EP2799531A1 - Einsatz von Phosphatasen zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden - Google Patents

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EP2799531A1
EP2799531A1 EP13166529.1A EP13166529A EP2799531A1 EP 2799531 A1 EP2799531 A1 EP 2799531A1 EP 13166529 A EP13166529 A EP 13166529A EP 2799531 A1 EP2799531 A1 EP 2799531A1
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EP
European Patent Office
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oil
phospholipase
enzymes
phytase
phosphatase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13166529.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kirstin Dr. Suck
Ulrich Dr. Sohling
Paul Bubenheim
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Clariant Produkte Deutschland GmbH
Original Assignee
Clariant Produkte Deutschland GmbH
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Filing date
Publication date
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Priority to ARP140101797A priority patent/AR096185A1/es
Priority to PCT/EP2014/001161 priority patent/WO2014177279A1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/001—Refining fats or fatty oils by a combination of two or more of the means hereafter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C11B3/04—Refining fats or fatty oils by chemical reaction with acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/16—Refining fats or fatty oils by mechanical means

Definitions

  • the invention relates to a method for increasing the oil yield in the degumming of triglycerides by using a phosphatase. Furthermore, the invention relates to the use of at least one phosphatase for degumming crude vegetable oils. Another aspect of the invention relates to the de-oiling of vegetable oil slime, wherein in addition to the increase in oil yield, the recovery and purification of lecithin is in the foreground.
  • Raw vegetable oils contain phosphatides, protein and carbohydrate-containing substances, phytochemicals and colloidal compounds, which greatly reduce the shelf life of the oil. These substances must therefore be removed.
  • the chemical refining consists of the processes 1. Degumming, 2. Neutralization, 3. Bleaching, 4. Deodorization. During degumming, phospholipids ("gums") and metal ions (Ca 2+ , Mg 2+ ) are removed from the oil. The neutralization serves to extract the fatty acids. Bleaching removes the dyes, other metal ions and residual mucilage. Deodorization is a steam distillation process that removes other compounds that affect the smell and taste of the oil. In physical refining, deacidification is performed along with deodorization at the end of the refining process.
  • the degumming of the oils can be carried out by extraction of the phospholipids with water or an aqueous solution of an acid which complexes Ca 2+ and Mg 2+ ions, such as e.g. As citric acid or phosphoric acid. Often one first carries out an aqueous, so-called pre-degumming with which the water-soluble phospholipids are removed. This is called hydratable phospholipids.
  • triglycerides is understood to mean triple esters of glycerol with fatty acids, which are the main constituent of natural fats and oils, be it of vegetable or animal origin. Triglycerides include vegetable or animal fats and oils, and mixtures thereof both with each other and with synthetic or modified fats and oils.
  • vegetable oil is understood here to mean any oil of plant origin.
  • preferred oils are soybean oil, rapeseed oil, canola oil, sunflower oil, olive oil, palm oil, jatropha oil, camelina oil or cottonseed oil.
  • the vegetable oil according to the invention comprises mixtures of different vegetable oils with one another, as well as the mixture of vegetable oil with animal and / or synthetic or modified fats and oils.
  • raw refers to the fact that the oil has not yet undergone degumming, neutralization, bleaching and / or deodorization step. It is also possible in the context of the method according to the invention that a mixture of several crude oils is used or pretreated, eg pre-degummed and / or preconditioned oils are treated with the enzymes.
  • pre- degumming or "wet degumming” is understood to mean a treatment of the crude oil with water or an aqueous acid solution in order to remove water-soluble phospholipids as far as possible from the oil. Also, in the context of a pre- or wet degumming after the addition of acid, if necessary, an addition of alkali to neutralize the acid. Before the enzyme addition, the separation of the aqueous phase takes place. After pre-degumming, the phosphorus content in the crude oil is reduced from approx. 500-1500 ppm, eg for soybean and rapeseed, to below 200 ppm in the pre-degummed oil.
  • lecithin can be obtained from the resulting slime phase or the slime phase can be worked up as feed.
  • the disadvantage of separating off the aqueous phase or lowering the phosphorus content is a yield loss with respect to the oil.
  • the phosphatides passing into the aqueous phase have an emulsifying effect and cause some of the oil to be emulsified in the aqueous phase and separated therewith. Subsequently, the oil can be further treated enzymatically, wherein the enzymes may need to be separated in a further step.
  • preconditioning of the oil in this invention means the addition of water or an aqueous acid solution to the untreated oil. Subsequently, by addition of alkali, for. For example, sodium hydroxide, adjusted to a pH at which the following enzymatic reaction takes place. Ideally, the optimal pH for the enzyme reaction is adjusted from 4 to 7. Subsequently, however, no separation of the aqueous phase, but immediately the addition of the enzymes. The existing mucilages remain so for the time being in the oil or in the emulsion. The separation of the aqueous phase and thus the Enzymes take place only after the action of the enzymes on the (possibly preconditioned) crude oil.
  • alkali for.
  • sodium hydroxide adjusted to a pH at which the following enzymatic reaction takes place.
  • the optimal pH for the enzyme reaction is adjusted from 4 to 7.
  • no separation of the aqueous phase but immediately the addition of the enzymes.
  • the existing mucilages remain so for the time being in the
  • phosphatase is understood to mean a group of enzymes which split off phosphoric acid from phosphoric esters or polyphosphates.
  • Phytase is the name for enzymes that hydrolytically degrade phytic acid and thus release the bound phosphate. Depending on which phosphate group is broken down, a distinction is made between 3-, 4-, 5- and 6-phytase. Phytases are known from animals, plants, fungi and bacteria; the best characterized phytases are from fungi. The phytase formed by many plants and bacteria acts as a 3-phytase; this is used commercially together with 6-phytase. 4-phytase is an acid phosphatase.
  • Acid phosphatases are phosphatases whose pH optimum is in the acidic pH range, such as 4.0 to 5.5.
  • Phospholipases D which split or exchange the head group.
  • Phospholipases B which cleave the fatty acid in both the sn 1 and sn 2 positions to form a 1,2-lysophospholipid.
  • acyltransferase is understood to mean an enzyme that acyl groups, for example fatty acids from a phospholipid, onto one suitable acceptor, eg a sterol, to form an ester transfers.
  • the phosphorus content of the oil when the oils are used, for example, for the production of biodiesel.
  • the phosphorus content of the biodiesel is limited to 5 ppm and it is expedient to carry out the phosphorus reduction already on the oil side.
  • a particularly low phosphorus content ie a phosphorus content which is as low as possible and preferably 0, is necessary if the oils are hydrogenated in further treatment steps either for the use of food, ie converted unsaturated into saturated fatty acids, or if, according to the NxBTL process of Neste, hydrogenation is carried out in such a way that alkanes, that is to say a conventional biodiesel fuel, but produced from vegetable oil, are obtained as the end product.
  • the so-called enzymatic degumming avoids several disadvantages of existing processes or further improves the extraction process.
  • the enzymatic degumming is brought about in the prior art by the use of phospholipases, in particular phospholipase A1 and A2, phospholipase B, phospholipase C or phospholipase D or a combination of phospholipases.
  • An alternative concept for oil degumming represents the systems of the company Danisco, in which a Lipidacyltransferase is used. This enzyme also turns a phospholipid into a lysophospholipid, but transfers the fatty acid residue to a sterol in the oil phase.
  • the corresponding enzymes and methods of using these enzymes are in the WO 2006/008508 and the WO 2009/081094 described.
  • Phytases are marketed primarily as feed additives on the market. About two-thirds of phosphorus in plant feed for livestock are bound to phytic acid or its salts and can be cleaved only by the phytases and thereby made available for the phosphate metabolism of livestock. However, the phytases do not occur in the gastrointestinal tract of pigs and poultry. In order to improve the utilization of phosphorus from vegetable feeds, phytases are added to the animal feed.
  • Such phytases are for example in the patents EP1066373B1 (Novozymes), EP2295553 (Novozymes), US6475762 (Genencor International), WO9855599 (Gist Brocades); WO9949740 (DSM); WO2004071218 (DSM); WO2011117396 (Novozymes), US2009081331 (BASF); WO2009129489 (Danisco US INC.).
  • Typical phytases available on the market are the products Natuphos® from BASF (3-phytase), Ronozyme® from DSM, Axtra® PHY and Phyzyme® from Danisco.
  • phytases are in the modification of plant foods and is for example in the WO2004 / 071218 and the US2004058049 described.
  • the phytic acid especially in the neutral environment of the intestine, forms (sparingly soluble) salts with the divalent ions of the minerals and thus reduces their absorption. This should be the case in particular for the ions of Fe, Zn and Ca.
  • these effects can be reduced. It is discussed to pretreat foods with phytase to make the minerals contained therein more available / absorbable. That's how it describes US2004058049A1 the addition of phytases in soft drinks.
  • the object of the present application is to develop an alternative process for the enzymatic degumming of triglycerides, which reduces the phosphorus content of the oil to be degummed, increases the oil yield and / or increases the reaction rate of the enzymatic degumming. At the same time, this method should enable economic implementation on an industrial scale.
  • a further object of the invention is to provide a process for obtaining lecithin from triglycerides, in particular from crude soybean, sunflower or rapeseed oil, in high yield, wherein the content of oil in the lecithin obtained is as low as possible, or in other words, the De-oiling the lecithin or reducing the oil content in the vegetable oil slime.
  • an (acidic) phosphatase and / or a phytase are particularly suitable for degumming triglycerides or for de-oiling lecithin.
  • the use of acidic phosphatases or phytases in the enzymatic oil degumming was not previously known.
  • only applications of these enzymes in purely aqueous systems have been known, but not in oil-water two-phase systems as used in aqueous oil degumming.
  • those phytases are suitable, which are already used for the treatment of food.
  • vegetable oil slime can be used, which is obtained in the degumming of vegetable oils, either by degumming by conventional or the inventive method.
  • the vegetable oil slime is brought into contact with the at least one phosphatase according to step a) and then after step b2), which is carried out analogously to b1), separated into an aqueous, lecithin-containing phase and an oil-containing phase.
  • the slime phase or the vegetable oil slime is used in particular in the production of lecithin.
  • the at least one phosphatase is an acid phosphatase or a phytase or a combination of both enzymes.
  • the acid phosphatase is preferably one or more enzymes of the enzyme class EC 3.1.3.2.
  • the enzymes of this class are generally substrate-unspecific, cleave from a variety of organic substrates phosphate groups and have a pH optimum of less than or equal to 7, preferably less than or equal to 6.5, more preferably of less than or equal to 6.
  • the lower limit of the pH is preferably 3.0, more preferably 3.5. In this pH range, a fast reaction is possible.
  • acid phosphatases can also be isolated from milk such as mammalian milk.
  • Purple Acid Phospatases are a distinct class of acid phosphatases that contain dinuclear transition metal centers and show a violet color in solution.
  • a typical representative of this class is the purple acid phosphatase from the sweet potato, as you for example from Kusudo T, Sakaki T, Inouye K. Purification and Characterization of Purple Acid Phosphatase PAP1 from Dry Powder of Sweet Potato, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003 67 (7): 1609-11 is described.
  • PAPs are also widely available and can also be isolated from soybean, rice, onions and red kidney beans. In addition, such enzymes can also be isolated from bacteria or mammals.
  • the acid phosphatase is derived from plants, in particular from sweet potato, from wheat germ or soya, from mammalian milk or from fungi, yeasts or bacteria.
  • the phytase used in the process according to the invention is a single phytase or a mixture of two or more phytases. It is preferably a so-called 3-phytase (enzyme class EC 3.1.3.8), 4-phytase (enzyme class EC 3.1.3.26), 5-phytase (enzyme class EC 3.1.3.72) or 6-phytase (enzyme class EC 3.1.3.26) , (Citation: Enzymes in Industry, Wolfgang Aehle Editor, Wiley VCH, Weinheim, Second Edition, 2004 Chapter 5 Industrial Enzyme, p.
  • the numbers refer to the position of the phosphate groups in the phytic acid, which are the first cleaved by the action of phytases. Thereafter, depending on the reaction time and the reaction conditions, further phosphate groups are split off.
  • Phytases are bulk enzymes that are industrially produced on a large scale.
  • the phytase is derived from the following organisms: plants, bacteria, yeasts and fungi.
  • the phytase is derived from corn, soybean, wheat bran, Bacillus species, Escherichia coli species, Klebsiella species, Pseudomonas species, Aspergillus species, Trichoderma Species, Rhizopus species, Saccharomyces species, Pichia species, Penicillium species, Schwanniomyces species, Arxula adeninivorans.
  • the phytases used in the process according to the invention have a pH optimum at a pH of less than or equal to 8, preferably less than or equal to 7; most preferably less than or equal to 6.
  • the lower limit of the pH is preferably 3.0, more preferably 3.5.
  • a phospholipid-cleaving enzyme is used.
  • the phospholipid-cleaving enzyme is a phospholipase A1, phospholipase A2, phospholipase B, phospholipase C, phospholipase D or acyltransferase. More preferably, the phospholipid-cleaving enzyme is selected from phospholipase A1, phospholipase A2 or phospholipase B.
  • the phospholipase A1 is obtained from the following species: Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas species, Trichoderma reesei, Pichia pastoris, porcine pancreas or bovine pancreas.
  • the phospholipase A1 is from Thermomyces lanunginosus.
  • Phospholipase A2 is preferably and independently produced from the following sources: porcine pancreas, bovine pancreas, Streptomyces violaceoruber, Naja mossambica, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Trichoderma reesei, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes or Pseudomonas species.
  • the phospholipase B is preferably and independently obtained from the following species: Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Pichia pastoris, Trichoderma reesei, Pseudomonas species, porcine pancreas or bovine pancreas.
  • Phospholipase C is preferably and independently obtained from the following species: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Pichia pastoris or Pseudomonas species.
  • the phospholipase D is derived from the following species: porcine pancreas, bovine pancreas, cabbage, peanut, Streptomyces species, Streptomyces chromofuscus, Streptomyces violaceoruber, Naja mossambica, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Trichoderma reesei, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes or Pseudomonas species.
  • the phospholipase A1 is selected from Thermomyces lanuginosus or Fusarium oxysporium, and / or independently, the phospholipase A2 is selected from porcine pancreas, bovine pancreas, Streptomyces violaceoruber, Trichoderma reesei, Aspergillus niger or Naja mossambica, and / or independently, the phospholipase C is selected selected from Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Pichia pastoris or Listeria monocytogenes.
  • the process according to the invention is preferably carried out in one of the aqueous phases of the oil-water mixture of less than 7, preferably less than 6, particularly preferably less than 5.
  • the lower limit of the pH is preferably 3.0, more preferably 3.5.
  • the method of the present invention is carried out at a pH of 4.0 to 5.5.
  • the ratio of the phosphatase to the phospholipid-cleaving enzyme ranges from 0.01: 6 units / g of oil to 6: 0.01 units / g of oil.
  • the phosphatase and / or the phospholipid-cleaving enzyme are in supported form.
  • soybean oil, rapeseed oil, canola oil, sunflower oil, olive oil, palm oil, jatropha oil, camelina oil or cottonseed oil are used as oils.
  • an aqueous vegetable oil slime which is obtained in the oil degumming of one of the abovementioned oils, is used.
  • soybean oil is degummed with a phytase, preferably a 3-phytase or 6-phytase, and optionally additionally with a phospholipase A1.
  • rapeseed oil is degummed with an acid phosphatase and optionally additionally with a phospholipase A1.
  • the crude vegetable oil is contacted with water and / or acid.
  • This measure is known as preconditioning if, before carrying out step a), there is no separation into water or oil, or as pre-degumming, if a separation into water or oil takes place before carrying out step a).
  • one of the enzymes as defined above is used to increase the oil yield in a process for aqueous oil degumming, to reduce the emulsifiability of vegetable oils in aqueous phases, or to de-oil vegetable leucite or lecithin.
  • a combination of two or more of the aforementioned phosphatase enzymes can be used, which may originate from the same or different sources.
  • the enzymes can be derived from any organism (eg isolated from a thermophilic organism) or from a synthetic source. The same applies to the phospholipid-cleaving enzymes or their mixtures with phosphatases.
  • the method of the present invention is advantageous because the use of the phosphatase enzymes, in particular by the relatively inexpensive bulk enzyme phytase or by acid phosphatases, the cleavage of components that are present in the mucus phase can take place.
  • the phosphatase enhances the action of the phospholipid-cleaving enzyme when used in addition to the phosphatase. It is believed that by using the phosphatase, in particular by phytase and / or acid phosphatase, a decrease in the viscosity of the mucous phase, an increase in the mobility of the phospholipids or better accessibility of the phospholipids can be achieved. An additional increase of the effects described above results when in addition phospholipid-cleaving enzymes are used.
  • phosphatase In particular, phytase and acid phosphatase are suitable for this purpose.
  • Two or more phytases can be used, which may come from the same or different sources; they can e.g. also be isolated from a thermophilic organism or derived from a synthetic source.
  • acidic phosphatases and their mixture with phytase (n) the same applies mutatis mutandis.
  • the phospholipid-cleaving enzyme may be a phospholipase capable of cleaving either a fatty acid residue or a phosphatidyl residue or a head group from a phospholipid.
  • a so-called acyltransferase in which the cleavage of the fatty acid residue from a phospholipid is associated with a transfer of this residue to a free sterol with ester formation in the oil phase.
  • the present invention relates to a process wherein a phospholipid-cleaving enzyme from the phospholipase A1, phospholipase A2, phospholipase C, phospholipase B, phospholipase D or acyltransferase.
  • Typical enzymes from this group are the Lecitase® Ultra from Novozymes®, a phospholipase A1; Lecitinase® from Novozymes, a phospholipase A2; Rohalase® MPL, a phospholipase A2 from AB Enzymes, Darmstadt (D); Gumzyme TM, a phospholipase A2 from DSM, Purifine®, a phospholipase C from DSM; Lysomax®, an acyltransferase from Danisco.
  • phospholipid-cleaving enzymes within the group of phospholipid-cleaving enzymes, a combination of two or more of the aforementioned phospholipid-cleaving enzymes can be used, which may originate from the same or different sources.
  • the enzymes can be derived from any organism (eg isolated from a thermophilic organism) or from a synthetic source.
  • an addition of water or an aqueous acid solution and optionally of alkali to neutralize the acid to crude oil in the sense of preconditioning done but omits the separation of the aqueous phase before the addition of the enzymes (in the sense of Naughtvorentschleimung).
  • an increase in the oil yield is possible.
  • An increase in the oil yield of one percentage point has enormous economic importance, since this percentage corresponds to about 400,000 t of oil, based on the annual production of soybean oil.
  • the inventive method thus allows the immediate use of crude oils from soybean or rape with phosphorus contents of 500 to 1500 ppm phosphorus. Moreover, it is a simplification of the process, because the separation step before enzyme addition is omitted.
  • the enzyme activity of the phosphatase (s) is selected in the range of 0.01 to 10 units / g of oil, more preferably in the range of 0.1 to 6 units / g of oil, more preferably in the range of 0.2 to 5 units / g of oil.
  • the enzyme activity of the phospholipid-cleaving enzymes in the range of 0.01 to 6 units / g of oil, preferably 0.1 to 3 units / g of oil and more preferably in the range of 0.2 to 2.5 units / g of oil, and most preferably in the range of 0.25 to 1 units / g of oil. (Unit: International unit for enzyme activity, 1 unit corresponds to substrate turnover of 1 ⁇ mol / min).
  • the ratio of the enzyme activity of the phosphatase to the enzyme activity of the phospholipid-cleaving enzymes will be in the range of 0.01: 6 units / g of oil to 6: 0.01 units / g of oil, preferably in the range of 0.1: 4 units / g oil to 4: 0.1 units / g oil. It is also preferred if the proportion of phosphatase (s) and the proportion of phospholipid-cleaving enzymes is the same, for example, if both proportions in the range of 0.1 to 5 units / g of oil, preferably in the range 0.2 to 3 units / g of oil.
  • the ⁇ lentschleimung or de-oiling of the plant mucus in acid pH is carried out.
  • a preferred pH of the aqueous portion of the oil-water mixture is in the range of from 3.0 to 7.5, preferably from 3.5 to 6.5, most preferably from 3.8 to 6.0. If the pH is within this range, rapid reaction can be observed.
  • the phosphatase enzymes and / or phospholipid-cleaving enzymes can be used, for example, freeze-dried and dissolved in an enzyme buffer.
  • an enzyme buffer As examples, citrate buffer 0.01-0.25 M, pH 3.8-7.5, preferably 0.1 M citrate buffer at pH 5.0, or acetate buffer 0.01-0.25 M, pH 3.8 7.5, preferably 0.1 M acetate buffer at pH 4.0, are called.
  • the enzymes are taken up in water or enzyme buffer and added to the crude oil. In order to achieve a better solubility of the enzymes - especially in the mixtures containing phospholipids - also the addition of organic solvents is possible. These find application for. B. in the separation of phospholipids and are described in the literature.
  • non-polar organic solvents such as.
  • hexane, or acetone or mixtures preferably in an amount of 1 to 30 wt .-% (examples of possible solvents are described in the EP 1531182 A2 ).
  • the phosphatase enzyme and / or the phospholipid-cleaving enzyme are used in supported form, wherein the enzymes are adsorptively or covalently bound to a carrier material.
  • Preferred support materials are inorganic support materials, such as. As silica gels, precipitated silicas, silicates or aluminosilicates, and organic support materials such. As methacrylates or ion exchange resins.
  • the support materials facilitate the separability and recyclability of the (relatively expensive) enzymes from the oil-water emulsion in a subsequent process step and contribute to the economics of the process.
  • the phosphatase enzyme comprises at least one enzyme selected from the group consisting of phytase, acid phosphatase, alkaline Phosphatase, and phosphatidic acid-specific phosphatase consists.
  • the phospholipid-cleaving enzyme preferably comprises at least one enzyme selected from the group consisting of phospholipase A1, phospholipase A2, phospholipase B, phospholipase C, phospholipase D, and acyltransferase.
  • freeze-dried enzymes are used which are present in a buffer selected from citrate buffer or acetate buffer. It is also preferred if at least the phosphatase enzyme is present in adsorptive or covalent binding on a carrier.
  • phosphatase enzymes in particular acid phosphatase and / or phytase, are suitable for effectively and effectively reducing the emulsifiability of vegetable oil in aqueous phases.
  • this effect can be enhanced by combining the phosphatase enzymes with phospholipid-cleaving enzymes.
  • the method can be advantageously used for the degumming of crude vegetable oil or for the treatment of mucilage.
  • the mucilages may be obtained, for example, by a conventional degumming process or by the process according to the invention when it is used for degumming crude vegetable oil.
  • Triglycerides preferably crude or untreated triglycerides, can be used as starting material, which are brought into contact with the phosphatase enzyme, optionally in combination with phospholipid-cleaving enzymes (step a) and subsequently separated into mucilages and (degummed) triglycerides become; (Step b1). In this case, the enzyme according to the invention is added before separation step b1).
  • a vegetable oil slime obtained for example, by a conventional degumming process, such as by treatment with water or aqueous acid, optionally followed by a neutralization with brine, may be contacted with the phosphatase enzyme (Step a) and then separated into an aqueous lecithin-containing phase and an oil phase; (Step b2).
  • the phosphatase enzyme is added after separation of the vegetable oil mucus. With this procedure, it is thus possible to obtain from vegetable oil slime both further oil and de-oiled lecithin.
  • the phosphatases optionally in combination with the phospholipases A1, A2 or B, can be used for de-oiling vegetable oil slime.
  • phosphatase enzymes it has been found that it is possible by the use of phosphatase enzymes to increase the oil yield of the reaction. Furthermore, it was surprisingly found that the combination of phosphatase enzymes with phospholipid-cleaving enzymes, the oil yield of the reaction is further increased. Moreover, the addition of the phosphatases further reduces the phospholipid content of the crude oil compared to the pure use of phospholipid-cleaving enzyme (in the prior art), increases the reaction rate during enzymatic degumming, and / or improves the separability of the gum phase formed.
  • phosphatase enzymes in particular by acid phosphatase and / or phytase, it is possible in conjunction with phospholipid-cleaving enzymes, the dosage of phospholipid-cleaving enzymes such.
  • phospholipase A1, A2 or B optionally combined with phospholipase C, and thus to save costs in addition to the above-mentioned advantages for the process.
  • the "bringing into contact” can be carried out in the context of the inventive method in any way that is known to those skilled in the art as suitable for the purpose of the invention.
  • a preferred mode of contacting is to mix the crude oil and the enzymes.
  • the mixture of crude oil and enzyme is preferably stirred, more preferably with a paddle stirrer at 200 to 800 rpm, preferably 250 to 600 rpm and most preferably 300 to 500 U / min.
  • the temperature of the mixture during the contacting is preferably in the range of 15 to 99 ° C, more preferably in the range of 20 to 95 ° C, more preferably 22 to 80 ° C, also preferably 30 to 80 ° C, more preferably from 32 to 80 ° C, and most preferably from 35 to 80 ° C.
  • the temperature of the mixture should always be chosen so that the denaturation temperature of the enzymes is not exceeded.
  • the temperature of the mixture is at least 5 ° C below the denaturation temperature of the enzymes or the lowest denaturation temperature of the enzymes. When using enzymes that have been isolated from thermophilic organisms, generally higher temperatures are to be preferred.
  • the process temperature is preferably in the range from 80 to 120 ° C., more preferably in the range from 85 to 100 ° C.
  • the use of thermostable enzymes has the advantage that thus an elevated process temperature can be selected, whereby the viscosity of the vegetable oil is reduced and the process can be shortened overall - also due to an increased reaction rate of the enzymes.
  • a pretreatment which advantageously also at followed by cooling below a lower denaturation temperature of the enzymes used.
  • the use of thermostable enzymes thus leads to a process shortening and cost reduction.
  • the duration of the contacting is preferably in the range from 1 minute to 12 hours, more preferably from 5 minutes to 10 hours, also preferably from 10 minutes to 6 hours, more preferably from 15 minutes to 4 hours.
  • the pH of the aqueous portion of the oil / enzyme mixture during contacting is preferably in the range of pH 3 to pH 7.5, more preferably in the range of pH 3.5 to pH 6.5, and most preferably in the range of Range from pH 3.8 to pH 6.0.
  • the separation of the mucilages according to step b) of the method according to the invention can be carried out in any manner which is known to those skilled in the art as suitable for the purpose of the invention, but preferably the separation is carried out by centrifugation or filtration, centrifugation is preferred.
  • the centrifugation phase separates the mixture so that the treated vegetable oil, mucilages and enzyme composition are in separate phases that are easily separated.
  • the separate products differ only in their quantity, but not in their chemical nature.
  • the phase containing the mucilages and the phase containing the enzyme is separated from the treated oil. It is particularly preferred if all enzymes are separated simultaneously with the mucilage.
  • the enzymes can be regenerated or purified after the separation and, for example, in a new purification process be used. In this case, too, it is likewise favorable to work again with the enzymes according to the invention, either by using the phosphatase enzymes directly in combination with supported phospholipases or lipid acyltransferases, or by using the enzyme according to the invention to prepare the vegetable oil mucus, for example supported phospholipases liable to remove in order to better reuse the supported enzymes in a new process can.
  • the bringing into contact is preferably carried out under the same conditions as described above for step a) of the process according to the invention.
  • the phosphatase enzymes and / or the phospholipid-cleaving enzymes are subjected to regeneration or purification before re-contacting.
  • the crude vegetable oil is brought into contact with water and / or acid before contacting in step a) of the process according to the invention.
  • Preferred acids are calcium and magnesium-complexing acids alone or in combination, such as. As citric acid and phosphoric acid. This is called a so-called "pre-degumming".
  • bringing into contact with water at a temperature between 30 ° C to 90 ° C for 15 to 60 minutes, preferably 30 to 60 minutes, wherein a temperature of 35 to 85 ° C is preferred and a temperature of 40 to 80 ° C is particularly preferred.
  • the bringing into contact with acid takes place in the context of the method according to the invention preferably at a temperature between 30 ° C to 90 ° C for 5 to 60 minutes, preferably 15 to 60 minutes, with a temperature of 35 to 85 ° C is preferred and a temperature of 40 to 80 ° C is particularly preferred.
  • the acidic, aqueous phase is then z. B.
  • a neutralization step will be carried out with a corresponding base to achieve a pH of from 3.5 to 8.0, preferably from 4 to 7.
  • the oil of the mucins obtained by z As centrifugation or filtration are separated. It is also possible and preferred according to the method of the present invention if the enzyme (s) are added directly to the vegetable oil without previously undergoing a separation step.
  • the phosphatase (s) and optionally the phospholipase (s) should preferably be taken to ensure that the reaction temperature does not exceed the optimum temperature range of the enzyme to prevent denaturation of the enzyme.
  • Temperatures between 35 to 75 ° C, better between 45 to 70 ° C, are suitable, by use of enzymes from thermophilic organisms, ie particularly thermally stable enzymes, use at 80 to 100 ° C is possible, so that between the in- Contacting the crude vegetable oil with water and / or acid and bringing into contact with the enzyme or enzymes no temperature reduction must be made.
  • An increase in temperature stability can also be achieved by immobilizing the enzymes. Since many enzymes have a certain tolerance to organic solvents (Faber, K., Biotransformations in Organic Chemistry (2001), Springer-Verlag, Heidelberg), accordingly pretreated oils or mucus can be treated with the enzymes in the context of the present invention.
  • the method of the present invention comprises the steps:
  • a so-called preconditioning is carried out before step a) of the process by mixing the crude oil in a separate process step with an amount of 300-1,000 ppm of organic acid, preferably citric acid.
  • the temperature of the mixture is in this case preferably set to 45 to 85 ° C, more preferably 48-80 ° C.
  • the mixture After a reaction time of preferably 10 minutes to 2 hours, more preferably 15 minutes - 1 hour, the mixture by addition of a stoichiometric amount of alkali, preferably sodium hydroxide, in an amount of preferably 0.5 to 2 mol / l, more preferably 1 mol / l, adjusted to a pH of 4-5. Only then is the process according to the invention proceeded according to step a).
  • This preferred embodiment B) is combined in a preferred embodiment with a post-degumming by the addition of an organic acid and / or alkali (after step b) or b1)).
  • the temperature of the mixture is in this case preferably set to 35 to 60 ° C, more preferably 50 ° C.
  • an alkali preferably sodium hydroxide, in a concentration of preferably 0.5 to 2 mol / l, more preferably 1 mol / l, to a pH of 4-5 set.
  • a slime phase which has been separated by a conventional or the degumming method according to the invention is brought into contact with the enzyme (s).
  • the method is preferably carried out according to the embodiment A), B) or D).
  • this process allows the recovery of degummed oil that has been separated with the slime phase. It thus allows a recovery of the oil and leads to an indirect increase in the oil yield; It also allows de-oiling of the lecithin.
  • any phosphatidic acids still dissolved in the vegetable oil and not split by the phospholipases can be further reduced by reducing the Ca and / or Mg content of the oil treated according to the invention. Therefore, in general embodiments, the abovementioned embodiments of the process A) to D) according to the invention are supplemented by a subsequent step in which, by adding again complexing agents, such as e.g. Citric acid or phosphoric acid, the content of bivalent ions and parallel to the content of P in the oil is further reduced.
  • complexing agents such as e.g. Citric acid or phosphoric acid
  • the method according to the invention it is possible to greatly lower the phosphorus value in the crude vegetable oil. It will the phosphorus value is reduced to below 20 ppm, more preferably below 10 ppm.
  • the inventive method to reduce the calcium and magnesium content of the crude vegetable oil to below 20 ppm, more preferably below 15 ppm, most preferably below 10 ppm, also preferably below 8 ppm, and most preferably below 4 ppm.
  • the calcium and magnesium content is reduced to below 3 ppm.
  • the content of free fatty acids is determined by the consumption of sodium hydroxide or potassium hydroxide via a saponification reaction. The percentage of free fatty acids in the examined oil is obtained. The determination was carried out in accordance with DIN 53402 (method DGF C-V 2).
  • the slime phase contained in the oil is measured by enzymatically untreated and enzymatically treated slime.
  • a 10 mL sling glass is heated to the working temperature of the reaction mixture, the samples (2 x 2 mL) are filled and tempered for at least 4 minutes at 3000 rpm centrifuged to separate the slime from the oil. From the upper oil phases samples are taken for analysis. For documentation purposes, the result of the phase formation is additionally photographed.
  • the determination of the oil yield, the (residual) oil content in the slime phase and the slime volume are determined by the determination of the slime volume according to the standardized method as described in PCT / EP 2013/053 199 detectable. Furthermore, by Soxhlet extraction of the isolated mucus of the oil content of the mucus can be determined separately according to DIN ISO 659.
  • the amount of crude to be treated 400 to 600 g, is poured into a Duran reactor DN120 1000 mL and samples for analysis are taken.
  • the oil in the Duran reactor is heated by means of a hot plate to a temperature of 35 to 90 ° C, in particular 48 ° C or 80 ° C, while maintaining a temperature at which the enzyme does not denature. After the temperature is reached, the preconditioning is started.
  • a defined amount of dilute citric acid for example 450-1000 ppm
  • the mixture can be mixed with an Ultraturrax for 1 minute. Alternatively, incubate with stirring at about 600 rpm for 15 minutes to 1 hour to await the reaction of the acid.
  • a defined amount of sodium hydroxide solution (1-4 mol / L, remaining amount to 2-3% v / v, minus water from acid addition and enzyme addition) is added and it is incubated for a further 10 minutes with stirring.
  • the addition of the enzyme, the enzyme mixture or the immobilizate, preferably dissolved in buffer is stirred in, for which the stirrer speed can be briefly increased (1 minute to 900 rpm), then stirring is continued at a lower speed.
  • Sampling takes place at defined time intervals. The sample is taken with the help of a pipette, filled into a tempered glass (temperature of the reaction mixture) and tempered for at least 4 minutes at 3000 rpm to separate the slime phase from the oil. For documentation purposes, the result of phase formation is photographed. From the supernatant samples are taken to determine the phosphorus, calcium and magnesium content.
  • phosphatases and optionally additional enzymes in a suitable combination as free enzymes or immobilized enzymes together with an aqueous phase (enzyme buffer, pH 4-5) 0.05 to 5% w / v, added to the crude oil.
  • the emulsion consisting of water, enzyme, possibly enzyme carriers and oil, is mixed.
  • the Reaction tempered between 20 to 70 ° C, better carried out between 40 to 65 ° C.
  • the phase separation is awaited, the solids settle or can be prepared by a standard method known in the art, for. B. be removed by centrifugation or filtration.
  • the oil can be degummed with dilute acid (eg citric acid) or lye according to a procedure known to the skilled person as degumming.
  • oil slime is treated with enzymes.
  • further enzymes are added to the oil slime, which is obtained by a process known to the expert as degumming. These may be dissolved in an aqueous phase or suspended in an organic solvent. The mixture is ideally tempered to a temperature between 20 to 70 ° C, better to a temperature between 35 to 65 ° C. The batch is mixed until the process is complete. This can be checked by viscosity measurements or visually, by dissolving the otherwise solid slime phase. By centrifugation, a phase separation can be achieved, the individual phases can be separated.
  • the upper phase consists of the recovered oil
  • the middle phase of the phospholipids and the lower phase is an aqueous phase and contains the enzymes.
  • the enzymes can be recycled and reused.
  • the oil or the water phase containing the enzyme must be purified by the addition of complexing agents before further use of the ions.
  • the crude oil is brought to a high temperature, especially 70 to 100 ° C, more precisely 75 to 85 ° C.
  • the crude oil is conditioned with acid and brine according to the procedure described above, the temperature is maintained and thermostable enzymes are added.
  • the enzyme is stirred in, for which the stirrer speed can be briefly increased (eg 1 minute to 900 rpm), then stirring is continued at 600 rpm until the reaction is complete.
  • the separation of the oil slime can be carried out as previously described.
  • reaction variant 1 a soybean oil with the following starting contents was used: phosphorus 700 ppm, calcium 65.6 ppm, magnesium 62.6 ppm and a free fatty acid content of 1%.
  • the crude oil was preconditioned using aqueous citric acid (450 ppm) and aqueous sodium hydroxide solution (1 mol / L). Regular samples were taken (see Table 1). At the end of the reaction, the slime phase was centrifuged off and the residual oil content determined according to Soxhlet.
  • this preconditioning was carried out with the addition of an enzyme, phospholipase A1 from the organism Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) (see FIG. 2 , Table 2).
  • Table 3 shows results of preconditioning with addition of the enzyme PLA1 from Thermomyces lanuginosus and another enzyme, a phytase, ie a 6-phytase from Aspergillus niger (from ASA special enzymes).
  • FIG. 1 shows how out FIG. 1 it can be seen that the use of acid and lye on the crude oil as preconditioning leads to a not inconsiderable mucus volume, which does not decrease significantly in the sequence despite the use of a stirrer at 600 rpm.
  • the single photo corresponds to a sampling. The samples are taken at times 10, 60, 120, 180 and 240 minutes. Table 1 lists the associated analytical data: the phosphorus content dropped from 33 ppm to 21 ppm after 240 minutes; the concentration of divalent ions calcium and magnesium increases slightly in the case of calcium from 7.8 ppm to 9.8 ppm; the concentration of magnesium decreases from 4.1 ppm to 3.2 ppm during the course of the reaction. The content free Fatty acids remain almost unchanged.
  • the preconditioning serves as a preparatory reaction for the oil degumming and at the same time as a reference treatment.
  • FIG. 2 When using the enzyme Phospholipase A1 from Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) a decrease in the mucus volume in the course of the reaction can be seen (one photo per measurement / sampling). The associated data and times of sampling are shown in Table 2.
  • Tab. 2 shows a decrease in the calcium concentration from 9.6 ppm to 8.1 ppm, a decrease in the magnesium concentration from 4.4 ppm to 3 ppm and a decrease in the phosphorus content from 23 ppm to 15 ppm; the content of free fatty acids increases from 0.79% to 1.24%, in each case after 180 min reaction time.
  • the increase in free fatty acid is a sign of the activity of PLA1, which splits off the fatty acids from the phospholipid molecules and also the mucus volume decreases continuously.
  • FIG. 3 the volume of the mucus phase of a pre-conditioned crude oil treated with PLA1 and additionally with phytase, ie a 6-phytase from Aspergillus niger (ASA Spezialenzyme), is shown. It is evident from the associated analytical data from Table 3 that, surprisingly, a reduced mucus volume of 2.0% is already reached after 120 minutes, compared to the mucus volume of 2.8% when using PLA1 alone (Table 2). In addition, the ion values (Table 3) are reduced more rapidly compared to the values in Table 2 to 4.7 ppm Ca, 1.7 ppm Mg and 11 ppm P z. B. after 180 min reaction.
  • phytase ie a 6-phytase from Aspergillus niger
  • reaction variant 1 a rapeseed oil with the following starting contents was used: phosphorus 1200 ppm, calcium 365 ppm, magnesium 145 ppm and a free fatty acid content of 1.65%.
  • the crude oil was preconditioned using aqueous citric acid (1000 ppm) and aqueous sodium hydroxide solution (4 mol / L). Samples were taken regularly (see Table 4). At the end of the reaction, the slime phase was centrifuged off and the residual oil content determined according to Soxhlet.
  • this preconditioning was carried out with the addition of an enzyme, phospholipase A1 from the organism Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) (see FIG. 5 , Table 5).
  • Table 6 shows results of preconditioning with the addition of the enzyme PLA1 (from Thermomyces lanuginosus) and another enzyme, a sweet-potato acid phosphatase (Sigma-Aldrich).
  • FIG. 4 shows the use of acid and lye on the crude oil as preconditioning leads to a not inconsiderable mucus volume, which does not decrease significantly in the sequence despite the use of a stirrer at 600 rpm.
  • the single photo corresponds to a sampling; the samples are taken at times 10, 60, 120, 180 and 240 minutes.
  • Table 4 shows the associated analytical data, the phosphorus content decreased from 247 ppm to 14 ppm after 240 minutes, the concentration of divalent ions calcium and magnesium in the case of calcium decreased from 76 ppm to 9.5 ppm, the concentration of magnesium decreases from 31 ppm to 1.7 ppm during the course of the reaction. The content of free fatty acids remains almost unchanged.
  • the preconditioning serves as a preparatory reaction for the oil degumming and at the same time as a reference treatment.
  • FIG. 5 If the enzyme Phospholipase A1 from Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) is used, a decrease in the mucus volume of 1% can be detected in the course of the reaction (one photograph per measurement / sampling). The associated data and times of sampling are shown in Table 5.
  • Tab. 5 shows a decrease of the calcium concentration from 26 ppm to 7.9 ppm, a decrease of the magnesium concentration from 9.7 ppm to 1.5 ppm and a decrease in the phosphorus content from 82 ppm to 12 ppm, the free fatty acid content increases from 1.76% to 2.14%.
  • the increase in free fatty acid is indicative of the activity of PLA1, which cleaves the fatty acids from the phospholipid molecules, and also the mucus volume decreases.
  • FIG. 6 the volume of the mucus phase of a pre-conditioned crude oil treated with PLA1 (from Thermomyces lanuginosus ) and additionally with sweet potato acid phosphatase is shown. It is evident from the associated analytical data from Table 6 that, surprisingly, the additional use of acid phosphatase compared to the sole use of phospholipase ( Fig. 5 Tab.5) the mucus volume of the reaction is significantly reduced. This is synonymous with an increase in oil yield (cf. Fig. 5 and 6 , Table 5 + 6) and thus a larger profit margin of the process.
  • soybean oil About 43.5 million tonnes of soybean oil are produced each year worldwide (USDA FAS - 2012). With a 97.1% oil yield increase to 97.7% in the standard process through the phytase and PLA1 enzymatic process, 260,000 tonnes more soybean oil would be produced each year.

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Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden und zur Entölung des Pflanzenölschleims, der bei der Ölentschleimung anfällt, bereit und umfasst das In-Kontakt-Bringen des Triglycerids mit mindestens einer Phosphatase sowie die Trennung der Schleimphase von der Ölphase.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Ölausbeute bei der Entschleimung von Triglyceriden durch Verwendung einer Phosphatase. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung mindestens einer Phosphatase zur Entschleimung von rohen Pflanzenölen. Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft die Entölung von Pflanzenölschleim, wobei neben der Erhöhung der Ölausbeute die Gewinnung und Reinigung des Lecithins im Vordergrund steht.
  • Rohe Pflanzenöle enthalten Phosphatide, eiweiß- und kohlenhydrathaltige Stoffe, pflanzliche Schleimstoffe sowie kolloidale Verbindungen, die die Haltbarkeit des Öls stark herabsetzen. Diese Stoffe müssen daher entfernt werden.
  • Bei der Raffination von Pflanzenölen werden die unerwünschten Begleitstoffe entfernt. Man unterscheidet zwischen chemischer und physikalischer Raffination. Die chemische Raffination besteht aus den Prozessen 1. Entschleimung, 2. Neutralisation, 3. Bleichung, 4. Desodorierung. Bei der Entschleimung werden Phospholipide ("Schleimstoffe") und Metallionen (Ca2+, Mg2+) aus dem Öl entfernt. Die Neutralisation dient zur Extraktion der Fettsäuren. Bei der Bleichung werden die Farbstoffe, weitere Metallionen und restliche Schleimstoffe entfernt. Bei der Desodorierung handelt es sich um eine Wasserdampfdestillation, bei der weitere Verbindungen entfernt werden, die den Geruch und den Geschmack des Öls beeinträchtigen. Bei der physikalischen Raffination wird die Entsäuerung zusammen mit der Desodorierung am Ende des Raffinationsprozesses durchgeführt.
  • Die Entschleimung der Öle kann durch Extraktion der Phospholipide mit Wasser oder einer wässrigen Lösung einer Säure erfolgen, die Ca2+- und Mg2+-Ionen komplexiert, wie z. B. Zitronensäure oder Phosphorsäure. Häufig führt man hierbei zunächst eine wässrige, sogenannte Vorentschleimung durch, mit der die wasserlöslichen Phospholipide entfernt werden. Man spricht hierbei von hydratisierbaren Phospholipiden.
    • Definitionen
  • Unter dem Begriff Triglyceride werden dreifache Ester des Glycerins mit Fettsäuren verstanden, welche den Hauptbestandteil von natürlichen Fetten und Ölen darstellen, sei es pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Triglyceride umfassen pflanzliche oder tierische Fette und Öle, und deren Mischungen sowohl untereinander als auch mit synthetischen bzw. modifizierten Fetten und Ölen.
  • Unter dem Begriff Pflanzenöl wird hierbei jedes Öl pflanzlichen Ursprungs verstanden. Bevorzugte Öle sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Sojaöl, Rapsöl, Canolaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Palmöl, Jatrophaöl, Leindotteröl, oder Baumwollsaatöl. Überdies umfasst das Pflanzenöl im Sinne der Erfindung Mischungen verschiedener Pflanzenöle untereinander, als auch die Mischung von Pflanzenöl mit tierischen und/oder synthetischen bzw. modifizierten Fetten und Ölen.
  • Die Bezeichnung "roh" bezieht sich dabei darauf, dass das Öl noch keinem Entschleimungs-, Neutralisations-, Bleichungs-und/oder Desodorierungsschritt unterzogen wurde. Es ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auch möglich, dass eine Mischung mehrerer Rohöle eingesetzt wird oder vorbehandelte, z.B. vorentschleimte und/oder vorkonditionierte Öle mit den Enzymen behandelt werden.
  • Unter Schleimphase / Schleimstoffe / Pflanzenölschleim versteht man hier im folgenden Text die gesamte Gruppe dieser Stoffe, die nach Behandlung mit einer säurehaltigen und/oder wässrigen Lösung aus dem Öl als schwere Phase ausfallen (Michael Bokisch: Fats and Oils Handbook, AOCS Press, Champaign, Illinois, 1998, Seite 428-444). Die Verwendung dieses Pflanzenölschleims als Ausgangsmaterial ist insbesondere für die Gewinnung von Lecithin von Bedeutung, da Lecithin ein wesentlicher Bestandteil des Pflanzenölschleims ist.
  • Unter dem Begriff "Verringerung des Ölgehalts im Pflanzenölschleim" versteht man die Abtrennung des Öls aus dem eingesetzten Pflanzenölschleim, welcher dadurch entölt wird. Je nach Betrachtungsweise stehen die Gewinnung von Öl und/oder die Gewinnung der Lecithin-haltigen Schleimphase im Vordergrund.
  • Unter dem Begriff "Vorentschleimung" bzw. "Naßentschleimung" wird eine Behandlung des Rohöls mit Wasser oder einer wässrigen Säurelösung verstanden, um wasserlösliche Phospholipide weitestgehend aus dem Öl zu entfernen. Auch kann im Rahmen einer Vor- bzw. Naßentschleimung nach der Säurezugabe ggf. eine Zugabe von Alkali erfolgen, um die Säure zu neutralisieren. Vor der Enzymzugabe erfolgt die Abtrennung der wässrigen Phase. Nach einer Vorentschleimung wird der Phosphorgehalt im Rohöl von ca. 500-1500 ppm, z.B. für Soja und Raps, auf unter 200 ppm im vorentschleimten Öl gesenkt. Durch die Vorentschleimung kann z.B. Lecithin aus der entstandenen Schleimphase gewonnen werden bzw. die Schleimphase als Futtermittel aufgearbeitet werden. Der Nachteil der Abtrennung der wässrigen Phase bzw. der Senkung des Phosphorgehaltes ist jedoch ein Ausbeuteverlust bezüglich des Öls. Die in die wässrige Phase übergehenden Phosphatide wirken emulgierend und führen dazu, dass ein Teil des Öls in der wässrigen Phase emulgiert und mit dieser abgetrennt wird. Anschließend kann das Öl enzymatisch weiterbehandelt werden, wobei die Enzyme ggf. in einem weiteren Schritt abgetrennt werden müssen.
  • Unter dem Begriff "Vorkonditionierung" des Öls wird in dieser Erfindung die Zugabe von Wasser bzw. einer wässrigen Säurelösung zu dem unbehandelten Öl verstanden. Anschließend wird durch Zugabe von Alkali, z. B. Natronlauge, ein pH-Wert eingestellt, bei dem die folgende enzymatische Reaktion stattfindet. Idealerweise wird der für die Enzymreaktion optimale pH-Wert von 4 bis 7 eingestellt. Anschließend erfolgt jedoch keine Abtrennung der wässrigen Phase, sondern unmittelbar die Zugabe der Enzyme. Die vorhandenden Schleimstoffe verbleiben also vorerst im Öl bzw. in der Emulsion. Die Abtrennung der wässrigen Phase und damit der Enzyme erfolgt erst nach Einwirkung der Enzyme auf das (ggf. vorkonditionierte) Rohöl.
  • Unter dem Begriff Phosphatase werden eine Gruppe von Enzymen verstanden, die aus Phosphorsäureestern oder Polyphosphaten Phosphorsäure abspalten.
  • Phytase ist der Name für Enzyme, die Phytinsäure hydrolytisch abbauen und somit das gebundene Phosphat freisetzen. Je nachdem, welche Phosphatgruppe abgebaut wird, unterscheidet man zwischen 3-, 4-, 5- und 6-Phytase. Phytasen sind aus Tieren, Pflanzen, Pilzen und Bakterien bekannt; die am besten charakterisierten Phytasen stammen aus Pilzen. Die von vielen Pflanzen und Bakterien gebildete Phytase fungiert als 3-Phytase; diese wird zusammen mit 6-Phytase kommerziell genutzt. 4-Phytase ist eine saure Phosphatase.
  • Saure Phosphatasen sind Phosphatasen, deren pH-Optimum im sauren pH-Bereich, etwa bei 4,0 bis 5,5, liegt.
  • Phospholipasen sind Enzyme, die zur Gruppe der Hydrolasen gehören, die die Esterbindung von Phospholipiden hydrolysieren. Phospholipasen werden nach ihrer Regioselektivität bei Phospholipiden in 5 Gruppen eingeteilt:
    • Phospholipasen A1 (PLA1), die die Fettsäure in der sn1-Position unter Bildung des 2-Lysophospholipids abspalten.
    • Phospholipasen A2 (PLA2), die die Fettsäure in der sn2-Position unter Bildung des 1-Lysophospholipids abspalten.
    • Phospholipasen C (PLC), die einen Phosphorsäuremonoester abspalten.
  • Phospholipasen D (PLD), die die Kopfgruppe abspalten oder austauschen.
  • Phospholipasen B (PLB), die die Fettsäure sowohl in der sn1-Position als auch in der sn2-Position unter Bildung eines 1,2-Lysophospholipids abspalten.
  • Unter einer Acyltransferase versteht man ein Enzym, dass Acylgruppen, z.B. Fettsäuren aus einem Phospholipid, auf einen geeigneten Akzeptor, z.B. ein Sterol, unter Bildung eines Esters überträgt.
    • Stand der Technik
  • Die Thematik der hydratisierbaren und nicht-hydratisierbaren Phospholipide ist beispielsweise beschrieben in Nielsen, K., Composition of difficultly extractable soy bean phosphatides, J. Am. Oil. Chem. Soc. 1960, 37, 217-219 und A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189. Dabei handelt es sich insbesondere um Phosphatidyl-Cholin und Phosphatidyl-Inositol. Die Behandlung mit verdünnten wässrigen Calcium- und Magnesium-komplexierenden Säuren, wie z. B. Zitronensäure oder Phosphorsäure, führt nach dem Stand der Technik dazu, dass nicht-hydratisierbare Phospholipide in hydratisierbare Phospholipide überführt werden. Man geht davon aus, dass der Mechanismus dieser Reaktion darauf beruht, dass Calciumionen, die verschiedene Phospholipidmoleküle, wie z.B. Phosphatidsäuren an den Phosphatgruppen, überbrücken und stabilisieren, aus dem Öl entfernt werden. Dies führt zur verbesserten Extraktion dieser Phospholipide mit Wasser. Zwar wird durch die wässrige Vorentschleimung und die Behandlung mit wässrigen Säuren bei einigen Ölen eine hinreichend gute Entschleimung erreicht, jedoch gibt es auch schwer entschleimbare Öle, für die diese beiden Extraktionsschritte sehr oft zu einer ungenügenden Reduktion der Schleimstoffe führen. Üblicherweise wünscht man sich hierbei eine Reduktion des Phosphorgehaltes auf 10 oder weniger ppm Phosphor im Öl für Nahrungsmittelanwendungen (nach dem Stand der Technik bestimmt durch ICP/AES-Analyse des Öls). Höhere Anforderungen werden an den Phosphorgehalt des Öls dann gestellt, wenn die Öle beispielsweise zur Herstellung von Biodiesel eingesetzt werden. Dort ist nach der EU-Norm der Phosphorgehalt des Biodiesels auf 5 ppm begrenzt und es ist zweckmäßig, die Phosphorreduktion bereits ölseitig durchzuführen. Weiterhin ist ein besonders niedriger Phosphorgehalt, d. h. ein Phosphorgehalt, der so niedrig wie möglich ist und möglichst 0 beträgt, dann erforderlich, wenn man die Öle in weiteren Behandlungsschritten entweder für den Nahrungsmitteleinsatz hydriert, d. h. ungesättigte in gesättigte Fettsäuren überführt, oder wenn man nach dem NExBTL-Prozess der Firma Neste eine Hydrierung so durchführt, dass als Endprodukt Alkane, sprich ein konventioneller Biodieseltreibstoff, jedoch hergestellt aus Pflanzenöl, erhalten wird. Diese Prozesse stellen, wie vorher angeführt, extrem hohe Anforderungen an einen niedrigen Phosphorgehalt im Öl, und der Einsatz solcher Prozesse wird in dem Maße zunehmen wie Pflanzenöle als Rohstoffe für die chemische Industrie eingesetzt werden.
  • Eine weitere Variante stellt das sog. "caustic refining" dar. Dieses Verfahren wird eingesetzt, um möglichst alle Phospholipide zusammen mit freien Fettsäuren aus dem Öl zu entfernen. Dieser Prozess ist beispielsweise in der WO 08/094847 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird das rohe oder Wasservorentschleimte Öl zunächst mit geringen Mengen an Zitronensäure oder Phosphorsäure vermischt und intensiv gerührt. Hierbei werden, wie vorher schon erläutert, Salze von nicht-hydratisierbaren Phospholipiden stärker hydratisierbar gemacht. Dann wird verdünnte Natronlauge hinzugefügt, wobei die Menge so berechnet wird, dass man einen geringen Überschuss gegenüber der zur Neutralisation der freien Fettsäure benötigten Menge erhält. Dadurch werden die Fettsäuresalze gebildet. Durch Absetzen und nachfolgende Zentrifugation wird die Mischung dann aufgetrennt, und man erhält eine wässrige Fettsäurelösung als Rückstand, in der sich auch die Phospholipide befinden. Das Öl wird dann nachfolgend nochmals mit enthärtetem Wasser gewaschen. Die NaOH-Behandlung hat den Nachteil, dass teilweise auch Verseifung des Öles eintritt, wodurch dessen Ausbeute erniedrigt wird.
  • Ein weiterer Nachteil der konventionellen Ölentschleimungsprozesse liegt darin, dass sowohl die wässrige Vorentschleimung als auch die Behandlung mit wässrigen Säuren zu Ölverlusten führen, die dadurch verursacht sind, dass die in das Wasser überführten Phospholipide Emulgatoren darstellen, die einen zwar geringen, aber doch beträchtlichen Teil des Pflanzenöls in der wässrigen Phase emulgieren, wodurch Pflanzenöl verloren geht. Diese Verluste können im Bereich weniger Prozente bezogen auf das ursprünglich eingesetzte Rohöl liegen. Als Faustregel gilt, dass mit je zwei Molekülen Phopholipid etwa ein Triglyceridmolekül emulgiert wird (beschrieben in WO 08/094847 ).
  • Die sogenannte enzymatische Entschleimung vermeidet mehrere Nachteile der bestehenden Verfahren bzw. verbessert die Extraktionsverfahren weiter. Die enzymatische Entschleimung wird im Stand der Technik durch den Einsatz von Phospholipasen, insbesondere Phospholipase A1 und A2, Phospholipase B, Phospholipase C oder Phospholipase D oder einer Kombination von Phospholipasen herbeigeführt.
  • Die Verwendung von Phospholipasen, vor allem Phospholipase A, zur Entschleimung von Rohölen ist beispielsweise in der EP 0513709 B1 (sogenannter Enzymax-Prozess der Firma Lurgi, Frankfurt) geschützt. Es wird davon ausgegangen, dass die Abspaltung einer Fettsäure zu einem Lysolecithin führt, welches eine wesentlich geringere Emulgierkapazität für Öl hat und auch eine wesentlich höhere Wasserlöslichkeit besitzt. Dadurch wird sowohl die Ölausbeute erhöht als auch die Wasserlöslichkeit der schwer hydratisierbaren Phospholipide verbessert. Clausen, Enzymatic oil-degumming by novel microbial phospholipase, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103 (2001) 333-340, beschreibt die Entwicklung und den Einsatz einer Phospholipase A1 zur enzymatischen Ölentschleimung und vergleicht den Einsatz der Phospholipase A1 mit dem Einsatz der Phospholipase A2. Der aktuelle Stand der Technik zur enzymatischen Ölentschleimung ist zusammengefasst in A.J. Dijkstra, Recent developments in edible oil processing, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2009, 111, 857-864, und A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189. Dort werden die Vor- und Nachteile der einzelnen Phospholipasen für die enzymatische Ölentschleimung diskutiert und auch die Vorbehandlungsmethoden mit unterschiedlichen Säuren angeführt.
  • Ein alternatives Konzept zur Ölentschleimung stellen die Systeme der Firma Danisco dar, in denen eine Lipidacyltransferase eingesetzt wird. Dieses Enzym macht aus einem Phospholipid ebenfalls ein Lysophospholipid, überträgt jedoch den Fettsäurerest an ein Sterol in der Ölphase. Die entsprechenden Enzyme und Verfahren zum Einsatz dieser Enzyme sind in der WO 2006/008508 und der WO 2009/081094 beschrieben.
  • Phytasen werden auf dem Markt hauptsachlich als Futtermitteladditive vertrieben. Etwa zwei Drittel des Phosphors in pflanzlichen Futtermitteln für Nutztiere liegen gebunden an Phytinsäure oder deren Salze vor und können nur durch die Phytasen gespalten und dadurch für den Phosphatstoffwechsel der Nutztiere zur Verfügung gestellt werden. Die Phytasen kommen jedoch im Magen-Darm-Trakt von Schwein und Geflügel nicht vor. Um die Verwertung des Phosphors aus pflanzlichen Futtermitteln zu verbessern, setzt man deshalb dem Tierfutter Phytasen zu. Solche Phytasen sind beispielsweise in den Patenten EP1066373B1 (Novozymes), EP2295553 (Novozymes), US6475762 (Genencor International), WO9855599 (Gist Brocades); WO9949740 (DSM); WO2004071218 (DSM); WO2011117396 (Novozymes), US2009081331 (BASF); WO2009129489 (Danisco US INC.) beschrieben.
  • Typische auf dem Markt erhältliche Phytasen sind die Produkte Natuphos® von der BASF (3-Phytase), Ronozyme® von DSM, Axtra® PHY and Phyzyme® von Danisco.
  • Eine weitere Anwendung von Phytasen liegt in der Modifizierung von pflanzlichen Lebensmitteln und ist beispielsweise in der WO2004/071218 und der US2004058049 beschrieben. Für diese Anwendung wird davon ausgegangen, dass die Phytinsäure insbesondere im neutralen Milieu des Darmes (schwerlösliche) Salze mit den zweiwertigen Ionen der Mineralstoffe bildet und so deren Resorption herabsetzt. Dies soll insbesondere der Fall für die Ionen von Fe, Zn und Ca der Fall sein. Durch die enzymatische Abspaltung von Phosphatgruppen von der Phytinsäure mittels Phytase können diese Effekte verringert werden. Es wird diskutiert, mit Phytase Lebensmittel vorzubehandeln um die darin enthaltenden Mineralien besser verfügbar/resorbierbar zu machen. So beschreibt die US2004058049A1 den Zusatz von Phytasen in Soft Drinks.
  • Aufgrund der weltweiten Zunahme des Verbrauchs an Speiseöl und der immer stärker werdenden Nutzung von Pflanzenölen als Rohstoffe für die chemische Industrie und als Treibstoff besteht ständig weiterer Bedarf, die Entschleimung von Pflanzenölen und insbesondere die enzymatische Entschleimung von Pflanzenölen weiter zu verbessern und die Ölausbeute bei der Entschleimung zu erhöhen.
    • Aufgabe der Erfindung
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben sich die Aufgabe gestellt, ein alternatives Verfahren zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden zu entwickeln, mit denen der Phosphorgehalt des zu entschleimenden Öls verringert, die Ölausbeute erhöht und/oder die Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Entschleimung erhöht wird. Gleichzeitig soll dieses Verfahren eine wirtschaftliche Durchführung im großtechnischen Maßstab ermöglichen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von Lecithin aus Triglyceriden, insbesondere aus rohem Soja-, Sonnenblumen- oder Rapsöl, mit hoher Ausbeute, wobei der Gehalt an Öl im gewonnen Lecithin möglichst gering ist, oder mit anderen Worten, die Entölung des Lecithins bzw. die Verringerung des Ölgehalts im Pflanzenölschleim.
    • Lösung der Aufgabe
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass eine (saure) Phosphatase und/oder eine Phytase besonders geeignet sind, um Triglyceride zu entschleimen, bzw. Lecithin zu entölen. Der Einsatz von sauren Phosphatasen bzw. Phytasen in der enzymatischen Ölentschleimung war bisher nicht bekannt. Bis jetzt waren lediglich Anwendungen dieser Enzyme in rein wässrigen Systemen bekannt, nicht aber in Öl-Wasser-Zweiphasensystemen wie sie in der wässrigen Ölentschleimung verwendet werden. Für den Einsatz in der enzymatischen Ölentschleimung sind insbesondere solche Phytasen geeignet, die zur Behandlung von Lebensmitteln bereits eingesetzt werden.
  • Die Verwendung von sauren Phosphatasen und/oder Phytasen zur enzymatischen Ölentschleimung ist im Hinblick auf einen effizienteren, kostengünstigeren Prozess besonders vorteilhaft, da Phytasen kostengünstige Bulkenzyme sind.
  • Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden oder zur Verringerung des Ölgehalts im Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung anfällt, gelöst, welches Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • Zunächst werden die Triglyceride oder der Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung anfällt, mit mindestens einer Phosphatase in Kontakt gebracht (Schritt a). Anschließend werden, wenn Triglyceride als Ausgangsmaterial verwendet werden, die Schleimstoffe von den Triglyceriden getrennt (Schritt b1). Bevorzugt werden rohe Pflanzenöle als Triglyceride eingesetzt.
  • Alternativ kann anstelle der Triglyceride als Ausgangsmaterial auch Pflanzenölschleim eingesetzt werden, der bei der Entschleimung von Pflanzenölen anfällt, sei es durch eine Entschleimung nach herkömmlichen oder dem erfindungsgemäßen Verfahren. Der Pflanzenölschleim wird gemäß Schritt a) mit der mindestens einen Phosphatase in Kontakt gebracht und anschließend nach Schritt b2), der analog zu b1) durchgeführt wird, in eine wässrige, Lecithin-haltige Phase und eine Öl-haltige Phase getrennt. Die Schleimphase bzw. der Pflanzenölschleim wird insbesondere bei der Gewinnung von Lecithin eingesetzt.
  • Vorzugsweise stellt die mindestens eine Phosphatase eine saure Phosphatase oder eine Phytase oder eine Kombination aus beiden Enzymen dar.
  • Bei der Sauren Phosphatase handelt es sich vorzugsweise um ein oder mehrere Enzyme der Enzymklasse EC 3.1.3.2. Die Enzyme dieser Klasse sind in der Regel substratunspezifisch, spalten von einer Vielzahl von organischen Substraten Phosphatgruppen ab und weisen ein pH-Optimum von kleiner oder gleich 7, bevorzugt von kleiner oder gleich 6,5, besonders bevorzugt von kleiner oder gleich 6 auf. Die Untergrenze des pH-Werts liegt vorzugsweise bei 3,0, stärker bevorzugt bei 3,5. In diesem pH-Bereich ist eine schnelle Reaktionsführung möglich. Diese Enzyme sind weit verbreitet und kommen in Pflanzen, Tieren, Pilzen und Bakterien vor. Saure Phosphatasen können aber auch aus Milch wie z.B. Säugetiermilch isoliert werden. Purple Acid Phospatases (Abkürzung: PAPs) sind eine eigene Klasse von sauren Phosphatasen, die zweikernige Übergangsmetallzentren enthalten und in Lösung eine violette Färbung zeigen. Ein typischer Vertreter dieser Klasse ist die Purple Acid Phospatase aus der Süßkartoffel, wie Sie beispielsweise von Kusudo T, Sakaki T, Inouye K. Purification and Characterization of Purple Acid Phosphatase PAP1 from Dry Powder of Sweet Potato, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003 67(7):1609-11 beschrieben ist. Auch PAPs sind weit verbreitet und können auch aus der Sojabohne, aus Reis, aus Zwiebeln und Red Kidney Beans isoliert werden. Daneben können solche Enzyme auch aus Bakterien oder Säugetieren isoliert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die saure Phosphatase aus Pflanzen, insbesondere aus der Süßkartoffel, aus Weizenkeimen oder Soja, aus Säugetiermilch oder aus Pilzen, Hefen oder Bakterien.
  • Bei der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Phytase handelt es sich um eine einzelne Phytase oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren Phytasen. Bevorzugt handelt es sich um eine sogenannte 3-Phytase (Enzymklasse EC 3.1.3.8), 4-Phytase (Enzymklasse EC 3.1.3.26), 5-Phytase (Enzymklasse EC 3.1.3.72) oder 6-Phytase (Enzymklasse EC 3.1.3.26). (Literaturangabe: Enzymes in Industry, Wolfgang Aehle Editor, Wiley VCH, Weinheim, Second Edition, 2004 Chapter 5 Industrial Enzyme, p. 216.) Die Ziffern beziehen sich auf die Position der Phosphatgruppen in der Phytinsäure, die durch die Einwirkung der Phytasen als erste abgespalten werden. Danach werden abhängig von der Reaktionszeit und den Reaktionsbedingungen weitere Phosphatgruppen abgespalten. Phytasen sind Bulkenzyme, die in großem Maßstab industriell hergestellt werden.
  • Vorzugsweise stammt die Phytase aus folgenden Organismen: Pflanzen, Bakterien, Hefen und Pilze.
  • Insbesondere stammt die Phytase aus Mais, Sojabohne, Weizenkleie, Bacillus Spezies, Escherichia coli Spezies, Klebsiella Spezies, Pseudomonas Spezies, Aspergillus Spezies, Trichoderma Spezies, Rhizopus Spezies, Saccharomyces Spezies, Pichia Spezies, Penicillium Spezies, Schwanniomyces Spezies, Arxula adeninivorans.
  • Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Phytasen haben ein pH Optimum bei einem pH Wert von kleiner oder gleich 8, bevorzugt kleiner oder gleich 7; ganz besonders bevorzugt kleiner oder gleich 6. Die Untergrenze des pH-Werts liegt vorzugsweise bei 3,0, stärker bevorzugt bei 3,5.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird neben der mindestens einen Phosphatase zusätzlich ein Phospholipid-spaltendes Enzym eingesetzt.
  • Vorzugsweise stellt das Phospholipid-spaltende Enzym eine Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase B, Phospholipase C, Phospholipase D oder Acyltransferase dar. Besonders bevorzugt wird das Phospholipid-spaltende Enzym aus der Phospholipase A1, Phospholipase A2 oder Phospholipase B ausgewählt.
  • Vorzugsweise wird die Phospholipase A1 aus folgenden Spezies gewonnen: Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas spezies, Trichoderma reesei, Pichia pastoris, Schweinepankreas oder Rinderpankreas. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt die Phospholipase A1 aus Thermomyces lanunginosus.
  • Vorzugsweise und unabhängig wird die Phospholipase A2 aus folgenden Quellen hergestellt: Schweinepankreas, Rinderpankreas, Streptomyces violaceoruber, Naja mossambica, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Trichoderma reesei, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes oder Pseudomonas spezies.
  • Vorzugsweise und unabhängig wird die Phospholipase B aus folgenden Spezies gewonnen: Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Pichia pastoris, Trichoderma reesei, Pseudomonas spezies, Schweinepankreas oder Rinderpankreas.
  • Vorzugsweise und unabhängig wird die Phospholipase C aus folgenden Spezies gewonnen: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Pichia pastoris oder Pseudomonas spezies.
  • Vorzugsweise und unabhängig wird die Phospholipase D aus folgenden Spezies gewonnen: Schweinepankreas, Rinderpankreas, Kohl, Erdnuss, Streptomyces Spezies, Streptomyces chromofuscus, Streptomyces violaceoruber, Naja mossambica, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Trichoderma reesei, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes oder Pseudomonas spezies.
  • Besonders bevorzugt wird die Phospholipase A1 aus Thermomyces lanuginosus oder Fusarium oxysporium ausgewählt, und/oder unabhängig davon wird die Phospholipase A2 aus Schweinepankreas, Rinderpankreas, Streptomyces violaceoruber, Trichoderma reesei, Aspergillus niger oder Naja mossambica ausgewählt, und/oder unabhängig davon wird die Phospholipase C aus Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Pichia pastoris oder Listeria monocytogenes ausgewählt.
  • Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einem der wässrigen Phase der Öl-Wasser-Mischung von kleiner 7, bevorzugt von kleiner 6, besonders bevorzugt von kleiner 5 durchgeführt. Die Untergrenze des pH-Wert liegt vorzugsweise bei 3,0, stärker bevorzugt bei 3,5. Wenn zusätzlich zur Phosphatase eine Phospholipase verwendet wird, wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einem pH-Wert von 4,0 bis 5,5 durchgeführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens liegt das Verhältnis der Phosphatase zu dem Phospholipid-spaltenden Enzym im Bereich von 0,01 : 6 units/g Öl bis 6 : 0,01 units/g Öl.
  • Vorzugsweise liegen die Phosphatase und/oder das Phospholipid-spaltende Enzym in geträgerter Form vor.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden Sojaöl, Rapsöl, Canolaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Palmöl, Jatrophaöl, Leindotteröl oder Baumwollsaatöl als Öle eingesetzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird anstelle des Pflanzenöls ein wässriger Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung von einem der vorstehend genannten Öle anfällt, eingesetzt.
  • Insbesondere wird Sojaöl mit einer Phytase, vorzugsweise einer 3-Phytase oder 6-Phytase, und ggf. zusätzlich mit einer Phospholipase A1 entschleimt. Gemäß einer Ausführungsform wird Rapsöl mit einer sauren Phosphatase und ggf. zusätzlich mit einer Phospholipase A1 entschleimt.
  • Vorzugsweise wird vor dem in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) das rohe Pflanzenöl mit Wasser und/oder Säure in Kontakt gebracht. Diese Maßnahme ist als Vorkonditionierung bekannt, wenn vor Durchführung des Schrittes a) keine Trennung in Wasser bzw. Öl erfolgt, bzw. als Vorentschleimung, wenn vor Durchführung des Schrittes a) eine Trennung in Wasser bzw. Öl erfolgt.
  • In bevorzugter Weise wird eines der Enzyme, wie vorstehend definiert, zur Erhöhung der Ölausbeute in einem Verfahren zur wässrigen Öl-Entschleimung, zur Verringerung der Emulgierbarkeit von Pflanzenölen in wässrigen Phasen, oder zur Entölung von Pflanzenölschleim bzw. Lecithin verwendet.
  • Generell können auch eine Kombination aus zwei oder mehr der vorgenannten Phosphatase-Enzyme eingesetzt werden, die aus gleichen oder verschienen Quellen stammen können. Die Enzyme können dabei von einem beliebigen Organismus (z.B. auch isoliert aus einem thermophilen Organismus) oder einer synthetischen Quelle stammen. Das Gleiche gilt für die Phospholipid-spaltenden Enzyme bzw. deren Mischungen mit Phosphatasen.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft, da durch den Einsatz der Phosphatase-Enzyme, insbesondere durch das relativ kostengünstige Bulk-Enzym Phytase bzw. durch saure Phosphatasen, die Spaltung von Komponenten, die in der Schleimphase vorhanden sind, erfolgen kann. Überdies verbessert die Phosphatase die Wirkung des Phospholipid-spaltenden Enzyms, wenn dieses zusätzlich zur Phosphatase eingesetzt wird. Es wird angenommen, dass durch den Einsatz der Phosphatase, insbesondere durch Phytase und/oder saure Phosphatase, eine Erniedrigung der Viskosität der Schleimphase, eine Erhöhung der Beweglichkeit der Phospholipide oder eine bessere Zugänglichkeit der Phospholipide erreicht werden kann. Eine zusätzliche Steigerung der vorstehend beschriebenen Wirkungen ergibt sich, wenn zusätzlich Phospholipid-spaltende Enzyme eingesetzt werden.
  • Es wurde überraschend gefunden, dass die Entschleimung von Triglyceriden mit mindestens einer Phosphatase durchgeführt werden kann; insbesondere eignen sich Phytase und saure Phosphatase zu diesem Zweck. Es können zwei oder mehrere Phytasen eingesetzt werden, die aus gleichen oder verschiedenen Quellen stammen können; sie können z.B. auch aus einem thermophilen Organismus isoliert werden oder aus einer synthetischen Quelle stammen. Für die sauren Phosphatasen und deren Mischung mit Phytase(n) gilt das Gleiche sinngemäß.
  • Ferner wurde gefunden, dass sich Triglyceride effizient entschleimen lassen, wenn neben der Phosphatase vorzugsweise ein weiteres Phospholipid-spaltendes Enzym zugegeben wird. Bei dem Phospholipid-spaltenden Enzym kann es sich um eine Phospholipase handeln, die in der Lage ist, entweder einen Fettsäurerest oder einen Phosphatidylrest oder eine Kopfgruppe von einem Phospholipid abzuspalten. Überdies kann es sich auch um eine sogenannte Acyltransferase handeln, bei der die Abspaltung des Fettsäurerests aus einem Phospholipid mit einer Übertragung dieses Restes auf ein freies Sterol unter Esterbildung in der Ölphase verbunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem ein Phospholipid-spaltendes Enzym aus der Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase C, Phospholipase B, Phospholipase D oder Acyltransferase ausgewählt wird.
  • Typische Enzyme aus dieser Gruppe sind die Lecitase® Ultra von Novozymes®, eine Phospholipase A1; Lecitinase® von Novozymes, eine Phospholipase A2; Rohalase® MPL, eine Phospholipase A2 von AB Enzymes, Darmstadt(D); Gumzyme TM, eine Phospholipase A2 von DSM, Purifine®, eine Phospholipase C von DSM,; Lysomax®, eine Acyltransferase der Firma Danisco. Dabei kann innerhalb der Gruppe der Phospholipid-spaltenden Enzyme auch eine Kombination aus zwei oder mehr der vorgenannten Phospholipid-spaltenden Enzyme eingesetzt werden, welche aus gleichen oder unterschiedlichen Quellen stammen können. Die Enzyme können dabei von einem beliebigen Organismus (z. B. auch isoliert aus einem thermophilen Organismus) oder einer synthetischen Quelle stammen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Zugabe von Wasser bzw. einer wässrigen Säurelösung und ggf. von Alkali zur Neutralisierung der Säure zum Rohöl im Sinne einer Vorkonditionierung erfolgen, jedoch unterbleibt die Abtrennung der wässrigen Phase vor der Zugabe der Enzyme (im Sinne einer Naßvorentschleimung). Durch den Verzicht auf den Abtrennungsschritt vor der Zugabe der Enzyme ist eine Steigerung der Ölausbeute möglich. Eine Steigerung der Ölausbeute um einen Prozentpunkt hat eine enorme wirtschaftliche Bedeutung, da dieses Prozent ca. 400.000 t Öl entspricht, bezogen auf die jährliche Produktion von Sojaöl. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit die unmittelbare Verwendung von Rohölen aus Soja bzw. Raps mit Phosphorgehalten von 500 bis 1.500 ppm Phosphor. Überdies stellt es eine Vereinfachung des Verfahrens dar, weil der Trennschritt vor Enzymzugabe entfällt.
  • Bei der Zugabe von Wasser ist Folgendes zu bedenken: Um die Phosphatide aus dem Öl zu entfernen, ist ca. 1 Vol.-% Wasser, bezogen auf das Ölvolumen, erforderlich, um ca. 400 ppm Phosphor zu entfernen. Nach dieser Überlegung ist die Zugabe von ca. 5 Vol.-% Wasser, bezogen auf das Ölvolumen, ausreichend, um auch ein Öl mit hohem Phosphorgehalt vollständig vom Phosphor zu befreien. Allerdings führt eine solche Vorgehensweise dazu, dass das Verfahren unwirtschaftlich wird, weil stets größere Reaktionsvolumina vorgehalten werden müssen. Überdies bedingt ein größeres zugegebenes Wasservolumen einen höheren Trennaufwand und eine geringere Ölausbeute; weniger zugegebenes Wasser bedeutet somit auch eine höhere Ölausbeute. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Ölbehandlung wird daher nicht mehr als 4 Vol.-% Wasser, vorzugsweise nicht mehr als 3 Vol.-% Wasser, jeweils bezogen auf das Ölvolumen, zum Öl gegeben.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden in dem Raffinationschritt - abgesehen von den im Öl bereits vorhandenen Emulgatoren, wie z.B. Lecithin - keine zusätzlichen Emulgatoren, wie z.B. Natriumdocecylsulfat (SDS), zugegeben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymaktivität der Phosphatase(n) im Bereich von 0,01 bis 10 units/g Öl gewählt, bevorzugter im Bereich von 0,1 bis 6 units/g Öl, besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 5 units/g Öl. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymaktivität der Phospholipid-spaltenden Enzyme im Bereich von 0,01 bis 6 units/g Öl, bevorzugt 0,1 bis 3 units/g Öl und besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 2,5 units/g Öl gewählt und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,25 bis 1 units/g Öl. (Unit: Internationale Einheit für Enzymaktivität; 1 Unit entspricht dem Substratumsatz von 1 µmol/min).
  • Vorzugsweise wird das Verhältnis der Enzymaktivität der Phosphatase zur Enzymaktivität der Phospholipid-spaltenden Enzyme im Bereich von 0,01 : 6 units/g Öl bis 6 : 0,01 units/g Öl liegen, bevorzugt im Bereich von 0,1 : 4 units/g Öl bis 4 : 0,1 units/g Öl. Dabei ist es auch bevorzugt, wenn der Anteil der Phosphatase(n) und der Anteil der phospholipid-spaltenden Enzyme gleich ist, wenn beispielsweise beide Anteile im Bereich von 0,1 bis 5 units/g Öl, bevorzugt im Bereich 0,2 bis 3 units/g Öl gewählt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung wird die Ölentschleimung bzw. die Entölung des Pflanzenschleims bei saurem pH-Wert durchgeführt. Ein bevorzugter pH-Wert des wässrigen Teils des Öl-Wasser - Mischung liegt im Bereich von 3,0 bis 7,5, bevorzugt von 3,5 bis 6,5, insbesondere bevorzugt von 3,8 bis 6,0. Wenn der pH-Wert innerhalb dieses Bereichs liegt, kann eine schnelle Reaktionsführung beobachtet werden.
  • Die Phosphatase-Enzyme und/oder Phospholipid-spaltenden Enzyme können beispielsweise gefriergetrocknet und in einem Enzympuffer gelöst verwendet werden. Als Beispiele können Citratpuffer 0,01 - 0,25 M, pH 3,8-7,5, vorzugsweise 0,1 m Citratpuffer bei pH 5,0, oder Acetatpuffer 0,01 - 0,25 M, pH 3,8-7,5, vorzugsweise 0,1 M Acetatpuffer bei pH 4,0, genannt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme in Wasser oder Enzympuffer aufgenommen und dem Rohöl zugesetzt. Um eine bessere Löslichkeit der Enzyme - insbesondere in den Phospholipide enthaltenden Mischungen - zu erreichen, ist auch der Zusatz von organischen Lösungsmitteln möglich. Diese finden Anwendung z. B. in der Auftrennung der Phospholipide und sind in der Literatur beschrieben. Bevorzugt verwendet werden unpolare organische Lösungsmittel, wie z. B. Hexan, oder Aceton oder Mischungen, bevorzugt in einer Menge von 1 bis 30 Gew.-% (Beispiele möglicher Lösungsmittel sind beschrieben in der EP 1531182 A2 ).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden das Phosphatase-Enzym und/oder das Phospholipid-spaltende Enzym in geträgerter Form eingesetzt, wobei die Enzyme adsorptiv oder kovalent auf einem Trägermaterial gebunden sind. Bevorzugte Trägermaterialien sind anorganische Trägermaterialien, wie z. B. Kieselgele, Fällungskieselsäuren, Silikate oder Alumosilikate, und organische Trägermaterialien, wie z. B. Methacrylate oder Ionentauscherharze. Die Trägermaterialien erleichtern die Abtrennbarkeit und Wiederverwertbarkeit der (relativ teuren) Enzyme aus der Öl-Wasser-Emulsion in einem folgenden Verfahrensschritt und tragen zur Wirtschaftlichkeit des Verfahrens bei.
  • In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Phosphatase-Enzym mindestens ein Enzym, das aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Phytase, saurer Phosphatase, alkalischer Phosphatase, und Phosphatidinsäure-spezifischer Phosphatase besteht. Das Phospholipid-spaltende Enzym umfasst vorzugsweise mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase B, Phospholipase C, Phospholipase D, und Acyltransferase.
  • Vorzugsweise werden gefriergetrocknete Enzyme eingesetzt, die in einem Puffer, ausgewählt aus Citratpuffer oder Acetatpuffer, vorliegen. Es ist zudem bevorzugt, wenn mindestens das Phosphatase-Enzym adsorptiv oder kovalent auf einem Träger gebunden vorliegt.
  • Die Erfinder des Verfahrens haben überraschend gefunden, dass Phosphatase-Enzyme, insbesondere saure Phosphatase und/oder Phytase, geeignet sind, die Emulgierbarkeit von Pflanzenöl in wässrigen Phasen wirkungsvoll und effektiv zu verringern. Zusätzlich kann dieser Effekt durch eine Kombination der Phosphatase-Enzyme mit Phospholipid-spaltenden Enzymen gesteigert werden. Das Verfahren kann vorteilhaft für die Entschleimung von rohem Pflanzenöl oder auch zur Aufbereitung der Schleimstoffe eingesetzt werden. Die Schleimstoffe können dabei beispielsweise durch ein herkömmliches Entschleimungsverfahren oder durch das erfindungsgemäße Verfahren, wenn es zur Entschleimung von rohem Pflanzenöl eingesetzt wird, erhalten werden.
  • Es können Triglyceride, vorzugsweise rohe oder unbehandelte Triglyceride, als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, die mit dem Phosphatase-Enzym, ggf. in Kombination mit Phospholipid-spaltenden Enzymen, in Kontakt gebracht werden (Schritt a) und anschließend in Schleimstoffe und (entschleimte) Triglyceride getrennt werden; (Schritt b1). In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Enzym vor dem Trennschritt b1) zugegeben.
  • Alternativ zu den Triglyceriden kann ein Pflanzenölschleim, der z.B. durch ein herkömmliches Entschleimungs-Verfahren, wie z.B. durch Behandlung mit Wasser oder wässriger Säure, optional gefolgt von einer Neutralisation mit Lauge, erhalten wurde, mit dem Phosphatase-Enzym in Kontakt gebracht werden (Schritt a) und anschließend in eine wässrige Lecithin-haltige Phase und eine Ölphase aufgetrennt werden; (Schritt b2). Im Fall der Abtrennung des Pflanzenölschleims nach einem herkömmlichen Verfahren, wird das Phosphatase-Enzym nach der Abtrennung des Pflanzenölschleims diesem zugesetzt. Mit dieser Vorgehensweise kann folglich aus Pflanzenölschleim sowohl weiteres Öl als auch entöltes Lecithin gewonnen werden. Die Phosphatasen, ggf. in Kombination mit den Phospholipasen A1, A2 oder B, können zur Entölung von Pflanzenölschleim eingesetzt werden.
  • Beiden Alternativen gemeinsam sind die Verfahrensschritte des in-Kontakt-Bringens der Ausgangsmaterialien mit dem erfindungsgemäßen Enzym und die anschließende Trennung in eine wässrige und eine ölige Phase; oder verkürzt ausgedrückt: die Gewinnung von lecithinfreiem Öl und ölfreiem Lecithin durch Trennung mittels Enzymen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der Emulgierbarkeit von Triglyceriden in wässrigen Phasen umfassend die Schritte
    1. a) in-Kontakt-Bringen der rohen Triglyceride mit einem oder mehreren Enzymen wie vorstehend beschrieben; und
    2. b) Abtrennen der Schleimstoffe von den Triglyceriden.
  • Erstaunlicherweise wurde gefunden, dass es gelingt, durch den Einsatz von Phosphatase-Enzymen die Ölausbeute der Reaktion zu erhöhen. Des Weiteren wurde überraschend gefunden, dass durch die Kombination von Phosphatase-Enzymen mit Phospholipid-spaltenden Enzymen die Ölausbeute der Reaktion noch weiter gesteigert wird. Überdies wird durch die Zugabe der Phosphatasen der Phospholipidgehalt des Rohöls gegenüber dem reinen Einsatz von Phospholipid-spaltendem Enzym (im Stand der Technik) weiter abgesenkt, die Reaktionsgeschwindigkeit bei der enzymatischen Entschleimung erhöht, und/oder die Abtrennbarkeit der gebildeten Schleimphase verbessert.
  • Durch den Einsatz von Phosphatase-Enzymen, insbesondere durch saure Phosphatase und/oder Phytase, ist es möglich, in Verbindung mit Phospholipid-spaltenden Enzymen, die Dosierung der Phospholipid-spaltenden Enzyme, wie z. B. der Phospholipase A1, A2 oder B, gegebenenfalls kombiniert mit Phospholipase C, zu verringern und so neben den oben angeführten Vorteilen für den Prozess auch Kosten zu sparen.
  • Das "in-Kontakt-Bringen" kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auf jede Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugte Art des in-Kontakt-Bringens ist dabei ein Vermischen des Rohöls und der Enzyme.
  • Nach dem Mischen des Rohöls mit dem Enzym bzw. den Enzymen wird die Mischung aus Rohöl und Enzym bevorzugt gerührt, besonders bevorzugt mit einem Flügelrührer bei 200 bis 800 U/min, bevorzugt 250 bis 600 U/min und am meisten bevorzugt bei 300 bis 500 U/min.
  • Die Temperatur der Mischung liegt während des in-Kontakt-Bringens bevorzugt im Bereich von 15 bis 99 °C, bevorzugter im Bereich von 20 bis 95 °C, weiter bevorzugt von 22 bis 80 °C, ebenfalls bevorzugt von 30 bis 80 °C, weiter bevorzugt von 32 bis 80 °C und am meisten bevorzugt von 35 bis 80 °C. Dabei soll gemäß einer Ausführungsform die Temperatur der Mischung immer so gewählt werden, dass die Denaturierungstemperatur der Enzyme nicht überschritten wird. Bevorzugt liegt die Temperatur der Mischung mindestens 5 °C unter der Denaturierungstemperatur der Enzyme bzw. der niedrigsten Denaturierungstemperatur der Enzyme. Bei Einsatz von Enzymen, die aus thermophilen Organismen isoliert wurden, sind generell höhere Temperaturen zu bevorzugen. Werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere thermostabile Enzyme eingesetzt, so liegt die Prozesstemperatur bevorzugt im Bereich von 80 bis 120 °C, bevorzugter im Bereich von 85 bis 100 °C. Die Verwendung thermostabiler Enzyme hat den Vorteil, dass somit eine erhöhte Verfahrenstemperatur gewählt werden kann, wodurch die Viskosität des Pflanzenöls verringert wird und das Verfahren insgesamt verkürzt werden kann - auch aufgrund einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit der Enzyme. Des Weiteren erübrigt sich im Falle einer Vorbehandlung, die vorteilhaft ebenfalls bei erhöhten Temperaturen durchgeführt wird, ein anschließendes Abkühlen unterhalb einer niedrigeren Denaturierungstemperatur der eingesetzten Enzyme. Insgesamt führt die Verwendung thermostabiler Enzyme damit zur einer Verfahrensverkürzung und Kostensenkung.
  • Die Dauer des in-Kontakt-Bringens liegt dabei bevorzugt im Bereich von 1 Minute bis 12 Stunden, bevorzugter von 5 Minuten bis 10 Stunden, ebenfalls bevorzugt von 10 Minuten bis 6 Stunden, weiter bevorzugt von 15 Minuten bis 4 Stunden.
  • Der pH-Wert des wässrigen Anteils der Mischung aus Öl und Enzym liegt während des in-Kontakt-Bringens bevorzugt im Bereich von pH 3 bis pH 7,5, bevorzugter im Bereich von pH 3,5 bis pH 6,5 und besonders bevorzugt im Bereich von pH 3,8 bis pH 6,0.
  • Das Abtrennen der Schleimstoffe gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf jede Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist, bevorzugt erfolgt die Abtrennung jedoch über Zentrifugation oder Filtration, wobei Zentrifugation bevorzugt ist. Bei der Zentrifugation erfolgt eine Phasentrennung der Mischung, sodass das behandelte Pflanzenöl, die Schleimstoffe und die Enzymzusammensetzung in separaten Phasen vorliegen, die leicht voneinander getrennt werden können. In Bezug auf die Abtrennung ist es unerheblich ob von Triglyceriden, insbesondere rohen Pflanzenölen, nach Schritt b1) ausgegangen wird, oder von Pflanzenölschleim nach Schritt b2), da beide Alternativen ein identisches Verfahren erfordern. Die voneinander getrennten Produkte unterscheiden sich lediglich in ihrer Menge, nicht jedoch in ihrer chemischen Natur.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei die Phase enthaltend die Schleimstoffe sowie die Phase, welche das Enzym enthält, von dem behandelten Öl abgetrennt. Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn gleichzeitig mit den Schleimstoffen sämtliche Enzyme abgetrennt werden.
  • Die Enzyme können nach der Abtrennung regeneriert bzw. gereinigt und beispielsweise in einem neuen Aufreinigungsverfahren eingesetzt werden. Auch in diesem Fall ist es ebenfalls günstig, wiederum mit den erfindungsgemäßen Enzymen zu arbeiten, entweder, indem man die Phosphatase-Enzyme direkt in Kombination mit geträgerten Phospholipasen oder Lipidacyltransferasen einsetzt, oder indem man das Enzym erfindungsgemäß einsetzt, um den Pflanzenölschleim, der z.B. an geträgerten Phospholipasen haftet, zu entfernen, um die geträgerten Enzyme besser in einem neuen Verfahren wiederverwenden zu können.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft zudem ein Verfahren wie vorstehend beschrieben, weiter umfassend den Schritt
    • c) erneutes in-Kontakt-Bringen der Triglyceride gemäß Schritt a) mit dem bzw. den erfindungsgemäß verwendeten Enzym(en) .
  • Das in-Kontakt-Bringen erfolgt dabei bevorzugt unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend für Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Dabei werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die Phosphatase-Enzyme und/oder die Phospholipid-spaltenden Enzyme vor dem erneuten in-Kontakt-Bringen einer Regeneration oder Reinigung unterzogen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das rohe Pflanzenöl vor dem in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Wasser und/oder Säure in Kontakt gebracht. Bevorzugte Säuren sind dabei Calcium- und Magnesium-komplexierende Säuren allein oder in Kombination, wie z. B. Zitronensäure und Phosphorsäure. Man spricht hier von einer sogenannten "Vorentschleimung".
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das in-Kontakt-Bringen mit Wasser bei einer Temperatur zwischen 30°C bis 90°C für 15 bis 60 Minuten, bevorzugt 30 bis 60 Minuten, wobei eine Temperatur von 35 bis 85 °C bevorzugt und eine Temperatur von 40 bis 80 °C besonders bevorzugt ist. Das in-Kontakt-Bringen mit Säure, insbesondere Zitronensäure oder Phosphorsäure, erfolgt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 30°C bis 90°C für 5 bis 60 Minuten, bevorzugt 15 bis 60 Minuten, wobei eine Temperatur von 35 bis 85 °C bevorzugt und eine Temperatur von 40 bis 80 °C besonders bevorzugt ist. In einer weiteren möglichen Ausführungsform wird anschließend die säurehaltige, wässrige Phase z. B. durch Zentrifugation abgetrennt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach der Säurebehandlung ein Neutralisationsschritt mit einer entsprechenden Base erfolgen, um einen pH-Wert von 3,5 bis 8,0, bevorzugt von 4 bis 7, zu erreichen. Anschließend kann das Öl von den erhaltenen Schleimstoffen durch z. B. Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden. Ebenfalls möglich und bevorzugt ist es gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wenn das bzw. die Enzyme direkt zu dem Pflanzenöl gegeben werden, ohne dass zuvor ein Abtrennungsschritt durchgeführt wurde.
  • Vor Zusatz der Phosphatase(n) und ggf. der Phospholipase(n) soll bevorzugt dafür gesorgt werden, dass die Reaktionstemperatur den optimalen Temperaturbereich des Enzyms nicht übersteigt, um ein Denaturieren des Enzyms zu verhindern. Temperaturen zwischen 35 bis 75 °C, besser zwischen 45 bis 70 °C, sind geeignet, wobei durch Einsatz von Enzymen aus thermophilen Organismen, also besonders temperaturstabilen Enzymen, ein Einsatz bei 80 bis 100 °C möglich ist, so dass zwischen dem in-Kontakt-Bringen des rohen Pflanzenöls mit Wasser und/oder Säure und dem in-Kontakt-Bringen mit dem Enzym bzw. den Enzymen keine Temperaturabsenkung erfolgen muss. Eine Erhöhung der Temperaturstabilität kann auch durch eine Immobilisierung der Enzyme erreicht werden. Da viele Enzyme eine gewisse Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln aufweisen (Faber, K., Biotransformations in Organic Chemistry (2001), Springer-Verlag, Heidelberg), können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch dementsprechend vorbehandelte Öle oder Schleime mit den Enzymen behandelt werden.
  • In Ausführungsformen, die den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken, umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Schritte:
    • Allgemeine Ausführungsform A)
    1. a) in-Kontakt-Bringen der Triglyceride, vorzugsweise von rohem Sojaöl und/oder rohem Rapsöl, mit einem Phosphatase-Enzym, vorzugsweise Phytase und/oder saure Phosphatase, und ggf. einer Phospholipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase B, Phospholipase C, Phospholipase D, oder Acyltransferase
    2. b) Abtrennen der Schleimstoffe von dem Pflanzenöl durch Zentrifugation.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor Schritt a) des Verfahrens eine sogenannte Vorkonditionierung durchgeführt, indem das rohe Öl in einem eigenen Verfahrensschritt mit einer Menge von 300-1.000 ppm an organischer Säure, bevorzugt Zitronensäure, vermischt wird. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 45 bis 85 °C eingestellt, besonders bevorzugt 48-80 °C. Nach einer Reaktionszeit von vorzugsweise 10 Minuten bis 2 Stunden, weiter bevorzugt 15 min - 1 Stunde, wird die Mischung durch Zugabe einer stöchiometrischen Menge Lauge, bevorzugt Natronlauge, in einer Menge von bevorzugt 0,5 bis 2 Mol/l, besonders bevorzugt 1 Mol/l, auf einen pH von 4-5 eingestellt. Erst danach wird gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verfahren.
    • Allgemeine Ausführungsform B)
    1. a) in-Kontakt-Bringen der Triglyceride, vorzugsweise des rohen Sojaöls und/oder Rapsöls, mit einem Phosphatase-Enzym, vorzugsweise Phytase und/oder saure Phosphatase, und ggf. einer Phospholipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase B, Phospholipase C, Phospholipase D, oder Acyltransferase, wobei es bevorzugt ist, wenn mindestens ein Enzym auf einem Träger immobilisiert vorliegt;
      Hierbei ist es besonders bevorzugt, dass die Phosphatase-Enzyme und ggf. der Phospholipase-Enzyme in einer wässrigen Phase (Puffer bevorzugt im Bereich pH 4,0 bis 5,5 in einer Konzentration von 0,05 bis 5 % w/v eingesetzt werden.
      Das in-Kontakt-Bringen erfolgt dabei bevorzugt bei einer Temperatur von 20 bis 70 °C, bevorzugter 40 bis 65 °C.
    2. b) Abtrennen der Schleimstoffe von den Triglyceriden durch Zentrifugation.
  • Diese bevorzugte Ausführungsform B) wird in einer bevorzugten Ausführungsform mit einer Nachentschleimung durch die Zugabe von einer organischen Säure und/oder Lauge (nach Schritt b) bzw. b1)) kombiniert. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 35 bis 60 °C eingestellt, besonders bevorzugt 50 °C. Nach einer Reaktionszeit von 5 Minuten bis 2 Stunden, bevorzugt 1 Stunde, wird die Mischung durch Zugabe einer Lauge, bevorzugt Natronlauge, in einer Konzentration von bevorzugt 0,5 bis 2 Mol/l, besonders bevorzugt 1 Mol/l, auf einen pH von 4-5 eingestellt.
    • Allgemeine Ausführungsform C)
  • Gemäß der bevorzugten Ausführungsform C) wird anstelle des rohen Pflanzenöls eine Schleimphase, welche durch ein herkömmliches oder das erfindungsgemäße Entschleimungsverfahren abgetrennt wurde, mit dem bzw. den Enzymen in-Kontakt-gebracht.
  • Das Verfahren erfolgt bevorzugt gemäß der Ausführungsform A), B) oder D). Dieses Verfahren ermöglicht beispielsweise die Rückgewinnung von entschleimtem Öl, das mit der Schleimphase abgetrennt wurde. Es gestattet somit eine Rückgewinnung des Öls und führt zu einer indirekten Erhöhung der Ölausbeute; außerdem ermöglicht es eine Entölung des Lecithins.
    • Allgemeine Ausführungsform D)
    1. a) in-Kontakt-Bringen der Triglyceride, vorzugsweise des rohen Sojaöls und/oder Rapsöls, mit einem Phosphatase-Enzym, vorzugsweise Phytase und/oder saure Phosphatase, und ggf. einer Phospholipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase B, Phospholipase C, Phospholipase D, oder Acyltransferase, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn mindestens ein Enzym auf einem Träger immobilisiert vorliegt.
      Das in-Kontakt-Bringen erfolgt dabei bevorzugt bei einer Temperatur von 70 bis 100 °C, bevorzugter 75 bis 85 °C und erfolgt unter Verwendung ausschließlich thermostabiler Enzyme bzw. von Enzymen, deren Denaturierungstemperatur mindestens 1 °C, bevorzugt 5 °C oberhalb der Prozesstemperatur liegt.
      In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor Schritt a) des Verfahrens eine sogenannte Vorkonditionierung durchgeführt, indem das rohe Öl in einem eigenen Verfahrensschritt mit einer Menge von 300-1.500 ppm an organischer Säure, bevorzugt Zitronensäure, vermischt wird. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 40 bis 85 °C eingestellt, besonders bevorzugt 48-80 °C. Nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten bis 2 Stunden, bevorzugt 15 min - 1 Stunde wird die Mischung durch Zugabe einer Lauge, bevorzugt Natronlauge, in einer Menge von bevorzugt 0,5 bis 2 Mol/l, besonders bevorzugt 1 Mol/l auf bevorzugt pH 4-5, konditioniert. Erst danach wird gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verfahren.
    2. b) Abtrennen der Schleimstoffe von den Triglyceriden durch Zentrifugation.
  • Zudem lassen sich etwaige, noch im Pflanzenöl gelöste und durch die Phospholipasen nicht gespaltene Phosphatidsäuren weiter reduzieren, indem der Ca- und/oder Mg-Gehalt des erfindungsgemäß behandelten Öls reduziert wird. Daher werden die oben angeführten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens A) bis D) in allgemeinen Ausführungsformen noch durch einen Folgeschritt ergänzt, bei dem durch nochmalige Zugabe von Komplexierungsmitteln, wie z.B. Zitronensäure oder Phosphorsäure, der Gehalt an zweiwertigen Ionen und parallel dazu der Gehalt an P im Öl weiter reduziert wird.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, den Phosphorwert in dem rohen Pflanzenöl stark abzusenken. Dabei wird der Phosphorwert auf unter 20 ppm gesenkt, besonders bevorzugt auf unter 10 ppm.
  • Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, den Calcium- und Magnesiumgehalt des rohen Pflanzenöls auf unter 20 ppm zu senken, besonders bevorzugt auf unter 15 ppm, ganz besonders bevorzugt auf unter 10 ppm, ebenfalls bevorzugt auf unter 8 ppm und am meisten bevorzugt auf unter 4 ppm. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Calcium- und Magnesiumgehalt auf unter 3 ppm gesenkt.
    • Beispiele und Figuren:
  • Die Erfindung wird im Weiteren an Hand von Figuren und Beispielen näher erläutert. Es wird hierbei betont, dass die Beispiele und Figuren lediglich veranschaulichenden Charakter besitzen und besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Weder Beispiele noch Figuren beschränken den Rahmen der vorliegenden Erfindung.
  • Es zeigen:
    • Fig. 1
    Sojaöl: Vorkonditionierung mit 2 % Gesamtwasseranteil
    Fig. 2
    Sojaöl: Vorkonditionierung mit Zugabe von Enzym PLA1 0,3 Units/g Öl und 2 % Gesamtwasseranteil
    Fig. 3
    Sojaöl: Vorkonditionierung mit Zugabe von Enzym PLA1 0,3 Units/g Öl und dem Enzym Phytase 1 Unit/g Öl, 2 % Gesamtwasseranteil
    Fig. 4
    Rapsöl: Vorkonditionierung mit 3 % Gesamtwasseranteil
    Fig. 5
    Rapsöl: Vorkonditionierung mit Zugabe von Enzym PLA1 0,3 Units/g Öl und 3 % Gesamtwasseranteil
    Fig. 6
    Rapsöl: Vorkonditionierung mit Zugabe von Enzym PLA1 0,3 Units/g Öl und dem Enzym saurer Phosphatase 0,4 Unit/g Öl, 3 % Gesamtwasseranteil
    Methoden
  • Es wurden folgende Analysenmethoden verwendet:
    • Bestimmung des Phosphorgehaltes in den Pflanzenölen
  • Die Bestimmung von Phosphor erfolgte durch ICP gemäß DEV E-22.
    • Bestimmung des Calcium- und Magnesiumgehaltes in den Pflanzenölen
  • Die Bestimmung von Calcium bzw. Magnesium erfolgte durch ICP gemäß DEV E-22.
    • Bestimmung des Gehalts freier Fettsäuren (FFA)
  • Bestimmt wird der Gehalt freier Fettsäuren über den Verbrauch an Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid über eine Verseifungsreaktion. Erhalten wird der prozentuale Gehalt freier Fettsäuren im untersuchten Öl. Die Bestimmung erfolgte gemäß DIN 53402 (Methode DGF C-V 2).
    • Bestimmung des Schleimvolumens
  • Mithilfe dieser Bestimmung wird die im Öl enthaltene Schleimphase von enzymatisch unbehandeltem und enzymatisch behandeltem Schleim gemessen. Ein 10 mL Schleuderglas wird auf die Arbeitstemperatur des Reaktionsansatzes erwärmt, die Proben (2 x 2 mL) werden eingefüllt und temperiert mindestens 4 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert um die Schleimphase vom Öl zu trennen. Von der oberen Ölphasen werden Proben für die Analytik entnommen. Zu Dokumentationszwecken wird das Ergebnis der Phasenbildung zusätzlich fotografiert.
    • Bestimmung der Ölausbeute, des Ölgehalts in der Schleimphase und des Schleimvolumens
  • Die Bestimmung der Ölausbeute, des (Rest-)Ölgehalts in der Schleimphase und des Schleimvolumens sind durch die Bestimmung des Schleimvolumens nach standardisiertem Verfahren, wie sie auch in PCT/EP 2013/053 199 beschrieben sind, detektierbar. Weiterhin kann durch Soxhlet-Extraktion des isolierten Schleims der Ölgehalt des Schleims separat gemäß DIN ISO 659 bestimmt werden.
    • Variante 1:
  • Die zu behandelnde Menge Rohöl, 400 bis 600 g, wird in einen Duran Reaktor DN120 1000 mL eingefüllt und Proben für die Analytik werden abgenommen. Das Öl im Duranreaktor wird mithilfe einer Heizplatte auf eine Temperatur von 35 bis 90 °C, insbesondere 48 °C oder 80°C, aufgeheizt, wobei eine Temperatur eingehalten werden muss, bei welcher das Enzym nicht denaturiert. Nachdem die Temperatur erreicht ist, wird mit der Vorkonditionierung begonnen. Dafür wird eine definierte, von der Ölmenge abhängige Menge verdünnter Zitronensäure (z. B. 450-1000 ppm), zum Öl zudosiert. Anschließend kann die Mischung mit einem Ultraturrax für 1 Minute durchmischt werden. Als Alternative wird unter Rühren bei etwa 600 rpm, 15 min bis 1 Stunde, inkubiert um die Reaktion der Säure abzuwarten. Anschließend wird eine definierte Menge Natronlauge (1-4 Mol/L, Restmenge zu 2-3 % v/v, abzüglich Wasser aus Säurezugabe und Enzymzugabe) zugegeben und es wird weitere 10 Minuten unter Rühren inkubiert. An dieser Stelle erfolgt die Zugabe des Enzyms, der Enzym-Mischung oder des Immobilisats, vorzugsweise gelöst in Puffer. Das Enzym wird untergerührt, wofür die Rührerdrehzahl kurzzeitig erhöht werden kann (1 Minute auf 900 rpm), anschließend wird bei niedrigerer Drehzahl weitergerührt.
  • Die Probenahme erfolgt in definierten Zeitabständen. Die Probe wird mithilfe einer Pipette genommen, in ein temperiertes Schleuderglas eingefüllt (Temperatur des Reaktionsansatzes) und temperiert mindestens 4 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert um die Schleimphase vom Öl zu trennen. Zu Dokumentationszwecken wird das Ergebnis der Phasenbildung fotografiert. Vom Überstand werden Proben zur Bestimmung des Phosphor-, Calcium-und Magnesiumgehaltes genommen.
    • Variante 2:
  • In einer weiteren Durchführung werden Phosphatasen und ggf. zusätzliche Enzyme in einer geeigneten Kombination als freie Enzyme oder immobilisierte Enzyme zusammen mit einer wässrigen Phase (Enzym-Puffer, pH 4-5) 0,05 bis 5 % w/v, dem Rohöl zugesetzt. Die Emulsion, bestehend aus Wasser, Enzym, eventuell Enzymträgern und Öl, wird durchmischt. Idealerweise wird die Reaktion temperiert zwischen 20 bis 70 °C, besser zwischen 40 bis 65 °C durchgeführt. Anschließend wird die Phasentrennung abgewartet, die Feststoffe setzen sich ab oder können nach einem dem Fachmann bekannten Standardverfahren z. B. über Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Als Nachbehandlung kann das Öl mit verdünnter Säure (z. B. Zitronensäure) oder Lauge nach einem dem Fachmann als Entschleimung bekannten Verfahren restentschleimt werden.
    • Variante 3:
  • In einer weiteren Durchführung wird Ölschleim mit Enzymen behandelt. Dem Ölschleim, welcher nach einem dem Fachmann als Entschleimung bekannten Verfahren erhalten wird, werden neben Phospholipasen, weitere Enzyme zugesetzt. Diese können sich gelöst in einer wässrigen Phase oder suspendiert in einem organischen Lösungsmittel befinden. Der Ansatz wird idealerweise auf eine Temperatur zwischen 20 bis 70 °C temperiert, besser auf eine Temperatur zwischen 35 bis 65 °C. Der Ansatz wird durchmischt bis der Prozess abgeschlossen ist. Dies kann durch Viskositätsmessungen überprüft werden oder visuell, durch Auflösen der ansonsten festen Schleimphase. Durch Zentrifugation lässt sich eine Phasenseparation erreichen, die einzelnen Phasen können abgetrennt werden. In der Regel besteht die obere Phase aus dem gewonnenen Öl, die mittlere Phase aus den Phospholipiden und die untere Phase ist eine wässrige Phase und enthält die Enzyme. Durch Wiederverwendung der wässrigen Phase lassen sich die Enzyme recyceln und wiederverwenden. Je nach Gehalt zweiwertiger Ionen muss das Öl oder die das Enzym enthaltende Wasserphase durch Zusatz von Komplexierungsmitteln vor der weiteren Verwendung von den Ionen gereinigt werden.
    • Variante 4:
  • In einer weiteren Durchführung wird das Rohöl auf eine hohe Temperatur gebracht, vornehmlich 70 bis 100 °C, genauer 75 bis 85 °C. Das Rohöl wird nach dem oben beschriebenen Verfahren mit Säure und Lauge konditioniert, die Temperatur wird beibehalten und es werden thermostabile Enzyme zusetzt. Im Weiteren wird wie bereits beschrieben fortgefahren. Das Enzym wird untergerührt, wofür die Rührerdrehzahl kurzzeitig erhöht werden kann (z. B. 1 Minute auf 900 rpm), anschließend wird bei 600 rpm weitergerührt, bis die Reaktion beendet ist. Die Abtrennung des Ölschleims kann wie vorhergehend beschrieben erfolgen.
    • Beispiel 1:
  • Gemäß Reaktionsvariante 1 wurde ein Sojaöl mit folgenden Ausgangsgehalten verwendet: Phosphor 700 ppm, Calcium 65,6 ppm, Magnesium 62,6 ppm und einem Gehalt an freien Fettsäuren von 1 %. Das Rohöl wurde einer Vorkonditionierung mithilfe von wässriger Zitronensäure (450 ppm) und wässriger Natronlauge (1 Mol/L) unterzogen. Es wurden regelmäßig Proben genommen (siehe Tabelle 1). Am Ende der Reaktion wurde die Schleimphase abzentrifugiert und der Restölgehalt dieser nach Soxhlet bestimmt.
  • Als Vergleich wurde eben diese Vorkonditionierung mit Zugabe eines Enzyms, Phospholipase A1 aus dem Organismus Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich), durchgeführt (siehe Figur 2, Tabelle 2). In Figur 3, Tabelle 3 sind Ergebnisse der Vorkonditionierung mit Zusatz des Enzyms PLA1 aus Thermomyces lanuginosus und eines weiteren Enzyms, einer Phytase, d.h. einer 6-Phytase aus Aspergillus niger (von ASA-Spezialenzyme), dargestellt. Tab. 1 Vorkonditionierung mit 2 % Gesamtwasseranteil, Phosphor-, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
    Zeit [min] 10 60 120 180 240
    Ca [ppm] 7,8 8, 8 9,3 9,7 9,8
    Mg [ppm] 4,1 3,2 3,1 3,3 3,2
    P [ppm] 33 20 18 20 21
    FFA [%] 0,75 0,76 0,78
    Schleim [%]3 min 4,5 4,5 4,5 4, 0 4, 0
    Tab. 2 Vorkonditionierung mit Zugabe von PLA1 aus Thermomyces lanuginosus 0,3 Units/g Öl und 2 % Gesamtwasseranteil, Phosphor-, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
    Zeit [min] 10 60 120 180
    Ca [ppm] 9,6 9,9 9,3 8,1
    Mg [ppm] 4,4 3,2 3,6 3
    P [ppm] 23 14 18 15
    FFA [%] 0,79 1,24
    Schleim [%]3 min 4,8 3,0 2, 8 2,5
    Tab. 3 Vorkonditionierung mit Zugabe von PLA1 (aus Thermomyces lanuginosus) 0,3 Units/g Öl und Phytase 1 Unit/g Öl (6-Phytase), 2 % Gesamtwasseranteil, Phosphor, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
    Zeit [min] 10 60 120 180 240
    Ca [ppm] 4 6,1 5,5 4,7 7 -
    Mg [ppm] 2, 9 2,3 2,1 1,7 7 -
    P [ppm] 24 13 13 11 -
    FFA [%] 0,77 1,28 1,37
    Schleim [%]3 min 4,3 2, 8 2, 0 2, 0 1,8
  • Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, führt die Anwendung von Säure und Lauge auf das Rohöl als Vorkonditionierung zu einem nicht unerheblichen Schleimvolumen, welches in der Folge trotz Einsatz eines Rührers bei 600 rpm nicht wesentlich abnimmt. Das einzelne Foto entspricht einer Probeentnahme. Die Probeentnahmen erfolgen zu den Zeitpunkten 10, 60, 120, 180 und 240 Minuten. In Tabelle 1 sind die zugehörigen analytischen Daten aufgeführt: der Phosphorgehalt sank nach 240 Minuten von 33 ppm auf 21 ppm; die Konzentration der zweiwertigen Ionen Calcium und Magnesium nimmt im Fall des Calciums von 7,8 ppm auf 9,8 ppm leicht zu; die Konzentration des Magnesiums sinkt von 4,1 ppm auf 3,2 ppm im Verlauf der Reaktion. Der Gehalt freier Fettsäuren bleibt nahezu unverändert. Die Vorkonditionierung dient als Vorbereitungsreaktion zur Ölentschleimung und gleichzeitig als Referenzbehandlung.
  • In Figur 2 ist bei Verwendung des Enzyms Phospholipase A1 aus Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) eine Abnahme des Schleimvolumens im Verlauf der Reaktion erkennbar (je Messung/Probenahme ein Foto). Die zugehörigen Daten und die Zeitpunkte der Probenahme sind in Tabelle 2 dargestellt. Aus Tab. 2 ergibt sich eine Abnahme der Calciumkonzentration von 9,6 ppm auf 8,1 ppm, eine Abnahme der Magnesiumkonzentration von 4,4 ppm auf 3 ppm und eine Abnahme des Phosphorgehalts von 23 ppm auf 15 ppm; der Gehalt freier Fettsäuren steigt von 0,79 % auf 1,24 % an, jeweils nach 180 min Reaktionszeit. Aus dem Anstieg im Gehalt der freien Fettsäuren und der Abnahme des Phosphorgehalts lässt sich schließen, dass die PLA1 enzymatisch aktiv ist und folglich die Ölentschleimung erfolgreich funktioniert. Die Zunahme der freien Fettsäure ist ein Zeichen für die Aktivität der PLA1, welche die Fettsäuren aus den Phospholipidmolekülen abspaltet und auch das Schleimvolumen nimmt kontinuierlich ab.
  • In Figur 3 ist das Volumen der Schleimphase eines mit PLA1 und zusätzlich mit Phytase, d.h. einer 6-Phytase aus Aspergillus niger (ASA Spezialenzyme), behandelten vorkonditionierten Rohöls dargestellt. Aus den dazugehörigen analytischen Daten aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass erstaunlicherweise bereits nach 120 Minuten ein reduziertes Schleimvolumen von 2,0 % erreicht wird, im Vergleich zum Schleimvolumen von 2,8 % bei Einsatz der PLA1 alleine (Tabelle 2). Zusätzlich sind die Ionenwerte (Tabelle 3) im Vergleich zu den Werten in Tabelle 2 schneller verringert auf 4,7 ppm Ca, 1,7 ppm Mg und 11 ppm P z. B. nach 180 min Reaktion. Zusätzlich steigt der Gehalt freier Fettsäuren von 0,77 % auf 1,28 % an und weist damit auf die Aktivität der Phospholipase hin. Die Ergebnisse belegen, dass es erstaunlicherweise durch Zusatz eines einzigen weiteren Enzyms, einer Phytase, zu einer schnelleren und stärkeren Reduktion der Schleimphase kommt.
    • Beispiel 2:
  • Gemäß Reaktionsvariante 1 wurde ein Rapsöl mit folgenden Ausgangsgehalten verwendet: Phosphor 1200 ppm, Calcium 365 ppm, Magnesium 145 ppm und einem Gehalt an freien Fettsäuren von 1,65 %. Das Rohöl wurde einer Vorkonditionierung mithilfe von wässriger Zitronensäure (1000 ppm) und wässriger Natronlauge (4 Mol/L) unterzogen. Es wurden regelmäßig Proben genommen (siehe Tabelle 4). Am Ende der Reaktion wurde die Schleimphase abzentrifugiert und der Restölgehalt dieser nach Soxhlet bestimmt.
  • Als Vergleich wurde eben diese Vorkonditionierung mit Zugabe eines Enzyms, Phospholipase A1 aus dem Organismus Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich), durchgeführt (siehe Figur 5, Tabelle 5). In Figur 6, Tabelle 6 sind Ergebnisse der Vorkonditionierung mit Zusatz des Enzyms PLA1 (aus Thermomyces lanuginosus) und eines weiteren Enzyms, einer sauren Phosphatase aus Süßkartoffel (Sigma-Aldrich), dargestellt. Tab. 4 Vorkonditionierung mit 3 % Gesamtwasseranteil, Phosphor-, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
    Zeit [min] 10 60 120 180 240
    Ca [ppm] 76 11 9,5 9, 4 9,5
    Mg [ppm] 31 2,8 1,7 1,6 1,7
    P [ppm] 247 20 14 13 14
    FFA [%] 1,73 1,68 1,72
    Schleim [%]3 min 5,8 6,5 6,0 6,0 5,8
    Tab. 5 Vorkonditionierung mit Zugabe von PLA1 aus Thermomyces lanuginosus 0,3 Units/g Öl und 3 % Gesamtwasseranteil, Phosphor-, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
    Zeit [min] 10 60 120 180 240
    Ca [ppm] 26 9,7 8,7 7,9 7,9
    Mg [ppm] 9,7 2,1 1,8 1,4 1,5
    P [ppm] 82 17 15 12 12
    FFA [%] 1,76 2,35 2,14
    Schleim [%]3 min 6,5 5,6 5,0 4,5 5,5
    Tab. 6 Vorkonditionierung mit Zugabe von PLA1 0,3 Units/g Öl und saurer Phosphatase 0,407 Unit/g Öl, 3 % Gesamtwasseranteil, Phosphor, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
    Zeit [min] 10 60 120 180 240
    Ca [ppm] 15 13 9, 7 9,6 8,2
    Mg [ppm] 5,2 3,5 1, 8 1, 9 1,6
    P [ppm] 39 25 13 14 11
    FFA [%] 1,73 2,14 2,28
    Schleim [%]3 min 7,2 5,0 4,6 4,0 4,1
  • Wie aus Figur 4 ersichtlich ist, führt die Anwendung von Säure und Lauge auf das Rohöl als Vorkonditionierung zu einem nicht unerheblichen Schleimvolumen, welches in der Folge trotz Einsatz eines Rührers bei 600 rpm nicht wesentlich abnimmt. Das einzelne Foto entspricht einer Probeentnahme; die Probeentnahmen erfolgen zu den Zeitpunkten 10, 60, 120, 180 und 240 Minuten. In Tabelle 4 sind die zugehörigen analytischen Daten aufgeführt, der Phosphorgehalt sank nach 240 Minuten von 247 ppm auf 14 ppm, die Konzentration der zweiwertigen Ionen Calcium und Magnesium nimmt im Fall des Calciums von 76 ppm auf 9,5 ppm ab, die Konzentration des Magnesiums sinkt von 31 ppm auf 1,7 ppm im Verlauf der Reaktion. Der Gehalt freier Fettsäuren bleibt nahezu unverändert. Die Vorkonditionierung dient als Vorbereitungsreaktion zur Ölentschleimung und gleichzeitig als Referenzbehandlung.
  • In Figur 5 ist bei Verwendung des Enzyms Phospholipase A1 aus Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) eine Abnahme des Schleimvolumens von 1 % im Verlauf der Reaktion erkennbar (je Messung/ Probenahme ein Foto). Die zugehörigen Daten und die Zeitpunkte der Probenahme sind in Tabelle 5 dargestellt. Aus Tab. 5 ergibt sich eine Abnahme der Calciumkonzentration von 26 ppm auf 7,9 ppm, eine Abnahme der Magnesiumkonzentration von 9,7 ppm auf 1,5 ppm und eine Abnahme des Phosphorgehalts von 82 ppm auf 12 ppm, der Gehalt freier Fettsäuren steigt von 1,76 % auf 2,14 % an. Die Zunahme der freien Fettsäure ist ein Zeichen für die Aktivität der PLA1, welche die Fettsäuren aus den Phospholipidmolekülen abspaltet, und auch das Schleimvolumen nimmt ab.
  • In Figur 6 ist das Volumen der Schleimphase eines mit PLA1 (aus Thermomyces lanuginosus) und zusätzlich mit saurer Phosphatase aus Süßkartoffel behandelten vorkonditionierten Rohöls dargestellt. Aus den dazugehörigen analytischen Daten aus Tabelle 6 ist ersichtlich, dass erstaunlicherweise durch den zusätzlichen Einsatz der sauren Phosphatase im Vergleich zum alleinigen Einsatz der Phospholipase (Abb. 5, Tab.5) das Schleimvolumen der Reaktion deutlich verringert wird. Dies ist gleichbedeutend mit einer Steigerung der Ölausbeute (vergleiche Abb. 5 und 6, Tabelle 5 + 6) und damit einer größeren Gewinnspanne des Prozesses. Tabelle 7: Sojaöl: Gesamtölausbeute der Reaktionen aus Beispiel 1 nach Soxhlet-Extraktion der Schleimphase
    Mittel Ölausbeute [%]
    H3Cit (Zitronensäure) 97,1
    PLA1 (Thermomyces lanuginosus) 97,4
    6-Phytase (Aspergillus niger) 97,3
    6-Phytase (Aspergillus niger) + PLA1 (Thermomyces lanuginosus) 97,7
    Tabelle 8: Rapsöl: Gesamtölausbeute der Reaktionen aus Beispiel 2 nach Soxhlet-Extraktion der Schleimphase
    Mittel Ölausbeute [%]
    H3Cit (Zitronensäure) 96,2
    PLA1 (Thermomyces lanuginosus) 97,4
    Saure Phosphatase (Süßkartoffel) 96,7
    Saure Phosphatase (Süßkartoffel) + PLA1 (Thermomyces lanuginosus) 98,3
  • In Tabellen 7 und 8 sind die Gesamtölausbeuten der Reaktionen aus den Beispielen 1 und 2 nach Soxhlet-Extraktion der Schleimphase dargestellt. Hierbei ist ersichtlich, dass die eingesetzten Phosphatasen alleine und in Kombination mit der PLA1 die Ölausbeuten deutlich steigern.
  • Es werden pro Jahr weltweit ca. 43,5 Mio Tonnen Sojaöl hergestellt (USDA FAS - 2012). Bei einer Ölausbeutesteigerung von 97,1% beim Standardprozess auf 97,7% durch den enzymatischen Prozess Phytase und PLA1 würden 260.000 Tonnen mehr Sojaöl pro Jahr hergestellt werden können.
  • Es werden pro Jahr weltweit ca. 23,5 Mio Tonnen Rapsöl hergestellt (USDA FAS - 2012). Bei einer Ölausbeutesteigerung von 96,2% beim Standardprozess auf 98,3% durch den enzymatischen Prozess saure Phosphatase aus Süßkartoffel und PLA1 würden 500.000 Tonnen mehr Rapsöl pro Jahr hergestellt werden können.

Claims (13)

  1. Verfahren zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden oder zur Verringerung des Ölgehalts im Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung anfällt, welches Verfahren folgende Schritte umfasst:
    a) In Kontakt-Bringen der Triglyceride oder des Pflanzenölschleims, der bei der Ölentschleimung anfällt, mit einer Zusammensetzung, die mindestens eine Phosphatase enthält; und
    b1) im Fall von Triglyceriden als Ausgangsmaterial: Abtrennen der Schleimstoffe von den Triglyceriden; oder
    b2) im Fall von Pflanzenölschleim als Ausgangsmaterial: Auftrennung in eine wässrige, Lecithin-enthaltende Phase und eine Öl-haltige Phase.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Phosphatase eine saure Phosphatase oder eine Phytase oder eine Kombination aus beiden Enzymen darstellt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die saure Phosphatase ein Enzym der Klasse EC 3.1.3.2 ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die saure Phosphatase aus Pflanzen, oder aus Säugetiermilch oder aus einem Pilz, Hefe oder Bakterium stammt.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Phytase ausgewählt ist aus der Gruppe von 3-Phytase (EC 3.1.3.8), 4-Phytase (EC 3.1.3.26), 5-Phytase (EC 3.1.3.72), 6-Phytase (EC 3.1.3.26) oder Gemischen von zwei oder mehreren Phytasen.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei zusätzlich ein Phospholipid-spaltendes Enzym eingesetzt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Phospholipid-spaltende Enzym aus der Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase B, Phospholipase C, Phospholipase D oder Acyltransferase ausgewählt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, wobei die enzymatischen Umsetzungen mit einer Phytase bei einem pH Wert des wässrigen Teil der Öl-Wasser-Mischung durchgeführt werden, der kleiner oder gleich 8 ist, bzw., die enzymatischen Umsetzungen mit einer sauren Phosphatase bei einem pH Wert des wässrigen Teil der Öl-Wasser-Mischung durchgeführt werden, der kleiner oder gleich 7 ist.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Phosphatase und/oder das Phospholipid-spaltende Enzym in geträgerter Form vorliegen.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Sojaöl, Rapsöl, Canolaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Palmöl, Jatrophaöl, Leindotteröl oder Baumwollsaatöl als Öle eingesetzt werden.
  11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei anstelle des Pflanzenöls ein wässriger Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung von einem der Öle nach Anspruch 10 anfällt, eingesetzt wird.
  12. Verwendung eines der Enzyme, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, zur Erhöhung der Ölausbeute bei der Ausführung einer wässrigen Öl-Entschleimung.
  13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Entölung von Pflanzenölschleim.
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