EP2986721A1 - Polypeptides codant pour des mannanases mutees ayant une efficacite catalytique amelioree - Google Patents

Polypeptides codant pour des mannanases mutees ayant une efficacite catalytique amelioree

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EP2986721A1
EP2986721A1 EP14709545.9A EP14709545A EP2986721A1 EP 2986721 A1 EP2986721 A1 EP 2986721A1 EP 14709545 A EP14709545 A EP 14709545A EP 2986721 A1 EP2986721 A1 EP 2986721A1
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EP
European Patent Office
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polypeptide
polynucleotide
vector
host cell
mannanase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14709545.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Guy BERRIN
Marie COUTURIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Agro Industrie Recherches et Developpements ARD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN, Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Agro Industrie Recherches et Developpements ARD filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP2986721A1 publication Critical patent/EP2986721A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01025—Beta-mannosidase (3.2.1.25), i.e. mannanase
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    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C12N9/2494—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01078—Mannan endo-1,4-beta-mannosidase (3.2.1.78), i.e. endo-beta-mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)

Definitions

  • the invention provides polypeptides encoding mannanase mutants having improved enzyme efficiency.
  • the invention also provides polynucleotides encoding such polypeptides, vectors and host cells comprising such polynucleotides, as well as compositions comprising such polypeptide (s), polynucleotide (s), vector (s) or host cell (s) (s).
  • the invention finally covers the various uses of such polypeptides, polynucleotides, vectors, host cells or compositions.
  • Saccharification ie the enzymatic hydrolysis of the components of lignocellulosic biomass, is today one of the main bottlenecks in the biological refinery process: the resistance of plant cell walls leads to the need for a large amount of enzymes to hydrolyze lignocellulosic biomass into fermentable sugars. The conversion of lignocellulosic biomass thus represents today a high cost reaction.
  • the Ascomycete fungus Trichoderma reesei is today one of the most used industrial fungi worldwide. It is indeed capable of producing an enzyme cocktail rich in cellulases, used for the degradation of lignocellulosic biomass. However, the considerable costs incurred by the use of such enzymatic cocktails for the degradation of lignocellulosic biomass constitute a barrier to the use of this renewable resource.
  • Lignocellulose is the most abundant component of biomass, comprising about fifty percent of plant material produced by photosynthesis and representing the most important renewable biological resource in the soil. It mainly contains three types of polymers: cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose accounts for about 45% of the dry mass of lignocellulose. It is a linear polymer composed of D-glucoses linked by long chain-linked 1,4-glycosidic bonds linked together by non-covalent bonds.
  • the hemicellulose is formed of heteropolymers representing 15 to 35% of the biomass, and containing pentoses, such as ⁇ -D-xylose or Fa-L-arabinose, hexoses, such as ⁇ -D-mannose, ⁇ -D-glucose or ⁇ -D-galactose, or uronic acids.
  • pentoses such as ⁇ -D-xylose or Fa-L-arabinose
  • hexoses such as ⁇ -D-mannose, ⁇ -D-glucose or ⁇ -D-galactose, or uronic acids.
  • Lignin is composed of phenylpropane units linked together by different types of bonds. It binds to cellulose and hemicellulose and forms a physical barrier protecting plants, more specifically plant cells.
  • Hemicellulose refers to a diverse set of non-crystalline carbohydrate polymers, of which mannan are a major component, especially in softwood.
  • Mannans are a family of complex sugars comprising a structure of residues of D-mannose, called mannan, or a combination of residues of ⁇ 1,4- ⁇ - ⁇ 3 ⁇ 8 ⁇ and pi, 4-D-glucose, called glucomannan.
  • Each of the two structures can be complemented with side chains of galactose, and then form a polymer of dinosaurs called galactomannan and galactoglucomannan, respectively.
  • Mannan in the broad sense of the term, are hydrolysed by a coordinated action of different types of glycoside hydrolases including mannanases. Mannanases are therefore necessary enzymes for the conversion of lignocellulosic biomass.
  • Two mannanases from the coprophilous fungus Podospora anserina have recently been studied and identified as factors that enhance the efficacy of the Trichoderma reesei enzyme cocktail for the degradation of lignocellulosic biomass (Couturier et al, Applied and Environmental Microbiology, January 2011, 77 (1)). 23: 237-246).
  • the inventors have sought to further increase the effectiveness of an enzymatic cocktail of Trichoderma reesei supplemented. They thus sought to develop Man5A and Man26A mannanase variants having improved enzymatic activities compared to native enzymes.
  • the invention thus relates to a mutated mannanase polypeptide having a sequence derived from a native mannanase of the coprophilous ascomycete filamentous fungal fungus Podospora anserina, and characterized by a catalytic efficiency increased by at least 25% relative to the efficacy. catalytic system of this native mannanase.
  • said polypeptide is derived from the mannanase Man5A or Man26A from Podospora anserina and is defined by one of the sequences SEQ ID NO: 3 to 14, and differs from at least one amino acid of the sequence SEQ ID NO: 1 or 11.
  • the invention also relates to a polynucleotide encoding such a peptide, a vector comprising such a polynucleotide and a host cell comprising such a polynucleotide or such a vector.
  • the invention further relates to a composition comprising a polypeptide, a polynucleotide, a vector or a host cell of the invention.
  • the invention finally relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell or a composition of the invention for the degradation of compounds comprising mannan, more particularly, for the degradation of lignocellulosic biomass.
  • mutant mannanases from the coprophilous ascomycete filamentous fungal fungus Podospora anserina, said mutants showing an improved catalytic efficiency of at least 25% relative to to native enzymes.
  • the subject of the present invention is therefore a polypeptide consisting of a mutated mannanase, having a sequence derived from a native mannanase of the coprophilous ascomycete filamentous fungal fungus Podospora anserina, and being characterized by a catalytic efficiency increased by at least 25% with respect to catalytic efficiency of this native mannanase.
  • mannanase refers to a family of enzymes capable of hydrolyzing polyose chains composed of mannoses (called mannans, mannopolymers or polymannoses).
  • mutant mannanase is meant a mannanase defined by a sequence derived from a native mannanase and whose sequence comprises at least one mutation relative to the sequence of this native mannanase.
  • mutation refers to the substitution, replacement, insertion or deletion of one or more amino acids in a reference protein sequence.
  • a mutated mannanase of the invention is characterized by a catalytic efficiency increased by at least 25% over the catalytic efficiency of the native mannanase.
  • the catalytic efficiency of an enzymatic reaction which is associated with a given enzyme, is well known to those skilled in the art and is commonly defined by measuring the ratio k CAT / KM, where k cat is the catalytic constant, corresponding to the number of moles of product formed per second per mole of enzyme, and where K is the Michaelis constant, characteristic of the enzyme tested.
  • the catalytic efficiency of the polypeptides of the invention is measured on the hydrolysis reaction of galactomannan and compared with that of native mannanase.
  • Hydrolysis reactions of mannooligosaccharides such as mannopentaose and mannohexaose can also be used. Such reactions and measurements are described in Berrin et al., 2007 (Appl Microbiol Biotechnol., 74 (5): 1001).
  • the polypeptide is derived from the mannanase Man5 A of Podospora anserina.
  • Man5A mannanase Man5A from Podospora anserina, defined by the protein sequence SEQ ID NO: 1. This mannanase is encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 2.
  • polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 1
  • the residue in position 256 is a valine, a leucine or an alanine
  • sequence SEQ ID NO: 3 differs from at least one amino acid of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 4. *
  • the polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 5 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYWIGFL T NRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN YWDDFGGMKA YV AFGGTX 139 E SWYTNARAQE QYKRYIQAVV SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR SLDKDFILITL GDEGFGLPGQ TTX 223 PYQYGEG TDFVKNLQI NLDFGTFHMY PGHWGVPTSF GPGWIKDHAA ACRAAGKPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWQWGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA T
  • sequence SEQ ID NO: 5 differs from at least one amino acid of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the catalytic efficiency of the polypeptide defined by the sequence SEQ ID NO: 6 (mutant K139R / Y223H) is increased by a factor of 1.7 (70% increase) relative to that of the native Man5A mannanase (SEQ ID NO: 1) on the hydrolysis reaction of galactomannan.
  • the polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 7 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VEDGKTGYFA GTNSYWIGFL TNN DVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GD LIIALVN YWDDFGGMKA YVNAFGGTKE SWYTNARAQE QYKRYIQAW SRYVNSPAEF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTYPYQYGEG TDFVKNLQIK NLDFGTFHMY PGHWGX STPs 256 GPGWIKDHAA ACRAAX 276 KPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWX 316 WGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCL
  • the residue in position 256 is a valine, a leucine or an alanine
  • sequence SEQ ID NO: 7 differs from at least one amino acid of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the catalytic efficiency of the polypeptide defined by the sequence SEQ ID NO: 8 (mutant V256L / G276V / Q316H) is increased by a factor of 1.3 (30% increase) relative to that of native mannanase Man5A (SEQ ID NO: 1) on the hydrolysis reaction of galactomannan.
  • the polypeptide of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 9.
  • sequence SEQ ID NO: 9 differs from at least one amino acid in the sequence
  • polypeptide of the invention is defined by the sequence
  • the catalytic efficiency of the polypeptide defined by the sequence SEQ ID NO: 10 (mutant W36R / I195T V256A) is increased by a 1.78 (78% increase) compared to that of native Man5A mannanase (SEQ ID NO: 1) on the hydrolysis reaction of galactomannan.
  • the mutated mannanase of the invention is derived from the mannanase Man26A of Podospora anserina.
  • Man26A is meant the mannanase Man26A of Podospora anserina, defined by the protein sequence SEQ ID NO: 11 and the nucleic sequence SEQ ID NO: 12.
  • the mutated mannanase of the invention derived from Man26A is defined by the sequence SEQ ID NO: 13.
  • sequence SEQ ID NO: 13 differs, from at least one amino acid, from the sequence SEQ ID NO: 11.
  • the mutated mannanase of the invention is defined by the sequence SEQ ID NO: 14.
  • the inventors have shown that the catalytic efficiency of a polypeptide defined by the sequence SEQ ID NO: 14 (P140L / D416G mutant) is increased by a factor of 1.3 (30% increase) relative to that of the native Man5A mannanase. (SEQ ID NO: 11) on the hydrolysis reaction of galactomannan.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention.
  • said polynucleotide is a DNA or RNA molecule.
  • said polynucleotide encodes a mutated mannanase of the invention defined by a sequence selected from SEQ ID NO: 3-10 and 13-14 sequences.
  • said polynucleotide is defined by a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 15-19.
  • a polynucleotide of the invention is preferably an isolated and / or purified sequence.
  • the subject of the invention is also a vector comprising a polynucleotide of the invention.
  • vector refers to a nucleic acid molecule in which it is possible to insert foreign nucleic acid fragments, and then introduce them. maintain or even express them in a host cell.
  • a polynucleotide of the invention may be introduced into any vector suitable for its expression, such as a plasmid, a cosmid, an episome, an artificial chromosome, a phage or a viral vector.
  • vectors that can be used in the context of the present invention are vast. They may be cloning and / or expression vectors. In general, they are known to those skilled in the art and many of them are available commercially but it is also possible to build or modify them by the techniques of genetic manipulation. Plasmids such as JMP61, pPICZaA, pPICZaB, pPICZaC, etc. can be mentioned as examples.
  • a vector implemented in the context of the present invention contains an origin of replication ensuring the initiation of replication in a producer cell and / or a host cell. It also includes the elements necessary for the expression of a polynucleotide of the invention, such as a promoter and a terminator. Examples of promoters that can be used according to the invention include, but are not limited to, the POX2, AOX (oxidated alcohol) promoters.
  • It may further comprise one or more selection gene (s) making it possible to select or identify the cells transfected by said vector (complementation of an auxotrophic mutation, gene encoding resistance to an antibiotic, etc.). It may also comprise additional elements improving its maintenance and / or its stability in a given cell (cer sequence which promotes the monomeric maintenance of a plasmid, integration sequences in the cellular genome).
  • the vector of the invention may optionally be combined with one or more substances that improve the transfection efficiency and / or the stability of the vector.
  • substances are widely documented in the literature accessible to those skilled in the art.
  • they may be polymers, especially cationic lipids, liposomes, nuclear proteins or neutral lipids. These substances can be used alone or in combination.
  • a plasmid recombinant vector associated with cationic lipids DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol, etc.
  • DOPE neutral lipids
  • the present invention also relates to a host cell comprising a vector or polynucleotide of the invention.
  • such a cell is constituted by any cell transferable by a polynucleotide or a vector of the invention as described above.
  • Bacterial expression systems can be used in the context of the present invention.
  • bacterial host cells include in particular bacteria of the Escherichia genera (for example Escherichia coli), Pseudomonas (e.g., Pseudomonas fluorescens or Pseudomonas stutzerei), Proteus (e.g. Proteus mirabilis), Ralstonia (e.g. Ralstonia eutrophd), Streptomyces, Staphylococcus (e.g. Streptomyces carnosus), Lactococcus (e.g. Lactoccocus lactis), or Bacillus (e.g. Bacillus subtilis, Bacillus megaterium or Bacillus licheniformis), etc.
  • Escherichia genera for example Escherichia coli
  • Pseudomonas e.g., Pseudomonas fluorescens or Pseu
  • yeast cells are also host cells that may be suitable in the context of the invention.
  • yeast host cells which may be used include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Klyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha or Pichia pastoris.
  • the fungal expression systems are also conceivable within the framework of the present invention, such as Aspergillus niger, Chrysosporium lucknowense, Aspergillus (for example Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, etc.), Podospora anserina or Trichoderma reesei.
  • mammalian expression systems can still be used in the context of the invention, for example NSO, CHO, BHK cell lines, transgenic systems of mammalian origin, but also cells insects or viral expression systems such as bacteriophage M13, T7 or ⁇ or Baculovirus expression systems.
  • the host cell of the invention is chosen from Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris.
  • the polynucleotide included in the vector and / or the host cell of the invention may optionally be associated with a sequence coding for a signal peptide (also called signal sequence), allowing the secretion of the mutated mannanases of the invention in the extracellular space and thus simplified detection and purification thereof in the culture supernatant of the host cells.
  • a signal peptide also called signal sequence
  • Another subject of the invention relates to a process for producing a polypeptide of the invention, said method comprising the steps of:
  • step (ii) inserting said nucleic acid fragment obtained in step (i) into an expression vector comprising a promoter, so as to allow the expression of said nucleic acid fragment under the control of said promoter,
  • step (iii) introducing the expression vector obtained in step (ii) into a host cell
  • step (iv) culturing the host cell obtained in step (iii),
  • nucleic acid fragment comprising a polynucleotide of the invention.
  • the nucleic acid fragment of step (i) comprises a polynucleotide associated with a signal sequence.
  • the signal sequence is fused to the polynucleotide of the invention upstream thereof.
  • signal sequences include, but are not limited to, the preprolip2 secretion peptide sequence (Bordes et al., 2007, J. Microbiol Meth., 70, 493), the pre-pro-factor secretion sequence has S. cerevisiae (Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol 54 (3): 277-86) or the signal sequence of native proteins.
  • the methods of amplification of a nucleic acid fragment are well known to those skilled in the art, and include in particular the polymerase chain reaction or PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • primer pairs usable for the amplification of a polypeptide of the invention derived from mannanase Man5A is provided by the sequences SEQ ID NO: 20-21; an example of primer pairs usable for the amplification of a polypeptide of the invention derived from mannanase Man26A is provided by the sequences SEQ ID NO: 22-23. 2
  • Said sequence is inserted into the vector so as to be operably linked to the promoter present in the vector, allowing the expression of said nucleic sequence under the control of said promoter.
  • operably linked means that the promoter is positioned relative to the inserted nucleic acid fragment so that transcription can begin. This means that the promoter is positioned upstream of said nucleic acid fragment, at a distance allowing the expression of the latter.
  • the expression vector comprises a selection gene.
  • selection genes include, but are not limited to, the zeocin resistance gene and the histidine auxotrophy gene.
  • the expression vector used in step (ii) is JMP61, pPICZaA, or pPICZaC.
  • the step (iii) of introducing the vector into the host cell is carried out by transformation techniques well known to those skilled in the art, such as electrolocation, transfection, lipofection, chemical transfection, transformation by ionization. Lithium acetate, biolistic transformation, PEG transformation, protoplast fusion, liposome transformation, Agrobacterium tumefaciens transformation, viral or adenoviral transformation or transduction.
  • the host cell of step (iii) is Pichia pastoris or Yarrowia lipolytica.
  • the vector of step (ii) is preferably pPICZaA, or pPICZaC.
  • the vector of step (ii) is preferably JMP61.
  • the production method of the invention may comprise an additional step (iv ') of selecting cells having integrated the expression vector in step (iii), to increase the production yield of a polypeptide of the invention. This type of selection is performed by techniques well known to those skilled in the art.
  • the recovery of the polypeptide of the invention is made from the culture medium of step (iv) and carried out by techniques well known to those skilled in the art.
  • the recovery can be done directly in the secretome of the host cells present in the culture medium obtained in step (iv).
  • step (i) does not comprise a signal sequence, it will be necessary to lyse the cells and recover the polypeptide of the invention for example in the supernatant of the culture medium after centrifugation of the -this.
  • the invention relates to a composition comprising at least one polypeptide, a polynucleotide, a vector or a host cell of the invention.
  • said composition may comprise one or more polypeptide (s) of the invention (or a polynucleotide, a vector or a host cell of the invention).
  • Said composition may also optionally comprise one or more native mannanase (s) (or at least one or more polynucleotide (s), vector (s) or associated host cell (s) (s) )) of Podospora anserina, such as, for example, native mannanases Man5A and Man26A.
  • native mannanase or at least one or more polynucleotide (s), vector (s) or associated host cell (s) (s)
  • Podospora anserina such as, for example, native mannanases Man5A and Man26A.
  • composition may also optionally comprise one or more mannanase (s) (or at least one or more polynucleotide (s), vector (s) or associated host cell (s)), which are native or mutated, of any species.
  • mannanase or at least one or more polynucleotide (s), vector (s) or associated host cell (s)
  • said composition optionally comprises one or more other hydrolase (s) (or polynucleotides, vectors or an associated host cell), the one or more other hydrolase (s) being review (s) degradation of the lignocellulosic biomass, such as endoglucanases, exoglucanases, polysaccharides monoxygenases, ⁇ -glucosidases, cellobiose dehydrogenases, xylanases, arabinofuranosidases, galactosidases, arabinanases, carbohydrates esterases, glucuronidases, methyl glucuronoyl esterases, acetyl esterases, pectinases.
  • hydrolase or polynucleotides, vectors or an associated host cell
  • said composition comprises an enzymatic cocktail of Trichoderma reesei cellulases.
  • the enzyme cocktail of Trichoderma reesei cellulases corresponds to the secretome of said fungus Trichoderma reesei.
  • secretome refers to all the proteins released by a cell, tissue or organism.
  • Methods for recovering the secretome of a cell including methods for obtaining a cocktail of Trichoderma reesei cellulases are well known to those skilled in the art.
  • Such cellulosic cocktails of Trichoderma reesei are also commercially available, such as the following enzymatic cocktails: GC220 (GENENCOR), MULTIFECT GC (GENENCOR), Accellerase (Danisco), Cellic C-Tec (NOVOZYME), or CELLUCLAST 1.5L (NOVOZYME).
  • said composition further comprises an enzymatic cocktail of Trichoderma reesei cellulases, and an enzymatic cocktail of Pycnoporus cinnabarinus, comprising a cellobiose dehydrogenase (CDH) or a cellobiose dehydrogenase of Pycnoporus cinnabarinus (or a polynucleotide, vector or associated host cell).
  • CDH cellobiose dehydrogenase
  • a cellobiose dehydrogenase of Pycnoporus cinnabarinus or a polynucleotide, vector or associated host cell.
  • said composition comprises an enzyme cocktail of Trichoderma reesei cellulases and at least one polypeptide of the invention, at a concentration of at most 10 mg of polypeptide per gram of material to be hydrolysed, preferentially 10 ⁇ g of polypeptide per gram of material to be hydrolysed.
  • Mannanases are enzymes that are used today in a wide variety of industrial fields such as the paper and cellulose industry, the food and agriculture industry, coffee extraction, oil drilling and the detergent industry. .
  • an object of the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the degradation of compounds comprising mannan.
  • a mannan is a polysaccharide composed of mannose monomers.
  • the term "mannan” is used here in the broad sense, and includes complex and derived sugars comprising mannose polymers. In particular, the term encompasses simple mannans (polymers consisting solely of mannose), galactomannans, glucomannans and galactoglucomannans.
  • Mannans are present in many plant compounds, such as fruits and some algae. They are also abundant in certain seeds and nuts ("ivory nut", locust bean gum, tara gum, guar gum, fenurec gum). They constitute an important component of biomass, particularly lignocellulosic biomass such as softwoods (gymnosperms), softwoods (pine, spruce) and in significant quantities in hardwoods.
  • biomass refers to all organic matter of plant origin (including algae), animal or fungal that can become a source of energy, for example by combustion, after methanisation (biogas) or after new chemical transformations (agrofuel).
  • biomass is lignocellulosic biomass.
  • lignocellulosic biomass refers to material derived from plants or other organisms in which the carbohydrate content is substantially lignocellulose consisting of cellulose, hemicellulose and lignin (not less than 5% ). For example, it consists of wood and green residues, straw, straw briquettes, sugar cane bagasse, or fodder.
  • Lignocellulosic biomass includes treated materials, such as paper with more than 5% lignin, but also natural raw materials such as agricultural waste. A mixture of water and / or other agents and solvents including ,
  • lignocellulosic biomass as the main solid component can also be considered as lignocellulosic biomass as such.
  • the lignocellulosic biomass is selected from the group consisting of herbaceous agricultural residues, silviculture residues, municipal solid waste, paper waste, pulp and stationary residues, or any combination of this.
  • the lignocellulosic biomass according to the invention is chosen from a group comprising maize stalks and stalks, for example straw from rice, wheat, rye, oats, barley, lavandin, bagasse, miscanthus. , herbs, bamboo, water hyacinth, wood consisting of hardwood for example eucalyptus, coppice coppice, wood consisting of softwood for example acacia, softwood pulp ...
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the degradation of the lignocellulosic biomass.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the pretreatment of lignocellulosic biomass to be degraded.
  • pretreatment is meant a manipulation of lignocellulosic biomass which renders its cellulosic components more accessible to enzymes converting carbohydrate polymers into fermentable sugars.
  • the invention relates to the use of a composition
  • a composition comprising a polypeptide of the invention (or a polynucleotide, a vector or a host cell of the invention) and an enzymatic cocktail of Trichoderma reesei cellulases for the degradation of the lignocellulosic biomass and / or for the pretreatment of the lignocellulosic biomass to be degraded.
  • said composition may further comprise other native or mutated mannanases, Podospora anserina or other species, and other enzymes useful for the degradation of lignocellulosic biomass.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the production of biofuels .
  • the components of lignocellulosic biomass are suitable substrates for the production of biofuels.
  • the polypeptides of the invention are used to convert the lignocellulosic biomass, the products thus obtained that can be used as biofuels (for example bioethanol, biobutanol) or as molecular components of such fuels (for example 3-hydroxypropionic acid, aspartic acid, xylitol and gluconic acid).
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for well stimulation.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the production of mannose or manno- oligosaccharides from plant compounds containing mannans.
  • Such compounds include, but are not limited to, oil palm core, coconut, coconut, konjac, locust bean gum, guar gum, soybean, etc.
  • Mannose is indeed a relatively rare resource with beneficial properties and used in food, pharmaceuticals, cosmetics, textiles and in the manufacture of polymers. It can be used as a raw material for the production of mannitol.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the production of mannitol.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention as a dietary supplement.
  • mannanases promote the degradation of food components containing mannan, thus releasing oligomannoses known to have beneficial properties for human and animal health, and help digestion by degrading polymers that are not easily degraded by organisms; they are especially useful to the body as prebiotics.
  • the invention relates to a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention in the treatment of food compounds.
  • mannanases can also be used in the extraction of palm oil: their application on oil palm cake, after a first extraction by pressure, allows an improvement of the yield, but also obtaining better quality oil palm kernels (because they contain less galactomannan fibers, anti-nutritive components in animal feed).
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for extraction. palm oil.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for extraction. Coffee.
  • mannanases in coffee extraction allows the hydrolysis of galactomannans present in liquid coffee extracts, thus reducing the viscosity of these liquid extracts and reducing the consumption of enzymes and energy during extraction.
  • the waste can be used for the production of mannose as described above.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention as a cooking ingredient.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for the bleaching of pulp.
  • a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention may be used alone, or in combination with one or more other mannanase (s) (polypeptide (s), polynucleotide (s) ), vector (s), host cell (s) and / or composition (s) associated), native or mutated, with xylanases, endoglucanases, ⁇ -galactosidases, cellobiohydrolases ...
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for desizing and bleaching of textile fibers.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention in detergent compositions. .
  • a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention may be used alone, or in combination with other mannanases, native or mutated, amylases, cellulases, lipases, pectinases, proteases and endoglucanases.
  • Mannanases also show properties of interest to the pharmaceutical industry.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention for elimination. of biofilms.
  • a polypeptide (polynucleotide, vector, host cell or composition) of the invention may be used alone, or in combination with detergents, other mannanases, native or mutated , from galactosidases, pectinases, xylanases, arabinoxylanases, proteases, beta-glucanases, cellulases, galactanases, endoglucanases, xylosidases, cutinases and lipases.
  • the invention relates to the use of a polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell and / or a composition of the invention in targeted or controlled release distribution over time.
  • Such systems are widely used in the drug industry for the delivery of active ingredients to a given organ and / or for a defined period of time. They are made using systems based on mannopolymer gels that contain and transport the material.
  • mannanase in such a system is the controlled release of the material by the partial or complete degradation of the gel, due to a specific change in the environment of the gel, for example pH and / or temperature, which activates mannanases. Mannanases also show applications in alcoholic fermentation and / or alcohol production processes.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing a fermentation product from lignocellulosic biomass, said method comprising the steps of:
  • step (ii) saccharification of said liquefied product obtained in step (i) with an enzymatic cocktail
  • step (iii) Fermentation of the saccharification product obtained in step (ii) using a fermenting microorganism.
  • the enzymatic cocktail used in step (ii) is a composition of the invention, comprising in particular (a) a polypeptide, a polynucleotide, a vector and / or a host cell and (b) so optional, a cellulase cocktail of Trichoderma reesei.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing gluconic acid, xylonic acid and / or xylobionic acid, or for increasing the amount of gluconic acid, xylonic acid and / or xylobionic acid from lignocellulosic biomass, said method comprising the steps of:
  • step (ii) saccharification of said liquefied product obtained in step (i) with an enzymatic cocktail.
  • the enzymatic cocktail used in step (ii) is a composition of the invention, comprising in particular (a) a polypeptide, a polynucleotide, a vector and / or a host cell and (b) optionally a cocktail of Trichoderma reesei cellulases.
  • Another subject of the invention relates to a method for increasing the production of sugars from lignocellulosic biomass, said method comprising the steps of:
  • step (ii) saccharification of said liquefied product obtained in step (i) with an enzymatic cocktail.
  • the enzymatic cocktail used in step (ii) is a composition of the invention, comprising in particular (a) a polypeptide, a polynucleotide, a vector and / or a host cell and (b) optionally a cocktail of Trichoderma reesei cellulases.
  • the inventors have developed mutants of the Man5A and Man26A proteins of Podospora anserina, and have studied their activity, seeking to increase the efficiency of these enzymes, in particular to increase the effectiveness of enzymatic cocktails used for the degradation of lignocellulosic biomass.
  • the two genes coding for the proteins Man5A (nucleotide sequence defined by SEQ ID NO: 2) and Man26A (nucleotide sequence defined by SEQ ID NO: 12) of Podospora anserina were each amplified with the primers defined by the SEQ ID sequences. NO: 20-21 and 22-23 respectively, inserted into the JMP61 expression vector, associated with a secretion peptide of preprolip2 (Bordes et al., 2007, J. Microbiol Meth., 70, 493) and placed under the control of the oleic acid POX2 inducible promoter.
  • the Yarrowia lipolytica yeast cells were transformed with the obtained vectors (JMP61-Man5A and JMP61-Man26A). Positive transformants were selected on plates comprising galactomannan. They were able to produce functional Man5A and Man26A enzymes at a level of 10.4 +/- 0.2 and 11.2 +/- 0.6 U.mL-1 in vitro.
  • the mutant G311S defined by the protein sequence SEQ ID NO: 4, and encoded by the sequence SEQ ID NO: 15,
  • mutant K139R / Y223H defined by the protein sequence SEQ ID NO: 6, and encoded by the sequence SEQ ID NO: 16,
  • mutant V256L / G276V / Q316H defined by the sequence SEQ ID NO: 8, and encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 17, and
  • the mutant W36R / I195T / V256A defined by the sequence SEQ ID NO: 10, and encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 18.
  • Mutant P140L D416G defined by the sequence SEQ ID NO: 14, and encoded by the nucleic sequence SEQ ID NO: 19.
  • the strain expressing the Man26A mutant P140L / D416G showed an increase in activity on the galactomannan hydrolysis reaction of 147% compared to a strain expressing the native Podospora anserina Man26.
  • the strains expressing the mutants of Man5A showed an increase in the activity of 46, 9, 20 and 11% respectively for the mutants V256L / G276V / Q316H, W36R / I195T / V256A, K139R / Y223H, G311S compared to a strain of Yarrowia lipolytica expressing the Man5 A protein of native Podospora anserina.
  • the inventors then wanted to evaluate more precisely the interest of these mutants from an enzymatic point of view, especially for the degradation of lignocellulosic biomass. They therefore studied the hydrolysis profile of galactomannan for each of them.
  • the mutants were produced in the Pichia pastoris expression system, to obtain expression levels higher than those obtained in the Yarrowia lipolytica expression system.
  • the genes encoding the native Man5A and Man26A proteins of Podospora anserina and the mutants developed were each amplified with the primers defined by the sequences SEQ ID NO: 20-23 (primers defined by the sequences SEQ ID NO: 20-21 for Man5A and its mutants, primers defined by the sequences SEQ ID NO: 22-23 for Man26A and its mutant), inserted into the expression vector pPICZaA, associated with the Saccharomyces cerevisiae pre-pro-factor a secretion sequence (Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol 54 (3): 277-86) and the C-terminal (His) 6 tag sequence, placed under the control of the AOX promoter (lcohol oxidase).
  • the expression vector used included a zeocin resistance gene. Pichia pastoris cells were transformed with the vectors obtained
  • the hydrolysis capacity of galactomannan was evaluated.
  • the determination of the kinetic parameters of each enzyme, native or mutated, on the hydrolysis reaction of galactomannan was carried out using the DNS activity test: 1 ⁇ g of each enzyme, native or mutated, was mixed with 190 ⁇ g of galactomannan and incubated at 40 ° C for 5 minutes. The reaction was stopped by adding 300 ⁇ L of DNS and the samples were placed for 10 minutes at 95 ° C. The OD540 optical density was measured relative to the mannose standard of 0 to 20 mM.
  • One unit of mannanase activity endo-pI, 4-mannanase was defined as the amount of protein required for the release of 1 ⁇ of sugar monomer per minute.
  • K ca , KM, and catalytic efficiency were measured for each enzyme, native or mutated.
  • Table 1 Increased catalytic efficiency of each mutant relative to its native enzyme.

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Abstract

La présente invention concerne un polypeptide codant pour une mannanase mutée, dont la séquence est dérivée d'une mannanase native du champignon filamenteux ascomycète coprophile Podospora anserina, et étant caractérisée par une efficacité catalytique augmentée d'au moins 25%. L'invention fournit aussi un polynucléotide codant pour un polypeptide de l'invention, un vecteur comprenant un polynucléotide de l'invention, une cellule hôte comprenant un vecteur ou un polynucléotide de l'invention, et une composition comprenant un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur ou une cellule hôte de l'invention. La présente invention couvre enfin l'utilisation d'un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur, une cellule hôte ou une composition de l'invention pour la dégradation de composés comprenant des mannanes, notamment la biomasse lignocellulosique, ainsi que les diverses utilisations envisageables d'un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur, une cellule hôte ou une composition de l'invention.

Description

POLYPEPTIDES CODANT POUR DES MANNANASES MUTEES AYANT UNE EFFICACITE CATALYTIQUE AMELIOREE
La présente demande internationale revendique la priorité de la demande de brevet française FR 13/00467 déposée en date du 1 mars 2013. DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne des polypeptides codant pour des mutants de mannanases ayant une efficacité enzymatique améliorée. L'invention fournit aussi des polynucléotides codant pour de tels polypeptides, des vecteurs et cellules hôtes comprenant de tels polynucléotides, ainsi que des compositions comprenant de tels polypeptide(s), polynucléotide(s), vecteur(s) ou cellule(s) hôte(s).
L'invention couvre enfin les diverses utilisations de tels polypeptides, polynucléotides, vecteurs, cellules hôtes ou compositions.
ART ANTERIEUR
La conversion de la biomasse, notamment la biomasse lignocellulosique, en sucres simples est largement étudiée, car préalable à la fermentation des produits de dégradation de celle-ci pour la production de bioéthanol ou de produits industriels variés.
La saccharification, c'est-à-dire l'hydrolyse enzymatique des composants de la biomasse lignocellulosique, constitue aujourd'hui un des principaux points de blocage du processus de raffinerie biologique : la résistance des parois cellulaires végétales entraine la nécessité d'utilisation d'une grande quantité d'enzymes pour hydrolyser la biomasse lignocellulosique en sucres fermentables. La conversion de la biomasse lignocellulosique représente donc aujourd'hui une réaction à coût élevé.
Le champignon ascomycète Trichoderma reesei est aujourd'hui l'un des champignons industriels les plus utilisés à travers le monde. Il est en effet capable de produire un cocktail enzymatique riche en cellulases, utilisé pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique. Cependant, les coûts considérables engendrés par l'utilisation de tels cocktails enzymatiques pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique constituent une barrière à l'utilisation de cette ressource renouvelable.
Il est donc nécessaire d'améliorer les cocktails enzymatiques existants pour augmenter leur efficacité et leur rendement, afin de diminuer le coût de revient de conversion de la biomasse.
La lignocellulose est le composant le plus abondant de la biomasse, comprenant environ cinquante pourcents de matière végétale produite par photosynthèse et représentant la ressource biologique renouvelable la plus importante dans le sol. Elle contient principalement trois types de polymères : la cellulose, l 'hémicellulose et la lignine. La cellulose représente environ 45% de la masse sèche de lignocellulose. C'est un polymère linéaire composé de D-glucoses liés par des liaison i,4-glycosidiques, formant de longue chaînes liées entre elles par des liaisons non covalentes. L'hémicellulose est formée d'hétéropolymères représentant 15 à 35% de la biomasse, et contenant des pentoses, tels que le β-D-xylose ou Fa-L-arabinose, des hexoses, tels que le β-D-mannose, le β-D-glucose ou Γα-D-galactose, ou encore des acides uroniques. La lignine est composée d'unités de phénylpropane liées entre elles par différents types de liaisons. Elle se lie à la cellulose et à l'hémicellulose et forme une barrière physique protégeant les végétaux, plus spécifiquement les cellules végétales.
L'hémicellulose désigne un ensemble divers de polymères de carbohydrates non- cristallins, parmi lesquels les mannanes constituent un composant majeur, notamment dans le bois tendre. Les mannanes constituent une famille de sucres complexes comprenant une structure de résidus de D-mannose, appelée mannane, ou une combinaison de résidus de β1,4-ο-πΐ3ηηο8ε et de pi,4-D-glucose, appelée glucomannane. Chacune des deux structures peut être complémentée de chaînes latérales de galactose, et forme alors un polymère d'osés appelé galactomannane et galactoglucomannane, respectivement.
Les mannanes, au sens large du terme, sont hydrolysés par une action coordonnée de différents types de glycoside hydrolases comprenant notamment les mannanases. Les mannanases sont donc des enzymes nécessaires pour la conversion de la biomasse lignocellulosique. Deux mannanases issues du champignon coprophile Podospora anserina ont récemment été étudiées et identifiées comme facteurs renforçant l'efficacité du cocktail enzymatique de Trichoderma reesei pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique (Couturier et al, Applied and Environmental Microbiology, January 2011, 77(1) :23, pages 237-246).
Cette étude constitue une voie d'amélioration des cocktails enzymatiques existants pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique. Des études supplémentaires pourraient permettre l'émergence de nouvelles enzymes ou de nouveaux outils pour améliorer encore leur efficacité. SOMMAIRE DE L'INVENTION
Cherchant à améliorer les moyens actuels de dégradation de la biomasse lignocellulosique, les inventeurs ont au préalable montré que l'efficacité des cocktails enzymatiques actuellement disponibles pour la dégradation lignocellulosique, tels que ceux issus du sécrétome de Trichoderma reesei, peut être accrue par la supplémentation de ceux-ci avec des enzymes supplémentaires, parmi lesquelles les mannanases Man5A et Man26A issues du champignon ascomycète Podospora anserina (Couturier et al., 2011).
Suite à ces résultats, les inventeurs ont cherché à augmenter encore l'efficacité d'un cocktail enzymatique de Trichoderma reesei supplémenté. Ils ont ainsi cherché à développer des variants des mannanases Man5A et Man26A ayant des activités enzymatiques améliorées par rapport aux enzymes natives.
L'invention concerne ainsi un polypeptide consistant en une mannanase mutée, ayant une séquence dérivée d'une mannanase native du champignon filamenteux ascomycète coprophile Podospora anserina, et étant caractérisée par une efficacité catalytique augmentée d'au moins 25% par rapport à l'efficacité catalytique de cette mannanase native.
Plus particulièrement, ledit polypeptide est dérivé de la mannanase Man5A ou Man26A de Podospora anserina et est défini par l'une des séquences SEQ ID NO :3 à 14, et diffère d'au moins un acide aminé de la séquence SEQ ID NO :1 ou 11. L'invention concerne aussi un polynucléotide codant pour un tel peptide, un vecteur comprenant un tel polynucléotide et une cellule hôte comprenant un tel polynucléotide ou un tel vecteur.
L'invention concerne de plus une composition comprenant un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur ou une cellule hôte de l'invention.
L'invention concerne enfin l'utilisation d'un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur, une cellule hôte ou une composition de l'invention pour la dégradation des composés comprenant des mannanes, plus particulièrement, pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Cherchant à améliorer l'efficacité des cocktails enzymatiques utilisés pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique, les inventeurs ont développé des mutants de mannanases issus du champignon filamenteux ascomycète coprophile Podospora anserina, lesdits mutants montrant une efficacité catalytique améliorée d'au moins 25% par rapport aux enzymes natives.
La présente invention a ainsi pour objet un polypeptide consistant en une mannanase mutée, ayant une séquence dérivée d'une mannanase native du champignon filamenteux ascomycète coprophile Podospora anserina, et étant caractérisée par une efficacité catalytique augmentée d'au moins 25% par rapport à l'efficacité catalytique de cette mannanase native.
Le terme « mannanase » fait référence à une famille d'enzymes capable d'hydrolyser des chaînes polyoses composées de mannoses (appelées mannanes, mannopolymères ou polymannoses).
Par « mannanase mutée », on entend une mannanase définie par une séquence dérivée d'une mannanase native et dont la séquence comprend au moins une mutation par rapport à la séquence de cette mannanase native.
Le terme « mutation » fait référence à la substitution, au remplacement, à l'insertion ou à la délétion d'un ou plusieurs acides aminés dans une séquence protéique de référence. Une mannanase mutée de l'invention est caractérisée par une efficacité catalytique augmentée d'au moins 25% par rapport à l'efficacité catalytique de la mannanase native.
L'efficacité catalytique d'une réaction enzymatique, laquelle est associée à une enzyme donnée, est bien connue de l'homme du métier et est définie communément par la mesure du rapport kCAT/KM, où kcat est la constante catalytique, correspondant au nombre de moles de produit formées par seconde et par mole d'enzyme, et où K est la constante de Michaelis, caractéristique de l'enzyme testée.
De préférence, l'efficacité catalytique des polypeptides de l'invention est mesurée sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane et comparée à celle de la mannanase native. Les réactions d'hydrolyse de mannooligosaccharides tels que le mannopentaose et le mannohexaose peuvent aussi être utilisées. De telles réactions et mesures sont décrites dans Berrin et al, 2007 (Appl Microbiol Biotechnol., 74(5): 1001).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polypeptide est dérivé de la mannanase Man5 A de Podospora anserina.
Par « Man5A », on entend la mannanase Man5A de Podospora anserina, définie par la séquence protéique SEQ ID NO :1. Cette mannanase est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO :2.
SEQ ID NO :1 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYWIGFL
TNNRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN YWDDFGGMKA YVNAFGGTKE SWYTNARAQE QYKRYIQAVV SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTYPYQYGEG TDFVKNLQIK NLDFGTFHMY PGHWGVPTSF GPGWIKDHAA ACRAAGKPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWQWGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA INALPA
SEQ ID NO :2 TCCCCCAAGCACAAGGTGGAGGAGCAGCCGCCTCAGCCAAAGTC
AGCGGCACCCGCTTCGTGATCGACGGCAAAACCGGCTACTTTGCA
GGAACAAACTCCTACTGGATTGGCTTGGTGACGAACAACAGAGAT
GTCGACACAACCTTGGACCACATCGCCTCCTCGGGCCTCAAAATC
CTCCGCGTCTGGGGCTTCAACGACGTGAACAACCAACCATCCGGT AACACCGTCTGGTTCCAACGCCTCGCCTCCTCAGGCTCCCAAATC
AACACCGGCCCCAACGGCCTCCAACGCCTCGACTACCTCGTCAGA
TCAGCCGAAACCCGCGGCATCAAGCTCATCATCGCGCTGGTCAAC
TACTGGGATGACTTTGGCGGCATGAAAGCCTACGTCAACGCCTTT
GGAGGCACAAAAGAATCCTGGTACACCAACGCCCGCGCTCAGGA
GCAGTACAAGCGTTACATCCAGGCTGTCGTCTCGCGATATGTCAA
CAGCCCCGCAATCTTTGCGTGGGAACTTGCCAACGAGCCCAGGTG
CAAGGGGTGCAACACGAATGTTATTTTCAACTGGGCGACGCAGAT
TTCAGATTATATCCGGAGCTTGGATAAGGATCATTTGATCACCCTT
GGGGATGAGGGGTTTGGGTTGCCGGGGCAGACGACGTATCCGTAT
CAGTATGGGGAGGGGACCGACTTCGTCAAGAATCTGCAGATTAAG
AATCTGGACTTTGGGACGTTTCATATGTATCCTGGTCATTGGGGGG
TGCCGACGAGTTTTGGTCCAGGGTGGATTAAGGATCATGCGGCGG
CTTGCAGGGCGGCGGGGAAGCCGTGTTTGTTGGAGGAGTATGGGT
ATGAGAGTGATAGGTGTAATGTGCAGAAGGGCTGGCAGCAGGCG
TCGAGGGAGCTGAGCAGGGATGGGATGAGTGGTGATTTGTTTTGG
CAATGGGGCGATCAGTTGAGTACTGGGCAGACACATAATGATGG
GTTCACGATTTATTATGGTTCTTCGTTGGCTACTTGCTTGGTTACTG
ACCATGTGAGGGCTATCAATGCTCTCCCGGCGTAG
Selon l'invention, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID
NO :3.
SEQ ED NO :3 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYX IGFL
TNNRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN YWDDFGGMKA YVNAFGGTX139E SWYTNARAQE QYKRYIQAVV SRYVNSPAIF AWELA EPRC KGCNTNVIFN WATQX19SSDYIR SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTX223PYQYGEG TDFVK LQIK NLDFGTFHMY PGHWGX256PTSF GPGWI DHAA ACRAAX276KPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS X3UDLFWX316WGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDUVRA INALPA
Où :
- le résidu en position 36 est un tryptophane ou une arginine (X36 = W ou R),
- le résidu en position 139 est une lysine ou une arginine (X139 = K ou ?
R),
- le résidu en position 195 est une isoleucine ou une thréonine (X195= I ou T),
- le résidu en position 223 est une tyrosine ou une histidine (X223= Y ou H),
- le résidu en position 256 est une valine, une leucine ou une alanine
(X256= V, L ou A),
- le résidu en position 276 est une glycine ou une valine (X276= G ou
V),
- le résidu en position 311 est une glycine ou une sérine (X311= G ou
S), et
- le résidu en position 316 est une glutamine ou une histidine (X316= Q ou H).
La séquence SEQ ID NO :3 diffère d'au moins un acide aminé de la séquence SEQ ID NO :l.
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID NO :4. *
SEQ ID NO :4 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYWIGFL
TNNRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF
QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN
YWDDFGGMKA YVNAFGGTKE SWYTNARAQE QYKRYIQAW
SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR
SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTYPYQYGEG TDFVKNLQIK
NLDFGTFHMY PGHWGVPTSF GPGWIKDHAA ACRAAGKPCL
LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS SDLFWQWGDQ
LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA INALPA
L'efficacité catalytique du polypeptide défini par la séquence SEQ ID NO :4
(mutant G311S) est augmentée d'un facteur 8 (augmentation de 800%) par rapport à celle de la mannanase Man5A native (SEQ ID NO :1) sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane.
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID NO :5. SEQ ID NO :5 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYWIGFL T NRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN YWDDFGGMKA YV AFGGTX139E SWYTNARAQE QYKRYIQAVV SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR SLDKDFILITL GDEGFGLPGQ TTX223PYQYGEG TDFVKNLQI NLDFGTFHMY PGHWGVPTSF GPGWIKDHAA ACRAAGKPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWQWGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA I ALPA
Où :
- le résidu en position 139 est une lysine ou une arginine (X139 = K ou
R), et
- le résidu en position 223 est une tyrosine ou une histidine (X223= Y ou H).
La séquence SEQ ID NO :5 diffère d'au moins un acide aminé de la séquence SEQ ID NO :1.
Plus préférentiellement, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID NO :6.
SEQ ID NO :6 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYWIGFL
TNNRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF
QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN
YWDDFGGMKA YVNAFGGTRE SWYTNARAQE QYKRYIQAVV
SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR
SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTHPYQYGEG TDFVKNLQIK
NLDFGTFHMY PGHWGVPTSF GPGWIKDHAA ACRAAGKPCL
LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWQWGDQ
LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA INALPA
L'efficacité catalytique du polypeptide défini par la séquence SEQ ID NO :6 (mutant K139R/Y223H) est augmentée d'un facteur 1,7 (augmentation de 70%) par rapport à celle de la mannanase Man5A native (SEQ ID NO : l) sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID NO :7. SEQ ID NO :7 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VEDGKTGYFA GTNSYWIGFL TNN DVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GD LIIALVN YWDDFGGMKA YVNAFGGTKE SWYTNARAQE QYKRYIQAW SRYVNSPAEF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTYPYQYGEG TDFVKNLQIK NLDFGTFHMY PGHWGX256PTSF GPGWIKDHAA ACRAAX276KPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWX316WGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA INALPA
Où :
- le résidu en position 256 est une valine, une leucine ou une alanine
(X256= V, L ou A),
- le résidu en position 276 est une glycine ou une valine (X276= G ou
V),
- le résidu en position 316 est une glutamine ou une histidine (X316= Q ou H).
La séquence SEQ ID NO :7 diffère d'au moins un acide aminé de la séquence SEQ ID NO :l .
Plus préférentiellement, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID NO :8.
SEQ ID NO :8 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYWIGFL
TNNRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GDCLIIALVN YWDDFGGMKA YVNAFGGTKE SWYTNARAQE QYKRYIQAW SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQISDYIR SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTYPYQYGEG TDFVKNLQIK NLDFGTFHMY PGHWGLPTSF GPGWIKDHAA ACRAAVKPCL LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWHWGDQ LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA INALPA
L'efficacité catalytique du polypeptide défini par la séquence SEQ ID NO :8 (mutant V256L/G276V/Q316H) est augmentée d'un facteur 1,3 (augmentation de 30%) par rapport à celle de la mannanase Man5A native (SEQ ID NO :1) sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane. Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence SEQ ID NO :9.
La séquence SEQ ID NO :9 diffère d'au moins un acide aminé de la séquence
SEQ ID NO : 1.
Plus préférentiellement, le polypeptide de l'invention est défini par la séquence
SEQ ID NO :10.
SEQ ID NO :10 LPQAQGGGAA ASAKVSGTRF VIDGKTGYFA GTNSYRIGFL
TNNRDVDTTL DHIASSGLKI LRVWGFNDVN NQPSGNTVWF
QRLASSGSQI NTGPNGLQRL DYLVRSAETR GIKLIIALVN
YWDDFGGMKA YVNAFGGTKE SWYTNARAQE QYKRYIQAW
SRYVNSPAIF AWELANEPRC KGCNTNVIFN WATQTSDYIR
SLDKDHLITL GDEGFGLPGQ TTYPYQYGEG TDFVKNLQIK
NLDFGTFHMY PGHWGAPTSF GPGWIKDHAA ACRAAGKPCL
LEEYGYESDR CNVQKGWQQA SRELSRDGMS GDLFWQWGDQ
LSTGQTHNDG FTIYYGSSLA TCLVTDHVRA INALPA
L'efficacité catalytique du polypeptide défini par la séquence SEQ ID NO : 10 (mutant W36R/I195T V256A) est augmentée d'un faéteur 1,78 (augmentation de 78%) par rapport à celle de la mannanase Man5A native (SEQ ID NO : 1) sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la mannanase mutée de l'invention est dérivée de la mannanase Man26A de Podospora anserina.
Par « Man26A », on entend la mannanase Man26A de Podospora anserina, définie par la séquence protéique SEQ ID NO : 11 et la séquence nucléique SEQ ID NO :12.
SEQ ID NO :11 KPCKPRDGPV TYEAEDAILT GTTVDTAQVG YTGRGYVTGF
DEGSDKITFQ ISSATTKLYD LSIRYAAIYG DKRTNVVLNN GAVSEVFFPA GDSFTSVAAG QVLLNAGQNT IDIVNNWGWY LIDSITLTPS APRPPHDINP NLNNPNADTN AKKLYSYLRS VYGNKIISGQ QELHHAEWIR QQTGKTPALV AVDLMDYSPS RVERGTTSHA VEDAIAHHNA GGIVSVLWHW NAPVGLYDTE ENKWWSGFYT RATDFDIAAT LANPQGANYT LLIRDIDAIA VQLKRLEAAG VPVLWRPLHE AEGGWFWWGA KGPEPAKQLW DILYERLTVH HGLDNLIWVW NSILEDWYPG DDTVDILSAD VYAQGNGPMS TQYNELIALG RDKKMIAAAE VGAAPLPGLL QAYQANWLWF AVWGDDFINN PSWNTVAVLN EIYNSDYVLT LDEIQGWRS
SEQ ID NO :12 AAGCCTTGTAAGCCTCGTGATGGCCCCGTGACCTACGAGGCCGA
AGATGCCATCCTCACCGGCACCACCGTCGACACTGCTCAGGTAG
GCTATACCGGCCGTGGCTACGTCACCGGCTTCGACGAGGGCTCC
GACAAGATCACCTTCCAGATCAGCTCCGCCACCACCAAGCTCTA
CGACCTCTCCATCCGGTACGCCGCCATCTACGGTGACAAGCGAA
CCAACGTCGTCCTCAACAACGGTGCCGTCAGCGAGGTCTTCTTC
CCCGCCGGTGACTCTTTTACTTCTGTCGCCGCCGGCCAGGTCCTC
CTCAACGCTGGACAAAACACCATCGACATCGTCAACAACTGGGG
ATGGTACCTCATCGACTCCATCACCCTCACCCCCTCCGCCCCTCG
CCCCCCCCACGACATCAACCCCAACCTCAACAACCCCAACGCCG
ACACCAACGCCAAGAAGCTCTACTCCTACCTCCGCTCTGTCTAC
GGCAACAAGATCATCTCTGGCCAGCAGGAGCTCCACCACGCCGA
GTGGATCAGACAGCAAACCGGCAAGACTCCCGCGCTGGTGGCTG
TCGATCTGATGGATTACTCCCCCTCCCGCGTCGAGCGTGGCACC ACCAGCCATGCCGTCGAGGACGCCATCGCCCACCACAACGCAGG
CGGTATCGTTTCTGTCCTCTGGCACTGGAACGCTCCCGTCGGTCT
GTATGACACCGAAGAGAACAAGTGGTGGTCCGGCTTCTACACTC
GGGCTACCGACTTTGACATTGCCGCCACGTTGGCCAACCCCCAG
GGTGCGAACTACACTCTTCTCATCAGGGACATTGACGCGATTGC
TGTCCAGCTCAAGAGGCTGGAGGCTGCTGGTGTTCCGGTCTTGT
GGAGACCTCTTCACGAGGCGGAGGGTGGTTGGTTCTGGTGGGGA
GCCAAGGGGCCAGAGCCGGCGAAGCAGCTTTGGGATATCTTGTA
TGAGCGTCTGACGGTGCACCATGGTTTGGATAATTTGATTTGGGT
GTGGAATTCGATTTTGGAGGATTGGTATCCGGGTGATGATACGG
TTGATATCTTGTCGGCCGATGTGTATGCGCAGGGTAATGGGCCC
ATGTCGACTCAGTACAATGAGTTGATCGCCCTCGGCAGGGACAA
GAAGATGATTGCTGCTGCAGAGGTTGGCGCTGCCCCTTTGCCCG
GCTTGTTGCAGGCTTACCAGGCCAACTGGCTGTGGTTTGCTGTCT
GGGGTGATGACTTTATCAACAACCCCAGCTGGAACACGGTTGCT
GTTCTCAACGAGATCTACAACAGCGACTATGTGTTGACGCTGGA
TGAGATTCAGGGGTGGAGGAGTTAG
Dans un mode de réalisation plus particulier, la mannanase mutée de l'invention dérivée de Man26A est définie par la séquence SEQ ID NO :13.
SEQ ID NO : 13 KPCKPRDGPV TYEAEDAILT GTTVDTAQVG YTGRGYVTGF
DEGSDKITFQ ISSATTKLYD LSIRYAAIYG DKRTNWLNN
GAVSEVFFPA GDSFTSVAAG QVLLNAGQNT rorvNNWGWY
LIDSITLTPS APRPPHDINX140 NLN PNADTN AKKLYSYLRS
VYGNKHSGQ QELHHAEWIR QQTG TPALV AVDLMDYSPS
RVERGTTSHA VEDAIAHHNA GGIVSVLWHW NAPVGLYDTE
ENKWWSGFYT RATDFDIAAT LANPQGA YT LLIRDIDAIA
VQLKRLEAAG VPVLWRPLHE AEGGWFWWGA KGPEPAKQLW
DDLYERLTVH HGLDNLIWVW NSILEDWYPG DDTVDILSAD
VYAQGNGPMS TQYNELIALG RDK MIAAAE VGAAPLPGLL
QAYQANWLWF AVWGDX 16FIN PSWNTVAVLN EIY SDYVLT
LDEIQGWRS
Où :
- le résidu en position 140 est une proline ou une leucine (X140= P ou
L), et - le résidu en position 416 est un aspartate ou une glycine (X416= D ou G).
La séquence SEQ ID NO :13 diffère, d'au moins un acide aminé, de la séquence SEQ ID NO :11.
Dans un mode de réalisation préféré, la mannanase mutée de l'invention est définie par la séquence SEQ ID NO : 14.
SEQ ID NO :14 KPCKPRDGPV TYEAEDAILT GTTVDTAQVG YTGRGYVTGF
DEGSDKITFQ ISSATTKLYD LSIRYAAIYG DKRTNWLNN
GAVSEVFFPA GDSFTSVAAG QVLLNAGQNT IDIVNNWGWY
LIDSITLTPS APRPPHDINL NLNNPNADTN AKKLYSYLRS
VYGNKIISGQ QELHHAEWIR QQTGKTPALV AVDLMDYSPS
RVERGTTSHA VEDAIAHHNA GGIVSVLWHW NAPVGLYDTE
ENKWWSGFYT RATDFDIAAT LANPQGANYT LLIRDIDAIA
VQLKRLEAAG VPVLWRPLHE AEGGWFWWGA KGPEPAKQLW
DILYERLTVH HGLDNLIWVW NSILEDWYPG DDTVDILSAD
VYAQGNGPMS TQYNELIALG RDKKMIAAAE VGAAPLPGLL
QAYQANWLWF AVWGDGFINN PSWNTVAVLN EIYNSDYVLT
LDEIQGWRS
Les inventeurs ont montré que l'efficacité catalytique d'un polypeptide défini par la séquence SEQ ID NO :14 (mutant P140L/D416G) est augmentée d'un facteur 1.3 (augmentation de 30%) par rapport à celle de la mannanase Man5A native (SEQ ID NO : 11) sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane.
Un autre objet de l'invention concerne un polynucléotide codant pour un polypeptide de l'invention.
Selon l'invention, ledit polynucléotide est une molécule d'ADN ou d'ARN.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit polynucléotide code pour une mannanase mutée de l'invention définie par une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO :3-10 et 13-14.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit polynucléotide est défini par une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 15-19.
SEQ ID NO : 15 CTCCCCCAAGCACAAGGTGGAGGAGCAGCCGCCTCAGCCAAAGTCAGCG GCACCCGCTTCGTGATCGACGGCAAAACCGGCTACTTTGCAGGAACAAA
CTCCTACTGGATTGGCTTCCTGACCAACAACAGAGATGTCGACACAACCT
TGGACCACATCGCCTCCTCGGGCCTCAAAATCCTCCGCGTCTGGGGCTTC
AACGACGTGAACAACCAACCATCCGGTAACACCGTCTGGTTCCAACGCC
TCGCCTCCTCAGGCTCCCAAATCAACACCGGCCCCAACGGCCTCCAACGC
CTCGACTACCTCGTCAGATCAGCCGAAACCCGCGGCATCAAGCTCATCAT
CGCGCTGGTCAACTACTGGGATGACTTTGGCGGCATGAAAGCCTACGTCA
ACGCCTTTGGAGGCACAAAAGAATCCTGGTACACCAACGCCCGCGCTCA
GGAGCAGTACAAGCGTTACATCCAGGCTGTCGTCTCGCGATATGTCAACA
GCCCCGCAATCTTTGCGTGGGAACTTGCCAACGAGCCCAGGTGCAAGGG
GTGCAACACGAATGTTATTTTCAACTGGGCGACGCAGATTTCAGATTATA
TCCGGAGCTTGGATAAGGATCATTTGATCACCCTTGGGGATGAGGGGTTT
GGGTTGCCGGGGCAGACGACGTATCCGTATCAGTATGGGGAGGGGACCG
ACTTCGTCAAGAATCTGCAGATTAAGAATCTGGACTTTGGGACGTTTCAT
ATGTATCCTGGTCATTGGGGGGTGCCGACGAGTTTTGGTCCAGGGTGGAT
TAAGGATCATGCGGCGGCTTGCAGGGCGGCGGGGAAGCCGTGTTTGTTG
GAGGAGTATGGGTATGAGAGTGATAGGTGTAATGTGCAGAAGGGCTGGC
AGCAGGCGTCGAGGGAGCTGAGCAGGGATGGGATGAGTAGTGATTTGTT
TTGGCAATGGGGCGATCAGTTGAGTACTGGGCAGACACATAATGATGGG
TTCACGATTTATTATGGTTCTTCGTTGGCTACTTGCTTGGTTACTGACCAT
GTGAGGGCTATCAATGCTCTCCCGGCG
SEQ ID NO : 16 CTCCCCCAAGCACAAGGTGGAGGAGCAGCCGCCTCAGCCAAAGT
CAGCGGCACCCGCTTCGTGATCGACGGCAAAACCGGCTACTTTGC
AGGAACAAACTCCTACTGGATTGGCTTCCTGACCAACAACAGAGA
TGTCGACACAACCTTGGACCACATCGCCTCCTCGGGCCTCAAAAT
CCTCCGCGTCTGGGGCTTCAACGACGTGAACAACCAACCATCCGG
TAACACCGTCTGGTTCCAACGCCTCGCCTCCTCAGGCTCCCAAATC
AACACCGGCCCCAACGGCCTCCAACGCCTCGACTACCTCGTCAGA
TCAGCCGAAACCCGCGGCATCAAGCTCATCATCGCGCTGGTCAAC
TACTGGGATGACTTTGGCGGCATGAAAGCCTACGTCAACGCCTTT
GGAGGCACAAGAGAATCCTGGTACACCAACGCCCGCGCTCAGGA
GCAGTACAAGCGTTACATCCAGGCTGTCGTCTCGCGACATGTCAA
CAGCCCCGCAATCTTTGCGTGGGAACTTGCCAACGAGCCCAGGTG
CAAGGGGTGCAACACGAATGTTATTTTCAACTGGGCGACGCAGAT
TTCAGATTATATCCGGAGCTTGGATAAGGATCATTTGATCACCCTT
GGGGATGAGGGGTTTGGGTTGCCGGGGCAGACGACGTATCCGTAT
CAGTATGGGGAGGGGACCGACTTCGTCAAGAATCTGCAGATTAAG AATCTGGACTTTGGGACGTTTCATATGTATCCTGGTCATTGGGGGG
TGCCGACGAGTTTTGGTCCAGGGTGGATTAAGGATCATGCGGCGG
CTTGCAGGGCGGCGGGGAAGCCGTGTTTGTTGGAGGAGTATGGGT
ATGAGAGTGATAGGTGTAATGTGCAGAAGGGCTGGCAGCAGGCG
TCGAGGGAGCTGAGCAGGGATGGGATGAGTGGTGATTTGTTTTGG
CAATGGGGCGATCAGTTGAGTACTGGGCAGACACATAATGATGG
GTTCACGATTTATTATGGTTCTTCGTTGGCTACTTGCTTGGTTACTG
ACCATGTGAGGGCTATCAATGCTCTCCCGGCG
SEQ ID NO .17 CTCCCCCAAGCACAAGGTGGAGGAGCAGCCGCCTCAGCCAAAGT
CAGCGGCACCCGCTTCGTGATCGACGGCAAAACCGGCTACTTTGC
AGGAACAAACTCCTACTGGATTGGCTTCCTGACCAACAACAGAGA
TGTCGACACAACCTTGGACCACATCGCCTCCTCGGGCCTCAAAAT
CCTCCGCGTCTGGGGCTTCAACGACGTGAACAACCAACCATCCGG
TAACACCGTCTGGTTCCAACGCCTCGCCTCCTCAGGCTCCCAAATC
AACACCGGCCCCAACGGCCTCCAACGCCTCGACTACCTCGTCAGA
TCAGCCGAAACCCGCGGCATCAAGCTCATCATCGCGCTGGTCAAC
TACTGGGATGACTTTGGCGGCATGAAAGCCTACGTCAACGCCTTT
GGAGGCACAAAAGAATCCTGGTACACCAACGCCCGCGCTCAGGA
GCAGTACAAGCGTTACATCCAGGCTGTCGTCTCGCGATATGTCAA
CAGCCCCGCAATCTTTGCGTGGGAACTTGCCAACGAGCCCAGGTG
CAAGGGGTGCAACACGAATGTTATTTTCAACTGGGCGACGCAGAT
TTCAGATTATATCCGGAGCTTGGATAAGGATCATTTGATCACCCTT
GGGGATGAGGGGTTTGGGTTGCCGGGGCAGACGACGTATCCGTAT
CAGTATGGGGAGGGGACCGACTTCGTCAAGAATCTGCAGATTAAG
AATCTGGACTTTGGGACGTTTCATATGTATCCTGGTCATTGGGGGT
TGCCGACGAGTTTTGGTCCAGGGTGGATTAAGGATCATGCGGCGG
CTTGCAGGGCGGCGGTGAAGCCGTGTTTGTTGGAGGAGTATGGGT
ATGAGAGTGATAGGTGTAATGTGCAGAAGGGCTGGCAGCAGGCG
TCGAGGGAGCTGAGCAGGGATGGGATGAGTGGTGATTTGTTTTGG
CACTGGGGCGATCAGTTGAGTACTGGGÇAGACACATAATGATGGG
TTCACGATTTATTATGGTTCTTCGTTGGCTACTTGCTTGGTTACTGA
CCATGTGAGGGCTATCAATGCTCTCCCGGCG
SEQ ID NO :18 CTCCCCCAAGCACAAGGTGGAGGAGCAGCCGCCTCAGCCAAAGT
CAGCGGCACCCGCTTCGTGATCGACGGCAAAACCGGCTACTTTGC
AGGAACAAACTCCTACAGGATTGGCTTCCTGACCAACAACAGAGA TGTCGACACAACCTTGGACCACATCGCCTCCTCGGGCCTCAAAAT
CCTCCGCGTCTGGGGCTTCAACGACGTGAACAACCAACCATCCGG
TAACACCGTCTGGTTCCAACGCCTCGCCTCCTCAGGCTCCCAAATC
AACACCGGCCCCAACGGCCTCCAACGCGTCGACTACCTCGTCAGA
TCAGCCGAAACCCGCGGCATCAAGCTCATCATCGCGCTGGTCAAC
TACTGGGATGACTTTGGCGGCATGAAAGCCTACGTCAACGCCTTT
GGAGGCACAAAAGAATCCTGGTACACCAACGCCCGCGCTCAGGA
GCAGTACAAGCGTTACATCCAGGCTGTCGTCTCGCGATATGTCAA
CAGCCCCGCAATCTTTGCGTGGGAACTTGCCAACGAGCCCAGGTG
CAAGGGGTGCAACACGAATGTTATTTTCAACTGGGCGACGCAGAT
CTCAGATTATATCCGGAGCTTGGATAAGGATCATTTGATCACCCTT
GGGGATGAGGGGTTTGGGTTGCCGGGGCAGACGACGTATCCGTAT
CAGTATGGGGAGGGGACCGACTTCGTCAAGAATCTGCAGATTAAG
AATCTGGACTTTGGGACGTTTCATATGTATCCTGGTCATTGGGGGG
CGCCGACGAGTTTTGGTCCAGGGTGGATTAAGGATCATGCGGCGG
CTTGCAGGGCGGCGGGGAAGCCGTGTTTGTTGGAGGAGTATGGGT
ATGAGAGTGATAGGTGTAATGTGCAGAAGGGCTGGCAGCAGGCG
TCGAGGGAGCTGAGCAGGGATGGGATGAGTGGTGATTTGTTTTGG
CAATGGGGCGATCAGTTGAGTACTGGGCAGACACATAATGATGG
GTTCACGATTTATTATGGTTCTTCGTTGGCTACTTGCTTGGTTACTG
ACCATGTGAGGGCTATCAATGCTCTCCCGGCG
SEQ ID NO :19 AAGCCTTGCAAGCCTCGTGATGGCCCCGTGACCTACGAGGCCGAA
GATGCCATCCTCACCGGCACCACCGTCGACACTGCTCAGGTAGGC
TATACCGGCCGTGGCTACGTCACCGGCTTCGACGAGGGCTCCGAC
AAGATCACCTTCCAGATCAGCTCCGCCACCACCAAGCTCTACGAC
CTCTCCATCCGGTACGCCGCCATCTACGGTGACAAGCGAACCAAC
GTCGTCCTCAACAACGGTGCCGTCAGCGAGGTCTTCTTCCCCGCC
GGTGACTCTTTTACTTCTGTCGCCGCCGGCCAGGTCCTCCTCAACG
CTGGACAAAACACCATCGACATCGTCAACAACTGGGGATGGTACC
TCATCGACTCCATCACCCTCACCCCCTCCGCCCCTCGCCCCCCCCA
CGACATCAACCCCAACCTCAATAACCCCAACGCCGACACCAACGC
CAAGAAGCTCTACTCCTACCTCCGCTCTGTCTACGGCAACAAGAT
CATCTCTGGCCAGCAGGAGCTCCACCACGCCGAGTGGATCAGACA
GCAAACCGGCAAGACTCCCGCGCTGGTGGCTGTCGATCTGATGGA TTACTCCCCCTCCCGCGTCGAGCGTGGCACCACCAGCCATGCCGT
CGAGGACGCCATCGCCCACCACAACGCAGGCGGTATCGTTTCTGT
CCTCTGGCACTGGAACGCTCCCGTCGGTCTGTATGACACCGAAGA
GAACAAGTGGTGGTCCGGCTTCTACACTCGGGCTACCGACTTTGA
CATTGCCGCCACGTTGGCCAACCCCCAGGGTGCGAACTACACTCT
TCTCATCAGGGACATTGACGCGATTGCTGTCCAGCTCAAGAGGCT
GGAGGCTGCTGGTGTTCCGGTCTTGTGGAGACCTCTTCACGAGGC
GGAGGGTGGTTGGTTCTGGTGGGGAGCCAAGGGGCCAGAGCCGG
CGAAGCAGCTTTGGGATATCTTGTATGAGCGTCTGACGGTGCACC
ATGGTTTGGATAATTTGATTTGGGTGTGGAATTCGATTTTGGAGGA
TTGGTATCCGGGTGATGATACGGTTGATATCTTGTCGGCCGATGTG
TATGCGCAGGGTAATGGGCCCATGTCGACTCAGTACAATGAGTTG
ATCGCCCTCGGCAGGGACAAGAAGATGATTGCTGCTGCAGAGGTT
GGCGCTGCCCCTTTGCCCGGCTTGTTGCAGGCTTACCAGGCCAACT
GGCTGTGGTTTGCTGTCTGGGGTGATGACTTTATCAGCAACCCCA
GCTGGAACACGGTTGCTGTTCTCAACGAGATCTACAACAGCGACT
ATGTGTTGACGCTGGATGAGATTCAGGGGTGGAGGAGT
Un polynucléotide de l'invention est de préférence une séquence isolée et/ou purifiée.
L'invention a encore pour objet un vecteur comprenant un polynucléotide de l'invention.
Le terme « vecteur » (ou encore « plasmide » ou « vecteur d'expression ») fait référence à une molécule d'acide nucléique dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étrangers, pour ensuite les introduire, les maintenir voire les exprimer dans une cellule hôte.
Un polynucléotide de l'invention peut être introduit dans n'importe quel vecteur approprié pour son expression, tel qu'un plasmide, un cosmide, un épisome, un chromosome artificiel, un phage ou un vecteur viral.
Le choix des vecteurs utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides tels que JMP61, pPICZaA, pPICZaB , pPICZaC ...
De préférence, un vecteur mis en œuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de réplication assurant l'initiation de la réplication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte. Il comprend également les éléments nécessaires à l'expression d'un polynucléotide de l'invention, tels qu'un promoteur et un terminateur. Des exemples de promoteur utilisables selon l'invention comprennent, mais ne sont pas limités aux promoteurs POX2, AOX (alcohol oxidasé).
II peut en outre comprendre un ou plusieurs gène(s) de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées par ledit vecteur (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...). Il peut aussi comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide, séquences d'intégration dans le génome cellulaire).
Le vecteur de l'invention peut éventuellement être associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité du vecteur. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art. A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides notamment cationiques, de liposomes, de protéines nucléaires ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc.) et des lipides neutres (DOPE).
La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant un vecteur ou un polynucléotide de l'invention.
Aux fins de la présente invention, une telle cellule est constituée par toute cellule transférable par un polynucléotide ou un vecteur de l'invention tels que décrits ci- avant.
Les systèmes d'expression bactériens peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Des exemples de cellules hôtes bactériennes comprennent notamment des bactéries des genres Escherichia (par exemple Escherichia coli), Pseudomonas (par exemple Pseudomonas fluorescens ou Pseudomonas stutzerei), Proteus (par exemple Proteus mirabilis), Ralstonia (par exemple Ralstonia eutrophd), Streptomyces, Staphylococcus (par exemple Streptomyces carnosus), Lactococcus (par exemple Lactoccocus lactis), ou Bacillus (par exemple Bacillus subtilis, Bacillus megaterium ou Bacillus licheniformis), etc.
Les cellules de levures sont aussi des cellules hôtes pouvant convenir dans le cadre de l'invention. Des exemples de cellules hôtes de levure pouvant utilisées comprennent, mais ne sont pas limités à, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Klyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha ou Pichia pastoris.
Les systèmes d'expression fongiques sont aussi envisageables dans le cadre de la présente invention, tels que Aspergillus niger, Chrysosporium lucknowense, Aspergillus (par exemple Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, etc.), Podospora anserina ou Trichoderma reesei.
D'autres systèmes d'expression tels que les systèmes d'expression mammifères peuvent encore être utilisés dans le cadre de l'invention, par exemple les lignées cellulaires NSO, CHO, BHK, les systèmes transgéniques d'origine mammifère, mais aussi les cellules d'insectes ou les systèmes d'expression viraux tels que les bactériophages M13, T7 ou λ ou encore les systèmes d'expression Baculovirus.
De préférence, la cellule hôte de l'invention est choisie parmi Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris.
Le polynucléotide compris dans le vecteur et/ou la cellule hôte de l'invention peut de manière optionnelle être associé à une séquence codant pour un peptide signal (aussi appelée séquence signal), permettant la sécrétion des mannanases mutées de l'invention dans l'espace extracellulaire et ainsi une détection et une purification simplifiées de celles-ci dans le surnageant de culture des cellules hôtes.
Les séquences promotrices et signal utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent être modifiées et améliorées par des techniques d'optimisation des séquences bien connues de l'homme du métier. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un polypeptide de l'invention, ledit procédé comprenant les étapes de :
(i) production et amplification d'un fragment d'acide nucléique comprenant un polynucléotide de l'invention,
(ii) insertion dudit fragment d'acide nucléique obtenu à l'étape (i) dans un vecteur d'expression comprenant un promoteur, de manière à permettre l'expression dudit fragment d'acide nucléique sous le contrôle dudit promoteur,
(iii) introduction du vecteur d'expression obtenu à l'étape (ii) dans une cellule hôte,
(iv) mise en culture de la cellule hôte obtenue à l'étape (iii),
(v) récupération du polypeptide de l'invention.
Il est aisé pour un homme du métier de produire un fragment d'acide nucléique comprenant un polynucléotide de l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le fragment d'acide nucléique de l'étape (i) comprend un polynucléotide associé à une séquence signal. De préférence, la séquence signal est fusionnée au polynucléotide de l'invention en amont de celle-ci.
Des exemples de séquences signal comprennent, mais ne sont pas limités à la séquence du peptide de sécrétion preprolip2 (Bordes et al., 2007, J Microbiol Meth., 70, 493), la séquence de sécrétion du pré-pro-facteur a de S. cerevisiae (Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol. 54(3):277-86) ou encore la séquence signal des protéines natives.
Les méthodes d'amplification d'un fragment d'acide nucléique sont bien connues de l'homme du métier, et comprennent notamment la réaction en chaîne par polymérase ou PCR (Polymérase Chain Reaction).
Un exemple de paires d'amorces utilisable pour l'amplification d'un polypeptide de l'invention dérivé de la mannanase Man5A est fourni par les séquences SEQ ID NO :20-21 ; un exemple de paires d'amorces utilisable pour l'amplification d'un polypeptide de l'invention dérivé de la mannanase Man26A est fourni par les séquences SEQ ID NO :22-23. 2
Les techniques d'insertion d'un fragment d'acide nucléique dans un vecteur d'expression sont bien connues de l'homme du métier.
Ladite séquence est insérée dans le vecteur de manière à être liée de manière opérationnelle au promoteur présent dans le vecteur, cela permettant l'expression de ladite séquence nucléique sous le contrôle dudit promoteur.
Généralement, l'expression « lié de manière opérationnelle » signifie que le promoteur est positionné par rapport au fragment d'acide nucléique inséré de manière à ce que la transcription puisse commencer. Cela signifie que le promoteur est positionné en amont dudit fragment d'acide nucléique, à une distance permettant l'expression de ce dernier.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend un gène de sélection.
Des exemples de gènes de sélection comprennent, mais ne sont pas limités au gène de résistance de la zéocine et au gène d'auxotrophie à l'histidine
De préférence, le vecteur d'expression utilisé à l'étape (ii) est JMP61, pPICZaA, ou pPICZaC.
L'étape (iii) d'introduction du vecteur dans la cellule hôte est réalisée par des techniques de transformation bien connues de l'homme du métier, telles que F électrolocation, la transfection, la lipofection, la transfection chimique, la transformation par l'acétate de lithium, la transformation par biolistique, la transformation par PEG, la fusion de protoplaste, la transformation par liposome, la transformation par Agrobacterium tumefaciens, les transformations virales ou adénovirales ou encore la transduction.
De préférence, la cellule hôte de l'étape (iii) est Pichia pastoris ou Yarrowia lipolytica.
Dans le cas où la cellule hôte est Pichia pastoris, le vecteur de l'étape (ii) est de préférence pPICZaA, ou pPICZaC. Dans le cas où la cellule hôte est Yarrowia lipolytica, le vecteur de l'étape (ii) est de préférence JMP61. Dans le cas où le vecteur comprend un gène de sélection, le procédé de production de l'invention peut comprendre une étape supplémentaire (iv') de sélection des cellules ayant intégré le vecteur d'expression à l'étape (iii), pour augmenter le rendement de production d'un polypeptide de l'invention. Ce type de sélection est réalisé par des techniques bien connues de l'homme du métier.
La récupération du polypeptide de l'invention est faite à partir du milieu de culture de l'étape (iv) et réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Si le fragment d'acide nucléique de l'étape (i) comprend le polynucléotide de l'invention associé à une séquence signal, la récupération pourra se faire directement dans le sécrétome des cellules hôtes présent dans le milieu de culture obtenu à l'étape (iv).
Si le fragment d'acide nucléique de l'étape (i) ne comprend pas de séquence signal, il sera nécessaire de lyser les cellules et de récupérer le polypeptide de l'invention par exemple dans le surnageant du milieu de culture après centrifugation de celui-ci.
L'invention concerne une composition comprenant au moins un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur ou une cellule hôte de l'invention.
Selon l'invention, ladite composition peut comprendre un ou plusieurs polypeptide(s) de l'invention (ou un polynucléotide, un vecteur ou une cellule hôte de l'invention).
Ladite composition peut aussi comprendre, de manière optionnelle, une ou plusieurs mannanase(s) native(s) (ou au moins un ou plusieurs polynucléotide(s), vecteur(s) ou une cellule(s) hôte(s) associé(s)) de Podospora anserina, telle que, par exemple, les mannanases natives Man5A et Man26A.
Ladite composition peut encore comprendre, de manière optionnelle, une ou plusieurs mannanase(s) (ou au moins un ou plusieurs polynucléotide(s), vecteur(s) ou une cellule(s) hôte(s) associé(s)), natives ou mutées, de n'importe quelle espèce.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition comprend éventuellement une ou plusieurs autre(s) hydrolase(s) (ou polynucléotides, vecteurs ou une cellules hôtes associés), la ou lesdites autre(s) hydrolase(s) étant utile(s) à la dégradation de la biomasse lignocellulosique, telles que des endoglucanases, des exoglucanases, des polysaccharides mono-oxygénases, des β-glucosidases, des cellobiose déshydrogénases, des xylanases, des arabinofuranosidases, des galactosidases, des arabinanases, des carbohydrates estérases, des glucuronidases, des méthyl glucuronoyl estérases, des acétyl estérases, des pectinases.
Dans un mode de réalisation plus particulier de l'invention, ladite composition comprend un cocktail enzymatique de cellulases de Trichoderma reesei.
Dans un mode de réalisation préféré, le cocktail enzymatique de cellulases de Trichoderma reesei correspond au sécrétome dudit champignon Trichoderma reesei.
Le terme « sécrétome » fait référence à la totalité des protéines libérées par une cellule, un tissu ou un organisme. Les méthodes pour récupérer le sécrétome d'une cellule, et notamment les méthodes d'obtention d'un cocktail de cellulases de Trichoderma reesei sont bien connues de l'homme du métier. De tels cocktails de cellulases de Trichoderma reesei sont par ailleurs disponibles commercialement, tels que les cocktails enzymatiques suivants : GC220 (GENENCOR), MULTIFECT GC (GENENCOR), Accellerase (Danisco), Cellic C-Tec (NOVOZYME), ou encore CELLUCLAST 1.5L (NOVOZYME).
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition comprend en outre un cocktail enzymatique de cellulases de Trichoderma reesei, et un cocktail enzymatique de Pycnoporus cinnabarinus, comprenant une cellobiose deshydrogénase (CDH) ou une cellobiose deshydrogénase de Pycnoporus cinnabarinus (ou un polynucléotide, vecteur ou une cellule hôte associé).
Dans un mode de réalisation préféré, ladite composition comprend un cocktail enzymatique de cellulases de Trichoderma reesei et au moins un polypeptide de l'invention, à une concentration d'au plus 10 mg de polypeptide par gramme de matériel à hydrolyser, préférentiellement 10 μg de polypeptide par gramme de matériel à hydrolyser.
La présente demande de brevet vise aussi à couvrir les diverses utilisations possibles d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention. Les mannanases sont des enzymes aujourd'hui utilisées dans des domaines industriels très variés tels que l'industrie du papier et de la cellulose, l'industrie agricole et alimentaire, l'extraction du café, le forage pétrolier ou encore l'industrie du détergent.
Ainsi, un objet de l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour la dégradation des composés comprenant des mannanes.
Un mannane est un polyoside composé de monomères de mannose. Le terme « mannane » est ici utilisé au sens large, et englobe les sucres complexes et dérivés comprenant des polymères de mannose. Notamment, le terme englobe les mannanes simples (polymères uniquement constitués de mannose), galactomannanes, les glucomannanes et les galactoglucomannanes.
Les mannanes sont présents dans de nombreux composés végétaux, tels que les fruits et certaines algues. Ils sont également abondant dans certains graines et noix (« ivory nut », gomme de caroube, gomme tara, gomme guar, gomme de fenurec). Ils constituent notamment un composant important de la biomasse, notamment la biomasse lignocellulosique tel que les bois tendres (gymnospermes), les bois de résineux (pin, épicéa) et en quantité non négligeables dans les bois durs.
Dans le domaine de l'énergie, et plus particulièrement des bioénergies, le terme de biomasse désigne l'ensemble des matières organiques d'origine végétale (algues incluses), animale ou fongique pouvant devenir source d'énergie, par exemple par combustion, après méthanisation (biogaz) ou après de nouvelles transformations chimiques (agrocarburant). Un de ses constituants principaux est la biomasse lignocellulosique.
Le terme « biomasse lignocellulosique » fait référence à un matériau dérivé de plantes ou d'autres organismes dans lequel le contenu en carbohydrate est substantiellement de la lignocellulose constitué de cellulose, d'hémicellulose et de la lignine (à hauteur d'au moins 5%). Elle est constituée par exemple de bois et résidus verts, de paille, briquettes de paille, de bagasse de canne à sucre, ou encore de fourrage. La biomasse lignocellulosique inclut notamment des matériaux traités, comme le papier ayant plus de 5% de lignine, mais aussi les matières premières naturelles, comme les déchets agricoles. Un mélange d'eau et/ou d'autres agents et solvants comprenant de la ,
biomasse lignocellulosique comme principal composant solide peut aussi être considéré comme de la biomasse lignocellulosique en tant que telle.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la biomasse lignocellulosique est sélectionnée parmi le groupe comprenant des résidus agricoles herbacés, des résidus de sylviculture, des déchets solides municipaux, les déchets de type papier, la pulpe et des résidus de papeterie, ou une combinaison quelconque de cela.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la biomasse lignocellulosique selon l'invention est choisie dans un groupe comprenant les tiges et rafles de maïs, la paille par exemple de riz, blé, seigle, avoine, orge, lavandin, la bagasse, le miscanthus, les herbes, le bambou, la jacinthe d'eau, le bois consistant de bois dur par exemple l'eucalyptus, le peuplier en taillis, le bois consistant de bois tendre par exemple l'acacia, la pulpe de bois tendre...
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour le prétraitement de la biomasse lignocellulosique à dégrader.
Par « prétraitement », on entend une manipulation de la biomasse lignocellulosique qui rend ses composants cellulosiques plus accessibles aux enzymes convertissant les polymères de carbohydrates en sucres fermentables.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant un polypeptide de l'invention (ou un polynucléotide, un vecteur ou une cellule hôte de l'invention) et un cocktail enzymatique de cellulases Trichoderma reesei pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique et/ou pour le prétraitement de la biomasse lignocellulosique à dégrader.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ladite composition peut en outre comprendre d'autres mannanases natives ou mutées, de Podospora anserina ou d'autres espèces, et d'autres enzymes utiles à la dégradation de la biomasse lignocellulosique. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour la production de biocarburants.
En effet, les composants de la biomasse lignocellulosique constituent des substrats convenables pour la production de biocarburants. Les polypeptides de l'invention sont utilisés pour convertir la biomasse lignocellulosique, les produits ainsi obtenus pouvant être utilisés comme biocarburants (par exemple du bioéthanol, biobutanol) ou comme composants moléculaires de tels carburants (par exemple l'acide 3-hydroxy propionique, l'acide aspartique, le xylitol et l'acide gluconique).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour la stimulation de puits de pétrole et de gaz par fracturation hydraulique.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour la production de mannose ou de manno- oligosaccharides à partir de composés végétaux contenant des mannanes.
Des exemples de tels composés comprennent, mais ne sont pas limités à, le noyau de palmier à huile, les noix de coco, le coprah, le konjac, la gomme de caroube, la gomme de guar, le soja...
Le mannose est en effet une ressource relativement rare dotée de propriétés bénéfiques et utilisé dans la nourriture, les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les textiles et dans la manufacture de polymères. Il peut notamment être utilisé comme matière première pour la production de mannitol.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour la production de mannitol.
De nombreuses utilisations sont envisageables dans l'industrie alimentaire et agricole.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention comme complément alimentaire.
En effet, les mannanases promeuvent la dégradation des composants alimentaires contenant des mannanes, libérant ainsi des oligomannoses connus comme ayant des propriétés bénéfiques pour la santé humaine et animale, et aident à la digestion en dégradant des polymères difficilement dégradés par les organismes ; ils sont notamment utiles à l'organisme en tant que prébiotiques.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention dans le traitement de composés alimentaires.
En effet, l'application de mannanases aux ananas, citrons, oranges, pamplemousses avant de les presser permet une amélioration de la récupération des jus de ces fruits.
Par ailleurs, les mannanases peuvent aussi être utilisées dans le cadre de l'extraction de l'huile de palme : leur application sur des tourteaux de noyaux de palmier à huile, après une première extraction par pression, permet une amélioration du rendement, mais aussi l'obtention de tourteaux de noyaux de palmier à huile de meilleure qualité (car ils contiennent moins de fibres de galactomannanes, composants anti-nutritifs dans l'alimentation animale).
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour l'extraction de l'huile de palme.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour l'extraction du café.
L'utilisation de mannanases dans l'extraction de café permet l'hydrolyse des galactomannanes présents dans les extraits liquides de café, permettant ainsi de diminuer la viscosité de ces extraits liquides et de diminuer la consommation d'enzymes et d'énergie au cours de l'extraction.
Par ailleurs, dans le cadre de l'extraction du café, les déchets peuvent être utilisés pour la production de mannose tels de décrit ci-avant. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention comme ingrédient de cuisson.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour le blanchiment de la pâte à papier.
Un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur, une cellule hôte et/ou une composition de l'invention peut être utilisée seul(e), ou en association avec une ou plusieurs autres mannanase(s) (polypeptide(s), polynucléotide(s), vecteur(s), cellule hôte(s) et/ou composition(s) associé(s)), natives ou mutées, avec des xylanases, des endoglucanases, des α-galactosidases, des cellobiohydrolases...
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour le désencollage et le blanchissement des fibres textiles. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention dans des compositions détergentes.
Selon l'invention, un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur, une cellule hôte et/ou une composition de l'invention peut être utilisée seul(e), ou en association avec d'autres mannanases, natives ou mutées, des amylases, cellulases, lipases, pectinases, protéases et endoglucanases.
Les mannanases montrent aussi des propriétés d'intérêt pour l'industrie pharmaceutique.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention pour l'élimination de biofilms.
Pour l'élimination de biofilms, un polypeptide (un polynucléotide, un vecteur, une cellule hôte ou une composition) de l'invention peut être utilisée seul(e), ou en association avec des détergents, d'autres mannanases, natives ou mutées, d'à- galactosidases, pectinases, xylanases, arabinoxylanases, protéases, bêta-glucanases, cellulases, galactanases, endoglucanases, xylosidases, cutinases et lipases.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention dans des systèmes de distribution ciblée ou à libération contrôlée dans le temps.
De tels systèmes sont très utilisés dans l'industrie du médicament pour l'administration de principes actifs jusqu'à un organe donné et/ou pendant une durée définie. Ils sont réalisés à l'aide des systèmes basés sur les gels de mannopolymères qui contiennent et transportent la matière.
La fonction d'une mannanase dans un tel système est la sortie contrôlée de la matière par la dégradation partielle ou complète du gel, en raison d'un changement spécifique de l'environnement du gel, par exemple le pH et/ou la température, qui active les mannanases. Les mannanases montrent aussi des applications dans les procédés de fermentation alcoolique et/ou de production d'alcool.
Ainsi, un autre objet de l'invention est relatif à une méthode de production d'un produit de fermentation à partir de la biomasse lignocellulosique, ladite méthode comprenant les étapes de :
(i) Liquéfaction de la biomasse lignocellulosique par utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention, dans le but d'obtenir un produit liquéfié ayant une masse sèche d'au moins 20%,
(ii) Saccharification dudit produit liquéfié obtenu à l'étape (i) avec un cocktail enzymatique,
(iii) Fermentation du produit de saccharification obtenu à l'étape (ii) par utilisation d'un microorganisme fermentant.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le cocktail enzymatique utilisé à l'étape (ii) est une composition de l'invention, comprenant notamment (a) un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur et/ou une cellule hôte et (b), de manière optionnelle, un cocktail de cellulases de Trichoderma reesei.
Un autre objet de l'invention est relatif à une méthode de production d'acide gluconique, d'acide xylonique et/ou d'acide xylobionique, ou d'accroissement de la d'acide gluconique, d'acide xylonique et/ou d'acide xylobionique, à partir de la biomasse lignocellulosique, ladite méthode comprenant les étapes de :
(i) Liquéfaction de la biomasse lignocellulosique par utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention, dans le but d'obtenir un produit liquéfié ayant une masse sèche d'au moins 20%,
(ii) Saccharification dudit produit liquéfié obtenu à l'étape (i) avec un cocktail enzymatique.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le cocktail enzymatique utilisé à l'étape (ii) est une composition de l'invention, comprenant notamment (a) un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur et/ou une cellule hôte et (b), de manière optionnelle, un cocktail de cellulases de Trichoderma reesei.
Un autre objet de l'invention est relatif à une méthode d'accroissement de la production de sucres à partir de la biomasse lignocellulosique, ladite méthode comprenant les étapes de :
(i) Liquéfaction de la biomasse lignocellulosique par utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur, d'une cellule hôte et/ou d'une composition de l'invention, dans le but d'obtenir un produit liquéfié ayant une masse sèche d'au moins 20%,
(ii) Saccharification dudit produit liquéfié obtenu à l'étape (i) avec un cocktail enzymatique.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le cocktail enzymatique utilisé à l'étape (ii) est une composition de l'invention, comprenant notamment (a) un polypeptide, un polynucléotide, un vecteur et/ou une cellule hôte et (b), de manière optionnelle, un cocktail de cellulases de Trichoderma reesei.
EXEMPLES D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, sans pour autant que ceux-ci ne constituent une quelconque limitation de l'invention.
Les inventeurs ont développé des mutants des protéines Man5A et Man26A de Podospora anserina, et ont étudié leur activité, cherchant à accroître l'efficacité de ces enzymes, notamment pour augmenter l'efficacité des cocktails enzymatiques utilisés pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique.
Production des enzymes natives
Ainsi, les deux gènes codant pour les protéines Man5A (séquence nucléique définie par SEQ ID NO :2) et Man26A (séquence nucléique définie par SEQ ID NO : 12) de Podospora anserina ont chacun été amplifiés avec les amorces définies par les séquence SEQ ID NO :20-21 et 22-23 respectivement, insérés dans le vecteur d'expression JMP61, associés à un peptide de sécrétion de preprolip2 (Bordes et al., 2007, J Microbiol Meth., 70, 493) et placés sous le contrôle du promoteur inductible par acide oléique POX2. Les cellules de levure de Yarrowia lipolytica ont été transformées avec les vecteurs obtenus (JMP61-Man5A et JMP61-Man26A). Les transformants positifs ont été sélectionnés sur des plaques comprenant du galactomannane. Ils étaient capables de produire des enzymes Man5A et Man26A fonctionnelles, à un niveau de 10.4 +/- 0.2 et 11.2 +/- 0.6 U.mL-1 in vitro.
Les activités moyennes obtenues après répétition des expérimentations étaient de 1.78 +/- 0.138 et 1.24 +/- 0.152 U.mL"1 de culture pour Man5A et Man26A respectivement.
Production de mutants
Les chercheurs ont alors développé des mutants, puis étudié leur activité.
Quatre mutants ont été développés pour Man5A :
• le mutant G311S, défini par la séquence protéique SEQ ID NO :4, et codé par la séquence SEQ ID NO :15,
• le mutant K139R/Y223H, défini par la séquence protéique SEQ ID NO :6, et codé par la séquence SEQ ID NO : 16, • le mutant V256L/G276V/Q316H, défini par la séquence SEQ ID NO :8, et codé par la séquence nucléique SEQ ID NO : 17, et
• le mutant W36R/I195T/V256A, défini par la séquence SEQ ID NO :10, et codé par la séquence nucléique SEQ ID NO :18.
Un unique mutant a été développé à partir de Man26A :
• le mutant P140L D416G, défini par la séquence SEQ ID NO :14, et codé par la séquence nucléique SEQ ID NO :19.
Etude de l'activité des souches de Yarrowia lipolytica exprimant ces mutants
La souche exprimant le mutant P140L/D416G de Man26A a montré une augmentation de l'activité sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane de 147% comparé à une souche exprimant la Man26 de Podospora anserina native.
Sur la même réaction, les souches exprimant les mutants de Man5A ont montré une augmentation de l'activité de 46, 9, 20 et 1 1% respectivement pour les mutants V256L/G276V/Q316H, W36R/I195T/V256A, K139R/Y223H, G311S comparé à une souche de Yarrowia lipolytica exprimant la protéine Man5 A de Podospora anserina native.
Les inventeurs ont alors voulu évaluer plus précisément l'intérêt de ces mutants d'un point de vue enzymatique, notamment pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique. Ils ont donc étudié le profil d'hydrolyse du galactomannane pour chacun d'eux.
Production des mutants dans le système d'expression Pichia pastoris
Les mutants ont été produits dans le système d'expression Pichia pastoris, pour l'obtention de niveaux d'expression supérieurs à ceux obtenus dans le système d'expression Yarrowia lipolytica.
Les gènes codant pour les protéines natives Man5A et Man26A de Podospora anserina et les mutants développés ont chacun été amplifiés avec les amorces définies par les séquences SEQ ID NO :20-23 (amorces définies par les séquences SEQ ID NO :20-21 pour Man5A et ses mutants, amorces définies par les séquences SEQ ID NO :22-23 pour Man26A et son mutant), insérés dans le vecteur d'expression pPICZaA, associés à la séquence de sécrétion du pré-pro-facteur a de Saccharomyces cerevisiae (Kjeldsen, 2000, Appl Microbiol Biotechnol. 54(3):277-86) et à la séquence C-terminale (His)6tag, placés sous le contrôle du promoteur AOX ( lcohol oxidase). Le vecteur d'expression utilisé comprenait un gène de résistance à la zéocine. Les cellules de Pichia pastoris ont été transformées avec les vecteurs obtenus
(pPICZaA-Man5A, pPICZaA-Man26A, pPICZaA"-Man5A-G311 S, pPICZaA-Man5A- 139R/Y223H, pPICZaA-Man5A-V256L/G276V/Q316H, pPICZaA~Man5A W36R/I195T/V256A, pPICZaA-Man26A-P140L/D416G). Les transformants positifs ont été sélectionnés de par leur résistance à la zéocine. Tous les mutants ont été produits avec succès dans le système d'expression Pichia pastoris à environ lg/L de milieu de culture et purifiés grâce à la séquence C-terminale (His)6tag.
Caractérisation cinétique des mutants
Pour chaque mutant, la capacité d'hydrolyse du galactomannane a été évaluée. La détermination des paramètres cinétiques de chaque enzyme, native ou mutée, sur la réaction d'hydrolyse du galactomannane a été réalisée grâce au test d'activité DNS : 1 μg de chaque enzyme, native ou mutée, a été mélangée à 190 μg de galactomannane et incubée à 40°C pendant 5 minutes. La réaction a été stoppée par addition de 300 iL de DNS et les échantillons ont été placés pendant 10 minutes à 95°C. La densité optique DO540 a été mesurée relativement au standard du mannose de 0 à 20 mM. Une unité d'activité mannanase (endo-pi,4-mannanase) a été définie comme étant la quantité de protéine nécessaire à la libération d' 1 μιηοΐ de monomère de sucre par minute.
Les paramètres cinétiques ont été estimés par analyse de régression non-linéaire pondérée, à l'aide du programme GRAFIT. Les constantes Kcat, KM, et l'efficacité catalytique ont été mesurées pour chaque enzyme, native ou mutée.
Les résultats sont résumés dans le Tableau 1 : Efficacité catalytique
Enzyme testée Kcat/KM Augmentation de l'efficacité catalytique
(mg^.m '.min 1)
Man26A native
1398 -
P140L/D416G
1838 +31%
Man5A native
145 -
V256L/G276V/Q316H
191 + 31%
W36R/I195T/V256A
259 + 78%
K139R/Y223H
247 + 70%
G311S
1187 Multipliée par un facteur 8
Tableau 1 : Augmentation de l'efficacité catalytique de chaque mutant par rapport à son enzyme native.
Au vu des valeurs apparentes de K , tous les mutants ont montré une affinité apparente améliorée pour le galactomannane. Tous les mutants affichent une efficacité catalytique améliorée d'au moins 30% par rapport à l'enzyme native. Le mutant G31 1 S de Man5A montre lui une activité étonnante, augmentée d'un facteur 8 par rapport à l'enzyme native.

Claims

REVENDICATIONS
Un polypeptide ayant une séquence dérivée d'une mannanase native du champignon filamenteux ascomycète coprophile Podospora anserina, et étant caractérisée par une efficacité catalytique augmentée d'au moins 25% par rapport à l'efficacité catalytique de cette mannanase native.
Un polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est dérivé de la mannanase Man5A ou Man26A de Podospora anserina définies respectivement par les séquences protéiques SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :11.
Un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il est défini par une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO :3- 10 ou 13-14 ou les séquences SEQ ID NO :3-10 et 13-14 diffèrent d'au moins un acide aminé des séquences SEQ ID NO :1 et 11.
Un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1-3.
Un polynucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est défini par une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO :15-19.
Un vecteur comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 et 5.
Une cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 6 ou un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 et 5.
Une composition comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1-3, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, un vecteur selon la revendication 6 ou une cellule hôte selon la revendication 7.
Une composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre d'autres hydrolases, telles que des mannanases, des endoglucanases, des exoglucanases, des β-glucosidases ou des xylanases.
10. Une composition selon l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'elle comprend un cocktail enzymatique de cellulases de Trichoderma reesei.
1 1. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1- 3, d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, d'un vecteur selon la revendication 6, d'une cellule hôte selon la revendication 7 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour la dégradation des composés comprenant des mannanes.
12. Utilisation selon la revendication 11, pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique.
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