EP2707692A1 - Fluidic cell guidance for flow cytometry - Google Patents

Fluidic cell guidance for flow cytometry

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Publication number
EP2707692A1
EP2707692A1 EP12748175.2A EP12748175A EP2707692A1 EP 2707692 A1 EP2707692 A1 EP 2707692A1 EP 12748175 A EP12748175 A EP 12748175A EP 2707692 A1 EP2707692 A1 EP 2707692A1
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EP
European Patent Office
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channel
flow
guide
cells
channel bottom
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12748175.2A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Oliver Hayden
Michael Johannes HELOU
Sandro Francesco Tedde
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens AG
Original Assignee
Siemens AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Siemens AG filed Critical Siemens AG
Publication of EP2707692A1 publication Critical patent/EP2707692A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects thereof, e.g. conductivity or capacity
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
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    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502776—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for focusing or laminating flows
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions

Definitions

  • the present invention relates to flow cytometry, in particular cell guidance.
  • optical measurement methods such as scattered light or fluorescence measurement and magnetic detection methods are known.
  • the magnesium tophorese known in which a magnetic force is applied to the selected cells in such a manner by means of magnetic guide strips is that they can be separated fol ⁇ quietly these guide strips or on a cell measuring device can be aligned. So far, an enrichment mar- kierter cells or particles on a substrate surface will be ⁇ acts by means of a magnetic gradient field can be aligned in turn means magnetophoresis of the cells or particles to be detected.
  • the inventive device for flow cytometry environmentally summarizes a flow passage, a magnetic unit which is disposed below the channel bottom of the flow channel and is configured in a magnetic gradient field testify ⁇ to it, which passes through the area enclosed by the flow channel volume, at least one cell measuring means and Minim ⁇ least a Guide threshold, which is arranged in the flow channel, that can be deflected by the flow channel flowable cells from the guide threshold to the cell measuring device.
  • This has the advantage that the cells to be detected can be ⁇ accumulates in a microfluidic due to the flow conditions and the magnetic gradient field in two dimensions.
  • the device further has the advantage of being able to dispense with a magnetophoretic enrichment and thus is structurally less costly than hitherto known enrichment routes.
  • the device comprises a flow channel, which is designed in terms of channel diameter and surface finish of Kanalin ⁇ nenwand so that a flow of a complex cell suspension in the flow channel with laminar flow profile can be generated.
  • the flow channel is a microfluidic channel. Preference is given to working with relatively large channel diameters, which ensure a laminar flow of a complex solution, without causing blockages, for example due to comes from deposits. Even an enrichment for cell ⁇ measuring device is ensured out by the configuration of the channel with the guide threshold to dispense, as is for example used in the art for the separation of labeled cells which allows a Y-shaped microfluidics.
  • the device comprises a magnetic unit, which is designed to generate a magnetic gradient field, by which magnetically marked cells can be enriched at the channel bottom.
  • the labeling of the cells is in particular a superparamagnetic label, for example by means of superparamagnetic beads.
  • the guide threshold has a height in about the cell diameter of the cell type to be detected.
  • the guide threshold in the device in particular ei ⁇ ne collection against the channel bottom or it is formed from a reduction against the channel bottom.
  • the leadership threshold forms, for example a narrowing of the Ka ⁇ Nals by protrudes as an elevation in the channel volume, or it forms a widening of the channel, by being formed in the channel base as the edge of a drop, so to speak, a groove.
  • the threshold height is in the case of the surveys against the channel ⁇ soil, the height of the survey, in the case of lowering against the channel bottom, it is at the threshold height, so to speak, the depth of the channel in the channel bottom.
  • the Rin ⁇ nenau connection to which the flow tapers, so to speak, the lead threshold forms.
  • the device comprises a multiplicity of guide sleepers. These are arranged in the flow passage that are anreicher ⁇ bar through the flow channel flowable cells from the guide thresholds in a partial volume of the flow channel over a partial area of the channel bottom.
  • the elevations of the guide thresholds are in particular designed so that the cells do not get stuck in the spaces between the guide thresholds and do not clog these gaps. Therefore, the structure height, ie the height of the thresholds relative to the channel bottom, preferably of the order of magnitude of the cell diameter, is preferably somewhat smaller than the cell diameter.
  • the arrangement of multiple guide sleepers must leave a sufficiently large portion of the channel floor free to allow the enriched cells to continue their trajectory through the flow channel. Either a sufficiently wide channel between the guide ⁇ thresholds is kept free or alternatively ensures a sufficient offset in finger structures.
  • the guide thresholds can be realized by means of photoresist strips, for example on a silicon wafer.
  • the photoresist thresholds in particular by means of photolithography generated.
  • the enrichment route is ⁇ leads with the guide thresholds as a one-piece plastic part, in particular by injection molding, whereby the Anreiche ⁇ approximately no stretch silicon substrate claimed. This has the advantage of reducing the silicon footprint and thus also the manufacturing and component costs of the flow cytometry device.
  • the guide thresholds of the device so extend through the channel bottom, that magnetically-labeled cells, which is a magneti ⁇ specific force in the direction of the channel bottom as well as a fluidic
  • the guide thresholds can only overcome a path over a predeterminable surface area of the channel bottom. That is, the guide ⁇ swell in particular on the channel walls on both sides of the Ka ⁇ nalêts start so that enriched at the channel bottom may not be able to flow along the channel walls ⁇ genetically labeled cells.
  • the guide sleepers extend over both longitudinal halves of the channel bottom in each case from one channel wall to approximately the middle of the channel, where a passage for cells enriched at the channel bottom is ensured in the flow direction.
  • the guide thresholds can in particular be arranged such that the partial surface over which the marked cells are enriched is a narrow rectangular partial surface which runs along the middle of the channel in the direction of flow.
  • the guide thresholds can also engage in one another in a finger-like manner, so that the partial area over which the cells are enriched represents a zigzag or undulating partial section.
  • the partial surface, to which the cells are enriched can also taper in the flow direction in the course of the flow channel.
  • the guide thresholds are made in one piece with the channel bottom.
  • the guide thresholds are designed with the channel bottom as an injection molded part. The embodiment as Injection molded part has the advantage that the enrichment path does not have to be additionally arranged on the substrate for the cell measurement, which in most cases is expediently a silicon wafer.
  • the so-called footprint that is to say the dimensions of the silicon substrate, for the component for flow cytometry can be considerably reduced, which also reduces the price of such a flow cytometry device.
  • the design of the fluidic enrichment section is much easier to manufacture, especially compared to lithographic methods such as those used in the production of magneto-tophoretic enrichment routes.
  • the guide thresholds are straight line-shaped elevations against the channel bottom. With the straight line shape, the cells enriched at the bottom are transported along the thresholds by the laminar flow, without disturbing turbulences in the flow at the channel bottom.
  • the guide thresholds may extend in an arc towards the channel center. When aligning the straight line-like thresholds, these are arranged in particular at an acute angle to the direction of flow. This means that the enriched cells to be transported along the guide sills are not retained by them, but that the transport of the cells in the direction of flow continues.
  • the device comprises the Anreiche ⁇ for crossing a combination of guide thresholds on a separate plastics channel section, which are designed, for example, with the channel bottom in one part and a small part of the accumulation path by means of photoresist thresholds on the silicon wafer on which the cell-measuring device is arranged.
  • the silicon footprint can be reduced.
  • the cells are enriched to ei ⁇ ner any length enrichment route through the geometry of the guide swelling and fluid mechanical conditions and as soon as they achieve the silicon wafer chen, are also there before the cell measuring device, preferably still a few guide thresholds upstream, in order to obtain the accumulation and alignment of the cells on passage to the new channel bottom substrate.
  • the hybrid form of the enrichment route thus forms an advantageous variant of reducing the silicon food print.
  • the structure of the fluidic enrichment section by means of the guide thresholds on a plastic substrate is then upstream of the silicon die, for example.
  • On the Si ⁇ lizium These are in particular the magnetoresistive components for the detection of magnetically marked single cells.
  • Such hybrid enrichment section can ⁇ example, also comprise a part, in which the guide thresholds have a nickel content or are realized as a nickel strip. With a nickel content in the guide thresholds, excess unbound magnetic markers can be retained by magnetic holding forces on the nickel strips or nickel guide sleepers and, so to speak, filtered out of the complex suspension.
  • nickel guide sleepers are structured by means of laser ablation.
  • the guide sleepers with a nickel content are in particular connected upstream of the enrichment path with the non-nickel-containing guide sleepers, ie are arranged in the direction of flow in the channel in front of the guide sleepers.
  • the nickel-containing guide and filter strips can also be arranged on the silicon substrate immediately before reaching the cell measuring device and perform there the double function of enrichment and guidance as well as the filtering of excess markers.
  • the dynamic accumulation and cell guide in the flow of advantage of the device is ensured, the Anreiche ⁇ tion and measurement can be made in a channel.
  • the device is not for sorting by Y-shaped separation of labeled cells from the surrounding dependent complex complex and also excess markers do not have to be separated from the suspension consuming, but can be retained by the guide thresholds.
  • the guide thresholds are arranged in their height and in their angle to the flow direction so that unbound magnetic markers, which are much smaller in their hydrodynamic diameter than marked cells, get caught on the guide sleepers and can not be overcome. Only available from the major units or particles such as labeled cells in the com plex ⁇ suspension are entrained in the laminar flow and thus transported to the sleepers along. That is to say, non-magnetic or non-magnetophoretic enrichment, as in this case by means of the guide sleepers, can exert a filter effect on excess and thus undesired markers in the measuring range of the cell measuring device.
  • the threshold height rises in the course of the flow channel in the flow direction.
  • the first threshold is still very low and can be overcome by most particles and cells.
  • the threshold height then increases and thus keeps back ever larger particles. Only the magnetically marked cells to be detected are not stopped by the thresholds, but are transported along the thresholds and concentrated in a partial volume of the channel. To this end, all thresholds insbeson ⁇ ular this partial volume down, which is particularly evident in the channel center on the canal floor.
  • the channel diameter or the channel height and width are in particular a few 100 ym, for example 200 ym.
  • the Barrier height depends on the cell to be detected and places de ⁇ ren cell diameter and in particular is a few microns, for example 10 ym or even up to 30 ym.
  • the flow channel can thus in particular lead a sufficiently large volume of a complex suspension without clogging.
  • a laminar flow of a cell sample is generated and the cells are enriched by means of guide thresholds in a predeterminable partial volume of the flow channel.
  • the cells to be detected are magnetically marked and dynamically enriched in the channel bottom in a magnetic gradient field.
  • This method has the advantage that flow mechanical and magnetic forces cooperate in such a way that magnetically labeled cells can be specifically enriched in a predeterminable volume without having to separate them from the cell suspension.
  • the partial volume runs in the flow direction along the channel bottom, so that the cells are guided individually along an axis via a cell measuring device.
  • a blood sample is transported in a laminar manner through the microfluidics.
  • the cells close to the channel bottom are partially aligned by the structuring of the substrate, ie the guide sleepers.
  • gradient beispielswei ⁇ se superparamagnetic analytes are used to the structured channel floor and detected there Magneto.
  • the inventive method for magnetic throughput flow cytometry therefore act on the magnetically-labeled cells or on magnetic beads, or generally to magnetic particles to be detected Rende three forces: the magnetic force of the magnetic gradient field which is generated by the magneti ⁇ specific unit under the floor channel , Magnetic field strengths of this gradient field are, for example between 1 and 300 mT. This magnetic force so pulls the Zel ⁇ len vertically toward the channel bottom surface. Furthermore affects the shear force of the flowing cell sample to the individual ⁇ cells. The flow is in particular a laminar flow. This force thus acts in the direction of the cell sample flow through the channel.
  • a third force exert the guide thresholds on the channel bottom, which represent a flow-mechanical obstacle for the magnetically marked cells enriched on the bottom. This will cause the cells to move along the guide thresholds towards the center of the channel to move forward in the direction of flow, or generally move toward a portion of the channel, depending on the orientation of the guide thresholds.
  • the magnetic marking is preferably done by superparamagnetic particles.
  • the microwave cytometry and the flow velocity the microwavenei ⁇ genschaft as well as the magnetic field strength to play a role.
  • the flow rate for example, is particularly adapted to the cell sample and above all the channel diameter in order to ensure a laminar flow.
  • the surface properties of the channel inner walls and the channel bottom can be optimized.
  • the field strength of the magnetic gradient field further influence can be exerted on the cells to be deflected and enriched.
  • To be detected cells also possess mechanical properties which can be influenced by the sizes of the flow rate, surface quality and magnetic field strength ⁇ .
  • guide sleepers are made in one piece with the channel bottom, in particular as an injection molded part.
  • the inventive device has the advantage of a solution for flow cytometry without magnetophoresisgorgebie ⁇ th.
  • a structured substrate are produced, which leads by the Füh ⁇ tion thresholds, so the structure of the substrate bottom, the magnetically labeled cells according to and enriches. Accordingly, no lithographic expenses as in the magnetophoretic enrichment are necessary.
  • the magnetic guide lines of a magnetophoresis enrichment route are replaced by a three-dimensional structural ⁇ structure of the substrate soil.
  • the preferred herringbone form is adopted in particular.
  • the patterning comprises linear elevations which are referred to as Füh ⁇ approximately swell.
  • the thresholds typically measure heights between 0.1 and 20 ym against the channel bottom. In their width, the guide thresholds measure, for example, between 1 and 100 ym.
  • the length of the guide thresholds is selected in dependence on the channel width so that they terminate at the edge of the channel with the channel ⁇ wall and approximately up to the middle of the channel chen pure. Either they only just reach the middle, so that between the guide sills, which protrude from both sides in the direction of the middle of the channel, a passage remains or alternatively protrude from their length beyond the middle of the channel and are then finger-shaped arranged interlocking.
  • the angle to the flow direction is, for example we ⁇ niger than 45 °, in particular less than 20 °.
  • a blood sample is transported in a laminar manner through the microfluidics.
  • Cells within said blood sample are partially aligned close to the sub ⁇ stratober Design through the substrate structure.
  • Magnetically labeled analytes in particular superparamagnetically labeled analytes, are attracted to the substrate surface in the gradient field, ie to the channel bottom and are guided close to the substrate, ie at the channel bottom, where it can influence the substrate structuring.
  • the thus enriched and aligned cells can then be magnetoresistively detected.
  • FIG. 2 shows a longitudinal section or a side view of the channel bottom with underlying permanent magnets
  • Figure 3 shows a cross section and a front view of the
  • Figure 4 shows a plan view of the arrangement with the
  • Figure 5 shows a further plan view of the arrangement with the fishbone-like arranged guide grooves or sleepers and
  • FIG. 6 shows an enlarged detail of FIG. 4.
  • FIG. 7 shows a hybrid cell enrichment path.
  • Kanalsbo ⁇ dens 13 which is illustrated as a flat substrate.
  • a further flat cuboid 20 is shown, which represents the magnetic unit 20.
  • the magnetic unit 20 is in particular a permanent magnet.
  • the magnetic unit 20 may also extend over a larger area than that of the channel base 13, in order to ensure a homogeneous magnetic field in the area of the flow channel ⁇ 100th In particular, generates the magnetic unit 20 in the flow channel 100 ⁇ a gradient field in which magnetic particles such as the magnetically-labeled cells 1 or unbound magnetic markers in the minus z-direction toward the channel bottom 13 toward be enriched.
  • x-, y- and z-direction are indicated in the figures by small coordinate systems at the edge.
  • a multiplicity of guide sleepers 12, which are shown as narrow cuboids, are arranged on the channel bottom substrate 13. These surveys 12 set in particular on Edge of the channel bottom or on the channel walls 14 at.
  • the channel walls 14 are not shown in the illustration of Figure 1.
  • the guide thresholds 12 protrude into the channel center, where they do not collide with the opposite guide thresholds, but either grant a straight passage in the middle or interlock in such a finger-shaped manner that a zigzag or serpentine line can run through the guide sleepers.
  • Possible flow paths of magnetically marked cells 1 are indicated by arrows 41 in FIG.
  • the magnetically labeled cells 1 are shown as circles or ovals.
  • the engaging forces the cells 10 x, y, z are angedeu ⁇ tet by double arrows. Again by wide double arrows, the flow ⁇ direction 40 is displayed, which runs in the figure 1 from left to right.
  • the magnetically marked cells 1 are thus introduced at one end within a complex cell suspension and flow through in the flow direction 40, the enrichment path with the guide ⁇ thresholds 12.
  • the magnetic force 10 z the direction channel floor 13
  • the shear force 10 of the liquid in the laminar flow which points in the flow direction 40 and through the guide thresholds 12, which constitute a barrier, which in turn exert a mechanical force 10 x in the xy plane of Figure 1 on the cells 1, the cells 1 along the Guide sleepers pushed in the direction of the
  • the cell measuring device 30 which in particular comprises at least one magnetoresistive element.
  • FIG. 2 shows a longitudinal section or a side view of a device similar to that in FIG. 1.
  • two flat rectangles are arranged one above the other, which represent the substrate or the channel bottom 13 and spaced below it the magnetic unit 20.
  • the permanent magnet can also be arranged directly below the channel bottom 13 without spacing.
  • Ober ⁇ half of the channel bottom 13 is again with a double arrow the Flow direction 40, in the figure 2 from left to right, and a cross-section through three ofêtsschwel ⁇ len 12 and by the cell measuring device 30 at the right end of Figure 2 and thus at the end of the enrichment route.
  • the magnetically marked cells 1 experience through the permanent magnet 20 a magnetic force 10 perpendicular to Kanalbo ⁇ the 13 out.
  • the height of the guide sleepers 12 is particularly matched to the extent, ie the hydrodynamic diameter of the magnetically marked cells 1, and in particular is slightly less than the cell diameter. However, if the height is too low, the magnetically-labeled cells would not experience a guiding force 10 through the thresholds 12, but would be torn away in the laminar flow. If the barriers 12 are too high, the magnetically marked cells 1 would no longer experience shearing force 10 y through the flow and would remain behind the sleepers 12.
  • FIG. 3 shows a cross-section or the front view of the flow channel 100.
  • the magnetic unit 20 is again shown as narrow rectangles and the substrate 13 for the channel bottom is shown spaced above it.
  • the channel wall 14 is arranged, which encloses a cuboid channel volume ,
  • the partial volume 110, in which the magnetically marked cells 1 are enriched, is shown in dashed lines in the flow channel 100.
  • FIG. 4 now shows a plan view of the channel bottom 13, on which the flow direction from left to right in FIG. 4 is again illustrated with double arrows 40.
  • the side of the channel bottom 13 are shown hatched in section, the channel walls ⁇ fourteenth Within the channel walls 14 each has a dashed line, which marks the end of the magne ⁇ tables area. That is, the distance between the gestri ⁇ Chelten lines 200, the width of the translated by the magnetic field transit area displays. This is especially wider than the flow channel 100. This ensures that the Mag ⁇ netfeld is as homogeneous as possible in the channel volume.
  • the magnetic field penetrated region 200 is by the magnetic Unit 20 generates, which is below the channel bottom 13 angeord ⁇ net, as shown in Figures 1 to 3 is visible.
  • guide sleepers 12 are arranged at an angle ⁇ to the channel wall 14, so that the guide thresholds 12 point from the channel wall 14 in the direction of the channel center in the flow direction 40.
  • the magnetically marked cells 1, as indicated by the flow paths 41 can be deflected at the guide thresholds 12 in the direction of the portion 130 which extends to the cell measuring device 30 or beyond.
  • FIG. 5 shows a possible arrangement of ceremoniessschwel ⁇ len 12, which extend at a very acute angle ⁇ to each other. Again, the channel width 100 is displayed.
  • FIG. 6 shows an enlarged detail from FIG. 5 with the guide sleepers 12 tapering at an acute angle ⁇ , which have a threshold thickness or width d and a spacing between the thresholds D.
  • the angle ⁇ , in which the thresholds 12 are arranged relative to the flow direction 40 can for example be measured relative to the channel center line as shown in FIG. 6 or relative to the channel wall 14.
  • magnetically marked cells 1 are shown as small circles in FIG. It is made clear that a sufficiently wide flow path between the sleepers 12 is ensured for the cells 1 so that they do not clog the guide-threshold gaps.
  • Figure 7 finally shows a possible Ausgestal ⁇ processing of the apparatus with a hybrid enhancement route.
  • the substrate 13 In the left portion of the figure 7 is the approximately swell enhancement ⁇ distance on a plastic substrate 13 having plastic guidance 12, which effect with the described strö ⁇ mung mechanical enrichment of the cells.
  • the substrate 13 In the right-hand area of the drawing, the substrate 13 is followed by the silicon chip 15, on which the cell measuring device 30 is arranged.
  • This shows yet another guide ge ⁇ thresholds have 125 which in particular the enrichment route to the subregion 130 continue.
  • the flow direction 40 is again by a double arrow from left to right in the drawing Darge ⁇ provides.
  • the magnetically marked cells 1 are shown as ovals and their flow paths are marked with arrows 41. In the example shown in FIG.
  • the silicon chip 15 still has a small section of enrichment path with guide sleepers 125.
  • These may for example also have a nickel content in the material of the guide thresholds 125 and thus still unbound
  • FIG. 7 again shows by double arrows the deflecting force 10x, which guides the cells 1 along the guide sleepers 12 to the center and also the shearing force of the fluidic flow 10y, which points in the flow direction 40.

Abstract

The invention relates to a device and a method for fluidic cell guidance for flow cytometry or analyte enrichment. This allows magnetically marked analytes, in particular cells (1), to be dynamically enriched and individually detected in the flow from a sample, in particular magnetoresistively. For cell guidance, guiding ridges (12) are arranged in a flow channel (100), and so, in addition to a magnetic enrichment force (10z) and the shearing force of the flow (10y), a deflecting force (10x) caused by the fluidic obstacles (12) also acts on the cells (1) to be detected.

Description

Beschreibung description
Strömungsmechanische Zellführung für Durchflusszytometrie Die vorliegende Erfindung betrifft die Durchflusszytometrie, insbesondere die Zellführung. Flow Mechanical Cell Guidance for Flow Cytometry The present invention relates to flow cytometry, in particular cell guidance.
Im Bereich der Zellmessung und Zelldetektion sind optischen Messverfahren, wie Streulicht- oder Fluoreszenzmessung sowie magnetische Detektionsverfahren bekannt. In the field of cell measurement and cell detection, optical measurement methods, such as scattered light or fluorescence measurement and magnetic detection methods are known.
Insbesondere bei magnetischen Detektionsverfahren ist zur Zellsortierung, Zellführung oder Zellanreicherung die Magne- tophorese bekannt, bei der mittels magnetischer Führungs- streifen eine magnetische Kraft auf die markierten Zellen derart ausgeübt wird, dass sie diesen Führungsstreifen fol¬ gend abgetrennt werden können oder auch auf eine Zellmesseinrichtung hin ausgerichtet werden können. Bisher wird mit Hilfe eines magnetischen Gradientenfeldes eine Anreicherung mar- kierter Zellen oder Partikel auf einer Substratoberfläche be¬ wirkt, auf der wiederum mittels Magnetophorese die Zellen oder zu detektierenden Partikel ausgerichtet werden. In particular, in the magnetic detection method is suitable for cell sorting, cell guidance or cell enrichment, the magnesium tophorese known in which a magnetic force is applied to the selected cells in such a manner by means of magnetic guide strips is that they can be separated fol ¬ quietly these guide strips or on a cell measuring device can be aligned. So far, an enrichment mar- kierter cells or particles on a substrate surface will be ¬ acts by means of a magnetic gradient field can be aligned in turn means magnetophoresis of the cells or particles to be detected.
Zur Herstellung einer derartigen Magnetophorese-Anreiche- rungs- und Ausrichtungsstrecke ist es bekannt, auf das Sub¬ strat z.B. durch Lithographie magnetische Streifen aufzubrin¬ gen. Derartige Herstellungsverfahren sind jedoch sehr aufwendig und daher von Nachteil für die Herstellung eines Bau¬ teils, das von seiner Verwendung her auf hohe Stückzahlen ausgerichtet ist. Einen weiteren Nachteil der magnetophoreti- schen Anreicherungsstrecke birgt der dadurch vergrößerte Si- lizium-Footprint . Für die Integration von Anreicherungsstre¬ cke und Zellmesseinrichtung auf einen Siliziumchip übersteigt dessen Größe vernünftige Kosten für die Anwendung derartiger Bauteile. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine vereinfacht herstellbare Vorrichtung zur Durchflusszytometrie zu schaf¬ fen . Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Ein Verfahren zur Zellführung wird in Patentanspruch 11 angegeben. Ein Herstellungsverfahren für eine erfindungsgemäße Vorrichtung wird in Patentanspruch 13 angege¬ ben. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegens- tand der Unteransprüche. Rungs- for producing such a magnetophoresis-enrichment and orientation path, it is known, however, to the sub ¬ strat example by lithography magnetic strip aufzubrin ¬ gene. Such preparation processes are very complex and therefore disadvantageous for the production of a construction ¬ partly that of Its use is geared towards high volumes. Another disadvantage of the magnetophoretic enrichment path is the increased silicon footprint. For the integration of enrichment Stre ¬ cke and cell measuring device on a silicon chip whose size exceeds reasonable costs for the application of such components. It is an object of the present invention, a simplified manufacturable device for flow cytometry to sheep ¬ fen. The object is achieved by a device according to claim 1. A method for cell guidance is specified in claim 11. A manufacturing method for a device according to the invention is angege ¬ ben in claim 13. Advantageous embodiments of the invention are subject matter of the subclaims.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchflusszytometrie um- fasst einen Durchflusskanal, eine magnetische Einheit, welche unterhalb des Kanalbodens des Durchflusskanals angeordnet ist und ausgestaltet ist ein magnetisches Gradientenfeld zu er¬ zeugen, welches das vom Durchflusskanal umschlossene Volumen durchsetzt, wenigstens eine Zellmesseinrichtung sowie mindes¬ tens eine Führungsschwelle, welche derart im Durchflusskanal angeordnet ist, dass durch den Durchflusskanal strömbare Zel- len von der Führungsschwelle zur Zellmesseinrichtung hinlenkbar sind. Dies hat den Vorteil, dass die zu detektierenden Zellen in einer Mikrofluidik durch die Strömungsbedingungen und das magnetische Gradientenfeld in zwei Dimensionen ange¬ reichert werden können. Die Vorrichtung hat weiter den Vor- teil auf eine magnetophoretische Anreicherung verzichten zu können und somit baulich wesentlich weniger aufwendig zu sein als bisher bekannte Anreicherungsstrecken. The inventive device for flow cytometry environmentally summarizes a flow passage, a magnetic unit which is disposed below the channel bottom of the flow channel and is configured in a magnetic gradient field testify ¬ to it, which passes through the area enclosed by the flow channel volume, at least one cell measuring means and Minim ¬ least a Guide threshold, which is arranged in the flow channel, that can be deflected by the flow channel flowable cells from the guide threshold to the cell measuring device. This has the advantage that the cells to be detected can be ¬ accumulates in a microfluidic due to the flow conditions and the magnetic gradient field in two dimensions. The device further has the advantage of being able to dispense with a magnetophoretic enrichment and thus is structurally less costly than hitherto known enrichment routes.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst die Vorrichtung einen Durchflusskanal, welcher hinsichtlich Kanaldurchmesser und Oberflächenbeschaffenheit der Kanalin¬ nenwand so ausgestaltet ist, dass ein Fluss einer komplexen Zellsuspension in dem Durchflusskanal mit laminarem Strömungsprofil erzeugbar ist. Insbesondere handelt es sich bei dem Durchflusskanal um einen Mikrofluidikkanal . Vorzugsweise wird mit relativ großen Kanaldurchmessern gearbeitet, welche einen laminaren Durchfluss einer komplexen Lösung gewährleisten, ohne dass es zu Verstopfungen, beispielsweise aufgrund von Ablagerungen kommt. Auch ist durch die Ausgestaltung des Kanals mit der Führungsschwelle eine Anreicherung zur Zell¬ messeinrichtung hin gewährleistet, die erlaubt auf eine Y- förmige Mikrofluidik zu verzichten, wie sie beispielsweise im Stand der Technik zur Separation markierter Zellen verwendet wird . In an advantageous embodiment of the invention, the device comprises a flow channel, which is designed in terms of channel diameter and surface finish of Kanalin ¬ nenwand so that a flow of a complex cell suspension in the flow channel with laminar flow profile can be generated. In particular, the flow channel is a microfluidic channel. Preference is given to working with relatively large channel diameters, which ensure a laminar flow of a complex solution, without causing blockages, for example due to comes from deposits. Even an enrichment for cell ¬ measuring device is ensured out by the configuration of the channel with the guide threshold to dispense, as is for example used in the art for the separation of labeled cells which allows a Y-shaped microfluidics.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine magnetische Einheit, welche aus- gestaltet ist, ein magnetisches Gradientenfeld zu erzeugen, durch welches magnetisch markierte Zellen am Kanalboden anreicherbar sind. Bei der Markierung der Zellen handelt es sich insbesondere um eine superparamagnetische Markierung, beispielsweise mittels superparamagnetischer Beads . Dies hat den Vorteil, dass alle magnetisch markierten Zellen am Kanalboden anreicherbar sind, wo sie in der laminaren Strömung an die mindestens eine Führungsschwelle herangeführt werden, so dass sie durch diese abgelenkt werden können. Dabei weist die Führungsschwelle eine Höhe in etwa des Zelldurchmessers der zu detektierenden Zellsorte auf. In a further advantageous embodiment of the invention, the device comprises a magnetic unit, which is designed to generate a magnetic gradient field, by which magnetically marked cells can be enriched at the channel bottom. The labeling of the cells is in particular a superparamagnetic label, for example by means of superparamagnetic beads. This has the advantage that all magnetically marked cells are enriched at the channel bottom, where they are brought in the laminar flow to the at least one guide threshold, so that they can be deflected by this. In this case, the guide threshold has a height in about the cell diameter of the cell type to be detected.
Die Führungsschwelle in der Vorrichtung, ist insbesondere ei¬ ne Erhebung gegen den Kanalboden oder sie ist aus einer Absenkung gegen den Kanalboden gebildet. D.h. also die Füh- rungsschwelle bildet beispielsweise eine Verengung des Ka¬ nals, indem sie als Erhebung in das Kanalvolumen hineinragt, oder sie bildet eine Verbreiterung des Kanals, indem sie als Rand einer Absenkung, sozusagen einer Rinne, im Kanalboden gebildet ist. Durch diese Führungsschwellen-Ausführungsformen können unterschiedliche strömungsmechanische Beeinflussungen der Zellprobe vorgenommen werden. The guide threshold in the device, in particular ei ¬ ne collection against the channel bottom or it is formed from a reduction against the channel bottom. So for the leadership threshold forms, for example a narrowing of the Ka ¬ Nals by protrudes as an elevation in the channel volume, or it forms a widening of the channel, by being formed in the channel base as the edge of a drop, so to speak, a groove. Through these guide threshold embodiments, different fluid mechanical influences of the cell sample can be made.
Die Schwellenhöhe ist im Fall der Erhebungen gegen den Kanal¬ boden die Höhe der Erhebung, im Fall der Absenkung gegen den Kanalboden, handelt es sich bei der Schwellenhöhe sozusagen um die Tiefe der Rinne im Kanalboden. Dabei bildet die Rin¬ nenaußenwand, auf die die Strömung zuläuft, sozusagen die Führungsschwelle . Insbesondere ist von der Vorrichtung eine Vielzahl von Führungsschwellen umfasst. Diese sind derart im Durchflusskanal angeordnet, dass durch den Durchflusskanal strömbare Zellen von den Führungsschwellen in einem Teilvolumen des Durchflusskanals über einer Teilfläche des Kanalbodens anreicher¬ bar sind. Dies hat den Vorteil, dass es sich bei der Vorrich¬ tung nicht um eine Y-förmige Mikrofluidik handelt, bei der markierte Zellen aussortiert werden, sondern es ist eine An- reicherung der zu detektierenden Zellen innerhalb des Probenvolumens möglich. Zweckdienlicherweise ist das Teilvolumen bzw. die Teilfläche des Kanalbodens in der Mitte des Durch¬ flusskanals, wohin die Zellen von beiden Seiten aus angerei¬ chert werden können. Innerhalb der Teilfläche des Kanalbodens ist dann auch insbesondere die Zellmesseinrichtung angeord¬ net. Die Zellmesseinrichtung ist beispielsweise am oder im Kanalboden angeordnet. Insbesondere erstreckt sich der Erfas¬ sungsbereich der Zellmesseinrichtung über das Teilvolumen oberhalb der Zellmesseinrichtung. The threshold height is in the case of the surveys against the channel ¬ soil, the height of the survey, in the case of lowering against the channel bottom, it is at the threshold height, so to speak, the depth of the channel in the channel bottom. The Rin ¬ nenaußenwand to which the flow tapers, so to speak, the lead threshold forms. In particular, the device comprises a multiplicity of guide sleepers. These are arranged in the flow passage that are anreicher ¬ bar through the flow channel flowable cells from the guide thresholds in a partial volume of the flow channel over a partial area of the channel bottom. This has the advantage that it is not in the Vorrich ¬ tung to a Y-shaped microfluidic are sorted out in the labeled cells, but it is an arrival enrichment of the cells to be detected are possible within the sample volume. Conveniently, the partial volume and the partial surface of the channel bottom in the middle of the river channel through ¬ where the cells can be from both sides angerei ¬ chert. Within the sub-area of the channel bottom cell measuring device is then particularly angeord ¬ net. The cell measuring device is arranged, for example, on or in the channel bottom. In particular, the Erfas ¬ sungsbereich the cell measuring device extending over the partial volume above the cell measuring means.
Die Erhebungen der Führungsschwellen sind insbesondere so ausgestaltet, dass die Zellen in den Zwischenräumen zwischen den Führungsschwellen nicht steckenbleiben und diese Zwischenräume nicht verstopfen. Daher ist die Strukturhöhe, also die Höhe der Schwellen relativ zum Kanalboden, vorzugsweise in der Größenordnung des Zelldurchmessers, vorzugsweise etwas geringer als der Zelldurchmesser. Die Anordnung von mehreren Führungsschwellen muss einen ausreichend großen Teilbereich des Kanalbodens freilassen auf dem die angereicherten Zellen ihre Bahn durch den Durchflusskanal fortsetzen können. Entweder ist ein ausreichend breiter Kanal zwischen den Führungs¬ schwellen freigehalten oder alternativ ein ausreichender Versatz bei Fingerstrukturen gewährleistet. In einer beispielhaften Ausführungsform der Vorrichtung können die Führungsschwellen mittels Fotolackstreifen beispielsweise auf einem Siliziumwafer realisiert sein. Dazu werden die Fotolackschwellen insbesondere mittels Fotolithographie erzeugt. Vorteilhafterweise wird die Anreicherungsstrecke mit den Führungsschwellen als einteiliges Kunststoffteil ausge¬ führt, insbesondere mittels Spritzguss, womit die Anreiche¬ rungsstrecke kein Siliziumsubstrat beansprucht. Dies hat den Vorteil den Silizium-Footprint zu reduzieren und damit auch die Herstellungs- und Bauteilkosten der Durchflusszytometrie- Vorrichtung . The elevations of the guide thresholds are in particular designed so that the cells do not get stuck in the spaces between the guide thresholds and do not clog these gaps. Therefore, the structure height, ie the height of the thresholds relative to the channel bottom, preferably of the order of magnitude of the cell diameter, is preferably somewhat smaller than the cell diameter. The arrangement of multiple guide sleepers must leave a sufficiently large portion of the channel floor free to allow the enriched cells to continue their trajectory through the flow channel. Either a sufficiently wide channel between the guide ¬ thresholds is kept free or alternatively ensures a sufficient offset in finger structures. In an exemplary embodiment of the device, the guide thresholds can be realized by means of photoresist strips, for example on a silicon wafer. For this purpose, the photoresist thresholds in particular by means of photolithography generated. Advantageously, the enrichment route is ¬ leads with the guide thresholds as a one-piece plastic part, in particular by injection molding, whereby the Anreiche ¬ approximately no stretch silicon substrate claimed. This has the advantage of reducing the silicon footprint and thus also the manufacturing and component costs of the flow cytometry device.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erstrecken sich die Führungsschwellen der Vorrichtung so über den Kanalboden, dass magnetisch markierte Zellen, welche eine magneti¬ sche Kraft in Richtung Kanalboden sowie eine fluidische In an advantageous embodiment of the invention, the guide thresholds of the device so extend through the channel bottom, that magnetically-labeled cells, which is a magneti ¬ specific force in the direction of the channel bottom as well as a fluidic
Scherkraft in Durchflussrichtung erfahren, die Führungsschwellen nur auf einem Weg über eine vorgebbare Teilfläche des Kanalbodens überwinden können. D.h., dass die Führungs¬ schwellen insbesondere an den Kanalwänden beidseitig des Ka¬ nalbodens so ansetzen, dass am Kanalboden angereicherte mag¬ netisch markierte Zellen nicht an den Kanalwänden entlang fließen können. Insbesondere erstrecken sich die Führungs- schwellen über beide Längshälften des Kanalbodens jeweils von einer Kanalwand bis in etwa zur Kanalmitte hin, wo ein Durch- lass für am Kanalboden angereicherte Zellen in Strömungsrichtung gewährleistet ist. Dabei können die Führungsschwellen insbesondere so angeordnet sein, dass die Teilfläche über der die markierten Zellen angereichert werden, eine schmale rechteckige Teilfläche ist, die entlang der Kanalmitte in Durchflussrichtung verläuft. Alternativ können die Führungsschwellen auch fingerartig ineinander greifen, so dass die Teilfläche, über der die Zellen angereichert werden, eine Zickzack- bzw. wellenförmig verlaufende Teilstrecke darstellt. Insbesondere kann sich die Teilfläche, auf die die Zellen hin angereichert werden, auch im Verlauf des Durchflusskanals in Durchflussrichtung verjüngen. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die Führungsschwellen mit dem Kanalboden einteilig ausgeführt. Insbesondere sind die Führungsschwellen mit dem Kanalboden als ein Spritzgussteil ausgeführt. Die Ausführungsform als Spritzgussteil hat den Vorteil, dass die Anreicherungsstrecke nicht zusätzlich auf dem Substrat für die Zellmessung angeordnet sein muss, welches in den meisten Fällen zweckdienlicherweise ein Siliziumwafer ist. Dadurch kann der sogenann- te Footprint, also die Maße des Siliziumsubstrats, für das Bauteil zur Durchflusszytometrie erheblich reduziert werden, was auch den Preis für eine derartige Durchflusszytometrie- Vorrichtung senkt. Außerdem ist die Ausgestaltung der strömungsmechanischen Anreicherungsstrecke wesentlich einfacher in der Herstellung, vor allem gegenüber lithographischen Verfahren wie sie beispielsweise bei der Herstellung von magne- tophoretischen Anreicherungsstrecken verwendet werden. Experience shear force in the flow direction, the guide thresholds can only overcome a path over a predeterminable surface area of the channel bottom. That is, the guide ¬ swell in particular on the channel walls on both sides of the Ka ¬ nalbodens start so that enriched at the channel bottom may not be able to flow along the channel walls ¬ genetically labeled cells. In particular, the guide sleepers extend over both longitudinal halves of the channel bottom in each case from one channel wall to approximately the middle of the channel, where a passage for cells enriched at the channel bottom is ensured in the flow direction. In this case, the guide thresholds can in particular be arranged such that the partial surface over which the marked cells are enriched is a narrow rectangular partial surface which runs along the middle of the channel in the direction of flow. Alternatively, the guide thresholds can also engage in one another in a finger-like manner, so that the partial area over which the cells are enriched represents a zigzag or undulating partial section. In particular, the partial surface, to which the cells are enriched, can also taper in the flow direction in the course of the flow channel. In an advantageous embodiment of the invention, the guide thresholds are made in one piece with the channel bottom. In particular, the guide thresholds are designed with the channel bottom as an injection molded part. The embodiment as Injection molded part has the advantage that the enrichment path does not have to be additionally arranged on the substrate for the cell measurement, which in most cases is expediently a silicon wafer. As a result, the so-called footprint, that is to say the dimensions of the silicon substrate, for the component for flow cytometry can be considerably reduced, which also reduces the price of such a flow cytometry device. In addition, the design of the fluidic enrichment section is much easier to manufacture, especially compared to lithographic methods such as those used in the production of magneto-tophoretic enrichment routes.
Insbesondere sind die Führungsschwellen gerade linienförmige Erhebungen gegen den Kanalboden. Mit der geraden Linienform werden die am Boden angereicherten Zellen durch den laminaren Fluss an den Schwellen entlang transportiert, ohne dass es zu störenden Turbulenzen im Fluss am Kanalboden kommt. Alternativ können die Führungsschwellen in einem Bogen zur Kanalmit- te hin verlaufen. Bei der Ausrichtung der geraden linienför- migen Schwellen werden diese insbesondere in einem spitzen Winkel zur Durchflussrichtung angeordnet. D.h., dass die an den Führungsschwellen entlang zu transportierenden angereicherten Zellen durch diese nicht zurückgehalten werden, son- dern dass der Transport der Zellen in Durchflussrichtung weiter verläuft. In particular, the guide thresholds are straight line-shaped elevations against the channel bottom. With the straight line shape, the cells enriched at the bottom are transported along the thresholds by the laminar flow, without disturbing turbulences in the flow at the channel bottom. Alternatively, the guide thresholds may extend in an arc towards the channel center. When aligning the straight line-like thresholds, these are arranged in particular at an acute angle to the direction of flow. This means that the enriched cells to be transported along the guide sills are not retained by them, but that the transport of the cells in the direction of flow continues.
Vorteilhafterweise umfasst die Vorrichtung mit der Anreiche¬ rungsstrecke eine Kombination aus Führungsschwellen auf einem separaten Kunststoffkanalabschnitt , die beispielsweise mit dem Kanalboden einteilig ausgeführt sind und einen kleinen Teil der Anreicherungsstrecke mittels Fotolackschwellen auf dem Siliziumwafer, auf dem auch die Zellmesseinrichtung angeordnet ist. Mittels einer derartigen Kombination kann der Si- lizium-Footprint reduziert werden. Die Zellen werden auf ei¬ ner beliebig langen Anreicherungsstrecke durch die Geometrie der Führungsschwellen und die strömungsmechanischen Bedingungen angereichert und sobald diese den Siliziumwafer errei- chen, sind auch dort vor der Zellmesseinrichtung, vorzugsweise noch ein paar wenige Führungsschwellen vorgeschaltet, um die Anreicherung und Ausrichtung der Zellen bei Übertritt auf das neue Kanalbodensubstrat zu erhalten. Advantageously, the device comprises the Anreiche ¬ for crossing a combination of guide thresholds on a separate plastics channel section, which are designed, for example, with the channel bottom in one part and a small part of the accumulation path by means of photoresist thresholds on the silicon wafer on which the cell-measuring device is arranged. By means of such a combination, the silicon footprint can be reduced. The cells are enriched to ei ¬ ner any length enrichment route through the geometry of the guide swelling and fluid mechanical conditions and as soon as they achieve the silicon wafer chen, are also there before the cell measuring device, preferably still a few guide thresholds upstream, in order to obtain the accumulation and alignment of the cells on passage to the new channel bottom substrate.
Die hybride Form der Anreicherungsstrecke bildet also eine vorteilhafte Variante den Silizium-Food-Print zu reduzieren. Der Aufbau der strömungsmechanischen Anreicherungsstrecke mittels der Führungsschwellen auf einem Plastiksubstrat ist dann beispielsweise dem Silizium Die vorgelagert. Auf dem Si¬ lizium Die befinden sich insbesondere die magnetoresistiven Bauteile zur Detektion der magnetisch markierten Einzelzellen . The hybrid form of the enrichment route thus forms an advantageous variant of reducing the silicon food print. The structure of the fluidic enrichment section by means of the guide thresholds on a plastic substrate is then upstream of the silicon die, for example. On the Si ¬ lizium These are in particular the magnetoresistive components for the detection of magnetically marked single cells.
Eine derartige hybride Anreicherungsstrecke kann beispiels¬ weise auch einen Teil umfassen, in dem die Führungsschwellen einen Nickelanteil aufweisen oder als Nickelstreifen realisiert sind. Mit einem Nickelanteil in den Führungsschwellen können überschüssige ungebundene magnetische Marker durch magnetische Haltekräfte an den Nickelstreifen oder Nickelführungsschwellen zurückgehalten werden und sozusagen aus der komplexen Suspension herausgefiltert werden. Insbesondere werden Nickelführungsschwellen mittels Laserablation strukturiert. Die Führungsschwellen mit einem Nickelanteil werden insbesondere der Anreicherungsstrecke mit dem nicht nickel- haltigen Führungsschwellen vorgeschaltet, d.h. sind in Durchflussrichtung im Kanal vor den Führungsschwellen angeordnet. Alternativ können die nickelhaltigen Führungs- und Filterstreifen aber auch auf dem Siliziumsubstrat unmittelbar vor Erreichen der Zellmesseinrichtung angeordnet sein und dort die doppelte Funktion der Anreicherung und Führung als auch der Filterung von überschüssigen Markern vollbringen. Such hybrid enrichment section can ¬ example, also comprise a part, in which the guide thresholds have a nickel content or are realized as a nickel strip. With a nickel content in the guide thresholds, excess unbound magnetic markers can be retained by magnetic holding forces on the nickel strips or nickel guide sleepers and, so to speak, filtered out of the complex suspension. In particular, nickel guide sleepers are structured by means of laser ablation. The guide sleepers with a nickel content are in particular connected upstream of the enrichment path with the non-nickel-containing guide sleepers, ie are arranged in the direction of flow in the channel in front of the guide sleepers. Alternatively, however, the nickel-containing guide and filter strips can also be arranged on the silicon substrate immediately before reaching the cell measuring device and perform there the double function of enrichment and guidance as well as the filtering of excess markers.
Durch die dynamische Anreicherung und Zellführung im Fluss ist der Vorteil der Vorrichtung gewährleistet, das Anreiche¬ rung und Messung in einem Kanal vorgenommen werden kann. Die Vorrichtung ist nicht auf eine Aussortierung mittels Y- förmiger Abtrennung von markierten Zellen von der umgebenden komplexen Suspension angewiesen und auch überschüssige Marker müssen nicht aufwendig aus der Suspension abgetrennt werden, sondern können durch die Führungsschwellen zurückgehalten werden. Insbesondere sind die Führungsschwellen in ihrer Höhe und in ihrem Winkel zur Durchflussrichtung so angeordnet, dass ungebundene magnetische Marker, welche sehr viel kleiner in ihrem hydrodynamischen Durchmesser sind als markierte Zellen, an den Führungsschwellen hängen bleiben und zurückgehalten werden, d.h. diese nicht überwinden können. Nur die grö- ßeren Anteile oder Partikel, wie markierte Zellen in der kom¬ plexen Suspension, werden im laminaren Fluss mitgerissen und so an den Schwellen entlang transportiert. D.h. auch nicht magnetische bzw. nicht magnetophoretische Anreicherung wie in diesem Fall mittels der Führungsschwellen kann eine Filter- Wirkung auf überschüssige und demnach unerwünschte Marker im Messbereich der Zellmesseinrichtung ausüben. The dynamic accumulation and cell guide in the flow of advantage of the device is ensured, the Anreiche ¬ tion and measurement can be made in a channel. The device is not for sorting by Y-shaped separation of labeled cells from the surrounding dependent complex complex and also excess markers do not have to be separated from the suspension consuming, but can be retained by the guide thresholds. In particular, the guide thresholds are arranged in their height and in their angle to the flow direction so that unbound magnetic markers, which are much smaller in their hydrodynamic diameter than marked cells, get caught on the guide sleepers and can not be overcome. Only available from the major units or particles such as labeled cells in the com plex ¬ suspension are entrained in the laminar flow and thus transported to the sleepers along. That is to say, non-magnetic or non-magnetophoretic enrichment, as in this case by means of the guide sleepers, can exert a filter effect on excess and thus undesired markers in the measuring range of the cell measuring device.
Zur Unterstützung des strömungsmechanischen Filtereffektes an den Führungsschwellen, die insbesondere nicht magnetisch sind, d.h. keinen Nickelanteil aufweisen, können diese in der Höhe variiert werden, d.h. insbesondere auf die Größe der zu detektierenden Zellsorte und die Größe der zu filternden, nicht gebundenen magnetischen Partikel bzw. Marker angepasst werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform steigt die Schwellenhöhe im Verlauf des Durchflusskanals in Durchfluss¬ richtung an. Die erste Schwelle ist noch sehr niedrig und kann von den meisten Partikeln und Zellen überwunden werden. Im Kanalverlauf steigt die Schwellenhöhe dann zunehmend an und hält somit immer größere Partikel zurück. Nur die magne- tisch markierten Zellen, die detektiert werden sollen, werden von den Schwellen nicht aufgehalten, sondern werden an den Schwellen entlang transportiert und in einem Teilvolumen des Kanals aufkonzentriert . Dazu weisen alle Schwellen insbeson¬ dere auf dieses Teilvolumen hin, welches sich insbesondere in der Kanalmitte am Kanalboden befindet. To support the fluid-mechanical filter effect on the guide sleepers, which are in particular non-magnetic, ie have no nickel content, they can be varied in height, ie in particular the size of the cell type to be detected and the size of the non-bonded magnetic particles to be filtered or Marker can be adjusted. In an advantageous embodiment, the threshold height rises in the course of the flow channel in the flow direction. The first threshold is still very low and can be overcome by most particles and cells. In the course of the canal, the threshold height then increases and thus keeps back ever larger particles. Only the magnetically marked cells to be detected are not stopped by the thresholds, but are transported along the thresholds and concentrated in a partial volume of the channel. To this end, all thresholds insbeson ¬ ular this partial volume down, which is particularly evident in the channel center on the canal floor.
Der Kanaldurchmesser bzw. die Kanalhöhe und -breite betragen insbesondere einige 100 ym, beispielsweise 200 ym. Die Schwellenhöhe ist von der zu detektierenden Zellsorte und de¬ ren Zelldurchmesser abhängig und beträgt insbesondere einige Mikrometer, beispielsweise 10 ym oder auch bis zu 30 ym. Der Durchflusskanal kann also insbesondere ein ausreichend großes Volumen einer komplexen Suspension führen ohne dadurch zu verstopfen . The channel diameter or the channel height and width are in particular a few 100 ym, for example 200 ym. The Barrier height depends on the cell to be detected and places de ¬ ren cell diameter and in particular is a few microns, for example 10 ym or even up to 30 ym. The flow channel can thus in particular lead a sufficiently large volume of a complex suspension without clogging.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur magnetischen Durch- flusszytometrie wird ein laminarer Fluss einer Zellprobe er- zeugt und die Zellen mittels Führungsschwellen in einem vorgebbaren Teilvolumen des Durchflusskanals angereichert. Dabei werden die zu detektierenden Zellen magnetisch markiert und in einem magnetischen Gradientenfeld dynamisch am Kanalboden angereichert. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass strö- mungsmechanische und magnetische Kräfte so zusammenwirken, dass magnetisch markierte Zellen gezielt in einem vorgebbaren Volumen angereichert werden können, ohne dass diese aus der Zellsuspension abgetrennt werden müssen. In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens verläuft das Teilvolumen in Flussrichtung entlang des Kanalbodens, so dass die Zellen entlang einer Achse einzeln über eine Zellmesseinrichtung geführt werden. In the method according to the invention for magnetic flow cytometry, a laminar flow of a cell sample is generated and the cells are enriched by means of guide thresholds in a predeterminable partial volume of the flow channel. The cells to be detected are magnetically marked and dynamically enriched in the channel bottom in a magnetic gradient field. This method has the advantage that flow mechanical and magnetic forces cooperate in such a way that magnetically labeled cells can be specifically enriched in a predeterminable volume without having to separate them from the cell suspension. In an advantageous embodiment of the method, the partial volume runs in the flow direction along the channel bottom, so that the cells are guided individually along an axis via a cell measuring device.
Für das Verfahren zur Durchflusszytometrie wird beispielswei- se eine Blutprobe laminar durch die Mikrofluidik transportiert. Im Fluss werden die Zellen nahe am Kanalboden durch die Strukturierung des Substrats, d.h. die Führungsschwellen partiell ausgerichtet. Im Gradientenfeld werden beispielswei¬ se superparamagnetische Analyte an den strukturierten Kanal- boden herangezogen und dort magnetoresistiv detektiert. For the method for flow cytometry, for example, a blood sample is transported in a laminar manner through the microfluidics. In the flow the cells close to the channel bottom are partially aligned by the structuring of the substrate, ie the guide sleepers. In gradient beispielswei ¬ se superparamagnetic analytes are used to the structured channel floor and detected there Magneto.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur magnetischen Durch- flusszytometrie wirken also auf die magnetisch markierten Zellen oder auf Magnetbeads oder allgemein auf zu detektie- rende magnetische Partikel drei Kräfte: Die magnetische Kraft des magnetischen Gradientenfeldes, welches durch die magneti¬ sche Einheit unter dem Kanalboden erzeugt wird. Magnetische Feldstärken dieses Gradientenfeldes betragen beispielsweise zwischen 1 und 300 mT . Diese magnetische Kraft zieht die Zel¬ len also senkrecht zur Kanalbodenfläche hin. Des Weiteren wirkt die Scherkraft der fließenden Zellprobe auf die Einzel¬ zellen. Der Fluss ist insbesondere ein laminarer Fluss. Diese Kraft wirkt also in Richtung des Zellprobenflusses durch den Kanal. Eine dritte Kraft üben die Führungsschwellen am Kanal¬ boden aus, welche ein strömungsmechanisches Hindernis für die am Boden angereicherten magnetisch markierten Zellen darstellen. Dadurch wird bewirkt, dass die Zellen sich, um in Fluss- richtung weiter voranzukommen, entlang der Führungsschwellen zur Kanalmitte hin bewegen oder allgemein je nach Ausrichtung der Führungsschwellen auf einen Teilbereich des Kanals hin bewegen. Die magnetische Markierung geschieht vorzugsweise durch superparamagnetische Partikel. In the inventive method for magnetic throughput flow cytometry therefore act on the magnetically-labeled cells or on magnetic beads, or generally to magnetic particles to be detected Rende three forces: the magnetic force of the magnetic gradient field which is generated by the magneti ¬ specific unit under the floor channel , Magnetic field strengths of this gradient field are, for example between 1 and 300 mT. This magnetic force so pulls the Zel ¬ len vertically toward the channel bottom surface. Furthermore affects the shear force of the flowing cell sample to the individual ¬ cells. The flow is in particular a laminar flow. This force thus acts in the direction of the cell sample flow through the channel. A third force exert the guide thresholds on the channel bottom, which represent a flow-mechanical obstacle for the magnetically marked cells enriched on the bottom. This will cause the cells to move along the guide thresholds towards the center of the channel to move forward in the direction of flow, or generally move toward a portion of the channel, depending on the orientation of the guide thresholds. The magnetic marking is preferably done by superparamagnetic particles.
Bei der Durchführung des Verfahrens zur Durchflusszytometrie spielen auch die Strömungsgeschwindigkeit, die Oberflächenei¬ genschaft sowie die magnetische Feldstärke eine Rolle. Die Strömungsgeschwindigkeit etwa ist insbesondere auf die Zell- probe und vor allem den Kanaldurchmesser angepasst, um einen laminaren Fluss zu gewährleisten. Mittels einer Oberflächen- funktionalisierung können die Oberflächeneigenschaften der Kanalinnenwände und des Kanalbodens optimiert werden. Mittels der Feldstärke des magnetischen Gradientenfeldes kann weiter Einfluss auf die abzulenkenden und anzureichernden Zellen genommen werden. Die zu detektierenden Zellen besitzen auch mechanische Eigenschaften, welche durch die Größen der Strömungsgeschwindigkeit, Oberflächenbeschaffenheit und Magnet¬ feldstärke beeinflussbar sind. In carrying out the method of flow cytometry and the flow velocity, the Oberflächenei ¬ genschaft as well as the magnetic field strength to play a role. The flow rate, for example, is particularly adapted to the cell sample and above all the channel diameter in order to ensure a laminar flow. By means of a surface functionalization, the surface properties of the channel inner walls and the channel bottom can be optimized. By means of the field strength of the magnetic gradient field, further influence can be exerted on the cells to be deflected and enriched. To be detected cells also possess mechanical properties which can be influenced by the sizes of the flow rate, surface quality and magnetic field strength ¬.
Bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren für eine Vorrichtung zur Durchflusszytometrie werden Führungsschwellen mit dem Kanalboden einteilig ausgeführt, insbesondere als Spritzgussteil . In the production method according to the invention for a device for flow cytometry, guide sleepers are made in one piece with the channel bottom, in particular as an injection molded part.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat also den Vorteil eine Lösung zur Durchflusszytometrie ohne Magnetophorese anzubie¬ ten. Beispielsweise kann mit verschiedenen Techniken, wie un- ter anderem Spritzguss oder Embossing, ein derartig strukturiertes Substrat hergestellt werden, welches durch die Füh¬ rungsschwellen, also die Struktur des Substratbodens, die magnetisch markierten Zellen entsprechend führt und anrei- chert. Demnach sind keine lithographischen Aufwendungen wie bei der magnetophoretischen Anreicherung notwendig. Sozusagen werden die magnetischen Führungslinien einer magnetophoretischen Anreicherungsstrecke durch eine dreidimensionale Struk¬ tur des Substratbodens ersetzt. Die bevorzugte Fischgräten- form wird dabei insbesondere übernommen. Die Strukturierung weist insbesondere linienförmige Erhebungen auf, die als Füh¬ rungsschwellen bezeichnet werden. Diese sind insbesondere in einem steilen Winkel zur Flussrichtung durch den Kanal angeordnet. Die Schwellen messen gegen den Kanalboden typischer- weise Höhen zwischen 0,1 und 20 ym. In ihrer Breite messen die Führungsschwellen beispielsweise zwischen 1 und 100 ym. Die Länge der Führungsschwellen wird in Abhängigkeit von der Kanalbreite so gewählt, dass sie am Kanalrand mit der Kanal¬ wand abschließen und in etwa bis zur Mitte des Kanals rei- chen. Entweder sie reichen nur knapp bis zur Mitte, so dass zwischen den Führungsschwellen, die von beiden Seiten in Richtung Kanalmitte ragen, ein Durchlass bestehen bleibt oder alternativ ragen sie von ihrer Länge her über die Kanalmitte hinaus und sind dann fingerförmig ineinandergreifend angeord- net. Der Winkel zur Flussrichtung beträgt beispielsweise we¬ niger als 45°, insbesondere weniger als 20°. Thus, the inventive device has the advantage of a solution for flow cytometry without magnetophoresis anzubie ¬ th. For example, using different techniques, such as un- By other injection molding or embossing, such a structured substrate are produced, which leads by the Füh ¬ tion thresholds, so the structure of the substrate bottom, the magnetically labeled cells according to and enriches. Accordingly, no lithographic expenses as in the magnetophoretic enrichment are necessary. So to speak, the magnetic guide lines of a magnetophoresis enrichment route are replaced by a three-dimensional structural ¬ structure of the substrate soil. The preferred herringbone form is adopted in particular. In particular, the patterning comprises linear elevations which are referred to as Füh ¬ approximately swell. These are arranged in particular at a steep angle to the flow direction through the channel. The thresholds typically measure heights between 0.1 and 20 ym against the channel bottom. In their width, the guide thresholds measure, for example, between 1 and 100 ym. The length of the guide thresholds is selected in dependence on the channel width so that they terminate at the edge of the channel with the channel ¬ wall and approximately up to the middle of the channel chen pure. Either they only just reach the middle, so that between the guide sills, which protrude from both sides in the direction of the middle of the channel, a passage remains or alternatively protrude from their length beyond the middle of the channel and are then finger-shaped arranged interlocking. The angle to the flow direction is, for example we ¬ niger than 45 °, in particular less than 20 °.
Bei dem Verfahren zur Durchflusszytometrie wird insbesondere eine Blutprobe laminar durch die Mikrofluidik transportiert. Zellen innerhalb dieser Blutprobe werden nahe an der Sub¬ stratoberfläche durch die Substratstrukturierung partiell ausgerichtet. Magnetisch markierte Analyte, insbesondere su- perparamagnetisch markierte Analyte werden in dem Gradientenfeld an die Substratoberfläche, d.h. an den Kanalboden heran- gezogen und nahe am Substrat, d.h. am Kanalboden geführt, wo sie die Substratstrukturierung beeinflussen kann. Die so angereicherten und ausgerichteten Zellen können dann magnetore- sistiv detektiert werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren 1 bis 7 der ange¬ hängten Zeichnung beschrieben: In the flow cytometry method, in particular, a blood sample is transported in a laminar manner through the microfluidics. Cells within said blood sample are partially aligned close to the sub ¬ stratoberfläche through the substrate structure. Magnetically labeled analytes, in particular superparamagnetically labeled analytes, are attracted to the substrate surface in the gradient field, ie to the channel bottom and are guided close to the substrate, ie at the channel bottom, where it can influence the substrate structuring. The thus enriched and aligned cells can then be magnetoresistively detected. Embodiments of the present invention will be described in an exemplary manner with reference to Figures 1 to 7 of the attached drawing is ¬:
Figur 1 zeigt eine perspektivische Darstellung des Kanalbo¬ dens mit den zellführenden Erhebungen, 1 shows a perspective view of the Kanalbo ¬ dens with the cell leading elevations,
Figur 2 zeigt einen Längsschnitt bzw. eine Seitenansicht des Kanalbodens mit darunterliegendem Permanentmag- neten,  FIG. 2 shows a longitudinal section or a side view of the channel bottom with underlying permanent magnets,
Figur 3 zeigt einen Querschnitt bzw. eine Frontansicht des  Figure 3 shows a cross section and a front view of the
Durchflusskanals ,  Flow channel,
Figur 4 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung mit den  Figure 4 shows a plan view of the arrangement with the
fischgrätenartig angeordneten Führungsrinnen bzw. - schwellen,  herringbone arranged guide troughs or sleepers,
Figur 5 zeigt eine weitere Draufsicht auf die Anordnung mit den fischgrätenartig angeordneten Führungsrinnen bzw. -schwellen und  Figure 5 shows a further plan view of the arrangement with the fishbone-like arranged guide grooves or sleepers and
Figur 6 zeigt einen vergrößerten Ausschnitt der Figur 4. Figur 7 zeigt eine hybride Zellanreicherungsstrecke.  FIG. 6 shows an enlarged detail of FIG. 4. FIG. 7 shows a hybrid cell enrichment path.
Die Figur 1 zeigt eine perspektivische Ansicht des Kanalsbo¬ dens 13, der als flaches Substrat dargestellt ist. Darunter beabstandet ist ein weiterer flacher Quader 20 gezeigt, wel- eher die magnetische Einheit 20 darstellt. Die magnetische1 shows a perspective view of Kanalsbo ¬ dens 13, which is illustrated as a flat substrate. Below this, a further flat cuboid 20 is shown, which represents the magnetic unit 20. The magnetic
Einheit ist insbesondere ein Permanentmagnet. Die magnetische Einheit 20 kann sich auch über eine größere Fläche als die des Kanalbodens 13 erstrecken, um im Bereich des Durchfluss¬ kanals 100 ein homogenes Magnetfeld zu gewährleisten. Insbe- sondere erzeugt die magnetische Einheit 20 in dem Durchfluss¬ kanal 100 ein Gradientenfeld in dem magnetische Partikel wie etwa die magnetisch markierten Zellen 1 oder auch ungebundene magnetische Marker in Minus-z-Richtung zum Kanalboden 13 hin angereichert werden. x-,y- und z-Richtung sind in den Figuren jeweils durch kleine Koordinatensysteme am Rand angezeigt. In der Figur 1 sind auf dem Kanalbodensubstrat 13 eine Vielzahl an Führungsschwellen 12 angeordnet, die als schmale Quader dargestellt sind. Diese Erhebungen 12 setzen insbesondere am Rand des Kanalbodens bzw. an den Kanalwänden 14 an. Die Kanalwände 14 sind in der Darstellung von Figur 1 nicht gezeigt. Die Führungsschwellen 12 ragen in die Kanalmitte hin, wo sie jedoch nicht mit den gegenüberliegenden Führungs- schwellen zusammenstoßen, sondern entweder in der Mitte einen geraden Durchlass gewähren oder derart fingerförmig ineinandergreifen, dass eine Zickzack- oder schlangenförmige Linie durch die Führungsschwellen verlaufen kann. Mögliche Fließbahnen von magnetisch markierten Zellen 1 sind mit Pfeilen 41 in der Figur 1 eingezeichnet. Die magnetisch markierten Zellen 1 sind als Kreise oder Ovale gezeigt. Die an die Zellen angreifenden Kräfte 10x,y,z sind durch Doppelpfeile angedeu¬ tet. Wiederum durch breite Doppelpfeile ist die Durchfluss¬ richtung 40 angezeigt, welche in der Figur 1 von links nach rechts verläuft. Im Durchflusskanal 100 werden also an einem Ende die magnetisch markierten Zellen 1 innerhalb einer komplexen Zellsuspension eingeleitet und durchfließen in Durchflussrichtung 40 die Anreicherungsstrecke mit den Führungs¬ schwellen 12. Durch die magnetische Kraft 10z, die in Rich- tung Kanalboden 13 weist, die Scherkraft 10 der Flüssigkeit im laminaren Strom, die in Durchflussrichtung 40 weist und durch die Führungsschwellen 12, die eine Barriere darstellen, welche wiederum eine mechanische Kraft 10x in der x-y-Ebene der Figur 1 auf die Zellen 1 ausüben, werden die Zellen 1 entlang der Führungsschwellen geschoben, in Richtung desUnit is in particular a permanent magnet. The magnetic unit 20 may also extend over a larger area than that of the channel base 13, in order to ensure a homogeneous magnetic field in the area of the flow channel ¬ 100th In particular, generates the magnetic unit 20 in the flow channel 100 ¬ a gradient field in which magnetic particles such as the magnetically-labeled cells 1 or unbound magnetic markers in the minus z-direction toward the channel bottom 13 toward be enriched. x-, y- and z-direction are indicated in the figures by small coordinate systems at the edge. In FIG. 1, a multiplicity of guide sleepers 12, which are shown as narrow cuboids, are arranged on the channel bottom substrate 13. These surveys 12 set in particular on Edge of the channel bottom or on the channel walls 14 at. The channel walls 14 are not shown in the illustration of Figure 1. The guide thresholds 12 protrude into the channel center, where they do not collide with the opposite guide thresholds, but either grant a straight passage in the middle or interlock in such a finger-shaped manner that a zigzag or serpentine line can run through the guide sleepers. Possible flow paths of magnetically marked cells 1 are indicated by arrows 41 in FIG. The magnetically labeled cells 1 are shown as circles or ovals. The engaging forces the cells 10 x, y, z are angedeu ¬ tet by double arrows. Again by wide double arrows, the flow ¬ direction 40 is displayed, which runs in the figure 1 from left to right. In the flow channel 100, the magnetically marked cells 1 are thus introduced at one end within a complex cell suspension and flow through in the flow direction 40, the enrichment path with the guide ¬ thresholds 12. By the magnetic force 10 z , the direction channel floor 13, the shear force 10 of the liquid in the laminar flow, which points in the flow direction 40 and through the guide thresholds 12, which constitute a barrier, which in turn exert a mechanical force 10 x in the xy plane of Figure 1 on the cells 1, the cells 1 along the Guide sleepers pushed in the direction of the
Teilbereichs 130 des Kanalbodens 13. Am Ende dieses Teilbe¬ reichs 130, in dem die Zellen 1 aufkonzentriert werden, be¬ findet sich noch die Zellmesseinrichtung 30, welche insbesondere wenigstens ein magnetoresistives Element umfasst. Subregion 130 of the channel bottom 13. At the end of this Teilbe ¬ rich 130, in which the cells 1 are concentrated, be ¬ still there is the cell measuring device 30, which in particular comprises at least one magnetoresistive element.
Die Figur 2 zeigt einen Längsschnitt bzw. eine Seitenansicht einer Vorrichtung ähnlich wie in Figur 1. Dabei sind zwei flache Rechtecke übereinander angeordnet, die das Substrat bzw. den Kanalboden 13 und beabstandet darunter die magneti- sehe Einheit 20 darstellen. Alternativ zu der gezeigten Ausführungsform kann der Permanentmagnet auch direkt unterhalb des Kanalbodens 13 ohne Beabstandung angeordnet sein. Ober¬ halb des Kanalbodens 13 ist wieder mit einem Doppelpfeil die Durchflussrichtung 40, in der Figur 2 von links nach rechts, angezeigt und ein Querschnitt durch drei der Führungsschwel¬ len 12 sowie durch die Zellmesseinrichtung 30 am rechten Ende der Figur 2 und somit am Ende der Anreicherungsstrecke. Die magnetisch markierten Zellen 1 erfahren durch den Permanentmagneten 20 eine magnetische Kraft 10 senkrecht zum Kanalbo¬ den 13 hin. Die Höhe der Führungsschwellen 12 ist insbesondere auf die Ausdehnung, also den hydrodynamischen Durchmesser der magnetisch markierten Zellen 1 abgestimmt und beträgt insbesondere etwas weniger als der Zelldurchmesser. Bei einer zu geringen Höhe jedoch würden die magnetisch markierten Zellen keine Führungskraft 10 durch die Schwellen 12 erfahren, sondern im laminaren Strom über diese hinweggerissen werden. Bei zu hohen Barrieren 12 würden die magnetisch markierten Zellen 1 keine Scherkraft 10y durch den Fluss mehr erfahren und hinter den Schwellen 12 hängen bleiben. FIG. 2 shows a longitudinal section or a side view of a device similar to that in FIG. 1. In this case, two flat rectangles are arranged one above the other, which represent the substrate or the channel bottom 13 and spaced below it the magnetic unit 20. Alternatively to the embodiment shown, the permanent magnet can also be arranged directly below the channel bottom 13 without spacing. Ober ¬ half of the channel bottom 13 is again with a double arrow the Flow direction 40, in the figure 2 from left to right, and a cross-section through three of Führungsschwel ¬ len 12 and by the cell measuring device 30 at the right end of Figure 2 and thus at the end of the enrichment route. The magnetically marked cells 1 experience through the permanent magnet 20 a magnetic force 10 perpendicular to Kanalbo ¬ the 13 out. The height of the guide sleepers 12 is particularly matched to the extent, ie the hydrodynamic diameter of the magnetically marked cells 1, and in particular is slightly less than the cell diameter. However, if the height is too low, the magnetically-labeled cells would not experience a guiding force 10 through the thresholds 12, but would be torn away in the laminar flow. If the barriers 12 are too high, the magnetically marked cells 1 would no longer experience shearing force 10 y through the flow and would remain behind the sleepers 12.
Die Figur 3 zeigt einen Querschnitt bzw. die Frontansicht des Durchflusskanals 100. In der Figur 3 sind wieder als schmale Rechtecke die magnetische Einheit 20 und beabstandet darüber das Substrat 13 für den Kanalboden gezeigt, darüber ist die Kanalwand 14 angeordnet, die ein quaderförmiges Kanalvolumen einschließt. Im Durchflusskanal 100 ist noch gestrichelt das Teilvolumen 110 gezeigt, in welchem die magnetisch markierten Zellen 1 angereichert werden. 3 shows a cross-section or the front view of the flow channel 100. In FIG. 3, the magnetic unit 20 is again shown as narrow rectangles and the substrate 13 for the channel bottom is shown spaced above it. Above this, the channel wall 14 is arranged, which encloses a cuboid channel volume , The partial volume 110, in which the magnetically marked cells 1 are enriched, is shown in dashed lines in the flow channel 100.
Die Figur 4 nun zeigt eine Draufsicht auf den Kanalboden 13, auf dem wieder mit Doppelpfeilen 40 die Durchflussrichtung von links nach rechts in der Figur 4 verdeutlicht ist. Je- weils seitlich des Kanalbodens 13 sind im Schnitt die Kanal¬ wände 14 schraffiert dargestellt. Innerhalb der Kanalwände 14 verläuft je eine gestrichelte Linie, die das Ende des magne¬ tischen Bereiches kennzeichnet. D.h. der Abstand der gestri¬ chelten Linien 200 zeigt die Breite des vom Magnetfeld durch- setzten Bereichs an. Dieser ist insbesondere breiter als der Durchflusskanal 100. Somit ist gewährleistet, dass das Mag¬ netfeld im Kanalvolumen möglichst homogen ist. Der vom Magnetfeld durchsetzte Bereich 200 wird durch die magnetische Einheit 20 erzeugt, die unterhalb des Kanalbodens 13 angeord¬ net ist, wie in den Figuren 1 bis 3 sichtbar ist. Im Kanal 100 sind wieder Führungsschwellen 12 in einem Winkel δ zur Kanalwand 14 angeordnet, so dass die Führungsschwellen 12 von der Kanalwand 14 in Richtung Kanalmitte in Durchflussrichtung 40 zeigen. So können die magnetisch markierten Zellen 1, wie durch die Fließbahnen 41 angezeigt, an den Führungsschwellen 12 abgelenkt werden in Richtung des Teilbereichs 130, der sich bis zu der Zellmesseinrichtung 30 oder darüber hinaus erstreckt. FIG. 4 now shows a plan view of the channel bottom 13, on which the flow direction from left to right in FIG. 4 is again illustrated with double arrows 40. In each case the side of the channel bottom 13 are shown hatched in section, the channel walls ¬ fourteenth Within the channel walls 14 each has a dashed line, which marks the end of the magne ¬ tables area. That is, the distance between the gestri ¬ Chelten lines 200, the width of the translated by the magnetic field transit area displays. This is especially wider than the flow channel 100. This ensures that the Mag ¬ netfeld is as homogeneous as possible in the channel volume. The magnetic field penetrated region 200 is by the magnetic Unit 20 generates, which is below the channel bottom 13 angeord ¬ net, as shown in Figures 1 to 3 is visible. In the channel 100 again guide sleepers 12 are arranged at an angle δ to the channel wall 14, so that the guide thresholds 12 point from the channel wall 14 in the direction of the channel center in the flow direction 40. Thus, the magnetically marked cells 1, as indicated by the flow paths 41, can be deflected at the guide thresholds 12 in the direction of the portion 130 which extends to the cell measuring device 30 or beyond.
Die Figur 5 zeigt eine mögliche Anordnung von Führungsschwel¬ len 12, welche in einem sehr spitzen Winkel δ zueinander verlaufen. Wiederum ist die Kanalbreite 100 angezeigt. Die Figur 6 zeigt einen vergrößerten Ausschnitt aus der Figur 5 mit den in einem spitzen Winkel δ zulaufenden Führungsschwellen 12, welche eine Schwellendicke bzw. -breite d und einen Abstand zwischen den Schwellen D aufweisen. Der Winkel δ, in dem die Schwellen 12 relativ zur Flussrichtung 40 angeordnet sind, kann beispielsweise relativ zur Kanalmittellinie wie in Figur 6 gezeigt, oder relativ zur Kanalwand 14 gemessen werden. Wiederum sind magnetisch markierte Zellen 1 als kleine Kreise in der Figur 6 eingezeichnet. Dabei wird verdeutlicht, dass für die Zellen 1 ein ausreichend breiter Fließweg zwischen den Schwellen 12 hindurch gewährleistet ist, so dass diese die Führungsschwellenzwischenräume nicht verstopfen. 5 shows a possible arrangement of Führungsschwel ¬ len 12, which extend at a very acute angle δ to each other. Again, the channel width 100 is displayed. FIG. 6 shows an enlarged detail from FIG. 5 with the guide sleepers 12 tapering at an acute angle δ, which have a threshold thickness or width d and a spacing between the thresholds D. The angle δ, in which the thresholds 12 are arranged relative to the flow direction 40, can for example be measured relative to the channel center line as shown in FIG. 6 or relative to the channel wall 14. Again, magnetically marked cells 1 are shown as small circles in FIG. It is made clear that a sufficiently wide flow path between the sleepers 12 is ensured for the cells 1 so that they do not clog the guide-threshold gaps.
Die Figur 7 schließlich zeigt noch eine mögliche Ausgestal¬ tungsform der Vorrichtung mit einer hybriden Anreicherungs- strecke. Im linken Bereich der Figur 7 ist die Anreicherungs¬ strecke auf einem KunststoffSubstrat 13 mit Kunststofffüh- rungsschwellen 12 gezeigt, welche mit die beschriebene strö¬ mungsmechanische Anreicherung der Zellen 1 bewirken. Im rechten Bereich der Zeichnung schließt sich an das Substrat 13 der Siliziumchip 15 an, auf dem die Zellmesseinrichtung 30 angeordnet ist. Dieser kann wie im Beispiel der Figur 7 ge¬ zeigt noch weitere Führungsschwellen 125 aufweisen, welche insbesondere die Anreicherungsstrecke auf den Teilbereich 130 fortsetzen. Die Durchflussrichtung 40 ist wieder durch einen Doppelpfeil von links nach rechts in der Zeichnung darge¬ stellt. Die magnetisch markierten Zellen 1 sind als Ovale dargestellt und deren Fließbahnen mit Pfeilen 41 gekennzeich- net. In dem gezeigten Beispiel in Figur 7 greifen die Führungsschwellen 12, die beidseitig an den Kanalwänden 14 ansetzen, nicht fingerförmig ineinander, sondern lassen einen geraden Durchflussbereich im Bereich der Kanalmitte offen, der in dem Teilbereich 130 zur Anreicherung liegt. Um die Zellen 1 auch nach der Anreicherungsstrecke durch die Führungsschwellen 12 noch gerade über den Zellmessbereich 30 zu führen, weist der Siliziumchip 15 noch ein kleines Teilstück Anreicherungsstrecke mit Führungsschwellen 125 auf. Diese können beispielsweise auch einen Nickelanteil im Material der Führungsschwellen 125 aufweisen und somit noch ungebundeneFigure 7 finally shows a possible Ausgestal ¬ processing of the apparatus with a hybrid enhancement route. In the left portion of the figure 7 is the approximately swell enhancement ¬ distance on a plastic substrate 13 having plastic guidance 12, which effect with the described strö ¬ mung mechanical enrichment of the cells. 1 In the right-hand area of the drawing, the substrate 13 is followed by the silicon chip 15, on which the cell measuring device 30 is arranged. This may as in the example of Figure 7 shows yet another guide ge ¬ thresholds have 125 which in particular the enrichment route to the subregion 130 continue. The flow direction 40 is again by a double arrow from left to right in the drawing Darge ¬ provides. The magnetically marked cells 1 are shown as ovals and their flow paths are marked with arrows 41. In the example shown in FIG. 7, the guide sleepers 12, which adjoin the channel walls 14 on both sides, do not engage in one another like a finger, but leave open a straight flow area in the region of the channel center which lies in the enrichment subarea 130. In order to guide the cells 1 even after the enrichment route through the guide sleepers 12 just above the cell measuring area 30, the silicon chip 15 still has a small section of enrichment path with guide sleepers 125. These may for example also have a nickel content in the material of the guide thresholds 125 and thus still unbound
Marker vor der Zellmesseinrichtung 30 durch magnetische Rückhaltekräfte herausfiltern. Alternativ können die Führungsschwellen 125 auf dem Siliziumchip 15 etwa durch Fotolackstrukturen realisiert sein. Des Weiteren ist in der Figur 7 wieder durch Doppelpfeile die ablenkende Kraft lOx gezeigt, die die Zellen 1 an den Führungsschwellen 12 entlang zur Mitte führt als auch die Scherkraft des Fluidikstroms lOy, die in Durchflussrichtung 40 weist. Filter out markers in front of the cell measuring device 30 by means of magnetic retention forces. Alternatively, the guide thresholds 125 may be realized on the silicon chip 15, for example by means of photoresist structures. Furthermore, FIG. 7 again shows by double arrows the deflecting force 10x, which guides the cells 1 along the guide sleepers 12 to the center and also the shearing force of the fluidic flow 10y, which points in the flow direction 40.

Claims

Patentansprüche claims
1. Vorrichtung zur Durchflusszytometrie mit 1. Device for flow cytometry with
einem Durchflusskanal (100),  a flow channel (100),
- mit einer magnetischen Einheit (20), welche unterhalb des Kanalbodens (13) des Durchflusskanals (100) ange¬ ordnet ist und ausgestaltet ist, ein magnetisches Gra¬ dientenfeld zu erzeugen, welches das vom Durchflusska¬ nal (100) umschlossene Volumen durchsetzt, - carrying a magnetic unit (20) which is attached ¬ arranged below the channel bottom (13) of the flow channel (100) and configured to generate a magnetic Gra ¬ serves field, which passes through the by Durchflusska ¬ nal (100) enclosed volume,
- wenigstens einer Zellmesseinrichtung (30) sowie  - At least one cell measuring device (30) and
mindestens einer Führungsschwelle (12), welche derart im Durchflusskanal (100) angeordnet ist, dass durch den Durchflusskanal (100) strömbare Zellen (1) von der Füh¬ rungsschwelle (12) zur Zellmesseinrichtung (30) hin lenkbar sind. at least one guide threshold (12) which is arranged in the flow channel (100) that through the flow channel (100) flowable cells (1) from the Füh ¬ approximately threshold (12) to the cell measuring means (30) toward steerable.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Durchflusskanal (100) hinsichtlich Kanaldurchmesser und Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet ist, dass ein Fluss einer komplexen Zellsuspension in dem Durchflusskanal (100) mit laminarem Strömungsprofil erzeugbar ist. 2. Device according to claim 1, wherein the flow channel (100) is designed with respect to channel diameter and surface texture of the channel inner wall so that a flow of a complex cell suspension in the flow channel (100) can be generated with laminar flow profile.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die magnetische Einheit (20) ausgestaltet ist, ein magnetisches Gradientenfeld zu erzeugen, durch welches magnetisch markierte Zellen (1), insbesondere superparamagnetisch markierte Zellen (1), am Kanalboden (13) anreicherbar sind. 3. Device according to one of claims 1 or 2, wherein the magnetic unit (20) is designed to generate a magnetic gradient field through which magnetically marked cells (1), in particular superparamagnetically labeled cells (1), at the channel bottom (13) enriched are.
4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Führungsschwelle (12) eine Erhebung gegen den Kanalboden4. Device according to one of the preceding claims, wherein the guide threshold (12) has a projection against the channel bottom
(13) ist oder aus einer Absenkung gegen den Kanalboden (13) gebildet ist. (13) or is formed from a depression against the channel bottom (13).
5. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit ei- ner Vielzahl von Führungsschwellen (12), welche derart im5. Device according to one of the preceding claims with a plurality of guide sleepers (12), which in such
Durchflusskanal (100) angeordnet sind, dass durch den Durch¬ flusskanal (100) strömbare Zellen (1) von den Führungsschwel¬ len (12) in einem Teilvolumen des Durchflusskanals (100) über einer Teilfläche (130) des Kanalbodens (13) anreicherbar sind . Flow channel (100) are arranged, that by the through ¬ flow channel (100) flowable cells (1) from the Führungsschwel ¬ len (12) len in a partial volume of the flow channel (100) via a partial surface (130) of the channel bottom (13) can be enriched.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zellmesseinrichtung (30) am oder im Kanalboden (13) angeordnet ist. 6. Device according to one of the preceding claims, wherein the cell measuring device (30) is arranged on or in the channel bottom (13).
7. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei sich die Führungsschwellen (12) so über den Kanalboden erstrecken, dass magnetisch markierte Zellen (1), welche eine magnetische Kraft (10z) in Richtung Kanalboden (13) sowie ei¬ ne fluidische Scherkraft (10y) in Durchflussrichtung (40) er¬ fahren, die Führungsschwellen (12) nur auf einem Weg über eine vorgebbare Teilfläche (130) des Kanalbodens (13) überwin- den können. 7. Device according to one of the preceding claims, wherein the guide thresholds (12) extend over the channel bottom, that magnetically marked cells (1), which a magnetic force (10 z ) towards the channel bottom (13) and ei ¬ ne fluidic shear force (10 y ) in the flow direction (40) he ¬ drive, the guide thresholds (12) only on a path over a predetermined part surface (130) of the channel bottom (13) can overcome.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Führungsschwellen (12) mit dem Kanalboden (13) einteilig ausgeführt sind, insbesondere als Spritzgussteil. 8. Device according to one of the preceding claims, wherein the guide thresholds (12) with the channel bottom (13) are made in one piece, in particular as an injection molded part.
9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Führungsschwellen (12) gerade linienförmige Erhebungen gegen den Kanalboden (13) sind. 9. Device according to one of the preceding claims, wherein the guide thresholds (12) are straight line-shaped elevations against the channel bottom (13).
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Führungsschwellen (12) in einem spitzen Winkel zur Durchflussrichtung (40) angeordnet sind. 10. Device according to one of claims 5 to 9, wherein the guide thresholds (12) are arranged at an acute angle to the flow direction (40).
11. Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie bei dem ein laminarer Fluss einer Zellprobe erzeugt wird, die Zellen (1) magnetisch markiert werden und in einem magnetischen Gradientenfeld dynamisch am Kanalboden (13) angereichert werden und bei dem die Zellen (1) mittels Führungsschwellen (12) in einem vorgebbaren Teilvolumen (110) des Durchflusskanals (100) über einer Teilfläche (130) des Kanalbodens (13) ange¬ reichert werden. 11. A method for magnetic flow cytometry in which a laminar flow of a cell sample is generated, the cells (1) are magnetically marked and are dynamically enriched in a magnetic gradient field at the channel bottom (13) and wherein the cells (1) by means of guide thresholds (12) in a predeterminable partial volume (110) of the flow channel (100) over a partial surface (130) of the channel bottom (13) are ¬ enriched.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Teilfläche (130) in Flussrichtung (40) entlang des Kanalbodens (13) verläuft, so dass die Zellen (1) entlang einer Achse über eine Zellmess¬ einrichtung (30) geführt werden. 12. The method of claim 11, wherein the partial surface (130) in flow direction (40) along the channel bottom (13) extends, so that the cells (1) along an axis through a cell measuring ¬ means (30) are guided.
13. Herstellungsverfahren für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bei dem die Führungsschwellen (12) mit dem Kanalboden (13) einteilig ausgeführt werden, insbesondere als Spritzgussteil . 13. A manufacturing method for a device according to one of claims 1 to 10, wherein the guide sleepers (12) with the channel bottom (13) are made in one piece, in particular as an injection molded part.
EP12748175.2A 2011-07-28 2012-07-24 Fluidic cell guidance for flow cytometry Withdrawn EP2707692A1 (en)

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