EP2809802A1 - Biomarqueur pour les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques - Google Patents

Biomarqueur pour les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques

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EP2809802A1
EP2809802A1 EP13701803.2A EP13701803A EP2809802A1 EP 2809802 A1 EP2809802 A1 EP 2809802A1 EP 13701803 A EP13701803 A EP 13701803A EP 2809802 A1 EP2809802 A1 EP 2809802A1
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EP
European Patent Office
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gpr15
expression
copd
subject
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13701803.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nelly FROSSARD
Jacques Haiech
Christine LEHALLE
Romain KESSLER
Antoine MAGNAN
Pascal CHANEZ
Jean-Luc Galzi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Strasbourg filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2809802A1 publication Critical patent/EP2809802A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6884—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from lung
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    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7158—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
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    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G01N2800/122—Chronic or obstructive airway disorders, e.g. asthma COPD

Definitions

  • the invention relates to the use of a novel biomarker for diagnosing chronic pulmonary inflammatory disease, specifically asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in a subject.
  • the biomarker according to the invention also makes it possible to determine the susceptibility of a subject to develop a chronic pulmonary inflammatory disease, and / or to follow the course of a chronic pulmonary inflammatory disease in an affected subject. More specifically, the marker makes it possible to differentiate between asthma and COPD.
  • Chronic pulmonary inflammatory diseases which affect the respiratory system to varying degrees, have been rapidly expanding for several decades, particularly in the industrialized countries.
  • the main environmental factors singled out are smoking and poor air quality.
  • the increase in air of chemical pollutants is contributing to the emergence of new cases and the worsening of cases already listed.
  • chronic inflammatory diseases of the airways we find mainly asthma and chronic obstructive pulmonary disease, which however have opposite inflammatory profiles.
  • Asthma is the most common chronic pulmonary inflammatory disease in industrialized countries and affects all age groups. Asthma is a polyfactorial disease, which does not necessarily have a genetic origin. It is mainly characterized by inflammatory bronchi, participating in the reduction of their diameter and thus making it difficult for the breathing of asthmatics to expire. This inflammation is reversible, so that the person with asthma can, apart from asthma attacks, not present any particular symptoms of the disease. Depending on the cause, the number and frequency of asthma attacks include intermittent asthma, mild persistent asthma, moderate persistent asthma or severe persistent asthma. In addition, depending on the nature of asthma, chronic, allergic, stress, etc., the diagnosis may be more difficult to establish.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • bronchitis chronic bronchitis and emphysema.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • emphysema chronic diseases of the respiratory system
  • COPD chronic bronchitis and emphysema.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • a decrease in expiratory flow due mainly to bronchial obstruction not completely reversible by a beta2 adrenergic agonist and progressive worsening.
  • COPD is one of the most common smoking-related conditions and affects between 4% and 10% of the global adult population, with a higher prevalence among adults over 40 years of age.
  • the symptoms of COPD include coughing, expectoration and increasing shortness of breath on exertion.
  • the diagnosis of severity is based on a respiratory function test that measures the degree of bronchial obstruction.
  • COPD screening by functional exploration is limited
  • biomarkers Given the constraint and the difficulty of these diagnoses of chronic pulmonary inflammatory diseases, the development of efficient and reliable biomarkers would make it easier to diagnose these diseases, to detect them at an early stage, to establish a prognosis and to improve the diagnosis. management of patients by giving them the appropriate treatment as soon as possible. The benefit of such biomarkers would be i) the rapid indication of appropriate treatment in the usual clinic (societal interest), and ii) a more detailed characterization of patients entering clinical trials of new molecules or new therapeutics (industrial interest). Summary of the invention
  • the present invention aims at overcoming the difficulties related to screening and diagnosis of chronic pulmonary inflammatory diseases and monitoring the progression of the disease in patients, by proposing the use of a specific biomarker whose expression profile is representative of these diseases.
  • the present invention is useful for the differential diagnosis of asthma and COPD.
  • the present invention is useful for the diagnosis of asthma.
  • it is also useful for the diagnosis of COPD.
  • the inventors have unexpectedly demonstrated that the analysis of the expression of the gene of a G protein-coupled receptor, GPR15, is particularly suitable for the characterization of chronic pulmonary inflammatory diseases, and particularly of the asthma and COPD.
  • the analysis of the expression profile of the GPR15 gene makes it possible to establish rapidly and reliably, independently of factors external to the disease, whether a subject is suffering from one or the other chronic pulmonary inflammatory disease: the inventors have discovered patients have a different GPR15 gene expression pattern depending on whether they have asthma or COPD.
  • the biomarker according to the invention therefore makes it possible to determine whether a patient has asthma or COPD.
  • the use of the expression profile of the GPR15 gene according to the invention makes it possible to establish a diagnosis from a simple biological sample, and in particular a blood sample, of the patient, which makes such a diagnosis simple and not easy. expensive.
  • the temporal follow-up of the expression profile of the biomarker according to the invention in a patient suffering from a chronic pulmonary inflammatory disease makes it possible to study the evolution of the disease with or without treatment, or to predict its evolution. .
  • the bio marker could be used to determine the stage of the disease.
  • the use of the expression profile of the GPR15 gene according to the invention makes it possible to select the most appropriate treatment for the patients and / or to select the patients requiring a particular clinical follow-up.
  • the subject of the invention is an in vitro or ex vivo method of diagnosis and / or prognosis and / or evaluation of the evolution of a chronic pulmonary inflammatory disease in a subject, according to which a sample is measured in a biological sample. of the subject the level of expression of the GPR15 gene.
  • the method is implemented to diagnose / prognose / evaluate the course of asthma in a subject, a subexpression of the GPR15 gene being indicative of asthma.
  • the method is implemented to diagnose / prognose / evaluate the evolution of COPD in a subject, overexpression of the GPR15 gene being indicative of COPD.
  • the present invention relates to an in vitro method of diagnosing COPD in a subject, wherein the level of expression of the G protein coupled receptor (GPR15) gene is measured in a biological sample of the subject and compares the expression level of the GPR15 gene to a reference level of expression taking into account the age of the patient, GPR15 overexpression being indicative of COPD.
  • GPR15 G protein coupled receptor
  • the present invention relates to an in vitro diagnostic method for determining whether a patient has asthma or chronic obstructive pulmonary disease (COPD), wherein the patient's biological sample is GPR15-coupled receptor gene expression (GPR15) expression, GPR15 under-expression being indicative of asthma and overexpression of GPR15 being indicative of COPD.
  • GPR15 GPR15-coupled receptor gene expression
  • the level of expression of the GPR15 gene in the biological sample of the subject to be diagnosed / prognosed is compared to a reference level of expression.
  • the level of reference expression takes into account the age of the patient.
  • the present invention relates to an in vitro method of diagnosing asthma and / or COPD in a subject, wherein the level of expression of the GPR15 gene is measured in a biological sample of the subject and the level of expression of the GPR15 gene is compared. expression of the GPR15 gene at a reference level of expression taking into account the age of the patient, GPR15 overexpression being indicative of COPD and a subexpression of GPR15 being indicative of asthma.
  • the level of expression of the GPR15 gene at the nucleic and / or protein level is advantageously measured, for example by measuring the amount of transcribed mRNA and / or by measuring the amount of GPR15 protein with the aid of at least one specific method for measuring GPR15 expression.
  • Techniques for detecting GPR15 gene expression at the nucleic level are well known to those skilled in the art.
  • the detection can be carried out in particular by real-time quantitative RT-PCR, a microfluidic technique, a DNA chip, high-throughput sequencing of the mRNAs, or any appropriate technique for quantifying mRNA, such as an RNA chip, methods LCR (“Ligase Chain Reaction”), TMA (“Transcription Mediated Amplification”), PCE (“enzyme amplified immunoassay”) and DNA (“branched DNA signal amplification”), etc.
  • the techniques making it possible to detect the expression of the GPR15 gene at the protein level are also well known to those skilled in the art and may notably include flow cytometry, quantitative immunocytochemistry, cellular ELISA, the Taqman® protein test (Taqman Protein Assay, Applied Biosystems), protein or antibody chips coupled or not to mass spectrometry, binding of labeled ligands, etc.
  • the biological sample is a whole blood sample, the detection of the product of the expression of the GPR15 gene being preferably on the total leukocyte population.
  • kits comprising at least one reagent specific for the product of the expression of the GPR15 gene, preferably chosen from a monoclonal or polyclonal antibody or any other type of molecules or macro molecules. capable of specifically interacting with the GPR15 protein, a ligand, natural or synthetic, or a nucleic sequence, capable of specifically hybridizing with a fragment of the mRNA encoding GPR15, for diagnosis and / or prognosis and / or evaluating the course of a chronic pulmonary inflammatory disease in a subject.
  • Chronic pulmonary inflammatory disease can be asthma or COPD.
  • the invention relates to the use of a kit comprising at least one reagent specific for the product of the expression of the GPR15 gene for the diagnosis of asthma or the differential diagnosis of asthma and COPD in a subject.
  • the present invention also relates to the use of a kit comprising at least one reagent specific for the product of GPR15 gene expression and information relating to reference GPR15 expression levels taking age into account for diagnosis. COPD in a subject.
  • the invention also relates to the use in vitro or ex vivo of a product of the expression of the GPR15 gene as a biomarker for the diagnosis and / or prognosis and / or evaluation of the evolution of a chronic pulmonary inflammatory disease in a subject.
  • chronic pulmonary inflammatory disease is asthma or COPD.
  • the invention relates to the use in vitro or ex vivo of a product of the expression of the GPR15 gene as a biomarker for the differential diagnosis of asthma and COPD in a subject.
  • Figure 1 Schematic representation of the decision tree that led to the selection of GRP15 as a biomarker of chronic pulmonary inflammatory diseases.
  • Figure 2 Boxplot (box plots) showing the expression profile of the GPR15 gene in patients with asthma or COPD compared to the expression profile in control volunteers without these diseases.
  • FIG. 3 Expression of the GPR15 gene in patients with asthma or COPD versus controls lacking these diseases represented in age-appropriate amplification threshold (Ct) cycles.
  • the present invention is based on the study of the expression profile of the G protein coupled receptor gene [GPR15, GPCR15, or BOB (Brother of Bonzo)].
  • the family of G protein-coupled receptors includes numerous membrane receptors, including GPR15.
  • the gene encoding GPR15 is located in humans on chromosome 3ql 1,2-ql3.1 (Heiber et al, Genomics 32, 462-465, 1995). So far, a link between GPR15 and human immunodeficiency virus (HIV) infection has been identified (Blaak et al, Journal of Virology, 79: 1686-1700, 2005, Okamoto & Shikano, Journal of Biological Chemistry 286, 7171-7181, 2001).
  • GPR15 would be a co-receptor for HIV entry into circulating lymphocytes.
  • GPR15 refers to the G 15 protein-coupled receptor. It is described in the gene databases under the following references: HGNC: 4469; GenelD: 2838; RefSeq Protein: NP 005281.1; RefSeq RNA: NM 005290.1. Of course, GPR15 is relative to that of the human.
  • the inventors have demonstrated a correlation between the expression of GPR15 and chronic pulmonary inflammatory diseases. More particularly, the inventors have discovered that the analysis of the expression profile of the gene GPR15 reliably determines whether a subject has chronic inflammatory lung disease, and advantageously differentiates subjects with asthma from those with COPD.
  • the invention proposes to use a product of the expression of the GPR15 gene as a biomarker, in particular for diagnosing a chronic pulmonary inflammatory disease, but also for the prognosis and the follow-up of the evolution of a chronic pulmonary inflammatory disease.
  • chronic pulmonary inflammatory disease is asthma or COPD.
  • the invention provides an in vitro or ex vivo method of diagnosis and / or prognosis and / or evaluation of the evolution of a chronic pulmonary inflammatory disease in a subject according to which a biological sample of subject the level of expression of the G protein coupled receptor gene (GPR15).
  • GPR15 G protein coupled receptor gene
  • a "subject” or “patient” includes any mammalian subject or patient, and preferably a human subject or patient, including children and adults.
  • Chronic pulmonary inflammatory diseases means chronic inflammatory diseases of the airways, and more specifically, asthma and chronic obstructive pulmonary disease, including chronic bronchitis and emphysema.
  • the "diagnosis” relates to the detection and / or identification in a subject of a chronic pulmonary inflammatory disease, regardless of its stage.
  • the diagnosis makes it possible to determine if a subject has asthma or COPD.
  • Prognosis refers to the assessment of the disease as to the susceptibility to develop the disease, and / or the susceptibility to progression to a more advanced stage / degree, and / or to the risk of complications and exacerbations, and / or its outcome, etc.
  • the "evaluation of the evolution of the disease” corresponds to the analysis in time of the evolution of the previously diagnosed or predicted disease. Such a follow-up in time can make it possible to select, validate and / or adapt a treatment. It also makes it possible to determine the intensity of the clinical follow-up necessary for the patient. This monitoring makes it possible to determine at any time if a treatment is necessary.
  • the invention also provides a method for providing information that may be useful for diagnosing and / or prognosticating and / or assessing the course of a chronic pulmonary inflammatory disease in a subject, wherein the biological level of the subject is of expression of the GPR15 gene.
  • chronic pulmonary inflammatory disease is asthma or COPD.
  • the invention provides a method for providing information that may be useful to differentially diagnose asthma and COPD in a patient, i.e., to differentiate subjects with asthma from subjects with a COPD.
  • GPR15 can be used as a biomarker for the prognosis and / or diagnosis of chronic pulmonary inflammatory disease, and more specifically COPD and asthma, as well as for the differential diagnosis of asthma and osteoarthritis. COPD.
  • GPR15 can be used as a biomarker for the follow-up of a subject diagnosed with chronic and / or prognostic pulmonary inflammatory disease as likely to develop such a disease and / or to develop more advanced / severe disease and / or or develop complications and / or exacerbations.
  • the chronic pulmonary inflammatory disease is asthma.
  • chronic pulmonary inflammatory disease is COPD.
  • Such a biomarker can also be used for the selection of subjects with chronic pulmonary inflammatory disease who may benefit from a particular treatment and / or to evaluate the course of the disease in subjects with chronic pulmonary inflammatory disease. during a treatment.
  • GPR15 can thus serve as a biomarker for the selection, evaluation and adaptation of the treatment of a subject suffering from a chronic pulmonary inflammatory disease.
  • the invention is particularly useful for selecting the appropriate treatment depending on whether the patient has asthma or COPD.
  • GPR15 is used as a biomarker of chronic pulmonary inflammatory diseases, and more specifically asthma and COPD.
  • the expression profile of the GPR15 gene can be achieved in various ways, in particular by measuring, determining or assaying the amount of the expression product of this gene from a biological sample of the subject.
  • the sample is preferably a cell sample from a biological fluid of the subject, such as blood.
  • the sample of the subject is a sample containing leukocytes.
  • the methods according to the present invention may comprise a sampling step and / or a step of preparing / purifying the sample.
  • the expression product of the GPR15 gene corresponds to a product transcribed or translated from this gene, such as the mRNA or the GPR15 G protein-coupled receptor itself.
  • the amount of GPR15 protein can be determined by any method known to those skilled in the art. Typically, these methods comprise a step of contacting the sample with a selective ligand of the GPR15 protein, such as an antibody directed against GPR15 specific epitopes, a fragment or a derivative of this antibody, or a endogenous ligand or a small molecule binding to the receptor with high affinity.
  • a selective ligand of the GPR15 protein such as an antibody directed against GPR15 specific epitopes, a fragment or a derivative of this antibody, or a endogenous ligand or a small molecule binding to the receptor with high affinity.
  • the anti-GPR15 antibodies used in the present invention are antibodies or any protein or other molecule specifically binding to GPR15 with submicromolar affinity. These are, for example, monoclonal antibodies or monospecific polyclonal antibodies, ie which specifically recognize only one epitope. Preferably, the antibodies will be specific for the extracellular portion of the receptor.
  • an anti-GPR15 antibody can be obtained by immunization of a non-human animal (rabbit, mouse, etc.) with the aid of GPR15 or an antigenic sequence thereof, sampling and exhaustion of the antiserum. obtained for example on an immunoadsorbent containing GPR15, according to methods known to those skilled in the art.
  • the amount of GPR15 protein can be measured using flow cytometry techniques, immunological tests (ELISA, EIA, RIA, etc.), immunoassay, chemiluminescent or fluorescent assays, immunoelectrophoresis, immunoprecipitations, the use of mass spectrometry, etc.
  • the method most often comprises a step of revealing the labeling, such as fluorescent, radioactive, enzymatic, or colored molecule labeling, or more generally any marking making it possible to demonstrate the formation of the antigen / antibody complex or any biophysical method. to highlight the interaction between GPR15 and a molecule either protein or synthetic (aptamer, ligand, ...)
  • the mRNAs of the GPR15 gene can be detected by any method known to those skilled in the art. Generally, these methods require a first step of extraction of the nucleic acids contained in the biological sample, by techniques well known to those skilled in the art, using, for example, lysing enzymes, suitable chemical solutions or extraction resins. specific. The said mRNAs are then brought into contact with a nucleotide probe, advantageously labeled, specific for the GPR15 mRNAs, under conditions allowing hybridization with the said mRNAs, followed by an assay of the hybrid forms obtained, advantageously labeled. . The extracted mRNAs can also be previously amplified (for example by the RT-PCR technique).
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • RNA detection of the GPR15 gene is carried out by
  • RNAs from a biological sample, such as a whole blood sample
  • a PCR amplification of the cDNA in the presence of oligonucleotide primers specific for the GPR15 gene the quantification of the PCR product, in particular by contact with a nucleic acid probe, advantageously labeled, specific for GPR15 AR m (indirect detection), in particular under conditions allowing hybridization, followed by an assay hybrid forms obtained, advantageously marked.
  • the expression profile of a product of the GPR15 gene in a biological sample of a patient is compared with the reference expression profile of a product of the GPR15 gene.
  • This reference expression profile may be that obtained from a control biological sample.
  • the control expression profile may correspond to an average or a median of the expression profiles obtained for a panel of biological control samples.
  • the expression levels obtained in the samples of the subjects to be analyzed and in the control samples are advantageously standardized by using the level of expression of proteins known to have a stable level of expression in the subjects presenting a chronic pulmonary inflammatory disease and in healthy subjects, such as HPRT1 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1), TBP (TATA binding protein) or TFRC (Transferrin receptor protein 1) for human leukocyte mRNA and such as B-actin or GAPDH (glyceraldehyde 3- phospho-dehydrogenase) for protein samples.
  • HPRT1 hyperxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1
  • TBP TATA binding protein
  • TFRC Transferrin receptor protein 1
  • B-actin or GAPDH glycose hydrochloride dehydrogenase
  • the products of the GPR15 gene analyzed to produce the expression profile of the patient in a biological sample and to produce the control expression profile are identical, as is the nature of the samples used. However, they may contain any mutations that will be highlighted by sequencing.
  • the reference expression profile is made from biological samples of subjects not likely to present a chronic pulmonary inflammatory disease. Such a reference expression profile makes it possible in particular to diagnose a chronic pulmonary inflammatory disease at a very early stage of the disease.
  • the reference expression profile is made from biological samples of subjects presenting with pulmonary inflammatory disease. chronic diagnosed, and whose stage / degree is advantageously known.
  • Such profiles may be particularly useful for monitoring the progression of the disease in a subject, in particular to assess the risk of complications and / or exacerbation, and / or to select, adapt, modify, start or stop a treatment.
  • the inventors have demonstrated a correlation between the level of expression of GPR15 and the age of the subject. This observation was extended to all patients with asthma, those with COPD and for all control subjects. More particularly, as shown in Figure 3, patients with asthma have low levels of GPR15 expression (including a large number of amplification cycles necessary to be detected) and age-consistent . On the other hand, it has been observed that control subjects (healthy) and COPD subjects have a decreasing expression level of GPR15 as a function of age. For COPD, the inventors have shown that the parameter of age must absolutely be taken into account. Thus, preferably, the reference expression level takes into account the age of the patient.
  • the age parameter of the subject may possibly be neglected because the two groups are sufficiently distinct from each other. Reference expression profiles can therefore be made according to the age of the control subjects.
  • the level of expression of GPR15 for a patient is then advantageously compared to the reference level of controls of the same age class (patient's age ⁇ 2.5 years).
  • the onset of the symptoms of the disease is late for patients with COPD (> 40 years) and earlier for asthmatic patients, the age of the control population is preferably 18 to 85 years.
  • age class may be of particular interest for the diagnosis or prognosis of chronic lung diseases known to occur at a particular age. This classification may also be useful for the evaluation of the evolution of the disease, and in particular for COPD, whose evolution according to the age of the patient can be rapid and / or critical.
  • the various criteria set out above for producing expression expression profiles are not exclusive of each other. For example, it may be particularly interesting to make reference expression patterns according to the stage of the disease and the age of the subjects.
  • the inventors have discovered that patients with asthma have an expression profile of the GPR15 gene that is opposed to the expression profile of patients with COPD.
  • the use of the GPR15 biomarker is particularly relevant for reliably determining whether a subject has either of these two chronic lung diseases.
  • the method comprises a step of determining whether the level of expression of the GPR15 gene product in a subject is high or low relative to the reference expression level.
  • the level of reference expression corresponds to a normal level of expression of the product of the GPR15 gene, that is to say, excluding any chronic pulmonary inflammatory disease.
  • the expression level in the subject is considered to be high, and therefore has overexpression, if said level is, for example, at least 20, 30, 40 or 50% higher than the standard expression level after normalization, and preferentially at less than 100%, 150% or 200%.
  • the level of expression in the subject is considered to be low, and therefore has a sub-expression, if said level is for example at least 20, 30, 40 or 50% lower than the expression level of the subject. reference after normalization, and preferably at least less than 100%), 150%) or 200%>.
  • the patient's own level of expression of the GPR15 gene product at a given time t may serve as a reference level of expression for monitoring the evolution of the disease of said patient at time t + 1.
  • Overexpression or sub-expression of the product of the patient's GPR15 gene at t + 1 relative to the level of expression of the patient's GPR15 gene product at time t may be indicative of an improvement or degradation of the state of health of said patient according to the observed disease.
  • the level of reference expression corresponds to a level of expression of the product of the GPR15 gene for a population of patients suffering from asthma for the diagnosis of asthma or COPD for the diagnosis of it.
  • reference curves or clouds will be defined for asthma and / or COPD according to age.
  • the present invention relates to an in vitro method to determine the stage of COPD in a subject, in which the level of expression of the GPR15 gene is measured in a biological sample of the subject, the level of expression of the GPR15 gene is compared with reference expression levels taking into account the stage of COPD and preferably the age of the subject, and on the basis of this comparison, the stage of COPD in the subject is determined.
  • the information of a patient will be positioned relative to a set of reference data thus making it possible to determine the state of the pathology of the patient considered.
  • the particular embodiments described above are applicable in this method.
  • kits comprising at least one reagent specific for the product of the expression of the GPR15 gene, chosen from a monoclonal or polyclonal antibody directed against GPR15 or any protein molecule or other specifically binding molecule.
  • a probe capable of specifically hybridizing with a fragment of mRNA or cDNA encoding GPR15, and at least one pair of nucleic acid primers specific for mRNA or the cDNA encoding GPR15 for the diagnosis and / or prognosis and / or evaluation of the course of a chronic pulmonary inflammatory disease in a subject.
  • chronic pulmonary inflammatory disease is asthma or COPD.
  • the invention relates to the use of a kit comprising at least one reagent specific for the product of GPR15 gene expression for the differential diagnosis of asthma and COPD in a subject.
  • the invention relates to the use of a kit comprising at least one reagent specific for the product of the expression of the GPR15 gene and information relating to levels of GPR15 expression of reference taking into account age for the diagnosis of COPD.
  • the information could be a reference curve / cloud of GPR15 expression in age-controlled individuals, and / or a reference curve / cloud of GPR15 expression in asthmatic subjects. depending on age, and / or a reference curve / cloud of GPR15 expression in subjects with COPD as a function of age.
  • the invention relates to the use of a kit for determining the stage of COPD, comprising at least one product-specific reagent of GPR15 gene expression and information relating to levels of reference GPR15 expression taking into account the stage of COPD and optionally age.
  • the information may be a reference curve / cloud of expression of GPR15 in individuals with COPD depending on the stage of the disease and optionally on age.
  • the information of a patient will be positioned relative to a set of reference data thus making it possible to determine the state of the pathology of the patient considered.
  • the kit may comprise means for detecting the complex formed between the GPR15 protein and the ligand, and / or a means for detecting the hybridization of at least one fragment-specific probe.
  • Table 1 Characteristics of asthmatic patients and their related controls
  • PD20 Metacholine dose causing a 20% fall in FEV1.
  • Last exacerbation last hospitalization due to a respiratory infection related to an amplification of the symptoms of the disease
  • Tiffeneau index ratio FEV1 / FVC (Forced Vital Capacity) in percentage.
  • PD20 Metacholine dose causing a 20% fall in FEV1.
  • Stage of severity moderate stage: 80 to 50%> of theoretical FEV1; Severe stage: 50 to 30% of the theoretical value of FEV1
  • Last exacerbation last hospitalization due to a respiratory infection related to an amplification of the symptoms of the disease
  • Phadiatop common pneumallergen sensitization assessment test The study was conducted after referral to the Consultative Committee for the Protection of Persons Suitable for Biomedical Research (CCPPRB) Alsace No. 1 dated 14 June 2005, in accordance with the Huriet Law No. 88-1138 of 20 December 1988, as amended. of the Public Health Code, and has been declared to the High Authority of Health. The amendments to the protocol (promotion, additional investigators) were seized by the committee for the protection of persons (CPP East No. IV).
  • Total leukocytes are obtained from whole blood (20 ml) taken from EDTA. Six ml of blood is injected through LeukoLOCK TM microporous filter (Fractionation & Stabilization Kit, Life Technologies TM) retaining leukocytes. The filter is rinsed with PBS, followed by KNAlater ® for RNA preservation and stored at -80 ° C until the extraction of RNA.
  • LeukoLOCK TM microporous filter Fractionation & Stabilization Kit, Life Technologies TM
  • the filter is rinsed with PBS, followed by KNAlater ® for RNA preservation and stored at -80 ° C until the extraction of RNA.
  • RNA binding / Binding Solution Concentrate Total RNA Isolation Kit, LeukoLOCK TM
  • the lysate is recovered in a 15 ml Falcon tube and treated with proteinase K of the kit.
  • the RNAs are fixed on beads by adding RNA Binding Beads and centrifuged. The supernatant is removed, the beads washed 3 times with a solution containing isopropanol and then ethanol.
  • the RNAs are then eluted (50 ⁇ l, elution solution, LeukoLOCK TM) into an Eppendorf tube which can be stored at -80 ° C.
  • RNAs are purified by silica gel centrifugation which has a high affinity for the RNA (RNeasy® mini kit, Qiagen), eluted by DEPC (50 ⁇ l) and recovered in an Eppendorf tube which is stored at -80 °. vs.
  • RNAs are quantified by two different techniques: 1) high precision NanoDrop ® spectrophotometer (Thermo Scientifc) allowing the analysis of micro volumes (1 ⁇ ) resulting in an absorption spectrum of 230 to 350 nm; a good quality RNA is defined by ratios A 2 60 A 2 8 0 close to 2 and A 230 / A 26 o between 1.8 and 2.2; 2) Fluorescence measurement (Qubit TM Fluorometer, Qiagen) using Quant-it TM fluorescent intercalant RNA assay Kit (Qiagen). The result is expressed as an RNA concentration proportional to the fluorescence emitted. This concentration is compared to that obtained on the NanoDrop ® . A ratio between 0.9 and 1.1 allows the acceptance of the RNA for further analysis. Otherwise, the RNA is removed ( Figure 1).
  • RNA Integrity Number The integrity of the RNA is validated by a ratio of 28S / 18S> 1.8 and a RIN> 7 ( Figure 1).
  • Quantitative PCR analysis of GPCRs requires verification of the absence of residual genomic DNA that could interfere. This validation is carried out by amplification of a highly expressed gene on the RNA samples using a pair of primers designed on a single exon (TaqMan ® Gene Expression Assay). An absence of amplification during the PCR validates the absence of genomic DNA in the sample. RNAs not satisfying this step are eliminated ( Figure 1).
  • RNA Alien ® (2 ⁇ 10 6 copies) and subjected to reverse transcription at 37 ° C for 2h in the presence of a reverse transcriptase of viral origin Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MuLV, Life Technologies).
  • the reaction mixture (marketed by Life Technologies) comprises MuLV, deoxynucleotides triphosphate, degenerate primers, RNase inhibitors in the RT buffer of the kit in a final volume of 100 ⁇ l.
  • the quantification of gene expression of GPCRs by quantitative real-time PCR was performed on ABI PRISM ® 7900 (Life Technologies TM) in microfluidic card 384 "® TaqMan Low Density Array" (TLD A, Life Technologies TM). Each well on the TLDA card contains a freeze-dried TaqMan ® probe and a specific pair of primers. Of the 384 primer pairs, 360 are specific for RCPGs, 20 for housekeeping genes and 4 for a control gene, 18S. The amplification takes place for 2 h in a final reaction volume of 2 ⁇ . The results of the biomarker gene expression highlighted are confirmed by quantitative PCR in 96-well plate on ABI PRISM ® 7000.
  • the results of the amplifications are delivered for each gene in terms of amplification threshold cycle (Ct) value by the RQ Study software integrated into the ABI PRISM ® 7900.
  • the statistical analyzes were carried out with the Excel spreadsheet and the R software.
  • Figure 3 illustrates this dependence of the expression value of GPR15 in the different patient groups with the age variable.
  • Three atypical values are observed in the COPD group: it is a smoker (Al 006), for whom the diagnosis is to be confirmed; a smoking control subject (C2010, 30 packs / year); and a non-smoker control subject (C1001) with a Tiffeneau index (FEV1 / FVC%) at 78 and will need to be reviewed.

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Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, utilisant le niveau d'expression du gène récepteur couplé aux protéines G GPR15, comme biomarqueur de la maladie.

Description

BIOMARQUEUR POUR LES MALADIES INFLAMMATOIRES PULMONAIRES
CHRONIQUES
L'invention concerne l'utilisation d'un nouveau biomarqueur pour diagnostiquer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, spécifiquement l'asthme et la broncho- pneumopathie chronique obstructive (BPCO) chez un sujet. Le biomarqueur selon l'invention permet également de déterminer la susceptibilité d'un sujet à développer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, et/ou de suivre l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet atteint. Plus particulièrement, le marqueur permet de différencier l'asthme et la BPCO. Contexte de l'invention
Les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, qui affectent à différents degrés l'appareil respiratoire, sont en forte expansion depuis plusieurs décennies, notamment dans les pays industrialisés. De nos jours, on estime à plus de 3 millions par an le nombre de décès dans le monde liés à ces maladies. Les principaux facteurs environnementaux pointés du doigt sont le tabagisme et la mauvaise qualité de l'air. Ainsi, dans les pays industrialisés, l'accroissement dans l'air de polluants chimiques participe à l'émergence de nouveaux cas et à l'aggravation des cas déjà répertoriés. Parmi ces maladies inflammatoires chroniques des voies aériennes, on trouve principalement l'asthme et la broncho-pneumopathie chronique obstructive, qui présentent toutefois des profils inflammatoires opposés.
L'asthme est la maladie inflammatoire pulmonaire chronique la plus répandue dans les pays industrialisés, et qui touche toutes les classes d'âges. L'asthme est une maladie polyfactorielle, qui n'a pas nécessairement une origine génétique. Elle se caractérise principalement par des bronches inflammatoires, participant à la réduction de leur diamètre et rendant ainsi l'expiration, lors de la respiration des personnes asthmatiques, difficile. Cette inflammation est réversible, de sorte que la personne asthmatique peut, en dehors des crises d'asthme, ne présenter aucun symptôme particulier de la maladie. Suivant la cause, le nombre et la fréquence des crises d'asthme, on parle d'asthme intermittent, d'asthme persistant léger, d'asthme persistant modéré ou d'asthme persistant sévère. En outre, selon la nature de l'asthme, chronique, allergique, à l'effort etc., le diagnostic peut être plus difficile à établir. Généralement, ce n'est qu'après la survenue de crises d'asthme répétées que l'on procède à une exploration poussée de la fonction respiratoire/ventilatoire des poumons du patient. Les tests associés, tels que le test d'hyperréactivité bronchique, le test de réversibilité à un bronchodilatateur, sont éprouvants pour le patient et les résultats peuvent parfois être difficiles à interpréter par le personnel soignant, en fonction de la nature de l'asthme, du stade de la maladie, de l'état de santé physique du patient au moment de l'examen, etc.
La broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) quant à elle regroupe plusieurs maladies chroniques du système respiratoire, dont les bronchites chroniques et l'emphysème. La BPCO se caractérise par une diminution du débit expiratoire due principalement à une obstruction bronchique non complètement réversible par un agoniste bêta2 adrénergique et d'aggravation progressive. La BPCO fait partie des pathologies liées au tabagisme la plus répandue et touche entre 4 et 10% de la population mondiale adulte, avec une plus forte prévalence chez les adultes de plus de 40 ans. Généralement, les symptômes de la BPCO incluent la toux, l'expectoration et un essoufflement croissant à l'effort. Le diagnostic de sévérité est basé sur une épreuve fonctionnelle respiratoire qui mesure le degré d'obstruction bronchique. Actuellement, le dépistage de la BPCO par l'exploration fonctionnelle est limité, car cet examen est peu accessible, et on estime à plus de 40% la proportion de patients atteints non diagnostiqués.
Par ailleurs, le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO se révèle souvent assez complexe. Le résultat du test de réversibilité bronchique par un agoniste bêta-2 mimétique n'est pas toujours clair. Pourtant, il est important de bien faire la différence entre ces deux pathologies pour le choix du traitement approprié, ainsi que pour la caractérisation des patients entrant dans des essais cliniques.
Face à la contrainte et la difficulté de ces diagnostics des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, le développement de biomarqueurs efficaces et fiables permettrait de diagnostiquer plus facilement ces maladies, de les dépister à un stade précoce, d'en établir un pronostic et d'améliorer la prise en charge des patients en leur donnant au plus tôt le traitement approprié. Le bénéfice de tels biomarqueurs serait i) l'indication rapide du traitement approprié en clinique usuelle (intérêt sociétal), et ii) une caractérisation plus fine des patients entrant dans les essais cliniques de nouvelles molécules ou de nouvelles thérapeutiques (intérêt industriel). Résumé de l'invention
La présente invention tend à pallier les difficultés liées au dépistage et au diagnostic des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques et au suivi de l'évolution de la maladie chez les patients, en proposant l'utilisation d'un biomarqueur spécifique dont le profil d'expression est représentatif de ces maladies. Notamment, la présente invention est utile pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO. Alternativement, la présente invention est utile pour le diagnostic de l'asthme. Par ailleurs, elle est également utile pour le diagnostic de la BPCO.
Les inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, que l'analyse de l'expression du gène d'un récepteur couplé aux protéines G, GPR15, est particulièrement adaptée pour la caractérisation des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, et tout particulièrement de l'asthme et de la BPCO. L'analyse du profil d'expression du gène GPR15 permet d'établir de manière rapide et fiable, indépendamment de facteurs extérieurs à la maladie, si un sujet est atteint d'une ou l'autre maladie inflammatoire pulmonaire chronique : les inventeurs ont découvert que les patients présentent un profil d'expression du gène GPR15 différent selon qu'ils sont atteints d'asthme ou de BPCO. Le biomarqueur selon l'invention permet donc de déterminer si un patient est atteint d'asthme ou d'une BPCO. L'utilisation du profil d'expression du gène GPR15 selon l'invention permet l'établissement d'un diagnostic à partir d'un simple échantillon biologique, et notamment un échantillon sanguin, du patient, ce qui rend un tel diagnostic simple et peu coûteux. En outre, le suivi dans le temps du profil d'expression du biomarqueur selon l'invention chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique permet d'étudier l'évolution de la maladie avec ou sans traitement, ou de pronostiquer son évolution. Notamment, le bio marqueur pourrait être utilisé pour déterminer le stade de la maladie. Enfin, l'utilisation du profil d'expression du gène GPR15 selon l'invention permet de sélectionner le traitement le plus adéquat pour les patients et/ou de sélectionner les patients nécessitant un suivi clinique particulier.
Ainsi l'invention a pour objet un procédé in vitro ou ex vivo de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, selon lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15. Dans un exemple particulier de l'invention, le procédé est mis en œuvre pour diagnostiquer/pronostiquer/évaluer l'évolution de l'asthme chez un sujet, une sous- expression du gène GPR15 étant indicative de l'asthme.
Dans un autre exemple particulier de l'invention, le procédé est mis en œuvre pour diagnostiquer/pronostiquer/évaluer l'évolution d'une BPCO chez un sujet, une surexpression du gène GPR15 étant indicative d'une BPCO. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic de la BPCO chez un sujet, dans lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène du récepteur couplé aux protéines G 15 (GPR15) et on compare le niveau d'expression du gène GPR15 à un niveau d'expression de référence prenant en compte l'âge du patient, une surexpression de GPR15 étant indicative de BPCO.
Ainsi, la présente invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic permettant de déterminer si un patient est atteint d'asthme ou d'une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), dans lequel on mesure dans un échantillon biologique du patient le niveau d'expression du gène du récepteur couplé aux protéines G 15 (GPR15), une sous- expression de GPR15 étant indicative de l'asthme et une surexpression de GPR15 étant indicative d'une BPCO.
Le niveau d'expression du gène GPR15 dans l'échantillon biologique du sujet à diagnostiquer/pronostiquer est comparé à un niveau d'expression de référence. De préférence, le niveau d'expression de référence prend en compte l'âge du patient.
La présente invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic de l'asthme et/ou la BPCO chez un sujet, dans lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15 et on compare le niveau d'expression du gène GPR15 à un niveau d'expression de référence prenant en compte l'âge du patient, une surexpression de GPR15 étant indicative de BPCO et une sous-expression de GPR15 étant indicative e l'asthme.
Selon l'invention, on mesure avantageusement le niveau d'expression du gène GPR15 au niveau nucléique et/ou protéique, par exemple en mesurant la quantité d'ARNm transcrit et/ou en mesurant la quantité de protéine GPR15 à l'aide d'au moins une méthode spécifique de mesure de l'expression de GPR15. Les techniques permettant de détecter l'expression du gène GPR15 au niveau nucléique sont bien connues de l'homme du métier. La détection peut notamment être réalisée par RT-PCR quantitative en temps réel, une technique microfluidique, une puce à ADN, le séquençage à haut débit des ARNm, ou toute technique appropriée de quantification de l'ARNm, telle que puce à ARN, méthodes LCR (« Ligase Chain Reaction »), TMA (« Transcription Mediated Amplification »), PCE (« enzyme amplified immunoassay ») et ADNb (« branched DNA signal amplification »), etc. Les techniques permettant de détecter l'expression du gène GPR15 au niveau protéique sont également bien connues de l'homme du métier et peuvent notamment inclure la cytomètrie en flux, l'immunocytochimie quantitative, l'ELISA cellulaire, le test protéique Taqman® (Taqman® Protein Assay, Applied Biosystems), des puces à protéines ou anticorps couplés ou non à la spectrométrie de masse, la liaison de ligands marqués, etc.
Selon un exemple de mise en œuvre de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon de sang total, la détection du produit de l'expression du gène GPR15 se faisant de préférence sur la population leucocytaire totale.
Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15, choisi de préférence parmi un anticorps monoclonal ou polyclonal ou tout autre type de molécules ou macro molécules capables d'interagir de manière spécifique avec la protéine GPR15, un ligand, naturel ou synthétique, ou une séquence nucléique, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de lARNm codant pour GPR15, pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet. La maladie inflammatoire pulmonaire chronique peut être l'asthme ou la BPCO. L'invention porte sur l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 pour le diagnostic de l'asthme ou le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO chez un sujet. La présente invention concerne également l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 et des informations relatives à des niveaux d'expression de GPR15 de référence prenant en compte l'âge pour le diagnostic de la BPCO chez un sujet.
L'invention a également pour objet l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un produit de l'expression du gène de GPR15 comme biomarqueur pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet. De préférence, la maladie inflammatoire pulmonaire chronique est l'asthme ou la BPCO. En outre, l'invention est relative à l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un produit de l'expression du gène de GPR15 comme biomarqueur pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO chez un sujet.
Brève description des figures
Figure 1 : représentation schématique de l'arbre de décisions ayant conduit à la sélection de GRP15 en tant que biomarqueur des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques.
Figure 2 : Boxplot (boîtes à moustaches) montrant le profil d'expression du gène GPR15 chez des patients atteints d'asthme ou de BPCO par rapport au profil d'expression chez des volontaires contrôles ne présentant pas ces maladies.
Figure 3 : Expression du gène GPR15 chez les patients atteints d'asthme ou de BPCO versus contrôles ne présentant pas ces maladies représentée en cycles seuil d'amplification (Ct) en fonction de l'âge.
Description détaillée de l'invention
La présente invention est basée sur l'étude du profil d'expression du gène récepteur couplé aux protéines G 15 [GPR15, GPCR15, ou BOB (Brother of Bonzo)]. La famille des récepteurs couplés aux protéines G regroupe de nombreux récepteurs membranaires, dont GPR15. Le gène codant GPR15 est situé chez l'homme sur le chromosome 3ql l .2-ql3.1 (Heiber et al, Genomics 32, 462-465, 1995). Jusqu'à présent, un lien entre GPR15 et l'infection par le virus de rimmunodéfïcience humaine (VIH) a été mis en évidence (Blaak et al, Journal of virology, 79: 1686-1700, 2005, - Okamoto & Shikano, Journal of Biological Chemistry 286, 7171-7181, 2001). GPR15 serait un co- récepteur de l'entrée du VIH dans les lymphocytes circulants.
Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme "GPR15" fait référence au récepteur couplé aux protéines G 15. Il est décrit dans les bases de données géniques sous les références suivantes : HGNC : 4469 ; GenelD : 2838 ; RefSeq Protein : NP 005281.1 ; RefSeq ARN : NM 005290.1. Bien entendu, GPR15 est relatif à celle de l'humain.
De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence une corrélation entre l'expression de GPR15 et les maladies inflammatoires pulmonaires chroniques. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que l'analyse du profil d'expression du gène GPR15 permet de déterminer de manière fiable si un sujet est atteint d'une maladie pulmonaire inflammatoire chronique, et avantageusement de différencier les sujets atteints d'asthme des sujets atteints d'une BPCO.
Aussi, l'invention propose d'utiliser un produit de l'expression du gène GPR15 comme biomarqueur, notamment pour diagnostiquer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, mais également pour le pronostic et le suivi de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique. De préférence, la maladie inflammatoire pulmonaire chronique est l'asthme ou la BPCO. En particulier, elle propose d'utiliser un produit de l'expression du gène GPR15 comme biomarqueur pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO, c'est-à-dire pour différencier les sujets atteints d'asthme des sujets atteints d'une BPCO.
Plus particulièrement, l'invention propose un procédé in vitro ou ex vivo de diagnostic et/ou de pronostic et/ou d'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet selon lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène récepteur couplé aux protéines G 15 (GPR15).
Dans le contexte de la présente invention, un « sujet » ou un « patient » inclut tout sujet ou patient mammifère, et de préférence un sujet ou un patient humain, incluant notamment les enfants et les adultes.
Par « maladies inflammatoires pulmonaires chroniques », on entend les maladies inflammatoires chroniques des voies aériennes, et plus spécifiquement l'asthme et la broncho-pneumopathie chronique obstructive, incluant les bronchites chroniques et l'emphysème.
Dans le contexte de l'invention, le « diagnostic » a pour objet la détection et/ou identification chez un sujet d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, quelque soit son stade. Notamment, le diagnostic permet de déterminer si un sujet est atteint d'asthme ou d'une BPCO.
Le « pronostic » s'entend de l'évaluation de la maladie quant à la susceptibilité de développer la maladie, et/ou quant à la susceptibilité d'évolution vers un stade/degré plus avancé, et/ou quant aux risques de complications et d'exacerbations, et/ou quant à son issue, etc. L' « évaluation de l'évolution de la maladie » correspond à l'analyse dans le temps de l'évolution de la maladie préalablement diagnostiquée ou pronostiquée. Un tel suivi dans le temps peut permettre de sélectionner, de valider et/ou d'adapter un traitement. Il permet également de déterminer l'intensité du suivi clinique nécessaire pour le patient. Ce suivi permet de déterminer à tout moment si un traitement est nécessaire.
L'invention propose également une méthode pour fournir des informations pouvant être utiles pour diagnostiquer et/ou pronostiquer et/ou évaluer l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet, selon laquelle on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15. De préférence, la maladie inflammatoire pulmonaire chronique est l'asthme ou la BPCO. Plus particulièrement, l'invention propose une méthode pour fournir des informations pouvant être utiles pour diagnostiquer de manière différentielle l'asthme et la BPCO chez un patient, c'est-à-dire pour différencier les sujets atteints d'asthme des sujets atteints d'une BPCO. Selon l'invention, GPR15 peut être utilisé comme biomarqueur pour le pronostic et/ou le diagnostic d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, et plus spécifiquement la BPCO et l'asthme, ainsi que pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO.
De même, GPR15 peut être utilisé comme biomarqueur pour le suivi d'un sujet diagnostiqué comme présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique et/ou pronostiqué comme susceptible de développer une telle maladie et/ou de développer une maladie de stade plus avancé/sévère et/ou de développer des complications et/ou des exacerbations. De préférence, la maladie inflammatoire pulmonaire chronique est l'asthme. Alternativement, la maladie inflammatoire pulmonaire chronique est la BPCO.
Un tel biomarqueur peut également être utilisé pour la sélection de sujets atteints d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique susceptibles de bénéficier d'un traitement particulier et/ou pour évaluer l'évolution de la maladie chez des sujets atteints d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique au cours d'un traitement. GPR15 peut ainsi servir de biomarqueur pour la sélection, l'évaluation et l'adaptation du traitement d'un sujet atteint d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique. L'invention est tout particulièrement utile pour choisir le traitement approprié suivant le fait que le patient souffre d'asthme ou de BPCO. Selon l'invention, GPR15 est utilisé comme biomarqueur des maladies inflammatoires pulmonaires chroniques, et plus spécifiquement l'asthme et la BPCO.
Le profil d'expression du gène GPR15 peut être réalisé de différentes manières, notamment en mesurant, en déterminant ou en dosant la quantité du produit d'expression de ce gène à partir d'un échantillon biologique du sujet. L'échantillon est de préférence un échantillon cellulaire provenant d'un fluide biologique du sujet, tel que le sang. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon du sujet est un échantillon contenant des leucocytes. Les méthodes selon la présente invention peuvent comprendre une étape de prélèvement et/ou une étape de préparation/purification de l'échantillon. Le produit d'expression du gène GPR15 correspond à un produit transcrit ou traduit de ce gène, tel que l'ARNm ou le récepteur couplé aux protéines G GPR15 lui-même.
La quantité de la protéine GPR15 peut être déterminée par toute méthode connue de l'homme de l'art. De manière classique, ces méthodes comprennent une étape de mise en contact de l'échantillon avec un ligand sélectif de la protéine GPR15, tel qu'un anticorps dirigé contre des épitopes spécifiques de GPR15, un fragment ou un dérivé de cet anticorps, ou un ligand endogène ou une petite molécule se liant au récepteur avec une forte affinité.
D'une manière générale, les anticorps anti-GPR15 utilisés dans la présente invention sont des anticorps ou toute molécule protéique ou autre se liant spécifiquement à GPR15 avec une affinité submicromolaire. Ce sont par exemple des anticorps monoclonaux ou des anticorps polyclonaux monospécifiques, c'est à dire qui ne reconnaissent spécifiquement qu'un épitope. De préférence, les anticorps seront spécifiques de la partie extracellulaire du récepteur.
Ces anticorps peuvent notamment être obtenus par toute méthode de production conventionnelle. Notamment, un anticorps anti-GPR15 peut être obtenu par immunisation d'un animal non humain (lapin, souris, etc.) à l'aide du GPR15 ou d'une séquence antigénique de celui-ci, prélèvement puis épuisement de l'antisérum obtenu par exemple sur un immunoadsorbant contenant GPR15, selon des méthodes connues de l'homme du métier. La quantité de protéine GPR15 peut être mesurée en utilisant des techniques de cytométrie en flux, des tests immunologiques (ELISA, EIA, RIA, etc.), des tests radio immuno logiques, chemiluminescents ou fluorescents, des immunoélectrophorèses, immunoprécipitations, l'utilisation de la spectrométrie de masse, etc. Le procédé comporte le plus souvent une étape de révélation du marquage, tel qu'un marquage fluorescent, radioactif, enzymatique, ou par molécule colorée, ou plus généralement tout marquage permettant de mettre en évidence la formation du complexe antigène/anticorps ou toute méthode biophysique permettant de mettre en évidence l'interaction entre GPR15 et une molécule soit protéique soit synthétique (aptamére, ligand, ...)
Selon l'invention, les ARNm du gène GPR15 peuvent être détectés par toute méthode connue de l'homme de l'art. Généralement, ces méthodes requièrent une première étape d'extraction des acides nucléiques contenus dans l'échantillon biologique, par des techniques bien connues de l'homme du métier, utilisant par exemple des enzymes lysant, des solutions chimiques adaptées ou des résines d'extraction spécifiques. On procède ensuite à la mise en contact desdits ARNm avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm de GPR15, dans des conditions permettant l'hybridation avec lesdits ARNm, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées. Les ARNm extraits peuvent également être préalablement amplifiés (par exemple par la technique de RT-PCR). Les techniques de RT- PCR (« reverse transcription polymerase chain reaction ») et notamment la RT-PCR quantitative en temps réel, sont particulièrement préférées. Alternativement, d'autres méthodes de détection d'acides nucléiques peuvent être employées, telles que les méthodes LCR (« Ligase Chain Reaction »), TMA (« Transcription Mediated Amplification »), PCE (« enzyme amplifîed immunoassay »), ADNb (« branched DNA signal amplification ») et séquençage à haut débit. Typiquement, la détection d'ARN du gène GPR15 est réalisée par
l'obtention d'ARN totaux ou messagers à partir d'un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang total,
la synthèse d' ADNc par reverse transcription,
une amplification par PCR de l'ADNc en présence d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du gène GPR15, la quantification du produit de la PCR, en particulier par mise contact avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des AR m de GPR15 (détection indirecte), en particulier dans des conditions permettant l'hybridation, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.
Selon un mode particulier de l'invention, le profil d'expression d'un produit du gène GPR15 dans un échantillon biologique d'un patient est comparé au profil d'expression de référence d'un produit du gène GPR15. Ce profil d'expression de référence peut être celui obtenu à partir d'un échantillon biologique témoin. Bien entendu, le profil d'expression témoin peut correspondre à une moyenne ou une médiane des profils d'expression obtenus pour un panel d'échantillons biologiques témoins. Les niveaux d'expression obtenus dans les échantillons des sujets à analyser et dans les échantillons témoins sont avantageusement normalisés en utilisant le niveau d'expression de protéines connues pour avoir un niveau d'expression stable chez les sujets présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique et chez les sujets sains, tel que HPRT1 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase 1), TBP (TATA binding protein) ou TFRC (Transferrin receptor protein 1) pour l'ARNm des leucocytes humains et tel que la B-actine ou la GAPDH (glycéraldéhyde 3-phospho-déshydrogénase) pour les échantillons protéiques. Préférentiellement, les produits du gène GPR15 analysés pour réaliser le profil d'expression du patient dans un échantillon biologique et pour réaliser le profil d'expression témoin sont identiques, de même que la nature des échantillons utilisés. Ils peuvent cependant comporter d'éventuelles mutations qui seront mises en évidence par séquençage. Dans un exemple de réalisation, le profil d'expression de référence est réalisé à partir d'échantillons biologiques de sujets non susceptibles de présenter une maladie inflammatoire pulmonaire chronique. Un tel profil d'expression de référence permet notamment de diagnostiquer une maladie inflammatoire pulmonaire chronique à un stade très précoce de la maladie. Dans un autre exemple de réalisation, le profil d'expression de référence est réalisé à partir d'échantillons biologiques de sujets présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique diagnostiquée, et dont le stade/degré est avantageusement connu. Il peut être particulièrement intéressant de réaliser des profils d'expression de référence, à partir d'échantillons biologiques de sujets diagnostiqués comme présentant une maladie inflammatoire pulmonaire chronique, pour chacun des stades de la maladie. De tels profils peuvent être notamment utiles pour le suivi de l'évolution de la maladie chez un sujet, afin notamment d'évaluer les risques de complication et/ou d'exacerbation, et/ou de sélectionner, adapter, modifier, débuter ou cesser un traitement.
Par exemple, dans le cas de l'asthme, il est possible de réaliser des profils d'expression de référence à partir de sujets diagnostiqués comme présentant un asthme qualifié de « contrôlé » ou de « non contrôlé » selon la classification GINA (« global initiative for asthma ») (2006, 2011), ou selon des stades de sévérité : intermittent ou persistant léger, modéré ou sévère (GINA 2002). L'asthme peut également être qualifié en fonction de facteurs favorisants comme l'allergie, on parle alors d'asthme allergique ou non allergique.
De même, dans le cas de la BPCO, il est possible de réaliser des profils d'expression de référence à partir de sujets diagnostiqués comme présentant des bronchites chroniques, à partir de sujets diagnostiqués comme présentant un emphysème, et à partir de sujets diagnostiqués comme présentant des bronchites chroniques et un emphysème. Il est également possible de tenir compte du degré d'obstruction bronchique (indice de Tiffeneau : VEMS/CVF < 70%). Par exemple, il est possible de réaliser des profils d'expression de référence à partir de sujets présentant une bronchite chronique légère (VEMS>80%), modérée (50%<VEMS<80%), sévère (30%<VEMS<50%) et très sévère (VEM<30%).
De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence une corrélation entre le niveau d'expression de GPR15 et l'âge du sujet. Cette observation a été étendue à l'ensemble des patients atteints d'asthme, de ceux atteints de BPCO et pour tous les sujets contrôles. Plus particulièrement, comme le montre la Figure 3, les patients atteints d'asthme présentent des niveaux d'expression de GPR15 faibles (notamment, un nombre important de cycles d'amplification est nécessaire pour être détecté) et constants en fonction de l'âge. A contrario, il a été observé que les sujets témoins (sains) et les sujets BPCO présentent un niveau d'expression de GPR15 diminuant en fonction de l'âge. Pour la BPCO, les inventeurs ont mis en évidence que le paramètre de l'âge devait absolument être pris en compte. Ainsi, préférentiellement, le niveau d'expression de référence prend en compte l'âge du patient. Cependant, il peut être également remarqué que pour différencier la BPCO et l'asthme, le paramètre de l'âge du sujet peut éventuellement être négligé car les deux groupes sont suffisamment distincts l'un de l'autre. Des profils d'expression de référence peuvent donc être réalisés en fonction de l'âge des sujets témoins. Le niveau d'expression de GPR15 pour un patient est alors avantageusement comparé au niveau de référence de témoins de la même classe d'âge (âge du patient ± 2,5 ans).
L'apparition des symptômes de la maladie se faisant tardivement pour les patients atteints de BPCO (>40 ans) et plus précocement pour les malades asthmatiques, l'âge de la population témoin s'étage préférentiellement de 18 à 85 ans. Une telle classification en fonction de la classe d'âges peut être particulièrement intéressante pour le diagnostic ou le pronostic de maladies pulmonaires chroniques connues pour se déclarer à un âge particulier. Cette classification peut également s'avérer utile pour l'évaluation de l'évolution de la maladie, et notamment pour les BPCO, dont l'évolution en fonction de l'âge du patient peut être rapide et/ou critique. Les différents critères exposés ci-dessus pour la réalisation de profils d'expression témoins ne sont pas exclusifs les uns des autres. Par exemple, il peut être particulièrement intéressant de réaliser des profils d'expression de référence en fonction du stade de la maladie et de l'âge des sujets.
Les inventeurs ont découvert que les patients atteints d'asthme présentent un profil d'expression du gène GPR15 opposé au profil d'expression des patients atteints d'une BPCO. Ainsi, l'utilisation du biomarqueur GPR15 se révèle particulièrement pertinente pour déterminer de manière fiable si un sujet est atteint de l'une ou l'autre de ces deux maladies pulmonaires chroniques.
Plus précisément, les sujets atteints d'asthme présentent une diminution de l'expression du produit du gène GPR15 par rapport à l'expression du produit du gène GPR15 chez un sujet témoin, non atteint de cette maladie. A l'inverse les sujets atteints d'une BPCO présentent une surexpression du produit du gène GPR15 par rapport à l'expression du produit du gène GPR15 chez un sujet témoin, non atteint de cette maladie. Dans un exemple de mise en œuvre de l'invention, le procédé comprend une étape pour déterminer si le niveau d'expression du produit du gène GPR15 chez un sujet est élevé ou faible par rapport au niveau d'expression de référence.
Dans un exemple de mise en œuvre, on considère que le niveau d'expression de référence correspond à un niveau d'expression normal du produit du gène GPR15, c'est-à-dire hors toute maladie inflammatoire pulmonaire chronique. Le niveau d'expression chez le sujet est considéré comme élevé, et donc présente une surexpression, si ledit niveau est par exemple au moins supérieur de 20, 30, 40 ou 50% au niveau d'expression de référence après normalisation, et préférentiellement au moins supérieur de 100%, 150% ou 200%. A l'inverse, le niveau d'expression chez le sujet est considéré comme faible, et donc présente une sous-expression, si ledit niveau est par exemple au moins inférieur de 20, 30, 40 ou 50% au niveau d'expression de référence après normalisation, et préférentiellement au moins inférieur de 100%), 150%) ou 200%>. Le propre niveau d'expression du produit du gène GPR15 du patient à un temps t donné peut servir de niveau d'expression de référence pour le suivi de l'évolution de la maladie dudit patient à un temps t+1. Une surexpression ou une sous-expression du produit du gène GPR15 du patient à t+1 par rapport au niveau d'expression du produit du gène GPR15 du patient au temps t peut être indicative d'une amélioration ou d'une dégradation de l'état de santé dudit patient en fonction de la maladie observée. Dans un autre exemple de mise en œuvre, on considère que le niveau d'expression de référence correspond à un niveau d'expression du produit du gène GPR15 pour une population de patients souffrant d'asthme pour le diagnostic de l'asthme ou de la BPCO pour le diagnostic de celle-ci. Ainsi, des courbes ou nuages de référence seront définis pour l'asthme et/ou la BPCO en fonction de l'âge. Une fois que l'expression du produit du gène GPR15 pour le sujet à diagnostiquer a été déterminée, celle-ci sera comparée à ces courbes ou nuages de référence en tenant compte de l'âge du patient et il pourra être déterminé si le sujet souffre de BPCO ou d'asthme.
Par ailleurs, il est proposé d'utiliser le profil d'expression du gène GPR15 pour déterminer le stade d'une maladie pulmonaire chronique, en particulier la BPCO. Ainsi, des références d'expression du gène GPR15 seraient déterminées pour chaque stade de la BPCO. De préférence, ces références d'expression du gène GPR15 tiennent compte du stade de la BPCO et de l'âge du patient. Ainsi, la présente invention est relative à une méthode in vitro pour déterminer le stade de BPCO chez un sujet, dans laquelle on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15, on compare le niveau d'expression du gène GPR15 à des niveaux d'expression de référence prenant en compte le stade de la BPCO et de préférence l'âge du sujet, et sur la base de cette comparaison, on détermine le stade de la BPCO chez le sujet. L'information d'un malade sera positionnée par rapport à un ensemble de données de référence permettant ainsi de déterminer l'état de la pathologie du patient considéré. Les modes de réalisation particuliers décrient ci-dessus sont applicables dans cette méthode.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15, choisi parmi un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre GPR15 ou toute molécule protéique ou autre se liant spécifiquement à GPR15 avec une affinité submicromolaire, une sonde capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour GPR15, et au moins une paire d'amorces d'acide nucléique spécifiques de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour GPR15, pour le diagnostic et/ou le pronostic et/ou l'évaluation de l'évolution d'une maladie inflammatoire pulmonaire chronique chez un sujet. De préférence, la maladie inflammatoire pulmonaire chronique est l'asthme ou la BPCO. En outre, l'invention porte sur l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO chez un sujet.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 et des informations relatives à des niveaux d'expression de GPR15 de référence prenant en compte l'âge pour le diagnostic de la BPCO. En particulier, les informations pourront être une courbe/nuage de référence de l'expression de GPR15 chez des individus contrôles en fonction de l'âge, et/ou une courbe/nuage de référence de l'expression de GPR15 chez des des sujets asthmatiques en fonction de l'âge, et/ou une courbe/nuage de référence de l'expression de GPR15 chez des sujets souffrant de BPCO en fonction de l'âge.
Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'invention concerne l'utilisation d'un kit pour déterminer le stade de la BPCO, comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 et des informations relatives à des niveaux d'expression de GPR15 de référence prenant en compte le stade de la BPCO et facultativement l'âge. En particulier, les informations pourront être une courbe/nuage de référence de l'expression de GPR15 chez des individus souffrant de la BPCO en fonction du stade de la maladie et facultativement de l'âge. L'information d'un malade sera positionnée par rapport à un ensemble de données de référence permettant ainsi de déterminer l'état de la pathologie du patient considéré.
Dans un exemple de réalisation particulier de l'invention, le kit peut comporter un moyen pour détecter le complexe formé entre la protéine GPR15 et le ligand, et/ou un moyen pour détecter l'hybridation d'au moins une sonde spécifique à un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour GPR15 et/ou des moyens pour amplifier et/ou détecter ledit ARNm ou ADNc.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée.
EXPERIMENTATIONS Matériel et méthode
Caractéristiques des patients
Les patients asthmatiques et leurs contrôles génétiquement appariés (ascendant, descendant, fratrie) sont recrutés aux services de pneumologie à l'hôpital de Nantes (Pr A. Magnan) et de Marseille (Pr P. Chanez). Les caractéristiques de ces volontaires sont décrites dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Caractéristiques des patients asthmatiques et leurs contrôles apparentés
F = Femme ; H = Homme ; Fu = Fumeur ; NFu = Non Fumeur ; Ex = Ex-Fumeur ; ND = Non Déterminé
VEMS = Volume expiratoire maximum seconde.
PD20 = Dose de métacholine provoquant une chute de 20% du VEMS.
Dernière exacerbation : dernière hospitalisation due à une infection respiratoire liée à une amplification des symptômes de la maladie
Phadiatop : test d'évaluation allergique
Les patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive ou BPCO et leurs contrôles environnementaux appariés (conjoint, voisin) sont recrutés au service de pneumologie des hôpitaux universitaires de Strasbourg (Pr R. Kessler). Les caractéristiques de ces volontaires sont décrites dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Caractéristiques des patients BPCO et leurs contrôles environnementaux appariés
F = Femme ; H = Homme ; Fu = Fumeur ; NFu = Non Fumeur ; Ex = Ex-Fumeur ; Passif = Tabagisme Passif
VEMS = Volume expiratoire maximum seconde.
Indice de Tiffeneau : rapport VEMS/CVF (Capacité Vitale Forcée) en pourcentage. Chez un patient obstructif : VEMS/CVF < 70%
PD20 = Dose de métacholine provoquant une chute de 20% du VEMS.
Stade de gravité = stade modéré : 80 à 50%> de la valeur théorique du VEMS ; Stade sévère : 50 à 30% de la valeur théorique du VEMS
Dernière exacerbation : dernière hospitalisation due à une infection respiratoire liée à une amplification des symptômes de la maladie
Phadiatop : test d'évaluation de la sensibilisation aux pneumallergènes communs L'étude a été réalisée après saisine du Comité Consultatif de Protection des Personnes se prêtant à la Recherche Biomédicale (CCPPRB) Alsace N°l en date du 14 juin 2005, conformément à la loi Huriet N°88-1138 du 20 décembre 1988 modifiée du code de la santé publique, et a été déclarée auprès de la Haute Autorité de Santé. Les amendements au protocole (promotion, investigateurs complémentaires) ont été saisis par le comité de protection des personnes (CPP Est n°IV).
Obtention des leucocytes
Les leucocytes totaux sont obtenus à partir du sang total (20 ml) prélevé sur EDTA. Six ml de sang sont injectés à travers un filtre microporeux LeukoLOCK™ (Fractionation & Stabilization Kit, Life Technologies™) retenant les leucocytes. Le filtre est rincé à l'aide de PBS, puis de KNAlater® permettant la conservation des ARN et stocké à -80°C jusqu'à l'extraction de TARN.
Extraction et purification des ARN Après décongélation, la solution de KNAlater® est éliminée par injection d'air dans le filtre à l'aide d'une seringue. Une solution Lysing/Binding solution concentrate (Total RNA isolation Kit, LeukoLOCK™) permettant la lyse des cellules est ajoutée au filtre. Le lysat est récupéré dans un tube Falcon 15 ml et traité par la protéinase K du kit. Les ARN sont fixés sur des billes par ajout de RNA Binding Beads et centrifugés. Le surnageant est éliminé, les billes lavées 3 fois par une solution contenant de l'isopropanol puis de l'éthanol. Les ARN sont alors élués (50μ1 ; solution d'élution, LeukoLOCK™) dans un tube Eppendorf qui peut être conservé à -80°C.
Les ARN totaux sont purifiés par centrifugation sur gel de silice qui présente une affinité élevée pour l'ARN (RNeasy® mini kit, Qiagen), élués par eau DEPC (50 μΐ) et récupérés dans un tube Eppendorf qui est stocké à -80°C.
Quantification et qualité de l'ARN
Les ARN totaux sont quantifiés par deux techniques différentes : 1) spectrophotomètre NanoDrop® (Thermo Scientifîc) de grande précision permettant l'analyse de micro volumes (1 μΐ) résultant en un spectre d'absorption de 230 à 350 nm ; un ARN de bonne qualité est défini par des rapports A26o A28o proche de 2 et A230/A26o compris entre 1,8 et 2,2 ; 2) mesure de fluorescence (Fluoromètre Qubit™, Qiagen) grâce à un intercalant fluorescent Quant-it™ RNA assay Kit (Qiagen). Le résultat est exprimé en concentration d'ARN proportionnelle à la fluorescence émise. Cette concentration est comparée à celle obtenue sur le NanoDrop®. Un rapport compris entre 0,9 et 1,1 permet l'acceptation de l'ARN pour la poursuite de l'analyse. Dans le cas contraire, l'ARN est éliminé (Figure 1).
Intégrité des ARN
L'intégrité de l'ARN est mesurée par électrophorèse capillaire automatisée (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies) utilisant des puces "RNA 6000 Nano LabChip " (Agilent Technologies). Un agent fluorescent se liant à l'ARN est ajouté ; l'ARN est soumis à un champ électrique et la fluorescence émise est mesurée. La qualité de l'ARN est évaluée par le rapport ARNr 28S / ARNr 18S et par l'analyse d'un électrophorégramme complet incluant les ARN dégradés de petite taille, résultant en une valeur de RIN (RNA Integrity Number). L'intégrité de l'ARN est validée par un rapport 28S/18S > 1,8 et un RIN > 7 (Figure 1).
Contamination par l'ADN génomique
L'analyse des RCPGs en PCR quantitative nécessite la vérification de l'absence d'ADN génomique résiduel qui pourrait interférer. Cette validation est réalisée par amplification d'un gène hautement exprimé sur les échantillons d'ARN à l'aide d'un couple d'amorces dessinées sur un seul exon (TaqMan® Gene Expression Assay). Une absence d'amplification lors de la PCR valide l'absence d'ADN génomique dans l'échantillon. Les ARN ne satisfaisant pas à cette étape sont éliminés (Figure 1).
Transcription inverse
Lors de la transcription inverse, une expérience permettant de valider l'absence d'inhibiteurs de PCR dans les échantillons d'ARN est mise en place. Elle implique l'introduction d'un ARN étranger ne comportant aucune séquence homologue d'ARN eucaryote (Alien®, Stratagene) dans les échantillons. Les ARN totaux (1 μg) ayant passé le crible Go-NoGo représenté sur le schéma 1 sont additionnés de l'ARN Alien® (2 μΐ, 106 copies) et soumis à transcription inverse à 37°C pendant 2h en présence d'une transcriptase inverse d'origine virale la Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MuLV, Life Technologies ). Le mélange réactionnel (commercialisé par Life Technologies ) comprend la MuLV, les désoxynucléotides triphosphate, les amorces dégénérées, des inhibiteurs de RNase dans le tampon RT du kit dans un volume final de 100 μΐ.
Validation de l'absence d'inhibiteurs de PCR L'amplification par PCR en temps réel est réalisée en plaques 96 puits sur ABI PRISM® 7000 (Life Technologies). L'ADNc Alien® en présence d'ADNc d'intérêt est amplifié à l'aide d'amorces Alien® (Stratagène). Les valeurs de cycle seuil d'amplification (Ct) d' Alien® sont comparées en présence et en absence d'échantillons d'ADNc à différentes dilutions. La dilution permettant l'amplification de l'ADNc Alien® non modifiée correspond à une dilution au l/3e de l'échantillon d'ADNc d'intérêt. Cette dilution correspond à une dilution suffisante des résidus de traitement des échantillons (phénol, éthanol, guanidine, EDTA) jouant le rôle d'inhibiteurs de PCR.
Quantification de l'expression génique des RCPGs
La quantification de l'expression génique des RCPGs par PCR quantitative en temps réel est réalisée sur ABI PRISM® 7900 (Life Technologies™) en carte microfluidique 384 puits « TaqMan® Low Density Array » (TLD A, Life Technologies™). Chaque puits de la carte TLDA contient une sonde TaqMan® lyophilisée et un couple d'amorces spécifiques. Parmi les 384 couples d'amorces, 360 sont spécifiques des gènes RCPGs, 20 de gènes domestiques et 4 d'un gène contrôle, le 18S. L'amplification se déroule pendant 2 h dans un volume réactionnel final de 2 μΐ. Les résultats d'expression du gène biomarqueur mis en évidence sont confirmés par PCR quantitative en plaque 96 puits sur ABI PRISM® 7000.
Analyse statistique et expression des résultats
Les résultats des amplifications sont délivrés pour chaque gène en valeur de cycle seuil d'amplification (Ct) par le logiciel RQ Study intégré à l'ABI PRISM® 7900. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le tableur Excel et le logiciel R.
RESULTATS ET ANALYSE
Les valeurs de l'expression de GPR15 chez les contrôles asthme et les contrôles BPCO ne sont pas signifïcativement différentes (p= 0.20728197) ; les deux ensembles contrôles ont donc été fusionnés pour constituer l'ensemble « contrôle », augmentant ainsi la puissance d'analyse.
Les résultats de l'expression de GPR15 sont représentés graphiquement : i) en boîtes à moustaches (Figure 2), ii) en dispersion point-par-point du Ct en fonction de l'âge des patients et une droite résumant la variation en fonction de l'âge pour chaque groupe (Figure 3).
Les valeurs d'expression de GPR15 pour les patients BPCO et le groupe contrôle sont signifïcativement différents (p= 0.00164019) (figure 2).
Les valeurs d'expression de GPR15 pour les patients Asthmatiques et le groupe contrôle sont aussi signifïcativement différents (p= 0.02535037) (figure 2).
L'analyse de l'expression de GPR15 dans le groupe contrôle montre une corrélation de l'expression avec l'âge du patient (r2=0.32) de même que dans le groupe BPCO (r2=0.51).
La figure 3 illustre cette dépendance de la valeur d'expression de GPR15 dans les différents groupes de patients avec la variable âge. Trois valeurs atypiques sont observées dans le groupe BPCO : il s'agit d'un asthmatique fumeur (Al 006), pour lequel le diagnostic est à confirmer ; un sujet contrôle fumeur (C2010, 30 paquets/année) ; et un sujet contrôle non fumeur (C1001) avec un indice de Tiffeneau (VEMS/CVF%) à 78 et qu'il faudra revoir.

Claims

REVENDICATIONS
Procédé in vitro de diagnostic permettant de déterminer si un patient est atteint d'asthme ou d'une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), dans lequel on mesure dans un échantillon biologique du patient le niveau d'expression du gène du récepteur couplé aux protéines G 15 (GPR15), une sous-expression de GPR15 étant indicative de l'asthme et une surexpression de GPR15 étant indicative d'une BPCO.
Procédé in vitro de diagnostic de l'asthme chez un sujet, dans lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15, une sous-expression de GPR15 étant indicative de l'asthme.
Procédé in vitro selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on compare le d'expression du gène GPR15 à un niveau d'expression de référence.
Procédé in vitro selon la revendication 3, dans lequel le niveau d'expression de référence prend en compte l'âge du patient.
Procédé in vitro de diagnostic de la BPCO chez un sujet, dans lequel on mesure dans un échantillon biologique du sujet le niveau d'expression du gène GPR15 et on compare le niveau d'expression du gène GPR15 à un niveau d'expression de référence prenant en compte l'âge du patient, une surexpression de GPR15 étant indicative de BPCO.
6- Procédé in vitro selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le niveau d'expression du gène GPR15 est déterminé en mesurant la quantité de protéine GPR15.
7- Procédé in vitro selon la revendication 6, dans lequel la quantité de protéine GPR15 est mesurée par immuno fluorescence, chemiluminescence, immunohistochimie, immunocytochimie, ELISA, le test protéique Taqman®, puce à protéines ou anticorps.
8- Procédé in vitro selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel le niveau d'expression du gène GPR15 est déterminé en mesurant la quantité d'AR m codant la protéine GPR15.
9- Procédé in vitro selon la revendication 8, selon lequel la quantité d'ARNm de GPR15 est mesurée par la technique de RT-PCR quantitative en temps réel, par technique micro fluidique, puce à ARN, méthodes LCR, TMA, PCE ,ADNb ou séquençage à haut débit.
10- Procédé in vitro selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin.
11- Procédé in vitro selon la revendication 10, dans lequel le produit de l'expression du gène GPR15 est détecté dans les leucocytes.
12- Utilisation d'un kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO chez un sujet ou pour le diagnostic de l'asthme chez un sujet, ou pour le diagnostic de la BPCO chez un sujet en tenant compte de son âge.
13- Utilisation d'un kit pour le diagnostic de la BPCO chez un sujet, le kit comprenant au moins un réactif spécifique du produit de l'expression du gène GPR15 et des informations relatives à des niveaux d'expression de GPR15 de référence prenant en compte l'âge.
14- Utilisation selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle le réactif est choisi parmi un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre le GPR15, un ligand naturel ou synthétique du GPR15, une séquence nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de lARNm codant la protéine GPR15. - Utilisation in vitro d'un produit de l'expression du gène GPR15 pour le diagnostic pour le diagnostic différentiel de l'asthme et de la BPCO chez un sujet, pour le diagnostic de l'asthme chez un sujet, ou pour le diagnostic de la BPCO chez un sujet en tenant compte de son âge.
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