  • TRIS-HCl tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • MOPS 3- (N-morpholino) -propansulphonic acid
  • the reaction is preferably carried out at atmospheric pressure.
  • NADPH + H + or NADP + can be used with magnesium ions (Mg 2+ ), eg as magnesium sulphate, if the enzyme LbADH is used.
  • NADH + H + , NAD + and other ions such as Ca 2+ , Mn 2+ , K + , Na + , Co 2+ , Li + , Zn 2+ or Rb + may be used.
  • the addition of metal ions is optional and has a positive effect on cofactor regeneration.
  • a formate dehydrogenase (FDH) with formate as cosubstrate can be used for cofactor regeneration, with TbADH from Thermoanaerobium brockii with ethanol or isopropanol as cosubstrate or with GDH (glucose dehydrogenase) with glucose as cosubstrate ,
  • the process can be performed in vitro.
  • the enzymatic reaction can be done in vivo.
  • E. coli bacteria can be used as production organisms.
  • genes which code for an alcohol dehydrogenase can be ligated into a vector.
  • the E. coli strains are recombinant and contain plasmids carrying genes for alcohol dehydrogenase. If vectors, for example plasmids are used, then these genes must be for a
  • the Alokholdehydrogenasen can be for example from Lactobacillus, preferably from Lactobacillus brevis (LbADH).
  • the vectors or plasmids may include alcohol dehydrogenases from Lactobacillus kefir, Candida magnolia, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor or Trichosporon cutaneum.
  • plasmids for example, pET21a or pKK233 basic bodies can be used which carry the corresponding alcohol dehydrogenase genes.
  • the production organisms secrete the desired product according to formula (2) into the aqueous solution.
  • the production method according to the invention can be operated both in vitro and in vivo.
  • the partial steps may either be either in vivo or in vitro, or the partial steps may be mixed in vivo or in vitro.
  • the process can be carried out in a one-pot reaction, so that it is easy to carry out and requires only a few work-up steps for the product according to formula 3.
  • Fig.1 A formula scheme for a method according to the invention.
  • Fig. 2 The time course of the Eduktabddling (1, 2 - PPDO) and a byproduct increase (acetophenone) for reaction step 1.
  • Figure 3 The time course of the decrease of APPO (intermediate) and the
  • the 2-step synthesis is carried out with the combination of the S-selective transaminase CV2025 from Chromobacterium violaceum in the first step and the S-selective LbADH from Lactobacillus brevis in the second step.
  • the conversion over both steps with a reaction time of 24 hours is 57.3%.
  • the resulting cathine has a very high optical purity: ee and de> 99%.
  • In Ganzzellsatz a turnover of> 95% in the first step ( Figure 2) and ⁇ 65% in the second step ( Figure 3) was achieved. Over both steps, sales were 61, 4%.
  • the resulting cathin has an ee of 97.4% and a de of 89.8%.
  • Step 1 10 mM 1-phenylpropane-1,2-dione, 15 mM (S) -alpha-methylbenzylamine, 10 mg / ml CV2025 (or 1 mg / ml purified enzyme), 100 mM HEPES with 0.1 mM pyridoxal 5'-phosphate, pH 7.5; Reaction time 24 h; Room temperature.
  • reaction solution after pH-shift 100 mM sodium formate, 10 mg cells / ml LbADH (or 1 mg / ml purified enzyme), 10 ⁇ / ml FDH, 0.2 mM NADP + , reaction time 24 h.

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Abstract

Verfahren zu Herstellung von Cathin in welchem l-Phenylpropan-1-2-dion nach Formel (1) in einem ersten Schritt mit einer S-selektiven Transaminase zu (S)-2-Amino-l-Phenylpropan-l-on nach Formel (2) umgesetzt und das (S)-2-Amino-l-Phenylpropan-l-on weiter nach Formel (2) in einem zweiten Schritt mit einer (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase zu (1 S,2S)-Norpseudoephedrin (Cathin) nach Formel (3) reduziert wird.

Description

Verfahren zur Herstellung von Cathin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cathin.
Cathin ((1 S.2S) - Norpseudoephedrin)) gehört zur Substanzklasse der Ephedrea-Alkaloide und kann aus den Blättern des Kathstrauches gewonnen werden. Es findet auf Grund der symphatomimetrischen, das vegetative Nervensystem anregenden, Funktion Anwendung als Herzkreislaufmittel und kommt häufig als Appetitzügler zum Einsatz.
Für die synthetische Herstellung sind nach dem Stand der Technik verschiedene Verfahren bekannt.
So ist aus der Veröffentlichung„Stereoselective Synthesis of Norphenedrine and Norpseu- doephedrine by Using Asymmetrie Transfer Hydrogenation Accompanied by Dynamic Kinetic Resolution" von Hyeon-Kyu Lee et al. im J. Org. Chem. 2012, S 5454-5460 eine 7-Schritt- synthese bekannt.
Die Veröffentlichung "Efficient Synthesis of Ephedra Alkaloid Analogous Using an Enantio- merically Pure N-[(R)-(+)-a-Methylbenzyl]aziridine-2-carboxaldehyde" von Gwon-Il Hwang et al. aus dem J. Org. Chem. 1996, 61 , 6183-6188 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Cathin mit hohen Enantiomerenüberschüssen, das von enantiomerenreinem Substrat ausgeht und daher sehr teuer ist.
Andere Verfahren wie beispielsweise in der Veröffentlichung„Asymetric N1 Unit Transfer to Olefins with a Chiral Nitridomanganese Complex: Novel Stereoselective Pathways to Aziridi- nes or Oxazolines" von Masaaki Nishimura et al. J. Org. Chem. 2002, 67, 2101-2110 be- schreiben, Verfahren, bei denen Cathin als Nebenprodukt gebildet wird.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung ein einfaches Herstellungsverfahren von Cathin zur Verfügung zu stellen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet und das mit wenigen Reaktionsschritten auskommt, preisgünstig ist, zu einer hohen Enantiomeren- und Diastereomerenreinheit, und einer hohen Ausbeute führt und möglichst wenige Aufarbei- tungsschritte erfordert. Die Maßstabsvergrößerung soll einfach zu realisieren sein.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Cathin mit einer Enantiomerenreinheit und Diastereomerenreinheit von 99 % oder mehr hergestellt werden. Es kann ein Umsatz von bis zu 61 ,4 % erzielt werden. Die Herstellung verläuft in einem zweistufigen Verfahren, ist einfach, preisgünstig und erfordert keine aufwändige Aufarbeitung. Es können kommerziell erhältliche Edukte eingesetzt werden und die beiden Reaktionsschritte können in einem Reaktionsgefäß ohne Isolierung des Zwischenproduktes durchgeführt werden. Die Syntheseschritte können entweder mit vorzugsweise gereinigten und lyophilisierten Enzymen oder mit rekombinanten E. coli -
Zellen durchgeführt werden, die die erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme enthalten. Das Verfahren kann gut hochskaliert werden und ist daher für großtechnische Prozesse geeignet.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Unter einem S-selektiven Enzym im Sinne der Erfindung ist ein Enzym zu verstehen, wel- ches ein Substrat zu einem S-konfigurierten Produkt umsetzt.
In einem ersten Reaktionsschritt wird 1 -Phenylpropan-1 ,2-dion (PPDO) nach Formel (1 ),
wie in Figur 1 dargestellt, in vitro mit einem Amindonor, wie Methylbenzylamin mit einer S-selektiven Transaminase zu (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on (APPO) nach Formel (2)
umgesetzt.
Methylbenzylamin ist dabei ein Beispiel für einen Amindonor.
Es können jedoch auch andere Amindonoren eingesetzt werden. Beispielhaft können Benzylamin, Isopropylamin, L-Alanin, (±)-1-Methyl-3-phenylpropylamin und (±)-1 -Aminoindan genannt werden.
Für den ersten Reaktionsschritt der chemischen reduktiven Aminierung können Transaminasen eingesetzt werden, die das Substrat mit hoher Stereoselektivität zum (S)-Produkt umsetzen.
Die Transaminase kann aus einem Chromobakterium, beispielsweise Chromobakterium violacaeum, vorzugsweise CV2025 sein. Weiterhin können Transaminasen aus Alealigens denitrificans, Arthrobacter citreus, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluoreszens, Vibrio flurialis oder Caulobacter crescentus eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden gereinigte und lyophilisierte Enzyme eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass mit gereinigten Enzymen Produkte mit deutlich höheren optischen Reinheiten, also höherem Enantiomeren- und Diastereomerenüberschüssen entstehen. Die Enzyme sind stabil und können hohe Substratkonzentrationen umsetzen.
Die Reaktion kann in einem wässrigen Medium in einem pH-Bereich von 6 bis 1 1 , vorzugsweise pH 7,5 bis 8,5 durchgeführt werden.
Dazu können geeignete Puffer, wie HEPES, Kaliumphosphat, MOPS, TEA oder TRIS-HCI eingesetzt werden.
Der bevorzugte Temperaturbereich liegt bei Raumtemperatur, die Reaktion kann in einem Temperaturbereich von 20°C bis 30°C gut durchgeführt werden.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei Atmosphärendruck durchgeführt.
Als Kofaktor kann Pyridoxal-5'-phsophat eingesetzt werden. Vorzugsweise liegt die Pyridoxal-5'-phosphat-Konzentration zwischen 100-200 μΜ.
Der Prozess kann in vitro durchgeführt werden.
Alternativ kann die enzymatische Umsetzung in vivo erfolgen.
Dazu können E.coli Bakterien als Produktionsorganismen eingesetzt werden.
Dabei können Gene, die für eine Transaminase kodieren in einen Vektor ligiert werden. Vorzugsweise sind die E.coli Stämme rekombinant und enthalten Plasmide, die Gene für eine (S)-selektive Transaminase tragen.
Vorzugsweise können die Plasmide die Gene für die o. g. Transaminasen beinhaltet.
Als Plasmide können beispielsweise pET29a oder pKK233- Grundkörper eingesetzt werden, die die entsprechenden Transaminasegene beinhalten. Die Produktionsorganismen sekretieren das gewünschte Produkt nach Formel (2) in die wässrige Lösung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transaminase nach dem ersten Reaktionsschritt desaktiviert.
Das kann durch eine Veränderung des pH-Wertes in den sauren Bereich, beispielsweise pH 2, erfolgen. Dazu kann eine Säure, vorzugsweise eine nichtoxidierende Säure, beispielswei- se HCl oder H2S04, zugegeben werden.
Alternativ kann die Inaktivierung auch durch Ultrafiltration des Enzyms erfolgen. Dazu kann eine Membran mit einem molekularen Ausschluss von beispielsweise 10 kDa (kilo Dalton) verwendet werden.
Im einem zweiten Reaktionsschritt wird (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on (APPO) nach Formel (2) mittels einer (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase in vitro zu (1 S.2S)- Norpseudoephedrin (NPE) (Cathin) nach Formel (3)
umgesetzt.
Generell kann diese Reaktion, eine reduktive Hydrogenierung, mit Alkoholdehydrogenasen, die das Substrat umsetzen und die (S)-selektiv sind durchgeführt werden.
Die Alkoholdehydrogenase kann aus Lactobacillus, vorzugsweise aus Lactobacillus brevis (LbADH) sein. Alternativ können Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir, Candida magnoliae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor oder Trichosporon cutaneum eingesetzt werden. Vorzugsweise werden gereinigte und lyophilisierte Enzyme eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass mit gereinigten Enzymen Produkte mit deutlich höheren optischen Reinheiten, also höherem Enantiomeren- und Diastereomerenüberschüssen entstehen. Die Enzyme sind stabil und können hohe Substratkonzentrationen umsetzen.
Die Reaktion kann in einem wässrigen Medium in einem pH-Bereich von 6,5 bis 8,5, vor- zugsweise pH 7,5 bis 8,5, durchgeführt werden.
Dazu können geeignete Puffer, wie HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)- ethansulfonsäure), Kaliumphosphat, TEA (Triethanolamin), TRIS-HCI (Tris(hydroxymethyl)- aminomethan) oder MOPS (3-(N-Morpholino)-Propansulsonsäure) eingesetzt werden. Der bevorzugte Temperaturbereich liegt bei Raumtemperatur, die Reaktion kann in einem Temperaturbereich von 20°C bis 30°C gut durchgeführt werden.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei Atmosphärendruck durchgeführt.
Als Kofaktor kann NADPH + H+ oder NADP+ mit Magnesiumionen (Mg2+), z.B. als Magnesi- umsulphat, eingesetzt werden, wenn als Enzym LbADH eingesetzt wird.
Bei anderen ADH's können NADH + H+, NAD+ und andere Ionen, wie Ca2+, Mn2+, K+, Na+, Co2+, Li+, Zn2+ oder Rb+ eingesetzt werden. Der Zusatz der Metallionen ist fakultativ und wirkt sich positiv auf die Kofaktorregenerierung aus.
Bei der Verwendung von NADPH + H+ als Kofaktor kann zur Kofaktorregenerierung eine Formiatdehydrogenase (FDH) mit Formiat als Kosubstrat, bei TbADH aus Thermoanaerobi- um brockii mit Ethanol oder Isopropanol als Kosubstrat oder bei GDH (Glucose- Dehydrogenase) mit Glucose als Kosubstrat eingesetzt werden.
Der Prozess kann in vitro durchgeführt werden.
Alternativ kann die enzymatische Umsetzung in vivo erfolgen. Dazu können E. coli Bakterien als Produktionsorganismen eingesetzt werden.
Dazu können die Gene, die für eine Alkoholdehydrogenase kodieren, in einen Vektor ligiert werden.
Vorzugsweise sind die E. coli Stämme rekombinant und enthalten Plasmide, die Gene für eine Alkoholdehydrogenase tragen. Werden Vektoren, beispielsweise Plasmide eingesetzt, so müssen diese Gene für eine
Alkoholdehydrogenase enthalten. Die Alokholdehydrogenasen können beispielsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise aus Lactobacillus brevis (LbADH) sein. Alternativ können die Vektoren bzw. Plasmide Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir, Candida magno- liae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor oder Trichosporon cutaneum beinhal- ten.
Als Plasmide können beispielsweise pET21 a oder pKK233 Grundkörper eingesetzt werden, die die entsprechenden Alkoholdehydrogenasegene tragen.
Die Produktionsorganismen sekretieren das gewünschte Produkt nach Formel (2) in die wässrige Lösung. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann sowohl in vitro als auch in vivo betrieben werden. Dabei können die Teilschritte entweder beide in vivo oder in vitro sein oder die Teilschritte können gemischt in vivo oder in vitro sein.
Vorteilhafterweise kann das Verfahren in einer Eintopfreaktion durchgeführt werden, so dass es einfach durchzuführen ist und nur wenige Aufarbeitungsschritte für das Produkt nach Formel 3 benötigt.
Im Folgenden werden Beispiele für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgeführt.
In den Figuren sind ein Reaktionsschema und kinetische Untersuchungsergebnisse darge- stellt.
Es zeigt:
Fig.1 : Ein Formelschema für ein erfindungsgemäßes Verfahren.
Fig.2: Den zeitlichen Verlauf der Eduktabnahme (1 ,2 - PPDO) und eine Nebenproduktzunahme (Acetophenon) für Reaktionsschritt 1. Fig.3: Den zeitlichen Verlauf der Abnahme von APPO (Zwischenprodukt) und der
Zunahme von Cathin (Entprodukt).
Beispiel:
Die 2-Schritt Synthese wird mit der Kombination der S-selektiven Transaminase CV2025 aus Chromobacterium violaceum im ersten Schritt und der S-selektiven LbADH aus Lactobacillus brevis im zweiten Schritt durchgeführt. Mit den gereinigten, lyophilisierten Enzymen beträgt der Umsatz über beide Schritte bei einer Reaktionszeit von jeweils 24 Stunden 57,3 %. Das entstandene Cathin hat eine sehr hohe optische Reinheit: ee und de > 99 %. Im Ganzzellansatz wurde ein Umsatz von > 95% im ersten Schritt (Figur 2) und ~ 65 % im zweiten Schritt (Figur 3) erzielt. Über beide Schritte betrug der Umsatz 61 ,4 %. Das entstandene Cathin hat einen ee von 97,4 % und einen de von 89,8 %.
Reaktionsbedingungen:
Schritt 1 : 10 mM 1-Phenylpropan-1 ,2-dion, 15 mM (S)-alpha-Methylbenzylamin, 10 mg- Zellen/ml CV2025 (bzw. 1 mg/ml gereinigtes Enzym), 100 mM HEPES mit 0, 1 mM Pyridoxal- 5'-phosphat, pH 7,5; Reaktionszeit 24 h; Raumtemperatur. Inaktivierung der Transaminase nach dem reduktiven Aminierungsschritt:
A) pH-Shift zur Inantivierung bei Verwendung von lyophilisierten Zellen: mit HCl (20 % v/v) auf pH 2 titriert, dann wieder auf pH 7,5 mit 5 M NaOH. Anschließend wurden die Zelltrümmer und denaturierte, unlösliche Proteine durch Zentrifugation sedimentiert.
B) Ultrafiltration zur Inaktivierung bei Verwendung von gereinigten Enzymen: Centricon mit Membran cutoff: 10 kDa-Zentrifugation: 4000rpm.
Schritt 2:
Zur Reaktionslösung wurden nach dem pH-Shift hinzugefügt: 100 mM Natriumformiat, 10 mg-Zellen/ml LbADH (bzw. 1 mg/ml gereinigtes Enzym), 10 μΙ/ml FDH, 0,2 mM NADP+, Reaktionszeit 24 h.

Claims

P ate n ta n s p rü c h e
1. Verfahren zur Herstellung von (1S.2S) - Norspeudoephedrin
dadurch gekennzeichnet,
dass 1-Phenylpropan-1,2-dion nach Formel (1)
in einem ersten Schritt mit einer (S)-selektiven Transaminase und einem Amindonor 2-Amino-1-Phenylpropan-1-on nach Formel (2)
umgesetzt wird und das (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on nach Formel (2) in einem zweiten Schritt mit einer (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase zu (1 S,2S)- Norpseudoephedrin
nach Formel (3)
umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Transaminase aus Chromobakterium violacaeum eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Transaminase CV2025 eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass im zweiten Schritt eine Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass bei Schritt 1 als Amindonor eine Komponente aus der Gruppe Methylbenzylamin, Benzylamin, Isopropylamin, L-Alanin, (±)-1-Methyl-3phenylpropylamin oder (±)-1 - Aminoindan eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass Schritt 1 bei einem pH Wert zwischen 6 bis 11 durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass Schritt 2 bei einem pH Wert zwischen 6,5 bis 8,5 durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass als Puffer HEPES, Kaliumphosphat, MOPS, TEA oder TRIS-HCI eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass bei Schritt 1 Pyridoxal-5 '-phosphat als Kofaktor eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass Pyridoxal-5 '-phosphat in einer Konzentration zwischen 100-200 μΜ eingesetzt wird.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis10,
dadurch gekennzeichnet,
dass bei Schritt 2 NADPH + H+ oder NADH + H* als Kofaktor eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass zu Kofaktorregenerierung Formiatdehydrogenase mit Formiat als Kosubstrat, TbADH mit Ethanol oder Isopropanol als Kosubstrat oder Glucose-Dehydrogenase mit Glucose als Kostubstrat eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass die der Transaminase nach dem ersten Schritt und vor dem zweiten Schritt inaktiviert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Inaktivierung durch Zugabe einer Säure oder durch Abtrennung der Transaminase durch Ultrafiltration erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass der erste und/oder der zweite Schritt in vivo durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Umsetzung durch die Transaminase und/oder Alkoholdehydrogenase in £ coli erfolgt. 7. Verfahren nach einem er Ansprüche 14 oder 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Gene kodierend für die Transaminase und/oder Alkoholdehydrogenase in einen Vektor ligiert sind.
EP14717091.4A 2013-05-31 2014-03-19 Verfahren zur herstellung von cathin Withdrawn EP3004364A1 (de)

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