EP2959008A1 - Hocheffiziente herstellung von blutglucose-teststreifen - Google Patents

Hocheffiziente herstellung von blutglucose-teststreifen

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EP2959008A1
EP2959008A1 EP14705543.8A EP14705543A EP2959008A1 EP 2959008 A1 EP2959008 A1 EP 2959008A1 EP 14705543 A EP14705543 A EP 14705543A EP 2959008 A1 EP2959008 A1 EP 2959008A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
batch
diagnostic
detection reagent
coenzyme
chemical detection
Prior art date
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Ceased
Application number
EP14705543.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Claudia Gaessler-Dietsche
Hans-Peter Haar
Carina HORN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diabetes Care GmbH
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG, Roche Diagnostics GmbH filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Priority to EP14705543.8A priority Critical patent/EP2959008A1/de
Publication of EP2959008A1 publication Critical patent/EP2959008A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for the production of diagnostic elements, a diagnostic product comprising a stable chemical detection reagent, and the use of this stable chemical detection reagent.
  • Diagnostic elements are important components of clinically relevant analysis methods.
  • analytes e.g. Metabolites or substrates in the foreground, which are determined directly or indirectly, for example, using an enzyme specific for the analyte.
  • the analytes are here reacted with the aid of an enzyme-coenzyme complex and then quantified using suitable means.
  • the analyte to be determined is brought into contact with a suitable enzyme and a coenzyme, the enzyme usually being used in catalytic amounts.
  • the coenzyme is physicochemically altered by the enzymatic reaction, e.g. oxidized or reduced, and detects the process, for example, electrochemical or photometric.
  • a calibration provides a direct correlation between the measured value and the concentration of the analyte to be determined.
  • the error results are based primarily on the fact that the substances used in such diagnostic elements, in particular enzymes, coenzymes or / and mediators, generally sensitive to moisture, heat and / or light and are inactivated over time. This has u.a. As a result, during the manufacturing process certain service lives of a test chemical prepared in aqueous solution must not be exceeded and the test chemical applied to a suitable carrier can not be stored for an excessively long time before the next processing step.
  • test chemistry To accommodate these limitations dictated by test chemistry, the size of batches of a test chemistry used to make diagnostic elements is usually limited. In this way it can be ensured that a single batch of the test chemistry is substantially homogeneous and that the substances contained in the test chemistry furthermore have a sufficiently high activity for the subsequent detection of an analyte to be determined even after their processing into a diagnostic element.
  • the object underlying the invention was thus to a To provide methods for the production of diagnostic elements, in which the disadvantages of the prior art are at least partially eliminated.
  • the method should enable the provision of large and homogeneous batches of test chemistry to be used, ensure high homogeneity of sequentially produced batches of diagnostic elements, allow the use of a single batch coding for a large number of diagnostic elements, and, moreover, the possibility of encoding individual diagnostic elements Offer.
  • the second diagnostic elements are each provided with the batch coding produced in step (d) before the separation of the coated second carrier.
  • a chemical detection reagent comprising a combination of a coenzyme-dependent enzyme and an artificial coenzyme greatly simplifies the preparation, testing, packaging and handling of diagnostic elements due to its high stability to moisture, heat and light. Furthermore, the use of such a chemical detection reagent results in time and financial advantages, which are of paramount importance in the large-scale production of diagnostic test elements.
  • the first step of the method of the invention requires the provision of a batch of a chemical detection reagent which i.a. a coenzyme-dependent enzyme, such as a flavin, nicotinamide or pyrroloquinoline quinone-dependent oxidoreductase.
  • a coenzyme-dependent enzyme such as a flavin, nicotinamide or pyrroloquinoline quinone-dependent oxidoreductase.
  • the method according to the invention provides for the use of a flavin, nicotinamide or pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenase, with nicotinamide-dependent dehydrogenases, in particular NAD (P) / NAD (P) H-dependent
  • a coenzyme-dependent enzyme is preferably a dehydrogenase selected from the group consisting of alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2), L-amino acid dehydrogenase (EC 1.4.1.5), glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47 ), Glucose-6-phosphate
  • Dehydrogenase (EC 1.1.1.49), glycerol dehydrogenase (EC1 .1.6), 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.30), lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28), malate dehydrogenase ( EC 1.1.1.37), glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3, EC 1.4.1.4) and sorbitol dehydrogenase. More preferred is the enzyme glucose dehydrogenase (E.C. 1.1.1.47), glucose-6-phosphate
  • mutated coenzyme-dependent enzyme designate a genetically modified variant of a native coenzyme-dependent enzyme (wild-type enzyme), which has the same number of amino acids the wild-type enzyme has altered amino acid sequence, that is different in at least one amino acid from the wild-type enzyme.
  • wild-type enzyme a native coenzyme-dependent enzyme
  • the mutant preferably has an increased thermal or / and hydrolytic stability compared with the wild-type enzyme.
  • the mutant coenzyme-dependent enzyme can be obtained by mutation of a native coenzyme-dependent enzyme derived from any biological source, the term "biological source” for the purposes of this invention encompassing both prokaryotes and eukaryotes site-specific or non-site-specific, preferably site-specific using recombinant methods known in the art, wherein at least one amino acid exchange results within the amino acid sequence of the native enzyme.
  • the coenzyme-dependent enzyme used is a mutated glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47) or a mutated glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49).
  • mutated glucose dehydrogenases are described, inter alia, in WO 2005/045016, WO 2011/020856, Baik (Appl. Environ. Microbiol. (2005), 71, 3285) and Väsquez-Figueroa (ChemBioChem (2007), 8, 2295) , the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the coenzyme-dependent enzyme is a mutant glucose dehydrogenase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (GlucDH_E96G_E170K) or SEQ ID NO: 2 (GlucDH_E170K_K252L).
  • the chemical detection reagent used according to the invention furthermore comprises an artificial coenzyme.
  • An artificial coenzyme for the purposes of the present invention is a coenzyme chemically modified with respect to the native coenzyme, which at atmospheric pressure has a higher stability to moisture compared to native coenzyme, temperatures in particular in the range from 0 ° C. to 50 ° C., acids and bases, in particular Range of pH 4 to pH 10, and / or nucleophiles such as alcohols or amines, and thus can operate under identical environmental conditions over a longer period than the native coenzyme its effect.
  • the artificial coenzyme has a higher hydrolytic stability compared to the native coenzyme, with full hydrolytic stability being particularly preferred under test conditions.
  • the artificial coenzyme may have a reduced binding constant for the coenzyme-dependent enzyme, for example a binding constant reduced by a factor of 2 or more.
  • artificial coenzymes which can be used in the context of the process according to the invention are artificial NAD (P) / NAD (P) H compounds, ie chemical derivatives of native nicotinamide adenine dinucleotide (NAD / NADH) or native nicotinamide Adenine dinucleotide phosphate (NADP / NADPH) or the compound of formula (I)
  • the NAD (P) / NAD (P) H artificial compound preferably comprises a 3-pyridinecarbonyl or a 3-pyridinethiocarbonyl -Rest, which is linked without glycosidic bond via a linear or cyclic organic radical, in particular via a cyclic organic radical, with a phosphorus-containing radical, such as a phosphate radical.
  • the artificial coenzyme is particularly preferably selected from a compound of the general formula (II):
  • A adenine or an analog thereof
  • T each independently O, S,
  • V each independently OH or a phosphate group, or two Groups that form a cyclic phosphate group;
  • X 1 , X 2 each independently O, CH 2 , CHCH 3 , C (CH 3 ) 2 , NH, NCH 3 ,
  • Y NH, S, O, CH 2 ,
  • Z a linear or cyclic organic radical
  • Z is particularly preferably a saturated or unsaturated carbocyclic or heterocyclic five-membered ring, in particular a radical of the general formula (III),
  • R 4 each independently H, F, Cl, CH 3 ,
  • R 6 , R 6 ' each independently CH or CCH 3 .
  • the compounds of general formula (II) contain an adenine analog.
  • adenine analog refers to a chemical derivative of native adenine that exhibits the same pharmacological activity in the human body as adenine.
  • "Concrete examples of adenine analogs include, in particular, C" 8 "and N" 6 " -substituted adenine, 7- deazaadenine, 8-azaadenine, 7-deaza-8-azaadenine and formycin, wherein the 7-Deazaversionn in the 7-position with halogen, Ci -6 alkynyl, Ci -8 alkenyl or Ci-e Alkyl may be substituted.
  • the compounds contain adenosine analogues which instead of ribose contain, for example, 2-methoxydesoxyribose, 2'-fluorodeoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs, such as bicyclo, LNA and tricyclo sugars.
  • ribose contain, for example, 2-methoxydesoxyribose, 2'-fluorodeoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs, such as bicyclo, LNA and tricyclo sugars.
  • ribose contain, for example, 2-methoxydesoxyribose, 2'-fluorodeoxyribose, hexitol, altritol or polycyclic analogs, such as bicyclo, LNA and tricyclo sugars.
  • di) -phosphate oxygens isotronically for example O " by S " or BH 3 " , O by
  • the artificial coenzyme is the compound known in the literature as carbaNAD (JT Slama, Biochemistry (1988), 27, 183 and Biochemistry (1989), 28, 7688).
  • the chemical detection reagent may comprise other substances which serve for the qualitative detection or / and the quantitative determination of analytes, such as a mediator and / or an optical indicator.
  • mediator refers to a chemical compound which increases the reactivity of the reduced coenzyme obtained by reaction with the analyte and allows for the transfer of electrons to a suitable optical indicator or optical indicator system
  • mediators include in particular azo compounds, nitrosoanilines, quinones and phenazines.
  • any substance which is reducible and undergoes a visually and / or machine-detectable change in its optical properties can be used as the optical indicator.
  • Preferred optical indicators for the purposes of the present invention include reducible heteropolyacids, in particular 2,18-phosphomolybdic acid.
  • quinones such as resazurin, dichlorophenolindophenol or / and tetrazolium salts, can be used as optical indicators.
  • a first part of this charge is applied to a first carrier, such as a film or an injection molded part, and then dried, thereby coating the first carrier with the first batch of chemical detection reagent , While both this step and subsequent processing steps using conventional test chemistry which is sensitive to moisture, heat and / or light may only take a short time, it can be achieved by the use of a combination of coenzyme-dependent enzyme and artificial coenzyme and thereby achieved long-term stability of the test chemistry can be dispensed with an immediate further processing of the complete batch of the chemical detection reagent, which brings significant production advantages.
  • a single batch of the chemical detection reagent can also coat a larger number of supports, ultimately allowing the generation of a larger batch of diagnostic elements which is also more homogeneous than a single batch of diagnostic elements comprising conventional test chemistry.
  • the chemical detection reagent described above has the advantage that multiple batches of diagnostic elements can be generated by means of a single batch, which are then homogeneous with each other. In this way, it is ensured that even with a large batch of the chemical detection reagent, the first diagnostic elements produced therefrom and the last are identical or merely vary within narrow limits. In contrast, when using conventional test chemistry, small batches of diagnostic test elements have to be produced so that the dispersion of the reactivity of the chemical detection reagent, which deteriorates due to environmental influences, still remains within the permissible range.
  • the coated first carrier is separated by means of suitable techniques into a plurality of first diagnostic elements (preliminary batch) and, using at least one of the first diagnostic elements, a batch coding is generated for the complete batch of the chemical detection reagent.
  • the batch coding produced in this context preferably contains a mathematical equation which indicates the optionally temperature-dependent relationship between the respective amount of an analyte to be determined and the resulting signal, which can be measured optically or electrochemically, for example.
  • any code which appears appropriate to the person skilled in the art for the coding of diagnostic elements and which allows reliable traceability of the diagnostic elements provided with the code can be used as batch coding.
  • an optically and / or electronically readable code is used as batch coding, such as a barcode or an RFID transponder.
  • a barcode which can be provided in one or two dimensions, can be configured in black-and-white, in grayscale or in color and, if desired, can comprise a hologram.
  • the method according to the invention provides for the coating of a second carrier, in particular a film or an injection-molded part, with a second part of the batch of the chemical detection reagent.
  • a coated second support is obtained, from which, by subsequent singulation, a plurality of second diagnostic elements are obtained, which can be subjected to review as necessary and suitably packaged after passing quality control.
  • the coding of the second diagnostic elements takes place according to the invention before the separation of the coated second carrier.
  • the second diagnostic elements are each provided individually with the batch coding based on the preliminary batch (ie with the first diagnostic elements), preferably by applying the batch coding to the second carrier before coating the second carrier with the second part of the batch chemical detection reagent is realized.
  • This has considerable financial and production advantages, since a single batch coding is sufficient to encode an amount of diagnostic elements increased by a factor of 2, preferably by a factor of 3, particularly preferably by a factor of 5, as in the case of conventional test chemistry.
  • the method according to the invention makes it possible to code each individual diagnostic element by targeted application of the batch coding to the second carrier, which is generally not possible when using conventional test chemistry.
  • the preparation of batch coding usually requires the preparation of a pre-batch.
  • the subsequent coding of diagnostic elements with the batch coding obtained in this case must be carried out in an earlier production step, and in in any case prior to separation of the respective carrier to the diagnostic elements, to be economically justifiable and technically feasible.
  • coding individual diagnostic elements By realizable according to the invention coding individual diagnostic elements, the use of ROM keys or the input of code numbers by the consumer is dispensable.
  • the advantage of encoding individual diagnostic elements over the encoding of an entire magazine e.g., a can of test strips
  • an inappropriate code e.g., with an earlier batch of the diagnostic element
  • a batch of the chemical detection reagent need not be further processed immediately after its preparation in order to avoid a change in its chemical and / or physical properties. Rather, the inventive method allows that between the first Providing a batch of the chemical detection reagent and its complete processing into diagnostic elements can be from several hours to several weeks, offering both temporal and production advantages.
  • a period of at least 36 hours, preferably at least 48 lies between the provision of the charge of the chemical detection reagent and the subsequent coating of the second carrier with the second part of the batch of chemical detection reagent hours.
  • a period of at least 20 days, preferably of at least 30 days lies between the coating of the second carrier with the second part of the batch of the chemical detection reagent and the separation of the coated second carrier into a plurality of second diagnostic elements ,
  • the period between the provision of the batch of the chemical detection reagent and the coating of the second support, or / and between the coating of the second support and its separation into a plurality of second diagnostic elements is preferably selected such that the batch of the chemical detection reagent is substantially free Changes in their chemical and / or physical properties and thus enables the production of diagnostic elements, which ensure a determination of analytes within the legally permissible limits.
  • substantially no change in chemical and / or physical properties in this context means a decrease in the activity of the coenzyme-dependent enzyme or a decrease in the content of artificial coenzyme in the chemical detection reagent of less than 40%, preferably less than 30%, and most preferably less than 20%, based on the activity of the coenzyme dependent enzyme and based on the content of artificial coenzyme in the chemical detection reagent immediately after its production.
  • the first diagnostic elements and second diagnostic elements generated by means of the method according to the invention can be identical or different, but are preferably of the same design.
  • the diagnostic elements may, in principle, have any physical form known to those skilled in the art, which is suitable for determining the presence and / or amount of an analyte in a sample, and each comprise at least one test field, which are brought into contact with a sample containing the analyte can and with the aid of suitable ittel a qualitative or / and quantitative determination of the analyte allows.
  • first diagnostic elements and / or second diagnostic elements include, in particular, test strips, test tapes and test discs from which diagnostic elements based thereon, such as test strip magazines and tape magazines, can be made, if necessary.
  • Suitable test strip magazines include in particular blister magazines, Leporellomagazine, disc magazines, staple magazines, drum magazines and turning magazines, which u.a. in EP 0 951 939, EP 1 022 565, EP 1 736 772, WO 2005/104948 and WO 2010/094427.
  • Tape magazines are u.a. from DE 10 2005 013 685, EP 1 739 432 and WO 2004/047642. The disclosure of the above publications is hereby incorporated by reference.
  • the first diagnostic elements and / or the second diagnostic elements each comprise a plurality of test fields, preferably at least 10 individual test fields, more preferably at least 25 individual test fields, and most preferably at least 50 individual ones Test fields.
  • the individual test fields are each arranged at a distance of a few millimeters to a few centimeters, for example at a distance of ⁇ 2.5 cm, from each other.
  • each of the test fields of the first diagnostic elements and / or the second diagnostic elements is at least partially surrounded by a hydrophobic edge or / and is stored in its own, substantially closed chamber.
  • a hydrophobic edge is particularly advantageous in cases in which a consumer has to apply a sample of the analyte to be determined manually to a test field of the respective diagnostic element and an overflow of the sample to adjacent test fields or an entry of the sample into a for measuring the diagnostic element required device is to be avoided.
  • Diagnostic elements in which each test field is stored in its own, essentially closed chamber are used, for example, in fully automatic measuring systems.
  • Such measuring systems have several test fields, e.g. can be arranged annularly side by side on a rotatable plate, as well as many trained to scrape skin needle elements in magazinierter form.
  • no manual application of the sample to a test field has to be made by the consumer (this is done automatically by the system), the individual test fields must be in separate compartments for reasons of hygiene.
  • substantially closed chamber in this context means that the chamber walls can be permeable to air and / or water, but do not allow the entry of dust particles into the chamber and thus ensure a dust-free storage of the test fields.
  • test fields of a diagnostic element conventional test chemistry, which has a low stability to moisture, heat and / or light, so must the test fields at least partially surrounding hydrophobic edge or the enclosing the test fields chambers must be prepared in a complicated and technically complex process.
  • the chemical detection reagent used according to the invention is stable to, inter alia, light, and in particular UV light
  • the diagnostic elements described in the present application may also comprise photocurable or UV-curable materials.
  • the method according to the invention provides in a preferred variant that the hydrophobic edge at least partially surrounding the test fields of a diagnostic element and / or the chamber walls of the chambers enclosing the individual test fields are formed from a UV-curable material.
  • UV-curable materials which may be used in this context are known to those skilled in the art and include i.a. Epoxy and acrylate adhesives, but are not limited to these.
  • the method according to the invention additionally comprises a check of the thickness and / or the homogeneity of the layer of the chemical detection reagent on the second diagnostic elements.
  • diagnostic elements which are coated with a chemical detection reagent used according to the invention also have a high stability to moisture. Accordingly, diagnostic elements which have been produced by means of the method according to the invention and subsequently packaged are preferably not subjected to a water vapor tightness test, whereby the entire production process can be accelerated and the production costs can be reduced.
  • the diagnostic elements produced by the method according to the invention can be used for the qualitative and / or quantitative determination of any biological or chemical substance which can be detected optically or electrochemically.
  • the analyte is selected from the group consisting of malic acid, alcohol, ascorbic acid, cholesterol, glucose, glycerol, urea, 3-hydroxybutyrate, lactic acid, pyruvate and triglycerides, with glucose being particularly preferred.
  • the analyte to be determined may be from any source, but is preferably in a body fluid, including, but not limited to, whole blood, plasma, serum, lymph, bile, cerebrospinal fluid, extracellular tissue fluid, urine, and glandular secretions such as saliva or sweat, contain.
  • a body fluid including, but not limited to, whole blood, plasma, serum, lymph, bile, cerebrospinal fluid, extracellular tissue fluid, urine, and glandular secretions such as saliva or sweat, contain.
  • the presence or / and the amount of an analyte in a sample selected from the group consisting of whole blood, plasma and serum is preferably determined by means of the detection reagent according to the invention.
  • the invention relates to a diagnostic product comprising (a) at least one diagnostic element, and (b) optionally at least one needle element for scoring skin.
  • the diagnostic element in turn comprises (i) a carrier, (ii) a chemical detection reagent comprising a coenzyme-dependent enzyme and an artificial co
  • the diagnostic product according to the invention in addition to the chemical detection reagent further comprises a needle element for scoring skin, which preferably consists of a sterilizable material, such as metal or plastic.
  • the needle element preferably comprises a capillary channel, by means of which a sufficient amount of the sample for the determination of the analyte and taken by taking capillary forces on a test field of the diagnostic element can be applied.
  • diagnostic element including the preferred variants for carrier, chemical detection reagent and batch coding
  • the invention features the use of a chemical detection reagent comprising a coenzyme-dependent enzyme and an artificial coenzyme to increase batch size and / or batch homogeneity in the production of diagnostic elements, wherein each of the individual diagnostic elements of a batch substantially are identical.
  • the batch size to a chemical detection reagent comprising a coenzyme-dependent enzyme and a native coenzyme by a factor of 2, preferably by a factor of 3, particularly preferably increased by a factor of 5.
  • Figure 1 Representation of the activity of glucose-dehydrogenase double mutant GlucDH_E96G_E170K (GlucDH-Mut2) on storage of the enzyme in the presence of carbaNAD over a period of 52 weeks at a temperature of 5 ° C and 35 ° C and a relative humidity of 0 % (Desiccant), 75% and 85% respectively.
  • FIG. 2 Representation of the content of carbaNAD (cNAD) during storage of the coenzyme in the presence of glucose dehydrogenase double mutant GlucDH_E96G_E170K over a period of 52 weeks at a temperature of 5 ° C. or 35 ° C. and a relative atmospheric humidity of 0% ( Desiccant), 75% and 85%, respectively.
  • cNAD carbaNAD
  • FIG. 3 Representation of the amino acid sequences of the glucose dehydrogenase double mutants GlucDH_E96G_E170K (GlucDH Mut1) and GlucDH_E170K_K252L (GlucDH Mut2), which were obtained by mutation of wild-type glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis.
  • FIG. 4 Representation of the stability of lactate dehydrogenase (LDH) in 2.5% NaCl-containing K / NaP 2 0 7 at pH 8.0 and a temperature of 40 ° C and 50 ° C. Shown is the stability in the presence or absence of the co-factors NAD and carbaNAD (cNAD).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Figure 5 Representation of the stability of glutamate dehydrogenase (GIDH) in 2.5% NaCl-containing K / NaP 2 0 7 at pH 8.0 and a temperature of 40 ° C and 50 ° C. Shown is the stability in the presence or absence of the co-factors NAD and carbaNAD (cNAD).
  • GIDH glutamate dehydrogenase
  • a mixture of glucose dehydrogenase double mutant GlucDH_E170K_K252L and carbaNAD was (a) at a temperature of 5 P C and a relative humidity of 0% (ie in the presence of a desiccant), (b) at a temperature of 5 ° C and a relative Humidity of 75%, (c) stored at a temperature of 35 ° C and a relative humidity of 0%, or (d) at a temperature of 35 ° C and a relative humidity of 85% over a period of 52 weeks ,
  • Lactate dehydrogenase (LDH) was dissolved in 2.5% NaCl-containing K / NaP 2 0 7 solution Temperatures of 40 ° C and 50 ° C exposed. The activity of lactate dehydrogenase was then examined at the beginning and after 3, 21 and 45 hours. The measurement was carried out in the presence and absence of the co-factors NAD and carbaNAD (cNAD).
  • FIG. 4 A graphic representation of the results of these determinations is shown in FIG. 4 of the present application.
  • Glutamate dehydrogenase (GIDH) was exposed in 2.5% NaCl-containing K / NaP 2 0 7 - solution temperatures of 40 ° C and 50 ° C. The activity of glutamate dehydrogenase was then examined at the beginning and after 3, 24 and 45 hours. The measurement was carried out in the presence and absence of the co-factors NAD and carbaNAD (cNAD). These measurements showed that the activity of the enzyme at elevated temperature of 50 ° C in the absence of a co-factor and in the presence of the co-factor NAD strongly decreases, while the stability of the glutamate dehydrogenase in the presence of the co-factor carbaNAD even after several days is still within the range of the initial value.
  • Table 2 The results are summarized in the following Table 2:
  • FIG. 5 of the present application A graphic representation of the results of these determinations is shown in FIG. 5 of the present application.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Elementen, ein diagnostisches Produkt, welches ein stabiles chemisches Nachweisreagenz umfasst, sowie die Verwendung dieses stabilen chemischen Nachweisreagenzes.

Description

Hocheffiziente Herstellung von Blutglucose-Teststreifen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Elementen, ein diagnostisches Produkt, welches ein stabiles chemisches Nachweisreagenz umfasst, sowie die Verwendung dieses stabilen chemischen Nachweisreagenzes.
Diagnostische Elemente sind wichtige Bestandteile klinisch relevanter Analyseverfahren. Hierbei steht die Messung von Analyten, z.B. Metaboliten oder Substraten, im Vordergrund, welche beispielsweise mit Hilfe eines für den Analyten spezifischen Enzyms direkt oder indirekt bestimmt werden. Die Analyten werden hierbei mit Hilfe eines Enzym-Coenzym-Komplexes umgesetzt und unter Verwendung geeigneter Mittel anschließend quantifiziert.
Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem geeigneten Enzym und einem Coenzym in Kontakt gebracht, wobei das Enzym meist in katalytischen Mengen eingesetzt wird. Das Coenzym wird durch die enzymatische Reaktion physikochemisch verändert, z.B. oxidiert bzw. reduziert, und der Vorgang beispielsweise elektrochemisch oder photometrisch erfasst. Eine Kalibrierung liefert einen direkten Zusammenhang zwischen dem Messwert und der Konzentration des zu bestimmenden Analyten.
Aus dem Stand der Technik bekannte diagnostische Elemente zeichnen sich durch eine zeitlich begrenzte Haltbarkeit sowie durch spezielle Anforderungen an die Umgebung, wie Kühlung oder trockene Lagerung, zur Erzielung dieser Haltbarkeit aus. Bei bestimmten Anwendungsformen, z.B. bei Tests, die vom Endverbraucher selbst durchgeführt werden, wie etwa beim Blutglucose-Selbstmonitoring, können daher durch eine falsche, unbemerkte Fehllagerung des Messsystems Fehlergebnisse vorkommen, welche vom Verbraucher kaum zu erkennen sind und ggf. zu einer Fehlbehandlung der jeweiligen Erkrankung führen können.
Die Fehlergebnisse beruhen in erster Linie auf der Tatsache, dass die in derartigen diagnostischen Elementen eingesetzten Substanzen, insbesondere Enzyme, Coenzyme oder/und Mediatoren, im Allgemeinen empfindlich auf Feuchtigkeit, Wärme oder/und Licht reagieren und mit der Zeit inaktiviert werden. Dies hat u.a. zur Folge, dass während des Herstellungsprozesses bestimmte Standzeiten einer in wässriger Lösung angesetzten Testchemie nicht überschritten werden dürfen und die auf einen geeigneten Träger aufgebrachte Testchemie vor dem nächsten Verarbeitungsschritt nicht übermäßig lange aufbewahrt werden kann.
Um diesen durch die Testchemie vorgegebenen Beschränkungen Rechnung zu tragen, ist die Größe der Chargen einer für die Herstellung diagnostischer Elemente verwendeten Testchemie üblicherweise begrenzt. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass eine einzelne Charge der Testchemie im wesentlichen homogen ist und die in der Testchemie enthaltenen Substanzen darüber hinaus auch nach ihrer Verarbeitung zu einem diagnostischen Element noch eine ausreichend hohe Aktivität für die nachfolgende Detektion eines zu bestimmenden Analyten besitzen.
Da jede Charge einer zur Herstellung diagnostischer Elemente verwendeten Testchemie aus Qualitätsgründen üblicherweise eine eigene Chargenkodierung erhält, ergibt sich indessen das Problem, dass eine einzelne Chargenkodierung lediglich eine geringe Menge an diagnostischen Elementen erfasst. Um eine große Anzahl an diagnostischen Elementen zu kodieren, muss folglich eine Vielzahl unterschiedlicher Chargenkodierungen erstellt werden, was mit einem erheblichen zeitlichen, technischen und finanziellen Mehraufwand verbunden ist.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Herstellung diagnostischer Elemente bereitzustellen, bei welchem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt sind. Insbesondere sollte das Verfahren die Bereitstellung großer und homogener Chargen einer zu verwendenden Testchemie ermöglichen, eine hohe Homogenität nacheinander produzierter Chargen diagnostischer Elemente gewährleisten, die Verwendung einer einzigen Chargenkodierung für eine große Anzahl an diagnostischen Elementen gestatten, und darüber hinaus die Möglichkeit der Kodierung einzelner diagnostischer Elemente bieten.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst mittels eines Verfahrens zur Herstellung von diagnostischen Elementen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Charge eines chemischen Nachweisreagenzes, umfassend ein Coenzym-abhängiges Enzym und ein artifizielles Coenzym,
(b) Beschichten eines ersten Trägers mit einem ersten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes,
(c) Vereinzeln des beschichteten ersten Trägers zu mehreren ersten diagnostischen Elementen,
(d) Erstellen einer Chargenkodierung für die Charge des chemischen Nachweisreagenzes anhand mindestens eines der ersten diagnostischen Elemente,
(e) Beschichten eines zweiten Trägers mit einem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes,
(f) Vereinzeln des beschichteten zweiten Trägers zu mehreren zweiten diagnostischen Elementen, und
(g) ggf. Überprüfen und Verpacken der zweiten diagnostischen Elemente, dadurch gekennzeichnet,
dass die zweiten diagnostischen Elemente vor dem Vereinzeln des beschichteten zweiten Trägers jeweils mit der in Schritt (d) erstellten Chargenkodierung versehen werden.
Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass ein chemisches Nachweisreagenz, welches eine Kombination aus einem Coenzym-abhängigen Enzym und einem artifiziellen Coenzym umfasst, aufgrund seiner hohen Stabilität gegenüber Feuchtigkeit, Wärme und Licht die Herstellung, Überprüfung, Verpackung und Handhabung diagnostischer Elemente erheblich vereinfacht. Weiterhin ergeben sich durch den Einsatz eine solchen chemischen Nachweisreagenzes zeitliche und finanzielle Vorteile, welche speziell bei der großindustriellen Produktion von diagnostischen Testelement eine überragende Bedeutung besitzen.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens erfordert die Bereitstellung einer Charge eines chemischen Nachweisreagenzes, welches u.a. ein Coenzym-abhängiges Enzym, wie beispielsweise eine Flavin-, Nicotinamid- oder Pyrrolochinolinchinon-abhängige Oxidoreduktase, umfasst. Vorzugsweise sieht das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung einer Flavin-, Nicotinamid- oder Pyrrolochinolinchinon- abhängigen Dehydrogenase vor, wobei Nicotinamid-abhängige Dehydrogenasen, insbesondere NAD(P)/NAD(P)H-abhängige
Dehydrogenasen, stärker bevorzugt sind.
Bevorzugt wird als Coenzym-abhängiges Enzym eine Dehydrogenase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkohol-Dehydrogenase (E.G. 1.1.1.1 ; E.C. 1.1.1.2), L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C. 1.4.1.5), Glucose-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.47), Glucose-6-phosphat-
Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.49), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1. .1.6), 3- Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.30), Lactat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.27; E.C. 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37), Glutamat-Dehydrogenase (E.C. 1.4.1.2; E.C. 1.4.1.3; E.C. 1.4.1.4) und Sorbitol-Dehydrogenase eingesetzt. Stärker bevorzugt ist das Enzym Glucose-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.47), Glucose-6-phosphat-
Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.49), Lactat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.27; E.C. 1.1.1.28) oder Glutamat-Dehydrogenase (E.C. 1.4.1.2; E.C. 1.4.1.3, E.C. 1.4.1.4). lm Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können sowohl native als auch mutierte Coenzym-abhängige Enzyme zur Anwendung gelangen. Die Begriffe„mutiertes Coenzym-abhängiges Enzym" bzw.„Mutante", wie sie in vorliegender Anmeldung verwendet werden, bezeichnen dabei jeweils eine genetisch veränderte Variante eines nativen Coenzym-abhängigen Enzyms (Wildtyp-Enzym), welche bei gleicher Anzahl an Aminosäuren eine gegenüber dem Wildtyp-Enzym veränderte Aminosäuresequenz besitzt, d.h. sich in mindestens einer Aminosäure vom Wildtyp-Enzym unterscheidet. Bevorzugt weist die Mutante eine gegenüber dem Wildtyp-Enzym erhöhte thermische oder/und hydrolytische Stabilität auf.
Das mutierte Coenzym-abhängige Enzym kann durch Mutation eines aus einer beliebigen biologischen Quelle stammenden nativen Coenzym- abhängigen Enzyms erhalten werden, wobei der Begriff„biologische Quelle" im Sinne dieser Erfindung sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten umfasst. Die Einführung der Mutation(en) kann ortsspezifisch oder nicht- ortsspezifisch, bevorzugt ortsspezifisch unter Verwendung von im Fachbereich bekannten rekombinanten Methoden, erfolgen, wobei mindestens ein Aminosäureaustausch innerhalb der Aminosäuresequenz des nativen Enzyms resultiert.
In einer besonders bevorzugten Variante der Erfindung wird als Coenzym- abhängiges Enzym eine mutierte Glucose-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.47) oder eine mutierte Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.49) verwendet. Beispiele für mutierte Glucose-Dehydrogenasen sind u.a. in WO 2005/045016, WO 2011/020856, Baik (Appl. Environ. Microbiol. (2005), 71 , 3285) und Väsquez-Figueroa (ChemBioChem (2007), 8, 2295) beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Coenzym-abhängigen Enzym um eine mutierte Glucose-Dehydrogenase, welche die in SEQ ID NO: 1 (GlucDH_E96G_E170K) oder die in SEQ ID NO: 2 (GlucDH_E170K_K252L) dargestellte Aminosäuresequenz besitzt. Neben dem Coenzym-abhängigen Enzym umfasst das erfindungsgemäß eingesetzte chemische Nachweisreagenz weiterhin ein artifizielles Coenzym. Ein artifizielles Coenzym im Sinne der vorliegenden Erfindung Ist ein gegenüber dem nativen Coenzym chemisch verändertes Coenzym, welches bei Atmosphärendruck eine im Vergleich zum nativen Coenzym höhere Stabilität gegenüber Feuchtigkeit, Temperaturen insbesondere im Bereich von 0°C bis 50°C, Säuren und Basen insbesondere im Bereich von pH 4 bis pH 10, oder/und Nukleophilen wie beispielsweise Alkoholen oder Aminen, aufweist und insofern unter identischen Umgebungsbedingungen über einen längeren Zeitraum als das native Coenzym seine Wirkung entfalten kann.
Vorzugsweise weist das artifizielle Coenzym eine im Vergleich zum nativen Coenzym höhere hydrolytische Stabilität auf, wobei eine vollständige Hydrolysestabilität unter Testbedingungen besonders bevorzugt ist. Im Vergleich zum nativen Coenzym kann das artifizielle Coenzym eine verringerte Bindungskonstante für das Coenzym-abhängige Enzym aufweisen, beispielsweise eine um den Faktor von 2 oder mehr verringerte Bindungskonstante.
Bevorzugte Beispiele für artifizielle Coenzyme, welche im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können, sind artifizielle NAD(P)/NAD(P)H-Verbindungen, d.h. chemische Derivate von nativem Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD/NADH) bzw. nativem Nikotinamid- Adenln-Dinukleotidphosphat (NADP/NADPH), oder die Verbindung der Formel (I)
Sofern es sich bei dem artifiziellen Coenzym um eine artifizielle NAD(P)/NAD(P)H-Verbindung handelt, umfasst die artifizielle NAD(P)/NAD(P)H-Verbindung vorzugsweise einen 3-Pyridincarbonyl- oder einen 3-Pyridinthiocarbonyl-Rest, welcher ohne glykosidische Bindung über einen linearen oder cyclischen organischen Rest, insbesondere über einen cyclischen organischen Rest, mit einem phosphorhaltigen Rest, wie beispielsweise einem Phosphatrest, verknüpft ist.
Besonders bevorzugt wird das artifizielle Coenzym aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) ausgewählt:
(M)
worin
A = Adenin oder ein Analogon hiervon,
T = jeweils unabhängig O, S,
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3 ", BCNHZ ",
V = jeweils unabhängig OH oder eine Phosphatgruppe, oder zwei Gruppen, die eine cyclische Phosphatgruppe bilden;
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig
H oder Ci-C2-Alkyl,
X1, X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = ein linearer oder cyclischer organischer Rest ist,
mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Verbindung verknüpft sind, oder ein Salz oder eine reduzierte Form davon.
In den Verbindungen der Formel (II) ist Z vorzugsweise ein linearer Rest mit 4-6 C-Atomen, vorzugsweise mit 4 C-Atomen, worin 1 oder 2 C-Atome gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N ersetzt sind, oder ein Rest umfassend eine cyclische Gruppe mit 5 oder 6 C-Atomen, die gegebenenfalls ein Heteroatom ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR4 2, wobei CR4 2 an die cyclische Gruppe und an X2 gebunden ist, mit R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3.
Besonders bevorzugt ist Z ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Fünfring, insbesondere ein Rest der allgemeinen Formel (III),
R5
C(R4)2^. r6/ \ r6'
\ /
R5-R5"
(III) wobei zwischen R5' und R5" eine Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, mit
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
R5 = CR4 2, R5, = O, S, NH, NC C2-Alkyl, CR4 2, CHOH, CHOCH3) und R5" = CR4 2, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R5' und R5" eine Einfachbindung vorliegt,
R5' = R5" = CR4, wenn zwischen R5' und R5" eine Doppelbindung vorliegt, und
R6, R6' = jeweils unabhängig CH oder CCH3.
In einer Ausführungsform enthalten die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) ein Adenin-Analogon. Der Begriff „Adenin-Analogon", wie er in vorliegender Anmeldung verwendet wird, bezeichnet ein chemisches Derivat von nativem Adenin, welches im menschlichen Körper die gleiche pharmakologische Wirkung entfaltet wie Adenin. Konkrete Beispiele für Adenin-Analoga umfassen insbesondere C8- und N6-substituiertes Adenin, 7- Deazaadenin, 8-Azaadenin, 7-Deaza-8-azaadenin und Formycin, wobei die 7-Deazavarianten in der 7-Position mit Halogen, Ci-6-Alkinyl, Ci-8-Alkenyl oder Ci-e-Alkyl substituiert sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Verbindungen Adenosin-Analoga, welche statt Ribose z.B. 2-Methoxydesoxyribose, 2'- Fluorodesoxyribose, Hexitol, Altritol bzw. polycyclische Analoga, wie Bicyclo-, LNA- und Tricyclo-Zucker enthalten. Insbesondere können in den Verbindungen der Formel (II) auch (Di-)-Phosphatsauerstoffe isotronisch ersetzt sein, wie z.B. O" durch S" bzw. BH3 ", O durch NH, NCH3 bzw. CHZ und =O durch =S. In den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (II) ist W vorzugsweise CONH2 oder COCH3
In den Gruppen der Formel (III) ist R5 vorzugsweise CH2. Weiterhin ist bevorzugt, dass R5' ausgewählt ist aus CH2, CHOH und NH. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind R5' und R5" jeweils CHOH. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R5' NH und R5" CH2. Am stärksten bevorzugt ist eine Verbindung der Formel (III), in welcher R4 = H ist, R5 = CH2 ist, R5' = R5" = CHOH ist, und R6 = R6' = CH ist. ln der am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem artifiziellen Coenzym um die literaturbekannte Verbindung carbaNAD (J.T. Slama, Biochemistry (1988), 27, 183 und Biochemistry (1989), 28, 7688). Andere stabile Coenzyme, welche erfindungsgemäß Anwendung finden können, sind in WO 98/33936, WO 01/49247, WO 2007/012494, US 5,801 ,006, US 11/460,366 und der Publikation Blackburn et al. (Chem. Comm. (1996), 2765), beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Sofern gewünscht, kann das chemische Nachweisreagenz neben dem Coenzym-abhängigen Enzym und dem artifiziellen Coenzym weitere Substanzen umfassen, welche dem qualitativen Nachweis oder/und der quantitativen Bestimmung von Analyten dienen, wie etwa einen Mediator oder/und einen optischen Indikator. Der Begriff „Mediator", wie er in vorliegender Anmeldung verwendet wird, bezeichnet eine chemische Verbindung, welche die Reaktivität des durch Umsetzung mit dem Analyten erhaltenen, reduzierten Coenzyms erhöht und eine Übertragung von Elektronen auf einen geeigneten optischen Indikator oder ein optisches Indikatorsystem ermöglicht. Konkrete Beispiele für Mediatoren umfassen insbesondere Azoverbindungen, Nitrosoaniline, Chinone und Phenazine.
Als optischer Indikator kann erfindungsgemäß eine beliebige Substanz zum Einsatz gelangen, welche reduzierbar ist und bei Reduktion eine visuell oder/und maschinell detektierbare Änderung ihrer optischen Eigenschaften, wie beispielsweise Farbe, Fluoreszenz, Remission, Transmission, Polarisation oder/und Brechungsindex, erfährt. Bevorzugte optische Indikatoren im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen reduzierbare Heteropolysäuren, insbesondere 2,18-Phosphormolybdänsäure. Alternativ können auch Chinone, wie beispielsweise Resazurin, Dichlorphenolindophenol oder/und Tetrazoliumsalze, als optische Indikatoren eingesetzt werden.
Nach Bereitstellen einer Charge des chemischen Nachweisreagenzes, welche vorzugsweise in flüssiger Form und besonders bevorzugt als Suspension vorliegt, wird ein erster Teil dieser Charge auf einen ersten Träger, wie beispielsweise eine Folie oder ein Spritzgussteil, aufgebracht und anschließend getrocknet, wodurch eine Beschichtung des ersten Trägers mit der ersten Charge des chemischen Nachweisreagenzes erfolgt. Während sowohl dieser Schritt als auch nachfolgende Verarbeitungsschritte bei Verwendung konventioneller Testchemie, welche gegenüber Feuchtigkeit, Wärme oder/und Licht empfindlich ist, nur kurze Zeit in Anspruch nehmen dürfen, kann durch den Einsatz einer Kombination aus Coenzym-abhängigem Enzym und artifiziellem Coenzym und die hierdurch erzielte Langzeitstabilität der Testchemie auf eine sofortige Weiterverarbeitung der kompletten Charge des chemischen Nachweisreagenzes verzichtet werden, was erhebliche produktionstechnische Vorteile mit sich bringt.
Infolge der Unempfindlichkeit des erfindungsgemäß verwendeten chemischen Nachweisreagenzes gegenüber Feuchtigkeit, Wärme und Licht lassen sich deutlich größere Chargen des chemischen Nachweisreagenzes erzeugen, ohne dass während des Produktions- bzw. Verarbeitungsprozesses umweltbedingte Verschlechterungen der Testchemie eintreten. Dementsprechend kann mit einer einzelnen Charge des chemischen Nachweisreagenzes auch eine größere Anzahl an Trägern beschichtet werden, womit letztlich die Erzeugung einer größeren Charge an diagnostischen Elementen ermöglicht wird, welche zudem homogener ist als eine einzelne Charge diagnostischer Elemente, welche konventionelle Testchemie umfasst.
Darüber hinaus hat das oben beschriebene chemische Nachweisreagenz den Vorteil, dass mittels einer einzelnen Charge mehrere Chargen an diagnostischen Elementen erzeugt werden können, welche alsdann untereinander homogen sind. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass selbst bei einer großen Charge des chemischen Nachweisreagenzes die ersten hieraus hergestellten diagnostischen Elemente und die zuletzt hergestellten diagnostischen Elementen identisch sind oder lediglich innerhalb enger Grenzen variieren. Demgegenüber müssen bei der Verwendung konventioneller Testchemie kleine Chargen an diagnostischen Testelemeneten produziert werden, damit sich die Streuung der sich durch Umwelteinflüsse verschlechternden Reaktivität des chemischen Nachweisreagenzes noch innerhalb des zulässigen Rahmens bewegt.
Im Anschluss an die Beschichtung wird der beschichtete erste Träger mittels geeigneter Techniken zu mehreren ersten diagnostischen Elementen vereinzelt (Vorbatch) und anhand mindestens eines der ersten diagnostischen Elemente eine Chargenkodierung für die komplette Charge des chemischen Nachweisreagenzes erstellt. Die in diesem Zusammenhang erstellte Chargenkodierung enthält vorzugsweise eine mathematische Gleichung, welche die gegebenenfalls temperaturabhängige Beziehung zwischen der jeweiligen Menge eines zu bestimmenden Analyten und dem hieraus resultierenden, beispielsweise optisch oder elektrochemisch messbaren Signal angibt.
Als Chargenkodierung kann grundsätzlich jeder beliebige Code verwendet werden, welcher dem Fachmann für die Kodierung diagnostischer Elemente angemessen erscheint und unter Einsatz geeigneter Mittel eine zuverlässige Rückverfolgung der mit dem Code versehenen diagnostischen Elemente erlaubt. Bevorzugt wird als Chargenkodierung ein optisch oder/und elektronisch auslesbarer Code verwendet, wie beispielsweise ein Barcode oder ein RFID-Transponder. Besonders bevorzugt gelangt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Barcode zur Anwendung, welcher ein- oder zweidimensional bereitgestellt sein kann, in Schwarzweiß, in Graustufen oder in Farbe ausgestaltet sein kann und, sofern gewünscht, ein Hologramm umfassen kann. Alternativ besteht speziell im Falle der Herstellung elektrochemisch zu detektierender Testelemente die Möglichkeit, eine Kodierung über eine elektrische Kontaktierung der einzelnen diagnostischen Elemente zu realisieren. Nach der Erstellung der Chargenkodierung sieht das erfindungsgemäße Verfahren die Beschichtung eines zweiten Trägers, insbesondere einer Folie oder eines Spritzgussteils, mit einem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes vor. Nach Aufbringen des chemischen Nachweisreagenzes auf den zweiten Träger und nachfolgende Trocknung wird ein beschichteter zweiter Träger erhalten, aus welchem durch anschließende Vereinzelung mehrere zweite diagnostische Elemente erhalten werden, die bei Bedarf einer Überprüfung unterzogen und nach Bestehen der Qualitätskontrolle in geeigneter Weise verpackt werden können.
Die Kodierung der zweiten diagnostischen Elemente erfolgt erfindungsgemäß vor dem Vereinzeln des beschichteten zweiten Trägers. Hierbei werden die zweiten diagnostischen Elemente jeweils einzeln mit der anhand des Vorbatches (d.h. mit der anhand der ersten diagnostischen Elemente) erstellten Chargenkodierung versehen, was vorzugsweise durch Aufbringen der Chargenkodierung auf den zweiten Träger vor dem Beschichten des zweiten Trägers mit dem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes realisiert wird. Dies hat erhebliche finanzielle und produktionstechnische Vorteile, da eine einzige Chargenkodierung ausreicht, um eine um den Faktor 2, bevorzugt um den Faktor 3, besonders bevorzugt um den Faktor 5 erhöhte Menge an diagnostischen Elementen zu kodieren wie bei Einsatz konventioneller Testchemie.
Gleichzeitig ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren durch gezieltes Aufbringen der Chargenkodierung auf den zweiten Träger eine Kodierung jedes einzelnen diagnostischen Elements, was bei Verwendung konventioneller Testchemie im Allgemeinen nicht möglich ist. Wie vorstehend erläutert, erfordert die Erstellung einer Chargenkodierung üblicherweise die Herstellung eines Vorbatches. Die anschließende Kodierung diagnostischer Elemente mit der hierbei erhaltenen Chargenkodierung muss jedoch in einem früheren Produktionsschritt, und in jedem Fall vor der Vereinzelung des jeweiligen Trägers zu den diagnostischen Elementen, erfolgen, um wirtschaftlich vertretbar und technisch machbar zu sein.
Allerdings erfordert die Erstellung einer Chargenkodierung anhand eines Vorbatches auch eine Unterbrechung der Produktion. Mit konventioneller Testchemie, welche eine geringe Stabilität gegenüber Feuchtigkeit, Wärme oder/und Licht aufweist, ist eine solche Unterbrechung der Produktion zur Erstellung einer Chargenkodierung indessen nicht möglich, da bei einer längeren Lagerzeit bzw. einem länger laufenden Verarbeitungsprozess Verschlechterungen der Testchemie eintreten. Die Chargenkodierung eines solchen Vorbatches würde sich folglich stark und nicht-reproduzierbar von der Chargenkodierung einer nachfolgend produzierten Charge diagnostischer Elemente unterscheiden.
Durch die erfindungsgemäß realisierbare Kodierung einzelner diagnostischer Elemente wird die Verwendung von ROM-Keys oder die Eingabe von Codenummern durch den Verbraucher verzichtbar. Der Vorteil der Kodierung einzelner diagnostischer Elemente gegenüber der Kodierung eines ganzen Magazins (z.B. einer Dose mit Teststreifen) ist vor allem bei Elementen zu sehen, bei denen der Verbraucher die Kodierung selbstständig vornehmen muss, dies aber aus Bequemlichkeit, Vergesslichkeit oder Unwissenheit unteriässt. Durch die Kodierung einzelner diagnostischer Elemente wird somit das Risiko, dass der Verbraucher eine Messung mit einem unpassenden Code (z.B. mit einer früheren Charge des diagnostischen Elements) durchführt, ausgeschlossen.
Infolge der Unempfindlichkeit des erfindungsgemäß verwendeten chemischen Nachweisreagenzes gegenüber Feuchtigkeit, Wärme und Licht muss eine Charge des chemischen Nachweisreagenzes nicht unmittelbar nach ihrer Herstellung weiterverarbeitet werden, um eine Änderung ihrer chemischen oder/und physikalischen Eigenschaften zu vermeiden. Vielmehr ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren, dass zwischen der erstmaligen Bereitstellung einer Charge des chemischen Nachweisreagenzes und ihrer vollständigen Verarbeitung zu diagnostischen Elementen ein Zeitraum von mehreren Stunden bis hin zu mehreren Wochen liegen kann, was sowohl zeitliche als auch produktionstechnische Vorteile bietet.
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt zwischen der Bereitstellung der Charge des chemischen Nachweisreagenzes und der im Anschluss an die Erstellung der Chargenkodierung erfolgenden Beschichtung des zweiten Trägers mit einem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes ein Zeitraum von mindestens 36 Stunden, bevorzugt von mindestens 48 Stunden. Darüber hinaus ist es aus produktionstechnischen Gründen bevorzugt, dass zwischen der Beschichtung des zweiten Trägers mit dem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes und der Vereinzelung des beschichteten zweiten Trägers zu mehreren zweiten diagnostischen Elementen ein Zeitraum von mindestens 20 Tagen, bevorzugt von mindestens 30 Tagen liegt.
Im einzelnen wird der Zeitraum zwischen der Bereitstellung der Charge des chemischen Nachweisreagenzes und der Beschichtung des zweiten Trägers, oder/und zwischen der Beschichtung des zweiten Trägers und dessen Vereinzelung zu mehreren zweiten diagnostischen Elementen vorzugsweise derart gewählt, dass die Charge des chemischen Nachweisreagenzes im wesentlichen keine Änderung ihrer chemischen oder/und physikalischen Eigenschaften erfährt und dementsprechend die Herstellung diagnostischer Elemente ermöglicht, welche eine Bestimmung von Analyten innerhalb des gesetzlich zulässigen Rahmens sicherstellen.
Der Ausdruck "im wesentlichen keine Änderung der chemischen oder/und physikalischen Eigenschaften" bedeutet in diesem Zusammenhang eine Abnahme der Aktivität des Coenzym-abhängigen Enzyms bzw. eine Abnahme des Gehalts an artifiziellem Coenzym in dem chemischen Nachweisreagenz von weniger als 40%, bevorzugt von weniger als 30%, und am stärksten bevorzugt von weniger als 20%, bezogen auf die Aktivität des Coenzym-abhängigen Enzyms bzw. bezogen auf den Gehalt an artifiziellem Coenzym in dem chemischen Nachweisreagenz unmittelbar nach dessen Herstellung.
Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten ersten diagnostischen Elemente und zweiten diagnostischen Elemente können gleich oder unterschiedlich ausgebildet sein, sind jedoch bevorzugt gleich ausgebildet. Die diagnostischen Elemente können prinzipiell jede dem Fachmann geläufige physikalische Form aufweisen, welche für die Bestimmung des Vorhandenseins oder/und der Menge eines Analyten in einer Probe geeignet ist, und umfassen jeweils mindestens ein Testfeld, welches mit einer den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt gebracht werden kann und unter Verwendung geeigneter ittel eine qualitative oder/und quantitative Bestimmung des Analyten ermöglicht.
Bevorzugte Beispiele für erste diagnostische Elemente oder/und zweite diagnostische Elemente umfassen insbesondere Teststreifen, Testbänder und Testdiscs, aus denen bei Bedarf hierauf basierende diagnostische Elemente, wie beispielsweise Teststreifenmagazine und Bandmagazine, hergestellt werden können. Geeignete Teststreifenmagazine umfassen insbesondere Blistermagazine, Leporellomagazine, Scheibenmagazine, Stapelmagazine, Trommelmagazine und Wendemagazine, welche u.a. in EP 0 951 939, EP 1 022 565, EP 1 736 772, WO 2005/104948 und WO 2010/094427 beschrieben sind. Bandmagazine sind u.a. aus DE 10 2005 013 685, EP 1 739 432 und WO 2004/047642 bekannt. Auf die Offenbarung vorstehender Druckschriften wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Bevorzugt umfassen die ersten diagnostischen Elemente oder/und die zweiten diagnostischen Elemente jeweils mehrere Testfelder, bevorzugt mindestens 10 einzelne Testfelder, stärker bevorzugt mindestens 25 einzelne Testfelder, und am stärksten bevorzugt mindestens 50 einzelne Testfelder. Vorzugsweise sind die einzelnen Testfelder hierbei jeweils in einem Abstand von wenigen Millimetern bis zu wenigen Zentimetern, beispielsweise in einem Abstand von < 2.5 cm, voneinander angeordnet.
Besonders bevorzugt ist jedes der Testfelder der ersten diagnostischen Elemente oder/und der zweiten diagnostischen Elemente zumindest teilweise von einem hydrophoben Rand umgeben oder/und ist in einer eigenen, im wesentlichen geschlossenen Kammer gelagert. Die Verwendung eines hydrophoben Rands ist insbesondere in Fällen von Vorteil, in welchen ein Verbraucher eine Probe des zu bestimmenden Analyten manuell auf ein Testfeld des jeweiligen diagnostischen Elements aufbringen muss und ein Überlaufen der Probe auf benachbarte Testfelder oder ein Eintritt der Probe in ein zur Vermessung des diagnostischen Elements benötigtes Gerät vermieden werden soll.
Diagnostische Elemente, in welchen jedes Testfeld in einer eigenen, im wesentlichen geschlossenen Kammer gelagert ist, finden beispielsweise bei vollautomatischen Messsystemen Anwendung. Derartige Messsysteme weisen mehrere Testfelder, die z.B. ringförmig nebeneinander auf einer drehbaren Platte angeordnet sein können, und ebenso viele, zum Anritzen von Haut ausgebildete Nadelelemente in magazinierter Form auf. Obwohl in diesen Fällen keine manuelle Aufbringung der Probe auf ein Testfeld seitens des Verbrauchers vorgenommen werden muss (dies erledigt das System automatisch), müssen sich die einzelnen Testfelder aus hygienischen Gründen in voneinander getrennten Kammern befinden. Der Ausdruck "im wesentlichen geschlossene Kammer" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Kammerwände für Luft oder/und Wasser durchlässig sein können, jedoch keinen Eintritt von Staubpartikeln in die Kammer ermöglichen und somit eine staubfreie Lagerung der Testfelder gewährleisten.
Enthalten die Testfelder eines diagnostischen Elements konventionelle Testchemie, welche eine geringe Stabilität gegenüber Feuchtigkeit, Wärme oder/und Licht aufweist, so muss der die Testfelder zumindest teilweise umgebende hydrophobe Rand bzw. müssen die die Testfelder umschließenden Kammern in einem komplizierten und technisch aufwändigen Verfahren hergestellt werden. Aufgrund der Tatsache, dass das erfindungsgemäß eingesetzte chemischen Nachweisreagenz u.a. gegenüber Licht, und insbesondere gegenüber UV-Licht, stabil ist, können die in vorliegender Anmeldung beschriebenen diagnostischen Elemente indessen auch lichthärtbare bzw. UV-härtbare Materialien umfassen.
Insofern sieht das erfindungsgemäße Verfahren in einer bevorzugten Variante vor, dass der die Testfelder eines diagnostischen Elements zumindest teilweise umgebende hydrophobe Rand oder/und die Kammerwände der die einzelnen Testfelder umschließenden Kammern aus einem UV-härtbaren Material gebildet sind. Konkrete Beispiele für UV- härtbare Materialien, welche in diesem Zusammenhang Anwendung finden können, sind dem Fachmann bekannt und umfassen u.a. Epoxid- und Acrylat-Klebstoffe, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Darüber hinaus ist es erfindungsgemäß möglich, Licht gezielt zur Generierung einer Schicht des chemischen Nachweisreagenzes auf den diagnostischen Elementen zu nutzen.
Aufgrund der Stabilität des erfindungsgemäß eingesetzten chemischen Nachweisreagenzes gegenüber Licht ergeben sich darüber hinaus signifikante Vorteile in Bezug auf die Produktion sowie eine eventuelle Qualitätskontrolle hieraus hergestellter diagnostischer Elemente. So müssen zum einen keinerlei produktionstechnisch aufwändige Maßnahmen ergriffen werden, welche einem Schutz der diagnostischen Elemente vor Licht dienen. Auf diese Weise ist es möglich, die Produktion erheblich zu vereinfachen und gleichzeitig die Produktionskosten zu verringern.
Andererseits können diagnostische Elemente, welche mit einem erfindungsgemäß eingesetzten chemischen Nachweisreagenz beschichtet sind, beispielsweise mittels optischer Methoden auf mögliche Defekte oder auf eine ungleichmäßige Verteilung der Beschichtung untersucht werden. Dementsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren in einer bevorzugten Variante zusätzlich eine Überprüfung der Dicke oder/und der Homogenität der Schicht des chemischen Nachweisreagenzes auf den zweiten diagnostischen Elementen.
Gleichzeitig weisen diagnostische Elemente, welche mit einem erfindungsgemäß eingesetzten chemischen Nachweisreagenz beschichtet sind, auch eine hohe Stabilität gegenüber Feuchtigkeit auf. Demzufolge werden diagnostische Elemente, welche mittels des erfindunsgemäßen Verfahrens hergestellt und anschließend verpackt worden sind, vorzugsweise keiner Wasserdampfdichtigkeitsprüfung unterzogen, wodurch der gesamte Fertigungsprozess beschleunigt und die Produktionskosten verringert werden können.
Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten diagnostischen Elemente können zur qualitativen oder/und quantitativen Bestimmung einer beliebigen biologischen oder chemischen Substanz verwendet werden, welche optisch oder elektrochemisch nachweisbar ist. Vorzugsweise wird der Analyt aus der Gruppe bestehend aus Äpfelsäure, Alkohol, Ascorbinsäure, Cholesterin, Glucose, Glycerin, Harnstoff, 3-Hydroxybutyrat, Milchsäure, Pyruvat und Triglyceriden ausgewählt, wobei Glucose besonders bevorzugt ist.
Der zu bestimmende Analyt kann aus einer beliebigen Quelle stammen, ist jedoch bevorzugt in einem Körperfluid, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Vollblut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, extrazelluläre Gewebeflüssigkeit, Harn, sowie Drüsensekrete wie beispielsweise Speichel oder Schweiß, enthalten. Bevorzugt wird mittels des erfindungsgemäßen Nachweisreagenzes indessen das Vorhandensein oder/und die Menge eines Analyten in einer Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma und Serum bestimmt. ln einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein diagnostisches Produkt, welches (a) mindestens ein diagnostisches Element, und (b) ggf. mindestens ein Nadelelement zum Anritzen von Haut umfasst. Das diagnostische Element umfasst seinerseits (i) einen Träger, (ii) ein chemisches Nachweisreagenz, umfassend ein Coenzym-abhängiges Enzym und ein artifizielles Coenzym, welches auf den Träger in Form einer Schicht aufgebracht ist, und (iii) eine Chargenkodierung.
In einer bevorzugten Variante umfasst das erfindungsgemäße diagnostische Produkt neben dem chemischen Nachweisreagenz weiterhin ein Nadelelement zum Anritzen von Haut, welches vorzugsweise aus einem sterilisierbaren Material, wie beispielsweise aus Metall oder Kunststoff, besteht. Um einen Transfer des zu untersuchenden Körperfluids, wie beispielsweise von Blut, auf das diagnostische Element zu ermöglichen, umfasst das Nadelelement vorzugsweise einen Kapillarkanal, mittels welchem eine zur Bestimmung des Analyten ausreichende Menge der Probe aufgenommen und unter Ausnutzung von Kapillarkräften auf ein Testfeld des diagnostischen Elements aufgebracht werden kann.
Was bevorzugte Ausführungsformen des diagnostischen Elements (inklusive der bevorzugten Varianten für Träger, chemisches Nachweisreagenz und Chargenkodierung) betrifft, so wird auf die Ausführungen in Zusammenhang mit der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines chemischen Nachweisreagenzes, umfassend ein Coenzym-abhängiges Enzym und ein artifizielles Coenzym, zur Erhöhung der Chargengröße oder/und Chargenhomogenität bei der Herstellung von diagnostischen Elementen, wobei die einzelnen diagnostischen Elemente einer Charge jeweils im wesentlichen identisch sind.
In einer bevorzugten Variante kann durch Verwendung des oben beschriebenen chemischen Nachweisreagenzes die Chargengröße gegenüber einem chemischen Nachweisreagenz, welches ein Coenzym- abhängiges Enzym und ein natives Coenzym umfasst, um den Faktor 2, bevorzugt um den Faktor 3, besonders bevorzugt um den Faktor 5 erhöht werden.
Was bevorzugte Ausführungsformen des chemischen Nachweisreagenzes sowie der diagnostischen Elemente betrifft, so wird wiederum auf die Ausführungen in Zusammenhang mit der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen.
Die Erfindung soll durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden:
Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Darstellung der Aktivität von Glucose-Dehydrogenase- Doppelmutante GlucDH_E96G_E170K (GlucDH-Mut2) bei Lagerung des Enzyms in Gegenwart von carbaNAD über einen Zeitraum von 52 Wochen bei einer Temperatur von 5°C bzw. 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% (Trockenmittel), 75% bzw. 85%.
Figur 2: Darstellung des Gehalts an carbaNAD (cNAD) bei Lagerung des Coenzyms in Gegenwart von Glucose-Dehydrogenase-Doppelmutante GlucDH_E96G_E170K über einen Zeitraum von 52 Wochen bei einer Temperatur von 5°C bzw. 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% (Trockenmittel), 75% bzw. 85%.
Figur 3: Darstellung der Aminosäuresequenzen der Glucose- Dehydrogenase-Doppelmutanten GlucDH_E96G_E170K (GlucDH-Mut1 ) und GlucDH_E170K_K252L (GlucDH-Mut2), welche durch Mutation von Wildtyp-Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis erhalten wurden.
Figur 4: Darstellung der Stabilität von Lactat-Dehydrogenase (LDH) in 2,5% NaCI-haltigen K/NaP207 bei pH 8,0 und einer Temperatur von 40°C bzw. 50°C. Gezeigt ist die Stabilität in Gegenwart oder Abwesend heit der Co- Faktoren NAD und carbaNAD (cNAD).
Figur 5: Darstellung der Stabilität von Glutamat-Dehydrogenase (GIDH) in 2,5% NaCI-haltigen K/NaP207 bei pH 8,0 und einer Temperatur von 40°C bzw. 50°C. Gezeigt ist die Stabilität in Gegenwart oder Abwesenheit der Co- Faktoren NAD und carbaNAD (cNAD).
Beispiel 1
Ein Gemisch aus Glucose-Dehydrogenase-Doppelmutante GlucDH_E170K_K252L und carbaNAD wurde (a) bei einer Temperatur von 5PC und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% (d.h. in Gegenwart eines Trockenmittels), (b) bei einer Temperatur von 5°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75%, (c) bei einer Temperatur von 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0%, bzw. (d) bei einer Temperatur von 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 85% über einen Zeitraum von jeweils 52 Wochen eingelagert.
Anschließend wurde in regelmäßigen Abständen die Aktivität der Glucose- Dehydrogenase-Doppelmutante GlucDH_E170K_K252L sowie der Gehalt an carbaNAD in dem Gemisch aus Enzym und artifiziellem Coenzym bestimmt. Eine graphische Darstellung der Ergebnisse dieser Bestimmungen ist den Figuren 1 und 2 der vorliegenden Anmeldung zu entnehmen.
Im Rahmen dieser Messungen zeigte sich, dass die Aktivität des Enzyms nach Lagerung für 52 Wochen bei einer Temperatur von 5°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% bei knapp 100% liegt. Nach Einlagerung des Gemisches bei einer Temperatur von 5°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75% wird noch eine Enzymaktivität von etwa 95%, bezogen auf den Ausgangswert, gemessen (siehe Figur 1 ). Wird das Enzym für 52 Wochen bei einer Temperatur von 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% eingelagert, beträgt die Restaktivität noch etwa 75%. Nach Einlagerung des Gemisches aus Enzym und artifiziellem Coenzym bei einer Temperatur von 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 85% wird nach 52 Wochen eine Enzymaktivität von etwa 20%, bezogen auf den Ausgangswert, beobachtet.
Was die Stabilität von carbaNAD in dem Gemisch aus Enzym und artifiziellem Coenzym betrifft, so geht aus Figur 2 hervor, dass der Gehalt an carbaNAD nach Lagerung für 52 Wochen bei einer Temperatur von 5°C sowohl bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% als auch bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75% bei knapp 100%, bezogen auf den Ausgangswert, liegt.
Selbst bei Einlagerung des Gemisches aus Enzym und artifiziellem Coenzym für 52 Wochen bei einer Temperatur von 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 0% beträgt der Gehalt an carbaNAD nach dieser Zeit etwa 100%. Wird das Gemisch bei einer Temperatur von 35°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 85% eingelagert, so ergibt sich nach 52 Wochen noch ein Coenzymgehalt von etwa 60%, bezogen auf den Ausgangswert.
Anhand dieser Daten zeigt sich, dass carbaNAD bei erhöhten Temperaturen oder/und bei erhöhter relativer Luftfeuchtigkeit über einen langen Zeitraum stabil ist. Gleichzeitig wird deutlich, dass die Glucose-Dehydrogenase- Doppelmutante GlucDHJEI 70K_K252L in Gegenwart von carbaNAD eine hohe Stabilität aufweist, was insbesondere Vorteile bei der Herstellung und Verarbeitung von diagnostischen Elementen für die Glucosebestimmung mit sich bringt.
Beispiel 2
Lactat-Dehydrogenase (LDH) wurde in 2,5% NaCI-haltiger K/NaP207-Lösung Temperaturen von 40°C bzw. 50°C ausgesetzt. Es wurde dann die Aktivität der Lactat-Dehydrogenase zu Beginn und nach 3, 21 und 45 Stunden untersucht. Die Messung wurde in Gegenwart und Abwesenheit der Co- Faktoren NAD und carbaNAD (cNAD) durchgeführt.
Im Rahmen dieser Messungen zeigte sich, dass die Aktivität des Enzyms bei erhöhter Temperatur von 50°C in Abwesenheit eines Co-Faktors und in Gegenwart des Co-Faktors NAD stark abnimmt, während die Stabilität der Lactat-Dehydrogenase in Gegenwart des Co-Faktors carbaNAD auch nach mehreren Tagen noch im Bereich des Ausgangswerts liegt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt:
Tabelle 1
Eine graphische Darstellung der Ergebnisse dieser Bestimmungen ist Figur 4 der vorliegenden Anmeldung zu entnehmen.
Beispiel 3
Glutamat-Dehydrogenase (GIDH) wurde in 2,5% NaCI-haltiger K/NaP207- Lösung Temperaturen von 40°C bzw. 50°C ausgesetzt. Es wurde dann die Aktivität der Glutamat-Dehydrogenase zu Beginn und nach 3, 24 und 45 Stunden untersucht. Die Messung wurde in Gegenwart und Abwesenheit der Co-Faktoren NAD und carbaNAD (cNAD) durchgeführt. lm Rahmen dieser Messungen zeigte sich, dass die Aktivität des Enzyms bei erhöhter Temperatur von 50°C in Abwesenheit eines Co-Faktors und in Gegenwart des Co-Faktors NAD stark abnimmt, während die Stabilität der Glutamat-Dehydrogenase in Gegenwart des Co-Faktors carbaNAD auch nach mehreren Tagen noch im Bereich des Ausgangswerts liegt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt:
Tabelle 2
Eine graphische Darstellung der Ergebnisse dieser Bestimmungen ist Figur 5 der vorliegenden Anmeldung zu entnehmen.

Claims

Ansprüche
Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Elementen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Charge eines chemischen Nachweisreagenzes, umfassend ein Coenzym-abhängiges Enzym und ein artifizielles Coenzym,
(b) Beschichten eines ersten Trägers mit einem ersten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes,
(c) Vereinzeln des beschichteten ersten Trägers zu mehreren ersten diagnostischen Elementen,
(d) Erstellen einer Chargenkodierung für die Charge des chemischen Nachweisreagenzes anhand mindestens eines der ersten diagnostischen Elemente,
(e) Beschichten eines zweiten Trägers mit einem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes,
(f) Vereinzeln des beschichteten zweiten Trägers zu mehreren zweiten diagnostischen Elementen, und
(g) ggf. Überprüfen und Verpacken der zweiten diagnostischen Elemente,
dadurch gekennzeichnet,
dass die zweiten diagnostischen Elemente vor dem Vereinzeln des beschichteten zweiten Trägers jeweils mit der in Schritt (d) erstellten Chargenkodierung versehen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass zwischen den Schritten (a) und (e) ein Zeitraum von mindestens 36 Stunden, bevorzugt von mindestens 48 Stunden liegt oder/und zwischen den Schritten (e) und (f) ein Zeitraum von mindestens 20 Tagen, bevorzugt von mindestens 30 Tagen liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Charge des chemischen Nachweisreagenzes zwischen den Schritten (a) und (e) oder/und zwischen den Schritten (e) und (f) im wesentlichen keine Änderung ihrer chemischen oder/und physikalischen Eigenschaften erfährt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Charge des chemischen Nachweisreagenzes in flüssiger Form, insbesondere als Suspension, vorliegt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass als Coenzym-abhängiges Enyzm eine NAD(P)/NAD(P)H-abhängige Dehydrogenase, insbesondere eine mutierte NAD(P)/NAD(P)H- abhängige Glucose-Dehydrogenase (EC 1.1.1.47) oder Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49), verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass als artifizielles Coenzym eine artifizielle NAD(P)/NAD(P)H- Verbindung, insbesondere carba-NAD, oder die Verbindung der Formel (I)
verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass der zweite Träger vor dem Beschichten mit dem zweiten Teil der Charge des chemischen Nachweisreagenzes mit der Chargenkodierung versehen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass als Chargenkodierung ein optisch oder/und ein elektronisch auslesbarer Code, insbesondere ein Barcode, verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass die ersten diagnostischen Elemente oder/und die zweiten diagnostischen Elemente jeweils mehrere Testfelder umfassen.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass jedes Testfeld zumindest teilweise von einem hydrophoben Rand umgeben ist oder/und in einer eigenen, im wesentlichen geschlossenen Kammer gelagert ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass der hydrophobe Rand oder/und die Kammerwände aus einem UV- härtbaren Material gebildet sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass in Schritt (g) die Dicke oder/und die Homogenität der Schicht des chemischen Nachweisreagenzes überprüft wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass es keine Überprüfung der Wasserdampfdichtigkeit der verpackten diagnostischen Elemente umfasst.
14. Diagnostisches Produkt, umfassend:
(a) mindestens ein diagnostisches Element, umfassend
(i) einen Träger,
(ii) ein chemisches Nachweisreagenz, umfassend ein Coenzym- abhängiges Enzym und ein artifizielles Coenzym, welches auf den Träger in Form einer Schicht aufgebracht ist, und
(iii) eine Chargenkodierung, und
(b) ggf. mindestens ein Nadelelement zum Anritzen von Haut.
15. Diagnostisches Produkt nach Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass das diagnostische Element mehrere Testfelder umfasst.
16. Diagnostisches Produkt nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass jedes Testfeld zumindest teilweise von einem hydrophoben Rand umgeben ist oder/und in einer eigenen, im wesentlichen geschlossenen Kammer gelagert ist.
17. Diagnostisches Produkt nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass der hydrophobe Rand oder/und Kammerwände aus einem UV- härtbaren Material gebildet sind.
18. Diagnostisches Produkt nach einem der Ansprüche 15 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass das diagnostische Element als Teststreifen, Testband, Testdisc, Bandmagazin oder Teststreifenmagazin ausgebildet ist.
19. Verwendung eines chemischen Nachweisreagenzes, umfassend ein Coenzym-abhängiges Enzym und ein artifizielles Coenzym, zur Erhöhung der Chargengröße oder/und Chargenhomogenität bei der
Herstellung von diagnostischen Elementen, wobei die einzelnen diagnostischen Elemente einer Charge jeweils im wesentlichen identisch sind. 0. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Chargengröße gegenüber einem chemischen Nachweisreagenz, welches ein Coenzym- abhängiges Enzym und ein natives Coenzym umfasst, um den Faktor 2, bevorzugt um den Faktor 3, besonders bevorzugt um den Faktor 5 erhöht ist.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102372113B1 (ko) * 2016-10-05 2022-03-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중 분석물 진단 테스트 엘리먼트들을 위한 검출 시약들 및 전극 배열들, 그리고 그것을 사용하는 방법들
CN115856278A (zh) * 2020-01-07 2023-03-28 北京九强生物技术股份有限公司 妥布霉素检测试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3539450A (en) * 1966-06-30 1970-11-10 Calbiochem Stabilization of enzymes
EP1288653A1 (de) * 2001-08-29 2003-03-05 Roche Diagnostics GmbH Biosensor mit ein Bar Code
DE102004048864A1 (de) * 2004-10-07 2006-04-13 Roche Diagnostics Gmbh Analytisches Testelement mit drahtloser Datenübertragung
US20070110615A1 (en) * 2005-07-15 2007-05-17 Neel Gary T Diagnostic strip coding system and related methods of use
EP2292751A1 (de) * 2009-08-20 2011-03-09 Roche Diagnostics GmbH Stabilisierung von Enzymen mit stabilen Coenzymen
WO2012140027A1 (de) * 2011-04-12 2012-10-18 Roche Diagnostics Gmbh Analytisches hilfsmittel

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5801006A (en) 1997-02-04 1998-09-01 Specialty Assays, Inc. Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites
CZ296644B6 (cs) 1998-04-24 2006-05-17 Roche Diagnostics Gmbh Úlozná schránka pro vyuzití v kompaktním mericím prístroji a zarízení pro ulození analytických prípravku
US6380380B1 (en) 1999-01-04 2002-04-30 Specialty Assays, Inc. Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates
DE19902601A1 (de) 1999-01-23 2000-07-27 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Entnehmen analytischer Verbrauchsmittel aus einem Vorratsbehältnis
EP1424040A1 (de) 2002-11-26 2004-06-02 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung zur Untersuchung von Körperflüssigkeiten
WO2005045016A2 (en) 2003-08-11 2005-05-19 Codexis, Inc. Improved glucose dehydrogenase polypeptides and related polynucleotides
US8591436B2 (en) 2004-04-30 2013-11-26 Roche Diagnostics Operations, Inc. Lancets for bodily fluid sampling supplied on a tape
DE102005013685A1 (de) 2005-03-18 2006-09-28 Roche Diagnostics Gmbh Bandmagazin für ein Handgerät zur Untersuchung einer Körperflüssigkeit, sowie Handgerät
EP1736772B1 (de) 2005-06-22 2016-05-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Testvorrichtung mit Testelement-Lagervorrichtung
ES2374537T3 (es) 2005-06-29 2012-02-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Sistema de análisis con tira de ensayo.
DE102005035461A1 (de) 2005-07-28 2007-02-15 Roche Diagnostics Gmbh Stabile NAD/NADH-Derivate
WO2010094427A2 (de) 2009-02-19 2010-08-26 Roche Diagnostics Gmbh Platzsparende magazinierung analytischer hilfsmittel

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3539450A (en) * 1966-06-30 1970-11-10 Calbiochem Stabilization of enzymes
EP1288653A1 (de) * 2001-08-29 2003-03-05 Roche Diagnostics GmbH Biosensor mit ein Bar Code
DE102004048864A1 (de) * 2004-10-07 2006-04-13 Roche Diagnostics Gmbh Analytisches Testelement mit drahtloser Datenübertragung
US20070110615A1 (en) * 2005-07-15 2007-05-17 Neel Gary T Diagnostic strip coding system and related methods of use
EP2292751A1 (de) * 2009-08-20 2011-03-09 Roche Diagnostics GmbH Stabilisierung von Enzymen mit stabilen Coenzymen
WO2012140027A1 (de) * 2011-04-12 2012-10-18 Roche Diagnostics Gmbh Analytisches hilfsmittel

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of WO2014128271A1 *

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Publication number Publication date
WO2014128271A1 (de) 2014-08-28
US20160010141A1 (en) 2016-01-14
EP2770064A1 (de) 2014-08-27

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