EP2909630A1 - Recombinant gra antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis - Google Patents

Recombinant gra antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis

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EP2909630A1
EP2909630A1 EP13777058.2A EP13777058A EP2909630A1 EP 2909630 A1 EP2909630 A1 EP 2909630A1 EP 13777058 A EP13777058 A EP 13777058A EP 2909630 A1 EP2909630 A1 EP 2909630A1
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EP
European Patent Office
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gra6
gra2
igg
positive
antigens
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13777058.2A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Corinne Mercier
Marie-France DELAUW
Hervé PELLOUX
Hélène FRICKER-HIDALGO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Original Assignee
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Joseph Fourier Grenoble 1, Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble filed Critical Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Publication of EP2909630A1 publication Critical patent/EP2909630A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • G01N2333/45—Toxoplasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention provides a method for early in vitro diagnosis of toxoplasmosis infection in humans, as well as a diagnostic kit.
  • Toxoplasmosis an infection caused by the protozoan parasite Toxoplasma gondii, affects at least one third of the world's human population. There is only one genus and one species of the parasite Toxoplasma gondii, but parasite isolates are currently classified into 12 haplogroups I to XII. Strains mostly found in Europe and North America are of type II. The parasite most often infects warm-blooded animals, including humans, but its definitive host is a feline.
  • toxoplasmosis The prevalence of toxoplasmosis varies from country to country; it is between 60% and 80% in certain areas of South America. In Western Europe, the prevalence of toxoplasmosis varies from 50 to 70%; it varies from 20 to 50% in Southern Europe as well as in the humid regions of Africa; it is less than 30% in the Scandinavian countries and the United Kingdom, 25 to 30% in the Central European countries and is very low in South East Asia and North America (Pappas et al. 2009).
  • CNR 201 1 Three hundred fetuses with congenital toxoplasmosis (CNR 201 1), 30 of which will develop serious sequelae, are identified each year in France.
  • T. gondii infection it is therefore important to be able to diagnose T. gondii infection early in order to put in place the appropriate treatments: combination of pyrimethamine-sulfadiazine and folic acid in patients with congenital or immunodepressed toxoplasmosis, and spiramycin in pregnant woman.
  • the current diagnosis of toxoplasmosis relies mainly on the detection, from the serum of patients, of isotype-specific antibodies G and M directed against the entire parasite.
  • the immunoglobulin M (IgM) levels which are in principle markers of a recent infection, then of serum immunoglobulin G (IgG) rise within two weeks after infection. If IgM is a sign of a recent infection (they appear in a few days, the peak is reached in 2 - 3 months and then decrease), they can persist for several months, even years, and are therefore not reliable indicators of infection. recent seroconversion.
  • IgM immunoglobulin M
  • IgG serum immunoglobulin G
  • TORCH targets pathogens that can pass the placental barrier
  • T - Toxoplasma gondii O - Other infections (Coxsackievirus, Syphilis, Varicella - Zoster Virus, HIV, Parvovirus B19), R - Rubella, C - Cytomegalovirus, H - Herpes simplex virus).
  • Toxoplasma gondii Several antigens of Toxoplasma gondii have been identified and classified into different families according to their cellular localization:
  • Antigens of the dense granules of toxoplasm GRA2, GRA3, GRA4, GRA5, GRA6, GRA7, GRA8 .
  • Rhoptries antigens secretory organelles specific to Apicomplexa
  • ROP1 secretory organelles specific to Apicomplexa
  • Abbott's patent application EP 1 082 343 describes a diagnostic composition comprising the antigens p29 (GRA7), p30 (SAG1) and p35 (GRA8), or p29 (GRA7), p35 (GRA8) and p66 (ROP1).
  • the antigens GRA2 / p28 (Mercier et al., 1993, FR 2 692 282) and GRA6 / p32 (Lecordier et al., 1993, FR 2 702 497) are antigens derived from dense granules, secreted by T. gondii and playing an essential role in intracellular parasitism. They are major components of the dense granules (secretory organelles specific to Apicomplexa) and the vacuole in which the parasite multiplies within the infected cell. These highly immunogenic proteins are good candidates for diagnostic applications.
  • the recombinant GRA2 protein purified from a bacterial production system, was tested in an ELISA test whose specificity was 96.4% and the sensitivity of 95.8% to 100% for acute infections, lower for chronic infections (Golkar ef al., 2007)
  • the recombinant GRA6 protein was tested in an ELISA test which shows much better specificity for the sera of patients with acute infection than for those with chronic infection (Golkar et al., 2008).
  • the recombinant GRA2 protein has been associated with the ROP1 antigen (P66); these two antigens are detected more frequently by the sera of patients with acute infection than by the sera of patients with chronic infection, thus allowing a distinction between the two clinical cases (Holec-Gasior et al., 2009).
  • the recombinant GRA6 protein was combined with GRA1, another dense granule antigen, in an ELISA assay. This test, designed to differentiate patients with a recent infection profile from those with chronic infection, was found to be insufficiently sensitive for this application (Ferrandiz et al., 2004).
  • the invention relates to a method for detecting the presence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said serum with a composition comprising recombinant GRA2 and GRA6 proteins. More particularly, the invention relates to a direct or indirect ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) test which allows the early detection in human serum of specific antibodies directed against the antigenic combination GRA2 and GRA6.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • the first advantage of this test is its precocity because it can detect a very recent infection in the serum of the individuals tested.
  • the second major advantage of this test is that it makes it possible to distinguish more rapidly, on serums of newborns taken at different times after birth, the presence of antibodies, which has the advantage of excluding or confirming rapidly. the diagnosis of congenital toxoplasmosis in the newborn.
  • the invention relates to a method for detecting the presence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said serum with a composition comprising recombinant GRA2 and GRA6 proteins.
  • ImmunoSorbent Assay that applies this method, allows its use to confirm recent seroconversion in pregnant women and for the diagnosis of congenital toxoplasmosis in neonates.
  • the invention relates to a method for identifying the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said pre-collected serum with antigens capable of binding with said antibodies.
  • -Toxoplasma gondii and the finding of a binding or an absence of binding of antibodies with said antigens characterized in that said antigens comprise the combination of two recombinant proteins GRA2 and GRA6.
  • An antibody is a complex protein produced and used by the immune system to specifically detect and neutralize pathogens.
  • the antibodies are glycoproteins of the immunoglobulin superfamily. They are formed of 4 polypeptide chains: 2 heavy chains and 2 light chains which are connected to each other by a variable number of disulfide bridges. These chains form a Y structure. Each light chain consists of a constant domain and a variable domain; heavy chains are composed of a variable fragment and 3 or 4 constant fragments according to the isotype. For a given antibody, the two heavy chains are identical, likewise for the two light chains.
  • Antibodies have the ability to recognize and specifically bind to an antigen, this specificity being conferred by the presence of variable domains.
  • anti-Toxoplasma gondii antibody any antibody capable of binding to an antigen derived from this parasite Toxoplasma gondii. This designation refers to polyclonal and monoclonal antibodies.
  • Pre-collected serum means any collection of human or animal blood, taken according to techniques well known to those skilled in the art, in particular by means of a syringe, and centrifuged to eliminate blood cells and coagulation factors. .
  • the serum will preferably be kept cold to limit the degradation of the proteins. Serum may also be referred to herein as the "sample”.
  • antigen designates, according to the invention, any protein derived from Toxoplasma gondii or any recombinant protein synthesized from DNA derived from Toxoplasma gondii, and capable of inducing an immune response in an infected subject.
  • An antigen generally has several different epitopes that are as many antibody binding sites.
  • binding of antibodies to said antigens refers to the interaction between an antigen and an antibody specific for that antigen and more specifically, the immune complex resulting from the combination of an immunogenic epitope of the antigen with a specifically directed antibody. against this epitope.
  • Both GRA2 and GRA6 proteins refer to proteins with high antigenic potency of Toxoplasma gondii, as previously described.
  • recombinant proteins refers to proteins produced in genetically modified cells, in particular by introduction of an expression vector carrying a gene of interest. This gene encoding a protein of interest is expressed by the producing species (bacteria, mammalian cells in culture, etc.). Preferably, the recombinant proteins will be produced in a bacterial system and in particular in Escherichia coli. After purification, they will be used to 'capture' antibodies potentially present in human or animal serum.
  • the antigens present in the method according to the invention comprise at least the recombinant proteins GRA2 and GRA6 but may also comprise other recombinant proteins such as GRA1, GRA3, GRA4, GRA5, GRA7, GRA8, etc.
  • the method is characterized in that the antigens consist of the combination of the two recombinant proteins GRA2 and GRA6 only.
  • the GRA2 and GRA6 proteins can be present in all proportions and in particular, their molar ratio GRA2 / GRA6 can be 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30 , 80/20, or 90/10. According to a preferred aspect of the invention, the molar ratio GRA2 / GRA6 is between 40/60 and 60/40. According to a preferred aspect of the invention, the molar ratio GRA2 / GRA6 is 50/50.
  • the method described above can be carried out according to all types of immunological assays known to those skilled in the art, such as radioimmunoassays which use radioactive compounds associated with antigens or enzyme immunoassays which use coupled enzymes. antigens.
  • the method for detecting the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibody in a serum also called an antibody assay method, can be carried out in solution or on a solid support.
  • the invention relates in particular to a method characterized in that the antigens are fixed on a support.
  • This support will preferably be an ELISA test plate.
  • the enzyme-linked immunosorbent assay which is an enzyme-linked enzyme immunoabsorption assay, that is to say a solid enzyme immunoassay, is conventionally used in immunology. to detect and assay an antibody or antigen in a sample.
  • This test is characterized in that the assay is coupled to an enzyme catalyzed reaction that releases a colored component followed by spectroscopy.
  • the ELISA is generally based on the use of two antibodies: one of these is specific for the antigen, while the other reacts with the immune complexes (antigen-antibody) and is coupled to an enzyme. This secondary antibody, responsible for the name of the technique, can also cause the emission of a signal by a chromogenic or fluorogenic substrate.
  • ELISA techniques are known to those skilled in the art, such as direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA or competitive ELISA.
  • the enzyme acts as an enhancer: even if few antibodies conjugated to the enzyme would be attached, the enzyme would catalyze the formation of many signals, making this test very sensitive but also increasing the number of false positives. It is therefore necessary to provide "control" wells.
  • the finding of a binding or an absence of antibody binding with said antigens comprises the application of reagents for detecting the antibodies attached to the recombinant proteins.
  • these reagents make it possible to determine the amount of antibody present in the serum.
  • the serum is from a pregnant woman.
  • the serum is from a newborn.
  • the method of the invention may be advantageously used to diagnose congenital toxoplasmosis early.
  • the term "early” indicates that the diagnosis can be made very early in the first months of life of the child.
  • the method according to the invention can also be characterized in that it is carried out in addition to another diagnostic test for toxoplasmosis.
  • this test is preferably a test of "second intention", having a very good sensitivity vis-à-vis the sera of recent infection.
  • This diagnostic test will preferably be proposed in special situations where recent seroconversion is suspected, as a complementary test to routine diagnostic tests.
  • the present invention also relates to a kit for identifying the presence or absence of aniloxoplasma gondii antibody in human or animal serum comprising:
  • Reagents for detecting antibodies that bind to recombinant proteins are provided.
  • the recombinant proteins GRA2 and GRA6 will be in a molar ratio of between 40/60 and 60/40 in this kit.
  • GRA2 21 -185) (II) denoted GRA2 (II), or
  • the recombinant proteins GRA2 and GRA6 are fused with the peptide pUET and thus purified after synthesis; for greater accuracy of the test, the absorbance values obtained with GRA2 (II), GRA6 (II) or the mixture are deduced from the absorbance value of the pUET peptide.
  • the solid support undergoes three washes with a conventional buffer PBS + 0.05% Tween 20 (PBS-T) on the scrubber.
  • PBS-T 0.05% Tween 20
  • Non-specific sites are blocked with bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 1% for one hour at 37 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • the support is washed three times in PBS-T buffer.
  • the support is washed three times in PBS-T buffer.
  • the support is washed three times in PBS-T buffer.
  • FIG. 1 Summary analysis of 259 negative sera, making it possible to determine the positivity threshold (at 2 standard deviations and 3 standard deviations) of each of the 3 GRA ELISAs, as well as the specificity of each of the 3 tests: (A) GRA (II); (B) GRA6 Nt (It; (C) GRA2 + GRA6
  • FIG. 1 Summary analysis of 253 chronic sera (infections older than 12 months: IgG-positive sera by routine but negative IgM tests) to show that GRA ELISA tests are not suitable for first-line diagnosis; (A) ELISA GRA2 + GRA6; (B) Vidas IgG.
  • Figure 6 summary table of the sensitivity of the ELISA GRA tests.
  • the number of samples found positive in the GRA ELISA test is represented in relation to the number of samples found positive in the VIDAS IgG test ("against VIDAS IgG” columns) and with respect to all two IgG tests ("columns” compared to IgG tests (VIDAS + IF) ").
  • o 253 sera diagnosed as positive for old toxoplasmosis that is, more than 12 months old (ie sera for which positive IgG levels were detected but no IgM).
  • the method according to the invention is a test whose sensitivity for sera of recent infection and the specificity are particularly good.
  • the sensitivity of a test is its ability to give a positive result when the disease (here, Toxoplasma gondii infection) is present.
  • the specificity of the test is, it, the ability of the test to give a negative result when the disease is not present.
  • Example 1 Summary analysis of 259 negatives, making it possible to determine the positivity threshold of each of the 3 GRA ELISA tests (with 2 standard deviations and with 3 standard deviations) as well as the specificity of each of the 3 tests.
  • IgG IFI (Indirect Immunofluorescence) test threshold 8 IU / ml
  • the specificity of the ELISA GRA test is calculated by dividing the number of sera found negative in the GRA ELISA test by the number of negative sera passed in the ELISA test and the whole multiplied by 100.
  • the sensitivity of the 3 GRA ELISA tests, on all the sera tested, is very variable, depending on whether one considers old infection sera (low sensitivity, 86.56% for the GRA2 + GRA6 Nt test).
  • recent seroconversions or sera from infants suspected of congenital toxoplasmosis (sensitivity greater than 100% for the GRA2 + GRA6 Nt (II) test because it detects more serum than routine tests (Cf.
  • the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA test has a very good sensitivity with respect to sera of very recent infection, which justifies proposing this diagnostic test in particular situations where recent seroconversion is suspected as a complementary test to routine diagnostic tests (see Figure 6).
  • FIGS. 2A and 2B show the analysis of 253 old infection sera, using two different tests:
  • This kit uses the "ELFA” assay principle combining the ELISA method with a final fluorescence blue reading.
  • the threshold of positivity of the kit is 4-8 IU / mL. It can detect:
  • the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA detects 86.56% of old infections whereas the Biomérieux kit detects 99.6%.
  • the dark background colors of the cells represent the absorbance values above the positivity threshold (3 ET).
  • the light colors represent the absorbance values located between the positivity threshold (2 AND) and the positivity threshold (3 AND).
  • the light colors represent the values located in the equivocal zone, when it exists.
  • the GRA2 + GRA6 Nt (II) test is therefore more sensitive and makes it possible to detect the infection earlier than the ELFA IgG VIDAS ,.
  • the GRA2 + GRA6 NT (II) test actually allows you to "recover":
  • the GRA2 + GRA6 test therefore makes it possible to identify sera judged to be "negative” in IgG by another test but that are actually "positive” for Toxoplasma gondii infection and for which the diagnosis was based solely on IgM detection. .
  • a ninth column indicates the diagnosis formulated by the practitioners, without taking into account the results obtained afterwards with the ELISA tests GRA2 (II), GRA6 Nt (II) and GRA2 + GRA6 Nt (ll).
  • the GRA2 + GRA6 Nt (II) IgG ELISA test is revealed positive even before IgM is detected.
  • patient 3 underwent four samples at 1-month intervals.
  • the test serum 1 according to the Biomerieux kit, the serum was considered negative for the presence of IgG anl ⁇ -Toxoplasma gondii.
  • the GRA2 + GRA6 Nt (II) test indicated the presence of anti-GRA IgG antibodies.
  • patient 1 underwent four samples at 1-month intervals.
  • the serum was considered negative for the presence of IgG anl ⁇ -Toxoplasma gondii.
  • the values were still below the detection threshold for the Biomérieux test, but they indicated the presence of anti-GRA IgG antibodies when using the GRA2 + GRA6 Nt (II) test.
  • the GRA2 + GRA6 Nt (II) IgG ELISA test is negative at the same time as the IgM IFI if we consider the positivity threshold at 3 ET but it remains positive at 2 ET. There is therefore a significant decrease in the amount of IgG directed against GRA2 (II) and GRA6 Nt (II).
  • the GRA2 + GRA6 NT (II) IgG ELISA is more rapidly negative than the Vidas IgA ELFA: Patients 4, 5, 8, 12, 13, 16, 20 (7/10 TC - at 3 ET and 9 / 10 to 2 ET)).
  • Patient # 8 was diagnosed positive for IgG at birth (Sample # 37) and therefore had to be followed while already negative by the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA.
  • the IgGs detected by the routine tests (VIDAS IgG and IF IgG) were thus residual IgG of the mother, passed in the child's blood during delivery. These IgG are eliminated naturally after a few weeks.
  • patient no. 12 was diagnosed positive for anti-Toxoplasma gondii IgG by routine tests up to sample # 64 whereas he was diagnosed negative from sample # 63 by the GRA2 + ELISA test.
  • GRA6 Nt (II) was diagnosed positive for anti-Toxoplasma gondii IgG by routine tests up to sample # 64 whereas he was diagnosed negative from sample # 63 by the GRA2 + ELISA test.

Abstract

The present invention relates to a method for identifying the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in a human or animal serum, including placing said previously drawn serum in contact with antigens capable of binding with said anti-Toxoplasma gondii antibodies, and the observation of a bond or of an absence of a bond of antibodies with said antigens, the method being characterized in that said antigens include the combination of two recombinant GRA2 and GRA6 proteins. In particular, the antigens are attached to a support, in particular an ELISA plate. This test is preferably carried out as a supplement to another test for diagnosing toxoplasmosis.

Description

ANTIGENES GRA RECOMBINANTS ET LEUR APPLICATION  ANTIGENES GRA RECOMBINANTS AND THEIR APPLICATION
POUR LE DIAGNOSTIC PRECOCE DE LA TOXOPLASMOSE  FOR THE EARLY DIAGNOSIS OF TOXOPLASMOSIS
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention concerne une méthode pour diagnostiquer in vitro de façon précoce une infection par la toxoplasmose chez l'humain, ainsi qu'un kit de diagnostic.  The present invention provides a method for early in vitro diagnosis of toxoplasmosis infection in humans, as well as a diagnostic kit.
INTRODUCTION INTRODUCTION
La toxoplasmose, infection causée par le protozoaire parasite Toxoplasma gondii, affecte au moins un tiers de la population humaine mondiale. Il n'existe qu'un seul genre et une seule espèce du parasite Toxoplasma gondii, mais les isolats parasitaires sont classés actuellement en 12 haplogroupes I à XII. Les souches rencontrées majoritairement en Europe et en Amérique du Nord sont de type II. Le parasite infecte le plus souvent des animaux à sang chaud, y compris l'être humain, mais son hôte définitif est un félidé. Toxoplasmosis, an infection caused by the protozoan parasite Toxoplasma gondii, affects at least one third of the world's human population. There is only one genus and one species of the parasite Toxoplasma gondii, but parasite isolates are currently classified into 12 haplogroups I to XII. Strains mostly found in Europe and North America are of type II. The parasite most often infects warm-blooded animals, including humans, but its definitive host is a feline.
La prévalence de la toxoplasmose varie d'un pays à l'autre ; elle est comprise entre 60% et 80% dans certaines régions d'Amérique du Sud. En Europe de l'Ouest, la prévalence de la toxoplasmose varie de 50 à 70% ; elle varie de 20 à 50% en Europe du Sud ainsi que dans les régions humides de l'Afrique ; elle est de moins de 30% dans les pays Scandinaves et au Royaume-Uni, de 25 à 30% dans les pays d'Europe Centrale et elle est très faible en Asie du Sud Est et en Amérique du Nord (Pappas et al., 2009).  The prevalence of toxoplasmosis varies from country to country; it is between 60% and 80% in certain areas of South America. In Western Europe, the prevalence of toxoplasmosis varies from 50 to 70%; it varies from 20 to 50% in Southern Europe as well as in the humid regions of Africa; it is less than 30% in the Scandinavian countries and the United Kingdom, 25 to 30% in the Central European countries and is very low in South East Asia and North America (Pappas et al. 2009).
En France, on estime que 40 à 50 % de la population adulte est infectée (source : Haute Autorité de Santé, 2009 ; Centre National de Référence de la Toxoplasmose (CNR)), généralement sans symptôme apparent, et qu'il y a de 200 000 à 300 000 nouvelles infections chaque année, dont 27 000 cas chez les femmes enceintes. Trois cents fœtus présentant une toxoplasmose congénitale (CNR 201 1 ), dont 30 développeront des séquelles graves, sont identifiés chaque année en France.  In France, it is estimated that 40 to 50% of the adult population is infected (source: Haute Autorité de Santé, 2009, National Toxoplasmosis Reference Center (CNR)), generally without any apparent symptoms, and that there is 200,000 to 300,000 new infections each year, including 27,000 cases in pregnant women. Three hundred fetuses with congenital toxoplasmosis (CNR 201 1), 30 of which will develop serious sequelae, are identified each year in France.
Aux USA, la prévalence serait de 1 1 % chez les femmes enceintes nées aux USA et de 28,1 % chez celles nées hors limites des frontières (Jones et al., 2007). Dans ce pays, 1 enfant sur 10 000 est atteint de toxoplasmose congénitale (Brown et al., 2009 ; Lopez et al., 2000) et la toxoplasmose oculaire est responsable de 17% des cas d'uvéites et de 25% des cas d'uvéites postérieures. Si l'infection des sujets immunocompétents par des souches de type II est généralement bénigne, elle peut s'avérer dramatique chez les sujets immuno-déficients ou lorsque le système immunitaire n'est pas encore fonctionnel (atteintes congénitales). Chez l'enfant atteint de toxoplasmose congénitale, les atteintes sont principalement cérébrales et oculaires (hydrocéphalie, calcifications intracrâniennes, convulsions, retard mental, choriorétinite). De plus, l'infection de sujets, même immunocompétents, par des souches atypiques peut être mortelle. Enfin, l'inflammation cérébrale temporaire qui se produit lors de l'infection par T. gondii a récemment été corrélée de façon positive à un ensemble de désordres neuropsychiatriques, parmi lesquels la schizophrénie (Yolken et al., 2009 ; Pedersen et al., 201 1 ), les troubles bi-polaires, les maladies neuro-dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (Kusbeci et al., 2011 ) et la maladie de Parkinson (Miman et al., 2010). In the USA, the prevalence is 1% among pregnant women born in the USA and 28.1% among those born outside borders (Jones et al., 2007). In this country, 1 in 10,000 children have congenital toxoplasmosis (Brown et al., 2009, Lopez et al., 2000) and ocular toxoplasmosis is responsible for 17% of uveitis cases and 25% of cases of posterior uveitis. If infection of immunocompetent individuals with type II strains is usually benign, it can be dramatic in immuno-deficient individuals or when the immune system is not yet functional (congenital disorders). In children with congenital toxoplasmosis, the attacks are mainly cerebral and ocular (hydrocephalus, intracranial calcifications, convulsions, mental retardation, chorioretinitis). In addition, infection of even immunocompetent individuals with atypical strains can be fatal. Finally, the temporary brain inflammation that occurs during T. gondii infection has recently been positively correlated with a range of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia (Yolken et al., 2009, Pedersen et al. 201 1), bipolar disorders, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (Kusbeci et al., 2011) and Parkinson's disease (Miman et al., 2010).
Il est donc important de pouvoir diagnostiquer précocement l'infection par T. gondii afin de mettre en place les traitements adéquats : combinaison de pyriméthamine-sulfadiazine et d'acide folique chez les patients atteints de toxoplasmose congénitale ou immuno-déprimés, et spiramycine chez la femme enceinte.  It is therefore important to be able to diagnose T. gondii infection early in order to put in place the appropriate treatments: combination of pyrimethamine-sulfadiazine and folic acid in patients with congenital or immunodepressed toxoplasmosis, and spiramycin in pregnant woman.
ETAT DE LA TECHNIQUE STATE OF THE ART
Le diagnostic actuel de la toxoplasmose repose essentiellement sur la détection, à partir du sérum des patients, d'anticorps spécifiques d'isotypes G et M dirigés contre l'ensemble du parasite. Les taux d'immunoglobulines M (IgM), en principe marqueurs d'une infection récente, puis d'immunoglobulines G (IgG) sériques s'élèvent en effet dans les deux semaines qui suivent la contamination. Si les IgM sont le signe d'une infection récente (ils apparaissent en quelques jours, le pic est atteint en 2 - 3 mois puis ils diminuent), ils peuvent persister plusieurs mois, voire plusieurs années et ne sont donc pas des indicateurs fiables d'une séroconversion récente. De plus, chaque patient étant différent, il n'existe pas de niveau « seuil » des IgG qui permette de distinguer une infection ancienne d'une infection récente.  The current diagnosis of toxoplasmosis relies mainly on the detection, from the serum of patients, of isotype-specific antibodies G and M directed against the entire parasite. The immunoglobulin M (IgM) levels, which are in principle markers of a recent infection, then of serum immunoglobulin G (IgG) rise within two weeks after infection. If IgM is a sign of a recent infection (they appear in a few days, the peak is reached in 2 - 3 months and then decrease), they can persist for several months, even years, and are therefore not reliable indicators of infection. recent seroconversion. In addition, each patient being different, there is no "threshold" level of IgG that distinguishes an old infection from a recent infection.
La grande majorité des diagnostics est réalisée chez la femme enceinte, dans le cadre d'un diagnostic multiple nommé TORCH qui vise les agents pathogènes qui peuvent passer la barrière placentaire (T - Toxoplasma gondii, O - Other infections (Coxsackievirus, Syphilis, Varicella-Zoster Virus, HIV, Parvovirus B19), R - Rubella, C - Cytomegalovirus, H - Herpès simplex virus). Des résultats sérologiques positifs sont complétés par un test d'avidité des IgG et par la recherche de la présence du parasite par polymerase chain reaction (PCR) à partir du liquide amniotique dans le cas des femmes enceintes ou à partir de liquide céphalo-rachidien chez l'enfant (dans certains pays uniquement mais pas en France) ou les sujets immuno-déprimés suspectés d'une infection récente (Montoya and Remington, 2008). The vast majority of diagnoses are carried out in pregnant women, as part of a multiple diagnosis called TORCH which targets pathogens that can pass the placental barrier (T - Toxoplasma gondii, O - Other infections (Coxsackievirus, Syphilis, Varicella - Zoster Virus, HIV, Parvovirus B19), R - Rubella, C - Cytomegalovirus, H - Herpes simplex virus). Positive serological results are complemented by an IgG avidity test and by the search for the presence of the polymerase chain reaction (PCR) parasite from the amniotic fluid in the case of pregnant women or from liquid cerebrospinal fluid in children (in some countries only, but not in France) or immunocompromised individuals suspected of recent infection (Montoya and Remington, 2008).
La majorité des trousses commercialisées de diagnostic de la toxoplasmose utilise des lysats parasitaires (antigènes totaux) pour la détection des anticorps spécifiques. Ces kits sont sensibles, spécifiques et automatisables mais sont soumis à des variations de qualité dans le temps et ils restent onéreux, du fait du mode de préparation des antigènes soumis à l'amplification des parasites dans la cavité intra-péritonéale de souris ou dans des cellules humaines en culture. La sensibilité des tests est également variable.  The majority of commercially available diagnostic kits for toxoplasmosis use parasite lysates (total antigens) for the detection of specific antibodies. These kits are sensitive, specific and automatable but are subject to variations in quality over time and they remain expensive, because of the mode of preparation of the antigens subjected to the amplification of the parasites in the intraperitoneal cavity of mice or in human cells in culture. The sensitivity of the tests is also variable.
L'utilisation de protéines recombinantes en tant qu'antigènes pour sensibiliser des supports utilisés pour la détection des anticorps spécifiques est donc en plein développement.  The use of recombinant proteins as antigens to sensitize supports used for the detection of specific antibodies is therefore in full development.
Plusieurs antigènes de Toxoplasma gondii ont été identifiés et classés en différentes familles en fonction de leur localisation cellulaire :  Several antigens of Toxoplasma gondii have been identified and classified into different families according to their cellular localization:
Les antigènes des granules denses du toxoplasme (GRA1 , GRA2, GRA3, GRA4, GRA5, GRA6, GRA7, GRA8...)  Antigens of the dense granules of toxoplasm (GRA1, GRA2, GRA3, GRA4, GRA5, GRA6, GRA7, GRA8 ...)
- Les protéines de surface (SAG1 , SAG2, ...)  - The surface proteins (SAG1, SAG2, ...)
Les antigènes des rhoptries (organites de sécrétion propres aux Apicomplexa) tels que ROP1 ....  Rhoptries antigens (secretory organelles specific to Apicomplexa) such as ROP1 ....
Un premier type de test, Architect, basé sur la détection de la protéine majeure de surface du parasite (SAG1 ) et de la protéine de granules denses GRA8, est commercialisé par la compagnie Abbott. La demande de brevet EP 1 082 343 d'Abbott décrit une composition diagnostique comprenant les antigènes p29 (GRA7), p30 (SAG1 ) et p35 (GRA8), ou p29 (GRA7), p35 (GRA8) et p66 (ROP1 ).  A first type of test, Architect, based on the detection of the major parasite surface protein (SAG1) and the GRA8 dense granule protein, is marketed by Abbott. Abbott's patent application EP 1 082 343 describes a diagnostic composition comprising the antigens p29 (GRA7), p30 (SAG1) and p35 (GRA8), or p29 (GRA7), p35 (GRA8) and p66 (ROP1).
Les antigènes GRA2 / p28 (Mercier et al., 1993 ; FR 2 692 282) et GRA6 /p32 (Lecordier et al., 1993 ; FR 2 702 497) sont des antigènes issus des granules denses, sécrétés par T. gondii et jouant un rôle essentiel dans le parasitisme intracellulaire. Il s'agit de composants majeurs des granules denses (organites de sécrétion propres aux Apicomplexa) et de la vacuole dans laquelle le parasite se multiplie, au sein de la cellule infectée. Ces protéines, très immunogènes, sont de bons candidats pour des applications diagnostiques.  The antigens GRA2 / p28 (Mercier et al., 1993, FR 2 692 282) and GRA6 / p32 (Lecordier et al., 1993, FR 2 702 497) are antigens derived from dense granules, secreted by T. gondii and playing an essential role in intracellular parasitism. They are major components of the dense granules (secretory organelles specific to Apicomplexa) and the vacuole in which the parasite multiplies within the infected cell. These highly immunogenic proteins are good candidates for diagnostic applications.
La protéine recombinante GRA2, purifiée à partir d'un système de production bactérien, a été testée dans un test ELISA dont la spécificité était de 96.4% et la sensibilité de 95.8% à 100% pour des infections aiguës, plus faible pour des infections chroniques (Golkar ef al., 2007) La protéine recombinante GRA6 a été testée dans un test ELISA qui montre une bien meilleure spécificité pour les sérums de patients présentant une infection aiguë que pour ceux des patients présentant une infection chronique (Golkar et al., 2008). The recombinant GRA2 protein, purified from a bacterial production system, was tested in an ELISA test whose specificity was 96.4% and the sensitivity of 95.8% to 100% for acute infections, lower for chronic infections (Golkar ef al., 2007) The recombinant GRA6 protein was tested in an ELISA test which shows much better specificity for the sera of patients with acute infection than for those with chronic infection (Golkar et al., 2008).
Il a été proposé d'associer plusieurs antigènes recombinants pour augmenter la spécificité et la sensibilité des tests.  It has been proposed to combine several recombinant antigens to increase the specificity and sensitivity of the tests.
En particulier, la protéine recombinante GRA2 a été associée à l'antigène ROP1 (P66) ; ces deux antigènes sont détectés plus fréquemment par les sérums des patients présentant une infection aiguë que par les sérums des patients présentant une infection chronique, permettant ainsi une distinction entre les deux cas cliniques (Holec-Gasior et al., 2009).  In particular, the recombinant GRA2 protein has been associated with the ROP1 antigen (P66); these two antigens are detected more frequently by the sera of patients with acute infection than by the sera of patients with chronic infection, thus allowing a distinction between the two clinical cases (Holec-Gasior et al., 2009).
La protéine recombinante GRA6 a été associée à GRA1 , un autre antigène des granules denses, dans un test ELISA. Ce test, destiné à différencier des patients présentant un profil d'infection récente de ceux ayant une infection chronique, s'est avéré insuffisamment sensible pour cette application (Ferrandiz et al., 2004).  The recombinant GRA6 protein was combined with GRA1, another dense granule antigen, in an ELISA assay. This test, designed to differentiate patients with a recent infection profile from those with chronic infection, was found to be insufficiently sensitive for this application (Ferrandiz et al., 2004).
La combinaison des antigènes recombinants GRA2 et GRA6 a été utilisée dans une combinaison vaccinale mais la stimulation antigénique induite par la combinaison était décevante par rapport à celle obtenue par l'injection de la protéine GRA2 seule (Golkar et al., 2007).  The combination of the GRA2 and GRA6 recombinant antigens was used in a vaccine combination but the combination-induced antigenic stimulation was disappointing compared to that obtained by the injection of the GRA2 protein alone (Golkar et al., 2007).
Un des grands enjeux du traitement de la toxoplasmose, notamment chez la femme enceinte, est de traiter la femme le plus précocement possible après la primo infection, afin de limiter au maximum les risques de passage du parasite à travers la barrière placentaire. Ceci n'est possible que si le diagnostic est établi au plus tôt. Ainsi, la mise au point de nouveaux tests permettant de diagnostiquer précocement l'infection répond à un réel besoin du corps médical. Par ailleurs, la spécificité des tests connus doit être améliorée car ceux-ci détectent encore trop de « faux-positifs ». En particulier, lors de la détection chez les nouveau-nés, il est nécessaire de distinguer, le plus précocement possible, une réaction positive due à la simple présence des anticorps maternels acquis pendant l'accouchement, d'une réelle réaction positive liée à une toxoplasmose congénitale. EXPOSE DE L'INVENTION  One of the major issues in the treatment of toxoplasmosis, especially in pregnant women, is to treat the woman as early as possible after primary infection, in order to minimize the risk of passage of the parasite through the placental barrier. This is only possible if the diagnosis is made as soon as possible. Thus, the development of new tests to diagnose the infection early meets a real need of the medical profession. Moreover, the specificity of the known tests must be improved because they still detect too many "false positives". In particular, during detection in newborns, it is necessary to distinguish, as early as possible, a positive reaction due to the simple presence of maternal antibodies acquired during delivery, a real positive reaction linked to a congenital toxoplasmosis. SUMMARY OF THE INVENTION
L'invention concerne une méthode pour détecter la présence d'anticorps anti- Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact de ce sérum avec une composition comprenant des protéines recombinantes GRA2 et GRA6. Plus particulièrement, l'invention est relative à un test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) direct ou indirect qui permet la détection précoce dans le sérum humain, des anticorps spécifiques dirigés contre la combinaison antigénique GRA2 et GRA6. The invention relates to a method for detecting the presence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said serum with a composition comprising recombinant GRA2 and GRA6 proteins. More particularly, the invention relates to a direct or indirect ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) test which allows the early detection in human serum of specific antibodies directed against the antigenic combination GRA2 and GRA6.
La sensibilité et la spécificité de ce test permettent d'envisager son utilisation pour la confirmation d'une séroconversion récente chez la femme enceinte et pour le diagnostic d'une toxoplasmose congénitale chez les nouveau-nés.  The sensitivity and specificity of this test make it possible to consider its use for confirmation of recent seroconversion in pregnant women and for the diagnosis of congenital toxoplasmosis in newborns.
Le premier avantage de ce test est sa précocité car il permet de détecter une infection très récente dans le sérum des individus testés.  The first advantage of this test is its precocity because it can detect a very recent infection in the serum of the individuals tested.
Le deuxième avantage majeur de ce test est qu'il permet de distinguer plus rapidement, sur des sérums de nouveau-nés prélevés à différents moments après la naissance, la présence d'anticorps, ce qui a pour intérêt d'exclure ou de confirmer rapidement le diagnostic d'une toxoplasmose congénitale chez le nouveau-né.  The second major advantage of this test is that it makes it possible to distinguish more rapidly, on serums of newborns taken at different times after birth, the presence of antibodies, which has the advantage of excluding or confirming rapidly. the diagnosis of congenital toxoplasmosis in the newborn.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
L'invention concerne une méthode pour détecter la présence d'anticorps anti- Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact de ce sérum avec une composition comprenant des protéines recombinantes GRA2 et GRA6. The invention relates to a method for detecting the presence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said serum with a composition comprising recombinant GRA2 and GRA6 proteins.
La sensibilité et la spécificité de cette méthode et du test ELISA (Enzyme-Linked The sensitivity and specificity of this method and the ELISA test (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) direct ou indirect qui applique cette méthode, permet d'envisager son utilisation pour la confirmation d'une séroconversion récente chez la femme enceinte et pour le diagnostic d'une toxoplasmose congénitale chez les nouveau-nés. ImmunoSorbent Assay) that applies this method, allows its use to confirm recent seroconversion in pregnant women and for the diagnosis of congenital toxoplasmosis in neonates.
L'invention concerne un procédé pour identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti- Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact dudit sérum préalablement prélevé, avec des antigènes capables de se lier avec lesdits anticorps anl\-Toxoplasma gondii et la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes, procédé caractérisé en ce que lesdits antigènes comprennent la combinaison de deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6.  The invention relates to a method for identifying the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said pre-collected serum with antigens capable of binding with said antibodies. -Toxoplasma gondii and the finding of a binding or an absence of binding of antibodies with said antigens, characterized in that said antigens comprise the combination of two recombinant proteins GRA2 and GRA6.
Un anticorps est une protéine complexe produite et utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière spécifique. Les anticorps sont des glycoprotéines de la superfamille des immunoglobulines. Ils sont formés de 4 chaînes polypeptidiques : 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures. Ces chaînes forment une structure en Y. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant et d'un domaine variable ; les chaînes lourdes sont composées d'un fragment variable et de 3 ou 4 fragments constants selon l'isotype. Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Les anticorps ont la capacité de reconnaître et de se fixer de manière spécifique à un antigène, cette spécificité étant conférée par la présence des domaines variables. An antibody is a complex protein produced and used by the immune system to specifically detect and neutralize pathogens. The antibodies are glycoproteins of the immunoglobulin superfamily. They are formed of 4 polypeptide chains: 2 heavy chains and 2 light chains which are connected to each other by a variable number of disulfide bridges. These chains form a Y structure. Each light chain consists of a constant domain and a variable domain; heavy chains are composed of a variable fragment and 3 or 4 constant fragments according to the isotype. For a given antibody, the two heavy chains are identical, likewise for the two light chains. Antibodies have the ability to recognize and specifically bind to an antigen, this specificity being conferred by the presence of variable domains.
Par « anticorps anti- Toxoplasma gondii », on entend tout anticorps capable de se fixer à un antigène issu de ce parasite Toxoplasma gondii. Cette appellation désigne les anticorps polyclonaux et monoclonaux.  By "anti-Toxoplasma gondii antibody" is meant any antibody capable of binding to an antigen derived from this parasite Toxoplasma gondii. This designation refers to polyclonal and monoclonal antibodies.
Par « sérum préalablement prélevé », on entend tout prélèvement de sang humain ou animal, prélevé selon les techniques bien connues de l'homme du métier, notamment au moyen d'une seringue, et centrifugé pour éliminer les cellules sanguines et les facteurs de coagulation. Le sérum sera de préférence conservé au froid pour limiter la dégradation des protéines. Le sérum pourra également être désigné dans la présente demande, par le terme « échantillon ».  "Pre-collected serum" means any collection of human or animal blood, taken according to techniques well known to those skilled in the art, in particular by means of a syringe, and centrifuged to eliminate blood cells and coagulation factors. . The serum will preferably be kept cold to limit the degradation of the proteins. Serum may also be referred to herein as the "sample".
Le terme « antigène » désigne, selon l'invention, toute protéine issue de Toxoplasma gondii ou toute protéine recombinante synthétisée à partir d'ADN issu de Toxoplasma gondii, et susceptible d'induire une réponse immunitaire chez un sujet infecté. Un antigène possède généralement plusieurs épitopes différents qui sont autant de sites de liaison aux anticorps.  The term "antigen" designates, according to the invention, any protein derived from Toxoplasma gondii or any recombinant protein synthesized from DNA derived from Toxoplasma gondii, and capable of inducing an immune response in an infected subject. An antigen generally has several different epitopes that are as many antibody binding sites.
Le terme « liaison d'anticorps avec lesdits antigènes » désigne l'interaction entre un antigène et un anticorps spécifique de cet antigène et plus spécifiquement, le complexe immun résultant de la combinaison d'un épitope immunogène de l'antigène avec un anticorps dirigé spécifiquement contre cet épitope.  The term "binding of antibodies to said antigens" refers to the interaction between an antigen and an antibody specific for that antigen and more specifically, the immune complex resulting from the combination of an immunogenic epitope of the antigen with a specifically directed antibody. against this epitope.
Les deux protéines GRA2 et GRA6 font référence à des protéines à haut pouvoir antigénique de Toxoplasma gondii, telles que décrites précédemment.  Both GRA2 and GRA6 proteins refer to proteins with high antigenic potency of Toxoplasma gondii, as previously described.
Le terme « protéines recombinantes » désigne des protéines produites dans des cellules modifiées génétiquement, notamment par introduction d'un vecteur d'expression portant un gène d'intérêt. Ce gène codant pour une protéine d'intérêt est exprimé par l'espèce productrice (bactéries, cellules mammifères en culture, etc.). Préférentiellement, les protéines recombinantes seront produites dans un système bactérien et notamment, chez Escherichia coli. Après purification, elles seront utilisées pour 'capturer' les anticorps potentiellement présents dans un sérum humain ou animal.  The term "recombinant proteins" refers to proteins produced in genetically modified cells, in particular by introduction of an expression vector carrying a gene of interest. This gene encoding a protein of interest is expressed by the producing species (bacteria, mammalian cells in culture, etc.). Preferably, the recombinant proteins will be produced in a bacterial system and in particular in Escherichia coli. After purification, they will be used to 'capture' antibodies potentially present in human or animal serum.
Les antigènes présents dans le procédé selon l'invention comprennent au moins les protéines recombinantes GRA2 et GRA6 mais peuvent également comprendre d'autres protéines recombinantes telles que GRA1 , GRA3, GRA4, GRA5, GRA7, GRA8, etc. Selon un aspect préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que les antigènes consistent en la combinaison des deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6 seulement. The antigens present in the method according to the invention comprise at least the recombinant proteins GRA2 and GRA6 but may also comprise other recombinant proteins such as GRA1, GRA3, GRA4, GRA5, GRA7, GRA8, etc. According to a preferred aspect of the invention, the method is characterized in that the antigens consist of the combination of the two recombinant proteins GRA2 and GRA6 only.
Les protéines GRA2 et GRA6 peuvent être présentes en toutes proportions et notamment, leur rapport molaire GRA2/GRA6 peut être de 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, ou 90/10. Selon un aspect préféré de l'invention, le rapport molaire GRA2/GRA6 est compris entre 40/60 et 60/40. Selon un aspect préférentiel de l'invention, le rapport molaire GRA2/GRA6 est de 50/50.  The GRA2 and GRA6 proteins can be present in all proportions and in particular, their molar ratio GRA2 / GRA6 can be 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30 , 80/20, or 90/10. According to a preferred aspect of the invention, the molar ratio GRA2 / GRA6 is between 40/60 and 60/40. According to a preferred aspect of the invention, the molar ratio GRA2 / GRA6 is 50/50.
Le procédé décrit ci-dessus peut être réalisé selon tous types de dosage immunologiques connus de l'homme du métier, tels que des dosages radio-immunologiques qui utilisent des composés radioactifs associés à des antigènes ou des dosages immuno- enzymatiques qui utilisent des enzymes couplées aux antigènes.  The method described above can be carried out according to all types of immunological assays known to those skilled in the art, such as radioimmunoassays which use radioactive compounds associated with antigens or enzyme immunoassays which use coupled enzymes. antigens.
Le procédé de détection de présence ou d'absence d'anticorps anti- Toxoplasma gondii dans un sérum, aussi appelé procédé de dosage d'anticorps, peut être réalisé en solution ou sur un support solide.  The method for detecting the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibody in a serum, also called an antibody assay method, can be carried out in solution or on a solid support.
L'invention est en particulier relative à un procédé caractérisé en ce que les antigènes sont fixés sur un support. Ce support sera de manière préférentielle, une plaque de test ELISA.  The invention relates in particular to a method characterized in that the antigens are fixed on a support. This support will preferably be an ELISA test plate.
La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais « enzyme-linked immunosorbent assay », littéralement « dosage d'immunoabsorption par enzyme liée », c'est-à-dire dosage immuno-enzymatique sur support solide) est classiquement utilisée en immunologie pour détecter et doser un anticorps ou un antigène dans un échantillon. Ce test est caractérisé par le fait que le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par spectroscopie. L'ELISA est basé en général sur l'utilisation de deux anticorps : l'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène.  The enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immunosorbent assay), which is an enzyme-linked enzyme immunoabsorption assay, that is to say a solid enzyme immunoassay, is conventionally used in immunology. to detect and assay an antibody or antigen in a sample. This test is characterized in that the assay is coupled to an enzyme catalyzed reaction that releases a colored component followed by spectroscopy. The ELISA is generally based on the use of two antibodies: one of these is specific for the antigen, while the other reacts with the immune complexes (antigen-antibody) and is coupled to an enzyme. This secondary antibody, responsible for the name of the technique, can also cause the emission of a signal by a chromogenic or fluorogenic substrate.
Plusieurs techniques ELISA sont connues de l'homme du métier, telles que l'ELISA direct, l'ELISA indirect, l'ELISA en sandwich ou l'ELISA par compétition.  Several ELISA techniques are known to those skilled in the art, such as direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA or competitive ELISA.
Les étapes de l'ELISA indirect, technique la plus couramment utilisée pour déterminer la concentration en anticorps du sérum, sont :  The steps of the indirect ELISA, the most commonly used technique for determining serum antibody concentration, are:
1. l'application d'un antigène connu sur une surface, le plus souvent celle d'un puits d'une plaque de micro-titration. L'antigène est fixé à la surface, de façon à le rendre immobile ; 2. La saturation des sites non occupés par l'antigène par une protéine non spécifique, généralement l'albumine sérique bovine ; 1. the application of a known antigen on a surface, most often that of a well of a micro-titration plate. The antigen is fixed on the surface, so as to make it immobile; 2. The saturation of sites not occupied by the antigen by a non-specific protein, usually bovine serum albumin;
3. le recouvrement des puits par les échantillons de sérum à tester, dont la concentration en anticorps est, par définition, inconnue ;  3. the recovery of the wells by the serum samples to be tested, whose antibody concentration is, by definition, unknown;
4. le rinçage de la plaque, de façon à retirer les anticorps non liés. Après rinçage, seuls les complexes antigène-anticorps demeurent attachés à la surface du puits ; 4. rinsing the plate, so as to remove the unbound antibodies. After rinsing, only the antigen-antibody complexes remain attached to the surface of the well;
5. l'ajout aux puits des anticorps secondaires qui se lieront à l'anticorps primaire (il s'agit dans ce cas, d'un anticorps anti-immunoglobuline). Ces anticorps secondaires sont couplés à l'enzyme modificatrice de substrat qui permet de suivre l'évolution de la réaction ; 5. the addition to the wells of the secondary antibodies which will bind to the primary antibody (in this case, an anti-immunoglobulin antibody). These secondary antibodies are coupled to the substrate modifying enzyme which makes it possible to follow the evolution of the reaction;
6. le second rinçage de la plaque, de sorte à éliminer les anticorps non liés ;  6. the second rinse of the plate, so as to eliminate the unbound antibodies;
7. l'application d'un substrat qui, s'il est converti par l'enzyme, émet un signal chromogénique ou fluorescent ;  7. the application of a substrate which, if converted by the enzyme, emits a chromogenic or fluorescent signal;
8. la quantification du résultat par spectrophotométrie ou tout autre appareil d'optique. L'enzyme agit comme amplificateur : quand bien même peu d'anticorps conjugués à l'enzyme seraient attachés, l'enzyme catalyserait la formation de nombreux signaux, ce qui rend ce test très sensible mais augmente également le nombre de faux-positifs. Il faut donc prévoir des puits « contrôles ».  8. the quantification of the result by spectrophotometry or any other optical device. The enzyme acts as an enhancer: even if few antibodies conjugated to the enzyme would be attached, the enzyme would catalyze the formation of many signals, making this test very sensitive but also increasing the number of false positives. It is therefore necessary to provide "control" wells.
Dans le procédé selon l'invention, de manière préférée, la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes comprend l'application de réactifs permettant de détecter les anticorps fixés aux protéines recombinantes. En particulier, ces réactifs permettent de doser la quantité d'anticorps présents dans le sérum.  In the method according to the invention, preferably, the finding of a binding or an absence of antibody binding with said antigens comprises the application of reagents for detecting the antibodies attached to the recombinant proteins. In particular, these reagents make it possible to determine the amount of antibody present in the serum.
Selon un aspect préféré de l'invention, le sérum provient d'une femme enceinte.  According to a preferred aspect of the invention, the serum is from a pregnant woman.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, le sérum provient d'un nouveau-né.  In another preferred aspect of the invention, the serum is from a newborn.
En particulier, le procédé de l'invention peut être avantageusement utilisé pour diagnostiquer précocement une toxoplasmose congénitale. Le terme « précocement » indique que le diagnostic pourra se faire très tôt au cours des premiers mois de vie de l'enfant. In particular, the method of the invention may be advantageously used to diagnose congenital toxoplasmosis early. The term "early" indicates that the diagnosis can be made very early in the first months of life of the child.
Le procédé selon l'invention peut également être caractérisé en ce qu'il est réalisé en complément d'un autre test de diagnostic de la toxoplasmose. En effet, ce test est préférentiellement un test de « deuxième intention », présentant une très bonne sensibilité vis-à-vis des sérums d'infection récente. Ce test de diagnostic sera préférentiellement proposé dans des situations particulières où une séroconversion récente est suspectée, en tant que test complémentaire aux tests de diagnostic de routine. La présente invention est également relative à un kit destiné à identifier la présence ou l'absence d'anticorps anl\-Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant : The method according to the invention can also be characterized in that it is carried out in addition to another diagnostic test for toxoplasmosis. Indeed, this test is preferably a test of "second intention", having a very good sensitivity vis-à-vis the sera of recent infection. This diagnostic test will preferably be proposed in special situations where recent seroconversion is suspected, as a complementary test to routine diagnostic tests. The present invention also relates to a kit for identifying the presence or absence of aniloxoplasma gondii antibody in human or animal serum comprising:
- Un support (plaque ELISA) sur lequel sont fixées les protéines recombinantes - A support (ELISA plate) on which the recombinant proteins are fixed
GRA2 et GRA6 ; GRA2 and GRA6;
- Des réactifs permettant de détecter les anticorps se fixant aux protéines recombinantes.  Reagents for detecting antibodies that bind to recombinant proteins.
De préférence, les protéines recombinantes GRA2 et GRA6 seront dans un rapport molaire compris entre 40/60 et 60/40 dans ce kit.  Preferably, the recombinant proteins GRA2 and GRA6 will be in a molar ratio of between 40/60 and 60/40 in this kit.
Protocole ELISA ELISA protocol
• Le support solide est recouvert pendant une nuit, à 4°C, d'une solution comprenant :  • The solid support is covered overnight at 4 ° C with a solution comprising:
o 100 μί de GRA2 (21 -185) (II) notée GRA2 (II), ou  o 100 μί of GRA2 (21 -185) (II) denoted GRA2 (II), or
o de protéine GRA6 (41 -152) (I I) notée GRA6 Nt (II), ou  o of GRA6 protein (41 -152) (I I) denoted GRA6 Nt (II), or
o d'un mélange 50/50 de GRA2 (II) et GRA6 Nt (II) noté GRA2 + GRA6 Nt (I I), soit 1 ,5 μg_de protéines dialysées en PBS puis diluées dans un tampon carbonate pH 9,6, ou nombre équivalent de moles de peptide pUET (= 0,5 μg) dialysé en PBS. En effet, les protéines recombinantes GRA2 et GRA6 sont fusionnées avec le peptide pUET et ainsi purifiées après synthèse ; pour plus de précision du test, on déduit des valeurs d'absorbance obtenues avec GRA2 (II), GRA6 (II) ou le mélange, la valeur d'absorbance du peptide pUET.  a 50/50 mixture of GRA2 (II) and GRA6 Nt (II) denoted GRA2 + GRA6 Nt (II), ie 1.5 μg of PBS-dialysed proteins then diluted in a carbonate buffer pH 9.6, or number equivalent of moles of peptide pUET (= 0.5 μg) dialyzed in PBS. Indeed, the recombinant proteins GRA2 and GRA6 are fused with the peptide pUET and thus purified after synthesis; for greater accuracy of the test, the absorbance values obtained with GRA2 (II), GRA6 (II) or the mixture are deduced from the absorbance value of the pUET peptide.
Le support solide subit trois lavages avec un tampon classique PBS + 0.05% Tween 20 (PBS-T) sur laveur.  The solid support undergoes three washes with a conventional buffer PBS + 0.05% Tween 20 (PBS-T) on the scrubber.
Le blocage des sites non spécifiques se fait avec de la sérum albumine bovine (BSA) en concentration de 1 %, pendant une heure à 37°C.  Non-specific sites are blocked with bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 1% for one hour at 37 ° C.
Le support est lavé trois fois dans un tampon PBS-T.  The support is washed three times in PBS-T buffer.
Incubation du sérum humain : à 37°C, pendant 1 h : 100 μί sérum humain 1/50eme dans PBS-T 0.5% BSA, 5% (v/v) lysat bactérien 4 μg/m\. Incubation of human serum: at 37 ° C for 1 hour: 100 μί human serum 1/50 in PBS-T 0.5% BSA, 5% (v / v) bacterial lysate 4 mcg / m \.
Le support est lavé trois fois dans un tampon PBS-T.  The support is washed three times in PBS-T buffer.
• Incubation de l'anticorps conjugué. A 37°C, pendant 1 h : 100 μί sérum de lapin anti- IgG humaines (H+L) - peroxydase (Jackson) 1/30,000ème. • Incubation of the conjugated antibody. At 37 ° C., for 1 hour: 100 μl anti-human IgG rabbit serum (H + L) - peroxidase (Jackson) 1 / 30,000 th .
Le support est lavé trois fois dans un tampon PBS-T.  The support is washed three times in PBS-T buffer.
Révélation. 10 min, Température ambiante, dans le noir : 100 μί 1 -Step Ultra TMB, avec arrêt de la réaction grâce à l'ajout de 50 μί HCI 3 M.  Revelation. 10 min, Ambient temperature, in the dark: 100 μί 1 -Step Ultra TMB, with reaction stopped by the addition of 50 μί 3 M HCI.
• Lecture des résultats à une Densité Optique de 450 nm, réf 630 nm. DESCRIPTION DES FIGURES • Reading of the results at an Optical Density of 450 nm, ref. 630 nm. DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figure 1 : Analyse récapitulative de 259 sérums négatifs, permettant de déterminer le seuil de positivité (à 2 écarts-types et à 3 écarts-types) de chacun des 3 ELISA GRA, ainsi que la spécificité de chacun des 3 tests : (A) GRA (II) ; (B) GRA6 Nt (Il ; (C) GRA2+GRA6 FIG. 1: Summary analysis of 259 negative sera, making it possible to determine the positivity threshold (at 2 standard deviations and 3 standard deviations) of each of the 3 GRA ELISAs, as well as the specificity of each of the 3 tests: (A) GRA (II); (B) GRA6 Nt (It; (C) GRA2 + GRA6
Figure 2. Analyse récapitulative de 253 sérums chroniques (infections datant de plus de 12 mois : sérums positifs en IgG par les tests de routine mais négatifs en IgM) permettant de montrer que les tests ELISA GRA ne sont pas adaptés au diagnostic de première intention ; (A) ELISA GRA2+GRA6 ; (B) IgG Vidas. Figure 2. Summary analysis of 253 chronic sera (infections older than 12 months: IgG-positive sera by routine but negative IgM tests) to show that GRA ELISA tests are not suitable for first-line diagnosis; (A) ELISA GRA2 + GRA6; (B) Vidas IgG.
Figure 3. Analyse de 122 séroconversions récentes datées Figure 3. Analysis of 122 recent seroconvertions
Figure 4. Analyse de 120 sérums de séroconversions séquentielles, issus de 32 femmes enceintes Figure 4. Analysis of 120 sera of sequential seroconversions, from 32 pregnant women
Figure 5. Analyse cinétique de 106 prélèvements de toxoplasmoses congénitales suspectées  Figure 5. Kinetic analysis of 106 suspected congenital toxoplasmosis specimens
Figure 6 : tableau récapitulatif de la sensibilité des tests ELISA GRA.  Figure 6: summary table of the sensitivity of the ELISA GRA tests.
ET : écart-type ; SC : séroconversion, TC : toxoplasmose congénitale AND: standard deviation; SC: seroconversion, TC: congenital toxoplasmosis
Dans chaque case, est représenté le nombre d'échantillons trouvés positifs dans le test ELISA GRA par rapport au nombre d'échantillons trouvés positifs dans le test VIDAS IgG (colonnes « par rapport au VIDAS IgG ») et par rapport à l'ensemble des deux tests IgG (« colonnes « par rapport aux tests IgG (VIDAS + IF) »).  In each box, the number of samples found positive in the GRA ELISA test is represented in relation to the number of samples found positive in the VIDAS IgG test ("against VIDAS IgG" columns) and with respect to all two IgG tests ("columns" compared to IgG tests (VIDAS + IF) ").
EXEMPLES EXAMPLES
Plusieurs tests ont été réalisés sur un total de 860 sérums humains collectés au Service de Parasitologie et de Mycologie de l'Hôpital Michallon, lors d'analyses de routine (sérums de femmes enceintes, d'enfants suspectés de toxoplasmose congénitale, de patients positifs pour le HIV, en attente de greffe, etc). Several tests were conducted on a total of 860 human sera collected at the Department of Parasitology and Mycology at Hôpital Michallon, during routine analyzes (sera of pregnant women, children suspected of congenital toxoplasmosis, patients positive for HIV, waiting for transplant, etc.).
Ces sérums comprenaient : These sera included:
o 259 sérums négatifs par les tests de routine, c'est-à-dire dont le seuil de détection des tests utilisés ne permettait pas de mettre en évidence la présence d'anticorps anti-toxoplasmose ;  o 259 negative sera by routine tests, that is to say the threshold of detection of the tests used did not allow to highlight the presence of anti-toxoplasmosis antibodies;
o 253 sérums diagnostiqués comme positifs pour une toxoplasmose ancienne, c'est-à-dire datant de plus de douze mois (c'est-à-dire sérums pour lesquels des taux positifs d'IgG avaient été détectés mais sans IgM.) o 122 sérums pour lesquels la date de la séroconversion avait pu être estimée comme récente, c'est-à-dire inférieure à 1 an (répartition par intervalles d'un mois) ; parmi ces 122 sérums, 120 étaient positifs en IgG par les tests de routine (ELFA VIDAS et/ou IFI) ; o 253 sera diagnosed as positive for old toxoplasmosis, that is, more than 12 months old (ie sera for which positive IgG levels were detected but no IgM). o 122 sera for which the date of seroconversion could be estimated as recent, that is to say less than 1 year (distribution at monthly intervals); of these 122 sera, 120 were IgG positive by routine tests (ELFA VIDAS and / or IFI);
o 120 sérums provenant de 32 patientes suivies séquentiellement sur plusieurs prélèvements, dans le cadre d'une séroconversion en cours de grossesse ; parmi ces 120 sérums, 79 étaient positifs en IgG par les tests de routine (ELFA VIDAS et/ou IFI) ;  o 120 sera from 32 patients followed sequentially on several samples as part of seroconversion during pregnancy; Of these 120 sera, 79 were IgG positive by routine tests (ELFA VIDAS and / or IFI);
o 106 prélèvements issus de 20 nourrissons chez qui on soupçonnait une toxoplasmose congénitale (au final, 10 cas confirmés de toxoplasmose congénitale et 10 cas négatifs). Parmi ces 106 sérums, 90 étaient positifs en IgG par les tests de routine (ELFA VIDAS et/ou IFI).  o 106 samples from 20 infants suspected of having congenital toxoplasmosis (in the end, 10 confirmed cases of congenital toxoplasmosis and 10 negative cases). Of these 106 sera, 90 were IgG positive by routine testing (ELFA VIDAS and / or IFI).
Le procédé selon l'invention est un test dont la sensibilité pour les sérums d'infection récente et la spécificité sont particulièrement bonnes. La sensibilité d'un test est sa capacité de donner un résultat positif lorsque la maladie (ici, l'infection par Toxoplasma gondii) est présente. La spécificité du test est, elle, la capacité du test de donner un résultat négatif lorsque la maladie n'est pas présente. The method according to the invention is a test whose sensitivity for sera of recent infection and the specificity are particularly good. The sensitivity of a test is its ability to give a positive result when the disease (here, Toxoplasma gondii infection) is present. The specificity of the test is, it, the ability of the test to give a negative result when the disease is not present.
Les exemples présentés ci-dessous illustrent les bonnes performances du procédé selon l'invention.  The examples presented below illustrate the good performance of the process according to the invention.
Exemple 1 : Analyse récapitulative de 259 négatifs, permettant de déterminer le seuil de positivité de chacun des 3 tests ELISA GRA (à 2 écarts-types et à 3 écarts-types) ainsi que la spécificité de chacun des 3 tests. Example 1: Summary analysis of 259 negatives, making it possible to determine the positivity threshold of each of the 3 GRA ELISA tests (with 2 standard deviations and with 3 standard deviations) as well as the specificity of each of the 3 tests.
Seuils des tests commerciaux utilisés Thresholds of commercial tests used
- Seuil du test IgG ELFA Vidas (bioMérieux) :  - ELFA Vidas IgG test threshold (bioMérieux):
DO<4 Ul/ml négatif ;  OD <4 IU / ml negative;
DO>7 Ul/ml positif,  OD> 7 IU / ml positive,
DO = 4-7 Ul/ml équivoque  OD = 4-7 IU / ml equivocal
Seuil du test IgG IFI (Immunofluorescence Indirecte) : 8 Ul/ml  IgG IFI (Indirect Immunofluorescence) test threshold: 8 IU / ml
- Seuil du test IgM ELISA Vidas (bioMérieux) :  - Vidas IgM ELISA test threshold (bioMérieux):
DO<0.55 négatif ;  OD <0.55 negative;
DO0.65 positif ;  DO0.65 positive;
DO=0.55-0.65 équivoque - Seuil du test IgM I FI : 1/40 OD = 0.55-0.65 equivocal - IgM I FI test threshold: 1/40
- Seuil du test IgM ISAGA (bioMérieux) : 9  - ISAGA IgM test threshold (bioMérieux): 9
Les valeurs des tableaux présentés peuvent être analysées en tenant compte des seuils de positivité listés ci-dessus. Ces valeurs définissent la quantité d'anticorps détectée qui est suffisamment significative pour indiquer une infection par Toxoplasma gondii. The values in the tables presented can be analyzed taking into account the positivity thresholds listed above. These values define the amount of antibody detected that is significant enough to indicate Toxoplasma gondii infection.
En comparaison, les résultats présentés en figure 1 permettent de déterminer les seuils de positivité et de spécificité des tests de la présente invention. Seuil de positivité et spécificité des tests ELISA GRA développés par les inventeurs : In comparison, the results presented in FIG. 1 make it possible to determine the thresholds of positivity and specificity of the tests of the present invention. Threshold of positivity and specificity of the ELISA GRA tests developed by the inventors:
La spécificité du test ELISA GRA est calculée en divisant le nombre de sérums trouvés négatifs dans le test ELISA GRA par le nombre de sérums négatifs passés dans le test ELISA et le tout multiplié par 100.  The specificity of the ELISA GRA test is calculated by dividing the number of sera found negative in the GRA ELISA test by the number of negative sera passed in the ELISA test and the whole multiplied by 100.
- Seuil de positivité de l'ELISA GRA2 (II) - résultats en figure 1A : - ELISA GRA2 (II) positivity threshold - results in FIG. 1A:
A450 =0,218 (2 écarts-types, chiffres en gras dans le tableau) et A450 = 0.218 (2 standard deviations, bold numbers in the table) and
(3 écarts-types, chiffres an gras et fond de cellules plus foncé). (3 standard deviations, bold digits and darker cell background).
Sur 253 sérums testés négatifs par les tests de routine, 3 sont au dessus du seuil de positivité du test ELISA GRA2 (II) (3 ET). Ainsi la spécificité est de : 250/253 x100 = 98,81 % Of 253 sera tested negative by routine tests, 3 are above the positivity threshold of the ELISA GRA2 (II) test (3 ET). So the specificity is: 250/253 x100 = 98,81%
- Seuil de positivité de l'ELISA GRA6 Nt (II) - résultats en figure 1 B : - ELISA GRA6 Nt (II) positivity threshold - results in Figure 1 B:
(2 écarts-types, chiffres en gras dans le tableau) et (2 standard deviations, bold numbers in the table) and
(3 écarts-types, chiffres an gras et fond de cellules plus foncé) (3 standard deviations, bold digits and darker cell backgrounds)
Sur 253 sérums testés négatifs par les tests de routine, 6 sont au dessus du seuil de positivité du test ELISA GRA6 Nt (II) (3 ET) ; donc spécificité du test est de: 247/253 x100 = 97,62% Of 253 sera tested negative by routine tests, 6 are above the positivity threshold of the GRA6 Nt (II) ELISA (3 ET); therefore specificity of the test is: 247/253 x100 = 97.62%
- Seuil de positivité de l'ELISA GRA2+GRA6 Nt (II) - résultats en figure 1 C: - ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) positivity threshold - results in figure 1 C:
(2 écarts-type, chiffres en gras dans le tableau) et (3 écarts-type, chiffres an gras et fond de cellules plus foncé) (2 standard deviations, bold numbers in the table) and (3 standard deviations, bold digits and darker cell backgrounds)
Sur 255 sérums testés négatifs par les tests de routine, 3 sont au dessus du seuil de positivité du test ELISA GRA6 Nt (II) (3 ET) ; donc spécificité du test est de: 252/255 x100 = 98,82% La sensibilité d'un test est calculée en divisant le nombre d'échantillons trouvés positifs dans le test (ELISA GRA) par le nombre d'échantillons positifs dans le test de diagnostic de référence et en multipliant le tout par 100. La difficulté, pour le diagnostic de la toxoplasmose, est qu'il n'y a pas de test de référence. C'est l'accumulation des résultats de 5 tests différents recherchant à la fois les IgM et les IgG, ainsi que le suivi du patient dans le temps, qui permet de définir si celui-ci est infecté ou non et s'il l'est, depuis quand. On définira néanmoins la sensibilité de nos tests ELISA GRA : Of the 255 sera tested negative by routine tests, 3 are above the threshold of positivity of the ELISA GRA6 Nt (II) test (3 ET); therefore specificity of the test is: 252/255 x100 = 98.82% The sensitivity of a test is calculated by dividing the number of samples found positive in the test (ELISA GRA) by the number of positive samples in the reference diagnostic test and multiplying it by 100. The difficulty, for the diagnosis of toxoplasmosis, is that there is no reference test. It is the accumulation of the results of 5 different tests looking for both IgM and IgG, as well as the follow-up of the patient over time, which makes it possible to define whether the patient is infected or not and if he or she is, since when. We will nevertheless define the sensitivity of our ELISA GRA tests:
par rapport au test VIDAS IgG, même si celui-ci est connu pour détecter les IgG tardivement (alors que le test IF IgG, qui détecte les IgG dirigées contre les protéines de surface du parasite, se positive plus précocement) ;  compared to the VIDAS IgG test, even though it is known to detect IgG late (whereas the IgG IF test, which detects IgG directed against the surface proteins of the parasite, is positive earlier);
par rapport à l'ensemble des deux tests IgG réalisés au laboratoire en routine compared to all the two IgG tests routinely performed in the laboratory
(VIDAS IgG et IF IgG) (voir figure 6). (VIDAS IgG and IF IgG) (see Figure 6).
Les résultats développés ci-après tendent à prouver que : The results developed below tend to prove that:
- La sensibilité des 3 tests ELISA GRA, sur l'ensemble des sérums testés, est très variable, selon que l'on considère des sérums d'infection ancienne (sensibilité faible, de 86,56% pour le test GRA2 + GRA6 Nt (II) Cf. figure 6), de séroconversions récentes ou des sérums issus de nourrissons suspectés de toxoplasmose congénitale (sensibilité supérieure à 100% pour le test GRA2 + GRA6 Nt (II) car il détecte plus de sérums que les tests de routine (Cf. figure 6). par contre, le test ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) présente une très bonne sensibilité vis-à-vis des sérums d'infection très récente, ce qui justifie de proposer ce test de diagnostic dans des situations particulières où une séroconversion récente est suspectée, en tant que test complémentaire aux tests de diagnostic de routine (voir figure 6).  The sensitivity of the 3 GRA ELISA tests, on all the sera tested, is very variable, depending on whether one considers old infection sera (low sensitivity, 86.56% for the GRA2 + GRA6 Nt test). II) See Figure 6), recent seroconversions or sera from infants suspected of congenital toxoplasmosis (sensitivity greater than 100% for the GRA2 + GRA6 Nt (II) test because it detects more serum than routine tests (Cf. On the other hand, the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA test has a very good sensitivity with respect to sera of very recent infection, which justifies proposing this diagnostic test in particular situations where recent seroconversion is suspected as a complementary test to routine diagnostic tests (see Figure 6).
Exemple 2 - Analyse de 253 sérums chroniques (= issus de personnes infectées dans une période datant de plus de 12 mois) Les figures 2A et 2B montrent l'analyse de 253 sérums d'infection ancienne, à l'aide de deux tests différents : Example 2 - Analysis of 253 chronic sera (= from infected persons over a period of more than 12 months) FIGS. 2A and 2B show the analysis of 253 old infection sera, using two different tests:
- Un ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) - voir figure 2A  - An IgG ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) - see Figure 2A
Le kit commercialisé par Biomérieux, « ELFA IgG VIDAS®», ci-après nommé 'kit Biomérieux'. - voir résultats figure 2B. Ce kit utilise le principe de dosage « ELFA » associant la méthode ELISA à une lecture finale en fluorescence bleue. Le seuil de positivité du kit est de 4-8 UI/mL. Il permet de détecter : The kit marketed by Biomérieux, "ELFA IgG VIDAS®", hereinafter named "Biomérieux kit". - see results figure 2B. This kit uses the "ELFA" assay principle combining the ELISA method with a final fluorescence blue reading. The threshold of positivity of the kit is 4-8 IU / mL. It can detect:
1 sérum négatif (chiffre en italique, fond de la cellule blanc)  1 negative serum (number in italics, bottom of the white cell)
- 29 sérums avec un titre entre 4 et 8 UI/mL, donc 'équivoques' (chiffres en gras, fond de la cellule gris clair)  - 29 sera with a titre between 4 and 8 IU / mL, so 'equivocal' (bold figures, light gray cell bottom)
223 sérums avec un titre supérieur à 8 UI/mL c'est-à-dire positifs (fond de la cellule gris foncé) L'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) (figure 2A) a un seuil de positivité de 0,364 (3 ET) et 223 sera with a titre greater than 8 IU / mL that is to say positive (dark gray cell bottom) ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) (FIG. 2A) has a positivity threshold of 0.364 (3 AND) and
0,264 (2 ET). Il détecte 77,07% des infections anciennes alors que le kit Biomérieux en détecte 88, 14%, dans la catégorie « Pos. 3 ET », soit avec un seuil de positivité du test placé à la valeur moyenne d'absorbance des 255 sérums négatifs + 3 écarts-types comme présenté précédemment (0,264 pour 2 ET, 0,364 pour 3 ET). 0.264 (2 ET). It detects 77.07% of old infections while the Biomérieux kit detects 88, 14%, in the category "Pos. 3 ET ", ie with a test positivity threshold placed at the average absorbance value of the 255 negative sera + 3 standard deviations as previously presented (0.264 for 2 SD, 0.364 for 3 SD).
Si on descend le seuil du test à 2 écarts-types seulement, l'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) détecte 86,56% des infections anciennes alors que le kit Biomérieux en détecte 99,6%.  If the test threshold is only 2 standard deviations, the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA detects 86.56% of old infections whereas the Biomérieux kit detects 99.6%.
Il apparaît donc que l'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) n'est pas approprié pour détecter les infections anciennes. Les tableaux présentés dans les figures 3, 4 et 5 reprennent dans le détail, les données issues de l'analyse des différents sérums d'infection récente.  It therefore appears that the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA is not suitable for detecting old infections. The tables presented in Figures 3, 4 and 5 detail the data from the analysis of the different serums of recent infection.
EXEMPLE 3 - ANALYSE DE 122 SEROCONVERSIONS DATÉES (DONT 120 ÉCHANTILLONS POSITIFS EN IGG) EXAMPLE 3 - ANALYSIS OF 122 DATE SEROCONVERSIONS (OF WHICH 120 POSITIVE SAMPLES IN IGG)
Les résultats sont présentés en figure 3. Huit tests, dont les seuils sont rappelés entre parenthèses, sont réalisés en parallèle sur chaque sérum : The results are presented in FIG. 3. Eight tests, whose thresholds are given in parentheses, are carried out in parallel on each serum:
- ELISA IgG Vidas (4-8 Ul/ml équivoque)  - Vidas IgG ELISA (4-8 IU / ml equivocal)
- IFI IgG (8 Ul/ml)  IFI IgG (8 IU / ml)
- ELISA IgM Vidas (0,55-0,65 DO équivoque)  - IgM Vidas ELISA (0.55-0.65 OD equivocal)
- IFI IgM (Dil 1/40)  IFM IgM (Dil 1/40)
- ISAGA IgM (9)  - ISAGA IgM (9)
- GRA2 (II) (0,218-0,314)  - GRA2 (II) (0.218-0.314)
- GRA6 Nt (II) (0,422-0,604)  - GRA6 Nt (II) (0.422-0.604)
- GRA2 + GRA6 Nt (II) 50/50 (0,264-0,364) Pour les tests ELISA GRA : - GRA2 + GRA6 Nt (II) 50/50 (0.264-0.364) For the ELISA GRA tests:
les couleurs foncées de fond de cellules représentent les valeurs d'absorbance situées au dessus du seuil de positivité (3 ET).  the dark background colors of the cells represent the absorbance values above the positivity threshold (3 ET).
les couleurs claires représentent les valeurs d'absorbance situées entre le seuil de positivité (2 ET) et le seuil de positivité (3 ET).  the light colors represent the absorbance values located between the positivity threshold (2 AND) and the positivity threshold (3 AND).
Pour les tests de routine : For routine tests:
les couleurs foncées de fond de cellules représentent les valeurs positives ;  Dark background colors of cells represent positive values;
- les couleurs claires représentent les valeurs situées dans la zone équivoque, quand elle existe.  - the light colors represent the values located in the equivocal zone, when it exists.
Les cellules en fond blanc représentent les résultats obtenus en dessous du seuil de chaque test. Les lignes de fond plus foncées sont celles pour lesquelles des sérums sont manquants. ELISA GRA2 (II) The cells in white background represent the results obtained below the threshold of each test. The darker baselines are those for which sera are missing. ELISA GRA2 (II)
90 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  90 sera positive (3 ET) out of 120 IgG positive by routine tests
90 + 11 = 101 sérums positifs (2 ET) sur 120 sérums positifs en IgG par les tests de routine  90 + 11 = 101 positive sera (2 ET) out of 120 IgG-positive sera by routine tests
ELISA GRA6 Nt (II) ELISA GRA6 Nt (II)
105 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  105 sera positive (3 ET) out of 120 positive IgG by routine tests
105 + 0 = 105 sérums positifs (2 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  105 + 0 = 105 sera positive (2 ET) out of 120 IgG positive by routine tests
ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II)
121 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  121 sera positive (3 ET) out of 120 IgG positive by routine tests
121 + 0 = 121 sérums positifs (2 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  121 + 0 = 121 positive sera (2 ET) out of 120 IgG positive by routine tests
VIDAS IgG VIDAS IgG
102 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  102 sera positive (3 ET) out of 120 IgG positive by routine tests
102 + 8 = 1 10 sérums positifs (2 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine  102 + 8 = 1 10 positive sera (2 ET) out of 120 IgG positive by routine tests
Résultats obtenus avec le test ELISA IgG GRA2 (II) + GRA6 Nt (II) Results obtained with the GRA2 (II) + GRA6 Nt (II) IgG ELISA Assay
Positivité supérieure à 2 écarts-types : 121/120 = 100,83%  Positivity greater than 2 standard deviations: 121/120 = 100.83%
Positivité supérieure à 3 écarts-types: 121/120 = 100,83%  Positivity greater than 3 standard deviations: 121/120 = 100.83%
Equivoques. : 0/120 = 0%  Equivocal. : 0/120 = 0%
Négatifs : 1/120 = 0,83% Résultats obtenus avec le test Biomérieux (ELFA Vidas IgG) Negative: 1/120 = 0.83% Results obtained with the Biomérieux test (ELFA Vidas IgG)
Positivité supérieure à 2 écarts-types: 1 10/120 = 90,66%  Positivity greater than 2 standard deviations: 1 10/120 = 90.66%
Positivité supérieure à 3 écarts-types: 102/120 = 85%  Positivity greater than 3 standard deviations: 102/120 = 85%
Equivoques. : 8/120 = 6,66%  Equivocal. : 8/120 = 6.66%
Négatifs : 12/120 = 10%  Negatives: 12/120 = 10%
Si on considère les pos.>3ET, le test GRA2+GRA6 Nt (II) est donc plus sensible et permet de détecter l'infection plus précocement que l'ELFA IgG VIDAS,. Quand on regarde les résultats plus en détails, par comparaison au test ELFA IgG Vidas, le test GRA2+GRA6 NT (II) permet en fait de « récupérer » : If we consider pos> 3ET, the GRA2 + GRA6 Nt (II) test is therefore more sensitive and makes it possible to detect the infection earlier than the ELFA IgG VIDAS ,. When looking at the results in more detail, compared to the Vidas ELFA IgG test, the GRA2 + GRA6 NT (II) test actually allows you to "recover":
- 8 sérums entre 0 et 1 mois, dont 2 encore négatifs en IFI IgG (tous positifs en IgM) - 8 sera between 0 and 1 month, including 2 still negative IFI IgG (all IgM positive)
- 3 sérums entre 1 et 2 mois (positifs en IgM), - 3 sera between 1 and 2 months (IgM positive),
- 1 sérum entre 6 et 7 mois (positif en IgM et en IF IgG)  - 1 serum between 6 and 7 months (positive in IgM and IF IgG)
Le test GRA2 + GRA6 permet donc d'identifier des sérums jugés « négatifs » en IgG par un autre test mais qui sont en fait « positifs » pour l'infection à Toxoplasma gondii et pour lesquels le diagnostic ne reposait que sur la détection des IgM. Ceci est dû au fait que le test développé par les inventeurs présente une meilleure sensibilité vis-à-vis des sérums d'infection récente (supérieure à 100% car permet de détecter plus d'échantillons que les tests de routine) que les tests actuellement commercialisés (entre 85 et 91 ,66%, selon les écarts types considérés). EXEMPLE 4 - ANALYSE DE 120 SERUMS DE SEROCONVERSIONS SÉQUENTIELLES, ISSUS DEThe GRA2 + GRA6 test therefore makes it possible to identify sera judged to be "negative" in IgG by another test but that are actually "positive" for Toxoplasma gondii infection and for which the diagnosis was based solely on IgM detection. . This is due to the fact that the test developed by the inventors has a better sensitivity with respect to sera of recent infection (greater than 100% because it makes it possible to detect more samples than the routine tests) than the tests currently performed. marketed (between 85 and 91, 66%, depending on the standard deviations considered). EXAMPLE 4 - ANALYSIS OF 120 SEQUENTIAL SEROCONVERSION SERUMS, FROM
32 PATIENTES (79 SERUMS POSITIFS EN IGG PAR LES TESTS DE ROUTINE) 32 PATIENTES (79 POSITIVE SERIES IN IGG BY ROUTINE TESTS)
Les résultats sont présentés en figure 4. Les tests ont été réalisés à partir des sérums de 32 femmes enceintes. Pour chacune d'entre elles, de 3 à 5 échantillons de sérum ont été testés. Pour 11 patientes, l'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) a permis une détection de l'infection plus précocement que les tests de routine. The results are presented in Figure 4. The tests were performed from the sera of 32 pregnant women. For each of them, from 3 to 5 serum samples were tested. For 11 patients, the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA allowed detection of the infection earlier than routine tests.
Huit tests, dont les seuils sont rappelés entre parenthèses, sont réalisés en parallèle sur chaque sérum : Eight tests, whose thresholds are recalled in parentheses, are carried out in parallel on each serum:
- ELISA IgG Vidas (4-8 Ul/ml équivoque) - IFI IgG (8 Ul/ml) - Vidas IgG ELISA (4-8 IU / ml equivocal) IFI IgG (8 IU / ml)
- ELISA IgM Vidas (0,55-0,65 DO équivoque)  - IgM Vidas ELISA (0.55-0.65 OD equivocal)
- IFI IgM (Dil 1/40)  IFM IgM (Dil 1/40)
- ISAGA IgM (9)  - ISAGA IgM (9)
- GRA2 (II) (0,218-0,314)  - GRA2 (II) (0.218-0.314)
- GRA6 Nt (II) (0,422-0,604)  - GRA6 Nt (II) (0.422-0.604)
- GRA2 + GRA6 Nt (II) 50/50 (0,264-0,364)  - GRA2 + GRA6 Nt (II) 50/50 (0.264-0.364)
Une neuvième colonne indique le diagnostic formulé par les praticiens, sans tenir compte des résultats obtenus postérieurement avec les tests ELISA GRA2 (II), GRA6 Nt (II) et GRA2+GRA6 Nt (ll).  A ninth column indicates the diagnosis formulated by the practitioners, without taking into account the results obtained afterwards with the ELISA tests GRA2 (II), GRA6 Nt (II) and GRA2 + GRA6 Nt (ll).
Les mêmes codes couleurs que pour la figure 3 sont utilisés.  The same color codes as for Figure 3 are used.
Résultats sur 120 sérums dont 79 positifs en IgG par les tests de routine : ELISA GRA2 (II) Results on 120 sera including 79 IgG positive by routine tests: ELISA GRA2 (II)
75 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine  75 sera positive (3 ET) out of 79 IgG positive by routine tests
75 + 12 = 87 sérums positifs (2 ET) sur 79 sérums positifs en IgG par les tests de routine  75 + 12 = 87 positive sera (2 SD) out of 79 IgG positive sera by routine testing
ELISA GRA6 Nt (II) ELISA GRA6 Nt (II)
78 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine 78 sera positive (3 ET) out of 79 IgG positive by routine tests
78 + 8 = 86 sérums positifs (2 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine  78 + 8 = 86 sera positive (2 ET) out of 79 IgG positive by routine tests
ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II)
85 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine  85 sera positive (3 ET) out of 79 IgG positive by routine tests
85 + 9 = 94 sérums positifs (2 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine 85 + 9 = 94 sera positive (2 ET) out of 79 IgG positive by routine tests
VIDAS IgG VIDAS IgG
56 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine  56 sera positive (3 ET) out of 79 IgG positive by routine tests
56 + 6 = 62 sérums positifs (2 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine  56 + 6 = 62 sera positive (2 ET) out of 79 positive IgG by routine tests
Pour les patientes n°3, 14, 16, 20, 21 , 22, 27, 28, 30, 31 (10 patientes/32 dont 3 patientes à 2 ET) : le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) se révèle positif avant même que les IgM ne soient détectées. En particulier, la patiente 3 a subi quatre prélèvements à des intervalles de 1 mois. Lors du test du 1er sérum, selon le kit Biomérieux, le sérum était considéré comme négatif pour la présence d'IgG anl\-Toxoplasma gondii. Or, dès ce premier prélèvement, le test GRA2+GRA6 Nt (II) indiquait la présence d'anticorps IgG anti-GRA. For patients n ° 3, 14, 16, 20, 21, 22, 27, 28, 30, 31 (10 patients / 32 including 3 patients with 2 ET): the GRA2 + GRA6 Nt (II) IgG ELISA test is revealed positive even before IgM is detected. In particular, patient 3 underwent four samples at 1-month intervals. During the test serum 1, according to the Biomerieux kit, the serum was considered negative for the presence of IgG anl \ -Toxoplasma gondii. However, from this first sample, the GRA2 + GRA6 Nt (II) test indicated the presence of anti-GRA IgG antibodies.
Pour la patiente 23 (positive uniquement en IgM ISAGA très sensible), le test GRA2+GRA6 Nt (II) indiquait la présence d'anticorps IgG anti-GRA. For patient 23 (positive only in highly sensitive ISAGA IgM), the GRA2 + GRA6 Nt (II) test indicated the presence of anti-GRA IgG antibodies.
Pour les patientes n°1 , 7, 9, 15, 17, 18, 19, 24, 29, 32 (10 patientes/32) : le diagnostic positif n'a été rendu que sur la seule présence des IgM, ou des IgM et d'une valeur seuil des IgG en IFI. Le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) aurait permis d'assurer le diagnostic par la mise en évidence d'IgG précoces anti-GRA. For patients # 1, 7, 9, 15, 17, 18, 19, 24, 29, 32 (10 patients / 32): the positive diagnosis was made only on the presence of IgM, or IgM and a threshold value of IgG in IFI. The GRA2 + GRA6 Nt (II) IgG ELISA test would have made it possible to ensure the diagnosis by the detection of early anti-GRA IgG.
En particulier, la patiente 1 a subi quatre prélèvements à des intervalles de 1 mois. Lors du test du 1er sérum, selon le kit Biomérieux ainsi qu'avec le kit GRA2 + GRA6 Nt (II), le sérum était considéré comme négatif pour la présence d'IgG anl\-Toxoplasma gondii. Lors du test du deuxième sérum, au contraire, les valeurs étaient toujours en dessous du seuil de détection pour le test Biomérieux mais elles indiquaient la présence d'anticorps IgG anti-GRA lors de l'utilisation du test GRA2+GRA6 Nt (II). Pour les patientes 1 et 8 : le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) se négative en même temps que l'IFI IgM si on considère le seuil de positivité à 3 ET mais il reste positif à 2 ET. Il y a donc une diminution sensible de la quantité d'IgG dirigées contre GRA2 (II) et GRA6 Nt (II). In particular, patient 1 underwent four samples at 1-month intervals. During the test serum 1, as well as the kit Biomérieux GRA2 GRA6 Nt + kit (II), the serum was considered negative for the presence of IgG anl \ -Toxoplasma gondii. In the second serum test, on the other hand, the values were still below the detection threshold for the Biomérieux test, but they indicated the presence of anti-GRA IgG antibodies when using the GRA2 + GRA6 Nt (II) test. . For patients 1 and 8: the GRA2 + GRA6 Nt (II) IgG ELISA test is negative at the same time as the IgM IFI if we consider the positivity threshold at 3 ET but it remains positive at 2 ET. There is therefore a significant decrease in the amount of IgG directed against GRA2 (II) and GRA6 Nt (II).
EXEM PLE 5 - ANALYSE CINETIQUE DE 106 PRELEVEMENTS DE TOXOPLASMOSES CONGENITALES (10 CAS +, 1 0 CAS -) DONT 90 PRELEVEMENTS POSITIFS EN IGG PAR LES TESTS DE ROUTINE EXEM PLE 5 - KINETIC ANALYSIS OF 106 SAMPLES OF CONGENITAL TOXOPLASMOSES (10 CASES, 1 0 CASES) - OF WHICH 90 POSITIVE SAMPLES IN IGG BY ROUTINE TESTS
Les résultats obtenus sont présentés en figure 5. Les mêmes codes couleurs que pour la figure 3 sont utilisés. The results obtained are shown in FIG. 5. The same color codes as for FIG. 3 are used.
106 sérums dont 90 positifs en IgG par les tests de routine : 106 sera including 90 positive IgG by routine tests:
ELISA GRA2 (II) ELISA GRA2 (II)
60 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine  60 positive sera (3 ET) out of 90 IgG positive by routine tests
60 + 7 = 67 sérums positifs (2 ET) sur 90 sérums positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA6 Nt (II) 60 + 7 = 67 positive sera (2 ET) out of 90 IgG-positive sera by routine tests ELISA GRA6 Nt (II)
63 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine  63 sera positive (3 ET) out of 90 IgG positive by routine tests
63 + 7 = 70 sérums positifs (2 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II)  63 + 7 = 70 positive sera (2 ET) out of 90 IgG positive by routine GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA tests
77 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine  77 sera positive (3 ET) out of 90 IgG positive by routine tests
77 + 4 = 81 sérums positifs (2 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine  77 + 4 = 81 sera positive (2 ET) out of 90 IgG positive by routine tests
VIDAS IgG VIDAS IgG
76 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine 76 positive sera (3 ET) out of 90 IgG positive by routine tests
76 + 10 = 86 sérums positifs (2 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine  76 + 10 = 86 sera positive (2 ET) out of 90 IgG positive by routine tests
Le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 NT (II) se négative plus rapidement que l'ELFA IgG Vidas : cas des patients 4, 5, 8, 12, 13, 16, 20 (7/10 TC - à 3 ET et 9/10 à 2 ET)). The GRA2 + GRA6 NT (II) IgG ELISA is more rapidly negative than the Vidas IgA ELFA: Patients 4, 5, 8, 12, 13, 16, 20 (7/10 TC - at 3 ET and 9 / 10 to 2 ET)).
Le patient N°8 a par exemple été diagnostiqué positif en IgG à la naissance (prélèvement N°37) et a donc dû être suivi, alors qu'il était déjà négatif par le test ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II). Les IgG détectées par les tests de routine (VIDAS IgG et IF IgG) étaient donc des IgG résiduelles de la mère, passées dans le sang de l'enfant lors de l'accouchement. Ces IgG s'éliminent naturellement après quelques semaines. For example, Patient # 8 was diagnosed positive for IgG at birth (Sample # 37) and therefore had to be followed while already negative by the GRA2 + GRA6 Nt (II) ELISA. The IgGs detected by the routine tests (VIDAS IgG and IF IgG) were thus residual IgG of the mother, passed in the child's blood during delivery. These IgG are eliminated naturally after a few weeks.
De même, le patient N°12 a été diagnostiqué positif en IgG anti- Toxoplasma gondii par les tests de routine jusqu'au prélèvement N°64 alors qu'il aurait été diagnostiqué négatif dès le prélèvement N°63 par le test ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II). Similarly, patient no. 12 was diagnosed positive for anti-Toxoplasma gondii IgG by routine tests up to sample # 64 whereas he was diagnosed negative from sample # 63 by the GRA2 + ELISA test. GRA6 Nt (II).
A noter le cas particulier du patient N°20 : rebond de ses IgG après s'être négativées. To note the particular case of the patient N ° 20: rebound of its IgG after being negativées.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti- Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact dudit sérum préalablement prélevé avec des antigènes capables de se lier avec lesdits anticorps anl\-Toxoplasma gondii et la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes, le procédé étant caractérisé en ce que lesdits antigènes comprennent la combinaison de deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6. A method for identifying the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising contacting said previously sampled serum with antigens capable of binding with said antibodies to toxoplasma gondii and the finding of a binding or an absence of antibody binding with said antigens, the method being characterized in that said antigens comprise the combination of two recombinant proteins GRA2 and GRA6.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les antigènes consistent en la combinaison des deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6.  2. Method according to claim 1, characterized in that the antigens consist of the combination of the two recombinant proteins GRA2 and GRA6.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le rapport molaire GRA2/GRA6 est compris entre 40/60 et 60/40.  3. Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the molar ratio GRA2 / GRA6 is between 40/60 and 60/40.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le rapport molaire GRA2/GRA6 est de 50/50.  4. Method according to claim 3, characterized in that the molar ratio GRA2 / GRA6 is 50/50.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les antigènes sont fixés sur un support, en particulier sur une plaque de test ELISA.5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the antigens are fixed on a support, in particular on an ELISA test plate.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes comprend l'application de réactifs permettant de détecter les anticorps fixés aux protéines recombinantes. 6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the finding of a binding or an absence of binding of antibodies to said antigens comprises the application of reagents for detecting the antibodies attached to the proteins. recombinant.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le sérum provient d'une femme enceinte.  7. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the serum is from a pregnant woman.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le sérum provient d'un nouveau-né.  8. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the serum is from a newborn.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est réalisé en complément d'un autre test de diagnostic de la toxoplasmose.  9. Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that it is carried out in addition to another diagnostic test of toxoplasmosis.
10. Kit destiné à identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti- Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant :  A kit for identifying the presence or absence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in human or animal serum, comprising:
- Un support (plaque ELISA) sur lequel sont fixées les protéines recombinantes - A support (ELISA plate) on which the recombinant proteins are fixed
GRA2 et GRA6 ; GRA2 and GRA6;
- Des réactifs permettant de détecter les anticorps se fixant aux protéines recombinantes.  Reagents for detecting antibodies that bind to recombinant proteins.
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