EP2614370A1 - Test pronostic de l'évolution d'une tumeur solide par analyse d'images - Google Patents

Test pronostic de l'évolution d'une tumeur solide par analyse d'images

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EP2614370A1
EP2614370A1 EP11754678.8A EP11754678A EP2614370A1 EP 2614370 A1 EP2614370 A1 EP 2614370A1 EP 11754678 A EP11754678 A EP 11754678A EP 2614370 A1 EP2614370 A1 EP 2614370A1
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EP
European Patent Office
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tumor
cells
zone
graph
density
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11754678.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-François EMILE
Marc-Antoine Allard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite de Versailles Saint Quentin en Yvelines
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite de Versailles Saint Quentin en Yvelines
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Filing date
Publication date
Application filed by Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP, Universite de Versailles Saint Quentin en Yvelines filed Critical Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Publication of EP2614370A1 publication Critical patent/EP2614370A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G—PHYSICS
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
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    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
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    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30096—Tumor; Lesion

Definitions

  • Cancer is a disease characterized by an abnormally large cell proliferation within a normal body tissue, so that the survival of the body is threatened. These cells are all derived from the same clone, a cancer-initiating cell that has acquired certain characteristics allowing it to divide indefinitely. During the evolution of the disease, some cells can form a malignant tumor (a neoplasm) or spread through the body and form metastases.
  • a malignant tumor a neoplasm
  • the risk factors are genetic (mono- or multigenic) and environmental (diet, smoking, bacterial flora, etc.).
  • Several types of cancers appear to be increasing, for environmental or lifestyle reasons, as well as - for a few cases only - because of the aging of the population.
  • the detected cancer rates increase in each age group, a better detection than formerly also having a role in this increase.
  • a sample of the tumor comes either from a biopsy (simple removal of a piece of the tumor) that can be done, depending on the location, according to different procedures (fibroscopy, puncture through the skin ...), or an operative piece (tumor removed by the surgeon).
  • the sample is most often appropriately fixed and sections are taken. These sections can be stained by conventional histochemistry treatments and if necessary immunohistochemistry to allow at least the identification of different cell types and delineation of the tumor front.
  • TNM classification internationally recognized criteria
  • the TNM classification makes it possible to group patients according to the anatomical extent of their disease. It aims to i) assess the prognosis, ii) guide the therapeutic indication, and iii) compare the results of different therapeutic protocols.
  • the code T refers to the size and the local extent of the primary tumor, the N code to the possible involvement of the ganglia (node in English), the M code with metastases. Each letter is assigned a coefficient.
  • the grouping of the three codes defines stages, characteristics of the probable evolution of the tumor.
  • the letter T symbolizes the local extension of the primary tumor. It is quoted from T0 (when the primary lesion is not found) to T4 for the most extensive tumors. This rating depends on the tumor volume, represented by the maximum diameter of the lesion and / or infiltration of neighboring tissues and organs.
  • the letter N from NO to N3, depends on the ganglionic territory, more or less close to the tumor, the dimensions of the adenopathies, their number and / or their possible fixation. to neighboring tissues.
  • the letter M is rated MO in the absence of known metastases or Ml in their presence, regardless of their seat, single or multiple.
  • This classification was designed to give oncologists in all countries a common language that facilitates the exchange of information between physicians and researchers. It is periodically discussed and updated by specialists within the framework of the UICC which is responsible for disseminating it around the world in the form of an explanatory manual. It helps to codify treatment indications. According to the tumor locations, the combination of the three TNM markers makes it possible to establish a more synthetic stage (I to IV).
  • the pathological classification includes information obtained by pathological examination of the primary tumor and lymph nodes.
  • TNM classification has its limits because it is often difficult to evaluate the volume of tumor masses by imaging (criterion T), and the extent of microscopic invasion.
  • analysis of the tumor sample taken is only visual and requires the skills of a specialist in the field of tumor pathology specialist. This analysis is therefore essentially subjective, and takes a lot of time.
  • the prognostic method of the invention meets this need by providing an objective method for evaluating the prognosis of a cancer based on the analysis of a virtual slide by a computer software.
  • the method of the invention is therefore more reliable and faster than existing methods for assessing the vital prognosis of a patient with a solid tumor, including colorectal cancer. It also makes it possible to supplement the current methods in order to specify the prognosis resulting from the TNM classification.
  • Other prognostic image analysis systems have been developed in the last ten years.
  • US 2004/0013292 describes the analysis of tumor sections by segmenting them into different regions.
  • US 2003/0050553 and Rijken P. et al describe more precisely methods for determining the density of microvessels present in tumors.
  • US 5,616,469 deduces a method of prognosis of the evolution of a solid tumor in an individual.
  • the present method incorporates in its measurement the main factor of variation of the density (that is to say the distance relative to the tumor front), 2) it takes into account the peri-tumoral infiltrate, 3) the result obtained (the classification of tumors according to the profiles of graphs obtained) is therefore highly reproducible.
  • this counting technique can be completely automated thanks to the use of virtual slides, image analysis software, and thanks to the standardization. measures expressed in the form of graphs.
  • TILs Tumor infiltrating lymphocyte quantification systems
  • the lymphocytes were counted either on staining by ⁇ (Jass et al., J Clin Pathol 1996), ie after immunohistochemistry in situ. The counts were performed either on whole sections (Pages, NEngl JMed 2005, Laghi Lancet Oncol, 2009) or on tissue arrays (Galon et al, Science 2006, Salama et al, J. Clin, Oncol, 2009), or manually by pathologist (Prall et al., Human Pathol 2004), or with image analysis software.
  • the software accounted for either a percentage of marked area (Laghi et al., Lancet Oncol, 2009) or identified lymphocytes after image segmentation (Salama et al, J. Clin, Oncol, 2009).
  • the cited studies used only one or two density values for correlation with clinical outcome.
  • these systems are in practice not used by the doctors, because they face problems of reproducibility due to the heterogeneous distribution of the TILs in the tumors.
  • the results of the present inventors have indeed demonstrated that the density of TILs depends on the position relative to the tumor front.
  • TIL densities measured at some points in the tumor are not representative of the tumor infiltrate as a whole and these measurements are unreliable.
  • the present invention proposes to measure the distribution of TILs continuously, on either side of the tumor front.
  • the present invention relates to a method for predicting the evolution of a solid tumor in an individual, comprising at least the following steps: a) making a virtual slide from a tumor sample, on which a tumor front is identifiable, b) quantify on said virtual slide made in step a) the density in cells and / or blood vessels present in a continuous zone covering the tumor front and extending on either side of the forehead tumor at a distance of at least 0.5 mm, called a "quantization zone", preferably a rectangular zone, c) deduce from said quantification the risks of postoperative relapse and / or sensitivity to various antitumor treatments and / or the risk of developing metastases in said patient.
  • the rectangular quantization zone is such that: i) the mediators of the short side and the long side of this rectangle are respectively normal and tangent to the tumor front at said point of intersection, and ii) the intersection point of the mediators is a point of the tumor front.
  • step a) consists at least of digitizing and recording a microscopy image of an immunohistochemically labeled tissue section.
  • the quantization step b) is performed using computer software and comprises sampling the density of cells and / or blood vessels in a continuous set of rectangular areas of predefined width, said areas having the length the width of the quantization zone, and sweeping the quantization zone on either side of the tumor front, over the entire length of the quantization zone.
  • the result of said quantification is expressed on a graph, the analysis of which makes it possible to evaluate the risks of postoperative relapse and / or the sensitivity to the various antitumor treatments and / or the risks of developing metastases in said patient. .
  • said graph is such that: i) on the abscissa axis the distance from one side to the other of the point of the tumor front is plotted; ii) in the ordinate is reported the density in cells and / or in blood vessels measured in each sampled area.
  • the evaluation of said risks is carried out by: i) comparing the shape of said graph to a standard profile, or ii) calculating the area under the graph for each pre- and post-tumor front area, and comparing with threshold values, iii) By measuring the slopes of variation at two points of the graph located at a determined distance on either side of the tumor front and comparing them with threshold values, or iv) Comparing the values obtained at two points of the graph situated at a determined distance on either side of the tumor front at threshold values.
  • the present invention therefore aims at a method for predicting the evolution of a solid tumor in an individual, comprising the following steps: a) obtaining a virtual blade of a tissue section of an immunohistochemically labeled tumor, on which a tumor front is identifiable, b) quantify on this virtual slide the density in cells and / or blood vessels present on both sides of the tumor front, in a rectangular continuous zone extending on both sides of the tumor margin over a distance of at least 0.5 mm, c) expressing these results on a graph whose abscissa axis corresponds to the distance from the tumor front, and the ordinate the quantity of cells or blood vessels measured at that distance.
  • step d) Perform at least one of the op selected from: i) Compare the shape of the graph to a typical profile, or ii) Calculate the area under the graph for each pre- and post-tumor area, and compare it to threshold values. iii) Measure the slope of variation at two points in the graph at a fixed distance from each other. of the tumor front and compare them to threshold values, or iv) compare the values obtained at two points of the graph situated at a determined distance on either side of the tumor front at threshold values. e) deduce from step d) the risks of postoperative relapse and / or sensitivity to the various anti-tumor treatments and / or the risks of developing metastases in said individual.
  • the cells to be quantified are leukocytes such as T lymphocytes, B cells, macrophages, NK cells, dendritic cells, or subpopulations of these immune cells.
  • the cells to be quantified are immunohistochemically labeled and are positive for CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3, CD68 markers.
  • FIG. 1 represents, on a virtual slide representing a section of an immunohistochemistry-labeled colorectal tumor with an anti-CD3 antibody so as to mark the immune cells of interest (lymphocytes), the positioning of a rectangular quantification zone of on both sides of the tumor front, usable in the method of the invention (A, with, on the left, the tumor zone, and on the right the non-tumor tissue), the quantification zone within the meaning of the present invention, situated on either side of the tumor front (B, the tumor front is identified by a black arrow), and finally a graph representing the automatic quantification of the density of CD3 cells on either side of the tumor front in the quantification zone defined in A by image analysis using Visilog ® software (C).
  • FIG. 2 represents, on a virtual slide representing a section of a colorectal tumor marked immunohistochemically with an anti-CD3 antibody so as to mark the immune cells of interest (A), the positioning of three different quantification zones from and another of the tumor front (B), and a graph showing the density of CD3 + cells on either side of the tumor front in the different quantification zones defined in B by image analysis using Visilog ® software .
  • FIG. 1 represents, on a virtual slide representing a section of a colorectal tumor marked immunohistochemically with an anti-CD3 antibody so as to mark the immune cells of interest (A), the positioning of three different quantification zones from and another of the tumor front (B), and a graph showing the density of CD3 + cells on either side of the tumor front in the different quantification zones defined in B by image analysis using Visilog ® software .
  • 3 represents, on a virtual slide representing a section of a colorectal tumor marked immunohistochemically with an anti-CD3 antibody so as to mark the immune cells of interest (A), the positioning of three different quantification zones from and another of the tumor front (B), and a graph showing the density of CD3 + cells on either side of the tumor front in the different quantification zones defined in B by image analysis using Visilog ® software .
  • Figure 4 shows different graph profiles obtained from colorectal tumor samples. On each of the 3 graphs a curve corresponds to 1 patient. Patients were grouped according to the profile of the curves: A: profile 3, called "weak", associated with a bad prognosis
  • FIG. 5 represents the tumor extension front which is easily detectable in the vast majority of cases (whatever the coloring), but which can sometimes be exceeded by budding phenomena (budding).
  • the photographs were made after double labeling in immunohistochemistry, with the tumor in red (anti-cytokeratin AE1 / AE3) and the lymphocytes in brown (anti-CD3).
  • the tumor front (that is, the interface between the red and non-red areas) is easily identifiable.
  • high magnification (right image) many CD3 - positive lymphocytes were detected outside and inside the tumor.
  • FIG. 6 shows two test curves obtained by varying the detection terminals of red (A) or blue (B) for the same sample, in the same quantization rectangle (see point 5 of the experimental part). The preferred thresholds and settings for detecting both colors have been established from these standard curves.
  • FIG 7 illustrates the type 1 profile known as "strong tumor infiltrate”: for the same colorectal tumor sample (the same patient), three different quantification zones were used (measurements 1, 2 and 3 on image A) then the presence lymphocyte infiltrate (CD3 positive cells) in each zone was quantified using the method of the invention and then represented in graph form (B).
  • strong tumor infiltrate for the same colorectal tumor sample (the same patient), three different quantification zones were used (measurements 1, 2 and 3 on image A) then the presence lymphocyte infiltrate (CD3 positive cells) in each zone was quantified using the method of the invention and then represented in graph form (B).
  • FIG. 8 illustrates the type 4 profile called "weak infiltrate”: for the same colorectal tumor sample (the same patient), two different quantification zones were used (measurements 1 and 2) on image A), then the presence of the 'infiltrate lymphocyte (CD3 positive cells) in each zone was quantified using the method of the invention and then represented in graph form (B).
  • FIG. 9 illustrates the so-called "strong peak” type 2 profile: for the same colorectal tumor sample (the same patient), three different quantification zones were used (measurements 1, 2 and 3 on image A) then the presence of the lymphocyte infiltrate (CD3-positive cells) in each zone was quantified using the method of the invention and then represented in the form of a graph (B).
  • FIG. 10 represents the Kaplan-Meyer survival curve of the patients between the date of diagnosis of their cancer and the detection of metastases in the lungs or the liver according to their profile measured according to the method of the invention.
  • the prognostic method of the invention is carried out ex vivo and makes it possible to evaluate the risks of postoperative relapse and / or sensitivity to the various antitumor treatments and / or the risks of developing metastases in a patient to whom all or part of a tumor was removed.
  • the term "virtual blade” means a digital image of a tissue sample attached to a glass slide.
  • the digital image sensor acquires the photograph and stores it on the hard disk of the computer, with its information in X and Y
  • Moving the sample Move the sample in the X and Y directions to the next position, so that the next image can be precisely located relative to the other images.
  • the tumor sample that can be used to establish a prognosis according to the method of the invention is taken from a patient who has undergone a biopsy or a surgical operation, and then treated so that it can be cut into thin slices by a microtome .
  • This treatment consists in fixing the constituents of the sample in relation to each other, so as to solidify the assembly and allow cutting.
  • the techniques commonly used for this treatment in laboratories include: fixation in formalin (or other fixatives) or cryopreservation.
  • the thin slices of tumor sample are deposited on slides, and then treated by the widely used histology, histochemistry and / or immunohistochemistry techniques to reveal: the different tissue types, cell types, blood vessels, tumor front, cell density, etc.
  • the prognostic method according to the invention is therefore characterized in that step a) consists of at least digitizing and recording a microscopy image of an immunohistochemically labeled tissue section.
  • tumor front means the boundary between the tumor tissue and the non-tumor tissue. In the great majority of tumors, and especially in carcinomas, this limit is easily identifiable with usual histological or immunohistochemical stains. Beyond (outside) the tumor front there may exist, in some tumors, some isolated cells or microamas corresponding to a budding tumor (budding) phenomenon (see Figure 5C).
  • the tumor front must be comparable to an arc whose center is located inside the tumor, which corresponds to the smoothing of the area of the tumor. interface between tumor and non-tumor tissues.
  • the quantization zone is chosen in a particular way, so that it covers a tumor front which has a curvature as regular as possible, that is to say a front having a curvature such that a tangent can be traced in at least one point of this front.
  • the quantification zone of the invention must contain the tumor front and must extend on either side of the latter over a distance at least equal to 0.3 mm, preferably 0.5 mm, moreover more preferred at least 0.6 mm.
  • This zone can have any shape as long as it is continuous (that is to say, it is possible to connect any two points of the zone without leaving it). Such continuous areas are, for example, circles, triangles, diamonds, squares, rectangles, etc.
  • the quantization zone is rectangular, and selected in the following manner: firstly, a regular part of the tumor front is identified on the virtual blade ("regular part of the tumor front" means a tumor / stroma interface which is assimilable to an arc whose center is located inside the tumor). Secondly, we define a point on this regular part of the tumor front, for which we draw the tangent to the tumor front, as well as the normal to the tumor front passing through this point. Finally, the quantization zone is chosen so that: i) the mediators of the short side and the long side of this rectangle are the normal and the tangent to the tumor front at the point of intersection, and ii) the point of intersection of the mediators is said point defined on the tumor front.
  • the mediator of the short side must extend on either side of the tumor front over a distance of at least 0.3 mm, preferably 0.5 mm, even more preferably at least 0.6 mm.
  • the quantization zone has a surface area of 2 mm 2 , even more preferably 3 mm 2 .
  • the length of said rectangle is at least 0.6 mm
  • the width of said rectangle is at least 0.2 mm.
  • the second step (step b) of the prognostic method according to the invention consists in quantifying, in the quantization zone selected in the manner described above, the density of a tissue element (vessels, collagen fibers, etc.). .) or cellular (lymphocyte, macrophage, ...) identifiable by its shape, size and / or color, measured on both sides of the tumor front.
  • the density is here defined as the measured element quantity, referred to a surface unit, for example mm 2 or ⁇ 2 .
  • the density of cells and / or blood vessels present in the quantization zone is measured.
  • the density in certain cells of the immune system, present in said zone or in subsets of said zone is measured.
  • These cells are, for example, leukocytes such as T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, NK cells, dendritic cells, or subpopulations of these immune cells.
  • these cells are advantageously labeled by immunohistochemistry and are positive for the CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3 and / or CD68 markers.
  • the cells studied are positive for the CD3 marker (CD3 + ).
  • the CD3 marker (or "differentiation cluster 3") characterizes T lymphocytes.
  • This well-known membrane protein complex consists of 4 different chains. In mammals, this complex is formed by a CD3y chain, a CD35 chain and two CD3s channels. These transmembrane proteins associate with the T cell receptor (TCR) and a redesign chain to form the TCR complex and generate the T cell activation signal.
  • TCR T cell receptor
  • the immunohistochemical staining is revealed by a substrate of peroxidase (diaminobenzidine) in the examples indicated, but it is possible to use another colored substrate or another enzyme (alkaline phosphatase) or a fluorescent substrate, or even a combination of these methods. .
  • T lymphocytes, regulatory T, etc. the quantification techniques of these immune cells (T lymphocytes, regulatory T, etc.) in the studies carried out so far consisted in comparing the number of immune cells present in tumor zones of variable surface (TMA spots (tissue-microarrays) or fields at high magnification of microscopes). These zones were most often chosen either randomly or without a clearly described methodology concerning, in particular, the position and surface of the counting zones.
  • TMA spots tissue-microarrays
  • the work of J. Galon's team distinguished the infiltrates at the forehead and inside the tumor, but does not indicate whether the forehead samples are located inside or on the outside of the tumor. tumor.
  • Counts performed on full TMA spots are too large to allow a peak to appear, and a small variation in TMA core position may be responsible for a large variation in the measurement .
  • An important feature of the method of the invention is to make several (ie more than 3, and preferably more than 4) density measurements each of which is associated with the position relative to the tumor front.
  • the method of the invention can also be very reliable by quantifying the number of blood vessels passing through the quantization zone, these vessels can be labeled by immunohistochemistry, for example by revealing the CD34 or CD31 markers (Couvelard et al. Br J Cancer 2005, Couvelard et al Mod Pathol, 2009).
  • the solid tumor whose prognosis is to be evaluated is a colon cancer or rectal cancer.
  • Colon cancer develops from the lining of the "large intestine" or colon. Because colon and rectal cancers are quite similar, they are grouped under the term "colorectal cancer". It is always a malignant tumor. It is the second cancer, in terms of frequency, in women (after breast cancer) and third in men (after lung cancer and prostate cancer). Colon cancer has a high frequency in France: every day, 100 people learn that they have colorectal cancer. In non-smokers, they are the second leading cause of cancer death. Men are slightly more affected than women (incidence rate of 40 and 27 percent, respectively). It is essentially a cancer of middle age, nearly 85% of cases occurring after 65 years. Its frequency seems to increase.
  • the only classification used in preoperative classification is the TM whose 7 th version dates from 2010. From the data of the TNM classification, colon cancers are classified into 4 stages. The chances of recovery vary considerably from stage I to stage IV. The therapeutic strategy is also adapted to each of these stages.
  • the quantification provided in step b) of the prognostic method of the invention is carried out using computer software.
  • computer programs to measure the labeling of labeled virtual slides in immunohistochemistry we can mention: NIH Image, Visilog, Metamorph, Histolab, etc.
  • the parameterization of the image analysis software to enable identification and then counting of the cells or tissue structures is to be adapted to the staining techniques of the slides.
  • the settings have been set such that they can be used without modification between several colored slides according to the same technique, and such that a small amplitude modification of each of these settings induces only a slight modification. of the graph obtained (see Figure 6).
  • step b) of the prognostic method of the invention consists in sampling the density in cells and / or in blood vessels in a continuous set of rectangular zones of predefined width, said zones having for length the width of the zone of quantification, and scanning the quantization zone on either side of the tumor front, along the entire length of the quantization zone.
  • the computer software counts the elements to be measured (cells and / or vessels) in "slices" of the quantization zone, these "slices” having a predefined width of between 2 and 20 ⁇ , and preferably 5 ⁇ .
  • This sampling step is a conventional step for image processing analysis, and the only parameter to be defined is the width of the quantization slice.
  • the density to be quantified in step b) of the method of the invention is thus defined here as being the quantity, per unit area, of cells and / or blood vessels detected in these subsets of the quantization zone. .
  • the result of this quantization is expressed on a graph (see FIGS. 1C, 2C, 3C and 4).
  • This graph is preferably defined as follows: i) on the abscissa axis is the distance on either side of the point of the defined tumor front which is the intersection point of the mediators of the quantification rectangle, ii the ordinate is plotted the density in cells and / or blood vessels measured in each sampled area.
  • the abscissa axis of this graph is centered on the point of the tumor front which is at the intersection of the mediators of the quantization rectangle, and on either side the distance of the quantization slices relative to each other is reported. That much.
  • the "zero" of the x-axis can be defined either at one of the ends of the rectangle (in which case the graduations on this axis correspond to the distance of the slices from this extreme point, and it should be indicated on the graph in which position is the point of the tumor front, by a line or an arrow for example, see Figures 1C, 2C, 3C and 4A, B, C), or at the point of the tumor front (in which case the graduations on this axis will be relative values with respect to this central point).
  • Profile 1 Lymphocytes are abundant inside the tumor and also outside near the forehead. The further you get from the front, the more the infiltrate disappears.
  • Profile 2 Immune cells are concentrated with a peak just outside the tumor front. In the tumor there are only a few more cells than outside at a distance from the forehead
  • Profile 3 The immune cells are few and outside and inside the tumor, but there is a peak outside the tumor front. This peak is however very weak.
  • Profile 4 the curve has no peak, and the average cell density is very low on both sides of the tumor front.
  • the work of the present inventors made it possible to establish that the cell distribution obtained on the profiles 1 and 2 is associated with a significantly lower recurrence rate in patients operated on for stage II and stage III adenocarcinoma. Immunohistochemistry with CD3 seems to be the most effective marker. This marker is therefore preferred among all.
  • the present invention also provides a method of image processing a virtual slide obtained by microscopy, on which a tumor front is visualized, comprising the following steps: a) obtaining a virtual blade of a tissue section of a marked tumor by immunohistochemistry, on which a tumor front is identifiable, b) quantify on this virtual slide the density in cells and / or blood vessels located on both sides of the tumor front, in a rectangular continuous zone, and extending from on either side of the tumor front for a distance of at least 0.5 mm, c) express these results on a graph whose abscissa axis corresponds to the distance from the tumor front, and the ordinate the quantity of cells or of blood vessels measured at that distance in a rectangular area whose width along the abscissa is predefined and the length of which is the width of the rectangular area of quantification and d) Perform at least one of the following comparative operations: i) Compare the shape of the graph to a typical profile, or ii) Calculate the area under the graph for each pre
  • the quantization area mentioned in step b) of the image processing method of the invention is chosen such that: i) the mediators of the short side and the long side of this rectangle are respectively normal and the tangent to the tumor front at the point of intersection, and ii) the point of intersection of the mediators is said defined point on the tumor front.
  • the application further relates to the method of prognosis of the evolution of a solid tumor in an individual, comprising said steps a) to e) of the image processing method of the invention.
  • These cells are, for example, leukocytes such as T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, NK cells, dendritic cells, or subpopulations of these immune cells.
  • leukocytes such as T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, NK cells, dendritic cells, or subpopulations of these immune cells.
  • these cells are advantageously labeled by immunohistochemistry and are positive for CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3, and / or CD68 markers.
  • the cells are labeled with an anti-CD3 antibody and are CD3 + .
  • Tumors were collected from patients with colorectal adenocarcinoma of the colon and upper rectum operated at Ambroise Paré Hospital between January 1998 and December 2005.
  • the inclusion criteria were patients classified as stage II (T2 to T4, NO ).
  • the criteria for non-inclusion were the presence of lymph node invasion or distant metastasis, localization in the middle or lower rectum, perforated tumors, history of cancer, cancers developed on polyposis or Lynch syndrome, lost patients who died or who died in the month following surgery or who received adjuvant chemotherapy, and finally the patients for whom the resection was not microscopically complete (R1 or R2).
  • Stage II was chosen because it groups together patients with different prognoses and for whom the development of a discriminating prognostic factor would be of great interest.
  • Tumor samples from the patients were preserved in paraffin in the anatomic pathology laboratory.
  • the slides of each patient were read by an expert pathologist in digestive oncology to verify or complete the histological data studied and to select a paraffin block to achieve the IHC.
  • the block chosen in the latter case contained the tumor specimen with the largest tumor-environment interface peri-tumoral.
  • the blocks thus selected were cut with microtome Microm blade 3 ⁇ thick.
  • the slides were then stored in an oven at 60 ° C for 24 hours.
  • Immunohistochemistry was performed using a Bond Max automated Leica Microsystems single label, with the following antibodies:
  • T cell markers CD3 Pan T Cell, France Dako, dilution of l / 50th
  • the slides were scanned using a high resolution MIRAX DESK, Zeiss blade scanner.
  • the virtual slides obtained in MRX format constituted the working support of the image analysis software (VISILOG 6.0) developed by the company Noesis (Saclay, France).
  • An application of this software has been developed specifically to measure lymphocyte infiltration.
  • the cells of interest, marked, colored in brown are recognized during the analysis of the virtual slide.
  • Immunohistochemistry reveals the carrier elements of the antigen of interest in brown. Counterstaining with hematoxylin appears in blue, and allows better visualization of the various tissue and cell constituents.
  • the Visilog software separates each element of the virtual slide in a binary way according to their colors: red or blue.
  • the intensity of red and blue is represented by the software in a numeric value with no value ranging from 0 (stronger) to 255 (lighter). It is possible to set the detection thresholds of each element.
  • the red and blue thresholds range from 0 to 255. These settings are used to identify an element according to the intensity of its coloring. Indeed, a labeled lymphocyte has a cytoplasmic and / or membrane staining, and a nucleus which will remain weakly blue because of the absence of nuclear staining. This adjustment is made in such a way that the blue component of the nucleus of a labeled lymphocyte is neglected and that the marked lymphocyte is recognized as a red element. For FoxP3, the marking is nuclear. Red detection thresholds
  • the software will recognize the full range of red intensity.
  • the advantage of this setting is that all the red elements will be recognized, and that the detection sensitivity of the lymphocytes will be 100%
  • this setting will also take into account the background noise, which will reduce the specificity.
  • the very dark red areas correspond to immunohistochemical reactions of high intensity, therefore very specific lymphocytes of interest. It was therefore chosen to set the lower limit of the detection threshold of red to 0, that is to say to take into account the highest intensities. Tests were performed to determine the level of light red to take into account all the lymphocytes, but without background.
  • a virtual slide with a large tumor-peri-tumor area interface without detachment was chosen to determine the thresholds. 5 measurements were carried out consecutively while respecting an identical analysis surface. The length of the analysis was set at 1800 ⁇ . Each measurement differed only in the red upper detection limit, the lower limit being fixed to 0. With a red detection terminal greater than 100, the curves become superimposable and the detection threshold of the red is no longer a parameter. critical. The background noise appearing in very light red is detected by the software when the setting of the red upper detection terminal is beyond 210. The red detection terminals selected are therefore from 0 to 200.
  • the red detection terminals were therefore set at 0 Blue detection thresholds
  • Fixing the blue detection terminals is also essential. Indeed, for the software, all the elements recognized in blue are eliminated that is to say not counted. 8 measurements of an identical surface were made by varying the two blue detection terminals. The lymphocyte infiltrate density of the measured area was very low in the peri-tumor region and strong in the area from the tumor front to the tumor center. By ob- serving the curves corresponding to the different blue detection thresholds (see Figure 6), it appeared that the most representative curve of the lymphocyte infiltrate is that obtained with the limits of the blue set from 100 to 250.
  • lymphocyte density was measured in 50 randomly selected tumor samples. As a result of preliminary analyzes, 4 mm 2 analysis regions were chosen on either side of the tumor front (1 mm wide and 2 mm long on each side of the forehead), and counts were performed every 5 ⁇ . Each lymphocyte density was therefore calculated for a region of 500 ⁇ 2 and was associated with its distance from the tumor front. The maximum and minimum values measured were 98 and 726 CD3 + cells per mm 2 . The mean density / minimum density ratio measured in the tumors was 14.2 (range 2.5 - 55) and 31 (62%) tumors had a ratio greater than 6. Interestingly, for 26 tumors in the group with this high ratio (84% of these tumors), the density variation represented a Gaussian, whose peak was located between 400 ⁇ outside and 200 ⁇ inside the forehead. invasion of the tumor.
  • lymphocyte density is very heterogeneous within tumors and on both sides of the tumor front, so that it is not possible to establish a reliable prognosis on only one to a few measurements of densities in intra-tumor territories.
  • lymphocyte infiltrate of the peri-tumoral region at the center of the tumor was measured according to the technique described above for the first 20 patients of the cohort.
  • the 20 curves obtained were classified into subgroups according to the general profile of the curve with respect to the tumor front, that is to say the lymphocyte density variations from the periphery to the tumor center.
  • the criteria used to rank the profiles are:
  • Type 1 profile "Strong intratumoral infiltrate"
  • the lymphocyte density is increasing.
  • the average density is at least two times higher than the average density in the peritumoral region (see Figure 4C)
  • Type 2 profile "Peak of high lymphocyte density at the tumor front"
  • This peak is defined as a lymphocyte density at a given point in the analysis band greater than 3 times the average density of the peri-tumor region.
  • the curve has a lymphocyte density peak at a distance of less than 300 ⁇ m from the tumor extension front (see FIG. 4B). This peak is said to be strong because it exceeds the density of 6 lymphocytes detected over a length of 5 ⁇ for a width of ⁇ .
  • the threshold of 6 lymphocytes was defined only for the curves revealing lymphocytes positive for CD3 (this threshold is at 4 for CD8 + lymphocytes, at 2.5 for Foxp3 + lymphocytes and at 7 for CD45R0 + )
  • Type 3 profile "Low lymphocyte density peak at the tumor front"
  • the curve has a lymphocyte density peak at a distance of less than 300 ⁇ from the tumor extension front. This peak is said to be low because it remains below the density threshold of 6 lymphocytes detected over a length of 5 ⁇ for a width of ⁇ (see Figure 4A).
  • Type 4 Profile "Low Global Infiltrate"
  • the curve has no peak.
  • the average density of lymphocytes is below the threshold of 2 for CD3, and CD45R0, and 1 for Foxp3 and CD8.
  • lymphocyte infiltrate measurements do not differ in different measurement points of the same slide was tested as follows: 2 to 4 measurements were made on 5 consecutive slides depending on the size of the slide. the tumor-peri-tumor region interface. The curves obtained for each measurement were classified in type 1 to 4 according to the profiles described above. No difference in the type of curves was observed between the measurements of the same patient, as shown in FIGS. 7B, 8B and 9B.
  • the lymphotum test was also carried out after labeling the tumors of these 17 patients with anti-CD8, CD45RO and foxP3. These markers were also significantly associated with survival in univariate and multivariate analysis.
  • the CD3 lymphotum test was, however, slightly better.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de pronostic de l' évolution d'une tumeur solide chez un individu, comprenant au moins les étapes suivantes: a) réaliser une lame virtuelle à partir d'un échantillon tumoral, sur laquelle un front tumoral est identifiable, b) quantifier sur ladite lame virtuelle réalisée à l'étape a) la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents dans une zone continue recouvrant le front tumoral et s' étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, appelée « zone de quantification », et c) déduire de ladite quantification les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit patient. De préférence, les cellules à quantifier sont des leucocytes tels que les lymphocytes T, les lymphocytes B, les macrophages, les cellules NK, les cellules dendritiques, ou des sous-populations de ces cellules immunitaires.

Description

TEST PRONOSTIC DE L'EVOLUTION D'UNE TUMEUR SOLIDE PAR
ANALYSE D'IMAGES
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormalement importante au sein d'un tissu normal de l'organisme, de telle manière que la survie de ce dernier est menacée. Ces cellules dérivent toutes d'un même clone, cellule initiatrice du cancer qui a acquis certaines caractéristiques lui permettant de se diviser indéfiniment. Au cours de l'évolution de la maladie, certaines cellules peuvent former une tumeur maligne (un néoplasme) ou se propager à travers le corps et former des métastases.
Les facteurs de risques sont génétiques (mono- ou multigéniques) et environnementaux (alimentation, tabagisme, flore bactérienne, etc . ). Plusieurs types de cancers semblent en augmentation, pour des raisons environnementales ou de modes de vie, ainsi que - pour une partie des cas seulement - en raison du vieillissement de la population. Les taux de cancers détectés augmentent dans chaque tranche d'âge, une meilleure détection qu'autrefois ayant aussi un rôle dans cette augmentation.
En 2008, le cancer a causé la mort de 7,6 millions de personnes en 2008, surtout dans les pays en voie de développement, selon une étude du Centre international de recherche sur le cancer (CIRC, émanation de l'Organisation mondiale de la santé). En 2008, 56% des 12,7 millions de nouveaux cas de cancer et 63% des 7,6 millions de décès associés à un cancer dans le monde sont survenus dans les pays en développement. Les cancers les plus fréquemment diagnostiqués dans le monde sont ceux du poumon (12,7%), du sein (10,9%) et le cancer colorectal (9,7%). Les décès les plus fréquents sont provoqués par le cancer du poumon (18,2%), de l'estomac (9,7%>) et le cancer du foie (9,2%). Les cancers du col utérin et du foie sont beaucoup plus fréquents dans les régions en développement, tandis que ceux de la prostate et du côlon-rectum sont plus fréquents dans les régions développées. Même s'il existe plusieurs éléments permettant d'identifier un type de tumeur avec une grande probabilité, le diagnostic de la malignité d'une tumeur et le pronostic vital d'un patient ne se fait aujourd'hui que sur analyse au microscope (anatomopathologie) d'un échantillon de la tumeur. Cet échantillon vient soit d'une biopsie (simple prélèvement d'un morceau de la tumeur) qui peut être faite, suivant la localisation, suivant différentes procédures (fibroscopie, ponction à travers la peau...), soit d'une pièce opératoire (tumeur enlevée par le chirurgien). L'échantillon est le plus souvent fixé de manière appropriée et des coupes sont prélevées. Ces coupes peuvent être colorées par des traitements classiques d'histochimie et si besoin d'immunohistochimie afin de permettre au moins l'identification des différents types cellulaires et la délimitation du front tumoral.
Les observations d'un médecin spécialisé en anatomo-pathologie permet ensuite de classer l' échantillon tumoral selon des critères reconnus internationalement (la classification TNM), qui permettent d'estimer les chances de survie du patient qui porte (ou portait) cette tumeur.
La classification TNM permet de grouper les patients selon l'extension anatomique de leur maladie. Elle a pour but i) d'évaluer le pronostic, ii) de guider l'indication thérapeutique, et iii) de comparer l es résultats de différents protocoles thérapeutiques. Dans le système TNM défini par l'Union Internationale contre le Cancer (UICC), le code T réfère à la taille et l' extension locale de la tumeur primitive, le code N à l'atteinte éventuelle des ganglions (node en anglais), le code M aux métastases. Chaque lettre est affectée d'un coefficient. Le regroupement des trois codes définit des stades, caractéristiques de l'évolution probable de la tumeur.
La lettre T symbolise l'extension locale de la tumeur primitive. Elle est cotée de T0 (quand la lésion primitive n' est pas retrouvée) à T4 pour les tumeurs les plus étendues. Cette cotation dépend du volume tumoral, représenté par le diamètre maximum de la lésion et/ou de l'infiltration des tissus et organes voisins. La lettre N, de NO à N3, dépend du territoire ganglionnaire, plus ou moins proche de la tumeur, des dimensions des adénopathies, de leur nombre et/ou de leur éventuelle fixation aux tissus voisins. Enfin, la lettre M est cotée MO en l'absence de métastases connues ou Ml en leur présence, quel que soit leur siège, unique ou multiple.
Cette classification a été conçue pour donner aux cancérologues de tous les pays un langage commun qui facilite les échanges d' information entre médecins et chercheurs. Elle est périodiquement discutée et mise à jour par des spécialistes dans le cadre de l'UICC qui se charge de la diffuser dans le monde sous forme d'un Manuel explicatif. Elle contribue à codifier les indications de traitement. Selon les localisations tumorales la combinaison des trois repères TNM permet d'établir un stade (de I à IV) plus synthétique. Il existe cependant d'autres systèmes de classification, proposés par un institut ou à l'échelon d'un pays et de ses spécialistes, pour améliorer ou simplifier la caractérisation d'un cancer et le choix de traitement qui en découle. Par exemple, la classification anatomopathologique (ou pTNM) englobe des informations obtenues par l'examen pathologique de la tumeur primaire et des ganglions. Cependant, la classification TNM a ses limites, car il est souvent difficile d'évaluer le volume des masses tumorales par l 'imagerie (critère T), et l ' ampleur des envahissements microscopiques. Par ailleurs, l'analyse de l'échantillon tumoral prélevé est uniquement visuelle et requiert les compétences de l'homme du métier médecin anatomo-pathologiste spécialiste des tumeurs. Cette analyse est donc essentiellement subjective, et prend beaucoup de temps.
Il existe donc un besoin d'une méthode de pronostic rapide et objective (donc plus fiable) de la malignité des tumeurs solides et donc des risques de récidive chez ces patients. La méthode de pronostic de l'invention répond à ce besoin, en procurant une méthode objective d'évaluation du pronostic d'un cancer basée sur l'analyse d'une lame virtuelle par un logiciel informatique. La méthode de l'invention est donc plus fiable et plus rapide que les méthodes existantes pour évaluer le pronostic vital d'un patient portant une tumeur solide, notamment un cancer colorectal. Elle permet par ailleurs de compléter les méthodes actuelles afin de préciser le pronostic issu de la classification TNM. D'autres systèmes d'analyse d'images à visée pronostique ont été développés dans les dix dernières années. Par exemple, US 2004/0013292 décrit l'analyse de coupes de tumeurs en les segmentant en différentes régions. US 2003/0050553 et Rijken P. et al (Molecular Research, 1995) décrivent plus précisément des méthodes pour déterminer la densité de microvaisseaux présents dans des tumeurs. US 5,616,469 en déduit une méthode de pronostic de l'évolution d'une tumeur solide chez un individu.
Cependant, toutes ces méthodes se basent sur l'analyse d'images acquises au sein même des tumeurs, et non, comme le propose les présents Inventeurs, en comparaison avec la périphérie de celles-ci et en fonction de la distance par rapport au front d'extension tumoral. Or il a pu être démontré que Γ infiltrât des tumeurs par des lymphocytes est de densité extrêmement hétérogène au sein d'une même tumeur dans la majorité des cas, et que le pic maximal de densité est parfois situé à l'extérieur de la tumeur. Les Inventeurs ont également démontré que le principal facteur de variabilité de la densité lymphoïde était la position par rapport au front d'extension tumoral (cf. exemple 6 de la présente demande). C'est pourquoi la méthode proposée dans la présente demande se fonde sur la mesure de la nature et de la densité de l'infiltrat de part et d'autre du front tumoral.
Les avantages de la méthode proposée dans la présente demande par rapport à celles connues dans l'art antérieur sont nombreux: 1) la présente méthode intègre dans sa mesure le facteur principal de variation de la densité (c'est-à-dire la distance par rapport au front tumoral), 2) elle prend en compte l'infiltrat péri-tumoral, 3) le résultat obtenu (la classification des tumeurs en fonction des profils de graphiques obtenus) est de ce fait hautement reproductible.
De plus, dans un souci d'améliorer la rapidité de son exécution et sa fiabilité, la présente technique de comptage peut être complètement automatisée grâce à l'utilisation de lames virtuelles, de logiciels d'analyse d'image, et grâce à la standardisation des mesures exprimées sous forme de graphiques.
Des systèmes de quantification de lymphocytes infiltrant les tumeurs (TILs) ont par ailleurs été mis au point. Les lymphocytes étaient comptés soit sur coloration par ΗΕ (Jass et al, J Clin Pathol 1996), soit après immunohistochimie in situ. Les comptages étaient réalisés soit sur coupes entières (Pages, NEngl JMed 2005, Laghi Lancet Oncol, 2009) soit sur tissue arrays (Galon et al, Science 2006, Salama et al, J. Clin. Oncol. 2009), soit manuellement par un pathologiste (Prall. et al, Human Pathol. 2004), ou encore avec un logiciel d'analyse d'image. Le logiciel comptabilisait soit un pourcentage de surface marquée (Laghi et al, Lancet Oncol. 2009), soit des lymphocytes identifiés après segmentation des images (Salama et al, J. Clin. Oncol. 2009). Pour chaque tumeur, les études citées n'ont utilisé qu'une ou deux valeurs de densité pour la corrélation avec l'évolution clinique. Malgré le nombre de travaux réalisés, ces systèmes ne sont en pratique pas utilisés par les médecins, car ils se heurtent à des problèmes de reproductibilité due à la répartition hétérogène des TILs dans les tumeurs. Les résultats des présents inventeurs ont en effet démontré que la densité des TILs dépend de la position relative au front tumoral. Ainsi, les densités en TILs mesurées en quelques points dans la tumeur ne sont pas représentatives de l'infiltrat tumoral dans son entier et ces mesures sont peu fiables. A l'inverse, la présente invention propose de mesurer la répartition des TILs de façon continue, de part et d'autre du front tumoral.
Résumé de l'invention La présente invention concerne une méthode de pronostic de l'évolution d'une tumeur solide chez un individu, comprenant au moins les étapes suivantes: a) réaliser une lame virtuelle à partir d'un échantillon tumoral, sur laquelle un front tumoral est identifiable, b) quantifier sur ladite lame virtuelle réalisée à l'étape a) la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents dans une zone continue recouvrant le front tumoral et s'étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, appelée « zone de quantification », de préférence une zone rectangulaire, c) déduire de ladite quantification les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit patient.
Dans un mode de réalisation particulier, la zone de quantification rectangulaire est telle que: i) les médiatrices du petit côté et du grand côté de ce rectangle sont respectivement la normale et la tangente au front tumoral audit point d'intersection, et ii) le point d'intersection des médiatrices est un point du front tumoral. De préférence, l'étape a) consiste au moins à numériser et enregistrer une image de microscopie d'une coupe tissulaire marquée par immunohistochimie.
De préférence, l' étape b) de quantification est effectuée à l' aide d'un logiciel informatique et consiste à échantillonner la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins dans un ensemble continu de zones rectangulaires de largeur prédéfinie, lesdites zones ayant pour longueur la largeur de la zone de quantification, et balayant la zone de quantification de part et d'autre du front tumoral, sur toute la longueur de la zone de quantification.
De préférence, le résultat de ladite quantification est exprimé sur un graphique, dont l'analyse permet d'évaluer les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit patient.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit graphique est tel que : i) sur l'axe des abscisses est reportée la distance de part et d'autres du point du front tumoral, ii) en ordonnée est reportée la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins mesurée dans chaque zone échantillonnée. De préférence, l'évaluation desdits risques s'effectue : i) En comparant la forme dudit graphique à un profil type, ou ii) En calculant l'aire sous le graphique pour chaque zone pré- et post- front tumoral, et en la comparant à des valeurs-seuils, iii) En mesurant les pentes de variation en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral et les comparer à des valeurs-seuils, ou iv) En comparant les valeurs obtenues en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral à des valeurs-seuils. Plus précisément, la présente invention vise donc une méthode de pronostic de l'évolution d'une tumeur solide chez un individu, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir une lame virtuelle d'une coupe tissulaire d'une tumeur marquée par immunohistochimie, sur laquelle un front tumoral est identifiable, b) quantifier sur cette lame virtuelle la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents de part et d'autre du front tumoral, dans une zone continue rectangulaire s'étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, c) exprimer ces résultats sur un graphique dont l'axe des abscisses correspond à la distance par rapport au front tumoral, et en ordonnée la quantité de cellules ou de vaisseaux sanguins mesurée à cette distance dans une surface rectangulaire dont la largeur le long de l'abscisse est prédéfinie, et dont la longueur est la largeur de la zone rectangulaire de quantification, et d) Effectuer au moins une des opérations choisies parmi : i) Comparer la forme dudit graphique à un profil type, ou ii) Calculer l'aire sous le graphique pour chaque zone pré- et postfront tumoral, et la comparer à des valeurs-seuils, iii) Mesurer les pentes de variation en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral et les comparer à des valeurs-seuils, ou iv) comparer les valeurs obtenues en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral à des valeurs- seuils. e) déduire de l ' étape d) les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit individu.
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules à quantifier sont des leucocytes tels que les lymphocytes T, les lymphocytes B, les macrophages, les cellules NK, les cellules dendritiques, ou des sous-populations de ces cellules immunitaires.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, les cellules à quantifier sont marquées par immunohistochimie et sont positives pour les marqueurs CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3, CD68.
Légendes des figures
La figure 1 représente, sur une lame virtuelle représentant une coupe d'une tumeur colorectale marquée par immunohistochimie avec un anticorps anti-CD3 de sorte à marquer les cellules immunitaires d'intérêt (lymphocytes), le positionnement d'une zone de quantification rectangulaire de part et d'autre du front tumoral, utilisable dans la méthode de l'invention (A, avec, à gauche, la zone tumorale, et à droite le tissu non tumoral), la zone de quantification au sens de la présente invention, située de part et d'autre du front tumoral (B, le front tumoral étant identifié par une flèche noire), et enfin un graphique représentant la quantification automatique de la densité de cellules CD3 de part et d'autre du front tumoral dans la zone de quantification définie en A par analyse de l'image grâce au logiciel Visilog® (C).
La figure 2 représente, sur une lame virtuelle représentant une coupe d'une tumeur colorectale marquée par immunohistochimie avec un anticorps anti-CD3 de sorte à marquer les cellules immunitaires d'intérêt (A), le positionnement de trois zones de quantifications différentes de part et d'autre du front tumoral (B), et un graphique représentant la densité de cellules CD3+ de part et d'autre du front tumoral dans les différentes zones de quantification définies en B par analyse de l'image grâce au logiciel Visilog®. La figure 3 représente, sur une lame virtuelle représentant une coupe d'une tumeur colorectale marquée par immunohistochimie avec un anticorps anti-CD3 de sorte à marquer les cellules immunitaires d'intérêt (A), le positionnement de trois zones de quantifications différentes de part et d'autre du front tumoral (B), et un graphique représentant la densité de cellules CD3+ de part et d'autre du front tumoral dans les différentes zones de quantification définies en B par analyse de l'image grâce au logiciel Visilog® .
La figure 4 représente différents profils de graphiques obtenus à partir d'échantillons de tumeurs colorectales. Sur chacun des 3 graphes une courbe correspond à 1 patient. Les patients ont été regroupés en fonction du profil des courbes : A : profil 3, dit « faible », associé à un mauvais pronostic vital
B : profil 2, dit « pic fort », à l'extérieur de la tumeur, associé à un bon pronostic vital
C : profil 1, dit « infiltrât tumoral fort », associé à un bon pronostic vital
La figure 5 représente le front d'extension tumoral qui est aisément détectable dans la grande majorité des cas (quelle que soit la coloration), mais qui peut parfois être dépassé par des phénomènes de bourgeonnement tumoral (budding) . Le s photographies ont été réalisées après un double marquarge en immunohistochimie, avec la tumeur en rouge (anti-cytokératine AE1/AE3) et les lymphocytes en marron (anti-CD3).
A : Sur cette tumeur, le front tumoral (c'est-à-dire l'interface entre les zones rouges et non rouges) est aisément repérable. On détecte au plus fort grossissement (image de droite) de nombreux lymphocytes positifs pour CD 3 à l' extérieur et à l'intérieur de la tumeur.
B : Sur cette autre tumeur, le front tumoral est également aisément repérable. On détecte au plus fort grossissement (image de droite) que peu de lymphocytes sont positifs pour CD3. C. Sur cette troisième tumeur, le front tumoral est défini par les plus larges amas tumoraux compacts (délimités par un trait noir au centre). On détecte au plus fort grossissement (image la plus à droite), outre 2 plus petits amas tumoraux, de nombreuses cellules tumorales isolées. Sur cette coupe, les lymphocytes CD3 positifs sont nombreux. La figure 6 présente deux courbes-test obtenues en faisant varier les bornes de détection du rouge (A) ou du bleu (B) pour un même échantillon, dans un même rectangle de quantification (voir point 5 de la partie expérimentale). Les seuils et les réglages préférés pour la détection des deux couleurs ont été établis à partir de ces courbes étalons. La figure 7 illustre le profil type 1 dit « infiltrât tumoral fort » : pour un même échantillon de tumeur colorectale (un même patient), trois zones de quantifications différentes ont été utilisées (mesures 1 , 2 et 3 sur image A) puis la présence de l'infiltrat lymphocytaire (cellules positives pour CD3) dans chaque zone a été quantifiée grâce à la méthode de l 'invention puis représentée sous forme de graphique (B).
La figure 8 illustre le profil type 4 dit « infiltrât faible » : pour un même échantillon de tumeur colorectale (un même patient), deux zones de quantifications différentes ont été utilisées (mesures 1 et 2) sur image A) puis la présence de l 'infiltrat lymphocytaire (cellules positives pour CD3) dans chaque zone a été quantifiée grâce à la méthode de l'invention puis représentée sous forme de graphique (B).
La figure 9 illustre le profil type 2 dit « pic fort » : pour un même échantillon de tumeur colorectale (un même patient), trois zones de quantifications ont été différentes utilisées (mesures 1, 2 et 3 sur image A) puis la présence de l'infiltrat lymphocytaire (cellules positives pour CD3) dans chaque zone a été quantifiée grâce à la méthode de l'invention puis représentée sous forme de graphique (B).
La figure 10 représente la courbe de survie de Kaplan-Meyer des patients entre la date de diagnostic de leur cancer et la détection des métastases dans les poumons ou le foie en fonction de leur profil mesuré selon la méthode de l'invention.
Description détaillée de Γ invention
La méthode de pronostic de l'invention est réalisée ex vivo et permet d'évaluer les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti- tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez un patient auquel tout ou partie d'une tumeur a été prélevé.
Elle comprend au moins les étapes suivantes : a) réaliser une lame virtuelle à partir d'un échantillon tumoral, sur laquelle un front tumoral, est identifiable, b) quantifier sur ladite lame virtuelle réalisée à l'étape a) la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents dans une zone continue recouvrant le front tumoral et s'étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, appelée « zone de quantification », c) déduire de ladite quantification les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit patient. Au sens de la présente invention, on entend par « lame virtuelle » une image numérique d'un échantillon de tissu fixé sur une lame de verre. Pour que cette lame virtuelle offre la même résolution que l'on peut obtenir en regardant dans l'oculaire d'un microscope, des milliers d'images de l'échantillon fournies par l'obj ectif du microscope à un agrandissement suffisant sont acquises de manière sérielle, puis réarrangées, pour reconstruire totalement l'échantillon. Trois étapes sont nécessaires pour réaliser une lame virtuelle :
1) focalisation : à une position donnée (repérée par ses coordonnées en X et Y), l'échantillon est déplacé en hauteur (direction Z), jusqu'à ce que le programme de balayage décide que l'image fournie par l'objectif est aussi nette que possible.
2) Numérisation de l'image : le capteur d'image numérique acquiert la photographie et la stocke sur le disque dur de l'ordinateur, avec ses informations en X et Y
3) Déplacement de l'échantillon : déplacer l ' échantillon dans les directions X et Y à la position suivante, de sorte que la prochaine image puisse être précisément localisée par rapport aux autres images.
Les techniques d'acquisition de lames virtuelles sont désormais bien connues de l 'homme du métier. De nombreuses sociétés proposent des logiciels ou des plateformes microscopiques capables de générer de telles lames à partir de scanner de lames (exemples : scanner de lames Mirax, Aperio, Hamamatsu et Leica) ou de microscopes.
Ces lames virtuelles présentent de nombreux avantages en comparaison avec les lames réelles (« classiques ») portant les échantillons : d'une part, la qualité d'une lame virtuelle ne peut pas s'altérer au cours du temps. D'autre part, l'analyse des lames peut s'effectuer à tout moment, et à distance, puisque les lames virtuelles peuvent être partagées, envoyées, et consultées par tous ceux qui le souhaitent, au moyen d'un ordinateur simplement muni d'un logiciel de lecture d'image. De nombreux logiciels de lecture d'image sont connus et utilisés en routine dans les laboratoires : NIH Image, Visilog, Metamorph, Histolab, etc ..
L'échantillon tumoral que l' on peut utiliser pour établir un pronostic selon la méthode de l'invention est prélevé chez un patient qui a subi une biopsie ou une opération chirurgicale, puis traité de sorte à pouvoir être coupé en minces tranches par un microtome. Ce traitement consiste à fixer les constituants de l'échantillon les uns par rapport aux autres, de sorte à solidifier l'ensemble et permettre la découpe. Les techniques communément utilisées pour ce traitement dans les laboratoires sont notamment : la fixation dans du formol (ou d'autres fixateurs) ou la cryo- préservation. Après la découpe, les minces tranches d'échantillon tumoral sont déposées sur des lames, puis traités par les techniques très répandues d'histologie, histochimie et/ou immunohistochimie de sorte à révéler : les différents types tissulaires, cellulaires, les vaisseaux sanguins, le front tumoral, la densité cellulaire, etc..
Avantageusement, la méthode de pronostic selon l'invention est donc caractérisée en ce que l'étape a) consiste à au moins à numériser et enregistrer une image de microscopie d'une coupe tissulaire marquée par immunohistochimie.
Au sens de la présente invention, on entend par « front tumoral » la limite entre le tissu tumoral et le tissu non tumoral. Dans la grande maj orité des tumeurs, et notamment dans les carcinomes, cette limite est facilement identifiable avec des colorations usuelles histologiques ou immunohistochimique. Au-delà (à l'extérieur) du front tumoral il peut exister, dans certaines tumeurs, quelques cellules ou microamas cellulaires isolées correspondant à un phénomène de bourgeonnement (budding) tumoral (cf. figure 5C).
Par ailleurs, dans la zone de quantification définie dans la méthode de l'invention, le front tumoral doit être assimilable à un arc de cercle dont le centre est situé à l'intérieur de la tumeur, qui correspond au lissage de la zone d'interface entre la tumeur et les tissus non tumoraux. En d'autres termes, dans la méthode de l'invention, la zone de quantification est choisie de façon particulière, de telle sorte qu'elle recouvre un front tumoral qui a une courbure aussi régulière que possible, c'est-à-dire un front ayant une courbure telle qu'une tangente puisse être tracée en au moins un point de ce front. La zone de quantification de l'invention doit contenir le front tumoral et doit s'étendre de part et d'autre de celui-ci sur une distance au moins égale à 0,3 mm, de préférence 0,5 mm, de manière encore plus préférée au moins égale à 0,6 mm. Cette zone peut avoir n'importe quelle forme du moment qu'elle est continue (c'est-à-dire qu'il est possible de relier deux points quelconques de la zone sans en sortir). De telles zones continues sont par exemple les cercles, les triangles, les losanges, les carrés, les rectangles, etc.
De préférence, la zone de quantification est rectangulaire, et sélectionnée de la façon suivante : premièrement, une partie régulière du front tumoral est identifiée sur la lame virtuelle (on entend par « partie régulière du front tumoral » une interface tumeur/stroma qui est assimilable à un arc de cercle dont le centre est situé à l'intérieur de la tumeur). Deuxièmement, on définit un point sur cette partie régulière du front tumoral, pour lequel on trace la tangente au front tumoral, ainsi que la normale au front tumoral passant par ce point. Enfin, la zone de quantification est choisie de façon telle que : i) les médiatrices du petit côté et du grand côté de ce rectangle sont respectivement la normale et la tangente au front tumoral audit point d'intersection, et ii) le point d'intersection des médiatrices est ledit point défini sur le front tumoral. Des exemples de zones de quantification utilisables dans la méthode de l'invention sont présentés dans les figures de la demande (cf. figures 1,2 et 3). Dans la méthode de l'invention, la médiatrice du petit côté doit s'étendre de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0,3 mm, de préférence 0,5 mm, de manière encore plus préférée au moins égale à 0,6 mm.
De manière préférée, la zone de quantification a une surface de 2 mm2, de manière encore plus préférée de 3 mm2. De manière préférée, lorsque la zone de quantification est un rectangle, la longueur dudit rectangle est au moins de 0,6 mm, et la largeur dudit rectangle est au moins 0,2 mm.
La deuxième étape (étape b) de la méthode de pronostic selon l'invention consiste à quantifier, dans la zone de quantification sélectionnée de la façon décrite ci-dessus, la densité d'un élément tissulaire (vaisseaux, fibres de collagène, ... ) ou cellulaire (lymphocyte, macrophage, ...) identifiable par sa forme, sa taille et/ou sa coloration, mesurée de part et d'autre du front tumoral.
La densité est ici définie comme étant la quantité d'élément mesurée, rapportée à une unité de surface, par exemple le mm2 ou le μπι2. De préférence, la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents dans la zone de quantification (telle que définie ci-dessus) est mesurée. De manière encore plus préférée, la densité en certaines cellules du système immunitaire, présentes dans ladite zone ou dans des sous-ensembles de ladite zone, est mesurée. Ces cellules sont par exemple les leucocytes tels que les lymphocytes T, les lymphocytes B, les macrophages, les cellules NK, les cellules dendritiques, ou des sous-populations de ces cellules immunitaires.
Selon la méthode de l'invention, ces cellules sont avantageusement marquées par immunohistochimie et sont positives pour les marqueurs CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3, et/ou CD68. De manière préférée, les cellules étudiées sont positives pour le marqueur CD3 (CD3+).
Le marqueur CD3 (ou « cluster de différenciation 3 ») caractérise les lymphocytes T. Ce complexe protéique membranaire bien connu est constitué de 4 chaînes différentes. Chez les mammifères, ce complexe est formé par une chaîne CD3y, une chaîne CD35 et deux chaînes CD3s. Ces protéines transmembranaires s'associent avec le récepteur des cellules T (TCR) et une chaîne ζ pour former le "complexe TCR" et générer le signal d'activation des lymphocytes T.
Le marquage immunohistochimique est révélé par un substrat de la péroxydase (diaminobenzidine) dans les exemples indiqués, mais il est possible d'utiliser un autre substrat coloré ou une autre enzyme (phosphatase alcaline) ou un substrat fluorescent, ou même une combinaison de ces méthodes.
En effet, de nombreuses études ont clairement établi que le système immunitaire est fortement impliqué dans le contrôle des tumeurs et que la densité de l'infiltrat immunitaire au sein des tumeurs est souvent associée à un bon pronostic vital des patients opérés d'une tumeur solide (Naito Y et al, Cancer Research 1998, Uppaluri R et al, Cancer immunity 2008, Salama P et al, Journal of clinical Oncology 2009, Galon J, et al, Science 2006, Badoual et al, Clinical Cancer Research, 2006).
A ce suj et, il est à noter que les techniques de quantification de ces cellules immunitaires (lymphocytes T, T régulateurs, etc.) dans les études réalisées jusqu'à présent consistaient à comparer le nombre de cellules immunitaires présent dans des zones tumorales de surface variable (spots de TMA (tissue-microarrays) ou champs au fort grossissement de microscopes). Ces zones étaient le plus souvent choisies soit de façon aléatoire, soit sans méthodologie clairement décrite concernant notamment la position et la surface des zones de comptage. Les travaux de l'équipe de J. Galon ont distingués les infiltrats au front et à l'intérieur de la tumeur, mais n'indique pas si les prélèvements du front sont situés à l'intérieur ou au contraire à l'extérieur de la tumeur. Les comptages réalisés sur des spot complets de TMA (généralement 0.6 mm de diamètre), sont trop étendus pour permettre de faire apparaître un pic, et une faible variation de la position de la carotte de TMA peut être responsable d'une importante variation de mesure. Bien que l'information concernant la présence et le nombre de cellules immunitaires au sein ou en périphérie des tumeurs soit reconnue comme étant un indice pronostic très fiable du risque de récidive de la tumeur, aucune étude n'a jusqu'ici proposé d'établir un profil objectif et continu du nombre de cellules immunitaires autour du front tumoral. Une particularité importante de la méthode de l'invention est de réaliser plusieurs (c'est-à-dire plus de 3, et de préférence plus de 4) mesures de densités dont chacune est associée à la position par rapport au front tumoral.
D'autre part, la méthode de l'invention peut être également très fiable en quantifiant le nombre de vaisseaux sanguins traversant la zone de quantification, ces vaisseaux pouvant être marqués par immunohistochimie, par exemple en révélant les marqueurs CD34 ou CD31 (Couvelard et al, Br J Cancer 2005 ; Couvelard et al, Mod. Pathol. 2009).
De manière préférée, la tumeur solide dont on cherche à évaluer le pronostic est un cancer du colon ou un cancer du rectum. Le cancer du côlon se développe à partir de la muqueuse du « gros intestin » ou côlon. Les cancers du côlon et du rectum étant assez semblables, on les regroupe sous le terme de « cancer colorectal ». Il s'agit toujours d'une tumeur maligne. C'est le second cancer, en termes de fréquence, chez la femme (après le cancer du sein) et le troisième chez l'homme (après le cancer du poumon et celui de la prostate). Les cancers coliques ont une fréquence élevée en France : chaque jour, 100 personnes apprennent qu'elles ont un cancer colorectal. Chez les non-fumeurs, ils sont la deuxième cause de mortalité par cancer. Les hommes sont un peu plus touchés que les femmes (taux d'incidence de 40 et 27 pour cent-mille, respectivement). Il s'agit essentiellement d'un cancer de l'âge mûr, près de 85 % des cas survenant après 65 ans. Sa fréquence semble augmenter.
La seule classification utilisée en préopératoire est la classification T M dont la 7eme version date de 2010. A partir des données de la classification TNM, les cancers du côlon sont classés en 4 stades. Les chances de guérison varient considérablement du stade I au stade IV. La stratégie thérapeutique est également adaptée à chacun de ces stades.
En ce qui concerne les tumeurs colorectales, la densité en cellules T (T mémoire, T régulateur, et/ou T CD8+), a souvent été associée à un bon pronostic (Galon J, et al, Science 2006, Salama P et al, J. Clinical Oncol 2009, Pagès F et al, N. Engl. J.Med 2005). De préférence, la quantification prévue à l'étape b) de la méthode pronostique de l'invention est effectuée à l'aide d'un logiciel informatique. Il existe de nombreux logiciels informatiques permettant de mesurer le marquage de lames virtuelles marquées en immunohistochimie. Parmi eux on peut citer : NIH Image, Visilog, Metamorph, Histolab, etc. En réglant de façon adéquate les seuils et les paramètres des marquages à étudier, la quantité précise de cellules marquées présentes dans la zone de quantification est évaluée.
Le paramétrage du logiciel d'analyse d'image pour permettre l'identification puis le comptage des cellules ou des structures tissulaires est à adapter aux techniques de coloration des lames. Dans les exemples présentés, les réglages ont été fixés tels qu'ils puissent être utilisés sans modification entre plusieurs lames colorées selon la même technique, et tels qu'une modification de faible amplitude de chacun de ces réglages n'induit qu'une faible modification du graphe obtenu (cf. figure 6).
Avantageusement, l'étape b) de la méthode pronostique de l'invention consiste à échantillonner la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins dans un ensemble continu de zones rectangulaires de largeur prédéfinie, lesdites zones ayant pour longueur la largeur de la zone de quantification, et balayant la zone de quantification de part et d'autre du front tumoral, sur toute la longueur de la zone de quantification.
Dans ce cas précis, le logiciel informatique comptabilise les éléments à mesurer (cellules et/ou vaisseaux) dans des « tranches » de la zone de quantification, ces « tranches » ayant une largeur prédéfinie, comprise entre 2 et 20 μπι, et de préférence 5 μπι. Cette étape d'échantillonnage est une étape classique pour les analyses de traitement d'image, et le seul paramètre à définir est la largeur de la tranche de quantification. La densité à quantifier dans l'étape b) de la méthode de l'invention est donc ici définie comme étant la quantité, par unité de surface, de cellules et/ou de vaisseaux sanguins détectés dans ces sous-ensembles de la zone de quantification.
De manière préférée, le résultat de cette quantification est exprimé sur un graphique (cf. figures 1C, 2C, 3C et 4). Ce graphique est défini de préférence de la façon suivante : i) sur l'axe des abscisses est reportée la distance de part et d'autre du point du front tumoral défini qui est le point d'intersection des médiatrices du rectangle de quantification, ii) en ordonnée est reportée la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins mesurée dans chaque zone échantillonnée.
De manière préférée, l'axe des abscisses de ce graphique est centré sur le point du front tumoral qui est à l'intersection des médiatrices du rectangle de quantification, et de part et d'autre est reportée la distance des tranches de quantification par rapport à ce point.
Le « zéro » de l'axe des abscisses peut être défini : soit à l'une des extrémités du rectangle (auquel cas les graduations sur cet axe correspondent à la distance des tranches par rapport à ce point extrême, et il convient d'indiquer sur le graphique en quelle position se situe le point du front tumoral, par un trait ou une flèche par exemple, cf. figures 1C, 2C, 3C et 4 A,B,C), soit au point du front tumoral (auquel cas les graduations sur cet axe seront des valeurs relatives par rapport à ce point central).
Ces graphiques permettent donc de visualiser rapidement la répartition des cellules et/ou vaisseaux autour du front tumoral. Quatre profils distincts intéressants et prédictifs de la survie du patient portant la tumeur ont été identifiés par les présents Inventeurs:
Profil 1 : Les lymphocytes sont abondants à l'intérieur de la tumeur et également à l'extérieur à proximité du front. Plus on s'éloigne du front, plus l'infiltrat disparait. Profil 2 : les cellules immunitaires sont concentrées avec un pic situé juste à l'extérieur du front tumoral. Dans la tumeur il n'y a qu' à peine plus de cellules qu'à l'extérieur à distance du front
Profil 3 : les cellules immunitaires sont peu nombreuses et à l'extérieur et à l'intérieur de la tumeur, mais on distingue un pic à l'extérieur du front tumoral. Ce pic est cependant très faible.
Profil 4 : la courbe ne présente aucun pic, et la densité moyenne de cellules est très faible de part et d'autre du front tumoral.
Des exemples de tels profils sont fournis sur les figures 4 A (profil 3), B (profil 2), et C (profil 1).
Les présents Inventeurs ont pu démontrer que ces profils sont reproductibles au sein au sein d'une même tumeur, c'est-à-dire indépendant de la zone analyse et de l'opérateur (cf. figures 7, 8 et 9).
Ils ont également démontré qu'à ces différents types de graphique sont associés un pronostic plus ou moins bon et qu'il suffit donc d'établir ce graphique pour améliorer l' évaluation des risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez un patient auquel tout ou partie d'une tumeur a été prélevé.
Plus précisément, les travaux des présents Inventeurs ont permis d'établir que la répartition cellulaire obtenue sur les profils 1 et 2 est associée à un taux de récidive significativement plus faible chez les patients opérés pour un adénocarcinome de stade II et de stade III. L'immunohistochimie avec le CD3 parait être le marqueur le plus performant. Ce marqueur est donc préféré entre tous.
Il est donc possible d'obtenir un pronostic rapide, objectif et fiable de la survenue de métastases ou de la survie d'un patient atteint d'une tumeur grâce à la méthode de l'invention en comparant la forme dudit graphique à un profil type tel que défini ci- dessus, ou en calculant l'aire sous le graphique pour chaque zone pré- et post- front tumoral, et en la comparant à des valeurs- seuil s, ou en mesurant les pentes de variation en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral et les comparer à des valeurs-seuils, ou encore en comparant les valeurs obtenues en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral à des valeurs-seuils.
La présente invention vise également un procédé de traitement d'image d'une lame virtuelle obtenue par microscopie, sur laquelle un front tumoral est visualisé, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir une lame virtuelle d'une coupe tissulaire d'une tumeur marquée par immunohistochimie, sur laquelle un front tumoral est identifiable, b) quantifier sur cette lame virtuelle la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins situés de part et d' autre du front tumoral, dans une zone continue rectangulaire, et s' étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, c) exprimer ces résultats sur un graphique dont l'axe des abscisses correspond à la distance par rapport au front tumoral, et en ordonnée la quantité de cellules ou de vaisseaux sanguins mesurée à cette distance dans une surface rectangulaire dont la largeur le long de l'abscisse est prédéfinie, et dont la longueur est la largeur de la zone rectangulaire de quantification, et d) Effectuer au moins une des opérations comparatives suivantes : i) Comparer la forme dudit graphique à un profil type, ou ii) Calculer l'aire sous le graphique pour chaque zone pré- et postfront tumoral, et la comparer à des valeurs-seuils, iii) Mesurer les pentes de variation en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral et les comparer à des valeurs-seuils, ou iv) Comparer les valeurs obtenues en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral à des valeurs- seuils. e) Estimer le risque de rechute postopératoire et/ou le risque de développer des métastases du patient à qui la tumeur étudiée sur la lame virtuelle a été prélevée.
De préférence, la zone de quantification mentionnée à l' étape b) du procédé de traitement d'image de l'invention est choisie de façon telle que : i) les médiatrices du petit côté et du grand côté de ce rectangle sont respectivement la normale et la tangente au front tumoral audit point d'intersection, et ii) le point d'intersection des médiatrices est ledit point défini sur le front tumoral.
La demande vise en outre la méthode de pronostic de l'évolution d'une tumeur solide chez un individu, comprenant lesdites étapes a) à e) du procédé de traitement d'image de l'invention.
Les profils types y sont définis comme indiqué plus haut.
De préférence, c'est la densité en certaines cellules du système immunitaire présentes dans ladite zone ou dans des sous-ensembles de ladite zone de quantification, qui est mesurée. Ces cellules sont par exemple les leucocytes tels que les lymphocytes T, les lymphocytes B, les macrophages, les cellules NK, les cellules dendritiques, ou des sous-populations de ces cellules immunitaires. Ces cellules sont avantageusement marquées par immunohistochimie et sont positives pour les marqueurs CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3, et/ou CD68. De manière préférée, les cellules sont marquées avec un anticorps anti-CD3 et sont CD3+. EXEMPLES :
1. Cohortes :
Les tumeurs ont été prélevées chez des patients porteurs d' adénocarcinomes colorectaux du colon et du haut rectum opérés à l'hôpital Ambroise Paré entre janvier 1998 et décembre 2005. Les critères d'inclusion étaient les patients classés stade II (T2 à T4, NO). Les critères de non inclusion étaient la présence d'un envahissement ganglionnaire ou de métastase à distance, la localisation au moyen ou au bas rectum, les tumeurs perforées, les antécédents de cancer, les cancers développés sur polypose ou syndrome de Lynch, les patients perdus de vue ou décédés dans le mois suivant l'intervention ou ayant reçu une chimiothérapie adj uvante et enfin l es pati ents pour lesquelles la résecti on n ' était pas microscopiquement complète (RI ou R2). Le stade II a été choisi car il regroupe des patients avec des pronostics différents et pour lesquels la mise au point d'un facteur pronostique discriminant serait d'un grand intérêt.
78 p ati ents ont été i n clu s s el on c e s critère s . T oute s l e s donn é e s anatomopathologiques (cl assificati on TNM, emb oles vasculaires veineux, engainement périnerveux, nombre de ganglions examinés, budding) ont été consignées dans une base de données APIX déclarée. Les données cliniques étaient disponibles dans le dossier clinique informatisé FSD.
39 autres patients atteints d'adénocarcinomes colorectaux du colon et du haut rectum au stade III et ayant reçus après la résection chirurgicale complète une chimiothérapie adjuvante ont également été analysés.
2. Autres types de cancer étudiés :
Outre les tumeurs colorectales mentionnées ci-dessus, d'autres tumeurs ont été également étudiées afin de valider l'intérêt de la méthode de l'invention sur une grande variété de tumeurs. Ainsi, la méthode de l'invention a été testée sur des carcinomes urothélial vésical (n = 5), des adénocarcinomes pancréatiques (n = 5), des carcinomes rénaux à cellules claires (n = 5), et des mélanomes nodulaires invasifs cutanés (n = 10). 3. Prélèvement, découpe, traitement et coloration des échantillons tumoraux
Les échantillons tumoraux des patients ont été conservés en paraffine au sein du laboratoire d'anatomo-pathologie. Les lames de chaque patient ont été relues par un anatomopathologiste expert en oncologie digestive afin de vérifier ou de compléter les données histologiques étudiées et afin de sélectionner un bloc de paraffine permettant de réaliser l'IHC. Le bloc choisi dans ce dernier cas contenait le prélèvement tumoral présentant la plus grande interface tumeur-environnement péri- tumoral. Les blocs ainsi sélectionnés ont été coupés au microtome Microm en lame de 3 μιη d'épaisseur. Les lames ont ensuite été conservées dans une étuve à 60°C pendant 24 heures.
L'immunohistochimie (IHC) a été réalisée à l'aide d'un automate Bond Max, Leica Microsystems en simple marquage, avec les anticorps suivants:
- anticorps monoclonal anti-CD3 (marqueurs des lymphocytes T : CD3 Pan T Cell, Dako France, dilution au l/50ème)
- anticorps monoclonal anti-CD 8 (marqueurs des lymphocytes T cytotoxiques : CD 8 Pan T Cell, Dako France, dilution l/25ème)
- anticorps monoclonal anti-CD45R0 (marqueurs des lymphocytes mémoires : Dakocytomation, dilution l/400eme)
- anticorps monoclonal anti-Foxp3 (marqueurs des lymphocytes T régulateurs : Abcam, dilution l/100ème)
Ces 4 anticorps ont été retenus dans cette étude car ce sont les seuls anticorps mentionnés dans la littérature pour lesquels un impact pronostic a été démontré. Tous les anticorps primaires ont été révélés avec le kit Bond Polymer Refine Détection (Leica, Biosystems, Newcastle Ltd), dans l'automate Bond-Max (Leica).
4. Analyse d'image
Les lames ont été scannées à l'aide d'un scanner de lame haute résolution MIRAX DESK, Zeiss. Les lames virtuelles obtenues dans un format MRX ont constitué le support de travail du logiciel d'analyse d'image (VISILOG 6.0) mis au point par la société Noesis (Saclay, France). Une application de ce logiciel a été développée spécifiquement pour mesurer l'infiltration lymphocytaire. Les cellules d'intérêt, marquées, colorées en marron sont reconnues lors de l'analyse de la lame virtuelle. On dispose d'une surface rectangulaire aux dimensions variables au sein de laquelle les lymphocytes marquées seront comptabilisées. 5. Réglages des contrastes : détermination des seuillages critiques de détection du bleu et du rouge
L'immunohistochimie fait apparaître les éléments porteurs de l'antigène d'intérêt en marron. La contre-coloration à l'hematoxyline apparaît en bleu, et permet de mieux visualiser les différents constituants tissulaires et cellulaires. Le logiciel Visilog sépare chaque élément de la lame virtuelle de manière binaire en fonction de leurs couleurs: rouge ou bleu.
L'intensité de rouge et de bleu est représentée par le logiciel en une grandeur numérique sans valeur allant de 0 (plus forte) à 255 (plus clair). Il est possible de régler les seuils de détection de chaque élément. Les bornes du seuillage rouge et bleu vont de 0 à 255. Ces réglages permettent d'identifier un élément en fonction de l'intensité de sa coloration. En effet, un lymphocyte marqué présente un marquage cytoplasmique et/ou membranaire, et un noyau qui restera faiblement bleu en raison de l'absence de marquage nucléaire. Ce réglage est fait de telle manière à ce que la composante bleue du noyau d'un lymphocyte marqué soit négligée et que le lymphocyte marqué soit reconnu comme un élément rouge. Pour FoxP3, le marquage est nucléaire. Les seuils de détection du rouge
Si on fixe les paramètres de détection de la couleur rouge de 0 à 255, le logiciel reconnaîtra toute la gamme d'intensité des rouges. L'avantage de ce réglage est que tous les éléments rouges seront reconnus, et que la sensibilité de détection des lymphocytes sera de 100% L'inconvénient est que ce réglage prendra également en compte le bruit de fond, ce qui fera baisser la spécificité. Les zones rouges très foncées correspondent à des réactions immunohistochimiques de forte intensité, donc très spécifiques des lymphocytes d'intérêt. Il a donc été choisi de fixer la borne inférieure du seuil de détection du rouge à 0, c'est-à-dire à prendre en compte les intensités les plus fortes. Des tests ont été réalisés pour déterminer le niveau de rouge clair permettant de prendre en compte tous les lymphocytes, mais sans bruit de fond.
Une lame virtuelle présentant une large interface tumeur-zone péri-tumorale sans décollement a été choisie pour déterminer les seuils. 5 mesures ont été réalisées de manière consécutive en respectant une surface d'analyse identique. La longueur de l' analyse était fixée à 1800 μπι. Chaque mesure ne différait que par la borne supérieure de détection du rouge, la borne inférieure étant fixée à 0. Avec une borne de détection du rouge supérieure à 100, les courbes deviennent superposables et le seuil de détection du rouge n'est plus un paramètre critique. Le bruit de fond apparaissant en rouge très clair est détecté par le logiciel lorsque le réglage de la borne supérieure de détection du rouge est au-delà de 210. Les bornes de détection du rouge retenues sont donc de 0 à 200.
Pour l'ensemble de l'étude, les bornes de détection du rouge ont donc été fixées de 0 Les seuils de détection du bleu
Fixer les bornes de détection du bleu est également indispensable. En effet, pour le logiciel, tous les éléments reconnus en bleu sont éliminés c'est-à-dire non comptabilisés. 8 mesures d'une surface identique ont été réalisées en faisant varier les deux bornes de détection du bleu. La densité de infiltrât lymphocytaire de la zone mesurée était très faible dans la région péri-tumorale et forte dans la région allant du front tumoral vers le centre tumoral . En ob servant les courbes correspondant aux différents seuillages de détection du bleu (voir la figure 6), il est apparu que la courbe la plus représentative de l'infiltrat lymphocytaire est celle obtenue avec les bornes du bleu fixées de 100 à 250.
Toutes les mesures de la suite de l'étude ont donc été faites avec les bornes de détection du rouge et du bleu respectivement fixées à 0 - 180 et à 100 - 250.
6. Analyse de la densité lymphocytaire au sein des tumeurs
Pour évaluer la densité lymphocytaire, la densité en lymphocytes a été mesurée sur 50 échantillons de tumeurs choisis au hasard. Par suite d'analyses préliminaires, des régions d'analyse de 4 mm2 ont été choisies de part et d'autre du front tumoral (région de 1 mm de large et de 2 mm de long de chaque côté du front), et les dénombrements ont été réalisés tous les 5 μπι. Chaque densité lymphocytaire a donc été calculée pour une région de 500 μπι2 et a été associée à sa distance par rapport au front tumoral. Les valeurs maximales et minimales mesurées étaient de 98 et 726 cellules CD3+ par mm2. La moyenne du rapport densité maximale / densité minimale mesurée au sein des tumeurs était de 14.2 (gamme 2,5 - 55) et 31 (62%) tumeurs ont présenté un rapport supérieur à 6. De façon intéressante, pour 26 tumeurs du groupe présentant ce rapport élevé (soit pour 84% de ces tumeurs), la variation densitaire représentait une Gaussienne, dont le pic était localisé entre 400μιη à l' extérieur et 200 μιη à l'intérieur du front d'invasion de la tumeur.
Ces résultats permettent de démontrer que la densité lymphocytaire est très hétérogène au sein des tumeurs et de part et d'autre du front tumoral, de sorte qu'il n'est pas possible d'établir un pronostic fiable sur seulement une à quelques mesures des densités dans des territoires intra-tumoraux.
7. Constitution des profils et des groupes
Sur chaque lame virtuelle, plusieurs (c'est-à-dire plus de 4) mesures de densités sont réalisées, dont chacune est associée à la position par rapport au front tumoral. Les mesures de densité dans les exemples présentés ont été réalisées tous les 5 micromètres.
L'infiltrat lymphocytaire de la région péri-tumorale au centre de la tumeur a été mesuré selon la technique décrite ci-dessus pour les 20 premiers patients de la cohorte.
Les 20 courbes obtenues ont été classées en sous-groupes selon le profil général de la courbe par rapport au front tumoral, c'est-à-dire les variations de densités lymphocytaires de la périphérie au centre tumoral. Les critères utilisés pour classer les profils sont :
1) l'existence d'un pic de densité lymphocytaire,
2) son intensité,
3) sa densité dans la région péri-tumorale et intra-tumorale. Profil de type 1 : « Infiltrat intra-tumoral fort »
La densité lymphocytaire est croissante. Dans la région intra-tumorale, la densité moyenne est au moins deux fois supérieure à la densité moyenne dans la région péri- tumorale (voir figure 4C)
Profil de type 2 : « Pic de densité lymphocytaire fort au front tumoral »
Ce pic est défini comme une densité lymphocytaire à un point donné de la bande d'analyse supérieur à 3 fois la densité moyenne de la région péri-tumorale. La courbe présente un pic de densité lymphocytaire à une distance inférieure à 300μπι du front d'extension tumoral (voir figure 4B). Ce pic est dit fort car il dépasse la densité de 6 lymphocytes détectés sur une longueur de 5 μπι pour une largeur de ΙΟΟΟμπι. Le seuil de 6 lymphocytes a été défini uniquement pour les courbes révélant les lymphocytes positifs pour CD3 (ce seuil est à 4 pour les lymphocytes CD8+, à 2,5 pour les lymphocytes Foxp3+ et à 7 pour les CD45R0+)
Profil de type 3 : « Pic de densité lymphocytaire faible au front tumoral »
La courbe présente un pic de densité lymphocytaire à une distance inférieure à 300μπι du front d'extension tumoral. Ce pic est dit faible car il reste inférieur au seuil de densité de 6 lymphocytes détectés sur une longueur de 5 μπι pour une largeur de ΙΟΟΟμπι (cf. figure 4A).
Profil de type 4 : « Infiltrat global faible »
La courbe ne présente aucun pic. La densité moyenne de lymphocytes est inférieure au seuil de 2 pour les CD3, et CD45R0, et de 1 pour Foxp3 et CD8.
8. Homogénéité et reproductibilité des mesures
L'hypothèse que les mesures de l 'infiltrat lymphocytaire ne diffèrent pas en différents points de mesure d'une même lame a été testée de la manière suivante : 2 à 4 mesures ont été réalisées sur 5 lames consécutives en fonction de la taille de l'interface tumeur- région péri-tumorale. Les courbes obtenues à chaque mesure ont été classés en type 1 à 4 selon les profils décrits ci-dessus. Aucune différence de type de courbes n' a été observée entre les mesures d'un même patient, comme en témoignent les figures 7B, 8B et 9B.
9. Résulats : impact pronostic
Les profils de courbe obtenus pour 50 patients choisis au hasard ont été analysés indépendamment par 3 observateurs. La reproductibilité inter-observateur pour la classification en type 1, 2, 3 ou 4 était excellente avec un kappa de 0,93.
Dans cette série de 1 17 patients, les courbes de survie ont été représentées selon la méthode de Kaplan et Meyer. L'association des paramètres pronostics potentiels à été testée par une analyse univariée puis multivariée. Les variables pronostiques habituelles étaient significatives en univariées, de même que les profils de courbe de densités (test « lymphotum »). En revanche, seuls les profils de courbe de densités (test lymphotum) étaient significativement associés à la survie en analyse multivariée.
Le tableau 1 ci-dessous expose les résultats obtenus par ces deux analyses (univariée et multivariée).
Tableau 1
Le test lymphotum a également été réalisé après marquage des tumeurs de ces 1 17 patients par anti-CD8, CD45RO et foxP3. Ces marqueurs étaient également significativement associés à la survie en analyse univariée puis multivariée. Le test lymphotum CD3 était toutefois légèrement plus performant.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de pronostic de l' évolution d'une tumeur solide chez un individu, comprenant au moins les étapes suivantes: a) réaliser une lame virtuelle à partir d'un échantillon tumoral, sur laquelle un front tumoral est identifiable, b) quantifier sur ladite lame virtuelle réalisée à l'étape a) la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents dans une zone continue recouvrant le front tumoral et s'étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, appelée « zone de quantification », c) déduire de ladite quantification les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit patient.
2. Méthode de pronostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape a) consiste au moins à numériser et enregistrer une image de microscopie d'une coupe tissulaire marquée par immunohistochimie.
3. Méthode de pronostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'étape b) de quantification est effectuée à l'aide d'un logiciel informatique.
4. Méthode de pronostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite zone continue est une zone rectangulaire.
5. Méthode de pronostic selon la revendication 4, caractérisée en ce que la zone rectangulaire est telle que: i) les médiatrices du petit côté et du grand côté de ce rectangle sont respectivement la normale et la tangente au front tumoral audit point d'intersection, et ii) le point d'intersection des médiatrices est un point du front tumoral.
6. Méthode de pronostic selon les revendications 4 et 5, dans laquelle l'étape b) consiste à échantillonner la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins dans un ensemble continu de zones rectangulaires de largeur prédéfinie, lesdites zones ayant pour longueur la largeur de la zone de quantification, et balayant la zone de quantification de part et d'autre du front tumoral, sur toute la longueur de la zone de quantification.
7. Méthode de pronostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que le résultat de ladite quantification est exprimé sur un graphique.
8. Méthode de pronostic selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'analyse dudit graphique permet d'évaluer les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit patient.
9. Méthode de pronostic selon les revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que ledit graphique est tel que : i) sur l'axe des abscisses est reportée la distance de part et d'autres du point du front tumoral défini à la revendication 5, ii) en ordonnée est reportée la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins mesurée dans chaque zone échantillonnée.
10. Méthode de pronostic selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'évaluation desdits risques s'effectue : i) En comparant la forme dudit graphique à un profil type, ou ii) En calculant l'aire sous le graphique pour chaque zone pré- et post- front tumoral, et en la comparant à des valeurs-seuils, iii) En mesurant les pentes de variation en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral et en les comparant à des valeurs-seuils, ou iv) En comparant les valeurs obtenues en deux points du graphique situés à une distance déterminée de part et d'autre du front tumoral à des valeurs-seuils.
11. Méthode de pronostic de l'évolution d'une tumeur solide chez un individu, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir une lame virtuelle d'une coupe tissulaire d'une tumeur marquée par immunohistochimie, sur laquelle un front tumoral est identifiable, b) quantifier sur cette lame virtuelle la densité en cellules et/ou en vaisseaux sanguins présents de part et d' autre du front tumoral, dans une zone continue rectangulaire telle que définie dans la revendication 5, et s'étendant de part et d'autre du front tumoral sur une distance au moins égale à 0.5 mm, c) exprimer ces résultats sur un graphique dont l'axe des abscisses correspond à la distance par rapport au front tumoral, et en ordonnée la quantité de cellules ou de vaisseaux sanguins mesurée à cette distance dans une surface rectangulaire dont la largeur le long de l'abscisse est prédéfinie, et dont la longueur est la largeur de la zone rectangulaire de quantification, et d) Effectuer au moins une des opérations telles que défini es à l a revendication 10, e) Déduire de l'étape d) les risques de rechute postopératoire et/ou la sensibilité aux divers traitements anti-tumoraux et/ou les risques de développer des métastases chez ledit individu.
12. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules à quantifier sont des leucocytes tels que les lymphocytes T, les lymphocytes B, les macrophages, les cellules NK, les cellules dendritiques, ou des sous-populations de ces cellules immunitaires.
13. Méthode de pronostic selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules à quantifier sont marquées par immunohistochimie et sont positives pour les marqueurs CD3, CD4, CD8, CD45RO, FoxP3, CD68.
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